(10)
|
Följande kapitel läggs till som kapitlen C.27, C.28, C.29 och C.30:
”C.27 TOXICITETSTEST I SEDIMENT- OCH VATTENFAS PÅ CHIRONOMIDLARVER MED SPIKAT SEDIMENT
INLEDNING
1.
|
Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 218 (2004). Syftet med testmetoden är att bedöma effekterna av långvarig kemikalieexponering på sedimentlevande larver i sötvatten av fjädermyggor Chironomus sp. Metoden är baserad på befintliga toxicitetstestprotokoll för Chironomus riparius och Chironomus tentans som har tagits fram i Europa (1) (2) (3) och Förenta staterna (4) (5) (6) (7) (8) samt ringtestats (1) (6) (9). Även övriga väldokumenterade chironomider kan användas, t.ex. Chironomus yoshimatsui (10) (11).
|
2.
|
Exponeringsscenariot i denna testmetod går ut på att spika sediment med testämnet. Valet av lämpligt exponeringsscenario beror på den avsedda tillämpningen för testet. Scenariot med spikning av sediment är avsett att simulera ackumulerade nivåer av kemikalier som finns kvar i sedimentet. Detta exponeringssystem innebär spikning av sediment i ett testsystem med sediment- och vattenfas.
|
3.
|
Ämnen som behöver testas på sedimentlevande organismer är sådana som i allmänhet blir kvar i sedimentet under långa tidsperioder. De sedimentlevande organismerna kan exponeras via ett antal rutter. Den relativa betydelsen av varje exponeringsrutt och den tid det tar för var och en av dem att bidra till de totala toxiska effekterna beror på den berörda kemikaliens fysikalkemiska egenskaper. För starkt adsorberande ämnen (t.ex. log Kow > 5) eller för ämnen som binds kovalent till sedimentet, kan förtäring av förorenad föda vara en betydande exponeringsrutt. För att toxiciteten hos starkt lipofila ämnen inte ska underskattas kan tillsättning av föda till sedimentet före applicering av testämnet övervägas. För att alla potentiella exponeringsrutter ska beaktas har denna testmetod fokus på långvarig exponering. Testets längd är 20–28 dagar för C. riparius och C. yoshimatsui och 28–65 dagar för C. tentans. Om korttidsdata krävs för ett specifikt ändamål, t.ex. för att undersöka effekterna av en instabil kemikalie, kan tilläggsreplikat avlägsnas efter tio dagar.
|
4.
|
De endpoints som mäts är det totala antalet kläckta vuxna exemplar och utvecklingstiden fram till kläckning. Det rekommenderas att mätningar av larvernas överlevnad och tillväxt endast görs efter en tiodagarsperiod i fall där ytterligare korttidsdata krävs, med användning av ytterligare replikat enligt vad som är lämpligt.
|
5.
|
För detta test rekommenderas syntetiskt sediment. Syntetiskt sediment har flera fördelar jämfört med naturliga sediment:
—
|
Variationen mellan experiment reduceras eftersom syntetiskt sediment bildar en reproducerbar ”standardmatris”, och behovet av att få fram oförorenade och rena sediment elimineras.
|
—
|
Testningen kan inledas när som helst utan att beakta säsongvariationer i testsedimentet och det behövs ingen förbehandling av sediment för att få bort naturligt förekommande fauna. När syntetiskt sediment används uppstår heller inte kostnader för insamling på fältet av tillräckliga mängder sediment för rutintestning.
|
—
|
Användning av syntetiskt sediment ger möjlighet till jämförelser av toxicitet och därmed klassificering av ämnen.
|
|
6.
|
Definitioner finns i tillägg 1.
|
PRINCIP FÖR TESTMETODEN
7.
|
Chironomidlarver i första larvstadiet exponeras för ett urval koncentrationer av testkemikalien i sediment-vattensystem. Testämnet spikas i sedimentet och därefter tillförs larverna i testkärlen som har stabiliserade sediment- och vattenkoncentrationer. Kläckning av fullbildade myggor och utvecklingshastighet mäts i slutet av testet. Överlevande larver och deras vikt kan också mätas efter tio dagar om så krävs (med användning av ytterligare replikat enligt det som är lämpligt). Dessa data analyseras med användning av en regressionsmodell för att uppskatta den koncentration som skulle orsaka × % minskning av antalet fullbildade myggor eller av larvernas överlevnad eller tillväxt (t.ex. EC15, EC50 osv.) eller genom användning av statistisk hypotesprövning för att bestämma NOEC/LOEC. Hypotesprövningen kräver en jämförelse mellan effektvärden och kontrollvärden med användning av statistiska test.
|
INFORMATION OM TESTÄMNET
8.
|
Testämnets vattenlöslighet, ångtryck, uppmätta eller beräknade fördelning i sedimentet samt stabilitet i vatten och sediment bör vara kända. Det bör finnas en tillförlitlig analysmetod för kvantifiering av testämnet i överliggande vatten, porvatten och sediment med känd och rapporterad exakthet och detektionsgräns. Det är också bra att känna till testämnets strukturformel och renhet. Hur testämnet agerar kemiskt (t.ex. upplösning, abiotisk och biotisk nedbrytning osv.) hör också till den information som är användbar. Närmare vägledning för testning av ämnen vars fysikalkemiska egenskaper försvårar detta test finns i (12).
|
REFERENSKEMIKALIER
9.
|
Referenskemikalier kan testas periodiskt för att säkerställa att testprotokollet och testbetingelserna är tillförlitliga. Exempel på toxiska referensämnen som med framgång har använts i ringtest och valideringsstudier är lindan, trifluranid, pentaklorfenol, kadmiumklorid och kaliumklorid (1) (2) (5) (6) (13).
|
TESTETS GILTIGHET
10.
|
För att testet ska vara giltigt gäller följande villkor:
—
|
Kläckningen av vuxna exemplar i kontrollkärlen måste vara minst 70 % i slutet av testet (1) (6).
|
—
|
Kläckningen av vuxna exemplar av C. riparius och C. yoshimatsui i kontrollkärlen bör inträffa 12–24 dagar efter att de har införts i kärlen, för C. tentans krävs en period på 20–65 dagar.
|
—
|
Vid slutet av testet bör pH och koncentrationen upplöst syre mätas i varje kärl. Syrekoncentrationen bör vara minst 60 % av luftmättnadsvärdet (ASV) vid den använda temperaturen och pH i överliggande vatten bör vara 6–9 i alla testkärl.
|
—
|
Variationen i vattentemperatur får inte vara större än ± 1,0 °C. Vattentemperaturen kan hållas under kontroll genom att göra testningen i ett isotermiskt utrymme, varvid rumstemperaturen bör kontrolleras med lämpliga tidsintervall.
|
|
METODBESKRIVNING
Testkärl
11.
|
Testet görs i 600 ml-glasbägare med 8 cm i diameter. Även andra slags kärl kan användas, men då måste det gå att garantera att överliggande vatten och sediment har lämpliga djup. Sedimentytan bör vara tillräckligt stor för att ge 2–3 cm2 per larv. Förhållandet mellan sedimentskiktets djup och överliggande vattnets djup bör vara 1:4. Testkärl och annan apparatur som kommer i kontakt med testsystemet bör vara gjorda av glas eller annat kemiskt inert material (t.ex. teflon).
|
Val av arter
12.
|
Den art som används i testet ska helst vara Chironomus riparius. Chironomus tentans kan också vara lämplig, men den är svårare att hantera och kräver en längre testperiod. Även Chironomus yohimatsui kan användas. I tillägg 2 finns närmare uppgifter om odlingsmetoder för Chironomus riparius. Information om odlingsbetingelser finns också för andra arter, t.ex. Chironomus tentans (4) och Chironomus yoshimatsui (11). Arternas identifiering måste bekräftas före testningen men är inte nödvändig före varje test om organismerna härrör från en odling inom laboratoriet.
|
Sediment
13.
|
Helst ska syntetisk sediment användas. Om naturligt sediment används bör dess egenskaper bestämmas (minst pH, halten organiskt kol, och gärna även andra parametrar såsom förhållandet C/N och granulometri). Sedimentet måste även vara fritt från föroreningar och andra organismer som kan konkurrera med eller konsumera chironomiderna. Dessutom rekommenderas att naturligt sediment som är avsett att användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras i sju dagar under samma betingelser som råder i det efterföljande testet. Följande syntetiska sediment, baserat på den syntetiska jord som används i testmetod C.8 (14), rekommenderas för detta test (1) (15) (16):
a)
|
4–5 % (torrvikt) torv så nära pH 5,5–6 som möjligt; det är viktigt att använda endast lufttorkad och finmalen torv i pulverform (partikelstorlek ≤ 1 mm).
|
b)
|
20 % (torrvikt) kaolinlera (kaolinithalt helst över 30 %).
|
c)
|
75–76 % (torrvikt) kvartssand (till största delen bestående av fin sand där mer än 50 % av partiklarna har storleken 50–200 μm).
|
d)
|
Avjoniserat vatten tillsätt så att blandningen får en slutlig fukthalt på 30–50 %.
|
e)
|
Kemiskt rent kalciumkarbonat CaCO3) tillsätts för att justera den slutliga sedimentblandningens pH till 7,0 ± 0,5. Den slutliga blandningens kolhalt bör vara 2 % ± 0,5 % och kan justeras med hjälp av lämpliga mängder torv och sand, enligt punkterna a och c.
|
|
14.
|
Torv, kaolinlera och sand ska härröra från kända källor. Sedimentkomponenterna bör kontrolleras för att bekräfta avsaknaden av kemiska föroreningar (t.ex. tungmetaller, organiska klorföreningar, organiska fosforföreningar osv.) Ett exempel på hur syntetiskt sediment kan tillredas beskrivs i tillägg 3. Det är också godtagbart att blanda torra beståndsdelar om det går att demonstrera att tillsats av överliggande vatten inte leder till att sedimentets beståndsdelar separerar (t.ex. flytande torvpartiklar) och att torven eller sedimentet konditioneras tillräckligt.
|
Vatten
15.
|
Allt vatten som uppfyller de kemiska kriterierna för godtagbart utspädningsvatten (se tilläggen 2 och 4) är lämpligt som testvatten. Allt lämpligt vatten, naturligt vatten (ytvatten eller grundvatten), rekonstituerat vatten (se tillägg 2) och avklorerat kranvatten är godtagbart som odlings- och testvatten om chironomiderna överlever i det under odling, acklimatisering och testning utan att uppvisa tecken på stress. Vid teststart ska testvattnets pH vara mellan 6 och 9 och totalhårdheten får inte vara högre än 400 mg/l uttryckt som CaCO3. Om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och testämnet, bör vatten med lägre hårdhet användas (i en sådan situation får Elendt Medium M4 inte användas). Samma typ av vatten bör användas under hela testningen. De vattenkvalitetsegenskaper som förtecknas i tillägg 4 bör mätas minst två gånger om året eller om man misstänker att egenskaperna har ändrats betydligt.
|
Stamlösningar – spikat sediment
16.
|
Spikat sediment med vald koncentration bereds i regel genom tillsättning av en lösning av testämnet direkt i sedimentet. En stamlösning av testämnet upplöst i avjoniserat vatten blandas med det syntetiska sedimentet i en rullkvarn, matningsblandare eller manuellt. Om testämnet har låg löslighet i vatten kan det lösas upp i minsta möjliga volym lämpligt organiskt lösningsmedel (t.ex. hexan, aceton eller kloroform). Denna lösning blandas sedan med 10 g fin kvartssand för ett testkärl. Lösningsmedlet får avdunsta och måste vara helt avlägsnat ur sanden, och därefter blandas sanden med lämplig mängd sediment per testbägare. Endast ämnen som avdunstar lätt får användas för att upplösa, dispergera eller emulgera testämnet. Här bör noteras att den sand som följer med testämnet och sandblandningen måste beaktas när sedimentet förbereds (dvs. sedimentet ska ha mindre mängd sand). Det är viktigt att se till att testämnet som tillsätts sedimentet fördelas omsorgsfullt och jämnt inom sedimentet. Vid behov kan delprover analyseras för att bestämma homogeniteten.
|
TESTETS UTFORMNING
17.
|
Testets utformning avser antalet koncentrationer och intervallen mellan dem, antalet kärl per koncentration och antalet larver per kärl. Här beskrivs utformningar för uppskattning av effektkoncentration, uppskattning av NOEC och för gränstest.
|
Utformning för regressionsanalys
18.
|
Effektkoncentrationen (t.ex. EC15, EC50) och det koncentrationsområde som är relevant för testämnet bör omfattas av de koncentrationer som ingår i testet. Allmänt taget gäller att exaktheten och särskilt giltigheten för uppskattningar av effektkoncentrationer (ECx) förbättras när effektkoncentrationen ligger inom området för de koncentrationer som testas. Extrapolering under lägsta positiva koncentration eller över högsta koncentration bör undvikas. Preliminära test kan användas för att hitta rätt koncentrationsområde (se punkt 27).
|
19.
|
Om ECx ska uppskattas bör testet omfatta minst fem koncentrationer och tre replikat för varje koncentration. Det är under alla omständigheter tillrådligt att använda tillräckligt många testkoncentrationer för att få en god modelluppskattning. Faktorn mellan koncentrationer bör inte vara större än två (undantag kan göras i fall där dos-responskurvan har liten lutning). Antalet replikat per behandling kan minskas om antalet testkoncentrationer med olika respons ökas. En ökning av antalet replikat eller minskning av testkoncentrationsintervall tenderar att leda till ett smalare konfidensintervall för testet. Ytterligare replikat krävs om en uppskattning ska göras av larvernas överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod.
|
Upplägg för uppskattning av NOEC/NOEC
20.
|
Om LOEC eller NOEC ska uppskattas bör fem testkoncentrationer med minst fyra replikat användas och faktorn mellan koncentrationerna bör inte vara större än två. Antalet replikat bör vara tillräckligt för att säkerställa tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). För uppskattning av utvecklingshastighet är det i regel lämpligt med variansanalys (ANOVA), såsom Dunnets eller Williams test (17) (18) (19) (20). För kläckningsfrekvens kan ett Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (med Bonferronikorrigering) eller ett Mantel-Haenszel-test användas.
|
Gränstest
21.
|
Gränstest kan göras (en testkoncentration och kontroll) om inga effekter framkommit vid det preliminära testet för att fastställa testområde. Syftet med gränstest är att genomföra ett test vid en koncentration som är tillräckligt hög för att man ska kunna utesluta eventuella toxiska effekter av testämnet, och gränsen sätts vid en koncentration som inte förväntas förekomma i någon situation. 1 000 mg/kg (torrvikt) rekommenderas. I regel krävs minst sex replikat både för behandling och kontroll. Man måste kunna demonstrera tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). Eftersom t-test ger kvantitativ respons (utvecklingshastighet och vikt) är t-test en lämplig statistisk metod förutsatt att data uppfyller testkraven (normalitet, homogena varianser osv.). Om dessa krav inte uppfylls kan man använda t-testet med olika varians eller ett icke-parametriskt test, såsom Wilcoxon-Mann-Whitneys test. För kläckningsfrekvens är det lämpligt att använda Fischers exakta test.
|
FÖRFARANDE
Exponeringsbetingelser
Beredning av systemet med spikat sediment och vatten
22.
|
Det förfarande för spikning som beskrivs i testmetod C.8 (Toxicitet för daggmaskar) rekommenderas för applicering av testämnet (14). Spikade sediment placeras i kärlen och överliggande vatten tillsätts så att förhållandet mellan sediment och vatten är 1:4 (se punkterna 11 och 15). Sedimentets djup bör vara 1,5–3 cm. För att undvika separation av sedimentets beståndsdelar och återsuspension av finfördelat material medan testvatten tillsätts i vattenkolumnen, kan sedimentet täckas med en plastplatta medan vattnet tillsätts, varefter plattan avlägsnas omedelbart. Även andra metoder kan vara lämpliga.
|
23.
|
Testkärlen bör vara täckta (t.ex. med glasplattor). Vid behov fylls under testets gång vatten på till ursprunglig volym för att kompensera för avdunstning. Detta bör göras med destillerat eller avjoniserat vatten för att förebygga ackumulering av salter.
|
Stabilisering
24.
|
Efter beredning av spikat sediment och överliggande vatten rekommenderas att testämnet får fördelas från vattenfasen till sediment (3) (4) (6) (13). Detta bör helst göras med samma temperatur- och luftningsbetingelser som används vid testningen. Stabiliseringstiden beror på sedimentet och kemikalien, och kan variera mellan några timmar och flera dagar, i sällsynta fall upp till flera veckor (4–5 veckor). Eftersom en lång stabiliseringstid kan leda till att vissa kemikalier sönderfaller, eftersträvas här inte jämvikt; i stället rekommenderas en stabiliseringstid på 48 timmar. I slutet av denna jämviktsperiod ska testämnets koncentration mätas i det överliggande vattnet, porvattnet och sediment, åtminstone för den högsta koncentrationen och en lägre koncentration (se punkt 38). Dessa analytiska bestämningar av testämnet gör det möjligt att beräkna massbalans och uttrycka resultaten på grundval av uppmätta koncentrationer.
|
Tillförsel av testorganismer
25.
|
Fyra till fem dagar innan testorganismerna tillförs testkärlen ska äggmassorna avlägsnas från odlingarna och placeras i små kärl i odlingsmedium. Åldrat medium från stamodling eller färskt berett medium kan användas. Om färskt medium används bör en liten mängd föda, t.ex. grönalger och/eller några droppar filtrat från en finmald suspension av fiskfoder i flingform tillsättas odlingsmediet (se tillägg 2). Endast färska äggmassor får användas. I regel börjar larverna kläckas några dagar efter att äggen har lagts (2–3 dagar för Chironomus riparius vid 20 °C och 1–4 dagar för Chironomus tentans vid 23 °C och Chironomus yoshimatsui vid 25 °C), och larvernas tillväxt sker i fyra stadier på 4–8 dagar per stadium. För testet ska första stadiets larver användas (2–3 eller 1–4 dagar efter kläckningen). Bestämning av larvstadium kan möjligen göras genom mätning av huvudkapseldiameter (6).
|
26.
|
Tjugo första stadiets larver fördelas slumpvis till varje testkärl som innehåller spikat sediment och vatten, med användning av en trubbig pipett. Luftningen av vattnet måste stoppas medan larverna tillsätts testkärlen och hållas stoppad i ytterligare 24 timmar efter tillsättningen (se punkterna 25 och 32). Enligt det testupplägg som används (se punkterna 19 och 20) är antalet larver per testkoncentration minst 60 för uppskattning av EC-punkt och 80 för bestämning av NOEC.
|
Testkoncentrationer
27.
|
Ett preliminärt test kan användas för att fastställa koncentrationerna för det definitiva testet. För detta ändamål används en serie brett spridda koncentrationer av testämnet. För att få samma ytdensitet per chironomid som ska användas för det slutliga testet, exponeras chironomiderna för varje koncentration av testämnet under en period som ger möjlighet att uppskatta lämpliga testkoncentrationer. Inga replikat krävs.
|
28.
|
Testkoncentrationerna för det definitiva testet baseras på resultaten från det preliminära testet. Det ska finnas minst fem testkoncentrationer som väljs enligt beskrivningen i punkterna 18–20.
|
Kontrollkärl
29.
|
Kontrollkärl som inte innehåller testämne utan enbart sediment bör ingå i testet med lämpligt antal replikat (se punkterna 19 och 20). Om lösningsmedel har använts för applicering av testämnet (se punkt 16) bör det också finnas kontrollkärl med sediment och lösningsmedel.
|
Testsystem
30.
|
De system som används är statiska. Semistatiska system eller genomflödessystem med intermittent eller kontinuerlig förnyelse av överliggande vatten kan användas i undantagsfall, t.ex. om vattenkvalitetspecifikationerna inte är lämpliga för testorganismen eller påverkar den kemiska jämvikten (t.ex. om syrenivåerna blir för låga, koncentrationen av utsöndrade produkter blir för hög eller om mineraler släpps ut från sedimentet och påverkar pH och/eller vattenhårdheten). I regel är det dock tillräckligt och rekommendabelt att använda andra metoder för kompensering av kvaliteten på överliggande vatten, såsom luftning.
|
Foder
31.
|
Larverna bör ges foder helst dagligen eller minst tre gånger per vecka. Fiskfoder (suspension i vatten eller finmalt foder, t.ex. Tetra-Min eller Tetra-Phyll, se närmare i tillägg 2) i mängder om 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg för C. yoshimatsui) per larv per dag anses vara lämpligt för unga larver under de tio första dagarna. För äldre larver kan det krävas lite större mängd: 0,5–1 mg per larv och dag bör vara tillräckligt för återstoden av testet. Mängden bör minskas för alla behandlingar och kontroller om det uppstår svamptillväxt eller mortalitet observeras i kontrollerna. Om svamptillväxten inte kan stoppas måste testet upprepas. Vid testning av starkt adsorberande ämnen (t.ex. log Kow > 5) eller ämnen som är kovalent bundna till sedimentet, kan mängden foder som krävs för att säkerställa överlevnad och naturlig tillväxt för organismerna tillsättas i det syntetiska sedimentet före stabiliseringsperioden. Då ska växtmaterial användas i stället för fiskfoder, t.ex. 0,5 % (torrvikt) finmalda löv från t.ex. brännässla (Urtica dioica), mullbär (Morus alba), vitklöver (Trifolium repens), spenat (Spinacia oleracea) eller annat växtmaterial (Cerophyl eller alfacellulosa).
|
Inkubationsbetingelser
32.
|
Skonsam luftning av överliggande vatten i testkärlen införs helst 24 timmar efter tillsättning av larverna och får pågå genom hela testet (se till att halten upplöst syre inte faller under 60 % av luftmättnadsvärdet ASV). Luftningen görs med hjälp av en Pasteur-glaspipett som är fäst 2–3 cm ovanför sedimentskiktet (en eller ett fåtal bubblor per sekund). Vid testning av flyktiga kemikalier kan man överväga att utesluta luftning av sediment-vattensystemet.
|
33.
|
Testet genomförs vid konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). För C. tentans och C. yoshimatsui rekommenderas temperaturer på 23 °C respektive 25 °C (± 2 °C). En ljusperiod på 16 timmar används och ljusintensiteten ska vara 500–1 000 lux.
|
Exponeringstid
34.
|
Exponeringen inleds när larver tillsätts i spikade kärl och kontrollkärl. Den maximala exponeringstiden är 28 dagar för C. riparius och C. yoshimatsui och 65 dagar för C. tentans. Om myggor kläcks tidigare, kan testet avslutas efter minst fem dagar efter att det sista vuxna exemplaret har kläckts i kontrollen.
|
Observationer
Kläckning
35.
|
Utvecklingstiden och totalantalet fullbildade han- och honmyggor bestäms. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner.
|
36.
|
Testkärlen bör granskas visuellt minst tre gånger i veckan för att bedöma förekomsten av onormalt beteende (t.ex. exemplar som lämnar sedimentet, ovanligt simmande) jämfört med kontrollen. Under perioden för förväntad kläckning är det nödvändigt att dagligen räkna antalet kläckta exemplar. Kön och antal fullbildade exemplar registreras dagligen. Efter identifiering avlägsnas myggorna från kärlen. Ägg som har deponerats före testets slutförande bör registreras och därefter avlägsnas för att förhindra att larver på nytt introduceras i sedimentet. Likaså ska registrering göras av antalet synliga puppor som inte har kläckts. Vägledning om övervakning av kläckning finns i tillägg 5.
|
Tillväxt och överlevnad
37.
|
Om det krävs data om överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod bör ytterligare testkärl införlivas från början, så att dessa därefter kan användas. Larverna i sedimentet från dessa tilläggskärl tillvaratas genom sållning med ett 250 μm-såll. Kriterierna för död är orörlighet eller utebliven reaktion på mekanisk stimulans. Larver som inte tillvaratas bör räknas som döda (larver som har dött i början av testet kan ha sönderdelats av mikrober). Torrvikten (askfri) för överlevande larver per testkärl bestäms och den genomsnittliga individuella torrvikten per kärl beräknas. Det är bra att bestämma vilket stadium överlevande larver tillhör, och för detta kan mätning av huvudkapselns bredd användas.
|
Analytiska mätningar
Testämnets koncentration
38.
|
Innan testet inleds, dvs. före tillsättning av larver, tas prover av bulksediment från minst ett kärl per behandling för analytisk bestämning av testämnets koncentration i sedimentet. Man bör åtminstone analysera prover av överliggande vatten, porvatten och sediment i början (se punkt 24) och i slutet av testet, för den högsta koncentrationen och en lägre koncentration. Dessa bestämningar av testämneskoncentrationen ger information om testämnets beteende/fördelning i vatten-sedimentsystemet.
|
39.
|
Om mellanliggande mätningar görs (t.ex. dag 7) och om det för analysen krävs stora prover som inte kan tas från testkärlen utan att testsystemet påverkas, bör de analytiska bestämningarna göras på prover som tas från extra testkärl som behandlas på samma sätt (inklusive förekomst av testorganismer) men som inte används för biologiska observationer.
|
40.
|
Centrifugering vid t.ex. 10 000 g och 4 °C i 30 minuter är det rekommenderade förfarandet för att isolera porvatten. Om det har demonstrerats att testämnet inte adsorberas på filter kan även filtrering godtas. I vissa fall är det kanske inte möjligt att analysera koncentrationerna i porvattnet därför att provet är för litet.
|
Fysikalkemiska parametrar
41.
|
Testkärlens pH och temperatur bör mätas på lämpligt sätt (se punkt 10). Hårdhet och ammonium bör mätas i kontrollerna och ett testkärl vid den högsta koncentrationen i början och slutet av testet.
|
DATA OCH RAPPORTERING
Behandling av resultaten
42.
|
Syftet med detta test är att bestämma testämnets effekt på utvecklingshastigheten och totalantalet fullbildade han- och honmyggor eller, om det gäller ett tiodagarstest, effekterna på larvernas överlevnad och vikt. Om det inte finns indikationer på statistiskt avvikande känslighet för hanar och honor, kan resultaten poolas för statistiska analyser. Känslighetsskillnaderna mellan hanar och honor kan bedömas statistiskt, t.ex. genom ett ”χ2-r × 2 table test”. Larvernas överlevnad och genomsnittlig individuell torrvikt per kärl måste bestämmas efter tio dagar där detta krävs.
|
43.
|
Effektkoncentrationerna uttryckta och baserade på torrvikt beräknas helst på grundval av uppmätta sedimentkoncentrationer vid testets början (se punkt 38).
|
44.
|
För att beräkna en punktvis uppskattning av EC50 eller något annat ECx-värde, kan statistiken per kärl användas som äkta replikat. Vid beräkning av konfidensintervallet för ett ECx-värde bör variansen mellan kärl beaktas, eller så bör man påvisa att variansen är så liten att den kan ignoreras. Om modellen anpassas med minsta kvadratmetoden bör transformation tillämpas på den kärlvisa statistiken i syfte att förbättra variansens homogenitet. ECx-värdena bör dock beräknas när responsen har transformerats tillbaka till det ursprungliga värdet.
|
45.
|
När syftet med den statistiska analysen är att bestämma NOEC/LOEC genom hypotestestning, måste variansen mellan kärl beaktas, t.ex. genom nästad ANOVA. Alternativt kan mer robust testning (21) vara lämplig i situationer där de vanliga ANOVA-antagandena inte gäller.
|
Kläckningsfrekvens
46.
|
Kläckningsfrekvenser är dikotoma (tvåpunktsfördelade) data och kan analyseras genom Cochran-Armitage test som tillämpas på step-down-grund där monoton dos-respons förväntas och dessa data stämmer överens med förväntningen. Om inte, kan Fishers exakta test eller ett Mantel-Haenszel-test med Bonferroni-Holm-korrigerade p-värden användas. Om det finns bevis på större variation mellan replikat inom samma koncentration än det som en binomial fördelning skulle indikera (ofta kallad extra-binomial fördelning), bör ett robust Cochran-Armitage-test eller Fischers exakta test användas, enligt det som föreslås i punkt 21.
