(1)

I del A ska följande kapitel läggas till:

”A.25   DISSOCIATIONSKONSTANTER I VATTEN (TITRERINGSMETOD – SPEKTROFOTOMETRISK METOD – KONDUKTOMETRISK METOD)

INLEDNING

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 112 (1981).

Förutsättningar

Vägledande information

Kvalificerande angivelser

Standarddokument

Denna testmetod är baserad på de metoder som anges i avsnittet ”Litteratur” och på dokumentet Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA av den 18 augusti 1978.

METOD – INLEDNING, SYFTE, OMFATTNING, RELEVANS, TILLÄMPNING OCH TESTGRÄNSER

Ämnets dissociation i vatten är av betydelse för bedömningen av dess miljöpåverkan. Detta styr ämnets form, vilket i sin tur avgör hur det beter sig och överförs. Det kan påverka kemikaliens adsorption till jord och sediment och absorption in i biologiska celler.

Definitioner och enheter

Dissociation är en reversibel uppdelning i två eller flera kemiska ämnen som kan vara joniska. Processen anges vanligen genom

RX ⇌ R ++ X –

och koncentrationens jämviktskonstant som styr reaktionen är

I det särskilda fallet där R är väte (ämnet är en syra) är konstanten t.ex.

eller

Referensämnen

Följande referensämnen behöver inte användas i samtliga fall när ett nytt ämne ska undersökas. Referensämnen tillhandahålls främst för att emellanåt kalibrera metoden och möjliggöra en jämförelse av resultaten när en annan metod tillämpas.

Här är det användbart att ha ett ämne med flera pK enligt avsnittet Testmetodens princip nedan. Exempel på sådana ämnen:

Testmetodens princip

Den kemiska process som beskrivs är i allmänhet endast något temperaturberoende i det miljömässigt relevanta temperaturintervallet. Bestämningen av dissociationskonstanten kräver en mätning av koncentrationerna av det kemiska ämnets dissocierade och icke-dissocierade former. Med utgångspunkt från kunskapen om dissociationsreaktionens stökiometri enligt avsnittet Definitioner och enheter ovan kan den lämpliga konstanten bestämmas. I det särskilda fall som beskrivs i denna testmetod beter sig ämnet som en syra eller en bas, och bestämningen görs lämpligen genom att fastställa de relativa koncentrationerna av ämnets joniserade och icke-joniserade former och lösningens pH-värde. Förhållandet mellan dessa termer anges i ekvationen för pKa i avsnittet Definitioner och enheter ovan. Vissa ämnen uppvisar mer än en dissociationskonstant och liknande ekvationer kan utvecklas. Några av de metoder som beskrivs här är också lämpliga för icke-syra/bas-dissociation.

Kvalitetskriterier

Repeterbarhet

Dissociationskonstanten bör replikeras (minst tre bestämningar) till inom ± 0,1 log-enheter.

BESKRIVNING AV TESTFÖRFARANDENA

Det finns två grundläggande metoder för bestämning av pKa. Den ena metoden omfattar titrering av en känd mängd av ämnet med standardsyra eller standardbas i förekommande fall, och enligt den andra metoden bestäms den relativa koncentrationen av de joniserade och icke-joniserade formerna och deras pH-beroende.

Förberedelser

Metoder som baseras på dessa principer kan klassificeras som titreringsförfaranden samt spektrofotometriska och konduktometriska förfaranden.

Testlösningar

För titreringsmetoden och den konduktometriska metoden ska det kemiska ämnet lösas upp i destillerat vatten. För den spektrofotometriska metoden och andra metoder används buffertlösningar. Koncentrationen av testämnet bör inte överstiga det mindre av 0,01 M eller halva mättnadskoncentrationen, och den renaste tillgängliga formen av ämnet bör användas för att bereda lösningarna. Om ämnet endast är måttligt lösligt kan det lösas i en liten mängd lösningsmedel som är blandbart i vatten innan de koncentrationer som anges ovan tillsätts.

Lösningarna bör kontrolleras med avseende på förekomst av emulsioner med hjälp av Tyndallstrålen, särskilt om ett hjälplösningsmedel har använts för att förbättra lösligheten. När buffertlösningar används bör bufferthalten inte överstiga 0,05 M.

Testbetingelser

Temperatur

Temperaturen bör regleras till minst ± 1 °C. Bestämningen bör företrädesvis utföras vid 20 °C.

Vid misstanke om betydande temperaturberoende bör bestämningen utföras åtminstone vid två andra temperaturer. I detta fall bör temperaturintervallen vara 10 °C och temperaturkontrollen ± 0,1 °C.

Analyser

Vilken metod som används beror på det testade ämnets natur. Metoden måste vara tillräckligt känslig för att möjliggöra bestämning av de olika kemiska beståndsdelarna vid varje testlösningskoncentration.

Testförfarande

Titreringsmetod

Testlösningen bestäms genom titrering med standardbas- eller standardsyralösning i förekommande fall, med mätning av pH-värdet efter varje tillsats av titreringsmedel. Minst tio stegvisa tillsatser bör göras före ekvivalenspunkten. Om jämvikt nås tillräckligt snabbt kan en registreringspotentiometer användas. För denna metod måste både den totala mängden av ämnet och dess koncentration vara exakt kända. Försiktighetsåtgärder måste vidtas för att utesluta koldioxid. Uppgifter om förfarande, försiktighetsåtgärder och beräkning ges i standardtesterna, t.ex. litteraturhänvisningarna (1), (2), (3), (4).

Spektrofotometrisk metod

En våglängd söks fram där de joniserade och icke-joniserade formerna av ämnet har avsevärt olika extinktionskoefficienter. UV-/VIS-absorptionsspektrumet erhålls från lösningar med konstant koncentration under ett pH-tillstånd där ämnet är i huvudsak icke-joniserat och helt joniserat och vid flera mellanliggande pH-värden. Detta kan antingen göras genom tillsats av omgångar av koncentrerad syra (bas) till en relativt stor mängd av en lösning av ämnet i en multikomponentbuffert, till en början vid högt (lågt) pH (litteraturhänvisning 5), eller genom tillsats av lika stora volymer av en stamlösning av ämnet i t.ex. vatten eller metanol, till konstanta volymer av olika buffertlösningar som täcker det önskade pH-intervallet. Från pH- och absorbansvärdena vid den valda våglängden beräknas ett tillräckligt antal värden för pKa med hjälp av data från minst 5 pH där ämnet är joniserat till minst 10 procent och högst 90 procent. Ytterligare uppgifter om försöket och beräkningsmetoden anges i litteraturhänvisning (1).

Konduktometrisk metod

Med användning av en cell med en liten och känd cellkonstant mäts ledningsförmågan hos en ca 0,1 M lösning av ämnet i konduktivitetslösning. Ledningsförmågan hos ett antal noggrant gjorda utspädningar av lösningen mäts också. Koncentrationen halveras varje gång och serien bör omfatta minst en storleksordning i koncentrationen. Den begränsande ledningsförmågan vid oändlig utspädning fastställs genom att ett liknande försök görs med Na-saltet och extrapolering. Dissociationsgraden kan sedan beräknas utifrån varje lösnings ledningsförmåga med hjälp av Onsager-ekvationen. Dissociationskonstanten kan beräknas med hjälp av Ostwalds utspädningslag, som K = α2C / (1 – α) där C är koncentrationen i mol per liter och α är den dissocierade fraktionen. Försiktighetsåtgärder måste vidtas för att utesluta koldioxid. Ytterligare uppgifter om försöket och beräkningsmetoden anges i standardtexter samt i litteraturhänvisningarna (1), (6) och (7).

DATA OCH RAPPORTERING

Behandling av resultaten

Titreringsmetod

pKa beräknas för 10 uppmätta punkter på titreringskurvan. Medelvärdet och standardavvikelsen för sådana pKa-värden beräknas. Ett diagram med pH avsatt mot volymerna av standardbas eller standardsyra bör ingå tillsammans med en presentation i tabellform.

Spektrofotometriska metoder

Absorbans och pH från varje spektrum ställs upp i tabellform. Minst fem värden för pKa beräknas från de mellanliggande datapunkterna i spektrumet. Även medelvärde och standardavvikelse för dessa resultat beräknas.

Konduktometrisk metod

Motsvarande ledningsförmåga Λ beräknas för varje syrakoncentration och för varje koncentration av en blandning av en syraekvivalent och en 0,98 ekvivalent av karbonatfri natriumhydroxid. Syftet med överskottssyran är att förhindra överskott av OH– på grund av hydrolys. 1 /Λ avsätts mot √C och Λo av saltet bestäms genom extrapolering till nollkoncentration.

Λo av syran kan beräknas med användning av litteraturvärden för H+ och Na+. PKa kan beräknas från α = Λi /Λo och Ka = α2C/(1 – α) för varje koncentration. Bättre värden för Ka kan fås genom korrigeringar för rörlighet och aktivitet. Medelvärde och standardavvikelser för PKa-värden bör beräknas.

Testrapport

Alla rådata och beräknade PKa-värden bör lämnas in tillsammans med beräkningsmetoden (företrädesvis i tabellformat, såsom föreslås i litteraturhänvisning 1), och detsamma gäller de statistiska parametrar som beskrivs ovan. För titreringsmetoder bör uppgifter om standardiseringen av titreringsmedel anges.

För den spektrofotometriska metoden bör samtliga spektrum anges. För den konduktometriska metoden bör uppgifter om bestämningen av cellkonstant rapporteras. Uppgifter om använd teknik samt analysmetoder och typen av eventuella buffertar bör också lämnas.

Testtemperaturer ska rapporteras.

LITTERATUR

(2)

I del B ska kapitel B.5 ersättas med följande:

”B.5   AKUT ÖGONIRRITATION/ÖGONKORROSION

INLEDNING

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 405 (2012). OECD:s riktlinjer för kemikalietestning ses över med jämna mellanrum för att säkerställa att de återspeglar bästa tillgängliga vetenskap. Vid tidigare revideringar av denna testriktlinje lades särskilt stor vikt vid möjligheterna till bättre testningsförfaranden, där djurskyddsfrågor beaktas så väl som möjligt. Sådana förfaranden innebär att all existerande information om testkemikalien utvärderas i syfte att undvika onödiga djurförsök. TG 405 (antagen 1981 och uppdaterad 1987, 2002 och 2012) innehåller en rekommendation om att laboratoriet, innan det beskrivna in vivo-testet för akut ögonkorrosion/ögonirritation inleds, bör göra en weight-of-the-evidence-analys (1) av existerande relevanta data. Om de data som finns att tillgå inte är tillräckliga bör behövliga data genereras med hjälp av stegvis testning (2) (3). Den rekommenderade testningsstrategin inbegriper validerade och godkända in vitro-test och anges i ett tillägg till denna testmetod. För tillämpningen av förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (2), ingår även en integrerad teststrategi i Echas relevanta vägledning (21). Testning på djur bör endast utföras om det bedöms vara nödvändigt efter övervägande av tillgängliga alternativa metoder och efter användning av de metoder som bedömts vara lämpliga. Vid tidpunkten för utarbetandet av denna uppdaterade testmetod var användningen av testmetoden fortfarande nödvändig i vissa fall eller krävdes enligt vissa regelverk.

Den senaste uppdateringen inriktas främst på användningen av smärtstillande medel och bedövningsmedel och påverkar inte testriktlinjens grundläggande princip och struktur. ICCVAM (3) och en oberoende internationell vetenskaplig expertpanel har granskat användbarhet och begränsningar när det gäller rutinmässig användning av lokalbedövningsmedel, systemiska smärtstillande medel och humana endpoints för säkerhetstester i fråga om ögonirritation (12). Granskningen visade att nästan all eller hela smärtan och lidandet kan undvikas med hjälp av lokalbedövningsmedel och systemiska smärtstillande medel utan att testet påverkas och ledde till rekommendationen att dessa ämnen alltid ska användas. Granskningen har beaktats i denna testmetod. Lokalbedövningsmedel, systemiska smärtstillande medel och humana endpoints bör användas rutinmässigt vid in vivo-testning med avseende på ögonirritation/ögonkorrosion. Undantag från användning bör motiveras. De förbättringar som beskrivs i denna metod kommer att bidra till att avsevärt minska eller undvika smärta och lidande hos djuren i de flesta testningssituationer där in vivo-testning fortfarande är nödvändig för att avgöra om ett ämne är säkert för ögonen.

Balanserande förebyggande smärtlindring bör omfatta i) rutinmässig förbehandling med lokalbedövningsmedel (t.ex. proparakain eller tetrakain) och ett systemiskt smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin), ii) ett rutinmässigt efterbehandlingsschema med systemiska smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin och meloxikam), iii) schemalagd observation, övervakning och registrering av djuren för kliniska tecken på smärta och/eller lidande och iv) schemalagd observation, övervakning och registrering av arten, svårighetsgraden och utvecklingen av alla ögonskador. Närmare uppgifter ges i de uppdaterade förfaranden som beskrivs nedan. När testkemikalien har applicerats bör inga ytterligare lokalbedövningsmedel eller smärtstillande medel användas för att undvika störningar i undersökningen. Smärtstillande medel med antiinflammatorisk verkan (t.ex. meloxikam) bör inte appliceras lokalt och doser som används systematiskt får inte påverka effekterna på ögonen.

Definitionerna anges i tillägget för testmetoden.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

Med hänsyn till sund vetenskaplig praxis och djurens välbefinnande bör in vivo-testning inte genomföras förrän alla tillgängliga data som är relevanta för kemikaliens förmåga att framkalla hudkorrosion/hudirritation har utvärderats genom en weight-of-the-evidence-analys. Sådana data utgör belägg från befintliga undersökningar på människor och/eller försöksdjur, belägg för ögonkorrosion/ögonirritation i fråga om ett eller flera strukturellt besläktade ämnen eller blandningar av sådana ämnen, data som visar att ämnet är starkt surt eller alkaliskt (4), (5) samt resultat från validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-tester med avseende på hudkorrosion och ögonkorrosion/ögonirritation (6) (13) (14) (15) (16) (17). Sådana undersökningar kan ha gjorts före, eller som ett resultat av, en weight-of-the-evidence-analys.

För vissa ämnen kan en sådan analys visa att det behövs in vivo-testning av kemikaliens förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögonirritation. I alla sådana fall bör man, innan ett in vivo-ögontest övervägs, helst göra ett in vivo- eller in vitro-test för utvärdering av kemikaliens verkningar på huden och utvärdera testet enligt den stegvisa testningsstrategin i testmetod B.4 (7) eller den integrerade testningsstrategi som beskrivs i Echas vägledning (21).

En rekommenderad strategi för stegvis testning, som inbegriper validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-test med avseende på ögonkorrosion/ögonirritation finns som tillägg till denna metod, och när det gäller Reach i Echas vägledning (21). En sådan testningsstrategi bör tillämpas innan in vivo-tester utförs. För nya kemikalier rekommenderas ett stegvis testningsförfarande för generering av vetenskapligt sunda data om en kemikalies förmåga att framkalla korrosion/irritation. För befintliga kemikalier med otillräckliga data om korrosion/irritation för hud och ögon kan strategin användas för att fylla upp luckor i tillgängliga data. Om en annan testningsstrategi eller ett annat förfarande används, eller om man beslutar att inte använda ett förfarande med stegvis testning, bör detta motiveras.

PRINCIP FÖR IN VIVO-TEST

Efter förbehandling med ett systemiskt smärtstillande medel och lämplig lokalbedövning appliceras testkemikalien som en engångsdos i försöksdjurets ena öga. Det obehandlade ögat används som referens. Graden av ögonirritation eller ögonkorrosion utvärderas genom klassificering av skadorna på ögats bindhinna (konjunktiva), hornhinnan och iris med specifika intervall. Likaså bör övriga verkningar i ögat och skadliga systemiska verkningar beskrivas för att en fullständig utvärdering av verkningarna ska fås. Testet bör pågå tillräckligt länge för att ge möjlighet att utvärdera om de observerade verkningarna är reversibla eller irreversibla.

Djur som uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande och/eller smärta i något skede av testningen eller skador som överensstämmer med de humana endpoints som beskrivs i denna testmetod (se punkt 26) bör avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av kemikalien. Kriterier för att fatta beslut om skonsam avlivning av döende eller allvarligt lidande djur finns i ett OECD-vägledningsdokument (8).

FÖRBEREDELSER FÖR IN VIVO-TEST

Val av art

Rekommenderat försöksdjur är albinokanin. Friska, unga vuxna exemplar bör användas. Om andra arter eller stammar används bör detta motiveras.

Förberedelse av djuren

De djur som preliminärt har valts ut för testning bör undersökas med avseende på båda ögonen inom 24 timmar före testets början. Djur som har irriterade ögon, okulära defekter eller existerande skada på hornhinnan bör inte användas.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

Djuren ska inhysas individuellt. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 20 °C (± 3 °C) för kaniner. Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs då målet bör vara 50–60 %. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. Överdriven ljusintensitet bör undvikas. Konventionellt laboratoriefoder kan användas för utfodringen, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten.

TESTFÖRFARANDE

Användning av lokalbedövningsmedel och systemiska smärtstillande medel

Följande förfaranden rekommenderas för att undvika eller minimera smärta och lidande i testningsförfaranden för att avgöra om ett ämne är säkert för ögonen. Alternativa förfaranden som har visat sig fungera lika bra för att undvika eller lindra smärta och lidande kan användas.

Applicering av testkemikalien

Testkemikalien tillförs i ena ögats konjunktivasäck (alla djur). Före tillförseln bör det undre ögonlocket varsamt dras ut en bit ut från ögongloben. Ögonlocken förs därefter samman i cirka en sekund för att förhindra att ämnet kommer ut. Det andra, obehandlade ögat används som referens.

Sköljning

Försöksdjurens ögon bör inte sköljas under minst 24 efter tillförseln av testkemikalien, utom när det gäller fasta ämnen (se punkt 18) eller om det uppstår omedelbara korrosiva eller irriterande verkningar. Efter 24 timmar kan ögonen sköljas, om detta bedöms vara lämpligt.

Användningen av en satellitgrupp för att undersöka inverkan av sköljningen rekommenderas inte, utom om det är vetenskapligt motiverat. Om en satellitgrupp används, ska den bestå av två kaniner. Sköljningsbetingelserna bör dokumenteras omsorgsfullt, t.ex. sköljningstidpunkten, lösningens sammansättning och temperatur samt sköljningstiden, applicerad volym och sköljningsintensitet.

Dosnivå

(1)   Testning av vätskor

Vid testning av vätskor används en dos på 0,1 ml. Pumpsprej bör inte användas för att tillföra kemikalien direkt i ögat. I stället bör vätskan sprejas in i en behållare, som används för att tillföra 0,1 ml i ögat.

(2)   Testning av fasta ämnen

Vid testning av fasta ämnen, pastor och kemikalier i partikelform, bör den tillförda mängden ha en volym på 0.1 ml eller en medelvikt på högst 100 mg. Testkemikalien bör malas ned till fint stoft. Det fasta materialets volym bör mätas efter en varsam kompaktering, som görs till exempel genom att knacka på mätbehållaren. Om en fast testkemikalie inte har tagits bort ur försöksdjurets öga med hjälp av fysiologiska mekanismer vid den första observationstidpunkten (en timme efter behandlingen), kan ögat sköljas med saltlösning eller destillerat vatten.

(3)   Testning av aerosoler

Det rekommenderas att material i form av pumpsprej eller aerosol sprejas i en behållare, som sedan används för tillförsel i ögat. Det enda undantaget är kemikalier i aerosoler i tryckbehållare som inte går att samla in på grund av förångning. I sådana fall hålls djurets öga öppet och testkemikalien sprutas in i ögat under cirka en sekund, på cirka 10 cm avstånd direkt framför ögat. Avståndet kan variera beroende på behållarens tryck och innehåll. Det är viktigt att se till att ögat inte skadas av sprejtrycket. I tillämpliga fall kan det vara nödvändigt att utvärdera om sprejstyrkan kan framkalla ”mekanisk” skada i ögat.

En uppskattning av dosen från en aerosol kan göras genom en simulering på följande sätt: Ämnet sprejas på ett vägningspapper genom en öppning som har storleken av ett kaninöga och som hålls strax framför papperet. Papperets viktökning används som grund för att uppskatta den mängd som har sprejats i ögat. För flyktiga kemikalier kan dosen uppskattas genom att väga en mottagningsbehållare före och efter borttagning av testkemikalien.

Preliminärt test (in vivo-test avseende ögonirritation/ögonkorrosion på ett enskilt djur)

Det rekommenderas starkt att in vivo-testet först görs på ett enskilt djur (se tillägget till denna testmetod: Strategi för stegvis testning med avseende på ögonirritation och ögonkorrosion Observationer bör göra det möjligt att bestämma svårhetsgrad och reversibilitet innan man går vidare till ett bekräftande test på ett andra djur.

Om resultatet av ett sådant test tyder på att kemikalien är korrosiv eller framkallar kraftig irritation i ögat när man använder det beskrivna förfarandet, bör ingen ytterligare testning utföras.

Bekräftande test (in vivo-test avseende ögonirritation med ytterligare djur)

Om ingen korrosiv verkan eller kraftig irritation observeras vid det preliminära testet, bör responsen (irriterande eller negativ) bekräftas med hjälp av högst två ytterligare djur. Om en kraftig irritation har observerats vid det preliminära testet rekommenderas bekräftande test som görs stegvis på ett djur i taget, i stället för samtidigt test på båda tilläggsdjuren. Om frätning eller kraftig irritation kan observeras på det tilläggsdjur som först används, bör testningen avbrytas. Om resultaten från testet på det andra djuret är tillräckliga för att fastställa en faroklassificering bör inga fler tester utföras.

Observationsperiod

Observationsperioden bör vara tillräckligt lång för att det till fullo ska gå att utvärdera omfattningen och reversibiliteten hos de observerade verkningarna. Försöket bör dock avslutas omedelbart, oavsett hur länge det pågått, om det berörda djuret uppvisar tecken på svåra smärtor eller lidande (8). För fastställandet av verkningarnas reversibilitet bör djuren i regel observeras i 21 dagar efter tillförsel av testkemikalien. Om reversibilitet kan observeras innan 21 dagar har gått kan försöket omedelbart avslutas.

Kliniska observationer och gradering av ögonreaktionerna

Ögonen bör utvärderas noggrant för att bekräfta förekomst eller frånvaro av ögonskador en timme efter appliceringen av testkemikalien, följt av minst dagliga utvärderingar. Försöksdjuren bör bedömas flera gånger dagligen under de första tre dagarna så att beslut om upphörande av testet fattas i rätt tid. Djuren bör utvärderas rutinmässigt under hela undersökningen när det gäller kliniska tecken på smärta och/eller lidande (t.ex. upprepat krafsande eller gnuggande i ögat, överdrivna blinkningar, överdriven tårbildning) (9) (10) (11), minst två gånger om dagen med minst sex timmar mellan observationerna, eller oftare om så krävs. Detta är nödvändigt för att i) utvärdera djuren på lämpligt sätt för att upptäcka tecken på smärta och lidande och utifrån detta fatta välgrundade beslut om behovet av att öka dosen av smärtstillande medel, och ii) utvärdera djuren för bevis för etablerade humana endpoints för att fatta välgrundade beslut om human avlivning av djuren och säkerställa att sådana beslut fattas i rätt tid. Fluoresceinfärgning bör användas rutinmässigt och spaltlampa bör användas om det anses lämpligt (t.ex. för att bedöma skadans djup vid förekomst av ulceration av kornea) och som ett hjälpmedel för att upptäcka och mäta ögonskador och utvärdera om de fastställda endpointkriterierna för human avlivning är uppfyllda. Digitala fotografier av observerade skador kan samlas in som referensmaterial och för permanent registrering av ögonskadornas omfattning. Djuren bör inte utsättas för testning längre än det är nödvändigt för att få definitiv information. Djur som uppvisar allvarliga tecken på smärta eller lidande bör omedelbart avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av kemikalien.

Djur som fått följande ögonskador efter tillförsel av kemikalien bör avlivas på ett humant sätt (skadegraderna beskrivs i tabell 1): perforering eller signifikant ulceration av kornea inklusive stafylom, blod i främre ögonkammaren, korneaopacitet av grad 4, ingen ljusreaktion (irisreaktion av grad 2) som varar i 72 timmar, ulceration av konjunktivamembran, nekros i konjunktiva- eller blinkhinna eller bildning av sårskorpa. Skälet till avlivningen är att dessa skador i regel är irreversibla. Vidare rekommenderas att följande ögonskador används som humana endpoints för beslut om att avsluta undersökningen före den planerade observationsperioden på 21 dagar. Följande skador anses tyda på allvarliga irritations- eller korrosionsskador och skador som inte förväntas gå tillbaka helt i slutet av observationsperioden på 21 dagar: mycket djupa skador (t.ex. ulceration av kornea som går djupare än ytlagren av stroma), förstörd limbus > 50 %, vilket visar sig i form av blekning av bindhinnevävnaden) och allvarlig ögoninfektion (varutsöndring). En kombination av vaskulering av hornhinnans yta (dvs. pannus), fluoresceinfärgade områden som inte minskar över tiden enligt dagliga utvärderingar och/eller brist på nybildning av epitel fem dagar efter appliceringen av testkemikalien kan också betraktas som eventuellt användbara kriterier för att motivera det kliniska beslutet att avsluta undersökningen i förtid. Dessa resultat är dock individuellt sett inte tillräckliga för att motivera att undersökningen avslutas i förtid. Om allvarliga okulära effekter identifieras bör en behandlande veterinär eller en kvalificerad laboratorieveterinär som är utbildad i att identifiera kliniska skador konsulteras för en klinisk undersökning i syfte att avgöra om kombinationen av dessa effekter motiverar att undersökningen avslutas i förtid. Graderna av okulär reaktion (konjunktiva, kornea och iris) bör fastställas och registreras 1, 24, 48 och 72 timmar efter appliceringen av kemikalien (tabell 1). Djur som inte utvecklar okulära skador ska inte avlivas förrän det har gått tre dagar från tillförsel av ämnet. Djur med okulära skador som inte är allvarliga bör observeras tills skadorna läks, eller under 21 dagar. Efter det avslutas undersökningen. Observationer bör göras och registreras efter minst 1, 24, 48 och 72 timmar samt efter 7, 14 och 21 dagar i syfte att fastställa skadornas status och huruvida de är reversibla eller inte. Tätare observationer bör göras om det är nödvändigt för att avgöra om försöksdjuren bör avlivas av humana skäl eller avlägsnas från undersökningen på grund av negativa resultat.

Graderna av okulära skador (tabell 1) bör registreras vid varje undersökning av djuren. Likaså bör alla andra ögonskador (t.ex. pannus, missfärgning, förändringar i främre ögonkammaren) eller skadliga systemiska verkningar även rapporteras.

Som hjälpmedel vid undersökningen av reaktionerna kan användas en binokulärlupp, ficklampa, biomikroskop eller annan lämplig utrustning. Efter det att observationerna har registrerats vid 24 timmar efter tillförseln, kan ögonen undersökas ytterligare med hjälp av fluorescein.

Graderingen av okulär respons är oundgängligen subjektiv. För att främja en tillnärmning av graderingen av okulär respons, och som stöd för testningslaboratorier och alla som är med om att utföra och tolka observationer, bör den personal som gör observationsarbetet få tillbörlig utbildning om klassificeringssystemet.

DATA OCH RAPPORTERING

Utvärdering av resultaten

Klassificeringen av okulär respons bör göras med hänsyn till skadornas natur och allvarlighetsgrad samt deras reversibilitet eller irreversibilitet. Individuella klassificeringsresultat representerar ingen absolut standard för en kemikalies förmåga att framkalla irritation, eftersom även andra verkningar av testkemikalien utvärderas. Enskilda klassificeringsresultat bör i stället ses som referensvärden, och de är meningsfulla endast när de åtföljs av en fullständig beskrivning och utvärdering av alla observationer.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande information:

Tolkning av resultaten.

En extrapolering av resultaten från undersökningar av ögonirritation som gjorts på försöksdjur är valid endast till en begränsad utsträckning. I många fall är albinokaniner mycket känsligare än människor i fråga om ämnen som är irriterande eller korrosiva för ögat.

Särskild noggrannhet bör iakttas vid tolkning av resultaten i syfte att utesluta irritation som beror på en sekundär infektion.

LITTERATUR

Tabell 1

Gradering av okulära skador

TILLÄGG TILL TESTMETOD B.5  (4)

STRATEGI FÖR STEGVIS TESTNING MED AVSEENDE PÅ ÖGONIRRITATION OCH ÖGONKORROSION

Allmänna överväganden

För en sund vetenskaplig praxis och för djurens välbefinnande är det viktigt att undvika onödig användning av djur, och minimera all testning som sannolikt framkallar allvarlig respons hos djuren. All information som är relevant för en kemikalies förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögonirritation bör utvärderas innan in vivo-testning övervägs. Det kanske redan finns tillräckliga bevis för att klassificera en testkemikalie med avseende på dess förmåga att framkalla ögonkorrosion eller ögonirritation, utan behov av testning på laboratoriedjur. Man kan därför, genom att använda en weight-of-the-evidence-analys och följa strategin för stegvis testning, minimera behovet av in vivo-testning, särskilt i fråga om kemikalier som sannolikt framkallar allvarliga reaktioner.

Det rekommenderas att en weight-of-the-evidence-analys används för att utvärdera befintlig information om olika kemikaliers förmåga att framkalla ögonirritation eller ögonkorrosion. Därefter kan man avgöra om det behövs ytterligare undersökningar, andra än in vivo-test, som hjälp för att karakterisera sådan egenskap. I fall där ytterligare undersökningar behövs, rekommenderas ett förfarande enligt strategin för stegvis testning för att få fram relevanta försöksdata. För ämnen som inte har testats tidigare bör strategin för stegvis testning följas för att få fram de data som behövs för att utvärdera ämnets förmåga att framkalla ögonkorrosion eller ögonirritation. Den inledande testningsstrategi som beskrivs i detta tillägg har utarbetats inom ramen för en OECD-arbetsgrupp (1). Strategin bekräftades och utvidgades senare i Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, i den form systemet godkändes av vid det 28:e gemensamma mötet för kemikaliekommittén och kemikaliearbetsgruppen (Chemicals Committee och Working Party on Chemicals), i november 1998 (2) och uppdaterades av en OECD-expertgrupp 2011.

Även om denna testningsstrategi inte ingår som en del av testmetod B.5, är den ett uttryck för de rekommenderade principerna för bestämning av ett ämnes förmåga att framkalla ögonirritation eller ögonkorrosion. Dessa principer representerar både bästa praxis och etiska riktlinjer för in vivo-testning med avseende på ögonirritation/ögonkorrosion. Testmetoden är en vägledning för utförandet av test in vivo, och utgör en sammanfattning av de faktorer som bör beaktas innan ett sådant test övervägs. Inom ramen för strategin för stegvis testning används weight-of-the-evidence-analyser för utvärderingen av befintliga data om olika testkemikaliers egenskaper med avseende på ögonirritation/ögonkorrosion. Samtidigt fås tillgång till en stegvis metod för generering av relevanta data om kemikalier för vilka det krävs ytterligare testning eller för ämnen som ännu inte har testats. Enligt strategin utför man först validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-tester och därefter görs undersökningar enligt TM B.4 under specifika omständigheter (3) (4).

Beskrivning av den stegvisa testningsstrategin

Innan testning utförs som en del av förfarandet enligt strategin för stegvis testning (se figuren), bör all tillgänglig information utvärderas i syfte att fastställa behovet av in vivo-test på ögonen. Trots att signifikant information kan fås genom utvärdering av enskilda parametrar (till exempel extrema pH-värden), bör den tillgängliga informationen utvärderas som en helhet. Alla relevanta data om den berörda kemikaliens och dess strukturella analogers verkningar bör utvärderas när man fattar ett beslut grundat på en weight-of-the-evidence-analys, och en motivering för beslutet bör anges. Huvudvikten bör läggas vid befintliga data om kemikalien (både i fråga om människor och djur). Därefter följer resultatet av testning in vitro eller ex vivo. Testning in vivo av korrosiva kemikalier bör alltid undvikas när det är möjligt. Till de faktorer som bör beaktas inom ramen för testningsstrategin hör följande:

TESTNINGS- OCH UTVÄRDERINGSSTRATEGI FÖR ÖGONIRRITATION/ÖGONKORROSION

LITTERATUR

(3)

I del B ska kapitel B.10 ersättas med följande:

”B.10   Test in vitro av kromosomavvikelser hos däggdjur

INLEDNING

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 473 (2016). Det är en del av en serie av testmetoder för genetisk toxikologi. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

Syftet med test in vitro av kromosomavvikelser hos däggdjur är att identifiera kemikalier som orsakar strukturella kromosomavvikelser hos odlade däggdjursceller (2) (3) (4). Strukturella avvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. Polyploidi (inklusive endoreduplicering) kan uppstå vid tester av kromosomavvikelser in vitro. Aneugener kan framkalla polyploidi, men enbart polyploidi tyder inte på aneugen potential, och kan helt enkelt tyda på störningar i cellcykeln eller cytotoxicitet (5). Detta test är inte utformat för att mäta aneuploidi. Mikrokärntest in vitro (6) rekommenderas för detektering av aneuploidi.

Test av kromosomavvikelser in vitro kan göras med kulturer av etablerade cellinjer eller primära cellkulturer från människor eller gnagare. De celler som används bör väljas ut på grundval av tillväxtförmåga vid odling, karyotypens stabilitet (inklusive antalet kromosomer) och den spontana frekvensen av kromosomavvikelser (7). De uppgifter som finns tillgängliga för närvarande tillåter inte bestämda rekommendationer, men de tyder på att det i utvärderingen av kemiska faror är viktigt att överväga p53-status, genetisk stabilitet (karyotyp) samt DNA-cellernas återhämtningskapacitet och ursprung (gnagare jämfört med människa) hos de celler som väljs ut för testning. Om denna testmetod används bör man överväga hur dessa och andra cellegenskaper inverkar på cellinjen för att upptäcka kromosomavvikelser, allteftersom kunskapen utvecklas på detta område.

Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

För testning in vitro krävs i regel ett exogent system för metabolisk aktivering, om cellerna inte är metaboliskt kompetenta i fråga om de ämnen som testas. Det exogena metaboliska aktiveringssystemet efterliknar inte helt förhållandena in vivo. Man bör också se till att undvika sådana förhållanden som leder till artefaktiska positiva resultat, dvs. kromosomskador som inte är orsakade av direkt samverkan mellan testkemikalierna och kromosomerna. Sådana förhållanden kan vara ändringar av pH eller osmolalitet (8) (9) (10), samverkan mellan mediets komponenter (11) (12) eller för hög cytotoxicitet (13) (14) (15) (16).

Detta test används för att detektera kromosomavvikelser som kan utlösas av klastogena händelser. Analysen av induktion av kromosomavvikelser bör göras med hjälp av celler i metafas. Det är därför viktigt att mitos har inträffat i både de behandlade och obehandlade odlingarna. Tillverkade nanomaterial kan kräva särskilda anpassningar av testmetoden, men de beskrivs inte här.

Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.

TESTPRINCIP

Cellodlingar från människa eller däggdjur exponeras för testkemikalien både med och utan exogent metaboliskt aktiveringssystem, utom om de celler som används har tillräcklig metaboliserande kapacitet (se punkt 13). Vid lämpliga förutbestämda intervall, efter det att cellodlingen har exponerats för testkemikalien, utförs behandling med ett ämne som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. colcemid eller colchicin). Därefter skördas cellerna och färgas in, varpå närvaro av kromatid- och kromosomavvikelser i metafascellerna analyseras mikroskopiskt.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Förberedelser

Celler

En mängd olika cellinjer kan användas (t.ex. äggstocksceller från kinesisk hamster (CHO), lungceller från kinesisk hamster V79, lungceller från kinesisk hamster (CHL)/IU, TK6) eller primära cellodlingar, inklusive perifera blodlymfocyter från människa eller andra däggdjur (7). Valet av använda cellinjer bör vara vetenskapligt motiverat. Om primära celler används av djurskyddsskäl bör man när så är möjligt överväga användning av primära celler med mänskligt ursprung som samlas in enligt humana etiska principer och föreskrifter. Humana perifera blodlymfocyter bör tas från unga rökfria personer (cirka 18–35 år) utan kända sjukdomar som inte nyligen har exponerats för genotoxiska läkemedel (t.ex. kemikalier, joniserande strålning) vid nivåer som skulle öka den bakomliggande incidensen av kromosomavvikelser. Detta garanterar att den bakomliggande incidensen av kromosomavvikelser är låg och konstant. Förekomsten av kromosomavvikelser ökar med åldern och denna tendens är mer markerad hos kvinnor än hos män (17) (18). Om celler från fler än en givare poolas för användning bör antalet givare anges. Man måste kunna påvisa att cellerna har delat sig från det att behandlingen med testkemikalien påbörjades fram till provtagningen av cellerna. Cellodlingarna hålls i en exponentiell celltillväxtfas (cellinjer) eller stimuleras så att de delar sig (primära lymfocytodlingar). Syftet med detta är att exponera cellerna i olika stadier av cellcykeln eftersom cellstadiernas känslighet för testkemikalierna kanske inte är känd. De primära celler som måste stimuleras med mitogena medel för att dela sig är i regel inte längre synkroniserade under exponeringen för testkemikalien (t.ex. humana lymfocyter efter mitogenisk stimulans i 48 timmar). Användning av synkroniserade celler under behandling rekommenderas inte, men kan vara godtagbar om det är motiverat.

Medier och odlingsbetingelser

Lämpliga odlingsmedier och inkubationsförhållanden (odlingskärl, luftfuktighet på 5 % CO2 i förekommande fall, inkubationstemperatur på 37 °C) bör väljas för odlingarna. Etablerade cellinjer och stammar bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på det modala kromosomantalets stabilitet och frånvaro av kontaminerad mykoplasma (7) (19), och får inte användas om kontamination har skett eller om det modala kromosomantalet har ändrats. Cellernas normala cellcykeltid eller den normala cellcykeltiden hos de primära kulturer som används i testlaboratoriet bör fastställas och bör överensstämma med kända cellegenskaper (20).

Beredning av odlingarna

Cellinjer: celler förökas från stamkulturer, sås ut i ett odlingsmedium som har en sådan densitet att celler i suspension eller monolager fortsätter att växa exponentiellt fram till skörd (konfluens av celler som växer i monolager bör undvikas).

Lymfocyter: helblod, behandlat med en antikoagulant (t.ex. heparin} eller så odlas separerade lymfocyter (t.ex. 48 timmar för humana lymfocyter) i närvaro av en mitogen [t.ex. fytohemaglutinin (PHA) för humana lymfocyter] för att framkalla celldelning innan cellerna exponeras för testkemikalien.

Metabolisk aktivering

Exogena metaboliserande system bör användas när cellerna inte har tillräcklig endogen metabolisk kapacitet. Det mest använda systemet, som rekommenderas som standard om inte annat kan motiveras, är en kofaktorstödd post-mitokondriell fraktion (S9) beredd ur lever från gnagare (vanligen råttor) som behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (21) (22) (23) eller en kombination av fenobarbital och β-naftoflavon (24) (25) (26) (27) (28) (29). Den senare kombinationen bryter inte mot Stockholmkonventionen om långlivade organiska föroreningar (30) och har visat sig vara lika effektiv som Aroclor 1254 när det gäller att inducera monooxygenaser (”mixed-function oxidases”) (24) (25) (26) (28). S9-fraktionen används vanligen i koncentrationer mellan 1–2 volymprocent men kan ökas till 10 volymprocent i det slutliga testmediet. Användning av produkter som minskar det mitotiska indexet, särskilt kalciumkomplexprodukter (31), bör undvikas under behandlingen. Valet av typ och koncentration av använt exogent metaboliskt aktiveringssystem eller metabolisk induktion kan påverkas av den kemikalieklass som testas.

Beredning av testkemikalien

Fasta testkemikalier bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och vid behov spädas ut innan cellerna behandlas (se punkt 23). Flytande testkemikalier kan tillsättas direkt till testsystemet och/eller spädas ut före behandling av testsystemet. Gaser eller flyktiga testkemikalier bör testas genom lämpliga modifikationer av standardprotokollen, såsom behandling i slutna odlingskärl (32) (33) (34). Testkemikalien bör beredas strax innan behandling om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel.

Testbetingelser

Lösningsmedel

Man bör välja ett lösningsmedel som optimerar testkemikaliens löslighet utan att testet påverkas negativt, t.ex. genom förändringar i celltillväxten som påverkar testkemikaliens integritet, reaktion med odlingskärlen eller försämrad metabolisk aktivering. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel (eller odlingsmedier). Vedertagna lösningsmedel är till exempel vatten eller dimetylsulfoxid. Generellt bör organiska lösningsmedel inte överstiga 1 volymprocent och vattenhaltiga lösningsmedel (saltlösningar eller vatten) bör inte överstiga 10 volymprocent i det slutliga behandlingsmediet. Om man använder lösningsmedel som inte är vedertagna (t.ex. etanol eller aceton) bör detta stödjas av uppgifter om att de är förenliga med testkemikalierna och testsystemet och att de inte är genetiskt toxiska vid den använda koncentrationen. Om ett sådant underlag saknas är det viktigt att inkludera obehandlade kontroller (se tillägg 1) som påvisar att inga skadliga eller klastogena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.

Mätning av cellproliferation och cytotoxicitet och val av exponeringskoncentrationer

Vid bestämning av den högsta testkemikaliekoncentrationen bör man undvika koncentrationer som kan ge artefaktiska positiva resultat, t.ex. för kraftig cytotoxicitet (se punkt 22), utfällning i odlingsmediet (se punkt 23) eller markerade ändringar av pH eller osmolalitet (se punkt 5). Om testkemikalien orsakar en markerad ändring av pH i mediet vid tillsättningstidpunkten kan pH justeras, företrädesvis genom buffring av det slutliga behandlingsmedlet för att undvika artefaktiska positiva resultat och upprätthålla lämpliga odlingsförhållanden.

Cellproliferationen bör mätas för att se till att ett tillräckligt antal behandlade celler har nått mitos under försöket och att behandlingarna görs på lämpliga nivåer av cytotoxicitet (se punkterna 18 och 22). Cytotoxicitet bör fastställas med och utan metabolisk aktivering i huvudförsöket med hjälp av lämplig indikation på celldöd och tillväxt. Även om det kan vara användbart att utvärdera cytotoxicitet i ett preliminärt test för att bättre definiera de koncentrationer som ska användas i huvudförsöket är ett preliminärt test inte obligatoriskt. Om ett preliminärt test utförs bör det inte ersätta mätning av cytotoxicitet i huvudförsöket.

Relativ populationsfördubblingstid (RPD) eller relativ ökning av celltal (RICC) är lämpliga metoder för bedömning av cytotoxicitet i cytogenetiska tester (13) (15) (35) (36) (55) (se tillägg 2 för formler). Om behandlings- och provtagningstiderna är långa efter det att behandlingen inletts kan cellcykellängder som är längre än 1,5 normala cellcykellängder (dvs. längre än totalt tre cellcykellängder) leda till en underskattning av cytotoxiteten om RPD används (37). Under dessa omständigheter kan RICC vara ett bättre mått. RPD kan dock även vara användbart för att utvärdera utvecklingen av cytotoxicitet efter 1,5 normala cellcykellängder.

När det gäller lymfocyter i primära odlingar är mitotiskt index (MI) ett mått på cytotoxiska/cytostatiska verkningar. Det påverkas dock av mätningstidpunkten efter behandling, använt mitogen och eventuella störningar i cellcykeln. MI är dock godtagbart eftersom andra cytotoxiska mätningar kan vara besvärliga och opraktiska och kanske inte går att använda för målpopulationen av lymfocyter som växer till följd av PHA-stimulering.

Rekommenderade cytotoxicitetsparametrar är således RICC och RPD för cellinjer och MI för primära odlingar av lymfocyter. Andra indikatorer (t.ex. cellintegritet, apoptos, nekros och cellcykel) kan ge värdefull kompletterande information.

Minst tre testkoncentrationer (exklusive lösningsmedel och positiva kontroller) som uppfyller acceptanskriterierna (lämplig cytotoxicitet, antal celler osv.) bör utvärderas. Oavsett celltyp (cellinjer eller primära odlingar av lymfocyter) kan antingen replikat eller enstaka behandlade kulturer användas för varje testad koncentration. Två identiska kulturer rekommenderas, men enstaka kulturer är också godtagbara under förutsättning att samma totala antal celler registreras för enstaka som för dubbla kulturer. Användning av enstaka kulturer är särskilt relevant när fler än tre koncentrationer utvärderas (se punkt 31). De resultat som erhölls i de oberoende replikatodlingarna vid en given koncentration kan slås ihop för dataanalysen (38). För testkemikalier med låg eller ingen cytotoxicitet är två- till trefaldiga koncentrationsintervall vanligen lämpliga. Om testkemikalien är cytotoxisk bör de valda testkoncentrationerna täcka ett relevant intervall för cytotoxiciteten enligt beskrivningen i punkt 22 och omfatta koncentrationer med måttlig, låg eller ingen cytotoxicitet. Många testkemikalier uppvisar branta koncentrations-reponskurvor. För att få uppgifter vid låg och måttlig cytotoxicitet eller undersöka dos-responsförhållandet i detalj är det därför nödvändigt att använda mera näraliggande koncentrationer och/eller fler än tre koncentrationer (enstaka kulturer eller replikat) i situationer där försöket måste upprepas (se punkt 47).

Om den maximala koncentrationen baseras på cytotoxicitet bör den högsta koncentrationen syfta till att uppnå 55 ± 5 % cytotoxicitet med hjälp av de rekommenderade cytotoxicitetsparametrarna (dvs. minskning av RICC och RPD för cellinjer och minskning av MI för primära odlingar av lymfocyter till 45 ± 5 % av den parallella negativa kontrollen). Man bör vara försiktig i tolkningen av positiva resultat som endast återfinns i den övre delen av detta cytotoxicitetsintervall på 55 ± 5 % (13).

För svårlösliga testkemikalier som inte är cytotoxiska vid koncentrationer som är lägre än den lägsta olösliga koncentrationen bör den högsta analyserade koncentrationen framkalla grumlighet eller en fällning som är synlig med blotta ögat eller med hjälp av ett inverterat mikroskop vid slutet av behandlingen med testkemikalien. Även om cytotoxicitet förekommer över den lägsta olösliga koncentrationen är det lämpligt att testa endast en koncentration som producerar grumlighet eller har en synlig fällning, eftersom fällningen kan ge artefaktiska effekter. När det gäller koncentrationer som ger fällningar bör man se till att detta inte stör testet (t.ex. färgning eller bestämning). Bestämning av löslighet i odlingsmediet före försöket kan vara användbart.

Om ingen fällning eller begränsande cytotoxicitet observeras ska de högsta testkoncentrationerna motsvara 10 mM, 2 mg/ml eller 2 μl/ml, enligt det som är lägst (39) (40) (41). Om testkemikalien inte har en definierad sammansättning, t.ex. ett ämne med okänd eller variabel sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiskt material (UVCB) (42), miljöextrakt osv., kan man behöva använda en högre toppkoncentration (t.ex. 5 mg/ml) om inte cytotoxiciteten är tillräckligt hög, för att öka koncentrationen för varje komponent. Det bör dock noteras att dessa krav kan skilja sig för humanläkemedel (43).

Kontroller

Parallella negativa kontroller (se punkt 15), bestående av enbart lösningsmedel i behandlingsmediet, och hanterade på samma sätt som behandlingsodlingarna, bör inkluderas varje gång odlingen skördas.

Parallella positiva kontroller behövs för att visa laboratoriets förmåga att identifiera klastogener enligt villkoren i det använda testprotokollet och, i förekommande fall, effektiviteten hos det exogena systemet för metabolisk aktivering. Exempel på positiva kontroller ges i tabell 1 nedan. Alternativa positiva kontrollkemikalier kan användas om det är motiverat. Tester av däggdjursceller in vitro för genetisk toxicitet är tillräckligt standardiserade och de positiva kontrollerna kan därför begränsas till en klastogen som kräver metabolisk aktivering. Förutsatt att denna enstaka positiva kontrollrespons görs samtidigt med det icke-aktiverade testet och med samma behandlingslängd kommer den att visa både aktiviteten hos det metaboliska aktiveringssystemet och testsystemets responsivitet. Separata positiva kontroller bör dock göras av långvariga behandlingar (utan S9) eftersom behandlingstiden skiljer sig från tester med metabolisk aktivering. Varje positiv kontroll bör användas för en eller flera koncentrationer som förväntas ge ökningar över bakgrunden som går att reproducera och detektera. Syftet med detta är att visa testsystemets känslighet (dvs. verkningarna är tydliga men avslöjar inte omedelbart identiteten hos de kodade utstryksglasen för avläsaren), och responsen får inte äventyras av cytotoxicitet som överskrider de gränser som anges i testmetoden.

Tabell 1

Rekommenderade referenskemikalier för utvärdering av laboratoriets kompetens att välja positiva kontroller.

FÖRFARANDET

Behandling med testkemikalien

Prolifererande celler behandlas med testkemikalien i såväl närvaro som frånvaro av ett system för metabolisk aktivering.

Tid för skörd av odlingen

För en grundlig utvärdering, vilket krävs för en slutsats om ett negativt resultat, bör samtliga tre försöksförhållanden som anges nedan tillämpas i en korttidsbehandling med och utan metabolisk aktivering samt en långtidsbehandling utan metabolisk aktivering (se punkterna 43, 44 och 45):

Om något av de ovannämnda försöksförhållandena leder till en positiv respons kan andra behandlingssystem behöva övervägas.

Kromosompreparation

Cellkulturer behandlas vanligtvis med colcemid eller colchicin under 1–3 timmar före skörd. Varje cellkultur skördas och behandlas separat för preparationen av kromosomer. Kromosompreparation innefattar hypoton behandling av cellerna, fixering och infärgning. I monolager kan det finnas mitotiska celler (som identifieras genom att de är runda och lösgör sig från ytan) i slutet av behandlingen på 3–6 timmar. Eftersom dessa mitotiska celler enkelt lösgörs, kan de förloras när mediet som innehåller testkemikalien avlägsnas. Om det finns bevis för en betydande ökning av antalet mitotiska celler jämfört med kontrollerna, vilket tyder på en sannolik mitotisk hämning, bör cellerna samlas in genom centrifugering och tillsättas till odlingarna igen, så att man inte förlorar celler som är i mitos och som riskerar kromosomavvikelser vid skördetidpunkten.

Analys

Alla utstryksglas, inklusive de från positiva och negativa kontroller, bör få en oberoende kodning innan den mikroskopiska analysen av kromosomavvikelser utförs. Eftersom fixeringen ofta ger upphov till brott på en del metafaser, med åtföljande förlust av kromosomer, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromerantal på minst 2 n ± 2, där n är det haploida antalet kromosomer.

Åtminstone 300 väl spridda metafaser bör förekomma per koncentration och kontroll för att man ska kunna dra slutsatsen att testkemikalien är tydligt negativ (se punkt 45). De 300 cellerna bör fördelas lika mellan replikaten när replikatodlingar används. Om enstaka odlingar används per koncentration (se punkt 21) bör minst 300 väl spridda metafaser förekomma i den enstaka odlingen. Fördelen med att använda 300 celler som förekomst är att testets statistiska kraft ökar och nollvärden kommer sällan att observeras (nollvärdet förväntas endast uppgå till 5 %) (44). Antalet påträffade metafaser kan minskas om höga antal celler med kromosomavvikelser observeras och testkemikalien anses vara tydligt positiv.

Celler med strukturella kromosomavvikelser, inklusive och exklusive luckor, ska bedömas. Brott och luckor definieras i tillägg 1 enligt (45) (46). Avvikelser av kromatid- och kromosomtyp bör registreras separat och klassificeras enligt subtyper (brott, utbyten). Laboratoriets förfaranden ska säkerställa att analysen av kromosomavvikelser utförs av välutbildade bedömare och fackgranskas vid behov.

Även om syftet med testet är att detektera strukturella kromosomavvikelser, är det viktigt att notera frekvenserna för polyploidi och endoreduplikation när dessa händelser observeras. (Se punkt 2).

Laboratoriets kompetens

För att fastställa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det används för rutintestning bör laboratoriet utföra en rad försök med positiva referenskemikalier som agerar via olika mekanismer samt flera negativa kontroller (med användning av olika lösningsmedel/vehiklar). Dessa positiva och negativa kontrollresponser bör överensstämma med litteraturen. Detta gäller inte laboratorier som redan har erfarenhet, dvs. har en historisk databas enligt punkt 37.

Laboratoriet bör undersöka ett urval av positiva kontrollkemikalier (se tabell 1 i punkt 26) med korta och långa behandlingar utan metabolisk aktivering, och även med kort behandlingstid med metabolisk aktivering, för att visa att det har kompetens att upptäcka klastogena kemikalier och bestämma effektiviteten hos det metaboliska aktiveringssystemet. En rad koncentrationer av de valda kemikalierna bör användas för att ge reproducerbara och koncentrationsrelaterade ökningar över bakgrunden i syfte att visa testsystemets sensitivitet och dynamiska omfång.

Historiska kontrolldata

Laboratoriet bör fastställa följande:

Om data för en historisk negativ kontrollfördelning samlas in först bör de parallella negativa kontrollerna överensstämma med publicerade kontrolldata om sådana finns. Allteftersom kontrollfördelningen kompletteras med fler försöksdata bör de parallella negativa kontrollerna i idealfallet ligga inom fördelningens kontrollgräns på 95 % (44) (47). Laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas kontroll bör inledningsvis baseras på minst 10 försök, men bör helst bestå av minst 20 försök utförda under jämförbara försöksbetingelser. Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex. C-diagram eller X-stapeldiagram (48)), för att fastställa hur variabla deras positiva och negativa kontrolldata är och för att visa att metoden är ”under kontroll” (44). Fler rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska kontrolldatabaser (t.ex. kriterier för att innefatta och utesluta data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (47).

Eventuella ändringar av försöksprotokollen bör övervägas när det gäller deras överensstämmelse med laboratoriets befintliga historiska kontrolldatabaser. Alla större inkonsekvenser bör leda till att en ny historisk kontrolldatabas upprättas.

Negativa kontrolldata bör bestå av förekomsten av celler med kromosomavvikelser från en enda odling eller summan av replikatodlingar enligt beskrivningen i punkt 21. Parallella negativa kontroller bör helst ligga inom kontrollgränsen på 95 % för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas (44) (47). Om parallella negativa kontrolldata faller utanför kontrollgränserna på 95 % kan de ändå ingå i den historiska kontrollfördelningen så länge de inte är extremt avvikande och det finns bevis för att testsystemet är under kontroll (se punkt 37) och att inga tekniska eller mänskliga fel begåtts.

DATA OCH RAPPORTERING

Presentation av resultaten

Procentandelen celler med strukturella kromosomavvikelser bör utvärderas. Avvikelser av kromatid- och kromosomtyp som klassificeras enligt subtyper (brott, utbyten) bör anges separat, med antal och intervaller för försöks- och kontrollodlingarna. Luckor i DNA-strängen registreras och rapporteras separat, men inkluderas i allmänhet inte i den totala avvikelsefrekvensen. Andelen polyploidi och/eller endoreduplicerade celler rapporteras om de observeras.

Parallella mätningar av cytotoxicitet för alla behandlade samt negativa och positiva kontrollkulturer i huvudförsöken avseende avvikelser bör samlas in.

Data bör anges per enskild odling. Dessutom bör alla data sammanfattas i tabellform.

Kriterier för godkännande

Testet måste uppfylla följande kriterier för att godkännas:

Utvärdering och tolkning av resultaten

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart positiv om något av följande gäller för någon av de undersökta försöksbetingelserna (se punkt 28):

Om alla dessa kriterier är uppfyllda anses testkemikalien kunna inducera kromosomavvikelser hos odlade däggdjursceller i detta testsystem. Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns i litteraturen (49) (50) (51).

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart negativ om följande gäller för samtliga undersökta försöksbetingelser (se punkt 28):

Testkemikalien anses inte kunna inducera kromosomavvikelser hos odlade däggdjursceller i detta testsystem.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller negativt svar.

Om responsen varken är klart negativ eller klart positiv enligt beskrivningen ovan eller för att göra det lättare att fastställa resultatets biologiska relevans bör uppgifterna fackgranskas och/eller undersökas ytterligare. Det kan även vara användbart att klassificera ytterligare celler (i förekommande fall) eller upprepa försöket, eventuellt med ändrade försöksbetingelser (t.ex. koncentrationsavstånd, andra metaboliska aktiveringsbetingelser (dvs. S9-koncentration eller S9-ursprung)).

I sällsynta fall är det inte möjligt att dra en slutsats om positiva eller negativa resultat trots ytterligare undersökningar, och i dessa fall anses den kemiska responsen vara tvetydig.

En ökning av antalet polyploida celler kan utgöra en indikation på att testkemikalien har potential att inhibera mitotiska processer och att inducera numeriska kromosomavvikelser (52). En ökning av antalet celler med endoreduplicerade kromosomer kan utgöra en indikation på att testkemikalierna har potential att inhibera cellcykelns förlopp (53) (54) (se punkt 2). Därför bör förekomsten av polyploida celler och celler med endoreduplicerade kromosomer registreras separat.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande information:

LITTERATUR

Tillägg 2.

FORMLER FÖR BESTÄMNING AV CYTOTOXICITET

Mitotiskt index (MI):

Relativ ökning av celltal (RICC) eller relativ populationsfördubbling (RPD) rekommenderas, eftersom den andel av cellpopulationen som har delat sig beaktas i båda metoderna.

där

Populationsfördubbling: [log (Cellantal efter behandling ÷ Ursprungligt cellantal)] ÷ log 2

En RICC eller en RPD på 53 % indikerar t.ex. 47 % cytotoxicitet/cytostas, och 55 % cytotoxicitet/cytostas mätt med MI innebär att det faktiska MI är 45 % av kontrollen.

I alla händelser bör antalet celler före behandling mätas, vilket även gäller behandlade och negativa kontrollodlingar.

Tidigare användes RCC (dvs. antalet celler i behandlade kulturer/antalet celler i kontrollkulturer) som cytotoxicitetsparameter, men rekommenderas inte längre eftersom cytotoxiciteten kan underskattas enligt detta mått.

I negativa kontrollkulturer bör populationsfördubblingstiden överensstämma med kravet på provtagning av celler efter behandling vid en tidpunkt som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd. Det mitotiska indexet bör vara tillräckligt högt för att få ett tillräckligt antal celler i mitos och tillförlitligt beräkna en minskning med 50 %.

(4)

I del B ska kapitel B.11 ersättas med följande:

”B.11   Test av kromosomavvikelser i benmärg hos däggdjur

INLEDNING

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 475 (2016). Det är en del av en serie av testmetoder för genetisk toxikologi. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

Tester av kromosomavvikelser i benmärg hos däggdjur är särskilt relevanta för att bedöma gentoxicitet, eftersom faktorer rörande in vivo-metabolism, farmakokinetik och DNA-reparationsprocesser är aktiva och bidrar till responsen, även om de varierar mellan arterna. Ett test in vivo är även användbart för fortsatta undersökningar av gentoxicitet, med detektion i ett in vitro-system.

Testet in vivo av kromosomavvikelser hos däggdjur används för att detektera strukturella kromosomavvikelser inducerade av testkemikalier i benmärgsceller hos djur, vanligen hos gnagare (2) (3) (4) (5). Strukturella kromosomavvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. Huvuddelen av de gentoxiska kemikalieinducerade avvikelserna är av kromatidtyp, men även avvikelser av kromosomtyp förekommer. Kromosomskada och liknande händelser är orsaken till många genetiska sjukdomar hos människa och det finns omfattande bevis för att sådana skador och liknande händelser, när de ger upphov till förändringar i onkogener och tumörsuppressorgener, är inblandade i cancer hos människa och i experimentella system. Polyploidi (inklusive endoreduplicering) kan uppstå vid tester av kromosomavvikelser in vivo. En ökning av polyploidi tyder inte i sig på aneugener, och kan helt enkelt tyda på störningar i cellcykeln eller cytotoxicitet. Detta test är inte utformat för att mäta aneuploidi. Mikrokärntest in vivo av erytrocyter hos däggdjur (kapitel B.12 i denna bilaga) och däggdjurmikrokärntest in vivo av erytrocyter (kapitel B.49) i denna bilaga är det in vivo- respektive in vitro-test som rekommenderas för detektion av aneuploidi.

Definitioner av använd terminologi anges i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

Gnagare används rutinmässigt i detta test, men även andra arter kan vara lämpliga i vissa fall om det är vetenskapligt motiverat. Benmärg är målvävnaden i detta test, eftersom det är en mycket kärlrik vävnad som innehåller en cellpopulation med en snabb cellcykel, och där cellerna enkelt kan isoleras och bearbetas. Om andra arter än råttor och möss används bör en vetenskaplig motivering lämnas i rapporten. Om andra arter än gnagare används bör mätningen av kromosomavvikelser i benmärg integreras i ett annat lämpligt toxicitetstest.

Om det finns bevis för att testkemikalien eller dess metaboliter inte kommer att nå målvävnaden kan detta test vara olämpligt att använda.

Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.

TESTMETODENS PRINCIP

Försöksdjuren exponeras för testkemikalien genom en lämplig exponeringsväg och avlivas sedan humant vid en lämplig tid efter behandlingen. Innan de avlivas behandlas djuren med ett ämne som gör att celler stannar upp i metafas (t.ex. colchicin eller colcemid). Kromosomberedningar görs sedan från benmärgscellerna och färgas in, varpå celler i metafas analyseras med avseende på kromosomavvikelser.

KONTROLL AV LABORATORIEKOMPETENS

Kompetensundersökningar

För att fastställa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det används för rutintestning bör laboratoriet visa sin förmåga att reproducera förväntade resultat från publicerade data (för kromosomavvikelser (6) t.ex. frekvenser med minst två positiva kontrollkemikalier (inklusive svag respons inducerad av låga doser av positiva kontroller) enligt tabell 1 och med förenliga vehikel-/lösningsmedelskontroller (se punkt 22). I försöken bör man använda doser som ger reproducerbara och dosrelaterade ökningar och visar testsystemets sensitivitet och dynamiska omfång när det gäller den berörda vävnaden (benmärg), med användning av den klassificeringsmetod som laboratoriet tillämpar. Detta gäller inte laboratorier som redan har erfarenhet, dvs. har en historisk databas enligt punkterna 10–

Historiska kontrolldata

Laboratoriet bör fastställa följande i kompetenundersökningarna:

Om data för en historisk negativ kontrollfördelning samlas in först bör de parallella negativa kontrollerna överensstämma med publicerade kontrolldata om sådana finns. Allteftersom den historiska kontrollfördelningen kompletteras med fler försöksdata bör de parallella negativa kontrollerna i idealfallet ligga inom fördelningens kontrollgräns på 95 %. Laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas bör vara statistiskt robust för att säkerställa laboratoriets förmåga att bedöma fördelningen av negativa kontrolldata. Enligt litteraturen kan minst 10 försök behövas, men databasen bör helst bestå av minst 20 försök utförda under jämförbara försöksbetingelser. Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex. C-diagram eller X-stapeldiagram (7)), för att fastställa hur variabla deras data är och för att visa att metoden är ”under kontroll”. Fler rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska kontrolldatabaser (t.ex. kriterier för att innefatta och utesluta data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (8).

Om laboratoriet inte slutför ett tillräckligt antal försök för att fastställa en statistiskt robust negativ kontrollfördelning (se punkt 11) under kompetensundersökningarna (beskrivs i punkt 9) kan fördelningen byggas upp under de första rutintesterna. Denna strategi bör följa rekommendationerna i litteraturen (8) och de negativa kontrollresultat som erhållits i dessa experiment bör överensstämma med publicerade negativa kontrolldata.

Eventuella ändringar av försöksprotokollen bör övervägas för att se till att resulterande data fortfarande överensstämmer med laboratoriets befintliga historiska kontrolldatabas. Endast stora inkonsekvenser bör leda till upprättandet av en ny historisk kontrolldatabas om en fackgranskning fastslår att den skiljer sig från den föregående fördelningen (se punkt 11). Om en ny databas byggs upp kanske inte en fullständig negativ kontrolldatabas behövs för att utföra ett faktiskt test, under förutsättning att laboratoriet kan visa att dess parallella negativa kontrollvärden fortfarande överensstämmer med den tidigare databasen eller motsvarande publicerade data.

Negativa kontrolldata bör bestå av förekomsten av strukturella kromosomavvikelser (exklusive luckor) hos varje djur. Parallella negativa kontroller bör helst ligga inom kontrollgränsen på 95 % för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas. Om parallella negativa kontrolldata faller utanför kontrollgränserna på 95 % kan de ändå ingå i den historiska kontrollfördelningen så länge de inte är extremt avvikande och det finns bevis för att testsystemet är under kontroll (se punkt 11) och att inga tekniska eller mänskliga fel begåtts.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Förberedelser

Val av djurart

Unga och friska vuxna exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Oftast används råttor, men även möss kan vara lämpliga. Andra lämpliga däggdjursarter kan användas om en vetenskaplig motivering anges i rapporten.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

För gnagare bör temperaturen i djurens rum bör vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör helst vara 50–60 %, men minst 40 % och bör helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodring kan konventionellt laboratoriefoder användas med obegränsad tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna väg. Gnagare bör hållas i små grupper (högst fem per bur) av samma kön och behandlingsgrupp, om inget aggressivt beteende kan förväntas, företrädesvis i fasta golvburar med lämplig miljöberikning. Djuren får endast hållas individuellt om det är vetenskapligt motiverat.

