3)
|
Korvataan B osassa oleva B.22 luku seuraavasti:
”B.22 DOMINOIVA LETAALITESTI JYRSIJÖILLÄ
JOHDANTO
|
1.
|
Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 478 (2016). Testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvoinnin vuoksi. Tämä muokattu versio testimenetelmästä perustuu yli 30 vuoden kokemukseen tästä testistä ja mahdollisuuteen liittää tai yhdistää tämä testi muihin toksisuustesteihin, joita ovat esimerkiksi kehitys-, lisääntymis- tai genotoksisuustutkimukset. Koska tällä testillä on rajoituksensa ja koska siinä pitää käyttää paljon koe-eläimiä, sitä ei ole tarkoitettu käytettäväksi ensisijaisena menetelmänä vaan pikemminkin täydentävänä testimenetelmänä, jota voidaan käyttää vain, jos sille ei ole vaihtoehtoa sääntelyvaatimusten kannalta. Kun toksisuustestejä yhdistetään, suuret määrät koe-eläimiä välttyvät toksisuustesteissä käyttämiseltä. OECD on laatinut asiakirjan (1), joka sisältää yhteenvedon geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsauksen näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin.
|
|
2.
|
Dominoivan letaalitestin tarkoituksena on tutkia, tuottavatko kemikaalit mutaatioita, jotka johtuvat itusolujen kromosomipoikkeavuuksista. Lisäksi dominoiva letaalitesti on erityisen relevantti genotoksisuuden arvioinnissa, koska vaikka lajien välillä voi olla vaihtelua, in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin liittyvät tekijät ovat aktiivisia ja voivat vaikuttaa vasteisiin. Kun testikemikaalille altistus aiheuttaa dominoivia letaalimutaatioita, on syytä olettaa, että kemikaalilla on testattavan lajin sukusoluihin kohdistuvia vaikutuksia.
|
|
3.
|
Dominoivat letaalimutaatiot aiheuttavat alkio- tai sikiökuolemia. Kun testikemikaalille altistus aiheuttaa dominoivia letaalimutaatioita, on syytä olettaa, että kemikaalilla on testattavan lajin itusoluihin kohdistuvia vaikutuksia.
|
|
4.
|
Dominoiva letaalitesti on hyödyllinen, kun täytyy vahvistaa positiiviset tulokset testeistä, joissa on käytetty somaattisia in vivo -päätetapahtumia, ja se on myös merkityksellinen päätetapahtuma ihmisiin kohdistuvien vaarojen ja itulinjan kautta välittyvien geneettisten sairauksien riskin ennustamisessa. Tässä testissä pitää kuitenkin käyttää paljon koe-eläimiä, ja se vaatii myös paljon työvoimaa. Näin ollen testin tekeminen on hyvin kallista ja aikaa vievää. Koska dominoivien letaalimutaatioiden spontaani esiintymistaajuus on melko korkea, testin herkkyys havaita mutaationopeuden pientä lisääntymistä on yleisesti rajallinen.
|
|
5.
|
Keskeisten termien määritelmät esitetään lisäyksessä 1.
|
ALUSTAVAT HUOMIOT
|
6.
|
Testi tehdään useimmiten hiirillä (2) (3) (4) mutta myös muut lajit, kuten rotta (5) (6) (7) (8), voivat olla toisinaan asianmukaisia, jos niiden käyttö on tieteellisesti perusteltua. Dominoivat letaalivaikutukset johtuvat yleensä merkittävistä kromosomipoikkeavuuksista (rakenteelliset ja numeeriset poikkeavuudet) (9) (10) (11), mutta geenimutaatioitakaan ei voida sulkea pois. Dominoiva letaalimutaatio on sellainen mutaatio, jota esiintyy pelkästään itusolussa, tai sellainen, joka kehittyy varhaisvaiheen alkiossa hedelmöittymisen jälkeen mutta ei aiheuta sukusolun toimintahäiriöitä vaan on letaali hedelmöittyneelle munasolulle tai kehittyvälle alkiolle.
|
|
7.
|
Yksittäiset urokset pariutetaan peräkkäin astuttamattomien naaraiden kanssa määräajoin. Altistuksen jälkeisten parittelujen lukumäärä määräytyy dominoivan letaalitutkimuksen perimmäisen tavoitteen mukaan (23 kohta), ja sillä on määrä varmistaa, että dominoivat letaalivaikutukset arvioidaan uroksen itusolujen kaikissa kypsymisvaiheissa (12).
|
|
8.
|
Jos on näyttöä siitä, että testikemikaali tai sen metaboliitti (metaboliitit) ei(vät) pääse kiveksiin, tätä testiä ei pidä käyttää.
|
TESTIN PERIAATE
|
9.
|
Tässä testissä altistetaan yleensä urokset testikemikaalille asianmukaista reittiä pitkin ja pariutetaan ne altistamattomien ja astuttamattomien naaraiden kanssa. Erityyppisiä itusoluja voidaan testata jaksottamalla paritteluvälit. Parittelun jälkeen naaraat lopetetaan jonkin ajan kuluttua, ja niiden kohdut tutkitaan, jotta voidaan laskea kiinnittyneiden sekä elävien ja kuolleiden alkioiden lukumäärä. Testikemikaalin dominoiva letaalisuus määritetään vertaamalla, montako elävää kiinnittynyttä alkiota kullakin testiryhmän naaraalla on kantaja-aine-/liuotinkontrolliryhmän kunkin naaraan eläviin kiinnittyneisiin eläviin alkioihin nähden. Kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden lisääntyminen testiryhmän naarasta kohden verrattuna kontrolliryhmän naaraisiin kertoo siitä, että testikemikaali aiheuttaa alkiokuolemia kiinnittymisen jälkeen. Kiinnittymisen jälkeiset alkiokuolemat lasketaan määrittämällä kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden osuus kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärästä testiryhmässä ja vertaamalla sitä vastaavaan osuuteen kontrolliryhmässä. Ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat voidaan arvioida laskemalla munasarjojen keltarauhaset, joista vähennetään kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärä tai kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärä naarasta kohden testiryhmässä ja kontrolliryhmässä.
|
LABORATORIOIDEN PÄTEVYYDEN VARMISTAMINEN
|
10.
|
Laboratorion on todistettava tätä testiä koskeva pätevyytensä osoittamalla, että se pystyy tuottamaan dominoivien letaalivaikutusten esiintymistaajuuksia julkaistuista tiedoista (esimerkiksi (13) (14) (15) (16) (17) (18)) positiivisilla kontrolliaineilla (heikot vasteet mukaan luettuina), esimerkiksi niillä, jotka on lueteltu taulukossa 1, ja kantaja-ainekontrolleilla, ja negatiivisten kontrollien esiintymistaajuuksia, joita koskevien tietojen vaihteluväli on johdonmukaisesti hyväksyttävä (ks. viitteet edellä) tai laboratorion aiemman kontrollien jakauman mukainen, jos se on saatavilla.
|
MENETELMÄN KUVAUS
Testin valmistelu
Eläinlajin valinta
|
11.
|
Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia terveitä sukukypsiä eläimiä. Yleensä käytetään hiiriä, mutta myös rotat voivat olla sopivia. Kaikkia muita sopivia nisäkäslajeja voidaan käyttää, jos raportissa esitetään sille tieteellinen perustelu.
|
Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta
|
12.
|
Jyrsijöiden kohdalla koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden olisi mieluiten oltava 50–60 prosenttia, sen olisi oltava ainakin 40 prosenttia eikä mielellään yli 70 prosenttia muulloin kuin tilan puhdistuksen aikana. Huoneessa täytyy käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon valintaan voi vaikuttaa se, miten siihen voidaan sekoittaa sopiva määrä testikemikaalia, kun sitä annetaan tätä reittiä. Ennen altistusta tai parittelua jyrsijät on sijoitettava samaa sukupuolta edustaviin pienryhmiin (enintään viisi eläintä), ellei aggressiivista käyttäytymistä ole odotettavissa tai havaittu, mieluiten kiinteisiin häkkeihin, joissa on asianmukainen virikkeellinen ympäristö. Eläimet voivat olla häkissä yksittäin, jos tämä on tieteellisesti perusteltua.
|
Eläinten valmistelu
|
13.
|
Terveet, sukukypsät ja täysikasvuiset uros- ja naaraseläimet jaetaan satunnaisesti testi- ja kontrolliryhmiin. Eläimet merkitään yksilöllisesti inhimillisellä, mahdollisimman vähän invasiivisella toimenpiteellä (esimerkiksi rengastamalla, korvamerkillä, mikrosirulla tai biometrisellä tunnisteella, mutta ei varpaita tai korvia leikkaamalla), ja niitä sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Ristikontaminaatiota positiivisella kontrollilla ja testikemikaalilla tulisi välttää. Tutkimuksen alkaessa eläinten painonvaihtelun on oltava vähäistä, ja se saa vaihdella korkeintaan ± 20 prosenttia kummankin sukupuolen keskimääräisestä painosta.
|
Annosten valmistelu
|
14.
|
Kiinteät testikemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan asianmukaisiin liuottimiin tai kantaja-aineisiin taikka lisätään ravintoon tai juomaveteen, ennen kuin ne annetaan koe-eläimille. Nestemäiset testikemikaalit voidaan antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Testikemikaaleja voidaan antaa hengitysteiden kautta tapahtuvan altistamisen osalta kaasuna, höyrynä tai kiinteänä/nestemäisenä aerosolina niiden fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan. Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä ja asianmukaiset säilytysolosuhteet on määritetty.
|
Testiolosuhteet
Liuotin/kantaja-aine
|
15.
|
Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdollisista kemiallisista reaktioista tutkittavan kemikaalin kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Ensisijaisesti on harkittava vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä, mikäli mahdollista. Esimerkkejä yleisesti käytetyistä yhteensopivista liuottimista/kantaja-aineista ovat vesi, fysiologinen suolaliuos, metyyliselluloosaliuos, natriumkarboksimetyyliselluloosaliuos, oliiviöljy ja maissiöljy.
|
Positiiviset kontrollit
|
16.
|
Samanaikaisia positiivisia kontrollieläimiä on käytettävä aina, ellei laboratorio ole osoittanut pätevyyttään testin tekemisessä ja ellei se ole käyttänyt testiä rutiininomaisesti viime aikoina (esimerkiksi viiden viime vuoden aikana). Positiivisia kontrollieläimiä ei kuitenkaan tarvitse altistaa samaa reittiä kuin testikemikaalia saavia eläimiä, eikä näytteitä tarvitse ottaa kaikilta parittelujaksoilta. Positiivisten kontrolliaineiden on tiedettävä tuottavan dominoivia letaalivaikutuksia testissä käytetyissä olosuhteissa. Altistusta lukuun ottamatta kontrolliryhmän eläimiä on käsiteltävä samalla tavoin kuin testiryhmien eläimiä.
|
|
17.
|
Positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että ne tuottavat lieviä tai kohtalaisia vaikutuksia, jotta testin tehokkuutta ja herkkyyttä voidaan arvioida kriittisesti, mutta annosten on kuitenkin tuotettava jatkuvasti positiivisia dominoivia letaalivaikutuksia. Taulukossa 1 on esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista ja asianmukaisista annoksista.
|
Taulukko 1
Esimerkkejä positiivisista kontrolliaineista
Aine [CAS-numero]
(viitenumero)
|
Vaikuttavan annoksen vaihteluväli (mg/kg)
(jyrsijälajit)
|
Antoaika (päivää)
|
Trietyleenimelamiini [51-18-3] (15)
|
0,25 (hiiret)
|
1
|
Syklofosfamidi [50-18-0] (19)
|
50–150 (hiiret)
|
5
|
Syklofosfamidi [50-18-0] (5)
|
25–100 (rotat)
|
1
|
Etyylimetaanisulfonaatti [62-50-0] (13)
|
100–300 (hiiret)
|
5
|
Monomeerinen akryyliamidi [79-06-1] (17)
|
50 (hiiret)
|
5
|
Klorambusiili [305-03-3] (14)
|
25 (hiiret)
|
1
|
Negatiiviset kontrollit
|
18.
|
Negatiivisia kontrollieläimiä, joille annetaan pelkkää liuotinta tai kantaja-ainetta ja joita käsitellään muuten samalla tavalla kuin testiryhmiä, on sisällytettävä kuhunkin näytteenottokertaan (20). Jos käytettävissä ei ole aikaisempia tai julkaistuja kontrollitietoja, joissa osoitetaan, että valittu liuotin/kantaja-aine ei aiheuta dominoivia letaalivaikutuksia tai muita haitallisia vaikutuksia, kullakin näytteenottokerralla olisi käytettävä myös altistamattomia kontrollieläimiä, jotta kantaja-ainekontrollin hyväksyttävyys voidaan todeta.
|
MENETTELY
Eläinten lukumäärä
|
19.
|
Yksittäiset urokset pariutetaan peräkkäin mieluiten yhden astuttamattoman naaraan kanssa määräajoin (esimerkiksi viikon välein, ks. 21 ja 23 kohta). On huolehdittava etukäteen siitä, että kussakin ryhmässä on riittävästi uroksia (kullakin parittelujaksolla astutettujen naaraiden määrään nähden), jotta saadaan aikaan tarvittava tilastollinen voima vähintään dominoivien letaalivaikutusten esiintymistiheyden kaksinkertaistumisen havaitsemiseksi (44 kohta).
|
|
20.
|
Myös naaraiden määrä yhtä parittelujaksoa kohti on määritettävä etukäteen tilastollista voimaa koskevilla laskelmilla, jotta voidaan havaita vähintään dominoivien letaalivaikutusten esiintymistiheyden kaksinkertaistuminen (ts. riittävästi tiineitä naaraita, jotka tuottavat yhteensä vähintään 400 kiinnittynyttä alkiota) (20) (21) (22) (23) ja jotta odotettavissa on vähintään yksi kuollut kiinnittynyt alkio analyysiyksikköä (ts. annoskohtaista pariutumisryhmää) kohti (24).
|
Altistusjakso ja parittelujaksot
|
21.
|
Altistusohjelma määrää altistamisen jälkeisten parittelujaksojen määrän. Paritteluja olisi oltava niin monta, että kaikista uroksen itusolun kypsymisvaiheista voidaan arvioida dominoivien letaalivaikutusten aiheutuminen (12) (25). Yhdessä altistuksessa, jossa annetaan enintään viisi annosta päivässä, on oltava 8 (hiiret) tai 10 (rotat) parittelua viikon välein viimeisen altistuksen jälkeen. Jos testissä annetaan useampia annoksia, parittelujaksojen määrää voidaan vähentää altistusajan pitenemisen mukaan. Tavoitteena tulee kuitenkin olla kaikkien spermatogeneesin vaiheiden arviointi (esimerkiksi 28 vuorokauden altistuksen jälkeen vain neljä parittelua viikossa riittää, jotta voidaan arvioida hiiren spermatogeneesin kaikki vaiheet). Kaikki altistus- ja parittelusuunnitelmat on perusteltava tieteellisesti.
|
|
22.
|
Naaraita on pidettävä urosten luona vähintään yhden kiimakierron ajan (yksi kiimakierto kestää sekä hiirillä että rotilla yhden viikon). Naaraita, jotka eivät paritelleet viikon parittelujaksolla, voidaan käyttää seuraavalla parittelujaksolla tai siihen saakka, kunnes parittelun on todettu tapahtuneen emättimessä esiintyvän sperman tai emätintulpan perusteella.
|
|
23.
|
Altistus- ja paritteluohjelma on suunniteltava dominoivia letaalivaikutuksia koskevan tutkimuksen perimmäisen tavoitteen mukaan. Jos tavoitteena on selvittää, aiheuttaako tietty kemikaali dominoivia letaalimutaatioita, hyväksyttävä menetelmä olisi altistaa yksi spermatogeneesikierto kokonaan (ts. hiirellä 7 viikkoa, 5–7 altistusta viikossa) ja antaa eläimen paritella vasta kierron lopussa. Mutta jos tavoitteena on selvittää, minkä tyyppinen itusolu on herkkä dominoivien letaalivaikutusten aikaansaamiselle, ensisijainen menetelmä on yhden tai viiden päivän altistus ja viikoittainen parittelu.
|
Annostasot
|
24.
|
Jos tehdään alustava annoksenmääritystutkimus, koska sopivia tietoja ei ole vielä käytettävissä opastamaan annoksen valinnassa, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa (26). Tutkimuksessa on pyrittävä määrittämään suurin siedetty annos. Sillä tarkoitetaan suurinta annosta, jota siedetään ilman näyttöä tutkimusta rajoittavasta toksisuudesta tutkimuksen kestoon nähden (esimerkiksi annos, joka aiheuttaa poikkeavaa käyttäytymistä tai poikkeavia reaktioita, vähäistä painonlaskua tai verta muodostavan kudoksen sytotoksisuutta), mutta joka ei aiheuta kuolemaa eikä sellaista kipua, tuskaa tai kärsimystä, jonka vuoksi eläin olisi lopetettava inhimillisesti (27).
|
|
25.
|
Suurin siedetty annos ei myöskään saa haitata parittelun onnistumista (21).
|
|
26.
|
Testikemikaalit, joilla on tiettyjä biologisia vaikutuksia pieninä myrkyttöminä annoksina (kuten hormonit ja mitogeenit), ja kemikaalit, joissa esiintyy toksikokineettisten ominaisuuksien saturaatiota, voivat olla annoksen määrittämistä koskevien kriteerien osalta poikkeustapauksia, ja niitä on arvioitava tapauskohtaisesti.
|
|
27.
|
Jotta saadaan annosvastetiedot, täydelliseen tutkimukseen on sisällyttävä negatiivinen kontrolliryhmä ja vähintään kolme annostasoa, jotka yleensä erotetaan kertoimella 2 mutta enintään kertoimella 4. Jos testikemikaali ei aiheuta toksisuutta annoksenmääritystutkimuksessa tai olemassa olevien tietojen perusteella, suurin kerta-annos pitäisi olla 2 000 mg/painokilo. Jos testikemikaali aiheuttaa toksisuutta, suurimman siedetyn annoksen pitäisi olla suurin annettava annos, ja käytettävien annostasojen olisi mieluiten katettava vaihteluväli maksimista annokseen, joka aiheuttaa vain vähän tai ei lainkaan toksisuutta. Myrkyttömien kemikaalien yhteydessä vähintään 14 päivän mittaisen altistusjakson raja-annos on 1 000 mg painokiloa kohti päivässä. Jos altistusjakso on vähemmän kuin 14 päivää, raja-annos on 2 000 mg painokiloa kohti päivässä.
|
Antotapa
|
28.
|
Testin suunnittelussa on otettava huomioon oletettu ihmisen altistusreitti. Siksi altistusreitiksi voidaan perustellusti valita esimerkiksi ravinto tai juomavesi, ihonalainen, suonensisäinen tai topikaalinen reitti, altistus hengitysteitse tai oraalisesti (letkuruokinnalla) taikka implantaatio. Joka tapauksessa reitti on valittava siten, että voidaan varmistaa kohdekudosten riittävä altistus. Intraperitoneaalista injektiota ei yleensä suositella, koska sitä ei ole tarkoitettu ihmisen altistumisreitiksi, ja sitä tulisi käyttää vain erityisten tieteellisien perusteiden nojalla. Jos testikemikaali sekoitetaan ravintoon tai juomaveteen, varsinkin jos kyse on kerta-annoksesta, on huolehdittava siitä, että viive ravinnon ja veden saannin ja parittelun välillä on riittävä, jotta vaikutukset voidaan havaita (31 kohta). Se, kuinka paljon nestettä voidaan enintään antaa kerralla ruokintaletkun kautta tai injektiona, määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Yleensä määrä saa olla enintään 1 ml/100 g painoa. Poikkeuksena ovat vesiliuokset, joita käytettäessä enimmäismäärä voi olla 2 ml/100 g. Tätä suurempien määrien käyttö (jos eläinsuojelulainsäädäntö sen sallii) on perusteltava. Testitilavuuden vaihtelu on minimoitava muuttamalla pitoisuutta, jotta varmistetaan, että tilavuus on painoon nähden sama kaikilla annostasoilla.
|
Havainnot
|
29.
|
Koe-eläimistä tulee tehdä yleisiä kliinisiä havaintoja ja niiden kliinisiä oireita tulee kirjata vähintään kerran päivässä, mieluiten samaan aikaan joka päivä, ja tässä on otettava huomioon, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Kaikkien eläinten sairastuvuutta ja kuolleisuutta on havainnoitava vähintään kahdesti vuorokaudessa annostelun aikana. Eläimet on punnittava tutkimuksen alussa ja vähintään kerran viikossa toistuvan annoksen tutkimuksissa, ja eläinten lopetuksen yhteydessä. Ravinnon kulutus olisi mitattava ainakin kerran viikossa. Jos testikemikaalia annostellaan juomaveteen, veden kulutus on mitattava veden vaihdon yhteydessä tai vähintään kerran viikossa. Eläimet, joilla ilmenee ei-letaaleja merkkejä liiallisesta toksisuudesta, olisi lopetettava ennen tutkimusjakson päättymistä (27).
|
Kudosnäytteet ja niiden käsittely
|
30.
|
Naaraat lopetetaan tiineyden toisella puoliskolla, hiiret tiineyspäivänä 13 ja rotat tiineyspäivänä 14 tai 15. Niiden kohdut tutkitaan dominoivien letaalivaikutusten osalta kiinnittyneiden alkioiden, elävien ja kuolleiden alkioiden ja keltarauhasten määrän selvittämiseksi.
|
|
31.
|
Kohdunsarvet ja munasarjat avataan keltarauhasten laskemiseksi, ja sikiöt poistetaan, lasketaan ja punnitaan. Kohdusta on tutkittava huolellisesti myös mahdolliset elävien sikiöiden peittämät resorptiot, ja on varmistettava, että kaikki resorptiot lasketaan. Sikiökuolleisuus kirjataan. Myös hedelmöittyneiden naaraiden ja kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärä, ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat ja kiinnittymisen jälkeinen kuolleisuus (sekä varhain että myöhemmin tapahtuneet resorptiot) kirjataan. Lisäksi näkyvissä olevat sikiöt voidaan säilöä Bouinin fiksatiiviin vähintään kahden viikon ajaksi, jonka jälkeen ne tutkitaan selvien ulkoisten epämuodostumien varalta (28). Näin saadaan lisätietoa testiaineen vaikutuksista lisääntymiseen ja kehitykseen.
|
TIEDOT JA RAPORTOINTI
Tulosten käsittely
|
32.
|
Tulokset esitetään taulukossa, josta ilmenee paritelleiden urosten, tiineiden naaraiden sekä hedelmöittymättömien naaraiden lukumäärä. Kaikkien parittelujen tulokset sekä kunkin uroksen ja naaraan tunnistetiedot on esitettävä erikseen. Lisäksi on laskettava paritteluväli, altistettujen urosten annostaso sekä elävien kiinnittyneiden alkioiden ja kuolleiden alkioiden lukumäärä kunkin naaraan osalta.
|
|
33.
|
Kiinnittymisen jälkeiset alkiokuolemat lasketaan määrittämällä kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden osuus kaikista kiinnittyneistä alkioista testiryhmässä ja vertaamalla sitä vastaavaan osuuteen kantaja-ainetta tai liuotinta saaneessa kontrolliryhmässä.
|
|
34.
|
Ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat voidaan määrittää keltarauhasten ja kiinnittyneiden alkioiden määrän välisenä erotuksena tai kiinnittymisten keskimäärän vähenemisenä naarasta kohden kontrolliryhmän parittelutuloksiin verrattuna. Jos ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat on arvioitu, tämä on ilmoitettava.
|
|
35.
|
Dominoiva letaalikerroin arvioidaan näin: (kiinnittymisen jälkeiset alkiokuolemat / kiinnittymisten kokonaismäärä naarasta kohti) × 100.
|
|
36.
|
Tiedot toksisuudesta ja kliinisistä oireista (29 kohdan mukaisesti) on ilmoitettava.
|
Hyväksymisperusteet
|
37.
|
Testin hyväksyttävyys määritetään seuraavilla kriteereillä:
—
|
Samanaikainen negatiivinen kontrolli on aikaisempia negatiivisia kontrollitietoja koskevien julkaistujen normien ja laboratorion aiempien kontrollitietojen (jos niitä on saatavilla) mukainen (ks. 10 ja 18 kohta).
|
—
|
Samanaikaiset positiiviset kontrollit aiheuttavat vasteita, jotka ovat aikaisempia positiivisia kontrollitietoja koskevien julkaistujen normien tai laboratorion aikaisempien positiivisten kontrollien tietokannan (jos saatavilla) mukaisia, ja niiden tuottama kasvu on tilastollisesti merkitsevä negatiiviseen kontrolliin verrattuna (17 ja 18 kohta).
|
—
|
Asianmukainen määrä kiinnittymisiä ja annoksia on analysoitu (20 kohta).
|
—
|
Suurimman annoksen valintaperusteet vastaavat 24 ja 27 kohdassa kuvattuja perusteita.
|
|
Tulosten arviointi ja tulkinta
|
38.
|
Vähintään kolmea annosryhmää on analysoitava, jotta saadaan riittävästi tietoa annos-vastesuhdetta koskevaa analyysia varten.
|
|
39.
|
Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi positiivinen, mikäli:
—
|
ainakin yksi testiannoksista ilmentää tilastollisesti merkitsevää kasvua samanaikaiseen negatiiviseen kontrolliin verrattuna
|
—
|
kasvu riippuu annoksesta vähintään yksissä testiolosuhteissa (esimerkiksi viikon välein tapahtuva parittelu), kun sitä arvioidaan asianmukaisella testillä sekä
|
—
|
mikä tahansa tuloksista on negatiivisten kontrollitietojen jakauman tai laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman ulkopuolella (esimerkiksi Poissonin jakaumaan perustuva 95 prosentin kontrolliraja), jos näitä tietoja on saatavilla.
|
Tällöin testikemikaalin katsotaan pystyvän aiheuttamaan dominoivia letaalimutaatioita koe-eläinten itusoluissa. Suosituksia sopivimmista tilastomenetelmistä on 44 kohdassa; muita suositeltuja tilastollisia lähestymistapoja on myös lähdekirjallisuudessa (20) (21) (22) (24) (29). Käytetyissä tilastollisissa testeissä kokeellisena yksikkönä on pidettävä eläintä.
|
|
40.
|
Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi negatiivinen, mikäli:
—
|
mikään testiannoksista ei aiheuta tilastollisesti merkitsevää kasvua verrattuna samanaikaiseen negatiiviseen kontrolliin
|
—
|
annoksesta riippuvaista kasvua ei esiinny missään testiolosuhteissa ja
|
—
|
kaikki tulokset ovat negatiivisten kontrollitietojen tai laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman (esimerkiksi Poissonin jakaumaan perustuva 95 prosentin kontrolliraja) mukaisia, jos näitä tietoja on saatavilla.
|
Tällöin katsotaan, ettei testikemikaali pysty aiheuttamaan dominoivia letaalimutaatioita koe-eläinten itusoluissa.
|
|
41.
|
Selvästi positiivista tai selvästi negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.
|
|
42.
|
Jos vaste ei ole selvästi negatiivinen eikä selvästi positiivinen tai tuloksen biologisen merkityksellisyyden vahvistaminen kaipaa tukea (esimerkiksi heikko tai rajatapaukseksi luokiteltava kasvu), tietoja tulee arvioida asiantuntija-arvioinnissa ja/tai olemassa olevaan kokeelliseen tietoon perustuvissa lisätutkimuksissa, joissa esimerkiksi arvioidaan, onko positiivinen tulos negatiivisten kontrollitietojen tai laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen hyväksyttävän jakauman ulkopuolella (30).
|
|
43.
|
Harvoissa tapauksissa edes lisätutkimusten pohjalta ei voida päätellä, että testikemikaali tuottaa positiivisia tai negatiivisia tuloksia. Niitä pidetään tästä syystä epäselvinä tapauksina.
|
|
44.
|
Käytetyissä tilastollisissa testeissä kokeellisena yksikkönä on pidettävä urospuolista eläintä. Vaikka on mahdollista, että lukumääräaineisto (esimerkiksi kiinnittyneiden alkioiden lukumäärä naarasta kohti) voi noudattaa Poissonin jakaumaa ja/tai osuudet (esimerkiksi kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden osuus) voivat noudattaa binomijakaumaa, tällaisissa tiedoissa voi kuitenkin usein olla ylihajontaa (31). Sen vuoksi tilastollisessa analyysissa tulisi ensin tehdä yli- tai alihajontatesti käyttämällä varianssitestejä, kuten Cochranin binomiaalisen vaihtelun testiä (32) tai ylihajontaa koskevaa Taronen C(α)-testiä (31) (33). Jos poikkeamaa binomijakaumasta ei havaita, osuuksien trendejä kaikilla annostasoilla voidaan testata käyttämällä Cochran-Armitagen trenditestiä (34). Parivertailuja kontrolliryhmään voidaan testata Fisherin tarkalla testillä (35). Samalla tavoin jos poikkeamaa Poissonin jakaumasta ei havaita, lukumäärien trendejä voidaan testata käyttämällä Poissonin regressiota (36). Parivertailuja kontrolliryhmään voidaan testata Poissonin mallin yhteydessä käyttämällä parittaisia kontrasteja (36). Jos merkittävää yli- tai alihajontaa havaitaan, suositellaan käytettävän parametrittomia menetelmiä (23) (31). Niitä ovat esimerkiksi järjestykseen perustuvat testit, kuten Jonckheere-Terpstran trenditesti (37) ja Mann-Whitneyn testit (38) parivertailuista kantaja-aine-/liuotinkontrolliryhmän kanssa sekä permutaatio-, uudelleenotanta- tai bootstraptestit trendi- ja parivertailuihin kontrolliryhmän kanssa (31) (39).
|
|
45.
|
Positiivisesta dominoivien letaalivaikutusten testistä saadaan näyttöä testikemikaalin genotoksisuudesta testieläinlajin altistetun uroksen itusoluille.
|
|
46.
|
Vasteen biologisen merkityksellisyyden arvioinnissa apua voi olla sen tarkastelemisesta, ovatko havaitut arvot aikaisemman kontrollivaihteluvälin sisällä vai sen ulkopuolella (40).
|
Testiraportti
|
47.
|
Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot.
Yhteenveto
|
Testikemikaali:
—
|
alkuperä, eränumero, viimeinen käyttöpäivä, jos sellainen on
|
—
|
itse testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa
|
—
|
tutkittavan kemikaalin liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa, jos tiedossa
|
—
|
tarvittaessa pH-arvon, osmolaliteetin ja saostumisen mittaus soluviljelmän kasvatusliuoksessa, johon testikemikaalia lisättiin.
|
|
|
Yhdestä ainesosasta koostuva aine:
—
|
ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut merkitykselliset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet
|
—
|
kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa epäpuhtauksien kemialliset tunnistetiedot sen mukaan, mikä on käytännössä mahdollista, jne.
|
|
|
Useista ainesosista koostuvat aineet, UVCB-aineet ja seokset:
—
|
luonnehditaan mahdollisimman tarkoin ainesosien kemiallinen koostumuksen (ks. edellä), esiintymistiheyden ja merkityksellisten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla.
|
|
|
Testikemikaalin valmistus:
—
|
perustelut kantaja-aineen valinnalle
|
—
|
tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiilisuus liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa
|
—
|
ruoka-aineen, juomaveden tai inhalaatioiden formulointi
|
—
|
formulointien analyyttiset määritelmät (kuten stabiilius, homogeenisuus, nimellispitoisuudet), kun niitä käytetään.
|
|
|
Koe-eläimet:
—
|
käytetty eläinlaji/kanta ja perustelu sen valinnalle
|
—
|
eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli
|
—
|
lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.
|
—
|
eläinten yksilöintimenetelmä
|
—
|
lyhytkestoiset tutkimukset: kunkin urospuolisen eläimen paino testin alkaessa ja päättyessä yli viikon kestävät tutkimukset: yksilölliset painot tutkimuksen aikana ja ravinnon kulutus. Kunkin ryhmän painon vaihteluväli, keskiarvo ja keskihajonta on ilmoitettava.
|
|
|
Testiolosuhteet:
—
|
positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollitiedot
|
—
|
annosalueen määritystutkimuksen tulokset
|
—
|
annostasojen valintaperusteet
|
—
|
testikemikaalin valmistelun yksityiskohdat
|
—
|
testikemikaalin annostelun yksityiskohdat
|
—
|
antotavan valintaperusteet
|
—
|
eläimille aiheutuneiden myrkyllisten vaikutusten mittaamista koskevat menetelmät, tarvittaessa myös histopatologiset tai hematologiset analyysit, ja tiedot siitä, kuinka usein eläimiä koskevat havainnot tehtiin ja eläimet punnittiin
|
—
|
menettelyt, joilla varmistetaan, että testikemikaali kulkeutui kohdekudokseen tai verenkiertoon, jos saadaan negatiivisia tuloksia
|
—
|
todellinen annos (mg/painokilo/vrk), joka lasketaan ravintoon/juomaveteen sekoitetun testikemikaalin pitoisuudesta (ppm) ja kulutuksesta tarvittaessa
|
—
|
yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta
|
—
|
yksityiskohdat häkkien virikkeellisestä ympäristöstä
|
—
|
yksityiskohtaiset tiedot altistus- ja näytteenottoaikataulusta ja perustelut valinnoille
|
—
|
kivunlievitysmenetelmät
|
—
|
kudosten eristämis- ja säilömismenetelmät
|
—
|
kaikkien mittaussarjojen ja reagenssien lähde ja eränumerot (tarvittaessa)
|
—
|
dominoivien letaalivaikutusten laskentamenetelmät
|
—
|
parittelun toteamistapa
|
—
|
eläimen lopetusajankohta
|
—
|
dominoivien letaalivaikutusten pisteytysperusteet (keltarauhaset, kiinnittyneet alkiot, resorptiot ja ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat sekä elävät ja kuolleet kiinnittyneet alkiot).
|
|
|
Tulokset:
—
|
eläimen kunto koeaikaa ennen ja sen aikana sekä toksisuusoireet
|
—
|
uroksen paino altistus- ja parittelujaksojen aikana
|
—
|
paritelleiden naaraiden lukumäärä
|
—
|
annos-vastesuhde, jos mahdollista
|
—
|
samanaikaisen ja aikaisemman negatiivisen kontrollin tiedot, joihin sisältyvät vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonta
|
—
|
samanaikaisen positiivisen kontrollin tiedot
|
—
|
taulukoidut tiedo t jokaisesta naaraasta: keltarauhasten lukumäärä naarasta kohti kiinnittyneiden alkioiden lukumäärä naarasta kohti resorptioiden ja ennen kiinnittymistä tapahtuneiden alkiokuolemien lukumäärä naarasta kohti elävien kiinnittyneiden alkioiden lukumäärä naarasta kohti kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden lukumäärä naarasta kohti sikiöiden painot
|
—
|
yhteenveto edellä kuvatuista tiedoista jokaiselta parittelujaksolta ja jokaisesta annoksesta sekä tiedot dominoivista letaalitaajuuksista
|
—
|
käytetyt tilastolliset analyysit ja menetelmät.
|
|
|
LÄHDEKIRJALLISUUS
(1)
|
OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.
|
(2)
|
Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et al. (eds.) s. 235–334, Elsevier, Amsterdam
|
(3)
|
Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group ”Dominant” lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173–185
|
(4)
|
Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159–167.
|
(5)
|
Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267–270.
|
(6)
|
Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.
|
(7)
|
Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325–329.
|
(8)
|
Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80–85.
|
(9)
|
Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239–249.
|
(10)
|
Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616–624.
|
(11)
|
Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112–129.
|
(12)
|
Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169–172.
|
(13)
|
Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21–27.
|
(14)
|
Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167–180.
|
(15)
|
Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371–378.
|
(16)
|
James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303–314.
|
(17)
|
Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35–40.
|
(18)
|
Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143–156.
|
(19)
|
Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, s. 129–156.
|
(20)
|
Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.
|
(21)
|
Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313–318.
|
(22)
|
Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124–141.
|
(23)
|
Haseman J.K. and Soares E.R. (1976). The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277–288.
|
(24)
|
Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353–360.
|
(25)
|
Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417–429.
|
(26)
|
Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313–319.
|
(27)
|
OECD (2000). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
|
(28)
|
Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.
|
(29)
|
Kirkland D.J., (Ed.) (1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.
|
(30)
|
Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). ”Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87–90.
|
(31)
|
Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35–58.
|
(32)
|
Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417–451.
|
(33)
|
Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585–590.
|
(34)
|
Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. Teoksessa Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), s. 334–336. John Wiley and Sons, New York.
|
(35)
|
Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).
|
(36)
|
Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston
|
(37)
|
Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133–145.
|
(38)
|
Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York
|
(39)
|
Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.
|
(40)
|
Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.
|
Lisäys 1
MÄÄRITELMÄT
Kemikaali: Aine tai seos
Keltarauhanen (-rauhaset): Munasarjaan munasolun irtoamisen jälkeen munarakkulan tilalle muodostuva hormonia erittävä rakenne. Munasarjoissa olevien keltarauhasten määrä vastaa irronneiden munasolujen määrää.
Dominoiva letaalimutaatio: Itusolussa esiintyvä tai siihen hedelmöittymisen jälkeen kiinnittyvä mutaatio, joka aiheuttaa sikiö- ja alkiokuolemia.
Hedelmällisyysluku: Paritelleiden tiineiden naaraiden lukumäärä paritelleiden naaraiden lukumäärään nähden.
Parittelujakso: Altistettujen urosten altistuksen päättymisen ja parittelun välinen aika. Tätä jaksoa seuraamalla voidaan arvioida kemikaalien vaikutuksia erityyppisiin itusoluihin. Hiirten paritellessa viikoilla 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ja 8 altistuksen päättymisen jälkeen havaittiin vaikutuksia spermassa, kondensoituneissa spermatideissä, pyöreätumaisissa spermatideissä, pakyteenivaiheen spermatideissä, varhaisvaiheen spermatosyyteissä, erilaistuneissa spermatogonioissa, erilaistuvissa spermatogonioissa ja kantasoluista muodostuvissa spermatogonioissa.
Ennen kiinnittymistä tapahtuneet alkiokuolemat: Kiinnittyneiden alkioiden määrän ja keltarauhasten määrän välinen erotus. Se voidaan arvioida myös vertailemalla kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärää yhtä naarasta kohti testi- ja kontrolliryhmissä.
Kiinnittymisen jälkeen tapahtuneet alkiokuolemat: Kuolleiden kiinnittyneiden alkioiden osuus kiinnittyneiden alkioiden kokonaismäärästä testiryhmässä verrattuna vastaavaan osuuteen kontrolliryhmässä.
Testikemikaali: Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.
UVCB-aine: Koostumukseltaan tuntematon tai vaihteleva aine, kompleksi reaktiotuote tai biologinen materiaali
Lisäys 2
SPERMATOGENEESIN AJOITUS NISÄKKÄILLÄ
Kuva 1: Vertailu hiirien, rottien ja ihmisten miespuolisten itusolujen kehityksen kestosta (päivinä). DNA:n korjausta ei tapahdu varjostuksella korostetuilla ajanjaksoilla.
Yllä on esitetty kaaviokuva hiiren, rotan ja ihmisen spermatogeneesistä (lähde: Adler, 1996). Erilaistumattomia spermatogonioita ovat yksittäiset A-spermatogoniat, parilliset A-spermatogoniat (Apr) ja ketjuttuneet (Aal) spermatogoniat (Hess ja de Franca, 2008). Varsinaisina kantasoluina pidetään yksittäisiä A-spermatogonioita. Jotta kantasoluihin kohdistuvia vaikutuksia voidaan arvioida, viimeisen testikemikaali-injektion ja parittelun välissä on oltava vähintään 49 päivää (hiirellä).
Viitteet
Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169–172.
Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Teoksessa: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1–15.
” |