Det totala antalet myggor som kläckts per kärl, ne, bestäms och divideras med antalet tillsatta larver, na enligt följande:
där:
ER
|
=
|
kläckningsfrekvens
|
ne
|
=
|
antalet myggor som kläckts per kärl
|
na
|
=
|
antalet larver som tillsatts per kärl
|
|
47.
|
Ett alternativ som bäst lämpar sig för stora provstorlekar, när det finns extra-binomial varians, är att behandla kläckningsfrekvensen som en kontinuerlig respons och använda förfaranden såsom William-test när monoton dos-respons förväntas och stämmer överens med dessa data för kläckningsfrekvens. Dunnett-test är lämpligt i fall där det inte är hållbart med monotonicitet. I detta sammanhang definieras begreppet ”stort prov” som ett prov där antalet kläckta och antalet inte kläckta överstiger fem, per replikatkärl.
|
48.
|
Vid användning av ANOVA-metoder bör värdena för kläckningsfrekvens först transformeras genom arcsin-sqrt-transformation eller Freeman-Tukeytransformation för att få en ungefärlig normalfördelning och jämna ut varianserna. Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (Bonferroni) eller Mantel-Haenszel-test kan användas när absoluta frekvenser används. För att göra arcsin-sqrt-transformation tar man inverterad sinus (sin–1) av kvadratroten av kläckningsfrekvensen.
|
49.
|
ECx-värden för kläckningsfrekvenser beräknas med regressionsanalys (t.ex. probit (22), logit, Weibull, lämplig kommersiell mjukvara eller dylikt). Om regressionsanalysen inte lyckas (om det t.ex. finns mindre än två partiella responser) används andra icke-parametriska metoder såsom glidande medelvärde eller enkel interpolering.
|
Utvecklingshastighet
50.
|
Med genomsnittlig utvecklingstid avses den genomsnittliga tidsomfattningen mellan tillsättning av larver (testdag 0) och kläckningen av den experimentella kohorten myggor (för beräkning av den faktiska utvecklingstiden bör man beakta larvernas ålder vid tillsättningstidpunkten). Värdet för utvecklingshastighet är det reciproka värdet av tidsenheten för utveckling (enhet: 1/dag) och representerar den andel larvutveckling som sker per dag. Utvecklingshastigheten är det mått som helst ska användas för utvärdering av dessa sedimenttoxicitetsstudier eftersom variansen är lägre och homogenare samt närmare normalfördelningen i jämförelse med utvecklingstiden. Kraftfulla parametriska testförfaranden kan alltså användas baserade på utvecklingshastighet hellre än på utvecklingstid. För utvecklingshastighet som en kontinuerlig respons kan ECx-värden uppskattas med hjälp av regressionsanalys (t.ex. (23), (24)).
|
51.
|
För efterföljande statistiska test antas antalet myggor observerade på inspektionsdag × ha kläckts i mitten av tidsintervallet mellan dag × och dag x-1 (l är inspektionsintervallets längd, i regel 1 dag). Genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl (x) beräknas enligt följande:
där:
|
:
|
genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl
|
i
|
:
|
index för inspektionsintervall
|
m
|
:
|
maximiantalet inspektionsintervall
|
|
:
|
antalet myggor som kläckts under inspektionsintervallet i
|
ne
|
:
|
totalantalet myggor som kläckts i slutet av experimentet (= )
|
xi
|
:
|
utvecklingshastigheten för myggor som kläckts under intervallet i
|
där:
dagi
|
:
|
inspektionsdag (dagar från appliceringen)
|
li
|
:
|
inspektionsintervallets längd i (dagar, i regel 1 dag)
|
|
Testrapport
52.
|
Testrapporten ska innehålla minst följande uppgifter:
|
Testämne:
—
|
Fysikalisk natur och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper (vattenlöslighet, ångtryck, fördelningskoefficient i jord (eller i sediment, om tillgänglig), stabilitet i vatten osv.).
|
—
|
Kemiska identifieringsdata (trivialnamn, kemiskt namn, strukturformel, CAS-nummer osv.) samt renhet och analysmetod för kvantifiering av testämnet.
|
|
|
Testarter:
—
|
Organismer som använts för testet: art, vetenskapligt namn, ursprung och odlingsbetingelser.
|
—
|
Information om hantering av äggmassor och larver.
|
—
|
Organismernas ålder när de tillförs testkärlen.
|
|
|
Testbetingelser:
—
|
Sediment som använts (naturligt eller syntetiskt).
|
—
|
För naturligt sediment, insamlingsplatsens belägenhet och beskrivning av sedimentet, inbegripet i mån av möjlighet föroreningshistoria och egenskaper: pH, halten organiskt kol, C/N-kvot och granulometri (om lämpligt).
|
—
|
Beredning av syntetiskt sediment: beståndsdelar och egenskaper (halten organiskt kol, pH, fukthalt osv. vid testets början).
|
—
|
Beredning av testvatten (om rekonstituerat vatten används) och egenskaper (syrehalt, pH, konduktivitet, hårdhet osv. vid testets början).
|
—
|
Sedimentets och överliggande vattnets djup.
|
—
|
Volymen för överliggande vatten och porvatten, vikten för vått sediment med och utan porvatten.
|
—
|
Testkärl (material och storlek).
|
—
|
Metod för spikning av sediment: testkoncentrationer, antalet replikat och, i förekommande fall, använt lösningsmedel.
|
—
|
Fasen för stabilisering av jämvikt i systemet med spikat sediment och vatten: varaktighet och betingelser.
|
—
|
Inkubationsbetingelser: temperatur, ljuscykel och intensitet samt luftning (frekvens och intensitet).
|
—
|
Detaljerad information om utfodringen, inklusive typ av foder, beredning, mängd och utfodringsschema.
|
|
|
Resultat:
—
|
Nominella testkoncentrationer, uppmätta testkoncentrationer och resultaten av alla analyser för bestämning av testämnets koncentration i testkärl.
|
—
|
Vattenkvaliteten i testkärlen – pH, temperatur, upplöst syre, hårdhet och ammonium.
|
—
|
Ersättning av avdunstat testvatten, i förekommande fall.
|
—
|
Antalet kläckta hon- och hanmyggor per kärl och dag.
|
—
|
Antalet larver som inte utvecklats till myggor, per kärl.
|
—
|
Genomsnittlig individuell torrvikt för larver per kärl och per stadium, om lämpligt.
|
—
|
Procentandel kläckta exemplar per replikat- och testkoncentration (han- och honmyggor poolade).
|
—
|
Genomsnittlig utvecklingshastighet för fullbildade myggor per replikat och behandlingsnivå (han- och honmyggor poolade).
|
—
|
Uppskattning av toxiska endpoints t.ex. ECx (och associerade konfidensintervall), NOEC och/eller LOEC och de statistiska metoder som använts för bestämning av dem.
|
—
|
Diskussion av resultaten, inbegripet inverkan på testresultatet som kan tillskrivas avvikelser från denna testmetod.
|
|
|
LITTERATUR
(1)
|
BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H.Köpp. Berlin 1995.
|
(2)
|
Fleming R. m.fl. 1994), ”Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances”, Slutlig rapport till Europeiska kommissionen, rapport nr EC 3738, augusti 1994, WRc, UK.
|
(3)
|
SETAC (1993), ”Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments”, WOSTA Workshop, Nederländerna.
|
(4)
|
ASTM International/E1706-00 (2002), ”Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, s. 1125–1241, ASTM International 2002 Annual Book of Standards, vol. 11.05, ”Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides”, ASTM International, West Conshohocken, PA.
|
(5)
|
Environment Kanada (1997), ”Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method”, Report SPE 1/RM/32, december 1997.
|
(6)
|
US-EPA (2000), ”Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, andra utgåvan, EPA 600/R-99/064, mars 2000, revidering av första utgåvan juni 1994.
|
(7)
|
US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), ”Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates”.
|
(8)
|
US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), ”Chironomid Sediment toxicity Test”.
|
(9)
|
Milani D., Day K. E., McLeay D. J. och Kirby R. S. (1996), ”Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius)” Technical Report, Environment Kanada, National Water Research Institute, Burlington, Ontario, Kanada.
|
(10)
|
Sugaya Y. (1997), ”Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui”, Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4), s. 345–350.
|
(11)
|
Kawai K. (1986), ”Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera)”, Jp. J. Sanit. Zool. 37 (1), s. 47–57.
|
(12)
|
OECD, 2000, ”Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures”, OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, Nr 23.
|
(13)
|
Environment Kanada (1995), ”Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant”, Report EPS 1/RM/30, september 1995.
|
(14)
|
Testmetod C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar.
|
(15)
|
Suedel B. C. och Rodgers J. H. (1994), ”Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing”, Environ. Toxicol. Chem. 13, s. 1163–1175.
|
(16)
|
Naylor C. och Rodrigues C., (1995), ”Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment”, Chemosphere 31, s. 3291–3303.
|
(17)
|
Dunnett C. W. (1964), ”A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control”, J. Amer. Statis. Assoc., 50, s. 1096–1121.
|
(18)
|
Dunnett C. W. (1964), ”New tables for multiple comparisons with a control”, Biometrics, 20, s. 482–491.
|
(19)
|
Williams D. A. (1971), ”A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control”, Biometrics, 27, s. 103–117.
|
(20)
|
Williams D. A. (1972), ”The comparison of several dose levels with a zero dose control”, Biometrics, 28, s. 510–531.
|
(21)
|
Rao J. N. K. och Scott A. J. (1992), ”A simple method for the analysis of clustered binary data”, Biometrics, 48, s. 577–585.
|
(22)
|
Christensen E. R. (1984), ”Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model”, Water Research 18, s. 213–221.
|
(23)
|
Bruce och Versteeg (1992), ”A statistical procedure for modelling continuous toxicity data”, Environmental Toxicology and Chemistry 11, s. 1485–1494.
|
(24)
|
Slob W. (2002), ”Dose-response modelling of continuous endpoints”, Toxicol. Sci. 66, s. 298–312.
|
Tillägg 1
DEFINITIONER
I denna testmetod gäller följande definitioner:
|
syntetiskt sediment: rekonstituerat, konstgjort sediment som är en blandning av material avsedda att efterlikna de fysiska beståndsdelarna i naturligt sediment.
|
|
överliggande vatten: det vatten som hålls ovanför sedimentet i testkärlet.
|
|
porvatten: det vatten som finns i mellanrummen mellan sediment- och jordpartiklar.
|
|
spikat sediment: sediment med tillsatt testämne.
|
|
testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.
|
Tillägg 2
Rekommendationer för odling av Chironomus riparius
1.
|
Chironomus-larver kan odlas i kristalliseringskärl eller stora behållare. Fin kvartssand sprids som ett tunt skikt på cirka 5–10 mm på behållarens botten. Även kiselgur (t.ex. Merck, Art. 8117) har visat sig vara ett lämpligt substrat (det räcker med ett tunt lager på några mm). Lämpligt vatten tillsätts till ett djup på flera cm. Vattennivåerna bör fyllas på efter behov för att ersätta avdunstning och förebygga uttorkning. Vattnet kan vid behov ersättas. Det bör finnas en skonsam luftning. De kärl som innehåller larver bör hållas i en lämplig bur som hindrar vuxna exemplar från att rymma. Buren bör vara tillräckligt stor för att de vuxna exemplaren ska kunna svärma, annars kan kopulation utebli (minimum är cirka 30 × 30 × 30 cm).
|
2.
|
Burarna ska hållas i rumstemperatur eller ett tempererat utrymme vid 20 ± 2 °C med en ljusperiod på 16 timmar (intensitet ca 1 000 lux) och 8 timmar mörker. Det har rapporterats att luftfuktighet under 60 % RH kan hämma reproduktion.
|
Utspädningsvatten
3.
|
Allt lämpligt naturligt eller syntetiskt vatten kan användas. Ofta används källvatten, avklorerat kranvatten och artificiella medier (t.ex. Elendt M4 eller M7, se nedan). Vattnet måste luftas före användningen. Vid behov kan odlingsvattnet förnyas genom att försiktigt hälla eller sifonera använt vatten från odlingskärlen utan att förstöra larvrören.
|
Utfodring av larver
4.
|
Chironomus-larverna ges fiskfoder i flingform (Tetra Min®, Tetra Phyll® eller motsvarande patenterat märke), cirka 250 mg per kärl och dag. Fodret kan ges i form av torrt malet pulver eller som suspension i vatten: 1,0 g flingfoder blandas med 20 ml utspädningsvatten till en homogen blandning. Beredningen kan ges med en dosering på cirka 5 ml per kärl och dag (skaka om före användning). Äldre larver kan få en större dos.
|
5.
|
Utfodringen justeras enligt vattenkvaliteten. Om odlingsmediet blir grumligt bör dosen sänkas. Foderdoseringen måste övervakas noggrant. För liten mängd leder till att larverna emigrerar mot vattenkolumnen och för stor mängd leder till ökad mikrobiell aktivitet och lägre syrekoncentrationer. Båda omständigheterna kan leda till minskad tillväxt.
|
6.
|
Även celler av vissa grönalger (t.ex. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kan tillsättas när nya odlingskärl läggs upp.
|
Utfodring av vuxna exemplar
7.
|
Vissa testutövare har föreslagit att bomullskompresser indränkta i mättad sukroslösning kan användas som foder för vuxna exemplar.
|
Kläckning
8.
|
Vid 20 ± 2 °C börjar vuxna exemplar kläckas i odlingskärlen efter cirka 13–15 dagar. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner.
|
Äggmassor
9.
|
När vuxna exemplar finns i odlingsburen bör alla larver i odlingskärlen kontrolleras tre gånger per vecka för att se om gelatinösa äggmassor har deponerats. Om sådana upptäcks, bör de avlägsnas försiktigt. Äggmassorna överförs till ett litet kärl som innehåller ett prov av odlingsvattnet. De används sedan för att starta nya odlingskärl (t.ex. 2–4 äggmassor per kärl) eller för toxicitetstest.
|
10.
|
Första stadiets larver bör kläckas efter 2–3 dagar.
|
Uppläggning av nya odlingskärl
11.
|
När odlingarna är etablerade bör det vara möjligt att lägga upp en färsk larvodling veckovis eller med längre intervall beroende på testningskraven, och avlägsna äldre kärl efter att vuxna myggor har kläckts. På detta sätt fås regelbunden tillgång till vuxna exemplar med minimal insats.
|
Beredning av testlösningarna M4 och M7
12.
|
M4-mediet upptäcktes av Elendt (1990). M7-mediet bereds på samma sätt som M4-mediet med undantag för de ämnen som anges i tabell 1, för vilka koncentrationerna är fyra gånger lägre i M7 jämfört med M4. En publikation om M7-mediet är under arbete (Elendt, personlig kommunikation). Testlösningen ska inte beredas enligt Elendt och Bias (1990) eftersom de angivna koncentrationerna av NaSiO3·5H2O, NaNO3, KH2PO4 och K2HPO4 inte är lämpliga.
|
Beredning av M7-medium
13.
|
Varje stamlösning (I) bereds individuellt och en kombinerad stamlösning (II) bereds av dessa stamlösningar (I) (se tabell 1). 50 ml av den kombinerade stamlösningen (II) och de mängder av varje stamlösning med makronäring som anges i tabell 2 och avjoniserat vatten tillsätts upp till 1 liter för att bereda M7-mediet. En stamlösning med vitaminer bereds genom att tillsätta tre vitaminer till avjoniserat vatten enligt tabell 3, och 0,1 ml av den kombinerade vitaminstamlösningen tillsätts till det slutliga M7-mediet strax före användningen (vitaminstamlösningen förvaras djupfryst i små alikvoter). Mediet luftas och stabiliseras.
|
LITTERATUR
BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. Berlin 1995.
Tabell 1
Stamlösningar av spårelement för M4- och M7-medium
Stamlösningar (I)
|
Mängd (mg) som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten
|
Beredning av kombinerad stamlösning (II): blanda följande mängder (ml) stamlösning (I) och bygg upp till 1 liter med avjoniserat vatten
|
Slutliga koncentrationer i testlösningarna (mg/l)
|
M4
|
M7
|
M4
|
M7
|
H3BO3
(15)
|
57 190
|
1,0
|
0,25
|
2,86
|
0,715
|
MnCl2 · 4H2O (15)
|
7 210
|
1,0
|
0,25
|
0,361
|
0,090
|
LiCl (15)
|
6 120
|
1,0
|
0,25
|
0,306
|
0,077
|
RbCl (15)
|
1 420
|
1,0
|
0,25
|
0,071
|
0,018
|
SrCl2 · 6H2O (15)
|
3 040
|
1,0
|
0,25
|
0,152
|
0,038
|
NaBr (15)
|
320
|
1,0
|
0,25
|
0,016
|
0,004
|
Na2MoO4 · 2H2O (15)
|
1 260
|
1,0
|
0,25
|
0,063
|
0,016
|
CuCl2 · 2H2O (15)
|
335
|
1,0
|
0,25
|
0,017
|
0,004
|
ZnCl2
|
260
|
1,0
|
1,0
|
0,013
|
0,013
|
CaCl2 · 2H6O
|
200
|
1,0
|
1,0
|
0,010
|
0,010
|
KI
|
65
|
1,0
|
1,0
|
0,0033
|
0,0033
|
Na2SeO3
|
43,8
|
1,0
|
1,0
|
0,0022
|
0,0022
|
NH4VO3
|
11,5
|
1,0
|
1,0
|
0,00058
|
0,00058
|
Na2EDTA · 2H2O (15)
(16)
|
5 000
|
20,0
|
5,0
|
2,5
|
0,625
|
FeSO4 · 7H2O (15)
(16)
|
1 991
|
20,0
|
5,0
|
1,0
|
0,249
|
Tabell 2
Stamlösningar med makronäringsämnen för medium M4 och M7
|
Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten
(mg)
|
Mängd stamlösning med makronäringsämnen som tillsätts för att bereda medium M4 och M7
(ml/l)
|
Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7
(mg/l)
|
CaCl2 · 2H2O
|
293 800
|
1,0
|
293,8
|
MgSO4 · 7H2O
|
246 600
|
0,5
|
123,3
|
KCl
|
58 000
|
0,1
|
5,8
|
NaHCO3
|
64 800
|
1,0
|
64,8
|
NaSiO3 · 9H2O
|
50 000
|
0,2
|
10,0
|
NaNO3
|
2 740
|
0,1
|
0,274
|
KH2PO4
|
1 430
|
0,1
|
0,143
|
K2HPO4
|
1 840
|
0,1
|
0,184
|
Tabell 3
Stamlösningar med vitaminer för medium M4 och M7 Alla tre vitaminlösningar kombineras till en enda vitaminstamlösning.
|
Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten
(mg)
|
Mängd stamlösning med vitaminer som tillsätts för att bereda medium M4 och M7
(ml/l)
|
Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7
(mg/l)
|
Tiaminhydroklorid
|
750
|
0,1
|
0,075
|
Cyanokobalamin (B12)
|
10
|
0,1
|
0,0010
|
Biotin
|
7,5
|
0,1
|
0,00075
|
LITTERATUR
Elendt, B. P. (1990), ”Selenium Deficiency in Crustacean”, Protoplasma 154, s. 25–33.
Elendt, B. P. och W. R. Bias (1990), ”Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna”, Water Research 24 (9), s. 1157–1167.
Tillägg 3
BEREDNING AV SYNTETISKT SEDIMENT
Sedimentsammansättning
Syntetiskt sediment ska ha följande sammansättning:
Beståndsdel
|
Egenskaper
|
% av sedimentets
torrvikt
|
Torv
|
Sphagnum, så nära pH 5,5–6 som möjligt utan synliga växtrester och finfördelad (partikelstorlek ≤1 mm) och lufttorkad.
|
4–5
|
Kvartssand
|
Partikelstorlek: > 50 % av partiklarna bör ha storlek inom området 50–200 μm
|
75–76
|
Kaolinitlera
|
Kaolinithalt ≥ 30 %
|
20
|
Organiskt kol
|
Justeras genom tillsats av torv och sand
|
2 (± 0,5)
|
Kalciumkarbonat
|
CaCO3, pulveriserat, kemiskt rent
|
0,05–0,1
|
Vatten
|
Konduktivitet ≤ 10 μS/m
|
30–50
|
Beredning
Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver. En suspension av behövlig mängd torvpulver i avjoniserat vatten bereds med effektiv homogeniseringsapparat. Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneras minst två dagar med skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C, för att stabilisera pH och etablera en stabil mikrobiell komponent, varefter pH uppmäts på nytt och bör vara 6,0 ± 0,5. Torvsuspensionen blandas sedan med de övriga beståndsdelarna (sand och kaolinlera) och avjoniserat vatten till ett homogent sediment med en vattenhalt som ger kring 30–50 procent torrvikt av sediment. Därefter mäts den slutliga blandningens pH på nytt och justeras vid behov till 6,5–7,5 med CaCO3. Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten organiskt kol. Likaså rekommenderas att det syntetiska sediment som ska användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras före användningen i sju dagar i samma betingelser som råder i det efterföljande testet.
Förvaring
De torra beståndsdelarna för beredning av syntetiskt sediment kan lagras i ett torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Berett (vått) sediment ska inte lagras för användning i test. Det bör användas omedelbart efter den 7 dagar långa konditioneringsperioden i slutet av beredningen.
LITTERATUR
Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar.
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), ”Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media”, Ecotox. and Environ. Safety 39, s. 10–20.
Tillägg 4
Krav på kemiska egenskaper hos utspädningsvatten
Ämne
|
Koncentrationer
|
Partikelinnehåll
|
< 20 mg/l
|
Totalt organiskt kol
|
< 2 mg/l
|
Ojoniserad ammoniak
|
< 1 μg/l
|
Hårdhet som CaCO3
|
< 400 mg/l (17)
|
Restklor
|
< 10 μg/l
|
Bekämpningsmedel med organiska fosforföreningar, totalt.
|
< 50 ng/l
|
Bekämpningsmedel med organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler, totalt.
|
< 50 ng/l
|
Totalt organiskt klor
|
< 25 ng/l
|
Tillägg 5
Vägledning för övervakning av kläckning av chironomider
Fällor placeras på testbägarna. Dessa fällor behövs från dag 20 fram till testets slut. Exempel på en fälla visas nedan.
A: nylonnät
B: upp-och-nedvänd plastkopp
C: exponeringskärl utan läpp
D: filterportar för vattenutbyte
E: vatten
F: sediment
C. 28 TOXICITETSTEST I SEDIMENT- OCH VATTENFAS PÅ CHIRONOMID-LARVER MED SPIKAT VATTEN
INLEDNING
1.
|
Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 219 (2004). Syftet med testmetoden är att bedöma effekterna av långvarig kemikalieexponering på sedimentlevande larver i sötvatten av fjädermyggor Chironomus sp. Den baserar sig i huvudsak på BBA-vägledningen med ett sediment-vatten-testsystem med syntetisk jord och vattenkolumnexponering (1). Metoden beaktar också existerande toxicitetstestprotokoll för Chironomus riparius och Chironomus tentans som har tagits fram i Europa och Förenta staterna (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) och ringtestats (1) (6) (9). Även övriga väldokumenterade chironomider kan användas, t.ex. Chironomus yoshimatsui (10) (11).
|
2.
|
Exponeringen i denna testmetod görs med spikat vatten. Valet av lämpligt exponeringsscenario beror på den avsedda tillämpningen för testet. Vattenexponeringen med spikad vattenkolumn är avsedd att simulera vindavdrift av bekämpningsmedel och täcker den inledande toppkoncentrationen i porvatten. Metoden är också användbar för andra typer av exponering (inklusive kemikaliespill), med undantag för ackumuleringsprocesser som är längre än testperioden.
|
3.
|
Ämnen som behöver testas på sedimentlevande organismer är sådana som i allmänhet blir kvar i sedimentet under långa tidsperioder. De sedimentlevande organismerna kan exponeras via ett antal rutter. Den relativa betydelsen av varje exponeringsrutt och den tid det tar för var och en av dem att bidra till de totala toxiska effekterna beror på den berörda kemikaliens fysikalkemiska egenskaper. För starkt adsorberande ämnen (t.ex. log Kow > 5) eller för ämnen som binds kovalent till sedimentet, kan förtäring av förorenad föda vara en betydande exponeringsrutt. För att toxiciteten hos starkt lipofila ämnen inte ska underskattas kan tillsättning av föda till sedimentet före applicering av testämnet övervägas. För att alla potentiella exponeringsrutter ska beaktas har denna testmetod fokus på långvarig exponering. Testets längd är 20–28 dagar för C. riparius och C. yoshimatsui och 28–65 dagar för C. tentans. Om korttidsdata krävs för ett specifikt ändamål, t.ex. för att undersöka effekterna av instabila kemikalier, kan tilläggsreplikat avlägsnas efter tio dagar.
|
4.
|
De endpoints som mäts är det totala antalet kläckta vuxna exemplar och utvecklingstiden fram till kläckning. Det rekommenderas att mätningar av larvernas överlevnad och tillväxt endast görs efter en tiodagarsperiod i fall där ytterligare korttidsdata krävs, med användning av ytterligare replikat enligt vad som är lämpligt.
|
5.
|
För detta test rekommenderas syntetiskt sediment. Syntetiskt sediment har flera fördelar jämfört med naturliga sediment:
—
|
Variationen mellan testningar reduceras eftersom syntetiskt sediment bildar en reproducerbar ”standardmatris”, och behovet av att få fram oförorenade och rena sediment elimineras.
|
—
|
Testningen kan inledas när som helst utan att beakta säsongvariationer i testsedimentet och det behövs ingen förbehandling av sediment för att få bort naturligt förekommande fauna. När syntetiskt sediment används uppstår heller inte kostnader för insamling på fältet av tillräckliga mängder sediment för rutintestning.
|
—
|
Användning syntetiskt sediment ger möjlighet till jämförelser av toxicitet och därmed klassificering av ämnen. Toxicitetsdata från tester med naturliga och syntetiska sediment har visat sig vara jämförbara för flera kemikalier (2).
|
|
6.
|
Definitioner finns i tillägg 1.
|
PRINCIP FÖR TESTMETODEN
7.
|
Första stadiets chironomidlarver exponeras för ett urval koncentrationer av testämnet i ett sediment-vattensystem. Testet inleds genom att tillsätta första stadiets larver i testbägare som innehåller ett sediment-vatten-system och därefter spika vattnet med testämnet. Kläckning av fullbildade myggor och utvecklingshastighet mäts i slutet av testet. Överlevande larver och deras vikt kan också mätas efter tio dagar om så krävs (med användning av ytterligare replikat enligt det som är lämpligt). Dessa data analyseras med användning av en regressionsmodell för att uppskatta den koncentration som skulle orsaka × % minskning av antalet fullbildade myggor eller av larvernas överlevnad eller tillväxt (EC15, EC50 osv.) eller genom användning av statistisk hypotesprövning för att bestämma NOEC/LOEC. För hypotesprövningen krävs en jämförelse mellan effektvärden och kontrollvärden med användning av statistiska test.
|
INFORMATION OM TESTÄMNET
8.
|
Testämnets vattenlöslighet, ångtryck, uppmätt eller beräknad fördelning i sedimentet samt stabilitet i vatten och sediment bör vara kända. Det bör finnas en tillförlitlig analysmetod för kvantifiering av testämnet i överliggande vatten, porvatten och sediment med känd och rapporterad exakthet och detektionsgräns. Det är också bra att känna till testämnets strukturformel och renhet. Hur testämnet agerar kemiskt (t.ex. upplösning, abiotisk och biotisk nedbrytning osv.) hör också till den information som är användbar. Närmare vägledning för testning av ämnen vars fysikalkemiska egenskaper gör det svårt att genomföra detta test finns i (12).
|
REFERENSKEMIKALIER
9.
|
Referenskemikalier kan testas periodiskt för att säkerställa att testprotokollet och testbetingelserna är tillförlitliga. Exempel på toxiska referensämnen som med framgång har använts i ringtest och valideringsstudier är lindan, trifluranid, pentaklorfenol, kadmiumklorid och kaliumklorid (1) (2) (5) (6) (13).
|
TESTETS GILTIGHET
10.
|
För att testet ska vara giltigt gäller följande villkor:
—
|
Kläckningen av vuxna exemplar i kontrollkärlen måste vara minst 70 % i slutet av testet (1) (6).
|
—
|
Kläckningen av vuxna exemplar av C. riparius och C. yoshimatsui i kontrollkärlen bör inträffa 12–24 dagar efter att de har införts i kärlen, för C. tentans krävs en period på 20–65 dagar.
|
—
|
Vid slutet av testet bör pH och koncentrationen upplöst syre mätas i varje kärl. Syrekoncentrationen bör vara minst 60 % av luftmättnadsvärdet (ASV) vid den använda temperaturen och pH i överliggande vatten bör vara 6–9 i alla testkärl.
|
—
|
Variationen i vattentemperatur får inte vara större än ± 1,0 °C. Vattentemperaturen kan kontrolleras genom att göra testningen i ett isotermiskt utrymme, varvid rumstemperaturen bör kontrolleras med lämpliga tidsintervall.
|
|
METODBESKRIVNING
Testkärl
11.
|
Testet görs i 600 ml-glasbägare med 8 cm i diameter. Även andra slags kärl kan användas, men då måste det gå att garantera att överliggande vatten och sediment har lämpliga djup. Sedimentytan bör vara tillräckligt stor för att ge 2–3 cm2 per larv. Förhållandet mellan sedimentskiktets djup och överliggande vattnets djup bör vara 1:4. Testkärl och annan apparatur som kommer i kontakt med testsystemet bör vara gjorda av glas eller annat kemiskt inert material (t.ex. teflon).
|
Val av arter
12.
|
Den art som används i testet ska helst vara Chironomus riparius. Chironomus tentans kan också vara lämplig, men den är svårare att hantera och kräver en längre testperiod. Även Chironomus yohimatsui kan användas. I tillägg 2 finns närmare uppgifter om odlingsmetoder för Chironomus riparius. Information om odlingsbetingelser finns också för andra arter, t.ex. Chironomus tentans (4) och Chironomus yoshimatsui (11). Arternas identifiering måste bekräftas före testningen men är inte nödvändig före varje test om organismerna härrör från en odling inom laboratoriet.
|
Sediment
13.
|
Helst ska syntetiskt sediment användas. Om naturligt sediment används bör dess egenskaper bestämmas (minst pH, halten organiskt kol, och gärna även andra parametrar såsom förhållandet C/N och granulometri). Sedimentet måste även vara fritt från föroreningar och andra organismer som kan konkurrera med eller konsumera chironomiderna. Dessutom rekommenderas att naturligt sediment som är avsett att användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras i sju dagar under samma betingelser som råder i det efterföljande testet. Följande syntetiska sediment, baserat på den syntetiska jord som används i testmetod C.8 (14) rekommenderas för detta test (1) (15) (16):
a)
|
4–5 % (torrvikt) torv så nära pH 5,5–6 som möjligt; det är viktigt att använda endast lufttorkad och finmalen torv i pulverform (partikelstorlek ≤ 1 mm).
|
b)
|
20 % (torrvikt) kaolinlera (kaolinithalt helst över 30 %).
|
c)
|
75–76 % (torrvikt) kvartssand (till största del bestående av fin sand där mer än 50 % av partiklarna har storleken 50–200 μm).
|
d)
|
Avjoniserat vatten tillsätt så att blandningen får en slutlig fukthalt på 30–50 %.
|
e)
|
Kemiskt rent kalciumkarbonat CaCO3) tillsätts för att justera den slutliga sedimentblandningens pH till 7,0 ± 0,5.
|
f)
|
Den slutliga blandningens kolhalt bör vara 2 % ± 0,5 % och kan justeras med hjälp av lämpliga mängder torv och sand, enligt punkterna a och c.
|
|
14.
|
Torv, kaolinlera och sand ska härröra från kända källor. Sedimentkomponenterna bör kontrolleras för att bekräfta avsaknaden av kemiska föroreningar (t.ex. tungmetaller, organiska klorföreningar, organiska fosforföreningar osv.) Ett exempel på hur syntetiskt sediment kan tillredas beskrivs i tillägg 3. Det är också godtagbart att blanda torra beståndsdelar om det går att demonstrera att tillsats av överliggande vatten inte leder till att sedimentets beståndsdelar separerar (t.ex. flytande torvpartiklar) och att torven eller sedimentet konditioneras tillräckligt.
|
Vatten
15.
|
Allt vatten som uppfyller de kemiska kriterierna för godtagbart utspädningsvatten (se tilläggen 2 och 4) är lämpligt som testvatten. Allt lämpligt vatten, naturligt vatten (ytvatten eller grundvatten), rekonstituerat vatten (se tillägg 2) och avklorerat kranvatten är godtagbart som odlings- och testvatten om chironomiderna överlever i det under odling, acklimatisering och testning utan att uppvisa tecken på stress. Vid teststart ska testvattnets pH vara mellan 6 och 9 och totalhårdheten får inte vara högre än 400 mg/l uttryckt som CaCO3. Om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och testämnet, bör vatten med lägre hårdhet användas (i en sådan situation får Elendt Medium M4 inte användas). Samma typ av vatten bör användas under hela testningen. De vattenkvalitetsegenskaper som förtecknas i tillägg 4 bör mätas minst två gånger om året eller om man misstänker att egenskaperna har ändrats betydligt.
|
Stamlösningar – spikat vatten
16.
|
Testkoncentrationerna beräknas på grundval av vattenkolumnens koncentrationer, dvs. det vatten som ligger över sedimentet. Testlösningar för de valda koncentrationerna bereds i regel genom utspädning av en stamlösning. Stamlösningarna ska helst beredas genom upplösning av testämnet i ett testmedium. I vissa fall kan det krävas lösningsmedel eller dispergeringsmedel för att få en stamlösning med lämplig koncentration. Exempel på lämpliga lösningsmedel är aceton, etanol, metanol, etylenglykolmonoetyleter, etylenglykoldimetyleter, dimetylformamid och trietylenglykol. Dispergeringsmedel som kan användas är Cremofor RH40, Tween 80, metylcellulosa 0,01 % och HCO-40. Lösningsmedlets koncentration i det slutliga testmediet bör vara minimal (t.ex. ≤ 0,1 ml/l) och bör vara samma för alla behandlingar. Om lösningsmedel används, får det inte ha någon betydande effekt på överlevnad eller synliga skadliga effekter på chironomidlarverna, vilket kan verifieras genom en kontroll med enbart lösningsmedel. Man bör dock in i det sista undvika att använda dessa medel.
|
TESTETS UTFORMNING
17.
|
Testets utformning avser antalet koncentrationer och intervallen mellan dem, antalet kärl per koncentration och antalet larver per kärl. Här beskrivs utformningar för uppskattning av effektkoncentration, uppskattning av NOEC och för gränstest. Regressionsanalys rekommenderas för att testa hypotesen.
|
Utformning för regressionsanalys
18.
|
Effektkoncentrationen (t.ex. EC15, EC50) och det koncentrationsområde som är relevant för testämnet bör omfattas av de koncentrationer som ingår i testet. Allmänt taget gäller att exaktheten och särskilt giltigheten för uppskattningar av effektkoncentrationer (ECx) förbättras när effektkoncentrationen ligger inom området för de koncentrationer som testas. Extrapolering under lägsta positiva koncentration eller över högsta koncentration bör undvikas. Preliminära test kan användas för att hitta rätt koncentrationsområde (se punkt 27).
|
19.
|
Om ECx ska uppskattas bör testet omfatta minst fem koncentrationer och tre replikat för varje koncentration. Det är under alla omständigheter tillrådligt att använda tillräckligt många testkoncentrationer för att få en god modelluppskattning. Faktorn mellan koncentrationer bör inte vara större än två (undantag kan göras i fall där dos-responskurvan har liten lutning). Antalet replikat per behandling kan minskas om antalet testkoncentrationer med olika respons ökas. En ökning av antalet replikat eller minskning av testkoncentrationsintervall tenderar att leda till ett smalare konfidensintervall för testet. Ytterligare replikat krävs om en uppskattning ska göras av larvernas överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod.
|
Upplägg för uppskattning av NOEC/NOEC
20.
|
Om LOEC eller LOEC ska uppskattas bör det finnas fem testkoncentrationer med minst fyra replikat och faktorn mellan koncentrationerna får inte vara större än två. Antalet replikat bör vara tillräckligt för att säkerställa tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). För uppskattning av utvecklingshastighet är det i regel lämpligt med variansanalys (ANOVA), såsom Dunnets eller Williams test (17) (18) (19) (20). För kläckningsfrekvens kan ett Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (med Bonferronikorrigering) eller ett Mantel-Haenszel-test användas.
|
Gränstest
21.
|
Gränstest kan göras (en testkoncentration och kontroll) om inga effekter framkommit vid det preliminära testet för att fastställa testområde. Syftet med gränstest är att få indikation om att testämnets toxiska värde är högre än den testade gränskoncentrationen. Inga förslag på rekommenderade koncentrationer kan ges i denna testmetod, utan frågan måste bedömas av tillsynsmyndigheterna. I regel krävs minst sex replikat både för behandling och kontroll. Man måste kunna demonstrera tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). Eftersom t-test ger kvantitativ respons (utvecklingshastighet och vikt) är t-test en lämplig statistisk metod förutsatt att data uppfyller testkraven (normalitet, homogena varianser osv.). Om dessa krav inte uppfylls kan man använda t-testet med olika varians eller ett icke-parametriskt test, såsom Wilcoxon-Mann-Whitneys test. För kläckningsfrekvens är det lämpligt att använda Fischers exakta test.
|
FÖRFARANDE
Exponeringsbetingelser
Beredning av systemet med spikat vatten och sediment
22.
|
Lämpliga mängder syntetiskt sediment (se punkterna 13 och 14 och tillägg 3) tillförs testkärlet så att det bildas ett lager på minst 1,5 cm. Vatten tillsätts till ett djup på 6 cm (se punkt 15). Förhållandet mellan sedimentskiktets djup och vattenskiktets djup ska inte överskrida 1:4 och sedimentskiktet ska inte vara djupare än 3 cm. Systemet sediment-vatten bör hållas under skonsam luftning i sju dagar före tillsats av testorganismer (se punkt 14 och tillägg 3). För att undvika separation av sedimentets beståndsdelar och återsuspension av finfördelat material medan testvatten tillsätts i vattenkolumnen, kan sedimentet täckas med en plastplatta medan vattnet tillsätts, varefter plattan avlägsnas omedelbart. Även andra metoder kan vara lämpliga.
|
23.
|
Testkärlen bör vara täckta (t.ex. med glasplattor). Vid behov fylls under testets gång vatten på till ursprunglig volym för att kompensera för avdunstning. Detta bör göras med destillerat eller avjoniserat vatten för att förebygga ackumulering av salter.
|
Tillförsel av testorganismer
24.
|
Fyra till fem dagar innan testorganismerna tillförs testkärlen ska äggmassorna avlägsnas från odlingarna och placeras i små kärl i odlingsmedium. Åldrat medium från stamodling eller färskt berett medium kan användas. Om färskt medium används bör en liten mängd föda, t.ex. grönalger och/eller några droppar filtrat från en finmald suspension av fiskfoder i flingform tillsättas odlingsmediet (se tillägg 2). Endast färska äggmassor får användas. I regel börjar larverna kläckas några dagar efter att äggen har lagts (2–3 dagar för Chironomus riparius vid 20 °C och 1–4 dagar för Chironomus tentans vid 23 °C och Chironomus yoshimatsui vid 25 °C), och larvernas tillväxt sker i fyra stadier på 4–8 dagar per stadium. För testet ska första stadiets larver användas (2–3 eller 1–4 dagar efter kläckningen). Bestämning av larvstadium kan möjligen göras genom mätning av huvudkapseldiameter (6).
|
25.
|
Tjugo första stadiets larver fördelas slumpvis till varje testkärl som innehåller spikat sediment och vatten, med användning av en trubbig pipett. Luftningen av vattnet måste stoppas medan larverna tillsätts testkärlen och hållas stoppad i ytterligare 24 timmar efter tillsättningen (se punkterna 24 och 32). Enligt det testupplägg som används (se punkterna 19 och 20) är antalet larver per testkoncentration minst 60 för uppskattning av EC-punkt och 80 för bestämning av NOEC.
|
26.
|
Tjugofyra timmar efter tillsättning av larverna spikas den överliggande vattenkolumnen med testämnet, och en lätt luftning införs på nytt. Små volymer av testämnet tillsätts under vattenytan med hjälp av en pipett. Därefter görs försiktig omrörning av det överliggande vattnet utan att störa sedimentet.
|
Testkoncentrationer
27.
|
Ett preliminärt test kan användas för att fastställa koncentrationerna för det definitiva testet. För detta ändamål används en serie brett spridda koncentrationer av testämnet. För att få samma ytdensitet per chironomid som ska användas för det slutliga testet, exponeras chironomiderna för varje koncentration av testämnet under en period som ger möjlighet att uppskatta lämpliga testkoncentrationer. Inga replikat krävs.
|
28.
|
Testkoncentrationerna för det definitiva testet baseras på resultaten från det preliminära testet. Det ska finnas minst fem testkoncentrationer som väljs enligt beskrivningen i punkterna 18–20.
|
Kontrollkärl
29.
|
Kontrollkärl som inte innehåller testämne utan enbart sediment bör ingå i testet med lämpligt antal replikat (se punkterna 19–20). Om lösningsmedel har använts för applicering av testämnet (se punkt 16) bör det också finnas kontrollkärl med sediment och lösningsmedel.
|
Testsystem
30.
|
De system som används är statiska. Semistatiska system eller genomflödessystem med intermittent eller kontinuerlig förnyelse av överliggande vatten kan användas i undantagsfall, t.ex. om vattenkvalitetsspecifikationerna inte är lämpliga för testorganismen eller påverkar den kemiska jämvikten (t.ex. om syrenivåerna blir för låga, koncentrationen av utsöndrade produkter blir för hög eller om mineraler som släpps ut från sediment påverkar pH och/eller vattenhårdheten). I regel är det dock tillräckligt och rekommendabelt att använda andra metoder för kompensering av kvaliteten på överliggande vatten, såsom luftning.
|
Foder
31.
|
Larverna bör ges foder helst dagligen eller minst tre gånger per vecka. Fiskfoder (suspension i vatten eller finmalt foder, t.ex. Tetra-Min eller Tetra-Phyll, se närmare i tillägg 2) i mängder om 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg för C. yoshimatsui) per larv per dag anses vara lämpligt för unga larver under de tio första dagarna. För äldre larver kan det krävas lite större mängd: 0,5–1 mg per larv och dag bör vara tillräckligt för återstoden av testet. Mängden bör minskas för alla behandlingar och kontroller om det uppstår svamptillväxt eller mortalitet observeras i kontrollerna. Om svamptillväxten inte kan stoppas måste testet upprepas. Vid testning av starkt adsorberande ämnen (t.ex. log Kow > 5) eller ämnen som är kovalent bundna till sedimentet, kan mängden foder som krävs för att säkerställa överlevnad och naturlig tillväxt för organismerna tillsättas i det syntetiska sedimentet före stabiliseringsperioden. Då ska växtmaterial användas i stället för fiskfoder, t.ex. 0,5 % (torrvikt) finmalda löv från t.ex. brännässla (Urtica dioica), mullbär (Morus alba), vitklöver (Trifolium repens), spenat (Spinacia oleracea) eller annat växtmaterial (Cerophyl eller alfacellulosa).
|
Inkubationsbetingelser
32.
|
Skonsam luftning av överliggande vatten i testkärlen införs helst 24 timmar efter tillsättning av larverna och får pågå genom hela testet (se till att halten upplöst syre inte faller under 60 % av luftmättnadsvärdet ASV). Luftningen görs med hjälp av en Pasteur-glaspipett som är fäst 2–3 cm ovanför sedimentskiktet (en eller ett fåtal bubblor per sekund). Vid testning av flyktiga kemikalier kan man överväga att utesluta luftning av sediment-vattensystemet.
|
33.
|
Testet genomförs vid konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). För C. tentans och C. yoshimatsui rekommenderas temperaturer på 23 °C respektive 25 °C (± 2 °C). En ljusperiod på 16 timmar används och ljusintensiteten ska vara 500–1 000 lux.
|
Exponeringstid
34.
|
Exponeringen inleds när larver tillsätts i spikade kärl och kontrollkärl. Den maximala exponeringstiden är 28 dagar för C. riparius och C. yoshimatsui och 65 dagar för C. tentans. Om myggor kläcks tidigare, kan testet avslutas efter minst fem dagar efter att det sista vuxna exemplaret har kläckts i kontrollen.
|
OBSERVATIONER
Kläckning
35.
|
Utvecklingstiden och totalantalet fullbildade han- och honmyggor bestäms. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner.
|
36.
|
Testkärlen bör granskas visuellt minst tre gånger i veckan för att bedöma förekomsten av onormalt beteende (t.ex. exemplar som lämnar sedimentet, ovanligt simmande) jämfört med kontrollen. Under perioden för förväntad kläckning är det nödvändigt att dagligen räkna antalet kläckta exemplar. Kön och antal fullbildade exemplar registreras dagligen. Efter identifiering avlägsnas myggorna från kärlen. Ägg som har deponerats före testets slutförande bör registreras och därefter avlägsnas för att förhindra att larver på nytt introduceras i sedimentet. Likaså ska registrering göras av antalet synliga puppor som inte har kläckts. Vägledning om övervakning av kläckning finns i tillägg 5.
|
Tillväxt och överlevnad
37.
|
Om det krävs data om överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod bör ytterligare testkärl införlivas från början, så att dessa därefter kan användas. Larverna i sedimentet från dessa tilläggskärl tillvaratas genom sållning med ett 250 μm-såll. Kriterierna för död är orörlighet eller utebliven reaktion på mekanisk stimulans. Larver som inte tillvaratas bör räknas som döda (larver som har dött i början av testet kan ha sönderdelats av mikrober). Torrvikten (askfri) för överlevande larver per testkärl bestäms och den genomsnittliga individuella torrvikten per kärl beräknas. Det är bra att bestämma vilket stadium överlevande larver tillhör, och för detta kan mätning av huvudkapselns bredd användas.
|
Analytiska mätningar
Testämnets koncentration
38.
|
Som ett minimum bör prover av överliggande vatten, porvatten och sediment analyseras i början (helst inom en timme från tillsats av testämne) och i slutet av testet, för den högsta koncentrationen och för en lägre koncentration. Dessa bestämningar av testämneskoncentration ger information om testsubstansens beteende/fördelning i vatten-sedimentsystemet. Provtagning av sediment vid testets början kan påverka testsystemet (t.ex. genom att larver avlägsnas) och därför måste ytterligare testkärl användas för analytiska bestämningar vid testets start samt under testets gång om så är lämpligt (se punkt 39). Mätningar i sedimentet är eventuellt inte nödvändiga om fördelningen av testämnet mellan vatten och sediment har fastställts tydligt under motsvarande betingelser (t.ex. förhållandet mellan sediment och vatten, typ av applicering, sedimentets halt av organiskt kol).
|
39.
|
Om mellanliggande mätningar görs (t.ex. dag 7) och om det för analysen krävs stora prover som inte kan tas från testkärlen utan att testsystemet påverkas, bör de analytiska bestämningarna göras på prover som tas från extra testkärl som behandlas på samma sätt (inklusive förekomst av testorganismer) men som inte används för biologiska observationer.
|
40.
|
Centrifugering vid t.ex. 10 000 g och 4 °C i 30 minuter är det rekommenderade förfarandet för att isolera porvatten. Om det har demonstrerats att testämnet inte adsorberas på filter kan även filtrering godtas. I vissa fall är det kanske inte möjligt att analysera koncentrationerna i porvattnet därför att provet är för litet.
|
Fysikalkemiska parametrar
41.
|
Mätning bör göras av pH, upplöst syre i vattnet och temperatur i testkärlen på lämpligt sätt (se punkt 10). Hårdhet och ammonium bör mätas i kontrollerna och ett testkärl vid den högsta koncentrationen i början och slutet av testet.
|
DATA OCH RAPPORTERING
Behandling av resultaten
42.
|
Syftet med detta test är att bestämma testämnets effekt på utvecklingshastigheten och totalantalet fullbildade han- och honmyggor eller, om det gäller ett tiodagarstest, effekterna på larvernas överlevnad och vikt. Om det inte finns indikationer på statistiskt avvikande känslighet för hanar och honor, kan resultaten poolas för statistiska analyser. Känslighetsskillnaderna mellan hanar och honor kan bedömas statistiskt t.ex. genom ”χ2-r × 2 table test”. Larvernas överlevnad och genomsnittlig individuell torrvikt per kärl måste bestämmas efter tio dagar där detta krävs.
|
43.
|
Effektkoncentrationerna uttryckta som koncentrationer i överliggande vatten beräknas helst på grundval av uppmätta sedimentkoncentrationer vid testets början (se punkt 38).
|
44.
|
För att beräkna en punktvis uppskattning av EC50 eller något annat ECx-värde, kan statistiken per kärl användas som äkta replikat. Vid beräkning av konfidensintervallet för ett ECx-värde bör variansen mellan kärl beaktas, eller så bör man påvisa att variansen är så liten att den kan ignoreras. Om modellen anpassas med minsta kvadratmetoden bör transformation tillämpas på den kärlvisa statistiken i syfte att förbättra variansens homogenitet. ECx-värdena bör dock beräknas när responsen har transformerats tillbaka till det ursprungliga värdet.
|
45.
|
När syftet med den statistiska analysen är att bestämma NOEC/LOEC genom hypotestestning, måste variansen mellan kärl beaktas, t.ex. genom nästad ANOVA. Alternativt kan mer robust testning (21) vara lämplig i situationer där de vanliga ANOVA-antagandena inte gäller.
|
Kläckningsfrekvens
46.
|
Kläckningsfrekvenser är dikotoma (tvåpunktsfördelade) data och kan analyseras genom Cochran-Armitage test som tillämpas på step-down-grund där monoton dos-respons förväntas och dessa data stämmer överens med förväntningen. Om inte, kan Fishers exakta test eller ett Mantel-Haenszel-test med Bonferroni-Holm-korrigerade p-värden användas. Om det finns bevis på större variation mellan replikat inom samma koncentration än det som en binomial fördelning skulle indikera (ofta kallad extra-binomial fördelning), bör ett robust Cochran-Armitage-test eller Fischers exakta test användas, enligt det som föreslås i punkt 21.
|
47.
|
Det totala antalet myggor som kläckts per kärl, ne, bestäms och divideras med antalet tillsatta larver, na enligt följande:
där:
ER
|
=
|
kläckningsfrekvensen
|
ne
|
=
|
antalet myggor som kläckts per kärl
|
na
|
=
|
antalet larver som tillsatts per kärl
|
|
48.
|
Ett alternativ som bäst lämpar sig för stora provstorlekar, när det finns extra-binomial varians, är att behandla kläckningsfrekvensen som en kontinuerlig respons och använda förfaranden såsom William-test när monoton dos-respons förväntas och stämmer överens med dessa data för kläckningsfrekvens. Dunnett-test är lämpligt i fall där det inte är hållbart med monotonicitet. I detta sammanhang definieras begreppet ”stort prov” som ett prov där antalet kläckta och antalet inte kläckta överstiger fem, per replikatkärl.
|
49.
|
Vid användning av ANOVA-metoder bör värdena för kläckningsfrekvens först transformeras genom arcsin-kvadratsrotstransformation eller Freeman-Tukeytransformation för att få en ungefärlig normalfördelning och jämna ut varianserna. Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (Bonferroni) eller Mantel-Haenszel-test kan användas när absoluta frekvenser används. För att göra arcsin-kvadratrotstransformation tar man inverterad sinus (sin–1) av kvadratroten av kläckningsfrekvensen.
|
50.
|
ECx-värden för kläckningsfrekvenser beräknas med regressionsanalys (t.ex. probit (22), logit, Weibull, lämplig kommersiell mjukvara eller dylikt). Om regressionsanalysen inte lyckas (om det t.ex. finns mindre än två partiella responser) används andra icke-parametriska metoder såsom glidande medelvärde eller enkel interpolering.
|
Utvecklingshastighet
51.
|
Med genomsnittlig utvecklingstid avses den genomsnittliga tidsomfattningen mellan tillsättning av larver (testdag 0) och kläckningen av den experimentella kohorten myggor (för beräkning av den faktiska utvecklingstiden bör man beakta larvernas ålder vid tillsättningstidpunkten). Värdet för utvecklingshastighet är det reciproka värdet av tidsenheten för utveckling: (enhet: 1/dag) och representerar den andel larvutveckling som sker per dag. Utvecklingshastigheten är det mått som helst ska användas för utvärdering av dessa sedimenttoxicitetsstudier eftersom variansen är lägre och homogenare samt närmare normalfördelningen i jämförelse med utvecklingstiden. Kraftfulla parametriska testförfaranden kan alltså användas baserade på utvecklingshastighet hellre än på utvecklingstid. För utvecklingshastighet som en kontinuerlig respons kan ECx-värden uppskattas med hjälp av regressionsanalys (t.ex. (23), (24)).
|
52.
|
För efterföljande statistiska test antas antalet myggor observerade på inspektionsdag × ha kläckts i mitten av tidsintervallet mellan dag × och dag x-1 (l är inspektionsintervallets längd, i regel 1 dag). Genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl (x) beräknas enligt följande:
där:
|
:
|
genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl
|
i
|
:
|
index för inspektionsintervall
|
m
|
:
|
maximiantalet inspektionsintervall
|
|
:
|
antalet myggor som kläckts under inspektionsintervallet i
|
ne
|
:
|
totalantalet myggor som kläckts i slutet av experimentet (= )
|
xi
|
:
|
utvecklingshastigheten för myggor som kläckts under intervallet i
|
där:
dagi
|
:
|
inspektionsdag (dagar från appliceringen)
|
li
|
:
|
inspektionsintervallets längd i (dagar, i regel 1 dag)
|
|
Testrapport
53.
|
Testrapporten ska innehålla minst följande uppgifter:
|
Testämne:
—
|
Fysikalisk natur och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper (vattenlöslighet, ångtryck, fördelningskoefficient i jord (eller i sediment, om tillgänglig), stabilitet i vatten osv.).
|
—
|
Kemiska identifieringsdata (trivialnamn, kemiskt namn, strukturformel, CAS-nummer osv.) samt renhet och analysmetod för kvantifiering av testämnet.
|
|
|
Testarter:
—
|
Organismer som använts för testet: art, vetenskapligt namn, ursprung och odlingsbetingelser.
|
—
|
Information om hantering av äggmassor och larver.
|
—
|
Organismernas ålder när de tillförs testkärlen.
|
|
|
Testbetingelser:
—
|
Sediment som använts (naturligt eller syntetiskt).
|
—
|
För naturligt sediment, insamlingsplatsens belägenhet och beskrivning av sedimentet, inbegripet i mån av möjlighet föroreningshistoria och egenskaper: pH, halten organiskt kol, C/N-kvot och granulometri (om lämpligt).
|
—
|
Beredning av syntetiskt sediment: beståndsdelar och egenskaper (halten organiskt kol, pH, fukthalt osv. vid testets början).
|
—
|
Beredning av testvatten (om rekonstituerat vatten används) och egenskaper (syrehalt, pH, konduktivitet, hårdhet osv. vid testets början).
|
—
|
Sedimentets och överliggande vattnets djup.
|
—
|
Volymen för överliggande vatten och porvatten, vikten för vått sediment med och utan porvatten.
|
—
|
Testkärl (material och storlek).
|
—
|
Metod för beredning av stamlösningar och testkoncentrationer.
|
—
|
Tillsättning av testämne: antalet koncentrationer, antalet replikat och, i förekommande fall, använt lösningsmedel.
|
—
|
Inkubationsbetingelser: temperatur, ljuscykel och intensitet, luftning (frekvens och intensitet).
|
—
|
Detaljerad information om utfodringen, inklusive typ av foder, beredning, mängd och utfodringsschema.
|
|
|
Resultat:
—
|
Nominella testkoncentrationer, uppmätta testkoncentrationer och resultaten av alla analyser för bestämning av testämnets koncentration i testkärl.
|
—
|
Vattenkvaliteten i testkärlen – pH, temperatur, upplöst syre, hårdhet och ammonium.
|
—
|
Ersättning av avdunstat testvatten, i förekommande fall.
|
—
|
Antalet kläckta hon- och hanmyggor per kärl och dag.
|
—
|
Antalet larver som inte utvecklats till myggor, per kärl.
|
—
|
Genomsnittlig individuell torrvikt för larver per kärl och per stadium, om lämpligt.
|
—
|
Procentandel kläckta exemplar per replikat- och testkoncentration (han- och honmyggor poolade).
|
—
|
Genomsnittlig utvecklingshastighet för fullbildade myggor per replikat och behandlingsnivå (han- och honmyggor poolade).
|
—
|
Uppskattning av toxiska endpoints t.ex. ECx (och associerade konfidensintervall), NOEC och/eller LOEC, och statistiska metoder som använts för bestämning av dem.
|
—
|
Diskussion av resultaten, inbegripet inverkan på testresultatet som kan tillskrivas avvikelser från denna testmetod.
|
|
|
LITTERATUR
(1)
|
BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. Berlin 1995.
|
(2)
|
Fleming R. m.fl. 1994), ”Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances”, Slutlig rapport till Europeiska kommissionen, rapport nr EC 3738, augusti 1994, WRc, UK.
|
(3)
|
SETAC (1993), ”Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments”, WOSTA Workshop, Nederländerna.
|
(4)
|
ASTM International/E1706-00 (2002), ”Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, s. 1125–1241, ASTM International 2002 Annual Book of Standards, vol. 11.05, ”Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides”, ASTM International, West Conshohocken, PA.
|
(5)
|
Environment Kanada (1997), ”Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method”, Report SPE 1/RM/32, december 1997.
|
(6)
|
US-EPA (2000), ”Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, andra utgåvan, EPA 600/R-99/064, mars 2000, revidering av första utgåvan juni 1994.
|
(7)
|
US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), ”Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates”.
|
(8)
|
US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), ”Chironomid Sediment toxicity Test”.
|
(9)
|
Milani D., Day K. E., McLeay D. J. och Kirby R. S. (1996), ”Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius)” Technical Report, Environment Kanada, National Water Research Institute, Burlington, Ontario, Kanada.
|
(10)
|
Sugaya Y. (1997), ”Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui”, Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4), s. 345–350.
|
(11)
|
Kawai K. (1986), ”Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera)”, Jp. J. Sanit. Zool. 37 (1), s. 47–57.
|
(12)
|
OECD, 2000, ”Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures”, OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment Nr 23.
|
(13)
|
Environment Kanada (1995), ”Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant”, Report EPS 1/RM/30, september 1995.
|
(14)
|
Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar.
|
(15)
|
Suedel B. C. och Rodgers J. H. (1994), ”Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing”, Environ. Toxicol. Chem. 13, s. 1163–1175.
|
(16)
|
Naylor C. och Rodrigues C., (1995), ”Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment”, Chemosphere 31, s. 3291–3303.
|
(17)
|
Dunnett C. W. (1964), ”A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control”, J. Amer. Statis. Assoc. 50, s. 1096–1121.
|
(18)
|
Dunnett C. W. (1964), ”New tables for multiple comparisons with a control”, Biometrics, 20, s. 482–491.
|
(19)
|
Williams D. A. (1971), ”A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control”, Biometrics, 27, s. 103–117.
|
(20)
|
Williams D. A. (1972), ”The comparison of several dose levels with a zero dose control”, Biometrics, 28, s. 510–531.
|
(21)
|
Rao J. N. K. och Scott A. J. (1992), ”A simple method for the analysis of clustered binary data”, Biometrics 48, s. 577–585.
|
(22)
|
Christensen E. R. (1984), ”Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model”, Water Research 18, s. 213–221.
|
(23)
|
Bruce och Versteeg (1992), ”A statistical procedure for modelling continuous toxicity data”, Environmental Toxicology and Chemistry 11, s. 1485–1494.
|
(24)
|
Slob W. (2002), ”Dose-response modelling of continuous endpoints”, Toxicol. Sci. 66, s. 298–312.
|
Tillägg 1
DEFINITIONER
I denna testmetod gäller följande definitioner:
|
syntetiskt sediment: rekonstituerat, konstgjort sediment som är en blandning av material avsedda att efterlikna de fysiska beståndsdelarna i naturligt sediment.
|
|
överliggande vatten: det vatten som hålls ovanför sedimentet i testkärlet.
|
|
porvatten: det vatten som finns i mellanrummen mellan sediment- och jordpartiklar.
|
|
spikat sediment: sediment med tillsatt testämne.
|
|
testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.
|
Tillägg 2
Rekommendationer för odling av Chironomus riparius
1.
|
Chironomus-larver kan odlas i kristalliseringskärl eller stora behållare. Fin kvartssand sprids som ett tunt skikt på cirka 5–10 mm på behållarens botten. Även kiselgur (t.ex. Merck, Art. 8117) har visat sig vara ett lämpligt substrat (det räcker med ett tunt lager på några mm). Lämpligt vatten tillsätts till ett djup på flera cm. Vattennivåerna bör fyllas på efter behov för att ersätta avdunstning och förebygga uttorkning. Vattnet kan vid behov ersättas. Det bör finnas en skonsam luftning. De kärl som innehåller larver bör hållas i en lämplig bur som hindrar vuxna exemplar från att rymma. Buren bör vara tillräckligt stor för att de vuxna exemplaren ska kunna svärma, annars kan kopulation utebli (minimum är cirka 30 × 30 ×30 cm).
|
2.
|
Burarna ska hållas i rumstemperatur eller ett tempererat utrymme vid 20 ± 2 °C med en ljusperiod på 16 timmar (intensitet ca 1 000 lux) och 8 timmar mörker. Det har rapporterats att luftfuktighet under 60 % RH kan hämma reproduktion.
|
Utspädningsvatten
3.
|
Allt lämpligt naturligt eller syntetiskt vatten kan användas. Ofta används källvatten, avklorerat kranvatten och artificiella medier (t.ex. Elendt M4 eller M7, se nedan). Vattnet måste luftas före användningen. Vid behov kan odlingsvattnet förnyas genom att försiktigt hälla eller sifonera använt vatten från odlingskärlen utan att förstöra larvrören.
|
Utfodring av larver
4.
|
Chironomus-larverna ges fiskfoder i flingform (Tetra Min®, Tetra Phyll® eller motsvarande patenterat märke), cirka 250 mg per kärl och dag. Fodret kan ges i form av torrt malet pulver eller som suspension i vatten: 1,0 g flingfoder blandas med 20 ml utspädningsvatten till en homogen blandning. Beredningen kan ges med en dosering på cirka 5 ml per kärl och dag (skaka om före användning). Äldre larver kan få en större dos.
|
5.
|
Utfodringen justeras enligt vattenkvaliteten. Om odlingsmediet blir grumligt bör dosen sänkas. Foderdoseringen måste övervakas noggrant. För liten mängd leder till att larverna emigrerar mot vattenkolumnen och för stor mängd leder till ökad mikrobiell aktivitet och lägre syrekoncentrationer. Båda omständigheterna kan leda till minskad tillväxt.
|
6.
|
Även celler av vissa grönalger (t.ex. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kan tillsättas när nya odlingskärl läggs upp.
|
Utfodring av vuxna exemplar
7.
|
Vissa testutövare har föreslagit att bomullskompresser indränkta i mättad sukroslösning kan användas som foder för vuxna exemplar.
|
Kläckning
8.
|
Vid 20 ± 2 °C börjar vuxna exemplar kläckas i odlingskärlen efter cirka 13–15 dagar. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner.
|
Äggmassor
9.
|
När vuxna exemplar finns i odlingsburen bör alla larver i odlingskärlen kontrolleras tre gånger per vecka för att se om gelatinösa äggmassor har deponerats. Om sådana upptäcks, bör de avlägsnas försiktigt. Äggmassorna överförs till ett litet kärl som innehåller ett prov av odlingsvattnet. De används sedan för att starta nya odlingskärl (t.ex. 2–4 äggmassor per kärl) eller för toxicitetstest.
|
10.
|
Första stadiets larver bör kläckas efter 2–3 dagar.
|
Uppläggning av nya odlingskärl
11.
|
När odlingarna är etablerade bör det vara möjligt att lägga upp en färsk larvodling veckovis eller med längre intervall beroende på testningskraven, och avlägsna äldre kärl efter att vuxna myggor har kläckts. På detta sätt fås regelbunden tillgång till vuxna exemplar med minimal insats.
|
Beredning av testlösningarna M4 och M7
12.
|
M4-mediet upptäcktes av Elendt (1990). M7-mediet bereds på samma sätt som M4-mediet med undantag för de ämnen som anges i tabell 1, för vilka koncentrationerna är fyra gånger lägre i M7 jämfört med M4. En publikation om M7-mediet är under arbete (Elendt, personlig kommunikation). Testlösningen ska inte beredas enligt Elendt och Bias (1990) eftersom de angivna koncentrationerna av NaSiO3·5H2O, NaNO3, KH2PO4 och K2HPO4 inte är lämpliga.
|
Beredning av M7-medium
13.
|
Varje stamlösning (I) bereds individuellt och en kombinerad stamlösning (II) bereds av dessa stamlösningar (I) (se tabell 1). Femtio ml av den kombinerade stamlösningen (II) och de mängder av varje stamlösning med makronäring som anges i tabell 2 och avjoniserat vatten tillsätts upp till 1 liter för att bereda M7-mediet. En stamlösning med vitaminer bereds genom att tillsätta tre vitaminer till avjoniserat vatten enligt tabell 3, och 0,1 ml av den kombinerade vitaminstamlösningen tillsätts till det slutliga M7-mediet strax före användningen (vitaminstamlösningen förvaras djupfryst i små alikvoter). Mediet luftas och stabiliseras.
Tabell 1
Stamlösningar av spårelement för M4- och M7-medium
Stamlösningar (I)
|
Mängd (mg) som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten
|
Beredning av kombinerad stamlösning (II): blanda följande mängder (ml) stamlösning (I) och bygg upp till 1 liter med avjoniserat vatten
|
Slutliga koncentrationer i testlösningarna (mg/l)
|
M4
|
M7
|
M4
|
M7
|
H3BO3
(18)
|
57 190
|
1,0
|
0,25
|
2,86
|
0,715
|
MnCl2 · 4H2O (18)
|
7 210
|
1,0
|
0,25
|
0,361
|
0,090
|
LiCl (18)
|
6 120
|
1,0
|
0,25
|
0,306
|
0,077
|
RbCl (18)
|
1 420
|
1,0
|
0,25
|
0,071
|
0,018
|
SrCl2 · 6H2O (18)
|
3 040
|
1,0
|
0,25
|
0,152
|
0,038
|
NaBr (18)
|
320
|
1,0
|
0,25
|
0,016
|
0,004
|
Na2MoO4 · 2H2O (18)
|
1 260
|
1,0
|
0,25
|
0,063
|
0,016
|
CuCl2 · 2H2O (18)
|
335
|
1,0
|
0,25
|
0,017
|
0,004
|
ZnCl2
|
260
|
1,0
|
1,0
|
0,013
|
0,013
|
CaCl2 · 2H6O
|
200
|
1,0
|
1,0
|
0,010
|
0,010
|
KI
|
65
|
1,0
|
1,0
|
0,0033
|
0,0033
|
Na2SeO3
|
43,8
|
1,0
|
1,0
|
0,0022
|
0,0022
|
NH4VO3
|
11,5
|
1,0
|
1,0
|
0,00058
|
0,00058
|
Na2EDTA · 2H2O (18)
(19)
|
5 000
|
20,0
|
5,0
|
2,5
|
0,625
|
FeSO4 · 7H2O (18)
(19)
|
1 991
|
20,0
|
5,0
|
1,0
|
0,249
|
Tabell 2
Stamlösningar med makronäringsämnen för medium M4 och M7
|
Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten
(mg)
|
Mängd stamlösning med makronäringsämnen som tillsätts för att bereda medium M4 och M7
(ml/l)
|
Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7
(mg/l)
|
CaCl2 · 2H2O
|
293 800
|
1,0
|
293,8
|
MgSO4 · 7H2O
|
246 600
|
0,5
|
123,3
|
KCl
|
58 000
|
0,1
|
5,8
|
NaHCO3
|
64 800
|
1,0
|
64,8
|
NaSiO3 · 9H2O
|
50 000
|
0,2
|
10,0
|
NaNO3
|
2 740
|
0,1
|
0,274
|
KH2PO4
|
1 430
|
0,1
|
0,143
|
K2HPO4
|
1 840
|
0,1
|
0,184
|
Tabell 3
Stamlösningar med vitaminer för medium M4 och M7
Alla tre vitaminlösningar kombineras till en enda vitaminstamlösning.
|
Mängd som byggs upp till 1 liter med avjoniserat vatten
(mg)
|
Mängd stamlösning med vitaminer som tillsätts för att bereda medium M4 och M7
(ml/l)
|
Slutliga koncentrationer i testlösningarna M4 och M7
(mg/l)
|
Tiaminhydroklorid
|
750
|
0,1
|
0,075
|
Cyanokobalamin (B12)
|
10
|
0,1
|
0,0010
|
Biotin
|
7,5
|
0,1
|
0,00075
|
|
LITTERATUR
BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. Berlin 1995.
Elendt, B. P. (1990), ”Selenium Deficiency in Crustacean”, Protoplasma 154, s. 25–33.
Elendt B. P. och Bias W. R.(1990), ”Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna”, Water Research 24 (9), s. 1157–1167.
Tillägg 3
BEREDNING AV SYNTETISKT SEDIMENT
Sedimentsammansättning
Syntetiskt sediment ska ha följande sammansättning:
Beståndsdel
|
Egenskaper
|
% av sedimentets
torrvikt
|
Torv
|
Sphagnum, så nära pH 5,5–6 som möjligt utan synliga växtrester och finfördelad (partikelstorlek ≤1 mm) och lufttorkad.
|
4–5
|
Kvartssand
|
Partikelstorlek: > 50 % av partiklarna bör ha storlek inom området 50–200 μm
|
75–76
|
Kaolinitlera
|
Kaolinithalt ≥ 30 %
|
20
|
Organiskt kol
|
Justeras genom tillsats av torv och sand
|
2 (± 0,5)
|
Kalciumkarbonat
|
CaCO3, pulveriserat, kemiskt rent
|
0,05–0,1
|
Vatten
|
Konduktivitet ≤ 10 μS/m
|
30–50
|
Beredning
Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver. En suspension av behövlig mängd torvpulver i avjoniserat vatten bereds med effektiv homogeniseringsapparat. Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneras minst två dagar med skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C, för att stabilisera pH och etablera en stabil mikrobiell komponent, varefter pH uppmäts på nytt och bör vara 6,0 ± 0,5. Torvsuspensionen blandas sedan med de övriga beståndsdelarna (sand och kaolinlera) och avjoniserat vatten till ett homogent sediment med en vattenhalt som ger kring 30–50 procent torrvikt av sediment. Därefter mäts den slutliga blandningens pH på nytt och justeras vid behov till 6,5–7,5 med CaCO3. Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och halten organiskt kol. Likaså rekommenderas att det syntetiska sediment som ska användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras före användningen i sju dagar i samma betingelser som råder i det efterföljande testet.
Förvaring
De torra beståndsdelarna för beredning av syntetiskt sediment kan lagras i ett torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Berett (vått) sediment ska inte lagras för användning i test. Det bör användas omedelbart efter den 7 dagar långa konditioneringsperioden i slutet av beredningen.
LITTERATUR:
Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar.
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), ”Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media”, Ecotox. and Environ. Safety 39, s. 10–20.
Tillägg 4
Krav på kemiska egenskaper hos utspädningsvatten
Ämne
|
Koncentrationer
|
Partikelinnehåll
|
< 20 mg/l
|
Totalt organiskt kol
|
< 2 mg/l
|
Ojoniserad ammoniak
|
< 1 μg/l
|
Hårdhet som CaCO3
|
< 400 mg/l (20)
|
Restklor
|
< 10 μg/l
|
Bekämpningsmedel med organiska fosforföreningar, totalt.
|
< 50 ng/l
|
Bekämpningsmedel med organiska klorföreningar plus polyklorerade bifenyler, totalt.
|
< 50 ng/l
|
Totalt organiskt klor
|
< 25 ng/l
|
Tillägg 5
Vägledning för övervakning av kläckning av chironomider
Fällor placeras på testbägarna. Dessa fällor behövs från dag 20 fram till testets slut. Exempel på en fälla visas nedan.
A
|
:
|
nylonnät
|
B
|
:
|
upp-och-nedvänd plastkopp
|
C
|
:
|
exponeringskärl utan läpp
|
D
|
:
|
filterportar för vattenutbyte
|
E
|
:
|
vatten
|
F
|
:
|
sediment
|
C.29 LÄTT BIONEDBRYTBARHET – CO2 I FÖRSLUTNA KÄRL (Headspace-test)
INLEDNING
1.
|
Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje310 (2006). Denna testmetod är en screeningmetod för utvärdering av kemikaliers lättnedbrytbarhet och ger liknande information som de sex testmetoder som beskrivs i kapitel C.4 i denna bilaga A–F. En kemikalie som ger positiva testresultat med denna metod kan anses vara lätt bionedbrytbar och sönderfaller således snabbt i miljön.
|
2.
|
Den väletablerade koldioxidmetoden (1) är baserad på Sturms ursprungliga test (2) för bestämning av organiska kemikaliers bionedbrytbarhet, genom mätning av koldioxid (CO2) som produceras genom mikrobiell verksamhet, har i regel varit det första valet för testning av dåligt lösliga kemikalier och kemikalier med starkt adsorberande egenskaper. Testet väljs också för lösliga (men inte flyktiga) kemikalier, eftersom många anser att utveckling av koldioxid är det enda otvivelaktiga beviset på mikrobiell aktivitet. Avlägsnandet av upplöst organiskt kol kan påverkas av fysikalkemiska processer – adsorption, avdunstning, utfällning, hydrolys – såväl som av mikrobiell aktivitet och många icke-biologiska reaktioner som förbrukar syre; CO2 produceras sällan från organiska kemikalier på abiotisk väg. I det ursprungliga och modifierade Sturmtestet (1) (2) avlägsnas CO2 från vätskefasen till de absorberande kärlen genom s.k. sparging (luftbubblor får strömma genom vätskemediet för att avlägsna CO2), medan Larsons version (3) (4) går ut på att överföra CO2 från reaktionskärlet till absorberingsenheterna genom att låta CO2-fri luft passera genom utrymmet ovanför vätskan samtidigt som testkärlet omskakas kontinuerligt. Omskakning av reaktionskärlet används endast i Larson-modifieringen, och omrörning anges endast för olösliga ämnen i ISO 9439 (5) och i den ursprungliga US-versionen (6), enligt vilka sparging rekommenderas hellre än ersättning av gasfasen. I en annan officiell US EPA-metod (8) baserad på Gledhill-metoden (8) hålls reaktionskärlet under omskakning och förseglat från atmosfären, och CO2 som produceras samlas in i en intern alkalisk fälla direkt från gasfasen, på samma sätt som i klassiska Warburg/Barcroft-respirometerflaskor.
|
3.
|
Det har dock visat sig att det för ett antal kemikalier ackumuleras oorganiskt kol i mediet vid användning av standard-Sturmtest i modifierad form (9). En koncentration på upp till 8 mg/l oorganiskt kol konstaterades under sönderfall av 20 mg C/l anilin. Uppsamling av CO2 i alkaliska fällor gav således inte en äkta bild av mängden mikrobiologiskt producerad CO2 vid mellanliggande tidpunkter under sönderfallet. Det medför att specifikationen om att minst 60 % av teoretisk maximal CO2-produktion (ThCO2) måste samlas upp inom ett tiodagarsfönster (de tio dagar som följer omedelbart efter att 10 % bionedbrytning har uppnåtts) för att en testkemikalie ska klassificeras som lätt bionedbrytbar, inte uppfylls för vissa kemikalier som skulle ges denna klassificering om man använder eliminering av upplöst organiskt kol (DOC).
|
4.
|
Om procentandelen sönderdelning är lägre än förväntat, är det möjligt att oorganiskt kol har ackumulerats i testlösningen. Då kan nedbrytbarheten bedömas med andra test för biologisk nedbrytbarhet.
|
5.
|
De övriga nackdelarna med Sturmtest (besvärligt, tidskrävande, högre risk för experimentella fel och kan inte användas för flyktiga kemikalier) har tidigare lett till sökning efter en teknik med förslutet kärl, annan än Gledhill, hellre än gasgenomflöde (10) (11). Boatman m.fl. (12) granskade de tidigare metoderna och valde ett system med slutet utrymme ovan för vätskeytan där CO2 frigjordes till detta utrymme i slutet av inkubationen genom försurning av mediet. CO2 uppmättes med gaskromatografi (GC)/IC i automatiskt tagna prover i gasutrymmet, medan upplöst oorganiskt kol (DIC) i vätskefasen inte beaktades. Likaså var de kärl som användes mycket små (20 ml) med endast 10 ml medium, vilket orsakade problem t.ex. vid tillsättning av de mycket små mängderna av olösliga testkemikalier, och/eller eventuellt fanns det inte tillräckliga mängder eller inga mikroorganismer i det inokulerade mediet som kunde sönderbryta testkemikalierna.
|
6.
|
Dessa svårigheter har lösts genom oberoende studier gjorda av Struijs och Stoltenkamp (13) samt av Birch och Fletcher (14), där de senare byggde på erfarenheter med apparatur använd i test för anaerob biologisk nedbrytning (15). I den tidigare metoden (13) mäts CO2 i utrymmet ovanför vätskan efter försurning och jämvikt, medan den senare metoden (14) innebär att man mäter DIC i både gas- och vätskefaserna, utan behandling; över 90 % av bildat oorganiskt kol fanns i vätskefasen. Båda metoderna har fördelar jämfört med Sturmtest, i den meningen att testsystemet är mera kompakt och lätthanterligt, flyktiga kemikalier kan testas och man undviker risken för fördröjning vid mätning av producerad CO2.
|
7.
|
De två principerna kombinerades i ISO Headspace CO2 Standard (16) som ringtestades (17) och denna standard utgör grunden för den testmetod som beskrivs här. De två principerna har också använts i US EPA-metoden (18). Två metoder för mätning av CO2 har rekommenderats – CO2 i utrymmet ovanför vätskan (headspace) efter försurning (13) och oorganiskt kol i vätskefasen efter tillförsel av överskottsalkali. Den senare metoden infördes av Peterson under CONCAWE-ringtestet (19) av denna headspace-metod som modifierats till att mäta lätt biologisk nedbrytbarhet. De ändringar som gjordes vid 1992 års revidering (20) av metoden i kapitel C.4 i denna bilaga om lätt bionedbrytbarhet har införlivats i denna testmetod, så att betingelserna (medium, tidslängd osv.) för övrigt är desamma som betingelserna i det reviderade Sturmtestet (20). Birch och Fletcher (14) har visat att de resultat som erhölls med detta headspace-test är mycket lika de resultat som erhölls med samma kemikalier i OECD-ringtest (21) av de reviderade testmetoderna.
|
PRINCIP FÖR TESTMETODEN
8.
|
Testkemikalien, i regel 20 mg C/l, såsom enda källa för kol och energi, inkuberas i ett buffert-mineralsaltmedium som har inokulerats med en blandad population mikroorganismer. Testet genomförs i förslutna flaskor med ett luftutrymme ovanför vätskan som syrekälla för aerob biologisk nedbrytning. Utvecklingen av CO2 till följd av fullständig aerob biologisk nedbrytning av testkemikalien bestäms genom att mäta den mängd oorganiskt kol som produceras i testflaskorna utöver den mängd som produceras i kontrollkärl för bakgrundsvärde som endast innehåller inokulerat medium. Graden av biologisk nedbrytning uttrycks som en procentandel av den teoretiska maximiproduktionen av oorganiskt kol (ThIC), jämfört med den mängd testkemikalie (i form av organiskt kol) som tillfördes i början.
|
9.
|
DOC-elimineringen och/eller graden av primär biologisk nedbrytning av testkemikalien kan också mätas (20).
|
INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN
10.
|
Testkemikaliens halt av organiskt kol (viktprocent) måste vara känd, antingen på grundval av den kemiska strukturen eller genom mätning, så att den procentuella nedbrytningen kan beräknas. För flyktiga testkemikalier kan uppmätt eller beräknad Henrys lags konstant användas för beräkning av lämplig kvot mellan utrymmet ovanför vätskan och vätskevolymen. Information om testkemikaliens toxicitet för mikroorganismer kan användas för att välja en lämplig testkoncentration och för tolkning av resultat som tyder på dålig biologisk nedbrytbarhet – inhibitionskontroll rekommenderas om det inte är känt att testkemikalien inte inhiberar mikrobiella aktiviteter (se punkt 24).
|
METODENS LÄMPLIGHET
11.
|
Testmetoden kan användas för vattenlösliga och olösliga testkemikalier; god dispergering av testkemikalien bör säkerställas. Med användning av den rekommenderade kvoten på 1:2 mellan utrymmet ovanför vätskan och vätskevolymen kan flyktiga kemikalier med en Henrys lags konstant upp till 50 Pa m3 mol–1 testas eftersom andelen testkemikalie i utrymmet ovanför vätskan inte överskrider 1 % (13). Ett mindre utrymme ovanför vätskan kan användas vid testning av kemikalier som är flyktigare, men deras biotillgänglighet kan utgöra en begränsning, särskilt om de har dålig löslighet i vatten. Man bör dock se till att kvoten mellan utrymmet ovanför vätskan och vätskevolymen samt testkemikaliens koncentration ger tillgång till tillräckligt med syre för att fullständig aerob bionedbrytning ska kunna ske (t.ex. genom att undvika en hög substratkoncentration och för liten volym ovanför vätskan). Vägledning om detta finns i (13) och (23).
|
REFERENSKEMIKALIER
12.
|
I syfte att kontrollera testförfarandet bör en testkemikalie med känd biologisk nedbrytbarhet testas parallellt. För detta ändamål kan anilin, natriumbensoat eller etylenglykol användas vid testning av vattenlösliga testkemikalier och 1-oktanol för testkemikalier med dålig löslighet. Referenskemikaliernas biologiska nedbrytbarhet bör nå upp till mer än 60 % av ThIC inom 14 dagar.
|
REPRODUCERBARHET
13.
|
Vid ISO-ringtest av metoden (17) erhölls följande resultat i rekommenderade betingelser, i vilket ingick 20 mg C testkemikalie/l.
Testkemikalie
|
Medelvärde för procentuell biologisk nedbrytning
(28 d)
|
Variationskoefficient
(%)
|
Antal laboratorier
|
Anilin
|
90
|
16
|
17
|
1-oktanol
|
85
|
12
|
14
|
Variationen mellan tester (replikerbarhet) med användning av anilin var låg, med variationskoefficienter under 5 % för de flesta testningskörningar. I de två fall där replikerbarheten var sämre berodde den större variationen sannolikt på hög produktion av oorganiskt kol i kontrollkärlen för bakgrundsvärde. Replikerbarheten var sämre med 1-oktanol men var fortfarande lägre än 10 % för 79 % av testkörningarna. Denna större variation mellan tester kan ha berott på doseringsfel, eftersom en liten volym (3–4 μl) 1-oktanol måste injiceras i de förslutna testflaskorna. Variationskoefficienterna kan bli högre när lägre koncentrationer av testkemikalie används, särskilt vid koncentrationer under 10 mg C/l. Detta kan delvis lösas genom att sänka koncentrationen totalt oorganiskt kol (TIC) i inokulatet.
|
14.
|
I ett EU-ringtest (24) med fem ytaktiva ämnen tillsatta såsom 10 mg C/l erhölls följande testresultat:
Testkemikalie
|
Medelvärde för procentuell biologisk nedbrytning
(28 d)
|
Variationskoefficient
(%)
|
Antal laboratorier
|
Tetrapropylen
Bensensulfonat
|
17
|
45
|
10
|
Di-iso-oktylsulfo-succinat
(anioniskt)
|
72
|
22
|
9
|
Hexadekyl-trimetyl (21)
Ammoniumklorid
(katjonisk)
|
75
|
13
|
10
|
Iso-nonylfenol-(etoxylat)9
(icke-joniskt)
|
41
|
32
|
10
|
Cocoamido-
propyl-
betain
(amfoteriskt)
|
60
|
23
|
11
|
Resultaten tyder på att variationen allmänt taget var högre för de ytaktiva ämnen som hade sämre nedbrytning. Variationen mellan tester var mindre än 15 % för över 90 % av fallen, och den högsta variationen var 30–40 %.
ANMÄRKNING:
|
De flesta ytaktiva ämnen har inte enhetlig molekylär struktur utan är blandningar av isomerer, homologer osv. som sönderfaller efter olika långa lagfaser och med olika kinetiska hastigheter, vilket resulterar i lägre kurvor, dvs. gränsvärdet på 60 % kanske inte nås inom tiodagarsfönstret, även om varje enskild molekylär enhet skulle nå detta värde vid testning för sig. Detta kan även observeras med andra komplexa blandningar.
|
|
METODBESKRIVNING
Apparatur
15.
|
Normal laboratorieapparatur och följande:
a)
|
Glasserumflaskor, förseglade med butylgummiproppar och kapsyllock av aluminium. Rekommenderad storlek är ’125 ml’ som har en total volym på cirka 160 ml (i detta fall bör man försäkra sig om att volymen för var och en flaska är 160 ±1 ml. Mindre kärl kan användas om resultaten uppfyller de villkor som beskrivs i punkterna 66 och 67.
|
b)
|
Kolanalysator eller annat instrument (t.ex. gaskromatograf) för mätning av oorganiskt kol.
|
c)
|
Högprecisionssprutor för gas- och vätskeformiga prover.
|
d)
|
Orbitalt skakbord i temperaturkontrollerad omgivning.
|
e)
|
Tillförsel av CO2-fri luft – kan ordnas genom att låta luft flöda genom kalk-soda-granulat eller genom att använda en gasblandning av 80 % N2 och 20 % O2 (frivilligt) (se punkt 28).
|
f)
|
Membranfiltreringsutrustning med 0,20–0,45 μm porstorlek (frivilligt).
|
g)
|
Analysutrustning för organiskt kol (frivilligt).
|
|
Reagenser
16.
|
Alla reagenser som används ska vara av analytisk renhetsgrad.
|
Vatten
17.
|
Destillerat eller avjoniserat vatten ska användas med ≤ 1 mg/l som totalt organiskt kol. Detta representerar ≤ 5 % av det ursprungliga organiska kol som tillförs genom den rekommenderade dosen testkemikalie.
|
Stamlösningar av mineralsaltmediet
18.
|
Stamlösningar och mineralsaltmedium liknande de i testerna ISO 14593 (16) och C.4 för lätt biologisk nedbrytbarhet (20) ska användas. En högre koncentration av ammoniumklorid (2,0 g/l i stället för 0,5 g/l) är endast nödvändigt i särskilda undantagsfall, t.ex. när koncentrationen testkemikalie överstiger 40 mg C/l. Stamlösningarna bör förvaras i kylskåp och slängas efter sex månader, eller tidigare om det finns tecken på fällning eller mikrobiell tillväxt. Följande stamlösningar ska beredas:
a)
|
Kaliumdivätefosfat (KH2PO4) 8,50 g
Dikaliumvätefosfat (K2HPO4) 21,75 g
Dinatriumvätefosfatdihydrat (Na2HPO4·2H2O) 33,40 g
Ammoniumklorid (NH4Cl) 0,50 g
Lös upp i vatten och fyll upp till 1 liter. Lösningens pH bör vara 7,4 (± 0,2). Om inte, bered en ny lösning.
|
b)
|
Kalciumkloriddihydrat (CaCl2·2H2O) 36,40 g
Lös upp i vatten och fyll upp till 1 liter.
|
c)
|
Magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO4·7H2O) 22,50 g
Lös upp i vatten och fyll upp till 1 liter.
|
d)
|
Järn(III)kloridhexahydrat (FeCl3·6H2O) 0,25 g
Lös upp i vatten och fyll upp till 1 liter och tillsätt en droppe koncentrerad väteklorid.
|
|
Beredning av mineralmedium
19.
|
Blanda 10 ml av lösning a med cirka 800 ml vatten (punkt 17), tillsätt 1 ml av lösningarna b, c och d och fyll upp till 1 liter med vatten (punkt 17).
|
Övriga reagenser
20.
|
Koncentrerad ortofosforsyra (H3PO4) (> 85 % massa per volym).
|
Natriumhydroxidlösning 7 M
21.
|
Lös upp 280 g natriumhydroxid (NaOH) i 1 liter vatten (punkt 17). Bestäm DIC-koncentrationen i denna lösning och beakta värdet vid beräkning av testresultaten (se punkterna 55 och 61), särskilt med tanke på giltighetskriteriet enligt punkt 66 b. Bered en ny, färsk lösning om koncentrationen DIC är för hög.
|
Testkemikalie
22.
|
Bered en stamlösning av en tillräckligt vattenlöslig kemikalie i vatten (punkt 17) eller i testmedium (punkt 19) i en koncentration som helst är 100-faldig jämförd med den koncentration som ska användas i testet; det kan vara nödvändigt att justera stamlösningens pH. Stamlösning tillförs mineralmediet så att den slutliga halten av organiskt kol blir mellan 2 och 40 mg C/l, helst 20 mg C/l. Om lägre koncentrationer används kan precisionen bli lidande. Lösliga och olösliga vätskeformiga kemikalier kan tillsättas i kärlen direkt med hjälp av högprecisionssprutor. För dåligt lösliga och olösliga testkemikalier kan det krävas specialbehandling (25). Det finns följande alternativ:
a)
|
Direkt tillsättning av kända vägda mängder.
|
b)
|
Dispergering med ultraljud före tillsättning.
|
c)
|
Dispergering med hjälp av emulgeringsmedel som krävs för att fastställa huruvida de har inhiberande eller stimulerande effekter på den mikrobiella aktiviteten före tillsättning.
|
d)
|
Adsorption av vätskeformig testkemikalie eller lösning i ett lämpligt flyktigt lösningsmedel, på ett annat medium eller underlag (t.ex. glasfiberfilter), och därefter avdunstning av lösningsmedlet om sådant använts och direkt tillsättning av kända mängder.
|
e)
|
Tillsättning av känd mängd av en lösning av testkemikalien i ett lättflyktigt lösningsmedel i ett tomt testkärl, och därefter avdunstning av lösningsmedlet.
|
Medel eller lösningsmedel som används i c, d och e måste ha testats för stimulerande eller inhiberande effekt på mikrobiell aktivitet (se punkt 42 b).
|
Referenskemikalie
23.
|
Bered en stamlösning av (löslig) testkemikalie i vatten (punkt 17) i en koncentration som helst är 100-faldig i jämförelse med den slutliga koncentration som ska användas (20 mg C/l) i testet.
|
Inhibitionskontroll
24.
|
Det händer ofta att testkemikalier inte uppvisar någon betydande nedbrytning under de betingelser som används för bedömning av lätt bionedbrytbarhet. En tänkbar orsak är att testkemikalien fungerar inhiberande på inokulatet vid den koncentration som används i testet. Inhibitionskontroll kan införlivas i testutformningen för att göra det möjligt att (i efterhand) identifiera inhibering som en möjlig orsak eller bidragande faktor. Alternativt kan man med hjälp av inhibitionskontrollen utesluta sådana störningar och påvisa att ingen eller svag nedbrytning endast beror på motstånd mot mikrobiell attack i testbetingelserna. För att få information om testkemikaliens toxicitet för (aeroba) mikroorganismer) bereds en lösning i testmediet med testkemikalien och referenskemikalien (punkt 19), var och en i samma koncentration som tillsatt koncentration (se punkterna 22 och 23).
|
Inokulat
25.
|
Inokulatet kan härröra från ett flertal källor: aktiverat slam, avloppsvatten (oklorerat), ytvatten och jordar eller från en blandning av dessa (20). Källans bionedbrytningsaktivitet bör kontrolleras med hjälp av en referenskemikalie. Oavsett källa bör mikroorganismer som tidigare exponerats för testkemikalien inte användas om förfarandet är avsett att användas som ett test för lätt bionedbrytbarhet.
Varning:
|
Aktiverat slam, avlopp och avloppsutflöde innehåller patogena organismer och måste hanteras försiktigt.
|
|
26.
|
Erfarenheter har visat att den optimala volymen för inokulat är en volym som
—
|
är tillräcklig för att ge en tillbörlig bionedbrytningsaktivitet,
|
—
|
ger tillräcklig nedbrytning av referenskemikalien (se punkt 66),
|
—
|
ger 102 till 105 kolonibildande enheter per milliliter i den slutliga blandningen,
|
—
|
i regel ger en koncentration på 4 mg/l suspenderade fasta ämnen i den slutliga blandningen när aktiverat slam används; koncentrationer upp till 30 mg/l kan användas men då uppstår betydlig ökning av CO2-produktionen i kontrollkärlen för bakgrundsvärde (26),
|
—
|
bidrar till mindre än 10 % av ursprungskoncentrationen av organiskt kol som tillförs genom testkemikalien,
|
—
|
i regel är 1–10 ml inokulat per 1 liter testlösning.
|
|
Aktiverat slam
27.
|
Aktiverat slam tas i färsk form från luftningstanken i ett reningsverk eller en enhet i laboratorieskala som i huvudsak behandlar avlopp från hushåll. Vid behov kan grova partiklar avlägsnas genom sållning (t.ex. 1 mm2) och slammet bör hållas aerobt fram till att det används.
|
28.
|
Alternativt kan slammet efter eliminering av grova partiklar få sedimentera eller slammet centrifugeras (t.ex. 1 100 × g i 10 minuter). Avlägsna supernatantvätskan. Slammet kan tvättas i minerallösningen. Det koncentrerade slammet suspenderas i mineralmediet till en koncentration på 3–5 g suspenderade fasta ämnen per liter. Detta hålls under luftning tills att det används.
|
29.
|
Slammet bör tas från ett effektivt fungerande konventionellt reningsverk. Om slam måste tas från ett high rate-reningsverk (högre belastningsgrad och kortare retentionstider) eller kan förmodas innehålla inhibitorer, bör det tvättas. Sedimentera eller centrifugera det återsuspenderade slammet efter grundlig blandning, avlägsna överstående vätska och suspendera tvättat slam på nytt i en ny volym av mineralmedium. Upprepa förfarandet tills att slammet anses vara fritt från överflödigt substrat eller inhibitor.
|
30.
|
Efter fullständig återsuspension eller, om det gäller obehandlat slam, ta ett prov strax före användning för bestämning av torrvikten för suspenderade fasta ämnen.
|
31.
|
Ett annat alternativ är att homogenisera aktiverat slam (3–5 g suspenderade fasta ämnen/l). Behandla slammet i en Waring-blandare i 2 minuter på medelhastighet. Låt det blandade slammet sätta sig i 30 minuter eller vid behov längre och dekantera vätskan för användning som inokulat (cirka 10 mg/l mineralmedium).
|
32.
|
Ytterligare minskning av CO2-utveckling i kontrollprovet för bakgrundsvärde kan fås genom att lufta slammet över natten med CO2-fri luft. Använd 4 mg/l fasta ämnen från aktiverat slam som koncentration för inokulatet i detta test (13).
|
Sekundärt avloppsutflöde
33.
|
Alternativt kan inokulat tas från sekundärt utflöde från ett reningsverk eller en enhet i laboratorieskala som i huvudsak tar emot avloppsvatten från hushåll. Håll provet under aeroba förhållanden och använd det samma dag som det tagits eller gör vid behov förkonditionering. Utflödet filtreras genom ett grovfilter för att avlägsna stora partiklar och därefter mäts pH.
|
34.
|
För att minska halten oorganiskt kol gör sparging av filtratet med CO2-fri luft (punkt 15 e) i 1 timme medan pH hålls på 6,5 med hjälp av ortofosforsyra (punkt 20). Därefter återställs pH-värdet till det ursprungliga med natriumhydroxid (punkt 21) och efter sedimentering cirka 1 timme tas en lämplig volym av supernatanten för inokulering. Genom sparging reduceras inokulatets halt av oorganiskt kol. Om t.ex. den maximala rekommenderade volymen av filtrerat utflöde som genomgått sparging (100 ml) per liter vatten använts som inokulat, är mängden oorganiskt kol i kontrollkärlen för bakgrundsvärde mellan 0,4 till 1,3 mg/l (14), vilket representerar 2–6,5 % av testkemikaliens kol vid 20 mg C/l och 4–13 % vid 10 mg C/l.
|
Ytvatten
35.
|
Ett prov tas av lämpligt ytvatten. Provet bör hållas i aeroba förhållanden och användas samma dag som det tas. Vid behov bör provet koncentreras genom filtrering eller centrifugering. Den volym inokulat som används i vart och ett testkärl bör bestämmas enligt kriterierna i punkt 26.
|
Jordar
36.
|
Ett prov tas av lämplig jord på ned till 20 cm djup från jordytan. Stenar, växtrester och invertebrater bör avlägsnas från jordprovet innan det sållas genom 2 mm maskor (vid behov kan provet torkas lite om det är för vått för sållning). Provet bör hållas under aeroba förhållanden och användas samma dag som det tas (om provet transporteras i en löst sluten polyetenpåse kan det förvaras vid 2–4 °C upp till en månad).
|
Förkonditionering av inokulat
37.
|
Inokulatet kan förkonditioneras för försöksförhållandena men får inte föranpassas till testkemikalien. Genom förkonditionering kan man minska bakgrundsutveckling av CO2 i kontrollkärlen. Förkonditionering innebär att aktiverat slam luftas efter utspädning i testmediet till 30 mg/l med fuktig CO2-fri luft upp till 5–7 dagar vid testtemperatur.
|
TESTFÖRFARANDE
Antal flaskor
38.
|
Antalet flaskor (se punkt 15 a) som behövs för ett test beror på analysfrekvensen och testets tidslängd.
|
39.
|
Det rekommenderas att ett triplikat flaskor analyseras efter ett tillräckligt antal tidsintervall så att tiodagarsfönstret kan fastställas. Minst fem testflaskor (se punkt 15 a) från uppsättningarna a, b och c (se punkt 42) analyseras i slutet av testet, som grund för beräkning av 95 %-konfidensintervall för den genomsnittliga procentuella biologiska nedbrytningen.
|
Inokulerat medium
40.
|
Inokulatet används vid en koncentration på 4 mg/l aktiverat slam räknat som torrvikt. Bered omedelbart före användning tillräcklig mängd inokulerat medium genom tillsättning av t.ex. 2 ml lämpligt behandlat aktiverat slam (se punkterna 27–32) med 2 000 mg/l till 1 liter mineralsaltmedium (se punkt 19). När sekundärt avloppsutflöde ska användas, tillsätt upp till 100 ml utflöde (se punkt 33) till 900 ml mineralsaltmedium (se punkt 19) och späd till 1 liter med medium.
|
Beredning av flaskor
41.
|
Alikvoter av inokulerat medium doseras till replikatflaskor så att kvoten mellan ovanförliggande utrymme och vatten är 1:2 (tillsätt t.ex. 107 ml till flaskor med 160 ml kapacitet). Andra kvoter kan användas, men se varningarna i punkt 11. Oavsett vilken typ av inokulat som används är det viktigt att se till att det inokulerade mediet blandas tillräckligt för att säkerställa enhetlig fördelning i testflaskorna.
|
42.
|
Flaskuppsättningarna (punkt 15 a) bereds enligt följande:
a)
|
Testkärl (betecknade FT) som innehåller testkemikalie.
|
b)
|
Kontrollkärl för bakgrundsvärde (betecknade FB) som endast innehåller testmedium plus inokulat; likaså måste alla eventuella kemikalier, lösningsmedel, agenter eller glasfiberfilter som används för att införa testkemikalien i testkärlen tillsättas.
|
c)
|
Kärl (betecknade FC) för kontroll av förfarandet med referenskemikalien.
|
d)
|
Vid behov, kärl (betecknade FI) för kontroll av eventuell inhiberande effekt från testkemikalien som innehåller både testkemikalie och referenskemikalie vid samma koncentrationer (punkt 24) som i flaskorna FT och FC.
|
e)
|
Kärl (betecknade FS) för kontroll av eventuell abiotisk sönderdelning som i led a plus 50 mg/l HgCl2 eller steriliserade på annat sätt (t.ex. i autoklav).
|
|
43.
|
Vattenlösliga testkemikalier och referenskemikalier tillsätts som vattenbaserade stamlösningar (punkterna 22, 23 och 24) så att koncentrationer på 10–20 mg C/l erhålls.
|
44.
|
Olösliga testkemikalier och olösliga referenskemikalier tillsätts flaskorna på olika sätt (se punkt 22 a–e) beroende på testkemikaliens natur, antingen före eller efter tillsättning av inokulerat medium, beroende på metoden för behandling av testkemikalien. Om något av de förfaranden som anges i punkt 22 a–e används ska kontrollflaskorna för bakgrundsvärde FB (punkt 42 b) behandlas på samma sätt, men testkemikalien och referenskemikalien utesluts.
|
45.
|
Flyktiga testkemikalier ska injiceras i förslutna flaskor (punkt 47) med användning av mikrospruta. Dosen beräknas utifrån injicerad volym och testkemikaliens densitet.
|
46.
|
Vid behov bör vatten tillsättas, för att få samma vätskevolym i varje kärl. Det är viktigt att se till att kvoten mellan utrymmet ovanför vätskan och vätska (i regel 1:2) och koncentrationen testkemikalie är sådana att det finns tillräckligt med syre i utrymmet ovanför vätskan för fullständig biologisk nedbrytning.
|
47.
|
Därefter förseglas alla flaskor med t.ex. butylgummipropp (septum) och kapsyllock av aluminium. Om flyktiga kemikalier testas, tillsätts de i detta skede (punkt 45). Om övervakning ska göras av DOC-koncentrationsminskningen i testlösning och tidpunkt noll-analyser göras för ursprunglig koncentration av oorganiskt kol (sterila kontroller, punkt 43 e) eller andra determinanter, tas ett lämpligt prov från testkärlet. Därefter slängs testkärlet och dess innehåll.
|
48.
|
De förslutna flaskorna placeras på ett roterande skakbord (punkt 15 d) där skakhastigheten är tillräcklig för att hålla flaskornas innehåll väl blandat och suspenderat (t.ex. 150–200 rpm), och inkuberas i mörker vid 20 °C som bör hållas inom ± 1 °C.
|
Provtagning
49.
|
Provtagningsschemat beror på lagperioden och den kinetiska hastigheten för testkemikaliens biologiska nedbrytning. Flaskorna tas för analys på provtagningsdagen, och provtagning bör göras minst varje vecka eller oftare (t.ex. två gånger i veckan) om en fullständig nedbrytningskurva önskas. Behövligt antal replikatflaskor tas från skakbordet så att FT, FB och FC representeras, och, i förekommande fall FI och FS (se punkt 42). Testperioden är normalt 28 dagar. Om bionedbrytningskurvan tyder på att platåfasen har nåtts tidigare än efter 28 dagar, kan testet avslutas tidigare. Ta prover från de fem flaskor som reserverats för testdag 28 för analys, och använd resultaten för att beräkna konfidensintervall eller variationskoefficient för procentandelen biologisk nedbrytning. Provtagning från flaskor som representerar kontrollerna av inhibering och abiotisk nedbrytning behöver inte göras lika ofta som för de övriga flaskorna – dag 1 och dag 28 är tillräckligt.
|
Analys av oorganiskt kol
50.
|
CO2-produktionen i flaskorna bestäms genom att mäta ökningen av koncentrationen oorganiskt kol under inkubationen. Det finns två metoder som rekommenderas för mätning av mängden oorganiskt kol som produceras under testet; dessa beskrivs nedan. Eftersom metoderna kan ge något avvikande resultat, bör endast en av metoderna användas vid en testkörning.
|
51.
|
Metod a rekommenderas om mediet sannolikt innehåller rester av t.ex. glasfilterpapper och/eller olöslig testkemikalie. Analysen kan göras med gaskromatograf om kolanalysator inte finns att tillgå. Det är viktigt att flaskorna har testtemperatur eller nära testtemperatur när gasen i utrymmet ovanför vätskan analyseras. Metod b kan vara enklare för laboratorier som använder kolanalysatorer för att mäta oorganiskt kol. Det är viktigt att natriumhydroxidlösningen (punkt 21) som används för att omvandla CO2 till karbonat är antingen nyberedd eller att lösningens halt av oorganiskt kol är känd, så att detta kan beaktas vid beräkning av testresultaten (se punkt 66 b).
|
Metod a: försurning till pH < 3
52.
|
Före varje analyssats ska analysatorn av oorganiskt kol kalibreras med hjälp av en lämplig standard (t.ex. 1 % w/w CO2 i N2). Koncentrerad ortofosforsyra (punkt 20) injiceras genom varje provtagningsflaskas gummipropp för att sänka mediets pH till < 3 (tillsätt t.ex. 1 ml till 107 ml testmedium). Flaskorna sätts tillbaka på skakbordet. Efter en timme på skakbordet i testtemperatur avlägsnas flaskorna, alikvoter (t.ex. 1 ml) av gas dras ur utrymmet ovanför vätskan i varje flaska och injiceras i analysatorn för oorganiskt kol. De uppmätta koncentrationerna oorganiskt kol registreras som mg C/l.
|
53.
|
Principen med denna metod är att efter försurning till pH < 3 och stabilisering vid 20 °C, få en jämviktskonstant för fördelningen av CO2 mellan vätske- och gasfaserna i testflaskorna som är 1,0 när den uppmäts som en koncentration (13). Detta bör demonstreras för testsystemet minst en gång, enligt följande:
Lägg upp flaskor som innehåller 5 och 10 mg/l oorganiskt kol med användning av vattenfritt natriumkarbonat (Na2CO3) i CO2-fritt vatten som beretts genom försurning av vatten till pH 6,5 med koncentrerad ortofosforsyra (punkt 20), med sparging över natten med CO2-fri luft och därefter höjning av pH till neutralt med alkali. Se till att kvoten mellan utrymmet ovanför vätskan och vätskans volym är samma som vid testningen (t.ex. 1:2). Försura och stabilisera till jämvikt enligt beskrivningen i punkt 52 och mät koncentrationerna av oorganiskt kol i både gas- och vätskefasen. Kontrollera att båda koncentrationerna är desamma inom gränserna för försöksfel. Om de inte är det, bör förfarandena ses över. Denna kontroll av fördelningen av oorganiskt kol mellan vätske- och gasfasen behöver inte göras varje gång testet utförs, men kan rutinmässigt göras när kalibrering utförs.
|
54.
|
Om DOC-eliminering ska mätas (endast vattenlösliga testkemikalier) bör proverna tas från vätskefasen i separata (icke-försurade) flaskor, membranfiltreras och injiceras i DOC-analysatorn. Dessa flaskor kan enligt behov användas för andra analyser för mätning av primär bionedbrytning.
|
Metod b: omvandling av CO2 till karbonat
55.
|
Före varje analyssats ska analysatorn för oorganiskt kol kalibreras med hjälp av lämplig standard, t.ex. en lösning av natriumbikarbonat (NaHCO3) i CO2-fritt vatten (se punkt 53) inom området 0–20 mg/l räknat som oorganiskt kol. Natriumhydroxidlösning (7 M, punkt 21) (t.ex. 1 ml till 107 ml medium) injiceras genom varje provtagningsflaskas gummipropp och flaskorna skakas i en timme vid testtemperaturen. Använd samma NaOH-lösning för alla flaskor som tas till provtagning på en viss dag, men inte nödvändigtvis för alla provtagningar under hela testets gång. Om absoluta bakgrundsvärden för oorganiskt kol krävs vid alla provtagningar, måste bestämning av oorganiskt kol göras för NaOH-lösningen varje gång den används. Flaskorna tas ur skakbordet och innehållet får sätta sig. Lämpliga volymer (t.ex. 50–1 000 μl) av vätskefasen i varje kärl dras ut med injektionsspruta. Proverna injiceras i analysatorn för oorganiskt kol och koncentrationerna registreras. Man bör se till att analysatorn är tillbörligt utrustad för att tåla de alkaliska prover som analyseras i denna metod.
|
56.
|
Principen med metoden är att efter tillsättning av alkali och omskakning, ska koncentrationen av oorganiskt kol i utrymmet ovanför vätskan vara negligerbar. Detta bör kontrolleras för testsystemet minst en gång med användning av standarder för oorganiskt kol, tillsats av alkali, jämviktsstabilisering och mätning av koncentrationen oorganiskt kol både i gas- och vätskefasen (se punkt 53). Koncentrationen i gasfasen bör närma sig noll. Denna kontroll av virtuell fullständig absorption av CO2 behöver inte göras varje gång testet utförs.
|
57.
|
Om DOC-eliminering ska mätas (endast vattenlösliga testkemikalier) bör proverna tas från vätskefasen i separata flaskor (som inte innehåller tillsatt alkali), membranfiltreras och injiceras i DOC-analysatorn. Dessa flaskor kan enligt behov användas för andra analyser för mätning av primär bionedbrytning.
|
DATA OCH RAPPORTERING
Beräkning av resultaten
58.
|
Utifrån ett antagande om 100 % mineralisering av testkemikalie till CO2, motsvarar det ThIC utöver det som produceras i kontrollkärlen för bakgrundsvärde det TOC som tillfördes till varje testkärl i testets början, vilket betyder att
Totalmassan (mg) oorganiskt kol (TIC) i varje flaska är då
|
Ekvation 1
|
där:
VL
|
=
|
volymen vätska i flaskan (liter),
|
CL
|
=
|
koncentrationen oorganiskt kol i vätskan (mg/l räknat som kol),
|
VH
|
=
|
gasfasens volym (liter),
|
CH
|
=
|
koncentrationen oorganiskt kol i gasfasen (mg/l räknat som kol).
|
Beräkningarna av totalt oorganiskt kol för de två analysmetoderna som används för mätning av oorganiskt kol i detta test beskrivs nedan i punkterna 60 och 61. Den procentuella bionedbrytningen (% D) i vart och ett fall fås genom följande:
|
Ekvation 2
|
där:
TICt
|
=
|
mg TIC i testflaskan vid tidpunkten t,
|
TICb
|
=
|
genomsnitt för mg TIC i kontrollflaskorna för bakgrundsvärde vid tidpunkten t,
|
TOC
|
=
|
mg TOC som i början tillfördes testkärlet.
|
Den procentuella andelen biologisk nedbrytning % D beräknas för flaskorna för test (FT), referens (FC) och, om inhibitionsövervakning görs, övervakning (FI) utifrån de respektive mängder TIC som producerats fram till varje provtagningstidpunkt.
|
59.
|
Om det har förekommit en betydande ökning av TIC i de sterila kontrollerna (FS) över testperioden, kan man sannolikt sluta sig till att det har förekommit abiotisk nedbrytning av testkemikalien, och detta måste beaktas vid beräkning av D i ekvation 2.
|
Försurning till pH < 3
60.
|
Eftersom försurning till pH < 3 och balansering till jämvikt leder till utjämning av TIC-koncentrationen i vätske- och gasfaserna, behöver endast IC-koncentrationen i gasfasen mätas. Från ekvation 1 fås således
, där VB = serumflaskans volym. |
Omvandling av CO2 till karbonat
61.
|
I denna metod görs beräkningarna såsom i ekvation 1, men den negligerbara mängden IC i gasfasen ignoreras, dvs.
och
. |
Presentation av resultaten
62.
|
En bionedbrytningskurva fås genom att plotta den procentuella biologiska nedbrytningen D mot inkubationstiden och, om möjligt, lagfasen, bionedbrytningsfasen, tiodagarsfönstret och platåfasen (den fas då maximal nedbrytning har uppnåtts och bionedbrytningskurvan fasar ut). Om det finns jämförbara resultat för parallella testkärl FT (< 20 % skillnad), plottas en genomsnittskurva (se figur 1 i tillägg 2), och om inte, plottas kurvor för varje kärl. Genomsnittsvärdet för den procentuella bionedbrytningen i platåfasen bestäms eller det högsta värdet uppskattas (t.ex. när kurvan går nedåt i platåfasen), men i det senare fallet bör man se upp att det inte handlar om ett utomliggande värde. Ange i testrapporten den maximala nivån av biologisk nedbrytning såsom testkemikaliens grad av bionedbrytning. Om antalet testkärl inte varit tillräckligt för att platåfasen ska framgå, används uppmätta data under testets sista dag för att beräkna ett medelvärde. Detta sista värde, medelvärdet av fem replikat, indikerar den precision med vilken den procentuella biologiska nedbrytningen bestämts. Rapportera också det värde som erhölls i slutet av tiodagarsfönstret.
|
63.
|
Plotta på samma sätt en kurva för referenskemikalien FC och, i förekommande fall, för den abiotiska elimineringskontrollen FS och inhiberingskontrollen FI.
|
64.
|
Mängderna TIC i kontrollkärlen (FB) registreras, liksom mängderna i flaskorna FS (abiotisk kontroll), om dessa kärl har ingått i testet.
|
65.
|
Beräkna D för FI-kärlen, på grundval av teoretiskt IC-värde uppskattat endast från blandningens referenskomponent. Om på dag 28 [(DFC
(22) – DFI
(23))/DFC] × 100 > 25 %, kan man anta att testkemikalien har inhiberat inokulatets aktivitet och detta kan vara orsaken till lägre värden på DFT som erhållits under testbetingelserna. Då måste testet upprepas med en lägre testkoncentration och helst även med mindre DIC i inokulatet och TIC som bildas i kontrollkärlen, eftersom den lägre koncentrationen annars minskar metodens precision. Alternativt kan ett annat inokulat användas. Om det i flaskorna FS (abiotiska) observeras en betydande ökning (> 10 %) av mängden TIC, kan abiotiska nedbrytningsprocesser ha inträffat.
|
Resultatens giltighet
66.
|
Ett test anses vara giltigt om
a)
|
den genomsnittliga procentuella nedbrytningen i FC-kärl (som innehåller referenskemikalie) är > 60 % senast den 14:e dagen efter inkubation, och
|
b)
|
den genomsnittliga mängden TIC i kontrollkärlen FB i slutet av testet är > 3 mg C/l.
|
Om dessa gränsvärden inte nås, måste testet upprepas med inokulat från en annan källa och/eller testförfarandena bör ses över. Om t.ex. en hög produktion av IC i kontrollkärlen är ett problem, bör förfarandet enligt punkterna 27–32 användas.
|
67.
|
Om testkemikalien inte når upp till 60 % ThIC och inte visat sig vara inhiberande (punkt 65) kan testet upprepas med ökad koncentration av inokulat (upp till 30 mg/l) aktiverat slam och 100 ml utflöde/l) eller inokulat från andra källor, särskilt om nedbrytningen har legat inom området 20–60 %.
|
Tolkning av resultaten
68.
|
Biologisk nedbrytning > 60 % inom tiodagarsfönstret demonstrerar i detta test att testkemikalien är biologiskt lättnedbrytbar i aeroba betingelser.
|
69.
|
Om gränsvärdet på 60 % ThIC inte uppnås, bestäm pH-värdet i mediet i flaskor som inte har försurats eller alkaliserats – ett värde lägre än 6,5 kan tyda på att nitrifikation har inträffat. Upprepa i så fall testet med en buffertlösning med högre koncentration.
|
Testrapport
70.
|
Sammanställ en tabell med % D för varje flaska med testkemikalie (FT), referenskemikalie (FC) och, i förekommande fall, inhibitionskontroll (FI) för varje provtagningsdag. Om jämförbara resultat erhålls för replikatflaskor, plotta en kurva med genomsnittet av % D mot tiden. Registrera mängden TIC i kontrollerna (FB) och i de sterila kontrollerna (FS) DOC och/eller andra determinanter och den procentuella elimineringen.
|
71.
|
Bestäm genomsnittsvärdet för % D för platåfasen eller använd det högsta värdet om bionedbrytningskurvan går nedåt i platåfasen, och rapportera detta som graden bionedbrytning för testkemikalien. Det är viktigt att se till att i det senare fallet se till att det högsta värdet inte är ett utanförliggande värde.
|
72.
|
Testrapporten ska innehålla följande information:
|
Testkemikalie:
—
|
Trivialnamn, kemisk beteckning, CAS-nummer, strukturformel och relevanta fysikalkemiska egenskaper.
|
—
|
Testkemikaliens renhet (orenheter).
|
|
|
Testbetingelser:
—
|
Hänvisning till denna testmetod.
|
—
|
Beskrivning av testsystemet (t.ex. kärlvolym, kvoten mellan volymen gasfas och volymen vätskefas, omrörningsmetod osv.).
|
—
|
Applicering av testkemikalie och referenskemikalie till testsystemet, testkoncentration och mängd kol som doserats till var och en testflaska, eventuell användning av lösningsmedel.
|
—
|
Uppgifter om inokulat, eventuell förbehandling och förkonditionering.
|
—
|
Validering av IC-analysens princip.
|
—
|
Huvudegenskaper för IC-analysatorn (och alla andra analysmetoder som använts).
|
|
|
Resultat:
—
|
Rådata och beräknade värden för biologisk nedbrytning i tabellform.
|
—
|
Kurva över procentuell nedbrytning av test- och referenskemikalierna mot tiden, lagfas, nedbrytningsfas, tiodagarsfönster och lutning.
|
—
|
Procentandelen eliminering vid platåfasen, vid testets slut och efter tiodagarsfönstret.
|
—
|
Motiveringar för eventuella förkastade testresultat
|
—
|
Övriga fakta som är relevanta för de förfaranden som har använts.
|
—
|
Diskussion om resultaten.
|
|
|
LITTERATUR
(1)
|
Kapitel C.4 i denna bilaga, Bestämning av ”lätt” bionedbrytbarhet – CO2-utveckling (metod C.4-C).
|
(2)
|
Sturm R. N. (1973), ”Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation”, J.A,.Oil Chem Soc. 50, s. 159–167.
|
(3)
|
Larson R. J. (1979), ”Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals”, Appl Env. Microbiol. 38, s. 1153–1161.
|
(4)
|
Larson R. J., Hansmann M. A. och Bookland E. A. (1996), ”Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants”, Chemosphere 33, s. 1195–1210.
|
(5)
|
ISO 9439 (1990; reviderad 1999), Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
|
(6)
|
US EPA (1996), ”Fate, Transport and Transformation Test Guideline”, 835, ”3110 Carbon dioxide evolution test”, Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC.
|
(7)
|
US EPA (1996), ”Fate, Transport and Transformation Test Guideline”, 835, 3100, ”Aerobic aquatic biodegradation”, Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC.
|
(8)
|
Gledhill W. E., (1975), ”Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate”, Appl Microbiol. 30, s. 922–929.
|
(9)
|
Weytjens D., Van Ginneken I. och Painter H. A. (1994), ”The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability”, Chemosphere 28, s. 801–812.
|
(10)
|
Ennis D. M. och Kramer A. (1975), ”A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides”, J. Food Sci. 40, s. 181–185.
|
(11)
|
Ennis D. M., Kramer A., Jameson C. W., Mazzoccki P. H. och Bailey P. H. (1978), Appl. Env. Microbiol. 35, s. 51–53.
|
(12)
|
Boatman R. J., Cunningham S. L. och Ziegler D. A. (1986), ”A method for measuring the biodegradation of organic chemicals”, Env. Toxicol. Chem. 5, s. 233–243.
|
(13)
|
Struijs J. och Stoltenkamp J. (1990), ”Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test”, Ecotox. Env. Safety 19, s. 204–211.
|
(14)
|
Birch R. R. och Fletcher R. J. (1991), ”The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability”, Chemosphere 23, s. 507–524.
|
(15)
|
Birch R. R., Biver C., Campagna R., Gledhill W. E., Pagga U., Steber J., Reust H. och Bontinck W. J. (1989), ”Screening of chemicals for anaerobic biodegradation”, Chemosphere 19, s. 1527–1550.
|
(16)
|
ISO 14593, (1999), Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C02 headspace test).
|
(17)
|
Battersby N. S. (1997), ”The ISO headspace C02 biodegradation test”, Chemosphere 34: s. 1813–1822.
|
(18)
|
US EPA (1996), ”Fate, Transport and Transportation”, Series 835, 3120, ”Sealed vessel carbon dioxide production test”, Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
|
(19)
|
Battersby N. S., Ciccognani D., Evans M. R., King D., Painter H.A., Peterson D. R. och Starkey M. (1999), ”An ”inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test”, Chemosphere 38, s. 3219–3235.
|
(20)
|
Kapitel C.4 i denna bilaga, Bestämning av ”lätt” bionedbrytbarhet.
|
(21)
|
OECD, 1988, ”OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI)”, Paris.
|
(22)
|
Kapitel C.11 i denna bilaga, Biologisk nedbrytbarhet – Aktiverat slam – Respirationshämningstest.
|
(23)
|
Struijs J., Stoltenkamp-Wouterse M. J. och Dekkers A. L. M. (1995), ”A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests”, Biodegradation 6, s. 319–327.
|
(24)
|
EU (1999), ”Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697”, Water Research Centre, maj 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
|
(25)
|
ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
|
Tillägg 1
FÖRKORTNINGAR OCH DEFINITIONER
IC: oorganiskt kol.
ThCO2: teoretisk koldioxid (mg) är den mängd koldioxid som enligt beräkningar produceras från känd eller beräknad kolhalt i testkemikalien vid fullständig mineralisering, också uttryckt som mg koldioxid som utvecklas per mg testkemikalie.
DOC: upplöst organiskt kol är den mängd organiskt kol som finns i lösningen eller som passerar ett 0,45-mikrometers filter eller som blir kvar i centrifugatet efter centrifugering vid cirka 4 000 g (cirka 40 000 m s-2) i 15 minuter.
DIC: upplöst oorganiskt kol.
ThIC: teoretiskt oorganiskt kol.
TIC: totalt oorganiskt kol.
lätt bionedbrytbar: en godtycklig klass kemikalier som har klarat vissa specifika screeningtester för fullständig bionedbrytning; dessa tester är så krävande att man antar att kemikalierna snabbt bryts ned fullständigt i vattenmiljö i aeroba betingelser.
tiodagarsfönster: de 10 dagar som följer omedelbart efter att 10 % biologisk nedbrytning har uppnåtts.
lätt biologisk nedbrytbarhet: en klassificering för en kemikalie för vilken det finns otvetydiga belägg för biologisk nedbrytbarhet (primär eller fullständig) i alla tester för biologisk nedbrytbarhet.
fullständig aerob biologisk nedbrytning: den nivå av nedbrytning som nås när testkemikalien har förbrukats totalt av mikroorganismer under utveckling av koldioxid, vatten, mineralsalter och nya mikrobiella celler (biomassa).
mineralisering: mineralisering är en fullständig nedbrytning av en organisk kemikalie till CO2 och H2O i aeroba förhållanden, och till CH4, CO2 och H2O i anaeroba förhållanden.
lagfas: tiden från teststart fram till acklimatisering och/eller anpassning av de nedbrytande mikroorganismerna och när nivån för biologisk nedbrytning av en testkemikalie eller organiskt material har nått upp till en detekterbar nivå (t.ex. 10 % teoretisk biologisk nedbrytning, eller lägre, beroende på mätningsteknikens precision).
nedbrytningsfas: tiden från lagfasens slut fram till den tidpunkt då 90 % av maximinivån för nedbrytning har nåtts.
platåfas: platåfasen inträffar när maximal nedbrytning har uppnåtts och bionedbrytningskurvan fasar ut.
testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.
Tillägg 2
Exempel på en bionedbrytningskurva
Figur 1
Biologisk nedbrytning av 1-oktanol i CO2 Headspace-test
Ordlista:
Bionedbrytning
Nedbrytningsfas
Maximal bionedbrytning
Platåfas
Tiodagarsfönster
Testningstid (dagar)
C.30 BIOACKUMULERING I JORDLEVANDE OLIGOCHAETER (FÅBORSTMASKAR)
INLEDNING
1.
|
Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 317 (2010). Bland testmetoderna rörande omvandling, spridning och nedbrytning i miljön publicerades Biokoncentration: Genomflödestest med fisk (kapitel C.13 i denna bilaga (49)) och bioackumulering i sedimentlevande bottenlevande oligochaeter (53) 1996 respektive 2008. Att extrapolera data om bioackumulering i vattenlevande organismer till jordlevande organismer såsom daggmaskar är svårt eller omöjligt. Modellberäkningar baserade på en testkemikalies lipofilicitet, t.ex. (14) (37), används för närvarande för bedömning av bioackumulering av kemikalier i jord, såsom t.ex. i EU:s tekniska vägledningsdokument (19). Behovet av en miljöspecifik testmetod har redan tagits upp, t.ex. (55). En sådan metod är särskilt viktig för utvärdering av sekundär förgiftning i livsmedelskedjan för jordlevande organismer (4). Det finns flera nationella testmetoder som behandlar bioackumulering i andra organismer än fisk, t.ex. (2) och (72). En metod för mätning av bioackumulering från förorenade jordar i daggmaskar (Eisenia fetida, Savigny) och ringmaskar har utvecklats av American Society for Testing and Materials (3). Genom en internationellt accepterad metod för bestämning av bioackumulering i spikad jord förbättras riskbedömningen av kemikalier i ekosystem i jordar, t.ex. (25) (29).
|
2.
|
Jordätande invertebrater utsätts för jordbundna kemikalier. Bland dessa spelar jordlevande oligochaeter (fåborstmaskar) en viktig roll för jordarnas struktur och funktion (15) (20). Jordlevande oligochaeter lever i jorden och delvis på jordytan (särskilt i förnaskiktet) och de representerar ofta de vanligaste arterna i termer av biomassa (54). Genom att dessa sköter bioturbation av jorden och även utgör byte kan de ha en stark inverkan på kemikaliers biotillgänglighet för andra organismer såsom invertebrater (t.ex. jagande kvalster och skalbaggar, t.ex. (64)) eller jagande ryggradsdjur (t.ex. rävar och måsar) (18) (62). Vissa arter av jordlevande oligochaeter som för närvarande används för ekotoxikologisk testning beskrivs i tillägg 5.
|
3.
|
I ASTM:s Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid Potworm Enchytraeus albidus (3) finns många väsentliga och användbara uppgifter för hur man kan genomföra denna testmetod för bioackumulering. Övriga dokument som det hänvisas till inom den här testmetoden är kapitel C.13 i denna bilaga, Biokoncentration: Genomflödestest med fisk (49) och OECD:s testriktlinje 315: bioackumulering i sedimentlevande bottenlevande oligochaeter (53). Testmetoden bygger också i hög grad på praktisk erfarenhet från studier om bioackumulering i jordar och publicerad litteratur, t.ex. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79).
|
4.
|
Testmetoden lämpar sig bäst för stabila, neutrala organiska kemikalier som tenderar att adsorberas till jordar. Testning av bioackumulering av stabila metallorganiska föreningar som binds till jord kan göras med denna testmetod. Testet kan också användas för metaller och andra spårelement.
|
FÖRUTSÄTTNINGAR
5.
|
Tester för mätning av bioackumulering av en kemikalie i jordlevande oligochaeter har gjorts med tungmetaller (se t.ex. (63)) och långlivade organiska kemikalier med log Kow-värden mellan 3,0 och 6,0, t.ex. (40). Sådana tester kan också användas för
—
|
kemikalier som har log Kow på 6,0 eller högre (superhydrofoba kemikalier),
|
—
|
kemikalier som tillhör en klass av organiska kemikalier som är kända för att ha potential att bioackumuleras i levande organismer, t.ex. ytaktiva eller mycket adsorptiva kemikalier,
|
—
|
kemikalier vars strukturella egenskaper indikerar potential för bioackumulering, t.ex. analoger till kemikalier med känd bioackumuleringspotential,
|
|
6.
|
Information om testkemikalien, såsom trivialnamn, kemiskt namn (helst enligt IUPAC), strukturformel, CAS-nummer, renhet, säkerhetsåtgärder, lämpliga lagringsförhållanden och analysmetoder bör inhämtas innan studien inleds. Därutöver bör det finnas information om
b)
|
fördelningskoefficient oktanol-vatten, Kow,
|
c)
|
fördelningskoefficient jord-vatten, Koc,
|
e)
|
nedbrytbarhet (t.ex. i jord, vatten),
|
|
7.
|
Radioaktivmärkta eller inte radioaktivmärkta testkemikalier kan användas. För att underlätta analysen rekommenderas dock radioaktivmärkta testkemikalier. Beslutet bör baseras på detektionsgränser eller krav på att mäta ursprunglig kemikalie och metaboliter. Om en radioaktivmärkt testkemikalie används och totala radioaktiva rester mäts, är det viktigt att de radioaktivmärkta resterna både i jorden och i testorganismerna analyseras för procentandelar av ursprunglig testkemikalie och radioaktivmärkta metaboliter, t.ex. i prover som tas i stabilt tillstånd eller i slutet av upptagningsfasen, för att göra det möjligt att beräkna bioackumuleringsfaktor (BAF) för den ursprungliga testkemikalien och berörda metaboliter i jorden (se punkt 50). Den metod som beskrivs här måste eventuellt modifieras, t.ex. för att ge tillräcklig biomassa för mätning av organiska testkemikalier som inte är radioaktivmärkta eller metaller. När totalmängden radioaktiva rester har uppmätts (genom vätskescintillationsräkning efter extraktion, förbränning eller vävnadsupplösning), baserar sig bioackumuleringsfaktorn på den ursprungliga kemikalien och metaboliterna. Beräkningen av bioackumuleringsfaktorn bör helst baseras på den ursprungliga testkemikaliens koncentration i organismerna och totalmängden radioaktiva rester. Ackumuleringsfaktorn biota-jord (BSAF), normaliserad till maskens fettinnehåll och jordens halt organiskt kol (OC) ska alltså beräknas utifrån BAF, med tanke på jämförbarhet mellan resultat från olika bioackumuleringstest.
|
8.
|
Testkemikaliens toxicitet för de arter som används i testet bör vara känd, t.ex. en effektkoncentration (ECx) eller en dödlig koncentration (LCx) vid tidpunkten för upptagningsfasen, t.ex. (19). Den valda koncentrationen för testkemikalien bör helst vara 1 % av akut asymptotiskt LC50 och bör vara minst tiofaldig jämfört med detektionsgränsen i jord med den analysmetod som används. Helst bör toxicitetsvärden, om sådana finns, från långvariga studier om subletala endpoints användas (51) (52). Om sådana uppgifter inte finns kan test om akut toxicitet ge värdefull information (se t.ex. (23)).
|
9.
|
Det bör finnas en lämplig analysmetod med känd exakthet, precision och känslighet för kvantifiering av kemikalien i testlösningarna, i jorden och i det biologiska materialet, tillsammans med uppgifter om beredning och lagring av såväl prover som säkerhetsdatablad. De analytiska detektionsgränserna för testkemikalien i jord och maskvävnad bör också vara kända. Om en 14C-märkt testkemikalie används, bör den specifika radioaktiviteten (Bq mol–1) och den procentuella andelen radioaktivitet associerad med orenheter vara kända. Testkemikaliens specifika radioaktivitet bör vara tillräckligt hög för att möjliggöra analys, och de testkoncentrationer som används får inte framkalla toxiska effekter.
|
10.
|
Testet kan genomföras med syntetiska eller naturliga jordar. Information om egenskaper hos naturlig jord som används, t.ex. ursprung eller beståndsdelar, pH, halten organiskt kol, partikelstorleksfördelning (procentandel sand, dy och lera) och vattenhållningskapacitet (WHC), bör vara känd innan testet inleds (3) (48).
|
PRINCIP FÖR TESTMETODEN
11.
|
Till de parametrar som karakteriserar en testkemikalies bioackumulering hör bioackumuleringsfaktorn (BAF), upptagningskonstanten (ks) och elimineringskonstanten (ke). Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.
|
12.
|
Testet består av två faser: upptagningsfasen (exponering) och elimineringsfasen (efter exponering). Under upptagningsfasen exponeras replikerade grupper av maskar för jord som har spikats med testkemikalien. I tillägg till testdjuren hålls kontrollgrupper av maskar under identiska förhållanden utan testkemikalie. Testorganismernas torrvikt och fettinnehåll mäts. Detta kan göras med maskarna i kontrollgruppen. Analytiska bakgrundsvärden kan fås genom att analysera prover av kontrollmaskarna och kontrolljorden. För elimineringsfasen flyttas maskarna till en jord som inte innehåller testkemikalie. En elimineringsfas krävs alltid, med undantag för om upptaget av testkemikalie under exponeringen har varit obetydligt. Elimineringsfasen ger information om den hastighet med vilken testkemikalien utsöndras av testorganismerna (se t.ex. (27)). Om stabilt tillstånd inte uppnås under upptagningsfasen bör bestämningen av de kinetiska parametrarna – kinetisk bioackumuleringsfaktor BAFk, upptagnings- och elimineringskonstanterna – helst baseras på simultan anpassning av resultaten från upptagnings- och elimineringsfaserna. Koncentrationen av testkemikalie i/på maskarna kontrolleras under testets båda faser.
|
13.
|
Under upptagningsfasen görs mätningar vid provtagningstidpunkterna upp till 14 dagar (enchytraeider) eller 21 dagar (daggmaskar) tills stabilt tillstånd uppnås (11) (12) (67). Stabilt tillstånd uppnås när en kurva som plottas för koncentrationen i maskarna mot tiden blir parallell med tidsaxeln, och tre på varandra följande koncentrationsanalyser på prover som tas med minst två dagars mellanrum inte varierar med mer än ± 20 % sinsemellan baserat på statistiska jämförelser (t.ex. variansanalys, regressionsanalys).
|
14.
|
För elimineringsfasen överförs testorganismerna till kärl som innehåller samma substrat men ingen testkemikalie. Under elimineringsfasen görs mätningar vid provtagningstidpunkterna under 14 dagar (enchytraeider) eller 21 dagar (daggmaskar), utom om tidigare analytisk bestämning visar en minskning på 90 % av testkemikalierester i maskarna. Koncentrationen av testkemikalie i maskarna i slutet av elimineringsfasen rapporteras som icke-eliminerade rester. Bioackumuleringsfaktorn vid stabilt tillstånd (BAFss) beräknas helst både som kvoten mellan koncentrationen i maskarna (Ca) och i jorden (Cs) vid uppenbar klart fastställt stabilt tillstånd, och som en kinetisk bioackumuleringsfaktor (BAFK) som kvoten mellan upptagningsfaktorn (ks) och elimineringskonstanten (ke) (för definitioner, se tillägg 1) utifrån ett antagande om första ordningens kinetik (för beräkningar, se tillägg 2). Om första ordningens kinetik uppenbart inte kan tillämpas, bör andra modeller användas.
|
15.
|
Upptagningskonstanten, elimineringskonstanten (eller konstanterna, om andra modeller ingår), den kinetiska bioackumuleringsfaktorn (BAFK) och, där det är möjligt, konfidensgränserna för var och en av dessa parametrar beräknas utifrån datoriserade modellekvationer (se vägledning i tillägg 2). Anpassningens kvalitet (Goodness of fit) för valfri modell kan göras t.ex. utifrån korrelationskoefficienten eller determinationskoefficienten (koefficienter nära ett tyder på god kvalitet) eller testas med chi-två-test. Även värdet på medelfelet eller konfidensgränsen kring de uppskattade parametrarna kan ge indikation på anpassningens kvalitet för modellen.
|
16.
|
För att minska testresultatens variation för testkemikalier med hög lipofilicitet bör bioackumuleringsfaktorerna uttryckas i förhållande till fettinnehållet och halten organiskt kol (kg organiskt kol i jorden per kg fett i mask). Denna princip är baserad på att det för vissa kemiska klasser finns ett klart samband mellan potentialen för bioackumulering och lipofilicitet, vilket har klart etablerats för fisk (47). Det finns ett förhållande mellan fettinnehållet i fisk och bioackumulering av sådana kemikalier. För bottenlevande (bentiska) organismer har man funnit liknande korrelationer (se t.ex. (30) (44)). Denna korrelation har även påvisats för jordlevande oligochaeter (se t.ex. (5), (6), (7) (14)). Om tillräcklig mängd maskvävnad finns att tillgå, kan testdjurens fettinnehåll bestämmas på samma biologiska material som används för bestämning av koncentrationen testkemikalie. Alternativt kan kontrolldjur användas för mätning av fettinnehållet.
|
TESTETS GILTIGHET
17.
|
För att ett test ska vara giltigt måste följande kriterier uppfyllas för både kontroll- och behandlingsgrupperna:
—
|
Vid slutet av testet får den totala dödligheten under upptagnings- och elimineringsfaserna inte överskrida 10 % (daggmaskar) eller 20 % (enchytraeider) av det totala antalet tillförda maskar.
|
—
|
För Eisenia fetida och Eisenia andrei får medelförlusten uppmätt vid slutet av upptagningsfasen och vid slutet av elimineringsfasen inte överskrida 20 % jämfört med den ursprungliga färskvikten vid start av varje fas.
|
|
METODBESKRIVNING
Testarter
18.
|
Det finns flera arter av jordlevande oligochaeter som rekommenderas för testning av bioackumulering. De oftast använda arterna Eisenia fetida, Eisenia andrei (Lumbricidae), Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus eller Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae) beskrivs i tillägg 5.
|
Apparatur
19.
|
Uppmärksamhet bör fästas vid att undvika användning av material (gäller alla delar av utrustningen) som kan upplösas, adsorbera testkemikalien eller läcka andra kemikalier och som kan ha negativa effekter på testdjuren. Standardmässiga rektangulära eller cylindriska kärl gjorda av kemiskt inert material kan användas, av lämplig storlek för antalet testmaskar. Rostfritt stål, plast eller glas kan användas för utrustning som är i kontakt med testmediet. Testkärlen ska vara tillbörligen täckta så att maskarna inte kan komma ut, samtidigt som tillräcklig lufttillförsel säkerställs. För kemikalier med höga adsorptionskoefficienter, såsom syntetiska pyretroider, kan det vara nödvändigt med silaniserat glas. I sådana situationer måste utrustningen kasseras efter användning (49). Det är viktigt att se till att radioaktivmärkta testämnen och flyktiga kemikalier inte kan läcka ut. Det bör finnas fällor (t.ex. gastvättflaskor av glas) som innehåller lämpliga adsorbenter som håller kvar eventuella rester som avdunstar från testkärlen.
|
Jord
20.
|
Testjorden bör ha en kvalitet som ger testorganismerna möjlighet att överleva och helst föröka sig under acklimatiserings- och testperioderna utan avvikelser från normalt utseende och beteende. Maskarna bör vara inne i jorden.
|
21.
|
Den syntetiska jord som beskrivs i kapitel C.8 i denna bilaga (48) rekommenderas som substrat för testningarna. Beredning av syntetisk jord för användning i bioackumuleringstest och rekommendationer för hur denna jord ska lagras beskrivs i tillägg 4. Lufttorkad syntetisk jord kan förvaras i rumstemperatur fram till användningen.
|
22.
|
Även naturliga jordar från oförorenade platser kan användas som test- och/eller odlingsjord. För naturjordar bör minst anges ursprung (insamlingsplats), pH, halten organiskt kol, partikelstorleksfördelning (procentandel sand, dy och lera), maximal vattenhållningskapacitet (WHCmax) och procentuell andel vatten (3). Analys av jorden eller dess beståndsdelar med avseende på mikroföroreningar bör ge användbar information. Om fältjord från odlingsmark används, får den inte ha behandlats med växtskyddsprodukter eller gödsel från behandlade djur under minst ett år eller med organiska gödselmedel under minst sex månader innan jordprovet tas (50). De förfaranden som används för hantering av naturjordar innan dessa jordar används i ekotoxikologiska test med oligochaeter i laboratoriet beskrivs i (3). För naturjordar bör förvaringstiden i laboratoriet minimeras.
|
Applicering av testkemikalien
23.
|
Testkemikalien blandas in i jorden. Testkemikaliens fysikalkemiska egenskaper bör beaktas. En vattenlöslig testkemikalie bör upplösas fullständigt i vatten innan den blandas med jorden. Det rekommenderade spikningsförfarandet för dåligt vattenlösliga kemikalier är att en eller flera beståndsdelar i (den syntetiska) jorden beläggs med testkemikalien. Till exempel kan kvartssand eller en del av den dränkas in med en lösning av testkemikalien i lämpligt organiskt lösningsmedel som får avdunsta långsamt tills det torkat bort. Därefter kan den belagda jordfraktionen blandas i den våta jorden. En viktig fördel med detta förfarande är att inget lösningsmedel tillförs jorden. När naturjord används kan testkemikalien tillsättas genom att spika en lufttorkad del av jorden enligt det som beskrivs ovan för syntetisk jord, eller genom att blanda in testkemikalien i våt jord, med ett efterföljande avdunstningssteg om ett solubiliseringsmedel används. Allmänt taget bör man så långt som möjligt undvika kontakt mellan våt jord och lösningsmedel. Följande bör beaktas (3):
—
|
Om annat lösningsmedel än vatten används, bör det vara blandningsbart med vatten och/eller kunna avlägsnas (t.ex. genom avdunstning) så att endast testkemikalien blir kvar i jorden.
|
—
|
Om lösningsmedelskontroll används behövs ingen negativ kontroll. Lösningsmedelskontrollen bör ha den högsta koncentrationen av lösningsmedel som tillförs jorden och lösningsmedlet bör härstamma från samma sats som används för beredning av stamlösningen. Lösningsmedlets toxicitet och flyktighet och testkemikaliens löslighet i det valda lösningsmedlet bör vara de huvudsakliga kriterierna vid valet av lämpligt solubiliseringsmedel.
|
|
24.
|
För kemikalier med dålig löslighet i vatten och organiska lösningsmedel kan 2,0–2,5 g finmald kvartssand per testkärl blandas med mängden testkemikalie, t.ex. genom mortling, för att få önskad testkoncentration. Blandningen av kvartssand och testkemikalie tillförs den förhandsfuktade jorden och blandas omsorgsfullt med lämplig mängd avjoniserat vatten för att få önskad fukthalt. Den slutliga blandningen fördelas i testkärlen. Förfarandet upprepas för varje testkoncentration och likaså bereds en lämplig kontroll med 2,0–2,5 g finmald kvartssand per testkärl.
|
25.
|
Koncentrationen av testkemikalie i jorden bör fastställas efter spikning. Innan testorganismerna tillförs jorden bör det kontrolleras att testkemikalien är homogent fördelad i jorden. Metoden för spikning och motivering för valet av ett visst spikningsförfarande bör rapporteras (24).
|
26.
|
Jämvikten mellan jorden och porvattenfasen bör idealiskt sett etableras innan organismerna tillförs; en tidsperiod på fyra dagar vid 20 °C rekommenderas. För ett antal dåligt vattenlösliga organiska kemikalier kan tiden för att nå faktisk jämvikt mellan adsorberade och upplösta fraktioner räknas i dagar eller månader. Beroende på studiens ändamål, t.ex. om man vill efterlikna vissa miljöförhållanden, kan den spikade jorden få ”åldras” för en längre period, t.ex. för metaller i tre veckor vid 20 °C (22).
|
Odling av testorganismer
27.
|
Maskarna bör helst hållas i en permanent laboratorieodling. Vägledning om laboratorieodlingsmetoder för Eisenia fetida och Eisenia andrei och arter av enchytraeider finns i tillägg 5 (se också (48) (51) (52)).
|
28.
|
Maskarna som används för testet bör vara fria från synliga sjukdomar, abnormaliteter och parasiter.
|
TESTFÖRFARANDE
29.
|
Testorganismerna exponeras för testkemikalien under upptagningsfasen. Upptagningsfasen ska pågå i 14 dagar (enchytraeider) eller 21 dagar (daggmaskar) utom om det kan påvisas att stabilt stadium har uppnåtts.
|
30.
|
För elimineringsfasen flyttas maskarna till en jord som inte innehåller testkemikalie. Den första provtagningen bör göras 4–24 timmar efter elimineringsfasens början. Exempel på provtagningsschema för en 21-dagars upptagningsfas och en 21-dagars elimineringsfas finns i tillägg 3.
|
Testorganismer
31.
|
Många arter av jordlevande enchytraeider har en mycket låg individuell vikt (t.ex. 5–10 mg våtvikt per individ för Enchytraeus albidus och mindre för Enchytraeus crypticus eller Enchytraeus luxuriosus). För vägning och kemisk analys kan det vara nödvändigt att poola maskarna i replikattestkärlen (dvs. alla maskar i ett replikatkärl för att få de analytiska vävnadsresultaten). Tjugo individer enchytraeider tillförs varje replikat, och antalet replikat bör vara minst tre. Om testkemikaliens analytiska detektionsgräns är hög kan det krävas flera maskar. För testarter med högre individuell vikt (Eisenia fetida och Eisenia andrei) kan replikatkärl med en enda individ användas.
|
32.
|
Daggmaskar som används i ett test bör ha liknande vikt (t.ex. Eisenia fetida och Eisenia andrei bör ha en individuell vikt på 250–600 mg). Enchytraeider (t.ex. Enchytraeus albidus) bör ha en längd på cirka 1 cm. Alla maskar som används i ett visst test bör komma från samma källa och vara vuxna individer med clitellum (gördel) (se tillägg 5). Eftersom ett djurs vikt och ålder kan påverka BAF-värdena (t.ex. beroende på varierande fettinnehåll och/eller förekomsten av ägg), bör dessa parametrar registreras noggrant och beaktas vid tolkningen av resultaten. Dessutom kan kokonger deponeras under exponeringsperioden, vilket också påverkar BAF-värdena. Det rekommenderas att ett delprov av testmaskarna vägs före testet för att få en uppskattning av våt och torr medelvikt.
|
33.
|
Förhållandet mellan jord och maskar bör vara högt för att minimera sjunkande koncentration av testkemikalien i jorden under upptagningsfasen. För Eisenia fetida och Eisenia andrei bör det finnas en minimimängd på 50 g jord (torrvikt) per mask och för enchytraeider rekommenderas en minimimängd på 10–20 g jord (torrvikt) per testkärl. Jordlagret i kärlen bör vara 2–3 cm (enchytraeider) eller 4–5 cm (daggmaskar).
|
34.
|
Testmaskarna tas bort ur odlingen (t.ex. enchytraeider med användning av guldsmedstång). Vuxna exemplar överförs till obehandlad testjord för acklimatisering och ges föda (se punkt 36). Om testbetingelserna avviker från odlingsbetingelserna bör en acklimatiseringsfas på 24–72 timmar vara tillräcklig för att maskarna ska anpassa sig till testbetingelserna. Efter acklimatiseringen sköljs maskarna genom att överföras till glaskärl (t.ex. petriskålar) som innehåller rent vatten, och därefter vägs maskarna innan de överförs till testjorden. Före vägningen ska överskottsvatten avlägsnas från maskarna genom att försiktigt stryka av dem längs skålens kant eller försiktigt torka av dem med en lätt fuktad pappersduk.
|
35.
|
Testorganismernas nedgrävningsbeteende bör observeras och registreras. I test med daggmaskar gräver sig djuren (kontroll och behandling) in i jorden inom några timmar; detta bör kontrolleras senast 24 timmar efter att maskarna har placerats i testkärlen. Om maskarna inte gräver in sig i jorden (t.ex. över 10 % mer än hälften av maskarna i upptagningsfasen), tyder detta på att testbetingelserna är olämpliga eller att testorganismerna inte är friska. Då bör testet stoppas och göras på nytt. Enchytraeiderna vistas i huvudsak i jordens håligheter och det är vanligt att deras integument inte alltid kommer i kontakt med omgivande substrat; exponeringen av grävande och icke-grävande enchytraeider antas vara ekvivalent och om enchytraeiderna inte gräver in sig i jorden betyder detta inte nödvändigtvis att testet måste upprepas.
|
Utfodring
36.
|
Utfodring rekommenderas om jorden har låg halt totalt organiskt kol. Om syntetisk jord används rekommenderas veckovis utfodring (dvs. maskarna får föda en gång i veckan) med 7 mg torr dynga per g torrvikt jord för daggmaskar och en veckovis mängd på 2–2,5 mg malda havreflingor per g torrvikt jord för enchytraeider (11). Den första portionen föda bör blandas med jorden omedelbart innan testorganismerna tillförs. Helst ska samma typ av föda som i odlingarna användas (tillägg 5).
|
Ljus och temperatur
37.
|
Testningarna bör genomföras med en kontrollerad ljus/mörker-cykel på 16/8 timmar, helst med 400–800 lx i området där testkärlen finns (3). Testtemperaturen bör vara 20 ± 2 °C under hela testet.
|
Testkoncentrationer
38.
|
En enda koncentration används. Om ytterligare koncentrationer används måste detta motiveras. Om testkemikaliens toxicitet (ECx) ligger nära den analytiska detektionsgränsen rekommenderas användning av radioaktivmärkt testkemikalie med hög specifik radioaktivitet. För metaller bör koncentrationen ligga över bakgrundsnivåerna i vävnad och jord.
|
Replikat
39.
|
För kinetikmätningar (upptagnings- och elimineringsfaserna) bör det finnas minst tre behandlade replikatkärl per provtagningspunkt. Totalantalet replikat som bereds bör vara tillräckligt för att täcka alla provtagningstidpunkter under upptagnings- och elimineringsfaserna.
|
40.
|
För biologiska observationer och mätningar (t.ex. förhållandet mellan torrvikt och våtvikt, fettinnehåll) samt för analys av bakgrundskoncentrationerna i maskar och jord, bör minst 12 replikatkärl med negativ kontroll (fyra provtagningar vid start, fyra vid slutet av upptagningen och fyra vid slutet av elimineringen) beredas om inget annat lösningsmedel än vatten används. Om solubiliseringsmedel används för applicering av testkemikalien bör det finnas en lösningsmedelskontroll (fyra replikatkärl för provtagningen vid start, fyra vid slutet av upptagningen och fyra vid slutet av elimineringen) som innehåller alla beståndsdelar utom testämnet och som körs i tillägg till de behandlade replikaten. I detta fall kan fyra ytterligare replikatkärl med negativ kontroll (inget lösningsmedel) även användas för frivillig provtagning i slutet av upptagningsfasen. Dessa replikat kan jämföras biologiskt med lösningsmedelskontrollen för att få information om eventuella effekter av lösningsmedlet på testorganismerna. Likaså rekommenderas ett tillräckligt antal ytterligare reservreplikatkärl (t.ex. åtta) för behandling och kontroll(er).
|
Frekvens för kvalitetsmätning av jord
41.
|
Vid start och slut av upptagnings- och elimineringsfaserna bör jordens pH, fukthalt och temperatur mätas (kontinuerligt). En gång per vecka bör jordens fukthalt kontrolleras genom att väga testkärlen och jämföra de vikterna med vikterna vid testets början. Vattenförlust bör kompenseras genom tillförsel av avjoniserat vatten.
|
Provtagning och analys av maskar och jord
42.
|
Exempel på ett schema för upptagnings- och eliminationsfaserna i bioackumuleringstest för daggmaskar och enchytraeider finns i tillägg 3.
|
43.
|
Jordprover tas från testkärlen för bestämning av koncentrationen testkemikalie innan maskarna tillförs, samt under upptagnings- och elimineringsfaserna. Under testet bestäms koncentrationerna testkemikalie i maskarna och jorden. I regel mäts de totala koncentrationerna i jorden. Alternativt kan koncentrationerna i porvatten mätas, och då bör motivering och lämpliga metoder fastställas innan studien inleds, och inkluderas i rapporten.
|
44.
|
Prover av maskar och jord tas minst sex gånger under upptagnings- och elimineringsfaserna. Om man kan påvisa att testkemikalien är stabil, kan antalet jordanalyser reduceras. Det rekommenderas att minst tre replikat analyseras i början och slutet av upptagningsfasen. Om koncentrationen i jord uppmätt i slutet av upptagningsfasen avviker från den ursprungliga koncentrationen med mer än 30 %, bör även jordprover som tagits andra dagar analyseras.
|
45.
|
Ta bort maskarna i ett givet replikat varje gång prover ska tas (t.ex. genom att sprida ut jorden på en grund bricka och plocka bort maskarna med en mjuk guldsmedstång), och skölj dem snabbt i vatten på en grund glas- eller stålbricka. Avlägsna överflödigt vatten (se punkt 34). Överför maskarna försiktigt till ett förhandsvägt kärl och väg omedelbart kärlet plus maskar inklusive tarminnehåll.
|
46.
|
Därefter bör daggmaskarna (Eisena sp.) lämnas över natten för tömning av tarminnehåll, t.ex. på ett fuktat filterpapper i en täckt petriskål (se punkt 34). Efter tömningen bestäms maskarnas vikt i syfte att bedöma eventuell minskning av biomassa under testet (se giltighetskriterierna i punkt 17). Vägning och vävnadsanalys av enchytraeider görs utan tarmtömning, eftersom detta är tekniskt svårt på grund av att maskarna är så små. Efter slutlig viktbestämning bör maskarna avlivas omedelbart med lämpligaste metod (t.ex. med flytande kväve eller nedfrysning under 18 °C).
|
47.
|
Under elimineringsfasen ersätter maskarna förorenat tarminnehåll med ren jord. Det betyder att mätningar i otömda maskar (i detta fall enchytraeider) som tas ut omedelbart före elimineringsfasen inkluderar förorenad jord i tarmen. För vattenlevande oligochaeter antas att största delen av förorenat tarminnehåll har ersatts med rent sediment efter de första 4–24 timmarna av elimineringsfasen (se t.ex. (46)). Liknande resultat har rapporterats för daggmaskar i studier rörande ackumulering av radioaktivmärkt kadmium och zink (78). För icke-tömda enchytraeider kan koncentrationen i detta första prov från elimineringsfasen anses vara koncentrationen i vävnad efter tarmtömning. För att beakta den utspädning av testämneskoncentrationen som kan tillskrivas oförorenad jord under elimineringsfasen kan tarminnehållets vikt uppskattas från förhållandena mellan maskarnas våtvikt/askvikt eller torrvikt/askvikt.
|
48.
|
Jord- och maskproverna bör helst analyseras omedelbart efter att de tagits (inom 1–2 dagar) för att undvika nedbrytning eller andra förluster, och det rekommenderas att ungefärliga värden för upptagning och eliminering beräknas medan testet framskrider. Om analysen måste vänta, bör proverna förvaras på lämpligt sätt, t.ex. i djupfryst form (≤ –18 °C).
|
49.
|
Kontroll bör göras av att den kemiska analysens precision och reproducerbarhet, såväl som extraktion av testkemikalie från jord- och maskproverna är tillfredsställande för den metod det gäller, och extraktionseffektiviteten, detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ) bör rapporteras. Dessutom bör man kontrollera att testkemikalien inte kan detekteras i kontrollkärlen i koncentrationer som är högre än bakgrunden. Om koncentrationen av testkemikalie i testorganismen Ca är > 0 i kontrollmaskarna, bör detta inkluderas i beräkningen av de kinetiska parametrarna (se tillägg 2). Genom hela testet bör alla prover hanteras med tanke på minsta möjliga förorening och förlust (t.ex. till följd av att testkemikalien adsorberas på provtagningsutrustningen).
|
50.
|
När radioaktivitetsmärkta testkemikalier används är det möjligt att analysera ursprunglig kemikalie och metaboliter. Kvantifiering av ursprunglig testkemikalie och metaboliter vid stabilt tillstånd eller i slutet av upptagningsfasen ger viktig information. Proverna bör sedan putsas upp så att den ursprungliga testkemikalien kan kvantifieras separat. Om mängden av en enskild metabolit överskrider 10 % av den totala radioaktiviteten i det analyserade provet (de analyserade proverna) rekommenderas identifiering av dessa metaboliter.
|
51.
|
Det totala utbytet, och utbytet av testkemikalie i maskar, jord och i förekommande fall fällor med adsorbenter som fångar upp avdunstad testkemikalie, bör registreras och rapporteras.
|
52.
|
Pooling av enskilda prover från ett givet testkärl godtas för enchytraeider som är mindre än daggmaskar. Om poolingen inbegriper minskning av antalet replikat, begränsas de statistiska förfaranden som kan användas på erhållna data. Om det krävs ett specifikt statistiskt förfarande och en specifik tyngd, bör testet omfatta tillräckligt många replikatkärl för att få den pooling, det förfarande och den tyngd som önskas.
|
53.
|
Det rekommenderas att BAF uttrycks både som funktion av total torrvikt och, när så krävs (t.ex. för starkt hydrofoba kemikalier), som en funktion av fettinnehållet. Lämpliga metoder bör användas för bestämning av fettinnehållet (vissa befintliga metoder, t.ex. (31) (58), bör anpassas för ändamålet). Dessa metoder bygger på en kloroform/metanol-extraktionsteknik. För att undvika klorerade lösningsmedel bör en modifiering av Bligh och Dyer-metoden (9) enligt beskrivningen i (17) användas. Eftersom de olika metoderna inte ger identiska värden, är det viktigt att beskriva den metod som använts. Om det är möjligt, dvs. om det finns tillräckligt med maskvävnad att tillgå, bör analysen av fettinnehåll helst göras på samma prov eller extrakt som det som används för analys av testkemikalien, eftersom fetterna ofta måste avlägsnas från extraktet innan det kan analyseras kromatografiskt (49). Alternativt kan kontrolldjur användas för att mäta fettinnehållet, som sedan kan användas för att normalisera BAF-värdena. Det senare förfarandet minskar föroreningen av utrustningen med testkemikalien.
|
DATA OCH RAPPORTERING
Behandling av resultaten
54.
|
Upptagningskurvan för testkemikalien erhålls genom att plotta koncentrationen i/på maskarna under upptagningsfasen mot tiden enligt aritmetisk skala. När kurvan har nått en platå eller stabilt tillstånd (se definitionerna i tillägg 1) kan bioackumuleringsfaktorn vid stabilt tillstånd BAFss beräknas enligt följande:
Ca är testkemikaliens koncentration i testorganismen
Cs är testkemikaliens koncentration i jorden
|
55.
|
Om stabilt tillstånd inte uppnås bör man i stället för att bestämma BAFss bestämma BAFK på grundval av upptagnings- och elimineringskonstanterna, enligt följande:
—
|
Bestäm ackumuleringsfaktorn (BAFK) som kvoten ks/ke.
|
—
|
Upptagning och eliminering ska helst beräknas samtidigt (se ekvation 11 i tillägg 2).
|
—
|
Elimineringskonstanten (ke) bestäms i regel från elimineringskurvan (koncentrationen av testämnet i maskarna under elimineringsfasen). Därefter beräknas upptagningskonstanten ks utifrån ke, och ett värde på Ca som härleds från upptagningskurvan – se tillägg 2 för en beskrivning av dessa metoder. För att få BAFK och konstanterna ks och ke rekommenderas datorstödda icke-linjära parameteruppskattningsmetoder. Om elimineringen uppenbart inte är av första ordningen bör mer komplexa modeller användas.
|
|
Testrapport
56.
|
Testrapporten ska innehålla följande information:
|
Testkemikalie:
—
|
All tillgänglig information om akut toxicitet eller långtidstoxicitet (t.ex. ECx, LCx„ NOEC) av testkemikalien på jordlevande oligochaeter.
|
—
|
Renhet, fysikalisk natur och fysikalkemiska egenskaper, t.ex. log Kow, vattenlöslighet.
|
—
|
Kemisk identifiering, källa, identitet och koncentration för eventuella lösningsmedel som använts.
|
—
|
Om radioaktivmärkta testkemikalier används, uppgifter om exakt position för de märkta atomerna, specifik radioaktivitet och radiokemisk renhet.
|
|
|
Testarter:
—
|
Vetenskapligt namn, stam, eventuell förbehandling, acklimatisering, ålder, storleksintervall osv.
|
|
|
Testbetingelser:
—
|
Belysningens typ, egenskaper och ljusperiod(er).
|
—
|
Testets utformning (t.ex. antalet kärl, kärlstorlek, jordmassa, jordlagrets tjocklek, antalet replikat, antalet maskar per replikat, antalet testkoncentrationer, upptagnings- och elimineringsfasernas varaktighet samt provtagningsfrekvens.
|
—
|
Motivering för valet av testkärlens material.
|
—
|
Metod för beredning och applicering av testämne samt motivering för valet av en specifik metod.
|
—
|
Nominella testkoncentrationer, medelvärde för uppmätta värden och deras standardavvikelse i testkärlen och metoden för att erhålla dessa värden.
|
—
|
Källa för beståndsdelarna i syntetisk jord eller – om naturligt medium används – jordens ursprung, beskrivning av eventuell förbehandling, resultat för kontrollerna (överlevnad, utveckling av biomassa och reproduktion), jordens egenskaper (pH, totalhalten organiskt kol, partikelstorleksfördelning (procent sand, dy och lera), WHCmax, procentandelen vatten vid testets början och slut samt alla andra mätningar som har gjorts.
|
—
|
Detaljerad information om behandling av jord- och maskprover, inbegripet detaljer om beredning, lagring, spikningsförfaranden, extraktion och analytiska förfaranden (inklusive precision) för testämne i maskar och jord, fettinnehåll (om uppmätt) och utbyte för testämnet.
|
|
|
Resultat:
—
|
Mortalitet för kontrollmaskarna och maskarna i varje testkärl och allt observerat onormalt beteende (t.ex. undvikande av jorden och utebliven reproduktion i bioackumuleringstest med enchytraeider).
|
—
|
Förhållandet mellan torrvikt och våtvikt för jorden och testorganismerna (utnyttjas vid normalisering).
|
—
|
Maskarnas våtvikt vid varje provtagningstidpunkt; för daggmaskar våtvikterna vid testets början och vid varje provtagningstidpunkt före och efter tarmtömning.
|
—
|
Testorganismernas fettinnehåll (om detta bestäms).
|
—
|
Kurvor som visar upptagnings- -och elimineringskinetiken för testkemikalien i maskarna och tiden fram till stabilt tillstånd.
|
—
|
Ca och Cs (med standardavvikelse och område, om lämpligt) för alla provtagningstidpunkter (Ca uttryckt som g per kg våtvikt och torrvikt för hela kroppen, Cs uttryckt som g per kg våtvikt och torrvikt för jord). Om det krävs en ackumuleringsfaktor biota-jord (BSAF) (t.ex. för jämförelse av resultat från två eller flera test med djur som har olika fettinnehåll), kan Ca även uttryckas som g per kg fettinnehåll i organismen och Cs kan uttryckas som g per kg organiskt kol i jorden.
|
—
|
BAF (uttryckt som kg jord per kg mask), jordens upptagningskonstant ks (uttryckt som g jord per kg mask per dag) och elimineringskonstanten ke (uttryckt per dag), BSAF (uttryckt som kg totalt organiskt kol i jorden per kg fettinnehåll i mask) kan också rapporteras.
|
—
|
Om uppmätt: procentandelen ursprunglig kemikalie, metaboliter och bundna rester (den procentandel testkemikalie som inte kan extraheras med vanliga extraktionsmetoder) som detekteras i jord och testdjur.
|
—
|
Metoder som använts för statistiska analyser av data.
|
|
|
Utvärdering av resultaten
—
|
Resultatens överensstämmelse med giltighetskriterierna som förtecknas i punkt 17.
|
—
|
Oförväntade eller ovanliga resultat, t.ex. ofullständig eliminering av testkemikalien från testdjuren.
|
|
|
LITTERATUR
(1)
|
Amorim M. (2000), ”Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus”, examensarbete, University Coimbra.
|
(2)
|
ASTM (2000), ”Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates”, American Society for Testing and Materials, E 1688–00a.
|
(3)
|
ASTM International (2004), ”Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus”, ASTM International (2004), s. 26.
|
(4)
|
Beek B., Boehling S., Bruckmann U., Franke C., Joehncke U., Studinger G. (2000), ”The assessment of bioaccumulation”, I Hutzinger, O. (red.) The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek), ”Bioaccumulation - New Aspects and Developments”, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, s. 235–276.
|
(5)
|
Belfroid A., Sikkenk M., Seinen W., Van Gestel C., Hermens J. (1994), ”The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil”, Environ. Toxicol. Chem. 13, s. 93–99.
|
(6)
|
Belfroid A., Van Wezel A., Sikkenk M., Van Gestel C., Seinen W. och Hermens J. (1993). ”The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water”, Ecotox. Environ. Safety 25, s. 154–165.
|
(7)
|
Belfroid A., Meiling J., Drenth H., Hermens J., Seinen W., Van Gestel C. (1995), ”Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei)”, Ecotox. Environ. Safety 31, s. 185–191.
|
(8)
|
Bell A. W. (1958), ”The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus”, ann. Mus. Novitat. 1902, s. 1–13.
|
(9)
|
Bligh E. G. och Dyer W. J. (1959), ”A rapid method of total lipid extraction and purification”, Can. J. Biochem. Pysiol. 37, s. 911–917.
|
(10)
|
Bouche M. (1972), ”Lombriciens de France. Ecologie et Systematique”, INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, s. 671.
|
(11)
|
Bruns E., Egeler Ph., Moser T., Römbke J., Scheffczyk A, Spörlein P. (2001a), ”Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten”, rapport till tyska federala miljöbyrån (Umweltbundesamt Berlin), R&D nr 298, s. 64–416.
|
(12)
|
Bruns E., Egeler Ph., Römbke J. Scheffczyk A., Spörlein P. (2001b), ”Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida)”, Hydrobiologia 463, s. 185–196.
|
(13)
|
Conder J. M. och Lanno R. P. (2003), ”Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida”, J. Soils Sediments 3, s. 13–20.
|
(14)
|
Connell D. W. och Markwell R. D. (1990), ”Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System”, Chemosphere 20, s. 91–100.
|
(15)
|
Didden W. A. M. (1993), ”Ecology of Terrestrial Enchytraeidae”, Pedobiologia 37, s. 2–29.
|
(16)
|
Didden W. (2003), ”Oligochaeta”, i Bioindicators and biomonitors, Markert, B. A., Breure, A.M. och Zechmeister, H. G. (red.) Elsevier Science Ltd, Nederländerna, s. 555–576.
|
(17)
|
De Boer J., Smedes F., Wells D., Allan A. (1999), ”Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish”, Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
|
(18)
|
Dietrich D. R., Schmid P., Zweifel U., Schlatter C., Jenni-Eiermann S., Bachmann H., Bühler U., Zbinden N. (1995), ”Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study”Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29, s. 140–145.
|
(19)
|
Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, EUT L 396, 30.12.2006, s. 1.
|
(20)
|
Edwards C. A. och Bohlen P. J. (1996), ”Biology and ecology of earthworms”, Tredje utgåvan, Chapman & Hall, London, s. 426.
|
(21)
|
OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
(22)
|
Egeler Ph., Gilberg D., Scheffczyk A., Moser Th. och Römbke J. (2009), ”Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten)”, rapport till tyska federala miljöbyrån (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D nr 204 67 458, s. 149. Finns för nedladdning på: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf
|
(23)
|
Elmegaard N. och Jagers op Akkerhuis G. A. J. M. (2000), ”Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations”, National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325, s. 57.
|
(24)
|
Environment Kanada (1995), ”Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant”, Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
|
(25)
|
EPPO (2003), ”Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions”, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33, s. 195–208.
|
(26)
|
Franke C. (1996), ”How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment?”, Chemosphere 32, s. 1897–1905.
|
(27)
|
Franke C., Studinger G., Berger G., Böhling S., Bruckmann U., Cohors-Fresenborg D., Jöhncke U., (1994), ”The assessment of bioaccumulation”, Chemosphere 29, s. 1501–1514.
|
(28)
|
Füll C. (1996), ”Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae)”, Dissertation University Mainz, s. 156.
|
(29)
|
Füll C., Schulte C., Kula C. (2003), ”Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer”, UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15, s. 78–84.
|
(30)
|
Gabric A. J., Connell D. W., Bell P. R. F. (1990), ”A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes”, Wat. Res. 24, s. 1225–1231.
|
(31)
|
Gardner W. S., Frez W. A., Cichocki E. A., Parrish C. C. (1985), ”Micromethods for lipids in aquatic invertebrates”, Limnology and Oceanography 30, s. 1099–1105.
|
(32)
|
Hawker D. W. och Connell D. W. (1988), ”Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish”, Wat. Res. 22, s. 701–707.
|
(33)
|
Hund-Rinke K. och Wiechering H. (2000), ”Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests”, J. Soils Sediments 1, s. 15–20.
|
(34)
|
Hund-Rinke K., Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000), ”Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests” ingår i ”Toxikologische Beurteilung von Böden”, Heiden, S., Erb, R., Dott, W. och Eisentraeger, A. (red.), Spektrum Verl., Heidelberg, s. 59–81.
|
(35)
|
ISO 11268–2 (1998), Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Del 2: Determination of effects on reproduction.
|
(36)
|
Jaenike J. (1982), ”Eisenia foetida is two biological species”, Megadrilogica 4, s. 6–8.
|
(37)
|
Jager T. (1998), ”Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta)”, Environ. Toxicol. Chem. 17, s. 2080–2090.
|
(38)
|
Jager T., Sanchez P. A., Muijs B., van der Welde E., Posthuma L. (2000), ”Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil”, Environ. Toxicol. Chem. 19, s. 953–961.
|
(39)
|
Jager T., Baerselman R., Dijkman E., De Groot A. C., Hogendoorn E. A., DeJong A., Kruitbosch J. A. W., Peijnenburg W. J. G. M. (2003a), ”Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures”, Environ. Toxicol. Chem. 22, s. 767–775.
|
(40)
|
Jager T., Fleuren R. L. J., Hoogendoorn E., de Korte G. (2003b), ”Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta)”, Environ. Sci. Technol. 37, s. 3399–3404.
|
(41)
|
Janssen M. P. M., Bruins A., De Vries T. H., Van Straalen N. M. (1991), ”Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species”, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20, s. 305–312.
|
(42)
|
Kasprzak K, (1982), ”Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems”, Pedobiologia 23, s. 217–232.
|
(43)
|
Khalil A. M. (1990), ”Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern”, Dissertation University München, s. 137.
|
(44)
|
Landrum P. F. (1989), ”Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi”, Environ. Sci. Toxicol. 23, s. 588–595.
|
(45)
|
Marinussen M. P. J. C., Van der Zee S. E. A. T. M., De Haan F. A. (1997), ”Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions”, Ecotox. Environ. Safety 36, s. 17–26.
|
(46)
|
Mount D. R., Dawson T. D., Burkhard L. P. (1999), ”Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates”, Environ. Toxicol. Chem. 18, s. 1244–1249.
|
(47)
|
Nendza M. (1991), ”QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations”, i R. Nagel och R. Loskill (red.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
|
(48)
|
Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar.
|
(49)
|
Kapitel C.13 i denna bilaga, Biokoncentration: Genomflödesprovning med fisk.
|
(50)
|
Kapitel C.21 i denna bilaga, Jordlevande mikroorganismer: Test rörande omvandling av kväve.
|
(51)
|
OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
(52)
|
OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
(53)
|
OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
|
(54)
|
Petersen H. och Luxton M. (1982), ”A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes”, Oikos 39, s. 287–388.
|
(55)
|
Phillips D. J. H. (1993), ”Bioaccumulation”, ingår i Handbook of Ecotoxicology Vol. 1, Calow P. (red.). Blackwell Scientific Publ., Oxford, s. 378–396.
|
(56)
|
Pflugmacher J. (1992), ”Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten”, UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox, 4, s. 77–81.
|
(57)
|
Posthuma L., Weltje L., Anton-Sanchez F. A. (1996), ”oint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida”, RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
|
(58)
|
Randall R. C., Lee II H., Ozretich R. J., Lake J. L., Pruell R. J. (1991), ”Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation”, Environ.Toxicol. Chem. 10, s. 1431–1436.
|
(59)
|
Römbke J., Egele P., Füll C. (1998), ”Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium”, UBA-Texte 28/98, 84 S.
|
(60)
|
Römbke J. och Moser Th. (1999), ”Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test”UBA-Texte 4/99, s. 373.
|
(61)
|
Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000), ”Enchytraeen als Testorganismen”, i ”Toxikologische Beurteilung von Böden”, Heiden S., Erb, R., Dott, W. och Eisentraeger, A. (reds), Spektrum Verl., Heidelberg, s. 105–129.
|
(62)
|
Romijn CA. FM., Luttik R., Van De Meent D., Slooff W.,Canton J. H. (1993), ”Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains”, Ecotox. Envir. Safety 27, s. 107–127.
|
(63)
|
Sample B. E., Suter D. W., Beauchamp J. J., Efroymson R. A. (1999), ”Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation”, Environ. Toxicol. Chem. 18, s. 2110–2120.
|
(64)
|
Schlosser H. J. och Riepert F. (1992), ”Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung”, Zool. Beitr. NF 34, s. 413–433.
|
(65)
|
Schmelz R. och Collado R. (1999), ”Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida)”, Carolinea 57, s. 93–100.
|
(66)
|
Sims R. W. och Gerard B. M. (1985), ”Earthworms”, i Kermack D. M. och Barnes R. S. K. (Hrsg.), Synopses of the British Fauna (New Series) nr 31, 171 S, London, E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
|
(67)
|
Sousa J. P., Loureiro S., Pieper S., Frost M., Kratz W., Nogueira A. J. A., Soares A.M. V. M. (2000), ”Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod”, Environ. Toxicol. Chem. 19, s. 2557–2563.
|
(68)
|
Spacie A. och Hamelink J. L. (1982), ”Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish”, Environ. Toxicol. Chem. 1, s. 309–320.
|
(69)
|
Stephenson G. L., Kaushik A., Kaushik N. K., Solomon K. R., Steele T., Scroggins R. P. (1998), ”Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms”, ingår i ”Advances in earthworm ecotoxicology”, Sheppard S., Bembridge J., Holmstrup M., Posthuma L. (red.), Setac Press, Pensacola, s. 67–81.
|
(70)
|
Sterenborg I., Vork N. A., Verkade S. K., Van Gestel C. A. M., Van Straalen N. M. (2003), ”Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta”, Environ. Toxicol. Chemistry 22, s. 1167–1171.
|
(71)
|
UBA (Umweltbundesamt) (1991), ”Bioakkumulation - Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug”, UBA-Texte 42/91, Berlin.
|
(72)
|
US EPA (2000), ”Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates”, andra utgåvan, EPA 600/R-99/064, US Environmental Protection Agency, Duluth, MN, mars 2000.
|
(73)
|
Van Brummelen T. C. och Van Straalen N. M. (1996), ”Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber”, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31, s. 277–285.
|
(74)
|
Van Gestel C. A. M. 1992), ”The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review”, i Ecotoxicology of Earthworms (red. Becker H., Edwards, P.J., Greig-Smith P. W. och Heimbach F.). Intercept Press, Andover (GB).
|
(75)
|
Van Gestel C. A. och Ma W. C. (1990), ”An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies”, Chemosphere 21, s. 1023–1033.
|
(76)
|
Van Straalen N. M., Donker M. H., Vijver M. G., van Gestel C. A. M. (2005), ”Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates”, Environmental Pollution 136, s. 409–417.
|
(77)
|
Venter J. M. och Reinecke A. J. (1988), ”The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta)”, South African J. Zool. 23, s. 161–165.
|
(78)
|
Vijver M. G., Vink J. P. M., Jager T., Wolterbeek H. T., van Straalen N. M., van Gestel C. A. M. (2005), ”Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil”, Soil Biol, Biochem. 37, s. 1843–1851.
|
(79)
|
Widianarko B. och Van Straalen N. M. (1996), ”Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15, s. 402–406.
|
Tillägg 1
DEFINITIONER
|
bioackumulering: ökningen av testkemikaliens koncentration i eller på en organism i förhållande till testkemikaliens koncentration i det omgivande mediet. Bioackumulering uppstår till följd av både biokoncentrations- och biomagnifieringsprocesser (se nedan).
|
|
biokoncentration: ökningen av testkemikaliens koncentration i eller på en organism till följd av upptagning av kemikalien som endast sker från det omgivande mediet (t.ex. via kroppsytan och förtärd jord) i förhållande till testkemikaliens koncentration i det omgivande mediet.
|
|
biomagnifiering: ökningen av testkemikaliens koncentration i eller på en organism, främst till följd av upptagning från förorenad föda eller förorenat byte, i förhållande till testkemikaliens koncentration i födan eller bytet. Biomagnifiering kan leda till överföring eller ackumulering av testämnet inom näringsvävar.
|
|
eliminering: eliminering av en testkemikalie betyder att kemikalien avlägsnas från testorganismens vävnad genom aktiva eller passiva processer som inträffar oberoende av om testämnet finns eller inte finns i det omgivande mediet.
|
|
bioackumuleringsfaktor (BAF): den koncentration av testkemikalien under valfri tidpunkt under upptagningsfasen som förekommer i eller på testorganismen (Ca uttryckt som g per kg torrvikt mask) dividerad med testkemikaliens koncentration i det omgivande mediet (Cs uttryckt som g per kg torrvikt jord); BAF uttrycks med enheten kg jord per kg mask.
|
|
bioackumuleringsfaktor vid stabilt tillstånd (BAFss
): den BAF som gäller vid stabilt tillstånd och som inte förändras betydligt över en längre tidsperiod medan koncentrationen av testkemikalie i det omgivande mediet (Cs uttryckt som g per kg torrvikt jord) är konstant under denna tidsperiod.
|
|
kinetisk bioackumuleringsfaktor (BAFK): de bioackumuleringsfaktorer som beräknas direkt från förhållandet mellan upptagningskonstant och elimineringskonstant (ks och ke, se nedan).
|
|
bioackumuleringsfaktor biota-jord (BSAF): den fettnormaliserade koncentrationen av testkemikalien i eller på testorganismen dividerad med den organiskt kol-normaliserade koncentrationen av testkemikalien vid stabilt tillstånd. Ca uttrycks som g per kg fettinnehåll i organismen och Cs som g per kg organiskt innehåll i jorden; BSAF har enheten kg organiskt kol per kg fett.
|
|
platå eller stabilt tillstånd: jämvikt råder mellan upptagnings- och elimineringsprocesser som inträffar samtidigt under exponeringsfasen. Stabilt tillstånd syns i kurvan över BAF mot tiden när kurvan blir parallell med tidsaxeln och tre på varandra följande analyser av BAF på prover som tagits med minst två dagars mellanrum ligger inom 20 % från varandra, och det inte finns några statistiskt signifikanta skillnader mellan de tre provtagningsperioderna. För testkemikalier som tas upp långsamt är det lämpligare med ett intervall på sju dagar (49).
|
|
fördelningskoefficienten organiskt kol-vatten (Koc): förhållandet mellan en kemikalies koncentration i eller på jordens fraktion av organiskt kol och kemikaliens koncentration i vatten vid jämvikt.
|
|
fördelningskoefficienten oktanol-vatten (Kow): förhållandet mellan en kemikalies löslighet i n-oktanol och i vatten vid jämvikt; uttrycks även som Pow. Logaritmen av Kow (log Kow) används som indikator för en kemikalies potential för bioackumulering i vattenlevande organismer.
|
|
upptagnings- eller exponeringsfasen: den tid under vilken testorganismerna är exponerade för testkemikalien.
|
|
upptagningskonstant (ks): ett numeriskt värde som definierar hur snabbt koncentrationen av testämnet ökar i eller på testorganismen till följd av upptagning från jordfasen; ks uttrycks som g jord per kg mask per dag.
|
|
elimineringsfas: den tid efter överföringen av testorganismerna från ett förorenat medium till ett medium som inte innehåller testämne, under vilken eliminering (eller nettoförlust) av kemikalien från testorganismerna studeras.
|
|
elimineringskonstant (ke): det numeriska värde som definierar reduktionshastigheten för koncentrationen av testämne i eller på testorganismen efter överföring av testorganismerna från ett medium som innehåller testämnet till ett medium som inte innehåller testämnet; ke uttrycks som d-1.
|
|
testkemikalie: alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.
|
Tillägg 2
Beräkning av upptagnings- och elimineringsparametrar
Den huvudsakliga endpointen för ett bioackumuleringstest är bioackumuleringsfaktorn BAF. Uppmätt BAF kan beräknas genom att dividera koncentrationen i testorganismen Ca med koncentrationen i jorden Cs vid stabilt tillstånd. Om stabilt tillstånd inte uppnås under upptagningsfasen beräknas BAFK utifrån konstanterna i stället för utifrån BAFSS. Det bör dock finnas en anmärkning om huruvida BAF är baserat på koncentrationer vid stabilt tillstånd eller inte.
Den vanliga metoden för att få fram kinetisk bioackumuleringsfaktor (BAFK), upptagningskonstant (ks) och elimineringskonstant (ke) är att använda icke-linjära datorbaserade parameteruppskattningsmetoder, t.ex. baserade på de modeller som beskrivs i (68). Utifrån en viss uppsättning sekventiella tid-koncentrationsdata och modellekvationerna
|
0 < t < tc
|
(ekvation 1)
|
eller
|
t > tc
|
(ekvation 2)
|
där
Ca
|
=
|
koncentrationen kemikalie i maskar (g per kg våt- eller torrvikt)
|
ks
|
=
|
upptagningshastigheten i vävnad (g jord per kg mask per dag)
|
Cs
|
=
|
koncentrationen kemikalie i jord (g per kg våt- eller torrvikt)
|
ke
|
=
|
elimineringskonstant (d-1)
|
tc
|
=
|
tidpunkten vid slutet av upptagningsfasen
|
beräknar dessa datorprogram värden för BAFK, ks och ke.
Om bakgrundskoncentrationen i icke-exponerade maskar t.ex. på dag 0 avviker betydligt från noll (kan vara fallet t.ex. för metaller) bör denna bakgrundskoncentration Ca,0 införlivas i ekvationerna, enligt följande:
|
0 < t < tc
|
(ekvation 3)
|
och
|
t > tc
|
(ekvation 4)
|
Om en signifikant minskning av testkemikaliekoncentrationen i jorden kan observeras över tid under upptagningsfasen, kan följande modeller användas, t.ex. (67) (79):
|
(ekvation 5)
|
där
Cs
|
=
|
kemikaliekoncentrationen i jorden (g per kg våt- eller torrvikt)
|
k0
|
=
|
sönderfallskonstant i jord (d-1)
|
C0
|
=
|
ursprunglig kemikaliekoncentration i jord (g per kg våt- eller torrvikt)
|
|
0 < t < tc
|
(ekvation 6)
|
|
t > tc
|
(ekvation 7)
|
där
Ca
|
=
|
koncentrationen kemikalie i maskar (g per kg våt- eller torrvikt)
|
ks
|
=
|
upptagningshastigheten i vävnad (g jord per kg mask per dag)
|
k0
|
=
|
sönderfallskonstant i jord (d-1)
|
ke
|
=
|
elimineringskonstant (d-1)
|
tc
|
=
|
tidpunkten vid slutet av upptagningsfasen.
|
Om stabilt tillstånd nås under upptagningsfasen (t.ex. t = ∞) kan ekvation 1
|
0 < t < tc
|
(ekvation 1)
|
reduceras till
eller
|
(ekvation 8).
|
Då är ks/ke x Cs en tillnärmning av testämneskoncentrationen i maskvävnad vid stabilt tillstånd (Ca,ss).
Ackumuleringsfaktorn biota-jord (BSAF) kan beräknas enligt följande:
|
(ekvation 9)
|
där foc är fraktionen organiskt kol i jorden och flip är fraktionen fett i maskar, båda helst bestämda på prover som tagits i testet och på grundval av torrvikt eller våtvikt.
Elimineringskinetiken kan modelleras med stöd av data från elimineringsfasen och med tillämpning av följande modellekvation och en datorstödd icke-linjär metod för modelluppskattning. Om datapunkterna plottade mot tiden indikerar en konstant exponentiell minskning av testämneskoncentrationen i djuren, kan en one-compartment-modell (ekvation 9) användas för att beskriva elimineringens tidsförlopp.
|
(ekvation 10)
|
Elimineringsprocesserna verkar i bland ha två faser med en snabb minskning av Ca till en början och därefter en långsammare avgång av testämne senare under elimineringen, t.ex. (27) (68). De två faserna kan tolkas genom antagande om att det finns två olika enheter i organismen från vilka testämnet avgår med olika hastigheter. I sådana fall bör information inhämtas från specifik litteratur, t.ex. (38) (39) (40) (78).
Med användning av modellekvationerna ovan kan de kinetiska parametrarna ks och ke även kalkyleras i ett steg genom att samtidigt tillämpa modeller för första ordningens kinetik på alla data från både upptagnings- och elimineringsfasen. Beskrivning av en metod som ger möjlighet till en sådan kombinerad beräkning av upptagnings- och elimineringskonstanter kan sökas i hänvisningarna (41), (73) och (70).
|
(ekvation 11)
|
Anmärkning:
|
När upptagnings- och elimineringsparametrar uppskattas samtidigt utifrån kombinerade upptagnings- -och elimineringsdata är ”m” såsom visas i ekvation 11 en deskriptor som gör det möjligt för datorprogrammet att tilldela ekvationens subtermer till datauppsättningarna för respektive fas och göra utvärderingen korrekt (m = 1 för upptagningsfasen och m = 2 för elimineringsfasen).
|
Dessa modellekvationer bör dock användas med försiktighet, särskilt när det sker ändringar i testkemikaliens biotillgänglighet eller om (bio)nedbrytning sker under testet (se t.ex. (79)).
Tillägg 3
EXEMPEL PÅ SCHEMAN FÖR TEST AV BIOACKUMULERING FRÅN JORDAR
Test med daggmaskar
a)
|
Upptagningsfas med 8 provtagningsdatum som används för beräkning av kinetik.
Dag
|
Aktivitet
|
– 6
|
Konditionering av förberedd jord under 48 timmar.
|
– 4
|
Spikning av jordfraktionen med testkemikalielösning, avdunstning av eventuellt lösningsmedel, blandning av jordbeståndsdelarna, fördelning av jord i testkärlen och stabilisering till jämvikt under testbetingelserna i 4 dagar (3 veckor för metallspikad jord).
|
– 3 till – 1
|
Separation av testorganismerna från odlingen för acklimatisering, beredning och fuktning av jordbeståndsdelarna.
|
0
|
Mätning av temperatur och jordens pH, avlägsnande av jordprover från behandlade kärl och lösningsmedelskontroller för bestämning av testkemikaliens koncentration, tillsats av föda, vägning och slumpvis fördelning av maskarna till testkärlen med bibehållande av tillräckligt antal maskar för bestämning av analytiska bakgrundsvärden, våt- och torrvikt och fettinnehåll, vägning av alla testkärl för kontroll av jordens fukthalt och kontroll av lufttillförsel om stängda testsystem används.
|
1
|
Kontroll av lufttillförsel, registrering av maskarnas beteende och temperatur samt tagning av jord- och maskprover för bestämning av koncentrationen testämne.
|
2
|
Samma som dag 1.
|
3
|
Kontroll av lufttillförsel, maskarnas beteende och temperatur.
|
4
|
Samma som dag 1.
|
5–6
|
Samma som dag 3.
|
7
|
Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen.
|
8–9
|
Samma som dag 3.
|
10
|
Samma som dag 1.
|
11–13
|
Samma som dag 3.
|
14
|
Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen.
|
15–16
|
Samma som dag 3.
|
17
|
Samma som dag 1.
|
18–20
|
Samma som dag 3.
|
21
|
Samma som dag 1: mätning av temperatur och jordens pH, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen, slut på upptagningsfasen, överföring av maskarna från återstående exponerade replikat till kärl som innehåller ren jord för elimineringsfasen (ingen tarmtömning) samt provtagning av jord och maskar från lösningsmedelskontrollerna.
|
|
Aktiviteterna före exponering (stabiliseringsfasen) bör tidplaneras med beaktande av testkemikaliens egenskaper.
|
|
Aktiviteterna för dag 3 bör genomföras dagligen (åtminstone på arbetsdagar).
|
|
b)
|
Elimineringsfas
Dag
|
Aktivitet
|
– 6
|
Beredning och fuktning av jordens beståndsdelar samt konditionering av beredd jord i 48 timmar.
|
– 4
|
Blandning av jordens beståndsdelar, fördelning av jord till testkärlen och inkubation under testbetingelserna i 4 dagar.
|
0 (upptagningsfasens slut)
|
Mätning av temperatur och jordens pH, vägning och slumpmässig fördelning av maskar till testkärlen, tillförsel av föda, överföring av maskar från återstående exponerade replikat till kärl som innehåller ren jord samt tagning av jord- och maskprover efter 4–6 timmar för bestämning av testkemikaliens koncentration.
|
1
|
Kontroll av lufttillförsel, registrering av maskarnas beteende och temperatur samt tagning av jord- och maskprover för bestämning av testkemikaliens koncentration.
|
2
|
Samma som dag 1.
|
3
|
Kontroll av lufttillförsel, maskarnas beteende och temperatur.
|
4
|
Samma som dag 1.
|
5–6
|
Samma som dag 3.
|
7
|
Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen.
|
8–9
|
Samma som dag 3.
|
10
|
Samma som dag 1.
|
11–13
|
Samma som dag 3.
|
14
|
Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen.
|
15–16
|
Samma som dag 3.
|
17
|
Samma som dag 1.
|
18–20
|
Samma som dag 3.
|
21
|
Samma som dag 1: mätning av temperaturen och jordens pH, kontroll av jordens fuktighet genom vägning av testkärlen samt tagning av jord- och maskprover från lösningsmedelskontrollerna.
|
|
Beredning av jorden före elimineringsfasens början bör göras på samma sätt som beredningen före upptagningsfasen.
|
|
Aktiviteterna för dag 3 bör genomföras dagligen (åtminstone på arbetsdagar).
|
|
Test med enchytraeider
a)
|
Upptagningsfas med 8 provtagningsdatum som används för beräkning av kinetik.
Dag
|
Aktivitet
|
– 6
|
Konditionering av förberedd jord under 48 timmar.
|
– 4
|
Spikning av jordfraktionen med testkemikalielösning, avdunstning av eventuellt lösningsmedel, blandning av jordbeståndsdelarna, fördelning av jord i testkärlen och stabilisering till jämvikt i testbetingelserna i 4 dagar (3 veckor för metallspikad jord).
|
– 3 till – 1
|
Separation av testorganismerna från odlingen för acklimatisering, beredning och fuktning av jordbeståndsdelarna.
|
0
|
Mätning av temperatur och jordens pH, avlägsnande av jordprover från behandlade kärl och lösningsmedelskontroller för bestämning av testkemikaliens koncentration, tillsats av föda till jorden, vägning och slumpvis fördelning av maskarna till testkärlen med bibehållande av tillräckligt antal maskar för bestämning av analytiska bakgrundsvärden, våt- och torrvikt och fettinnehåll, vägning av alla testkärl för kontroll av jordens fukthalt och kontroll av lufttillförsel om stängda testsystem används.
|
1
|
Kontroll av lufttillförsel, registrering av maskarnas beteende och temperatur samt tagning av jord- och maskprover för bestämning av koncentrationen testämne.
|
2
|
Samma som dag 1.
|
3
|
Kontroll av lufttillförsel, maskarnas beteende och temperatur.
|
4
|
Samma som dag 1.
|
5–6
|
Samma som dag 3.
|
7
|
Samma som dag 1: tillförsel av föda till jorden, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen.
|
9
|
Samma som dag 1.
|
10
|
Samma som dag 3.
|
11
|
Samma som dag 1.
|
12–13
|
Samma som dag 3.
|
14
|
Samma som dag 1: tillförsel av föda till jorden, mätning av temperaturen och jordens pH, kontroll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen; slut på upptagningsfasen; överföring av maskarna från återstående exponerade replikat till kärl som innehåller ren jord för elimineringsfasen (ingen tarmtömning) samt provtagning av jord och maskar från lösningsmedelskontrollerna.
|
|
Aktiviteterna före exponering (stabiliseringsfasen) bör tidplaneras med beaktande av testkemikaliens egenskaper.
|
|
Aktiviteterna för dag 3 bör genomföras dagligen (åtminstone på arbetsdagar).
|
|
Tillägg 4
Syntetisk jord – rekommendationer för beredning och lagring
Eftersom naturjordar från en viss källa inte alltid finns att tillgå under hela året, och ingående organismer och mikroföroreningar kan påverka testet, rekommenderas syntetiskt substrat, syntetisk jord enligt kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet för daggmaskar (48), för användning i detta test. Flera olika testarter kan överleva, växa och föröka sig i denna jord, och den ger också maximal standardisering såväl som jämförbarhet inom och mellan laboratorier och odlingsbetingelser.
Jordens beståndsdelar
Torv:
|
10 %
|
Sphagnum-torv, enligt OECD:s riktlinje 207 (48)
|
Kvartssand:
|
70 %
|
Industriell kvartssand (lufttorkad), minst 50 % av partiklarna bör ha en storlek inom området 50–200 μm, men alla partiklar bör vara ≤ 2 mm
|
Kaolinitlera:
|
20 %
|
Kaolinithalt ≥ 30 %
|
Kalciumkarbonat:
|
≤ 1 %
|
CaCO3, pulveriserat, kemiskt rent
|
Alternativt kan jordens organiska kolhalt minskas, t.ex. genom att sänka torvhalten till 4–5 % av torrjord och öka sandhalten i motsvarande grad. Med en sådan minskning av halten organiskt kol kan möjligheterna till adsorption av testkemikalien till jorden (organiskt kol) minskas, och då blir testkemikalien bättre tillgänglig för maskarna (74). Det har demonstrerats att Enchytraeus albidus och Eisenia fetida kan uppfylla validitetskriterierna för reproduktion vid testning i fältjordar med lägre halt organiskt kol, t.ex. 2,7 % (33), (61), och det finns erfarenheter som visar att detta också kan uppnås i syntetisk jord med 5 % torv.
Beredning
Jordens torra beståndsdelar blandas omsorgsfullt (t.ex. i en storskalig laboratorieblandare). Detta bör göras cirka en vecka innan testet inleds. De blandade torra jordbeståndsdelarna bör fuktas med avjoniserat vatten minst 48 timmar före applicering av testämnet för att nå surhetsjämvikt. För bestämning av pH används en blandning av jord och 1 M lösning av KCl i förhållandet 1:5. Om pH-värdet inte ligger inom rekommenderat område (6,0 ± 0,5) bör tillräcklig mängd CaCO3 tillföras jorden eller så måste en ny sats jord beredas.
Den syntetiska jordens maximala vattenhållningskapacitet (WHC) bestäms enligt ISO 11268-2 (35). Minst två dagar innan testet inleds fuktas den torra syntetiska jorden med tillräcklig mängd avjoniserat eller rekonstituerat vatten till en vattenhalt som motsvarar cirka hälften av den slutliga vattenhalten. Den slutliga vattenhalten bör vara cirka 40–60 % av maximal vattenhållningskapacitet (WHC). Vid teststart ska den förhandsfuktade jorden delas upp i lika många delar som antalet testkoncentrationer och kontroller som används för testet, och fukthalten justeras till 40–60 % av WHCmax genom användning av en lösning av testämnet och/eller genom tillförsel av avjoniserat eller rekonstituerat vatten. Fukthalten bestäms i början och i slutet av testet (vid 105 °C). Fukthalten bör vara optimal för den art som testas (fukthalten kan också kontrolleras genom att försiktigt krama jorden i handen och då bör det komma fram små vattendroppar mellan fingrarna).
Förvaring
De torra beståndsdelarna av syntetisk jord kan förvaras i rumstemperatur fram till användningen. Den förberedda förfuktade jorden kan förvaras i svalt utrymme i upp till tre dagar före spikningen, och vattenavdunstningen bör minimeras. Jord som spikats med testämne bör användas omedelbart, med undantag för om det finns information om att jorden i fråga kan förvaras utan att testämnets toxicitet och biotillgänglighet påverkas. Prover av spikad jord kan sedan förvaras i de förhållanden som rekommenderas för testsystemet i fråga fram till analys.
Tillägg 5
Arter av jordlevande oligochaeter som rekommenderas för testning av bioackumulering från jord
Daggmaskar
Rekommenderad testart är Eisenia fetida (Savigny 1826), som tillhör familjen Lumbricidae. Från och med 1972 är den uppdelad i två underarter (Eisenia fetida och Eisenia andrei (10)). Enligt Jaenike (36) är dessa äkta, separata arter. Eisenia fetida känns lätt igen genom de klargula banden mellan segmenten medan Eisenia andrei har en enhetlig mörkröd färg. De härstammar sannolikt från Svartahavsregionen och finns numera över hela världen, särskilt i antropogent modifierade livsmiljöer såsom komposthögar. Båda kan användas för både ekotoxikologiska test och bioackumuleringstest.
Eisenia fetida och Eisenia andrei säljs allmänt på marknaden, t.ex. som fiskbete. Jämfört med andra daggmaskar (familjen Lumbricidae) har de en kort livscykel och når vuxenstadiet inom cirka 2–3 månader (vid rumstemperatur). Den optimala temperaturen för dessa daggmaskar ligger kring 20–24 °C. De föredrar relativt fuktiga substrat med nästan neutralt pH och en hög halt av organiskt material. Dessa arter har använts i stor utsträckning i standardiserade ekologiska tester i cirka 25 år och odling av dem är därför väl etablerad (48) (77).
Båda arterna kan odlas i ett stort urval djuravfall. Som odlingsmedium rekommenderas enligt ISO (35) en 50/50-blandning av häst- eller boskapsgödsel och torv. Mediet bör ha pH på cirka 6–7 (reglerat med kalciumkarbonat), låg jonisk konduktivitet (lägre än 6 mS/cm eller en salthalt under 0,5 %) bör inte ha för hög halt av ammoniak eller animaliskt urin. Likaså kan man använda kommersiell trädgårdsjord fri från tillsatser eller syntetisk jord enligt OECD (48) eller en 50/50-blandning av båda. Substratet bör vara fuktigt men inte för vått. Lämplig storlek på odlingslådorna är 10–50 liter.
För att få maskar med standardålder och standardmassa är det bäst att inleda odlingen med kokonger. För detta tillsätts vuxna maskar till en odlingslåda med färskt substrat för att de ska producera kokonger. Erfarenheterna har visat att en populationsdensitet på cirka 100 vuxna maskar per kg substrat (våtvikt) ger goda förökningsnivåer. Efter 28 dagar avlägsnas de vuxna maskarna. Daggmaskarna som kläckts ur kokonger används för testning när de har nått vuxenstadium efter minst 2 månader men högst 12 månader.
Maskar av de arter som beskrivs ovan kan anses vara friska om de rör sig genom substratet, inte försöker lämna substratet och förökar sig kontinuerligt. Mycket långsamma rörelser eller gul bakre del (i fråga om Eisenia fetida) tyder på utarmat substrat. Då rekommenderas färskt substrat och/eller mindre antal djur per låda.
Valda ytterligare hänvisningar
Gerard B. M. (1964), Synopsis of the British fauna, nr 6 Lumbricidae, Linnean Soc. London, 6, s. 1–58.
Graff O. (1953), ”Die Regenwürmer Deutschlands”, Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7, s. 1–81.
Römbke J. E., Egeler P., Füll C. (1997), ”Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium”, Bericht für das UBA, F + E 206 03 909, 86 S.
Rundgren S. (1977), ”Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden”, Oikos 28, s. 49–55.
Satchell J. E. (1955), ”Some aspects of earthworm ecology”, Soil Zoology (Kevan), s. 180–201.
Sims R. W. och Gerard B. M. (1985), ”A synopsis of the earthworms”, Linnean Soc. London, 31, s. 1–171.
Tomlin A. D. (1984), ”The earthworm bait market in North America”, ingår i ”Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture”. Satchell, J.E. (red.), Chapman & Hall, London, s. 331–338.
Enchytraeider
Den rekommenderade testarten är Enchytraeus albidus Henle 1837 (vit ringmask). Enchytraeus albidus är en av de största arterna (upp till 15 mm) bland ringmaskar (Annelida) i Oligochaetfamiljen Enchytraeidae och finns över hela världen, se t.ex. (8). Enchytraeus albidus finns i marina och limniska livsmiljöer och livsmiljöer på land, främst i multnande organiskt material (tång, kompost) men är sällsynt på ängar (42). Denna breda ekologiska tolerans och vissa morfologiska variationer tyder på att det kan finnas olika raser av denna art.
Enchytraeus albidus säljs allmänt på marknaden som fiskfoder. Kontroll bör göras av om odlingen är förorenad av andra, i regel mindre arter (60). Om förorening förekommer bör alla maskar tvättas med vatten i en petriskål. Stora vuxna exemplar av Enchytraeus albidus väljs sedan ut (med användning av stereomikroskop) för start av en ny odling. Alla andra maskar kasseras. Livscykeln är kort eftersom maskarna blir könsmogna mellan 33 dagar (vid 18 °C) och 74 dagar (vid 12 °C). Endast odlingar som har hållits i laboratoriet minst 5 veckor (en generation) utan problem får användas för testning.
Även andra arter av Enchytraeus är lämpliga, särskilt Enchytraeus luxuriosus. Denna art är en äkta jordlevande mask, vilket nyligen har beskrivits i (65). Om andra arter av Enchytraeus används bör de identifieras tydligt och rapporten bör innehålla motivering för valet av denna art.
Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) är en art som tillhör samma grupp som Enchytraeus luxuriosus. Man har inte med säkerhet kunna bekräfta dess existens på fältet, eftersom den endast har beskrivits utifrån daggmaskodlingar och komposthögar (Römbke 2003). Artens ursprungliga ekologiska krav är därför inte kända. Nyligen gjorda laboratoriestudier av olika slags fältjordar har dock bekräftat att denna art har en bred tolerans när det gäller jordegenskaper som pH och textur (Jänsch m.fl. 2005). Under de senaste åren har denna art ofta använts i ekotoxikologiska studier eftersom den är lätt att odla och testa(se t.ex. Kuperman m.fl. 2003). Den är dock liten (3–12 mm, i genomsnitt 7 mm, Westheide & Müller 1996), vilket gör hanteringen svårare i jämförelse med Enchytraeus albidus. När denna art används i stället för Enchytraeus albidus, kan storleken på testkärlen vara mindre, men det är inget krav. Dessutom bör man beakta att arten förökar sig mycket snabbt med en generationstid på mindre än 20 dagar vid 20 ± 2 °C (Achazi m.fl. 1999) och ännu snabbare vid högre temperaturer.
Enchytraeider av arten Enchytraeus albidus (såväl som andra Enchytraeus-arter) kan odlas i stora plastlådor (t.ex. 30 × 60 × 10 cm eller 20 × 12 × 8 cm, som lämpar sig för odling av små maskar) fyllda med en blandning av syntetisk jord och allmänt tillgänglig oförorenad trädgårdsjord utan tillsatser. Kompostmaterial bör undvikas eftersom det kan innehålla giftiga kemikalier såsom tungmetaller. Fauna bör avlägsnas från odlingsjorden före användning genom djupfrysning i tre omgångar. Rent syntetisk jord kan också användas men då kan förökningshastigheten vara lägre jämfört med blandade substrat. Substratet bör ha pH 6,0 ± 0,5. Odlingen hålls i en inkubator vid 15 ± 2 °C utan ljus. Under alla omständigheter ska temperaturer över 23 °C undvikas. Jorden (syntetisk eller naturlig) ska vara fuktig men inte våt. När jorden kramas försiktigt i handen ska endast små vattendroppar komma fram. Under alla omständigheter bör anoxiska betingelser undvikas (om t.ex. lock används, bör det ha tillräckligt antal hål för att ge tillräcklig luftväxling). Odlingsjorden bör luftas genom försiktig omblandning en gång per vecka.
Maskarna bör utfodras minst en gång per vecka ad libitum med havreflingor som placeras i en kavitet på jordens yta och täcks med jord. Om det finns kvar foder från föregående utfodring bör mängden foder justeras i motsvarande grad. Om det växer svamp på överblivet foder bör det ersättas med en ny mängd havreflingor. För att stimulera förökningen kan havreflingorna kompletteras med allmänt tillgängligt vitaminberikat proteinpulver varannan vecka. Efter tre månader överförs djuren till en färsk kultur eller färskt odlingssubstrat. Havreflingorna ska förvaras i kärl med tättslutande lock och bör behandlas i autoklav eller hettas upp före användning för att undvika infektion med mjölkvalster (t.ex. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) eller rovkvalster (t.ex. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Efter desinfektering mals fodret så att det enkelt kan spridas på jordytan. En annan tänkbar foderkälla är bakningsjäst eller fiskfoder TetraMin®.
Allmänt taget gäller att odlingsbetingelserna är tillräckliga om maskarna inte försöker lämna substratet, rör sig snabbt genom jorden, har en glansig yta utan vidhäftande jordpartiklar, har en mer eller mindre vitaktig färg och det går att iaktta maskar av olika åldrar. Dessutom kan maskarna anses vara friska om de förökar sig kontinuerligt.
Valda ytterligare hänvisningar
Achazi R. K., Fröhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999), ”The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta)”, Newsletter on Enchytraeidae 6, s. 117–126.
Jänsch S., Amorim M. J. B., Römbke J. (2005), ”Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species”, Environ. Reviews 13, s. 51–83.
Kuperman R. G., Checkai R. T., Simini M., Phillips C. T., Kolakowski J. E., Kurnas C. W., Sunahara G. I. (2003), ”Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX”, Pedobiologia 47, s. 651–656.
Römbke J. (2003), ”Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review”, Pedobiologia 47, s. 607–616.
Westheide W. och Graefe U. (1992), ”Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida)”, J. Nat. Hist. 26, s. 479–488.
Westheide W. och Müller M. C. (1996), ”Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology”, Hydrobiologia 334, s. 263–267.
” |