1.

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 105 (1995). Den här testmetoden är en reviderad version av den ursprungliga TG 105 vilken antogs 1981. Det finns ingen skillnad i sak mellan nuvarande version och den från 1981. Huvudsakligen har utformningen ändrats. Ändringen baserades på EU:s testmetod ”Vattenlöslighet” (1).

2.

Ett ämnes vattenlöslighet kan påverkas avsevärt av förekomsten av orenheter. Den här testmetoden behandlar bestämningen av löslighet i vatten av i huvudsak rena ämnen som är stabila i vatten och inte flyktiga. Innan man kan göra en bestämning av vattenlöslighet är det användbart med några preliminära uppgifter om testämnet, såsom strukturformel, ångtryck, dissocationskonstant och hydrolys som en funktion av pH.

3.

Två metoder finns beskrivna här: kolonnelueringsmetoden och kolvmetoden som täcker respektive löslighet under och över 10–2 g/l. Ett enkelt inledande test finns också beskrivet. Det anger det ungefärliga lämpliga antalet provtagningar för det slutliga testet, liksom den tid som åtgår för att uppnå mättnad.

4.

Ett ämnes löslighet i vatten är mättnadskoncentrationen av det ämnet i vatten vid en given temperatur.

5.

Vattenlöslighet uttrycks i mängden löst ämne per volym av lösningen. SI-enheten är kg/m3, men g/l kan också användas.

6.

Referenskemikalier behöver inte användas vid undersökning av ett testämne.

7.

Testet ska helst utföras vid temperaturen 20 ± 0,5 °C. Den valda temperaturen ska hållas konstant i utrustningens alla relevanta delar.

8.

I ett stegvist förfarande ska ökande volymer vatten vid rumstemperatur tillsättas till ca 0,1 g av provet (fasta testämnen måste pulvriseras) i ett 10 ml mätglas med glaspropp. Blandningen skakas i 10 minuter efter varje tillsats av vatten och avsynas för eventuella oupplösta delar av provet. Om provet eller delar av det fortfarande inte är upplöst efter tillsats av 10 ml vatten ska försöket fortgå i ett 100 ml mätglas. Den ungefärliga lösligheten anges i tabell 1 för den volym vatten där fullständig upplösning av provet sker. Det kan ta lång tid att lösa upp ett testämne när lösligheten är låg och minst 24 timmar bör avsättas för det. Om testämnet efter 24 timmar fortfarande inte är upplöst bör man avsätta längre tid (upp till 96 timmar), eller mer späda ut mer för att kunna fastställa om kolonnelueringsmetoden eller kolvmetoden bör användas.

Tabell 1

9.

Den här metoden bygger på elueringen av ett testämne med vatten från en mikrokolonn laddad med ett inert bärämne, som tidigare belagts med ett överskott av testämnet (2). Vattenlösligheten ges av eluatets masskoncentration när denna har nått en platå som en funktion av tiden.

10.

Utrustningen består av en mikrokolonn (figur 1), som hålls i konstant temperatur. Den är antingen ansluten till en cirkulationspump (figur 2) eller ett nivåkärl (figur 3). Mikrokolonnen innehåller en inert bärare som hålls på plats av en liten plugg av glasull som också används för att filtrera partiklar. Material som kan användas som bärare är glaspärlor, kiselgur eller andra inerta material.

11.

Mikrokolonnen som visas i figur 1 är lämplig för uppställningen av cirkulationspumpen. Den har ett gasutrymme för fem bäddvolymer (kasseras i början av försöket) och volym för fem prover (som tas bort för analys under försöket). Ett annat alternativ är att minska storleken om vatten kan tillsättas under försöket som ersättning för de fem första bäddvolymerna med orenheter som har avlägsnats. Kolonnen är ansluten till cirkulationspumpen med ett rör tillverkat i ett inert material med en kapacitet på ca 25 ml/tim. Cirkulationspumpen kan t.ex. vara en peristaltisk pump eller en membranpump. Försiktighet måste iakttas så att ingen förorening och/eller adsorption uppstår i rörmaterialet.

12.

Ett schematiskt arrangemang med ett nivåkärl visas i figur 3. I detta arrangemang är mikrokolonnen försedd med en envägsventil. Anslutningen till nivåkärlet består av inslipad hals och rör tillverkat i ett inert material. Flödeshastigheten från nivåkärlet bör vara ca 25 ml/tim.

Figur 1

Dimensioner i mm

Figur 2

Figur 3

13.

Ca 600 mg bärämne överförs till en 50 ml rundbottnad kolv. En lämplig mängd av testämnet upplöses i ett flyktigt lösningsmedel av analytisk reagenskvalitet och en lämplig volym av denna lösning tillsätts bärämnet. Lösningsmedlet avdunstas fullständigt, t.ex. med hjälp av en rotationsförångare, i annat fall uppnår bäraren ingen vattenmättnad under elueringssteget på grund av uppdelning på ytan. Det laddade bärämnet blötläggs två timmar i ca 5 ml vatten och suspensionen hälls i mikrokolonnen. Alternativt kan torrt laddat bärämne hällas i den vattenfyllda mikrokolonnen, och två timmar avsätts för ekvilibrering.

14.

Laddning av bärämnet kan ge problem som leder till felaktiga resultat, t.ex. om testämnet utfälls som en olja. Man bör se närmare på dessa problem och rapportera detaljerna.

15.

Flödet genom kolonnen startas. En flödeshastighet på ca 25 ml/tim rekommenderas vilket motsvarar 10 bäddvolymer i timmen för den beskrivna kolonnen. För borttagning av vattenlösliga orenheter ska minst de fem första bäddvolymerna kasseras. Efter detta ska pumpen vara på tills jämvikt uppnås, vilket definieras som fem successiva prov vilkas koncentrationer inte skiljer sig åt med mer än ± 30 % på ett slumpmässigt sätt. Proven bör vara skilda från varandra med ett tidsintervall som motsvarar genomströmningen av minst tio bäddvolymer. Beroende på den analysmetod som används upprättas en koncentrations-/tidskurva för att visa att jämvikt har uppnåtts.

16.

Successiva fraktioner av eluatet samlas in och analyseras med den valda metoden. Fraktioner av eluatet från mellanintervallet, där koncentrationerna är konstanta inom ± 30 % av minst fem successiva fraktioner, används för att fastställa lösligheten.

17.

Det föredragna eluatet är dubbeldestillerat vatten. Avjoniserat vatten med en resistivitet på över 10 megaohm/cm och ett totalt innehåll av organiskt kol lägre än 0,01 % kan också användas.

18.

För båda procedurerna utförs en andra omgång, med halverad flödeshastighet jämfört med den första. Testet är lyckat om resultatet från de två omgångarna överensstämmer. Om den uppmätta lösligheten är högre med den lägre flödeshastigheten, måste halveringen av flödeshastigheten fortsätta tills två successiva omgångar ger samma löslighet.

19.

I båda förfarandena ska fraktionerna kontrolleras beträffande förekomsten av kolloidalt material genom undersökning av Tyndalleffekten. Förekomsten av partiklar gör testet ogiltigt, och testet ska upprepas efter förbättringar av kolonnens filtrering.

20.

Varje provs pH mäts med särskilda indikatorremsor.

21.

Testämnet (fasta ämnen måste pulvriseras) löses upp i vatten vid en temperatur som ligger strax över testtemperaturen. När mättnad har uppnåtts kyls blandningen och hålls vid testtemperaturen. Om man genom lämplig provtagning säkerställer att mättnadsjämvikt har uppnåtts kan mätningen utföras direkt vid testtemperaturen. Därefter bestäms masskoncentrationen av testämnet i vattenlösningen, vilken inte får innehålla några olösta partiklar, genom en lämplig analysmetod (3).

22.

Följande material behövs:

23.

Efter det inledande testet bestäms den nödvändiga mängden testämne som behövs för att mätta den önskade volymen vatten. Ungefär fem gånger den mängden vägs in i var och en av de tre glaskärlen utrustade med glasproppar (t.ex. centrifugrör, kolvar). En volym vatten, som valts efter analysmetod och löslighetsintervall, tillsätts varje kärl. Kärlen försluts och skakas sedan vid 30 °C. Man bör använda en skak- eller omrörningsutrustning som kan hålla en konstant temperatur, t.ex. magnetisk omrörning i ett termostatreglerat vattenbad. Efter en dag ekvilibreras ett av kärlen under 24 timmar vid testtemperaturen, med enstaka skakningar. Kärlets innehåll centrifugeras vid testtemperaturen, och koncentrationen av testämnet i den klara vattenfasen bestäms genom en lämplig analysmetod. De andra bägge kolvarna behandlas likartat efter en initial ekvilibrering vid 30 °C i två, respektive tre, dagar. Testet är lyckat om den uppmätta koncentrationen i åtminstone två av de sista kärlen inte avviker med mer än 15 %. Om resultaten från kärl 1, 2 och 3 visar ökande värden, bör hela testet göras om med längre ekvilibreringstider.

24.

Testet kan också utföras utan föregående inkubation vid 30 °C. För att uppskatta graden av etablering av mättnadsjämvikten tas prover tills omrörning inte längre påverkar de uppmätta koncentrationerna.

25.

Varje provs pH mäts med särskilda indikatorremsor.

26.

En ämnesspecifik metod är att föredra eftersom små mängder lösliga orenheter kan orsaka stora fel i den uppmätta lösligheten. Exempel på sådana metoder är gas- eller vätskekromatografi, titrering, fotometri och voltametri.

27.

För varje omgång ska medelvärde och standardavvikelse beräknas från minst fem på varandra följande prov som tas från mättnadsplatån. De medelvärden som erhållits från två tester med olika flöden bör inte avvika med mer än 30 %.

28.

Medelvärdet beräknas för de individuella resultaten från var och en av de tre kolvarna, vilka inte bör avvika med mer än 15 %.

29.

Testrapporten måste innehålla följande information:

30.

Testrapporten måste innehålla följande information:

(1)

Kommissionens direktiv 92/69/EEG av den 31 juli 1992 om anpassning till tekniska framsteg för sjuttonde gången av rådets direktiv 67/548/EEG om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning och märkning av farliga ämnen, EGT L 383, 29.12.1992, s. 113–114.

(2)

NF T 20-045 (AFNOR) (september 1985). Kemiska produkter för industriell användning – Fastställande av vattenlöslighet för fasta ämnen och vätskor med låg löslighet – kolonnelueringsmetoden.

(3)

NF T 20-046 (AFNOR) (september 1985). Kemiska produkter för industriell användning – Fastställande av vattenlöslighet av fasta ämnen och vätskor med hög löslighet – kolvmetoden.”

1.

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 123 (2006). Fördelningskoefficient 1-oktanol/vatten (POW) med log POW-värden upp till 8,2 har noggrant bestämts genom metoden med långsam omrörning (1). Den lämpar sig därför för direkt bestämning av POW för mycket hydrofoba ämnen.

2.

Andra metoder för bestämning av fördelningskoefficienten 1-oktanol/vatten (POW) är ”skakkolvmetoden” (2), där POW bestäms utifrån retentionstiden vid HPLC-analys med omvänd fas (3). Skakkolvmetoden ger ofta upphov till artefakter beroende på att mikroskopiska droppar av oktanol övergår i vattenfasen. Med ökande värden på POW leder närvaron av dessa droppar i allt högre grad till att testämnets koncentration i vattnet överskattas. Metoden kan därför bara användas för ämnen med log POW < 4. Den andra metoden bygger på en tillförlitlig uppsättning direktbestämda POW-värden som används för att kalibrera förhållandet mellan retentionstiden med HPLC och de uppmätta POW-värdena. Det har funnits ett utkast till OECD-riktlinjer tillgängligt för bestämning av fördelningskoefficienten 1-oktanol/vatten för joniserbara ämnen (4), men detta ska inte längre användas.

3.

Den här testmetoden har utvecklats i Nederländerna. Precisionen för de förfaranden som beskrivs här har validerats och optimerats genom interkalibrering med 15 deltagande laboratorier (5).

4.

För inerta organiska ämnen har man funnit att det finns ett mycket tydligt samband mellan deras fördelningskoefficient 1-oktanol/vatten (POW) och deras bioackumulering i fisk. Det har dessutom konstaterats att det finns ett samband mellan kemikaliers POW och deras toxicitet för fisk samt mellan deras POW och förmåga att bindas till fasta material som jord och sediment. För en utförlig översikt över dessa samband, se hänvisning (6).

5.

Det har fastställts en rad samband mellan fördelningskoefficienten 1-oktanol/vatten och andra ämnesegenskaper som är av betydelse inom miljötoxikologi och miljökemi. Fördelningskoefficienten 1-oktanol/vatten har därför kommit att bli en mycket viktig parameter vid bedömning av miljörisker med kemikalier och för att förutsäga hur de kommer att uppföra sig i miljön.

6.

Metoden med långsam omrörning är tänkt att minska bildningen av mikrodroppar av 1-oktanol i vattenfasen. Detta torde minska risken för att koncentrationen i vattnet överskattas på grund av att molekyler av testämnet binds till sådana droppar. Metoden lämpar sig därför särskilt väl för bestämning av POW för ämnen som antas ha log POW-värden på 5 och högre, för vilka skakkolvmetoden (2) lätt kan ge felaktiga resultat.

7.

Ett ämnes fördelningskoefficient mellan vatten och ett lipofilt lösningsmedel (1-oktanol) beskriver dess jämviktsfördelning mellan de båda faserna. Fördelningskoefficienten 1-oktanol (POW) definieras som förhållandet mellan testämnets jämviktskoncentrationer i 1-oktanol mättad med vatten (CO) och i vatten mättat med 1-oktanol (CW).

Fördelningskoefficienten är en dimensionslös storhet eftersom den beskriver förhållandet mellan två koncentrationer. Den uttrycks vanligen som tiologaritmen (log POW). POW är temperaturberoende, och rapporterade data måste därför omfatta en angivelse av temperaturen vid mätningen.

8.

Vid bestämning av fördelningskoefficienten bringas vatten, 1-oktanol och testämnet i jämvikt med varandra vid konstant temperatur. Därefter bestäms testämnets koncentration i de båda faserna.

9.

Man kan minska problemet med bildning av mikroskopiska droppar under skakkolvförsöket genom att använda metoden med långsam omrörning som beskrivs här. Metoden går ut på att vatten, 1-oktanol och testämnet bringas i jämvikt i ett termostatreglerat reaktionskärl under omrörning. Utbytet mellan faserna påskyndas genom omrörning. Omrörningen gör också att det uppkommer viss turbulens som ökar utbytet mellan 1-oktanol och vatten utan att mikroskopiska droppar bildas (1).

10.

Eftersom förekomsten av andra ämnen än testämnet kan påverka testämnets aktivitetskoefficient, bör testämnet testas som ett rent ämne. Den högsta renhet som är kommersiellt tillgänglig ska användas för fördelningsförsöket med 1-oktanol/vatten.

11.

Den aktuella metoden gäller rena ämnen som inte upplöses eller förenas, och som inte visar någon signifikant gränsskiktsaktivitet. Den kan tillämpas för att bestämma fördelningsförhållandet för 1-oktanol/vatten för sådana ämnen och blandningar. När metoden används för blandningar, är fördelningsförhållandena som fastställs för 1-oktanol/vatten villkorade och beroende av den testade blandningens kemiska sammansättning och på elektrolytens sammansättning som används som vattenfas. Vidtas ytterligare åtgärder är metoden också tillämplig för dissocierings- eller associeringsföreningar (punkt 12).

12.

På grund av att multipel jämvikt i vatten och 1-oktanol inblandad i fördelningen 1-oktanol/vatten av dissocierade ämnen såsom organiska syror och fenoler, organiska baser och metallorganiska ämnen, är fördelningsförhållandet 1-oktanol/vatten en villkorad konstant starkt beroende av elektrolytsammansättning (7) (8). Bestämningen av fördelningsförhållandet för 1-oktanol/vatten kräver därför att pH och elektrolytsammansättning kontrolleras i försöket och rapporteras. En sakkunnig bedömning måste användas vid utvärderingen av dessa fördelningsförhållanden. När värdet för dissociationskonstant(er) används måste lämpliga pH-värden väljas så att ett fördelningsförhållande fastställs för varje joniseringstillstånd. Icke-komplexbildande buffertar måste användas vid testning av metallorganiska föreningar (8). Med beaktande av befintlig kunskap om vattenkemi (komplexbildningskonstanter, dissociationskonstanter) bör testbetingelserna väljas på ett sådant sätt att specificeringen av testämnet i vattenfasen kan beräknas. Jonstyrkan bör vara identisk i alla försök genom användning av en bakgrundselektrolyt.

13.

Under testet kan svårigheter uppstå för ämnen med låg vattenlöslighet eller högt POW, på grund av att halterna i vattnet blir så låga att det blir svårt att göra en noggrann bestämning. Den här testmetoden ger vägledning i hur man hanterar detta problem.

14.

Kemiska reagenser bör vara av analytisk renhetsgrad eller renare. För detta test rekommenderas omärkta testämnen med känd kemisk sammansättning och en renhet som helst uppgår till minst 99 %, eller radioaktivt märkta ämnen med känd kemisk sammansättning och radiokemisk renhet. När ämnen med kort halveringstid används för märkningen är det nödvändigt att korrigera för sönderfallet. För radioaktivt märkta testämnen bör man använda en analysmetod som är specifik för kemikalien i fråga, så att man kan vara säker på att den uppmätta radioaktiviteten härrör direkt från testämnet.

15.

Värdet på log POW kan uppskattas med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara eller genom att man jämför testämnets löslighet i de båda lösningsmedlen.

16.

Innan POW bestäms med den här metoden bör man ha tillgång till följande information om testämnet:

17.

Vanlig laboratorieutrustning behövs, i synnerhet följande:

18.

Kärlet bör vara tillverkat av ett inert material så att adsorptionen på kärlets väggar och botten är försumbar.

19.

Bestämningen av POW bör göras med den renaste 1-oktanol som finns i handeln (minst + 99 %). Det rekommenderas att 1-oktanol renas genom extraktion med syra, bas och vatten samt efterföljande torkning. 1-oktanol kan också renas genom destillation. Renad 1-oktanol används för att bereda standardlösningar av testämnena. Det vatten som används för bestämningen av POW ska vara destillerat i utrustning av glas eller kvarts, eller ska komma från ett reningssystem. Vatten av HPLC-kvalitet kan också användas. Destillerat vatten måste filtreras genom ett 0,22 μm filter, och för att kontrollera att de koncentrerade extrakten inte innehåller några föroreningar som kan reagera med testämnet måste blankprover ingå. Om ett glasfiberfilter används ska det rengöras genom upphettning vid 400 °C i minst tre timmar.

20.

Innan försöket inleds mättas de båda lösningsmedlen med varandra genom att bringas i jämvikt i ett tillräckligt stort kärl. Detta åstadkoms genom långsam omrörning av tvåfassystemet i två dagar.

21.

En lämplig koncentration av testämnet väljs och löses i 1-oktanol (mättad med vatten). Fördelningskoefficienten 1-oktanol/vatten ska bestämmas i utspädda lösningar i 1-oktanol och vatten. Testämnets koncentration bör därför inte överstiga 70 % av dess löslighet med en högsta koncentration på 0,1 M i endera fasen (1). De lösningar i 1-oktanol som används för försöket får inte innehålla något uppslammat testämne i fast form.

22.

En lämplig mängd av testämnet löses i 1-oktanol (mättad med vatten). Om den uppskattade log POW är större än fem måste man se till att de lösningar i 1-oktanol som används för försöket inte innehåller något uppslammat testämne i fast form. För att undvika detta ska följande metod användas för kemikalier vars uppskattade log POW-värde är > 5:

23.

En validerad analysmetod ska användas för bestämning av testämnet. De som utför försöket måste kunna styrka att koncentrationerna både i den vattenmättade 1-oktanolen och i den 1-oktanol-mättade vattenfasen ligger över den använda analysmetodens kvantifieringsgräns. Om det är nödvändigt att extrahera testämnet från vattenfasen och 1-oktanolfasen måste utbytet vid extraktion från respektive fas fastställas innan försöket inleds. Signalen måste korrigeras för blankvärden och det är viktigt att se till att ingen analyt överförs från ett prov till ett annat.

24.

För hydrofoba testämnen som har relativt låga koncentrationer i vattenfasen är det troligen nödvändigt att extrahera vattenfasen med ett organiskt lösningsmedel och att koncentrera extraktet före analys. Av samma anledning är det också nödvändigt att blankproverna har en mycket låg koncentration. Därför måste mycket rena lösningsmedel användas, helst lösningsmedel för spårämnesanalys. Risken för att föroreningar överförs mellan proverna kan också minskas genom att man använder noggrant rengjord glasutrustning (den kan t.ex. sköljas i lösningsmedel eller upphettas vid hög temperatur).

25.

Värdet på log POW kan uppskattas med hjälp av ett uppskattningsprogram eller genom sakkunnig bedömning. Om det är högre än 6 är det viktigt att korrigera för blankvärdena och kontrollera att det inte sker någon överföring av analyt mellan proverna. Om det uppskattade log POW-värdet överskrider 6 måste man använda en surrogatstandard för att korrigera för utbytet så att provet kan koncentras så mycket som möjligt före analys. Ett antal program för uppskattningen av log POW finns kommersiellt tillgängliga (1), t.ex. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) och ACD log P (19). I hänvisningarna (20–22) beskrivs olika metoder för att uppskatta log POW.

26.

Kvantifieringsgränserna för bestämning av testämnet i 1-oktanol och vatten ska fastställas med vedertagna metoder. Som en tumregel kan kvantifieringsgränsen anses vara den koncentration i vatten eller 1-oktanol som ger ett signal-brusförhållande på tio. En lämplig extraktions- och förkoncentrationsmetod ska väljas, och utbytet vid analysen ska också anges. En lämplig grad av förkoncentrering väljs så att en signal av erforderlig storlek erhålls vid den analytiska bestämningen.

27.

På grundval av analysmetodens parametrar och de förväntade koncentrationerna bestäms den ungefärliga provstorlek som krävs för en korrekt bestämning av ämnets koncentration. Man bör undvika att använda vattenprover som är så små att man inte erhåller en tillräcklig signal. Man bör likaså undvika alltför stora vattenprover, eftersom det annars kan hända att det inte finns tillräckligt mycket vatten kvar för att göra det erforderliga antalet analyser (n = 5). I tillägg 1 anges den minsta provvolymen som en funktion av kärlets volym, testämnets detektionsgräns och dess löslighet.

28.

Testämnena kvantifieras genom jämförelser av kalibreringskurvorna för respektive ämne. De analyserade provernas koncentrationer måste ligga i samma intervall som standardlösningarnas koncentrationer.

29.

För testämnen vars uppskattade log POW är högre än 6 måste vattenprovet spikas med en surrogatstandard före extraktionen, så att förlusterna vid extraktion och förkoncentrering av vattenproverna kan bedömas. För att utbytet ska kunna korrigeras så exakt som möjligt måste surrogatstandardens egenskaper vara mycket lika eller identiska med testämnets egenskaper. Helst ska (stabila) isotopmärkta analoger av testämnet (t.ex. deuterium- eller 13C-märkta) användas. Om det inte är möjligt att använda stabila isotopmärkta analoger såsom 13C eller 2H ska det genom tillförlitliga litteraturuppgifter visas att surrogatstandardens fysikalisk-kemiska egenskaper ligger mycket nära testämnets. Vid vätske-vätskeextraktionen av vattenfasen kan emulsioner bildas. Detta problem kan minskas genom tillsats av salt och genom att man låter emulsionen klarna över natten. I rapporten ska det anges vilka metoder som används för extraktion och förkoncentrering av proverna.

30.

Prover som tas från 1-oktanolfasen kan vid behov spädas med ett lämpligt lösningsmedel före analys. Dessutom rekommenderas att utbytet korrigeras genom användning av surrogatstandarder om det vid försök visat sig att utbytet varierar mycket (relativ standardavvikelse > 10 %).

31.

Rapporten ska omfatta detaljerade uppgifter om den använda analysmetoden. Hit hör extraktions- och förkoncentrationsmetoder, utspädningsfaktorer, instrumentparametrar, kalibreringsrutin, kalibreringsområde, analytisk utbyte av testämnet från vatten, tillsats av surrogatstandarder för korrigering av utbytet, blankvärden, detektionsgränser och kvantifieringsgränser.

32.

När man väljer volymerna av 1-oktanol och vatten bör man beakta kvantifieringsgränserna i 1-oktanol och vatten, graden av förkoncentration av vattenproverna, provtagningsvolymerna i 1-oktanol och vatten och de förväntade koncentrationerna. Av experimentella skäl bör volymen av 1-oktanol väljas så att skiktet av 1-oktanol blir så tjockt (> 0,5 cm) att det är möjligt att ta prover från 1-oktanolfasen utan att den störs.

33.

Vid bestämning av fördelningskoefficienten för ämnen med log POW på 4,5 och högre används typiskt 20 till 50 ml 1-oktanol och 950 till 980 ml vatten i ett enliterskärl.

34.

Reaktionskärlet ska vara termostatreglerat så att temperaturvariationen under försöket är mindre än 1 °C. Försöket ska utföras vid 25 °C.

35.

Försökssystemet måste skyddas från dagsljus, antingen genom att försöket utförs i ett mörkt rum eller genom att reaktionskärlet täcks med aluminiumfolie.

36.

Försöket ska utföras i en så dammfri miljö som möjligt.

37.

Blandningen av 1-oktanol och vatten rörs om tills jämvikt inställer sig. Hur lång tid det tar att uppnå jämvikt bestäms i ett pilotförsök där prover på vatten och 1-oktanol tas med jämna mellanrum. Det ska gå minst fem timmar mellan provtagningstillfällena.

38.

Varje bestämning av POW ska bygga på minst tre oberoende omrörningsförsök.

39.

Jämvikt antas ha inställt sig när man vid regression av koncentrationsförhållandet mellan 1-oktanol och vatten som en funktion av tiden, över en tidsrymd som omfattar fyra punkter, får en lutning som inte avviker nämnvärt från 0 vid en p-nivå på 0,05. Systemet måste bringas i jämvikt under minst en dag innan provtagningen inleds. Som en tumregel kan provtagning av ämnen med ett uppskattat log POW mindre än 5 göras under dag två och tre. För mer hydrofoba ämnen kan det ta längre tid att uppnå jämvikt. För ett ämne med ett log POW på 8,23 (dekaklorbifenyl) krävdes 144 timmar för att nå jämvikt. För att avgöra om jämvikt inställt sig tas upprepade prover från ett och samma kärl.

40.

Försöket inleds genom att reaktionskärlet fylls med vatten mättat med 1-oktanol. Kärlet får sedan stå tills den temperatur som termostaten är inställd på nås.

41.

Därefter tillsätts försiktigt önskad mängd av testämnet (löst i erforderlig volym 1-oktanol mättad med vatten) till reaktionskärlet. Detta är ett kritiskt steg i försöket, eftersom man måste undvika turbulent blandning av de båda faserna. 1-oktanolfasen kan därför långsamt pipetteras mot reaktionskärlets vägg, nära vattenfasen. Den kommer att rinna längs glasväggen och bilda en film ovanpå vattenfasen. 1-oktanol får aldrig hällas direkt i reaktionskärlet och det är viktigt att se till att droppar av 1-oktanol inte faller direkt i vattnet.

42.

Omröraren startas och omrörningshastigheten ökas långsamt. Om omrörarmotorn inte kan justeras ordentligt bör man överväga att använda en transformator. Omrörningshastigheten justeras så att strömvirveln i kontaktytan mellan vattnet och 1-oktanolen är 0,5 till högst 2,5 cm djup. Om strömvirveln är djupare än 2,5 cm ska omrörningshastigheten minskas. I annat fall kan det bildas mikrodroppar av 1-oktanol i vattenfasen, som leder till att testämnets koncentration i vattenfasen överskattas. Rekommendationen att omrörningshastigheten ska ge en virvel på högst 2,5 cm grundas på resultaten av den utförda interkalibreringen (5). Det är en kompromiss mellan önskan att snabbt uppnå jämvikt och att begränsa bildningen av mikroskopiska droppar av 1-oktanol.

43.

Omröraren stängs av före provtagningen och man väntar sedan tills vätskorna slutat röra sig. När provtagningen är avslutad startas omröraren igen, först långsamt och sedan gradvis snabbare såsom beskrivs ovan.

44.

Prover på vattenfasen tas från en kran i botten av reaktionskärlet. Släng alltid bort den dödvolym vatten som finns i kranen (ca 5 ml i det kärl som visas i tillägg 2). Vattnet i kranen är inte omrört och är därför inte i jämvikt med resten av vätskan i kärlet. Anteckna vattenprovernas volym och se till att testämnet som finns i det slängda vattnet beaktas när massbalansen upprättas. Avdunstningsförlusterna minimeras genom att vattnet sakta får rinna in i separertratten, utan att vatten- och 1-oktanolfaserna störs.

45.

Prover av 1-oktanol tas genom att små alikvoter (ca 100 μl) avlägsnas från 1-oktanolfasen med en 100 mikrolitersspruta helt av glas och metall. Det är viktigt att de båda vätskorna inte blandas i kontaktytan. Den provtagna vätskans volym antecknas. Det räcker med små alikvoter eftersom 1-oktanol-provet späds ut.

46.

Onödiga provöverföringssteg bör undvikas. Provvolymen bör därför bestämmas gravimetriskt. För vattenprover kan detta åstadkommas genom att man samlar upp vattenprovet i en separertratt som redan innehåller den erforderliga mängden lösningsmedel.

47.

Enligt den här metoden bestäms POW genom att man utför tre omrörningsförsök med det ämne som ska undersökas under identiska betingelser. Den regressionsanalys som används för visa att jämvikt uppnåtts ska grundas på resultaten av minst fyra på varandra bestämningar av CO/CW vid olika tidpunkter. På så sätt kan man beräkna variansen som ett mått på osäkerheten för det medelvärde som erhålls från varje försöksenhet.

48.

POW kan beskrivas genom den varians i data som erhålls i varje försöksenhet. Denna information används för att beräkna POW som det vägda medelvärdet för resultaten i de enskilda försöksenheterna. Det inverterade värdet på variansen hos resultaten från försöksenheterna används som vikt. Detta leder till att data som uppvisar en stor variation (uttryckt som varians) och som därför är mindre tillförlitliga inte påverkar resultaten lika mycket som data med liten varians.

49.

Den vägda standardavvikelsen beräknas på samma sätt. Den beskriver POW-mätningens repeterbarhet. Ett lågt värde på den vägda standardavvikelsen visar att bestämningen av POW har en mycket god repeterbarhet inom ett och samma laboratorium. Den formella statistiska behandlingen av erhållna data beskrivs nedan.

50.

Logaritmen för förhållandet mellan testämnets koncentrationer i 1-oktanol och vatten (log (CO/Cw)) beräknas för varje provtagningstidpunkt. För att visa att jämvikt uppnåtts plottas detta förhållande som en funktion av tiden. En platå i kurvan, som ska omfatta minst fyra på varandra följande mätpunkter, tyder på att jämvikt har uppnåtts och att ämnet verkligen är löst i 1-oktanol. Om så inte är fallet måste försöket fortgå tills fyra på varandra följande mätpunkter ger en lutning som inte avviker nämnvärt från 0 vid en p-nivå på 0,05, vilket anger att log Co/Cw är oberoende av tid.

51.

Värdet på log POW i försöksenheten beräknas som det vägda medelvärdet för log Co/Cw för den del av kurvan (log Co/Cw som en funktion av tiden) där det har visats att jämvikt uppnåtts. Det vägda medelvärdet beräknas genom att data vägs med det inverterade värdet på variansen så att deras påverkan på slutresultatet är omvänt proportionell mot deras osäkerhet.

52.

Medelvärdet av log POW för olika försöksenheter beräknas som medelvärdet av resultaten från de enskilda försöken viktade med sina respektive varianser.

Beräkningen utförs med hjälp av följande formel:

där

Den inverterade variansen för log POW,i används som wi ().

53.

Medelfelet av log POW uppskattas som den repeterbarhet för log Co/Cw som bestäms under jämviktsfasen i varje enskild försöksenhet. Det uttrycks som den vägda standardavvikelsen för log POW,Av (σlog Pow,Av) som i sin tur är ett mått på det fel som hänger samman med POW,Av. Den vägda standardavvikelsen kan beräknas från den viktade variansen (varlog Pow,Av) enligt följande formel:

Symbolen n står för antalet försöksenheter.

54.

Testrapporten ska omfatta följande information:

(1)

De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499–512.

(2)

Kapitel A.8 i denna bilaga, fördelningskoefficient.

(3)

Kapitel A.8 i denna bilaga, fördelningskoefficient.

(4)

OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.

(5)

Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.

(6)

Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, Förenta staterna.

(7)

Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.

(8)

Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596–2602.

(9)

OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.

(10)

Kapitel A.6 i denna bilaga, vattenlöslighet.

(11)

Kapitel C.7 i denna bilaga, nedbrytning – abiotisk nedbrytning: hydrolys som funktion av pH.

(12)

Kapitel C.4 – del II–VII (Metod A till F) i denna bilaga, bestämning av ”lätt” bionedbrytbarhet.

(13)

Kapitel A.4 i denna bilaga, ångtryck.

(14)

Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623–626.

(15)

Lyman WJ (1990). Solubility in water. I: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.

(16)

Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.

(17)

Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.

(18)

Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.

(19)

ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Kanada, 2001.

(20)

Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. I Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.

(21)

Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479–488.

(22)

Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386–390.

1.

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 403 (2009) (1). Den ursprungliga testriktlinjen för akut inhalation 403 (TG 403) antogs 1981. Denna reviderade testmetod B.2 (som motsvarar den reviderade TG 403) har utformats för att vara mer flexibel, för att minska användningen av djur, och för att uppfylla regulatoriska behov. Den reviderade testmetoden presenterar två studietyper: Ett traditionellt LC50-protokoll och ett koncentration × tid-protokoll (k × t). Den här testmetodens visar primärt förhållandet mellan koncentration-respons vars räckvidd sträcker sig från icke-dödlig till dödlig utgång så att man kan komma fram till en genomsnittlig dödlig koncentration (LC50), icke-dödlig tröskelkoncentration (t.ex. LC01), och kurva, och för att identifiera en möjlig könsberoende mottaglighet. K × t-protokollet ska användas om det finns ett specifikt rättsligt eller vetenskapligt behov som kräver testning av djur som sträcker sig över flera tidsperioder, såsom katastrofhanteringsplanering (värden för att t.ex. komma fram till riktnivåer för akut exponering (AEGL), riktlinjer för katastrofhanteringsplanering (ERPG) eller tröskelvärden för akut exponering (AETL)), eller markanvändningsplanering.

2.

I vägledningsdokumentet om akut inhalationstoxicitet (GD 39) (2) kan man få vägledning om den här beskrivna metodens genomförande och tolkning vid studier.

3.

Definitioner som används inom ramen för den här metoden finns i slutet av det här kapitlet och i GD 39 (2).

4.

Den här testmetoden möjliggör karakterisering och kvantitativ riskbedömning av testkemikalierna och gör det möjligt att rangordna och klassificera testkemikalierna i enlighet med förordning (EG) nr 1272/2008 (3). GD 39 (2) ger en vägledning om valet av en lämplig testmetod vid akuttestning. Om endast information om klassificering och märkning krävs, rekommenderas rent allmänt kapitel B.52 i denna bilaga (4) (se GD 39 (2)). Den här testmetoden B.2 är inte specifikt avsedd för testning av specialmaterial såsom svårlösliga isometriska eller fibrösa material, eller avsiktligt tillverkade nanomaterial.

5.

Innan man överväger ett test i enlighet med den här testmetoden bör testlaboratoriet överväga all information avseende testkemikalien, inklusive befintliga studier (t.ex. kapitel B.52 i denna bilaga (4)) vars data visar att man inte behöver göra fler tester för att därmed minska djuranvändningen. Information som kan underlätta val av lämplig art, stam, kön, exponeringssätt och lämplig testkoncentration är ämnets identitet och kemiska struktur, fysikalisk-kemiska egenskaper, resultat från andra eventuella in vitro- eller in vivo-tester avseende toxicitet; förväntad användning och risken för mänsklig exponering, tillgängliga (Q)SAR-data samt toxikologiska data om strukturellt närbesläktade ämnen (se GD 39 (2)).

6.

Testning av frätande och/eller irriterande kemikalier vid koncentrationer som förväntas orsaka svår smärta och/eller lidande bör undvikas så vitt det är möjligt. Eventuell frätning/irritation bör utvärderas genom en sakkunnig bedömning som grundas på erfarenheter från människa och djur (t.ex. genom upprepade doseringsstudier utförda med doser som inte är frätande/irriterande), befintliga in vitro-data (t.ex. från kapitel B.40, (5), B.40a (6) i denna bilaga eller OECD TG 435 (7)), pH-värden, information om liknande ämnen eller eventuellt andra relevanta data i syfte att undersöka om man kan undvika ytterligare testning. För specifika regulatoriska behov (t.ex. i beredskapsplaneringssyften), kan den här testmetoden användas för att exponera djur för dessa ämnen, eftersom det ger försöksledaren eller den ansvarige prövaren kontroll över valet av målkoncentrationer. I vilket fall som helst ska målkoncentrationer inte medföra allvarlig irritation/frätning, men ändå vara tillräckliga för att utvidga koncentrations-responskurvan till nivåer som gör att testets regulatoriska och vetenskapliga mål kan uppfyllas. Dessa koncentrationer ska väljas från fall till fall och det ska finnas en motivering för valet av koncentration (se GD 39 (2)).

7.

Den här reviderade testmetoden B.2 har utformats för att man ska erhålla tillräcklig information om en testkemikalies akuta toxicitet för att klassificera den och tillhandahålla dödlighetsdata (t.ex. LC50, LC01 och lutning) för ett eller båda könen efter behov för kvantitativ riskbedömning. Den här testmetoden erbjuder två metoder. Den första metoden är ett traditionellt protokoll i vilka grupper av djur exponeras för en begränsad koncentration (toleranstest) eller en serie koncentrationer i ett stegvist förfarande under en förutbestämd period på normalt 4 timmar. Andra exponeringstider kan gälla för specifika regulatoriska ändamål. Den andra metoden är ett (k × t) protokoll i vilka grupper av djur exponeras för en (gränskoncentration) eller en serie av koncentrationer som sträcker sig över flera perioder.

8.

Döende djur eller djur som visar tecken på uppenbar smärta eller svårt och ihållande lidande ska avlivas skonsamt och medtas i tolkningen av testresultaten på samma sätt som de som avled under testet. Kriterier för att ta beslutet att avliva döende eller svårt lidande djur, och vägledning om hur man känner igen tecknen på förutsägbar eller annalkande död, omfattas i OECD:s vägledningsdokument nr 19 om humana endpoints (8).

9.

I testet används friska unga vuxna djur av stammar som vanligtvis används på laboratorier. För detta test används råtta och det ska motiveras om annan art används.

10.

Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. På exponeringsdagen bör djuren vara unga vuxna 8 till 12 veckor gamla och kroppsvikten bör ligga inom ± 20 % av medelvikten för vardera könet av eventuella tidigare exponerade djur i samma ålder. Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan identifieras individuellt. Därefter får djuren acklimatisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst fem dagar före teststarten. Djuren bör också acklimatisera sig till testutrustningen en kort period före testet, eftersom detta minskar den stress som en ny miljö innebär.

11.

Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa fuktigheten bör ligga mellan 30 och 70 %, även om detta kanske inte är möjligt när vatten används som vehikel. Före och efter exponeringen bör djuren inhysas i grupper avhängigt kön och koncentration, dock får antalet djur per bur inte hindra en tydlig observation av varje enskilt djur, och förluster genom kannibalism och slagsmål bör minimeras. Om endast djurens nosar ska exponeras kan det vara nödvändigt att de får acklimatisera sig till fasthållningsrören. Fasthållningsrören ska inte medföra onödig fysisk, termisk eller fasthållningsstress för djuren. Fasthållning kan påverka fysiologiska endpoints såsom kroppstemperatur (hypotermi) och/eller minimala respiratoriska volymer. Om det finns generiska data tillgängliga som inte pekar på sådana förändringar i någon nämnvärd omfattning är det inte nödvändigt med anpassningen till rören före exponeringen. Djur vars hela kroppar ska exponeras för en aerosol ska inhysas individuellt under exponeringen för att förhindra att de andra djuren i buren filtrerar aerosolen genom sina pälsar. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, utom under exponeringen, tillsammans med en obegränsad tillgång till vatten. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker.

12.

Vid val av inhalationskammare bör man beakta kemikaliens beskaffenhet och testets ändamål. Det föredragna exponeringssättet är enbart nos (termen inkluderar även enbart huvud, enbart nos eller enbart tryne). Exponering av enbart nos föredras i allmänhet vid studier av vätskor och fasta aerosoler och ånga som kan kondenseras och bilda aerosoler. Vissa av undersökningens mål kan bättre uppnås genom exponering av hela kroppen, men detta ska motiveras i undersökningsrapporten. För att säkerställa atmosfärisk stabilitet vid användningen av en helkroppskammare ska den totala volymen av försöksdjuren inte överskrida 5 % av kammarens volym. Teknikerna för enbart nos och helkroppsexponeringen, deras principer och särskilda för- och nackdelar finns beskrivna i GD 39 (2).

13.

Enbart nos-exponering kan för råttor vara av vilken längd som helst upp till 6 timmar. Om möss exponeras enbart nos överskrider exponeringen i allmänhet inte 4 timmar. Motivering bör ges om längre tidsperioder för studier behövs (se GD 39 (2)). Djur som exponeras för aerosoler i helkroppskammare ska inhysas individuellt för att hindra intagandet av testkemikalien vid skötsel av de andra djuren i buren. Inget foder ska ges under exponeringsperioden. Vatten kan tillhandahållas under en helkroppsexponering.

14.

Djur exponeras för testkemikalien som en gas, ånga, aerosol eller en blandning av dem. Det fysikaliska tillstånd som ska testas beror på testkemikaliens fysikalisk-kemiska egenskaper, vald koncentration och/eller dess mest sannolika fysikaliska form vid hanteringen och användningen. Hygroskopiska och kemiskt reaktiva testkemikalier ska testas i torr luft. Det är viktigt att se till att inga explosiva koncentrationer skapas.

15.

Partikeldimensionering bör utföras för alla aerosoler och ångor som kan kondenseras och bilda aerosoler. För att möjliggöra exponering av alla relevanta områden i luftvägarna, rekommenderas aerosoler med en aerodynamisk diameter (MMAD) i intervallet 1 till 4 μm med en geometrisk standardavvikelse (σg) i intervallet 1,5 till 3,0 (2) (9) (10). Även om en rimlig ansträngning krävs för att uppfylla denna standard bör en sakkunnig bedömning göras om detta inte kan uppnås. Till exempel kan metalldimma understiga denna standard, och laddade partiklar, fibrer och hygroskopiska material (som ökar i storlek i den fuktiga miljön i andningsvägarna) kan överstiga denna standard.

16.

En vehikel kan användas för att generera en lämplig koncentration och partikelstorlek av testkemikalien i atmosfären. I regel bör vatten ha företräde. För att uppnå den erfordrade partikelstorleksfördelningen bör partikelmaterialet utsättas för mekaniska processer, emellertid bör man iaktta försiktighet så att inte testkemikalien sönderdelas eller förändras. I de fall där mekaniska processer tros ha förändrat testkemikaliens sammansättning (t.ex. extrema temperaturer från friktionen vid överdriven fräsning), bör testkemikaliens sammansättning verifieras analytiskt. Det är viktigt att testkemikalien inte förorenas. Det är inte nödvändigt att testa icke-spröda granulära material som avsiktligt är sammansatta så att de inte kan inhaleras. Ett friktionstest ska användas för att visa att inga inandningsbara partiklar bildas när det granulära materialet hanteras. Om ett friktionstest bildar inandningsbara ämnen ska ett test utföras avseende inhalationstoxicitet.

17.

Det är inte nödvändigt med en parallell negativ (luft-) kontrollgrupp. Om en annan vehikel än vatten används för att skapa testatmosfären ska en vehikelkontrollgrupp endast användas när historiska data om inhalationstoxicitet inte är tillgängliga. Om en toxicitetsstudie av en testkemikalie som har beretts i en vehikel inte påvisar någon toxicitet, framgår det att vehikeln är icke-toxisk vid den testade koncentrationen, och därmed finns det inget behov av en vehikelkontroll.

18.

Luftflödet genom kammaren ska omsorgsfullt kontrolleras, kontinuerligt övervakas och registreras minst en gång i timmen under varje exponering. Övervakningen av testatmosfärens koncentration (eller stabilitet) är en integrerad mätning av samtliga dynamiska parametrar och ett indirekt sätt att kontrollera alla relevanta atmosfärsskapande dynamiska parametrar. Särskild hänsyn bör tas för att undvika återandning i enbart nos-kammare i de fall där luftflödet genom exponeringssystemet är otillräckligt för att ge ett dynamiskt flöde i testkemikalieatmosfären. Det finns föreskrivna metoder som kan användas för att visa att återandning inte sker under de valda processförhållandena (2) (11). Syrehalten bör vara minst 19 % och koncentrationen av koldioxid bör inte överstiga 1 %. Om det finns anledning att tro att dessa standarder inte kan uppfyllas bör man mäta koncentrationen av syre och koldioxid.

19.

Kammarens temperatur bör upprätthållas vid 22 ± 3 °C. Relativ fuktighet i djurens andningsområden, gäller både enbart nos och helkroppsexponering, bör övervakas och registreras minst tre gånger under tidsperioder på upp till 4 timmar, och varje timme för kortare tidsperioder. Den relativa fuktigheten bör företrädesvis upprätthållas inom intervallet 30 till 70 %, men detta kanske inte är möjligt (t.ex. vid testning av vattenbaserade blandningar) eller inte mätbart på grund av att testkemikalien stör själva testmetoden.

20.

När det är möjligt bör den nominella koncentrationen i exponeringskammaren beräknas och registreras. Den nominella koncentrationen är massan av den genererade testkemikalien dividerad med den totala volymen av luft som passerade genom kammarsystemet. Den nominella koncentrationen används inte för att karakterisera djurens exponering, men en jämförelse mellan den nominella koncentrationen och den faktiska koncentrationen ger en indikation på testsystemets genereringsprestanda, och kan därmed användas för att upptäcka genereringsproblem.