Förberedelse av djuren

Normalt används friska unga vuxna djur (6–10 veckor gamla vid behandlingsstarten, även om något äldre djur också är godtagbara) som slumpvis väljs ut till kontroll- och behandlingsgrupperna. Djuren ska ha en unik identifiering som appliceras med en human och minimalt invasiv metod (t.ex. ringmärkning, taggar, mikrochip eller biometrisk identifiering, men inte öron- eller tassclips). De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar. Burarna bör placeras så att eventuella verkningar på grund av placeringen minimeras. Korskontaminering av den positiva kontrollen och testkemikalien bör undvikas. Vid undersökningens början bör viktskillnaderna mellan försöksdjuren vara minimal och inte överskrida ± 20 % av medelvikten för varje kön.

Beredning av doser

Fasta testkemikalier bör lösas upp i, eller blandas med, lämpliga lösningsmedel eller vehiklar eller blandas i foder eller dricksvatten innan dosen administreras till djuren. Testkemikalier i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före doseringen. Vid inhalationexponering kan testkemikalier administreras såsom gas, ånga eller en fast/flytande aerosol, beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper. Nygjorda beredningar av testkemikalien bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel och lämpliga lagringsförhållanden bör fastställas.

Lösningsmedel/vehikel

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testkemikalien. Om andra lösningsmedel/vehiklar än väl kända används bör det finnas referensdata som visar att de är kompatibla. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar. Exempel på vanliga kompatibla lösningsmedel/vehiklar är vatten, fysiologisk saltlösning, metylcellulosalösning, karboximetylcellulosa natriumsaltlösning, olivolja och majsolja. I avsaknad av historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga strukturella avvikelser eller andra skadliga effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehikeln bör en preliminär undersökning utföras för att fastställa acceptansen för vehikelkontrollen.

Kontroller

Positiva kontroller

En grupp djur som behandlas med en positiv kontrollkemikalie bör normalt ingå i varje test. Denna regel kan frångås om testlaboratoriet har visat att det är kvalificerat att utföra testet och har fastställt ett historiskt positivt kontrollintervall. Om en parallell positiv kontrollgrupp inte ingår bör klassificeringskontroller (fasta och ofläckade utstryksglas) inkluderas i varje försök. Detta kan åstadkommas genom att inbegripa lämpliga referensprover i klassificeringen av undersökningen som har erhållits och lagrats från ett separat positivt kontrollförsök som utförs med jämna mellanrum (.tex var 6:e till 18 månad) på det laboratorium där testet utförs, t.ex. under kvalifikationsprövning och vid behov med jämna mellanrum därefter.

Positiva kontrollkemikalier bör på ett tillförlitligt sätt ge en detekterbar ökning i frekvensen av celler med strukturella kromosomavvikelser över den spontana nivån. Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos de kodade proverna för bedömaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testkemikalien och enligt ett annat behandlingsschema, och att provtagningen endast sker vid ett tillfälle. Dessutom kan användningen av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier övervägas i förekommande fall. Exempel på positiva kontrollkemikalier ges i tabell 1.

Tabell 1

Exempel på positiva kontrollkemikalier

Negativa kontroller

Djur från den negativa kontrollgruppen bör inkluderas vid varje provtagningstillfälle och i övrigt hanteras på samma sätt som behandlingsgrupperna, med undantag för att de inte behandlas med testkemikalien. Om lösningsmedel/vehikel används för att tillföra testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras lösningsmedlet/vehikeln. Om testlaboratoriet påvisar enhetliga variationer mellan djur och frekvenser av celler med strukturella avvikelser genom historiska negativa kontrolldata vid varje provtagningstillfälle kan det dock vara tillräckligt med en enda provtagning för den negativa kontrollen. Om en enda provtagning används för negativa kontroller bör den vara det första provtagningstillfället i undersökningen.

FÖRFARANDET

Djurens antal och kön

I regel är responsen när det gäller mikrokärnor liknande mellan han- och hondjur (9), och detta förväntas även gälla strukturella kromosomavvikelser. De flesta försök kan därför utföras på båda könen. Om det finns data som visar på relevanta skillnader mellan hanar och honor (t.ex. skillnader i systemisk toxicitet, metabolism, biotillgänglighet, benmärgstoxicitet osv., inklusive ett preliminärt test) bör båda könen användas. I detta fall kan det vara lämpligt att göra en undersökning av båda könen, t.ex. som en del av en upprepad dostoxicitetsundersökning. Om båda könen används kan ett faktorförsök vara lämpligt. En närmare beskrivning av hur man analyserar data med användning av faktorförsök ges i tillägg 2.

Gruppernas storlek vid försöksstarten bör fastställas. Målet bör vara minst fem analyserbara djur av ett kön, eller av varje kön om båda könen används, per grupp. I de fall där exponering av människa för kemikalier kan ge könsspecifika resultat, som t.ex. för vissa läkemedel, bör testet utföras med försöksdjur av lämpligt kön. Som en vägledning för ett vanligt krav på maximalt antal djur skulle det krävas 45 djur för en benmärgsundersökning med två provtagningstillfällen, tre dosgrupper och en parallell negativ kontrollgrupp plus en positiv kontrollgrupp (fem djur av ett kön i varje grupp).

Dosnivåer

Om det inte redan finns lämpliga data som kan ge vägledning om dosval och en preliminär undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvudundersökningen (10). Syftet med undersökningen bör vara att identifiera högsta tolererbara dos (MTD), som definieras som den dos som tolereras utan bevis för toxicitet som begränsar undersökningen i förhållande till dess varaktighet (t.ex. genom att inducera minskad kroppsvikt eller hematopoietisk systemcytotoxicitet, men inte dödlighet eller tecken på smärta, lidande eller ångest som kräver human avlivning (11)).

Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken producerar en indikation på toxicitet för benmärgen.

Kemikalier som uppvisar mättnad av toxikokinetiska egenskaper eller inducerar avgiftningsprocesser som kan leda till minskad exponering efter långtidsbehandling kan vara undantag från kriterierna för dosbestämning och bör utvärderas från fall till fall.

För att inhämta data om dosrespons bör en fullständig undersökning omfatta en negativ kontrollgrupp och minst tre dosnivåer som vanligen separeras av en faktor på 2, men inte högre än 4. Om testkemikalien inte visar toxicitet i en preliminär undersökning eller baserat på befintliga uppgifter bör den högsta dosen för engångsdosering vara 2 000 mg/kg kroppsvikt. Om testkemikalien orsakar toxicitet bör MTD vara den högsta dosen och de dosnivåer som används bör helst omfatta ett intervall från maxdos till en dos som producerar liten eller ingen toxicitet. När toxicitet i målvävnaden (benmärg) observeras vid alla testade dosnivåer rekommenderas fortsatta undersökningar med icke-toxiska doser. Undersökningar som syftar till att mer grundligt karakterisera kvantitativ information om dosrespons kan kräva ytterligare dosgrupper. Dessa gränser kan variera för vissa typer av testkemikalier (t.ex. humanläkemedel) som omfattas av särskilda krav.

Toleranstest

Om försök för att fastställa dosering eller befintliga data från besläktade djurstammar tyder på att ett behandlingssystem med minst gränsdosen (beskrivs nedan) inte ger några observerbara toxiska effekter (ingen minskning av benmärgens proliferation eller andra bevis på cytotoxicitet i målvävnaden), och om ingen gentoxicitet förväntas baserat på in vitro-undersökningar av gentoxicitet eller data från strukturellt besläktade kemikalier, anses det kanske inte nödvändigt med ett fullständigt test med tre dosnivåer, under förutsättning att det har påvisats att testkemikalien når målvävnaden (benmärg). I sådana fall kan en enda dosnivå, vid gränsdosen, vara tillräcklig. För en administrationsperiod på > 14 dagar är gränsdosen 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag. För administrationsperioder på 14 dagar eller mindre är gränsdosen 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag.

Tillförsel av doser

Den förväntade exponeringsvägen för människor bör beaktas vid utformningen av en analys. Därför kan exponeringsvägar (t.ex. föda, dricksvatten, lokalt, subkutant, intravenöst, oralt (via sond), inhalation, intratrakealt eller implantation) väljas som motiverad exponering. Exponeringsvägen bör i alla händelser väljas för att säkerställa lämplig exponering av målvävnaden. Intraperitoneal injektion rekommenderas generellt inte eftersom den inte är en avsedd exponeringsväg för människor, och bör endast användas med specifik vetenskaplig motivering. Om testkemikalien blandas i födan eller dricksvattnet bör man, särskilt i fråga om engångsdosering, se till att fördröjningen mellan födo- och vattenintag och provtagning är tillräcklig för att upptäcka effekterna (se punkterna 33–34). Den maximala vätskevolymen som kan administreras genom sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör normalt inte överstiga 1 ml per 100 g kroppsvikt, utom för vattenlösningar där högst 2 ml/100 g får användas. Användning av volymer som är större än så bör motiveras. Med undantag för irriterande eller frätande testkemikalier, som normalt kommer att ge stegrade verkningar vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa att en konstant volym ges i förhållande till kroppsvikten vid alla dosnivåer.

Behandlingsschema

Testkemikalierna ges normalt som en enstaka behandling, men kan även ges som en delad dos (dvs två eller flera behandlingar samma dag med högst 2–3 timmars mellanrum) för att underlätta tillförsel av stora volymer. Under dessa omständigheter eller när tillförseln av testkemikalien sker via inhalation bör provtagningstiden planeras baserat på tidpunkten för den sista doseringen eller när exponeringen upphör.

Det finns få uppgifter om huruvida ett protokoll med upprepade doser är lämpligt för detta test. Under omständigheter där det är önskvärt att integrera detta test med ett toxicitetstest med upprepade doser bör man dock vara noga med att undvika förlust av mitotiska celler med kromosomskador, som kan förekomma vid toxiska doser. Integrering är godtagbar när den högsta dosen är större eller motsvarar gränsdosen (se punkt 29) och en dosgrupp ges som gränsdos under behandlingsperiodens varaktighet. Mikrokärntest (testmetod B.12) bör vara det in vivo-test som väljs för kromosomavvikelser när integrering med andra undersökningar är önskvärt.

Benmärgsprov bör tas vid två separata tillfällen efter enstaka behandlingar. För gnagare bör det första provtagningsintervallet vara den tid som krävs för att slutföra 1,5 normala cellcykellängder (normalt 12–18 timmar efter behandlingsperioden). Eftersom den tid som krävs för upptag och metabolism av testkemikalien och dess effekt på cellcykelns kinetik kan påverka den optimala tiden för detektion av kromosomavvikelser, rekommenderas att provtagningen senareläggs till 24 timmar efter det första provtagningstillfället. Vid det första provtagningstillfället bör alla dosgrupper behandlas och prover samlas in för analys. Vid senare provtagningstillfällen behöver endast den högsta dosen ges. Om doseringar på mer än en dag används baserat på en vetenskaplig motivering bör man ha ett provtagningstillfälle vid upp till cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter den slutliga behandlingen.

Efter behandling och före provtagning injiceras försöksdjuren intraperitonealt med en lämplig dos av ett metafashämmande medel (t.ex. colcemid eller colchicin), och prover samlas in vid ett lämpligt intervall därefter. För möss är detta intervall ungefär 3–5 timmar före insamlingen och för råttor 2–5 timmar. Celler skördas från benmärgen, svullna, fixerade och färgade, och analyseras med avseende på kromosomavvikelser (12).

Observationer

Allmänna kliniska observationer av testdjuren bör göras och kliniska tecken registreras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen. Djuren bör observeras minst två gånger dagligen under doseringsperioden beträffande morbiditet och mortalitet. Alla djur bör vägas när undersökningen inleds, åtminstone en gång i veckan under undersökningar med upprepad dosering och vid avlivning. För undersökningar som varar minst en vecka bör mätning av foderkonsumtion göras minst en gång i veckan. Om testkemikalien tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas vid varje byte av vatten och minst en gång i veckan. Djur som uppvisar icke-dödliga indikatorer på överskottstoxicitet bör avlivas på ett humant sätt innan testperiodens slut (11).

Exponering av målvävnaden

Blodprov tas vid lämpliga tidpunkter för att möjliggöra undersökningar av testkemikaliens plasmanivåer. Syftet med detta är att visa att benmärgen har exponerats om så krävs och om det inte finns andra exponeringsdata (se punkt 44).

Benmärg och kromosompreparat

Omedelbart efter det att djuren avlivats humant tas benmärgsceller från djurens lår- eller skenben, exponeras för hypoton lösning och fixeras. Metafascellerna sprids sedan ut på utstryksglas och färgas med användning av etablerade metoder (se (3) (12)).

Analys

Alla utstryksglas, inklusive utstryksglas med positiva och negativa kontroller, bör ges en oberoende kodning före analysen och bör randomiseras så att bedömaren inte känner till behandlingsbetingelserna.

Det mitotiska indexet bör fastställas som ett mått på cytotoxicitet hos minst 1 000 celler per djur för alla behandlade försöksdjur (inklusive positiva kontroller), obehandlade försöksdjur eller djur för negativ kontroll med vehikel/lösningsmedel.

Minst 200 metafaser bör analyseras för varje djur med avseende på strukturella kromosomavvikelser, inklusive och exklusive luckor (6). Om den historiska databasen över negativa kontroller visar att bakgrundsmedelvärdet för frekvensen för strukturella kromosomavvikelser är < 1 % på testlaboratoriet bör man överväga att klassificera ytterligare celler. Avvikelser av kromatid- och kromosomtyp bör registreras separat och klassificeras enligt subtyper (brott, utbyten). Laboratoriets förfaranden ska säkerställa att analysen av kromosomavvikelser utförs av välutbildade bedömare och fackgranskas vid behov. Eftersom beredningen av utstryksglas ofta resulterar i brott på en del av de celler som är i metafas med förlust av kromosomer som följd, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromererantal på minst 2n ± 2, där n är antalet haploider för kromosomerna hos den arten.

DATA OCH RAPPORTERING

Behandling av resultaten

Individuella djurdata bör presenteras i tabellform. Mitotiskt index, antalet metafasceller som påträffas, antalet avvikelser per metafascell och procentandelen celler med strukturella kromosomavvikelser utvärderas för varje djur. Olika typer av strukturella kromosomavvikelser bör listas med antal och frekvenser för behandlade grupper och kontrollgrupper. Luckor samt polyploida celler och celler med endoreduplicerade kromosomer registreras separat. Frekvensen av luckor rapporteras men tas i regel inte med i analysen av den totala strukturella avvikelsefrekvensen. Om det inte finns några bevis för en skillnad i resultaten mellan könen, kan data kombineras för statistisk analys. Uppgifter om toxicitet för djur och kliniska tecken bör också rapporteras.

Kriterier för godkännande

Följande kriterier avgör om testet är godtagbart:

Utvärdering och tolkning av resultaten

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart positiv om följande gäller:

Om endast den högsta dosen undersöks vid ett visst provtagningstillfälle anses en testkemikalie vara klart positiv om det finns en statistiskt säkerställd ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen och resultaten ligger utanför fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser). Rekommendationer om lämpliga statistiska metoder finns i litteraturen (13). Om en dos-responsanalys genomförs bör minst tre behandlade dosgrupper analyseras. Statistiska tester som används bör betrakta djuret som den experimentella enheten. Positiva resultat i testet av kromosomavvikelser visar att testkemikalien inducerar strukturella kromosomavvikelser i benmärgen hos de arter som testades.

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart negativ om följande gäller för samtliga undersökta försöksbetingelser:

Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns i litteraturen (13). Bevis för att benmärgen exponerats för en testkemikalie kan vara en minskning av det mitotiska indexet eller mätningar av plasma- och blodnivåerna i förhållande till testkemikalien. Vid intravenös tillförsel behövs inga bevis på exponering. Alternativt kan ADME-data, som erhållits i en oberoende undersökning med samma exponeringsväg och samma arter, användas för att visa benmärgsexponering. Negativa resultat indikerar att testkemikalien, under dessa försöksbetingelser, inte inducerar strukturella kromosomavvikelser i benmärgen hos de arter som testades.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller negativt svar.

Om responsen varken är klart negativ eller klart positiv och för att göra det lättare att fastställa resultatets biologiska relevans (t.ex. en svag ökning eller en ökning som ligger på gränsen) bör de försök som slutförts fackgranskas och/eller undersökas ytterligare. I vissa fall kan analys av fler celler eller ett upprepat försök med modifierade försöksbetingelser vara användbart.

I sällsynta fall är det inte möjligt att dra en slutsats om huruvida testkemikalien ger positiva eller negativa resultat trots ytterligare undersökningar, och i dessa fall anses undersökningen vara tvetydig.

Frekvenserna av polyploida och endoreduplicerade metafaser bland det totala antalet metafaser bör registreras separat. En ökning av antalet polyploida/endoreduplicerade celler kan utgöra en indikation på att testkemikalierna har potential att inhibera mitotiska processer eller cellcykelns förlopp (se punkt 3).

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande information:

Sammanfattning

LITTERATUR

(5)

I del B ska kapitel B.12 ersättas med följande:

”B.12   Mikrokärntest av erytrocyter hos däggdjur

INLEDNING

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 474 (2016). Det är en del av en serie av testmetoder för genetisk toxikologi. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

Mikrokärntest in vivo hos däggdjur är särskilt relevanta för att bedöma gentoxicitet, eftersom faktorer rörande in vivo-metabolism, farmakokinetik och DNA-reparationsprocesser är aktiva och bidrar till responsen, även om de varierar mellan arterna. Ett test in vivo är även användbart för fortsatta undersökningar av gentoxicitet, med detektion i ett in vitro-system.

Mikrokärntest in vivo hos däggdjur används för att detektera skador som testkemikalien inducerar på kromosomerna i den mitotiska funktionen hos erytroblaster. Testet utvärderar bildning av mikrokärnor i erytrocyter som antingen tas från benmärgen eller perifera blodceller hos djur, vanligen gnagare.

Avsikten med testet av mikrokärnor är att identifiera kemikalier som orsakar cytogen skada, vilket resulterar i bildning av mikrokärnor som antingen innehåller isolerade kromosomfragment eller hela kromosomer.

När en erytroblast från benmärg utvecklas till en omogen erytrocyt (ibland även kallad polykromatisk erytrocyt eller retikulocyt) stöts huvudkärnan ut. Eventuella mikrokärnor som har bildats kan stanna kvar i cytoplasman. Visualisering eller detektering av mikrokärnor underlättas i dessa celler eftersom de saknar en huvudkärna. En ökning av frekvensen av omogna erytrocyter med mikrokärnor hos behandlade försöksdjur utgör en indikation på inducerade strukturella eller numeriska kromosomavvikelser.

Nybildade erytrocyter med mikrokärnor identifieras och kvantifieras genom färgning, följt av antingen visuell klassificering med mikroskop eller genom automatisk analys. Ett tillräckligt stort antal erytrocyter måste räknas i perifert blod eller benmärgen hos vuxna djur. Räkningen underlättas avsevärt om man använder en automatisk klassificeringsplattform. Användningen av sådana plattformar är godtagbara alternativ till manuell utvärdering (2). Jämförande studier har visat att sådana metoder, med användning av lämpliga kalibreringsstandarder, kan ge bättre reproducerbarhet och sensitivitet inom laboratoriet än manuell klassificering med mikroskop (3) (4). Automatiska system som kan mäta frekvenser för erytrocyter med mikrokärnor är bland annat flödescytometrar (5), bildanalysplattformar (6) (7) och laserskanningcytometrar, även om det finns andra alternativ (8).

Även om det normalt inte görs under testet kan kromosomfragment särskiljas från hela kromosomer med hjälp av ett antal kriterier. Dessa innefattar identifiering av närvaron eller frånvaron av en kinetokor eller av centromer-DNA, som båda är karakteristiska för intakta kromosomer. Frånvaro av kinetokor eller av centromer-DNA tyder på att mikrokärnorna endast innehåller kromosomfragment, medan närvaro är ett tecken på kromosomförlust.

Definitioner av använd terminologi anges i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

Målvävnaden för genetisk skada i detta test är benmärg hos unga vuxna gnagare, eftersom erytrocyter bildas i denna vävnad. Mätning av mikrokärnor i omogna erytrocyter i perifert blod hos andra däggdjursarter är godtagbart om det har visats att arten är tillräckligt känslig för att detektera kemikalier som orsakar strukturella eller numeriska kromosomavvikelser hos dessa celler (genom induktion av mikrokärnor i omogna erytrocyter) och en vetenskaplig motivering ges. Frekvensen av omogna erytrocyter med mikrokärnor utgör den huvudsakliga slutpunkten. Frekvensen av mogna erytrocyter som innehåller mikrokärnor i perifert blod kan också användas som endpoint hos arter utan stark selektion i mjälten mot celler med mikrokärnor och när djuren behandlas kontinuerligt under en period som är längre än livslängden för erytrocyter hos den använda arten (t.ex. fyra veckor eller mer hos möss).

Om det finns bevis för att testkemikalien eller dessa metaboliter inte kommer att nå målvävnaden kan detta test vara olämpligt att använda.

Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.

TESTMETODENS PRINCIP

Försöksdjuren exponeras för testkemikalien på ett lämpligt sätt. Om benmärg används bör försöksdjuren avlivas humant vid en lämplig tidpunkt efter behandling, varvid benmärgen extraheras och beredningar görs och färgas (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Om perifert blod används samlas blodet upp vid lämpliga tidpunkter efter behandling och beredningar görs, vilka sedan färgas in (12) (16) (17) (18). När behandlingen ges akut är det viktigt att välja lämpliga tidpunkter för skörd av benmärg eller blod så att behandlingsrelaterad induktion av omogna erytrocyter kan detekteras. Vid provtagning av perifert blod måste tillräckligt lång tid ha gått för att dessa händelser ska vara synliga i det cirkulerande blodet. Beredningarna analyseras med avseende på närvaro av mikrokärnor, antingen genom visualisering med användning av mikroskop, bildanalys, flödescytometri eller laserskanningcytometri.

KVALIFIKATIONSPRÖVNING AV LABORATORIET

Kvalifikationsprövning

För att fastställa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det används för rutintestning bör laboratoriet visa sin förmåga att reproducera förväntade resultat från publicerade data (17) (19) (20) (21) (22) för frekvenser av mikrokärnor med minst två positiva kontrollkemikalier (inklusive svag respons som induceras av låga doser av positiva kontroller) enligt tabell 1 och med förenliga vehikel-/lösningsmedelskontroller (se punkt 26). I försöken bör man använda doser som ger reproducerbara och dosrelaterade ökningar och visar testsystemets sensitivitet och dynamiska omfång när det gäller den berörda vävnaden (benmärg eller perifert blod), med användning av den klassificeringsmetod som laboratoriet tillämpar. Detta gäller inte laboratorier som redan har erfarenhet, dvs. har en historisk databas enligt punkterna 14–18.

Historiska kontrolldata

Laboratoriet bör fastställa följande i kvalifikationsprövningen:

Om data för en historisk negativ kontrollfördelning samlas in först bör de parallella negativa kontrollerna överensstämma med publicerade kontrolldata om sådana finns. Allteftersom den historiska kontrollfördelningen kompletteras med fler försöksdata bör de parallella negativa kontrollerna i idealfallet ligga inom fördelningens kontrollgräns på 95 %. Laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas bör vara statistiskt robust för att säkerställa laboratoriets förmåga att bedöma fördelningen av negativa kontrolldata. Enligt litteraturen kan minst 10 försök behövas, men databasen bör helst bestå av minst 20 försök utförda under jämförbara försöksbetingelser. Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex. C-diagram eller X-stapeldiagram (23)), för att fastställa hur variabla deras data är och för att visa att metoden är ”under kontroll”. Fler rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska kontrolldatabaser (t.ex. kriterier för att innefatta och utesluta data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (24).

Om laboratoriet inte slutför ett tillräckligt antal försök för att fastställa en statistiskt robust negativ kontrollfördelning (se punkt 15) under kompetensundersökningarna (beskrivs i punkt 13) kan fördelningen byggas upp under de första rutintesterna. Denna strategi bör följa rekommendationerna i litteraturen (24) och de negativa kontrollresultat som erhållits i dessa experiment bör överensstämma med publicerade negativa kontrolldata.

Eventuella ändringar av försöksprotokollen bör övervägas för att se till att resulterande data fortfarande överensstämmer med laboratoriets befintliga historiska kontrolldatabas. Endast stora inkonsekvenser bör leda till upprättandet av en ny historisk kontrolldatabas om en fackgranskning fastslår att den skiljer sig från den föregående fördelningen (se punkt 15). Om en ny databas byggs upp kanske inte en fullständig negativ kontrolldatabas behövs för att utföra ett faktiskt test, under förutsättning att laboratoriet kan visa att dess parallella negativa kontrollvärden fortfarande överensstämmer med den tidigare databasen eller motsvarande publicerade data.

Negativa kontrolldata bör bestå av förekomsten av omogna erytrocyter med mikrokärnor hos varje djur. Parallella negativa kontroller bör helst ligga inom kontrollgränsen på 95 % för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas. Om parallella negativa kontrolldata faller utanför kontrollgränserna på 95 % kan de ändå ingå i den historiska kontrollfördelningen så länge de inte är extremt avvikande och det finns bevis för att testsystemet är under kontroll (se punkt 15) och att inga tekniska eller mänskliga fel begåtts.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Förberedelser

Val av djurart

Unga och friska vuxna exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Möss, råttor eller andra lämpliga däggdjursarter kan användas. När perifert blod används måste det fastställas att avlägsnandet av celler med mikrokärnor i mjälten från cirkulationen inte gör det svårare att detektera inducerade mikrokärnor i de arter som valts ut. Detta har tydligt visats hos perifert blod från möss och råttor (2). Om andra arter än råttor och möss används bör en vetenskaplig motivering lämnas i rapporten. Om andra arter än gnagare används bör mätningen av inducerade mikrokärnor integreras i ett annat lämpligt toxicitetstest.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

För gnagare bör temperaturen i försöksdjurens rum vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör helst vara 50–60 %, men minst 40 % och bör helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodring kan konventionellt laboratoriefoder användas med obegränsad tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna väg. Gnagare bör hållas i små grupper (högst fem per bur) av samma kön och behandlingsgrupp, om inget aggressivt beteende kan förväntas, företrädesvis i fasta golvburar med lämplig miljöberikning. Djuren får endast hållas individuellt om det är vetenskapligt motiverat.

Förberedelse av djuren

Normalt används friska unga vuxna djur (6–10 veckor gamla vid behandlingsstarten, även om något äldre djur också är godtagbara) som slumpvis väljs ut till kontroll- och behandlingsgrupperna. Djuren ska ha en unik identifiering som appliceras med en human och minimalt invasiv metod (t.ex. ringmärkning, taggar, mikrochip eller biometrisk identifiering, men inte öron- eller tassclips). De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar. Burarna bör placeras i sådan ordning att eventuella verkningar på grund av placeringen minimeras. Korskontaminering av den positiva kontrollen och testkemikalien bör undvikas. Vid undersökningens början bör viktskillnaderna mellan försöksdjuren vara minimal och inte överstiga ± 20 % av medelvikten för varje kön.

Beredning av doser

Fasta testkemikalier bör lösas upp i, eller blandas med, lämpliga lösningsmedel eller vehiklar eller blandas i foder eller dricksvatten innan dosen administreras till djuren. Testkemikalier i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före doseringen. Vid inhalationexponering kan testkemikalier administreras såsom gas, ånga eller en fast/flytande aerosol, beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper. Nygjorda beredningar av testkemikalien bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel och lämpliga lagringsförhållanden bör fastställas.

Testbetingelser

Lösningsmedel/vehikel

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används bör det finnas referensdata som visar att de är kompatibla. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar. Exempel på vanliga kompatibla lösningsmedel/vehiklar är vatten, fysiologisk saltlösning, metylcellulosalösning, karboximetylcellulosa natriumsaltlösning, olivolja och majsolja. I avsaknad av historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga effekter på mikrokärnor eller andra skadliga effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehikeln bör en preliminär undersökning utföras för att fastställa acceptansen för vehikelkontrollen.

Kontroller

Positiva kontroller

En grupp djur som behandlas med en positiv kontrollkemikalie bör normalt ingå i varje test. Denna regel kan frångås om testlaboratoriet har visat att det är kvalificerat att utföra testet och har fastställt ett historiskt positivt kontrollintervall. Om en parallell positiv kontrollgrupp inte ingår bör klassificeringskontroller (fixerade och ofläckade utstryksglas eller prover med cellsuspensioner, beroende på vad som är lämpligt för klassificeringsmetoden) inkluderas i varje försök. Detta kan åstadkommas genom att inbegripa lämpliga referensprover i klassificeringen av undersökningen som har erhållits och lagrats från ett separat positivt kontrollförsök som utförs med jämna mellanrum (.tex var 6:e till 18 månad), t.ex. under kvalifikationsprövning och vid behov med jämna mellanrum därefter.

Positiva kontrollkemikalier bör på ett tillförlitligt sätt ge en detekterbar ökning i frekvensen av mikrokärnor över den spontana nivån. Om klassificeringen görs manuellt med mikroskop bör positiva kontrolldoser väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos de kodade proverna för bedömaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testkemikalien och enligt ett annat behandlingsschema, och att provtagningen endast sker vid ett tillfälle. Dessutom kan användningen av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier övervägas i förekommande fall. Exempel på positiva kontrollkemikalier ges i tabell 1.

Tabell 1

Exempel på positiva kontrollkemikalier.

Kemikalier och CASRN

Etylmetansulfonat [CASRN 62-50-0]

Metylmetansulfonat [CASRN 66-27-3]

Etylnitrosourea [CASRN 759-73-9]

Mitomycin C [CASRN 50-07-7]

Cyklofosfamid (monohydrat) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Trietylenmelamin [CASRN 51-18-3]

Colchicin [CASRN 64-86-8] eller vinblastin [CASRN 865-21-4] – som aneugens

Negativa kontroller

Djur från den negativa kontrollgruppen bör inkluderas vid varje provtagningstillfälle och i övrigt hanteras på samma sätt som behandlingsgrupperna, med undantag för att de inte behandlas med testkemikalien. Om lösningsmedel/vehikel används för att tillföra testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras lösningsmedlet/vehikeln. Om testlaboratoriet påvisar konsekventa variationer mellan djur och frekvenser av celler med mikrokärnor genom historiska negativa kontrolldata vid varje provtagningstillfälle kan det dock vara tillräckligt med en enda provtagning för den negativa kontrollen. Om en enda provtagning används för negativa kontroller bör den vara det första provtagningstillfället i undersökningen.

Om perifert blod används är ett förbehandlat prov godtagbart i stället för en parallell negativ kontroll för kortvariga undersökningar om de resulterande uppgifterna överensstämmer med testlaboratoriets historiska kontrolldatabas. Det har visats att förbehandling av prov med små volymer (t.ex. under 100 μl/dag) hos råttor har en minimal inverkan på bakgrundsfrekvensen av mikrokärnor (25).

FÖRFARANDE

Djurens antal och kön

I regel är mikrokärnornas respons liknande mellan han- och hondjur och de flesta undersökningar kan därför utföras på endera könet (26). Om det finns data som visar på relevanta skillnader mellan hanar och honor (t.ex. skillnader i systemisk toxicitet, metabolism, biotillgänglighet, benmärgstoxicitet osv., inklusive ett preliminärt test) bör båda könen användas. I detta fall kan det vara lämpligt att göra en undersökning av båda könen, t.ex. som en del av en upprepad dostoxicitetsundersökning. Om båda könen används kan ett faktorförsök vara lämpligt. En närmare beskrivning av hur man analyserar data med användning av faktorförsök ges i tillägg 2.

Gruppernas storlek vid försöksstarten bör fastställas. Målet bör vara minst fem analyserbara djur av ett kön, eller av vardera könet om båda används, per grupp. I de fall där exponering av människa för kemikalier kan ge könsspecifika resultat, som t.ex. för vissa läkemedel, bör testet utföras med försöksdjur av lämpligt kön. Som en vägledning för ett vanligt krav på maximalt antal djur skulle det krävas 25–35 djur för en benmärgsundersökning som utförs enligt de parametrar som fastställs i punkt 37, med tre dosgrupper och parallella negativa och positiva kontrollgrupper (fem djur av ett kön i varje grupp)

Dosnivåer

Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvudundersökningen (27). Syftet med undersökningen bör vara att identifiera högsta tolererbara dos (MTD), som definieras som den dos som tolereras utan bevis för toxicitet som begränsar undersökningen i förhållande till dess varaktighet (t.ex. genom att inducera minskad kroppsvikt eller hematopoietisk systemcytotoxicitet, men inte dödlighet eller tecken på smärta, lidande eller ångest som kräver human avlivning (28)).

Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger upphov till toxicitet i benmärgen (t.ex. en reduktion av andelen omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter i benmärgen eller i perifert blod på mer än 50 % men inte mindre än 20 % av kontrollvärdet). Om man analyserar CD71-positiva celler i den perifera blodcirkulationen (dvs. genom flödescytometri) reagerar denna mycket unga fraktion av omogna erytrocyter dock mycket snabbare på toxiska utmaningar än större RNA-positiva kohorter av omogna erytrocyter. Därför kan en skenbart högre toxicitet framträda i utformningar med akut exponering som undersöker CD71-positiva fraktioner av omogna erytrocyter jämfört med undersökningar som identifierar omogna erytrocyter baserat på RNA-innehåll. Om försökens behandlingstider är fem dagar eller kortare kan därför den högsta dosnivån för testkemikalier som orsakar toxicitet definieras som den dos som ger en statistiskt signifikant minskning av andelen CD71-positiva omogna erytrocyter av det totala antalet erytrocyter, men inte mindre än 5 % av kontrollvärdet (29).

Kemikalier som uppvisar mättnad av toxikokinetiska egenskaper eller inducerar avgiftningsprocesser som kan leda till minskad exponering efter långtidstillförsel kan vara undantag från kriterierna för dosbestämning och bör utvärderas från fall till fall.

För att inhämta data om dosrespons bör en fullständig undersökning omfatta en negativ kontrollgrupp och minst tre dosnivåer som vanligen skiljer sig med en faktor 2, men inte högre än 4. Om testkemikalien inte orsakar toxicitet i en preliminär undersökning eller baserat på befintliga uppgifter är den högsta dosen 1 000 mg/kg/kroppsvikt/dag för administrationsperioder på 14 dagar eller 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag för administrationsperioder på mindre än 14 dagar. Om testkemikalien orsakar toxicitet bör MTD vara den högsta dosen och de dosnivåer som används bör helst omfatta ett intervall från maxdos till en dos som producerar liten eller ingen toxicitet. När toxicitet i målvävnaden (benmärg) observeras vid alla testade dosnivåer rekommenderas fortsatta undersökningar med icke-toxiska doser. Undersökningar som syftar till att mer grundligt karakterisera kvantitativ information om dosrespons kan kräva ytterligare dosgrupper. Dessa gränser kan variera för vissa typer av testkemikalier (t.ex. humanläkemedel) som omfattas av särskilda krav.

Toleranstest

Om försök för att fastställa dosering eller befintliga data från besläktade djurstammar tyder på att ett behandlingssystem med minst gränsdosen (beskrivs nedan) inte ger några observerbara toxiska effekter (ingen minskning av benmärgens proliferation eller andra bevis på cytotoxicitet i målvävnaden), och om ingen gentoxicitet förväntas baserat på in vitro-undersökningar av gentoxicitet eller data från strukturellt besläktade kemikalier, anses det kanske inte nödvändigt med ett fullständigt test med tre dosnivåer, under förutsättning att det har påvisats att testkemikalien når målvävnaden (benmärg). I sådana fall kan en enda dosnivå, vid gränsdosen, vara tillräcklig. För administrationsperioder på 14 dagar eller mer är gränsdosen 1 000 mg/kg/kroppsvikt/dag. För administrationsperioder på mindre än 14 dagar är gränsdosen 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag.

Tillförsel av doser

Den förväntade exponeringsvägen för människor bör beaktas vid utformningen av en analys. Därför kan exponeringsvägar (t.ex. föda, dricksvatten, lokalt subkutant, intravenöst, oralt (via sond), inhalation, intratrakealt eller implantation) väljas som motiverad exponering. Exponeringsvägen bör i alla händelser väljas för att säkerställa lämplig exponering av målvävnaden. Intraperitoneal injektion rekommenderas generellt inte eftersom den inte är en avsedd exponeringsväg för människor, och bör endast användas med specifik vetenskaplig motivering. Om testkemikalien blandas i födan eller dricksvattnet bör man, särskilt i fråga om engångsdosering, se till att fördröjningen mellan födo- och vattenintag och provtagning är tillräcklig för att upptäcka effekterna (se punkt 37). Den maximala vätskevolymen som kan administreras genom sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör normalt inte överstiga 1 ml per 100 g kroppsvikt, utom för vattenlösningar där högst 2 ml/100 g får användas. Användning av volymer som är större än den bör motiveras. Med undantag för irriterande eller frätande testkemikalier, som normalt kommer att ge stegrade verkningar vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa att en konstant volym ges i förhållande till kroppsvikten vid alla dosnivåer.

Behandlingsschema

Företrädesvis utförs två eller fler behandlingar som ges i 24-timmarsintervaller, särskilt om detta test integreras i andra toxicitetsundersökningar. Alternativt kan enstaka behandlingar ges om det är vetenskapligt motiverat (om det t.ex. är känt att testkemikalien blockerar cellcykeln). Testkemikalierna kan också ges som en enstaka behandling, men kan även ges som en delad dos (dvs två eller flera behandlingar samma dag med högst 2–3 timmars mellanrum) för att underlätta tillförsel av stora volymer. Under dessa omständigheter eller när tillförseln av testkemikalien sker via inhalation bör provtagningstiden planeras baserat på tidpunkten för den sista doseringen eller när exponeringen upphör.

Testet kan utföras på möss eller råttor på ett av följande tre sätt:

Andra doserings- eller provtagningssystem kan användas när det är relevant, vetenskapligt motiverat och underlättar integration med andra toxicitetstester.

Observationer

Allmänna kliniska observationer av testdjuren bör göras och kliniska tecken registreras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen. Djuren bör observeras minst två gånger dagligen under doseringsperioden beträffande morbiditet och mortalitet. Alla djur bör vägas när undersökningen inleds, åtminstone en gång i veckan under undersökningar med upprepad dosering och vid avlivning. För undersökningar som varar minst en vecka bör mätning av foderkonsumtion göras minst en gång i veckan. Om testkemikalien tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas vid varje byte av vatten och minst en gång i veckan. Djur som uppvisar icke-dödliga indikatorer på överskottstoxicitet bör avlivas på ett humant sätt innan testperiodens slut (28). Under vissa omständigheter kan djurens kroppstemperatur övervakas, eftersom det är känt att hyper- och hypotermi till följd av behandling ger felaktiga resultat (32) (33) (34).

Exponering av målvävnaden

Blodprov tas vid lämpliga tidpunkter för att möjliggöra undersökningar av testkemikaliens plasmanivåer. Syftet med detta är att visa att benmärgen har exponerats om så krävs och om det inte finns andra exponeringsdata (se punkt 48).

Preparation av benmärg/blod

Benmärgsceller erhålls vanligen från lårbenet eller skenbenet omedelbart efter det att djuret avlivats på ett humant sätt. Normalt avlägsnas cellerna, prepareras och färgas in med hjälp av etablerade metoder. Små volymer av perifert blod kan erhållas enligt lämpliga djurskyddsnormer, antingen med hjälp av en metod där testdjuret överlever, t.ex. blödning från svansådern eller något annat lämpligt blodkärl, eller genom hjärtpunktering eller provtagning från ett stort blodkärl vid avlivning. Både för erytrocyter från benmärg och perifert blod, beroende på analysmetod, kan cellerna färgas in omedelbart supravitalt (16) (17) (18). Utstrykspreparat görs och färgas sedan in för mikroskopundersökning eller fixeras och färgas på lämpligt sätt för analys med flödescytometri. Användningen av ett DNA-specifikt färgämne (t.ex. akridinorange (35) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (36)) kan eliminera några av de artefakter som ar associerade med användning av ett färgämne som inte är DNA-specifikt. Denna fördel utesluter inte användningen av konventionella färgämnen (t.ex. Giemsa för mikroskopanalys). Ytterligare system (t.ex. cellulosakolonner för att avlägsna celler med kärnor (37) (38) kan även användas, förutsatt att dessa system har visat sig vara förenliga med beredningen av prov i laboratoriet.

Om sådana metoder är tillämpliga kan system med anti-kinetokor-antikroppar (39), FISH-teknik med pancentromera DNA-prober (40) eller primad in situ-märkning med pancentromerspecifik primer, tillsammans med lämplig DNA-motfärgning (41), användas för att identifiera mikrokärnans karaktär (kromosom/kromosomfragment) för att fastställa om induktionen av mikrokärnor beror på klastogen och/eller aneugen aktivitet. Andra metoder för differentiering mellan klastogener och aneugener kan användas om de har visat sig vara effektiva.

Analys (manuell och automatisk)

Alla utstryksglas eller analysprover, inklusive glasen från de positiva och negativa kontrollerna, bör ges en oberoende kodning före analysen och bör randomiseras så att den manuella bedömaren inte känner till behandlingsbetingelserna. Kodning är inte nödvändig vid användning av automatiska klassificeringssystem som inte bygger på visuell kontroll och inte kan påverkas av bedömarens förutfattade mening. Andelen omogna erytrocyter bland det totala antalet erytrocyter (omogna + mogna) bestäms för varje djur genom att totalt räkna minst 500 erytrocyter för benmärg och 2 000 erytrocyter för perifert blod (42). Minst 4 000 omogna erytrocyter per djur bör undersökas med avseende på förekomst av omogna erytrocyter med mikrokärnor (43). Om den historiska databasen över negativa kontroller visar att bakgrundsmedelvärdet för frekvensen för omogna erytrocyter i mikrokärnor är < 0,1 % på testlaboratoriet bör man överväga att klassificera ytterligare celler. När proverna analyseras bör andelen omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter hos de behandlade djuren inte vara mindre än 20 % av andelen vehikel-/lösningskontroll vid klassificering med mikroskop, och inte mindre än cirka 5 % av andelen vehikel-/lösningskontroll när CD71 + omogna erytrocyter klassificeras med cytometriska metoder (se punkt 31) (29). Exempel: I ett försök med benmärg som klassificeras med mikroskop där kontrollandelen omogna erytrocyter i benmärgen uppgår till 50 % skulle den övre toxicitetsgränsen vara 10 % omogna erytrocyter.

Råttans mjälte isolerar och förstör erytrocyter med mikrokärnor. För att upprätthålla en hög sensitivitet vid analyser av perifert blod från råttor bör analysen av omogna erytrocyter med mikrokärnor därför begränsas till den yngsta fraktionen. Vid användning av automatiska analysmetoder kan de mest omogna erytrocyterna identifieras via deras höga RNA-halt eller den höga nivån av transferrinreceptorer (CD71+), uttryckt på deras yta (31). En direkt jämförelse av olika färgningsmetoder har dock visat att tillfredsställande resultat kan erhållas med olika metoder, inklusive konventionell färgning med akridinorange (3) (4).

DATA OCH RAPPORTERING

Behandling av resultaten

Individuella djurdata bör presenteras i tabellform. Antalet omogna erytrocyter som påträffas, antalet omogna erytrocyter med mikrokärnor, och andelen omogna bland det totala antalet erytrocyter bör listas separat för varje djur som analyseras. Om möss behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller mer bör även uppgifter om antal och andel mogna erytrocyter med mikrokärnor anges om sådana uppgifter samlas in. Uppgifter om toxicitet för djur och kliniska tecken bör också rapporteras.

Kriterier för godkännande

Följande kriterier avgör om testet är godtagbart:

Utvärdering och tolkning av resultaten

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart positiv om följande gäller:

Om endast den högsta dosen undersöks vid ett visst provtagningstillfälle anses en testkemikalie vara klart positiv om det finns en statistiskt säkerställd ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen och resultaten ligger utanför fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser). Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns i litteraturen (44) (45) (46) (47). Om en dos-responsanalys genomförs bör minst tre behandlade dosgrupper analyseras. Statistiska tester som används bör betrakta djuret som den experimentella enheten. Positiva resultat i testet av mikrokärnor tyder på att testkemikalien inducerar mikrokärnor som är ett resultat av en kromosomskada eller skada på den mitotiska apparaten i erytroblasterna hos den art som testas. Om ett test utfördes för att detektera centromerer i mikrokärnorna är en testkemikalie som producerar mikrokärnor med centromerer (centromerisk DNA eller kinetokor, som visar på fullständig kromosomförlust) bevis på att testkemikalien är en aneugen.

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart negativ om följande gäller för samtliga undersökta försöksbetingelser:

Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns i litteraturen (44) (45) (46) (47). Bevis för att benmärgen exponerats för en testkemikalie kan vara en minskning av förhållandet mellan omogna och mogna erytrocyter eller mätningar av plasma- och blodnivåerna i förhållande till testkemikalien. Vid intravenös tillförsel behövs inga bevis på exponering. Alternativt kan ADME-data, som erhållits i en oberoende undersökning med samma exponeringsväg och samma arter, användas för att visa benmärgsexponering. Negativa resultat indikerar att testkemikalien, under dessa försöksbetingelser, inte ger upphov till mikrokärnor i de omogna erytrocyterna hos den art som testas.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller negativt svar.

Om responsen varken är klart negativ eller klart positiv och för att göra det lättare att fastställa resultatets biologiska relevans (t.ex. en svag ökning eller en ökning som ligger på gränsen) bör de försök som slutförts fackgranskas och/eller undersökas ytterligare. I vissa fall kan analys av fler celler eller ett upprepat försök med modifierade försöksbetingelser vara användbart.

I sällsynta fall är det inte möjligt att dra en slutsats om huruvida testkemikalien ger positiva eller negativa resultat trots ytterligare undersökningar, och i dessa fall anses undersökningen vara tvetydig.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande information:

LITTERATURHÄNVISNINGAR

(6)

I del B ska kapitel B.15 utgå.

(7)

I del B ska kapitel B.16 utgå.

(8)

I del B ska kapitel B.18 utgå.

(9)

I del B ska kapitel B.19 utgå.

(10)

I del B ska kapitel B.20 utgå.

(11)

I del B ska kapitel B.24 utgå.

(12)

I del B ska kapitel B.47 ersättas med följande:

”B.47   Testmetoden BCOP (Bovine Corneal Opacity and Permeability) för identifiering av i) kemikalier som orsakar allvarlig ögonskada och ii) kemikalier för vilka det inte krävs klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada

INLEDNING

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 437 (2013). BCOP-testmetoden utvärderades 2006 och 2010 (1)(2) av amerikanska ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) tillsammans med Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM) och det japanska centret för validering av alternativa metoder (JaCVAM). I den första utvärderingen undersökte man om BCOP-testmetoden var användbar för att identifiera kemikalier (ämnen och blandningar) som framkallar allvarliga ögonskador (1). I den andra utvärderingen undersökte man om BCOP-testmetoden var användbar för att identifiera kemikalier (ämnen och blandningar) som inte är klassificerade för ögonirritation eller allvarliga ögonskador (2). BCOP-valideringsdatabasen innehöll totalt 113 ämnen och 100 blandningar (2) (3). Av dessa utvärderingar och granskningarna av dessa drog man slutsatsen att testmetoden korrekt kan identifiera kemikalier (både ämnen och blandningar) som inducerar allvarlig ögonskada (kategori 1) samt kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt FN:s globala harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (4) och förordning (EG) nr 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) (7). Metoden ansågs därför vara vetenskapligt giltig för båda ändamålen. Med allvarlig ögonskada avses vävnadsskada i ögat eller allvarlig synnedsättning som uppstår efter applicering av ett en testkemikalie på ögats främre yta och som inte är fullt reversibel inom 21 dagar från appliceringen. Testkemikalier som inducerar allvarliga ögonskador klassificeras som GHS-kategori 1 enligt FN:s system. Kemikalier som inte klassificerats för ögonirritation eller allvarliga ögonskador definieras som kemikalier som inte uppfyller kraven för att klassificeras som GHS-kategori 1 eller 2 (2A eller 2B), dvs. klassificeringen GHS Ingen klassificering. Denna testmetod beskriver rekommenderad användning av och begränsningar hos BCOP-testmetoden baserat på utvärderingarna. De största skillnaderna mellan den ursprungliga versionen från 2009 och den uppdaterade versionen från 2013 av OECD-testriktlinje avser, men är inte begränsade till, användning av BCOP-testmetoden för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering enligt GHS (punkterna 2 och 7), förtydliganden av tillämpningen av BCOP-testmetoden för testning av alkoholer, ketoner och fasta ämnen (punkterna 6 och 7) och av ämnen och blandningar (punkt 8), förtydliganden av hur ytaktiva ämnen och blandningar som innehåller ytaktiva ämnen bör testas (punkt 28), uppdateringar och förtydliganden av positiva kontroller (punkterna 39 och 40), uppdatering av beslutskriterierna för BCOP-testmetoden (punkt 47), en uppdatering av acceptanskriterier för undersökningar (punkt 48), en uppdatering av de uppgifter som ska ingå i provningsrapporten (punkt 49), en uppdatering av definitionerna i bilaga 1, en ny bilaga 2 om BCOP-testmetodens prediktionsförmåga enligt olika klassificeringssystem, en uppdatering av förteckningen över kemikalier för kvalitetstest samt en uppdatering av tillägg 4 om BCOP-hornhinnehållaren (punkt 1) och opacitetsmätaren (punkterna 2 och 3).

Det är allmänt vedertaget att inget ögonirritationstest in vitro inom överskådlig framtid kommer att kunna ersätta Draizes ögontext in vivo för att förutsäga alla typer av ögonirritation för olika kemiska klasser. Strategiska kombinationer av flera alternativa testmetoder inom ramen för en (differentierad) teststrategi kan dock ersätta Draizes ögontest (5). Uppifrån och ned-strategin (5) är utformad för att användas när en kemikalie förväntas vara mycket irriterande baserat på befintlig information, medan botten-upp-strategin (5) å sin sida är utformad för att användas när en kemikalie inte förväntas orsaka tillräcklig ögonirritation för att kräva en klassificering baserat på befintlig information. BCOP-testmetoden är en testmetod in vitro som kan användas under vissa omständigheter och med särskilda begränsningar för klassificering och märkning av kemikalier som är farliga för ögonen. BCOP-testmetoden anses i sig inte vara en giltig ersättning för test på kaninögon in vivo, men rekommenderas som ett första steg i en teststrategi såsom den uppifrån och ned-strategi som föreslagits av Scott m.fl. (5) För att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada, dvs. kemikalier som klassificeras som GHS-kategori 1, utan ytterligare testning (4). BCOP-testmetoden rekommenderas också för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt definitionen i GHS (GHS Ingen klassificering) (4) inom ramen för en teststrategi som botten-upp-strategin (5). Kemikalier som inte förutsägs orsaka allvarlig ögonskada eller inte klassificeras för ögonirritation/allvarlig ögonskada enligt BCOP-testmetoden kräver dock ytterligare testning (in vitro och/eller in vivo) för att fastställa en definitiv klassificering.

Syftet med denna testmetod är att beskriva de förfaranden som används för att utvärdera om kemikalien kan vara skadlig för ögonen, mätt som kemikaliens förmåga att framkalla opacitet och öka permeabiliteten i en isolerad hornhinna från nötkreatur. De toxiska effekterna på hornhinnan mäts med hjälp av i) minskad ljustransmission (opacitet) och ii) ökad passage av natriumfluorescein (permeabilitet). Bedömningen av hornhinnans opacitet och permeabilitet efter exponeringen för testkemikalien kombineras till ett IVIS-värde (In Vitro Irritancy Score), som används för att klassificera testkemikaliens förmåga att framkalla irritation.

Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

Testmetoden baserar sig på BCOP-testmetodsprotokollet från amerikanska ICCVAM (6) (7), som i sin tur ursprungligen utvecklades på grundval av information från IIVS:s protokoll (Institute for In Vitro Sciences) och INVITTOX-protokollet 124 (8), som representerar det protokoll som användes för den förvalideringsstudie av BCOP-test som genomfördes 1997–1998 och sponsrades av Europeiska gemenskapen. Båda dessa protokoll baserades på den BCOP-testmetod som först rapporterades av Gautheron m.fl. (9).

BCOP-testmetoden kan användas för att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada enligt GHS, dvs. kemikalier som klassificeras som GHS-kategori 4 (4). När BCOP-testmetoden används för detta syfte har den en övergripande noggrannhet på 79 % (150/191), ett falskt positivt värde på 25 % (32/126) och ett falskt negativt värde på 14 % (9/65) jämfört med in vivo-testning på kaninögon enligt klassificeringssystemet GHS (3) (se tillägg 2, tabell 1). När testkemikalier inom en viss kemikalie (dvs. alkoholer, ketoner) eller fysiska (dvs. fasta) klasser undantas från databasen har BCOP-testmetoden en övergripande noggrannhet på 85 % (111/131), ett falskt positivt värde på 20 % (16/81) och ett falskt negativt värde på 8 % (4/50) enligt klassificeringssystemet GHS (3). BCOP-testmetodens begränsningar när den används för att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1) baserar sig på höga falska positiva värden för alkoholer och ketoner och höga falska negativa värden för fasta ämnen som observerats i valideringsdatabasen (1)(2)(3). Alla alkoholer och ketoner överskattas dock inte av BCOP-testmetoden och vissa klassificeras korrekt som GHS-kategori 1, vilket innebär att dessa två organiska funktionella grupper inte anses gå utöver testmetodens tillämpningsområde. Det är upp till användaren av testmetoden att avgöra om en eventuell överprediktion av en alkohol eller en keton kan godtas eller om ytterligare testning krävs enligt en weight-of-the-evidence-metod. När det gäller falska negativa värden för fasta ämnen bör det noteras att fasta ämnen kan leda till varierande och extrema exponeringsförhållanden i Draizes ögonirritationstest in vivo, vilket i sin tur kan leda till irrelevanta förutsägelser om ämnets verkliga irritationspotential (10). När det gäller identifiering av kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1) bör det också noteras att inget av de falska negativa värden som identifieras i ICCVAM-validationsdatabasen (2)(3) ledde till IVIS ≤ 3, vilket är det kriterium som används för att identifiera en testkemikalie i GHS-kategorin Ingen klassificering. Falska negativa värden är inte kritiska i detta sammanhang, eftersom alla testkemikalier som ger ett värde på 3 < IVIS ≤ 55 därefter testas med andra lämpligt validerade in vitro-test och som ett sista alternativ på kaniner, beroende på kraven i tillämpliga bestämmelser, med tillämpning av en strategi med stegvis testning enligt principen om sammanvägd bedömning Med tanke på att vissa fasta kemikalier korrekt klassificeras som GHS-kategori 1 enligt BCOP-testmetoden anses inte heller detta fysiska tillstånd gå utöver testmetodens tillämpningsområde. Forskare kan överväga att använda denna testmetod för alla kemikalier. I ett sådant fall bör IVIS > 55 godtas som en indikation på en respons som inducerar allvarlig ögonskada och kemikalien bör klassificeras som GHS-kategori 1 utan ytterligare testning. Som redan nämnts bör positiva resultat från test med alkoholer eller ketoner dock tolkas försiktigt på grund av risken för överprediktion.

BCOP-testmetoden kan också användas för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt GHS-klassificeringssystemet (4). När BCOP-testmetoden används för detta syfte har den en övergripande noggrannhet på 69 % (135/196), ett falskt positivt värde på 69 % (61/89) och ett falskt negativt värde på 0 % (0/107) jämfört med in vivo-testning på kaninögon enligt klassificeringssystemet GHS (3) (se tillägg 2, tabell 2). Det falska positiva värde som erhålls (in vivo, kemikalier som klassificeras som GHS Ingen klassificering och som ger värdet IVIS > 3, se punkt 47) är högt, men inte kritiskt i detta sammanhang, eftersom alla testkemikalier som ger ett värde på 3 < IVIS ≤ 55 testas vidare med andra lämpligt validerade in vitro-test, eller som ett sista alternativ på kaniner beroende på lagstadgade krav, med användning av en stegvis teststrategi enligt en weight-of-evidence-metod. BCOP-testmetoden visar inga specifika brister när det gäller testning av alkoholer, ketoner och fasta ämnen när syftet är att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada (GHS Ingen klassificering) (3). Forskarna bör överväga att använda denna testmetod för alla typer av kemikalier. Ett negativt resultat (IVIS ≤ 3) bör godtas som en indikation på att ingen klassificering krävs (GHS Ingen klassificering). Eftersom endast 31 % av de kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada kan identifieras med hjälp av BCOP-testmetoden, bör denna testmetod inte vara förstahandsvalet för en botten-upp-strategi (5), om andra validerade och godkända in vitro-metoder med liknande hög sensitivitet men högre specificitet finns tillgängliga.

BCOP-valideringsdatabasen innehöll totalt 113 ämnen och 100 blandningar (2) (3). BCOP-testmetoden anses därför vara tillämplig på testning av både ämnen och blandningar.

BCOP-testmetoden rekommenderas inte för identifiering av testkemikalier som bör klassificeras som irriterande för ögonen (GHS-kategori 2 eller 2A) eller testkemikalier som bör klassificeras som måttligt irriterande för ögonen (GHS-kategori 2b), eftersom det finns ett stort antal kemikalier i GHS-kategori 1 som är underklassificerade som GHS-kategori 2, 2A eller 2B medan andra kemikalier i GHS-kategorin Ingen klassificering är överklassificerade som GHS-kategori 2, 2A eller 2B (2) (3). Därför kan det krävas ytterligare testning med en annan passande metod.

Alla förfaranden som omfattar ögon och hornhinnor från nötkreatur bör respektera testningslaboratoriets tillämpliga regler och förfaranden för hantering av material som kommer från djur, omfattande men inte begränsat till vävnader och vävnadsvätskor. Likaså rekommenderas allmänna försiktighetsåtgärder för laboratorier (11).

BCOP-testmetoden beaktar inte skador på ögats bindhinna (konjunktiva) eller iris, men däremot skador på hornhinnan, som är den viktigaste in vivo-klassificeringen med avseende på GHS-klassificeringen. Reversibiliteten hos hornhinneskador kan i sig inte utvärderas med BCOP-test. På grundval av studier av kaninögon har det föreslagits att en bedömning av det initiala djupet för hornhinneskada kan användas för att identifiera vissa typer av irreversibla effekter (12). Det krävs dock ytterligare vetenskaplig kunskap för att man ska kunna förstå hur irreversibla effekter som inte är kopplade till en initialt allvarlig skada kan uppstå. Slutligen gäller att BCOP inte ger möjlighet att bedöma potentialen för systemisk toxicitet associerad med okulär exponering.

Testmetoden kommer att uppdateras regelbundet allteftersom ny information och data övervägs. Histopatologi kan t.ex. eventuellt vara användbart om en mer fullständig karakterisiering av skador på hornhinnan krävs. Såsom anges i OECD:s vägledningsdokument nr 160 (13) uppmuntras användarna att bevara hornhinnor och bereda histopatologiska prover som kan användas för att utveckla en databas och beslutskriterier för att ytterligare förbättra metodens noggrannhet.

Laboratorier som tar denna testmetod i bruk för första gången bör använda de kvalifikationskemikalier som förtecknas i bilaga 3. Ett laboratorium kan använda dessa kemikalier för att påvisa sin tekniska kompetens att genomföra BCOP-testmetoden innan det lämnar in BCOP-testdata avsedda för lagstadgad faroklassificering.

TESTMETODENS PRINCIP

BCOP-testmetoden är en organotypisk modell enligt vilken hornhinnan från nötkreatur under kort tid bibehåller normal fysiologisk och biokemisk funktion in vitro. Testmetoden innebär att skador framkallade av testkemikalien bedöms med kvantitativa mätningar av ändringar i korneal opacitet och permeabilitet med opacitetsmätare respektive spektrofotometer för synligt ljus. Med hjälp av resultaten från de två mätningarna beräknas ett IVIS-värde som används för att bestämma en in vitro-klassificering av farokategori för prognos av testkemikaliens potential att framkalla ögonirritation in vivo (se beslutskriterierna i punkt 48).

För BCOP-testmetoden används isolerade hornhinnor från ögon som tillvaratagits från nyligen slaktade nötkreatur. Den korneala opaciteten mäts kvantitativt som ljustransmissionen genom hornhinnan. Permeabiliteten mäts kvantitativt som mängden natriumfluorescein som passerar genom hornhinnans hela djup enligt mätning i mediet i hornhinnehållarens bakre kammare. Kemikalierna appliceras på hornhinnans epitelyta via den främre kammaren. I tillägg 4 finns en beskrivning och en schematisk bild av den hornhinnehållare som används vid BCOP-testmetoden. Hornhinnehållare finns att köpa på marknaden hos olika leverantörer eller kan konstrueras i laboratoriet.

Källa och ålder för ögon från nötkreatur, val av djurart

Nötkreatur som sänds till slakterier avlivas i regel för användning som livsmedel eller för andra kommersiella ändamål. Endast friska djur som anses vara lämpliga för användning i livsmedelskedjan får användas för tillvaratagande av hornhinnor som används vid BCOP-testmetoden. Eftersom nötkreaturens vikt kan variera stort beroende på ras, ålder och kön finns det ingen rekommenderad slaktvikt för de djur som används.

Hornhinnornas dimensioner kan variera beroende på djurens ålder. Hornhinnor med en horisontell diameter > 30,5 mm och en central hornhinnetjocklek (CCT) ≥ 1100 μm kommer i regel från nötkreatur som är äldre än åtta år, medan hornhinnor med en horisontell diameter < 28,5 mm och CCT < 900 μm i regel kommer från nötkreatur som är yngre än fem år (14). Därför används normalt inte ögon från nötkreatur som är äldre än 60 månader. Ögon från nötkreatur som är yngre än 12 månader används i regel inte eftersom ögonen fortfarande håller på att utvecklas och hornhinnans tjocklek och diameter är betydligt mindre än de värden som rapporteras för ögon från vuxna nötkreatur. Hornhinnor från unga djur (6–12 månader) får dock användas eftersom det medför vissa fördelar såsom bättre tillgänglighet, smalare åldersintervall och lägre risker för att de anställda exponeras för bovin spongiform encefalopati (15). Det vore värdefullt med ytterligare utvärdering av hur hornhinnans storlek eller tjocklek påverkar responsen från frätande och irriterande kemikalier, och därför uppmanas användarna att rapportera uppskattad ålder och/eller vikt för de djur vars hornhinna använts för undersökningen.

Tillvaratagande och transport av ögon till laboratoriet

Ögonen tas till vara av slakteriets personal. För att minimera mekaniska och andra typer av skador på ögonen bör dessa tas till vara så snart som möjligt efter slakten och kylas omedelbart efter tillvaratagande och under transport. För att hindra att ögonen exponeras för potentiellt irriterande kemikalier bör rengöringsmedel inte användas vid sköljning av djurets huvud vid slakteriet.

Ögonen bör hållas helt nedsänkta i kylda HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) i ett kärl av lämplig storlek, och transporteras till laboratoriet på sådant sätt att skador och/eller bakterieförorening minimeras. Eftersom ögonen tas till vara under slaktningen utsätts de eventuellt för blod och andra biologiska material, inbegripet bakterier och andra mikroorganismer. Det är därför viktigt att minimera föroreningsrisken (t.ex. genom att hålla kärlet med ögonen på krossad is under insamling och transport samt lägga till antibiotika i HBSS-förvaringslösningen, t.ex. 100 IE/ml penicillin eller 100 μg/ml streptomycin).

Tiden mellan tillvaratagande av ögonen och användningen av hornhinnorna i BCOP-testmetoden bör minimeras (normalt bör tillvaratagande och användning ske samma dag) och det måste påvisas att väntetiden inte stör analysresultaten. Dessa baserar sig på urvalskriterierna för ögonen såväl som på positiv och negativ kontrollrespons. Alla ögon som används för testning bör komma från samma grupp av ögon som har tillvaratagits en viss dag.

Urvalskriterier för ögon som används för BCOP-testmetoden

När ögonen har tagits emot vid laboratoriet ska de undersökas omsorgsfullt för skador såsom ökad opacitet, repor och nykärlsbildning. Endast hornhinnor från oskadade ögon får användas.

De individuella hornhinnornas kvalitet utvärderas också i senare steg i testningen. Hornhinnor vars opacitet efter en inledande jämviktsperiod på en timme är högre än sju opacitetsenheter eller motsvarande för opacitetsmätaren och använda hornhinnehållare ska förkastas (OBS: opacitetsmätaren ska kalibreras med opacitetsstandarder för opacitetsenheter, se tillägg 4).

Varje behandlingsgrupp (testkemikalie, parallella negativa och positiva kontroller) ska bestå av minst tre ögon. För den negativa kontrollen enligt BCOP-testmetoden ska tre hornhinnor användas. Eftersom hornhinnorna skärs ut från globen som helhet och därefter monteras i hornhinnekamrarna, finns det en risk för att de individuella värdena för korneal opacitet och permeabilitet (inbegripet negativ kontroll) påverkas av artefakter från hanteringen. Vidare används opacitets- och permeabilitetsvärden från de negativa kontrollernas hornhinnor för att korrigera de opacitets- och permeabilitetsvärden från testade kemiskt behandlade och positivkontrollerade hornhinnor som används för IVIS-beräkningarna.

FÖRFARANDE

Förberedelse av ögonen

Defektfria hornhinnor skärs ut med en 2–3 mm omgivande kant av senhinna som är avsedd att underlätta efterföljande hantering. Var noga med att undvika skador på hornhinnans epitel och endotel. Hornhinnorna monteras en och en i särskilt utformade hornhinnehållare som har en bakre och en främre kammare som angränsar mot hornhinnans epitelsida respektive endotelsida. Båda kamrarna fylls med förvärmt EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) i överskott (bakre kammaren först). Se till så att det inte bildas bubblor. Därefter hålls utrustningen vid 32 ± 1 °C i minst en timme så att jämvikt nås mellan mediet och hornhinnorna och normal metabolisk aktivitet uppstår i den mån det är möjligt (en hornhinna in vivo har en ungefärlig temperatur på 32 °C).

Efter jämviktsperioden tillsätts färskt förvärmt EMEM fritt från fenolrött till båda kamrarna och grundvärden för opacitet mäts på varje hornhinna. Efter jämviktsperioden tillsätts färskt förvärmt EMEM fritt från fenolrött till båda kamrarna och grundvärden för opacitet mäts på varje hornhinna. Alla hornhinnor som uppvisar en makroskopisk vävnadsskada (t.ex. repor, pigmentering, kärlnybildning) eller opacitet över 7 opacitetsenheter eller motsvarande för opacitetsmätaren och hornhinnehållarna ska förkastas. Opacitetsmedelvärdet beräknas för alla jämviktsbehandlade hornhinnor. Minst tre hornhinnor väljs ut som exemplar för negativa kontroller (eller lösningsmedelskontroller). Återstående hornhinnor delas upp i behandlingsgrupp och positiv kontrollgrupp.

Eftersom vatten har en högre värmekapacitet än luft, ger vatten stabilare temperaturförhållanden för inkubation. Därför rekommenderas vattenbad för att hålla hornhinnehållaren och dess innehåll vid 32 ± 1 °C. Luftinkubatorer kan dock också användas under förutsättning att temperaturen hålls stabil (t.ex. genom förvärmning av hållare och media).

Applicering av testkemikalien

Två olika behandlingsprotokoll används, ett för vätskor och ytaktiva ämnen (fasta eller flytande) och ett för fasta ämnen som inte är ytaktiva.

Vätskor testas i outspädd form. Halvfasta ämnen, krämer och vaxer testas normalt som vätskor. Rena ytaktiva ämnen testas vid en koncentration på 10 % vikt/volym i en 0,9 % natriumkloridlösning, destillerat vatten eller annat lösningsmedel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet. Om andra utspädningskoncentrationer används bör detta motiveras. Blandningar som innehåller ytaktiva ämnen kan testas outspädda eller utspädda till en lämplig koncentration, beroende på det aktuella exponeringsscenariot in vivo. Lämplig motivering bör ges för den testade koncentrationen. Hornhinnorna exponeras för vätskor och ytaktiva ämnen under 10 minuter. Om avvikande exponeringstider används bör tillbörlig vetenskaplig motivering ges. Definitioner av ytaktiva ämnen och blandningar innehållande ytaktiva ämnen ges i tillägg 1.

Fasta ämnen som inte är ytaktiva testas normalt som lösningar eller suspensioner vid 20 % vikt/volym i en 0,9 % natriumkloridlösning, destillerat vatten eller annat lösningsmedel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet. I vissa förhållanden och med angivande av tillbörlig vetenskaplig motivering kan fasta ämnen också testas i ren form med direkt applicering på hornhinnans yta med användning av metoden med öppen kammare (se punkt 32). Hornhinnorna exponeras för fasta ämnen under fyra timmar, och på samma sätt som med vätskor och ytaktiva ämnen måste avvikande exponeringstider motiveras med tillbörliga vetenskapliga grunder.

Olika behandlingsmetoder kan användas, beroende på testkemikaliens fysikaliska natur och kemiska egenskaper (t.ex. fasta ämnen, vätskor och viskösa respektive icke-viskösa vätskor). Den kritiska faktorn är att se till att testkemikalien täcker epitelytan tillräckligt och att det avlägsnas effektivt under sköljningsstegen. Metoden med sluten kammare används normalt vid testning av icke-viskösa till lätt viskösa kemikalier, medan metoden med öppen kammare normalt används för semiviskösa och viskösa kemikalier och rena fasta ämnen.

När sluten kammare används tillförs testkemikalien i den främre kammaren genom doseringshålen på kammarens övre yta i tillräcklig mängd (750 μl) för att täcka hornhinnans epitelsida och därefter hålls hålen förslutna med pluggar under exponeringen. Det är viktigt att varje hornhinna exponeras för testkemikalien under avsedd tidslängd.

När öppen kammare används ska den främre kammarens fönsterlåsring och glasfönster avlägsnas före behandlingen. Kontroll- eller testkemikalien (750 μl eller tillräckligt för att täcka hornhinnan helt) tillförs direkt på hornhinnans epitelyta med hjälp av en mikropipett. Om testkemikalien är svår att pipettera kan den i stället appliceras med en s.k. positive displacement-pipett. Positive displacement-pipettens spets införs i sprutans doseringsspets så att ämnet kan tryckas in i positive displacement-spetsen. Samtidigt dras sprutkolven ut medan pipettens pistong dras uppåt. Om det uppstår bubblor i pipettspetsen ska testkemikalien avlägsnas (tryckas ut) och förfarandet upprepas till dess att spetsen fylls utan att det uppstår luftbubblor. Vid behov kan man använda en vanlig spruta (utan nål) eftersom den ger möjlighet att mäta en exakt volym av testkemikalien och underlättar appliceringen på hornhinnans epitelyta. Efter doseringen monteras glasfönstret tillbaka på den främre kammaren så att systemet återförsluts.

Inkubation efter exponering

Efter exponeringsperioden avlägsnas testkemikalien, eller den kemikalie som används för negativ eller positiv kontroll, från den främre kammaren och epitelytan tvättas minst tre gånger (eller till dess att ingen testkemikalie kan observeras visuellt på ytan) med EMEM (med fenolrött). Medium innehållande fenolrött används för sköljning eftersom färgändringen av fenolrött kan användas som indikator på effektiv sköljning av sura eller alkaliska testkemikalier. Hornhinnorna ska tvättas mer än tre gånger om färgförändringen av fenolrött kvarstår (gult eller purpurrött) eller om rester av testkemikalien kan observeras. När mediet är rent från testkemikalien görs en slutsköljning av hornhinnorna med EMEM (utan fenolrött). EMEM (utan fenolrött) används som slutsköljning för att säkerställa att allt fenolrött avlägsnas från den främre kammaren före opacitetsmätningen. Därefter fylls den främre kammaren på nytt med färskt EMEM utan fenolrött.

För vätskor och ytaktiva ämnen ska hornhinnorna efter sköljning inkuberas i ytterligare två timmar vid 32 ± 1 °C. Längre tider kan vara till fördel under vissa omständigheter och kan övervägas från fall till fall. Hornhinnor som exponerats för fasta ämnen sköljs grundligt efter den fyra timmar långa exponeringen och kräver ingen efterföljande inkubation.

Efter den inkubationsperiod som följer på exponeringen (vätskor och ytaktiva ämnen) eller efter slutet av den fyra timmar långa exponeringsperioden (icke-ytaktiva fasta ämnen) görs mätningar av opaciteten och permeabiliteten för varje hornhinna. Varje hornhinna granskas också visuellt och relevanta observationer noteras (t.ex. avflagning av vävnad, rester av testkemikalien, oenhetliga opacitetsmönster). Sådana observationer kan vara viktiga eftersom de också är kopplade till variationer av opacitetsmätarens avläsningar.

Kontrollkemikalier

Parallella negativa kontroller eller lösningsmedels-/vehikelkontroller och positiva kontroller ingår i varje försök.

Vid testning av ett vätskeformigt ämne vid 100 % ska BCOP-testmetoden inbegripa en parallell negativ kontroll (t.ex. 0,9 % natriumkloridlösning eller destillerat vatten) så att icke-specifika ändringar i testsystemet kan upptäckas och för att ge en bakgrundsnivå för testningens endpoint. På så sätt säkerställs också att testningsförhållandena inte i onödan framkallar irritation.

Vid testning av en utspädd vätska, ett ytaktivt ämne eller ett fast ämne ska BCOP-testmetoden omfatta en parallell kontrollgrupp med lösningsmedel/vehikel så att icke-specifika ändringar i testsystemet kan upptäckas och för att ge en bakgrundsnivå för testningens endpoint. Endast lösningsmedel/vehikel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet får användas.

En kemikalie som är känd att inducera positiv respons inkluderas som en parallell positiv kontroll i varje försök för att kontrollera testsystemets integritet och se till att det tillämpas korrekt. För att säkerställa att den positiva kontrollresponsen kan bedömas över tiden bör den irritation som framkallas inte vara för stark.

Exempel på en positiv kontrollkemikalie för testning av flytande testkemikalier är 100 % etanol eller 100 % dimetylformamid. Exempel på en positiv kontrollkemikalie för testning av fasta ämnen är 20 % (vikt/volym) imidazol i 0,9 % natriumkloridlösning.

Referenskemikalier kan användas för utvärdering av förmågan att framkalla ögonirritation hos okända kemikalier tillhörande en specifik kemisk klass eller produktklass, eller för utvärdering av den relativa irritationspotentialen hos ett ögonirriterande ämne inom ett specifikt responsområde.

Mätning av endpoints

Opaciteten bestäms enligt ljustransmissionen genom hornhinnan. Hornhinnans opacitet mäts kvantitativt med hjälp av en opacitetsmätare som mäter opacitetsvärden på en kontinuerlig skala.

Permeabiliteten bestäms med hjälp av mängden natriumfluorescein som passerar hela hornhinnan (dvs. epitelet på hornhinnans yttre yta och genom hornhinnan till endotelet på hornhinnans inre yta). 1 ml natriumfluoresceinlösning (4 eller 5 mg/ml vid testning av vätskor och ytaktiva ämnen respektive icke-ytaktiva fasta ämnen) tillförs hornhinnehållarens främre kammare (den som angränsar mot hornhinnans epitelsida) medan den bakre kammaren (den som angränsar mot hornhinnans endotelsida) fylls med färskt EMEM. Därefter inkuberas hållaren i horisontellt läge i 90 ± 5 minuter vid 32 ± 1 °C. Mängden natriumfluorescein som kommer in i den bakre kammaren mäts kvantitativt med hjälp av UV/VIS-spektrofotometri. De spektrofotometriska mätningarna vid 490 nm noteras som optisk densitet (OD490) eller absorbansvärden som mäts på en kontinuerlig skala. Permeabilitetsvärdena för fluorescein bestäms genom OD490-värden med en spektrofotometer för synligt ljus och en standardvåglängd på 1 cm.

Alternativt kan man använda en 96-håls mikrotiterplatta förutsatt att i) det linjära området för avläsning av plattan när det gäller fluorescein OD490-värden kan fastställas och ii) korrekt volym fluoresceinprover används i mikrotiterplattan för att få OD490-värden som motsvarar standardväglängden 1 cm (för detta krävs eventuellt att brunnen är helt full, i regel 360 l).

DATA OCH RAPPORTERING

Utvärdering av data

När opacitetsvärdena och permeabilitetsmedelvärdena (OD490) har korrigerats för bakgrundsopacitet och den negativa kontrollens permeabilitetsvärden (OD490), ska varje behandlingsgrupps medelvärden för opacitet och permeabilitet (OD490) kombineras i en empiriskt härledd formel för beräkning av IVIS-värdet (In Vitro Irritancy Score) enligt följande:

IVIS = medelvärdet för opacitet + (15 × medelvärdet för permeabilitet OD490)

Sina m.fl. (16) har rapporterat att denna formel härleddes under försök som utfördes inom och mellan laboratorier. Data som genererades för en serie med 36 föreningar i en undersökning som omfattade flera laboratorier användes som indata i en multivariat analys för bestämning av vilken ekvation som ger den bästa anpassningen mellan in vivo- och in vitro-data. Analysen genomfördes av forskare på två separata företag och de resulterande ekvationerna var nästan identiska.

Opacitets- och permeabilitetsvärdena bör också utvärderas fristående för att fastställa huruvida en testkemikalie har en frätande eller kraftigt irriterande verkan endast genom en av de två endpoints (se beslutskriterierna).

Beslutskriterier

IVIS-brytpunktsvärden för att identifiera testkemikalier som framkallar allvarliga ögonskador (GHS-kategori 1) och testkemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarliga ögonskador (GHS Ingen klassificering) ges nedan:

Kriterier för godkännande av ett försök

Ett försök anses vara godkänt om den positiva kontrollen ger ett IVIS-värde som faller inom två standardavvikelser för det aktuella historiska medelvärdet, som måste uppdateras minst var tredje månad, eller varje gång ett godkänt test genomförs i laboratorier där försök genomförs oregelbundet (mindre än en gång per månad). Responsen från den negativa kontrollen eller lösningsmedels-/vehikelkontrollen bör ge opacitets- och permeabilitetsvärden som är lägre än de fastställda övre gränserna för bakgrundsvärden för opacitet och permeabilitet för nötkreaturshornhinnor behandlade med negativa kontrollämnen eller lösningsmedel/vehikler. En enda testomgång med minst tre hornhinnor bör vara tillräcklig för en testkemikalie förutsatt att den resulterande klassificeringen är otvetydig. Om den första testomgången ger resultat som ligger på gränsen bör en andra testomgång övervägas (men är inte alltid nödvändig). Om medelvärdet för IVIS-resultaten inte överensstämmer mellan de två första testomgångarna bör en tredje testomgång övervägas. I detta sammanhang anses resultat i den första testomgången vara gränsfall om förutsägelserna för de tre hornhinnorna inte överensstämde, om

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter i den mån de är relevanta:

LITTERATUR

Tillägg 4

HORNHINNEHÅLLARE FÖR BCOP-TESTMETODEN

Hornhinnehållare för BCOP är gjorda av ett inert material (t.ex. polypropen). De består av två halvor (en främre och en bakre kammare) och har två likadana cylindriska inre kammare. Varje kammare rymmer 5 ml och har ett glasfönster genom vilket opacitetsmätningarna görs. De inre kamrarna mäter 1,7 cm i diameter och 2,2 cm i djup (11). Den bakre kammaren har en o-ring för att förhindra läckor. Hornhinnorna placeras med endotelsidan nedåt på den bakre kammarens o-ring och den främre kammaren placeras på hornhinnornas epitelsida. Kamrarna hålls på plats med hjälp av tre rostfria stålskruvar på kammarens ytterkanter. Varje kammare har ett glasfönster som kan tas bort för att enkelt nå hornhinnan. Det finns också en o-ring mellan glasfönstret och kammaren för att förhindra läckor. Upptill på varje kammare finns två hål för att tillsätta och ta bort medium och testkemikalier. Hålen försluts med gummiproppar under behandlings- och inkubationsperioderna. Ljustransmissionen genom hornhinnehållarna kan eventuellt ändras eftersom slitage eller ackumulering av specifika kemikaliska rester på den inre kammarens diameter eller på glasfönstren kan påverka ljusspridningen eller reflektansen. Följden kan bli ökningar eller minskningar i grundvärden för ljustransmission (och omvänt grundvärden för opacitet) genom hornhinnehållarna, och kan vara uppenbar som anmärkningsvärda förändringar i de förväntade grundvärdena vid initiala mätningar av hornhinneopacitet i individuella kammare (dvs, de initiala hornhinneopacitetsvärdena i särskilda individuella hornhinnehållare kan rutinmässigt skilja sig åt med mer än 2 eller 3 opacitetsenheter från de förväntade grundvärdena). Laborationerna bör införa program för att utvärdera ändringar i ljustransmissionen genom hornhinnehållarna, beroende på vilken typ av kemikalier som testas och hur ofta kamrarna används. För att fastställa jämförelsevärden kan man kontrollera hornhinnehållarna före rutinmässig användning genom att mäta grundvärden för opacitet (eller ljustransmission) i kamrarna, fyllda med komplett medium utan hornhinnor. Hornhinnehållarna kontrolleras därefter regelbundet för att upptäcka ändringar i ljustransmissionen under användningsperioderna. Laboratorierna kan fastställa kontrollintervaller för hornhinnehållarna baserat på testade kemikalier, användningsfrekvens och observationer av ändringar i grundvärdena för hornhinnornas opacitet. Om märkbara förändringar i ljustransmissionen genom hornhinnehållarna observeras måste laboratoriet överväga lämpliga rengörings- och/eller poleringsrutiner för hornhinnehållarnas yta eller byta ut hornhinnehållarna.

Hornhinnehållare: sprängskiss

glass disc

PTFE-O-ring

refill

hanger

cap

glass disc

nut

O-ring

posterior compartment

anterior compartment

nut

fixing screws

(13)

I del B ska kapitel B.48 ersättas med följande:

”B.48   Testmetoden ICE (Isolated Chicken Eye Test) för identifiering av i) kemikalier som orsakar allvarlig ögonskada och ii) kemikalier för vilka det inte krävs klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada

INLEDNING

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 438 (2013). ICE-testmetoden (Isolated Chicken Eye) utvärderades 2006 and 2010 (1)(2) av amerikanska ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) tillsammans med Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM) och det japanska centret för validering av alternativa metoder (JaCVAM) 1) (2) (3). I den första utvärderingen godkändes ICE som en vetenskapligt giltig testmetod för användning som ett screeningtest för att identifiera kemikalier (ämnen och blandningar) som inducerar allvarlig ögonskada (kategori 1) enligt definitionen i FN:s globala harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (1) (2) (4) och förordning (EG) 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) (12). I den andra utvärderingen undersökte man om ICE-testmetoden var användbar som ett screeningtest för att identifiera kemikalier som inte är klassificerade för ögonirritation eller allvarliga ögonskador enligt GHS (3) (4). Enligt resultaten från valideringsstudien och rekommendationerna från den expertpanel som granskat metoden behölls den ursprungliga rekommendationen om att använda ICE för klassificering av kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1), eftersom dem tillgängliga databasen inte ändrats sedan den ursprungliga ICCVAM-rekommendationen. I detta skede föreslås inga ytterligare rekommendationer om att utöka ICE-metodens tillämpningsområde till att även omfatta andra kategorier. En förnyad utvärdering gjordes av de in vitro- och in vivo-datauppsättningar som använts för att bedöma om ICE-metoden är användbar för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada (5). Denna förnyade utvärdering visade att ICE-testmetoden även kan användas för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation och allvarlig ögonskada enligt definitionen i GHS (4) (5). Denna testmetod beskriver rekommenderad användning av och begränsningar hos ICE-testmetoden baserat på dessa utvärderingar. De största skillnaderna mellan den ursprungliga versionen från 2009 och den uppdaterade versionen från 2013 av OECD-testriktlinjen avser, men är inte begränsade till, användning av ICE-testmetoden för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering enligt GHS-klassificeringen, en uppdatering av de uppgifter som ska ingå i testrapporten, en uppdatering av tillägg 1 om definitioner och en uppdatering av tillägg 2 om kvalifikationskemikalier.

Det är allmänt vedertaget att inget ögonirritationstest in vitro inom överskådlig framtid kommer att kunna ersätta Draizes ögontext in vivo för att förutsäga alla typer av ögonirritation för olika kemiska klasser. Strategiska kombinationer av flera alternativa testmetoder inom ramen för en (differentierad) teststrategi kan dock ersätta Draizes ögontest (6). Uppifrån och ned-strategin (7) är utformad för att användas när en kemikalie förväntas vara mycket irriterande baserat på befintlig information, medan botten-upp-strategin (7) å sin sida är utformad för att användas när en kemikalie inte förväntas orsaka tillräcklig ögonirritation för att kräva en klassificering baserat på befintlig information. ICE-testmetoden är en testmetod in vitro som kan användas under vissa omständigheter och med särskilda begränsningar (som beskrivs i punkterna 8–10) för klassificering och märkning av kemikalier som är farliga för ögonen. ICE-testmetoden anses i sig inte vara en giltig ersättning för test på kaninögon in vivo, men rekommenderas som ett första steg i en teststrategi såsom den uppifrån och ned-strategi som föreslagits av Scott m.fl. (7) För att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada, dvs. kemikalier som klassificeras som GHS-kategori 1, utan ytterligare provning (4). ICE-testmetoden rekommenderas också för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt definitionen i GHS (GHS ingen klassificering, NC) (4) och kan därför användas som ett första steg i en teststrategi som botten-upp-strategin (7). Kemikalier som inte förutsägs orsaka allvarlig ögonskada eller inte klassificeras för ögonirritation/allvarlig ögonskada enligt ICE-testmetoden kräver dock ytterligare testning (in vitro och/eller in vivo) för att fastställa en definitiv klassificering. Dessutom bör berörda tillsynsmyndigheter rådfrågas innan man använder ICE-metoden inom ramen för en botten-upp-strategi enligt andra klassificeringssystem än FN:s GHS.

Syftet med denna testmetod är att beskriva de förfaranden som används för att utvärdera om kemikalien kan vara skadlig för ögonen, mätt som kemikaliens förmåga att inducera toxicitet eller ej i ett isolerat kycklingöga. De toxiska verkningarna på hornhinnan mäts genom i) kvalitativ bedömning av opacitet, ii) kvalitativ bedömning av skadan på epitel efter applicering av fluorescein på ögat (fluoresceinfärgning), iii) kvantitativ mätning av ökad tjocklek (svullnad) och iv) kvalitativ utvärdering av makroskopisk morfologisk skada på ytan. Korneal opacitet, svullnad och skadebedömning efter exponering för en testkemikalie utvärderas var för sig och kombineras till ett resultat som används för klassificering av ämnet med avseende på ögonirritation.

Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

Testmetoden baserar sig på det protokoll som föreslås i OECD:s vägledningsdokument 160 (8) som har tagits fram enligt ICCVAM:s internationella valideringsstudie (1) (3) (9), med bidrag från Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM), det japanska centret för validering av alternativa metoder (JaCVAM) och TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology (Nederländerna). Protokollet grundar sig på uppgifter från offentliggjorda protokoll och från det protokoll som för närvarande används av TNO (10) (11) (12) (13) (14).

En omfattande mängd olika kemikalier har testats vid den validering som ligger till grund för denna testmetod och valideringsstudiens empiriska databas uppgick till totalt 152 kemikalier, inklusive 72 ämnen och 80 blandningar (5). Testmetoden är tillämplig på fasta ämnen, vätskor, emulsioner och geler. Vätskorna kan vara vattenbaserade eller icke-vattenbaserade och de fasta ämnena kan vara vattenlösliga eller icke-vattenlösliga. Gaser och aerosoler har ännu inte bedömts genom valideringsstudier.

ICE-testmetoden kan användas för att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada, dvs. kemikalier som klassificeras som GHS-kategori 1 (4). När den används för detta syfte baserar de identifierade begränsningarna för ICE-testmetoden sig på höga falska positiva värden för alkoholer och höga falska negativa värden för fasta ämnen och ytaktiva ämnen (1) (3) (9). Falska negativa värden är dock inte kritiska i detta sammanhang (GHS-kategori 1, identifierade som inte tillhörande GHS-kategori 1), eftersom alla testkemikalier som ger ett negativt resultat därefter testas med andra lämpligt validerade in vitro-test och som ett sista alternativ på kaniner, beroende på kraven i tillämpliga bestämmelser, med tillämpning av en strategi med stegvis testning enligt principen om sammanvägd bedömning Det bör noteras att fasta ämnen kan leda till varierande och extrema exponeringsförhållanden i Draizes ögonirritationstest in vivo, vilket i sin tur kan leda till irrelevanta förutsägelser om ämnets verkliga irritationspotential (15). Forskare kan överväga att använda denna testmetod för alla kemikalier. I ett sådant fall bör ett positivt resultat godtas som en indikation allvarlig ögonskada, dvs. klassificering i GHS-kategori 1 utan ytterligare testning. Positiva resultat från test med alkoholer bör dock tolkas försiktigt på grund av risken för överprediktion.

När ICE-testmetoden används för att identifiera kemikalier som ger upphov till allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1) har den en övergripande noggrannhet på 86 % (120/140), ett falskt positivt värde på 6 % (7/113) och ett falskt negativt värde på 48 % (13/27) jämfört med in vivo-testning på kaninögon enligt klassificeringssystemet GHS (4) (5).

ICE-testmetoden kan också användas för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt GHS-klassificeringssystemet (4). Berörda tillsynsmyndigheter bör rådfrågas innan man använder ICE-metoden inom ramen för en botten-upp-strategi enligt andra klassificeringssystem. Denna testmetod kan användas för alla typer av kemikalier, och ett negativt resultat kan godtas för att inte klassificera en kemikalie för ögonirritation och allvarlig ögonskada. På grundval av ett resultat från valideringsdatabasen kan organiska lösningsmedel med antifoulingeffekt som innehåller färg dock vara underskattade (5).

När ICE-testmetoden används för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation och allvarlig ögonskada har de en övergripande noggrannhet på 82 % (125/152), ett falskt positivt värde på 33 % (26/79) och ett falskt negativt värde på 1 % (1/73) jämfört med data från metoden för in vivo-testning på kaninögon enligt GHS (4) (5). När testkemikalier inom vissa klasser (t.ex. organiska lösningsämnen med antifoulingeffekt som innehåller färg) undantas från databasen har ICE-testmetoden en noggrannhet på 83 % (123/149), ett falskt positivt värde på 33 % (26/78) och ett falskt negativt värde på 0 % (0/71) enligt GHS (4) (5).

ICE-testmetoden rekommenderas inte för identifiering av testkemikalier som bör klassificeras som irriterande för ögonen (dvs. GHS-kategori 2 eller 2A) eller testkemikalier som bör klassificeras som måttligt irriterande för ögonen (GHS-kategori 2b), eftersom det finns ett stort antal kemikalier i GHS-kategori 1 som är underklassificerade som GHS-kategori 2, 2A eller 2B medan andra kemikalier i GHS-kategorin Ingen klassificering är överklassificerade som GHS-kategori 2, 2A eller 2B. Därför kan det krävas ytterligare testning med en annan passande metod.

Alla förfaranden som omfattar ögon från kycklingar bör respektera testningslaboratoriets tillämpliga regler och förfaranden för hantering av material som kommer från människor eller djur, omfattande men inte begränsat till vävnader och vävnadsvätskor. Likaså rekommenderas allmänna försiktighetsåtgärder för laboratorier (16).

ICE-testmetoden beaktar inte skador på ögats bindhinna (konjunktiva) eller iris, vilka utvärderas enligt testmetoden för öronirritation hos kaniner, men däremot skador på hornhinnan, som är den viktigaste in vivo-klassificeringen med avseende på FN:s GHS-klassificering. Dessutom gäller att även om reversibiliteten hos hornhinneskador i sig inte kan utvärderas vid ICE-test, har det på grundval av studier av kaninögon föreslagits att en bedömning av det initiala djupet för hornhinneskada kan användas för att identifiera vissa typer av irreversibla effekter (17). Det krävs i synnerhet ytterligare vetenskaplig kunskap för att man ska kunna förstå hur irreversibla effekter som inte är kopplade till en initialt allvarlig skada kan uppstå. Slutligen gäller att ICE inte ger möjlighet att bedöma potentialen för systemisk toxicitet associerad med okulär exponering.

Denna testmetod kommer att uppdateras regelbundet allteftersom ny information och data övervägs. Till exempel kan histopatologi vara potentiellt användbart när det behövs en mer fullständig karakterisering av skador på hornhinnan. För att utvärdera denna möjlighet uppmuntras användarna att bevara ögon och bereda histopatologiska prover som kan användas för att utveckla en databas och beslutskriterier för att ytterligare förbättra metodens noggrannhet. OECD har tagit fram ett vägledningsdokument om användning av okulära toxicitetsmetoder in vivo, som innehåller detaljerade förfaranden om insamling av histopatologiska prover och information om var prover och/eller histopatologiska data ska lämnas in (8).

Laboratorier som tar denna testmetod i bruk för första gången bör använda de kvalifikationskemikalier som förtecknas i tillägg 2. Ett laboratorium kan använda dessa kemikalier för att påvisa sin tekniska kompetens att genomföra ICE-testmetoden innan laboratoriet lämnar in ICE-testdata avsedda för lagstadgad faroklassificering.

TESTPRINCIP

ICE-testmetoden är en organotypisk modell enligt vilken kycklingögon under kort tid bibehåller normal fysiologisk och biokemisk funktion in vitro. Med denna testmetod utvärderas den skada som framkallats av testkemikalien genom bestämning av hornhinnans svullnad, opacitet och fluoresceinfärgning. De två senare parametrarna bedöms kvalitativt medan analysen av hornhinnans svullnad görs kvantitativt. Varje mätning konverteras till ett kvantitativt värde som används för att kalkylera ett övergripande irritationsindex eller för att tilldela en kvalitativ kategorisering som används för att fastställa en klassificering in vitro av kemikalier som är farliga för ögonen, antingen som GHS-kategori 1 eller GHS ingen klassificering. Dessa resultat kan sedan användas för att förutsäga risken för allvarlig ögonskada in vivo eller om testkemikalien inte behöver klassificeras som farlig för ögonen (se beslutskriterierna). Kemikalier som inte förutsägs orsaka allvarlig ögonskada eller inte klassificeras med ICE-testmetoden kan dock inte klassificeras (se punkt 11).

Källa och ålder för kycklingögon

I regel används ögon tillvaratagna från kycklingar som kommer från ett slakteri där de avlivats för användning som livsmedel, vilket eliminerar behovet av försöksdjur. Endast ögon från friska djur som anses lämpliga för livsmedelskedjan får användas.

Det har inte gjorts någon kontrollerad undersökning för att utvärdera optimal ålder för kycklingarna för testmetoden, men i regel används kycklingar som slaktats på vanligt sätt i ett fjäderfäslakteri (cirka 7 veckor gamla, 1,5–2,5 kg).

Tillvaratagande och transport av ögon till laboratoriet

Kycklingarnas huvuden ska avlägsnas omedelbart efter bedövning (i regel med elchock) med snitt i halsen för blödning. Kycklinghuvudena bör komma från en lokal källa nära laboratoriet så att de tillräckligt snabbt kan transporteras från slakteriet till laboratoriet för att minimera risken för skador och/eller bakterieförorening. Tidsintervallet mellan tillvaratagandet av kycklinghuvudena och placeringen av ögonen i superfusionsapparatens kammare efter isolering bör minimeras (i regel högst två timmar) för att säkerställa att försökskriterierna är uppfyllda. Alla ögon som används för testning bör komma från samma grupp av ögon som har tillvaratagits på en viss dag.

Ögonen avlägsnas i laboratoriet, och de orörda kycklinghuvudena ska därför transporteras från slakteriet vid rumstemperatur(normalt 18–25 °C) i plastlådor som fuktas med pappershanddukar indränkta i fysiologisk koksaltlösning.

Urvalskriterier och antal ögon som används för ICE-test

Ögon med högt grundvärde för fluoresceinfärgning (> 0,5) eller korneal opacitet (> 0,5) efter tillvaratagandet ska förkastas.

Varje behandlingsgrupp med parallell positiv kontroll består av minst tre ögon. Den negativa kontrollgruppen eller lösningsmedelskontrollen (om annat lösningsmedel än saltlösning används) ska bestå av minst ett öga.

När det gäller fasta material som leder till ett GHS NC-resultat rekommenderas en andra provomgång för att bekräfta eller avvisa det negativa resultatet.

FÖRFARANDE

Förberedelse av ögonen

Ögonlocken skärs bort försiktigt med undvikande av skador på hornhinnan. Hornhinnans intakta skick kan utvärderas snabbt med en droppe 2 % natriumfluorescein (vikt/volym) som appliceras på hornhinnans yta för några sekunder och därefter sköljs bort med fysiologisk koksaltlösning. De fluoresceinbehandlade ögonen undersöks därefter med spaltlampa för att kontrollera att hornhinnan är intakt (värdet för fluoresceinfärgning och korneal opacitet ≤ 0,5).

Förutsatt att hornhinnan är intakt skärs ögat ut från skallen med varsamhet så att hornhinnan inte skadas. Ögongloben dras ut ur ögonhålan med ett stadigt grepp om blinkhinnan med hjälp av kirurgisk tång och ögonmusklerna klipps av med en böjd trubbig sax. Det är viktigt att greppet om hornhinnan inte är så starkt att det uppstår skador (t.ex. kompressionsartefakter).

När ögat har tagits ut ur hålan bör det finnas kvar en vidfäst synlig del av synnerven. Därefter placeras ögat på ett absorberande underlag och blinkhinnan och annan bindvävnad skärs bort.

Därefter monteras ögat i en klämma av rostfritt stål med hornhinnan i upprätt riktning. Klämman med ögat överförs till superfusionsapparaten (18). Klämmorna ska placeras i superfusionsapparaten så att droppet med fysiologisk koksaltlösning når hela hornhinnan (3–4 droppar per minut eller 0,1–0,15 ml/min.). Superfusionsapparatens kammare ska ha en kontrollerad temperatur på 32 ± 1,5 °C. I tillägg 3 finns en schematisk bild av en typisk superfusionsapparat med ögonklämmor. Utrustningen kan anskaffas kommersiellt eller konstrueras i laboratoriet. Apparaten kan också anpassas efter behoven vid ett enskilt laboratorium (t.ex. för att hålla ett avvikande antal ögon).

Efter att ögonen placerats i superfusionsapparaten granskas de på nytt med spaltlampa för att kontrollera att de inte har fått skador under dissektionen. Samtidigt ska även hornhinnans tjocklek mätas vid hornhinnans apex med hjälp av spaltlampans tillbehör för djupmätning. Ögon som har i) fluoresceinfärgningsvärde > 0,5, ii) värde för korneal opacitet > 0,5 eller iii) andra tecken på skada ska bytas ut. Ögon som inte har förkastats enligt något av dessa kriterier men där hornhinnans tjocklek avviker mer än 10 % från medelvärdet för alla ögon ska förkastas. Det är viktigt att vara medveten om att spaltlampan kan ge olika värden på hornhinnans tjocklek beroende på inställningen för spaltbredd. Spaltbredden ska ställas in på 0,095 mm.

Undersökta och godkända ögon inkuberas i cirka 45–60 minuter för att få dem i jämvikt med testsystemet före doseringen. Efter jämviktsperioden görs en referensmätning av hornhinnans tjocklek och opacitet för att få ett grundvärde (tid = 0). Fluoresceinvärdet som uppmättes vid dissektionen används som grundvärde för denna endpoint.

Applicering av testkemikalien

Omedelbart efter mätningarna av nollreferens tas ögonen (i sina hållare) bort ur superfusionsapparaten, placeras i liggande läge och testkemikalien appliceras på hornhinnan.

Vätskeformiga testkemikalier används i regel i outspädd form men kan spädas ut om det bedöms vara nödvändigt (t.ex. som en del av försöksutformningen). Eventuell utspädning ska helst göras med fysiologisk koksaltlösning. Andra lösningsmedel än fysiologisk koksaltlösning kan användas under kontrollerade förhållanden men då bör lämpligheten påvisas.

Vätskeformiga testkemikalier appliceras på hornhinnan så att hela ytan är jämnt täckt med testkemikalien (standardvolymen är 0.03 ml).

Fasta testkemikalier ska så långt det är möjligt finfördelas i mortel eller motsvarande redskap. Pulvret appliceras så att hornhinnan blir jämnt täckt med testkemikalien. Standardmängden är 0,03 g.

Testkemikalien (vätska eller fast ämne) får verka på hornhinnan i 10 sekunder och sköljs sedan bort från ögat med rumstempererad fysiologisk koksaltlösning (cirka 20 ml). Ögat (i sin hållare) återförs därefter till superfusionsapparaten i ursprunglig upprätt position. Vid behov kan en ytterligare sköljning göras efter 10 sekunders applicering och vid olika tidpunkter därefter (t.ex. om man upptäcker rester av testkemikalien på hornhinnan). I regel är den mängd saltlösning som används för sköljning inte en kritisk faktor, men det är viktigt att kontrollera att kemikalien fäster vid hornhinnan.

Kontrollkemikalier

Parallella negativa kontroller eller lösningsmedels-/vehikelkontroller och positiva kontroller ska ingå i varje försök.

Vid testning av outspädda vätskor eller fasta ämnen med ICE-testmetoden ska fysiologisk koksaltlösning användas som parallell negativ kontroll för att upptäcka icke-specifika ändringar i testsystemet och för att säkerställa att testningsförhållandena inte i onödan framkallar irritation.

Vid testning av utspädda vätskor ska en parallell negativ kontrollgrupp för lösningsmedel/vehikel inbegripas för att upptäcka icke-specifika ändringar i testsystemet och för att säkerställa att testningsförhållandena inte i onödan framkallar irritation. Som det konstateras i punkt 31 får endast lösningsmedel/vehikel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet användas.

Ett känt ögonirriterande ämne ska ingå som parallell positiv kontroll i varje försök för att bekräfta att rätt slags respons framkallas. Eftersom ICE används i denna testmetod för att identifiera frätande eller kraftigt irriterande ämnen, ska den positiva kontrollen göras med en referenskemikalie som framkallar kraftig respons. För att säkerställa att den positiva kontrollresponsens variationer över tiden kan bedömas, bör den kraftiga irritation som framkallas inte vara för stark. Tillräckliga in vitro-data bör genereras för den positiva kontrollen så att det går att beräkna ett godtagbart intervall för denna. Om det inte finns tillbörliga historiska ICE-testmetodsdata för en särskild positiv kontroll måste man eventuellt genomföra försök för att få fram denna information.

Exempel på positiva kontroller för vätskeformiga testkemikalier är 10 % ättiksyra eller 5 % bensalkoniumklorid, och exempel på positiva kontroller för fasta testkemikalier är natriumhydroxid eller imidazol.

Referenskemikalier kan användas för utvärdering av förmågan att framkalla ögonirritation hos okända kemikalier tillhörande en specifik kemisk klass eller produktklass, eller för utvärdering av den relativa irritationspotentialen hos ett ögonirriterande ämne inom ett specifikt responsområde.

Mätning av endpoints

Hornhinnorna utvärderas före behandlingen och vid 30, 75, 120, 180 och 240 minuter (± 5 minuter) efter den sköljning som görs efter behandlingen. Dessa tidpunkter ger ett tillbörligt antal mätningar under den fyra timmar långa behandlingsperioden och ger tillräckligt med tid mellan mätningarna för att genomföra observationerna av alla ögon.

De endpoints som ska bedömas är korneal opacitet, svullnad, fluoresceinfärgning och morfologiska effekter (t.ex. gropbildning eller avlossning av epitel). Alla endpoints, med undantag av fluoresceinfärgning (som endast bestäms före behandlingen och 30 minuter efter exponering av testkemikalien) bestäms vid alla de ovan nämnda tidpunkterna.

Fotografier rekommenderas för dokumentering av korneal opacitet, fluoresceinfärgning, morfologiska verkningar och, i förekommande fall, histopatologi.

Efter den sista granskningen vid tidpunkten fyra timmar är det rekommendabelt att hålla ögonen i lämpligt konserveringsmedel (t.ex. neutralt formalin med buffert) med tanke på eventuell histopatologisk undersökning (se punkt 14 och hänvisning 8 för närmare uppgifter).

Hornhinnans svullnad bestäms genom mätningar av hornhinnans tjocklek med en pachymeter eller spaltlampa. Svullnaden uttrycks som ett procenttal och beräknas på grundval av mätningarna enligt följande formel:

Medelvärdet för hornhinnans svullnad för alla testögon beräknas för alla observationstidpunkter. Det högsta medelvärdet för svullnad oavsett observationstidpunkt används som grund för en övergripande kategorisering av testkemikalien (se punkt 51).

Den korneala opaciteten utvärderas på grundval av mätningarna på det område av hornhinnan som har den tätaste opaciteten enligt tabell 1. Medelvärdet för den korneala opaciteten för alla testögon beräknas för alla observationstidpunkter. Det högsta medelvärdet för korneal opacitet oberoende av tidpunkt används som grund för en övergripande kategorisering av testkemikalien (se punkt 51).

Tabell 1

Värden för korneal opacitet.

Fluoresceinfärgningen utvärderas efter 30 minuters observationstid enligt tabell 2. Medelvärdet för fluoresceinfärgning för alla testögon beräknas därefter för observationstidpunkten 30 minuter och används för övergripande kategorivärde som ges för varje testkemikalie (se punkt 51).

Tabell 2

Värden för fluoresceinfärgning.

Till de morfologiska effekterna hör gropbildning i hornhinnans epitel, avlossning av epitel, uppruggning av hornhinnans yta och vidfästning av testkemikalien vid hornhinnan. Dessa observationer kan ha olika allvarlighetsgrad och kan förekomma samtidigt. Klassificeringen av observationerna är subjektiva och beror på personlig tolkning.

DATA OCH RAPPORTERING

Utvärdering av data

Resultaten för korneal opacitet, svullnad och fluoresceinfärgning bör utvärderas separat för att ge en ICE-klass för varje endpoint. ICE-klasserna för varje endpoint kombineras därefter, så att man får en klassificering av varje testkemikalie med avseende på irritationsframkallande egenskaper.

Beslutskriterier

Efter att varje endpoint har utvärderats kan ICE-klasser tilldelas i enlighet med en på förhand fastställd skala. Tolkningen av hornhinnans svullnad (tabell 3), opacitet (tabell 4) och fluoresceinfärgning (tabell 5) med användning av fyra ICE-klasser görs enligt de skalor som visas nedan. Det är viktigt att notera att de värden för hornhinnans svullnad som anges i tabell 3 endast gäller om tjockleken mäts med en spaltlampa (t.ex. Haag-Streit BP900) med djupmätanordning nr 1 och spaltbredd på 9

Tabell 3

ICE-klassificeringskriterier för hornhinnans svullnad.

Tabell 4

ICE-klassificeringskriterier för opacitet.

Tabell 5

ICE-klassificeringskriterier för fluoresceinfärgning.

Testkemikaliens övergripande klassificering in vitro bedöms genom avläsning av den GHS-klassificering som motsvarar kombinationen av kategorier för hornhinnan i fråga om svullnad, korneal opacitet och fluoresceinfärgning enligt beskrivningen i tabell 6.

Tabell 6

Övergripande in vitro-klassificeringar.

Kriterier för godkännande av ett försök

Testet anses godtagbart om de parallella negativa kontrollerna eller vehikel-/lösningsmedelskontrollerna och de parallella positiva kontrollerna identifieras som GHS ingen klassificering respektive GHS-kategori 1.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter i den mån de är relevanta: