Accept Refuse

EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32019R1390

Komisjoni määrus (EL) 2019/1390, 31. juuli 2019, millega muudetakse tehnika arenguga kohandamise eesmärgil määruse (EÜ) nr 440/2008 (millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)) lisa (EMPs kohaldatav tekst)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

ET

Euroopa Liidu Teataja

L 247/1


KOMISJONI MÄÄRUS (EL) 2019/1390,

31. juuli 2019,

millega muudetakse tehnika arenguga kohandamise eesmärgil määruse (EÜ) nr 440/2008 (millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)) lisa

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Liidu toimimise lepingut,

võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. aasta määrust (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ, (1) eriti selle artikli 13 lõiget 2,

ning arvestades järgmist:

(1)

Komisjoni määruses (EÜ) nr 440/2008 (2) on esitatud katsemeetodid, mida kasutatakse kemikaalide füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ja ökotoksilisuse määramiseks määruse (EÜ) nr 1907/2006 kohaldamisel.

(2)

Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon (OECD) töötab välja ühtlustatud ja rahvusvaheliselt kokkulepitud katsejuhendid regulatiivsel eesmärgil kemikaalide uurimiseks. OECD annab korrapäraselt välja uusi ja muudetud katsejuhendeid, võttes arvesse teaduse arengut selles valdkonnas.

(3)

Selleks et võtta arvesse tehnika arengut ning vähendada võimaluse korral katsetes kasutatavate loomade arvu vastavalt määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 13 lõikele 2, tuleks pärast asjakohaste OECD katsejuhendite vastuvõtmist kehtestada kaks uut katsemeetodit ökotoksilisuse hindamiseks ja üheksa uut katsemeetodit inimeste tervisele avalduva toksilise mõju kindlakstegemiseks ning seitset kaitsemeetodit tuleks ajakohastada. Nendest üksteist katsemeetodit on seotud in vitro katsetega nahka ja silmi ärritava/söövitava, nahka sensibiliseeriva, genotoksilise ja endokriinse toime kohta. Esitatud muudatusettepanekuga seoses on konsulteeritud sidusrühmadega.

(4)

Seepärast tuleks määrust (EÜ) nr 440/2008 vastavalt muuta.

(5)

Käesoleva määrusega ettenähtud meetmed on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 133 kohaselt asutatud komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:

Artikkel 1

Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse vastavalt käesoleva määruse lisale.

Artikkel 2

Käesolev määrus jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.

Brüssel, 31. juuli 2019

Komisjoni nimel

president

Jean-Claude JUNCKER


(1)  ELT L 396, 30.12.2006, lk 1.

(2)  Komisjoni 30. mai 2008. aasta määrus (EÜ) nr 440/2008, millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) (ELT L 142, 31.5.2008, lk 1).


LISA

Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse järgmiselt.

1)

B osas asendatakse peatükk B.4 järgmisega:

„B.4.   ÄGE NAHAÄRRITUS/-SÖÖVITUS

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 404 (2015). Kemikaalidega katsete tegemist käsitlevaid OECD katsejuhendeid vaadatakse korrapäraselt läbi eesmärgiga tagada, et need kajastaksid parimaid olemasolevaid teadusandmeid. OECD katsejuhendi nr 404 läbivaatamisel on pööratud erilist tähelepanu võimalikele muudatustele seoses loomade heaolu parandamisega ja uuritavat kemikaali käsitleva kogu olemasoleva teabe hindamisele, et ära hoida tarbetute katsete tegemist laboriloomadega. OECD katsejuhendi nr 404 (algselt vastu võetud 1981. aastal ning muudetud aastatel 1992, 2002 ja 2015) ajakohastatud versioon sisaldab viidet juhenddokumendile nahaärrituse/-söövitusega seotud katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta (1); nimetatud dokumendis pakutakse välja modulaarne lähenemisviis nahaärrituse ja nahasöövituse hindamiseks. Kõnealuse katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi raames kirjeldatakse mitut moodulit, milles teabeallikad ja analüüsivahendid on rühmitatud, ning i) antakse suuniseid, kuidas lõimida ja kasutada olemasolevaid katse- ja muid andmeid kemikaalide võimaliku nahka ärritava ja nahka söövitava toime hindamiseks ja ii) pakutakse välja lähenemisviis juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid (1). Peale selle soovitatakse kõnealuses katsejuhendis kasutada algses in vivo katses katseloomal vajaduse korral kolme katselappi mitte üheaegselt, vaid üksteise järel.

2.

Nahaärrituse ja nahasöövituse määratlus on esitatud käesoleva katsemeetodi liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

3.

Nii usaldusväärsete teadustulemuste kui ka loomade heaolu huvides ei tohiks in vivo uuringuid ette võtta enne, kui kõiki kättesaadavaid andmeid uuritava kemikaali võimaliku nahka söövitava/ärritava toime kohta on hinnatud tõendite kaalukusel põhineva analüüsi teel, nagu on kirjeldatud juhenddokumendis nahaärrituse/-söövitusega seotud katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta, st selle juhenddokumendi kolme osa ja neile vastavate moodulite kohaselt (1). Lühidalt kirjeldatuna vaadeldakse olemasolevaid andmeid 1. osas seitsme mooduli alusel, mis hõlmavad andmeid inimese kohta, in vivo andmeid, in vitro andmeid, füüsikalis-keemilisi omadusi (nt pH, eelkõige tugev happelisus või aluselisus) ja katsetel mittepõhinevaid meetodeid. Teises osas viiakse läbi tõendite kaalukusel põhinev analüüs. Kui selle analüüsi tulemused on ebaselged, tuleks teha 3. osa kohased täiendavad katsed, alguses in vitro meetoditega ning viimase võimalusena in vivo katsed. Seega peaks kõnealune analüüs vähendama vajadust teha in vivo katseid selliste uuritavate kemikaalidega, mille puhul on muudest uuringutest saadud juba piisavalt tõendeid nende nahka söövitava/ärritava toime kohta.

IN VIVO KATSE PÕHIMÕTE

4.

Uuritav kemikaal kantakse ühes annuses katselooma nahale; katselooma töötlemata nahapiirkondi kasutatakse negatiivse kontrollina. Ärrituse/söövituse ulatus registreeritakse ja seda hinnatakse kindlate ajavahemike järel ning mõju täielikuks hindamiseks lisatakse selle täiendav kirjeldus. Uuringu kestus peaks olema piisav, et hinnata täheldatud mõju pöörduvust või pöördumatust.

5.

Loomad, kellel täheldatakse mis tahes katseetapis pideva tugeva stressi ja/või valu tunnuseid, tuleks humaanselt surmata ning uuritava kemikaali hindamisel tuleks seda arvesse võtta. Otsustamiskriteeriumid surmaeelses seisundis või raskelt kannatavate loomade humaanseks surmamiseks on esitatud eraldi juhenddokumendis (2).

IN VIVO KATSE ETTEVALMISTAMINE

Loomaliigi valimine

6.

Eelistatud laboriloom on albiinoküülik; kasutatakse noori terveid täiskasvanud küülikuid. Muude liikide kasutamisel tuleks esitada vastav põhjendus.

Loomade ettevalmistamine

7.

Umbes 24 tundi enne katset tuleks loomade seljaosa karvad võimalikult lühikeseks lõigata. Tuleks vältida naha marrastamist ning kasutada tuleks üksnes terveid, terve nahaga loomi.

8.

Mõnel küülikuliinil esineb tiheda karvastikuga laike, mis on teatavatel aastaaegadel silmatorkavamad. Selliseid tiheda karvastikuga piirkondi ei tohiks katses kasutada.

Pidamis- ja söötmistingimused

9.

Loomi tuleks pidada ühekaupa. Katseloomade ruumi temperatuur peaks küülikute puhul olema 20 °C (± 3 °C). Ehkki suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, on sobivaim vahemik 50–60 %. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett.

KATSE KÄIK

Uuritava kemikaali kasutamine

10.

Uuritav kemikaal tuleks kanda väikesele (umbes 6 cm2 suurusele) nahapinnale ning katta see marlilapiga, mida hoiab paigal nahka mitteärritav teip. Kui uuritavat kemikaali ei ole võimalik otse nahale kanda (nt vedelikud ja mõned pastad), kantakse see esmalt marlilapile, mis seejärel asetatakse nahale. Lappi hoitakse kogu kokkupuuteperioodi vältel sobiva poolläbilaskva sideme abil õrnalt vastu nahka. Kui uuritav kemikaal kantakse lapile, tuleks lapp asetada nahale nii, et kemikaal puutuks nahaga korralikult kokku ja oleks nahal ühtlaselt jaotunud. Tuleks takistada looma ligipääsu lapile ning uuritava kemikaali allaneelamist ja sissehingamist.

11.

Vedelaid uuritavaid kemikaale kasutatakse üldjuhul lahjendamata kujul. Kui katses kasutatakse tahket ainet (selle võib vajaduse korral pulbristada), tuleks uuritavat kemikaali niisutada võimalikult väikese koguse veega (või vajaduse korral muu sobiva kandeainega), et tagada hea kokkupuude nahaga. Kui kasutatakse muud kandeainet kui vett, peaks kandeaine võimalik mõju uuritava kemikaali põhjustatud nahaärritusele olema minimaalne või puuduma.

12.

Kokkupuuteperioodi lõppedes ehk tavaliselt nelja tunni möödudes tuleks uuritava kemikaali jäägid võimaluse korral vee või sobiva lahusti abil eemaldada, muutmata seejuures marrasknaha terviklikkust ega selles tekkinud reaktsiooni.

Annustamine

13.

Katses kasutatavale pinnale kantakse 0,5 ml vedelikku või 0,5 g tahket ainet või pastat.

Algkatse (ühe loomaga in vivo katse nahaärrituse/-söövituse hindamiseks)

14.

Kui tõendite kaalukusel põhinevast analüüsist või varasematest in vitro katsetest nähtub, et uuritav kemikaal on söövitav või ärritav või klassifitseerimata, ei ole täiendavate in vivo katsete tegemine tavaliselt vajalik. Kui aga lisaandmete kogumine osutub vajalikuks, viiakse in vivo katse esmalt läbi ühe loomaga ja seejuures kasutatakse järgmist lähenemisviisi. Loomale pannakse üksteise järel kuni kolm katselappi. Esimene lapp eemaldatakse kolme minuti pärast. Kui tõsist nahareaktsiooni ei täheldata, pannakse loomale teine lapp ja eemaldatakse see tunni aja pärast. Kui selles etapis tehtud vaatlustest ilmneb, et kokkupuudet võib humaanselt pikendada nelja tunnini, pannakse loomale kolmas lapp, eemaldatakse see nelja tunni pärast ja hinnatakse tekkinud reaktsiooni.

15.

Kui kolmest kõnealusest järjestikusest kokkupuuteperioodist ükskõik millise järel täheldatakse söövitavat toimet, lõpetatakse katse kohe. Kui pärast viimase lapi eemaldamist ei täheldata söövitavat toimet, jälgitakse looma 14 päeva jooksul, välja arvatud juhul, kui söövitus ilmneb varem.

16.

Kui uuritav kemikaal ei põhjusta eeldatavalt söövitust, kuid võib olla ärritav, tuleks ühele loomale panna üks lapp neljaks tunniks.

Kinnitav katse (täiendavate loomadega in vivo katse nahaärrituse hindamiseks)

17.

Kui algkatses ei täheldata söövitavat toimet, tuleks ärritava toime olemasolu või puudumise kinnitamiseks kasutada veel kuni kahte looma ja iga looma puhul ühte lappi kokkupuuteperioodiga neli tundi. Kui algkatses täheldatakse ärritavat toimet, võib kinnitavas katses kasutada järjestikust hindamist või kanda kemikaali üheaegselt kahele lisaloomale. Kui erandjuhul ei ole algkatset tehtud, võib kahele või kolmele loomale asetada ühe lapi, mis eemaldatakse nelja tunni pärast. Kui kasutatakse kahte looma ja mõlemal täheldatakse sama reaktsiooni, ei ole vaja enam lisakatseid teha. Muul juhul tehakse katse ka kolmanda loomaga. Ebaselgete tulemuste hindamiseks võib olla vaja kasutada veel loomi.

Vaatlusperiood

18.

Vaatlusperiood peaks olema piisavalt pikk, et võimaldada täielikult hinnata täheldatud toime pöörduvust. Siiski tuleks katse kohe lõpetada, kui loomal täheldatakse pideva tugeva valu või stressi tunnuseid. Toime pöörduvuse kindlakstegemiseks tuleks loomi jälgida kuni 14 päeva vältel pärast lapi eemaldamist. Kui pöörduvust täheldatakse enne 14 päeva möödumist, tuleks katse sel hetkel lõpetada.

Kliinilised vaatlused ja nahareaktsioonide hindamine

19.

Kõikidel loomadel uuritakse nahapunetuse ja turse esinemist ning reaktsioone hinnatakse lapi eemaldamisest 60 minuti ning seejärel 24, 48 ja 72 tunni möödumisel. Ühe loomaga tehtavas algkatses vaadeldakse kokkupuutes olnud nahapinda ka vahetult pärast lapi eemaldamist. Nahareaktsioonide hindamiseks ja registreerimiseks kasutatakse allpool tabelis esitatud hindeid. Kui nahal esineb 72 tunni järel kahjustus, mis ei ole käsitatav ärrituse ega söövitusena, võib olla vaja teha vaatlusi kuni 14. päevani, et teha kindlaks toime pöörduvus. Peale ärrituse jälgimise tuleks täielikult kirjeldada kõiki paikseid mürgisuse ilminguid, näiteks naha rasvkoe kadumist, ja mis tahes süsteemseid kahjulikke toimeid (nt kliinilisi mürgisuse nähte ja mõju kehamassile) ning need registreerida. Ebaselgete tulemuste puhul tuleks kaaluda histopatoloogilise analüüsi tegemist.

20.

Nahareaktsioonide hindamine on paratamatult subjektiivne. Nahareaktsioonide hindamise ühtlustamiseks ning nii katseid läbi viivate laborite kui ka vaatlusi tegevate ja vaatlustulemusi tõlgendavate isikute abistamiseks on vaja vaatluste läbiviijad kasutatava hindamissüsteemiga (vt tabelit allpool) piisavalt kurssi viia. Seejuures võib olla abi illustreeritud juhendist nahaärrituse ja muude kahjustuste hindamiseks (3).

ANDMED JA ARUANDLUS

21.

Uuringutulemused tuleks esitada lõplikus katseprotokollis tabeli kujul ja need peaksid hõlmama kõiki punktis 24 loetletud üksikasju.

Tulemuste hindamine

22.

Nahaärrituse hindamisel tuleks ühtlasi arvesse võtta kahjustuse laadi ja raskusastet ning selle pöörduvust või pöördumatust. Üksikud hinded ei väljenda eraldivõetuna aine ärritava toime absoluuttaset, kuna samaaegselt hinnatakse ka uuritava aine muud toimet. Selle asemel tuleks üksikuid hindeid käsitada võrdlusväärtusena, mida tuleb hinnata koos kõikide muude uuringu käigus saadud vaatlustulemustega.

23.

Ärritusreaktsioonide hindamisel tuleks arvesse võtta nahakahjustuste pöörduvust. Kui sellised reaktsioonid nagu alopeetsia (piiratud alal), hüperkeratoos, hüperplaasia ja kestendamine püsivad 14-päevase vaatlusperioodi lõpuni, tuleks uuritavat kemikaali käsitada ärritava kemikaalina.

Katseprotokoll

24.

Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.

 

In vivo uuringu tegemise põhjendus:

olemasolevatest katseandmetest, sealhulgas järjestikuse hindamise strateegia rakendamisel saadud tulemustest lähtuv tõendite kaalukusel põhinev analüüs;

varasematest katsetest saadud asjakohaste andmete kirjeldus;

igas katsestrateegia kohases etapis saadud andmed;

tehtud in vitro katsete kirjeldus, sealhulgas katsete üksikasjalik käik ning uuritavate ja võrdlusainetega saadud tulemused;

in vivo uuringu tegemist toetav tõendite kaalukusel põhinev analüüs.

 

Uuritav kemikaal:

ühest koostisosast koosnev aine: kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

mitmest koostisosast koosnev aine, segu või tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal (UVCB): võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest;

füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

allikas ja partii number, kui see on olemas;

vajaduse korral teave uuritava kemikaali / kontrollaine töötlemise kohta enne katset (näiteks soojendamine, peenestamine);

uuritava kemikaali püsivus ja aegumiskuupäev või kordusanalüüsi tegemise tähtpäev, kui see on teada;

säilitustingimused.

 

Kandeaine:

identimisandmed, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus;

kandeaine valimise põhjendus.

 

Katseloom(ad):

kasutatud loomaliik/-liin, muu(de) looma(de) kui albiinoküüliku kasutamise korral sellekohane põhjendus;

kummastki soost loomade arv;

iga looma kaal katse alguses ja lõpus;

vanus katse alguses;

looma(de) päritolu, pidamistingimused, toitumisandmed jms.

 

Katsetingimused:

lapi asetuskoha ettevalmistamise meetod;

kasutatud lapimaterjalide ja lapi asetamise meetodi üksikasjad;

uuritava kemikaali ettevalmistamise, pealekandmise ja eemaldamise üksikasjad.

 

Tulemused:

ärritus-/söövitusnähtude hindamise tulemused iga looma kohta igal mõõtmiskorral tabeli kujul;

kõikide täheldatud kahjustuste kirjeldus;

täheldatud ärrituse või söövituse laadi ja astme jutustav kirjeldus ja võimalikud histopatoloogilised leiud;

nahaärritusele ja -söövitusele lisanduvate muude kahjulike paiksete (nt naha rasvkoe kadumine) ja süsteemsete toimete kirjeldus.

 

Tulemuste arutelu

 

Järeldused

KIRJANDUS

(1)

OECD (2014). Guidance Document on an Integrated Approach to Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 203. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(2)

OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances. Heaks kiidetud kemikaalikomitee ja kemikaalide töörühma 28. ühiskoosolekul novembris 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

Tabel

Nahareaktsioonide Hindamine

Nahapunetust ei esine…

0

Väga nõrk (vaevumärgatav) nahapunetus…

1

Selgesti nähtav nahapunetus…

2

Mõõdukas kuni tugev nahapunetus…

3

Tugev nahapunetus (lihapunane) kuni punetuse hindamist takistava raia esinemine…

4

Suurim võimalik punktide arv: 4

Turset ei esine…

0

Väga kerge (vaevumärgatav) turse…

1

Kerge turse (ala servad on selgesti nähtavalt kõrgemal)…

2

Mõõdukas turse (ala on ligikaudu 1 mm kõrgemal)…

3

Tugev turse (ala on üle 1 mm kõrgemal ja levinud kokkupuutealast väljapoole)…

4

Suurim võimalik punktide arv: 4

Ebaselgete tulemuste puhul võib teha histopatoloogilise analüüsi.

Liide

MÕISTED

Kemikaal – aine või segu.

Nahasöövitus – pöördumatu nahakahjustuse, st marrasknahast pärisnahani ulatuva nähtava nekroosi tekkimine uuritava kemikaali kuni neljaks tunniks pealekandmise tagajärjel. Tüüpilised söövitusnähud on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14-päevase vaatlusperioodi lõpuks ilmnev värvimuutus naha valastumise tõttu, täielik alopeetsia ja armistumine. Ebaselgete kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogilise analüüsi tegemist.

Nahaärritus – pöörduva nahakahjustuse tekkimine uuritava kemikaali kuni neljaks tunniks pealekandmise tagajärjel.

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

2)

B osas asendatakse peatükk B.17 järgmisega:

„B.17.   HPRT VÕI XPRT GEENIL PÕHINEVAD IN VITRO GEENIMUTATSIOONIKATSED IMETAJARAKKUDEGA

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 476 (2016). Katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaolu. Käesolevas katsemeetodi B.17 muudetud versioonis kajastuvad selle katse tegemisel saadud peaaegu kolmekümne aasta pikkused kogemused ja samuti tulemused, mis on saadud tümidiini kinaasi geenil põhineva, imetajarakkudega tehtava in vitro geenimutatsioonikatse jaoks uue eraldi meetodi väljatöötamise käigus. Katsemeetod B.17 kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. OECD on välja töötanud dokumendi, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia valdkonna katsete kohta ning ülevaade genotoksilisust käsitlevates OECD katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).

2.

Käesoleva meetodi kohase imetajarakkudega läbi viidava in vitro geenimutatsioonikatse eesmärk on tuvastada kemikaalide põhjustatud geenimutatsioone. Kõnealustes katsetes kasutatakse rakuliine, mis võimaldavad tuvastada otsemutatsioone reportergeenides, täpsemalt endogeenses hüpoksantiini-guaniini fosforibosüültransferaasi geenis (näriliserakkudes Hprt ja inimese rakkudes HPRT; käesolevas katsemeetodis viidatakse neile koos kui geenile Hprt ning vastavale katsele kui HPRT-katsele) ja ksantiini-guaniini fosforibosüültransferaasi transgeenis (gpt) (vastavale katsele viidatakse kui XPRT-katsele). HPRT- ja XPRT-mutatsioonikatsega tuvastatakse eri geneetilisi muutusi. Asjaolu, et transgeen gpt paikneb autosoomil, võimaldab tuvastada peale HPRT-katsega kindlaks tehtavate mutatsioonide (nt aluspaarivahetused, raaminihked, väikesed deletsioonid ja insertsioonid) ka suurtest deletsioonidest ja võimalikust mitootilisest rekombinatsioonist põhjustatud mutatsioone, mida HPRT-katsega pole võimalik tuvastada, kuna geen Hprt paikneb X-kromosoomil (2, 3, 4, 5, 6, 7). XPRT-katset kasutatakse regulatiivsel eesmärgil praegu vähem kui HPRT-katset.

3.

Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD

4.

In vitro katsete puhul tuleb metabolismi aktiveerimiseks üldjuhul kasutada eksogeenset allikat. Eksogeenne metabolismi aktiveerimise süsteem ei võimalda täielikult matkida in vivo tingimusi.

5.

Tuleks hoiduda kasutamast tingimusi, mille puhul saadakse valepositiivseid tulemusi, mis ei ole põhjustatud uuritava kemikaali vahetust interaktsioonist raku geneetilise materjaliga (st võib esineda vastastikmõju katsesüsteemiga); sellised tingimused hõlmavad pH või osmolaalsuse muutusi (8, 9, 10), söötme koostisosadega reageerimist (11, 12) ja liiga suurt tsütotoksilisust (13). HPRT-katse puhul loetakse liiga suureks tsütotoksilisuseks punktis 19 määratletud soovitatavat suurimat tsütotoksilisuse määra ületavat tsütotoksilisust.

6.

Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud.

KATSE PÕHIMÕTE

7.

Mutantsed rakud, millel on HPRT-katse puhul kadunud HPRT ensümaatiline aktiivsus ja XPRT-katse puhul XPRT ensümaatiline aktiivsus, on puriini analoogi 6-tioguaniini tsütostaatilise toime suhtes resistentsed. Rakud, kus on olemas Hprt (HPRT-katse puhul) või gpt (XPRT-katse puhul), on aga 6-tioguaniini suhtes tundlikud ning see aine pärsib neis rakkudes ainevahetust ja peatab rakkude edasise jagunemise. Seega on mutantsed rakud võimelised 6-tioguaniini juuresolekul paljunema, ent normaalsed rakud, kus on olemas Hprt (HPRT-katse puhul) või gpt (XPRT-katse puhul), seda ei suuda.

8.

Rakususpensioon või ühekihiline rakukultuur viiakse sobivaks ajavahemikuks (3–6 tunniks) kokkupuutesse uuritava kemikaaliga – nii koos metabolismi aktiveeriva eksogeense allikaga kui ka ilma selleta (vt punkt 14) – ning seejärel külvatakse rakud ümber, et hinnata tsütotoksilisust ja võimaldada fenotüübi avaldumist enne mutantide selekteerimist (14, 15, 16, 17). Tsütotoksilisust hinnatakse suhtelise elulemuse, st kloonimistõhususe järgi, mis tehakse kindlaks kohe pärast töötlemist ja mida kohandatakse lähtuvalt rakkude arvu võimalikust vähenemisest negatiivse kontrolliga võrreldes (punkt 18 ja 2. liide). Töödeldud kultuure kasvatatakse söötmes rakutüübist sõltuva ajavahemiku vältel, mis on piisav tekkinud mutatsioonide fenotüüpide võimalikult optimaalseks avaldumiseks (tavaliselt vähemalt 7–9 päeva). Fenotüübi avaldumise järgselt külvatakse teadaolev arv rakke muteerumissageduse määramiseks nii söötmesse, mis sisaldab mutantsete kolooniate tuvastamist võimaldavat selektiivainet, kui ka selektiivaineta söötmesse, et teha kindlaks kloonimistõhusus (eluvõimelisus). Sobiva inkubatsiooniperioodi lõppedes kolooniad loendatakse. Muteerumissagedus arvutatakse mutantsete kolooniate arvu põhjal, mida on korrigeeritud lähtuvalt kloonimistõhususest mutantide selekteerimise ajal.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistused

Rakud

9.

HPRT- ja XPRT-katses kasutatavate rakutüüpide puhul peaks olema tõendatud, et asjaomased rakud on keemiliste mutageenide suhtes tundlikud, nende kloonimistõhusus on suur, neil on püsiv karüotüüp ja nende spontaanse muteerumise sagedus on püsiv. HPRT-katses kõige sagedamini kasutatavate rakkude hulka kuuluvad hiina hamstri rakuliinid CHO, CHL ja V79, hiire lümfoomi rakuliin L5178Y ja inimese lümfoblastoidne rakuliin TK6 (18, 19). XPRT-katses kasutatakse rakuliinist CHO saadud liini AS52, mis sisaldab transgeeni gpt ja kust on eemaldatud geen Hprt (20, 21); AS52 rakke ei saa kasutada HPRT-katses, kuna Hprt on neist eemaldatud. Muude rakuliinide kasutamist tuleks põhjendada ja need peaksid olema valideeritud.

10.

Rakuliine tuleks regulaarselt kontrollida, et veenduda modaalse kromosoomiarvu püsivuses ning mükoplasmasaastuse puudumises (22, 23); saastunud rakkude ja muutunud modaalse kromosoomiarvuga rakkude kasutamisest tuleks hoiduda. Tuleks kindlaks teha katseid läbi viivas laboris aluseks võetav tavapärane rakutsükli kestus, mis peaks vastama asjaomaste rakkude kohta avaldatud näitajatele. Samuti tuleks kontrollida spontaanse muteerumise sagedust rakkude tüvikultuuris ja kui muteerumissagedus on vastuvõetamatu, ei tohiks seda tüvikultuuri kasutada.

11.

Enne käesoleva meetodi kohases katses kasutamist võib olla vaja puhastada kultuurid olemasolevatest mutantsetest rakkudest; selleks võib kasvatada neid HPRT-katse puhul näiteks HAT-söötmes ja XPRT-katse puhul MPA-söötmes (5, 24) (vt 1. liide). Puhastatud rakud võib krüosäilitada ja seejärel töökultuurina kasutamiseks üles sulatada. Katses võib kasutada värskelt sulatatud töökultuuri pärast rakkude arvu tavapärase kahekordistumisaja saavutamist. XPRT-katse puhul tuleks AS52 rakkude tavapärasel kultiveerimisel kasutada tingimusi, millega tagatakse transgeeni gpt säilimine (20).

Söötmed ja kultiveerimistingimused

12.

Rakukultuuride kasvatamisel tuleks kasutada sobivat söödet ja sobivaid inkubeerimistingimusi (kasvunõud, 5-protsendilise CO2-sisaldusega niiske atmosfäär, inkubeerimistemperatuur 37 °C). Kultiveerimisel tuleks alati järgida tingimusi, millega tagatakse rakkude püsimine logaritmilises kasvufaasis. On väga oluline valida söötmed ja kasvutingimused nii, et oleks tagatud rakkude optimaalne kasv ekspressiooniperioodil ning optimaalne kloonimistõhusus nii muteerunud kui ka muteerumata rakkude puhul.

Rakukultuuride ettevalmistamine

13.

Rakkude paljundamiseks tüvikultuurist külvatakse need söötmesse sellise tihedusega, et rakkude eksponentsiaalne kasv suspensioonis või ühekihilises kultuuris jätkuks kogu töötlemis- ja ekspressiooniperioodi vältel (nt tuleks ühekihiliselt kasvavate rakkude puhul ära hoida konfluentsuse teket).

Metabolismi aktiveerimine

14.

Kui kasutatavate rakkude endogeenne metaboliseerimisvõime on ebapiisav, tuleks kasutada eksogeenseid metabolismisüsteeme. Kui ei ole teisiti põhjendatud, soovitatakse üldjuhul kasutada kõige sagedamini rakendatavat süsteemi, mis koosneb näriliste (tavaliselt roti) maksast valmistatud, mitokondrite eemaldamisel saadud fraktsioonist S9, millele on lisatud kofaktoreid ning mida on töödeldud selliste ensüümiinduktoritega nagu Aroclor 1254 (25, 26, 27, 28) või fenobarbitaali ja β-naftoflavooni kombinatsioon (29, 30, 31, 32). Viimati nimetatud kombinatsiooni kasutamine ei ole vastuolus püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsiooniga (33) ning see on osutunud monooksügenaaside induktorina sama tõhusaks kui Aroclor 1254 (29, 31). Fraktsiooni S9 kasutatakse tavaliselt kontsentratsioonis 1–2 mahuprotsenti, kuid selle kontsentratsiooni lõplikus katsesöötmes võib suurendada kuni 10 mahuprotsendini. Kasutatava eksogeense metabolismi aktiveerimise süsteemi või ensüümiinduktori liigi ja kontsentratsiooni valikut võib mõjutada uuritava aine klass (34, 35, 36).

Uuritava kemikaali ettevalmistamine

15.

Enne rakkude töötlemist tuleks tahke uuritav kemikaal lahustada sobivas lahustis ja vajaduse korral tuleks saadud lahust lahjendada (vt punkt 16). Vedelat uuritavat kemikaali võib lisada otse katsesüsteemi või seda enne lisamist lahjendada. Gaasilise või lenduva kemikaali kasutamisel tuleks standardmeetodit asjakohaselt muuta, näiteks viia kemikaaliga töötlemine läbi suletud kultiveerimisnõus (37, 38). Uuritav kemikaal tuleks katseks ette valmistada vahetult enne kasutamist, välja arvatud juhul, kui püsivuse andmetest nähtub, et kemikaali säilitamine on vastuvõetav.

KATSETINGIMUSED

Lahustid

16.

Lahusti tuleks valida nii, et oleks tagatud uuritava kemikaali optimaalne lahustumine, kuid lahusti ei mõjutaks samal ajal negatiivselt katse käiku näiteks rakkude kasvukiiruse või uuritava kemikaali omaduste muutmise, kultiveerimisnõuga reageerimise või metabolismi aktiveerimise süsteemi kahjustamise teel. Esmajärjekorras soovitatakse võimaluse korral kaaluda veepõhise lahusti (või söötme) kasutamist. Tavapäraselt kasutatavad lahustid on näiteks vesi ja dimetüülsulfoksiid. Üldjuhul ei tohiks orgaanilise lahusti sisaldus töötlemiseks kasutatavas lõppsöötmes ületada 1 mahuprotsenti ja veepõhise lahusti (füsioloogilise lahuse või vee) sisaldus 10 mahuprotsenti. Kui kasutatakse tavapärasest erinevat lahustit (nt etanooli või atsetooni), tuleks esitada tõendavad andmed selle sobivuse kohta uuritava kemikaali ja katsesüsteemi puhul ning genotoksilise toime puudumise kohta kasutataval kontsentratsioonil. Selliste tõendavate andmete puudumisel on oluline lisada katsesse kemikaaliga töötlemata kontrollid (vt 1. liide), et tõendada valitud lahustist tuleneva kahjuliku või mutageense toime puudumist.

Tsütotoksilisuse mõõtmine ja kokkupuutekontsentratsioonide valimine

17.

Uuritava kemikaali suurima kontsentratsiooni valimisel tuleks hoiduda valimast kontsentratsiooni, mille puhul on võimalik saada valepositiivseid tulemusi, näiteks tulenevalt liiga suurest tsütotoksilisusest (vt punkt 20), söötmes sadenemisest (vt punkt 21) või pH või osmolaalsuse olulisest muutumisest (vt punkt 5). Kui uuritav kemikaal muudab lisamise hetkel oluliselt söötme pH-d, võib pH reguleerimiseks lisada töötlemiseks kasutatavasse lõppsöötmesse puhvrit, et hoida ära valepositiivsete tulemuste saamist ja säilitada sobivad kultiveerimistingimused.

18.

Kontsentratsioonide valimisel lähtutakse tsütotoksilisusest ja muudest kaalutlustest (vt punktid 20–22). Ehkki tsütotoksilisuse hindamine eelkatses võib põhikatses kasutatavate kontsentratsioonide täpsemaks kindlakstegemiseks kasulikuks osutuda, ei ole eelkatse tegemine kohustuslik. Põhikatses on tsütotoksilisuse mõõtmine igas kultuuris vajalik ka juhul, kui tsütotoksilisust on eelnevalt juba hinnatud. Tsütotoksilisuse hindamiseks tuleks kasutada suhtelist elulemust, st võrrelda vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude kloonimise tõhusust, mida on kohandatud rakkude arvu võimaliku vähenemise suhtes töötlemise ajal, kloonimistõhususe kohandatud väärtusega negatiivsete kontrollide puhul, mille elulemuseks loetakse 100 % (vt valem 2. liites).

19.

Kemikaali tuleks hinnata vähemalt neljal nõuetekohasuse kriteeriumidele (sobiv tsütotoksilisuse määr, rakkude arv jne) vastaval katsekontsentratsioonil (see ei hõlma lahustiga kontrolli ega positiivseid kontrolle). Töötlemisel on soovitatav kasutada iga katsekontsentratsiooni puhul kahte paralleelkultuuri, ent võib kasutada ka suuremat arvu paralleelkultuure või ühteainsat kultuuri. Iga kontsentratsiooni puhul tuleks sõltumatute paralleelkultuuridega saadud tulemused esitada eraldi, kuid andmeanalüüsi jaoks võib need koondada (17). Uuritavate kemikaalide puhul, mille tsütotoksilisus on väike või millel see puudub, sobivad tavaliselt kontsentratsioonid, mis erinevad üksteisest umbes kaks kuni kolm korda. Tsütotoksilisuse esinemisel peaksid valitud katsekontsentratsioonid hõlmama vahemikku tsütotoksilisuse ilmnemise kontsentratsioonist kuni kontsentratsioonideni, mille juures täheldatakse mõõdukat ja väikest või olematut tsütotoksilisust. Paljudel uuritavatel kemikaalidel on toime kontsentratsioonist sõltuvuse kõver järsu tõusuga ning tsütotoksilisuse täieulatuslikuks iseloomustamiseks või kontsentratsioonist sõltuvuse üksikasjalikuks uurimiseks võib olla vaja kasutada üksteisest vähem erinevaid kontsentratsioone ja enam kui nelja kontsentratsiooni, eriti olukorras, kus on vaja teha korduskatse (vt punkt 43). Enam kui nelja kontsentratsiooni kasutamine võib osutuda eriti oluliseks, kui kasutatakse ühteainsat kultuuri.

20.

Kui suurima kontsentratsiooni valimisel lähtutakse tsütotoksilisusest, tuleks see kontsentratsioon valida nii, et saavutataks suhteline elulemus 10–20 %. Selliste positiivsete tulemuste tõlgendamisel, mille puhul täheldatav suhteline elulemus on vaid 10 % või väiksem, tuleks olla ettevaatlik (punkt 43).

21.

Raskesti lahustuva uuritava kemikaali puhul, mis ei ole tsütotoksiline kontsentratsioonidel, mis on väiksemad kui vähim kontsentratsioon, mille juures kemikaal ei lahustu, peaks suurimal analüüsitaval kontsentratsioonil olema pärast kemikaaliga töötlemise lõppemist täheldatav hägusus või silma või invertmikroskoobiga nähtav sade. Isegi kui tsütotoksilisus avaldub suuremal kontsentratsioonil kui vähim kontsentratsioon, mille juures kemikaal ei lahustu, on soovitatav teha katse ainult ühel sellisel kontsentratsioonil, mille puhul tekib hägusus või nähtav sade, sest sade võib põhjustada katsevigu. Sademe moodustumise kontsentratsiooni puhul tuleb hoolikalt veenduda, et sade ei mõjuta katse käiku. Enne katse alustamist võib olla kasulik määrata kemikaali lahustuvus söötmes.

22.

Kui ei täheldata ei sadet ega liigset tsütotoksilisust, peaks suurim katsekontsentratsioon olema vähim järgmistest kontsentratsioonidest: 10 mM, 2 mg/ml või 2 μl/ml (39, 40). Kui uuritava kemikaali koostis ei ole määratav, näiteks kui see on tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal (UVCB) (41), keskkonnast saadud ekstrakt vms, võib juhul, kui ei täheldata kemikaali piisavat tsütotoksilisust, olla vaja selle iga koostisosa kontsentratsiooni suurendamiseks kasutada suuremat maksimumkontsentratsiooni (nt 5 mg/ml). Tuleks siiski märkida, et inimravimite puhul võivad need nõuded olla teistsugused (42).

Kontrollid

23.

Iga katserežiimi puhul tuleks kasutada paralleelseid negatiivseid kontrolle (vt punkt 16), mille puhul töötlemiseks kasutatavale söötmele lisatakse vaid lahusti ja kultuure käideldakse muus osas samamoodi kui uuritava kemikaaliga töödeldud kultuure.

24.

Paralleelsete positiivsete kontrollide kasutamine on vajalik, et tõendada labori pädevust tuvastada rakendatavale katsemeetodile vastavates tingimustes mutageene ning vajaduse korral veenduda metabolismi eksogeense aktiveerimise süsteemi tõhususes. Positiivsete kontrollide näited on esitatud allpool tabelis 1. Kui see on põhjendatud, võib positiivse kontrollina kasutada mõnda muud ainet. Kuna in vitro genotoksilisuse katsed imetajarakkudega on piisavalt standarditud, võib katsetes, kus kasutatakse töötlemist koos metabolismi eksogeense aktiveerimisega ja ilma selleta, kasutada üksnes sellist positiivset kontrolli, mis nõuab metabolismi aktiveerimist. Sel juhul võimaldab kõnealuse üheainsa positiivse kontrolliga saadud tulemus tõendada nii metabolismi aktiveerimise süsteemi toimimist kui ka katsesüsteemi reageerimisvõimet. Iga positiivse kontrolli puhul tuleks kasutada ühte või mitut kontsentratsiooni, mille juures võib eeldada, et saadakse tausttaset reprodutseeritavalt ja tuvastatavalt ületavad tulemused, mis võimaldavad tõendada katsesüsteemi tundlikkust, ning samal ajal ei tohiks tulemused olla mõjutatud käesolevas katsemeetodis sätestatud piirmäära ületavast tsütotoksilisusest (vt punkt 20).

Tabel 1

Labori pädevuse hindamiseks ja positiivsete kontrollide valimiseks soovitatavad võrdlusained

Metabolismi aktiveerimise kasutamine

Lookus

Aine ja CASi nr

Metabolismi eksogeenset aktiveerimist ei kasutata

Hprt

Etüülmetaansulfonaat [CASi nr: 62-50-0] Etüülnitrosouurea [CASi nr: 759-73-9] 4-nitrokinoliin-1-oksiid [CASi nr: 56-57-5]

 

xprt

Streptonigriin [CASi nr: 3930-19-6] Mitomütsiin C [CASi nr: 50-07-7]

Kasutatakse metabolismi eksogeenset aktiveerimist

Hprt

3-metüülkolantreen [CASi nr: 56-49-5] 7,12-dimetüülbensantratseen [CASi nr: 57-97-6] Benso[a]püreen [CASi nr: 50-32-8]

 

xprt

Benso[a]püreen [CASi nr: 50-32-8]

KATSE KÄIK

Uuritava kemikaaliga töötlemine

25.

Paljunevaid rakke töödeldakse uuritava kemikaaliga nii metabolismi aktiveerimise süsteemi juuresolekul kui ka ilma selleta. Kokkupuuteperiood peab olema sobiva pikkusega (tavaliselt piisab 3–6 tunnist).

26.

Rakkude minimaalse arvu valimisel iga kultuuri (nii kontroll- kui ka töödeldud kultuuride) ja iga katseetapi jaoks tuleks lähtuda spontaanse muteerumise sagedusest. Üldsuunisena tuleks võtta töötlemiseks ja ümberkülvamiseks piisav hulk rakke, et tagada igas katseetapis 10 mutandi spontaanne teke igas kultuuris (17). Spontaanse muteerumise sagedus jääb üldjuhul vahemikku 5 kuni 20 × 10-6. Kui spontaanse muteerumise sagedus on 5 × 10-6, on piisava arvu mutantide (vähemalt 10) spontaanse tekke tagamiseks ka kultuurides, mida on töödeldud kontsentratsioonil, mille juures töötlemisest tulenev tsütotoksilisus on 90 % (suhteline elulemus on 10 %), vaja võtta töötlemiseks vähemalt 20 × 106 rakku. Peale selle tuleb ekspressiooniperioodi vältel kultiveerida ja mutantide selekteerimiseks välja külvata piisaval arvul rakke (alati vähemalt kaks miljonit rakku) (17).

Fenotüübi avaldumise aeg ja muteerumissageduse mõõtmine

27.

Töötlemisperioodi lõppedes kasvatatakse rakke kultuuris, et võimaldada mutantse fenotüübi avaldumist. Uute tekkinud Hprt- ja xprt-mutantide fenotüübi optimumilähedaseks avaldumiseks piisav miinimumperiood on tavaliselt 7–9 päeva (43, 44). Selle ajavahemiku vältel külvatakse rakke regulaarselt ümber, et tagada nende eksponentsiaalne kasv. Pärast fenotüübi avaldumist külvatakse rakud nii selektiivainet 6-tioguaniini sisaldavasse kui ka ilma selektiivaineta söötmesse, et teha kindlaks vastavalt mutantide arv ja selekteerimisaegne kloonimistõhusus. Sellisel külvamisel võib ühekihiliste kultuuride puhul kasutada tasse ja suspensioonina kasvavate rakkude puhul mikrotiiterplaate. Mutantide selekteerimiseks tuleks rakud välja külvata sellisel tihedusel, millega tagatakse optimaalne mutantide tuvastamine (st metaboolne koostöö on takistatud) (17). Rakke kasvatatakse kolooniate optimaalseks kasvuks sobiva ajavahemiku vältel (nt 7–12 päeva) ning seejärel loendatakse kolooniad. Muteerumissagedus arvutatakse mutantsete kolooniate arvu põhjal, mida on korrigeeritud lähtuvalt kloonimistõhususest mutantide selekteerimise ajal (valemid on esitatud 2. liites).

Labori pädevus

28.

Laboris peaks enne katsemeetodi rutiinset kasutamist olema katse läbiviimiseks piisava kogemuse omandamiseks tehtud katseseeria positiivse kontrollina kasutatud võrdlusainetega, millel on eri toimemehhanismid (tabelis 1 loetletud ainete hulgast valitud ained, millest vähemalt üks vajab toimimiseks metabolismi aktiveerimist ja vähemalt üks seda ei vaja), ning eri negatiivsete kontrollidega (eri lahustite/kandeainetega). Selliste positiivsete ja negatiivsete kontrollidega saadud tulemused peaksid olema kooskõlas kirjanduse andmetega. Seda nõuet ei kohaldata kogemusega laborite puhul, kus on olemas varasemate tulemuste andmebaas, nagu on määratletud punktides 30–33.

29.

Positiivseks kontrolliks valitud aineid (vt tabel 1 punktis 25) tuleks uurida nii aktiveeritud kui ka aktiveerimata metabolismi tingimustes, et tõendada mutageensete kemikaalide tuvastamise ja metabolismi aktiveerimise süsteemi tõhususe kindlakstegemise võimekust, samuti rakkude kasvutingimuste sobivust töötlemise, fenotüübi avaldumise ja mutantide selekteerimise ajal ning kasutatavate hindamismeetodite asjakohasust. Kõnealuste valitud ainete puhul tuleb katsesüsteemi tundlikkuse ja dünaamilise kasutusulatuse sobivuse tõendamiseks valida kontsentratsioonivahemikud nii, et oleks võimalik saada reprodutseeritavaid tausttaset ületavaid kontsentratsioonist sõltuvaid tulemusi.

Varasemad andmed kontrollide kohta

30.

Laboris tuleks kindlaks teha:

positiivse kontrolliga saadud varasemate tulemuste vahemik ja jaotus,

negatiivsete kontrollidega (töötlemata rakud, lahustiga kontroll) saadud varasemate tulemuste vahemik ja jaotus.

31.

Kui negatiivseid kontrolle iseloomustavate tulemuste jaotuse kindlakstegemiseks kogutakse andmeid esmakordselt, peaksid paralleelsete negatiivsete kontrollidega saadud andmed olema kooskõlas kontrolle käsitlevate avaldatud andmetega (22). Kontrollidega saadud tulemuste jaotuse lähteandmetele üha uute katseandmete lisandumisel peaksid paralleelsete negatiivsete kontrollide puhul täheldatavad tulemused jääma ideaaljuhul selle jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 % (17, 45, 46).

32.

Laboris negatiivsete kontrollidega saadud varasemate tulemuste andmebaas peaks algselt hõlmama vähemalt 10 katse andmeid, kuid soovitatavalt peaks see sisaldama vähemalt 20 võrreldavates tingimustes tehtud katse andmeid. Laboris tuleks kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, näiteks kontrollkaarte (nt vastavuse kontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (47)), et teha kindlaks, kui suures ulatuses positiivsete ja negatiivsete kontrollide andmed varieeruvad, ja tõendada, et laboris kasutatav metoodika on usaldusväärne (46). Varasemate katseandmete kogumist ja kasutamist käsitlevaid täiendavaid soovitusi (varasematele andmetele uute tulemuste lisamise või lisamata jätmise kriteeriumid ja konkreetse katse andmete vastuvõetavuse kriteeriumid) võib leida kirjandusest (45).

33.

Negatiivsete kontrollidega saadud andmed peaksid hõlmama muteerumissagedust ühes või soovitatavalt mitmes paralleelses kultuuris, nagu on kirjeldatud punktis 23. Paralleelsete negatiivsete kontrollidega saadud tulemused peaksid ideaaljuhul jääma laboris negatiivsete kontrollidega saadud varasemate tulemuste jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 % (17, 45, 46). Kui paralleelsete negatiivsete kontrollidega saadud tulemused jäävad väljapoole kõnealust usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %, võivad need olla kontrollidega saadud varasemate tulemuste jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmuslike võõrväärtustega ning on tõendatud, et katsesüsteem on usaldusväärne (vt eespool), ja puuduvad tõendid selle kohta, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksimusega.

34.

Katsemeetodi mis tahes muudatuse puhul tuleks kaaluda, kas see mõjutab katseandmete vastavust laboris kontrollidega varem saadud olemasolevatele andmetele. Iga olulise mittevastavuse korral tuleks luua uus kontrollidega saadud varasemate tulemuste andmebaas.

ANDMED JA ARUANDLUS

Tulemuste esitamine

35.

Esitatavad tulemused peaksid hõlmama kõiki vajalikke andmeid suhtelise elulemuse kaudu väljendatud tsütotoksilisuse arvutamiseks. Andmed nii töödeldud kultuuride kui ka kontrollkultuuride kohta peaksid hõlmama rakkude arvu töötluse lõppedes, vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude arvu ja kolooniate arvu (või mikrotiiterplaadi kasutamisel nende kannude arvu, milles kolooniad puudusid). Suhteline elulemus igas kultuuris tuleks esitada protsentuaalse osakaaluna väärtusest, mis on saadud paralleelse lahustit sisaldava kontrolli puhul (mõisted on määratletud 1. liites).

36.

Esitatavad tulemused peaksid samuti hõlmama kõiki vajalikke andmeid muteerumissageduse arvutamiseks. Andmed nii töödeldud kultuuride kui ka kontrollkultuuride kohta peaksid hõlmama 1) koos selektiivainega ja ilma selektiivaineta välja külvatud rakkude arvu (mutantide selekteerimiseks rakkude väljakülvamise hetkel) ning 2) selektiivaine juuresolekul ja ilma selleta kasvanud kultuurides loetletud kolooniate arvu (või mikrotiiterplaadi kasutamisel nende kannude arvu, milles kolooniad puudusid). Muteerumissagedus arvutatakse selektiivaine juuresolekul tekkinud mutantsete kolooniate arvu põhjal, mida on korrigeeritud lähtuvalt selektiivaineta kultuurides täheldatud kloonimistõhususest. Muteerumissagedus tuleks esitada muteerunud rakkude arvuna miljoni eluvõimelise raku kohta (mõisted on määratletud 1. liites).

37.

Andmed tuleks esitada iga kultuuri kohta eraldi. Peale selle tuleks kõik andmed esitada kokkuvõtlikult tabeli kujul.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

38.

Katse nõuetekohaseks tunnistamine põhineb järgmistel kriteeriumidel:

paralleelse negatiivse kontrolliga saadud tulemused loetakse laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste andmebaasi lisamiseks vastuvõetavaks, nagu on kirjeldatud punktis 33;

paralleelsete positiivsete kontrollidega (vt punkt 24) saadud tulemused peaksid olema võrreldavad positiivsete kontrollidega varem saadud tulemustega ning saadud väärtused peaksid paralleelset negatiivset kontrolli iseloomustavate väärtustega võrrelduna olema statistiliselt oluliselt suuremad;

katse on tehtud kahes eri tingimuses (st metabolismi aktiveerimisega ja ilma selleta), välja arvatud juhul, kui neist ühe puhul on saadud positiivsed tulemused (vt punkt 25);

rakkude ja kontsentratsioonide arv on analüüsimiseks piisav (punktid 25, 26 ja 19);

suurima kontsentratsiooni valimise kriteeriumid on kooskõlas punktides 20, 21 ja 22 kirjeldatud kriteeriumidega.

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

39.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritava kemikaaliga saadud tulemust selgelt positiivsena, kui mis tahes kasutatud katsetingimustes on täidetud järgmised kriteeriumid:

vähemalt ühel katsekontsentratsioonil täheldatakse saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes;

sobiva trenditestiga hindamisest nähtub, et see suurenemine on kontsentratsioonist sõltuv;

mis tahes saadud tulemus jääb väljapoole laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste jaotust (nt väljapoole Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %; vt punkt 33).

Kui kõik need kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali võimelisena põhjustama selles katsesüsteemis geenimutatsioone kultiveeritud imetajarakkudes. Soovitused kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta on esitatud kirjanduses (46, 48).

40.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt negatiivseks, kui kõikides kasutatud katsetingimustes on täidetud järgmised kriteeriumid:

ühelgi katsekontsentratsioonil ei täheldata saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes;

sobiva trenditestiga hindamisest nähtub, et kontsentratsioonist sõltuvat väärtuse suurenemist ei esine;

kõik tulemused jäävad laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste jaotusvahemikku (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %; vt punkt 33).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimetuna põhjustama selles katsesüsteemis geenimutatsioone kultiveeritud imetajarakkudes.

42.

Selgelt positiivset või negatiivset tulemust ei ole vaja üle kontrollida.

43.

Juhul, kui tulemus ei ole eespool kirjeldatu kohaselt selgelt negatiivne ega selgelt positiivne või kui eesmärk on aidata kindlaks teha tulemuse bioloogiline olulisus, tuleks andmete hindamiseks kasutada eksperdihinnangut ja/või täiendavaid uuringuid. Sellises olukorras võib olla kasulik teha korduskatse ja muuta vajaduse korral katsetingimusi (nt kontsentratsiooniintervalli või metabolismi aktiveerimise tingimusi – S9 kontsentratsiooni või S9 päritolu).

44.

Harvadel juhtudel ei võimalda andmed isegi pärast täiendavaid uuringuid teha järeldust selle kohta, kas tulemus on positiivne või negatiivne. Seepärast tuleks sel juhul lugeda uuritava kemikaaliga saadud tulemus ebaselgeks (seda tõlgendatakse positiivse ja negatiivse tulemuse võrdvõimalikkusena).

Katseprotokoll

45.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

 

Uuritav kemikaal:

allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas;

uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis, kui see on teada;

vastavalt vajadusele mõõtmistulemused söötme pH ja osmolaalsuse ning sademe tekke kohta pärast uuritava kemikaali lisamist;

 

ühest koostisosast koosnev aine:

füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

 

mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:

võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

 

Lahusti:

lahusti valimise põhjendus;

lahusti protsentuaalne sisaldus lõppsöötmes.

 

Rakud:

 

labori tüvikultuuride puhul:

rakuliinide tüüp ja päritolu;

võimaluse korral ümberkülvide arv ja laboris rakuliinidega tehtud varasemate toimingute andmed;

karüotüübi andmed ja/või kromosoomide modaalarv;

rakukultuuride säilitamise meetodid;

teave mükoplasma puudumise kohta;

rakkude arvu kahekordistumise aeg.

 

Katsetingimused:

kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valiku põhjendus, sealhulgas näiteks andmed tsütotoksilisuse ja lahustuvuspiirangute kohta;

söötme koostis, CO2 kontsentratsioon, niiskusesisaldus;

uuritava kemikaali kontsentratsioon, väljendatuna lõppkontsentratsioonina söötmes (nt μg/ml või mg/ml või mM);

söötmele lisatud lahusti ja uuritava kemikaali kontsentratsioon (ja/või ruumala);

inkubeerimistemperatuur;

inkubeerimisaeg;

töötluse kestus;

rakkude tihedus töötluse ajal;

metabolismi aktiveerimise süsteemi liik ja koostis (fraktsiooni S9 allikas, S9 segu valmistamise meetod, S9 segu ja S9 kontsentratsioon või ruumala lõppsöötmes, S9 kvaliteedikontrolli andmed);

positiivse või negatiivse kontrollina kasutatud ained ja nende lõppkontsentratsioonid iga töötlemistingimuse puhul;

ekspressiooniperioodi pikkus (samuti väljakülvatud rakkude arv ning vajaduse korral teave ümberkülvide ja söötmevahetusrežiimi kohta);

selektiivaine identimisandmed ja kontsentratsioon;

katsete nõuetekohasuse kriteeriumid;

eluvõimeliste ja muteerunud rakkude loendamiseks kasutatud meetodid;

tsütotoksilisuse mõõtmiseks kasutatud meetodid;

muu täiendav asjakohane teave tsütotoksilisuse ja kasutatud meetodi kohta;

väljakülvamisele järgneva inkubeerimise kestus;

kriteeriumid, mille alusel uuringutulemused loetakse positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks;

pH, osmolaalsuse ja sademe määramiseks kasutatud meetodid.

 

Tulemused:

töödeldud rakkude arv ja ümberkülvatud rakkude arv igas kultuuris;

tsütotoksilisuse andmed ja vajaduse korral muud tähelepanekud;

sadenemise ilmingud ja nende täheldamise aeg;

selektiivainega ja selektiivaineta söötmesse külvatud rakkude arv;

kolooniate arv selektiivaineta söötmes ja resistentsete kolooniate arv selektiivainega söötmes ning vastav muteerumissagedus;

võimaluse korral andmed kontsentratsioonist sõltuvuse kohta;

andmed paralleelsete negatiivsete (lahustiga) kontrollide ja positiivsete kontrollide kohta (kontsentratsioonid ja lahustid);

negatiivsete (lahustiga) kontrollide ja positiivsete kontrollidega varem saadud andmed, sealhulgas väärtusevahemikud, keskväärtused, standardhälbed ja usaldusvahemikud (nt usaldusnivool 95 %), samuti andmepunktide arv;

statistilise analüüsi tulemused (iga kultuuri kohta eraldi ja vajaduse korral paralleelkultuuride koondandmed) ja vajaduse korral p-väärtused.

 

Tulemuste arutelu

 

Järeldused

KIRJANDUS

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 234. OECD, Pariis.

(2)

Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J., ja Tindall, K. R. (toim.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(3)

Chu, E. H. Y., ja Malling, H. V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 61: 1306–1312.

(4)

Moore, M. M., Harrington-Brock, K., Doerr, C. L., ja Dearfield, K. L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis 4: 394–403.

(5)

Aaron, C. S., ja Stankowski, L. F. Jr. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutat. Res. 223: 121–128.

(6)

Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, L., Theiss, J., ja Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutat. Res. 312: 235–239.

(7)

Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H., ja Wasson, J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. Mutat. Res. 196, 17–36.

(8)

Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J., ja Myhr, B. C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutat. Res. 257: 147–204.

(9)

Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I., ja Okumura, K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutat. Res. 268: 297–305.

(10)

Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environ. Mutagen. 8: 789–886.

(11)

Nesslany, F., Simar-Meintieres, S., Watzinger, M., Talahari, I., ja Marzin, D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutagen. 49: 439–452.

(12)

Long, L. H., Kirkland, D., Whitwell, J., ja Halliwell, B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium. Mutat. Res. 634: 177–183.

(13)

Kirkland, D., Aardema, M., Henderson, L., ja Müller, L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutat. Res. 584: 1–256.

(14)

Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr., ja Yang, L. L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutat. Res. 189: 135–141.

(15)

Liber, H. L., Yandell, D. W., ja Little, J. B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutat. Res. 216: 9–17.

(16)

Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R., ja Hsie, A. W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutat. Res. 160: 133–147.

(17)

Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B., ja Asquith, J. C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. Väljaandes: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D. J. (toim.), Cambridge University Press. Lk 66–101.

(18)

Hsie, A. W., Casciano, D. A., Couch, D. B., Krahn, D. F., O’Neill, J. P., ja Whitfield, B. L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program. Mutat. Res. 86: 193–214.

(19)

Li, A. P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures. Mutat. Res. 85: 165–175.

(20)

Tindall, K. R., Stankowski, L. F. Jr., Machanoff, R., ja Hsie, A. W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells. Mol. Cell. Biol. 4: 1411–1415.

(21)

Hsie, A. W., Recio, L., Katz, D. S., Lee, C. Q., Wagner, M., ja Schenley, R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83(24): 9616–9620.

(22)

Lorge, E., Moore, M., Clements, J., Donovan, M. O., Honma, M., Kohara, A., Van Benthem, J., Galloway, S., Armstrong, M. J., Thybaud, V., Gollapudi, B., Aardema, M., Kim, J., Sutter, A., ja Kirkland, D. J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Pooleliolev käsikiri.)

(23)

Coecke, S., Balls, M., Bowe, G., Davis, J., Gstraunthaler, G., Hartung, T., Hay, R., Merten, O. W., Price, A., Schechtman, L., Stacey, G., ja Stokes, W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice. Altern. Lab. Anim. 33: 261–287.

(24)

Rosen, M. P., San, R.,H.,C., ja Stich, H. F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures. Cancer Lett. 8: 299–305.

(25)

Natarajan, A. T., Tates, A. D, Van Buul, P. P. W., Meijers, M., ja de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro – I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutat. Res. 37: 83–90.

(26)

Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N., ja Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutat. Res. 46: 365–373.

(27)

Ames, B. N., McCann, J., ja Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutat. Res. 31: 347–364.

(28)

Maron, D. M., ja Ames, B. N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutat. Res. 113: 173–215.

(29)

Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., ja Wolf, R. C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis 7: 175–177.

(30)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., ja Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. Väljaandes: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R., ja Philpot, R. M. (toim.), Elsevier, North-Holland. Lk 85–88.

(31)

Ong, T.-M., Mukhtar, M., Wolf, C. R., ja Zeiger, E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver. J. Environ. Pathol. Toxicol. 4: 55–65.

(32)

Johnson, T. E., Umbenhauer, D. R., ja Galloway, S. M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9. Environ. Mol. Mutagen. 28: 51–59.

(33)

UNEP (2001). Püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsioon. Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni Keskkonnaprogramm (UNEP). Kättesaadav aadressil [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan, E.-L., ja Hsie, A. W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutat. Res. 84: 147–156.

(35)

O’Neill, J. P., Machanoff, R., San Sebastian, J. R., ja Hsie, A. W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mutagen. 4: 7–18.

(36)

Li, A. P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation. 6: 539–544.

(37)

Krahn, D. F., Barsky, F. C., ja McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. Väljaandes: Genotoxic Effects of Airborne Agents. Tice, R. R., Costa, D. L., ja Schaich, K. M. (toim.), New York, Plenum. Lk 91–103.

(38)

Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P., ja Brooks, A. L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen. 5: 795–801.

(39)

OECD (2014). Dokument, millega toetatakse OECD katsejuhendite programmi riiklike koordinaatorite töörühma otsust rakendada imetajarakkudega tehtavate in vitro genotoksilisuse katsete puhul (katsejuhendid nr 473, 476 ja 487) suurima kontsentratsiooni valimise muudetud kriteeriume. Taotluse korral kättesaadav Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioonist.

(40)

Brookmire, L., Chen, J. J., ja Levy, D. D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay. Environ. Mol. Mutagen. 54: 36–43.

(41)

USA Keskkonnakaitseameti kemikaaliohutuse ja reostuse ennetamise büroo (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances.

(42)

USA Toidu- ja Ravimiamet (2012). International Conference on Harmonisation; Guidance on S2 (R1) Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Kättesaadav aadressil [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill, J. P., ja Hsie, A. W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system). Mutat. Res. 59: 109–118.

(44)

Chiewchanwit, T., Ma, H., El Zein, R., Hallberg, L., ja Au, W. W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutat. Res. 1335(2): 121–128.

(45)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J., ja Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutat. Res. 723: 87–90.

(46)

OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the OECD Test Guidelines on Genotoxicity. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 199. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(47)

Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O., ja Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. Väljaandes: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D. J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge. Lk 141–154.

(48)

Fleiss, J. L., Levin, B., ja Paik, M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions. Kolmas väljaanne. John Wiley & Sons, New York.

1. liide

MÕISTED

Aluspaarivahetust põhjustav mutageen: kemikaal, mis kutsub esile aluspaari vahetuse DNAs.

Fenotüübi avaldumise aeg: töötlusele järgnev aeg, mille vältel geneetiline muutus kinnistub genoomis ja mis tahes varem esinenud geeniproduktide sisaldus väheneb nii palju, et asjaomane fenotüübiline tunnus muutub.

Genotoksilisus: üldmõiste, mis hõlmab DNA ja kromosoomide mis tahes liiki kahjustusi, sealhulgas DNA-ahela katkemisi, adukte, ümberkorraldusi, mutatsioone, kromosoomiaberratsioone ja aneuploidsust. Genotoksiline mõju ei väljendu alati mutatsiooni või püsiva kromosoomikahjustusena.

HAT-sööde: sööde, mis sisaldab hüpoksantiini, aminopteriini ja tümidiini ning mida kasutatakse Hprt-mutantide selekteerimiseks.

Kemikaal: aine või segu.

Kloonimistõhusus: väikesel tihedusel välja külvatud rakkude hulgas esinevate selliste rakkude protsentuaalne osakaal, mis on võimelised moodustama loendatava koloonia.

Kontsentratsioon: tähistab uuritava kemikaali lõppkontsentratsiooni söötmes.

Lahustiga kontroll: üldmõiste, millega tähistatakse kontrollkultuuri, kuhu on lisatud üksnes uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatud lahustit.

Maksafraktsioon S9: maksahomogenaadi supernatant, mis on saadud pärast tsentrifuugimist 9 000g juures, st maksa toorekstrakt.

Mitootiline rekombinatsioon: mitoosi ajal homoloogsete kromatiidide vahel toimuv rekombinatsioon, millega võib kaasneda DNA kahe ahela katkemine või heterosügootsuse kadu.

MPA-sööde: sööde, mis sisaldab ksantiini, adeniini, tümidiini, aminopteriini ja mükofenoolhapet ning mida kasutatakse xprt-mutantide selekteerimiseks.

Mutageensus: omadus, mis põhjustab pärilikke muutusi geenide DNA aluspaaride järjestuses või kromosoomide struktuuris (kromosoomiaberratsioonid).

Muteerumissagedus: täheldatud mutantsete kolooniate arvu ja selektiivsöötmesse külvatud rakkude arvu suhe pärast selekteerimisaegse kloonimistõhususe (või elulemuse) suhtes korrigeerimist.

Päripidine mutatsioon: mutatsioon, mille puhul algne geen võtab mutantse vormi ja mille tulemusena muutub või kaob asjaomase kodeeritud valgu ensümaatiline aktiivsus või muu funktsioon.

Raaminihet põhjustav mutageen: kemikaal, mille mõjul lisatakse DNA molekuli või eemaldatakse sealt üks või mitu aluspaari.

S9 segu: maksafraktsiooni S9 ja metaboolsete ensüümide aktiivsuse tagamiseks vajalike kofaktorite segu.

Suhteline elulemus: näitaja, mille kaudu väljendatakse töötlusest tulenevat tsütotoksilisust. Suhteline elulemus on vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude kloonimise tõhusus, kohandatuna rakkude arvu võimaliku vähenemise suhtes töötlemise käigus ja võrrelduna kloonimistõhususega negatiivsete kontrollide puhul, mille elulemuseks loetakse 100 %.

Tsütotoksilisus: käesoleva katsemeetodi kohaste katsete puhul on tsütotoksilisus määratletud kui töödeldud rakkude suhtelise elulemuse vähenemine negatiivse kontrolliga võrreldes (vt asjaomane konkreetne punkt).

Töötlemata kontroll: kultuur, mida ei ole töödeldud (st ei uuritava kemikaali ega lahustiga), kuid mida käideldakse samal viisil kui uuritava kemikaaliga töödeldud kultuure ning nendega samaaegselt.

Uuritav kemikaal: iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB: tundmatu või muutuva koostisega kemikaal, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

2. liide

VALEMID TSÜTOTOKSILISUSE JA MUTEERUMISSAGEDUSE HINDAMISEKS

Tsütotoksilisuse hindamiseks kasutatakse suhtelist elulemust, mis on määratletud kui vahetult pärast töötlemist välja külvatud rakkude kloonimise tõhusus, kohandatuna rakkude arvu võimaliku vähenemise suhtes töötlemise käigus ja võrrelduna kohandatud kloonimistõhususega negatiivsete kontrollide puhul, mille elulemuseks loetakse 100 % (suhtelise elulemuse valem on esitatud allpool).

Uuritava kemikaaliga töödeldud kultuuri kohandatud kloonimistõhusus arvutatakse järgmiselt:

Formula

Uuritava kemikaaliga töödeldud kultuuri suhteline elulemus arvutatakse järgmiselt:

Formula

Muteerumissagedus on mutantsete kolooniate kloonimistõhusus selektiivsöötmes, jagatuna sama kultuuri puhul mõõdetud selekteerimisaegse kloonimistõhususega selektiivaineta söötmes.

Formula

Kui kloonimistõhususe hindamiseks kasutatakse tasse, siis:

kloonimistõhusus = kolooniate arv / välja külvatud rakkude arv.

Kui kloonimistõhususe hindamiseks kasutatakse mikrotiiterplaate, siis iseloomustab kolooniate arvu mikrotiiterplaadi kannu kohta Poissoni jaotus.

Kloonimistõhusus = – lnP(0) / välja külvatud rakkude arv kannu kohta,

kus – lnP(0) on tühjade kannude tõenäoline arv külvamiseks kasutatud kannude hulgas ning on kirjeldatav valemiga

lnP(0) = – ln (tühjade kannude arv / külvamiseks kasutatud kannude arv).

3)

B osas asendatakse peatükk B.22 järgmisega:

„B.22.   DOMINANTSE LETAALSE MÕJU KATSE NÄRILISTEGA

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 478 (2016). Katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaoluga seotud kaalutlusi. Käesolevas katsemeetodi muudetud versioonis kajastub selle meetodi kasutamisel saadud enam kui kolmekümne aasta pikkune kogemus, samuti annab see võimaluse lõimida või kombineerida seda meetodit muude mürgisuse hindamise meetoditega, mida kasutatakse näiteks arengu-, reproduktiiv- ja genotoksilisuse uurimiseks. Siiski on see katsemeetod sellega seotud piirangute ja suure arvu loomade kasutamise vajaduse tõttu ette nähtud kasutamiseks mitte peamise, vaid pigem täiendava katsemeetodina, mida võib kasutada üksnes juhul, kui regulatiivsetest nõuetest tulenevalt ei ole sellele alternatiivi. Mürgisuse hindamise meetodite kasutamine kombineerituna võimaldab säästa suure arvu mürgisuskatsetes kasutatavaid loomi. OECD on välja töötanud dokumendi, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia valdkonna katsete kohta ning ülevaade genotoksilisust käsitlevates OECD katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).

2.

Dominantse letaalse mõju katse eesmärk on uurida, kas kemikaal põhjustab mutatsioone, mille tagajärjeks on kromosoomiaberratsioonid idurakkudes. Peale selle on kõnealune katse oluline genotoksilisuse hindamiseks, sest ehkki in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA reparatsiooni protsessidega seotud tegurid võivad liigiti varieeruda, on need aktiivsed ja aitavad kaasa vastusreaktsiooni kujunemisele. Dominantse letaalse mutatsiooni mõju ilmnemine pärast uuritava kemikaaliga kokkupuudet osutab asjaolule, et kemikaal on mõjutanud katselooma reproduktiivkudet.

3.

Dominantne letaalne mutatsioon põhjustab embrüo või loote surma. Dominantse letaalse mutatsiooni mõju ilmnemine pärast uuritava kemikaaliga kokkupuudet osutab asjaolule, et kemikaal on mõjutanud katselooma idurakke.

4.

Dominantse letaalse mõju katse on kasulik in vivo somaatilistel lõppnäitajatel põhinevate katsete positiivsete tulemuste kinnitamiseks ning selle lõppnäitaja võimaldab asjakohaselt hinnata ohtu inimesele ja sugurakkude kaudu geneetiliste haiguste edasikandumise riski. Ent kuna see katse nõuab suure arvu loomade kasutamist ja on töömahukas, on selle läbiviimine väga kulukas ja aeganõudev. Kuna spontaansete dominantsete letaalsete mutatsioonide tekkesagedus on küllalt suur, on meetodi tundlikkus muteerumissageduse väikese tõusu tuvastamisel üldjuhul piiratud.

5.

Põhimõistete määratlused on esitatud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

6.

Katse viiakse kõige sagedamini läbi hiirtega (2, 3, 4), kuid mõnel juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud, võib olla asjakohane kasutada mõnda muud liiki, näiteks rotte (5, 6, 7, 8). Dominantset letaalset mõju põhjustavad üldjuhul suured kromosoomiaberratsioonid (struktuursed ja arvulised muutused) (9, 10, 11), ent ei saa välistada ka geenimutatsioone. Dominantne letaalne mutatsioon on mutatsioon, mis esineb juba idurakus või kinnistub pärast viljastumist varajases embrüostaadiumis ja mis ei põhjusta gameedi talitlushäireid, kuid on viljastatud munarakule või arenevale embrüole letaalne.

7.

Iga isaslooma paaritatakse sobivate ajavahemike järel järgemööda varem paaritumata emasloomadega. Töötlemisjärgsete paaritamiste arv sõltub dominantse letaalse mõju katse lõppeesmärgist (punkt 23) ja peaks võimaldama tagada, et dominantset letaalset mõju hinnatakse isaslooma idurakkude küpsemise kõikide etappide lõikes (12).

8.

Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav kemikaal või selle metaboliit/metaboliidid ei jõua munandisse, ei ole käesoleva katsemeetodi kasutamine asjakohane.

KATSE PÕHIMÕTE

9.

Üldpõhimõtte kohaselt viiakse isasloomad pärast sobiva kokkupuuteviisi valimist uuritava kemikaaliga kokkupuutesse ning neid paaritatakse varem paaritumata töötlemata emasloomadega. Teatava intervalliga järjestikuste paaritamiste teel on võimalik vaadelda eri tüüpi idurakke. Paaritamisele järgneva sobiva ajavahemiku möödudes surmatakse emasloomad humaanselt ning uuritakse nende emakat, et teha kindlaks pesastunud embrüote ning elus ja surnud embrüote arv. Uuritava kemikaali dominantse letaalse mõju tuvastamiseks võrreldakse pesastunud elus embrüote arvu emaslooma kohta kemikaaliga töödeldud rühmas ja kandeainega/lahustiga töödeldud kontrollide rühmas. Pesastunud surnud embrüote arvu suurenemine emaslooma kohta kemikaaliga töödeldud rühmas kontrollrühmaga võrrelduna osutab uuritavast kemikaalist põhjustatud pesastumisjärgsele embrüote kaole. Pesastumisjärgse embrüote kao arvutamiseks võrreldakse pesastunud surnud embrüote arvu ja pesastunud embrüote üldarvu suhet kemikaaliga töödeldud rühmas ja kontrollrühmas. Pesastumiseelse embrüote kao hindamiseks võib lahutada kollakehade arvust pesastunud embrüote üldarvu või võrrelda pesastunud embrüote üldarvu emaslooma kohta kemikaaliga töödeldud rühmas ja kontrollrühmas.

LABORI PÄDEVUSE TÕENDAMINE

10.

Käesoleva meetodi kasutamise pädevuse kinnitamiseks tuleks tõendada võimekust reprodutseerida dominantsete letaalsete mutatsioonide esinemissageduse kohta avaldatud tulemusi (nt allikad 13, 14, 15, 16, 17, 18) nii positiivse kontrollina kasutatavate ainete, näiteks tabelis 1 loetletud ainete (sealhulgas nõrga toime) puhul kui ka kandeainega töödeldud kontrollide puhul, samuti peaks negatiivsete kontrollide puhul täheldatud sagedus jääma vastuvõetavasse andmevahemikku (vt viited eespool) või laboris kontrollidega varem saadud tulemuste jaotusvahemikku, kui sellised tulemused on olemas.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistused

Loomaliigi valimine

11.

Tuleks kasutada tavapäraste laboriliinide terveid suguküpseid loomi. Tavaliselt kasutatakse hiiri, ent võivad sobida ka rotid. Võib kasutada ka mis tahes muud sobivat imetajaliiki, kui katseprotokollis esitatakse sellekohane teaduslik põhjendus.

Loomade pidamis- ja söötmistingimused

12.

Näriliste puhul peaks loomapidamisruumi temperatuur olema 22 °C (± 3 °C). Suhteline niiskus peaks olema vähemalt 40 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, ideaaljuhul aga 50–60 %. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada sööda sobivus uuritava kemikaali lisamiseks, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. Näriliste pidamisel tuleks enne töötlemist ja paaritamist kasutada väikesi samasooliste loomade rühmi (maksimaalselt viis looma rühmas), kui ei ole põhjust eeldada või ei täheldata agressiivset käitumist; soovitatavalt tuleks kasutada sobiva mitmekesistatud keskkonnaga täispõhjaga puure. Loomi võib pidada eraldi, kui see on teaduslikult põhjendatud.

Loomade ettevalmistamine

13.

Terved suguküpsed täiskasvanud isas- ja emasloomad jagatakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühmadesse. Iga looma üheseks identimiseks kasutatakse humaanset minimaalselt invasiivset meetodit (nt rõngastamine, märgistamine, mikrokiibistamine või biomeetriline tuvastamine, kuid mitte kõrva sälkamine ega varba köndistamine) ning loomadel lastakse vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud võimalik mõju oleks võimalikult väike. Tuleks ära hoida positiivse kontrollina kasutatava aine ja uuritava kemikaali vahelist ristsaastumist. Katse alguses peaksid loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte üle ± 20 % kummastki soost loomade keskmisest kehamassist.

Annuste ettevalmistamine

14.

Tahke uuritav kemikaal tuleks enne loomadele annustamist lahustada või suspendeerida sobivas lahustis või kandeaines või segada sööda või joogiveega. Vedelat uuritavat kemikaali võib annustada vahetult või seda enne annustamist lahjendada. Kui kokkupuude toimub sissehingamise teel, võib uuritavat kemikaali sõltuvalt selle füüsikalis-keemilistest omadustest manustada gaasina, auruna või tahke/vedela dispersse faasiga aerosoolina. Tuleks kasutada uuritava kemikaali värsket valmistist, välja arvatud juhul, kui kemikaali püsivusandmetest nähtub säilitamise vastuvõetavus ja on määratletud asjakohased säilitamistingimused.

Katsetingimused

Lahusti/kandeaine

15.

Lahusti/kandeaine ei tohiks avaldada kasutatavate annuste puhul mürgist mõju ning ei tohiks olla kahtlust, et see võib uuritava kemikaaliga keemiliselt reageerida. Kui on valitud vähem tuntud lahusti/kandeaine, tuleks selle sobivuse tõendamiseks esitada selle kasutamist toetavad võrdlusandmed. Kui vähegi võimalik, on soovitatav esmalt kaaluda veepõhise lahusti/kandeaine kasutamist. Tavaliselt kasutatavad lahustid/kandeained on näiteks vesi, füsioloogiline lahus, metüültselluloosi lahus, karboksümetüültselluloosi naatriumisoola lahus, oliiviõli ja maisiõli.

Positiivsed kontrollid

16.

Katses tuleks alati paralleelselt kasutada positiivse kontrollina kasutatava ainega töödeldud loomi, välja arvatud juhul, kui labori pädevus katse läbiviimiseks on tõendatud ja katsemeetodit on lähiminevikus (nt viimase viie aasta jooksul) korrapäraselt kasutatud. Siiski ei ole vaja manustada positiivse kontrollina kasutatavat ainet loomadele samal viisil kui uuritavat kemikaali, samuti ei ole vaja võtta proove iga paaritumisintervalli järel. Positiivse kontrollina kasutatavad ained peaksid katses kasutatavates tingimustes teadaolevalt avaldama dominantset letaalset mõju. Kontrollrühma loomi tuleks kohelda katserühma loomadega identsel viisil, välja arvatud ainega töötlemisel.

17.

Positiivse kontrollina kasutatava aine annused tuleks valida nii, et positiivne dominantne letaalne mõju oleks nõrk või mõõdukas ja võimaldaks kriitiliselt hinnata meetodi töökindlust ja tundlikkust, kuid oleks samal ajal järjepidevalt tuvastatav. Positiivse kontrollina kasutatavate ainete näited ja sobivad annused on esitatud tabelis 1.

Tabel 1

Positiivse kontrollina kasutatavate ainete näited

Aine [CASi nr]

(viitenumber)

Toimivate annuste vahemik (mg/kg)

(näriliseliigid)

Manustamisaeg (päevades)

Trietüleenmelamiin [51-18-3] (15)

0,25 (hiired)

1

Tsüklofosfamiid [50-18-0] (19)

50–150 (hiired)

5

Tsüklofosfamiid [50-18-0] (5)

25–100 (rotid)

1

Etüülmetaansulfonaat [62-50-0] (13)

100–300 (hiired)

5

Monomeerne akrüülamiid [79-06-1] (17)

50 (hiired)

5

Kloorambutsiil [305-03-3] (14)

25 (hiired)

1

Negatiivsed kontrollid

18.

Igal proovivõtukorral tuleks kasutada negatiivse kontrollina loomi, kellele on manustatud ainult lahustit või kandeainet ja keda on muidu koheldud samal viisil kui katserühma loomi (20). Valitud lahusti/kandeaine dominantse letaalse ja muu kahjuliku mõju puudumist kinnitavate varasemate laboriandmete või avaldatud kontrollandmete puudumisel tuleks igal proovivõtukorral kasutada kontrollina ka loomi, kellele ei ole midagi manustatud, et tõendada kandeainega töödeldud kontrollrühma andmete vastuvõetavust.

KATSE KÄIK

Loomade arv

19.

Iga isaslooma paaritatakse eelnevalt kindlaks määratud sobivate ajavahemike järel (nt kord nädalas; punktid 21 ja 23) järjestikku soovitatavalt ühe varem paaritumata emasloomaga. Eelnevalt peaks olema kindlaks tehtud, et isasloomade arv rühmas on piisav (hinnatuna koos igal paaritumisperioodil paaritunud emasloomade arvuga), et tagada vähemalt selline statistiline võimsus, mis on vajalik dominantse letaalse mõju esinemissageduse kahekordistumise tuvastamiseks (punkt 44).

20.

Samuti tuleks statistilise võimsuse arvutustega eelnevalt kindlaks teha emasloomade vajalik arv igal paaritumisperioodil, et võimaldada miinimumeesmärgina dominantse letaalse mõju esinemissageduse kahekordistumise tuvastamist (st piisav tiinete emasloomade arv, et pesastunud embrüote üldarv oleks vähemalt 400) (20, 21, 22, 23) ning eeldatavalt vähemalt ühe pesastunud surnud embrüo esinemist analüüsiühiku kohta (st igas paaritamisrühmas iga annuse puhul) (24).

Manustamisperiood ja paaritamisintervallid

21.

Töötlemisjärgsete paaritamisintervallide arv sõltub manustamisrežiimist ja seejuures tuleks tagada, et dominantse letaalse mõju ilmnemist hinnatakse kõikides isaslooma idurakkude küpsemise etappides (12, 25). Ühekordsel töötlemisel, mis hõlmab kuni viie päevaannuse manustamist, tuleks pärast viimast manustamist viia ühenädalase vahega läbi 8 (hiirte puhul) või 10 (rottide puhul) paaritamist. Suurema arvu annuste manustamisel võib paaritamisintervallide arvu vähendada proportsionaalselt manustamisperioodi pikenemisega, ent jätkuvalt tuleks järgida eesmärki hinnata mõju kõikides spermatogeneesi etappides (näiteks piisab hiirte puhul spermatogeneesi igas etapis avalduva mõju hindamiseks 28 päeva pikkuse kokkupuuteperioodi järgselt neljast nädalase vahega toimuvast paaritamisest). Kõik manustamis- ja paaritamisrežiimid peavad olema teaduslikult põhjendatud.

22.

Emasloomad peaksid jääma isasloomade juurde vähemalt üheks innatsükliks (nt hiirtel ja rottidel jääb ühe nädala sisse üks innatsükkel). Emasloomi, kes ei ole nädalapikkuse perioodi jooksul paaritunud, võib kasutada mõnel järgneval paaritamisperioodil. Emasloomad võib isasloomadest eraldada ka juba pärast paaritumist, mille tõendamiseks tehakse kindlaks seemnerakkude esinemine tupes või tupekorgi esinemine.

23.

Kasutatav kokkupuute- ja paaritamisrežiim sõltub dominantse letaalse mõju katse lõppeesmärgist. Kui eesmärk on teha kindlaks, kas asjaomane kemikaal üldse põhjustab dominantseid letaalseid mutatsioone, on vastuvõetav sellise meetodi kasutamine, mille puhul kokkupuude hõlmab kogu spermatogeneesitsüklit (nt hiirte puhul 7 nädalat, 5–7 manustamiskorda nädalas) ja paaritamine toimub kokkupuute järgselt üks kord. Kui aga eesmärk on teha kindlaks, millist tüüpi idurakud on dominantse letaalse mõju suhtes tundlikud, siis on soovitatav kasutada nädalase intervalliga paaritamist pärast ühekordset või viie päeva pikkust kokkupuudet.

Annused

24.

Kui annuste valimist hõlbustavate sobivate andmete puudumise tõttu tehakse annusevahemiku kindlakstegemiseks eeluuring, tuleks see läbi viia samas laboris, samast liigist, liinist ja soost loomadega ning sama manustamisrežiimi alusel kui põhiuuring (26). Eeluuringu eesmärk peaks olema teha kindlaks suurim talutav annus, mis on määratletud kui suurim annus, mida suudetakse uuringuperioodi jooksul taluda nii, et ei täheldata uuringu läbiviimist piirava mürgisuse nähte (näiteks ebatavalised reaktsioonid või käitumine, väike kehamassi vähenemine või tsütotoksilisus vereloomesüsteemi suhtes, mis aga ei põhjusta veel surma ega selliseid kannatusi, valu või stressi, mis nõuaksid loomade humaanset surmamist) (27).

25.

Samuti ei tohi suurima talutava annuse puhul ilmneda kahjulikku mõju paaritumisedukusele (21).

26.

Selliste uuritavate kemikaalide puhul, millel avaldub juba väikese mittemürgise annuse juures konkreetne bioloogiline aktiivsus (näiteks hormoonid ja mitogeenid) või mille puhul esineb toksikokineetiliste omadustega seotud küllastumine, ei pruugi annuste valimise kriteeriumid olla kohaldatavad ning neid kemikaale tuleks igal konkreetsel juhul eraldi hinnata.

27.

Annusest sõltuvuse kohta teabe saamiseks tehtav täielik uuring peaks hõlmama negatiivse kontrolli rühma ja vähemalt kolme eri annust, mis erinevad üksteisest üldjuhul kaks korda, ent kõige rohkem neli korda. Kui uuritav kemikaal ei ole annusevahemiku kindlakstegemise uuringus või olemasolevate andmete põhjal mürgine, peaks suurim korraga manustatav annus olema 2 000 mg kehamassi kilogrammi kohta. Kui aga uuritav kemikaal põhjustab mürgisusnähte, tuleks suurima manustatava annusena kasutada suurimat talutavat annust ning kasutatav annusevahemik peaks soovitatavalt ulatuma suurimast annusest kuni annuseni, mille puhul täheldatav mürgisus on vähene või puudub. Mittemürgiste kemikaalide puhul on piirannus 14 päeva pikkuse või pikema manustamisperioodi puhul 1 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas ning 14 päevast lühema manustamisperioodi puhul 2 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas.

Annuste manustamine

28.

Katse kavandamisel tuleks silmas pidada inimese puhul eeldatavat kokkupuuteviisi. Seepärast võib vastavast põhjendusest lähtuvalt kasutada selliseid manustamisviise nagu manustamine söödaga, joogiveega, naha alla, veenisiseselt, paikselt, sissehingamise teel, suu kaudu (toitmissondiga) või implantaadiga. Igal juhul tuleks manustamisviis valida nii, et oleks tagatud sihtkoe/-kudede piisav kokkupuude uuritava kemikaaliga. Intraperitoneaalne süstimine ei ole tavaliselt soovitatav, kuna tegemist ei ole inimese puhul ette nähtud kokkupuuteviisiga, ning seda tuleks kasutada ainult juhul, kui on olemas sellekohane konkreetne teaduslik põhjendus. Kui uuritav kemikaal segatakse sööda või joogiveega, tuleks eriti üheainsa annuse manustamisel jälgida, et sööda ja vee tarbimise ning paaritumise vaheline ajavahemik oleks piisav, et võimaldada kemikaali mõju tuvastamist (punkt 31). Toitmissondi kaudu või süstimise teel korraga manustatav suurim vedelikukogus sõltub katselooma suurusest. Tavaliselt ei tohiks see kogus olla suurem kui 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, mida võib kasutada koguses 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema koguse kasutamist (kui see on loomade heaolu käsitlevate õigusaktide kohaselt lubatud) tuleks põhjendada. Katses kasutatava ruumala varieeruvuse minimeerimiseks tuleks muuta kemikaali kontsentratsiooni, et tagada kehamassi suhtes püsiva ruumala kasutamine kogu annusevahemiku lõikes.

Vaatlused

29.

Katseloomadel tuleks teha kliinilisi vaatlusi ja registreerida kliinilised sümptomid vähemalt üks kord päevas, igal päeval soovitatavalt samal ajal, ning võtta seejuures arvesse manustamisjärgse eeldatava mõju maksimaalse avaldumise ajavahemikku. Manustamisperioodil tuleks kõiki loomi haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks kontrollida vähemalt kaks korda päevas. Kõikide loomade kaal tuleks määrata uuringu alguses, korduvannustamise uuringu kestel vähemalt kord nädalas ning humaanse surmamise hetkel. Sööda tarbimist tuleks mõõta vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist mõõta iga veevahetuse ajal ja vähemalt kord nädalas. Loomad, kellel täheldatakse liigse mittesurmava mürgisuse nähte, tuleks enne katse lõppu humaanselt surmata (27).

Kudede kogumine ja töötlemine

30.

Emasloomad surmatakse humaanselt tiinuse teises pooles, hiirte puhul tiinuse 13. päeval ja rottide puhul tiinuse 14.–15. päeval. Dominantse letaalse mõju tuvastamiseks uuritakse loomade emakat, et teha kindaks pesastunud embrüote, elus ja surnud embrüote ning kollakehade arv.

31.

Paljastatakse emakasarved ja munasarjad, et loendada kollakehad, ning looted eemaldatakse, loendatakse ja kaalutakse. Emakat tuleks hoolikalt uurida elus loodete varju jäävate resorbeerumiskohtade suhtes ja tagada, et kõik resorbeerumisjuhud saavad loendatud. Registreeritakse loodete suremus. Samuti registreeritakse edukalt tiinestunud emasloomade arv, pesastunud embrüote üldarv, pesastumiseelne kadu ja pesastumisjärgne suremus (sealhulgas varased ja hilised resorbeerumisjuhud). Peale selle võib nähtavaid looteid säilitada Bouini fikseerimislahuses vähemalt kaks nädalat ning seejärel uurida, kas neil esineb suuri väliseid väärarenguid (28), et saada lisateavet uuritava aine mõju kohta paljunemisvõimele ja arengule.

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmete töötlemine

32.

Andmed tuleks esitada tabelina, kus on välja toodud paaritunud isasloomade arv, tiinete emasloomade arv ja tiinestumata emasloomade arv. Tuleks esitada eraldi iga paaritamise tulemused koos iga isaslooma ja emaslooma identimisandmetega. Iga emaslooma puhul tuleks esitada paaritamisintervall, isasloomadele manustatud annus ning elus ja surnud embrüote arv.

33.

Pesastumisjärgse embrüote kao arvutamiseks võrreldakse pesastunud surnud embrüote arvu ja pesastunud embrüote üldarvu suhet kemikaaliga töödeldud rühmas ja lahustiga/kandeainega töödeldud kontrollrühmas.

34.

Pesastumiseelse embrüote kao leidmiseks arvutatakse kollakehade arvu ja pesastunud embrüote arvu vahe või emaslooma kohta pesastunud embrüote keskmise arvu ja kontrollpaaritamisel saadud vastava näitaja erinevus. Pesastumiseelse embrüote kao hindamise korral tuleks tulemused registreerida.

35.

Dominantse letaalsuse tegur leitakse järgmiselt: (pesastumisjärgsed surmajuhtumid / pesastunud embrüote üldarv emaslooma kohta) × 100.

36.

Tuleks esitada andmed mürgisuse ja kliiniliste sümptomite kohta (vt punkt 29).

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

37.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid on järgmised:

paralleelse negatiivse kontrolliga saadud tulemused on kooskõlas varasemaid negatiivse kontrolli andmeid käsitlevate avaldatud normidega, samuti laboris kontrollidega varem saadud tulemustega, kui need on olemas (vt punktid 10 ja 18);

paralleelsed positiivsed kontrollid kutsuvad esile reaktsioone, mis on kooskõlas varasemaid positiivsete kontrollide andmeid käsitlevate avaldatud normidega, samuti laboris positiivsete kontrollidega varem saadud tulemustega, kui need on olemas, ning paralleelsete positiivsete kontrollidega saadud väärtused on statistiliselt oluliselt suuremad kui negatiivse kontrolliga saadud väärtused (vt punktid 17 ja 18);

analüüsitud pesastunud embrüote üldarv ja eri annuste arv on piisav (punkt 20);

suurima annuse valimise kriteeriumid on kooskõlas punktides 24 ja 27 kirjeldatud kriteeriumidega.

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

38.

Annusest sõltuvuse analüüsimiseks piisavate andmete saamiseks on vaja uurida vähemalt kolme rühma, kus on töötlemiseks kasutatud eri annuseid.

39.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt positiivseks, kui:

vähemalt ühe katses kasutatud annuse puhul täheldatakse saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes,

kõnealune suurenemine on sobiva testiga hindamisel vähemalt ühte tüüpi katsetingimustes (nt nädalase paaritamisintervalli puhul) annusest sõltuv ning

mis tahes saadud tulemus jääb väljapoole vastuvõetavat negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste olemasolul selliste tulemuste jaotust (nt väljapoole Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimelisena põhjustama katseloomade idurakkudes dominantseid letaalseid mutatsioone. Kõige asjakohasemaid statistilisi meetodeid käsitlevad soovitused on esitatud punktis 44; kirjandusest võib leida teavet ka muude soovitatavate statistiliste lähenemisviiside kohta (20, 21, 22, 24, 29). Kasutatavate statistiliste testide puhul tuleks katseüksusena käsitada üksikisendit.

40.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt negatiivseks, kui:

ühegi katses kasutatud annuse puhul ei täheldata saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes,

ühegi katsetingimuse puhul ei esine annusest sõltuvat väärtuse suurenemist ning

kõik saadud tulemused jäävad vastuvõetavasse negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste olemasolul selliste tulemuste jaotusvahemikku (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimetuna põhjustama katseloomade idurakkudes dominantseid letaalseid mutatsioone.

41.

Selgelt positiivset või negatiivset tulemust ei ole vaja üle kontrollida.

42.

Juhul, kui tulemus ei ole selgelt negatiivne ega selgelt positiivne ning eesmärk on aidata kindlaks teha tulemuse – näiteks vaadeldava väärtuse väikese või piiripealse suurenemise – bioloogiline olulisus, tuleks andmete hindamiseks kasutada eksperdihinnangut ja/või olemasolevatel katseandmetel põhinevat täiendavat analüüsi, näiteks kaaluda, kas positiivne tulemus jääb väljapoole vastuvõetavat negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste jaotust (30).

43.

Harvadel juhtudel ei võimalda andmed isegi pärast täiendavat analüüsi teha järeldust selle kohta, kas tulemus on positiivne või negatiivne; sel juhul loetakse tulemus ebaselgeks.

44.

Kasutatavate statistiliste testide puhul tuleks katseüksusena käsitada isaslooma. Ehkki loendamisandmed (nt pesastunud embrüote arv emaslooma kohta) võivad olla Poissoni jaotusega ja/või osakaalu andmed (nt pesastunud surnud embrüote osakaal) binoomjaotusega, iseloomustab selliseid andmeid sageli siiski ülehajuvus (31). Sellest lähtuvalt tuleks statistilise analüüsi puhul esmalt kontrollida üle- või alahajuvuse esinemist selliste hajuvustestidega nagu Cochrani binoomjaotuse hajuvuse test (32) või Tarone’i C(α)-test binoomjaotuse ülehajuvuse tuvastamiseks (31, 33). Kui ei tuvastata kõrvalekallet binoomjaotusest, võib annusevahemiku lõikes täheldatavate osakaalumuutuste analüüsimiseks kasutada Cochrani-Armitage’i trenditesti (34) ja paariviisiliseks kontrollrühma andmetega võrdlemiseks Fisheri-Yatesi testi (35). Samamoodi võib juhul, kui ei tuvastata kõrvalekallet Poissoni jaotusest, kasutada loendamistulemustega seotud suundumuste tuvastamiseks Poissoni regressioonimudelit (36) ja Poissoni mudeli kontekstis paariviisiliseks kontrollrühma andmetega võrdlemiseks paariviisilisi kontraste (36). Kui tuvastatakse oluline üle- või alahajuvus, soovitatakse kasutada mitteparameetrilisi meetodeid (23, 31). Nende hulka kuuluvad sellised astakupõhised testid nagu Jonckheere’i-Terpstra trenditest (37) ja Manni-Whitney test (38) paariviisiliseks võrdlemiseks kandeainega/lahustiga töödeldud kontrollrühma andmetega, samuti permutatsiooni-, taasvalimis- ja bootstrap-testid suundumuste analüüsimiseks ja paariviisiliseks võrdlemiseks kontrollrühma andmetega (31, 39).

45.

Dominantse letaalse mõju katse positiivsed tulemused on tõend uuritava kemikaali genotoksilisuse kohta katseliigi töödeldud isaslooma idurakkudes.

46.

Saadud tulemuste bioloogilise olulisuse hindamisel võib juhinduda sellest, kas täheldatud väärtused jäävad laboris kontrollidega varem saadud tulemuste jaotusvahemikku või sellest väljapoole (40).

Katseprotokoll

47.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

Kokkuvõte

 

Uuritav kemikaal:

allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas;

uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis, kui see on teada;

vastavalt vajadusele mõõtmistulemused söötme pH ja osmolaalsuse ning sademe tekke kohta pärast uuritava kemikaali lisamist;

 

ühest koostisosast koosnev aine:

füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

 

mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:

võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

 

Uuritava kemikaali ettevalmistamine:

kandeaine valimise põhjendus;

uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis/kandeaines, kui see on teada;

sööda või joogiveega või sissehingamise teel manustamiseks sobiva valmistise valmistamine;

valmistise analüüsi tulemused (nt püsivus, homogeensus, nominaalne kontsentratsioon), kui need on olemas.

 

Katseloomad:

kasutatud liik/liin ja selle valimise põhjendus;

loomade arv, vanus ja sugu;

päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne;

loomade ühese identimise meetod;

lühiajaliste uuringute puhul: iga isaslooma kehamass katse alguses ja lõpus; ühest nädalast pikemate uuringute puhul: iga looma kehamass uuringu vältel ja sööda tarbimise andmed. Iga rühma kohta tuleks esitada kehamasside vahemik, keskväärtus ja standardhälve.

 

Katsetingimused:

positiivse ja negatiivse (kandeainega/lahustiga) kontrolli andmed;

annusevahemiku kindlakstegemise uuringu andmed;

annuste valimise põhjendus;

uuritava kemikaali ettevalmistamise üksikasjad;

uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;

manustamisviisi valimise põhjendus;

loomadel avalduva mürgisuse mõõtmise meetodid, sealhulgas andmed histopatoloogilise või hematoloogilise analüüsi kohta, kui seda on tehtud, samuti loomade vaatlemise ja kehamassi määramise sagedus;

negatiivsete tulemuste korral meetodid selle kontrollimiseks, et uuritav kemikaal on jõudnud sihtkoesse või üldvereringesse;

vajaduse korral tegelik annus (milligrammides kehamassi kilogrammi kohta päevas), mis arvutatakse lähtuvalt sööda/joogivee tarbimisest ja selles sisalduva uuritava kemikaali kontsentratsioonist (miljondikes);

sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;

puurikeskkonna mitmekesistamise üksikasjad;

manustamis- ja proovivõturežiimide üksikasjalik kirjeldus ja nende valimise põhjendus;

valutustamismeetod;

humaanse surmamise meetod;

kudede eraldamise ja säilitamise meetodid;

kõikide katsekomplektide ja reaktiivide päritolu ja partii number (vajaduse korral);

loendamismeetodid dominantse letaalse mõju määramiseks;

paaritamise ajakava;

paaritumise kindlakstegemiseks kasutatud meetodid;

humaanse surmamise aeg;

dominantse letaalse mõju hindamise kriteeriumid, sealhulgas kollakehade, pesastunud embrüote, embrüote resorbeerumise, pesastumiseelse kao, pesastunud elus embrüote ja pesastunud surnud embrüote kindlakstegemiseks.

 

Tulemused:

loomade seisund enne katset ja katseperioodi kestel, sealhulgas mürgisuse nähud;

isasloomade kehamass manustamisperioodil ja paaritamisperioodil;

paaritunud emasloomade arv;

võimaluse korral andmed annusest sõltuvuse kohta;

paralleelse negatiivse kontrolli andmed ja laboris negatiivse kontrolliga varem saadud andmed, sealhulgas tulemuste vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;

paralleelse positiivse kontrolli andmed;

tabeli kujul andmed iga tiinestunud emaslooma kohta: kollakehade arv tiinestunud emaslooma kohta; pesastunud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta; resorbeerunud embrüote ja enne pesastumist hävinud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta; pesastunud elus embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta; pesastunud surnud embrüote arv tiinestunud emaslooma kohta; loodete kehamass;

eespool nimetatud andmed koondatud kujul iga paaritamisperioodi ja annuse kohta koos dominantse letaalse mõju avaldumissagedusega;

teave statistilise analüüsi ja kasutatud meetodite kohta.

 

Tulemuste arutelu

 

Järeldused

KIRJANDUS

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 238. OECD, Pariis.

(2)

Bateman, A. J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse. Väljaandes: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. Kilbey, B. J. et al. (toim.), Elsevier, Amsterdam. Lk 235–334.

(3)

Ehling, U. H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., ja Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice Set up by the Work Group „Dominant lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics“. Arch. Toxicol. 39: 173–185.

(4)

Shelby, M. D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutat. Res. 352: 159–167.

(5)

Knudsen, I., Hansen, E. V., Meyer, O. A., ja Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutat. Res. 48: 267–270.

(6)

Anderson, D., Hughes, J. A., Edwards, A. J., ja Brinkworth, M. H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutat. Res. 397: 77–74.

(7)

Shively, C. A., White, D.,M., Blauch, J.,L., ja Tarka, S. M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20: 325–329.

(8)

Rao, K. S., Cobel-Geard, S. R., Young, J. T., Hanley, T. R. Jr., Hayes, W. C., John, J. A., ja Miller, R. R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol. 3: 80–85.

(9)

Brewen, J. G., Payne, H. S., Jones, K. P., ja Preston, R. J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells. Mutat. Res. 33: 239–249.

(10)

Marchetti, F., Bishop, J. B., Cosentino, L., Moore, D., II, ja Wyrobek, A. J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod. 70: 616–624.

(11)

Marchetti, F., ja Wyrobek, A. J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res. C 75: 112–129.

(12)

Adler, I.-D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutat. Res. 352: 169–172.

(13)

Favor, J., ja Crenshaw, J. W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice. Mutat. Res. 53: 21–27.

(14)

Generoso, W. M., Witt, K. L., Cain, K. T., Hughes, L., Cacheiro, N. L. A, Lockhart, A. M. C., ja Shelby, M. D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutat. Res. 345: 167–180.

(15)

Hastings, S. E., Huffman, K. W., ja Gallo, M. A. (1976). The Dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine. Mutat. Res. 40: 371–378.

(16)

James, D. A., ja Smith, D. M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay. Mutat. Res. 99: 303–314.

(17)

Shelby, M. D., Cain, K. T., Hughes, L. A., Braden, P. W., ja Generoso, W. M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutat. Res. 173: 35–40.

(18)

Sudman, P. D., Rutledge, J. C., Bishop, J.,B., ja Generoso, W. M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice. Mutat. Res. 296: 143–156.

(19)

Holstrom, L. M., Palmer, A. K., ja Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. Väljaandes: Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland, D. J., ja Fox, M. (toim.), Cambridge University Press. Lk 129–156.

(20)

Adler, I.-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I., ja Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis. Mutat. Res. 417: 19–30.

(21)

Adler, I.-D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T., ja Tanaka, N. (1994). Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutat. Res. 312: 313–318.

(22)

Generoso, W. M., ja Piegorsch, W. W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Väljaandes: Methods in Toxicology 3A. Lk 124–141.

(23)

Haseman, J. K., ja Soares, E. R. (1976). The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutat. Res. 41: 277–288.

(24)

Whorton, E. B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality. Teratogen. Carcin. Mut. 1: 353–360.

(25)

Anderson, D., Hodge, M. C. E., Palmer, S., ja Purchase, I. F. H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutat. Res. 85: 417–429.

(26)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., ja Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7: 313–319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(28)

Barrow, M. V., ja Taylor, W. J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. J. Morphol. 127: 291–306.

(29)

Kirkland, D. J. (toim.) (1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J., ja Thybaud, V. (2011). „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data“. Mutat. Res. 723: 87–90.

(31)

Lockhart, A. C., Piegorsch, W. W., ja Bishop, J. B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutat. Res. 272: 35–58.

(32)

Cochran, W. G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics 10: 417–451.

(33)

Tarone, R. E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika 66: 585–590.

(34)

Margolin, B. H. (1988). Test for Trend in Proportions. Väljaandes: Encyclopedia of Statistical Sciences, 9. köide. Kotz, S., ja Johnson, N. L. (toim.). Lk 334–336. John Wiley & Sons, New York.

(35)

Cox, D. R. (1970). Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London.

(36)

Neter, J. M., Kutner, H. C., Nachtsheim, J., ja Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models. Neljas väljaanne. 14. ja 17. peatükk. McGraw-Hill, Boston.

(37)

Jonckheere, R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika 41: 133–145.

(38)

Conover, W. J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley & Sons, New York.

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Tööstus- ja Rakendusmatemaatika Ühing, Philadelphia, PA.

(40)

Fleiss, J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley & Sons, New York.

1. liide

MÕISTED

Dominantne letaalne mutatsioon– idurakus tekkinud või pärast viljastamist kinnistunud mutatsioon, mis kutsub esile embrüo või loote surma.

Kemikaal– aine või segu.

Kollakeha– hormoone eritav moodustis munasarja pinnal, mis tekib munaraku vabastanud folliikuli asukohas. Kollakehade arv munasarjas vastab ovuleerunud munarakkude arvule.

Paaritamisintervall– kokkupuuteperioodi lõpu ja töödeldud isasloomade paaritamise vaheline ajavahemik. Selle intervalli muutmise teel on võimalik hinnata kemikaali mõju eri tüüpi idurakkudele. Hiirtel tehakse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ja 8 nädalat pärast kokkupuuteperioodi lõppu toimuva paaritamise teel kindlaks mõju vastavalt seemnerakkudele, kondenseerunud spermatiididele, ümaratele spermatiididele, pahhüteenis spermatotsüütidele, varajastele spermatotsüütidele, diferentseerunud spermatogoonidele, diferentseeruvatele spermatogoonidele ja spermatogoonide tüvirakkudele.

Pesastumiseelne kadu– kollakehade arvu ja pesastunud embrüote arvu vahe. Seda saab hinnata ka nii, et võrreldakse pesastunud embrüote üldarvu emaslooma kohta kemikaaliga töödeldud rühmas ja kontrollrühmas.

Pesastumisjärgne kadu– pesastunud surnud embrüote osakaal kemikaaliga töödeldud rühmas võrrelduna pesastunud surnud embrüote arvu ja pesastunud embrüote üldarvu suhtega kontrollrühmas.

Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB– tundmatu või muutuva koostisega kemikaal, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Viljakuskordaja– paaritunud tiinete emasloomade arvu ja paaritunud emasloomade arvu suhe.

2. liide

IMETAJATE SPERMATOGENEESI ETAPID

Image 1

Joonis 1. Hiire ja roti isaslooma ning mehe idurakkude arenguetappide kestuse (päevades) võrdlus; varjutusega perioodidel DNA reparatsiooni ei toimu

Eespool on esitatud hiire, roti ja inimese spermatogeneesi skemaatiline joonis (allikas: Adler, 1996). Diferentseerumata spermatogoonid hõlmavad A-tüüpi ühekaupa, A-tüüpi paarikaupa ja A-tüüpi reastunud spermatogoone (Hess ja Renato de Franca, 2008). Tõelisteks tüvirakkudeks peetakse A-tüüpi ühekaupa spermatogoone; seepärast peab ajavahemik uuritava kemikaali viimasest manustamisest kuni paaritamiseni olema vähemalt 49 päeva (hiirtel), et võimaldada hinnata tüvirakkudele avalduvat mõju.

Viited

Adler, I.-D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutat. Res. 352: 169–172.

Hess, R. A., ja Renato de Franca, L. (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Väljaandes: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis. Cheng, C. Y. (toim.), Landes Bioscience ja Springer Science+Business Media. Lk 1–15.

4)

B osas asendatakse peatükk B.23 järgmisega:

„B.23.   KROMOSOOMIABERRATSIOONIKATSE IMETAJATE SPERMATOGOONIDEGA

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 483 (2016). Katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaoluga seotud kaalutlusi. Käesolevas katsemeetodi muudetud versioonis kajastub selle meetodi kasutamisel saadud aastatepikkune kogemus, samuti annab see võimaluse lõimida või kombineerida seda meetodit muude mürgisuse või genotoksilisuse hindamise meetoditega. Mürgisuse hindamise meetodite kasutamine kombineerituna võimaldab vähendada mürgisuskatsetes kasutatavate loomade arvu. Käesolev katsemeetod kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. OECD on välja töötanud dokumendi, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia valdkonna katsete kohta ning ülevaade genotoksilisust käsitlevates OECD katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).

2.

Imetajate spermatogoonidega tehtava in vivo kromosoomiaberratsioonikatse eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis põhjustavad imetajate spermatogoonides struktuurseid kromosoomiaberratsioone (2, 3, 4). Peale selle on kõnealune katse oluline genotoksilisuse hindamiseks, sest ehkki in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA reparatsiooni protsessidega seotud tegurid võivad liigiti varieeruda, on need aktiivsed ja aitavad kaasa vastusreaktsiooni kujunemisele. Käesolev katsemeetod ei ole ette nähtud kromosoomiarvu kõrvalekallete mõõtmiseks ning seda ei kasutata regulaarselt sel eesmärgil.

3.

Käesoleva meetodiga mõõdetakse struktuurseid kromosoomiaberratsioone (nii kromosoomi- kui ka kromatiidiaberratsioone) jagunevates spermatogoonides ning seepärast võimaldab see eeldatavalt ennustada pärilike mutatsioonide tekkimist nimetatud idurakkudes.

4.

Põhimõistete määratlused on esitatud liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

5.

Käesoleva katsemeetodi puhul kasutatakse tavaliselt närilisi, kuid mõnel teaduslikult põhjendatud juhul võib olla asjakohane kasutada mõnda muud liiki. Näriliste munandite tavapäraste tsütogeneetiliste preparaatide puhul analüüsitakse mitoosi metafaasi (spermatogoonides) ja meioosi metafaasi (spermatotsüütides). Mitoosi ja meioosi metafaas tuvastatakse kromosoomide morfoloogia alusel (4). Käesolev in vivo tsütogeneetiline meetod võimaldab teha kindlaks mitoosi ajal täheldatavaid struktuurseid kromosoomiaberratsioone spermatogoonides. Käesolevat meetodit ei kasutata muude sihtkudede puhul.

6.

Spermatogoonides kromatiidiaberratsioonide tuvastamiseks tuleks uurida rakkude esimest töötlemisjärgset mitootilist jagunemist, kuna nimetatud aberratsioonidest saavad rakkude järgnevate jagunemiste käigus kromosoomiaberratsioonid. Lisateabe saamiseks analüüsitakse töödeldud spermatotsüütide kromosoome meioosi vältel diakineesi, I metafaasi ja II metafaasi etappides struktuursete kromosoomiaberratsioonide suhtes.

7.

Munandis esineb mitu spermatogoonide põlvkonda (5) ning kõnealuste eri tüüpi idurakkude tundlikkus kemikaalidega töötlemise suhtes võib olla erinev. Seega kajastavad tuvastatud aberratsioonid töödeldud spermatogoonide populatsioonidele avalduvat koondmõju. Munandipreparaatides on enamik mitoosis rakkudest B-tüüpi spermatogoonid, mille rakutsükli kestus on umbes 26 tundi (3).

8.

Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav kemikaal või selle metaboliit/metaboliidid ei jõua munandisse, ei ole käesoleva katsemeetodi kasutamine asjakohane.

KATSEMEETODI PÕHIMÕTE

9.

Üldpõhimõtte kohaselt viiakse loomad pärast sobiva kokkupuuteviisi valimist uuritava kemikaaliga kokkupuutesse ning sobiva ajavahemiku möödumisel töötlemisest surmatakse loomad humaanselt. Enne surmamist manustatakse loomadele ainet, mis peatab rakkude jagunemise metafaasis (nt kolhitsiin või Colcemid®). Seejärel tehakse idurakkudest kromosoomipreparaadid ja värvitakse need ning metafaasis rakke analüüsitakse kromosoomiaberratsioonide suhtes.

LABORI PÄDEVUSE TÕENDAMINE

10.

Käesoleva meetodi kasutamise pädevuse kinnitamiseks tuleks tõendada võimekust reprodutseerida positiivse kontrollina kasutatavate, näiteks tabelis 1 loetletud (sealhulgas nõrga toimega) ainetega saadud, spermatogoonides täheldatavate struktuursete kromosoomiaberratsioonide esinemissagedust käsitlevaid tulemusi, samuti peaks negatiivsete kontrollide puhul täheldatud sagedus jääma vastuvõetavasse kirjanduses avaldatud kontrollandmete jaotusvahemikku (nt allikad 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10) või laboris kontrollidega varem saadud tulemuste jaotusvahemikku, kui sellised tulemused on olemas.

MEETODI KIRJELDUS

Ettevalmistused

Loomaliigi valimine

11.

Tuleks kasutada tavapäraste laboriliinide terveid noori täiskasvanud loomi. Tavaliselt kasutatakse isaseid hiiri; kui see on teaduslikult põhjendatud, võib siiski kasutada ka mõne muu sobiva imetajaliigi isasloomi, et käesolevat katsemeetodit oleks võimalik kasutada koos mõne muu katsemeetodiga. Teaduslik põhjendus näriliste asemel mõne muu liigi loomade kasutamise kohta tuleks esitada katseprotokollis.

Loomade pidamis- ja söötmistingimused

12.

Näriliste puhul peaks loomapidamisruumi temperatuur olema 22 °C (± 3 °C). Suhteline niiskus peaks olema vähemalt 40 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, ideaaljuhul aga 50–60 %. Tuleks kasutada tehisvalgustust valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada tavapärast laborisööta ja piiramatus koguses joogivett. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada sööda sobivus uuritava kemikaali lisamiseks, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. Näriliste pidamisel tuleks kasutada väikesi loomade rühmi (maksimaalselt viis looma puuri kohta), kui ei ole põhjust eeldada agressiivset käitumist; soovitatavalt tuleks kasutada sobiva mitmekesistatud keskkonnaga täispõhjaga puure. Loomi võib pidada eraldi, kui see on teaduslikult põhjendatud.

Loomade ettevalmistamine

13.

Tavaliselt kasutatakse terveid noori täiskasvanud (töötlemishetkeks 8–12 nädala vanuseid) loomi, kes jagatakse juhuvaliku alusel kontroll- ja katserühmadesse. Iga looma üheseks identimiseks kasutatakse humaanset minimaalselt invasiivset meetodit (nt rõngastamine, märgistamine, mikrokiibistamine või biomeetriline tuvastamine, kuid mitte kõrva sälkamine ega varba köndistamine) ning loomadel lastakse vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud võimalik mõju oleks võimalikult väike. Tuleks ära hoida positiivse kontrollina kasutatava aine ja uuritava kemikaali vahelist ristsaastumist. Katse alguses peaksid loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte üle ± 20 %.

Annuste ettevalmistamine

14.

Tahke uuritav kemikaal tuleks enne loomadele annustamist lahustada või suspendeerida sobivas lahustis või kandeaines või segada sööda või joogiveega. Vedelat uuritavat kemikaali võib annustada vahetult või seda enne annustamist lahjendada. Kui kokkupuude toimub sissehingamise teel, võib uuritavat kemikaali sõltuvalt selle füüsikalis-keemilistest omadustest manustada gaasina, auruna või tahke/vedela dispersse faasiga aerosoolina. Tuleks kasutada uuritava kemikaali värsket valmistist, välja arvatud juhul, kui kemikaali püsivusandmetest nähtub säilitamise vastuvõetavus ja on määratletud asjakohased säilitamistingimused.

Katsetingimused – lahusti/kandeaine

15.

Lahusti/kandeaine ei tohiks avaldada kasutatavate annuste puhul mürgist mõju ega olla võimeline uuritava kemikaaliga keemiliselt reageerima. Kui on valitud vähem tuntud lahusti/kandeaine, tuleks selle sobivuse tõendamiseks esitada selle kasutamist toetavad võrdlusandmed. Kui vähegi võimalik, on soovitatav esmalt kaaluda veepõhise lahusti/kandeaine kasutamist. Tavaliselt kasutatavad lahustid/kandeained on näiteks vesi, füsioloogiline lahus, metüültselluloosi lahus, karboksümetüültselluloosi naatriumisoola lahus, oliiviõli ja maisiõli. Valitud ebatüüpilisest lahustist/kandeainest põhjustatud struktuursete kromosoomiaberratsioonide ja muu kahjuliku mõju puudumist kinnitavate varasemate laboriandmete või avaldatud kontrollandmete puudumisel tuleks teha eelkatse, et tõendada lahustiga/kandeainega töödeldud kontrollrühma andmete vastuvõetavust.

Positiivsed kontrollid

16.

Katses tuleks alati paralleelselt kasutada positiivse kontrollina kasutatava ainega töödeldud loomi, välja arvatud juhul, kui labori pädevus katse läbiviimiseks on tõendatud ja katsemeetodit on lähiminevikus (nt viimase viie aasta jooksul) korrapäraselt kasutatud. Kui paralleelse positiivse kontrolli rühma ei kasutata, peaks iga katse hõlmama hindamiskontrolle (fikseeritud ja värvimata mikroskoobipreparaadid). Selleks võib uuringu raames hinnata asjakohaseid säilitatud võrdlusproove, mis on saadud positiivse kontrolliga tehtud eraldi katsest, mida viiakse uuringut tegevas laboris läbi korrapäraselt (nt iga 6–18 kuu järel), näiteks pädevuse tõendamise käigus ja seejärel regulaarselt vastavalt vajadusele.

17.

Positiivse kontrollina kasutatavate ainete puhul tuvastatav struktuursete kromosoomiaberratsioonidega rakkude esinemissagedus peaks järjepidevalt olema suurem kui vastav spontaanse esinemise sagedus. Positiivse kontrolli annused tuleks valida nii, et toime oleks selgelt tuvastatav, kuid ei võimaldaks hindajal teha kohe kindlaks kodeeritud proovide identiteeti. Positiivse kontrollina kasutatavate ainete näited on esitatud tabelis 1.

Tabel 1

Positiivse kontrollina kasutatavate ainete näited

Aine [CASi nr] (viitenumber)

Tsüklofosfamiid(monohüdraat) [CASi nr: 50-18-0 (CASi nr: 6055-19-2)] (9)

Tsükloheksüülamiin [CASi nr: 108-91-8] (7)

Mitomütsiin C [CASi nr: 50-07-7] (6)

Monomeerne akrüülamiid [CASi nr: 79-06-1] (10)

Trietüleenmelamiin [CASi nr: 51-18-3] (8)

Negatiivsed kontrollid

18.

Igal proovivõtukorral tuleks kasutada negatiivse kontrollina loomi, kellele on manustatud ainult lahustit või kandeainet ja keda on muidu koheldud samal viisil kui katserühma loomi. Valitud lahustist/kandeainest põhjustatud kromosoomiaberratsioonide ja muu kahjuliku mõju puudumist kinnitavate varasemate laboriandmete või avaldatud kontrollandmete puudumisel tuleks igal proovivõtukorral kasutada kontrollina ka loomi, kellele ei ole midagi manustatud, et tõendada kandeainega töödeldud kontrollrühma andmete vastuvõetavust.

KATSE KÄIK

Loomade arv

19.

Uuringu alguses tuleks kindlaks määrata selline rühmade suurus, et igas rühmas oleks vähemalt viis isaslooma. Sellist loomade arvu peetakse piisavaks, et tagada küllaldane statistiline võimsus (st üldjuhul võimekus tuvastada miinimumeesmärgina kromosoomiaberratsioonide esinemissageduse kahekordistumine 80-protsendilise tõenäosusega olulisusnivool 0,05, kui negatiivse kontrolli puhul täheldatav esinemissagedus on 1 % või suurem) (3, 11). Tüüpilisel juhul on suurim vajalik loomade arv katses, kus on kaks proovivõtuaega ning kolm eri annustele vastavat katserühma, paralleelse negatiivse kontrolli rühm ja positiivse kontrolli rühm (igas rühmas viis looma), 45 isendit.

Manustamiskava

20.

Uuritavat kemikaali manustatakse tavaliselt üks kord (st ühekordse annusena); kui see on teaduslikult põhjendatud, võib kasutada ka mõnda muud annustamisrežiimi.

21.

Rühmas, kus kemikaali kasutatakse suurimas annuses, võetakse manustamise järel proove kahel korral. Kuna uuritava(te) kemikaali(de) omastamiseks ja metaboliseerimiseks ning rakutsükli kineetikale mõju avaldumiseks vajalik aeg võib mõjutada kromosoomiaberratsioonide tuvastamise optimaalset aega, võetakse varasemad proovid umbes 24 tundi ja hilisemad proovid umbes 48 tundi pärast kemikaaliga töötlemist. Suurimast annusest erinevate annuste puhul tuleks proovid võtta varasemal proovivõtuajal ehk 24 tundi pärast töötlemist (see ajavahemik on lühem või sama pikk kui B-tüüpi spermatogoonide rakutsükli kestus ning esimese töötlemisjärgse metafaasi hindamise tõenäosus on seega optimaalne), välja arvatud juhul, kui mõne muu proovivõtuaja kasutamine on teadaolevalt asjakohasem ja põhjendatud.

22.

Võib kasutada ka teistsuguseid proovivõtuaegu. Näiteks võib olla asjakohane kasutada S-faasist sõltumatu toimega kemikaalide puhul varasemat proovivõtuaega (st 24 tunnist lühemat ajavahemikku).

23.

Võib kasutada ka korduvannustamisel põhinevat režiimi, näiteks juhul, kui katse viiakse läbi koos katsega, milles hinnatakse mõnda muud lõppnäitajat ja kus kasutatakse 28 päeva pikkust manustamisperioodi (nt vastavalt katsemeetodile B.58); sel juhul on siiski vaja kasutada erinevate proovivõtuaegade puhul täiendavaid loomade rühmi. Sellest lähtuvalt tuleb sellise manustamiskava asjakohasust igal eraldi juhul teaduslikult põhjendada.

24.

Enne humaanset surmamist süstitakse loomadele intraperitoneaalselt sobivas annuses kemikaali, mis peatab rakkude jagunemise metafaasis (nt Colcemid® või kolhitsiin). Seejärel võetakse loomadelt sobiva intervalliga proove. Hiirte ja rottide puhul on see intervall umbes 3–5 tundi.

Annused

25.

Kui annuste valimist hõlbustavate sobivate andmete puudumise tõttu tehakse annusevahemiku kindlakstegemiseks eeluuring, tuleks see vastavalt annusevahemiku kindlakstegemise uuringu tegemist käsitlevatele soovitustele viia läbi samas laboris, samast liigist ja liinist loomadega ning sama manustamisrežiimi alusel kui põhiuuring (12). Eeluuringu eesmärk peaks olema teha kindlaks suurim talutav annus, mis on määratletud kui annus, mille puhul täheldatakse uuringuperioodi jooksul vähest mürgist mõju (näiteks ebatavalised reaktsioonid või käitumine, väike kehamassi vähenemine või tsütotoksilisus vereloomesüsteemi suhtes), kuid mis ei põhjusta surma ega selliseid kannatusi, valu või stressi, mis nõuaksid loomade humaanset surmamist (13).

26.

Suurima annusena võib käsitada ka annust, mille puhul täheldatakse teatavaid mürgisuse ilminguid spermatogoonides (nt mitootiliste spermatogoonide ning meioosi esimeses või teises metafaasis olevate rakkude suhtarvu vähenemine). Kõnealune vähenemine ei tohiks olla suurem kui 50 %.

27.

Selliste uuritavate kemikaalide puhul, millel avaldub juba väikese mittemürgise annuse juures konkreetne bioloogiline aktiivsus (näiteks hormoonid ja mitogeenid) või mille puhul esineb toksikokineetiliste omadustega seotud küllastumine, ei pruugi annuste valimise kriteeriumid olla kohaldatavad ning neid kemikaale tuleks igal konkreetsel juhul eraldi hinnata.

28.

Annusest sõltuvuse kohta teabe saamiseks tehtav täielik uuring peaks hõlmama negatiivse kontrolli rühma (punkt 18) ja vähemalt kolme eri annust, mis erinevad üksteisest üldjuhul kaks korda, ent kõige rohkem neli korda. Kui uuritav kemikaal ei ole annusevahemiku kindlakstegemise uuringus või olemasolevate andmete põhjal mürgine, peaks suurim korraga manustatav annus olema 2 000 mg kehamassi kilogrammi kohta. Kui aga uuritav kemikaal põhjustab mürgisusnähte, tuleks suurima manustatava annusena kasutada suurimat talutavat annust ning kasutatav annusevahemik peaks soovitatavalt ulatuma suurimast annusest kuni annuseni, mille puhul täheldatav mürgisus on vähene või puudub. Kui mürgisust sihtkoe (st munandite) suhtes täheldatakse kõigi katses kasutatud annuste puhul, on soovitatav teha lisakatse, milles kasutatakse mittemürgiseid annuseid. Uuringutes, milles soovitakse kvantitatiivset annusest sõltuvust lähemalt iseloomustada, võib olla vaja kasutada täiendavaid annuserühmi. Teatavat liiki uuritavate kemikaalide (näiteks inimravimite) puhul, mille suhtes kohaldatakse erinõudeid, võivad asjaomased piirmäärad olla teistsugused. Kui uuritav kemikaal ei ole mürgine, tuleks kasutada piirannust ja kahte väiksemat annust (nagu on kirjeldatud eespool). Piirannus on 14 päeva pikkuse või pikema manustamisperioodi puhul 1 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas ning 14 päevast lühema manustamisperioodi puhul 2 000 mg kehamassi kilogrammi kohta päevas.

Annuste manustamine

29.

Katse kavandamisel tuleks silmas pidada inimese puhul eeldatavat kokkupuuteviisi. Seepärast võib vastavast põhjendusest lähtuvalt kasutada selliseid manustamisviise nagu manustamine söödaga, joogiveega, paikselt, naha alla, veenisiseselt, suu kaudu (toitmissondiga), sissehingamise teel või implantaadiga. Igal juhul tuleks manustamisviis valida nii, et oleks tagatud sihtkoe piisav kokkupuude uuritava kemikaaliga. Intraperitoneaalne süstimine ei ole tavaliselt soovitatav, kui see ei ole teaduslikult põhjendatud, kuna üldjuhul ei ole tegemist inimese puhul füsioloogiliselt asjakohase kokkupuuteviisiga. Kui uuritav kemikaal segatakse sööda või joogiveega, tuleks eriti üheainsa annuse manustamisel jälgida, et sööda ja vee tarbimise ning proovivõtmise vaheline ajavahemik oleks piisav, et võimaldada kemikaali mõju tuvastamist (vt punkt 33). Toitmissondi kaudu või süstimise teel korraga manustatav suurim vedelikukogus sõltub katselooma suurusest. Tavaliselt ei tohiks see kogus olla suurem kui 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, mida võib kasutada koguses 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema koguse kasutamist (kui see on loomade heaolu käsitlevate õigusaktide kohaselt lubatud) tuleks põhjendada. Katses kasutatava ruumala varieeruvuse minimeerimiseks tuleks muuta kemikaali kontsentratsiooni, et tagada kehamassi suhtes püsiva ruumala kasutamine kogu annusevahemiku lõikes.

Vaatlused

30.

Katseloomadel tuleks teha kliinilisi vaatlusi ja registreerida kliinilised sümptomid vähemalt üks kord päevas, igal päeval soovitatavalt samal ajal, ning võtta seejuures arvesse manustamisjärgse eeldatava mõju maksimaalse avaldumise ajavahemikku. Kõiki loomi tuleks haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks kontrollida vähemalt kaks korda päevas. Kõikide loomade kaal tuleks määrata uuringu alguses, korduvannustamise uuringu kestel vähemalt kord nädalas ning humaanse surmamise hetkel. Kui uuring kestab vähemalt ühe nädala, tuleks vähemalt kord nädalas mõõta sööda tarbimist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleks vee tarbimist mõõta iga veevahetuse ajal ja vähemalt kord nädalas. Loomad, kellel täheldatakse liigse mittesurmava mürgisuse nähte, tuleks enne katse lõppu humaanselt surmata (13).

Kromosoomipreparaatide valmistamine

31.

Kohe pärast humaanset surmamist võetakse ühest või kummastki munandist idurakususpensioon, mis viiakse hüpotoonilisse lahusesse ja fikseeritakse väljatöötatud meetodite kohaselt (nt allikad 2, 14, 15). Seejärel kantakse rakud objektiklaasile ja värvitakse (16, 17). Kõik mikroskoobipreparaadid tuleks kodeerida, et nende identiteet ei oleks hindajale teada.

Analüüs

32.

Iga looma puhul tuleks hinnata vähemalt 200 hästi väljendunud metafaasis rakku (3, 11). Kui laboris negatiivse kontrolli puhul varem täheldatud sagedus on < 1 %, tuleks statistilise võimsuse suurendamiseks hinnata üle 200 raku looma kohta (3). Tuleks kasutada tsentromeeri tuvastamist võimaldavaid värvimismeetodeid.

33.

Kromosoomi- ja kromatiidiaberratsioonid tuleks registreerida eraldi ja liigitada need alatüübi alusel (katked, vahetused). Tuleks registreerida ka lüngad, kuid jätta need selle kindlakstegemisel, kas kemikaal põhjustab kromosoomiaberratsioonidega rakkude esinemissageduse olulist suurenemist, arvesse võtmata. Labori eeskirjadega tuleks tagada, et kromosoomiaberratsioone analüüsivad väljaõppinud hindajad. Lähtuvalt asjaolust, et mikroskoobipreparaadi valmistamise käigus puruneb sageli osa metafaasis olevatest rakkudest ning sellega kaasneb kromosoomide kadu, peaks tsentromeeride arv hinnatavates rakkudes olema vähemalt 2n ± 2, kus n on liigiomane haploidne kromosoomiarv.

34.

Ehkki katse eesmärk on tuvastada struktuurseid kromosoomiaberratsioone, on oluline registreerida polüploidsete rakkude ja endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude täheldamisel ka nende esinemissagedus (vt punkt 44).

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmete töötlemine

35.

Andmed iga looma kohta tuleks esitada tabelina. Iga looma puhul tuleks hinnata struktuurse(te) kromosoomiaberratsiooni(de)ga rakkude arvu ja kromosoomiaberratsioonide arvu raku kohta. Alatüüpidesse liigitatud kromatiidi- ja kromosoomiaberratsioonid (katked, vahetused) tuleks loetleda eraldi ning esitada nende arv ja esinemissagedus katse- ja kontrollrühmades. Lüngad registreeritakse eraldi. Lünkade esinemissagedus küll esitatakse, kuid üldjuhul ei võeta seda struktuursete kromosoomiaberratsioonide üldsageduse analüüsimisel arvesse. Polüploidsete rakkude või endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude esinemisel esitatakse ka nende protsentuaalne osakaal.

36.

Tuleks esitada andmed mürgisuse ja kliiniliste sümptomite kohta (vt punkt 30).

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

37.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid on järgmised:

paralleelse negatiivse kontrolliga saadud tulemused on kooskõlas varasemaid negatiivse kontrolli andmeid käsitlevate avaldatud normidega, mille kohaselt on kromosoomiaberratsioonidega rakkude osakaal eeldatavalt > 0 % ja ≤ 1,5 %, ning samuti laboris kontrollidega varem saadud tulemustega, kui need on olemas (vt punktid 10 ja 18);

paralleelsed positiivsed kontrollid kutsuvad esile reaktsioone, mis on kooskõlas varasemaid positiivsete kontrollide andmeid käsitlevate avaldatud normidega, samuti laboris positiivsete kontrollidega varem saadud tulemustega, kui need on olemas, ning paralleelsete positiivsete kontrollidega saadud väärtused on statistiliselt oluliselt suuremad kui negatiivse kontrolliga saadud väärtused (vt punktid 17 ja 18);

analüüsitud rakkude ja eri annuste arv on piisav (vt punktid 28 ja 32);

suurima annuse valimise kriteeriumid on kooskõlas punktides 25 ja 26 kirjeldatud kriteeriumidega.

38.

Kui vaadeldakse nii meioosi kui ka mitoosi, tuleks tsütotoksilisuse hindamiseks teha iga töödeldud looma ja negatiivse kontrolli looma puhul kindlaks mitootiliste spermatogoonide ja meioosi esimeses või teises metafaasis olevate rakkude suhtarv proovis, kus on kokku 100 jagunevat rakku. Kui vaadeldakse üksnes mitoosi, tuleks iga looma puhul teha vähemalt 1 000 raku põhjal kindlaks mitoosiindeks.

Tulemuste hindamine ja tõlgendamine

39.

Annusest sõltuvuse analüüsimiseks piisavate andmete saamiseks on vaja uurida vähemalt kolme rühma, kus on töötlemiseks kasutatud eri annuseid.

40.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt positiivseks, kui:

vähemalt ühe katses kasutatud annuse puhul täheldatakse saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes,

kõnealune suurenemine on vähemalt ühe proovivõtuaja puhul annusest sõltuv ning

mis tahes saadud tulemus jääb väljapoole vastuvõetavat negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste olemasolul selliste tulemuste jaotust (nt väljapoole Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimelisena põhjustama katseloomade spermatogoonides kromosoomiaberratsioone. Soovitused kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta on esitatud ka kirjanduses (11, 18). Kasutatavate statistiliste testide puhul tuleks katseüksusena käsitada üksikisendit.

41.

Kui kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritava kemikaaliga saadud tulemus selgelt negatiivseks, kui:

ühegi katses kasutatud annuse puhul ei täheldata saadud väärtuse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes,

ühegi katsetingimuse puhul ei esine annusest sõltuvat väärtuse suurenemist ning

kõik saadud tulemused jäävad vastuvõetavasse negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste olemasolul selliste tulemuste jaotusvahemikku (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldusnivool 95 %).

Sel juhul käsitatakse uuritavat kemikaali võimetuna põhjustama katseloomade spermatogoonides kromosoomiaberratsioone. Soovitused kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta on esitatud ka kirjanduses (11, 18). Negatiivse tulemuse korral ei ole välistatud võimalus, et kemikaal põhjustab kromosoomiaberratsioone mõnes uuringuga hõlmamata hilisemas arenguetapis või kutsub esile geenimutatsioone.

42.

Selgelt positiivset või negatiivset tulemust ei ole vaja üle kontrollida.

43.

Juhul, kui tulemus ei ole selgelt negatiivne ega selgelt positiivne ning eesmärk on aidata kindlaks teha tulemuse – näiteks vaadeldava väärtuse väikese või piiripealse suurenemise – bioloogiline olulisus, tuleks andmete hindamiseks kasutada eksperdihinnangut ja/või olemasolevatel katseandmetel põhinevat täiendavat analüüsi, näiteks kaaluda, kas positiivne tulemus jääb väljapoole vastuvõetavat negatiivse kontrolli andmete vahemikku või laboris negatiivsete kontrollidega varem saadud tulemuste jaotust (19).

44.

Harvadel juhtudel ei võimalda andmed isegi pärast täiendavat analüüsi teha järeldust selle kohta, kas tulemus on positiivne või negatiivne; sel juhul loetakse tulemus ebaselgeks.

45.

Polüploidsete rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav kemikaal on võimeline pärssima mitoosiprotsesse ja põhjustama kromosoomiarvu muutusi (20). Endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav kemikaal on võimeline pärssima rakutsükli edenemist (21, 22) – see kromosoomiarvu muutusi põhjustav mehhanism erineb mitoosiprotsesside pärssimise mehhanismist (vt punkt 2). Seepärast tuleks polüploidsete rakkude ja endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude esinemissagedus registreerida eraldi.

Katseprotokoll

46.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

 

Kokkuvõte

 

Uuritav kemikaal:

allikas, partii number, aegumiskuupäev, kui on olemas;

uuritava kemikaali püsivus, kui see on teada;

uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis, kui see on teada;

vastavalt vajadusele mõõtmistulemused söötme pH ja osmolaalsuse ning sademe tekke kohta pärast uuritava kemikaali lisamist;

 

ühest koostisosast koosnev aine:

füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

 

mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:

võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.

 

Uuritava kemikaali ettevalmistamine:

kandeaine valimise põhjendus;

uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis/kandeaines;

sööda või joogiveega või sissehingamise teel manustamiseks sobiva valmistise valmistamine;

valmistise analüüsi tulemused (nt püsivus, homogeensus, nominaalne kontsentratsioon), kui need on olemas.

 

Katseloomad:

kasutatud liik/liin ja selle kasutamise põhjendus;

loomade arv ja vanus;

päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne;

loomade ühese identimise meetod;

lühiajaliste uuringute puhul: iga looma kehamass katse alguses ja lõpus; ühest nädalast pikemate uuringute puhul: iga looma kehamass uuringu vältel ja sööda tarbimise andmed. Iga rühma kohta tuleks esitada kehamasside vahemik, keskväärtus ja standardhälve.

 

Katsetingimused:

positiivse ja negatiivse (kandeainega/lahustiga) kontrolli andmed;

annusevahemiku kindlakstegemise uuringu andmed, kui need on olemas;

annuste valimise põhjendus;

manustamisviisi valimise põhjendus;

uuritava kemikaali ettevalmistamise üksikasjad;

uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;

surmamisaja valimise põhjendus;

loomadel avalduva mürgisuse mõõtmise meetodid, sealhulgas andmed histopatoloogilise või hematoloogilise analüüsi kohta, kui seda on tehtud, samuti loomade vaatlemise ja kehamassi määramise sagedus;

negatiivsete tulemuste korral meetodid selle kontrollimiseks, et uuritav kemikaal on jõudnud sihtkoesse või üldvereringesse;

vajaduse korral tegelik annus (milligrammides kehamassi kilogrammi kohta päevas), mis arvutatakse lähtuvalt sööda/joogivee tarbimisest ja selles sisalduva uuritava kemikaali kontsentratsioonist (miljondikes);

sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;

manustamis- ja proovivõturežiimide üksikasjalik kirjeldus ja nende valimise põhjendus;

humaanse surmamise meetod;

valutustamismeetod (kui seda kasutati);

kudede eraldamise meetodid;

kemikaal, mida kasutati rakkude jagunemise peatamiseks metafaasis, selle kontsentratsioon ja manustamise kestus;

mikroskoobipreparaadi valmistamise meetodid;

aberratsioonide hindamise kriteeriumid;

analüüsitud rakkude arv looma kohta;

kriteeriumid uuringutulemuse liigitamiseks positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks.

 

Tulemused:

loomade seisund enne katset ja katseperioodi kestel, sealhulgas mürgisuse nähud;

kehamass ja organite kaal surmamishetkel (korduvmanustamise korral manustamisperioodi vältel mõõdetud kehamass);

mürgisusnähud;

mitoosiindeks;

mitootiliste spermatogoonide ja meioosi esimeses või teises metafaasis olevate rakkude suhtarv või mõni muu tõend, et sihtkude on kemikaaliga kokku puutunud;

aberratsioonitüübid ja aberratsioonide arv eraldi iga looma kohta;

aberratsioonide üldarv rühma kohta ning vastavad keskväärtused ja standardhälbed;

aberratsioonidega rakkude arv rühma kohta ning vastavad keskväärtused ja standardhälbed;

võimaluse korral andmed annusest sõltuvuse kohta;

teave statistilise analüüsi ja kasutatud meetodite kohta;

paralleelse negatiivse kontrolli andmed;

negatiivse kontrolliga varem saadud andmed, sealhulgas väärtusevahemikud, keskväärtused, standardhälbed ja usaldusvahemikud usaldusnivool 95 % (kui need on olemas), või varasemad avaldatud negatiivse kontrolli andmed, mida kasutati katsetulemuste vastuvõetavuse hindamiseks;

paralleelse positiivse kontrolli andmed;

täheldatud muutused ploidsuses, sealhulgas polüploidsete ja/või endoreduplikatsiooniga rakkude esinemissagedus.

 

Tulemuste arutelu

 

Järeldused

KIRJANDUS

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 238. OECD, Pariis.

(2)

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. Väljaandes: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Venitt, S., ja Parry, J. M. (toim.), IRL Press, Oxford, Washington, D. C. Lk 275–306.

(3)

Adler, I.-D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T., ja Tanaka, N. (1994). Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutat. Res. 312: 313–318.

(4)

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutat. Res. 455: 167–189.

(5)

Hess, R. A., ja Renato de Franca, L. (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Väljaandes: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis. Cheng, C. Y. (toim.), Landes Bioscience ja Springer Science+Business Media. Lk 1–15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C. Mutat. Res. 23(3): 368–379. Adler, I.-D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. Väljaandes: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis. Ramel, C., Lambert, B., ja Magnusson, J. (toim.), Liss, New York. Lk. 477–484.

(7)

Cattanach, B. M., ja Pollard, C. E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse. Mutat. Res. 12: 472–474.

(8)

Cattanach, B. M., ja Williams, C. E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens. Mutat. Res. 13: 371–375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia. Humangenetik 29: 135–140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice. Mutat. Res. 57(3): 313–324.

(11)

Adler, I.-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I., ja Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis. Mutat. Res. 417: 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., ja Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis 7: 313–319.

(13)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Series on Testing and Assessment No. 19. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(14)

Yamamoto, K., ja Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutat. Res. 52: 207–209.

(15)

Hsu, T. C., Elder, F., ja Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen. 1: 291–294.

(16)

Evans, E. P., Breckon, G., ja Ford, C. E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenet. Cell Genet. 3: 289–294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G., ja Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays. Väljaandes: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Kirkland, D. J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney. Lk 115–141.

(18)

Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G., ja Savage, J. R. K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. Väljaandes: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part III. Kirkland, D. J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney. Lk 184–232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J., ja Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutat. Res. 723: 87–90.

(20)

Warr, T. J., Parry, E. M., ja Parry, J. M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens. Mutat. Res. 287: 29–46.

(21)

Huang, Y., Change, C., ja Trosko, J. E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res. 43: 1362–1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutat. Res. 119: 403–413.

Liide

MÕISTED

Aneuploidsus– mis tahes kõrvalekalle normaalsest diploidsest (või haploidsest) kromosoomiarvust ühe või enama kromosoomi võrra, kuid mitte terve(te) kromosoomikomplekti(de) võrra (polüploidsus).

Genotoksilisus– üldmõiste, mis hõlmab DNA ja kromosoomide mis tahes liiki kahjustusi, sealhulgas katkeid, deletsioone, adukte, nukleotiidide modifikatsioone ja sidemete teket, ümberkorraldusi, mutatsioone, kromosoomiaberratsioone ja aneuploidsust. Genotoksiline mõju ei väljendu alati mutatsiooni või püsiva kromosoomikahjustusena.

Kemikaal– aine või segu.

Klastogeen– mis tahes kemikaal, mis põhjustab rakkude või organismide populatsioonis struktuurseid kromosoomiaberratsioone.

Kromatiidiaberratsioon– struktuurne kromosoomikahjustus, mis väljendub üksikkromatiidi katkemisena või kromatiidide katkemise ja omavahelise taasühinemisena.

Kromosoomiaberratsioon– struktuurne kromosoomikahjustus, mis väljendub mõlema kromatiidi katkemisena või katkemise ja taasühinemisena samas kohas.

Kromosoomiarvu kõrvalekalle– kasutatud loomadele omase tavapärase kromosoomiarvu muutus.

Kromosoomide varieeruvus– kromosoomide kuju ja suuruse varieeruvus (nt metatsentrilised, akrotsentrilised vm kromosoomid).

Lünk– akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi laius ja millega kaasneb kromatiidi struktuuri minimaalne muutus.

Mitoos– rakutuuma jagunemise protsess, mis tavaliselt jagatakse profaasiks, prometafaasiks, metafaasiks, anafaasiks ja telofaasiks.

Mitoosiindeks– suhtarv, mis saadakse metafaasis olevate rakkude arvu jagamisel vaatlusaluse rakupopulatsiooni rakkude üldarvuga; võimaldab hinnata paljunemismäära selles rakupopulatsioonis.

Mutageensus– omadus, mis põhjustab pärilikke muutusi geenide DNA aluspaaride järjestuses või kromosoomide struktuuris (kromosoomiaberratsioonid).

Polüploidsus– haploidse kromosoomiarvu (n) kordsus, v.a diploidsus (nt 3n, 4n jne).

Struktuurne aberratsioon– raku jagunemise metafaasietapis mikroskoobi abil tuvastatav kromosoomistruktuuri muutus, mis väljendub deletsioonis või fragmentide vahetuses.

Tsentromeer– kromosoomi piirkon(na)d, mille külge kinnituvad raku jagunemise ajal kääviniidid, mis võimaldavad tütarkromosoomidel liikuda korrapäraselt tütarrakkude poolustele.

Uuritav kemikaal– iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB– tundmatu või muutuva koostisega kemikaal, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

5)

B osas asendatakse peatükk B.40 järgmisega:

„B.40.    IN VITRO NAHASÖÖVITUS: TRANSKUTAANSE ELEKTRITAKISTUSE (TET) MÕÕTMISEL PÕHINEV KATSEMEETOD

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 430 (2015). Nahasöövituse all mõistetakse läbi marrasknaha pärisnahani ulatuva nähtava nekroosina avalduva pöördumatu nahakahjustuse tekkimist pärast uuritava kemikaaliga töötlemist, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (1) ning Euroopa Liidu (EL) määruses nr 1272/2008, milles käsitletakse ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (edaspidi „CLP-määrus“) (1). Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi B.40 näol on tegemist in vitro meetodiga, mis võimaldab tuvastada mittesöövitavaid ja söövitavaid aineid ja segusid kooskõlas ÜRO GHSi (1) ja CLP-määrusega.

2.

Nahasöövituse hindamisel on tavapäraselt kasutatud laboriloomi (katsemeetod B.4, mis on samaväärne algselt 1981. aastal vastu võetud ning aastatel 1992, 2002 ja 2015 muudetud OECD katsejuhendiga nr 404) (2). Peale käesoleva katsemeetodi B.40 on valideeritud ja vastu võetud muudki in vitro katsemeetodid kemikaalide võimaliku nahka söövitava toime tuvastamiseks – näiteks katsemeetodid B.40b (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 431) (3) ja B.65 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 435) (4), mis võimaldavad vajaduse korral teha kindlaks ka söövitava kemikaali alamkategooria. Samuti on katsemeetodi B.46 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 439) (5) raames vastu võetud mitu valideeritud in vitro katsemeetodit nahaärrituse hindamiseks. OECD juhenddokumendis nahasöövituse ja -ärrituse puhul kasutatava katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta kirjeldatakse mitut moodulit, milles eri teabeallikad ja analüüsivahendid on rühmitatud, ning i) antakse suuniseid, kuidas lõimida ja kasutada olemasolevaid katse- ja muid andmeid kemikaalide võimaliku nahka ärritava ja nahka söövitava toime hindamiseks ja ii) pakutakse välja lähenemisviis juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid (6).

3.

Käesolevas katsemeetodis on käsitletud inimtervisega seotud lõppnäitajana nahasöövitust. Meetod põhineb roti naha transkutaanse elektritakistuse (TET) mõõtmisel ning selle puhul kasutatakse nahakettaid, mille abil tehakse kindlaks söövitavad ained selle järgi, kas need on võimelised kahjustama normaalse sarvkihi terviklikkust ja selle toimimist kaitsekihina. Vastav OECD katsejuhend võeti algselt vastu 2004. aastal ja seda ajakohastati 2015. aastal, et lisada viide eespool nimetatud juhenddokumendile katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta.

4.

In vitro nahasöövituse tuvastamise metoodika hindamiseks regulatiivsel eesmärgil viidi läbi valideerimiseelsed uuringud (7) ja seejärel roti naha TET mõõtmisel põhineva, nahasöövituse hindamiseks kasutatava katsemeetodi ametlik valideerimisuuring (8, 9, 10, 11). Nende uuringute tulemusena esitati soovitus, et kõnealust TET mõõtmisel põhinevat katsemeetodit, mis on määratud valideeritud standardmeetodiks (VSM), võiks kasutada regulatiivsel eesmärgil in vivo nahasöövituse hindamiseks (12, 13, 14).

5.

Enne kui regulatiivsel eesmärgil nahasöövituse hindamiseks saab VSMi kõrval kasutada mõnda muud TET mõõtmisel põhinevat soovitud sarnast või muudetud in vitro katsemeetodit, tuleks teha kindlaks sellise meetodi usaldusväärsus, asjakohasus (täpsus) ja piirangud kavandatava kasutusotstarbe puhul, et tagada selle sarnasus VSMiga kooskõlas tulemuslikkuse standardites sätestatud nõuetega (15). OECD otsuse kohane andmete vastastikune tunnustamine on tagatud üksnes pärast seda, kui tulemuslikkuse standarditele vastav mis tahes välja pakutud uus või ajakohastatud katsemeetod on läbi vaadatud ja asjaomasesse OECD katsejuhendisse lisatud.

MÕISTED

6.

Kasutatud mõisted on määratletud liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

7.

Valideerimisuuringu (10) ja muude avaldatud uuringute (16, 17) andmeil võimaldab roti naha TET mõõtmisel põhinev katsemeetod eristada 122 ainet sisaldavas andmebaasis esindatud teadaolevaid nahka söövitavaid aineid mittesöövitavatest ainetest üldise tundlikkusega 94 % (51/54) ja spetsiifilisusega 71 % (48/68).

8.

Käesolevas katsemeetodis käsitletakse in vitro nahasöövitust. Meetod võimaldab teha kooskõlas ÜRO GHSi / CLP-määrusega kindlaks mittesöövitavad ja söövitavad uuritavad kemikaalid. Nagu nähtub valideerimisuuringutest (8, 9, 10, 11), piirab selle katsemeetodi kasutamist asjaolu, et see ei võimalda liigitada söövitavaid aineid ja segusid ÜRO GHSi / CLP-määruse kohastesse alamkategooriatesse. Käesoleva katsemeetodi kasutusviis määratakse kindlaks kohaldatava õigusraamistikuga. Ehkki käesolev katsemeetod ei võimalda saada piisavat teavet nahaärrituse kohta, tuleks tähele panna, et tervisemõjuna hinnatavat in vitro nahaärritust käsitletakse konkreetselt katsemeetodis B.46 (5). Ühekordse nahakaudse kokkupuute järel nahale avalduva lokaalse toime täielikku hindamist on kirjeldatud OECD juhenddokumendis katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta (6).

9.

Käesoleva katsemeetodi valideerimiseks uuriti paljusid eri kemikaale, peamiselt aineid; valideerimisuuringu empiirilises andmebaasis on 60 ainet paljudest eri kemikaaliklassidest (8, 9). Kokkuvõetuna nähtub olemasolevatest andmetest, et katsemeetod on kasutatav paljude eri kemikaaliklasside ja eri füüsikalises olekus ainete, sealhulgas vedelike, pooltahkete ja tahkete ainete ning vahade puhul. Tuleks märkida, et kuna teatud kindlate füüsikaliste olekute puhul ei ole sobivate võrdlusandmetega katseained hõlpsalt kättesaadavad, on valideerimise käigus hinnatud suhteliselt väikest arvu vahasid ja tahkeid söövitavaid aineid. Vedelikud võivad olla vesilahused või muud vedelikud; tahked ained võivad olla vees lahustuvad või lahustumatud. Kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa teatud kindla kategooria ainete puhul kasutada, tuleks hoiduda selle kasutamisest sellise kategooria ainete puhul. Peale selle saab käesolevat katsemeetodit ainete kõrval eeldatavalt kasutada ka segude puhul. Ent kuna segud kuuluvad paljudesse eri kategooriatesse ja on eri koostisega ning nende kasutamise kohta katses on praegu piiratud hulgal teavet, tuleks juhul, kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa teatud kindla kategooria segude puhul kasutada (nt strateegia abil, mille on 2012. aastal välja pakkunud Eskes et al.) (18), hoiduda selle kasutamisest sellise kategooria segude puhul. Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud. Gaase ja aerosoole ei ole valideerimisuuringutes veel hinnatud (8, 9). Ehkki on võimalik, et neidki saab uurida TET mõõtmisel põhineva katsemeetodiga, ei võimalda praegune katsemeetod gaaside ega aerosoolide uurimist.

KATSE PÕHIMÕTE

10.

Uuritav aine kantakse kuni 24 tunniks nahaketaste marrasknahale kahekambrilises katsesüsteemis, milles nahakettad toimivad kambritevahelise eralduskihina. Nahakettad võetakse humaanselt surmatud 28–30 päeva vanustelt rottidelt. Söövitavad kemikaalid tehakse kindlaks nende võime järgi kahjustada normaalse sarvkihi terviklikkust ja selle toimimist kaitsekihina; see ilmneb mõõdetud TET vähenemisena allapoole läviväärtust (16) (vt punkt 32). Roti naha TET läviväärtuseks on valitud 5 kΩ; selle väärtuse valimisel on lähtutud suurest hulgast andmetest paljude eri ainete kohta, millest valdava enamiku puhul on TET väärtus nimetatud väärtusest selgelt suurem (sageli > 10 kΩ) või selgelt väiksem (sageli < 3 kΩ) (16). Üldjuhul ei põhjusta uuritavad kemikaalid, mis on loomadele mittesöövitavad ning kas ärritavad või mitteärritavad, TET vähenemist kõnealusest läviväärtusest allapoole. Muude nahapreparaatide või seadmete kasutamine võib aga tingida selle läviväärtuse muutmise ning sel juhul on vajalik täiendav valideerimine.

11.

Käesolev katsemeetod hõlmab värvaine sidumise etappi, et võimaldada katseliselt kinnitada TET mõõtmisel saadud positiivseid tulemusi, sealhulgas juhul, kui saadud väärtus jääb 5 kΩ lähedusse. Värvaine sidumise etapis tehakse kindlaks, kas ioonilise läbitavuse suurenemine on tingitud sarvkihi füüsilisest hävimisest. On tõendatud, et roti naha TET mõõtmisel põhineva meetodiga saab prognoosida katsemeetodi B.4 abil hinnatavat in vivo söövitavat toimet küülikul (2).

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

12.

Enne käesolevale katsemeetodile vastava, roti naha TET mõõtmisel põhineva katsemeetodi regulaarset kasutamist tuleks labori tehnilise pädevuse tõendamiseks õigesti liigitada kaksteist tabelis 1 loetletud soovitatavat pädevusainet. Kui mõni loetletud ainetest ei ole kättesaadav või kui see on põhjendatav, võib kasutada mõnda muud ainet, mille kohta on olemas piisavad in vivo ja in vitro võrdlusandmed (nt võrdluskemikaalide loetelust (16) valitud ainet), ent üksnes juhul, kui kohaldatakse samu valikukriteeriume, nagu on kirjeldatud tabelis 1.

Tabel 1

Pädevusainete loetelu  (2)

Aine

CASi nr

Kemikaaliklass (3)

ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane in vivo tulemustel põhinev kategooria (4)

VSMga saadud in vitro tulemustel põhinev kategooria

Füüsikaline olek

pH (5)

In vivo söövitavad ained

N,N’-dimetüüldipropüleentriamiin

10563-29-8

Orgaaniline alus

1A

6 × S

V

8,3

1,2-diaminopropaan

78-90-0

Orgaaniline alus

1A

6 × S

V

8,3

Väävelhape (10 %)

7664-93-9

Anorgaaniline hape

(1A/)1B/1C

5 × S 1 × MS

V

1,2

Kaaliumhüdroksiid (10 % vesilahus)

1310-58-3

Anorgaaniline alus

(1A/)1B/1C

6 × S

V

13,2

Oktaanhape (kaprüülhape)

124-07-2

Orgaaniline hape

1B/1C

4 × S 2 × MS

V

3,6

2-tert-butüülfenool

88-18-6

Fenool

1B/1C

4 × S 2 × MS

V

3,9

In vivo mittesöövitavad ained

Isostearhape

2724-58-5

Orgaaniline hape

MS

6 × MS

V

3,6

4-amino-1,2,4-triasool

584-13-4

Orgaaniline alus

MS

6 × MS

T

5,5

Fenetüülbromiid

103-63-9

Elektrofiil

MS

6 × MS

V

3,6

4-(metüültio)bensaldehüüd

3446-89-7

Elektrofiil

MS

6 × MS

V

6,8

1,9-dekadieen

1647-16-1

Neutraalne orgaaniline aine

MS

6 × MS

V

3,9

Tetrakloroetüleen

127-18-4

Neutraalne orgaaniline aine

MS

6 × MS

V

4,5

Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i registrinumber; MS – mittesöövitav; S – söövitav; T – tahkis; V – vedelik; VSM – valideeritud standardmeetod.

KATSE KÄIK

13.

Standardne töökord roti naha TET-l põhineva, nahasöövituse hindamist võimaldava katsemeetodi rakendamiseks on leitav kirjandusest (19). Käesoleva katsemeetodi kohases roti naha TET mõõtmise katses peaksid olema täidetud järgmised tingimused.

Loomad

14.

Tuleks kasutada rotte, sest nende naha tundlikkus ainetele käesoleva katsemeetodi kasutamisel on juba tõendatud (12) ning tegemist on ainsa nahaallikaga, mis on ametlikult valideeritud (8, 9). Väga oluline on roti vanus (naha võtmise hetkel) ja päritoluliin, kuna tuleks tagada, et karvanääpsud on uinuvas olekus ja täiskasvanud looma karvakasv ei ole veel alanud.

15.

Noorte, umbes 22 päeva vanuste (Wistari või sellega võrreldavast liinist pärit) emas- või isasrottide selja- ja küljekarv eemaldatakse hoolikalt väikeste kääridega. Seejärel pestakse loomi hoolikalt pühkimise teel ning pügatud piirkond kastetakse üleni antibiootikumilahusesse (mis sisaldab näiteks streptomütsiini, penitsilliini, klooramfenikooli ja amfoteritsiini kontsentratsioonis, mille juures bakterite kasv on pärsitud). Loomi pestakse antibiootikumidega uuesti kolmandal või neljandal päeval pärast esimest pesu ning kasutatakse kolme päeva jooksul pärast teist pesu, kui sarvkiht on karvade eemaldamisest taastunud.

Nahaketaste ettevalmistamine

16.

Loomad surmatakse humaanselt 28–30 päeva vanuses; see vanus on väga oluline. Seejärel eemaldatakse iga looma selja- ja küljenahk ning tõmmatakse sellelt ettevaatlikult maha liigne nahaalune rasvakiht. Lõigatakse välja nahakettad läbimõõduga umbes 20 mm. Nahka võib enne ketaste kasutamist säilitada, kui on tõendatud, et sellise naha puhul positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud tulemused on samaväärsed värske naha kasutamisel saadud tulemustega.

17.

Iga nahaketas asetatakse polütetrafluoroetüleentoru (PTFE-toru) ühele otsale nii, et marrasknaha pind on toruga kontaktis. Toru otsa surutakse naha paigal hoidmiseks kummist rõngastihend ja liigne kude lõigatakse ära. Seejärel tihendatakse kummist rõngastihendi ja PTFE-toru ühenduskoht hoolikalt vaseliiniga. Toru asetatakse vastuvõtunõusse, mis sisaldab MgSO4 lahust (154 mM), ja kinnitatakse vedruklambriga (joonis 1). Nahaketas peaks jääma üleni MgSO4 lahusesse. Ühe roti nahast võib saada 10–15 nahaketast. Toru ja rõngastihendi mõõtmed on esitatud joonisel 2.

18.

Enne katse algust mõõdetakse iga looma naha kvaliteedi kontrollimiseks kahe nahaketta transkutaanne elektritakistus. Kummagi ketta elektritakistus peaks olema suurem kui 10 kΩ, et ülejäänud kettaid oleks võimalik katses kasutada. Kui takistus on väiksem kui 10 kΩ, tuleks kõik ülejäänud sellest nahast saadud kettad ära visata.

Uuritavate kemikaalide ja kontrollainetega töötlemine

19.

Katsemudeli piisava töökindluse tõendamiseks tuleks igas mõõtmistsüklis (katses) kasutada paralleelset positiivset ja negatiivset kontrolli. Igas eraldi mõõtmistsüklis (katses) tuleks kasutada ühelt ja samalt loomalt saadud nahakettaid. Soovitatavad positiivse ja negatiivse kontrolli ained on vastavalt 10 M soolhape ja destilleeritud vesi.

20.

Vedelad uuritavad kemikaalid (150 μl) kantakse ühtlaselt toru sees olevale marrasknahale. Tahke aine uurimisel kantakse see ühtlaselt nahakettale piisavas koguses, et kogu marrasknaha pind saaks kaetud. Tahkele ainele lisatakse deioniseeritud vett (150 μl) ja toru loksutatakse ettevaatlikult. Nahaga maksimaalse kontakti saavutamiseks võib olla vaja uuritavat tahket kemikaali sulatamiseks või pehmendamiseks kuni 30 °C-ni soojendada või seda teralise materjali või pulbri saamiseks peenestada.

21.

Iga uuritava kemikaali ja kontrollaine jaoks kasutatakse igas mõõtmistsüklis (katses) kolme nahaketast. Uuritavat kemikaali hoitakse temperatuuril 20–23 °C nahaga kontaktis 24 tundi. Seejärel pestakse nahka uuritava kemikaali eemaldamiseks toatemperatuuril oleva või jahedama kraanivee joaga, kuni materjali enam ei eraldu.

TET mõõtmine

22.

Naha impedantsi määramiseks mõõdetakse TETd madalpingel töötava Wheatstone’i vahelduvvoolusilla abil (18). Mõõtesilla üldised tehnilised näitajad on järgmised: tööpinge 1–3 V, siinus- või ristkülikvahelduvvool sagedusega 50–1 000 Hz ja mõõtepiirkond vähemalt 0,1–30 kΩ. Valideerimisuuringus kasutatud mõõtesillaga mõõdeti sagedusel 100 Hz või 1 kHz induktiivsust, mahtuvust ja takistust väärtuseni vastavalt 2 000 H, 2 000 μF või 2 MΩ; seejuures kasutati jada- või rööpühenduse puhul saadud näitusid. TET-põhises söövitavuskatses mõõdetakse takistust sagedusel 100 Hz ning kasutatakse jadaühenduse puhul saadud näitusid. Enne elektritakistuse mõõtmist lisatakse naha pindpinevuse vähendamiseks 70-protsendilist etanooli koguses, millest piisab marrasknaha katmiseks. Mõne sekundi pärast eemaldatakse etanool torust ja koe niisutamiseks lisatakse 3 ml MgSO4 lahust (154 mM). Nahakettast kummalegi poole paigutatakse mõõtesilla elektroodid, et mõõta nahaketta takistust kilo-oomides (joonis 1). Elektroodide mõõtmed ja hammasklambrist allapoole ulatuva elektroodiosa pikkus on esitatud joonisel 2. Sisemisele elektroodile kinnitatav klamber toetatakse takistuse mõõtmise ajaks PTFE-toru otsale, et elektrood ulatuks alati samas pikkuses MgSO4 lahusesse. Välimine elektrood paigutatakse vastuvõtunõusse nii, et see toetub nõu põhjale. Vedruklambri ja PTFE-toru põhja vahelist kaugust hoitakse konstantsena (joonis 2), sest see kaugus mõjutab saadavat takistuse väärtust. Seega peaks vahemaa sisemise elektroodi ja nahaketta vahel olema konstantne ja minimaalne (1–2 mm).

23.

Kui mõõdetud takistuse väärtus on üle 20 kΩ, võib see olla tingitud uuritava kemikaali jääkidest nahaketta marrasknaha pinnal. Võib proovida neid jääke veel kord eemaldada, näiteks sulgeda PTFE-toru kinnastatud pöidlaga ja loksutada seda umbes kümme sekundit; MgSO4 lahus valatakse ära ja takistuse mõõtmist korratakse värske MgSO4 lahusega.

24.

Katseseadme omadused ja mõõtmed ning katse läbiviimise kord võivad mõjutada saadavaid TET väärtusi. Söövitavuse läviväärtus 5 kΩ on kehtestatud käesolevas katsemeetodis kirjeldatud konkreetse seadme ja mõõtmismeetodiga saadud andmete põhjal. Katsetingimuste muutmisel või teistsuguse seadme kasutamisel võivad lävi- ja kontrollväärtused olla teised. Seepärast on vaja selle meetodi ja takistuse läviväärtuste kaliibrimiseks teha mõõtmisi pädevusainetega, mis on valitud valideerimisuuringus kasutatud ainete hulgast (8, 9) või kemikaaliklassidest, mis on sarnased uuritavate ainete klassidega. Sobivate pädevusainete loetelu on esitatud tabelis 1.

Värvaine sidumisel põhinevad meetodid

25.

Teatavate mittesöövitavate ainetega kokkupuutumise tulemusena võib takistus muutuda läviväärtusest 5 kΩ väiksemaks, kuna sellised ained võimaldavad ioonidel läbi sarvkihi liikuda ja vähendavad seeläbi elektritakistust (9). Näiteks võivad pindaktiivsed neutraalsed orgaanilised ained ja kemikaalid (sealhulgas detergendid, emulgaatorid ja muud pindaktiivsed ained) eemaldada nahast lipiidid ning muuta kaitsekihi ioonidele paremini läbitavaks. Seepärast tuleks juhul, kui selliste kemikaalide puhul täheldatav TET väärtus on nahaketaste nähtavate kahjustuste puudumise korral umbes 5 kΩ või sellest väiksem, hinnata nii kontroll- kui ka katsekoe puhul värvaine imendumist, et teha kindlaks, kas saadud TET väärtus oli põhjustatud naha suurenenud läbilaskvusest või söövitusest (7, 9). Viimasel juhul tungib värvaine sulforodamiin B nahapinnale kantuna vigastatud sarvkihi kohalt kiiresti naha sisse ja põhjustab sarvkihialuste kudede värvumise. See konkreetne värvaine on püsiv paljude kemikaalide suhtes ning seda ei mõjuta allpool kirjeldatud ekstraheerimine.

Värvaine sulforodamiin B pealekandmine ja eemaldamine

26.

Pärast TET määramist valatakse magneesiumsulfaat torust välja ja nahka uuritakse hoolikalt silmanähtavate kahjustuste suhtes. Kui silmanähtavaid suuri kahjustusi (nt perforatsiooni) ei esine, kantakse iga nahaketta marrasknaha pinnale kaheks tunniks 150 μl värvaine sulforodamiin B (happeline punane 52; CI number: 45100; CASi number: 3520-42-1) 10-protsendilist (massiühikutes mahuühiku kohta) lahust destilleeritud vees. Seejärel pestakse nahakettaid toatemperatuuril oleva või jahedama kraaniveega umbes kümme sekundit liigse/seondumata värvaine eemaldamiseks. Iga nahaketas eemaldatakse ettevaatlikult PTFE-torult ja asetatakse viaali (nt 20-milliliitrisesse klaasist stsintillatsiooniviaali), mis sisaldab deioniseeritud vett (8 ml). Viaale loksutatakse ettevaatlikult viis minutit, et eemaldada kogu seondumata värvaine. Loputamist korratakse ning seejäreleemaldatakse nahakettad ja pannakse viaalidesse, mis sisaldavad 5 ml 30-protsendilist (massiühikutes mahuühiku kohta) naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) lahust destilleeritud vees, ning kettaid inkubeeritakse temperatuuril 60 °C hommikuni.

27.

Pärast inkubeerimist nahakettad eemaldatakse ja visatakse ära ning järelejäänud lahust tsentrifuugitakse kaheksa minutit temperatuuril 21 °C (suhtelise tsentrifugaaljõuga ~175 g). Seejärel lahjendatakse supernatandist võetud 1 ml suurust proovi mahuliselt viis korda (st 1 ml + 4 ml) 30-protsendilise (massiühikutes mahuühiku kohta) SDSi lahusega destilleeritud vees. Lahuse optilist tihedust mõõdetakse lainepikkusel 565 nm.

Värvaine sisalduse arvutamine

28.

Värvaine sulforodamiin B sisaldus ketta kohta arvutatakse optilise tiheduse väärtuste alusel (9) (sulforodamiin B molaarne ekstinktsioonikoefitsient lainepikkusel 565 nm on 8,7 × l04ja molekulmass 580). Sobiva kaliibrimiskõvera abil määratakse värvainesisaldus iga nahaketta puhul ning seejärel arvutatakse paralleelproovide keskmine värvainesisaldus.

Katse nõuetekohasuse kriteeriumid

29.

Saadud TET keskväärtus on vastuvõetav, kui paralleelse positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud väärtused jäävad katset läbi viivas laboris käesoleva meetodi kasutamise puhul vastuvõetavasse väärtusevahemikku. Vastuvõetavad takistusevahemikud eespool kirjeldatud metoodika ja seadme puhul on esitatud järgmises tabelis.

Kontroll

Aine

Takistusevahemik (kΩ)

Positiivne

10 M soolhape

0,5–1,0

Negatiivne

Destilleeritud vesi

10–25

30.

Värvaine sidumist iseloomustavad keskväärtused on vastuvõetavad tingimusel, et paralleelsete kontrollidega saadud väärtused jäävad kõnealuse meetodi puhul vastuvõetavasse vahemikku. Kontrollainete jaoks soovitatavad vastuvõetavad värvainesisalduse vahemikud on eespool kirjeldatud metoodika ja seadme puhul järgmised.

Kontroll

Aine

Värvainesisalduse vahemik (μg ketta kohta)

Positiivne

10 M soolhape

40–100

Negatiivne

Destilleeritud vesi

15–35

Tulemuste tõlgendamine

31.

TET läviväärtus, mis võimaldab eristada söövitavaid uuritavaid kemikaale mittesöövitavatest, määrati kindlaks katsemeetodi optimeerimise käigus, seda kontrolliti valideerimiseelses etapis ning selle sobivus leidis kinnitust ametlikus valideerimisuuringus.

32.

Allpool on esitatud roti naha TET-l põhineva, nahasöövituse hindamist võimaldava katsemeetodi puhul kasutatav prognoosimudel (9, 19), mis on seotud ÜRO GHSi / CLP-määruse kohase klassifitseerimissüsteemiga.

Uuritav kemikaal loetakse nahka mitte söövitavaks, kui:

i)

uuritava kemikaali puhul saadud TET keskväärtus on suurem kui (>) 5 kΩ või

ii)

uuritava kemikaali puhul saadud TET keskväärtus on sama suur või väiksem kui (≤) 5 kΩ ning

nahaketastel ei täheldata silmanähtavaid kahjustusi (nt perforatsiooni) ja

nahaketaste keskmine värvainesisaldus on väiksem kui (<) paralleelse positiivse kontrollina kasutatud 10 M HCl-ga töödeldud nahaketaste keskmine värvainesisaldus (positiivset kontrolli iseloomustavad väärtused on esitatud punktis 30).

Uuritav kemikaal loetakse nahka söövitavaks, kui:

i)

uuritava kemikaali puhul saadud TET keskväärtus on sama suur või väiksem kui (≤) 5 kΩ ning nahakettad on silmanähtavalt kahjustatud (nt perforeeritud) või

ii)

uuritava kemikaali puhul saadud TET keskväärtus on sama suur või väiksem kui (≤) 5 kΩ ning

nahaketastel ei täheldata silmanähtavaid kahjustusi (nt perforatsiooni), kuid

nahaketaste keskmine värvainesisaldus on sama suur või suurem kui (≥) paralleelse positiivse kontrollina kasutatud 10 M HCl-ga töödeldud nahaketaste keskmine värvainesisaldus (positiivset kontrolli iseloomustavad väärtused on esitatud punktis 30).

33.

Ühese klassifitseerimistulemuse puhul peaks piisama ühest mõõtmistsüklist (katsest), mille käigus analüüsitakse uuritava kemikaali toimet paralleelselt vähemalt kolmele nahakettale. Ebaselgete tulemuste puhul – näiteks kui paralleelproovidega saadud mõõtmisandmed lahknevad ja/või TET keskväärtus on 5 ± 0,5 kΩ – tuleks kaaluda vajadust viia läbi veel üks sõltumatu mõõtmistsükkel (katse) ning esimeses kahes mõõtmistsüklis (katses) saadud tulemuste lahknevuse korral veel kolmaski mõõtmistsükkel (katse).

ANDMED JA ARUANDLUS

Andmed

34.

Uuritava kemikaali ning positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud takistuse väärtused (kΩ) ja vajaduse korral värvainesisalduse väärtused (μg ketta kohta) tuleks esitada tabelina, millesse kantakse igas mõõtmistsüklis (katses) iga üksiku paralleelproovina kasutatud kettaga saadud andmed ning samuti keskväärtused ± standardhälve. Esitatakse kõikide korduskatsete tulemused. Iga uuritava kemikaali puhul tuleks esitada teave nahaketastes täheldatud kahjustuste kohta.

Katseprotokoll

35.

Katseprotokollis tuleks esitada järgmine teave.

 

Uuritav kemikaal ja kontrollained:

ühest koostisosast koosnev aine: kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;

mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu: võimalikult täpne omaduste kirjeldus lähtuvalt koostisosade keemilisest määratlusest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest;

füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;

allikas ja partii number, kui see on olemas;

vajaduse korral teave uuritava kemikaali / kontrollaine töötlemise kohta enne katset (näiteks soojendamine, peenestamine);

uuritava kemikaali püsivus ja aegumiskuupäev või kordusanalüüsi tegemise tähtpäev, kui see on teada;

säilitustingimused.

 

Katseloomad:

kasutatud liin ja sugu;

loomade vanus doonorloomana kasutamise hetkel;

päritolu, pidamistingimused, söötmisandmed jne;

naha ettevalmistamise üksikasjad.

 

Katsetingimused:

katseseadme kaliibrimiskõverad;

värvaine sidumise katset iseloomustavad kaliibrimiskõverad, optilise tiheduse mõõtmiseks kasutatud ribafiltri spektrivahemik ja vajaduse korral mõõteseadmega (nt spektrofotomeetriga) saavutatav optilise tiheduse väärtuste lineaarsusvahemik;

TET mõõtmise meetodi üksikasjad;

vajaduse korral üksikasjalik teave värvaine sidumise hindamiseks kasutatud meetodi kohta;

katses kasutatud annused, kokkupuuteperioodi(de) kestus ja kokkupuutetemperatuur(id);

kokkupuuteperioodi järgsete pesemistoimingute üksikasjad;

iga uuritava kemikaali ja kontrollide (positiivse ja negatiivse kontrolli) puhul paralleelproovidena kasutatud nahaketaste arv;

kõikide katsemeetodis tehtud muudatuste kirjeldus;

viide varasematele andmetele mudeli kohta. See hõlmab vähemalt järgmisi aspekte:

i)

positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud, kilo-oomides väljendatud TET väärtuste vastuvõetavus lähtuvalt positiivset ja negatiivset kontrolli iseloomustavatest takistusevahemikest;

ii)

positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud, nahaketta kohta mikrogrammides väljendatud värvainesisalduse väärtuste vastuvõetavus lähtuvalt positiivset ja negatiivset kontrolli iseloomustavatest värvainesisalduse vahemikest;

iii)

katsetulemuste vastuvõetavus lähtuvalt paralleelproovidena kasutatud nahaketastega saadud varasemate tulemuste varieeruvusest;

kasutatud otsustuskriteeriumide/prognoosimudeli kirjeldus.

 

Tulemused:

TET mõõtmise katsetes ja vajaduse korral värvaine sidumise katsetes iga uuritava kemikaali ja kontrolliga saadud, tabelina esitatavad andmed iga mõõtmistsükli (katse) ja iga paralleelproovina kasutatud nahaketta (iga üksiku looma ja nahaproovi) kohta, samuti vastavad keskväärtused, standardhälbed ja variatsioonikordajad;

mis tahes täheldatud toime kirjeldus;

klassifitseerimistulemused lähtuvalt kasutatud prognoosimudelist/otsustuskriteeriumidest.

 

Tulemuste arutelu

 

Järeldused

KIRJANDUS

(1)

Ühinenud Rahvaste Organisatsioon (ÜRO) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Viies, täiendatud väljaanne. ÜRO, New York ja Genf. Kättesaadav aadressil [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Käesoleva lisa peatükk B.4 „Äge nahaärritus/-söövitus“.

(3)

Käesoleva lisa peatükk B.40b „In vitro nahasöövitus: inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinev katsemeetod“.

(4)

Käesoleva lisa peatükk B.65 „In vitro membraanibarjääri katsemeetod nahasöövituse uurimiseks“.

(5)

Käesoleva lisa peatükk B.46 „In vitro nahaärritus: inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinev katsemeetod“.

(6)

OECD (2014). Guidance Document on an Integrated Approach to Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 203. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(7)

Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P., ja Balls, M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23: 219–255.

(8)

Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem J. H., Gerner I., Walker A. P., ja Worth, A. P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 12: 471–482.

(9)

Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhütter, H.-G., ja Liebsch, M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol. In Vitro 12: 483–524.

(10)

Balls, M., Blaauboer, B. J., Fentem, J. H., Bruner, L., Combes, R. D., Ekwall, B., Fielder, R. J., Guillouzo, A., Lewis, R. W., Lovell, D. P., Reinhardt, C. A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., ja Zucco, F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops. ATLA 23: 129–147.

(11)

Alternatiivsete meetodite valideerimise ametitevaheline koordineerimiskomitee (ICCVAM) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity). Koostanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC10), 3. aprill 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26: 275–280.

(14)

ICCVAM (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion Testing as described in TG 430. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 218. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

(16)

Oliver, G. J. A., Pemberton, M. A., ja Rhodes, C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test – Modifications and Validation. Food Chem. Toxicol. 24: 507–512.

(17)

Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D. J., ja Gardner, J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6: 191–194.

(18)

Eskes, C., Detappe, V., Koëter, H., Kreysa, J., Liebsch, M., Zuang, V., Amcoff, P., Barroso, J., Cotovio, J., Guest, R., Hermann, M., Hoffmann, S., Masson, P., Alépée, N., Arce, L. A., Brüschweiler, B., Catone, T., Cihak, R., Clouzeau, J., D’Abrosca, F., Delveaux, C., Derouette, J. P., Engelking, O., Facchini, D., Fröhlicher, M., Hofmann, M., Hopf, N., Molinari, J., Oberli, A., Ott, M., Peter, R., Sá-Rocha, V. M., Schenk, D., Tomicic, C., Vanparys, P., Verdon, B., Wallenhorst, T., Winkler, G. C., ja Depallens, O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 62: 393–403.

(19)

TET mõõtmise standardne töökord (detsember 2008). Andmebaasi INVITTOX katse-eeskiri nr 115 „Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test“.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 34. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.

Joonis 1

Roti Naha Tet Mõõtmiseks Kasutatav Seade

Image 2

Joonis 2

Polütetrafluoroetüleentoru (Ptfe-Toru) Ja Vastuvõtunõu Ning Kasutatavate Elektroodide Mõõtmed

Image 3

Olulised tegurid eespool kujutatud seadme puhul:

PTFE-toru siseläbimõõt;

elektroodide pikkus peaks PTFE-toru ja vastuvõtunõuga võrreldes olema selline, et nahaketas ei puutuks vastu elektroode ja elektroodid oleks teatavas standardpikkuses MgSO4 lahusega kokkupuutes;

MgSO4 lahuse hulk vastuvõtunõus peaks olema selline, et vedeliku sügavus võrreldes PTFE-torus oleva vedeliku tasemega vastaks joonisel 1 näidatule;

nahaketas peaks olema kinnitatud PTFE-toru külge piisavalt hästi, et elektritakistus iseloomustaks tõeselt naha omadusi.

Liide

MÕISTED

Aine – looduslik või mis tahes tootmisprotsessi tulemusena saadud keemiline element või selle ühend koos püsivuse tagamiseks vajalike lisaainete ja tootmisprotsessi käigus tekkinud lisanditega, mis ei hõlma siiski lahusteid, mida on võimalik aine püsivust mõjutamata või selle koostist muutmata ainest eraldada.

Asjakohasus – näitaja, mille abil kirjeldatakse, kuivõrd katsemeetod võimaldab uurida huvipakkuvat toimet, kas selle kasutamine on mõttekas ja kas see on konkreetse eesmärgi jaoks sobiv. Asjakohasusest nähtub, mil määral saab katsemeetodiga õigesti mõõta või ennustada huvipakkuvat bioloogilist toimet. Asjakohasuse puhul võetakse arvesse ka katsemeetodiga saavutatavat täpsust (vastavust) (20).

GHS (ÜRO ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem) – süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ainete ja segude) klassifitseerimine vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud liigile ja tasemele ning mis hõlmab selliseid asjaomaseid teavituselemente nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ning keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku toime kohta (1).

In vivo nahasöövitus – pöördumatu nahakahjustuse tekkimine, st läbi marrasknaha pärisnahani ulatuva nähtava nekroosi tekkimine pärast uuritava kemikaali pealekandmist kuni neljaks tunniks. Tüüpilised söövitusnähud on haavandid, verejooks, verised kärnad ning 14-päevase vaatlusperioodi lõpuks ilmnev värvimuutus naha valastumise tõttu, täielik alopeetsia ja armistumine. Ebaselgete kahjustuste hindamiseks tuleks kaaluda histopatoloogilise analüüsi tegemist.

Kemikaal – aine või segu.

Mitmest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja milles enam kui ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 10, kuid väiksem kui 80 massiprotsenti. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse tootmisprotsessi tulemusena. Erinevus segu ja mitmest koostisosast koosneva aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokkusegamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitmest koostisosast koosnev aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel.

MS – mittesöövitav.

(Mõõtmis)tsükkel – ühe uuritava kemikaali analüüsimine üheaegselt vähemalt kolmel paralleelproovina kasutataval nahakettal.

Positiivne kontroll – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida on töödeldud ainega, millega teadaolevalt saadakse positiivne tulemus. Positiivse tulemuse väärtus ei tohiks olla liiga suur, et võimaldada hinnata positiivse kontrolliga saadud tulemuste varieeruvust ajas.

S – söövitav.

Segu – kahest või enamast ainest koosnev segu või lahus.

Spetsiifilisus – katsemeetodiga õigesti negatiivseks/reaktsioonivõimetuks liigitatud kemikaalide osakaal kõikide negatiivsete kemikaalide hulgas. Spetsiifilisus kajastab sellise katsemeetodi täpsust, millega saadakse kategoriseeritav tulemus, ning see on oluline näitaja katsemeetodi asjakohasuse hindamiseks (20).

Transkutaanne elektritakistus (TET) – naha elektrilise impedantsi näitaja, mida väljendatakse takistusena kilo-oomides. Lihtne ja töökindel meetod kaitsekihina toimimise hindamiseks Wheatstone’i sillana töötava seadme abil, millega registreeritakse nahka läbiv ioonivoog.

Tulemuslikkuse standardid – valideeritud katsemeetodil põhinevad standardid, mille alusel hinnatakse mehhanismilt ja tööpõhimõttelt sarnase kavandatud katsemeetodi võrreldavust. Need hõlmavad: i) katsemeetodi olulisi elemente, ii) valideeritud katsemeetodi vastuvõetava tulemuslikkuse tõendamiseks kasutatud kemikaalide hulgast valitud võrdluskemikaalide miinimumloetelu ja iii) võrreldavat usaldusväärsuse ja täpsuse taset, mille puhul on lähtutud valideeritud katsemeetodiga saadud tulemustest ja mis tuleks saavutada kavandatud katsemeetodi hindamisel võrdluskemikaalide miinimumloetelu kasutamise teel.

Tundlikkus – katsemeetodiga õigesti positiivseks/reaktsioonivõimeliseks liigitatud kemikaalide osakaal kõikide positiivsete kemikaalide hulgas. Tundlikkus kajastab sellise katsemeetodi täpsust, millega saadakse kategoriseeritav tulemus, ning see on oluline näitaja katsemeetodi asjakohasuse hindamiseks (20).

Täpsus – katsemeetodiga saadud tulemuste ja vastuvõetavate võrdlusväärtuste kooskõla määr. Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda mõistet kasutatakse sageli vastavuse tähenduses, et väljendada katsemeetodiga saadud õigete tulemuste osakaalu (20).

Usaldusväärsus – näitaja, mis iseloomustab katsemeetodiga saadud tulemuste reprodutseeritavust pikema aja jooksul samas laboris ja eri laborites, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse laborisisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus (20).

Uuritav kemikaal – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.

UVCB – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.

Vastavus – katsemeetodi tulemuslikkuse näitaja katsemeetodite puhul, millega saadakse kategoriseeritav tulemus; üks asjakohastest aspektidest. Seda mõistet kasutatakse mõnikord täpsuse tähenduses ja see on määratletud kui õigesti positiivseks või negatiivseks liigitatud kemikaalide osakaal kõikide uuritud kemikaalide seas. Vastavus sõltub väga suurel määral positiivsete tulemuste osakaalust uuritavale kemikaalile vastavat liiki kemikaalide hulgas (20).

Ühest koostisosast koosnev aine – aine, mis on määratletud kvantitatiivse koostise alusel ja mille ühe põhikoostisosa sisaldus on vähemalt 80 massiprotsenti.

6)

B osas asendatakse peatükk B.40b järgmisega:

„B.40b.    IN VITRO NAHASÖÖVITUS: INIMESE REKONSTRUEERITUD MARRASKNAHAL PÕHINEV KATSEMEETOD

SISSEJUHATUS

1.

Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 431 (2016). Nahasöövituse all mõistetakse läbi marrasknaha pärisnahani ulatuva nähtava nekroosina avalduva pöördumatu nahakahjustuse tekkimist pärast uuritava kemikaaliga töötlemist, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (1) ning Euroopa Liidu (EL) määruses nr 1272/2008, milles käsitletakse ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (edaspidi „CLP-määrus“) (6). Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi B.40b näol on tegemist in vitro meetodiga, mis võimaldab tuvastada mittesöövitavaid ja söövitavaid aineid ja segusid kooskõlas ÜRO GHSi ja CLP-määrusega. Meetodiga on osaliselt võimalik liigitada söövitavaid kemikaale alamkategooriatesse.

2.

Kemikaalide võimaliku nahka söövitava toime hindamisel on tavapäraselt kasutatud laboriloomi (katsemeetod B.4, mis on samaväärne algselt 1981. aastal vastu võetud ning aastatel 1992, 2002 ja 2015 muudetud OECD katsejuhendiga nr 404) (2). Peale käesoleva katsemeetodi B.40b on valideeritud ja vastu võetud veel kaks in vitro katsemeetodit kemikaalide võimaliku nahka söövitava toime tuvastamiseks: katsemeetodid B.40 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 430) (3) ja B.65 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 435) (4). Peale selle on vastu võetud in vitro katsemeetod B.46 (samaväärne OECD katsejuhendiga nr 439) (5) võimaliku nahka ärritava toime hindamiseks. OECD juhenddokumendis nahasöövituse ja -ärrituse puhul kasutatava katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta kirjeldatakse mitut moodulit, milles teabeallikad ja analüüsivahendid on rühmitatud, ning i) antakse suuniseid, kuidas lõimida ja kasutada olemasolevaid katse- ja muid andmeid kemikaalide võimaliku nahka ärritava ja nahka söövitava toime hindamiseks ja ii) pakutakse välja lähenemisviis juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid (6).

3.

Käesolevas katsemeetodis on käsitletud inimtervisega seotud lõppnäitajana nahasöövitust. Selle meetodi puhul kasutatakse inimese rekonstrueeritud marrasknahka, mille saamiseks kasutatakse inimese marrasknaha transformeerumata keratinotsüüte ja mis on oma histoloogiliste, morfoloogiliste, biokeemiliste ja füsioloogiliste omaduste poolest väga sarnane inimese naha pealmiste kihtidega, st marrasknahaga. Vastavasisuline OECD katsejuhend võeti algselt vastu 2004. aastal ja seda ajakohastati 2013. aastal, et lisada täiendavad inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelitel põhinevad katsemeetodid ning võimalus kasutada neid meetodeid selleks, et toetada söövitavate kemikaalide liigitamist alamkategooriatesse, samuti 2015. aastal, et lisada viide juhenddokumendile katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta ning võimaldada ühe eluvõimelisuse mõõtmiseks sobiva alternatiivse meetodi kasutuselevõttu.

4.

Käesolev katsemeetod hõlmab nelja turul kättesaadavat inimese rekonstrueeritud marrasknaha valideeritud katsemudelit. Neist kahe – standardmudeli (SM) EpiSkin™ ja meetodi EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) – puhul on läbi viidud nii valideerimiseelsed uuringud (7) kui ka ametlik valideerimisuuring nahasöövituse hindamiseks (8, 9, 10, 11, 12) (allpool on neile osutatud kui valideeritud standardmeetoditele (VSM)). Kõnealuste uuringute tulemusena esitati soovitus, mille kohaselt võib eespool nimetatud kahte VSMi regulatiivsel eesmärgil kasutada söövitavate (S) ainete eristamiseks mittesöövitavatest (MS) ning peale selle võib mudelit EpiSkin™ kasutada selleks, et toetada söövitavate ainete liigitamist alamkategooriatesse (13, 14, 15). Ülejäänud kahe turul kättesaadava inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva nahasöövituse in vitro katsemudeliga on tulemuslikkuse standarditest lähtuval valideerimisel saadud tulemused, mis on sarnased VSMiga EpiDerm™ saadud tulemustega (16, 17, 18). Need mudelid on SkinEthic™ RHE (7) ja epiCS® (varasema nimega EST-1000) ning neid võib samuti kasutada regulatiivsel eesmärgil, et eristada söövitavaid aineid mittesöövitavatest (19, 20). Valideerimisjärgsete uuringute kohaselt, mille viisid aastatel 2012–2014 läbi inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevate mudelite tootjad vastavalt täiustatud katse-eeskirjale, millega nähakse ette uuritavate kemikaalide põhjustatud mittespetsiifilisest MTT redutseerumisest tulenevad parandused, on kõnealuste meetodite tulemuslikkus nii söövitavate ja mittesöövitavate kemikaalide eristamisel kui ka söövitavate kemikaalide alamkategooriatesse liigitamise toetamisel varem eeldatust suurem (21, 22). Meetodite EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE ja epiCS® puhul saadud valideerimisjärgsete andmete täiendava statistilise analüüsi teel on tehtud kindlaks alternatiivsed prognoosimudelid, mis võimaldavad suurendada nende meetodite ennustusvõimet alamkategooriatesse liigitamisel (23).

5.

Enne kui regulatiivsel eesmärgil nahasöövituse hindamiseks saab VSMide kõrval kasutada mõnda muud inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevat soovitud sarnast või muudetud in vitro katsemeetodit, tuleks teha kindlaks sellise meetodi usaldusväärsus, asjakohasus (täpsus) ja piirangud kavandatava kasutusotstarbe puhul, et tagada selle sarnasus VSMidega kooskõlas tulemuslikkuse standardites sätestatud nõuetega (24), mis on kehtestatud kooskõlas OECD juhenddokumendis nr 34 esitatud põhimõtetega (25). Andmete vastastikune tunnustamine on tagatud üksnes pärast seda, kui tulemuslikkuse standarditele vastav mis tahes välja pakutud uus või ajakohastatud katsemeetod on läbi vaadatud ja asjaomasesse katsejuhendisse lisatud. Kõnealusesse katsejuhendisse lisatud katsemudeleid võib kasutada in vitro nahasöövituse hindamise meetodiga saadavaid katsetulemusi käsitlevate siseriiklike nõuete järgimiseks ning seejuures saadakse kasu andmete vastastikusest tunnustamisest.

MÕISTED

6.

Kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.

LÄHTEKAALUTLUSED

7.

Käesolev katsemeetod võimaldab tuvastada mittesöövitavaid ja söövitavaid aineid ja segusid kooskõlas ÜRO GHSi ja CLP-määrusega. Ühtlasi võimaldab katsemeetod toetada söövitavate ainete ja segude vabatahtlikku liigitamist 1A alamkategooriasse kooskõlas ÜRO GHSiga (1), samuti 1B ja 1C alamkategooriate ühiskategooriasse (21, 22, 23). Käesoleva katsemeetodi piiranguna ei võimalda see teineteisest eristada nahka söövitavaid 1B ja 1C alamkategooria kemikaale kooskõlas ÜRO GHSi ja CLP-määrusega, kuna in vivo nahka söövitavaid 1C alamkategooriasse kuuluvaid tuntud kemikaale on vähe. Katsemudelid EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE ja epiCS® võimaldavad liigitamist alamkategooriatesse (st 1A alamkategooriasse, 1B ja 1C ühiskategooriasse ning mittesöövitavaks).

8.

Valideerimisel, mille tulemusena toetatakse käesoleva katsemeetodiga hõlmatud katsemudelite kasutamist mittesöövitavate ja söövitavate kemikaalide tuvastamiseks, uuriti paljusid eri kemikaale, peamiselt eraldi aineid; valideerimisuuringu empiirilises andmebaasis on 60 kemikaali paljudest eri kemikaaliklassidest (8, 9, 10). Katsed meetodi tundlikkuse, spetsiifilisuse ja täpsuse ning tulemuste laborisisese reprodutseeritavuse tõendamiseks alamkategooriatesse liigitamisel viisid läbi katsemeetodi väljatöötajad ning saadud tulemused vaatas läbi OECD (21, 22, 23). Kokkuvõetuna nähtub olemasolevatest andmetest, et käesolev katsemeetod on kasutatav paljude eri kemikaaliklasside ja eri füüsikalises olekus ainete, sealhulgas vedelike, pooltahkete ja tahkete ainete ning vahade puhul. Vedelikud võivad olla vesilahused või muud vedelikud; tahked ained võivad olla vees lahustuvad või lahustumatud. Võimaluse korral tuleks tahked ained enne kasutamist peeneks pulbriks jahvatada; proovi muul viisil eeltöötlemine ei ole vajalik. Kui on võimalik tõendada, et käesolevas katsemeetodis kirjeldatud katsemudeleid ei saa teatud kindla kategooria uuritavate kemikaalide puhul kasutada, tuleks hoiduda nende kasutamisest sellise kategooria uuritavate kemikaalide puhul. Peale selle saab käesolevat katsemeetodit ainete kõrval eeldatavalt kasutada ka segude puhul. Ent kuna segud kuuluvad paljudesse eri kategooriatesse ja on eri koostisega ning nende kasutamise kohta katses on praegu piiratud hulgal teavet, tuleks juhul, kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa teatud kindla kategooria segude puhul kasutada (nt allikas 26 välja pakutud strateegia abil), hoiduda selle kasutamisest sellise kategooria segude puhul. Kui soovitakse saada kavandatud regulatiivsel eesmärgil andmeid segu kohta, tuleks enne katsemeetodi kasutamist kaaluda, kas ja kuidas see võimaldab saada kõnealusele eesmärgile vastavaid asjakohaseid tulemusi. Selline kaalumine ei ole vajalik, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud. Gaase ja aerosoole ei ole valideerimisuuringutes veel hinnatud (8, 9, 10). Ehkki on võimalik, et neidki saab uurida inimese rekonstrueeritud marrasknaha kasutamisel põhineva tehnoloogia abil, ei võimalda praegune katsemeetod gaaside ega aerosoolide uurimist.

9.

Uuritavad kemikaalid, mis neelavad valgust samas vahemikus kui MTT formasaan, ning vitaalvärvaine MTT otsest MTT formasaaniks redutseerumist põhjustada võivad uuritavad kemikaalid võivad segada kudede eluvõimelisuse mõõtmist ja tingida vajaduse kasutada tulemuste korrigeerimiseks kohandatud kontrolle. Sõltuvalt uuritava kemikaali põhjustatud kõrvalekallete laadist ja MTT formasaani mõõtmise meetodist võib olla vaja kasutada eri liiki kohandatud kontrolle (vt punktid 25–31).

10.

Ehkki käesolev katsemeetod ei võimalda saada piisavat teavet nahaärrituse kohta, tuleks tähele panna, et tervisemõjuna hinnatavat in vitro nahaärritust käsitletakse konkreetselt katsemeetodis B.46, mis põhineb samal inimese rekonstrueeritud marrasknaha katsesüsteemil, ehkki seal kasutatakse teistsugust katse-eeskirja (5). Ühekordse nahakaudse kokkupuute järel nahale avalduva lokaalse toime täielikku hindamist on kirjeldatud OECD juhenddokumendis katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi kohta (6). Nimetatud lähenemisviisiga nähakse ette, et enne elusloomadega katsete tegemise kaalumist viiakse läbi in vitro katsed, mille abil hinnatakse nahasöövitust (näiteks käesolevas katsemeetodis kirjeldatud viisil) ja nahaärritust. Inimese naha kasutamine toimub mõistagi kooskõlas asjaomases riigis kehtivate ja rahvusvaheliste eetiliste tõekspidamiste ja tingimustega.

KATSE PÕHIMÕTE

11.

Uuritav kemikaal kantakse paikselt kolmemõõtmelisele inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelile, mis koosneb inimese marrasknaha transformeerumata keratinotsüütidest, mida on kasvatatud nii, et need moodustavad inimese mitmekihilise tugevalt diferentseerunud marrasknaha mudeli. See koosneb korrastatud basaalkihist, ogakihist ja sõmerkihist ning mitmekihilisest sarvkihist, mis sisaldab rakkudevahelisi õhukesi lipiidikihte, kus on analoogselt in vivo koele esindatud peamiste lipiidiklasside lipiidid.

12.

Inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva katsemeetodi puhul lähtutakse eeldusest, et söövitavad kemikaalid suudavad difusiooni või erosiooni teel tungida läbi sarvkihi ja on sellest allpool paiknevate kihtide rakkudele tsütotoksilised. Rakkude eluvõimelisuse hindamiseks jälgitakse vitaalvärvaine MTT (3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid; tiasolüülsinise tetrasooliumbromiid; CASi number: 298-93-1) ensümaatilist muundumist siniseks formasaansoolaks, mida mõõdetakse kvantitatiivselt pärast kudedest ekstraheerimist (27). Söövitavad kemikaalid tehakse kindlaks nende võime järgi vähendada rakkude eluvõimelisust nii palju, et see jääb allapoole kindlaksmääratud läviväärtust (vt punktid 35 ja 36). On tõendatud, et inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinev nahasöövituse hindamiseks kasutatav katsemeetod võimaldab prognoosida katsemeetodi B.4 kohaselt mõõdetavat nahka söövitavat in vivo toimet küülikutel (2).

PÄDEVUSE TÕENDAMINE

13.

Enne käesoleva katsemeetodi kohasest neljast inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhinevast valideeritud katsemudelist ükskõik millise regulaarset kasutamist tuleks labori tehnilise pädevuse tõendamiseks õigesti liigitada kaksteist tabelis 1 loetletud pädevusainet. Kui asjaomast meetodit kasutatakse täpsemaks liigitamiseks, tuleks tõendada ka õigesti alamkategooriatesse liigitamise võimekust. Kui mõni loetletud ainetest ei ole kättesaadav või kui see on põhjendatav, võib kasutada mõnda muud ainet, mille kohta on olemas piisavad in vivo ja in vitro võrdlusandmed (nt võrdluskemikaalide loetelust (24) valitud ainet), ent üksnes juhul, kui kohaldatakse samu valikukriteeriume, nagu on kirjeldatud tabelis 1.

Tabel 1

Pädevusainete loetelu  (8)

Aine

CASi nr

Kemikaaliklass (9)

ÜRO GHSi / CLP-määruse kohane in vivo tulemustel põhinev kategooria (10)

VSMga saadud in vitro tulemustel põhinev kategooria (11)

MTT redutseerija (12)

Füüsikaline olek

In vivo söövitavad 1A alamkategooria kemikaalid

Bromoäädikhape

79-08-3

Orgaaniline hape

1A

(3) 1A

T

Boortrifluoriiddihüdraat

13319-75-0

Anorgaaniline hape

1A

(3) 1A

V

Fenool

108-95-2

Fenool

1A

(3) 1A

T

Dikloroatsetüülkloriid

79-36-7

Elektrofiil

1A

(3) 1A

V

In vivo söövitavad 1B ja 1C alamkategooriate ühiskategooria kemikaalid

Glüoksüülhappe monohüdraat

563-96-2

Orgaaniline hape

1B/1C

(3) 1B/1C

T

Piimhape

598-82-3

Orgaaniline hape

1B/1C

(3) 1B/1C

V

Etanoolamiin

141-43-5

Orgaaniline alus

1B

(3) 1B/1C

J

Viskoosne

Soolhape (14,4 %)

7647-01-0

Anorgaaniline hape

1B/1C

(3) 1B/1C

V

In vivo mittesöövitavad kemikaalid

Fenetüülbromiid

103-63-9

Elektrofiil

MS

(3) MS

J

V

4-amino-1,2,4-triasool

584-13-4

Orgaaniline alus

MS

(3) MS

T

4-(metüültio)bensaldehüüd

3446-89-7

Elektrofiil

MS

(3) MS

J

V

Lauriinhape

143-07-7

Orgaaniline hape

MS

(3) MS

T

Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service’i registrinumber; J – jah; MS – mittesöövitav; T – tahkis; V – vedelik; VSM – valideeritud standardmeetod.

14.

Pädevuse tõendamise osana soovitatakse kasutajal pärast kudede saabumist kontrollida nende toimivust kaitsekihina vastavalt inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva asjaomase mudeli tootja kirjeldusele. See on eriti oluline pärast kudede pikaajalist transporti või tarnet pika vahemaa taha. Pärast katsemeetodi edukat kasutuselevõttu ja selle kasutamise pädevuse tõendamist ei ole selline tavapärane kontrollimine enam vajalik. Meetodi regulaarse kasutamise korral soovitatakse siiski jätkata kaitsekihina toimivuse hindamist korrapäraste ajavahemike järel.

KATSE KÄIK

15.

Allpool on esitatud üldine kirjeldus käesoleva katsemeetodi kohaste nahasöövituse hindamiseks kasutatavate inimese rekonstrueeritud marrasknaha katsemudelite elementide ja asjaomase katsemenetluse kohta. Käesoleva katsemeetodi raames kasutamiseks heaks kiidetud teaduslikult usaldusväärsed inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelid EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE ja epiCS® (16, 17, 19, 28, 29, 30, 31, 32, 33) on turul kättesaadavad. Standardne töökord kõnealusest neljast iga mudeli kasutamiseks on samuti kättesaadav (34, 35, 36, 37) ning meetodite põhielemendid on kokkuvõtlikult esitatud 2. liites. Ükskõik millise kõnealuse mudeli kasutuselevõtmisel ja rakendamisel laboris soovitatakse järgida asjaomast standardset töökorda. Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud, inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva kõnealuse nelja mudeli kasutamisel peaksid olema täidetud järgmised tingimused.

INIMESE REKONSTRUEERITUD MARRASKNAHAL PÕHINEVA KATSEMEETODI ELEMENDID

Üldtingimused

16.

Epiteelkoe rekonstrueerimiseks tuleks kasutada inimese transformeerumata keratinotsüüte. Talitlusvõimelise sarvkihi all peaks olema mitu kihti eluvõimelisi epiteelirakke (basaalkiht, ogakiht ja sõmerkiht). Sarvkiht peaks olema mitmekihiline ja sisaldama selliseid vajalikke lipiide, et moodustuks funktsionaalne kaitsekiht, mis suudab takistada tsütotoksiliste võrdluskemikaalide, näiteks naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) või Triton X-100 kiiret läbitungimist. Nimetatud kaitsekihina toimimist tuleks tõendada; selle hindamiseks võib teha kindlaks kontsentratsiooni, mille juures võrdluskemikaal vähendab kindlaksmääratud kokkupuuteaja vältel kudede eluvõimelisust 50 % võrra (IC50), või määrata kokkupuuteaja, mille vältel võrdluskemikaal vähendab teatud kindla kontsentratsiooni juures kudede eluvõimelisust 50 % võrra (ET50) (vt punkt 18). Kasutatav inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudel peaks olema selline, et aine ei saaks jõuda eluskoeni sarvkihti läbimata, kuna vastasel korral ei ole nahakaudse kokkupuute mudeliga saadud tulemused usaldusväärsed. Kasutatav mudel ei tohiks olla saastunud bakterite, viiruste, mükoplasma ega seentega.

Funktsionaaltingimused

Eluvõimelisus

17.

Kudede eluvõimelisuse kvantifitseerimiseks kasutatakse MTT-põhist meetodit (27). Vitaalvärvaine MTT redutseeritakse inimese rekonstrueeritud marrasknaha eluvõimelistes rakkudes siniseks sadestuvaks MTT formasaaniks, mis ekstraheeritakse seejärel koest isopropanooli (või muu sarnase lahusti) abil. Ekstraheerimiseks kasutatava lahusti enda optiline tihedus peaks olema piisavalt väike, st < 0,1. Ekstraheeritud MTT formasaani kvantifitseerimiseks võib kasutada kas tavapärast neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmist või HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat (38). Inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli kasutajad peaksid tagama, et mudeli iga kasutatav partii vastab negatiivse kontrolli kindlaksmääratud kriteeriumidele. Inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/tarnija peaks kindlaks määrama negatiivse kontrolli optilise tiheduse väärtuste lubatud vahemiku (ülem- ja alampiiri). Käesoleva katsemeetodiga hõlmatud, inimese rekonstrueeritud marrasknahal põhineva nelja valideeritud katsemudeli puhul lubatud väärtusevahemikud negatiivse kontrolli optilise tiheduse jaoks on esitatud tabelis 2. HPLC/UPLC-spektrofotomeetria kasutaja peaks negatiivse kontrolli vastuvõetavuse kriteeriumina kasutama tabelis 2 negatiivse kontrolli kohta esitatud optilise tiheduse väärtusevahemikku. Tuleks dokumentaalselt tõendada, et negatiivse kontrolliga töödeldud koed on kokkupuuteperioodi kestel kultuuris stabiilsed (võimaldavad saada sarnaseid optilise tiheduse väärtusi).

Tabel 2

Partii kvaliteedi kontrollimiseks kasutatav negatiivse kontrolli optilise tiheduse lubatud väärtusevahemik

 

Vastuvõetavate väärtuste alampiir

Vastuvõetavate väärtuste ülempiir

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Toimimine kaitsekihina

18.

Sarvkiht ja selle lipiidne koostis peavad olema sellised, et takistada teatud kindlate tsütotoksiliste võrdluskemikaalide (nt SDSi või Triton X-100) kiiret läbitungimist; seda hinnatakse IC50 või ET50 alusel (tabel 3). Inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/müüja peaks lõppkasutajale kudede tarnimisel tõendama mudeli iga kasutatava partii puhul toimivust kaitsekihina (vt punkt 21).

Morfoloogia

19.

Tuleks läbi viia inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli histoloogiline analüüs, et tõendada inimese marrasknahaga sarnaneva, basaal-, oga-, sõmer- ja sarvkihti sisaldava mitmekihilise struktuuri olemasolu ning inimese marrasknaha lipiidsele koostisele lähedase lipiidse koostise esinemist. Inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/müüja peaks lõppkasutajale kudede tarnimisel esitama mudeli iga kasutatava partii histoloogilise analüüsi tulemused, millest nähtub kudede morfoloogia nõuetekohasus (vt punkt 21).

Reprodutseeritavus

20.

Katsemeetodi kasutajad peaksid tõendama meetodiga saadavate positiivseid ja negatiivseid kontrolle iseloomustavate tulemuste reprodutseeritavust pikema aja jooksul. Peale selle tuleks käesolevat katsemeetodit kasutada üksnes juhul, kui inimese rekonstrueeritud marrasknaha asjaomase mudeli väljatöötaja/tarnija on esitanud andmed, millest nähtub söövitavate ja mittesöövitavate kemikaalidega, näiteks pädevusainete loetelust (tabel 1) valitud kemikaalidega saadavate tulemuste reprodutseeritavus pikema aja jooksul. Kui asjaomast meetodit kasutatakse täpsemaks liigitamiseks, tuleks tõendada tulemuste reprodutseeritavust ka alamkategooriatesse liigitamisel.

Kvaliteedikontroll

21.

Asjaomast inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelit tuleks kasutada üksnes juhul, kui selle väljatöötaja/tarnija on tõendanud, et kasutatava mudeli iga partii vastab tootele kehtestatud kvaliteedikriteeriumidele, mille hulgas kõige olulisemad on eluvõimelisuse (punkt 17), kaitsekihina toimivuse (punkt 18) ja morfoloogiaga (punkt 19) seotud kriteeriumid. Sellised andmed esitatakse meetodi kasutajatele, et nad saaksid lisada selle teabe katseprotokolli. Söövitavate kemikaalide liigituse usaldusväärse prognoosimise eesmärgil on vastuvõetavad üksnes sellised tulemused, mis on saadud kvaliteedikontrolli edukalt läbinud koepartiidega. IC50 või ET50 väärtuste lubatud vahemiku (ülem- ja alampiiri) määrab kindlaks inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudeli väljatöötaja/tarnija. Kõnealuse nelja valideeritud katsemudeli puhul lubatud väärtusevahemikud on esitatud tabelis 3.

Tabel 3

Partii kvaliteedikontrolli kriteeriumid

 

Vastuvõetavate väärtuste alampiir

Vastuvõetavate väärtuste ülempiir

EpiSkin™ (SM) (18-tunnine töötlus SDSiga) (33)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)

ET50 = 4,0 tundi

ET50 = 8,7 tundi

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)

ET50 = 4,0 tundi

ET50 = 10,0 tundi

epiCS® (1 % Triton X-100) (36)

ET50 = 2,0 tundi

ET50 = 7,0 tundi

Uuritava kemikaali ja kontrollkemikaalidega töötlemine

22.

Iga uuritava kemikaali ja kontrolli puhul tuleks igal kokkupuuteperioodil kasutada vähemalt kahte paralleelset koeproovi. Nii vedelate kui ka tahkete kemikaalide puhul tuleks töötlemiseks kasutada piisavat kogust uuritavat kemikaali, et marrasknaha pind saaks ühtlaselt kaetud, ent seejuures tuleks hoiduda lõpmata suure annuse kasutamisest; see tähendab, et kemikaali tuleks peale kanda koguses vähemalt 70 μl/cm2 või 30 mg/cm2. Sõltuvalt mudelist tuleks marrasknaha pinda enne tahke kemikaali pealekandmist niisutada deioniseeritud või destilleeritud veega, et parandada uuritava kemikaali kontakti marrasknaha pinnaga (34, 35, 36, 37). Võimaluse korral tuleks tahket kemikaali kasutada peene pulbri kujul. Töötlemismeetod peaks olema uuritava kemikaali jaoks sobiv (vt nt allikad 34–37). Kokkupuuteperioodi lõppedes tuleks uuritav kemikaal veepõhisepuhverlahuse või 0,9 % NaCl lahusega marrasknaha pinnalt hoolikalt maha pesta. Sõltuvalt sellest, millist kõnealusest neljast inimese rekonstrueeritud marrasknaha valideeritud katsemudelist kasutatakse, tuleb iga uuritava kemikaali puhul kasutada kahte või kolme kokkupuuteperioodi (kõigi nelja mudeli puhul kokkupuuteperioode kestusega 3 minutit ja 1 tund ning mudeli EpiSkin™ puhul täiendavat kokkupuuteperioodi kestusega 4 tundi). Kasutatavast inimese rekonstrueeritud marrasknaha katsemudelist ja konkreetsest kokkupuuteperioodist sõltuvalt võib kokkupuuteaegne inkubeerimistemperatuur varieeruda toatemperatuurist kuni 37 °C-ni.

23.

Igas mõõtmistsüklis tuleks kasutada paralleelset negatiivset ja positiivset kontrolli selle tõendamiseks, et kudede eluvõimelisus (negatiivse kontrolli puhul), toimivus kaitsekihina ja sellest sõltuv kudede tundlikkus (positiivse kontrolli puhul) jääb varasemate andmete alusel kindlaks määratud lubatud piiridesse. Soovitatav positiivseks kontrolliks sobiv kemikaal on kasutatavast inimese rekonstrueeritud marrasknaha mudelist sõltuvalt jää-äädikhape või 8 N KOH. Tuleks silmas pidada, et 8 N KOH on MTT otsene redutseerija ja selle kemikaali puhul võib olla vaja kasutada kohandatud kontrolle, nagu on kirjeldatud punktides 25 ja 26. Soovitatav negatiivne kontroll on 0,9 % (massiühikutes mahuühiku kohta) NaCl või vesi.

Rakkude eluvõimelisuse mõõtmine

24.

Käesoleva katsemeetodi raames tuleks rakkude eluvõimelisuse mõõtmiseks kasutada kvantitatiivset MTT-põhist meetodit (27). Koeproov asetatakse kolmeks tunniks sobiva kontsentratsiooniga (0,3 või 1 mg/ml) MTT lahusesse. Sadestunud sinine formasaan ekstraheeritakse seejärel lahusti (näiteks isopropanooli või hapestatud isopropanooli) abil ning formasaani kontsentratsiooni määramiseks mõõdetakse lahuse optiline tihedus lainepikkusel 570 nm – seejuures kasutatakse filtrit ribalaiusega kuni ± 30 nm – või rakendatakse HPLC/UPLC-spektrofotomeetriat (vt punktid 30 ja 31) (38).

25.

Uuritav kemikaal võib MTT-põhise katse tulemusi moonutada tulenevalt MTT otsesest redutseerimisest siniseks formasaaniks ja/või värvuse muutmise kaudu, kui asjaomane uuritav kemikaal neelab looduslikult või töötlemisprotsessi tulemusena valgust samas vahemikus, mida kasutatakse formasaanilahuse optilise tiheduse mõõtmiseks (570 ± 30 nm; seda täheldatakse peamiselt siniste ja lillade kemikaalide puhul). Selliste uuritavate kemikaalide võimaliku segava mõju tuvastamiseks ja tulemuste korrigeerimiseks tuleks kasutada täiendavaid kontrolle, näiteks MTT mittespetsiifilist redutseerimist (NSMTT) kajastavat kontrolli ja mittespetsiifilist värvumist (NSC) kajastavat kontrolli (vt punktid 26–30). See on eriti oluline juhul, kui konkreetset uuritavat kemikaali ei saa loputamise teel koepinnalt täielikult eemaldada või kui see tungib marrasknahka ja jääb seega eluvõimelisuse MTT-põhise määramise ajaks kudedesse. Üksikasjalik kirjeldus selle kohta, kuidas korrigeerida tulemusi MTT otsese redutseerimise ja värvust muutvate ainete mõju suhtes, on esitatud asjaomast katsemudelit käsitlevas standardses töökorras (34, 35, 36, 37).

26.

MTT otseste redutseerijate tuvastamiseks tuleks lisada iga uuritavat kemikaali värskelt valmistatud MTT lahusesse (34, 35, 36, 37). Kui MTT lahus värvub uuritava kemikaali toimel siniseks/lillaks, siis käsitatakse asjaomast uuritavat kemikaali MTT otsese redutseerijana ning sel juhul tuleks tavapärasest neelduvuse (optilise tiheduse) mõõtmisest või HPLC/UPLC-spektrofotomeetrial põhinevast määramisest sõltumatult kasutada täiendavat funktsionaalset kontrolli eluvõimetu marrasknahaga. Sellise täiendava funktsionaalse kontrolli puhul kasutatakse surmatud kudesid, mille metaboolne aktiivsus on peaaegu kadunud, kuid mis absorbeerivad uuritavat kemikaali eluvõimeliste kudedega sarnasel määral. Iga MTT-d redutseeriva kemikaaliga töödeldakse vähemalt kahte surmatud kudede paralleelproovi kokkupuuteperioodi kohta ning nende proovidega viiakse läbi täismahus nahasöövituskatse. Seejärel arvutatakse kudede tegeliku eluvõimelisuse kindlakstegemiseks asjaomase MTT redutseerijaga kokkupuutes olnud eluskudede puhul täheldatud eluvõimeliste kudede protsentuaalne osakaal, millest lahutatakse sama MTT redutseerijaga kokkupuutes olnud surmatud kudedega saadud, MTT mittespetsiifilist redutseerimist kajastav protsentuaalse osakaaluna väljendatud väärtus (NSMTT(%)); nimetatud väärtused arvutatakse korrigeeritavate andmete saamiseks kasutatud proovidega paralleelselt analüüsitud negatiivset kontrolli iseloomustava väärtuse suhtes.