21.

Den faktiska koncentrationen är testkemikaliens koncentration i djurets andningsområde i en inhalationskammare. Faktiska koncentrationer kan erhållas genom särskilda metoder (t.ex. direkt provtagning, adsorptiva eller kemiskt reaktiva metoder, och efterföljande analytisk karakterisering) eller av icke-specifika metoder såsom gravimetrisk filteranalys. Användningen av gravimetrisk analys är endast acceptabel för pulveraerosoler bestående av en enda komponent eller aerosoler bestående av vätskor med låg flyktighet, och bör stödjas av en lämplig preklinisk studie med kemikaliespecifik karakterisering. Koncentrationen i pulveraerosoler bestående av flera komponenter kan också bestämmas genom gravimetrisk analys. Detta kräver dock analysresultat som visar att sammansättningen av luftburet material liknar startmaterialet. Om denna information inte finns tillgänglig kan det vara nödvändigt med en ny analys av testkemikalien (helst i sitt luftburna tillstånd) under loppet av studien. För medel i aerosolform som kan förångas eller sublimeras bör man kunna visa att samtliga faser uppsamlades med den valda metoden.

22.

Målkoncentrationerna och de nominella och faktiska koncentrationerna ska finnas med i undersökningsrapporten, men endast de faktiska koncentrationerna används i de statistiska analyserna för att beräkna värdena för dödlig koncentration. En sats av testkemikalien ska användas, om möjligt, och provet ska lagras under sådana förhållanden att det bibehåller sin renhet, homogenitet och stabilitet. Inför starten av studien bör det finnas en beskrivning av testkemikalien som inbegriper dess renhet och, om det är tekniskt genomförbart, identitet, och kvantiteterna av identifierade föroreningar och orenheter. Detta kan visas genom, men är inte begränsat till, följande data: Retentionstid och relativ topparea, molekylvikt från masspektroskopi eller gaskromatografianalys, eller andra uppskattningar. Även om testlaboratoriet inte ansvarar för provets identitet kan det vara klokt att man i stora drag bekräftar karakteriseringen (t.ex. färg, fysisk natur etc.).

23.

Exponeringsatmosfären ska hållas så konstant som möjligt och övervakas kontinuerligt och/eller intermittent beroende på analysmetoden. När intermittent provtagning används bör prover på kammaratmosfären tas minst två gånger under en fyratimmarsstudie. Om det inte är möjligt på grund av begränsade luftflöden eller låga koncentrationer, kan ett prov tas under hela exponeringsperioden. Om märkta prov-till-prov-fluktationer förekommer, bör man för de påföljande koncentrationerna som ska testas ta fyra prover per exponering. Provtagning av koncentrationer från individuella kammare bör inte avvika från den genomsnittliga koncentrationen med mer än ± 10 % för gaser och ångor eller ± 20 % för flytande eller fasta aerosoler. Tiden tills kammaren når jämvikt (t95) bör beräknas och registreras. Varaktigheten för en exponering spänner sig över den tid som testkemikalien genereras och tar hänsyn till den tid som krävs för att uppnå t95. Riktlinjer för att uppskatta t95 finns i GD 39 (2).

24.

För mycket komplexa blandningar bestående av gaser/ångor och aerosoler (t.ex. förbränningsatmosfärer och testkemikalier framdrivna från därför avsedd slutanvändningsprodukt/-utrustning). Varje fas kan bete sig annorlunda i en inhalationskammare så minst en indikatorsubstans ska väljas (analyt), vanligtvis den huvudsakliga aktiva substansen i blandningen för varje fas (gas/ånga och aerosol). När testkemikalien är en blandning ska den analytiska koncentrationen i blandningen rapporteras, inte bara den aktiva substansen eller komponenten (analyten). Ytterligare information om faktisk koncentration finns i GD 39 (2).

25.

Aerosolers partikelstorleksfördelning bör fastställas minst två gånger under varje 4-timmarsexponering med hjälp av en kaskadimpaktor eller ett alternativt instrument såsom en aerodynamisk partikelsorterare. Om man kan visa ett likvärdigt resultat från en kaskadimpaktor eller det alternativa instrumentet, kan man använda det sistnämnda under hela försöket. En andra enhet, till exempel ett gravimetriskt filter eller en impinger/gasbubblare, bör användas parallellt med det primära instrumentet för att bekräfta uppsamlingsprestandan hos det primära instrumentet. Masskoncentrationen som erhållits genom analys av partikelstorleken ska ligga inom rimliga gränser för den masskoncentration som erhållits genom filteranalys (se GD 39 (2)). Om likvärdigheten kan påvisas i ett tidigt skede av försöket kan ytterligare bekräftande mätningar utelämnas. Av djurskyddsskäl bör åtgärder vidtas för att minimera ofullständiga uppgifter som kan leda till en upprepning av exponeringen. Partikeldimensionering bör utföras för ångorna, om det finns en möjlighet att kondensen kan bilda en aerosol, eller om partiklar upptäcks i ångatmosfären som kan göra så att faserna blandas (se punkt 15).

26.

Två studietyper beskrivs nedan: det traditionella protokollet och k × t-protokollet. Båda protokollen kan inkludera en inledande studie, en huvudstudie och/eller ett toleranstest (traditionellt protokoll), eller testning av en gränskoncentration (k × t). Om det ena könet är känt för att vara mer mottagligt kan försöksledaren välja att utföra studierna med enbart det mottagliga könet. Om andra gnagare än råttor utsätts för enbart nos, kan de maximala exponeringstiderna justeras för att minska artspecifikt lidande. Innan försöket påbörjas ska alla tillgängliga data beaktas för att minimera djuranvändningen. Till exempel kan data som genereras genom användning av kapitel B.52 i denna bilaga (4) eliminera behovet av en inledande studie, och kan också visa om ett kön är mer mottagligt (se GD 39 (2)).

27.

I en traditionell studie exponeras grupper av djur för testkemikalier under en fast tidsperiod (vanligtvis 4 timmar) i antingen en exponeringskammare för enbart nos eller en helkroppskammare. Djuren exponeras antingen för en begränsad koncentration (toleranstest) eller för minst tre koncentrationer i ett stegvist förfarande (huvudstudie). En inledande studie kan föregå en huvudstudie om det inte redan finns någon information om testkemikalien, såsom en tidigare utförd B.52-studie (se GD 39 (2)).

28.

En inledande studie används för att uppskatta testkemikaliens potens, identifiera könsskillnader beträffande mottaglighet, och för att välja nivå på exponeringskoncentrationen för huvudstudien eller toleranstestet. När man väljer nivå på koncentrationen för den inledande studien ska alla tillgängliga data användas, inklusive tillgängliga (Q)SAR-data och data för liknande kemikalier. Inte fler än tre hanar och tre honor ska exponeras för varje koncentration (3 djur per kön kan behövas för att fastställa en könsskillnad). En inledande studie kan bestå av en engångskoncentration, men fler koncentrationer kan testas vid behov. En inledande studie ska inte testa så många djur och koncentrationer att det liknar en huvudstudie. En tidigare utförd B.52-studie (4) kan användas i stället för en inledande studie (se GD 39 (2)).

29.

Ett toleranstest används när testkemikalien är känd eller förväntas vara praktiskt taget icke-toxisk, dvs. framkalla en toxisk reaktion endast över den regulatoriska gränskoncentrationen. I ett toleranstest exponeras en enda grupp bestående av tre hanar och tre honor för testkemikalien vid en koncentrationsgräns. Information om testkemikaliens toxicitet kan erhållas genom kunskap om liknande testade kemikalier, med beaktande av identitet och procentandel av komponenter kända för en signifikant toxicitet. I situationer när det finns lite eller ingen information om dess toxicitet, eller testkemikalien förväntas vara toxisk, ska huvudtestet utföras.

30.

Valet av koncentrationsgräns är vanligtvis beroende av regulatoriska krav. När förordning (EG) nr 1272/2008 används, är respektive koncentrationsgräns för gaser, ångor och aerosoler 20 000 ppm, 20 mg/l och 5 mg/l (eller den maximalt uppnåeliga koncentrationen) (3). Det kan vara tekniskt utmanande att generera koncentrationsgränser för vissa kemikalier, särskilt ångor och aerosoler. När man testar aerosoler bör det primära målet vara att uppnå en andningsbar partikelstorlek (MMAD av 1–4 μm). Det är möjligt för de flesta kemikalier med en koncentration på 2 mg/l. Testning av aerosoler med högre än 2 mg/l ska endast göras om en andningsbar partikelstorlek kan uppnås (se GD 39 (2)). Förordning (EG) nr 1272/2008 avråder från testning över koncentrationsgränsen av djurskyddsskäl (3). Koncentrationsgränsen ska endast övervägas om ett sådant test har en direkt relevans för skyddet av människors hälsa (3), och motivering angiven i undersökningsrapporten. När det gäller potentiellt explosiva testkemikalier bör man vara noga med att undvika förhållanden som är gynnsamma för en explosion. För att undvika onödig användning av djur ska ett test genomföras utan djur före toleranstestet, för att se till att förhållandena i kammaren kan uppnås för ett toleranstest.

31.

Om mortalitet eller döende observeras vid koncentrationsgränsen kan resultaten från toleranstestet tjäna som ett inledande test för ytterligare tester vid andra koncentrationer (se huvudstudie). Om en testkemikalies fysikaliska eller kemiska egenskaper gör det omöjligt att nå koncentrationsgränsen ska den maximalt uppnåeliga koncentrationen testas. Om dödligheten är lägre än 50 % vid den maximalt uppnåeliga koncentrationen behöver inga fler tester utföras. Om koncentrationsgränsen inte kunde uppnås ska undersökningsrapporten ge en förklaring och understödjande data. Om den maximalt nåbara koncentrationen för en ånga inte framkallar toxicitet kan det bli nödvändigt att generera testkemikalien som en flytande aerosol.

32.

En huvudstudie utförs normalt med fem hanar och fem honor (eller 5 djur av det mottagliga könet, om detta är känt) per koncentrationsnivå, med minst tre koncentrationsnivåer. För att uppnå en gedigen statistisk analys ska tillräckliga koncentrationsnivåer användas. Tidsintervallet mellan exponeringsgrupperna fastställs genom start, varaktighet och allvarlighetsgrad för tecknen på toxicitet. Exponering av djur vid nästa koncentrationsnivå ska fördröjas tills det finns rimlig anledning att anta att tidigare testade djur överlever. Detta gör att försöksledaren kan justera målkoncentrationen för nästa exponeringsgrupp. På grund av att man behöver sofistikerad teknik är detta inte alltid praktiskt genomförbart i inhalationsstudier, därför bör djurens exponering baseras på tidigare erfarenheter och vetenskapliga bedömningar. Man bör konsultera GD 39 (2) vid testning av blandningar.

33.

En stegvis k × t-studie kan övervägas som ett alternativ till ett traditionellt protokoll vid bedömning av inhalationstoxicitet (12) (13) (14). Detta tillvägagångssätt låter djuren exponeras för en testkemikalie på flera koncentrationsnivåer och med olika varaktigheter. Samtliga tester utförs i en enbart nos-kammare (helkroppskammare är inte praktiska för detta protokoll). Ett flödesdiagram i tillägg 1 belyser detta protokoll. En simuleringsanalys har visat att det traditionella protokollet och k × t-protokollet båda är kapabla att ge gedigna LC50-värden, men k × t-protokollet är generellt bättre på att ge gedigna LC01- och LC10-värden (15).

34.

En simuleringsanalys har visat att användningen av två djur per k × t-intervall (ett per kön vid användning av båda könen eller två av det mer mottagliga könet) i allmänhet kan vara tillräckligt när man testar 4 koncentrationer och 5 exponeringsvaraktigheter i en huvudstudie. Under vissa omständigheter kan försöksledaren välja att använda två råttor per kön per k × t-intervall (15). Att använda 2 djur per kön per koncentration och tidpunkt kan minska förutfattade meningar angående uppskattningarnas variation, öka framgångsgraden och förbättra konfidensintervallets täckning. I händelse av att resultatet inte ligger tillräckligt nära uppskattningsdatan (vid användning av ett djur per kön eller två av det mer mottagliga könet) kan dock även en 5:e koncentrationsexponering räcka. Ytterligare vägledning om antalet djur och koncentrationer som ska användas i en k × t-studie finns i GD 39 (2).

35.

En inledande studie används för att uppskatta testkemikaliens potens och underlätta valet av exponeringens koncentrationsnivåer för huvudstudien. En inledande studie som använder upp till tre djur per kön och koncentration (beträffande detaljer se tillägg III till GD 39 (2)) kan behöva välja en lämplig startkoncentration till huvudstudien för att minimera antalet djur som används. Det kan vara nödvändigt att använda tre djur per kön för att fastställa en könsskillnad. Dessa ska exponeras för en enstaka tidsperiod, vanligtvis 240 min. Möjligheten att generera adekvata testatmosfärer bör utvärderas vid tekniska förtester utan djur. Vanligtvis behöver man inte genomföra en inledande studie om det finns tillgängliga mortalitetsdata från en B.52-studie (4). När man väljer den inledande målkoncentrationen i en B.2-studie bör försöksledaren beakta mortalitetsmönstret som observerats i eventuella tillgängliga B.52-studier (4) för båda könen och för alla testade koncentrationer (se GD 39 (2)).

36.

Den inledande koncentrationen (exponeringssession 1) (tillägg 1) är antingen en gränskoncentration eller en koncentration vald av försöksledaren baserad på den inledande studien. Grupper om 1 djur per kön exponeras för den här koncentrationen under flera tidsperioder (t.ex. 15, 30, 60, 120 eller 240 minuter) vilket resulterar i ett totalt antal av 10 djur (vilket kallas exponeringssession I) (tillägg 1).

37.

Valet av koncentrationsgräns är vanligtvis beroende av regulatoriska krav. När förordning (EG) nr 1272/2008 används, är respektive koncentrationsgräns för gaser, ångor och aerosoler 20 000 ppm, 20 mg/l och 5 mg/l (eller den maximalt uppnåeliga koncentrationen) (3). Det kan vara tekniskt utmanande att generera koncentrationsgränser för vissa kemikalier, särskilt ångor och aerosoler. Vid testning av aerosoler bör målet vara att uppnå en inandningsbar partikelstorlek (dvs. en MMAD på 1–4 μm) vid en koncentrationsgräns på 2 mg/l. Detta är möjligt för de flesta testkemikalier. Testning av aerosoler med mer än 2 mg/l bör endast utföras om en andningsbar partikelstorlek kan uppnås (se GD 39 (2)). Förordning (EG) nr 1272/2008 avråder från testning över koncentrationsgränsen av djurskyddsskäl (3). Testning över koncentrationsgränsen ska endast övervägas när ett sådant test har en direkt relevans för skyddet av människors hälsa (3), motiveringen ska anges i undersökningsrapporten. När det gäller potentiellt explosiva testkemikalier bör man vara noga med att undvika förhållanden som är gynnsamma för en explosion. För att undvika onödig djuranvändning ska ett test genomföras utan djur före testningen med den inledande koncentrationen för att säkerställa att förhållandena i kammaren kan uppnås för denna koncentration.

38.

Om mortalitet eller döende observeras vid den inledande koncentrationen kan resultaten från denna koncentration tjäna som en inledande studie för ytterligare tester vid andra koncentrationer (se huvudstudie). När en testkemikalies fysikaliska eller kemiska egenskaper gör det omöjligt att nå koncentrationsgränsen ska den maximalt uppnåeliga koncentrationen testas. Om dödligheten är lägre än 50 % vid den maximalt uppnåeliga koncentrationen behöver inga fler tester utföras. Om koncentrationsgränsen inte kunde uppnås ska undersökningsrapporten ge en förklaring och understödjande data. Om den maximalt nåbara koncentrationen för en ånga inte framkallar toxicitet kan det bli nödvändigt att generera testkemikalien som en flytande aerosol.

39.

Den inledande koncentrationen (exponeringssession 1) (tillägg 1) som testas i huvudstudien är antingen en gränskoncentration eller en koncentration vald av försöksledaren baserad på den inledande studien. Om mortalitet har observerats under eller efter exponeringssession 1 kommer den minsta exponering (k × t) som leder till mortalitet att användas som riktlinje för fastställande av koncentration och exponeringsperiod för exponeringssession II. Varje efterföljande exponeringssession bygger på den föregående (se tillägg 1).

40.

För många testkemikalier är det resultat som erhålls vid den initiala koncentrationen, tillsammans med ytterligare tre exponeringssessioner med ett mindre tidsrutsystem (dvs. det geometriska mellanrummet för exponeringsperioder som anges av faktorn mellan på varandra följande perioder, i allmänhet √2), tillräckligt för att fastslå k × t-dödlighetsförhållandet (15), men det kan finnas vissa fördelar med att använda en 5:e exponeringskoncentration (se tillägg 1 och GD 39 (2)). För matematisk behandling av resultaten från k × t-protokollet, se tillägg 1.

41.

Djuren bör ofta observeras kliniskt under exponeringsperioden. Efter exponeringen ska kliniska observationer göras minst två gånger på dagen för exponeringen, eller oftare om djurens respons på behandlingen indikerar det, och därefter minst en gång per dag under en period av 14 dagar. Observationstidens längd är inte fast, utan bör bestämmas utifrån art och tidpunkt för de första kliniska tecknen samt längden på återhämtningsperioden. De tillfällen då tecken på toxicitet uppträder och försvinner är viktig, särskilt om tecknen på toxicitet visar en tendens att fördröjas. Alla observationer registreras systematiskt med individuella registreringar för varje djur. Djur som påträffas döende och djur som visar tecken på uppenbar smärta och/eller svårt ihållande lidande ska avlivas skonsamt av djurskyddsskäl. Försiktighet bör iakttas vid utförande av undersökningar för kliniska tecken på toxicitet, så att djur som ser dåliga ut och har övergående respiratoriska förändringar till följd av exponeringsförfarandet, inte misstas för testkemikalierelaterad toxicitet som kräver förtida avlivande av djuren. Principerna och kriterierna som finns sammanfattade i vägledningsdokumentet om humana endpoints (GD 19) bör tas i beaktande (7). När djur avlivas av humanitära skäl eller påträffas döda, ska tidpunkten för dödsfallet registreras så noggrant som möjligt.

42.

Observationer vid buren bör omfatta förändringar i bur och päls, ögon och slemhinnor, samt även andningsorganen, cirkulationsorganen och det autonoma och centrala nervsystemet, samt kroppsmotorik och beteendemönster. Om möjligt bör eventuella skillnader mellan lokala och systematiska effekter noteras. Uppmärksamhet bör fästas vid observationer av tremor, konvulsioner, salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Mätningen av rektal temperatur kan ge belägg för bradypnéreflex eller hypo/hypertermi relaterat till behandling eller inspärrning.

43.

Vikten på individuella djur bör registreras en gång under acklimatiseringsperioden på exponeringsdagen före exponeringen (dag 0), och åtminstone dag 1, 3 och 7 (och därefter varje vecka), och vid tidpunkten då döden eller avlivningen inträffar om dag 1 överskrids. Kroppsvikt är en erkänt viktig indikator på toxicitet, så djur som uppvisar en fortsatt minskning på ≥ 20 % jämfört med värdena i förstudien bör noggrant övervakas. Djur som överlever vägs och avlivas skonsamt i slutet av perioden efter exponeringsperioden.

44.

Alla försöksdjur, inklusive de som avlider under testet eller avlivas och tas bort från undersökningen av djurskyddsskäl bör obduceras. Om en obduktion inte kan utföras omedelbart efter att ett dött djur har upptäckts, bör djuret kylas (inte frysas) vid en temperatur som är tillräckligt låg för att minimera autolys. Obduktioner ska utföras så snart som möjligt, vanligtvis inom en dag eller två. Alla betydande patologiska förändringar bör registreras för varje djur med särskild uppmärksamhet på eventuella förändringar i luftvägarna.

45.

Ytterligare undersökningar inklusive a priori genom beräkning kan anses utöka studiens tolkningsvärde, såsom mätning av lungvikt hos överlevande råttor, och/eller ge prov på irritation genom den mikroskopiska undersökningen av luftvägarna. Undersökta organ kan också innefatta sådana som uppvisar betydande skador och som härrör från djur som överlevt 24 timmar eller mer, och organ kända för, eller som förväntas, att påverkas. Mikroskopisk undersökning av hela luftvägarna kan ge användbar information om testkemikalier som är reaktiva med vatten, såsom syror och hygroskopiska testkemikalier.

46.

Individuella data om kroppsvikt och obduktionsfynd bör tillhandahållas. Kliniska observationsdata bör sammanfattas i tabellform, som för varje testgrupp visar antalet djur som använts, antalet djur som visar tecken på toxicitet, antalet djur som avlidit under testet eller som avlivats av humanitära skäl, tidpunkten då det enskilda djuret har avlidit, beskrivning och tidsförlopp för toxiska verkningar och reversibilitet, samt obduktionsfynd.

47.

Testrapporten ska omfatta följande information, när så är lämpligt:

(1)

OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(2)

OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(3)

Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 31.12.2008, s. 1).

(4)

Kapitel B.52 i denna bilaga, akut inhalationstoxicitet – akut toxicitetsklass.

(5)

Kapitel B.40 i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: bestämning av transkutant elektriskt motstånd (TER).

(6)

Kapitel B.40a i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: test med modell av human hud.

(7)

OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(9)

SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.

(10)

Phalen RF (2009). Inhalation studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.

(11)

Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167.

(12)

Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290.

(13)

Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117.

(14)

Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71.

(15)

OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/testguidelines.

(16)

Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.

1.

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 407 (2008). Den ursprungliga testriktlinjen 407 antogs 19.81.1995 antogs en reviderad version för att erhålla ytterligare information från djuret som används i studien, i synnerhet om neurotoxicitet och immunotoxicitet.

2.

1998 inledde OECD en högprioriterad verksamhet för att se över befintliga testriktlinjer och utveckla nya riktlinjer för undersökning och testning av potentiellt endokrinstörande ämnen (8). Ett inslag i verksamheten var att uppdatera befintlig OECD-riktlinje för ”28-dagars toxicitetsstudie med upprepad oral dosering på gnagare” (TG407) med parametrar lämpliga för att upptäcka endokrin aktivitet för testkemikalier. Denna procedur genomgick ett omfattande internationellt program för att testa relevansen och tillämpbarheten av de kompletterande parametrarna, utförandet av dessa parametrar för kemikalier med (anti) östrogen-, (anti) androgen- och (anti) köldkörtelaktivitet och reproducerbarhet inom och mellan laboratorier samt de nya parametrarnas interferens med de som krävdes i den tidigare TG 407. Den stora mängden data som därvid erhölls har sammanställts och utvärderats i detalj i en omfattande OECD-rapport (9). Den här uppdaterade testmetoden B.7 (som är likvärdig med TG 407) är resultatet av de erfarenheter och resultat som uppnåddes under det internationella testprogrammet. Med den här testmetoden kan vissa endokrina indirekta verkningar sättas i samband med andra toxikologiska verkningar.

3.

Vid bedömningen och utvärderingen av de toxiska egenskaperna hos en kemikalie kan bestämningen av toxicitet med upprepad oral dosering genomföras efter att inledande information om toxicitet har erhållits genom testning av akut toxicitet. Avsikten med den här testmetoden är att undersöka effekterna på ett mycket brett spektrum av potentiella måltavlor för toxicitet. Den ger information om eventuella hälsorisker som kan uppstå vid upprepad exponering under en relativt begränsad tidsperiod, inklusive effekterna på nervsystemet, immunsystemet och det endokrina systemet. Vad beträffar dessa speciella endpoints, bör den identifiera kemikalier med neurotoxisk verkan, vilket kan motivera mer ingående undersökningar av denna aspekt, samt kemikalier som påverkar sköldkörtelns fysiologi. Den kan också tillhandahålla data om kemikalier som påverkar de manliga och/eller kvinnliga könsorganen hos unga vuxna djur samt ge indikationer på immunologiska effekter.

4.

Resultaten från denna testmetod B.7 bör användas för faroidentifiering och riskbedömning. Resultaten som erhölls genom de endokrinrelaterade parametrarna bör sättas i samband med ”OECD:s ramverk för testning och bedömning av endokrinstörande kemikalier” (11). Metoden innefattar den grundläggande toxicitetsstudien med upprepad dosering som kan användas för kemikalier för vilka en 90-dagarsstudie inte är motiverad (t.ex. när produktionsvolymen inte överskrider vissa gränser) eller som en inledning till en långtidsstudie. Varaktigheten för exponeringen bör vara 28 dagar.

5.

Det internationella programmet som genomfördes om validering av parametrar lämpliga för upptäckt av en testkemikalies eventuella endokrina aktivitet visade att kvaliteten på datan som erhölls genom denna testmetod B.7 beror mycket på testlaboratoriets erfarenheter. Detta hänför sig särskilt till histopatologisk bestämning av cykliska förändringar i de kvinnliga fortplantningsorganen och viktbestämning av de små hormonberoende organen som är svåra att dissekera. Vägledning för histopatologi har utvecklats (19). Den finns på OECD:s offentliga webbplats om riktlinjer för testning. Den är avsedd för att hjälpa patologer i deras undersökningar och bidra till att öka analysens känslighet. En mängd olika parametrar befanns vara indikativa för endokrinrelaterad toxicitet och har införlivats i testmetoden. Parametrar för vilka det fanns tillräckliga data tillgängliga för att visa nyttan eller vilka visade svaga bevis i valideringsprogrammet för deras förmåga att detektera endokrinstörande ämnen föreslås som valfria endpoints (se tillägg 2).

6.

På grundval av datan som genereras i valideringsprocessen, måste det framhållas att känsligheten hos denna analys inte är tillräcklig för att identifiera alla ämnen med (anti) androgena eller (anti) östrogena verkningssätt (9). Testmetoden genomförs inte i ett livsskede som är mest känslig för endokrina störningar. Dock har testmetoden under valideringsprocessen identifierat ämnen som svagt eller starkt påverkar sköldkörtelns funktion, och starka eller måttliga endokrina aktiva ämnen som verkar genom östrogena eller androgena receptorer, men som i de flesta fall misslyckades med att identifiera endokrina aktiva ämnen som svagt påverkar östrogena eller androgena receptorer. Därför kan den inte beskrivas som en screeninganalys av endokrin aktivitet.

7.

Följaktligen kan avsaknaden av verkningar relaterade till dessa verkningsmekanismer inte tas som bevis på bristen av verkningar på det endokrina systemet. Beträffande indirekta endokrina verkningar bör därför inte ämnets karakterisering baseras enbart på resultaten från denna testmetod, men bör användas i en sammanvägd bedömning som omfattar alla befintliga data om en kemikalie för att karakterisera eventuell endokrin aktivitet. Av denna anledning bör regulatoriskt beslutsfattande om endokrin aktivitet (ämneskarakterisering) vara en bred strategi, inte enbart beroende av resultaten från tillämpningen av denna testmetod.

8.

Det är erkänt att alla djurbaserade förfaranden kommer att överensstämma med lokala normer för djurvård; beskrivningarna av vård och behandling som anges nedan är miniminormer för prestanda som kommer att ersättas av strängare lokala bestämmelser. Ytterligare vägledning om human behandling av djur finns i OECD (14).

9.

Definitioner som används finns i tillägg 1.

10.

Testkemikalien tillförs oralt dagligen i graderade doser till flera grupper av försöksdjur, en dosnivå per grupp för en period på 28 dagar. Under administreringsperioden observeras djuren varje dag noggrant för tecken på toxicitet. Djur som dör eller avlivas under testet obduceras, och i slutet av testet avlivas överlevande djur och obduceras. En 28-dagarsstudie ger information om effekterna av upprepad oral exponering och kan indikera behovet av ytterligare långtidsstudier. Den kan också ge information om valet av koncentrationer för långtidsstudier. Datan som härrör från användningen av testmetoden ska göra det möjligt att karakterisera teskemikaliens toxicitet som en indikation på förhållandet dos-respons och bestämningen av nivån där ingen skadlig effekt observeras (NOAEL).

11.

Rekommenderad gnagare är råtta, även om andra gnagare kan användas. En utförlig motivering ska ges om de parametrar som anges i denna testmetod B.7 undersöks i andra gnagare. Även om det är biologiskt sannolikt att andra arter bör svara på gifter på liknande sätt som råttan, kan användningen av mindre arter resultera i ökad variabilitet på grund av tekniska utmaningar att dissekera mindre organ. I det internationella valideringsprogrammet för att detektera endokrinstörande ämnen, var råttan den enda art som användes. I testet bör unga friska vuxna djur användas av stammar som vanligtvis används på laboratorier. Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. Doseringen bör inledas snarast möjligt efter avvänjningen, och under alla förhållanden innan djuren är nio veckor gamla. Vid inledningen av studien bör viktskillnaden hos de använda djuren vara minimal och inte överstiga ± 20 % av medelvikten för varje kön. När en upprepad oral dos utförs som inledning till en långtidsstudie, är det att föredra att djur från samma stam och ursprung används för båda studierna.

12.

Alla förfaranden bör överensstämma med lokala normer för laboratoriedjurvård. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs, bör målet vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med ljusperioden 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas med ett obegränsat utbud av dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna metod. Djuren bör vara inrymda i små grupper av samma kön. Djuren kan inhysas individuellt om det är vetenskapligt motiverat. Vid grupplacering i bur bör inte fler än fem djur inhysas per bur.

13.

Fodret bör regelbundet analyseras beträffande föroreningar. Ett prov av fodret bör sparas tills rapporten är slutförd.

14.

Friska unga vuxna djur väljs slumpvis ut till kontroll- och behandlingsgrupperna. Burarna bör placeras så att en möjlig påverkan beroende på deras placering minimeras. Därefter identifieras djuren individuellt och får acklimatisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst fem dagar före behandlingsstudien.

15.

Testkemikalien tillförs genom sondmatning eller via fodret eller dricksvattnet. Metoden för oral tillförsel är beroende av syftet med studien och de fysikaliska/kemiska/toxikologisk-kinetiska egenskaperna hos testkemikalien.

16.

Vid behov kan testkemikalien upplösas eller suspenderas i en lämplig vehikel. Det rekommenderas, när så är möjligt, att man först använder en vattenbaserad lösning/suspension följt av en lösning/suspension i olja (t.ex. majsolja) och därefter eventuell lösning i andra vehiklar. För vehiklar annat än vatten måste de toxiska egenskaperna hos vehikeln vara kända. Testkemikaliens stabilitet i vehikeln bör bestämmas.

17.

Minst 10 djur (fem honor och fem hanar) bör användas för varje doseringsnivå. Om interimistisk avlivning planeras bör antalet djur ökas med det antal som man planerar att avliva innan studien slutförs. Man bör överväga en extra satellitgrupp på tio djur (fem per kön) i kontroll- och i toppdosgruppen för observation beträffande reversibilitet, persistens eller fördröjda toxiska verkningar under minst 14 dagar efter behandlingen.

18.

I allmänhet bör minst tre testgrupper och en kontrollgrupp användas, men ett toleranstest kan utföras om man efter utvärderingen av andra data inte förväntar sig några verkningar efter en dos på 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag. Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga kan en pilotstudie (djur av samma stam och ursprung) utföras för att underlätta bestämningen av de doser som ska användas. Med undantag av behandlingen med testkemikalien bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som testgruppen. Om en vehikel används för att tillföra testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym som används.

19.

Nivåerna på doserna bör väljas med hänsyn till eventuell toxicitetsdata och (toxikologisk-) kinetiska data som finns tillgängliga om testkemikalien eller liknande kemikalier. Den högsta nivån på dosen bör väljas i syfte att inducera toxiska verkningar, men inte leda till döden eller orsaka svåra lidanden. Därefter bör en fallande nivå på doserna väljas i syfte att påvisa en dosrelaterad respons och ingen påvisbar skadlig effekt vid den lägsta dosnivån (NOAEL). Två- till fyrfaldiga dosintervall är ofta optimala för de fallande dosnivåerna, och att lägga till en fjärde testgrupp är att föredra framför att använda mycket stora intervall (t.ex. mer än faktor 10) mellan doseringarna.

20.

Om allmän toxicitet observeras (t.ex. minskad kroppsvikt, verkningar på lever, hjärta eller njurar) eller andra förändringar som har observerats som kanske inte är toxiska reaktioner (t.ex. nedsatt födointag, leverförstoring), ska observerade effekter på immunförsvaret, neurologiska eller endokrint känsliga endpoints bör tolkas med försiktighet.

21.

Om ett test vid en dosnivå på minst 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag eller, vid tillförsel via foder eller dricksvatten, en motsvarande procentandel i fodret eller dricksvattnet (baserad på fastställd kroppsvikt) genom användning av de förfaranden som beskrivs för denna studie, inte ger några observerbara toxiska verkningar och om ingen toxicitet förväntas på grundval av data från strukturellt närbesläktade kemikalier är det inte nödvändigt att genomföra en fullständig studie med tre doseringsnivåer. Toleranstestet tillämpas, utom när mänsklig exponering anger att en högre dosnivå ska användas.

22.

Djuren doseras dagligen med testkemikalier, 7 dagar per vecka under en period av 28 dagar. När testkemikalien tillförs genom sondmatning bör detta ske i en engångsdos via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den största mängd vätska som kan administreras vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överskrida 1 ml per 100 g kroppsvikt utom i de fall när vattenlösningar används, då kan 2 ml per 100 g kroppsvikt användas. Med undantag för irriterande eller frätande kemikalier, som normalt kommer att visa stegrade verkningar vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen, för att säkerställa en konstant volym vid alla dosnivåer.

23.

För kemikalier som tillförs via foder eller dricksvatten är det viktigt att säkerställa att kvantiteterna av den berörda testkemikalien inte påverkar normal närings- eller vattenbalans. När testkemikalien tillförs via kosten kan antingen en konstant foderkoncentration (PPM) eller en konstant dosnivå i förhållande till djurens kroppsvikt användas; valet måste anges. När en kemikalie tillförs genom sondmatning bör dosen ges vid samma tidpunkt varje dag, och justeras vid behov för att upprätthålla en konstant dosnivå i förhållande till djurets kroppsvikt. Om en upprepad doseringsstudie används som inledning till en långtidsstudie ska ett liknande foder användas i båda studierna.

24.

Observationsperioden ska vara 28 dagar. Djuren i en satellitgrupp där uppföljande observationer planeras, ska hållas i minst 14 dagar utan behandling för att fördröjda eller kvarstående verkningar eller återhämtning från toxiska effekter ska kunna upptäckas.

25.

Allmänna kliniska observationer bör göras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt(er) med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen. Djurens hälsotillstånd bör registreras. Minst två gånger dagligen bör djuren observeras beträffande morbiditet och mortalitet.

26.

En gång före den första exponeringen (för att möjliggöra individuella jämförelser), och därefter minst en gång per vecka, ska ingående kliniska observationer göras av samtliga djur. Dessa observationer bör göras utanför buren på avsedd plats och helst vid samma tidpunkt varje gång. De bör noggrant registreras, helst med hjälp av ett poängsystem som utförligt definierats av testlaboratoriet. Ansträngningar bör göras för att säkerställa att testbetingelsernas variationer är minimala, och att observationerna utförs av någon som inte känner till behandlingen. Observationerna bör omfatta, men inte begränsas till, förändringar i hud, päls, ögon, slemhinnor, förekomst av sekret och utsöndringar samt autonom aktivitet (t.ex. tårflöde, upprest hårrem, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster). Förändringar i gång, hållning och reaktion på hantering liksom eventuella kramper eller spasmer, stereotypier (t.ex. överdrivet putsande, repetitivt cirklande) eller bisarrt beteende (t.ex. självstympning, baklängesgång) ska också registreras (2).

27.

Under fjärde exponeringsveckan bör bedömningar göras av sensoriska reaktioner på stimuli av olika slag (2) (t.ex. hörsel, syn och djupsensorisk stimuli) (3) (4) (5), bedömning av greppstyrka (6) och motorisk aktivitet (7). Ytterligare uppgifter om de procedurer som kan följas finns i respektive hänvisningar. Dock kan andra procedurer än de som hänvisats till användas.

28.

Funktionella observationer som görs under fjärde exponeringsveckan kan utelämnas om studien utförs som inledning till en subkronisk studie (90-dagars). I så fall bör de funktionella observationerna tas med i denna uppföljningsstudie. Å andra sidan kan tillgången på data om funktionella observationer från studien med upprepad dosering öka möjligheten att välja dosnivåer för en efterföljande subkronisk studie.

29.

I undantagsfall kan funktionella observationer utlämnas för grupper som annars skulle uppvisa tecken på toxicitet i sådan utsträckning att det väsentligen skulle påverka funktionstestets prestanda.

30.

Vid obduktion kan östruscykeln för alla honor bestämmas (valfritt) genom ett vaginalt utstryksprov. Dessa observationer ger information beträffande östruscykelns stadium vid tiden för avlivandet och hjälper till med den histologiska utvärderingen av östrogenkänsliga vävnader (se vägledning om histopatologi (19)).

31.

Alla djur bör vägas minst en gång i veckan. Mätning av foderkonsumtion bör göras minst en gång i veckan. Om testkemikalien tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas minst en gång i veckan.

32.

Följande hematologiska undersökningar bör göras i slutet av testperioden: hematokrit, hemoglobin koncentration, erytrocyträkning, retikulocyter, total och differential räkning av leukocyter, trombocyter och en mätning av blodets koaguleringstid/-potential. Andra bestämningar som bör utföras, om testkemikalien eller dess förmodade metaboliteter har eller misstänkas ha oxiderande egenskaper, inkluderar methemoglobinkoncentration och Heinz-kroppar.

33.

Blodprover bör tas från ett angivet ställe strax före eller som ett led i förfarandet för avlivning av djuren, och förvaras under lämpliga förhållanden. Djuren bör fasta över natten före avlivandet (7).

34.

Kliniska biokemiska bestämningar för att undersöka betydande toxiska effekter på vävnader, särskilt påverkan på lever och njurar, bör utföras på blodprov tagna på samtliga djur strax före, eller som ett led i, avlivningsproceduren (bortsett från de döende och/eller de som avlivats före studiens upphörande). Undersökningar av plasma eller serum ska omfatta natrium, kalium, glukos, totalkolesterol, urinämne, kreatinin, totalprotein och albumin, minst två enzymer som indikerar effekter på leverceller (såsom alaninaminotransferas, aspartataminotransferas, alkaliskt fosfatas, γ-glutamyltranspeptidas och glutamatdehydrogenas), samt gallsyror. Mätningar av ytterligare enzymer (från lever eller annat ursprung) och bilirubin kan under vissa omständigheter ge användbar information.

35.

Eventuellt kan också följande urinanalyser utföras under studiens sista vecka med klockad uppsamling av urinvolym: utseende, volym, osmolalitet eller specifik vikt, pH, protein, glukos och blod/blodceller.

36.

Dessutom bör man överväga studier för att undersöka plasma- eller serummarkörer för allmänna vävnadsskador. Andra bestämningar som bör utföras, om kända egenskaper hos testkemikalien kan, eller misstänks, påverka relaterade metaboliska profiler, inkluderar kalcium, fosfat, triglycerider, specifika hormoner och kolinesteras. Dessa bör identifieras för kemikalier i vissa klasser, eller från fall till fall.

37.

Även om man i den internationella utvärderingen av endokrinrelaterade endpoints inte kunde påvisa en klar fördel för bestämning av sköldkörtelhormoner (T3, T4) och TSH, kan det vara till hjälp att bevara plasma- eller serumprover för att mäta T3, T4 och TSH (valfritt), om det finns indikation på påverkan av hypofys-sköldkörtelaxeln. För att lagra proverna kan de frysas vid – 20 °. Följande faktorer kan påverka variationen och de absoluta koncentrationerna för hormonbestämningarna:

En slutgiltig identifiering av sköldkörtelaktiva kemikalier är mer tillförlitlig genom histopatologisk analys snarare än hormonnivåer.

38.

Plasmaprover särskilt avsedda för hormonbestämning bör tas vid en jämförbar tid på dagen. Det rekommenderas att man bör överväga om bestämningar av T3, T4 och TSH utlöstes på grund av förändringar av sköldkörtelns histopatologi. De numeriska värden som erhölls vid analys av hormonkoncentrationer skiljer sig åt mellan de olika analyssatser som finns i handeln. Därför är det kanske inte möjligt att tillhandahålla prestandakriterier baserade på enhetliga historiska data. Alternativt bör laboratorierna sträva efter att hålla variationskoefficienterna under 25 för T3 och T4, och under 35 för TSH. Alla koncentrationer ska anges i ng/ml.

39.

Om historiska basdata är otillräckliga bör hänsyn tas till hematologiska och kliniska biokemiska variabler innan doseringen påbörjas eller företrädesvis för en uppsättning djur som inte ingår i försöksgrupperna.

40.

Samtliga djur i studien bör underkastas en fullständig obduktion, som omfattar omsorgsfull granskning av kroppens yttre ytor, alla kroppsöppningar samt kranium, bröst- och bukhåla och deras innehåll. Lever, njurar, binjurar, testiklar, bitestiklar, prostata + sädesblåsor med koagulerade körtlar i sin helhet, bräss, mjälte, hjärna och hjärta från samtliga djur (med undantag av de döende och/eller de som har avlivats före studiens upphörande) ska putsas från angränsande vävnad vid behov, och deras våtvikt ska bestämmas så snart som möjligt efter dissektionen för att undvika uttorkning. Försiktighet måste iakttas vid putsning av prostatakomplexet för att undvika punktion av de vätskefyllda blåsorna. Alternativt kan sädesblåsor och prostata trimmas och vägas efter fixering.

41.

Dessutom skulle två andra vävnader eventuellt kunna vägas så snart som möjligt efter dissektionen, för att undvika uttorkning: parade äggstockar (våtvikt) och livmodern, inklusive livmoderhalsen (vägledning om borttagning och beredning av livmodervävnad för viktmätning finns i OECD:s TG 440 (18)).

42.

Sköldkörtelns vikt (valfritt) kan bestämmas efter fixering. Putsning ska också göras väldigt försiktigt, och först efter fixeringen för att undvika vävnadsskador. Vävnadsskador kan äventyra den histopatologiska analysen.

43.

Följande vävnader bör bevaras i det mest lämpade fixeringsmedlet för både vävnadstypen och den planerade efterföljande histopatologiska undersökningen (se punkt 47): Alla större skador, hjärna (representativa områden omfattande cerebrum, cerebellum och pons), ryggmärg, ögon, mage, tunn- och tjocktarm (inklusive Peyers plack), lever, njurar, binjurar, mjälte, hjärta, bräss, sköldkörtel, luftstrupe och lungor (konserverade genom uppumpning med fixermedel och därefter nedsänkning), könskörtlar (testiklar och äggstockar), accessoriska könsorgan (uterus och cervix, epididymes, prostata + sädesblåsor med koaguleringskörtlar), vagina, urinblåsa, lymfkörtlar (vid sidan av den mest proximala dräneringsnoden bör en annan lymfnod tas i enlighet med laboratoriets erfarenheter (15)), perifer nerv (ischias eller tibia) helst nära muskeln, skelettmuskel och ben med benmärg (sektion eller, alternativt, ett nymonterat benmärgsaspirat). Det rekommenderas att testiklarna fixeras genom nedsänkning i Bouins fixativ eller modifierat Davidsons fixativ (16) (17). Tunica albuginea måste försiktigt och ytligt punkteras med en nål på organets båda poler för en snabb inträngning av fixativet. Kliniska och andra fynd kan indikera behovet av att undersöka ytterligare vävnader. Också alla organ som sannolikt är målorgan, baserat på kunskap om testkemikaliens egenskaper, ska konserveras.

44.

Följande vävnader kan ge värdefulla tecken på endokrinrelaterade effekter: Könskörtlar (äggstockar och testiklar), accessoriska könsorgan (uterus inklusive cervix, epididymis, sädesblåsor med koaguleringskörtlar, dorsolaterala och ventrala prostata), vagina, hypofys, manliga bröstkörtlar, sköldkörtel och binjurar). Förändringar i manliga bröstkörtlar är inte tillräckligt väl dokumenterade, men denna parameter kan vara väldigt känslig för ämnen med östrogen verkan. Observation av organ/vävnader som inte nämns i avsnitt 43 är valfria (se tillägg 2).

45.

Vägledning om histopatologi (19) omfattar detaljerad information om dissektion, fixering, sektionering och histopatologi av endokrina vävnader.

46.

I det internationella testprogrammet erhölls vissa belägg för att subtila endokrina verkningar av kemikalier med en låg potens för att påverka könshormonhomeostas, kan identifieras genom störning av östruscykelns synkronisering i olika vävnader, och inte så mycket genom franka histopatologiska förändringar i kvinnliga könsorgan. Även om inga direkta bevis erhölls för sådana effekter, rekommenderas att bevis för eventuell asynkroni i östruscykeln ska tas med i beräkningen vid tolkningen av äggstockarnas histopatologi (follikulära, thecala och granulosa celler), uterus, cervix och vagina. Om utvärderat kan det skede av cykeln som bestämts genom vaginala utstryk också ingå i denna jämförelse.

47.

En fullständig histopatologisk undersökning bör utföras på bevarade organ och vävnader från samtliga djur i kontroll- och högdosgrupperna. Dessa undersökningar bör utsträckas till djur i alla andra doseringsgrupper, om behandlingsrelaterade förändringar observeras i högdosgruppen.

48.

Alla större skador ska undersökas.

49.

Om en satellitgrupp används bör en histopatologisk undersökning utföras på de vävnader och organ på vilka effekter har visats i de behandlade grupperna.

50.

Individuella data ska lämnas. Därutöver bör alla data sammanfattas i tabellform, som för varje testgrupp visar antal djur vid testets början, antal djur som påfanns döda under testet eller som avlivats av humanitära skäl och tidpunkten för dödsfallen eller eutanasin, antal djur som visar tecken på toxicitet, en beskrivning av de tecken på toxicitet som observerats, inklusive tidpunkt för de första tecknen, varaktighet och hur allvarliga de toxiska verkningarna är, antal djur som uppvisar skador, typ av skador, deras svårighetsgrad och procentandelen djur som uppvisar varje typ av skada.

51.

Om möjligt bör numeriska resultat utvärderas genom en lämplig och allmänt vedertagen statistisk metod. Vid jämförelser av effekten längs ett dosintervall bör man undvika användningen av multipla t-tester. Statistiska metoder ska väljas vid utformningen av studien.

52.

