32019R1390

Document 32019R1390

Title and reference

Komission asetus (EU) 2019/1390, annettu 31 päivänä heinäkuuta 2019, testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla annetun asetuksen (EY) N:o 440/2008 liitteen muuttamisesta sen mukauttamiseksi tekniikan kehitykseen (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

Languages, formats and link to OJ

HTML

PDF

Official Journal

To see if this document has been published in an e-OJ with legal value, click on the icon above (For OJs published before 1st July 2013, only the paper version has legal value).

Multilingual display

Text

26.9.2019

Euroopan unionin virallinen lehti

L 247/1

KOMISSION ASETUS (EU) 2019/1390,

annettu 31 päivänä heinäkuuta 2019,

testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla annetun asetuksen (EY) N:o 440/2008 liitteen muuttamisesta sen mukauttamiseksi tekniikan kehitykseen

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan unionin toiminnasta tehdyn sopimuksen,

ottaa huomioon kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N: o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta 18 päivänä joulukuuta 2006 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 (1) ja erityisesti sen 13 artiklan 2 kohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

(1)	Komission asetuksessa (EY) N:o 440/2008 (2) vahvistetaan asetuksen (EY) N:o 1907/2006 soveltamiseksi käytettävät testimenetelmät, joilla määritellään kemikaalien fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, myrkyllisyys ja myrkyllisyys ympäristölle.

(2)	Taloudellisen yhteistyön ja kehityksen järjestö OECD laatii yhdenmukaistettuja ja kansainvälisesti sovittuja testiohjeita kemikaalien testaamiseksi sääntelytarkoituksissa. OECD hyväksyy säännöllisesti uusia ja tarkistettuja testiohjeita, joissa otetaan huomioon alalla tapahtunut tieteen kehitys.

(3)

Jotta otetaan huomioon tekniikan kehitys ja aina kun se on mahdollista vähennetään tieteellisissä tarkoituksissa käytettävien eläinten määrää asetuksen (EY) N:o 1907/2006 13 artiklan 2 kohdan mukaisesti ja koska OECD on hyväksynyt asiaa koskevat testiohjeet, olisi vahvistettava kaksi uutta testimenetelmää ekotoksisuuden arviointia varten ja yhdeksän uutta testimenetelmää, joilla määritellään myrkyllisyyttä ihmisten terveydelle; lisäksi olisi ajantasaistettava seitsemän testimenetelmää. Yksitoista näistä testimenetelmistä liittyy iho- ja silmä-ärsytystä, ihon herkistymistä, genotoksisuutta ja hormonaalisia haittavaikutuksia koskeviin in vitro -testeihin. Sidosryhmiä on kuultu ehdotetuista muutoksista.

(4)	Sen vuoksi asetusta (EY) N:o 440/2008 olisi muutettava.

(5)	Tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat asetuksen (EY) N:o 1907/2006 133 artiklalla perustetun komitean lausunnon mukaiset,

ON HYVÄKSYNYT TÄMÄN ASETUKSEN:

1 artikla

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite tämän asetuksen liitteen mukaisesti.

2 artikla

Tämä asetus tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.

Tehty Brysselissä 31 päivänä heinäkuuta 2019.

Komission puolesta

Puheenjohtaja

Jean-Claude JUNCKER

(1) EUVL L 396, 30.12.2016, s. 1.

(2) Komission asetus (EY) N:o 440/2008, annettu 30 päivänä toukokuuta 2008, testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla (EUVL L 142, 31.5.2008, s. 1).

LIITE

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite seuraavasti:

Korvataan B osassa oleva B.4 luku seuraavasti:

”B.4 AKUUTTI IHOÄRSYTTÄVYYS/-SYÖVYTTÄVYYS

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 404 (2015). Kemikaalien testaamiseen tarkoitettuja OECD:n testiohjeita tarkistetaan säännöllisesti, jotta varmistetaan, että ne vastaavat parhaita käytettävissä olevia tieteellisiä menetelmiä. OECD:n testiohjeen 404 tarkistuksessa on erityisesti pyritty ottamaan huomioon eläinten hyvinvoinnin parantamiseen liittyvät näkökohdat sekä kaikkien testikemikaalista aiemmin saatujen tietojen arviointi, jotta voidaan välttää tarpeettomia eläinkokeita. OECD:n testiohjeen 404 (hyväksytty ensimmäisen kerran vuonna 1981, tarkistettu vuosina 1992, 2002 ja 2015) päivitetty versio sisältää viittauksia ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden testausta ja arviointia koskevat yhdennetyt lähestymistavat -ohjeeseen (1), jossa esitellään modulaarinen lähestymistapa ihoärsyttävyyden ja -syövyttävyyden testaukseen. Yhdennetyissä lähestymistavoissa kuvataan useita moduuleita, joihin on ryhmitelty tietolähteitä ja analysointityökaluja. Lisäksi niissä annetaan i) ohjeita siitä, miten integroida ja käyttää nykyisiä testaukseen perustuvia ja testauksen ulkopuolella saatuja tietoja kemikaalien ihoärsyttävyyden ja ihosyövyttävyyden potentiaalin arvioinnissa, ja ii) selostetaan, miten toimitaan, kun lisätestaus on tarpeen (1). Lisäksi kyseisessä ohjeessa suositellaan, että tarvittaessa in vivo -alkutestissä eläimelle asetetaan kolme testilappua peräkkäin eikä samanaikaisesti.

Ihoärsyttävyyden ja -syövyttävyyden määritelmät esitetään tämän testimenetelmän lisäyksessä.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Järkevien tieteellisten menettelytapojen ja eläinten hyvinvoinnin vuoksi in vivo -testausta ei tule tehdä, ennen kuin kaikkien testikemikaalin mahdollisen ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden kannalta oleellisten tietojen painoarvo on arvioitu ihoärsyttävyyden ja -syövyttävyyden testauksen ja arvioinnin yhdennettyjä lähestymistapoja koskevien ohjeiden mukaisesti. Tämä koskee tämän ohjeen kolmea osaa ja niitä vastaavia moduuleja (1). Osassa 1 aiempia tietoja käsitellään seitsemässä moduulissa, jotka koskevat ihmisillä saatuja tuloksia, in vivo -tietoja, in vitro -tietoja, fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia koskevia tietoja (esimerkiksi pH-arvoa ja varsinkin voimakasta happamuutta tai emäksisyyttä) ja muita kuin testaukseen perustuvia menetelmiä. Osassa 2 tehdään painoarvoanalyysi. Jos tietojen painoarvosta ei saada varmuutta, on jatkettava osaan 3, jossa tehdään lisätestejä in vitro -menetelmillä, ja in vivo -testausta käytetään vasta viimesijaisena keinona. Tällä analyysilla pyritään siis vähentämään in vivo -testien tarvetta sellaisten testikemikaalien kohdalla, joiden ihoärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä aiempi tutkimus on jo tuottanut riittävästi todisteita.

IN VIVO -TESTIN PERIAATE

Testikemikaali annostellaan yhtenä annoksena koe-eläimen iholle; eläimen ihon käsittelemättömät alueet toimivat kontrollina. Ärsyttävyyden/syövyttävyyden aste todetaan ja pisteytetään määrävälein, ja vauriota kuvaillaan vaikutusten arvioinnin täydentämiseksi. Testin on kestettävä niin pitkään, että havaittujen vaikutusten korjautuvuus tai korjautumattomuus voidaan arvioida.

Eläimet, joissa havaitaan merkkejä jatkuvasta vakavasta kärsimyksestä ja/tai kivusta missä tahansa testin vaiheessa, on lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon testikemikaalin arvioinnissa. Kuolevien ja kärsivien eläinten lopettamiskriteereihin sovelletaan OECD:n erillistä ohjetta (2).

IN VIVO -TESTIN VALMISTELU

Eläinlajin valinta

Suositeltava koe-eläinlaji on albiinokaniini. Kokeessa käytetään nuoria ja terveitä täysikasvuisia yksilöitä. Muiden lajien käyttö on perusteltava.

Eläinten valmistelu

Noin 24 tuntia ennen testiä eläinten selkäpuolen karva ajetaan pois. Ihoa on varottava hankaamasta. Testissä voidaan käyttää vain eläimiä, joiden iho on terve ja vahingoittumaton.

Joillakin kaniinikannoilla esiintyy tiheitä karvalaikkuja, jotka ovat tavallista voimakkaampia tiettyinä vuodenaikoina. Tällaisia tiheäkarvaisia alueita ei pidä käyttää testikohtina.

Koe-eläintilat ja ruokinta

Jokaisella eläimellä on oltava oma häkki. Koe-eläinhuoneen lämpötilan on oltava kaniineilla 20 °C (± 3 °C). Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70:tä prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa täytyy käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.

TESTIMENETTELY

Testikemikaalin annostelu

10.

Testikemikaali annostellaan pienelle ihoalueelle (noin 6 cm2) ja peitetään sideharsolapulla, joka kiinnitetään ihoa ärsyttämättömällä teipillä. Jos suora annostelu ei ole mahdollinen (esimerkiksi nesteiden tai joidenkin tahnojen kohdalla), testikemikaali annostellaan ensin sideharsolapulle, joka asetetaan iholle. Lappu on pidettävä kevyessä kosketuksessa ihoon sopivan, puolitiiviin siteen avulla koko altistusjakson ajan. Jos testikemikaali annostellaan lappuun, se on kiinnitettävä ihoon siten, että aine on hyvin kosketuksessa ihoon ja leviää tasaisesti. Eläimen yltäminen lappuun ja testikemikaalin nieleminen tai hengittäminen on estettävä.

11.

Nestemäisiä testikemikaaleja käytetään yleensä laimentamattomina. Testattaessa kiinteitä aineita (jotka voidaan tarvittaessa jauhaa) testikemikaali on kostutettava mahdollisimman pienellä määrällä vettä (tai tarvittaessa jollain muulla sopivalla kantaja-aineella), jotta saadaan hyvä ihokosketus. Jos käytetään muuta kantaja-ainetta kuin vettä, kantaja-aineen mahdollisen vaikutuksen testikemikaalin aiheuttamaan ihoärsytykseen pitäisi olla olematon tai mahdollisimman vähäinen.

12.

Altistusjakso kestää tavallisesti neljä tuntia, ja sen lopussa ylimääräinen testikemikaali on poistettava, jos se on käytännössä mahdollista, vedellä tai sopivalla liuottimella muuttamatta orvaskeden senhetkistä vastetta tai eheyttä.

Annostaso

13.

Testikohtaan annostellaan 0,5 ml nestettä tai 0,5 g kiinteää ainetta tai tahnaa.

Alkutesti (ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden in vivo -testi yhdelle eläimelle)

14.

Kun testikemikaali on määritetty painoarvoanalyysin tai aiemman in vitro -testauksen perusteella syövyttäväksi, ärsyttäväksi tai luokittelemattomaksi, muuta in vivo -testausta ei yleensä tarvita. Jos kuitenkin katsotaan, että kemikaalista tarvitaan lisää tietoa, in vivo -testi tehdään aluksi yhdellä eläimellä ja seuraavassa kuvattua lähestymistapaa noudattaen. Enintään kolme testilappua asetetaan yksi toisensa jälkeen eläimen iholle. Ensimmäinen niistä poistetaan kolmen minuutin kuluttua. Jos vakavaa ihoreaktiota ei havaita, toinen lappu asetetaan iholle eri kohtaan ja poistetaan tunnin kuluttua. Jos havainnot osoittavat tässä vaiheessa, että altistusta voidaan inhimillisesti jatkaa neljään tuntiin asti, kolmas lappu asetetaan paikoilleen ja poistetaan neljän tunnin kuluttua. Vaste pisteytetään.

15.

Jos syövyttävä vaikutus havaitaan minkä tahansa kolmen peräkkäisen altistuksen aikana, testi lopetetaan heti. Jos syövyttävää vaikutusta ei havaita viimeisen lapun poistamisen jälkeen, eläintä tarkkaillaan 14 päivän ajan, mikäli syöpymistä ei kehity sitä ennen.

16.

Jos testikemikaalin ei odoteta aiheuttavan syöpymistä vaan ärsytystä, eläimelle asetetaan yksi lappu neljän tunnin ajaksi.

Vahvistustesti (ihoärsyttävyyden in vivo -testi useille eläimille)

17.

Jos alkutestissä ei havaita syövyttävää vaikutusta, ärsyttävyys tai negatiivinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä kaksi eläintä. Kummallekin asetetaan lappu neljän tunnin altistusjakson ajaksi. Jos ärsyttävä vaikutus havaitaan alkutestissä, vahvistustesti voidaan tehdä peräkkäistestinä tai altistamalla kaksi lisäeläintä yhtäaikaisesti. Jos alkutestiä ei poikkeuksellisesti tehdä, kahdelle tai kolmelle eläimelle voidaan asettaa yksi lappu, joka poistetaan neljän tunnin kuluttua. Kun käytetään kahta eläintä, lisätestiä ei tarvita, jos molemmille kehittyy sama vaste. Muussa tapauksessa testataan myös kolmas eläin. Epäselvät vasteet täytyy mahdollisesti arvioida testaamalla lisää eläimiä.

Havainnointijakso

18.

Tarkkailujakson on oltava riittävän pitkä, jotta havaittujen vaikutusten korjautuvuus voidaan arvioida kokonaisuudessaan. Testi on kuitenkin lopetettava heti, jos eläin osoittaa jatkuvia merkkejä kovasta kärsimyksestä tai kivusta. Vaikutusten korjautuvuuden määrittämiseksi eläimiä on tarkkailtava enintään 14 päivän ajan lappujen poistamisen jälkeen. Jos korjautuvuus todetaan ennen kuin 14 päivää on kulunut, testi on lopetettava silloin.

Kliiniset havainnot ja ihoreaktioiden pisteytys

19.

Kaikista eläimistä tutkitaan eryteeman ja ödeeman merkit ja vasteet pisteytetään ensiksi 60 minuutin jälkeen ja sitten 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua lapun poistamisesta. Yhdelle eläimelle tehtävän alkutestin jälkeen testikohta tutkitaan myös heti lapun poistamisen jälkeen. Ihoreaktiot pisteytetään ja kirjataan jäljempänä esitetyn taulukon asteikon mukaan. Jos iholla esiintyy vaurioita, joita ei voida tunnistaa ärsytykseksi tai syöpymiseksi 72 tunnin kuluttua, havainnointia voi olla tarpeen jatkaa päivään 14 asti, jotta vaikutusten korjautuvuus voidaan todeta. Ärsytyksen lisäksi kaikki paikalliset toksiset vaikutukset, kuten ihon rasvan liukeneminen ja mitkä tahansa systeemiset haittavaikutukset (esimerkiksi vaikutukset kliinisiin toksisuuden merkkeihin ja painoon), on kuvattava ja kirjattava täydellisesti. Epäselvien vaurioiden yhteydessä on harkittava histopatologista tutkimusta.

20.

Ihovasteiden pisteytys on väistämättä subjektiivista. Ihovasteiden pisteytyksen yhdenmukaistamiseksi sekä testilaboratorioiden ja havaintoja tekevien ja tulkitsevien henkilöiden työn helpottamiseksi havaintoja tekevä henkilöstö on perehdytettävä käytettävään pisteytysjärjestelmään (ks. jäljempänä oleva taulukko). Kuvitettu opas ihoärsytyksen ja muiden vaurioiden asteista voi olla hyödyllinen (3).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

21.

Tutkimuksen tulokset on esitettävä taulukkona lopullisessa testiraportissa, ja niiden on sisällettävä kaikki kohdassa 24 luetellut asiat.

Tulosten arviointi

22.

Ihoärsytyspisteet on arvioitava yhdessä vaurioiden luonteen ja vakavuuden sekä niiden korjautuvuuden tai korjautumattomuuden kanssa. Yksittäiset pisteet eivät edusta aineen ärsyttävyysominaisuuksien absoluuttista tasoa, koska myös testikemikaalin muut vaikutukset arvioidaan. Sen sijaan yksittäisiä pisteitä voidaan tarkastella viitearvoina, jotka on arvioitava kaikkien muiden tutkimuksessa tehtyjen havaintojen yhteydessä.

23.

Ihovaurioiden korjautuvuus on otettava huomioon ärsytysvastetta arvioitaessa. Jos vasteet, kuten kaljuuntuminen (suppealla alueella), liikasarveistuminen, liikakasvu ja hilseily, jatkuvat 14 päivän tarkkailujakson loppuun asti, testikemikaali on luokiteltava ihoa ärsyttäväksi.

Testiraportti

24.

Testiraportissa on oltava seuraavat tiedot:

Perustelut in vivo -testin tekemiselle:

—	aiemmista tutkimuksista saatujen testitulosten painoarvoanalyysi, myös vaiheittaisen menettelyn tulokset

—	aiemmista testeistä saatujen relevanttien tulosten kuvaus

—	testausstrategian kustakin vaiheesta saadut tulokset

—	kuvaus tehdyistä in vitro -testeistä, myös yksityiskohtaiset tiedot menettelyistä ja testi-/vertailuaineista saadut tulokset

—	painoarvoanalyysi in vivo -testiä varten.

Testikemikaali:

—	Yhdestä ainesosasta koostuva aine: kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa epäpuhtauksien kemialliset tunnistetiedot sen mukaan, mikä on käytännössä mahdollista, jne.

—

Useammasta ainesosasta koostuva aine, seos ja koostumukseltaan tuntemattomat tai vaihtelevat aineet, kompleksit reaktiotuotteet tai biologiset materiaalit (UVCB-aineet): luonnehditaan mahdollisimman tarkoin ainesosien kemiallisten tunnistetietojen (ks. edellä), esiintymistiheyden ja merkityksellisten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla.

—	ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut merkitykselliset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

—	lähde, erän numero, jos saatavilla

—	tarvittaessa testikemikaalin ja/tai kontrolliaineen käsittely ennen testiä (esimerkiksi lämmittäminen tai jauhaminen)

—	testikemikaalin stabiilisuus, viimeinen käyttöpäivä tai uudelleenanalysointipäivä, jos se on tiedossa

—	säilytysolosuhteet.

Kantaja-aine:

—	tunnistetiedot, pitoisuus (tarvittaessa), käytetty tilavuus

—	perustelut kantaja-aineen valinnalle.

Koe-eläin (-eläimet):

—	käytetty laji/kanta, perustelut muiden eläinten kuin albiinokaniinien käytölle

—	uros- ja naaraseläinten määrä

—	eläinyksilöiden paino(t) testin alussa ja lopussa

—	eläinten ikä testin alussa

—	eläimen (eläinten) alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio jne.

Testiolosuhteet:

—	lapun asettamiskohdan valmistelumenetelmä

—	käytettyjen lappumateriaalien ja lappujen asettamismenetelmän yksityiskohdat

—	tiedot testikemikaalin valmistelusta, annostelusta ja iholta poistamisesta.

Tulokset:

—	kunkin eläimen ärsytys-/syöpymisvasteen pisteytys jokaiselta mittauskerralta taulukkona

—	kuvaus kaikista havaituista vaurioista

—	sanallinen kuvaus havaitun ärsytyksen/syöpymisen luonteesta ja asteesta sekä mahdolliset histopatologiset löydökset

—	kuvaus muista paikallisista haittavaikutuksista (esimerkiksi ihon rasvan liukeneminen) ja systeemisistä vaikutuksista ihoärsytyksen-/syöpymisen lisäksi.

Tulosten tarkastelu

Päätelmät

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)	OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(2)	OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

Taulukko

Ihoreaktioiden pisteytys


Ei eryteemaa…	0
Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava)…	1
Selkeästi erottuva eryteema…	2
Keskivakava tai vakava eryteema…	3
Vakava eryteema (voimakas punoitus) – karsta, joka estää eryteeman pisteytyksen…	4
Suurin mahdollinen pistemäärä: 4

Ei ödeemaa…	0
Hyvin lievä ödeema (tuskin havaittava)…	1
Lievä ödeema (selvärajainen alue, jonka reunat ovat koholla)…	2
Keskivakava ödeema (noin 1 mm koholla)…	3
Vakava ödeema (enemmän kuin 1 mm koholla ja levinnyt altistuskohtaa laajemmalle)…	4
Suurin mahdollinen pistemäärä: 4
Epäselvien vaurioiden tapauksessa voidaan tehdä histopatologinen tutkimus.

Lisäys

MÄÄRITELMÄT

Kemikaali on aine tai seos.

Ihoärsytys tarkoittaa korjautuvan ihovaurion syntymistä enintään neljä tuntia sen jälkeen, kun testikemikaalia on annosteltu.

Ihon syöpyminen tarkoittaa korjautumattoman ihovaurion syntymistä eli näkyvän orvasketeen ja verinahkaan ulottuvan kuolion ilmaantumista enintään neljä tuntia sen jälkeen, kun testikemikaalia on annosteltu. Tyypillisiä syöpymisreaktioita ovat haavaumat, verenvuoto, veriset ruvet sekä 14 päivän tarkkailujakson lopussa ihon vaalenemisen aiheuttama värinmuutos, kokonaan kaljuuntuneet alueet ja arvet. Epäselvien vaurioiden tapauksessa olisi harkittava histopatologista tutkimusta.

Testikemikaali on tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos.

”

Korvataan B osassa oleva B.17 luku seuraavasti:

”B.17 IN VITRO-GEENIMUTAATIOTESTIT NISÄKÄSSOLUILLA HPRT- JA XPRT-GEENEJÄ KÄYTTÄEN

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 476 (2016). Testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvoinnin vuoksi. Tämä tarkistettu versio testimenetelmästä B.17 perustuu lähes 30 vuoden kokemukseen tästä testistä sekä sellaisen erillisen uuden menetelmän kehittämistyön tuloksiin, jossa tehdään in vitro -geenimutaatiotestejä nisäkässoluilla tymidiinikinaasigeeniä käyttäen. Testimenetelmä B.17 on osa geneettisen toksikologian testimenetelmiä. OECD on laatinut asiakirjan (1), joka sisältää yhteenvedon geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsauksen näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin.

Nisäkässoluilla tehtävän in vitro -geenimutaatiotestin tarkoituksena on havaita kemikaalien aiheuttamia geenimutaatioita. Näissä testeissä käytettävissä solulinjoissa mitataan forward-mutaatioita reportterigeeneissä, erityisesti endogeenisessa hypoksantiini-guaniini-fosforibosyylitransferaasigeenissä (jyrsijöiden soluissa Hprt, ihmisen soluissa HPRT; tässä testimenetelmässä niistä käytetään nimityksiä Hprt-geeni ja HPRT-testi), ja ksantiini-guaniinifosforibosyylitransferaasin siirtogeenissä (gpt) (jäljempänä ’XPRT-testi’). HPRT- ja XPRT-mutaatiotesteillä voidaan havaita erilaisia geneettisiä tapahtumia. HPRT-testillä havaittujen mutaatiotapahtumien (mm. pistemutaatioiden, lukukehyksen siirtymien, pienten deleetioiden ja insertioiden) lisäksi autosomissa sijaitsevan gpt:n siirtogeenin avulla voidaan havaita myös suurista deleetioista ja mahdollisesti mitoottisesta rekombinaatiosta johtuvia mutaatioita, joita HPRT-testillä ei havaita, koska Hprt-geeni sijaitsee X-kromosomissa (2) (3) (4) (5) (6) (7). Tällä hetkellä XPRT-testiä käytetään sääntelytarkoituksissa vähemmän kuin HPRT-testiä.

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

ALUSTAVIA POHDINTOJA JA RAJOITUKSET

In vitro -testit edellyttävät yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää. Eksogeeninen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei täysin jäljittele in vivo -olosuhteita.

On huolehdittava siitä, että vältetään olosuhteet, jotka voisivat johtaa vääriin positiivisiin tuloksiin (ts. mahdollinen yhteisvaikutus testausjärjestelmän kanssa), jotka eivät johdu testikemikaalien ja solun geneettisen materiaalin suorasta yhteisvaikutuksesta. Tällaisiin olosuhteisiin sisältyvät pH:n tai osmolaliteetin muutokset (8) (9) (10), yhteisvaikutus kasvatusliuoksen komponenttien kanssa (11) (12) tai liian korkeat sytotoksisuustasot (13). HPRT-testissä sytotoksisuutta pidetään liian korkeana, jos se ylittää 19 kohdassa määritetyt sytotoksisuuden enimmäistasot.

Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, antaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos antaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa.

TESTIN PERIAATE

Mutantit solut, joista puuttuu Hprt-entsyymitoiminta HPRT-testissä tai xprt-entsyymitoiminta XPRT-testissä, ovat resistenttejä puriinianalogi 6-tioguaniinin sytostaattisille vaikutuksille. Hprt:n (HPRT-testissä) tai gpt:n (XPRT-testissä) läsnä ollessa solut ovat herkkiä tioguaniinille, joka estää solun aineenvaihduntaa ja pysäyttää solunjakautumisen. Mutantit solut kykenevät siis lisääntymään tioguaniinin läsnä ollessa, kun taas normaalit, Hprt-entsyymiä (HPRT-testissä) tai gpt-entsyymiä (XPRT-testissä) sisältävät solut eivät kykene.

Suspensiossa tai yksikerrosviljelmissä olevat solut altistetaan sopivaksi ajaksi (3–6 tunniksi) testikemikaalille sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä (ks. 14 kohta) ja jatkoviljellään sytotoksisuuden toteamiseksi ja fenotyypin ilmentymisen aikaansaamiseksi ennen mutanttien selektiota (14) (15) (16) (17). Sytotoksisuus määritetään yleensä mittaamalla viljelmien suhteellinen eloonjääneisyys (kloonaustehokkuus) heti altistuksen jälkeen ja mukauttamalla se mahdolliseen altistuksen aikaiseen solukatoon negatiiviseen kontrolliin verrattuna (18 kohta ja lisäys 2). Altistettuja viljelmiä pidetään kasvatusliuoksessa riittävän pitkä aika, joka on jokaiselle solutyypille ominainen, jotta aikaansaatujen mutanttien fenotyypin ilmentyminen olisi lähellä optimaalista (yleensä vähintään 7–9 päivää). Fenotyypin ilmentymisen jälkeen mutaationopeus lasketaan siten, että tunnettu lukumäärä soluja kylvetään toisaalta mutanttipesäkkeiden toteamiseksi selektiivistä ainetta sisältävälle alustalle ja toisaalta kloonaustehokkuuden (elinkykyisyyden) määrittämiseksi alustalle, joka ei sisällä selektiivistä ainetta. Sopivan inkubaatioajan kuluttua lasketaan pesäkkeet. Mutaationopeus lasketaan mutanttipesäkkeiden lukumäärän perusteella mutanttien selektion aikaisella kloonaustehokkuudella korjattuna.

MENETELMÄN KUVAUS

Testin valmistelu

Solut

HPRT- ja XPRT-testeissä on käytettävä solutyyppejä, joiden on osoitettu olevan herkkiä kemiallisille mutageeneille ja joilla on hyvä kloonaustehokkuus, stabiili karyotyyppi ja stabiili spontaanimutaationopeus. HPRT-testissä yleisimmin käytettyjä solulinjoja ovat kiinanhamsterin solulinjat CHO, CHL ja V79, hiiren lymfoomasolulinja L5178Y ja ihmisen lymfoblastoidisolulinja TK6 (18) (19). XPRT-testissä käytetään CHO-linjasta peräisin olevia AS52-soluja, jotka sisältävät gpt-siirtogeenin (ja joista Hprt-geeni on poistettu) (20) (21); HPRT-testiä ei voida tehdä AS52-soluilla, koska hprt-geeni on poistettu. Muiden solulinjojen käyttö on perusteltava ja validoitava.

10.

Solulinjoista on tarkistettava ajoittain modaalisen kromosomimäärän pysyvyys ja varmistettava, ettei mykoplasmakontaminaatiota ole (22) (23). Soluja ei pidä käyttää, jos ne ovat kontaminoituneet tai jos modaalinen kromosomimäärä on muuttunut. Normaali solusyklin kesto testauslaboratoriossa on määritettävä ja sen on oltava solujen julkaistujen ominaisuuksien mukainen. Myös isäntäsolukannan spontaani mutaationopeus on tarkistettava, eikä kantaa tule käyttää, ellei mutaationopeus ole hyväksyttävä.

11.

Ennen kuin viljelmiä käytetään tässä testissä, niistä voi olla tarpeen poistaa olemassa olevat mutanttisolut esimerkiksi viljelemällä HAT-liuoksessa (HPRT-testi) ja MPA-liuoksessa (XPRT-testi) (5) (24) (ks. lisäys 1). Puhdistetut solut voidaan kylmäsäilöä ja sulattaa käytettäviksi varastokantoina. Sulatettua varastokantaa voidaan käyttää testaukseen, kun normaalit kaksinkertaistumisajat ovat umpeutuneet. XPRT-testiä tehtäessä AS52-solujen rutiiniviljelyssä on käytettävä sellaisia olosuhteita, joiden avulla varmistetaan gpt-siirtogeenin säilyminen (20).

Kasvatusliuokset ja viljelyolosuhteet

12.

Soluviljelmiä on viljeltävä soveltuvassa kasvatusliuoksessa ja asianmukaisissa inkubaatio-olosuhteissa (kasvatusastiat, kosteutettu ilma, jonka CO2-pitoisuus on 5 prosenttia, ja 37 °C:n inkubointilämpötila). Soluviljelmät on pidettävä aina sellaisissa olosuhteissa, joiden avulla varmistetaan, että ne kasvavat log-vaiheessa. On erityisen tärkeää valita sellaiset kasvatusliuokset ja viljelyolosuhteet, jotka takaavat optimaalisen solukasvun ilmentymisaikana ja optimaalisen kloonaustehokkuuden sekä mutanteille että ei-mutanteille soluille.

Soluviljelmien valmistelu

13.

Solulinjat kasvatetaan kantaviljelmistä ja kylvetään kasvatusliuokseen sellaiseen tiheyteen, että suspensioissa tai yksikerrosviljelmissä olevat solut kasvavat eksponentiaalisesti altistus- ja ilmentymisaikana (esimerkiksi konfluenssia on vältettävä yksikerrosviljelmissä kasvavien solujen osalta).

Metabolinen aktivaatio

14.

Jos solujen endogeeninen metabolointikyky ei ole riittävä, on käytettävä eksogeenisia metabolisia järjestelmiä. Yleisimmin käytetty järjestelmä, jota suositellaan oletusarvoisesti, ellei toisin toimiminen ole perusteltua, on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:llä (25) (26) (27) (28) tai fenobarbitaalin ja β-naftoflavonin (29) (30) (31) (32) yhdistelmällä käsiteltyjen jyrsijöiden (yleensä rottien) maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. Jälkimmäisenä mainittu yhdistelmä ei ole ristiriidassa pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskevan Tukholman yleissopimuksen kanssa (33), ja sen on osoitettu indusoivan sekaoksidaasia yhtä tehokkaasti kuin Aroclor 1254 (29) (31). S9-jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue on 1–2 tilavuusprosenttia, mutta sen pitoisuutta voidaan nostaa 10 tilavuusprosenttiin lopullisessa testiliuoksessa. Testattavien aineiden luokka saattaa vaikuttaa siihen, mitä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän tai metabolisen indusoijan tyyppiä ja pitoisuutta päätetään käyttää (34) (35) (36).

Testikemikaalin valmistus

15.

Kiinteät testikemikaalit on valmistettava sopivissa liuottimissa ja tarvittaessa laimennettava ennen solujen käsittelyä (ks. 16 kohta). Nestemäiset testikemikaalit voidaan lisätä suoraan testijärjestelmään ja/tai laimentaa ennen testijärjestelmässä käsittelyä. Kaasujen tai haihtuvien kemikaalien testauksessa standardimenettelyihin on tehtävä tarvittavia muutoksia; kyseiset kaasut tai kemikaalit on esimerkiksi käsiteltävä suljetuissa astioissa (37) (38). Testikemikaali on valmistettava juuri ennen käsittelyä, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä.

KOE-OLOSUHTEET

Liuottimet

16.

Liuotin on valittava siten, että testikemikaalien liukoisuus on mahdollisimman hyvä eikä se haittaa testin suorittamista esimerkiksi muuttamalla solukasvua, vaikuttamalla testikemikaalin eheyteen, reagoimalla viljelyastioiden kanssa tai haittaamalla metabolista aktivaatiojärjestelmää. Vesipitoisen liuottimen (tai soluviljelmän kasvatusliuoksen) käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Vakiintuneita liuottimia ovat esimerkiksi vesi tai dimetyylisulfoksidi. Yleensä orgaanisten liuottimien osuus ei saa ylittää yhtä ja vesipitoisten liuottimien (suolaliuos tai vesi) kymmentä tilavuusprosenttia lopullisessa käsittelyaineessa. Jos testissä käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia (esimerkiksi etanolia tai asetonia), niiden käyttö on perusteltava tiedoilla, joilla osoitetaan, että ne, testikemikaalit ja testijärjestelmä sopivat yhteen ja etteivät ne ole genotoksisia käytettyinä pitoisuuksina. Tällaisten perustelevien tietojen puuttuessa on tärkeää käyttää käsittelemättömiä kontrolleja (ks. lisäys 1), jotka osoittavat, ettei valittu liuotin aiheuta mitään haitallisia tai mutageenisiä vaikutuksia.

Sytotoksisuuden mittaus ja altistuspitoisuuksien valinta

17.

Päätettäessä suurimmasta testikemikaalin pitoisuudesta on vältettävä pitoisuuksia, jotka voivat aiheuttaa vääriä positiivisia vasteita, kuten liian voimakasta sytotoksisuutta (ks. 20 kohta), saostumista kasvatusliuokseen (ks. 21 kohta) tai pH-arvon tai osmolaliteetin merkittävää muuttumista (ks. 5 kohta). Jos testikemikaali aiheuttaa sitä lisättäessä kasvatusliuoksen pH-arvon merkittävän muuttumisen, pH-arvoa voidaan mukauttaa puskuroimalla lopullinen käsittelyliuos väärien positiivisten tulosten välttämiseksi ja asianmukaisten viljelyolosuhteiden säilyttämiseksi.

18.

Pitoisuuden valinta perustuu sytotoksisuuteen ja muihin näkökohtiin (ks. 22–22 kohta). Vaikka sytotoksisuuden arviointi alustavassa testissä saattaa olla hyödyllinen, jotta voidaan määrittää pääasiallisessa kokeessa käytettävät pitoisuudet, alustava testi ei ole pakollinen. Vaikka alustava sytotoksisuustesti tehtäisiin, sytotoksisuus on kunkin viljelmän osalta silti mitattava myös pääasiallisessa kokeessa. Sytotoksisuus on arvioitava käyttämällä suhteellista eloonjääneisyyttä eli maljattujen solujen kloonaustehokkuutta heti altistuksen jälkeen mahdolliseen altistuksen aikaiseen solukatoon mukautettuna solumäärän perusteella verrattuna negatiivisten kontrollien kloonaustehokkuuteen (joille määritetty eloonjääneisyys on 100 %) (ks. kaavio lisäyksestä 2).

19.

Vähintään neljää hyväksymisperusteet (asianmukainen sytotoksisuus, solumäärä jne.) täyttävää testipitoisuutta (pois lukien liuotinkontrolli ja positiiviset kontrollit) on arvioitava. Vaikka rinnakkaisten viljelmien käyttö on suositeltavaa, kunkin testattavan pitoisuuden yhteydessä voidaan käyttää joko rinnakkaisviljelmiä tai yhtä viljelmää. Riippumattomista rinnakkaisviljelmistä tietyllä pitoisuudella saadut tulokset on raportoitava erikseen, mutta ne voidaan yhdistää tietojen analyysia varten (17). Sellaisten testikemikaalien kohdalla, jotka osoittavat vähän tai eivät lainkaan sytotoksisuutta, sopiva pitoisuusväli on yleensä noin 2–3. Jos sytotoksisuutta esiintyy, valittujen testipitoisuuksien on katettava vaihteluväli sytotoksisuuden esiintymispitoisuudesta vähäiseen sytotoksisuuteen tai tasoon, jolla sytotoksisuutta ei esiinny lainkaan. Monien testikemikaalien pitoisuus-vastekäyrä on jyrkkä, ja jotta saataisiin tietoja sytotoksisuuden koko vaihteluvälistä tai voitaisiin tutkia annosvastesuhdetta tarkasti, voi olla tarpeen käyttää pitoisuuksia, jotka ovat lähempänä toisiaan, ja useampaa kuin neljää pitoisuutta erityisesti tilanteissa, joissa tarvitaan toistettuja kokeita (ks. 43 kohta). Useamman kuin neljän pitoisuuden käyttö voi olla erityisen tärkeää silloin, kun käytetään yksittäisiä viljelmiä.

20.

Jos enimmäispitoisuus perustuu sytotoksisuuteen, suurimmalla pitoisuudella pitäisi saavuttaa 20 ja 10 prosentin välillä vaihteleva suhteellinen eloonjääneisyys. Vain 10 prosentin tai sitä pienempään suhteelliseen eloonjääneisyyteen viittaavia positiivisia tuloksia on tulkittava varoen (43 kohta).

21.

Sellaisten huonosti liukenevien testikemikaalien kohdalla, jotka eivät ole sytotoksisia pienintä liukenematonta pitoisuutta pienempinä pitoisuuksina, suurimmassa analysoitavassa pitoisuudessa on esiinnyttävä testikemikaalille altistumisen päättyessä silmin tai käänteismikroskoopilla nähtävää sameutta tai saostumista. Vaikka sytotoksisuutta esiintyisi pienintä liukenematonta pitoisuutta pienemmissä pitoisuuksissa, on suositeltavaa testata ainoastaan yksi sameutta tai näkyvää saostumista tuottava pitoisuus, koska saostuminen saattaa aiheuttaa vääriä vasteita. Saostumista aiheuttavissa pitoisuuksissa on huolehdittava siitä, ettei saostuminen vaikuta testin suorittamiseen. Ennen koetta saattaa olla hyödyllistä määrittää liukoisuus soluviljelmän kasvatusliuokseen.

22.

Jos saostumista tai rajoittavaa sytotoksisuutta ei esiinny, suurimman testipitoisuuden on vastattava tasoa 10 mM, 2 mg/ml tai 2 μl/ml sen mukaan, mikä pitoisuuksista on pienin (39) (40). Jos testikemikaalin koostumusta ei ole määritelty eli se on esimerkiksi koostumukseltaan tuntematon tai vaihteleva aine, kompleksi reaktiotuote tai biologinen materiaali (UVCB-aine) (41) taikka ympäristöstä otettu näyte, suurimman pitoisuuden on riittävän sytotoksisuuden puuttuessa ehkä oltava suurempi (esimerkiksi 5 mg/ml) kunkin osan pitoisuuden lisäämiseksi. On kuitenkin huomattava, että nämä vaatimukset voivat vaihdella ihmisille tarkoitettujen lääkkeiden osalta (42).

Kontrollit

23.

Kaikkiin testiolosuhteisiin on sisällytettävä samanaikaiset negatiiviset kontrollit (ks. 16 kohta), jotka koostuvat pelkästään käsittelyliuoksessa olevasta liuottimesta ja joita on käsitelty samalla tavoin kuin altistettuja viljelmiä.

24.

Samanaikaisia positiivisia kontrolleja tarvitaan osoittamaan laboratorion kyky tunnistaa mutageenejä käytetyn testisuunnitelman olosuhteissa sekä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän tehokkuus, kun tämä on tarpeen. Esimerkkejä positiivisista kontrolleista esitetään jäljempänä taulukossa 1. Vaihtoehtoisia positiivisia kontrolliaineita voidaan käyttää perustelluissa tapauksissa. Koska nisäkässoluilla tehtävät in vitro -geenitoksisuustestit ovat riittävän standardoidut, testit, joissa käytetään käsittelyjä eksogeenisen metabolisen aktivaation kanssa tai ilman sitä, voidaan tehdä käyttäen vain yhtä positiivista kontrollia, joka vaatii metabolista aktivaatiota. Tässä tapauksessa tämä yksittäinen positiivinen kontrollivaste osoittaa sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän toiminnan että testausjärjestelmän herkkyyden. Kutakin positiivista kontrollia on käytettävä yhtenä tai useampana pitoisuutena, joiden voidaan odottaa aiheuttavan toistettavissa ja havaittavissa oleva lisääntyminen taustaan verrattuna. Näin voidaan osoittaa testausjärjestelmän herkkyys, ja tässä testimenetelmässä määritetyt raja-arvot ylittävä sytotoksisuustaso ei saa vaarantaa vasteen luotettavuutta (ks. 20 kohta).

Taulukko 1

Vertailuaineet, joita suositellaan laboratorion pätevyyden arvioimiseksi ja positiivisten kontrollien valintaan

Metabolinen aktivaatio	Lokus	Aine ja CAS-nro
Ei eksogeenista metabolista aktivaatiota	Hprt	Etyylimetaanisulfonaatti [CAS-nro 62-50-0] Etyylinitrosourea [CAS-nro 759-73-9] 4-nitrokinoliini-1-oksidi [CAS-nro 56-57-5]
	xprt	Streptonigriini [CAS-nro 3930-19-6] Mitomysiini C [CAS-nro 50-07-7]
Eksogeeninen metabolinen aktivaatio	Hprt	3-metyylikolantreeni [CAS-nro 56-49-5] 7,12-dimetyylibentsantraseeni [CAS-nro 57-97-6] Bentso[a]pyreeni [CAS-nro 50-32-8]
	xprt	Bentso[a]pyreeni (CAS-nro 50-32-8)

MENETTELY

Käsittely testikemikaalilla

25.

Lisääntyvät solut altistetaan testikemikaalille metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa ja ilman sitä. Altistusajan on oltava sopiva (asianmukainen aika on yleensä 3–6 tuntia).

26.

Jokaisessa testiviljelmässä (kontrolli ja altistus) kussakin testivaiheessa käytettävien solujen vähimmäismäärän tulee perustua spontaaniin mutaationopeuteen. Yleisohje on altistaa ja siirrostaa riittävästi soluja, jotta jokaisessa viljelmässä on testin jokaisessa vaiheessa 10 spontaanimutaatiota (17). Spontaani mutaationopeus on yleensä 5–20 × 10-6. Jotta spontaani mutaationopeus olisi 5 × 10-6 ja jotta spontaanimutaatioita olisi riittävästi (vähintään 10) myös niissä viljelmissä, jotka on altistettu pitoisuuksille, jotka aiheuttavat 90 prosentin sytotoksisuutta käsittelyn aikana (suhteellinen eloonjääneisyys 10 prosenttia), on käsiteltävä vähintään 20 × 106 solua. Lisäksi on viljeltävä riittävä määrä soluja (aina kuitenkin vähintään 2 miljoonaa) ilmentymisaikana, ja solut on maljattava mutanttien selektiota varten (17).

Fenotyypin ilmentymisaika ja mutaationopeuden mittaus

27.

Altistusjakson jälkeen solut viljellään mutanttifenotyypin ilmentymisen aikaansaamiseksi. Vähintään 7–9 päivää on yleensä riittävä, jotta hiljattain aiheutettujen Hprt- ja xprt-mutanttien fenotyypin ilmentyminen olisi lähellä optimaalista (43) (44). Tänä aikana soluja jatkoviljellään säännöllisesti, jotta niiden eksponentiaalinen kasvu jatkuisi. Fenotyypin ilmentymisen jälkeen solut maljataan uudelleen selektiivistä ainetta (6-tioguaniinia) sisältävään kasvatusliuokseen, jotta voidaan määrittää mutanttien määrä ja kloonaustehokkuus selektion aikana. Yksikerrosviljelyssä voidaan käyttää maljoja tai suspensiossa olevien solujen osalta mikrokuoppalevyjä. Mutanttien selektion yhteydessä solut on maljattava sellaiseen tiheyteen, että mutanttien talteenotto voidaan varmistaa (ts. välttää metabolinen yhteisvaikutus) (17). Levyjä inkuboidaan optimaalisen pesäkekasvun kannalta riittävän pitkä aika (esimerkiksi 7–12 päivää), minkä jälkeen pesäkkeet lasketaan. Mutaationopeus lasketaan mutanttipesäkkeiden lukumäärän perusteella mutanttien selektion aikaisella kloonaustehokkuudella korjattuna (ks. kaavat lisäyksestä 2).

Laboratorion pätevyys

28.

Jotta laboratoriolla voidaan todeta olevan riittävä kokemus testistä ennen sen käyttöä rutiinitestauksessa, laboratorion täytyy olla suorittanut useita kokeita positiivisilla vertailuaineilla, jotka vaikuttavat eri mekanismien välityksellä (ainakin yksi metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa ja yksi ilman sitä vaikuttava aine, jotka valitaan taulukossa 1 luetelluista aineista), sekä useita negatiivisia kontrolleja (erilaisia liuottimia/kantaja-aineita käyttäen). Näiden positiivisten ja negatiivisten kontrollien vasteiden olisi oltava yhdenmukaisia lähdekirjallisuuden kanssa. Tätä ei sovelleta laboratorioihin, joilla on kokemusta eli joista on 30–33 kohdassa määritelty laboratoriokohtainen tietokanta.

29.

Tiettyjä positiivisia kontrolliaineita (ks. 25 kohdassa oleva taulukko 1) on tutkittava ilman metabolista aktivaatiota ja sen läsnä ollessa, jotta osoitetaan pätevyys havaita mutageenisia kemikaaleja, määrittää metabolisen aktivaatiojärjestelmän tehokkuus ja osoittaa solujen käsittelyn aikaisten kasvuolosuhteiden, fenotyypin ilmentymisen, sekä mutanttien selektion asianmukaisuus ja laskentamenetelmien soveltuvuus. Valittujen aineiden eri pitoisuudet on valittava siten, että ne aiheuttavat toistettavissa olevia ja pitoisuuteen liittyviä lisääntymisiä taustaan verrattuna, koejärjestelmän herkkyyden ja dynaamisen alueen osoittamiseksi.

Aiemmat kontrollitiedot

30.

Laboratorion on määritettävä:

—	aikaisempien positiivisten kontrollien vaihteluväli ja jakauma

—	aiempien negatiivisten kontrollien (käsittelemättömien ja liuotinkontrollien) vaihteluväli ja jakauma.

31.

Kun ensimmäisen kerran saadaan tietoja aikaisemman negatiivisen kontrollin jakaumasta, samanaikaisten negatiivisten kontrollien pitäisi olla julkaistujen kontrollitietojen mukaisia (22). Kun kontrollin jakaumaan lisätään enemmän kokeellista tietoa, samanaikaisten negatiivisten kontrollien tulisi mieluiten sijoittua kyseisen jakauman 95 prosentin kontrollirajojen sisälle (17) (45) (46).

32.

Laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokanta on aluksi luotava vähintään 10 kokeella, mutta sen olisi mieluiten koostuttava vähintään 20 kokeesta, jotka on suoritettu vastaavissa testiolosuhteissa. Laboratorioiden on käytettävä laadunvalvontamenetelmiä, kuten valvontakortteja (esim. C-kortteja tai X-bar-kortteja (47)), positiivisten ja negatiivisten kontrollitietojensa vaihtelevuuden määrittämiseksi ja sen osoittamiseksi, että laboratorio ”hallitsee” menetelmän (46). Lisäsuosituksia aikaisempien tietojen muodostamisesta ja käytöstä (esimerkiksi perusteet tietojen sisällyttämiseksi aikaisempiin tietoihin tai jättämiseksi pois niistä sekä kokeiden hyväksymisperusteet) annetaan lähdekirjallisuudessa (45).

33.

Negatiivisten kontrollitietojen on koostuttava mutaationopeuksista yhdessä viljelmässä tai mieluiten rinnakkaisviljelmissä 23 kohdan mukaisesti. Samanaikaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokannan 95 prosentin kontrollirajojen sisälle (17) (45) (46). Jos samanaikaisia negatiivisia kontrolleja koskevat tiedot jäävät 95 prosentin kontrollirajojen ulkopuolelle, ne voidaan hyväksyä aikaisempien kontrollien jakaumaan edellyttäen, että ne eivät ole äärimmäisiä harha-arvoja ja on näyttöä siitä, että testijärjestelmä on ”hallinnassa” (ks. edellä) ja että kyse ei ole teknisestä tai inhimillisestä virheestä.

34.

Mahdollisissa koejärjestelyn muutoksissa on otettava huomioon järjestelyn yhdenmukaisuus laboratorion olemassa olevien aikaisempia kontrolleja koskevan tietokannan kanssa. Jos havaitaan merkittäviä epäjohdonmukaisuuksia, on luotava uusi aikaisempien kontrollien tietokanta.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten esittäminen

35.

Tulokset on esitettävä siten, että ne sisältävät kaikki sytotoksisuuden laskemiseen tarvittavat tiedot (suhteellisella eloonjääneisyydellä ilmaistuna). Sekä altistettuja että kontrolliviljelmiä koskevien tietojen on sisällettävä solujen lukumäärä altistuksen päättyessä, heti altistuksen jälkeen maljattujen solujen lukumäärä sekä pesäkkeiden lukumäärä (tai pesäkkeettömien kuoppien lukumäärä mikrokuoppalevymenetelmässä). Suhteellinen eloonjääneisyys on ilmaistava jokaisen viljelmän osalta prosenttiosuutena samanaikaiseen liuotinkontrolliin nähden (ks. määritelmät lisäyksestä 1).

36.

Tulokset on esitettävä siten, että ne sisältävät kaikki mutaationopeuden laskemiseen tarvittavat tiedot. Sekä altistettuja että kontrolliviljelmiä koskevien tietojen on sisällettävä 1) selektiivisen aineen kanssa ja ilman sitä maljattujen solujen lukumäärä (silloin, kun solut maljataan mutanttien selektiota varten) ja 2) laskettujen pesäkkeiden lukumäärä (tai pesäkkeettömien kuoppien lukumäärä mikrokuoppalevymenetelmässä) maljoista, joissa on tai ei ole selektiivistä ainetta. Mutaationopeus lasketaan mutanttipesäkkeiden lukumäärän perusteella (maljat, joissa on selektiivistä ainetta) kloonaustehokkuudella korjattuna (maljat, joissa ei ole selektiivistä ainetta). Mutaationopeus on ilmaistava mutanttien solujen lukumäärällä miljoonaa elinkykyistä solua kohti (ks. määritelmät lisäyksestä 1).

37.

Kustakin viljelmästä on esitettävä tiedot erikseen. Kaikista tiedoista on lisäksi esitettävä yhteenveto taulukkona.

Hyväksymisperusteet

38.

Testin hyväksymisperusteet ovat seuraavat:

—	Samanaikaisten negatiivisten kontrollien tietoja pidetään hyväksyttävinä lisättäviksi laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokantaan 33 kohdassa kuvatun mukaisesti.

—	Samanaikaisten positiivisten kontrollien (ks. 24 kohta) on aiheutettava vasteita, jotka ovat yhteensopivia aikaisempien positiivisten kontrollien tietokannan vasteiden kanssa ja tuotettava tilastollisesti merkittävä lisääntyminen verrattuna samanaikaiseen negatiiviseen kontrolliin.

—	Testissä käytettiin kahdenlaisia testiolosuhteita (ts. metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä, ellei ensimmäinen niistä tuottanut positiivisia tuloksia (ks. 25 kohta).

—	Riittävä määrä soluja ja pitoisuuksia on analysoitavissa (25, 26 ja 19 kohta).

—	Suurimman pitoisuuden valintaperusteet vastaavat 20, 21 ja 22 kohdassa kuvattuja perusteita.

Tulosten arviointi ja tulkinta

39.

Mikäli kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaali katsotaan selvästi positiiviseksi, jos jossakin tarkastelluista testiolosuhteista:

—	vähintään yksi testipitoisuuksista aiheuttaa tilastollisesti merkitsevää kasvua verrattuna rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin

—	kasvu riippuu pitoisuudesta, kun sitä arvioidaan asianmukaisella trenditestillä

—	mikä tahansa tuloksista on aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman ulkopuolella (esimerkiksi Poissonin jakaumaan perustuva 95 prosentin kontrolliraja; ks. 33 kohta).

Kun kaikki nämä perusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan voivan aiheuttaa geenimutaatioita viljellyissä nisäkässoluissa tässä testijärjestelmässä. Lähdekirjallisuudessa on suosituksia sopivimmista tilastomenetelmistä (46) (48).

40.

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi negatiivinen, jos kaikissa tutkituissa testiolosuhteissa:

—	mikään testipitoisuuksista ei aiheuta tilastollisesti merkitsevää kasvua verrattuna samanaikaiseen negatiiviseen kontrolliin

—	pitoisuudesta riippuvaa kasvua ei esiinny asianmukaisella trenditestillä arvioituna

—	kaikki tulokset ovat aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman rajoissa (esimerkiksi Poissonin jakaumaan perustuva 95 prosentin kontrolliraja; ks. 33 kohta).

Tällöin katsotaan, ettei testikemikaali voi aiheuttaa geenimutaatioita viljellyissä nisäkässoluissa tässä testijärjestelmässä.

41.

Selvästi positiivista tai negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.

42.

Jos vaste ei ole selvästi negatiivinen eikä selvästi positiivinen edellä kuvatulla tavalla tai tuloksen biologisen merkityksellisyyden vahvistaminen kaipaa tukea, tietoja tulee arvioida asiantuntija-arvion ja /tai lisätutkimusten avulla. Kokeen toistaminen käyttäen mahdollisesti modifioituja testiolosuhteita (esimerkiksi pitoisuusvälit, muut metaboliset aktivaatiojärjestelmät [kuten S9-jakeen pitoisuus tai alkuperä]) saattaa olla hyödyllistä.

43.

Harvoissa tapauksissa edes lisätutkimusten pohjalta ei voida päätellä, että testikemikaali tuottaa positiivisia tai negatiivisia tuloksia. Tällöin testikemikaalin vaste jää epäselväksi (sen tulkitaan olevan yhtä todennäköisesti positiivinen tai negatiivinen).

Testiraportti

44.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

Testikemikaali:

—	alkuperä, eränumero, viimeinen käyttöpäivä, jos sellainen on

—	itse testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa

—	tutkittavan kemikaalin liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa, jos tiedossa

—	tarvittaessa pH-arvon mittaus, osmolaliteetin ja saostumisen mittaus kasvatusliuoksessa, johon testikemikaalia lisättiin.

Yhdestä ainesosasta koostuva aine:

—	ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut merkitykselliset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

—	kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa epäpuhtauksien kemialliset tunnistetiedot sen mukaan, mikä on käytännössä mahdollista, jne.

Useista ainesosista koostuvat aineet, koostumukseltaan tuntemattomat tai vaihtelevat aineet ja seokset:

—	luonnehditaan mahdollisimman tarkoin ainesosien kemiallinen koostumuksen (ks. edellä), esiintymistiheyden ja merkityksellisten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla.

Liuotin:

—	liuottimen valintaperusteet

—	liuottimen pitoisuus lopullisessa kasvatusliuoksessa.

Solut:

Laboratorion kantaviljelmät:

—	solulinjojen tyyppi ja lähde

—	siirrostusten lukumäärä, jos saatavilla, ja taustatiedot laboratoriossa

—	karyotyypin ominaisuudet ja/tai kromosomien modaalinen lukumäärä

—	soluviljelmien ylläpitomenetelmät

—	mykoplasman puuttuminen

—	solujen kaksinkertaistumisajat.

Testiolosuhteet:

—	pitoisuuksien ja viljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin sisältyvät esimerkiksi sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset

—	kasvatusliuosten koostumus, hiilidioksidipitoisuus, kosteustaso

—	testikemikaalin pitoisuus ilmaistuna lopullisena pitoisuutena kasvatusliuoksessa (esim. μg tai mg/ml tai mM kasvatusliuoksessa)

—	kasvatusliuokseen lisätyn liuottimen ja testikemikaalin pitoisuus (ja/tai tilavuus)

—	inkubointilämpötila

—	inkubointiaika

—	altistuksen kesto

—	solutiheys altistuksen aikana

—	metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus (S9-jakeen alkuperä, S9-seoksen valmistusmenetelmä, S9-seoksen ja S9-jakeen pitoisuus tai tilavuus lopullisessa kasvatusliuoksessa, S9-jakeen laadunvalvonta)

—	positiiviset ja negatiiviset kontrolliaineet, kunkin käsittelyolosuhteen lopulliset pitoisuudet

—	ilmentymisajan pituus (myös kylvettyjen solujen lukumäärä sekä jatkoviljelmät ja kasvatusliuoksen vaihtoajat tarvittaessa)

—	selektiivisen aineen tunnistetiedot ja sen pitoisuus

—	testien hyväksymisperusteet

—	elinkykyisten ja mutanttien solujen laskentamenetelmät

—	sytotoksisuuden mittauksessa käytetyt menetelmät

—	muut sytotoksisuuteen ja käytettyyn menetelmään liittyvät tiedot

—	inkubointiaikojen kesto maljauksen jälkeen

—	tutkimusten positiivisuuden, negatiivisuuden tai epäselvyyden arviointiperusteet

—	pH:n, osmolaliteetin ja saostumisen määritysmenetelmät.

Tulokset:

—	altistettujen solujen lukumäärä ja jokaisesta viljelmästä jatkoviljeltyjen solujen lukumäärä

—	sytotoksisuusmittaukset ja mahdolliset muut havainnot

—	saostumisen merkit ja määrittämisajankohta

—	selektiiviseen ja ei-selektiiviseen kasvatusliuokseen maljattujen solujen lukumäärä

—	ei-selektiivisessä kasvatusliuoksessa olevien pesäkkeiden lukumäärä ja selektiivisessä kasvatusliuoksessa olevien resistenttien pesäkkeiden lukumäärä ja niihin liittyvät mutaationopeudet

—	pitoisuus-vastesuhde, jos mahdollista

—	samanaikaisten negatiivisten (liuotin) ja positiivisten kontrollien tiedot (pitoisuudet ja liuottimet)

—	aiemmat negatiivisten (liuotin) ja positiivisten kontrollien tiedot, vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat sekä luottamusväli (esimerkiksi 95 prosenttia) ja tietojen määrä

—	tilastoanalyysit (yksittäisistä viljelmistä ja yhdistetyistä rinnakkaisviljelmistä, jos tarpeen) sekä mahdolliset p-arvot.

Tulosten tarkastelu

Päätelmät

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)	OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)	Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3)	Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306–1312.

(4)	Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394–403.

(5)	Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121–128.

(6)	Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, 235-239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17–36.

(8)	Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147–204.

(9)	Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297–305.

(10)	Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789–886.

(11)	Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439–452.

(12)	Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177–183.

(13)	Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14)	Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O'Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135–141.

(15)	Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9–17.

(16)	Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133–147.

(17)	Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. Teoksessa: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, s. 66–101.

(18)	Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193–214.

(19)	Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165–175.

(20)	Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411–1415.

(21)	Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Tekeillä oleva käsikirjoitus.)

(23)	Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261–287.

(24)	Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299–305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83–90.

(26)	Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365–373.

(27)	Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347–364.

(28)	Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)	Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175–177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. Teoksessa: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (eds.), Elsevier, North-Holland, s. 85–88.

(31)	Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55–65.

(32)	Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51–59.

(33)	UNEP. (2001). Pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskeva Tukholman yleissopimus, Yhdistyneiden kansakuntien ympäristöohjelma (UNEP). Saatavana osoitteessa [http://www.pops.int.html].

(34)	Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147–156.

(35)	O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7–18.

(36)	Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation., 4, 7–18.

(37)	Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. Teoksessa: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91–103.

(38)	Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen., 5, 795–801.

(39)	OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (testiohjeet 473, 476 ja 487). Saatavana OECD:stä pyynnöstä.

(40)	Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation., 54, 36–43.

(41)	EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42)	USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Saatavana osoitteessa [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)	O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109–118.

(44)	Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121–8.

(45)	Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87–90.

(46)	OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(47)	Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. Teoksessa: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141–154.

(48)	Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

Lisäys 1

MÄÄRITELMÄT

Emäsparien korvautumista aiheuttavat mutageenit: Kemikaaleja, jotka aiheuttavat emäsparien korvautumisen DNA:ssa.

Kemikaali: Aine tai seos.

Kloonaustehokkuus: Niiden harvakseltaan maljattujen solujen prosentuaalinen osuus, jotka pystyvät kasvamaan pesäkkeeksi, joka voidaan laskea.

Pitoisuudet: Testikemikaalin lopulliset pitoisuudet kasvatusliuoksessa

Sytotoksisuus: Tämän testimenetelmän mukaisissa analyyseissä sytotoksisuus määritetään aineelle altistettujen solujen suhteellisen eloonjääneisyyden pienentymisenä verrattuna negatiiviseen kontrolliin (ks. tätä koskeva kohta).

Forward-mutaatio: Geenin mutaatio parentaalisesta tyypistä mutanttimuotoon, minkä seurauksena geenin koodittama valkuaisaine menettää entsymaattisen aktiivisuutensa tai sen entsyymiaktiivisuus muuttuu.

Lukukehyksensiirtomutageenit: Kemikaaleja, jotka aiheuttavat yhden tai useamman emäsparin ylimäärän tai vajauksen DNA-molekyylissä.

Genotoksinen: Yleinen nimitys kaikentyyppisille DNA- tai kromosomivaurioille, muun muassa DNA:n katkeamiselle, addukteille, uudelleenjärjestäytymiselle, mutaatioille, kromosomipoikkeavuuksille ja aneuploidialle. Kaikki genotoksiset vaikutukset eivät johda mutaatioihin tai pysyviin kromosomivaurioihin.

HAT-liuos: Hypoksantiinia, aminopteriinia ja tymidiiniä sisältävä liuos, jota käytetään Hprt-mutanttien puhdistukseen.

Mitoottinen rekombinaatio: Mitoosin aikana tapahtuva kahden homologisen kromatidin rekombinaatio, joka voi saada aikaan DNA:n kahden säikeen katkeamisen tai heterotsygoottisuuden häviämisen.

MPA-liuos: Ksantiinia, adeniinia, tymidiiniä, aminopteriinia ja mykofenolihappoa sisältävä liuos, jota käytetään Xprt-mutanttien puhdistukseen.

Mutageeninen: Aiheuttaa periytyvän muutoksen geenien DNA:n emäsparirakenteessa (-rakenteissa) tai kromosomirakenteessa (kromosomipoikkeavuudet).

Mutaationopeus: Selektiiviselle alustalle maljatuista soluista todettujen mutanttipesäkkeiden lukumäärä korjattuna selektion aikaisella kloonaustehokkuudella (tai elinkykyisyydellä).

Fenotyypin ilmentymisaika: Altistuksen jälkeinen aika, jona geneettinen muutos kiinnittyy genomiin ja mahdolliset aikaisemmat geenituotteet poistuvat siten, että fenotyyppinen ominaisuus muuttuu.

Suhteellinen eloonjääneisyys: Suhteellista eloonjääneisyyttä käytetään altistukseen liittyvän sytotoksisuuden mittarina. Suhteellinen eloonjääneisyys on maljattujen solujen kloonaustehokkuus heti altistuksen jälkeen mahdolliseen altistuksen aikaiseen solukatoon mukautettuna ja verrattuna negatiivisten kontrollien kloonaustehokkuuteen (joille määritetty eloonjääneisyys on 100 %).

Maksasta eristetty S9-jae: Maksahomogenaatin supernatantti 9 000 g:n sentrifugoinnin jälkeen, ts. käsittelemätön maksanäyte.

S9-seos: Maksasta eristetyn S9-jakeen ja metabolisen entsyymitoiminnan kannalta välttämättömien kofaktorien seos.

Liuotinkontrolli: Yleinen nimitys kontrolliviljelmille, joihin lisätään vain testikemikaalin liuottamiseen käytettyä liuotinta.

Testikemikaali: Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Käsittelemätön kontrolli: Soluviljelmät, joita ei altisteta (eli joihin ei lisätä testikemikaalia eikä liuotinta), mutta jotka käsitellään samanaikaisesti samalla tavoin kuin testikemikaalia saavat soluviljelmät.

UVCB-aine: Koostumukseltaan tuntematon tai vaihteleva aine, kompleksi reaktiotuote tai biologinen materiaali

Lisäys 2

KAAVAT SYTOTOKSISUUDEN JA MUTAATIONOPEUDEN MÄÄRITYSTÄ VARTEN

Sytotoksisuus määritetään suhteellisena eloonjääneisyytenä eli maljattujen solujen kloonaustehokkuudella heti altistuksen jälkeen mahdolliseen altistuksen aikaiseen solukatoon mukautettuna ja verrattuna negatiivisten kontrollien mukautettuun kloonaustehokkuuteen (joille määritetty eloonjääneisyys on 100 %) (ks. suhteellisen eloonjääneisyyden kaava jäljempänä).

Testikemikaalille altistetun viljelmän mukautettu kloonaustehokkuus lasketaan näin:

Formula

Testikemikaalille altistetun viljelmän suhteellinen eloonjääneisyys lasketaan näin:

Formula

Mutaationopeus on selektiivisessä kasvatusliuoksessa todettujen mutanttipesäkkeiden kloonaustehokkuus jaettuna ei-selektiivisellä kasvatusliuoksessa todettujen pesäkkeiden kloonaustehokkuudella samassa viljelmässä selektion aikana.

Formula

Kun kloonaustehokkuuden määrittämisessä käytetään maljoja:

Kloonaustehokkuus (CE) = pesäkkeiden lukumäärä / maljattujen solujen lukumäärä.

Kun kloonaustehokkuuden määrittämisessä käytetään mikrokuoppalevyjä:

Pesäkkeiden lukumäärä kuoppaa kohti mikrokuoppalevyissä noudattaa Poissonin jakaumaa.

Kloonaustehokkuus = -LnP(0) / maljattujen solujen lukumäärä kuoppaa kohti

Tässä kaavassa -LnP(0) on tyhjien kuoppien todennäköinen lukumäärä kylvetyistä kuopista, ja sitä kuvataan seuraavalla kaavalla:

LnP(0)= -Ln (tyhjien kuoppien lukumäärä / maljattujen kuoppien lukumäärä)

”

Korvataan B osassa oleva B.22 luku seuraavasti:

”B.22 DOMINOIVA LETAALITESTI JYRSIJÖILLÄ

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 478 (2016). Testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvoinnin vuoksi. Tämä muokattu versio testimenetelmästä perustuu yli 30 vuoden kokemukseen tästä testistä ja mahdollisuuteen liittää tai yhdistää tämä testi muihin toksisuustesteihin, joita ovat esimerkiksi kehitys-, lisääntymis- tai genotoksisuustutkimukset. Koska tällä testillä on rajoituksensa ja koska siinä pitää käyttää paljon koe-eläimiä, sitä ei ole tarkoitettu käytettäväksi ensisijaisena menetelmänä vaan pikemminkin täydentävänä testimenetelmänä, jota voidaan käyttää vain, jos sille ei ole vaihtoehtoa sääntelyvaatimusten kannalta. Kun toksisuustestejä yhdistetään, suuret määrät koe-eläimiä välttyvät toksisuustesteissä käyttämiseltä. OECD on laatinut asiakirjan (1), joka sisältää yhteenvedon geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsauksen näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin.

Dominoivan letaalitestin tarkoituksena on tutkia, tuottavatko kemikaalit mutaatioita, jotka johtuvat itusolujen kromosomipoikkeavuuksista. Lisäksi dominoiva letaalitesti on erityisen relevantti genotoksisuuden arvioinnissa, koska vaikka lajien välillä voi olla vaihtelua, in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin liittyvät tekijät ovat aktiivisia ja voivat vaikuttaa vasteisiin. Kun testikemikaalille altistus aiheuttaa dominoivia letaalimutaatioita, on syytä olettaa, että kemikaalilla on testattavan lajin sukusoluihin kohdistuvia vaikutuksia.

Dominoivat letaalimutaatiot aiheuttavat alkio- tai sikiökuolemia. Kun testikemikaalille altistus aiheuttaa dominoivia letaalimutaatioita, on syytä olettaa, että kemikaalilla on testattavan lajin itusoluihin kohdistuvia vaikutuksia.

Dominoiva letaalitesti on hyödyllinen, kun täytyy vahvistaa positiiviset tulokset testeistä, joissa on käytetty somaattisia in vivo -päätetapahtumia, ja se on myös merkityksellinen päätetapahtuma ihmisiin kohdistuvien vaarojen ja itulinjan kautta välittyvien geneettisten sairauksien riskin ennustamisessa. Tässä testissä pitää kuitenkin käyttää paljon koe-eläimiä, ja se vaatii myös paljon työvoimaa. Näin ollen testin tekeminen on hyvin kallista ja aikaa vievää. Koska dominoivien letaalimutaatioiden spontaani esiintymistaajuus on melko korkea, testin herkkyys havaita mutaationopeuden pientä lisääntymistä on yleisesti rajallinen.

Keskeisten termien määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Testi tehdään useimmiten hiirillä (2) (3) (4) mutta myös muut lajit, kuten rotta (5) (6) (7) (8), voivat olla toisinaan asianmukaisia, jos niiden käyttö on tieteellisesti perusteltua. Dominoivat letaalivaikutukset johtuvat yleensä merkittävistä kromosomipoikkeavuuksista (rakenteelliset ja numeeriset poikkeavuudet) (9) (10) (11), mutta geenimutaatioitakaan ei voida sulkea pois. Dominoiva letaalimutaatio on sellainen mutaatio, jota esiintyy pelkästään itusolussa, tai sellainen, joka kehittyy varhaisvaiheen alkiossa hedelmöittymisen jälkeen mutta ei aiheuta sukusolun toimintahäiriöitä vaan on letaali hedelmöittyneelle munasolulle tai kehittyvälle alkiolle.

Yksittäiset urokset pariutetaan peräkkäin astuttamattomien naaraiden kanssa määräajoin. Altistuksen jälkeisten parittelujen lukumäärä määräytyy dominoivan letaalitutkimuksen perimmäisen tavoitteen mukaan (23 kohta), ja sillä on määrä varmistaa, että dominoivat letaalivaikutukset arvioidaan uroksen itusolujen kaikissa kypsymisvaiheissa (12).

Jos on näyttöä siitä, että testikemikaali tai sen metaboliitti (metaboliitit) ei(vät) pääse kiveksiin, tätä testiä ei pidä käyttää.

TESTIN PERIAATE

Tässä testissä altistetaan yleensä urokset testikemikaalille asianmukaista reittiä pitkin ja pariutetaan ne altistamattomien ja astuttamattomien naaraiden kanssa. Erityyppisiä itusoluja voidaan testata jaksottamalla paritteluvälit. Parittelun jälkeen naaraat lopetetaan jonkin ajan kuluttua, ja niiden kohdut tutkitaan, jotta voidaan laskea kiinnittyneiden sekä elävien ja kuolleiden alkioiden lukumäärä. Testikemikaalin dominoiva letaalisuus määritetään vertaamalla, montako elävää kiinnittynyttä alkiota kullakin testiryhmän naaraalla on kantaja-aine-/liuotinkontrolliryhmän kunkin naaraan eläviin kiinnittyneisiin eläviin alkioihin nähden. Kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden lisääntyminen testiryhmän naarasta kohden verrattuna kontrolliryhmän naaraisiin kertoo siitä, että testikemikaali aiheuttaa alkiokuolemia kiinnittymisen jälkeen. Kiinnittymisen jälkeiset alkiokuolemat lasketaan määrittämällä kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden osuus kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärästä testiryhmässä ja vertaamalla sitä vastaavaan osuuteen kontrolliryhmässä. Ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat voidaan arvioida laskemalla munasarjojen keltarauhaset, joista vähennetään kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärä tai kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärä naarasta kohden testiryhmässä ja kontrolliryhmässä.

LABORATORIOIDEN PÄTEVYYDEN VARMISTAMINEN

10.

Laboratorion on todistettava tätä testiä koskeva pätevyytensä osoittamalla, että se pystyy tuottamaan dominoivien letaalivaikutusten esiintymistaajuuksia julkaistuista tiedoista (esimerkiksi (13) (14) (15) (16) (17) (18)) positiivisilla kontrolliaineilla (heikot vasteet mukaan luettuina), esimerkiksi niillä, jotka on lueteltu taulukossa 1, ja kantaja-ainekontrolleilla, ja negatiivisten kontrollien esiintymistaajuuksia, joita koskevien tietojen vaihteluväli on johdonmukaisesti hyväksyttävä (ks. viitteet edellä) tai laboratorion aiemman kontrollien jakauman mukainen, jos se on saatavilla.

MENETELMÄN KUVAUS

Testin valmistelu

Eläinlajin valinta

11.

Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia terveitä sukukypsiä eläimiä. Yleensä käytetään hiiriä, mutta myös rotat voivat olla sopivia. Kaikkia muita sopivia nisäkäslajeja voidaan käyttää, jos raportissa esitetään sille tieteellinen perustelu.

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

12.

Jyrsijöiden kohdalla koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden olisi mieluiten oltava 50–60 prosenttia, sen olisi oltava ainakin 40 prosenttia eikä mielellään yli 70 prosenttia muulloin kuin tilan puhdistuksen aikana. Huoneessa täytyy käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon valintaan voi vaikuttaa se, miten siihen voidaan sekoittaa sopiva määrä testikemikaalia, kun sitä annetaan tätä reittiä. Ennen altistusta tai parittelua jyrsijät on sijoitettava samaa sukupuolta edustaviin pienryhmiin (enintään viisi eläintä), ellei aggressiivista käyttäytymistä ole odotettavissa tai havaittu, mieluiten kiinteisiin häkkeihin, joissa on asianmukainen virikkeellinen ympäristö. Eläimet voivat olla häkissä yksittäin, jos tämä on tieteellisesti perusteltua.

Eläinten valmistelu

13.

Terveet, sukukypsät ja täysikasvuiset uros- ja naaraseläimet jaetaan satunnaisesti testi- ja kontrolliryhmiin. Eläimet merkitään yksilöllisesti inhimillisellä, mahdollisimman vähän invasiivisella toimenpiteellä (esimerkiksi rengastamalla, korvamerkillä, mikrosirulla tai biometrisellä tunnisteella, mutta ei varpaita tai korvia leikkaamalla), ja niitä sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Ristikontaminaatiota positiivisella kontrollilla ja testikemikaalilla tulisi välttää. Tutkimuksen alkaessa eläinten painonvaihtelun on oltava vähäistä, ja se saa vaihdella korkeintaan ± 20 prosenttia kummankin sukupuolen keskimääräisestä painosta.

Annosten valmistelu

14.

Kiinteät testikemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan asianmukaisiin liuottimiin tai kantaja-aineisiin taikka lisätään ravintoon tai juomaveteen, ennen kuin ne annetaan koe-eläimille. Nestemäiset testikemikaalit voidaan antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Testikemikaaleja voidaan antaa hengitysteiden kautta tapahtuvan altistamisen osalta kaasuna, höyrynä tai kiinteänä/nestemäisenä aerosolina niiden fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan. Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä ja asianmukaiset säilytysolosuhteet on määritetty.

Testiolosuhteet

Liuotin/kantaja-aine

15.

Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdollisista kemiallisista reaktioista tutkittavan kemikaalin kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Ensisijaisesti on harkittava vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä, mikäli mahdollista. Esimerkkejä yleisesti käytetyistä yhteensopivista liuottimista/kantaja-aineista ovat vesi, fysiologinen suolaliuos, metyyliselluloosaliuos, natriumkarboksimetyyliselluloosaliuos, oliiviöljy ja maissiöljy.

Positiiviset kontrollit

16.

Samanaikaisia positiivisia kontrollieläimiä on käytettävä aina, ellei laboratorio ole osoittanut pätevyyttään testin tekemisessä ja ellei se ole käyttänyt testiä rutiininomaisesti viime aikoina (esimerkiksi viiden viime vuoden aikana). Positiivisia kontrollieläimiä ei kuitenkaan tarvitse altistaa samaa reittiä kuin testikemikaalia saavia eläimiä, eikä näytteitä tarvitse ottaa kaikilta parittelujaksoilta. Positiivisten kontrolliaineiden on tiedettävä tuottavan dominoivia letaalivaikutuksia testissä käytetyissä olosuhteissa. Altistusta lukuun ottamatta kontrolliryhmän eläimiä on käsiteltävä samalla tavoin kuin testiryhmien eläimiä.

17.

Positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että ne tuottavat lieviä tai kohtalaisia vaikutuksia, jotta testin tehokkuutta ja herkkyyttä voidaan arvioida kriittisesti, mutta annosten on kuitenkin tuotettava jatkuvasti positiivisia dominoivia letaalivaikutuksia. Taulukossa 1 on esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista ja asianmukaisista annoksista.

Taulukko 1

Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista

Aine [CAS-numero] (viitenumero)	Vaikuttavan annoksen vaihteluväli (mg/kg) (jyrsijälajit)	Antoaika (päivää)
Trietyleenimelamiini [51-18-3] (15)	0,25 (hiiret)	1
Syklofosfamidi [50-18-0] (19)	50–150 (hiiret)	5
Syklofosfamidi [50-18-0] (5)	25–100 (rotat)	1
Etyylimetaanisulfonaatti [62-50-0] (13)	100–300 (hiiret)	5
Monomeerinen akryyliamidi [79-06-1] (17)	50 (hiiret)	5
Klorambusiili [305-03-3] (14)	25 (hiiret)	1

Negatiiviset kontrollit

18.

Negatiivisia kontrollieläimiä, joille annetaan pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta ja joita käsitellään muuten samalla tavalla kuin testiryhmiä, on sisällytettävä kuhunkin näytteenottokertaan (20). Jos käytettävissä ei ole aikaisempia tai julkaistuja kontrollitietoja, joissa osoitetaan, että valittu liuotin/kantaja-aine ei aiheuta dominoivia letaalivaikutuksia tai muita haitallisia vaikutuksia, kullakin näytteenottokerralla olisi käytettävä myös altistamattomia kontrollieläimiä, jotta kantaja-ainekontrollin hyväksyttävyys voidaan todeta.

MENETTELY

Eläinten lukumäärä

19.

Yksittäiset urokset pariutetaan peräkkäin mieluiten yhden astuttamattoman naaraan kanssa määräajoin (esimerkiksi viikon välein, ks. 21 ja 23 kohta). On huolehdittava etukäteen siitä, että kussakin ryhmässä on riittävästi uroksia (kullakin parittelujaksolla astutettujen naaraiden määrään nähden), jotta saadaan aikaan tarvittava tilastollinen voima vähintään dominoivien letaalivaikutusten esiintymistiheyden kaksinkertaistumisen havaitsemiseksi (44 kohta).

20.

Myös naaraiden määrä yhtä parittelujaksoa kohti on määritettävä etukäteen tilastollista voimaa koskevilla laskelmilla, jotta voidaan havaita vähintään dominoivien letaalivaikutusten esiintymistiheyden kaksinkertaistuminen (ts. riittävästi tiineitä naaraita, jotka tuottavat yhteensä vähintään 400 kiinnittynyttä alkiota) (20) (21) (22) (23) ja jotta odotettavissa on vähintään yksi kuollut kiinnittynyt alkio analyysiyksikköä (ts. annoskohtaista pariutumisryhmää) kohti (24).

Altistusjakso ja parittelujaksot

21.

Altistusohjelma määrää altistamisen jälkeisten parittelujaksojen määrän. Paritteluja olisi oltava niin monta, että kaikista uroksen itusolun kypsymisvaiheista voidaan arvioida dominoivien letaalivaikutusten aiheutuminen (12) (25). Yhdessä altistuksessa, jossa annetaan enintään viisi annosta päivässä, on oltava 8 (hiiret) tai 10 (rotat) parittelua viikon välein viimeisen altistuksen jälkeen. Jos testissä annetaan useampia annoksia, parittelujaksojen määrää voidaan vähentää altistusajan pitenemisen mukaan. Tavoitteena tulee kuitenkin olla kaikkien spermatogeneesin vaiheiden arviointi (esimerkiksi 28 vuorokauden altistuksen jälkeen vain neljä parittelua viikossa riittää, jotta voidaan arvioida hiiren spermatogeneesin kaikki vaiheet). Kaikki altistus- ja parittelusuunnitelmat on perusteltava tieteellisesti.

22.

Naaraita on pidettävä urosten luona vähintään yhden kiimakierron ajan (yksi kiimakierto kestää sekä hiirillä että rotilla yhden viikon). Naaraita, jotka eivät paritelleet viikon parittelujaksolla, voidaan käyttää seuraavalla parittelujaksolla tai siihen saakka, kunnes parittelun on todettu tapahtuneen emättimessä esiintyvän sperman tai emätintulpan perusteella.

23.

Altistus- ja paritteluohjelma on suunniteltava dominoivia letaalivaikutuksia koskevan tutkimuksen perimmäisen tavoitteen mukaan. Jos tavoitteena on selvittää, aiheuttaako tietty kemikaali dominoivia letaalimutaatioita, hyväksyttävä menetelmä olisi altistaa yksi spermatogeneesikierto kokonaan (ts. hiirellä 7 viikkoa, 5–7 altistusta viikossa) ja antaa eläimen paritella vasta kierron lopussa. Mutta jos tavoitteena on selvittää, minkä tyyppinen itusolu on herkkä dominoivien letaalivaikutusten aikaansaamiselle, ensisijainen menetelmä on yhden tai viiden päivän altistus ja viikoittainen parittelu.

Annostasot

24.

Jos tehdään alustava annoksenmääritystutkimus, koska sopivia tietoja ei ole vielä käytettävissä opastamaan annoksen valinnassa, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa (26). Tutkimuksessa on pyrittävä määrittämään suurin siedetty annos. Sillä tarkoitetaan suurinta annosta, jota siedetään ilman näyttöä tutkimusta rajoittavasta toksisuudesta tutkimuksen kestoon nähden (esimerkiksi annos, joka aiheuttaa poikkeavaa käyttäytymistä tai poikkeavia reaktioita, vähäistä painonlaskua tai verta muodostavan kudoksen sytotoksisuutta), mutta joka ei aiheuta kuolemaa eikä sellaista kipua, tuskaa tai kärsimystä, jonka vuoksi eläin olisi lopetettava inhimillisesti (27).

25.

Suurin siedetty annos ei myöskään saa haitata parittelun onnistumista (21).

26.

Testikemikaalit, joilla on tiettyjä biologisia vaikutuksia pieninä myrkyttöminä annoksina (kuten hormonit ja mitogeenit), ja kemikaalit, joissa esiintyy toksikokineettisten ominaisuuksien saturaatiota, voivat olla annoksen määrittämistä koskevien kriteerien osalta poikkeustapauksia, ja niitä on arvioitava tapauskohtaisesti.

27.

Jotta saadaan annosvastetiedot, täydelliseen tutkimukseen on sisällyttävä negatiivinen kontrolliryhmä ja vähintään kolme annostasoa, jotka yleensä erotetaan kertoimella 2 mutta enintään kertoimella 4. Jos testikemikaali ei aiheuta toksisuutta annoksenmääritystutkimuksessa tai olemassa olevien tietojen perusteella, suurin kerta-annos pitäisi olla 2 000 mg/painokilo. Jos testikemikaali aiheuttaa toksisuutta, suurimman siedetyn annoksen pitäisi olla suurin annettava annos, ja käytettävien annostasojen olisi mieluiten katettava vaihteluväli maksimista annokseen, joka aiheuttaa vain vähän tai ei lainkaan toksisuutta. Myrkyttömien kemikaalien yhteydessä vähintään 14 päivän mittaisen altistusjakson raja-annos on 1 000 mg painokiloa kohti päivässä. Jos altistusjakso on vähemmän kuin 14 päivää, raja-annos on 2 000 mg painokiloa kohti päivässä.

Antotapa

28.

Testin suunnittelussa on otettava huomioon oletettu ihmisen altistusreitti. Siksi altistusreitiksi voidaan perustellusti valita esimerkiksi ravinto tai juomavesi, ihonalainen, suonensisäinen tai topikaalinen reitti, altistus hengitysteitse tai oraalisesti (letkuruokinnalla) taikka implantaatio. Joka tapauksessa reitti on valittava siten, että voidaan varmistaa kohdekudosten riittävä altistus. Intraperitoneaalista injektiota ei yleensä suositella, koska sitä ei ole tarkoitettu ihmisen altistumisreitiksi, ja sitä tulisi käyttää vain erityisten tieteellisien perusteiden nojalla. Jos testikemikaali sekoitetaan ravintoon tai juomaveteen, varsinkin jos kyse on kerta-annoksesta, on huolehdittava siitä, että viive ravinnon ja veden saannin ja parittelun välillä on riittävä, jotta vaikutukset voidaan havaita (31 kohta). Se, kuinka paljon nestettä voidaan enintään antaa kerralla ruokintaletkun kautta tai injektiona, määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Yleensä määrä saa olla enintään 1 ml/100 g painoa. Poikkeuksena ovat vesiliuokset, joita käytettäessä enimmäismäärä voi olla 2 ml/100 g. Tätä suurempien määrien käyttö (jos eläinsuojelulainsäädäntö sen sallii) on perusteltava. Testitilavuuden vaihtelu on minimoitava muuttamalla pitoisuutta, jotta varmistetaan, että tilavuus on painoon nähden sama kaikilla annostasoilla.

Havainnot

29.

Koe-eläimistä tulee tehdä yleisiä kliinisiä havaintoja ja niiden kliinisiä oireita tulee kirjata vähintään kerran päivässä, mieluiten samaan aikaan joka päivä, ja tässä on otettava huomioon, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Kaikkien eläinten sairastuvuutta ja kuolleisuutta on havainnoitava vähintään kahdesti vuorokaudessa annostelun aikana. Eläimet on punnittava tutkimuksen alussa ja vähintään kerran viikossa toistuvan annoksen tutkimuksissa, ja eläinten lopetuksen yhteydessä. Ravinnon kulutus olisi mitattava ainakin kerran viikossa. Jos testikemikaalia annostellaan juomaveteen, veden kulutus on mitattava veden vaihdon yhteydessä tai vähintään kerran viikossa. Eläimet, joilla ilmenee ei-letaaleja merkkejä liiallisesta toksisuudesta, olisi lopetettava ennen tutkimusjakson päättymistä (27).

Kudosnäytteet ja niiden käsittely

30.

Naaraat lopetetaan tiineyden toisella puoliskolla, hiiret tiineyspäivänä 13 ja rotat tiineyspäivänä 14 tai 15. Niiden kohdut tutkitaan dominoivien letaalivaikutusten osalta kiinnittyneiden alkioiden, elävien ja kuolleiden alkioiden ja keltarauhasten määrän selvittämiseksi.

31.

Kohdunsarvet ja munasarjat avataan keltarauhasten laskemiseksi, ja sikiöt poistetaan, lasketaan ja punnitaan. Kohdusta on tutkittava huolellisesti myös mahdolliset elävien sikiöiden peittämät resorptiot, ja on varmistettava, että kaikki resorptiot lasketaan. Sikiökuolleisuus kirjataan. Myös hedelmöittyneiden naaraiden ja kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärä, ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat ja kiinnittymisen jälkeinen kuolleisuus (sekä varhain että myöhemmin tapahtuneet resorptiot) kirjataan. Lisäksi näkyvissä olevat sikiöt voidaan säilöä Bouinin fiksatiiviin vähintään kahden viikon ajaksi, jonka jälkeen ne tutkitaan selvien ulkoisten epämuodostumien varalta (28). Näin saadaan lisätietoa testiaineen vaikutuksista lisääntymiseen ja kehitykseen.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten käsittely

32.

Tulokset esitetään taulukossa, josta ilmenee paritelleiden urosten, tiineiden naaraiden sekä hedelmöittymättömien naaraiden lukumäärä. Kaikkien parittelujen tulokset sekä kunkin uroksen ja naaraan tunnistetiedot on esitettävä erikseen. Lisäksi on laskettava paritteluväli, altistettujen urosten annostaso sekä elävien kiinnittyneiden alkioiden ja kuolleiden alkioiden lukumäärä kunkin naaraan osalta.

33.

Kiinnittymisen jälkeiset alkiokuolemat lasketaan määrittämällä kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden osuus kaikista kiinnittyneistä alkioista testiryhmässä ja vertaamalla sitä vastaavaan osuuteen kantaja-ainetta tai liuotinta saaneessa kontrolliryhmässä.

34.

Ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat voidaan määrittää keltarauhasten ja kiinnittyneiden alkioiden määrän välisenä erotuksena tai kiinnittymisten keskimäärän vähenemisenä naarasta kohden kontrolliryhmän parittelutuloksiin verrattuna. Jos ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat on arvioitu, tämä on ilmoitettava.

35.

Dominoiva letaalikerroin arvioidaan näin: (kiinnittymisen jälkeiset alkiokuolemat / kiinnittymisten kokonaismäärä naarasta kohti) × 100.

36.

Tiedot toksisuudesta ja kliinisistä oireista (29 kohdan mukaisesti) on ilmoitettava.

Hyväksymisperusteet

37.

Testin hyväksyttävyys määritetään seuraavilla kriteereillä:

—	Samanaikainen negatiivinen kontrolli on aikaisempia negatiivisia kontrollitietoja koskevien julkaistujen normien ja laboratorion aiempien kontrollitietojen (jos niitä on saatavilla) mukainen (ks. 10 ja 18 kohta).

—

Samanaikaiset positiiviset kontrollit aiheuttavat vasteita, jotka ovat aikaisempia positiivisia kontrollitietoja koskevien julkaistujen normien tai laboratorion aikaisempien positiivisten kontrollien tietokannan (jos saatavilla) mukaisia, ja niiden tuottama kasvu on tilastollisesti merkitsevä negatiiviseen kontrolliin verrattuna (17 ja 18 kohta).

—	Asianmukainen määrä kiinnittymisiä ja annoksia on analysoitu (20 kohta).

—	Suurimman annoksen valintaperusteet vastaavat 24 ja 27 kohdassa kuvattuja perusteita.

Tulosten arviointi ja tulkinta

38.

Vähintään kolmea annosryhmää on analysoitava, jotta saadaan riittävästi tietoa annos-vastesuhdetta koskevaa analyysia varten.

39.

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi positiivinen, mikäli:

—	ainakin yksi testiannoksista ilmentää tilastollisesti merkitsevää kasvua samanaikaiseen negatiiviseen kontrolliin verrattuna

—	kasvu riippuu annoksesta vähintään yksissä testiolosuhteissa (esimerkiksi viikon välein tapahtuva parittelu), kun sitä arvioidaan asianmukaisella testillä sekä

—	mikä tahansa tuloksista on negatiivisten kontrollitietojen jakauman tai laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman ulkopuolella (esimerkiksi Poissonin jakaumaan perustuva 95 prosentin kontrolliraja), jos näitä tietoja on saatavilla.

Tällöin testikemikaalin katsotaan pystyvän aiheuttamaan dominoivia letaalimutaatioita koe-eläinten itusoluissa. Suosituksia sopivimmista tilastomenetelmistä on 44 kohdassa; muita suositeltuja tilastollisia lähestymistapoja on myös lähdekirjallisuudessa (20) (21) (22) (24) (29). Käytetyissä tilastollisissa testeissä kokeellisena yksikkönä on pidettävä eläintä.

40.

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi negatiivinen, mikäli:

—	mikään testiannoksista ei aiheuta tilastollisesti merkitsevää kasvua verrattuna samanaikaiseen negatiiviseen kontrolliin

—	annoksesta riippuvaista kasvua ei esiinny missään testiolosuhteissa ja

—	kaikki tulokset ovat negatiivisten kontrollitietojen tai laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman (esimerkiksi Poissonin jakaumaan perustuva 95 prosentin kontrolliraja) mukaisia, jos näitä tietoja on saatavilla.

Tällöin katsotaan, ettei testikemikaali pysty aiheuttamaan dominoivia letaalimutaatioita koe-eläinten itusoluissa.

41.

Selvästi positiivista tai selvästi negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.

42.

Jos vaste ei ole selvästi negatiivinen eikä selvästi positiivinen tai tuloksen biologisen merkityksellisyyden vahvistaminen kaipaa tukea (esimerkiksi heikko tai rajatapaukseksi luokiteltava kasvu), tietoja tulee arvioida asiantuntija-arvioinnissa ja/tai olemassa olevaan kokeelliseen tietoon perustuvissa lisätutkimuksissa, joissa esimerkiksi arvioidaan, onko positiivinen tulos negatiivisten kontrollitietojen tai laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen hyväksyttävän jakauman ulkopuolella (30).

43.

Harvoissa tapauksissa edes lisätutkimusten pohjalta ei voida päätellä, että testikemikaali tuottaa positiivisia tai negatiivisia tuloksia. Niitä pidetään tästä syystä epäselvinä tapauksina.

44.

Käytetyissä tilastollisissa testeissä kokeellisena yksikkönä on pidettävä urospuolista eläintä. Vaikka on mahdollista, että lukumääräaineisto (esimerkiksi kiinnittyneiden alkioiden lukumäärä naarasta kohti) voi noudattaa Poissonin jakaumaa ja/tai osuudet (esimerkiksi kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden osuus) voivat noudattaa binomijakaumaa, tällaisissa tiedoissa voi kuitenkin usein olla ylihajontaa (31). Sen vuoksi tilastollisessa analyysissa tulisi ensin tehdä yli- tai alihajontatesti käyttämällä varianssitestejä, kuten Cochranin binomiaalisen vaihtelun testiä (32) tai ylihajontaa koskevaa Taronen C(α)-testiä (31) (33). Jos poikkeamaa binomijakaumasta ei havaita, osuuksien trendejä kaikilla annostasoilla voidaan testata käyttämällä Cochran-Armitagen trenditestiä (34). Parivertailuja kontrolliryhmään voidaan testata Fisherin tarkalla testillä (35). Samalla tavoin jos poikkeamaa Poissonin jakaumasta ei havaita, lukumäärien trendejä voidaan testata käyttämällä Poissonin regressiota (36). Parivertailuja kontrolliryhmään voidaan testata Poissonin mallin yhteydessä käyttämällä parittaisia kontrasteja (36). Jos merkittävää yli- tai alihajontaa havaitaan, suositellaan käytettävän parametrittomia menetelmiä (23) (31). Niitä ovat esimerkiksi järjestykseen perustuvat testit, kuten Jonckheere-Terpstran trenditesti (37) ja Mann-Whitneyn testit (38) parivertailuista kantaja-aine-/liuotinkontrolliryhmän kanssa sekä permutaatio-, uudelleenotanta- tai bootstraptestit trendi- ja parivertailuihin kontrolliryhmän kanssa (31) (39).

45.

Positiivisesta dominoivien letaalivaikutusten testistä saadaan näyttöä testikemikaalin genotoksisuudesta testieläinlajin altistetun uroksen itusoluille.

46.

Vasteen biologisen merkityksellisyyden arvioinnissa apua voi olla sen tarkastelemisesta, ovatko havaitut arvot aikaisemman kontrollivaihteluvälin sisällä vai sen ulkopuolella (40).

Testiraportti

47.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot.

Yhteenveto

Testikemikaali:

—	alkuperä, eränumero, viimeinen käyttöpäivä, jos sellainen on

—	itse testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa

—	tutkittavan kemikaalin liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa, jos tiedossa

—	tarvittaessa pH-arvon, osmolaliteetin ja saostumisen mittaus soluviljelmän kasvatusliuoksessa, johon testikemikaalia lisättiin.

Yhdestä ainesosasta koostuva aine:

—	ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut merkitykselliset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

—	kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa epäpuhtauksien kemialliset tunnistetiedot sen mukaan, mikä on käytännössä mahdollista, jne.

Useista ainesosista koostuvat aineet, UVCB-aineet ja seokset:

—	luonnehditaan mahdollisimman tarkoin ainesosien kemiallinen koostumuksen (ks. edellä), esiintymistiheyden ja merkityksellisten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla.

Testikemikaalin valmistus:

—	perustelut kantaja-aineen valinnalle

—	tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiilisuus liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa

—	ruoka-aineen, juomaveden tai inhalaatioiden formulointi

—	formulointien analyyttiset määritelmät (kuten stabiilius, homogeenisuus, nimellispitoisuudet), kun niitä käytetään.

Koe-eläimet:

—	käytetty eläinlaji/kanta ja perustelu sen valinnalle

—	eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli

—	lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.

—	eläinten yksilöintimenetelmä

—	lyhytkestoiset tutkimukset: kunkin urospuolisen eläimen paino testin alkaessa ja päättyessä yli viikon kestävät tutkimukset: yksilölliset painot tutkimuksen aikana ja ravinnon kulutus. Kunkin ryhmän painon vaihteluväli, keskiarvo ja keskihajonta on ilmoitettava.

Testiolosuhteet:

—	positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollitiedot

—	annosalueen määritystutkimuksen tulokset

—	annostasojen valintaperusteet

—	testikemikaalin valmistelun yksityiskohdat

—	testikemikaalin annostelun yksityiskohdat

—	antotavan valintaperusteet

—	eläimille aiheutuneiden myrkyllisten vaikutusten mittaamista koskevat menetelmät, tarvittaessa myös histopatologiset tai hematologiset analyysit, ja tiedot siitä, kuinka usein eläimiä koskevat havainnot tehtiin ja eläimet punnittiin

—	menettelyt, joilla varmistetaan, että testikemikaali kulkeutui kohdekudokseen tai verenkiertoon, jos saadaan negatiivisia tuloksia

—	todellinen annos (mg/painokilo/vrk), joka lasketaan ravintoon/juomaveteen sekoitetun testikemikaalin pitoisuudesta (ppm) ja kulutuksesta tarvittaessa

—	yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta

—	yksityiskohdat häkkien virikkeellisestä ympäristöstä

—	yksityiskohtaiset tiedot altistus- ja näytteenottoaikataulusta ja perustelut valinnoille

—	kivunlievitysmenetelmät

—	lopettamistapa

—	kudosten eristämis- ja säilömismenetelmät

—	kaikkien mittaussarjojen ja reagenssien lähde ja eränumerot (tarvittaessa)

—	dominoivien letaalivaikutusten laskentamenetelmät

—	paritteluaikataulu

—	parittelun toteamistapa

—	eläimen lopetusajankohta

—	dominoivien letaalivaikutusten pisteytysperusteet (keltarauhaset, kiinnittyneet alkiot, resorptiot ja ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat sekä elävät ja kuolleet kiinnittyneet alkiot).

Tulokset:

—	eläimen kunto koeaikaa ennen ja sen aikana sekä toksisuusoireet

—	uroksen paino altistus- ja parittelujaksojen aikana

—	paritelleiden naaraiden lukumäärä

—	annos-vastesuhde, jos mahdollista

—	samanaikaisen ja aikaisemman negatiivisen kontrollin tiedot, joihin sisältyvät vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonta

—	samanaikaisen positiivisen kontrollin tiedot

—

taulukoidut tiedo t jokaisesta naaraasta: keltarauhasten lukumäärä naarasta kohti kiinnittyneiden alkioiden lukumäärä naarasta kohti resorptioiden ja ennen kiinnittymistä tapahtuneiden alkiokuolemien lukumäärä naarasta kohti elävien kiinnittyneiden alkioiden lukumäärä naarasta kohti kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden lukumäärä naarasta kohti sikiöiden painot

—	yhteenveto edellä kuvatuista tiedoista jokaiselta parittelujaksolta ja jokaisesta annoksesta sekä tiedot dominoivista letaalitaajuuksista

—	käytetyt tilastolliset analyysit ja menetelmät.

Tulosten tarkastelu.

Päätelmät.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)	OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)	Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et al. (eds.) s. 235–334, Elsevier, Amsterdam

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group ”Dominant” lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173–185

(4)	Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159–167.

(5)	Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267–270.

(6)	Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)	Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325–329.

(8)	Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80–85.

(9)	Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239–249.

(10)	Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616–624.

(11)	Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112–129.

(12)	Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169–172.

(13)	Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21–27.

(14)	Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167–180.

(15)	Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371–378.

(16)	James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303–314.

(17)	Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35–40.

(18)	Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143–156.

(19)	Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, s. 129–156.

(20)	Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)	Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313–318.

(22)	Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124–141.

(23)	Haseman J.K. and Soares E.R. (1976). The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277–288.

(24)	Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353–360.

(25)	Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417–429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313–319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(28)	Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

(29)	Kirkland D.J., (Ed.) (1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)	Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). ”Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87–90.

(31)	Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35–58.

(32)	Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417–451.

(33)	Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585–590.

(34)	Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. Teoksessa Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), s. 334–336. John Wiley and Sons, New York.

(35)	Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36)	Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston

(37)	Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133–145.

(38)	Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

(39)	Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)	Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

Lisäys 1

MÄÄRITELMÄT

Kemikaali: Aine tai seos

Keltarauhanen (-rauhaset): Munasarjaan munasolun irtoamisen jälkeen munarakkulan tilalle muodostuva hormonia erittävä rakenne. Munasarjoissa olevien keltarauhasten määrä vastaa irronneiden munasolujen määrää.

Dominoiva letaalimutaatio: Itusolussa esiintyvä tai siihen hedelmöittymisen jälkeen kiinnittyvä mutaatio, joka aiheuttaa sikiö- ja alkiokuolemia.

Hedelmällisyysluku: Paritelleiden tiineiden naaraiden lukumäärä paritelleiden naaraiden lukumäärään nähden.

Parittelujakso: Altistettujen urosten altistuksen päättymisen ja parittelun välinen aika. Tätä jaksoa seuraamalla voidaan arvioida kemikaalien vaikutuksia erityyppisiin itusoluihin. Hiirten paritellessa viikoilla 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ja 8 altistuksen päättymisen jälkeen havaittiin vaikutuksia spermassa, kondensoituneissa spermatideissä, pyöreätumaisissa spermatideissä, pakyteenivaiheen spermatideissä, varhaisvaiheen spermatosyyteissä, erilaistuneissa spermatogonioissa, erilaistuvissa spermatogonioissa ja kantasoluista muodostuvissa spermatogonioissa.

Ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat: Kiinnittyneiden alkioiden määrän ja keltarauhasten määrän välinen erotus. Se voidaan arvioida myös vertailemalla kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärää yhtä naarasta kohti testi- ja kontrolliryhmissä.

Kiinnittymisen jälkeen tapahtuneet alkiokuolemat: Kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden osuus kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärästä testiryhmässä verrattuna vastaavaan osuuteen kontrolliryhmässä.

Testikemikaali: Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

UVCB-aine: Koostumukseltaan tuntematon tai vaihteleva aine, kompleksi reaktiotuote tai biologinen materiaali

Lisäys 2

SPERMATOGENEESIN AJOITUS NISÄKKÄILLÄ

Kuva 1: Vertailu hiirien, rottien ja ihmisten miespuolisten itusolujen kehityksen kestosta (päivinä). DNA:n korjausta ei tapahdu varjostuksella korostetuilla ajanjaksoilla.

Yllä on esitetty kaaviokuva hiiren, rotan ja ihmisen spermatogeneesistä (lähde: Adler, 1996). Erilaistumattomia spermatogonioita ovat yksittäiset A-spermatogoniat, parilliset A-spermatogoniat (Apr) ja ketjuttuneet (Aal) spermatogoniat (Hess ja de Franca, 2008). Varsinaisina kantasoluina pidetään yksittäisiä A-spermatogonioita. Jotta kantasoluihin kohdistuvia vaikutuksia voidaan arvioida, viimeisen testikemikaali-injektion ja parittelun välissä on oltava vähintään 49 päivää (hiirellä).

Viitteet

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169–172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Teoksessa: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1–15.

”

Korvataan B osassa oleva B.23 luku seuraavasti:

”B.23 NISÄKKÄIDEN SPERMATOGONIOIDEN KROMOSOMIPOIKKEAVUUSTESTI

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 483 (2016). Testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvoinnin vuoksi. Tämä muokattu versio testimenetelmästä perustuu useiden vuosien kokemukseen tästä testistä ja mahdollisuuteen liittää tai yhdistää tämä testi muihin toksisuus- tai genotoksisuustesteihin. Kun toksisuustestejä yhdistetään, niissä voidaan mahdollisesti käyttää tavallista vähemmän koe-eläimiä. Tämä testimenetelmä kuuluu geneettisen toksikologian testimenetelmiin. OECD on laatinut asiakirjan (1), joka sisältää yhteenvedon geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsauksen näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin.

Tämän nisäkkäiden spermatogonioilla tehtävän in vivo -kromosomipoikkeavuustestin tarkoituksena on tunnistaa kemikaalit, jotka aiheuttavat rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia nisäkkäiden spermatogoniaalisissa soluissa (2) (3) (4). Lisäksi tämä testi on erityisen relevantti genotoksisuuden arvioinnissa, koska vaikka lajien välillä voi olla vaihtelua, in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin liittyvät tekijät ovat aktiivisia ja voivat vaikuttaa vasteisiin. Tätä testimenetelmää ei ole suunniteltu mittaamaan numeerisia poikkeavuuksia; testiä ei käytetä siihen tavanomaisesti.

Tämä testi mittaa (sekä kromosomi- että kromatidityyppisiä) rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia jakautuvissa spermatogoniaalisissa itusoluissa, joten sen odotetaan voivan ennustaa itusolujen periytyvien mutaatioiden kehittymistä.

Keskeisten termien määritelmät esitetään liitteessä.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Tässä testissä käytetään yleensä jyrsijöitä, mutta muut lajit voivat olla joissain tapauksissa sopivia, jos niiden käyttö on tieteellisesti perusteltua. Jyrsijätestien sytogeneettiset vakiovalmisteet aiheuttavat mitoottisia (spermatogoniat) ja meioottisia (spermatosyytit) metafaaseja. Mitoottiset ja meioottiset metafaasit määritetään kromosomien morfologian perusteella (4). Tämä in vivo -sytogeneettinen testi paljastaa rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet spermatogonioiden mitooseissa. Tällä menetelmällä ei tutkita muita kohdesoluja.

Spermatogoniaalisten solujen kromatidityyppisten poikkeavuuksien havaitsemiseksi on tutkittava ensimmäistä mitoottista solunjakautumista altistuksen jälkeen, ennen kuin nämä poikkeavuudet häviävät myöhemmissä solunjakautumisissa. Altistetuista spermatosyyteistä voidaan saada lisätietoja tekemällä meioottisia kromosomianalyysejä kromosomityyppisten rakenteellisten poikkeavuuksien toteamiseksi diakineesi-metafaasi I:ssä ja metafaasi II:ssa.

Kiveksissä on yhtaikaa monia spermatogonioiden sukupolvia (5), ja näiden erilaisten itusolutyyppien herkkyys kemiallisten aineiden vaikutuksille voi vaihdella. Havaitut poikkeavuudet edustavat siis altistettujen spermatogoniaalisten solupopulaatioiden yhdistettyä vastetta. Suurin osa kivespreparaattien mitoottisista soluista ovat B-spermatogonioita, joiden solukierto on noin 26 tuntia (3).

Jos on näyttöä siitä, että testikemikaali tai sen metaboliitti ei (metaboliitit eivät) pääse kiveksiin, tätä testiä ei pidä käyttää.

TESTIMENETELMÄN PERIAATE

Eläimet altistetaan testikemikaalille soveltuvaa altistusreittiä käyttäen ja lopetetaan sopivan ajan kuluttua altistuksesta. Ennen lopettamista eläimille annetaan ainetta, joka pysäyttää solunjakautumisen metafaasiin (esimerkiksi kolkisiinia tai Colcemidia®). Tämän jälkeen itusoluista valmistetaan kromosomipreparaatit ja ne värjätään, ja metafaasissa olevista soluista analysoidaan kromosomipoikkeavuudet.

LABORATORIOIDEN PÄTEVYYDEN VARMISTAMINEN

10.

Tämän testin pätevyys on varmistettava osoittamalla, että sillä voidaan tuottaa uudestaan odotuksenmukaiset tulokset spermatogonioiden rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien taajuuksista esimerkiksi taulukossa 1 lueteltuja positiivisia kontrolliaineita käyttäen (mukaan luettuina heikot vasteet) ja saada sellaisia negatiivisten kontrollien taajuuksia, jotka ovat julkaistussa kirjallisuudessa esitettyjen kontrollitietojen hyväksyttävyysalueen mukaisia (esimerkiksi (2) (3) (6) (7) (8) (9)(10)) tai laboratorion aikaisemman kontrollijakauman mukaisia, jos se on saatavilla.

MENETELMÄN KUVAUS

Testin valmistelu

Eläinlajin valinta

11.

Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä. Yleensä käytetään uroshiiriä, mutta myös muiden soveltuvien nisäkäslajien uroksia voidaan käyttää, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos tämä testi on tarkoitus tehdä yhdessä jonkin toisen testimenetelmän kanssa. Raportissa on esitettävä tieteelliset perustelut muiden lajien kuin jyrsijöiden käytölle.

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

12.

Jyrsijöiden kohdalla koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden olisi mieluiten oltava 50–60 prosenttia, sen olisi oltava ainakin 40 prosenttia eikä mielellään yli 70 prosenttia muulloin kuin tilan puhdistuksen aikana. Huoneessa täytyy käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon valintaan voi vaikuttaa se, miten siihen voidaan sekoittaa sopiva määrä testikemikaalia, kun sitä annetaan tätä reittiä. Jyrsijät on sijoitettava pienryhmiin (enintään viisi eläintä häkkiä kohti), ellei aggressiivista käyttäytymistä ole odotettavissa, mieluiten kiinteisiin lattiahäkkeihin, joissa on asianmukainen virikkeellinen ympäristö. Eläimet voivat olla häkissä yksittäin, jos tämä on tieteellisesti perusteltua.

Eläinten valmistelu

13.

Yleensä käytetään terveitä, nuoria ja täysikasvuisia uroseläimiä (8–12 viikon ikäiset käsittelyn alkaessa), jotka jaetaan satunnaisesti kontrolli- ja testiryhmiin. Eläimet merkitään yksilöllisesti inhimillisellä, mahdollisimman vähän invasiivisella toimenpiteellä (esimerkiksi rengastamalla, korvamerkillä, mikrosirulla tai biometrisellä tunnisteella, mutta ei korvia tai varpaita leikkaamalla), ja niitä sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Ristikontaminaatiota positiivisella kontrollilla ja testikemikaalilla tulisi välttää. Tutkimuksen alkaessa eläinten painon vaihtelun on oltava minimaalista, enintään ± 20 %.

Annosten valmistelu

14.

Kiinteät testattavat kemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan asianmukaisiin liuottimiin tai kantaja-aineisiin taikka lisätään ravintoon tai juomaveteen, ennen kuin ne annetaan koe-eläimille. Nestemäiset testattavat kemikaalit voidaan antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Testikemikaaleja voidaan antaa hengitysteiden kautta tapahtuvan altistamisen osalta kaasuna, höyrynä tai kiinteänä/nestemäisenä aerosolina niiden fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan. Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä ja asianmukaiset säilytysolosuhteet on määritetty.

Testiolosuhteet - liuotin/kantaja-aine

15.

Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen käyttö saa aiheuttaa mahdollisia kemiallisia reaktioita testikemikaalien kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Esimerkkejä yleisesti käytetyistä yhteensopivista liuottimista/kantaja-aineista ovat vesi, fysiologinen suolaliuos, metyyliselluloosaliuos, natriumkarboksimetyyliselluloosan suolaliuos, oliiviöljy ja maissiöljy. Jos ei ole aikaisempia tai julkaistuja kontrollitietoja siitä, ettei valittu epätyypillinen liuotin/kantaja-aine aiheuta rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia tai muita haitallisia vaikutuksia, on tehtävä alustava tutkimus, jolla voidaan määrittää liuotin-/kantaja-ainekontrollin hyväksyttävyys.

Positiiviset kontrollit

16.

Samanaikaisia positiivisia kontrollieläimiä on käytettävä aina, ellei laboratorio ole osoittanut pätevyyttään testin tekemisessä ja ellei se ole käyttänyt testiä rutiininomaisesti viime aikoina (esimerkiksi viiden viime vuoden aikana). Jos samanaikaista positiivisen kontrollin ryhmää ei ole, kuhunkin kokeeseen on sisällytettävä pisteytyskontrollit (kiinteät ja värjätyt objektilasit). Nämä voidaan saada sisällyttämällä tutkimuksen pisteytykseen asianmukaiset vertailunäytteet, jotka on saatu erillisestä määräajoin (esimerkiksi 6–18 kuukauden välein) tehtävästä positiivisen kontrollin kokeesta ja joita säilytetään laboratoriossa, jossa koe tehdään, esimerkiksi pätevyyden testaamisen aikana ja säännöllisesti sen jälkeen, jos tarpeen.

17.

Positiivisten kontrolliaineiden pitäisi luotettavasti tuottaa havaittavaa lisääntymistä rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuuksissa spontaanitasoihin verrattuna. Positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti laskijoille koodattujen näytteiden identiteettiä. Taulukossa 1 on esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista.

Taulukko 1

Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista

Aineet [CAS-numero] (viitenro)

Syklofosfamidi (monohydraatti) [CAS-nro 50-18-0 (CAS-nro 6055-19-2)] (9)

Sykloheksylamiini [CAS-nro 108-91-8] (7)

Mitomysiini C [CAS-nro 50-07-7] (6)

Monomeerinen akryyliamidi [CAS 79-06-1] (10)

Trietyleenimelamiini [CAS-nro 51-18-3] (8)

Negatiiviset kontrollit

18.

Negatiivisia kontrollieläimiä, joille annetaan pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta ja joita käsitellään muuten samalla tavalla kuin testiryhmiä, on sisällytettävä kuhunkin näytteenottokertaan. Jos käytettävissä ei ole aikaisempia tai julkaistuja kontrollitietoja, joissa osoitetaan, että valittu liuotin/kantaja-aine ei aiheuta kromosomipoikkeavuuksia tai muita haitallisia vaikutuksia, kullakin näytteenottokerralla olisi käytettävä myös altistamattomia kontrollieläimiä, jotta kantaja-ainekontrollin hyväksyttävyys voidaan todeta.

MENETTELY

Eläinten lukumäärä

19.

Tutkimuksen alussa ryhmien koot pitäisi valita niin, että yhdessä ryhmässä on vähintään viisi urospuolista eläintä. Tätä ryhmäkohtaista eläinmäärää pidetään asianmukaisen tilastollisen voiman tuottamisen kannalta riittävänä (ts. jotta testissä voidaan yleensä havaita vähintään kromosomipoikkeavuuksien esiintymistaajuuden kaksinkertaistuminen, kun negatiivinen kontrollitaso on 1,0 tai suurempi ja kun todennäköisyys on 80 prosenttia ja merkitsevyystaso 0,05) (3) (11). Eläinten tyypillisen enimmäismäärän osalta voidaan todeta ohjeellisesti, että tutkimuksessa, jossa on kaksi näytteenottokertaa, kolme annosryhmää ja samanaikainen negatiivinen kontrolliryhmä sekä positiivinen kontrolliryhmä (kussakin ryhmässä on viisi eläintä), tarvitaan 45 eläintä.

Altistusohjelma

20.

Testikemikaaleja annetaan yleensä kerran (ts. kerta-altistuksena); myös muita annosteluohjelmia voidaan käyttää, jos se on tieteellisesti perusteltua.

21.

Suurinta annosta saavassa ryhmässä käytetään kahta näytteenottokertaa altistuksen jälkeen. Koska testikemikaali(e)n soluunottoon ja metaboloitumiseen kuluva aika ja sen vaikutus solukierron kinetiikkaan voi muuttaa kromosomipoikkeavuuksien optimaalista havaitsemisajankohtaa, on otettava yksi varhainen näyte 24 tunnin kuluttua ja toinen myöhempi näyte 48 tunnin kuluttua altistuksesta. Muiden annosten kuin suurimman annoksen osalta on noudatettava aikaisempaa näytteenottoaikaa eli 24:ää tuntia (joka on lyhyempi tai yhtä pitkä kuin B-spermatogonioiden solukiertoaika, jolloin ensimmäisten altistuksen jälkeisten metafaasien arvioimisen todennäköisyys on optimaalinen) altistuksen jälkeen, ellei jonkin toisen näytteenottoajan tiedetä olevan asianmukaisempi ja perustellumpi.

22.

Myös muita näytteenottoaikoja voidaan käyttää. Varhaisemmat näytteenottoajat (esimerkiksi alle 24 tuntia) saattavat olla asianmukaisia esimerkiksi sellaisten kemikaalien yhteydessä, joilla voi olla S-vaiheesta riippumattomia vaikutuksia.

23.

Myös toistuvan annoksen altistusohjelmaa voidaan käyttää esimerkiksi sellaisen toista päätetapahtumaa koskevan testin yhteydessä, jossa käytetään 28 päivän annosteluohjelmaa (esimerkiksi testimenetelmä B.58). Tällöin tarvitaan kuitenkin lisää eläinryhmiä eri näytteenottoaikojen vuoksi. Tällaisen ohjelman asianmukaisuus on kuitenkin perusteltava tieteellisesti ja tapauskohtaisesti.

24.

Ennen lopettamista eläimille annetaan injektiona vatsaonteloon sopiva annos kemikaalia, joka pysäyttää solut metafaasivaiheeseen (esimerkiksi Colcemidia® tai kolkisiinia). Elämistä otetaan näytteet sopivan ajan kuluttua tämän jälkeen. Hiirillä ja rotilla tämä väli on noin 3–5 tuntia.

Annostasot

25.

Jos tehdään alustava annoksenmääritystutkimus, koska muista tutkimuksista ei ole saatavilla soveltuvia tietoja, jotka auttaisivat annoksen valinnassa, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, samaa kantaa ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa on tarkoitus käyttää, annoksenmääritystutkimusta koskevien suositusten mukaisesti (12). Tässä tutkimuksessa pitäisi pyrkiä määrittämään suurin siedetty annos (MTD-arvo) eli annos, joka aiheuttaa lievästi toksisen vaikutuksen suhteessa tutkimusjakson kestoon (esimerkiksi epänormaalia käytöstä tai reagointia, vähäistä painonlaskua tai hematopoieettisen järjestelmän sytotoksisuutta), mutta ei kuolemaa tai merkkejä kivusta, kärsimyksestä tai stressistä, joka edellyttäisi eläinten lopettamista (13).

26.

Suurin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa joitakin toksisuuteen viittaavia muutoksia spermatogoniaalisissa soluissa (esimerkiksi spermatogonioiden mitoosien osuus ensimmäiseen ja toiseen meioottiseen metafaasiin nähden pienenee). Tämä pieneneminen saa olla enintään 50 prosenttia.

27.

Kemikaalit, joilla on tiettyjä biologisia vaikutuksia pieninä myrkyttöminä annoksina (kuten hormonit ja mitogeenit), ja kemikaalit, joissa esiintyy toksikokineettisten ominaisuuksien saturaatiota, voivat olla annoksen määrittämistä koskevien kriteerien osalta poikkeustapauksia, ja niitä on arvioitava tapauskohtaisesti.

28.

Jotta saadaan annosvastetiedot, täydelliseen tutkimukseen on sisällyttävä negatiivinen kontrolliryhmä (18 kohta) ja vähintään kolme annostasoa, jotka yleensä erotetaan kertoimella 2 mutta enintään kertoimella 4. Jos testikemikaali ei aiheuta toksisuusvaikutusta annoksenmääritystutkimuksessa tai olemassa olevien tietojen perusteella, suurin annos kerta-annostelulle pitäisi olla 2 000 mg/painokilo. Jos testikemikaali aiheuttaa toksisuutta, suurimman siedetyn annoksen pitäisi olla suurin annettava annos, ja käytettävien annostasojen olisi mieluiten katettava vaihteluväli maksimista annokseen, joka aiheuttaa vain vähän tai ei lainkaan toksisuutta. Kun kohdekudoksessa (ts. kiveksissä) havaitaan toksisuutta kaikilla testatuilla annostasoilla, on suositeltavaa tehdä täydentävä tutkimus myrkyttömillä annoksilla. Tutkimukset, joiden tarkoituksena on kuvata täydellisesti määrällisiä annos-vastetietoja, voivat vaatia täydentäviä annosryhmiä. Nämä rajat voivat vaihdella tietyntyyppisten testikemikaalien osalta (esimerkiksi ihmisten lääkkeet), jotka kuuluvat erityisvaatimusten piiriin. Jos testikemikaali aiheuttaa toksisuutta, on valittava raja-annos ja kaksi pienempää annosta (edellä kuvatun mukaisesti). Vähintään 14 päivän mittaisen altistusjakson raja-annos on 1 000 mg painokiloa kohti päivässä. Jos altistusjakso on vähemmän kuin 14 päivää, raja-annos on 2 000 mg painokiloa kohti päivässä.

Antotapa

29.

Testin suunnittelussa on otettava huomioon oletettu ihmisen altistusreitti. Siksi altistusreitiksi voidaan perustellusti valita esimerkiksi ravinto tai juomavesi, topikaalinen ihonalainen, suonensisäinen tai oraalinen (letkuruokinta) reitti, hengitystiet taikka implantaatio. Joka tapauksessa reitti on valittava siten, että voidaan varmistaa kohdekudosten asianmukainen altistuminen. Intraperitoneaalista injektiota ei yleensä suositella, ellei se ole tieteellisesti perusteltua, sillä se ei ole ihmisen altistumisen kannalta fysiologisesti merkittävä altistumisreitti. Jos testikemikaali sekoitetaan ravintoon tai juomaveteen, varsinkin jos kyse on yhdestä annoksesta, vaikutuksien havaitsemiseksi on huolehdittava siitä, että viive ravinnon ja veden kulutuksen ja näytteenoton välillä on riittävä (ks. 33 kohta). Suurin letkuruokinnan tai injektion avulla kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Yleensä määrä saa olla enintään 1 ml/100 g painoa. Poikkeuksena ovat vesiliuokset, joita käytettäessä enimmäismäärä voi olla 2 ml/100 g. Tätä suurempien määrien käyttö (jos eläinsuojelulainsäädäntö sen sallii) on perusteltava. Testitilavuuden vaihtelu on minimoitava muuttamalla pitoisuutta, jotta varmistetaan, että tilavuus on painoon nähden sama kaikilla annostasoilla.

Havainnot

30.

Koe-eläimistä tulee tehdä yleisiä kliinisiä havaintoja ja niiden kliinisiä oireita tulee kirjata vähintään kerran päivässä, mieluiten samaan aikaan joka päivä, ja tässä on otettava huomioon, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Kaikkien eläinten sairastuvuutta ja kuolleisuutta on havainnoitava ainakin kahdesti vuorokaudessa. Eläimet on punnittava tutkimuksen alussa ja vähintään kerran viikossa toistuvan annoksen tutkimuksissa ja lopetettaessa. Vähintään viikon kestävissä tutkimuksissa ravinnonkulutuksen mittaus on tehtävä vähintään viikoittain. Jos testikemikaalia annostellaan juomaveteen, veden kulutus on mitattava veden vaihdon yhteydessä tai vähintään kerran viikossa. Eläimet, joilla ilmenee ei-letaaleja merkkejä liiallisesta toksisuudesta, olisi lopetettava ennen tutkimusjakson päättymistä (13).

Kromosomipreparaattien valmistus

31.

Heti eläinten lopettamisen jälkeen toisesta kiveksestä tai molemmista kiveksistä otetaan itusolususpensioita, jotka pannaan hypotoniseen liuokseen ja fiksoidaan vahvistettujen menettelyjen mukaisesti (esimerkiksi (2) (14) (15)). Tämän jälkeen solut levitetään objektilaseille ja värjätään (16) (17). Kaikki lasit on koodattava siten, ettei laskija tiedä niiden identiteettiä.

Analyysi

32.

Jokaisesta eläimestä on laskettava vähintään 200 hyvin levinnyttä metafaasia (3) (11). Jos aikaisempien negatiivisten kontrollien taajuus on < 1 %, on laskettava yli 200 solua eläintä kohti tilastollisen voiman kasvattamiseksi (3). On käytettävä sellaisia värjäysmenetelmiä, joiden yhteydessä sentromeeri voidaan tunnistaa.

33.

Kromosomi- ja kromatidityyppiset poikkeavuudet on kirjattava erikseen ja luokiteltava alatyypin mukaan (katkeamiset, vaihdokset). Määritettäessä, aiheuttaako kemikaali sellaisten solujen lisääntymistä, joissa on kromosomipoikkeavuuksia, on kirjattava aukot, mutta niitä ei tarvitse ottaa huomioon. Laboratoriossa käytettävillä menettelyillä on varmistettava, että kromosomipoikkeavuuksien analyysin tekevät hyvin koulutetut laskijat. Koska objektilasien valmistelu johtaa usein joidenkin metafaasissa olevien solujen rikkoutumiseen ja siten kromosomien häviämiseen, sentromeerien lukumäärän lasketuissa soluissa on vastattava lukua 2n ± 2, jossa n on kyseisen lajin haploidinen kromosomiluku.

34.

Vaikka testillä pyritään ensisijaisesti toteamaan rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet, on tärkeää rekisteröidä myös polyploidisten ja endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävien solujen esiintymistaajuudet, mikäli näitä esiintyy (ks. 44 kohta).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten käsittely

35.

Yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot on esitettävä taulukossa. Jokaisesta eläimestä on arvioitava rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen lukumäärä ja kromosomipoikkeavuuksien lukumäärä solua kohti. Alatyyppeihin luokitellut kromatidi- ja kromosomityyppiset poikkeavuudet (katkeamiset, vaihdokset) on lueteltava erikseen, ja niiden lukumäärät ja esiintymistaajuudet testi- ja kontrolliryhmissä on mainittava. Aukot kirjataan erikseen. Aukkojen esiintymistaajuus ilmoitetaan, mutta sitä ei yleensä sisällytetä rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien kokonaistaajuuden analyysiin. Polyploidian ja endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävien solujen prosenttiosuus ilmoitetaan, jos näitä havaitaan.

36.

Tiedot toksisuudesta ja kliinisistä oireista (30 kohdan mukaisesti) on ilmoitettava.

Hyväksymisperusteet

37.

Testin hyväksyttävyys määritetään seuraavilla kriteereillä:

—

Samanaikainen negatiivinen kontrolli on aikaisempia negatiivisia kontrollitietoja koskevien julkaistujen normien (joiden mukaan yleensä odotetaan, että > 0 ja ≤ 1,5 prosentissa soluista on kromosomipoikkeavuuksia) ja laboratorion aiempien kontrollitietojen (jos niitä on saatavilla) mukainen (ks. 10 ja 18 kohta).

—

Samanaikaiset positiiviset kontrollit aiheuttavat vasteita, jotka ovat aikaisempia positiivisia kontrollitietoja koskevien julkaistujen normien tai laboratorion aiempien positiivisten kontrollien tietokannan (jos saatavilla) mukaisia, ja niiden tuottama kasvu on tilastollisesti merkitsevä negatiiviseen kontrolliin verrattuna (ks. 17 ja 18 kohta).

—	Soluja ja annoksia on analysoitu riittävät määrät (ks. 28 ja 32 kohta).

—	Suurimman annoksen valintaperusteet vastaavat 25 ja 26 kohdassa kuvattuja perusteita.

38.

Jos havaitaan sekä mitoosia että meioosia, spermatogonioiden mitoosien suhde ensimmäiseen ja toiseen meioottiseen metafaasiin on määritettävä sytotoksisuuden mittana kaikista altistetuista eläimistä ja negatiivisista kontrollieläimistä yhteensä 100 jakautuvan solun näytteestä eläintä kohti. Jos tarkastellaan ainoastaan mitoosia, mitoosi-indeksi on määritettävä vähintään 1 000 solusta jokaista eläintä kohti.

Tulosten arviointi ja tulkinta

39.

Vähintään kolmea annosryhmää on analysoitava, jotta saadaan riittävästi tietoa annos-vastesuhdetta koskevaa analyysia varten.

40.

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi positiivinen, mikäli:

—	ainakin yksi testiannoksista ilmentää tilastollisesti merkitsevää kasvua samanaikaiseen negatiiviseen kontrolliin verrattuna

—	kasvu riippuu annoksesta ainakin yhdellä näytteenottokerralla sekä

—	mikä tahansa tuloksista on aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman tai laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman ulkopuolella (esimerkiksi Poissonin jakaumaan perustuva 95 prosentin kontrolliraja), jos näitä tietoja on saatavilla.

Tällöin testikemikaalin katsotaan pystyvän aiheuttamaan kromosomipoikkeavuuksia koe-eläinten spermatogoniaalisissa soluissa. Lähdekirjallisuudessa on suosituksia myös sopivimmista tilastomenetelmistä (11) (18). Käytetyissä tilastollisissa testeissä kokeellisena yksikkönä on pidettävä eläintä.

41.

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi negatiivinen, mikäli:

—	mikään testiannoksista ei aiheuta tilastollisesti merkitsevää kasvua verrattuna samanaikaiseen negatiiviseen kontrolliin

—	annoksesta riippuvaista kasvua ei esiinny missään testiolosuhteissa sekä

—	kaikki tulokset ovat aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen tai laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman (esimerkiksi Poissonin jakaumaan perustuva 95 prosentin kontrolliraja) mukaisia, jos näitä tietoja on saatavilla.

Tällöin katsotaan, ettei testikemikaali pysty aiheuttamaan kromosomipoikkeavuuksia koe-eläinten spermatogoniaalisissa soluissa. Lähdekirjallisuudessa on suosituksia myös sopivimmista tilastomenetelmistä (11) (18). Negatiivinen tulos ei sulje pois mahdollisuutta, että kemikaali saattaa aiheuttaa kromosomipoikkeavuuksia myöhemmissä kehitysvaiheissa, joita ei ole tutkittu, tai geenimutaatioita.

42.

Selvästi positiivista tai selvästi negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.

43.

44.

45.

Polyploidisten solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että testikemikaalilla pystytään estämään mitoottisia prosesseja ja aiheuttamaan numeerisia kromosomipoikkeavuuksia (20). Endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävien solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että testikemikaali kykenee estämään solukierron etenemisen (21) (22), joka on erilainen numeerisia kromosomimuutoksia aiheuttava mekanismi kuin mitoottisten prosessien estäminen (ks. 2 kohta). Siksi polyploidiset solut ja endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävät solut on kirjattava erikseen.

Testiraportti

46.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

Yhteenveto.

Testikemikaali:

—	alkuperä, eränumero, viimeinen käyttöpäivä, jos sellainen on

—	itse testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa

—	testikemikaalin liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa, jos tiedossa

—	tarvittaessa pH-arvon, osmolaliteetin ja saostumisen mittaus soluviljelmän kasvatusliuoksessa, johon testikemikaalia lisättiin.

Yhdestä ainesosasta koostuva aine:

—	ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut merkitykselliset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

—	kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa epäpuhtauksien kemialliset tunnistetiedot sen mukaan, mikä on käytännössä mahdollista, jne.

Useista ainesosista koostuvat aineet, UVCB-aineet ja seokset:

—	luonnehditaan mahdollisimman tarkoin kemiallisten tunnistetietojen (ks. edellä), esiintymistiheyden ja merkityksellisten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla.

Testikemikaalin valmistus:

—	perustelut kantaja-aineen valinnalle

—	testikemikaalin liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa

—	ruoka-aineen, juomaveden tai inhalaatioiden formulointi

—	formulaatioiden analyyttiset määritykset (esimerkiksi stabiilius, homogeenisuus, nimellispitoisuudet), jos ne on tehty.

Koe-eläimet:

—	käytetty eläinlaji/kanta ja perustelu sen käytölle

—	eläinten määrä ja ikä

—	lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.

—	eläinten yksilöintimenetelmä

—	lyhytkestoiset tutkimukset: kunkin eläimen paino testin alkaessa ja päättyessä yli viikon kestävät tutkimukset: yksilölliset painot tutkimuksen aikana ja ravinnon kulutus. Kunkin ryhmän painon vaihteluväli, keskiarvo ja keskihajonta on ilmoitettava.

Testiolosuhteet:

—	positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollitiedot

—	mahdollisen raja-annostutkimuksen tulokset

—	annostason valintaperusteet

—	antoreitin valintaperusteet

—	testikemikaalin valmistelun yksityiskohdat

—	testikemikaalin annostelun yksityiskohdat

—	eläinten lopettamisajankohtien perustelut

—	eläimille aiheutuneiden myrkyllisten vaikutusten mittaamista koskevat menetelmät, tarvittaessa myös histopatologiset tai hematologiset analyysit, ja tiedot siitä, kuinka usein eläimiä koskevat havainnot tehtiin ja eläimet punnittiin

—	menettelyt, joilla varmistetaan, että testikemikaali kulkeutui kohdekudokseen tai verenkiertoon, jos saadaan negatiivisia tuloksia

—	todellinen annos (mg/painokilo/vrk), joka lasketaan ravintoon/juomaveteen sekoitetun testikemikaalin pitoisuudesta (ppm) ja kulutuksesta tarvittaessa

—	yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta

—	yksityiskohtaiset tiedot koe- ja näytteenottoaikataulusta ja perustelut valinnoille

—	lopettamistapa

—	kivunlievitysmenetelmä (jos sitä on käytetty)

—	kudosten eristämismenetelmät

—	metafaasin pysäyttämisessä käytetty kemikaali, sen pitoisuus ja käsittelyn kesto

—	objektilasien valmistusmenetelmät

—	kromosomipoikkeavuuksien laskentaperusteet

—	analysoitujen solujen lukumäärä eläintä kohti

—	kriteerit, joiden perusteella tutkimukset luokiteltiin positiivisiksi, negatiivisiksi tai epäselviksi.

Tulokset:

—	eläimen kunto koeaikaa ennen ja sen aikana sekä toksisuusoireet

—	ruumiin ja elinten painot lopetuksen yhteydessä (jos kyse on useammasta altistuksesta, ruumiinpaino punnitaan altistusohjelman aikana)

—	toksisuuden merkit

—	mitoosi-indeksi

—	spermatogonioiden mitoosien suhde ensimmäisiin ja toisiin meioottisiin metafaaseihin tai muut todisteet kohdekudoksen altistumisesta

—	kromosomipoikkeavuuksien tyyppi ja lukumäärä, ilmoitettava jokaisen eläimen osalta erikseen

—	kromosomipoikkeavuuksien kokonaismäärä ryhmää kohti sekä keskiarvot ja keskihajonnat

—	kromosomipoikkeavuuksia sisältäneiden solujen lukumäärä ryhmää kohti sekä keskiarvot ja keskihajonnat

—	annos-vastesuhde, jos mahdollista

—	käytetyt tilastolliset analyysit ja menetelmät

—	samanaikaisten negatiivisten kontrollien tiedot

—	aikaisemmat negatiivisten kontrollien tiedot, vaihteluvälit, keskiarvot, keskihajonnat ja 95 prosentin luottamusväli (jos saatavilla) tai testitulosten hyväksyttävyyden arvioinnissa käytetyt julkaistut tiedot aikaisemmista negatiivisista kontrolleista

—	samanaikaisen positiivisen kontrollin tiedot

—	ploidian muutokset, jos niitä esiintyy, myös polyploidian ja/tai endoreduplikoituneiden solujen esiintymistaajuudet.

Tulosten tarkastelu

Päätelmät

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)	OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)	Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. Teoksessa: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington D.C., s. 275–306.

(3)	Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313–318.

(4)	Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167–189.

(5)	Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. Teoksessa: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, s. 1–15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368–379. Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. Teoksessa: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, s. 477–484.

(7)	Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472–474.

(8)	Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371–375.

(9)	Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135–140.

(10)	Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313–324.

(11)	Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313–319.

(13)	OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(14)	Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207–209.

(15)	Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291–294.

(16)	Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289–294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, teoksessa: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommitte on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, teoksessa: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184–232.

(19)	Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87–90.

(20)	Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29–46.

(21)	Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362–1364.

(22)	Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403–413.

Lisäys

MÄÄRITELMÄT

Aneuploidia: Yksittäisen tai useamman kuin yhden kromosomin mutta ei kuitenkaan koko kromosomiston (polyploidia) poikkeaminen kromosomien tavallisesta diploidisesta (tai haploidisesta) määrästä.

Sentromeeri: Kromosomin alue (alueet), johon (joihin) sukkularihmat ovat kiinnittyneet solunjakautumisen aikana. Tähän perustuu tytärkromosomien järjestäytynyt siirtyminen tytärsolujen napoihin.

Kemikaali: Aine tai seos

Kromosomien diversiteetti: Kromosomien muotojen (esimerkiksi metasentrinen, akrosentrinen jne.) ja kokojen diversiteetti.

Kromatidipoikkeavuus: Rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee yksittäisten kromatidien katkeamisena tai kromatidien katkeamisena ja uudelleenyhtymisenä.

Kromosomipoikkeavuus: Rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee molempien kromatidien katkeamisena tai katkeamisena ja uudelleenyhtymisenä samassa kohdassa.

Klastogeeni: Mikä tahansa kemikaali, joka aiheuttaa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia solupopulaatioissa tai organismeissa.

Aukko: Akromaattinen leesio, joka on pienempi kuin yhden kromatidin leveys ja johon liittyy minimaalinen kromatidien siirtymä.

Genotoksinen: Yleisnimitys kaikentyyppisille DNA- tai kromosomivaurioille, muun muassa katkeamisille, deleetioille, addukteille, nukleotidien muutoksille ja sidoksille, uudelleenjärjestäytymisille, mutaatioille, kromosomipoikkeavuuksille ja aneuploidialle. Kaikki genotoksiset vaikutukset eivät johda mutaatioihin tai pysyviin kromosomivaurioihin.

Mitoosi-indeksi (MI): Suhdeluku, joka saadaan jakamalla metafaasissa olevien solujen määrä solupopulaatiossa todettujen solujen kokonaismäärällä; ilmoittaa solujen proliferaatioasteen kyseisessä solupopulaatiossa.

Mitoosi: Solutuman jakautuminen, joka jaetaan yleensä profaasiin, prometafaasiin, metafaasiin, anafaasiin ja telofaasiin.

Mutageeninen: Aiheuttaa periytyvän muutoksen geenien DNA:n emäsparirakenteessa (-rakenteissa) tai kromosomirakenteessa (kromosomipoikkeavuudet).

Numeerinen poikkeavuus: Testissä käytetyille eläimille tyypillisestä normaalista kromosomimäärästä poikkeava kromosomien lukumäärä.

Polyploidia: Haploidisen kromosomimäärän (n) esiintyminen moninkertaisena, muu kuin diploidinen kromosomimäärä (3n, 4n jne.).

Rakenteellinen poikkeavuus: Kromosomirakenteen muutos, joka voidaan havaita solunjakautumisen metafaasivaiheen mikroskooppitutkimuksella ja joka ilmenee deleetioina, fragmentteina ja vaihdoksina.

Testikemikaali: Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

UVCB-aine: Koostumukseltaan tuntematon tai vaihteleva aine, kompleksi reaktiotuote tai biologinen materiaali

”

Korvataan B osassa oleva B.40 luku seuraavasti:

”B.40. IN VITRO IHOSYÖVYTTÄVYYS: IHON SÄHKÖVASTUSMÄÄRITYS -TESTIMENETELMÄ (TER)

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 430 (2015). Ihosyövyttävyydellä tarkoitetaan pysyvän ihovaurion eli orvaskeden läpi verinahkaan ulottuvan näkyvän kuolion ilmaantumista testiaineen annostelun jälkeen [Yhdistyneiden kansakuntien yhdenmukaistetussa kemikaalien luokittelu- ja merkintäjärjestelmässä (GHS) (1) sekä aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta annetussa asetuksessa (EU) 1272/2008 (CLP-asetus) (1) määritetyn mukaisesti]. Tässä päivitetyssä testimenetelmässä B.40 kuvataan in vitro -menetelmä, jolla voidaan tunnistaa syövyttämättömät ja syövyttävät aineet ja seokset YK:n GHS-järjestelmän (1) ja

Ihosyövyttävyyden arvioinnissa on yleensä käytetty koe-eläimiä (testimenetelmä B.4, joka vastaa OECD:n testiohjetta 404, hyväksytty ensimmäisen kerran 1981 ja tarkistettu 1992, 2002 ja 2015) (2). Nykyisen testimenetelmän B.40 lisäksi muita kemikaalien ihosyövyttävyyspotentiaalin testaamiseen validoituja ja hyväksyttyjä in vitro -testimenetelmiä ovat testimenetelmät B.40 a (vastaa OECD:n testiohjetta 431) (3) ja B.65 (vastaa OECD:n testiohjetta 435) (4). Myös näillä menetelmillä voidaan tarvittaessa tunnistaa syövyttävien kemikaalien alakategorioita. Useita validoituja in vitro -testimenetelmiä on hyväksytty testimenetelmäksi B.46 (vastaa OECD:n testiohjetta 439) (5), jota voidaan käyttää ihoärsytyksen testaukseen. Ihosyövyttävyyden ja -ärsytyksen testauksen ja arvioinnin yhdennettyjä lähestymistapoja sisältävässä OECD:n ohjeasiakirjassa kuvataan useita moduuleita, joihin on ryhmitelty erilaisia tietolähteitä ja analysointityökaluja. Lisäksi niissä annetaan ohjeita siitä, i) miten integroida ja käyttää nykyisiä testaukseen perustuvia ja testauksen ulkopuolella saatuja tietoja kemikaalien ihoärsyttävyyden ja ihosyövyttävyyden potentiaalin arvioinnissa, ja ii) selostetaan, miten toimitaan, kun lisätestaus on tarpeen (6).

Tässä testimenetelmässä tarkastellaan ihosyövyttävyyttä ihmisten terveyteen liittyvänä määrityskohteena. Kyseessä on rotan ihon sähkövastukseen perustuva testimenetelmä. Siinä käytetään ihonäytteitä tunnistamaan syövyttäviä aineita, jotka pystyvät tuhoamaan normaalin marraskeden eheyden ja läpäisynestokyvyn. Vastaava OECD:n testiohje hyväksyttiin alun perin vuonna 2004, ja sitä päivitettiin vuonna 2015 ihosyövyttävyyden ja -ärsytyksen testauksen ja arvioinnin yhdennettyjen lähestymistapojen mukaiseksi.

Sääntelytarkoituksiin käytettävien in vitro -ihosyövyttävyystestien arvioimiseksi tehtiin validointia edeltäviä tutkimuksia (7), joiden jälkeen tehtiin virallinen validointitutkimus ihosyövyttävyyden arvioinnissa käytettävästä rotan ihon sähkövastusmääritykseen perustuvasta testimenetelmästä (8) (9) (10) (11). Näiden tutkimusten tulosten perusteella annettiin suositus, jonka mukaan sähkövastusmääritysmenetelmää (joka on nimetty validoiduksi vertailumenetelmäksi) voidaan käyttää sääntelytarkoituksissa in vivo -ihosyövyttävyyden arviointiin (12) (13) (14).

Ennen kuin sääntelytarkoituksissa voidaan käyttää muuta ihosyövyttävyyden arviointiin ehdotettua samankaltaista tai muutettua in vitro -sähkövastusmääritysmenetelmää kuin validoitua vertailumenetelmää, on selvitettävä ehdotetun menetelmän luotettavuus, merkityksellisyys (tarkkuus) ja sen ehdotetun käytön rajoitukset, jotta voidaan varmistua siitä, että se on samanlainen kuin validoitu vertailumenetelmä, suoritusvaatimusten mukaisesti (15). OECD:n sopimuksen mukainen tietojen vastavuoroinen hyväksyntä taataan vasta, kun ehdotettu uusi tai päivitetty suoritusvaatimusten mukainen testimenetelmä on tarkistettu ja sisällytetty OECD:n vastaavaan testiohjeeseen.

MÄÄRITELMÄT

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Validointitutkimuksessa (10) ja muissa julkaistuissa tutkimuksissa (16) (17) on todettu, että rotan ihon sähkövastusmääritys -testimenetelmällä pystytään erottelemaan tunnetut ihoa syövyttävät ja syövyttämättömät aineet siten, että 122 ainetta sisältävän tietokannan osalta kokonaisherkkyys on 94 prosenttia (51/54) ja spesifisyys 71 prosenttia (48/68).

Tällä testimenetelmällä tarkastellaan ihosyövyttävyyttä in vitro. Sen perusteella voidaan tunnistaa syövyttämättömiä ja syövyttäviä testikemikaaleja YK:n GHS-järjestelmän ja CLP-asetuksen mukaisesti. Validointitutkimuksissa (8) (9) (10) (11) osoitetun mukaisesti tämän testimenetelmän rajoitus on kuitenkin se, ettei sillä voida luokitella syövyttäviä aineita ja seoksia YK:n GHS-järjestelmän ja CLP-asetuksen mukaisiin alaluokkiin. Siitä, miten tätä testimenetelmää käytetään, määrätään sovellettavassa sääntelykehyksessä. Tällä testimenetelmällä ei saada asianmukaista tietoa ihoärsytyksestä, mutta testimenetelmä B.46 koskee nimenomaan terveysvaikutusta ihoärsytys in vitro (5). Jotta paikalliset ihovaikutukset ihon kerta-altistuksen jälkeen voidaan arvioida kattavasti, on tukeuduttava ihosyövyttävyyden ja -ärsytyksen testauksen ja arvioinnin yhdennettyjä lähestymistapoja koskevaan OECD:n ohjeasiakirjaan (6).

Tämän testimenetelmän perusteena olevassa validointitutkimuksessa on testattu laaja joukko kemikaaleja, jotka ovat pääasiassa aineita, ja validointitutkimuksen empiirinen tietokanta sisälsi 60 ainetta, jotka kuuluvat hyviin moniin kemikaaliluokkiin (8) (9). Kaikkien saatavilla olevien tietojen perusteella tätä testimenetelmää voidaan soveltaa hyvin moniin kemikaaliluokkiin ja aineiden fysikaalisiin olomuotoihin, myös nesteisiin, puolikiinteisiin ja kiinteisiin aineisiin sekä vahamaisiin aineisiin. Koska tiettyjen testiaineiden fysikaalisten olomuotojen testauksesta ei ole vielä saatavilla sopivia vertailutietoja, on syytä mainita, että validoinnissa arvioitiin melko pieni määrä vahoja ja syövyttäviä kiinteitä aineita. Nesteet voivat olla vesiliuoksia tai orgaanisia liuoksia; kiinteät aineet voivat olla joko veteen liukenevia tai veteen liukenemattomia. Jos voidaan osoittaa, ettei testimenetelmä sovi käytettäväksi tiettyjen aineluokkien kanssa, testimenetelmää ei pidä käyttää niihin. Sen ohella, että tämä testimenetelmä soveltuu aineiden testaamiseen, sen oletetaan soveltuvan myös seosten testaamiseen. Koska seokset kattavat laajan joukon luokkia ja koostumuksia ja koska seosten testaamisesta on tällä hetkellä saatavilla vain vähän tietoa, niissä tapauksissa, joissa voidaan osoittaa, ettei testimenetelmä sovi käytettäväksi tiettyjen aineluokkien kanssa (esimerkiksi Eskesin ja muiden (2012) ehdottaman strategian mukaisesti (18)), testimenetelmää ei pidä käyttää niihin. Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, antaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos antaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa. Kaasuja ja aerosoleja ei ole vielä arvioitu validointitutkimuksissa (8) (9). Vaikka voidaan ajatella, että niitä voidaan testata sähkövastusmääritysmenetelmällä, tällä testimenetelmällä kaasuja ja aerosoleja ei kuitenkaan voida testata.

TESTIN PERIAATE

10.

Testikemikaalia levitetään enintään 24 tunnin ajaksi ihonäytteiden orvaskesipinnalle kaksikammioisessa testijärjestelmässä, jossa ihonäytelevyt toimivat kammioiden välisenä erotusseinänä. Ihonäytteet otetaan inhimillisellä tavalla lopetetuista 28–30 päivän ikäisistä rotista. Kemikaalin katsotaan olevan syövyttävä, jos se pystyy tuhoamaan normaalin marraskeden eheyden ja läpäisynestokyvyn, mikä mitataan ihon sähkövastuksen pienenemisenä tietyn raja-arvon alapuolelle (16) (ks. 32 kohta) Rotan ihon sähkövastuksen raja-arvoksi valittiin 5 kΩ. Valinta perustui laajoihin tietoihin useista aineista, joissa suurin osa arvoista selvästi joko ylitti kyseisen arvon (usein > 10 kΩ) tai alitti sen (usein < 3 kΩ) (16). Yleensä testikemikaalit, jotka eivät ole syövyttäviä eläimille mutta jotka voivat olla joko ärsyttäviä tai ärsyttämättömiä, eivät laske ihon sähkövastusta tämän raja-arvon alle. Lisäksi muiden ihonäytteiden tai muiden laitteiden käyttö voi muuttaa raja-arvoa, mikä edellyttää lisävalidointia.

11.

Testimenetelmä sisältää väriaineensitomisvaiheen, jotta voidaan vahvistaa positiiviset tulokset tapauksissa, joissa sähkövastusarvo on noin 5 kΩ. Väriaineensitomisvaiheessa voidaan määrittää, johtuuko ionien läpäisykyvyn lisääntyminen marraskeden rakenteen tuhoutumisesta. Rotan ihoa käyttävän sähkövastusmenetelmän on osoitettu kykenevän ennustamaan syövyttävyyttä in vivo kanissa, jota käytettiin koe-eläimenä testimenetelmän B.4 mukaisessa testissä (2).

PÄTEVYYDEN OSOITUS

12.

Ennen kuin laboratorio alkaa käyttää tämän rotan ihon sähkövastusmääritys -testimenetelmän mukaista menetelmää rutiininomaisesti, sen on osoitettava tekninen pätevyytensä luokittelemalla taulukossa 1 suositellut 12 ainetta oikein. Jos luettelossa mainittua ainetta ei ole saatavilla tai jos se on perusteltua, voidaan käyttää toista ainetta, josta on saatavana asianmukaiset in vivo- ja in vitro -vertailutiedot (esimerkiksi vertailukemikaalien luettelosta (16)), kunhan sovelletaan taulukossa 1 kuvattuja samoja valintaperusteita.

Taulukko 1

Pätevyyden osoittamiseen tarkoitetut aineet (2)

Aine	CAS-nro	Kemikaaliluokka (3)	YK:n GHS / CLP Lk. in vivo -tulosten perusteella (4)	VVM Lk. in vitro -tulosten perusteella	Olomuoto	pH (5)
In vivo syövyttävät aineet
N,N’-dimetyyli-dipropyleenitriamiini	10563-29-8	orgaaninen emäs	1A	6 × C	N	8,3
1,2-diaminopropaani	78-90-0	orgaaninen emäs	1A	6 × S	N	8,3
Rikkihappo (10 %)	7664-93-9	epäorgaaninen happo	(1A/)1B/1C	5 × S 1 × x ES	N	1,2
Kaliumhydroksidi (10 % aq.)	1310-58-3	epäorgaaninen emäs	(1A/)1B/1C	6 × S	N	13,2
Oktaanihappo (kapryylihappo)	124-07-2	orgaaninen happo	1B/1C	4 × S2 × ES	N	3,6
2-tert-butyylifenoli	88-18-6	Fenoli	1B/1C	4 × S 2 × ES	N	3,9
In vivo syövyttämättömät aineet
Isosteariinihappo	2724-58-5	Orgaaninen happo	ES	6 × ES	N	3,6
4-amino-1,2,4-triatsoli	584-13-4	Orgaaninen emäs	ES	6 × ES	K	5,5
Fenetyylibromidi	103-63-9	Elektrofiili	ES	6 × ES	N	3,6
4-(metyylitio)-bentsaldehydi	3446-89-7	Elektrofiili	ES	6 × ES	N	6,8
1,9-dekadieeni	1647-16-1	Neutraali orgaaninen aine	ES	6 × ES	N	3,9
Tetrakloorietyleeni	127-18-4	Neutraali orgaaninen aine	ES	6 × ES	N	4,5
Lyhenteet: aq = vesiliuos; CASRN = Chemical Abstracts Service -rekisterinumero; VVM = validoitu vertailumenetelmä; S= syövyttävä ES=syövyttämätön.

MENETTELY

13.

Ihon syövyttävyyden tutkimisessa käytettävälle rotan ihon sähkövastusmääritys -testimenetelmälle on laadittu vakiotoimintamenettelyt (19). Tämän testimenetelmän mukaisten rotan ihon sähkövastusmääritys -testimenetelmien on oltava seuraavien edellytysten mukaiset:

Eläimet

14.

Koe-eläiminä on käytettävä rottia, koska aiemmissa tutkimuksissa (12) niiden ihon on osoitettu olevan herkkä tällä testimenetelmällä tutkittaville aineille ja tämä on ainoa iholähde, joka on virallisesti validoitu (8) (9). Rotan ikä (jolloin ihonäyte otetaan) ja kanta ovat erityisen tärkeitä, jotta voidaan varmistaa, että rottien karvatupet ovat vielä uinuvassa tilassa ennen aikuisen yksilön karvankasvun alkua.

15.

Nuorten (noin 22 päivän ikäisten) uros- tai naarasrottien (Wistar tai vastaava kanta) selästä ja kyljistä ajetaan karvat tarkasti pienillä karvaleikkureilla. Sen jälkeen eläimet pestään huolellisesti pyyhkimällä, ja alue, jolta on poistettu karvat, käsitellään antibioottiliuoksella (jossa on esimerkiksi streptomysiiniä, penisilliiniä, kloramfenikolia ja amfoterisiiniä bakteerikasvua tehokkaasti estävinä pitoisuuksina). Eläimet pestään jälleen antibioottiliuoksella kolmantena tai neljäntenä päivänä ensimmäisen pesun jälkeen ja käytetään kokeisiin kolmen päivän sisällä toisesta pesusta, kun marraskesi on toipunut karvojen poistosta.

Ihonäytteiden valmistus

16.

Eläimet lopetetaan inhimillisesti 28–30 päivän ikäisinä; ikävaatimus on ehdoton. Kunkin eläimen selkä- ja kylkinahka poistetaan ja nahasta kuoritaan tarkasti ylimääräinen ihonalainen rasva. Ihosta otetaan läpimitaltaan noin 20 mm:n suuruiset näytteet. Ihonäytteet voidaan varastoida ennen niiden käyttöä, jos voidaan osoittaa, että positiivisilla ja negatiivisilla kontrolleilla saatavat tiedot vastaavat tuoreilla näytteillä saatuja.

17.

Kukin ihonäyte asetetaan polytetrafluoroetyleeniputken (PTFE-putken) toisen pään yli siten, että orvaskesipinta on kosketuksissa putken kanssa. Ihonäyte kiristetään paikalleen kumisella O-renkaalla, ja liika nahka leikataan pois. O-rengas tiivistetään huolellisesti PTFE-putken päähän vaseliinilla. Putki kiinnitetään jousipidikkeellä koeastian sisälle, jossa on MgSO4-liuosta (154 mM) (kuva 1). Ihonäyte on upotettava MgSO4-liuokseen kokonaan. Yhdestä rotan nahasta on mahdollista saada 10–15 ihonäytettä. Kuvassa 2 esitetään putken ja O-renkaan mitat.

18.

Ennen testauksen alkua mitataan kahden ihonäytteen sähkövastus kunkin eläimen nahan laadunvarmistusmenettelynä. Kummankin näytteen vastusarvon on oltava yli 10 k,Ω jotta muita nahasta saatuja ihonäytteitä voidaan käyttää testissä. Jos vastusarvo on alle 10 kΩ, kaikki samasta nahasta saadut näytteet on hylättävä.

Testikemikaalin ja kontrolliaineiden annostelu

19.

Kussakin testissä (kokeessa) on käytettävä samanaikaisia positiivisia ja negatiivisia kontrolleja, jotta voidaan varmistaa, että testimalli on tarpeeksi tehokas. Kussakin testissä (kokeessa) on käytettävä vain yhdestä eläimestä otettuja ihonäytteitä. Suositellut kontrolliaineet ovat 10 M suolahappo (positiivinen kontrolli) ja tislattu vesi (negatiivinen kontrolli).

20.

Nestemäiset testikemikaalit (150 μl) applikoidaan tasaisesti putken sisäpuolella olevalle orvaskesipinnalle. Kun testataan kiinteitä aineita, ainetta on pantava näytteen päälle tasaisesti riittävä määrä, jotta se peittää koko orvaskesipinnan. Kiinteän aineen päälle lisätään sitten deionisoitua vettä (150 lμ), ja putkea ravistellaan varovasti. Jotta kiinteä aine olisi mahdollisimman hyvin kosketuksissa ihon kanssa, testikemikaalia voidaan sulattaa tai pehmentää lämmittämällä se 300:seen tai se voidaan jauhaa rakeiseksi tai jauhemaiseksi.

21.

Kutakin testi- ja kontrollikemikaalia kohti käytetään jokaisessa testissä (kokeessa) kolme ihonäytettä. Testikemikaaleja pidetään ihonäytteissä 24 tuntia 20–23 °C:n lämpötilassa. Testikemikaali poistetaan pesemällä ihonäytettä vesihanan alla enintään huoneenlämpötilassa, kunnes ainetta ei enää irtoa.

Ihon sähkövastuksen mittaukset

22.

Ihon impedanssi mitataan ihon sähkövastuksena matalajännitevaihtovirtasillalla (Wheatstone-silta) (18). Sillan yleiset eritelmät ovat: käyttöjännite 1–3 volttia, vaihtovirta 50–1 000 Hz (sini- tai suorakaideaalto) ja mittausalue vähintään 0,1–30 kΩ. Validointitutkimuksessa käytetty silta mittasi induktanssin aina arvoon 2 000 H, kapasitanssin arvoon 2 000 μF ja vastuksen arvoon 2 MΩ taajuuksilla 100 Hz tai 1 kHz sarja-arvoina tai rinnakkaisina arvoina. Syövyttävyystestissä ihon sähkövastusmäärityksen mittaukset kirjataan vastuksena taajuudella 100 Hz ja sarja-arvoina. Ennen sähkövastuksen mittausta ihon pintajännitystä pienennetään lisäämällä putkeen 70-prosenttista etanolia sen verran, että orvaskesi peittyy. Etanoli poistetaan putkesta muutaman sekunnin kuluttua, ja kudos hydratoidaan lisäämällä 3 ml MgSO4-liuosta (154 mM). Mittaussillan elektrodit asetetaan ihonäytteen molemmille puolille vastuksen mittaamiseksi kilo-ohmeina (kΩ) ihonäytettä kohti (kuva 1). Elektrodien mitat ja hauenleukapidikkeen alapuolella olevan elektrodin pituus esitetään kuvassa 2. Sisemmän elektrodin pidike pidetään vastusmittauksen aikana PTFE-putken päällä sen varmistamiseksi, että sama pituus elektrodia on upotettuna MgSO4-liuokseen. Ulompi elektrodi asetetaan koeastian sisälle siten, että se lepää astian pohjalla. Jousipidikkeen ja PTFE-putken pohjan välinen etäisyys pidetään vakiona (kuva 2), koska tämä etäisyys vaikuttaa mitattavaan vastuksen arvoon. Samoin sisemmän elektrodin ja ihonäytteen välisen etäisyyden on oltava vakio ja mahdollisimman pieni (1–2 mm).

23.

Jos mitattu vastusarvo on yli 20 kΩ, se voi johtua siitä, että testikemikaalin jäänteet peittävät ihonäytteen orvaskesipinnan. Tätä kerrosta voidaan yrittää poistaa esim. sulkemalla PTFE-putki peukalolla (suojakäsine kädessä) ja ravistelemalla putkea noin 10 sekuntia. MgSO4-liuos heitetään pois ja vastusmittaus toistetaan tuoreen MgSO4-liuoksen kanssa.

24.

Testauslaitteiden ominaisuudet ja mitat sekä koemenetelmä voivat vaikuttaa saatuihin ihon sähkövastusarvoihin. Viiden kΩ:n syövyttävyysraja perustuu tässä testimenetelmässä kuvatuilla erityislaitteilla ja menettelyllä saatuihin mittaustuloksiin. Jos testiolosuhteita muutetaan tai jos käytetään erilaisia laitteita, voi olla tarpeen käyttää eri raja- ja kontrolliarvoja. Siksi menetelmä ja vastuksen raja-arvot pitää kalibroida testaamalla pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja aineita, jotka on valittu validointitutkimuksessa käytettyjen aineiden joukosta (8) (9) tai vastaavista kemikaaliluokista kuin testattavat kemikaalit. Taulukossa 1 on luettelo sopivista pätevyyden osoittamiseen tarkoitetuista aineista.

Väriaineen sitomista mittaavat menetelmät

25.

Altistus tietyille syövyttämättömille materiaaleille voi vähentää vastusta alle 5 kΩ:n raja-arvon ja mahdollistaa ionien pääsyn marraskeden läpi, jolloin sähkövastus pienenee (9). Esimerkiksi neutraalit orgaaniset aineet ja pinta-aktiiviset aineet (mm. puhdistusaineet, emulgointiaineet ja muut pinta-aktiiviset aineet) voivat poistaa ihon lipidejä ja lisätä ihon läpäisevyyttä ioneille. Jos tällaisilla kemikaaleilla saadut ihon sähkövastusarvot ovat alle tai noin 5 kΩ mutta jos ihonäytteissä ei ole näkyvää vauriota, on määritettävä väriaineen tunkeutuminen kontrollinäytteiden ja käsiteltyjen näytteiden kudokseen sen selvittämiseksi, johtuvatko ihon sähkövastusarvot ihon läpäisevyyden lisääntymisestä vai ihon syöpymästä (7) (9). Kun on kyse syöpymästä, jossa marraskesi on vaurioitunut, ihon pinnalle levitetty sulforodamiini B -väriaine tunkeutuu nopeasti ihoon ja värjää pinnanalaisen kudoksen. Kyseinen väriaine on stabiili useiden eri aineiden kanssa, eikä jäljempänä kuvattu uuttomenettely vaikuta siihen.

Sulforodamiini B -väriaineen levittäminen ja poistaminen

26.

Ihon sähkövastusmäärityksen jälkeen magnesiumsulfaatti poistetaan putkesta. Tämän jälkeen tutkitaan tarkasti, onko ihossa selviä vaurioita. Jos selviä suuria vaurioita (esimerkiksi reikiä) ei ole, kunkin ihonäytteen orvaskeden pinnalle levitetään 150 μl tislatulla vedellä tehtyä 10-prosenttista (paino/tilavuus) laimennosta sulforodamiini B -väriaineesta (Acid Red 52; C.I. 45100; CAS-numero 3520-42-1) kahdeksi tunniksi. Sen jälkeen näitä ihonäytteitä pestään vesihanan alla huoneenlämpötilassa noin 10 sekuntia liiallisen tai sitoutumattomanväriaineen poistamiseksi. Ihonäytteet poistetaan varovasti PTFE-putkista ja pannaan pulloon (esim. 20 ml:n lasinen tuikelaskentapullo), jossa on deionisoitua vettä (8 ml). Pulloja ravistellaan varovasti 5 minuuttia mahdollisen jäljellä olevan sitoutumattoman väriaineen poistamiseksi. Huuhtelu toistetaan, ja sen jälkeen ihonäytteet otetaan pulloista, pannaan toisiin pulloihin, joissa on 5 ml 30-prosenttista (paino/tilavuus) natriumdodekyylisulfaattia (SDS) tislatussa vedessä, ja inkuboidaan yön yli 60 °C:ssa.

27.

Inkubaation jälkeen ihonäytteet otetaan pulloista ja heitetään pois. Jäljellä olevaa liuosta sentrifugoidaan 8 minuuttia 21 °C:ssa (suhteellinen keskipakoisvoima ~175 × g). Supernatantista otetaan 1 ml:n näyte, joka laimennetaan 1:5:een (tilavuus/tilavuus) [ts. 1 ml + 4 ml] 30-prosenttisella (paino/tilavuus) SDS:llä tislatussa vedessä. Liuoksen optinen tiheys mitataan aallonpituudella 565 nm.

Väriaineen pitoisuuden laskeminen

28.

Sulforodamiini B -väriaineen pitoisuus ihonäytteessä lasketaan optisen tiheyden arvoista (9) (sulforodamiini B:n molaarinen absorptiokerroin aallonpituudella 565 nm = 8,7 × l04; molekyylipaino = 580). Väriaineen pitoisuus ihonäytteessä määritetään käyttämällä sopivaa kalibrointikäyrää, ja väriaineen keskiarvopitoisuus lasketaan sitten rinnakkaisnäytteistä.

Hyväksymisperusteet

29.

Ihon sähkövastusmittausten keskiarvot hyväksytään, jos samaan aikaan mitatut positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden määritysten tulokset ovat tälle menetelmälle määritellyissä hyväksyttävissä rajoissa testilaboratoriossa. Hyväksyttävät vastusalueet käytettäessä tätä menetelmää ja näitä laitteita esitetään seuraavassa taulukossa:

Kontrolli	Aine	Vastusalue (kΩ)
Positiivinen	10 M kloorivetyhappo	0,5–1,0
Negatiivinen	Tislattu vesi	10–25

30.

Väriaineen sitoutumiskokeen keskiarvotulokset hyväksytään, jos samaan aikaan tehtyjen kontrolliaineiden määritysten tulokset ovat tälle menetelmälle määritellyissä hyväksyttävissä rajoissa. Suositellut kontrolliaineiden hyväksyttävät väriainepitoisuusalueet käytettäessä tätä menetelmää ja näitä laitteita esitetään seuraavassa taulukossa:

Kontrolli	Aine	Väriaineen pitoisuusalue (μg/näyte)
Positiivinen	10 M kloorivetyhappo	40–100
Negatiivinen	Tislattu vesi	15–35

Tulosten tulkitseminen

31.

Sähkövastusmäärityksen raja-arvo, jolla erotetaan syövyttävät testikemikaalit syövyttämättömistä, määritettiin testimenetelmän optimoinnin aikana, testattiin validointia edeltävässä vaiheessa ja vahvistettiin virallisessa validointitutkimuksessa.

32.

Rotan ihon sähkövastusmääritykseen perustuvan ihosyövyttävyyden testimenetelmässä käytettävä ennustemalli (9) (19), joka liittyy YK:n GHS-järjestelmän / CLP-asetuksen mukaiseen luokitusjärjestelmään, kuvataan alla:

Testiaineen katsotaan olevan ihoa syövyttämätön,

i)	jos testikemikaalille saatu ihon sähkövastusarvo on suurempi kuin (>) 5 kΩ, tai

ii)

jos testikemikaalille saatu ihon sähkövastusarvo (keskiarvo) on pienempi tai yhtä suuri kuin (≤) 5 kΩ ja

—	ihonäytteessä ei ole ilmeisiä vaurioita (esimerkiksi reikiä) ja

—	ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus on pienempi (<) kuin samanaikaisesti määritetyn positiivisen kontrollin (10M HCl) aiheuttama ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus (ks. positiivisen kontrollin arvot 30 kohdasta).

Testiaineen katsotaan olevan ihoa syövyttävä,

i)	jos testikemikaalille saatu ihon sähkövastusarvo (keskiarvo) on pienempi tai yhtä suuri kuin (≤) 5 kΩ ja ihonäytteissä on selviä vaurioita (esimerkiksi reikiä), tai

ii)

jos testikemikaalille saatu ihon sähkövastusarvo (keskiarvo) on pienempi tai yhtä suuri kuin (≤) 5 kΩ ja

—	ihonäytteessä ei ole selviä vaurioita (esimerkiksi reikiä), mutta

—	ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus on suurempi tai yhtä suuri (≥) kuin samanaikaisesti määritetyn positiivisen kontrollin (10M HCl) aiheuttama ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus (ks. positiivisen kontrollin arvot 30 kohdasta).

33.

Kun testikemikaalin luokittelu on yksiselitteinen, yleensä vähintään kolme kudosnäytettä käsittävä testiajo (koe) riittää. Jos luokittelu on vaikeaa, esimerkiksi jos rinnakkaisnäytteille saadut tulokset ovat erilaiset ja/tai jos sähkövastusarvon keskiarvo on 5 ± 0,5 kΩ, on harkittava toista riippumatonta testiajoa (koetta) ja myös kolmatta, jos kahden ensimmäisen testiajon (kokeiden) tulokset poikkeavat toisistaan.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tiedot

34.

Vastusarvot (kΩ) ja tarvittaessa väripitoisuusarvot (μg/näyte) sekä testikemikaalista että positiivisista ja negatiivisista kontrolleista on ilmoitettava taulukossa. Myös tiedot jokaisen testiajon (kokeen) yksittäisistä rinnakkaisnäytteistä ja keskiarvot ± keskihajonta on ilmoitettava. Niin ikään kaikki toistetut kokeet on raportoitava. Ihonäytteissä havaitut vauriot on ilmoitettava jokaisen testikemikaalin osalta.

Testiraportti

35.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

Testikemikaali ja kontrolliaineet:

—	Yhdestä ainesosasta koostuva aine: kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa epäpuhtauksien kemialliset tunnistetiedot sen mukaan, mikä on käytännössä mahdollista, jne.

—	Monesta ainesosasta muodostuva aine, UVCB-aineet ja seos: luonnehditaan mahdollisimman tarkoin ainesosien kemiallisten tunnistetietojen (ks. edellä), esiintymistiheyden ja merkityksellisten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla

—	ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut merkitykselliset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

—	lähde, erän numero, jos saatavilla

—	tarvittaessa testikemikaalin ja/tai kontrolliaineen käsittely ennen testiä (esimerkiksi lämmittäminen tai jauhaminen)

—	testikemikaalin stabiilisuus, viimeinen käyttöpäivä tai uudelleenanalysointipäivä, jos se on tiedossa

—	säilytysolosuhteet.

Koe-eläimet:

—	käytetty kanta ja sukupuoli

—	eläinten ikä, kun niitä käytetään luovuttajaeläiminä

—	lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.

—	tiedot ihonäytteestä.

Testiolosuhteet:

—	testilaitteiden kalibrointikäyrät

—	väriaineensitomistestin kalibrointikäyrät, optisten tiheysarvojen mittaamisessa käytetty kaistanpäästösuodatin ja mittalaitteen (esimerkiksi spektrofotometrin) optisen tiheyden lineaarisuusalue tarvittaessa

—	tiedot ihon sähkövastuksen mittauksiin käytetystä testimenettelystä

—	tiedot väriaineensitomistestissä käytetystä testimenettelystä (tarvittaessa)

—	käytetyt testiannokset, altistusjakson (-jaksojen) kesto ja altistuslämpötila(t)

—	tiedot altistusjakson jälkeen käytetystä pesumenetelmästä

—	testikemikaalia ja kontrolleja (positiiviset ja negatiiviset kontrollit) kohti käytettyjen rinnakkaisihonäytteiden lukumäärä

—	kuvaus testimenettelyn mahdollisista muutoksista

—

viittaukset mallia koskeviin aiempiin tietoihin. Näitä voivat olla esimerkiksi

i)	positiivisten ja negatiivisten kontrollien sähkövastusarvojen (yksikössä kΩ) hyväksyttävyys verrattuna positiivisten ja negatiivisten kontrollien vastusalueisiin

ii)	positiivisten ja negatiivisten kontrollien väriaineen pitoisuusarvojen (yksikössä μg/näyte) hyväksyttävyys verrattuna positiivisten ja negatiivisten kontrollien väriaineen pitoisuusalueisiin

iii)	testitulosten hyväksyttävyys verrattuna rinnakkaisihonäytteiden aikaisempaan vaihteluun

—	kuvaus sovelletuista päätöksentekoperusteista / käytetystä ennustemallista.

Tulokset:

—

taulukko sähkövastusmäärityksen ja (tarvittaessa) väriaineensitomistestin tiedoista jokaisen testikemikaalin ja kontrollin osalta, jokaisesta testiajosta (kokeesta) ja jokaisesta rinnakkaisihonäytteestä (yksittäiset eläimet ja yksittäiset ihonäytteet), keskiarvot, keskihajonnat ja variaatiokertoimet

—	kuvaus mahdollisista havaituista vaikutuksista

—	tulosten perusteella tehty luokitus ja tiedot käytetystä ennustemallista ja/tai käytetyistä päätöksentekoperusteista.

Tulosten tarkastelu

Päätelmät

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)	Yhdistyneet Kansakunnat (YK) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Saatavana osoitteessa [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)	Tämän liitteen luku B.4, Akuutti toksisuus: ihoärsyttävyys/-syövyttävyys.

(3)	Tämän liitteen luku B.40 a, In vitro -ihmisihomallitesti.

(4)	Tämän liitteen luku B.65, In vitro -kalvoestetestimenetelmä.

(5)	Tämän liitteen luku B.46, In vitro -ihoärsyttävyys: rekonstruoidun ihmisorvaskeden testimenetelmä.

(6)	OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219–255.

(8)	Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471–482.

(9)	Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro 12, 483–524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop. ATLA 23, 129–147.

(11)	ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97–3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)	EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(13)	ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Taloudellisen yhteistyön ja kehityksen järjestö, Pariisi.

(16)	Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol.24, 507–512.

(17)	Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6, 191–194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 62, 393–403.

(19)	Sähkövastusmääritystestin vakiotoimintamenettelyt (joulukuu 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)	OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Devlopment, Paris.

Kuva1

Rotan ihon Sähkövastuksen Määrityslaite

Kuva 2

Polytetrafluoroetyleeniputken (PTFE-Putken), Koeastioiden ja Elektrodien mitat

Yllä kuvattujen laitteiden kriittiset tekijät:

—	PTFE-putken sisähalkaisija

—	elektrodien pituus suhteessa PTFE-putkeen ja koeastiaan siten, että ihonäyte ei ole kosketuksissa elektrodeihin ja että vakiomitta elektrodia on kosketuksissa MgSO4-liuoksen kanssa

—	MgSO4-liuosta on oltava koeastiassa sellainen määrä, että nesteellä on tietty syvyys suhteessa nesteen tasoon PTFE-putkessa (kuvassa 1 esitetyllä tavalla)

—	ihonäyte on kiinnitettävä PTFE-putkeen tarpeeksi hyvin, jotta sähkövastus ilmentäisi ihon ominaisuuksia oikein.

Lisäys

MÄÄRITELMÄT

Tarkkuus : Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen ero. Tarkkuus on testimenetelmän suorituskyvyn mitta ja yksi merkityksellisyyden osatekijöistä. Tarkkuutta ja vastaavuutta (konkordanssi) käytetään usein toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta (20).

S : Syövyttävä

Kemikaali : Aine tai seos.

Vastaavuus : Testimenetelmän suorituskyvyn mitta sellaisille testimenetelmille, joiden tulokset ovat luokittelevia, ja yksi merkityksellisyyden osatekijöistä. Vastaavuutta ja tarkkuutta käytetään joskus toisiaan korvaavasti, ja vastaavuus on määritelty kaikkien niiden testikemikaalien osuudeksi, jotka on luokiteltu oikein positiivisiksi tai negatiivisiksi. Vastaavuuteen vaikuttaa suuresti positiivisten tulosten esiintyminen tutkittavien testikemikaalien tyypeissä (20).

GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, YK:n kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukaistettu luokitus- ja merkintäjärjestelmä) : Tässä järjestelmässä kemikaalit (aineet ja seokset) luokitellaan vakioitujen fysikaalisten sekä terveys- ja ympäristövaarojen tyyppien ja -tasojen mukaisesti, ja niihin liittyvät vaaraviestinnän tunnukset, kuten kuvamerkit, huomiosanat, vaaralausekkeet, turvalausekkeet ja käyttöturvallisuustiedotteet, jotta voidaan välittää tietoa kemikaalien haittavaikutuksista ihmisten ja ympäristön suojelemiseksi (esimerkiksi työnantajille, työntekijöille, kuljetushenkilökunnalle, kuluttajille ja pelastushenkilöstölle) (1).

IATA : Integrated Approach on Testing and Assessment, testauksen ja arvioinnin yhdennetyt lähestymistavat.

Seos : Seos tai liuos, joka koostuu vähintään kahdesta aineesta.

Yhdestä ainesosasta koostuva aine : Aine, jossa sen kvantitatiivisen koostumuksen perusteella on vähintään 80 painoprosenttia yhtä pääainesosaa.

Useasta ainesosasta koostuva aine : Aine, jossa sen kvantitatiivisen koostumuksen perusteella on useampaa kuin yhtä pääainesosaa ja jonka ainesosien pitoisuudet ovat vähintään 10 painoprosenttia ja alle 80 painoprosenttia. Useasta ainesosasta koostuva aine syntyy valmistusprosessin tuloksena. Seoksen ja useasta ainesosasta koostuvan aineen välinen ero on se, että seos saadaan aikaan sekoittamalla kahta tai useampaa ainetta ilman kemiallista reaktiota. Useasta ainesosasta muodostuva aine syntyy kemiallisen reaktion tuloksena.

ES : Ei syövyttävä.

OD : Optinen tiheys.

PK : Positiivinen kontrolli, näyte, jossa on kaikki testijärjestelmän osat ja joka on käsitelty aineella, jonka tiedetään aiheuttavan positiivisen vasteen. Vaste ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu ajan funktiona voidaan arvioida.

Suoritusvaatimukset : Validoituun testimenetelmään perustuvat vaatimukset, joiden avulla arvioidaan ehdotetun toiminnallisesti ja mekanistisesti samanlaisen testimenetelmän vertailtavuutta. Tähän sisältyvät: i) testimenetelmän oleelliset osat, ii) vähimmäisluettelo vertailukemikaaleista, jotka on valittu niiden kemikaalien joukosta, joita on käytetty osoittamaan validoidun vertailumenetelmän hyväksyttävää suorituskykyä; ja iii) samanlaiset validoidusta testimenetelmästä saatuihin tuloksiin perustuvat luotettavuuden ja tarkkuuden tasot, jotka ehdotetun testimenetelmän olisi osoitettava, kun sitä arvioidaan vertailukemikaalien vähimmäisluettelon avulla.

Merkityksellisyys : Kuvaus testimenetelmän ja toivotun vaikutuksen välisestä suhteesta ja siitä, onko testimenetelmä tarkoituksenmukainen ja hyödyllinen tiettyä tarkoitusta varten. Merkityksellisyydellä tarkoitetaan sitä, missä määrin testimenetelmällä voidaan tarkasti mitata tai ennustaa haluttua biologista vaikutusta. Merkityksellisyyden yhteydessä on huomioitava myös testimenetelmän tarkkuus (vastaavuus) (20).

Luotettavuus : Mittaa sitä, miten testimenetelmä voidaan toistaa samassa laboratoriossa tai eri laboratorioissa ajan myötä käytettäessä samaa protokollaa. Se arvioidaan laskemalla toistettavuus samassa laboratoriossa ja eri laboratorioissa (20).

Herkkyys : Niiden positiivisten/aktiivisten kemikaalien osuus, jotka on luokiteltu testimenetelmällä oikein. Sillä mitataan luokittavia tuloksia tuottavan testimenetelmän tarkkuutta. Herkkyys on tärkeää ottaa huomioon arvioitaessa testimenetelmän merkityksellisyyttä (20).

Ihosyövyttävyys in vivo : Korjautumattoman ihovaurion eli näkyvän orvasketeen ja verinahkaan ulottuvan kuolion ilmaantuminen enintään neljä tuntia kestäneen testikemikaalin annostelun jälkeen. Tyypillisiä syöpymisreaktioita ovat haavaumat, verenvuoto, veriset ruvet sekä 14 päivän tarkkailujakson lopussa ihon vaalenemisen aiheuttama värinmuutos, kokonaan kaljuuntuneet alueet ja arvet. Epäselvien vaurioiden yhteydessä on harkittava histopatologista tutkimusta.

Spesifisyys : Niiden negatiivisten/inaktiivisten kemikaalien osuus, jotka on luokiteltu testimenetelmällä oikein. Sillä mitataan luokittavia tuloksia tuottavan testimenetelmän tarkkuutta. Spesifisyys on tärkeää ottaa huomioon arvioitaessa testimenetelmän merkityksellisyyttä (20).

Aine : Alkuaine ja sen yhdisteet sellaisina kuin ne esiintyvät luonnossa tai tuotantoprosessein tuotettuina, mukaan luettuina aineen pysyvyyden säilyttämiseksi tarvittavat lisäaineet ja käytetyssä prosessissa muodostuvat epäpuhtaudet, ei kuitenkaan liuottimia, jotka voidaan erottaa vaikuttamatta aineen pysyvyyteen tai muuttamatta sen koostumusta.

(Testi)ajo : Yksittäinen testikemikaali, jota testataan samanaikaisesti vähintään kolmella rinnakkaisihonäytteellä.

Testikemikaali : Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Ihon sähkövastusmääritystesti (TER) : Ihon sähkövastus on ihon sähköisen impedanssin mittayksikkö (kilo-ohmeina). Kyseessä on ihon suojaavan vaikutuksen arviointiin käytettävä yksinkertainen ja luotettava menetelmä, jossa rekisteröidään ihon läpi kulkevat ionit Wheatstone-siltamittauksella.

UVCB-aine : Koostumukseltaan tuntematon tai vaihteleva aine, kompleksi reaktiotuote tai biologinen materiaali.

”

Korvataan B osassa oleva B.40 a luku seuraavasti:

”B.40a IN VITRO IHOSYÖVYTTÄVYYS: REKONSTRUOIDUN IHMISORVASKEDEN TESTIMENETELMÄ

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 431 (2016). Ihosyövyttävyydellä tarkoitetaan pysyvän ihovaurion eli orvaskeden läpi verinahkaan ulottuvan näkyvän kuolion ilmaantumista testiaineen annostelun jälkeen [Yhdistyneiden kansakuntien yhdenmukaistetussa kemikaalien luokittelu- ja merkintäjärjestelmässä (GHS) (1) sekä aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta annetussa asetuksessa (EU) 1272/2008 (CLP-asetus) (6) määritetyn mukaisesti]. Tässä päivitetyssä testimenetelmässä B.40 a kuvataan in vitro -menetelmä, jolla voidaan tunnistaa syövyttämättömät ja syövyttävät aineet ja seokset YK:n GHS-järjestelmän ja CLP-asetuksen mukaisesti. Sen avulla voidaan myös osittain luokitella syövyttäviä aineita alaluokkiin.

Kemikaalien ihosyövyttävyyspotentiaalin arvioinnissa on yleensä käytetty koe-eläimiä (testimenetelmä B.4, vastaa OECD:n testiohjetta 404; hyväksytty ensimmäisen kerran vuonna 1981 ja tarkistettu vuosina 1992, 2002 ja 2015) (2). Tämän testimenetelmän B.40 a lisäksi kaksi muuta kemikaalien ihosyövyttävyyspotentiaalin testaamiseen validoitua ja hyväksyttyä in vitro -testimenetelmää ovat testimenetelmät B.40 (vastaa OECD:n testiohjetta 430) (3) ja B.65 (vastaa OECD:n testiohjetta 435) (4). Lisäksi in vitro -testimenetelmä B.46 (vastaa OECD:n testiohjetta 439) (5) on hyväksytty ihoärsyttävyyspotentiaalin testaamiseen. Ihosyövyttävyyden ja -ärsytyksen testauksen ja arvioinnin yhdennettyjä lähestymistapoja sisältävässä OECD:n ohjeasiakirjassa kuvataan useita moduuleita, joihin on ryhmitelty tietolähteitä ja analysointityökaluja. Lisäksi niissä annetaan ohjeita siitä, i) miten integroida ja käyttää nykyisiä testaukseen perustuvia ja testauksen ulkopuolella saatuja tietoja kemikaalien ihoärsyttävyyden ja ihosyövyttävyyden potentiaalin arvioinnissa, ja ii) selostetaan, miten toimitaan, kun lisätestaus on tarpeen (6).

Tässä testimenetelmässä tarkastellaan ihosyövyttävyyttä ihmisten terveyteen liittyvänä määrityskohteena. Siinä käytetään (ihmisen orvaskeden keratinosyyteistä peräisin olevilla soluilla) rekonstruoitua ihmisen orvaskettä (Reconstructed human Epidermis, RhE), joka jäljittelee läheisesti ihmisihon ylemmän kerroksen eli epidermiksen histologisia, morfologisia, biokemiallisia ja fysiologisia ominaisuuksia. Vastaava OECD:n testiohje hyväksyttiin ensimmäisen kerran vuonna 2004. Se päivitettiin vuonna 2013 lisäämällä siihen muita RhE-mallia hyödyntäviä testimenetelmiä ja mahdollisuus käyttää menetelmiä syövyttävien kemikaalien alaluokkiin luokittelemisen tukena. Testiohje päivitettiin myös vuonna 2015 lisäämällä siihen viittauksia testauksen ja arvioinnin yhdennettyihin lähestymistapoihin ja ottamalla käyttöön elinkykyisyyden mittaamiseen tarkoitettu vaihtoehtoinen menettely.

Tähän testimenetelmään sisältyy neljä validoitua kaupallisesti saatavilla olevaa RhE-mallia. Kahdesta näistä kaupallisesti saatavilla olevasta testimallista, jotka ovat EpiSkin™ Standard Model (SM) ja EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (joista käytetään jäljempänä nimitystä validoidut vertailumenetelmät eli VVM:t), on tehty validointia edeltävät tutkimukset (7) ja sen jälkeen ihosyövyttävyyden arviointia (8) (9) (10) koskeva virallinen validointitutkimus (11) (12). Näiden tutkimusten tulosten perusteella annettiin suositus, jonka mukaan näitä kahta edellä mainittua validoitua vertailumenetelmää voidaan käyttää sääntelytarkoituksissa syövyttävien ja syövyttämättömien aineiden erottamiseen ja EpiSkin™-menetelmää voidaan käyttää lisäksi syövyttävien aineiden alaluokkiin luokittelemisessa (13) (14) (15). Kahdella muulla kaupallisesti saatavilla olevalla in vitro -ihosyövyttävyyden RhE-testimallilla on saatu samanlaisia tuloksia kuin EpiDerm™-VVM:llä suoritusvaatimuksiin perustuvan validoinnin mukaan (16) (17) (18). Nämä testit ovat SkinEthic™ RHE (7) ja epiCS® (aikaisempi nimi oli EST-1000), ja myös niitä voidaan käyttää sääntelytarkoituksiin syövyttävien ja syövyttämättömien aineiden erottelemisessa (19) (20). RhE-mallin tekijät tekivät vuosina 2012–2014 validoinnin jälkeisiä tutkimuksia, joissa testimenettelyä oli parannettu korjaamalla epäspesifistä MTT:n pelkistyksestä johtuneet häiriöt, joita testikemikaalit aiheuttivat. Tämä paransi sekä syövyttävien ja syövyttämättömien aineiden erottelun tarkkuutta ja helpotti syövyttävien aineiden luokittelua alaluokkiin (21) (22). EpiDerm™ SCT-, SkinEthic™ RHE- ja EpiCS®-testillä tuotetuista validoinnin jälkeisistä tiedoista on tehty myös tilastoanalyyseja, jotta voidaan määrittää muitakin ennustemalleja, jotka parantavat ennustettavuutta alaluokkiin luokittelun osalta (23).

Ennen kuin sääntelytarkoituksissa voidaan käyttää muita ihosyövyttävyyden arviointiin ehdotettua samankaltaista tai muutettua in vitro -RhE-testimenetelmää kuin validoitua vertailumenetelmiä, on selvitettävä ehdotetun menetelmän luotettavuus, merkityksellisyys (tarkkuus) ja sen ehdotetun käytön rajoitukset, jotta voidaan varmistua siitä, että se on samanlainen kuin validoidut vertailumenetelmät (24), OECD:n ohjeasiakirjassa 34 esitettyjen periaatteiden mukaan määritettyjen suoritusvaatimusten mukaisesti (25). Tietojen vastavuoroinen hyväksyntä taataan vasta, kun ehdotettu uusi tai päivitetty suoritusvaatimusten mukainen testimenetelmä on tarkistettu ja sisällytetty vastaavaan testiohjeeseen. Maat voivat käyttää tässä testiohjeessa olevia testimalleja määrittäessään ihosyövyttävyyden in vitro -testimenetelmän testituloksia koskevia vaatimuksiaan, ja samalla ne voivat hyödyntää tietojen vastavuoroista hyväksyntää.

MÄÄRITELMÄT

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Tällä testimenetelmällä voidaan tunnistaa syövyttämättömät ja syövyttävät aineet ja seokset YK:n GHS-järjestelmän ja CLP-asetuksen mukaisesti. Lisäksi tästä testimenetelmästä on apua luokiteltaessa syövyttäviä aineita ja seoksia valinnaiseen alaluokkaan 1A YK:n GHS-järjestelmän (1) mukaisesti ja yhdistettyihin alaluokkiin 1B ja 1C (21) (22) (23). Tämän testimenetelmän rajoitus on se, ettei sen avulla voida erotella ihosyövyttävyyttä alaluokkiin 1B ja 1C YK:n GHS-järjestelmän ja CLP-asetuksen mukaisesti, koska alaluokkaan 1C kuuluvia tunnettuja kemikaaleja, jotka ovat syövyttäviä in vivo, on vähän. EpiSkin™-, EpiDerm™ SCT-, SkinEthic™ RHE- ja epiCS®-testimalleilla voidaan luokitella kemikaaleja myös alaluokkiin (ts. 1A vs. 1B ja 1C vs. syövyttämättömät aineet).

Tähän testimenetelmään sisältyviä, syövyttämättömien ja syövyttävien aineiden määrittämisessä käytettyjä testimalleja tukevassa validoinnissa on testattu laaja joukko kemikaaleja, jotka edustavat pääasiassa yksittäisiä aineita; validointitutkimuksen empiirisessä tietokannassa oli 60 kemikaalia, jotka kattoivat laajalti eri kemikaaliluokkia (8) (9) (10). Testimenetelmän kehittäjät tekivät testejä, joissa osoitettiin alaluokkiin luokittelua koskevan testin herkkyys, spesifisyys, tarkkuus ja laboratorion sisäinen toistettavuus, ja OECD tarkasti testien tulokset (21) (22) (23). Kaikkien saatavilla olevien tietojen perusteella tätä testimenetelmää voidaan soveltaa hyvin moniin kemikaaliluokkiin ja aineiden fysikaalisiin olomuotoihin, myös nesteisiin, puolikiinteisiin ja kiinteisiin aineisiin sekä vahamaisiin aineisiin. Nesteet voivat olla vesiliuoksia tai orgaanisia liuoksia; kiinteät aineet voivat olla joko veteen liukenevia tai veteen liukenemattomia. Kiinteät aineet on mahdollisuuksien mukaan jauhettava hienoksi jauheeksi ennen applikointia; näytteen muuta esikäsittelyä ei vaadita. Jos voidaan osoittaa, etteivät tähän testimenetelmään sisältyvät testimallit sovi käytettäväksi tiettyjen testikemikaaliluokkien kanssa, testimenetelmää ei pidä käyttää niihin. Sen ohella, että tämä testimenetelmä soveltuu aineiden testaamiseen, sen oletetaan soveltuvan myös seosten testaamiseen. Koska seokset kattavat laajan joukon luokkia ja koostumuksia ja koska seosten testaamisesta on tällä hetkellä saatavilla vain vähän tietoa, niissä tapauksissa, joissa voidaan osoittaa, ettei testimenetelmä sovi käytettäväksi tiettyjen seosluokkien kanssa (esimerkiksi lähdeviitteessä (26) ehdotetun strategian mukaisesti), testimenetelmää ei pidä käyttää niihin. Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, antaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos antaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa. Kaasuja ja aerosoleja ei ole vielä arvioitu validointitutkimuksissa (8) (9) (10). Vaikka voidaan ajatella, että niitä voidaan testata RhE-tekniikalla, tällä testimenetelmällä kaasuja ja aerosoleja ei kuitenkaan voida testata.

Testikemikaalit, jotka absorboivat valoa samalla aallonpituudella kuin MTT-formatsaani, ja testikemikaalit, jotka voivat suoraan pelkistää MTT-vitaaliväriä (MTT-formatsaaniksi), voivat häiritä kudoksen elinkykyisyysmittauksia, ja niiden yhteydessä on käytettävä mukautettuja kontrolleja korjauksiin. Mahdollisesti tarvittavien mukautettujen kontrollien tyyppi vaihtelee sen mukaan, millaista häiriötä testikemikaali tuottaa ja mitä menetelmää MTT-formatsaanin mittaamisessa käytetään (ks. 25–31 kohta).

10.

Tällä testimenetelmällä ei saada asianmukaista tietoa ihoärsytyksestä, mutta testimenetelmä B.46 koskee nimenomaan terveysvaikutusta ihoärsytys in vitro, ja se perustuu samaan RhE-testijärjestelmään, vaikka siinä käytetään toisenlaista protokollaa (5). Jotta paikalliset ihovaikutukset ihon kerta-altistuksen jälkeen voidaan arvioida kattavasti, on tukeuduttava testauksen ja arvioinnin yhdennettyjä lähestymistapoja koskevaan OECD:n ohjeasiakirjaan (6). Näihin lähestymistapoihin kuuluu ihosyövyttävyystestien (tässä kuvattu testimenetelmä) ja ihoärsytystestien suorittaminen in vitro ennen testauksen harkitsemista elävillä eläimillä. Ihmisihon käyttöön on sovellettava kansallisia ja kansainvälisiä eettisiä käytäntöjä ja ehtoja.

TESTIN PERIAATE

11.

Testikemikaalia applikoidaan paikallisesti kolmiulotteiseen rekonstruoituun ihmisorvaskesimalliin. Se koostuu ihmisestä saaduista muuntamattomista orvaskeden keratinosyyteistä, jotka on viljelty ihmisen orvaskeden monikerroksiseksi, täysin erilaistuneiden solujen malliksi. Se koostuu järjestyneistä ja selkeistä tyvisolu-, okasolu- ja jyväiskerroksista ja monikerroksisesta marraskedestä, joka sisältää solujenvälisiä lamellaarisia lipidikerroksia, jotka edustavat myös in vivo -kokeissa havaittuja lipidiluokkia.

12.

RhE-testimenetelmän periaate perustuu oletukseen, jonka mukaan syövyttäviä kemikaaleja ovat ne, jotka pystyvät tunkeutumaan marrasketeen (diffundoitumalla tai eroosion seurauksena) ja ovat myrkyllisiä alemmissa solukerroksissa oleville soluille. Solujen elinkyky mitataan siten, että entsyymit muuntavat vitaaliväri MTT:n [3-(4,5-dimetyylitiatsol-2yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, tiatsolyylisininen; CAS-numero 298-93-1] siniseksi formatsaanisuolaksi, joka mitataan kvantitatiivisesti, kun se on uutettu kudoksista (27). Syövyttävät kemikaalit tunnistetaan niiden kyvystä alentaa solun elinkykyä määritettyjen kynnysarvojen alle (ks. 35 ja 36 kohta). RhE-malliin perustuvan ihosyövyttävyyden testimenetelmän on osoitettu voivan ennustaa ihoa syövyttäviä vaikutuksia in vivo kaneilla, kun niitä on arvioitu testimenetelmän B.4 mukaisesti (2).

PÄTEVYYDEN OSOITUS

13.

Ennen kuin laboratorio alkaa käyttää mitään näistä neljästä tähän testimenetelmään kuuluvasta validoidusta RhE-testimallista rutiininomaisesti, sen on osoitettava tekninen pätevyytensä luokittelemalla taulukossa 1 suositellut 12 ainetta oikein. Jos menetelmää käytetään alaluokkiin luokittelemiseen, pätevyys on osoitettava myös siinä. Jos luettelossa mainittua ainetta ei ole saatavilla tai jos se on perusteltua, voidaan käyttää toista ainetta, josta on saatavana asianmukaiset in vivo- ja in vitro -vertailutiedot (esimerkiksi vertailukemikaalien luettelosta (24)), kunhan sovelletaan taulukossa 1 kuvattuja samoja valintaperusteita.

Taulukko 1

Pätevyyden osoittamiseen tarkoitetut aineet (8)

Aine	CAS-nro	Kemikaaliluokka (9)	YK:n GHS-järj. / CLP-as. luokitus. In vivo -tulosten perusteella (10)	VVM Luokka, joka perustuu in vitro -tuloksiin (11)	MTT-pelkistin (12)	Fyysinen olomuoto
Alaluokka 1A In vivo syövyttävät aineet
Bromietikkahappo	79-08-3	Orgaaninen happo	1A	(3) 1A	—	Ki
Booritrifluorididihydraatti	13319-75-0	Epäorgaaninen happo	1A	(3) 1A	—	N
Fenoli	108-95-2	Fenoli	1A	(3) 1A	—	Ki
Diklooriasetyyli-kloridi	79-36-7	Elektrofiili	1A	(3) 1A	—	N
Alaluokkien 1B ja 1C (in vivo syövyttävät aineet) yhdistelmä
Glyoksyylihappo-monohydraatti	563-96-2	Orgaaninen happo	1B ja 1C	(3) 1B ja 1C	—	Ki
Maitohappo	598-82-3	Orgaaninen happo	1B ja 1C	(3) 1B ja 1C	—	N
Etanoliamiini	141-43-5	Orgaaninen emäs	1B	(3) 1B ja 1C	K	Viskoosinen
Suolahappo (14,4 %)	7647-01-0	Epäorgaaninen happo	1B ja 1C	(3) 1B ja 1C	—	N
In vivo syövyttämättömät aineet
Fenetyylibromidi	103-63-9	Elektrofiili	ES	(3) ES	K	N
4-amino-1,2,4-triatsoli	584-13-4	Orgaaninen emäs	ES	(3) ES	—	Ki
4-(metyylitio)-bentsaldehydi	3446-89-7	Elektrofiili	ES	(3) ES	K	N
Lauriinihappo	143-07-7	Orgaaninen happo	ES	(3) ES	—	Ki
Lyhenteet: CAS-nro = Chemical Abstracts Service -rekisterinumero; VVM = validoitu vertailumenetelmä; ES = ei syövyttävä K= kyllä; L=neste; Ki=kiinteä

14.

Osana pätevyyden osoittamista käyttäjän on kudosten vastaanoton jälkeen tarkastettava kudosten läpäisevyysominaisuudet RhE-mallin kehittäjän vaatimusten mukaisesti. Tämä on erityisen tärkeää, jos kudoksia kuljetetaan pitkiä välimatkoja tai pitkiä aikoja. Kun testimenetelmä on otettu onnistuneesti käyttöön ja laboratorion pätevyys on osoitettu, tällaista tarkastusta ei tarvitse tehdä säännöllisesti. Jos menetelmää käytetään säännöllisesti, läpäisevyysominaisuudet on kuitenkin jatkossakin syytä arvioida säännöllisin väliajoin.

MENETTELY

15.

Seuraavassa on yleinen kuvaus tämän testimenetelmän mukaisessa ihosyövyttävyyden määrittämisessä käytettävien RhE-testimallien osista ja menettelyistä. Tämän testimenetelmän mukaisesti käytettäviksi hyväksytyt tieteellisesti validit RhE-mallit (EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE ja epiCS®) (16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33) ovat saatavana kaupallisista lähteistä. Näille neljälle RhE-mallille on laadittu vakiotoimintamenettelyt (34) (35) (36) (37), ja niiden pääasialliset testimenetelmän osat on esitetty lisäyksessä 2. Asianmukaisia vakiotoimintamenettelyjä on syytä noudattaa, kun jotakin näistä menetelmistä käytetään laboratoriossa. Tämän testimenetelmän mukaisiin neljään RhE-testimalliin perustuvien testien on oltava seuraavien edellytysten mukaiset:

RHE-TESTIMENETELMÄN OSAT

Yleiset ehdot

16.

Epiteelin valmistamiseen on käytettävä muuntamattomia ihmisen keratinosyyttejä. Toimivan marraskeden alla on oltava useita kerroksia eläviä epiteelisoluja (tyvisolukerros, okasolukerros ja jyväiskerros). Marraskedessä on oltava useita kerroksia ja olennainen lipidikoostumus, jotta se voi toimia esteenä sytotoksisten vertailukemikaalien, kuten natriumdodekyylisulfaatin (SDS) tai Triton X-100:n, nopealle kulkeutumiselle ihokerrosten läpi. Läpäisynestokyky on osoitettava, ja se voidaan arvioida joko määrittämällä pitoisuus, jossa vertailukemikaali vähentää kudosten elinkykyä 50 prosentilla (IC50) tietyn altistusajan jälkeen, tai määrittämällä altistusaika, joka tarvitaan solun elinkyvyn vähenemiseen 50 prosentilla (ET50), kun vertailukemikaalia käytetään tiettynä kiinteänä pitoisuutena (ks. 18 kohta). Mallin on oltava sellainen, että marraskeden ympärillä olevan materiaalin pääsy elävään kudokseen estyy, sillä marraskeden ympärillä olevien testikemikaalien pääsy kudokseen heikentää mallin kykyä mallintaa ihoaltistusta. RhE-mallissa ei saa olla kontaminaatiota (bakteerit, virukset, mykoplasmat tai sieni-itiöt).

Toimintaolosuhteet

Solujen elinkyky

17.

Kudoksen elinkyky määritetään MTT-määrityksellä (27). RhE-kudoksen elinkykyiset solut pelkistävät vitaaliväri MTT:n saostuneeksi siniseksi MTT-formatsaaniksi, joka uutetaan kudoksista isopropanolilla (tai muulla vastaavalla liuottimella). Pelkän uuttoliuottimen optisen tiheyden (OD) on oltava riittävän pieni, ts. OD < 0,1. Uutettu MTT-formatsaani voidaan kvantifioida käyttämällä joko vakioabsorbanssimittausta (OD) tai HPLC-/UPLC-spektrofotometrimenettelyä (38). RhE-mallien käyttäjien on varmistettava, että kukin RhE-mallin erä täyttää negatiiviselle kontrollille asetetut vaatimukset. RhE-mallin kehittäjän/toimittajan on määritettävä negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyttävyysalue (ylempi ja alempi raja-arvo). Tähän testimenetelmään sisältyvien neljän validoidun RhE-testimallin negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyttävyysalue esitetään taulukossa 2. HPLC-/UPLC-spektrofotometrin käyttäjän on käytettävä taulukossa 2 esitettyjä negatiivisen kontrollin OD-vaihteluvälejä negatiivisen kontrollin hyväksymisperusteena. Negatiivisella kontrollilla käsiteltyjen kudosten vakaus viljelmässä (niiden on annettava samanlaiset tulokset OD-mittauksesta) altistusjakson ajan on dokumentoitava.

Taulukko 2

Negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyttävyysalue erän laadunvalvonnassa

	Alempi hyväksyttävyysraja	Ylempi hyväksyttävyysraja
EpiSkin™ (SM)	> 0,6	< 1,5
EpiDerm™ SCT (EPI-200)	> 0,8	< 2,8
SkinEthic™-RhE	> 0,8	< 3,0
epiCS®	> 0,8	< 2,8

Läpäisyn esto

18.

Marraskeden ja sen lipidikoostumuksen on oltava riittävä estämään sytotoksisten vertailukemikaalien (esimerkiksi SDS:n tai Triton X-100:n) nopea läpäisy arvioituna IC50:llä tai ET50:llä (taulukko 3). RhE-mallin kehittäjän/myyjän on osoitettava RhE-mallin jokaisen erän läpäisynestokyky, kun se toimittaa kudokset loppukäyttäjälle (ks. 21 kohta).

Morfologia

19.

RhE-mallin histologinen tutkimus on tehtävä osoittamalla, että mallissa on ihmisorvaskeden kaltainen monikerrosrakenne, joka koostuu tyvisolu-, okasolu- ja jyväiskerroksesta sekä marraskedestä ja että sen lipidikoostumus on samankaltainen kuin ihmisorvaskeden lipidikoostumus. RhE-mallin kehittäjän/myyjän on esitettävä RhE-mallin kunkin erän histologinen tutkimus, joka osoittaa, että kudosten morfologia on asianmukainen, kun kehittäjä/myyjä toimittaa kudokset loppukäyttäjälle (ks. 21 kohta).

Toistettavuus

20.

Testimenetelmän käyttäjien on osoitettava testimenetelmien toistettavuus pidemmällä aikavälillä positiivisilla ja negatiivisilla kontrolleilla. Lisäksi testimenetelmää saa käyttää vain, jos RhE-mallin kehittäjä/toimittaja on antanut tietoja, jotka osoittavat toistettavuuden pidemmällä aikavälillä esimerkiksi pätevyyden osoittamiseen tarkoitettujen aineiden luettelon (taulukko 1) mukaisilla syövyttävillä ja syövyttämättömillä kemikaaleilla. Jos testimenetelmää käytetään alaluokkiin luokittelemiseen, toistettavuus on osoitettava myös sen osalta.

Laadunvalvonta

21.

RhE-mallia saa käyttää vain, jos sen kehittäjä/toimittaja osoittaa, että kukin RhE-mallin erä täyttää määritellyt tuotantokriteerit, joiden joukosta elinkykyisyyttä (17 kohta), läpäisyn estoa (18 kohta) ja morfologiaa (19 kohta) koskevat perusteet ovat tärkeimmät. Tätä koskevat tiedot on annettava testimenetelmän käyttäjille, jotta he voivat ilmoittaa tiedot testiraportissa. Ainoastaan laadunvalvonnassa hyväksytyillä kudoserillä saadut tulokset voidaan hyväksyä luotettavaksi ennusteeksi syövyttävyyden luokittelua varten. RhE-mallin kehittäjän/toimittajan on määritettävä IC50- tai ET50-arvojen hyväksyttävyysalue (ylempi ja alempi raja-arvo). Neljän validoidun testimallin hyväksyttävyysalueet esitetään taulukossa 3.

Taulukko 3

Laadunvalvonnan perusteet erän vapauttamiseksi tehtaalta myyntiin

	Alempi hyväksyttävyysraja	Ylempi hyväksyttävyysraja
EpiSkin™ (SM) (18 tunnin käsittely SDS:llä) (33)	IC50 = 1,0 mg/ml	IC50 = 3,0 mg/ml
EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)	ET50 = 4,0 tuntia	ET50 = 8,7 tuntia
SkinEthic™-RhE (1 % Triton X-100) (35)	ET50 = 4,0 tuntia	ET50 = 10,0 tuntia
epiCS® (1 % Triton X-100) (36)	ET50 = 2,0 tuntia	ET50 = 7,0 tuntia

Testi- ja kontrollikemikaalien annostelu

22.

Jokaisesta testikemikaalista ja kontrolleista on käytettävä vähintään kahta rinnakkaista kudosnäytettä kullakin altistuskerralla. Sekä nestemäisiä että kiinteitä kemikaaleja käytettäessä orvaskeden pinnalle on annosteltava testikemikaalia tasaisesti riittävä määrä kuitenkin niin, ettei käytetä rajoittamatonta annosta. Kemikaalia on käytettävä vähintään 70 μl/cm2 tai 30 μl/cm2. Käytettävän mallin mukaan orvaskeden pinta on kostutettava deionisoidulla tai tislatulla vedellä ennen kiinteiden kemikaalien annostelua, jotta testikemikaalin ja orvaskeden pinnan välinen kosketus olisi parempi (34) (35) (36) (37). Kiinteät aineet on mahdollisuuksien mukaan testattava hienona jauheena. Annostelumenetelmän on sovelluttava testikemikaalille (katso esim. kirjallisuusviitteet 34–37). Altistusjakson jälkeen testikemikaali on huuhdeltava huolellisesti orvaskeden pinnalta sopivallavesipitoisella puskuriliuoksella tai 0,9-prosenttisella natriumkloridilla. Sen mukaan, mitä neljästä validoidusta RhE-testimallista käytetään, testikemikaalia kohti käytetään kaksi tai kolme altistusjaksoa (kaikki neljä validoitua RhE-mallia: 3 minuuttia ja 1 tunti; EpiSkin™-menetelmää käytettäessä 4 tunnin mittainen lisäaltistusaika). Sen mukaan, mitä RhE-testimallia käytetään ja millaista altistusjaksoa arvioidaan, altistumisen aikainen inkubointilämpötila saa vaihdella huoneenlämpötilan ja 37 °C:n välillä.

23.

Kussakin käsittelyssä on käytettävä samanaikaisia negatiivisia ja positiivisia kontrolleja osoittamaan, että solujen elinkyky (negatiivisella kontrollilla), läpäisyn esto ja altistuksesta seuraava kudoksen herkistyminen (positiivisella kontrollilla) ovat pidemmän määritetyn aikaisemman hyväksyttävyysalueen mukaisia. Suositellut positiiviset kontrollikemikaalit ovat jääetikkahappo tai 8N KOH sen mukaan, millaista RhE-mallia käytetään. On kuitenkin syytä muistaa, että 8N KOH on suora MTT:n pelkistin, jonka käyttö voi edellyttää kontrollien mukauttamista 25 ja 26 kohdassa kuvatun mukaisesti. Suositellut negatiiviset kontrollit ovat 0,9-prosenttinen natriumkloridi tai vesi.

Solujen elinkykymittaukset

24.

Tässä menetelmässä on käytettävä kvantitatiivista MTT-määritystä solujen elinkyvyn mittaamiseen (27). Kudosnäyte asetetaan kolmeksi tunniksi sopivan vahvuiseen MTT-liuokseen (esimerkiksi 0,3 tai 1 mg/ml). Saostunut sininen formatsaani uutetaan kudoksesta liuottimella (esimerkiksi isopropanoli tai hapan isopropanoli), ja formatsaanipitoisuus määritetään mittaamalla OD-arvo 570 nm:ssä käyttäen enintään ± 30 nm:n kaistanpäästösuodatinta tai käyttämällä HPLC-/UPLC-spektrofotometrimenetelmää (ks. 30 ja 31 kohta) (38).

25.

Testikemikaalit voivat häiritä MTT-määritystä joko pelkistämällä MTT:n suoraan siniseksi formatsaaniksi ja/tai väri-interferenssillä, jos testikemikaali absorboi valoa luonnostaan tai käsittelymenettelyjen takia samalla optisella tiheydellä kuin formatsaani (570 ± 30 nm, pääasiassa siniset ja violetit kemikaalit). Esimerkiksi epäspesifin MTT-pelkistinkontrollin (NSMTT) ja epäspesifin värikontrollin (NSC) kaltaisia lisäkontrolleja on käytettävä, jotta näistä testikemikaaleista johtuva mahdollinen häiriö voidaan havaita ja korjata (ks. 26–30 kohta). Tämä on tärkeää etenkin silloin, jos tiettyä testikemikaalia ei saada kokonaan pois kudoksesta huuhtelussa tai jos se tunkeutuu orvaskeden läpi, jolloin sitä on kudoksissa, kun elinkykyisyystesti MTT:llä tehdään. MTT:n suoran pelkistyksen ja väriaineiden aiheuttamien häiriöiden korjaamismenettelyt selostetaan yksityiskohtaisesti testimalleja koskevissa vakiotoimintamenettelyissä (34) (35) (36) (37).

26.

Jotta suorat MTT-pelkistimet voidaan tunnistaa, kukin testikemikaali tulee lisätä tuore