Som kvalitetskontroll föreslås att historiska kontrolldata samlas in för numeriska data, och med dem beräknas variationskoefficienter, särskilt för de parametrar som kopplas till endokrinstörande upptäckt. Dessa data kan sedan användas för jämförelseändamål när aktuella studier utvärderas.

53.

Testrapporten måste innehålla följande information:

(1)

OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.

(2)

IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60

(3)

Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.

(4)

Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704.

(5)

Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.

(6)

Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.

(7)

Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.

(8)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(9)

OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.

(10)

OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.

(11)

OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html

(12)

OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.

(13)

OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.

(14)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(15)

Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404–407.

(16)

Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. I: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, s. 52–85.

(17)

Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533.

(18)

OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N°440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.

(19)

OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.

1.

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 412 (2009). Den ursprungliga testriktlinjen 412 (TG 412) för subakut inhalation antogs 1981 (1). Den här testmetoden B.8 (som motsvarar den reviderade testriktlinjen 412) har uppdaterats för att återspegla vetenskapen och möta nuvarande och framtida lagstiftningsbehov.

2.

Den här testmetoden medger karakterisering av negativa effekter efter upprepad daglig exponering genom inhalation av en testkemikalie under 28 dagar. Uppgifterna som kommer från en 28-dagars substudie av akut inhalationstoxicitet kan användas för kvantitativa riskbedömningar (om den inte följs av en 90-dagars studie av subkronisk inhalationstoxicitet (kapitel B.29 i denna bilaga)). Uppgifterna kan också ge information om valet av koncentrationer för långtidsstudier såsom 90-dagarsstudien av subkronisk inhalationstoxicitet. Den här testmetoden är inte specifikt avsedd för testning av nanomaterial. Definitioner som används inom ramen för den här metoden finns i slutet av det här kapitlet och i vägledningsdokumentet 39 (2).

3.

All tillgänglig information om testkemikalien bör beaktas av laboratoriet innan studien genomförs i syfte att höja studiens kvalitet och minimera djuranvändningen. Information som underlättar valet av lämpliga testkoncentrationer kan inkludera identitet, kemisk struktur, och fysikalisk-kemiska egenskaper hos testkemikalien, resultat från eventuella in vitro- eller in vivo-toxicitetstester, förväntad användning(ar) och risken för mänsklig exponering, tillgängliga (Q)SAR-data och toxikologiska data om strukturellt närbesläktade kemikalier och data från testning av akut inhalationstoxicitet. Om neurotoxicitet förväntas eller observeras under studiens gång, kan försöksledaren välja att inkludera lämpliga utvärderingar såsom en funktionell samlingsstudie (FOB) och mätning av motorisk aktivitet. Även om tidpunkter för exponeringar i förhållande till specifika undersökningar kan vara kritiska, bör resultaten från dessa extra aktiviteter inte störa studiens grundläggande utformning.

4.

Utspädning av korrosiva eller irriterande testkemikalier kan testas vid koncentrationer som kommer att ge den önskade graden av toxicitet (se GD 39 (2)). När djur utsätts för dessa material bör målkoncentrationerna vara tillräckligt låga för att inte orsaka avsevärd smärta och lidande, men ändå tillräckliga för att utsträcka koncentration-respons-kurvan till nivåer som gör att testets regulatoriska och vetenskapliga mål kan uppnås. Dessa koncentrationer bör väljas från fall till fall, företrädesvis baserade på en adekvat utformad undersökning av spännvidden som ger information om den kritiska endpointen, eventuellt tröskelvärde för irritation och tiden för de första tecknen (se punkterna 11–13). Motivering för valet av koncentration ska anges.

5.

Döende djur eller djur som visar tecken på uppenbar smärta eller svårt och ihållande lidande ska avlivas skonsamt. Döende djur betraktas på samma sätt som de som dör under testet. Kriterier för att ta beslutet att avliva döende eller svårt lidande djur, och vägledning om hur man känner igen tecken på förutsägbar eller annalkande död, omfattas i OECD:s vägledningsdokument om humana endpoints (3).

6.

I testet bör friska unga vuxna gnagare användas av stammar som vanligtvis används på laboratorier. För detta test används råtta. Motivering ska ges om annan art används.

7.

Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. På dagen för randomiseringen bör djuren vara unga vuxna 7 till 9 veckor gamla. Kroppsvikten bör ligga inom ± 20 % av medelvikten för vardera könet. Djuren väljs ut slumpvis och märks för individuell identifikation, och får därefter acklimatisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst fem dagar före teststarten.

8.

Djuren bör identifieras individuellt, om möjligt med subkutana transpondrar för att underlätta observationer och undvika förvirring. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa fuktigheten bör ligga mellan 30 och 70 %, även om detta kanske inte är möjligt när vatten används som vehikel. Före och efter exponeringen bör djuren inhysas i grupper avhängigt kön och koncentration, dock får antalet djur per bur inte hindra en tydlig observation av varje enskilt djur, och förluster genom kannibalism och slagsmål bör minimeras. Om endast djurens nosar ska exponeras kan det vara nödvändigt att de får acklimatisera sig till fasthållningsrören. Fasthållningsrören ska inte medföra onödig fysisk, termisk eller fasthållningsstress för djuren. Fasthållning kan påverka fysiologiska endpoints såsom kroppstemperatur (hypotermi) och/eller minimala respiratoriska volymer. Om det finns generiska data tillgängliga som inte pekar på sådana förändringar i någon nämnvärd omfattning är det inte nödvändigt med anpassningen till rören före exponeringen. Djur vars hela kroppar ska exponeras för en aerosol ska inhysas individuellt under exponeringen för att förhindra att de andra djuren i buren filtrerar aerosolen genom sina pälsar. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, utom under exponeringen, tillsammans med en obegränsad tillgång till vatten. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker.

9.

Vid val av inhalationskammare bör man beakta kemikaliens beskaffenhet och ändamålet med testet. Det föredragna exponeringssättet är enbart nos (termen inkluderar även enbart huvud, enbart nos eller enbart tryne). Exponering av enbart nos föredras i allmänhet vid studier av vätskor och fasta aerosoler och ånga som kan kondenseras och bilda aerosoler. Vissa av undersökningens mål kan bättre uppnås genom exponering av hela kroppen, men detta ska motiveras i undersökningsrapporten. För att säkerställa atmosfärisk stabilitet vid användningen av en helkroppskammare ska den totala ”volymen” försöksdjur inte överskrida 5 % av kammarens volym. Teknikerna för enbart nos och helkroppsexponeringens deras principer och särskilda för- och nackdelar behandlas i GD 39 (2).

10.

Till skillnad från akuta studier finns det inga fastställda koncentrationsgränser i 28-dagarsstudier av subakut inhalationstoxicitet. För den högsta testade koncentrationen bör man beakta: 1) högsta möjliga koncentration, 2) värsta tänkbara fall av mänsklig exponering, 3) behovet av att ge en tillräcklig syretillförsel och/eller 4) djurskyddsskäl. I avsaknad av databaserade gränsvärden får de akuta gränsvärdena i förordning (EG) nr 1272/2008 (13) användas (dvs. upp till en högsta koncentration av 5 mg/l för aerosoler, 20 mg/l för ångor och 20 000 ppm för gaser), se GD 39 (2). Motivering ska ges om det är nödvändigt att överskrida dessa gränsvärden vid testning av gaser eller mycket flyktiga testkemikalier (t.ex. köldmedier). Koncentrationsgränsen bör framkalla tydlig toxicitet utan att utsätta djuren för onödig stress eller påverka deras livslängd (3).

11.

Innan huvudstudien påbörjas kan det vara nödvändigt att genomföra en spännviddsstudie. En spännviddsstudie är mer omfattande än en inledande studie eftersom den inte är begränsad till valet av koncentration. Kunskap från en spännviddsstudie kan leda till en lyckad huvudstudie. En spännviddsstudie kan till exempel ge teknisk information om analysmetoder, partikeldimensionering, upptäckt av toxiska mekanismer, klinisk patologi- och histopatologidata, och en uppskattning av vad som kan vara NOAEL- och MTC-koncentrationer i en huvudstudie. Försöksledaren kan välja att använda en spännviddsstudie för att identifiera tröskelvärdet för irritation i luftvägarna (t.ex. med histopatologi i luftvägarna, lungfunktionstest eller lungsköljning), den övre koncentration som tolereras utan att djuren utsätts för onödig stress och parametrarna som bäst kännetecknar en testkemikalies toxicitet.

12.

En spännviddsstudie kan bestå av en eller flera koncentrationsnivåer. Inte fler än tre hanar och tre honor ska exponeras vid varje koncentrationsnivå. En spännviddsstudie ska pågå under minst 5 dagar och vanligtvis inte mer än i 14 dagar. Motiveringen för valet av koncentrationer till huvudstudien ska ges i undersökningsrapporten. Syftet med huvudstudien är att påvisa ett koncentration-respons-förhållande baserat på vad som förväntas vara den mest känsliga endpointen. Den låga koncentrationen bör helst vara en koncentration utan en påvisbar skadlig effekt medan den höga koncentrationen bör framkalla tydlig toxicitet utan att utsätta djuren för onödig stress eller påverka deras livslängd (3).

13.

Vid valet av koncentrationsnivåer för spännviddsstudien bör all tillgänglig information beaktas, inklusive struktur-aktivitetsförhållanden samt data för liknande kemikalier (se punkt 3). En spännviddsstudie kan verifiera/motbevisa vad som anses vara de endpoints som är mest mekanistiskt baserade, t.ex. kolinesterasinhibition av organiska fosforföreningar, methemoglobinbildning av erytrocytotoxiska agens, sköldkörtelhormoner (T3, T4) för tyreotoxiska ämnen, protein, LDH eller neutrofiler i bronkialsköljning för ofarliga svårlösliga partiklar eller lungretande aerosoler.

14.

Huvudstudien för subakut toxicitet består i allmänhet av tre koncentrationsnivåer och även samtidiga negativa (luft) och/eller vehikelkontroller efter behov (se punkt 17). Alla tillgängliga data bör användas för att underlätta valet av lämpliga exponeringsnivåer, inklusive resultaten från de systematiska toxicitetsstudierna, metabolism och kinetik (särskild vikt bör läggas vid att undvika höga koncentrationsnivåer som mättar kinetiska processer). Varje testgrupp består av minst 10 gnagare (5 hanar och 5 honor) som exponeras för testkemikalien 6 timmar per dag 5 dagar per vecka under en period på 4 veckor (total studielängd 28 dagar). Djuren kan också exponeras 7 dagar per vecka (t.ex. vid testning av läkemedel som inhaleras. Om ett kön är känt för att vara mer mottagligt för en viss testkemikalie kan könen exponeras vid olika koncentrationsnivåer för att optimera koncentrationsresponsen enligt beskrivningen i punkt 15. Om andra gnagare än råttor exponeras enbart nos, får maximala exponeringstider justeras för att minska artspecifikt lidande. En motivering bör ges när man använder en kortare exponeringstid än 6 timmar/dag, eller när det är nödvändigt att utföra en helkroppsexponeringsstudie med lång varaktighet (t.ex. 22 timmar/dag) (se GD 39 (2)). Inget foder ska ges under exponeringsperioden, om den inte överskrider 6 timmar. Vatten kan tillhandahållas under en helkroppsexponering.

15.

Den målkoncentration som valts ska identifiera målorgan(en) och påvisa en tydlig koncentrationsrespons:

16.

En satellitstudie (reversibilitet) kan användas för att observera reversibilitet, persistens eller fördröjd toxicitet för en efterbehandlingsperiod av lämplig längd, dock inte mindre än 14 dagar. Satellitgrupper (reversibilitet) består av fem hanar och fem honor som exponeras samtidigt med försöksdjuren i huvudstudien. Satellitstudiegrupper bör exponeras för testkemikalien vid den högsta koncentrationsnivån och det bör finnas samtidiga luft- och/eller vehikelkontroller efter behov (se punkt 17).

17.

Samtidiga negativa (luft-) kontrolldjur bör hanteras på ett sätt som är identiskt med djuren i testgruppen, förutom att de exponeras för filtrerad luft i stället för testkemikalien. När vatten eller annat ämne används för att generera testatmosfären bör en vehikelkontrollgrupp i stället för en negativ (luft-) kontrollgrupp ingå i studien. Vatten bör användas som vehikel närhelst det är möjligt. När vatten används som vehikel bör kontrolldjuren exponeras för luft med samma relativa fuktighet som de exponerade grupperna. Valet av en lämplig vehikel bör grunda sig på en lämpligt utförd förstudie eller historiska data. Om en vehikels toxicitet inte är känd kan försöksledaren välja att använda både en negativ (luft-) kontroll och en vehikelkontroll, men det rekommenderas inte. Om historiska data visar att en vehikel inte är toxisk finns det inget behov av en negativ (luft-) kontrollgrupp och då bör endast en vehikelkontroll användas. Om en förstudie av en testkemikalie som beretts i en vehikel inte visar någon toxicitet, framgår det att vehikeln inte är toxisk vid den testade koncentrationen och att denna vehikelkontroll bör användas.

18.

Djur exponeras för testkemikalien som en gas, ånga, aerosol eller en blandning av dem. Det fysikaliska tillstånd som ska testas beror på testkemikaliens fysikalisk-kemiska egenskaper, vald koncentration och/eller dess mest sannolika fysikaliska form vid hanteringen och användningen. Hygroskopiska och kemiskt reaktiva testkemikalier ska testas i torr luft. Det är viktigt att se till att inga explosiva koncentrationer skapas. För att minska partikelstorleken kan partikelmaterialet utsättas för mekaniska processer. Mer vägledning finns i GD 39 (2).

19.

Partikeldimensionering bör utföras för alla aerosoler och ångor som kan kondenseras och bilda aerosoler. För att möjliggöra exponering av alla relevanta områden i luftvägarna, rekommenderas aerosoler med en aerodynamisk diameter (MMAD) i intervallet 1 till 3 μm med en geometrisk standardavvikelse (σg) i intervallet 1,5 till 3,0 (4). Även om en rimlig ansträngning krävs för att uppfylla denna standard, bör en sakkunnig bedömning ges om detta inte kan uppnås. Till exempel kan rökpartiklar av metall vara mindre än denna standard, och laddade partiklar och fibrer kan överstiga den.

20.

Testkemikalien ska helst testas utan en vehikel. Om det är nödvändigt att använda en vehikel för att generera en lämplig koncentration och partikelstorlek av testkemikalien, bör vatten ges företräde. Närhelst en testkemikalie är upplöst i en vehikel ska dess stabilitet påvisas.

21.

Luftflödet genom exponeringskammaren ska omsorgsfullt kontrolleras, kontinuerligt övervakas och registreras minst en gång i timmen under varje exponering. Övervakningen i realtid av testatmosfärens koncentration (eller temporal stabilitet) är en integrerad mätning av samtliga dynamiska parametrar och ger ett indirekt sätt att kontrollera alla relevanta dynamiska inhalationsparametrar. Om koncentrationen övervakas i realtid kan mätfrekvensen för luftflöden minskas till en enda mätning per exponeringsdag. Särskild hänsyn bör tas för att undvika återandning i enbart nos-kammare. Syrehalten bör vara minst 19 % och koncentrationen av koldioxid bör inte överstiga 1 %. Om det finns anledning att tro att denna standard inte kan uppfyllas bör man mäta koncentrationen av syre och koldioxid. Om mätningar under den första exponeringsdagen visar att dessa gaser har korrekta nivåer behöver inga fler mätningar utföras.

22.

Kammarens temperatur bör upprätthållas vid 22 ± 3 °C. Relativ fuktighet i djurens andningszoner, för både enbart nos och helkroppsexponering, bör om möjligt övervakas kontinuerligt och registreras varje timme för varje exponering. Den relativa fuktigheten bör helst upprätthållas inom intervallet 30 till 70 %, men detta kanske inte är möjligt (t.ex. vid testning av vattenbaserade blandningar), eller inte mätbart på grund av att testkemikalien stör själva testmetoden.

23.

När det är möjligt bör den nominella koncentrationen i exponeringskammaren beräknas och registreras. Den nominella koncentrationen är massan av den genererade testkemikalien dividerad med den totala volymen av luft som passerade genom inhalationskammarsystemet. Den nominella koncentrationen används inte för att karakterisera djurens exponering, men en jämförelse mellan den nominella koncentrationen och den faktiska koncentrationen ger en indikation på testsystemets genereringsprestanda, och kan därmed användas för att upptäcka genereringsproblem.

24.

Den faktiska koncentrationen är testkemikaliekoncentrationen som samlats in i djurets andningsområde i en inhalationskammare. Faktiska koncentrationer kan erhållas antingen genom särskilda metoder (t.ex. direkt provtagning, adsorptiva eller kemiskt reaktiva metoder, och efterföljande analytisk karakterisering) eller genom icke-specifika metoder såsom gravimetrisk filteranalys. Användningen av gravimetrisk analys är endast acceptabel för pulveraerosoler bestående av en enda komponent eller aerosoler bestående av vätskor med låg flyktighet, och bör stödjas av en lämplig preklinisk studie med kemikaliespecifik karakterisering. Koncentrationen i pulveraerosoler bestående av flera komponenter kan också bestämmas genom gravimetrisk analys. Detta kräver dock analysresultat som visar att sammansättningen av luftburet material liknar startmaterialet. Om denna information inte finns tillgänglig kan det vara nödvändigt med en ny analys av testkemikalien (helst i sitt luftburna tillstånd) under loppet av studien. För medel i aerosolform som kan förångas eller sublimeras bör man kunna visa att samtliga faser uppsamlades med den valda metoden.

25.

En sats av testkemikalien ska användas genom hela studien, om möjligt, och provet ska lagras under sådana förhållanden att det bibehåller sin renhet, homogenitet och stabilitet. Inför starten av studien bör det finnas en beskrivning av testkemikalien som inbegriper dess renhet och, om det är tekniskt genomförbart, identitet, och kvantiteterna av identifierade föroreningar och orenheter. Detta kan visas genom, men är inte begränsat till, följande data: retentionstid och relativ topparea, molekylvikt från masspektroskopi eller gaskromatografianalys, eller andra uppskattningar. Även om testlaboratoriet inte ansvarar för provets identitet kan det vara klokt att man i stora drag bekräftar karakteriseringen (t.ex. färg, fysisk natur etc.).

26.

Exponeringsatmosfären ska hållas så konstant som möjligt. En enhet för realtidsövervakning, såsom en aerosolfotometer för aerosoler eller en analysator för totalkolväte för ångor kan användas för att påvisa stabilitet hos exponeringsförhållandena. Faktisk kammarkoncentration bör mätas minst 3 gånger varje exponeringsdag vid varje exponeringsnivå. Om det inte är möjligt på grund av begränsade luftflöden eller låga koncentrationer, är det acceptabelt med ett prov per exponeringsperiod. Helst ska detta prov sedan samlas in under hela exponeringsperioden. Provtagning av kammarkoncentrationer från individuella kammare bör inte avvika från den genomsnittliga koncentrationen med mer än ± 10 % för gaser och ångor, och inte med mer än ± 20 % för flytande eller fasta aerosoler. Tid för att uppnå kammarjämvikt (t95) bör beräknas och rapporteras. Varaktigheten för en exponering sträcker sig över den tid som testkemikalien genereras. Detta tar hänsyn till den tid som krävs för att uppnå kammarens jämvikt (t95) och sönderfall. Riktlinjer för att uppskatta t95 finns i GD 39 (2).

27.

För mycket komplexa blandningar bestående av gaser/ångor och aerosoler (t.ex. förbränningsatmosfärer och testkemikalier framdrivna från därför avsedd slutanvändningsprodukt/-utrustning) kan varje fas bete sig olika i en inhalationskammare. Därför ska minst ett indikatorämne väljas (analyt), vanligtvis det huvudsakliga aktiva ämnet i blandningen för varje fas (gas/ånga och aerosol). När testkemikalien är en blandning ska den analytiska koncentrationen i totalblandningen rapporteras, inte bara den aktiva ingrediensen eller indikatorämnet (analyten). Ytterligare information om faktisk koncentration finns i GD 39 (2).

28.

Aerosolers partikelstorleksfördelning bör fastställas minst en gång i veckan för varje koncentrationsnivå med hjälp av en kaskadimpaktor eller ett alternativt instrument såsom en aerodynamisk partikelsorterare (APS). Om man kan visa ett likvärdigt resultat från en kaskadimpaktor och det alternativa instrumentet, kan man använda det sistnämnda under hela studien.

29.

En andra enhet, till exempel ett gravimetriskt filter eller en impinger/gasbubblare, bör användas parallellt med det primära instrumentet för att bekräfta uppsamlingsprestandan hos det primära instrumentet. Masskoncentrationen som erhållits genom analys av partikelstorleken ska ligga inom rimliga gränser för den masskoncentration som erhållits genom filteranalys (se GD 39 (2)). Om likvärdigheten kan påvisas för alla koncentrationer som testats i ett tidigt skede av försöket, kan ytterligare bekräftande mätningar utelämnas. Av hänsyn till djurskyddsskäl bör åtgärder vidtas för att minimera ofullständiga uppgifter som kan leda till att studien måste upprepas.

30.

Partikeldimensionering bör utföras för ångor om det finns en möjlighet att kondensen kan bilda en aerosol, eller om partiklar upptäcks i ångatmosfären som kan göra så att faserna blandas.

31.

Djuren bör observeras kliniskt före, under och efter exponeringsperioden. Mer frekventa iakttagelser kan indikeras beroende på djurens respons under exponeringen. När iakttagelser av djuren hindras genom användning av fasthållningsrör, dåligt upplysta kroppskammare eller ogenomskinlig atmosfär, bör djuren noga observeras efter exponeringen. Observationer före nästa dags exponering kan utvärdera eventuell reversibilitet eller stegrande toxiska effekter.

32.

Alla observationer registreras med individuell registrering för varje djur. När djur avlivas av humanitära skäl eller påträffas döda, ska tidpunkten för dödsfallet registreras så noggrant som möjligt.

33.

Observationer vid buren bör omfatta förändringar i hud och päls, ögon och slemhinnor, förändringar i andnings- och cirkulationssystemen, förändringar i nervsystemet, samt förändringar i kroppsmotorik och beteendemönster. Uppmärksamhet bör fästas vid iakttagelser av tremor, konvulsioner, salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Mätningen av rektala temperaturer kan ge belägg för bradypnéreflex eller hypo/hypertermi relaterat till behandling eller inspärrning. Ytterligare utvärderingar kan inkluderas i studiens protokoll såsom kinetik, biologisk övervakning, lungfunktion, retention av svårlösliga ämnen som ackumuleras i lungvävnad, samt beteendeförändringar.

34.

De enskilda djurens vikt bör registreras strax före den första exponeringen (dag 0), därefter två gånger i veckan (till exempel på fredagar och måndagar för att påvisa återhämtning över ett exponeringsfritt veckoslut eller under ett tidsintervall för bedömning av systematisk toxicitet), och vid tidpunkten för dödsfallet eller avlivningen. Visas inga effekter under de två första veckorna kan kroppsvikterna mätas en gång i veckan för återstoden av studien. Satellitdjur (reversibilitet) (om det används) ska fortsätta vägas varje vecka under hela återhämtningsperioden. Vid studiens upphörande bör samtliga djur vägas strax före avlivningen för en objektiv beräkning av förhållandet organ-kroppsvikt.

35.

Födointaget bör mätas varje vecka. Vattenintaget bör också mätas.

36.

Kliniska patologiska bedömningar bör göras av samtliga djur, inklusive kontroll- och satellitdjur (reversibilitet) när de avlivas. Tidsintervallet mellan exponeringens upphörande och insamlingen av blod ska registreras, i synnerhet när rekonstitueringen av endpointen är snabb. Provtagning efter att exponeringen har upphört indikeras för dessa parametrar med ett kort plasmaprov halvtid (t.ex. COHb, CHE och MetHb).

37.

Tabell 1 listar de kliniska patologiska parametrar som i allmänhet krävs för alla toxikologiska studier. Urinanalys krävs inte rutinmässigt, men kan utföras när det bedöms lämpligt utifrån förväntad eller observerad toxicitet. Försöksledaren kan välja att bedöma ytterligare parametrar för att bättre kunna karakterisera en testkemikalies toxicitet (t.ex. kolinesteras, lipider, hormoner, syra/bas-balans, methemoglobin eller Heinz-kroppar, kreatinkinas, myeloid/erytroid-förhållande, troponiner, arteriella blodgaser, laktatdehydrogenas, sorbitoldehydrogenas, glutamatdehydrogenas och gamma-glutamyltranspeptidas).

Tabell 1

Standardiserade parametrar för klinisk patologi

38.

När det finns bevis på att de nedre luftvägarna (dvs. alveolerna) är den främsta platsen för deponering och lagring, då kan lungsköljning vara det tekniska valet för att kvantitativt analysera hypotesbaserade doseffektparametrar med fokus på alveolit, lunginflammation och fosfolipidos. Detta gör att dosrespons och tidsförloppsförändringar för alveolär skada grundligt kan undersökas. BAL-vätskan kan analyseras för totalt och differentiellt leukocytantal, totalprotein och laktatdehydrogenas. Andra parametrar som kan beaktas är de som tyder på lysosomal skada, fosfolipidos, fibros, och irriterande eller allergisk inflammation som kan innefatta bestämning av pro-inflammatoriska cytokiner/kemokiner. BAL-mätningar kompletterar i allmänhet resultaten från histopatologiska undersökningar, men kan dock inte ersätta dem. Vägledning om hur man utför lungsköljning finns i GD 39 (2).

39.

Samtliga försöksdjur, inklusive de som avlider under testet eller avlivas och tas bort från undersökningen av djurskyddsskäl, bör underkastas fullständig blodtömning (om möjligt) och obduceras. Tidsperioden mellan slutfasen av varje djurs exponering och avlivandet av dem ska registreras. Om en obduktion inte kan utföras omedelbart efter att ett dött djur påfunnits, bör djuret kylas (inte frysas) vid en temperatur som är tillräckligt låg för att minimera autolys. Obduktioner ska utföras så snart som möjligt, vanligtvis inom en dag eller två. Alla betydande patologiska förändringar bör registreras för varje djur med särskild uppmärksamhet på eventuella förändringar i luftvägarna.

40.

Tabell 2 visar de organ och vävnader som bör bevaras i ett lämpligt medium under obduktion för histopatologisk undersökning. Bevarandet av organ och vävnader [inom hakparentes] och eventuellt andra organ och vävnader avgörs av försöksledaren. Organen i fetstil ska putsas och vägas våta så snart som möjligt efter dissektionen för att undvika uttorkning. Sköldkörteln och bitestiklarna bör endast vägas om det behövs, eftersom trimning av artefakter kan hindra en histopatologisk utvärdering. Vävnader och organ bör fixeras i 10 % buffrad formalin eller annat lämpligt fixativ så snart obduktionen utförts, och inte mindre än 24–48 timmar före trimning beroende på det fixativ som ska användas.

Tabell 2

Organ och vävnader som bevaras vid obduktion

Binjurar

Benmärg (och/eller färskt aspirat)

Hjärna (inklusive delar av cerebrum, cerebellum och medulla/pons)

(Ögon [retina, synnerv] och ögonlock)

Hjärta

Njurar

Larynx (3 nivåer, 1 nivå för att inkludera basen på epiglottis)

Lever

Lungor (alla lober på en nivå, inklusive huvudbronker)

Lymfkörtlar från lungans hilarregion, särskilt beträffande svårlösliga partikeltestkemikalier. För mer ingående undersökningar och/eller studier med immunologi i fokus kan ytterligare lymfkörtlar beaktas, t.ex. de från de mediastinala, cervikala/submandibulära och/eller aurikulära regionerna.

Nasofaryngeala vävnader (minst 4 nivåer; 1 nivå för att inkludera den nasofaryngeala kanalen och den nasalassocierade lymfvävnaden (NALT)

Esofagus

[Luktbulb]

Äggstockar

Sädesblåsor

Ryggmärg (cervikala, mitt på bröstkorgen och ländryggen)

Mjälte

Mage

Testiklar

Tymus

Sköldkörtel

Luftstrupe (minst 2 nivåer inklusive 1 längdsnitt genom carina och 1 tvärsnitt)

[Urinblåsa]

Uterus

Alla större skador

41.

Lungorna bör avlägsnas intakta, vägas och indränkas med lämpligt fixativ vid ett tryck på 20–30 cm vatten för att säkerställa att lungstrukturen bibehålls (5). Sektioner bör samlas in för alla lober på en nivå, inklusive huvudbronker, men om lungsköljning utförs ska den osköljda loben sektioneras på tre nivåer (ej seriella sektioner).

42.

Minst 4 nivåer av de nasofaryngeala vävnaderna bör undersökas, varav en ska innehålla den nasofaryngeala kanalen, (5, 6, 7, 8, 9) för en adekvat undersökning av den skvamösa, mellanliggande (icke-cilierade respiratoriska), respiratoriska (cilierade respiratoriska) och luktepitelet, samt den dränerade lymfvävnaden (NALT; 10, 11). Tre nivåer av struphuvudet bör undersökas, och en av dessa nivåer bör inkludera struplockets bas (12). Minst två nivåer av luftstrupen bör undersökas, inklusive ett längdsnitt genom förgreningen av carinan för de extrapulmonella bronkerna, samt ett tvärsnitt.

43.

En histopatologisk utvärdering av alla organ och vävnader som räknas upp i tabell 2 bör utformas för kontroll- och högkoncentrationsgrupperna och för alla djur som dör eller avlivas under studien. Särskild uppmärksamhet bör ges åt luftvägarna, målorganen och större skador. Organ och vävnader som har skador i högkoncentrationsgruppen bör undersökas i alla grupper. Försöksledaren kan välja att utföra histopatologiska utvärderingar av flera grupper för att påvisa en tydlig koncentrationsrespons. Om en satellitgrupp (reversibilitet) används bör en histopatologisk utvärdering göras av samtliga vävnader och organ där effekter visats i de behandlade grupperna. Om det finns alltför många tidiga dödsfall eller andra problem i högkoncentrationsgruppen som äventyrar datans signifikans, bör nästa lägre koncentration undersökas histopatologiskt. Ett försök bör göras att korrelera större observationer i relation till mikroskopiska fynd.

44.

Individuella data om djurens kroppsvikt, födointag, klinisk patologi, makroskopisk patologi, organvikter och histopatologi ska lämnas. Kliniska observationsdata bör sammanfattas i tabellform, som för varje testgrupp visar antalet djur som använts, antalet djur som visar tecken på toxicitet, antalet djur som avlidit under testet eller som avlivats av humanitära skäl, tidpunkten då det enskilda djuret har avlidit, beskrivning och tidsförlopp för toxiska verkningar och reversibilitet, samt obduktionsfynd. Samtliga resultat, kvantitativa och tillfälliga, ska utvärderas genom en lämplig statistisk metod. En allmänt vedertagen statistisk metod kan användas, och statistiska metoderna bör väljas under studiens utformning.

45.

Testrapporten ska omfatta följande information, när så är lämpligt: