28.4.2017   

SV

Europeiska unionens officiella tidning

L 112/1


KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EU) 2017/735

av den 14 februari 2017

om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach)

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,

med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG (1), särskilt artikel 13.2, och

av följande skäl:

(1)

I kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 (2) fastställs testmetoder som ska användas för tillämpning av förordning (EG) nr 1907/2006 när det gäller bestämning av kemikaliers fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet.

(2)

Det är nödvändigt att uppdatera förordning (EG) nr 440/2008 för att införa nya och uppdaterade testmetoder som nyligen har antagits av Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), i syfte att ta hänsyn till tekniska framsteg och säkerställa en minskning av antalet djur som används för försök, i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU (3). Samråd har förts med berörda parter om detta utkast.

(3)

Anpassningen till tekniska framsteg omfattar tjugo testmetoder: en ny metod för bestämning av en fysikalisk-kemisk egenskap, fem nya testmetoder och en uppdaterad testmetod för bedömning av ekotoxicitet, två uppdaterade testmetoder för bedömning av omvandling, spridning och fördelning i miljön samt fyra nya och sju uppdaterade testmetoder för bestämning av effekter på människors hälsa.

(4)

OECD ser regelbundet över sina testriktlinjer för att identifiera dem som är vetenskapligt föråldrade. Genom denna anpassning till tekniska framsteg utgår sex testmetoder för vilka de motsvarande testriktlinjerna från OECD har annullerats.

(5)

Förordning (EG) nr 440/2008 bör därför ändras i enlighet med detta.

(6)

De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från den kommitté som inrättats i enlighet med artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras i enlighet med bilagan till den här förordningen.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 14 februari 2017.

På kommissionens vägnar

Jean-Claude JUNCKER

Ordförande


(1)  EUT L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2)  Kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 av den 30 maj 2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (EUT L 142, 31.5.2008, s. 1).

(3)  Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (EUT L 276, 20.10.2010, s. 33).


BILAGA

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras på följande sätt:

(1)

I del A ska följande kapitel läggas till:

”A.25   DISSOCIATIONSKONSTANTER I VATTEN (TITRERINGSMETOD – SPEKTROFOTOMETRISK METOD – KONDUKTOMETRISK METOD)

INLEDNING

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 112 (1981).

Förutsättningar

Lämplig analysmetod

Vattenlöslighet

Vägledande information

Strukturformel

Elektrisk ledningsförmåga för konduktometrisk metod

Kvalificerande angivelser

Alla testmetoder kan utföras på rena eller kommersiellt producerade ämnen. Eventuella effekter av föroreningar på resultaten bör övervägas.

Titreringsmetoden är inte lämplig för ämnen med låg löslighet (se testlösningar nedan).

Den spektrofotometriska metoden är endast tillämplig på ämnen som har ett märkbart annorlunda UV/VIS-absorptionsspektrum för dissocierade och icke-dissocierade former. Denna metod kan även vara lämplig för ämnen med låg löslighet och för icke-syra/basdissociationer, t.ex. komplexbildning.

I de fall där Onsager-ekvationen håller kan den konduktometriska metoden användas, även vid måttligt låga koncentrationer och även i händelse av icke-syra/basjämvikter.

Standarddokument

Denna testmetod är baserad på de metoder som anges i avsnittet ”Litteratur” och på dokumentet Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA av den 18 augusti 1978.

METOD – INLEDNING, SYFTE, OMFATTNING, RELEVANS, TILLÄMPNING OCH TESTGRÄNSER

Ämnets dissociation i vatten är av betydelse för bedömningen av dess miljöpåverkan. Detta styr ämnets form, vilket i sin tur avgör hur det beter sig och överförs. Det kan påverka kemikaliens adsorption till jord och sediment och absorption in i biologiska celler.

Definitioner och enheter

Dissociation är en reversibel uppdelning i två eller flera kemiska ämnen som kan vara joniska. Processen anges vanligen genom

RXR ++ X

och koncentrationens jämviktskonstant som styr reaktionen är

Formula

I det särskilda fallet där R är väte (ämnet är en syra) är konstanten t.ex.

Formula

eller

Formula

Referensämnen

Följande referensämnen behöver inte användas i samtliga fall när ett nytt ämne ska undersökas. Referensämnen tillhandahålls främst för att emellanåt kalibrera metoden och möjliggöra en jämförelse av resultaten när en annan metod tillämpas.

 

pKa (1)

Temp. i °C

p-nitrofenol

7,15

251

Bensoesyra

4,12

20

p-kloranilin

3,93

20

Här är det användbart att ha ett ämne med flera pK enligt avsnittet Testmetodens princip nedan. Exempel på sådana ämnen:

Citronsyra

pKa (8)

Temp. i °C

 

1) 3,14

20

 

2) 4,77

20

 

3) 6,39

20

Testmetodens princip

Den kemiska process som beskrivs är i allmänhet endast något temperaturberoende i det miljömässigt relevanta temperaturintervallet. Bestämningen av dissociationskonstanten kräver en mätning av koncentrationerna av det kemiska ämnets dissocierade och icke-dissocierade former. Med utgångspunkt från kunskapen om dissociationsreaktionens stökiometri enligt avsnittet Definitioner och enheter ovan kan den lämpliga konstanten bestämmas. I det särskilda fall som beskrivs i denna testmetod beter sig ämnet som en syra eller en bas, och bestämningen görs lämpligen genom att fastställa de relativa koncentrationerna av ämnets joniserade och icke-joniserade former och lösningens pH-värde. Förhållandet mellan dessa termer anges i ekvationen för pKa i avsnittet Definitioner och enheter ovan. Vissa ämnen uppvisar mer än en dissociationskonstant och liknande ekvationer kan utvecklas. Några av de metoder som beskrivs här är också lämpliga för icke-syra/bas-dissociation.

Kvalitetskriterier

Repeterbarhet

Dissociationskonstanten bör replikeras (minst tre bestämningar) till inom ± 0,1 log-enheter.

BESKRIVNING AV TESTFÖRFARANDENA

Det finns två grundläggande metoder för bestämning av pKa. Den ena metoden omfattar titrering av en känd mängd av ämnet med standardsyra eller standardbas i förekommande fall, och enligt den andra metoden bestäms den relativa koncentrationen av de joniserade och icke-joniserade formerna och deras pH-beroende.

Förberedelser

Metoder som baseras på dessa principer kan klassificeras som titreringsförfaranden samt spektrofotometriska och konduktometriska förfaranden.

Testlösningar

För titreringsmetoden och den konduktometriska metoden ska det kemiska ämnet lösas upp i destillerat vatten. För den spektrofotometriska metoden och andra metoder används buffertlösningar. Koncentrationen av testämnet bör inte överstiga det mindre av 0,01 M eller halva mättnadskoncentrationen, och den renaste tillgängliga formen av ämnet bör användas för att bereda lösningarna. Om ämnet endast är måttligt lösligt kan det lösas i en liten mängd lösningsmedel som är blandbart i vatten innan de koncentrationer som anges ovan tillsätts.

Lösningarna bör kontrolleras med avseende på förekomst av emulsioner med hjälp av Tyndallstrålen, särskilt om ett hjälplösningsmedel har använts för att förbättra lösligheten. När buffertlösningar används bör bufferthalten inte överstiga 0,05 M.

Testbetingelser

Temperatur

Temperaturen bör regleras till minst ± 1 °C. Bestämningen bör företrädesvis utföras vid 20 °C.

Vid misstanke om betydande temperaturberoende bör bestämningen utföras åtminstone vid två andra temperaturer. I detta fall bör temperaturintervallen vara 10 °C och temperaturkontrollen ± 0,1 °C.

Analyser

Vilken metod som används beror på det testade ämnets natur. Metoden måste vara tillräckligt känslig för att möjliggöra bestämning av de olika kemiska beståndsdelarna vid varje testlösningskoncentration.

Testförfarande

Titreringsmetod

Testlösningen bestäms genom titrering med standardbas- eller standardsyralösning i förekommande fall, med mätning av pH-värdet efter varje tillsats av titreringsmedel. Minst tio stegvisa tillsatser bör göras före ekvivalenspunkten. Om jämvikt nås tillräckligt snabbt kan en registreringspotentiometer användas. För denna metod måste både den totala mängden av ämnet och dess koncentration vara exakt kända. Försiktighetsåtgärder måste vidtas för att utesluta koldioxid. Uppgifter om förfarande, försiktighetsåtgärder och beräkning ges i standardtesterna, t.ex. litteraturhänvisningarna (1), (2), (3), (4).

Spektrofotometrisk metod

En våglängd söks fram där de joniserade och icke-joniserade formerna av ämnet har avsevärt olika extinktionskoefficienter. UV-/VIS-absorptionsspektrumet erhålls från lösningar med konstant koncentration under ett pH-tillstånd där ämnet är i huvudsak icke-joniserat och helt joniserat och vid flera mellanliggande pH-värden. Detta kan antingen göras genom tillsats av omgångar av koncentrerad syra (bas) till en relativt stor mängd av en lösning av ämnet i en multikomponentbuffert, till en början vid högt (lågt) pH (litteraturhänvisning 5), eller genom tillsats av lika stora volymer av en stamlösning av ämnet i t.ex. vatten eller metanol, till konstanta volymer av olika buffertlösningar som täcker det önskade pH-intervallet. Från pH- och absorbansvärdena vid den valda våglängden beräknas ett tillräckligt antal värden för pKa med hjälp av data från minst 5 pH där ämnet är joniserat till minst 10 procent och högst 90 procent. Ytterligare uppgifter om försöket och beräkningsmetoden anges i litteraturhänvisning (1).

Konduktometrisk metod

Med användning av en cell med en liten och känd cellkonstant mäts ledningsförmågan hos en ca 0,1 M lösning av ämnet i konduktivitetslösning. Ledningsförmågan hos ett antal noggrant gjorda utspädningar av lösningen mäts också. Koncentrationen halveras varje gång och serien bör omfatta minst en storleksordning i koncentrationen. Den begränsande ledningsförmågan vid oändlig utspädning fastställs genom att ett liknande försök görs med Na-saltet och extrapolering. Dissociationsgraden kan sedan beräknas utifrån varje lösnings ledningsförmåga med hjälp av Onsager-ekvationen. Dissociationskonstanten kan beräknas med hjälp av Ostwalds utspädningslag, som K = α2C / (1 – α) där C är koncentrationen i mol per liter och α är den dissocierade fraktionen. Försiktighetsåtgärder måste vidtas för att utesluta koldioxid. Ytterligare uppgifter om försöket och beräkningsmetoden anges i standardtexter samt i litteraturhänvisningarna (1), (6) och (7).

DATA OCH RAPPORTERING

Behandling av resultaten

Titreringsmetod

pKa beräknas för 10 uppmätta punkter på titreringskurvan. Medelvärdet och standardavvikelsen för sådana pKa-värden beräknas. Ett diagram med pH avsatt mot volymerna av standardbas eller standardsyra bör ingå tillsammans med en presentation i tabellform.

Spektrofotometriska metoder

Absorbans och pH från varje spektrum ställs upp i tabellform. Minst fem värden för pKa beräknas från de mellanliggande datapunkterna i spektrumet. Även medelvärde och standardavvikelse för dessa resultat beräknas.

Konduktometrisk metod

Motsvarande ledningsförmåga Λ beräknas för varje syrakoncentration och för varje koncentration av en blandning av en syraekvivalent och en 0,98 ekvivalent av karbonatfri natriumhydroxid. Syftet med överskottssyran är att förhindra överskott av OH på grund av hydrolys. 1 /Λ avsätts mot √C och Λo av saltet bestäms genom extrapolering till nollkoncentration.

Λo av syran kan beräknas med användning av litteraturvärden för H+ och Na+. PKa kan beräknas från α = Λi /Λo och Ka = α2C/(1 – α) för varje koncentration. Bättre värden för Ka kan fås genom korrigeringar för rörlighet och aktivitet. Medelvärde och standardavvikelser för PKa-värden bör beräknas.

Testrapport

Alla rådata och beräknade PKa-värden bör lämnas in tillsammans med beräkningsmetoden (företrädesvis i tabellformat, såsom föreslås i litteraturhänvisning 1), och detsamma gäller de statistiska parametrar som beskrivs ovan. För titreringsmetoder bör uppgifter om standardiseringen av titreringsmedel anges.

För den spektrofotometriska metoden bör samtliga spektrum anges. För den konduktometriska metoden bör uppgifter om bestämningen av cellkonstant rapporteras. Uppgifter om använd teknik samt analysmetoder och typen av eventuella buffertar bör också lämnas.

Testtemperaturer ska rapporteras.

LITTERATUR

(1)

Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.

(2)

Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, s. 1186–1188 (1969).

(3)

ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(4)

Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.

(5)

Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (mars 1973).

(6)

ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(7)

Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (se ovan (4)).

(8)

Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).”

(2)

I del B ska kapitel B.5 ersättas med följande:

”B.5   AKUT ÖGONIRRITATION/ÖGONKORROSION

INLEDNING

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 405 (2012). OECD:s riktlinjer för kemikalietestning ses över med jämna mellanrum för att säkerställa att de återspeglar bästa tillgängliga vetenskap. Vid tidigare revideringar av denna testriktlinje lades särskilt stor vikt vid möjligheterna till bättre testningsförfaranden, där djurskyddsfrågor beaktas så väl som möjligt. Sådana förfaranden innebär att all existerande information om testkemikalien utvärderas i syfte att undvika onödiga djurförsök. TG 405 (antagen 1981 och uppdaterad 1987, 2002 och 2012) innehåller en rekommendation om att laboratoriet, innan det beskrivna in vivo-testet för akut ögonkorrosion/ögonirritation inleds, bör göra en weight-of-the-evidence-analys (1) av existerande relevanta data. Om de data som finns att tillgå inte är tillräckliga bör behövliga data genereras med hjälp av stegvis testning (2) (3). Den rekommenderade testningsstrategin inbegriper validerade och godkända in vitro-test och anges i ett tillägg till denna testmetod. För tillämpningen av förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (2), ingår även en integrerad teststrategi i Echas relevanta vägledning (21). Testning på djur bör endast utföras om det bedöms vara nödvändigt efter övervägande av tillgängliga alternativa metoder och efter användning av de metoder som bedömts vara lämpliga. Vid tidpunkten för utarbetandet av denna uppdaterade testmetod var användningen av testmetoden fortfarande nödvändig i vissa fall eller krävdes enligt vissa regelverk.

Den senaste uppdateringen inriktas främst på användningen av smärtstillande medel och bedövningsmedel och påverkar inte testriktlinjens grundläggande princip och struktur. ICCVAM (3) och en oberoende internationell vetenskaplig expertpanel har granskat användbarhet och begränsningar när det gäller rutinmässig användning av lokalbedövningsmedel, systemiska smärtstillande medel och humana endpoints för säkerhetstester i fråga om ögonirritation (12). Granskningen visade att nästan all eller hela smärtan och lidandet kan undvikas med hjälp av lokalbedövningsmedel och systemiska smärtstillande medel utan att testet påverkas och ledde till rekommendationen att dessa ämnen alltid ska användas. Granskningen har beaktats i denna testmetod. Lokalbedövningsmedel, systemiska smärtstillande medel och humana endpoints bör användas rutinmässigt vid in vivo-testning med avseende på ögonirritation/ögonkorrosion. Undantag från användning bör motiveras. De förbättringar som beskrivs i denna metod kommer att bidra till att avsevärt minska eller undvika smärta och lidande hos djuren i de flesta testningssituationer där in vivo-testning fortfarande är nödvändig för att avgöra om ett ämne är säkert för ögonen.

Balanserande förebyggande smärtlindring bör omfatta i) rutinmässig förbehandling med lokalbedövningsmedel (t.ex. proparakain eller tetrakain) och ett systemiskt smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin), ii) ett rutinmässigt efterbehandlingsschema med systemiska smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin och meloxikam), iii) schemalagd observation, övervakning och registrering av djuren för kliniska tecken på smärta och/eller lidande och iv) schemalagd observation, övervakning och registrering av arten, svårighetsgraden och utvecklingen av alla ögonskador. Närmare uppgifter ges i de uppdaterade förfaranden som beskrivs nedan. När testkemikalien har applicerats bör inga ytterligare lokalbedövningsmedel eller smärtstillande medel användas för att undvika störningar i undersökningen. Smärtstillande medel med antiinflammatorisk verkan (t.ex. meloxikam) bör inte appliceras lokalt och doser som används systematiskt får inte påverka effekterna på ögonen.

Definitionerna anges i tillägget för testmetoden.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

Med hänsyn till sund vetenskaplig praxis och djurens välbefinnande bör in vivo-testning inte genomföras förrän alla tillgängliga data som är relevanta för kemikaliens förmåga att framkalla hudkorrosion/hudirritation har utvärderats genom en weight-of-the-evidence-analys. Sådana data utgör belägg från befintliga undersökningar på människor och/eller försöksdjur, belägg för ögonkorrosion/ögonirritation i fråga om ett eller flera strukturellt besläktade ämnen eller blandningar av sådana ämnen, data som visar att ämnet är starkt surt eller alkaliskt (4), (5) samt resultat från validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-tester med avseende på hudkorrosion och ögonkorrosion/ögonirritation (6) (13) (14) (15) (16) (17). Sådana undersökningar kan ha gjorts före, eller som ett resultat av, en weight-of-the-evidence-analys.

För vissa ämnen kan en sådan analys visa att det behövs in vivo-testning av kemikaliens förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögonirritation. I alla sådana fall bör man, innan ett in vivo-ögontest övervägs, helst göra ett in vivo- eller in vitro-test för utvärdering av kemikaliens verkningar på huden och utvärdera testet enligt den stegvisa testningsstrategin i testmetod B.4 (7) eller den integrerade testningsstrategi som beskrivs i Echas vägledning (21).

En rekommenderad strategi för stegvis testning, som inbegriper validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-test med avseende på ögonkorrosion/ögonirritation finns som tillägg till denna metod, och när det gäller Reach i Echas vägledning (21). En sådan testningsstrategi bör tillämpas innan in vivo-tester utförs. För nya kemikalier rekommenderas ett stegvis testningsförfarande för generering av vetenskapligt sunda data om en kemikalies förmåga att framkalla korrosion/irritation. För befintliga kemikalier med otillräckliga data om korrosion/irritation för hud och ögon kan strategin användas för att fylla upp luckor i tillgängliga data. Om en annan testningsstrategi eller ett annat förfarande används, eller om man beslutar att inte använda ett förfarande med stegvis testning, bör detta motiveras.

PRINCIP FÖR IN VIVO-TEST

Efter förbehandling med ett systemiskt smärtstillande medel och lämplig lokalbedövning appliceras testkemikalien som en engångsdos i försöksdjurets ena öga. Det obehandlade ögat används som referens. Graden av ögonirritation eller ögonkorrosion utvärderas genom klassificering av skadorna på ögats bindhinna (konjunktiva), hornhinnan och iris med specifika intervall. Likaså bör övriga verkningar i ögat och skadliga systemiska verkningar beskrivas för att en fullständig utvärdering av verkningarna ska fås. Testet bör pågå tillräckligt länge för att ge möjlighet att utvärdera om de observerade verkningarna är reversibla eller irreversibla.

Djur som uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande och/eller smärta i något skede av testningen eller skador som överensstämmer med de humana endpoints som beskrivs i denna testmetod (se punkt 26) bör avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av kemikalien. Kriterier för att fatta beslut om skonsam avlivning av döende eller allvarligt lidande djur finns i ett OECD-vägledningsdokument (8).

FÖRBEREDELSER FÖR IN VIVO-TEST

Val av art

Rekommenderat försöksdjur är albinokanin. Friska, unga vuxna exemplar bör användas. Om andra arter eller stammar används bör detta motiveras.

Förberedelse av djuren

De djur som preliminärt har valts ut för testning bör undersökas med avseende på båda ögonen inom 24 timmar före testets början. Djur som har irriterade ögon, okulära defekter eller existerande skada på hornhinnan bör inte användas.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

Djuren ska inhysas individuellt. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 20 °C (± 3 °C) för kaniner. Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs då målet bör vara 50–60 %. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. Överdriven ljusintensitet bör undvikas. Konventionellt laboratoriefoder kan användas för utfodringen, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten.

TESTFÖRFARANDE

Användning av lokalbedövningsmedel och systemiska smärtstillande medel

Följande förfaranden rekommenderas för att undvika eller minimera smärta och lidande i testningsförfaranden för att avgöra om ett ämne är säkert för ögonen. Alternativa förfaranden som har visat sig fungera lika bra för att undvika eller lindra smärta och lidande kan användas.

Sextio minuter innan testkemikalien appliceras ges buprenorfin 0,01 mg/kg genom subkutan injektion (SI) för som smärtstillande behandling. Buprenorfin och andra liknande opioida smärtstillande medel som ges systematiskt är inte kända för att, och förväntas inte, medföra några ändringar av ögats respons (12).

Fem minuter före appliceringen av testkemikalien appliceras en eller två droppar av ett lokalt oftalmologiskt bedövningsmedel (t.ex. 0,5 % proparakainhydroklorid eller 0,5 % tetrakainhydroklorid) i varje öga. För att undvika eventuella störningar av undersökningen rekommenderas lokalbedövningsmedel som inte innehåller konserveringsmedel. Det öga som inte behandlas med testkemikalien utan med lokalbedövningsmedel används som referens. Om testkemikalien förväntas orsaka betydande smärta och lidande ska det normalt inte testas in vivo. Vid tvivel eller om testning är nödvändig bör man dock överväga ytterligare applicering av lokalbedövningsmedel i femminutersintervaller innan testkemikalien appliceras. Användarna bör vara medvetna om att flera appliceringar av lokalbedövningsmedel kan orsaka en liten ökning av svårighetsgraden och/eller den tid det tar innan kemiskt framkallade skador blir tydliga.

Åtta timmar efter appliceringen av testkemikalien ges buprenorfin 0,01 mg/kg SI och meloxikam 0,5 mg/kg SI som kontinuerlig smärtstillande behandling. Även om det inte finns några uppgifter som tyder på att meloxikam har en antiinflammatorisk verkan på ögat när det ges genom subkutan injektion en gång om dagen bör det inte ges förrän minst åtta timmar efter det att testkemikalien har applicerats för att undvika eventuella störningar av undersökningen (12).

När det har gått åtta timmar efter appliceringen av testkemikalien bör buprenorfin 0,01 mg/kg ges genom subkutan injektion var tolfte timme kombinerat med meloxikam 0,5 mg/kg SI var 24:e timme till dess att ögonskadorna läker och det inte finns kliniska tecken på smärta och lidande. Det finns långtidsverkande beredningar av smärtstillande medel som kan övervägas för att minska doseringen av sådana medel.

Akut smärtlindring bör ges omedelbart efter appliceringen av testkemikalien om förebyggande smärtlindring och lokalbedövning inte är tillräcklig. Om djuret visar tecken på smärta och lidande under undersökningen bör en ”akutdos” av buprenorfin 0,03 mg/kg omedelbart ges genom subkutan injektion och upprepas vid behov så ofta som var åttonde timme i stället för 0,01 mg/kg SI var tolfte timme. Meloxikam 0,5 mg/kg ges då genom subkutan injektion var 24:e timme tillsammans med akutdosen av buprenorfin, men inte förrän minst åtta timmar efter appliceringen av testkemikalien.

Applicering av testkemikalien

Testkemikalien tillförs i ena ögats konjunktivasäck (alla djur). Före tillförseln bör det undre ögonlocket varsamt dras ut en bit ut från ögongloben. Ögonlocken förs därefter samman i cirka en sekund för att förhindra att ämnet kommer ut. Det andra, obehandlade ögat används som referens.

Sköljning

Försöksdjurens ögon bör inte sköljas under minst 24 efter tillförseln av testkemikalien, utom när det gäller fasta ämnen (se punkt 18) eller om det uppstår omedelbara korrosiva eller irriterande verkningar. Efter 24 timmar kan ögonen sköljas, om detta bedöms vara lämpligt.

Användningen av en satellitgrupp för att undersöka inverkan av sköljningen rekommenderas inte, utom om det är vetenskapligt motiverat. Om en satellitgrupp används, ska den bestå av två kaniner. Sköljningsbetingelserna bör dokumenteras omsorgsfullt, t.ex. sköljningstidpunkten, lösningens sammansättning och temperatur samt sköljningstiden, applicerad volym och sköljningsintensitet.

Dosnivå

(1)   Testning av vätskor

Vid testning av vätskor används en dos på 0,1 ml. Pumpsprej bör inte användas för att tillföra kemikalien direkt i ögat. I stället bör vätskan sprejas in i en behållare, som används för att tillföra 0,1 ml i ögat.

(2)   Testning av fasta ämnen

Vid testning av fasta ämnen, pastor och kemikalier i partikelform, bör den tillförda mängden ha en volym på 0.1 ml eller en medelvikt på högst 100 mg. Testkemikalien bör malas ned till fint stoft. Det fasta materialets volym bör mätas efter en varsam kompaktering, som görs till exempel genom att knacka på mätbehållaren. Om en fast testkemikalie inte har tagits bort ur försöksdjurets öga med hjälp av fysiologiska mekanismer vid den första observationstidpunkten (en timme efter behandlingen), kan ögat sköljas med saltlösning eller destillerat vatten.

(3)   Testning av aerosoler

Det rekommenderas att material i form av pumpsprej eller aerosol sprejas i en behållare, som sedan används för tillförsel i ögat. Det enda undantaget är kemikalier i aerosoler i tryckbehållare som inte går att samla in på grund av förångning. I sådana fall hålls djurets öga öppet och testkemikalien sprutas in i ögat under cirka en sekund, på cirka 10 cm avstånd direkt framför ögat. Avståndet kan variera beroende på behållarens tryck och innehåll. Det är viktigt att se till att ögat inte skadas av sprejtrycket. I tillämpliga fall kan det vara nödvändigt att utvärdera om sprejstyrkan kan framkalla ”mekanisk” skada i ögat.

En uppskattning av dosen från en aerosol kan göras genom en simulering på följande sätt: Ämnet sprejas på ett vägningspapper genom en öppning som har storleken av ett kaninöga och som hålls strax framför papperet. Papperets viktökning används som grund för att uppskatta den mängd som har sprejats i ögat. För flyktiga kemikalier kan dosen uppskattas genom att väga en mottagningsbehållare före och efter borttagning av testkemikalien.

Preliminärt test (in vivo-test avseende ögonirritation/ögonkorrosion på ett enskilt djur)

Det rekommenderas starkt att in vivo-testet först görs på ett enskilt djur (se tillägget till denna testmetod: Strategi för stegvis testning med avseende på ögonirritation och ögonkorrosion Observationer bör göra det möjligt att bestämma svårhetsgrad och reversibilitet innan man går vidare till ett bekräftande test på ett andra djur.

Om resultatet av ett sådant test tyder på att kemikalien är korrosiv eller framkallar kraftig irritation i ögat när man använder det beskrivna förfarandet, bör ingen ytterligare testning utföras.

Bekräftande test (in vivo-test avseende ögonirritation med ytterligare djur)

Om ingen korrosiv verkan eller kraftig irritation observeras vid det preliminära testet, bör responsen (irriterande eller negativ) bekräftas med hjälp av högst två ytterligare djur. Om en kraftig irritation har observerats vid det preliminära testet rekommenderas bekräftande test som görs stegvis på ett djur i taget, i stället för samtidigt test på båda tilläggsdjuren. Om frätning eller kraftig irritation kan observeras på det tilläggsdjur som först används, bör testningen avbrytas. Om resultaten från testet på det andra djuret är tillräckliga för att fastställa en faroklassificering bör inga fler tester utföras.

Observationsperiod

Observationsperioden bör vara tillräckligt lång för att det till fullo ska gå att utvärdera omfattningen och reversibiliteten hos de observerade verkningarna. Försöket bör dock avslutas omedelbart, oavsett hur länge det pågått, om det berörda djuret uppvisar tecken på svåra smärtor eller lidande (8). För fastställandet av verkningarnas reversibilitet bör djuren i regel observeras i 21 dagar efter tillförsel av testkemikalien. Om reversibilitet kan observeras innan 21 dagar har gått kan försöket omedelbart avslutas.

Kliniska observationer och gradering av ögonreaktionerna

Ögonen bör utvärderas noggrant för att bekräfta förekomst eller frånvaro av ögonskador en timme efter appliceringen av testkemikalien, följt av minst dagliga utvärderingar. Försöksdjuren bör bedömas flera gånger dagligen under de första tre dagarna så att beslut om upphörande av testet fattas i rätt tid. Djuren bör utvärderas rutinmässigt under hela undersökningen när det gäller kliniska tecken på smärta och/eller lidande (t.ex. upprepat krafsande eller gnuggande i ögat, överdrivna blinkningar, överdriven tårbildning) (9) (10) (11), minst två gånger om dagen med minst sex timmar mellan observationerna, eller oftare om så krävs. Detta är nödvändigt för att i) utvärdera djuren på lämpligt sätt för att upptäcka tecken på smärta och lidande och utifrån detta fatta välgrundade beslut om behovet av att öka dosen av smärtstillande medel, och ii) utvärdera djuren för bevis för etablerade humana endpoints för att fatta välgrundade beslut om human avlivning av djuren och säkerställa att sådana beslut fattas i rätt tid. Fluoresceinfärgning bör användas rutinmässigt och spaltlampa bör användas om det anses lämpligt (t.ex. för att bedöma skadans djup vid förekomst av ulceration av kornea) och som ett hjälpmedel för att upptäcka och mäta ögonskador och utvärdera om de fastställda endpointkriterierna för human avlivning är uppfyllda. Digitala fotografier av observerade skador kan samlas in som referensmaterial och för permanent registrering av ögonskadornas omfattning. Djuren bör inte utsättas för testning längre än det är nödvändigt för att få definitiv information. Djur som uppvisar allvarliga tecken på smärta eller lidande bör omedelbart avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av kemikalien.

Djur som fått följande ögonskador efter tillförsel av kemikalien bör avlivas på ett humant sätt (skadegraderna beskrivs i tabell 1): perforering eller signifikant ulceration av kornea inklusive stafylom, blod i främre ögonkammaren, korneaopacitet av grad 4, ingen ljusreaktion (irisreaktion av grad 2) som varar i 72 timmar, ulceration av konjunktivamembran, nekros i konjunktiva- eller blinkhinna eller bildning av sårskorpa. Skälet till avlivningen är att dessa skador i regel är irreversibla. Vidare rekommenderas att följande ögonskador används som humana endpoints för beslut om att avsluta undersökningen före den planerade observationsperioden på 21 dagar. Följande skador anses tyda på allvarliga irritations- eller korrosionsskador och skador som inte förväntas gå tillbaka helt i slutet av observationsperioden på 21 dagar: mycket djupa skador (t.ex. ulceration av kornea som går djupare än ytlagren av stroma), förstörd limbus > 50 %, vilket visar sig i form av blekning av bindhinnevävnaden) och allvarlig ögoninfektion (varutsöndring). En kombination av vaskulering av hornhinnans yta (dvs. pannus), fluoresceinfärgade områden som inte minskar över tiden enligt dagliga utvärderingar och/eller brist på nybildning av epitel fem dagar efter appliceringen av testkemikalien kan också betraktas som eventuellt användbara kriterier för att motivera det kliniska beslutet att avsluta undersökningen i förtid. Dessa resultat är dock individuellt sett inte tillräckliga för att motivera att undersökningen avslutas i förtid. Om allvarliga okulära effekter identifieras bör en behandlande veterinär eller en kvalificerad laboratorieveterinär som är utbildad i att identifiera kliniska skador konsulteras för en klinisk undersökning i syfte att avgöra om kombinationen av dessa effekter motiverar att undersökningen avslutas i förtid. Graderna av okulär reaktion (konjunktiva, kornea och iris) bör fastställas och registreras 1, 24, 48 och 72 timmar efter appliceringen av kemikalien (tabell 1). Djur som inte utvecklar okulära skador ska inte avlivas förrän det har gått tre dagar från tillförsel av ämnet. Djur med okulära skador som inte är allvarliga bör observeras tills skadorna läks, eller under 21 dagar. Efter det avslutas undersökningen. Observationer bör göras och registreras efter minst 1, 24, 48 och 72 timmar samt efter 7, 14 och 21 dagar i syfte att fastställa skadornas status och huruvida de är reversibla eller inte. Tätare observationer bör göras om det är nödvändigt för att avgöra om försöksdjuren bör avlivas av humana skäl eller avlägsnas från undersökningen på grund av negativa resultat.

Graderna av okulära skador (tabell 1) bör registreras vid varje undersökning av djuren. Likaså bör alla andra ögonskador (t.ex. pannus, missfärgning, förändringar i främre ögonkammaren) eller skadliga systemiska verkningar även rapporteras.

Som hjälpmedel vid undersökningen av reaktionerna kan användas en binokulärlupp, ficklampa, biomikroskop eller annan lämplig utrustning. Efter det att observationerna har registrerats vid 24 timmar efter tillförseln, kan ögonen undersökas ytterligare med hjälp av fluorescein.

Graderingen av okulär respons är oundgängligen subjektiv. För att främja en tillnärmning av graderingen av okulär respons, och som stöd för testningslaboratorier och alla som är med om att utföra och tolka observationer, bör den personal som gör observationsarbetet få tillbörlig utbildning om klassificeringssystemet.

DATA OCH RAPPORTERING

Utvärdering av resultaten

Klassificeringen av okulär respons bör göras med hänsyn till skadornas natur och allvarlighetsgrad samt deras reversibilitet eller irreversibilitet. Individuella klassificeringsresultat representerar ingen absolut standard för en kemikalies förmåga att framkalla irritation, eftersom även andra verkningar av testkemikalien utvärderas. Enskilda klassificeringsresultat bör i stället ses som referensvärden, och de är meningsfulla endast när de åtföljs av en fullständig beskrivning och utvärdering av alla observationer.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande information:

 

Motivering för in vivo-testning: weight-of-evidence-analys av tidigare befintliga data, inbegripet resultat från ett förfarande enligt strategin för stegvis testning, enligt följande:

Beskrivning av relevanta data som erhållits före testningen.

Data som erhållits vid de olika stegen enligt testningsstrategin.

Beskrivning av utförda in vitro-test, inbegripet detaljerade uppgifter om förfaranden och resultat som erhållits med test- och referenskemikalier.

Beskrivning av utförda in vivo-test med avseende på hudirritation/hudkorrosion, inbegripet de resultat som erhållits.

Weight-of-the-evidence-analys för utförandet av in vivo-test.

 

Testkemikalie:

Identifieringsdata (t.ex. kemisk beteckning och CAS-nummer om detta är känt, renhet, kända föroreningar, källa, satsnummer).

Fysikalisk natur och fysikalisk-kemiska egenskaper (till exempel pH, flyktighet, löslighet, stabilitet, reaktivitet med vatten).

Om det rör sig om en blandning bör beståndsdelarna identifieras, inklusive identifieringsdata om ingående ämnen (t.ex. kemiska beteckningar och CAS-nummer om detta är känt) samt deras koncentrationer.

Dos.

 

Vehikel:

Identifieringsdata, koncentration (om tillämpligt), volym som har använts.

Motivering för val av vehikel.

 

Försöksdjur:

Art och stam som har använts, motivering om albinokanin inte har använts.

Djurens ålder, enskilt för varje djur vid testets start.

Antalet djur per kön i test- och kontrollgrupperna (vid behov).

De enskilda djurens vikt vid testets start och slut.

Ursprung, inhysning, foder etc.

 

Bedövning och smärtstillande medel

Doser och tidpunkter när topisk/lokal bedövning och systemiska smärtstillande medel gavs.

Om topisk/lokal bedövning används, anges identifieringsdata, renhet, typ och potentiell växelverkan med testkemikalien.

 

Resultat:

Beskrivning av den metod som har använts för att klassificera irritationen vid varje observationstidpunkt (till exempel ficklampa, biomikroskop, fluorescein).

En sammanställning i tabellform av responsdata rörande irritation/korrosion för varje djur vid varje observationstidpunkt fram till dess att testningen avslutas för det djurets del.

Narrativ beskrivning av graden och naturen hos den irritation eller korrosion som har observerats.

Beskrivning av alla andra eventuella ögonskador som har observerats (till exempel vaskularisering, pannusbildning, adhesioner, missfärgning).

Beskrivning av icke-okulära lokala och systemiska skadliga verkningar, register över kliniska tecken på smärta och lidande, digitala fotografier och, i förekommande fall, histopatologiska fynd.

 

Diskussion av resultaten.

Tolkning av resultaten.

En extrapolering av resultaten från undersökningar av ögonirritation som gjorts på försöksdjur är valid endast till en begränsad utsträckning. I många fall är albinokaniner mycket känsligare än människor i fråga om ämnen som är irriterande eller korrosiva för ögat.

Särskild noggrannhet bör iakttas vid tolkning av resultaten i syfte att utesluta irritation som beror på en sekundär infektion.

LITTERATUR

(1)

Barratt, M.D., m.fl. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410–429.

(2)

de Silva, O., m.fl. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159–164.

(3)

Worth A.P. och Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.

(4)

Young, J.R., m.fl. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.

(5)

Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.

(6)

Fentem, J.H., m.fl. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, pp.483–524.

(7)

Kapitel B.4 i denna bilaga, Akut hudirritation/hudkorrosion.

(8)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9)

Wright E.M., Marcella K.L., Woodson J.F. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20–36.

(10)

National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(11)

National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(12)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.

http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm

(13)

Kapitel B.40 i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: Bestämning av transkutant elektriskt motstånd (TER).

(14)

Kapitel B.40a i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: Test med modell av human hud.

(15)

OECD (2006), Test nr 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.

(16)

Kapitel B.47 i denna bilaga, testmetoden BCOP (Bovine Corneal Opacity and Permeability) för identifiering av i) kemikalier som orsakar allvarlig ögonskada och ii) kemikalier för vilka det inte krävs klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada.

(17)

Kapitel B.48 i denna bilaga, testmetoden ICE (Isolated Chicken Eye Test) för identifiering av i) kemikalier som orsakar allvarlig ögonskada och ii) kemikalier för vilka det inte krävs klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada.

(18)

U.S. EPA (2003), Label Review Manual: tredje upplagan, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.

(19)

FN (2011) Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), fjärde reviderade upplagan, New York och Genève: United Nations Publications.

(20)

Europeiska kommissionen (2008), Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 2008/EEG och 67/548/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1999/45. EUT L 353, s. 1.

(21)

ECHA, Guidance on information requirements and chemical safety assessment, kapitel R.7a: Särskild vägledning om endpoints:

http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf

Tabell 1

Gradering av okulära skador

Hornhinna (kornea)

Grad

Opacitet: graden av densitet (avläsningarna bör göras på området med den högsta densiteten) (*1).

 

Ingen ulceration eller opacitet.

0

Spridda eller diffusa områden med opacitet (annan än svag avmattning av den normala lystern), detaljer av iris klart synliga.

1

Enkelt skönjbart translucent område, detaljerna i iris är lätt förmörkade.

2

Pärlemorliknande område, inga detaljer i iris synliga, pupillens storlek kan knappt skönjas.

3

Opak hornhinna, iris kan inte skönjas genom opaciteten.

4

Maximum: 4

 

Iris

 

Normal

0

Märkbart fördjupade rugae, blodstockning, svullnad, måttlig hyperemi kring kornea eller injektion, iris reagerar för ljus (en långsam reaktion bedöms som en verkning).

1

Blödning, kraftig destruktion eller ingen reaktion på ljus.

2

Maximum: 2

 

Konjunktiva

 

Rodnad (hänför sig till palpebral och bulbär konjunktiva, exklusive hornhinnan och iris).

 

Normal

0

Vissa blodkärl är hyperemiska (injekterade).

1

Diffus, blodröd färg, individuella blodkärl kan inte skönjas med lätthet.

2

Diffust köttröd.

3

Maximum: 3

 

Chemos

 

Svullnad (hänför sig till ögonlocken och/eller blinkhinnor)

 

Normal

0

En viss svullnad över det normala.

1

Klar svullnad, delvis eversion av ögonlocken.

2

Svullnad, ögonlocken ungefär halvstängda.

3

Svullnad, ögonlocken mer än halvstängda.

4

Maximum: 4

 

Tillägg

DEFINITIONER

Syra-/bas-reserven : För sura beredningar är detta den mängd (g) natriumhydroxid/100 g beredning som krävs för att producera ett specificerat pH. För alkaliska beredningar är det den mängd (g) natriumhydroxid som motsvarar den mängd svavelsyra (g)/100 g beredning som krävs för att producera ett specificerat pH (Young m.fl. (1988).

Kemikalie : ett ämne eller en blandning.

Icke-irriterande ämnen : ämnen som inte klassificeras som okulärt irriterande enligt EPA-kategorierna I, II eller III eller ögonirriterande enligt GHS-kategorierna 1, 2, 2A eller 2B eller EU-kategorierna 1 eller 2 (17) (18) (19).

Kemikalier som är frätande för ögonen : a) kemikalier som orsakar irreversibel vävnadsskada på ögat, b) kemikalier som klassificeras som ögonirriterande enligt GHS-kategori 1 eller enligt EPA-kategori I eller EU-kategori 1 (17) (18) (19).

Ögonirriterande kemikalier : a) kemikalier som orsakar en reversibel förändring i ögat, b) kemikalier som klassificeras som ögonirriterande enligt EPA-kategori II eller III eller GHS-kategorierna 2, 2A eller 2B eller CLP-kategori 2 (17) (18) (19).

Kraftigt ögonirriterande kemikalier : a) kemikalier som orsakar vävnadsskada i ögat som inte läker inom 21 dagar från appliceringen eller orsakar allvarlig synnedsättning, b) kemikalier som klassificeras som ögonirriterande enligt GHS-kategori 1 eller EPA-kategori I eller CLP-kategori 1 (17) (18) (19).

Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Stegvis metod : en strategi för stegvis testning där all befintlig information om en testkemikalie granskas i en angiven ordning, med användning av förfarandet med sammanvägd bedömning (weight of evidence) för att avgöra om det finns tillräckligt med information till hands för att besluta om faroklassificering innan man går vidare till nästa steg. Om testkemikaliens förmåga att framkalla irritation kan fastställas på grundval av befintlig information behövs ingen ytterligare testning. Om testkemikaliens förmåga att framkalla irritation inte kan fastställas på grundval av befintlig information genomförs ett stegvis sekventiellt djurförsöksförfarande tills att det går att fastställa en otvetydig klassificering.

Weight-of-the-evidence (process) : Styrkor och svagheter hos en samling uppgifter som används som underlag för en slutsats som kanske inte framgår av de individuella uppgifterna.

TILLÄGG TILL TESTMETOD B.5  (4)

STRATEGI FÖR STEGVIS TESTNING MED AVSEENDE PÅ ÖGONIRRITATION OCH ÖGONKORROSION

Allmänna överväganden

För en sund vetenskaplig praxis och för djurens välbefinnande är det viktigt att undvika onödig användning av djur, och minimera all testning som sannolikt framkallar allvarlig respons hos djuren. All information som är relevant för en kemikalies förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögonirritation bör utvärderas innan in vivo-testning övervägs. Det kanske redan finns tillräckliga bevis för att klassificera en testkemikalie med avseende på dess förmåga att framkalla ögonkorrosion eller ögonirritation, utan behov av testning på laboratoriedjur. Man kan därför, genom att använda en weight-of-the-evidence-analys och följa strategin för stegvis testning, minimera behovet av in vivo-testning, särskilt i fråga om kemikalier som sannolikt framkallar allvarliga reaktioner.

Det rekommenderas att en weight-of-the-evidence-analys används för att utvärdera befintlig information om olika kemikaliers förmåga att framkalla ögonirritation eller ögonkorrosion. Därefter kan man avgöra om det behövs ytterligare undersökningar, andra än in vivo-test, som hjälp för att karakterisera sådan egenskap. I fall där ytterligare undersökningar behövs, rekommenderas ett förfarande enligt strategin för stegvis testning för att få fram relevanta försöksdata. För ämnen som inte har testats tidigare bör strategin för stegvis testning följas för att få fram de data som behövs för att utvärdera ämnets förmåga att framkalla ögonkorrosion eller ögonirritation. Den inledande testningsstrategi som beskrivs i detta tillägg har utarbetats inom ramen för en OECD-arbetsgrupp (1). Strategin bekräftades och utvidgades senare i Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, i den form systemet godkändes av vid det 28:e gemensamma mötet för kemikaliekommittén och kemikaliearbetsgruppen (Chemicals Committee och Working Party on Chemicals), i november 1998 (2) och uppdaterades av en OECD-expertgrupp 2011.

Även om denna testningsstrategi inte ingår som en del av testmetod B.5, är den ett uttryck för de rekommenderade principerna för bestämning av ett ämnes förmåga att framkalla ögonirritation eller ögonkorrosion. Dessa principer representerar både bästa praxis och etiska riktlinjer för in vivo-testning med avseende på ögonirritation/ögonkorrosion. Testmetoden är en vägledning för utförandet av test in vivo, och utgör en sammanfattning av de faktorer som bör beaktas innan ett sådant test övervägs. Inom ramen för strategin för stegvis testning används weight-of-the-evidence-analyser för utvärderingen av befintliga data om olika testkemikaliers egenskaper med avseende på ögonirritation/ögonkorrosion. Samtidigt fås tillgång till en stegvis metod för generering av relevanta data om kemikalier för vilka det krävs ytterligare testning eller för ämnen som ännu inte har testats. Enligt strategin utför man först validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-tester och därefter görs undersökningar enligt TM B.4 under specifika omständigheter (3) (4).

Beskrivning av den stegvisa testningsstrategin

Innan testning utförs som en del av förfarandet enligt strategin för stegvis testning (se figuren), bör all tillgänglig information utvärderas i syfte att fastställa behovet av in vivo-test på ögonen. Trots att signifikant information kan fås genom utvärdering av enskilda parametrar (till exempel extrema pH-värden), bör den tillgängliga informationen utvärderas som en helhet. Alla relevanta data om den berörda kemikaliens och dess strukturella analogers verkningar bör utvärderas när man fattar ett beslut grundat på en weight-of-the-evidence-analys, och en motivering för beslutet bör anges. Huvudvikten bör läggas vid befintliga data om kemikalien (både i fråga om människor och djur). Därefter följer resultatet av testning in vitro eller ex vivo. Testning in vivo av korrosiva kemikalier bör alltid undvikas när det är möjligt. Till de faktorer som bör beaktas inom ramen för testningsstrategin hör följande:

 

Utvärdering av befintliga data rörande människor och/eller djur och eller in vitro-data från validerade och internationellt vedertagna metoder (steg 1).

Befintliga data rörande människor, till exempel kliniska undersökningar eller undersökningar inom arbetslivet och fallstudier, och/eller djurförsöksdata från ögonstudier och/eller in vitro-data från validerade och internationellt vedertagna metoder för ögonirritation/ögonkorrosion bör beaktas först, eftersom de ger tillgång till information som direkt hör samman med verkningarna på ögonen. Därefter bör tillgängliga data från undersökningar på människor och/eller djur med avseende på hudkorrosion/hudirritation och/eller in vitro-data från validerade och internationellt vedertagna metoder för hudkorrosion utvärderas. Kemikalier med kända korrosiva egenskaper eller kemikalier som är kraftigt ögonirriterande bör inte appliceras på djurs ögon. Detsamma gäller kemikalier som ger korrosiva eller kraftigt irriterande verkningar på huden. Sådana kemikalier bör anses vara korrosiva och/eller irriterande även för ögonen. Om resultaten från tidigare utförda ögonstudier visar att en kemikalie inte är korrosiv eller irriterande, bör den inte heller testas på ögonen in vivo.

 

Analys av struktur-aktivitetssamband (SAR) (steg 2).

I mån av tillgänglighet bör resultaten från testning av strukturellt närbesläktade ämnen beaktas. Om det finns tillgång till data rörande människa och/eller djur för strukturellt närbesläktade ämnen eller blandningar av sådana ämnen, och dessa data är tillräckliga för att indikera att dessa ämnen har förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögonirritation, kan man anta att testkemikalien kommer att framkalla samma respons. I sådana fall behöver kemikalien eventuellt inte testas. Negativa data från undersökningar med strukturellt närbesläktade ämnen eller blandningar av sådana ämnen utgör inte, inom ramen för strategin för stegvis testning, tillräckliga bevis på att en kemikalie skulle sakna korrosiva eller irriterande egenskaper. Validerade och godkända metoder som bygger på struktur-aktivitetssamband bör användas för att identifiera förmågan att framkalla korrosion och irritation på huden och ögonen.

 

Fysikalisk-kemiska egenskaper och kemisk reaktivitet (steg 3).

Kemikalier med extrema pH-värden såsom ≤ 2,0 eller ≥ 11,5 kan ha kraftiga lokala verkningar. Om ett extremt pH-värde används som grund för att konstatera att en kemikalie är korrosiv eller irriterande för ögonen, behöver eventuellt också ämnets syra/bas-reserv (buffertkapacitet) beaktas (5) (6) (7). Om buffertkapaciteten tyder på att kemikalien eventuellt inte är korrosiv för ögonen (dvs. kemikalier med extremt pH och låg syra-/basreserv), bör ytterligare testning utföras för att bekräfta detta. Härvid bör man helst använda validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-tester (se punkt 10).

 

Beaktande av annan befintlig information (steg 4).

I detta steg bör man beakta all tillgänglig information om systemisk toxicitet när ett ämne tillförs via huden. Även testkemikaliens akuta toxicitet för huden bör beaktas. Om testkemikalien har konstaterats vara mycket toxisk när det tillförs via huden, behöver det eventuellt inte testas på ögonen. Även om det inte nödvändigt finns ett förhållande mellan akut toxicitet för huden och förmåga att framkalla ögonirritation/ögonkorrosion, kan man anta att ett ämne som har hög toxicitet vid tillförsel via huden, även har hög toxicitet när ämnet tillförs i ögonen. Sådana data kan även beaktas mellan steg 2 och steg 3.

 

Bedömning av kemikaliens hudkorrosion krävs även för tillsynsändamål (steg 5).

Kemikaliens förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögonirritation bör först utvärderas med användning av testmetod B.4 (4) och dess tillägg (8), inklusive validerade och internationellt vedertagna metoder för in vitro-testmetoder med avseende på hudkorrosion 9) (10) (11). Om kemikalien veterligen framkallar korrosion eller allvarlig hudirritation, bör det betraktas som frätande eller kraftigt ögonirriterande. Då krävs inga ytterligare tester. Om kemikalien inte är korrosiv eller kraftigt irriterande för huden, bör ögontest in vitro eller ex vivo utföras.

 

Resultat från in vitro- eller ex vivo-test (steg 6).

Kemikalier som har visat sig framkalla korrosion eller kraftig irritation i ett in vitro- eller ex vivo-test (12) (13) som har validerats och godkänts specifikt för utvärdering av korrosion eller irritation på ögonen, behöver inte testas på djur. Man kan anta att sådana kemikalier framkallar liknande allvarliga verkningar in vivo. Om det inte finns tillgång till resultat från validerade och godkända in vitro- eller ex vivo-test, ska man hoppa över steg 6 och fortsätta förfarandet direkt från steg 7.

 

In vivo-test på kanin (steg 7 och 8).

In vivo-ögontest bör börja med ett preliminärt test på ett enskilt djur. Om resultatet av ett sådant test tyder på att kemikalien framkallar korrosion eller kraftig irritation i ögat, bör ingen ytterligare testning utföras. Om testresultatet tyder på att ämnet inte framkallar korrosion eller kraftig irritation, utförs ett bekräftande test med ytterligare två djur. Ytterligare tester kan behövas beroende på resultatet av det bekräftande testet [se testmetod B.5].

TESTNINGS- OCH UTVÄRDERINGSSTRATEGI FÖR ÖGONIRRITATION/ÖGONKORROSION

 

Aktivitet

Iakttagelse

Slutsats

1

Befintliga data rörande människor och/eller djur och eller in vitro-data från validerade och internationellt vedertagna metoder som visar verkningar på ögonen.

Allvarlig skada på ögonen.

Apikal endpoint, bör anses vara frätande för ögonen. Ingen testning behövs.

Irriterande för ögonen.

Apikal endpoint, bör anses vara irriterande för ögonen. Ingen testning behövs.

Ej frätande eller irriterande för ögonen.

Apikal endpoint, bör anses vara icke-frätande och icke-irriterande för ögonen. Ingen testning behövs.

Befintliga data rörande människor och/eller djur och eller in vitro-data från validerade och internationellt vedertagna metoder som visar hudkorrosion.

Frätande för huden.

Bör antas vara frätande för ögonen. Ingen testning behövs.

Befintliga data rörande människor och/eller djur och eller in vitro-data från validerade och internationellt vedertagna metoder som visar kraftig hudirritation.

Framkallar kraftig irritation på huden.

Bör antas vara irriterande för ögonen. Ingen testning behövs.

 

 

Ingen information tillgänglig, eller så är den tillgängliga informationen inte avgörande.

 

 

 

 

2

Undersök struktur-aktivitetssamband för ögonkorrosion/ögonirritation.

Allvarlig skada på ögonen kan förutses.

Bör antas vara frätande för ögonen. Ingen testning behövs.

Irritation på ögonen kan förutses.

Bör antas vara irriterande för ögonen. Ingen testning behövs.

Överväg struktur-aktivitetssamband för hudkorrosion.

Korrosivitet för huden kan förutses.

Bör antas vara frätande för ögonen. Ingen testning behövs.

 

 

Inga verkningar kan förutspås eller det som kan förutspås är inte avgörande eller negativt.

 

 

 

 

3

Mätning av pH (buffertkapacitet, om relevant).

pH ≤ 2 eller ≥ 11,5 (med hög buffertkapacitet, om relevant).

Bör antas vara frätande för ögonen. Ingen testning behövs.

 

 

2 < pH < 11,5 eller pH ≤ 2,0 eller ≥ 11,5 med låg buffertkapacitet, om relevant.

 

 

 

 

4

Överväg befintliga data om systemisk toxicitet via huden.

Kraftigt toxisk vid koncentrationer som skulle används vid test på ögonen.

Kemikalien är för toxisk för att testas. Ingen testning behövs.

 

 

Sådan information är inte tillgänglig eller kemikalien har inte mycket hög toxicitet.

 

 

 

 

5

Experimentell bedömning av förmågan att framkalla hudkorrosion enligt testningsstrategin i kapitel B.4 i denna bilaga, om detta även krävs för tillsynsändamål.

Korrosiv eller kraftigt irriterande respons

Antag att kemikalien är ögonkorrosiv. Ingen ytterligare testning behövs.

 

 

Kemikalien är inte korrosiv eller kraftigt irriterande för huden

 

 

 

 

6

Utför validerade och godkända ögontest in vitro eller ex vivo.

Korrosiv eller kraftigt irriterande respons

Antag att kemikalien är korrosiv eller kraftigt irriterande för ögonen, under förutsättning att det utförda testet kan användas för att identifiera korrosiva/kraftigt irriterande kemikalier och kemikalien omfattas av testets tillämpningsområde. Ingen ytterligare testning behövs.

Irriterande respons

Antag att kemikalien är ögonirriterande, under förutsättning att det eller de utförda testen kan användas för att korrekt identifiera korrosiva, kraftigt irriterande och irriterande kemikalier och kemikalien omfattas av testet eller testernas tillämpningsområde. Ingen ytterligare testning behövs.

Icke-irriterande respons

Antag att kemikalien inte är ögonirriterande, under förutsättning att det eller de utförda testen kan användas för att korrekt identifiera ej irriterande kemikalier och korrekt särskilja dessa kemikalier från kemikalier som är irriterande, kraftigt irriterande eller korrosiva för ögonen, och kemikalien omfattas av testets tillämpningsområde. Ingen ytterligare testning behövs.

 

 

Validerade och godkända ögontest(er) in vitro eller ex vivo kan inte användas för att dra slutsatser.

 

 

 

 

7

Utför preliminärt in vivo-test på kaninöga med ett individuellt djur.

Allvarlig skada på ögonen.

Anses vara korrosiv för ögonen. Ingen ytterligare testning behövs.

 

 

Ingen allvarlig skada, eller ingen respons

 

 

 

 

8

Utför bekräftande test på ytterligare ett eller två djur.

Korrosiv eller irriterande

Anses vara korrosiv eller irriterande för ögonen. Ingen ytterligare testning behövs.

Ej korrosiv eller irriterande

Anses inte vara irriterande och korrosiv för ögonen. Ingen ytterligare testning behövs.

LITTERATUR

(1)

OECD (1996), OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Anordnades i Solna, Sverige den 22–24 januari 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3)

Worth, A.P. och Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161–177.

(4)

Kapitel B.4 i denna bilaga, Akut hudirritation/hudkorrosion.

(5)

Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.

(6)

Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. och Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483–524.

(7)

Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.

(8)

Tillägg till kapitel B.4 i denna bilaga, Stegvis testningsstrategi för hudirritation och hudkorrosion.

(9)

Kapitel B.40 i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: bestämning av transkutant elektriskt motstånd (TER).

(10)

Kapitel B.40a i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: test med modell av human hud.

(11)

OECD (2006), Test nr 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, avsnitt 4, OECD Paris.

(12)

Kapitel B.47 i denna bilaga, testmetoden BCOP (Bovine Corneal Opacity and Permeability) för identifiering av i) kemikalier som orsakar allvarlig ögonskada och ii) kemikalier för vilka det inte krävs klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada.

(13)

Kapitel B.48 i denna bilaga, testmetoden ICE (Isolated Chicken Eye Test) för identifiering av i) kemikalier som orsakar allvarlig ögonskada och ii) kemikalier för vilka det inte krävs klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada.”

(3)

I del B ska kapitel B.10 ersättas med följande:

”B.10   Test in vitro av kromosomavvikelser hos däggdjur

INLEDNING

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 473 (2016). Det är en del av en serie av testmetoder för genetisk toxikologi. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

Syftet med test in vitro av kromosomavvikelser hos däggdjur är att identifiera kemikalier som orsakar strukturella kromosomavvikelser hos odlade däggdjursceller (2) (3) (4). Strukturella avvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. Polyploidi (inklusive endoreduplicering) kan uppstå vid tester av kromosomavvikelser in vitro. Aneugener kan framkalla polyploidi, men enbart polyploidi tyder inte på aneugen potential, och kan helt enkelt tyda på störningar i cellcykeln eller cytotoxicitet (5). Detta test är inte utformat för att mäta aneuploidi. Mikrokärntest in vitro (6) rekommenderas för detektering av aneuploidi.

Test av kromosomavvikelser in vitro kan göras med kulturer av etablerade cellinjer eller primära cellkulturer från människor eller gnagare. De celler som används bör väljas ut på grundval av tillväxtförmåga vid odling, karyotypens stabilitet (inklusive antalet kromosomer) och den spontana frekvensen av kromosomavvikelser (7). De uppgifter som finns tillgängliga för närvarande tillåter inte bestämda rekommendationer, men de tyder på att det i utvärderingen av kemiska faror är viktigt att överväga p53-status, genetisk stabilitet (karyotyp) samt DNA-cellernas återhämtningskapacitet och ursprung (gnagare jämfört med människa) hos de celler som väljs ut för testning. Om denna testmetod används bör man överväga hur dessa och andra cellegenskaper inverkar på cellinjen för att upptäcka kromosomavvikelser, allteftersom kunskapen utvecklas på detta område.

Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

För testning in vitro krävs i regel ett exogent system för metabolisk aktivering, om cellerna inte är metaboliskt kompetenta i fråga om de ämnen som testas. Det exogena metaboliska aktiveringssystemet efterliknar inte helt förhållandena in vivo. Man bör också se till att undvika sådana förhållanden som leder till artefaktiska positiva resultat, dvs. kromosomskador som inte är orsakade av direkt samverkan mellan testkemikalierna och kromosomerna. Sådana förhållanden kan vara ändringar av pH eller osmolalitet (8) (9) (10), samverkan mellan mediets komponenter (11) (12) eller för hög cytotoxicitet (13) (14) (15) (16).

Detta test används för att detektera kromosomavvikelser som kan utlösas av klastogena händelser. Analysen av induktion av kromosomavvikelser bör göras med hjälp av celler i metafas. Det är därför viktigt att mitos har inträffat i både de behandlade och obehandlade odlingarna. Tillverkade nanomaterial kan kräva särskilda anpassningar av testmetoden, men de beskrivs inte här.

Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.

TESTPRINCIP

Cellodlingar från människa eller däggdjur exponeras för testkemikalien både med och utan exogent metaboliskt aktiveringssystem, utom om de celler som används har tillräcklig metaboliserande kapacitet (se punkt 13). Vid lämpliga förutbestämda intervall, efter det att cellodlingen har exponerats för testkemikalien, utförs behandling med ett ämne som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. colcemid eller colchicin). Därefter skördas cellerna och färgas in, varpå närvaro av kromatid- och kromosomavvikelser i metafascellerna analyseras mikroskopiskt.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Förberedelser

Celler

En mängd olika cellinjer kan användas (t.ex. äggstocksceller från kinesisk hamster (CHO), lungceller från kinesisk hamster V79, lungceller från kinesisk hamster (CHL)/IU, TK6) eller primära cellodlingar, inklusive perifera blodlymfocyter från människa eller andra däggdjur (7). Valet av använda cellinjer bör vara vetenskapligt motiverat. Om primära celler används av djurskyddsskäl bör man när så är möjligt överväga användning av primära celler med mänskligt ursprung som samlas in enligt humana etiska principer och föreskrifter. Humana perifera blodlymfocyter bör tas från unga rökfria personer (cirka 18–35 år) utan kända sjukdomar som inte nyligen har exponerats för genotoxiska läkemedel (t.ex. kemikalier, joniserande strålning) vid nivåer som skulle öka den bakomliggande incidensen av kromosomavvikelser. Detta garanterar att den bakomliggande incidensen av kromosomavvikelser är låg och konstant. Förekomsten av kromosomavvikelser ökar med åldern och denna tendens är mer markerad hos kvinnor än hos män (17) (18). Om celler från fler än en givare poolas för användning bör antalet givare anges. Man måste kunna påvisa att cellerna har delat sig från det att behandlingen med testkemikalien påbörjades fram till provtagningen av cellerna. Cellodlingarna hålls i en exponentiell celltillväxtfas (cellinjer) eller stimuleras så att de delar sig (primära lymfocytodlingar). Syftet med detta är att exponera cellerna i olika stadier av cellcykeln eftersom cellstadiernas känslighet för testkemikalierna kanske inte är känd. De primära celler som måste stimuleras med mitogena medel för att dela sig är i regel inte längre synkroniserade under exponeringen för testkemikalien (t.ex. humana lymfocyter efter mitogenisk stimulans i 48 timmar). Användning av synkroniserade celler under behandling rekommenderas inte, men kan vara godtagbar om det är motiverat.

Medier och odlingsbetingelser

Lämpliga odlingsmedier och inkubationsförhållanden (odlingskärl, luftfuktighet på 5 % CO2 i förekommande fall, inkubationstemperatur på 37 °C) bör väljas för odlingarna. Etablerade cellinjer och stammar bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på det modala kromosomantalets stabilitet och frånvaro av kontaminerad mykoplasma (7) (19), och får inte användas om kontamination har skett eller om det modala kromosomantalet har ändrats. Cellernas normala cellcykeltid eller den normala cellcykeltiden hos de primära kulturer som används i testlaboratoriet bör fastställas och bör överensstämma med kända cellegenskaper (20).

Beredning av odlingarna

Cellinjer: celler förökas från stamkulturer, sås ut i ett odlingsmedium som har en sådan densitet att celler i suspension eller monolager fortsätter att växa exponentiellt fram till skörd (konfluens av celler som växer i monolager bör undvikas).

Lymfocyter: helblod, behandlat med en antikoagulant (t.ex. heparin} eller så odlas separerade lymfocyter (t.ex. 48 timmar för humana lymfocyter) i närvaro av en mitogen [t.ex. fytohemaglutinin (PHA) för humana lymfocyter] för att framkalla celldelning innan cellerna exponeras för testkemikalien.

Metabolisk aktivering

Exogena metaboliserande system bör användas när cellerna inte har tillräcklig endogen metabolisk kapacitet. Det mest använda systemet, som rekommenderas som standard om inte annat kan motiveras, är en kofaktorstödd post-mitokondriell fraktion (S9) beredd ur lever från gnagare (vanligen råttor) som behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (21) (22) (23) eller en kombination av fenobarbital och β-naftoflavon (24) (25) (26) (27) (28) (29). Den senare kombinationen bryter inte mot Stockholmkonventionen om långlivade organiska föroreningar (30) och har visat sig vara lika effektiv som Aroclor 1254 när det gäller att inducera monooxygenaser (”mixed-function oxidases”) (24) (25) (26) (28). S9-fraktionen används vanligen i koncentrationer mellan 1–2 volymprocent men kan ökas till 10 volymprocent i det slutliga testmediet. Användning av produkter som minskar det mitotiska indexet, särskilt kalciumkomplexprodukter (31), bör undvikas under behandlingen. Valet av typ och koncentration av använt exogent metaboliskt aktiveringssystem eller metabolisk induktion kan påverkas av den kemikalieklass som testas.

Beredning av testkemikalien

Fasta testkemikalier bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och vid behov spädas ut innan cellerna behandlas (se punkt 23). Flytande testkemikalier kan tillsättas direkt till testsystemet och/eller spädas ut före behandling av testsystemet. Gaser eller flyktiga testkemikalier bör testas genom lämpliga modifikationer av standardprotokollen, såsom behandling i slutna odlingskärl (32) (33) (34). Testkemikalien bör beredas strax innan behandling om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel.

Testbetingelser

Lösningsmedel

Man bör välja ett lösningsmedel som optimerar testkemikaliens löslighet utan att testet påverkas negativt, t.ex. genom förändringar i celltillväxten som påverkar testkemikaliens integritet, reaktion med odlingskärlen eller försämrad metabolisk aktivering. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel (eller odlingsmedier). Vedertagna lösningsmedel är till exempel vatten eller dimetylsulfoxid. Generellt bör organiska lösningsmedel inte överstiga 1 volymprocent och vattenhaltiga lösningsmedel (saltlösningar eller vatten) bör inte överstiga 10 volymprocent i det slutliga behandlingsmediet. Om man använder lösningsmedel som inte är vedertagna (t.ex. etanol eller aceton) bör detta stödjas av uppgifter om att de är förenliga med testkemikalierna och testsystemet och att de inte är genetiskt toxiska vid den använda koncentrationen. Om ett sådant underlag saknas är det viktigt att inkludera obehandlade kontroller (se tillägg 1) som påvisar att inga skadliga eller klastogena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.

Mätning av cellproliferation och cytotoxicitet och val av exponeringskoncentrationer

Vid bestämning av den högsta testkemikaliekoncentrationen bör man undvika koncentrationer som kan ge artefaktiska positiva resultat, t.ex. för kraftig cytotoxicitet (se punkt 22), utfällning i odlingsmediet (se punkt 23) eller markerade ändringar av pH eller osmolalitet (se punkt 5). Om testkemikalien orsakar en markerad ändring av pH i mediet vid tillsättningstidpunkten kan pH justeras, företrädesvis genom buffring av det slutliga behandlingsmedlet för att undvika artefaktiska positiva resultat och upprätthålla lämpliga odlingsförhållanden.

Cellproliferationen bör mätas för att se till att ett tillräckligt antal behandlade celler har nått mitos under försöket och att behandlingarna görs på lämpliga nivåer av cytotoxicitet (se punkterna 18 och 22). Cytotoxicitet bör fastställas med och utan metabolisk aktivering i huvudförsöket med hjälp av lämplig indikation på celldöd och tillväxt. Även om det kan vara användbart att utvärdera cytotoxicitet i ett preliminärt test för att bättre definiera de koncentrationer som ska användas i huvudförsöket är ett preliminärt test inte obligatoriskt. Om ett preliminärt test utförs bör det inte ersätta mätning av cytotoxicitet i huvudförsöket.

Relativ populationsfördubblingstid (RPD) eller relativ ökning av celltal (RICC) är lämpliga metoder för bedömning av cytotoxicitet i cytogenetiska tester (13) (15) (35) (36) (55) (se tillägg 2 för formler). Om behandlings- och provtagningstiderna är långa efter det att behandlingen inletts kan cellcykellängder som är längre än 1,5 normala cellcykellängder (dvs. längre än totalt tre cellcykellängder) leda till en underskattning av cytotoxiteten om RPD används (37). Under dessa omständigheter kan RICC vara ett bättre mått. RPD kan dock även vara användbart för att utvärdera utvecklingen av cytotoxicitet efter 1,5 normala cellcykellängder.

När det gäller lymfocyter i primära odlingar är mitotiskt index (MI) ett mått på cytotoxiska/cytostatiska verkningar. Det påverkas dock av mätningstidpunkten efter behandling, använt mitogen och eventuella störningar i cellcykeln. MI är dock godtagbart eftersom andra cytotoxiska mätningar kan vara besvärliga och opraktiska och kanske inte går att använda för målpopulationen av lymfocyter som växer till följd av PHA-stimulering.

Rekommenderade cytotoxicitetsparametrar är således RICC och RPD för cellinjer och MI för primära odlingar av lymfocyter. Andra indikatorer (t.ex. cellintegritet, apoptos, nekros och cellcykel) kan ge värdefull kompletterande information.

Minst tre testkoncentrationer (exklusive lösningsmedel och positiva kontroller) som uppfyller acceptanskriterierna (lämplig cytotoxicitet, antal celler osv.) bör utvärderas. Oavsett celltyp (cellinjer eller primära odlingar av lymfocyter) kan antingen replikat eller enstaka behandlade kulturer användas för varje testad koncentration. Två identiska kulturer rekommenderas, men enstaka kulturer är också godtagbara under förutsättning att samma totala antal celler registreras för enstaka som för dubbla kulturer. Användning av enstaka kulturer är särskilt relevant när fler än tre koncentrationer utvärderas (se punkt 31). De resultat som erhölls i de oberoende replikatodlingarna vid en given koncentration kan slås ihop för dataanalysen (38). För testkemikalier med låg eller ingen cytotoxicitet är två- till trefaldiga koncentrationsintervall vanligen lämpliga. Om testkemikalien är cytotoxisk bör de valda testkoncentrationerna täcka ett relevant intervall för cytotoxiciteten enligt beskrivningen i punkt 22 och omfatta koncentrationer med måttlig, låg eller ingen cytotoxicitet. Många testkemikalier uppvisar branta koncentrations-reponskurvor. För att få uppgifter vid låg och måttlig cytotoxicitet eller undersöka dos-responsförhållandet i detalj är det därför nödvändigt att använda mera näraliggande koncentrationer och/eller fler än tre koncentrationer (enstaka kulturer eller replikat) i situationer där försöket måste upprepas (se punkt 47).

Om den maximala koncentrationen baseras på cytotoxicitet bör den högsta koncentrationen syfta till att uppnå 55 ± 5 % cytotoxicitet med hjälp av de rekommenderade cytotoxicitetsparametrarna (dvs. minskning av RICC och RPD för cellinjer och minskning av MI för primära odlingar av lymfocyter till 45 ± 5 % av den parallella negativa kontrollen). Man bör vara försiktig i tolkningen av positiva resultat som endast återfinns i den övre delen av detta cytotoxicitetsintervall på 55 ± 5 % (13).

För svårlösliga testkemikalier som inte är cytotoxiska vid koncentrationer som är lägre än den lägsta olösliga koncentrationen bör den högsta analyserade koncentrationen framkalla grumlighet eller en fällning som är synlig med blotta ögat eller med hjälp av ett inverterat mikroskop vid slutet av behandlingen med testkemikalien. Även om cytotoxicitet förekommer över den lägsta olösliga koncentrationen är det lämpligt att testa endast en koncentration som producerar grumlighet eller har en synlig fällning, eftersom fällningen kan ge artefaktiska effekter. När det gäller koncentrationer som ger fällningar bör man se till att detta inte stör testet (t.ex. färgning eller bestämning). Bestämning av löslighet i odlingsmediet före försöket kan vara användbart.

Om ingen fällning eller begränsande cytotoxicitet observeras ska de högsta testkoncentrationerna motsvara 10 mM, 2 mg/ml eller 2 μl/ml, enligt det som är lägst (39) (40) (41). Om testkemikalien inte har en definierad sammansättning, t.ex. ett ämne med okänd eller variabel sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiskt material (UVCB) (42), miljöextrakt osv., kan man behöva använda en högre toppkoncentration (t.ex. 5 mg/ml) om inte cytotoxiciteten är tillräckligt hög, för att öka koncentrationen för varje komponent. Det bör dock noteras att dessa krav kan skilja sig för humanläkemedel (43).

Kontroller

Parallella negativa kontroller (se punkt 15), bestående av enbart lösningsmedel i behandlingsmediet, och hanterade på samma sätt som behandlingsodlingarna, bör inkluderas varje gång odlingen skördas.

Parallella positiva kontroller behövs för att visa laboratoriets förmåga att identifiera klastogener enligt villkoren i det använda testprotokollet och, i förekommande fall, effektiviteten hos det exogena systemet för metabolisk aktivering. Exempel på positiva kontroller ges i tabell 1 nedan. Alternativa positiva kontrollkemikalier kan användas om det är motiverat. Tester av däggdjursceller in vitro för genetisk toxicitet är tillräckligt standardiserade och de positiva kontrollerna kan därför begränsas till en klastogen som kräver metabolisk aktivering. Förutsatt att denna enstaka positiva kontrollrespons görs samtidigt med det icke-aktiverade testet och med samma behandlingslängd kommer den att visa både aktiviteten hos det metaboliska aktiveringssystemet och testsystemets responsivitet. Separata positiva kontroller bör dock göras av långvariga behandlingar (utan S9) eftersom behandlingstiden skiljer sig från tester med metabolisk aktivering. Varje positiv kontroll bör användas för en eller flera koncentrationer som förväntas ge ökningar över bakgrunden som går att reproducera och detektera. Syftet med detta är att visa testsystemets känslighet (dvs. verkningarna är tydliga men avslöjar inte omedelbart identiteten hos de kodade utstryksglasen för avläsaren), och responsen får inte äventyras av cytotoxicitet som överskrider de gränser som anges i testmetoden.

Tabell 1

Rekommenderade referenskemikalier för utvärdering av laboratoriets kompetens att välja positiva kontroller.

Kategori

Kemikalie

CASRN

1.   

Klastogener utan metabolisk aktivering

 

Metylmetansulfonat

66-27-3

 

Mitomycin C

50-07-7

 

4-nitrokinolin-N-oxid

56-57-5

 

Cytosinarabinosid

147-94-4

2.   

Klastogener som kräver metabolisk aktivering

 

Benso(a)pyren

50-32-8

 

Cyklofosfamid

50-18-0

FÖRFARANDET

Behandling med testkemikalien

Prolifererande celler behandlas med testkemikalien i såväl närvaro som frånvaro av ett system för metabolisk aktivering.

Tid för skörd av odlingen

För en grundlig utvärdering, vilket krävs för en slutsats om ett negativt resultat, bör samtliga tre försöksförhållanden som anges nedan tillämpas i en korttidsbehandling med och utan metabolisk aktivering samt en långtidsbehandling utan metabolisk aktivering (se punkterna 43, 44 och 45):

Cellerna bör exponeras för testkemikalien utan metabolisk aktivering, under 3–6 timmar och prov bör tas ut vid en tid som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter det att behandlingen har påbörjats (18).

Cellerna bör exponeras för testkemikalien utan metabolisk aktivering, under 3–6 timmar och prov bör tas ut vid en tid som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter det att behandlingen har påbörjats (18).

Cellerna bör exponeras kontinuerligt utan metabolisk aktivering tills provtagning under en tidsperiod som motsvarar cirka 1,5 gånger de normala cellcykellängderna. Vissa kemikalier (t.ex. nukleosida analoger) kan vara enklare att detektera vid behandlings-/provtagningstider som är längre är 1,5 cykellängder (24).

Om något av de ovannämnda försöksförhållandena leder till en positiv respons kan andra behandlingssystem behöva övervägas.

Kromosompreparation

Cellkulturer behandlas vanligtvis med colcemid eller colchicin under 1–3 timmar före skörd. Varje cellkultur skördas och behandlas separat för preparationen av kromosomer. Kromosompreparation innefattar hypoton behandling av cellerna, fixering och infärgning. I monolager kan det finnas mitotiska celler (som identifieras genom att de är runda och lösgör sig från ytan) i slutet av behandlingen på 3–6 timmar. Eftersom dessa mitotiska celler enkelt lösgörs, kan de förloras när mediet som innehåller testkemikalien avlägsnas. Om det finns bevis för en betydande ökning av antalet mitotiska celler jämfört med kontrollerna, vilket tyder på en sannolik mitotisk hämning, bör cellerna samlas in genom centrifugering och tillsättas till odlingarna igen, så att man inte förlorar celler som är i mitos och som riskerar kromosomavvikelser vid skördetidpunkten.

Analys

Alla utstryksglas, inklusive de från positiva och negativa kontroller, bör få en oberoende kodning innan den mikroskopiska analysen av kromosomavvikelser utförs. Eftersom fixeringen ofta ger upphov till brott på en del metafaser, med åtföljande förlust av kromosomer, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromerantal på minst 2 n ± 2, där n är det haploida antalet kromosomer.

Åtminstone 300 väl spridda metafaser bör förekomma per koncentration och kontroll för att man ska kunna dra slutsatsen att testkemikalien är tydligt negativ (se punkt 45). De 300 cellerna bör fördelas lika mellan replikaten när replikatodlingar används. Om enstaka odlingar används per koncentration (se punkt 21) bör minst 300 väl spridda metafaser förekomma i den enstaka odlingen. Fördelen med att använda 300 celler som förekomst är att testets statistiska kraft ökar och nollvärden kommer sällan att observeras (nollvärdet förväntas endast uppgå till 5 %) (44). Antalet påträffade metafaser kan minskas om höga antal celler med kromosomavvikelser observeras och testkemikalien anses vara tydligt positiv.

Celler med strukturella kromosomavvikelser, inklusive och exklusive luckor, ska bedömas. Brott och luckor definieras i tillägg 1 enligt (45) (46). Avvikelser av kromatid- och kromosomtyp bör registreras separat och klassificeras enligt subtyper (brott, utbyten). Laboratoriets förfaranden ska säkerställa att analysen av kromosomavvikelser utförs av välutbildade bedömare och fackgranskas vid behov.

Även om syftet med testet är att detektera strukturella kromosomavvikelser, är det viktigt att notera frekvenserna för polyploidi och endoreduplikation när dessa händelser observeras. (Se punkt 2).

Laboratoriets kompetens

För att fastställa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det används för rutintestning bör laboratoriet utföra en rad försök med positiva referenskemikalier som agerar via olika mekanismer samt flera negativa kontroller (med användning av olika lösningsmedel/vehiklar). Dessa positiva och negativa kontrollresponser bör överensstämma med litteraturen. Detta gäller inte laboratorier som redan har erfarenhet, dvs. har en historisk databas enligt punkt 37.

Laboratoriet bör undersöka ett urval av positiva kontrollkemikalier (se tabell 1 i punkt 26) med korta och långa behandlingar utan metabolisk aktivering, och även med kort behandlingstid med metabolisk aktivering, för att visa att det har kompetens att upptäcka klastogena kemikalier och bestämma effektiviteten hos det metaboliska aktiveringssystemet. En rad koncentrationer av de valda kemikalierna bör användas för att ge reproducerbara och koncentrationsrelaterade ökningar över bakgrunden i syfte att visa testsystemets sensitivitet och dynamiska omfång.

Historiska kontrolldata

Laboratoriet bör fastställa följande:

Historiskt positivt kontrollintervall samt fördelning.

Historiskt negativt (obehandlad, lösningsmedel) kontrollintervall samt fördelning.

Om data för en historisk negativ kontrollfördelning samlas in först bör de parallella negativa kontrollerna överensstämma med publicerade kontrolldata om sådana finns. Allteftersom kontrollfördelningen kompletteras med fler försöksdata bör de parallella negativa kontrollerna i idealfallet ligga inom fördelningens kontrollgräns på 95 % (44) (47). Laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas kontroll bör inledningsvis baseras på minst 10 försök, men bör helst bestå av minst 20 försök utförda under jämförbara försöksbetingelser. Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex. C-diagram eller X-stapeldiagram (48)), för att fastställa hur variabla deras positiva och negativa kontrolldata är och för att visa att metoden är ”under kontroll” (44). Fler rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska kontrolldatabaser (t.ex. kriterier för att innefatta och utesluta data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (47).

Eventuella ändringar av försöksprotokollen bör övervägas när det gäller deras överensstämmelse med laboratoriets befintliga historiska kontrolldatabaser. Alla större inkonsekvenser bör leda till att en ny historisk kontrolldatabas upprättas.

Negativa kontrolldata bör bestå av förekomsten av celler med kromosomavvikelser från en enda odling eller summan av replikatodlingar enligt beskrivningen i punkt 21. Parallella negativa kontroller bör helst ligga inom kontrollgränsen på 95 % för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas (44) (47). Om parallella negativa kontrolldata faller utanför kontrollgränserna på 95 % kan de ändå ingå i den historiska kontrollfördelningen så länge de inte är extremt avvikande och det finns bevis för att testsystemet är under kontroll (se punkt 37) och att inga tekniska eller mänskliga fel begåtts.

DATA OCH RAPPORTERING

Presentation av resultaten

Procentandelen celler med strukturella kromosomavvikelser bör utvärderas. Avvikelser av kromatid- och kromosomtyp som klassificeras enligt subtyper (brott, utbyten) bör anges separat, med antal och intervaller för försöks- och kontrollodlingarna. Luckor i DNA-strängen registreras och rapporteras separat, men inkluderas i allmänhet inte i den totala avvikelsefrekvensen. Andelen polyploidi och/eller endoreduplicerade celler rapporteras om de observeras.

Parallella mätningar av cytotoxicitet för alla behandlade samt negativa och positiva kontrollkulturer i huvudförsöken avseende avvikelser bör samlas in.

Data bör anges per enskild odling. Dessutom bör alla data sammanfattas i tabellform.

Kriterier för godkännande

Testet måste uppfylla följande kriterier för att godkännas:

Den parallella negativa kontrollen måste anses godtagbar för registrering i laboratoriets historiska databas över negativa kontroller enligt punkt 39.

Parallella positiva kontroller (se punkt 26) bör framkalla reaktioner som överensstämmer med de kontroller som genereras i en historiska databasen över positiva kontroller och ge en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

Cellproliferationskriterierna i lösningsmedelskontrollen bör vara uppfyllda (punkterna 17 och 18).

Samtliga tre försöksbetingelser testades om inte ett gav positiva resultat (se punkt 28).

Tillräckligt många celler och koncentrationer finns tillgängliga för analys (punkterna 31 och 21).

Urvalskriterierna för toppkoncentrationen överensstämmer med de kriterier som beskrivs i punkterna 22, 23 och 24.

Utvärdering och tolkning av resultaten

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart positiv om något av följande gäller för någon av de undersökta försöksbetingelserna (se punkt 28):

a)

Åtminstone en av testkoncentrationerna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med samtidig negativ kontroll.

b)

Ökningen är dosrelaterad när den utvärderas med ett lämpligt trendtest.

c)

Något av resultaten ligger utanför fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser, se punkt 39).

Om alla dessa kriterier är uppfyllda anses testkemikalien kunna inducera kromosomavvikelser hos odlade däggdjursceller i detta testsystem. Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns i litteraturen (49) (50) (51).

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart negativ om följande gäller för samtliga undersökta försöksbetingelser (se punkt 28):

a)

Ingen av testkoncentrationerna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

b)

Det finns ingen koncentrationsrelaterad ökning vid utvärdering med ett lämpligt trendtest.

c)

Alla resultat ligger inom fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser, se punkt 39).

Testkemikalien anses inte kunna inducera kromosomavvikelser hos odlade däggdjursceller i detta testsystem.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller negativt svar.

Om responsen varken är klart negativ eller klart positiv enligt beskrivningen ovan eller för att göra det lättare att fastställa resultatets biologiska relevans bör uppgifterna fackgranskas och/eller undersökas ytterligare. Det kan även vara användbart att klassificera ytterligare celler (i förekommande fall) eller upprepa försöket, eventuellt med ändrade försöksbetingelser (t.ex. koncentrationsavstånd, andra metaboliska aktiveringsbetingelser (dvs. S9-koncentration eller S9-ursprung)).

I sällsynta fall är det inte möjligt att dra en slutsats om positiva eller negativa resultat trots ytterligare undersökningar, och i dessa fall anses den kemiska responsen vara tvetydig.

En ökning av antalet polyploida celler kan utgöra en indikation på att testkemikalien har potential att inhibera mitotiska processer och att inducera numeriska kromosomavvikelser (52). En ökning av antalet celler med endoreduplicerade kromosomer kan utgöra en indikation på att testkemikalierna har potential att inhibera cellcykelns förlopp (53) (54) (se punkt 2). Därför bör förekomsten av polyploida celler och celler med endoreduplicerade kromosomer registreras separat.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande information:

 

Testkemikalie:

Källa, satsnummer, sista förbrukningsdag om detta anges.

Testkemikaliens stabilitet i sig, om den är känd.

Löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet, om detta är känt.

Mätning av pH, osmolalitet och utfällningar i det odlingsmedium till vilket testkemikalien tillsattes, i förekommande fall.

 

Monokomponentämne:

fysiskt utseende, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper,

kemiska beteckningar, såsom IUPAC- eller CAS-beteckning, CAS--nummer, SMILES- eller InChI-kod, strukturell formel, renhet, kemisk beteckning på föroreningar i förekommande fall och om möjligt osv.

 

Multikomponentämne, UVCB och blandningar:

Karakteriseras så långt som möjligt genom kemisk beteckning (se ovan), kvantitativ förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper hos beståndsdelarna.

 

Lösningsmedel:

Motivering av valet av lösningsmedel.

Procentandelen lösningsmedel i den slutliga odlingsmediet ska också anges.

 

Celler:

Typ av celler och deras källa.

Den använda celltypens karyotypegenskaper och lämplighet.

Avsaknad av mykoplasma för cellinjer.

För cellinjer, uppgifter om cellcykelns längd, fördubblingstid eller proliferationsindex.

Blodgivarnas kön, ålder och annan relevant information om givarna, helblod eller separerade lymfocyter, använd mitogen substans.

Antal passager för cellinjer om sådan information finns.

Metoder för underhållet av cellodlingar för cellinjer.

Det modala antalet kromosomer för cellinjer.

 

Testbetingelser:

Identitet hos den kemikalie som stoppar celldelningen i metafasen, dess koncentration och cellexponeringens varaktighet.

Testkemikaliens koncentration, uttryckt som slutlig koncentration i odlingsmediet (t.ex. μg eller mg/mL eller mM av odlingsmediet).

Grund för val av koncentrationer och antalet kulturer inklusive t.ex. data för cytotoxicitet och löslighetsbegränsningar.

Mediets sammansättning, CO2-koncentration, om detta är tillämpligt, fuktighetsnivå.

Koncentration (och/eller volym) av det lösningsmedel och den testkemikalie som tillsätts odlingsmediet.

Inkubationstemperatur.

Inkubationstid.

Behandlingens varaktighet.

Tidpunkten för skörd efter behandlingen.

Celldensitet vid inokulering, om detta är tillämpligt.

Typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk aktivering (S9-källa, beredningsmetod för S9-blandningen, koncentration eller volym för S9-blandningen, S9 i det slutliga odlingsmediet, kvalitetskontroller av S9).

Positiva och negativa kontrollkemikalier, slutkoncentrationer för varje behandlingsförhållande.

Metoder för preparering av utstryksglas och färgningsteknik.

Acceptanskriterier för försöken.

Kriterier för hur avvikelser påvisas.

Antal analyserade metafaser.

Metoder för mätning av cytotoxicitet.

All tilläggsinformation som är relevant rörande cytotoxicitet samt använd metod.

Kriterier för att bedöma om testresultaten är positiva, negativa eller tvetydiga.

Använda metoder för att bestämma pH, osmolalitet och utfällningar.

 

Resultat:

Antal behandlade celler och antal skördade celler för varje odling om cellinjer används.

Cytotoxiska mätningar, t.ex. RPD, RICC och MI samt eventuella andra iakttagelser.

För cellinjer, uppgifter om cellcykelns längd, fördubblingstid eller proliferationsindex.

Tecken på utfällning och tid för bestämningen.

Definition av avvikelser, inklusive luckor i DNA-strängen.

Antal klassificerade celler, antal celler med kromosomavvikelser och typ av sådana avvikelser, angivna separat för varje behandlad kultur samt kontrollodling, inklusive och exklusive luckor.

Förändringar i ploiditet (polyploida celler och celler med endoreduplicerade kromosomer registreras separat) om sådana påvisas.

Koncentration-responsförhållande, där det är möjligt.

Data om parallella negativa (lösningsmedel) och positiva kontroller (koncentrationer och lösningsmedel).

Historiska negativa (lösningsmedel) och positiva kontrolldata med intervall, medelvärden, standardavvikelser och 95 %-kontrollgränser för distribution samt antalet uppgifter.

statistiska analyser, p-värden om sådana finns.

 

Diskussion av resultaten.

 

Slutsatser.

LITTERATUR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Evans, H.J. (1976), ”Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens”, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, s. 1–29

(3)

Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), ”The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture” in Progress in Mutation Research, vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, s. 427–432.

(4)

Galloway, S.M. m.fl. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 10/suppl. 10, s. 1–175.

(5)

Muehlbauer, P.A.m.fl. (2008), ”Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods, Environmental and Molecular Mutagenesis”, vol. 49/4, s. 318–327.

(6)

Kapitel B.49 i denna bilaga: Mikronukleustest av däggdjursceller in vitro.

(7)

ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.

(8)

Scott, D. m.fl. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, vol.257/2, s. 147–204.

(9)

Morita, T. m.fl. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 268/2, s. 297–305.

(10)

Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 8/6, s. 789–886.

(11)

Lång, L.H. m.fl. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 634/1-2, s. 177–183.

(12)

Nesslany, F. m.fl. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 49/6, s. 439–452.

(13)

Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 35/3, s. 191–201.

(14)

Kirkland, D. m.fl. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 584/1-2, s. 1–256.

(15)

Greenwood, S. m.fl. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 43/1, s. 36–44.

(16)

Hilliard, C.A. m.fl. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 31/4, s. 316–326.

(17)

Hedner K. m.fl. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, vol. 62, s. 305–309.

(18)

Ramsey M.J. m.fl. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, vol. 338, s. 95–106.

(19)

Coecke S. m.fl. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, vol. 33/3, s. 261–287.

(20)

Henderson, L. m.fl. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, vol.12/3, s.163–167.

(21)

Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, vol. 31/6, s. 347–363.

(22)

Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, vol. 113/3-4, s. 173–215.

(23)

Natarajan, A.T. m.fl. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, vol. 37/1, s. 83–90.

(24)

Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, vol. 66/3, s. 277–290.

(25)

Ong, T.-m. m.fl. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, vol. 4/1, s. 55–65.

(26)

Elliot B.M. m.fl. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, vol. 7/3, s. 175–177.

(27)

Matsushima, T. m.fl. (1976), ”A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems”, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85–88.

(28)

Galloway, S.M. m.fl. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, vol. 312/3, s. 241–261.

(29)

Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 28/1, s. 51–59.

(30)

Unep (2001), Stockholmskonventionen om långlivade organiska föroreningar, United Nations Environment Programme (Uneo). Finns på http://www.pops.int/.

(31)

Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, vol. 190/3, s. 225–228.

(32)

Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), ”CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids”, in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, s. 91–103.

(33)

Zamora, P.O. m.fl. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 5/6, s. 795–801.

(34)

Asakura, M. m.fl. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, vol. 652/2, s. 122–130.

(35)

Lorge, E. m.fl. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 655/1-2, s. 1–3.

(36)

Galloway, S. m.fl. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 723/2, s. 77–83.

(37)

Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 724/1-2, s. 86–87.

(38)

Richardson, C. m.fl. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141–154.

(39)

OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 och 487) ENV/JM/TG(2014)17. Tillgänglig på begäran.

(40)

Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 741/1-2, s. 32–56.

(41)

Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, vol. 54/1, s. 36–43.

(42)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.

(43)

USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Finns på https://federalregister.gov/a/2012-13774.

(44)

OECD (2014), Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(45)

ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.

(46)

Scott, D. m.fl. (1990), ”Metaphase chromosome aberration assays in vitro”, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62–86.

(47)

Hayashi, M. m.fl. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, vol. 723/2, s. 87–90.

(48)

Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.

(49)

Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.

(50)

Galloway, S.M. m.fl. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 10/suppl. 10, s. 1–175.

(51)

Richardson, C. m.fl. (1989), ”Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141–154.

(52)

Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, vol. 287/1, s. 29–46.

(53)

Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, vol. 119/3, s. 403–413.

(54)

Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, vol. 43/3, s. 1362–1364.

(55)

Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, vol. 312, s. 139–149.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Aneuploidi : alla avvikelser från det normala antalet diploida (eller haploida) kromosomer med en eller flera kromosomer, men inte med hela uppsättningar kromosomer (polyploidi).

Apoptos : programmerad celldöd som karakteriseras av en serie steg som leder till sönderfall av celler till membranbundna partiklar som därefter elimineras genom fagocytos eller avstötning.

Cellproliferation : ökning av antalet celler som resultat av mitotisk celldelning.

Kemikalie : ett ämne eller en blandning.

Kromatidbrott : diskontinuitet i en enstaka kromatid där det finns en tydlig missanpassning hos en av kromatiderna.

Kromatidlucka : ej färgat område (akromatisk skada) hos en enstaka kromatid där det finns en minimal missanpassning hos kromatiden.

Avvikelse av kromatidtyp : strukturell kromosomskada uttryckt som brott på enstaka kromatider eller brott och återförening mellan kromatider.

Avvikelse av kromosomtyp : strukturell kromosomskada uttryckt som brott och återförening, på båda kromatiderna på samma ställe.

Klastogen : alla kemikalier som orsakar strukturella kromosomavvikelser i populationer av celler eller organismer.

Koncentrationer : slutliga koncentrationer av testkemikalien i odlingsmediet.

Cytotoxicitet : För försök med användning av cellinjer som omfattas av denna testmetod avser cytotoxicitet en minskning av den relativa populationsfördubblingen (RPD) eller en relativ ökning av celltal (RICC) i behandlade celler jämfört med den negativa kontrollen (se punkt 17 och tillägg 2). För försök med användning av primära odlingar av lymfocyter som omfattas av denna testmetod avser cytotoxicitet en minskning av det mitotiska indexet (Ml) hos behandlade celler jämfört med den negativa kontrollen (se punkt 18 och tillägg 2).

Endoreduplikation : en process där kärnan efter en S-fas under DNA-replikationen inte övergår i mitos utan inleder ännu en S-fas. Resultatet är kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider.

Genotoxisk : allmän term som omfattar alla typer av DNA- eller kromosomskador, inklusive brott, deletioner, addukter, modifieringar av och kopplingar mellan nukleotider, omlagringar, genmutationer, kromosomavvikelser och aneuploidi. Inte alla typer av genotoxiska effekter leder till mutationer eller stabila kromosomskador.

Mitotiskt index (MI) : den andel celler som är i metafas delat med det totala antalet celler som kan observeras i en cellpopulation; en indikation på graden av tillväxt hos den populationen.

Mitos : delning av cellkärnan, i regel bestående av profas, prometafas, metafas, anafas och telofas.

Mutagent ämne : ämne som producerar en ärftlig ändring av DNA-basparssekvensen (-sekvenserna) i gener eller i kromosomstrukturen (kromosomavvikelser).

Numerisk avvikelse : en förändring av antalet kromosomer jämfört med det normala antalet karakteristika hos de celler som används.

Polyploidi : numeriska kromosomavvikelser i celler eller organismer som inbegriper en eller flera hela kromosomuppsättningar, i motsats till en enskild kromosom eller kromosomer (aneuploidi).

p53-status : p53-proteinet är involverat i cellcykelreglering, apoptos och DNA-reparation. Celler som lider brist på funktionellt p53-protein och är oförmögna att stoppa cellcykeln eller eliminera skadade celler via apoptos eller andra mekanismer (t.ex. induktion av DNA-reparation) i samband med p53-funktioner till svar på en DNA-skada, bör teoretiskt sett vara mer benägna till genmutationer eller kromosomavvikelser.

Relativ ökning i celltal (RICC) : ökning av antalet celler i kemiskt exponerade kulturer jämfört med ökningar i icke-behandlade kulturer, ett förhållande uttryckt i procent.

Relativ populationsfördubbling (RPD) : ökning av antalet populationsfördubblingar i kemiskt exponerade kulturer jämfört med ökningen i icke-behandlade kulturer, ett förhållande uttryckt i procent.

S9-leverfraktion : supernatant av leverhomogenat efter centrifugering vid 9 000 g, dvs. råleverextrakt.

S9-blandning : blandning av S9-leverfraktion och kofaktorer som krävs för metaboliska enzymers aktivitet.

Lösningsmedelskontroll : Allmän term för att definiera kontrollodlingar där endast lösningsmedel används för att lösa upp testkemikalien.

Strukturell avvikelse : en förändring i kromosomstrukturen som kan detekteras genom en mikroskopisk undersökning av celldelningens metafasstadium, och som uppträder i form av deletioner och fragment, interna eller externa utbyten.

Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Obehandlade kontroller : odlingar som inte behandlas (dvs. varken testkemikalie eller lösningsmedel tillsätts), men som behandlas parallellt på samma sätt som de odlingar där testkemikalien tillsätts.

Tillägg 2.

FORMLER FÖR BESTÄMNING AV CYTOTOXICITET

Mitotiskt index (MI):

Formula

Relativ ökning av celltal (RICC) eller relativ populationsfördubbling (RPD) rekommenderas, eftersom den andel av cellpopulationen som har delat sig beaktas i båda metoderna.

Formula

Formula

där

Populationsfördubbling: [log (Cellantal efter behandling ÷ Ursprungligt cellantal)] ÷ log 2

En RICC eller en RPD på 53 % indikerar t.ex. 47 % cytotoxicitet/cytostas, och 55 % cytotoxicitet/cytostas mätt med MI innebär att det faktiska MI är 45 % av kontrollen.

I alla händelser bör antalet celler före behandling mätas, vilket även gäller behandlade och negativa kontrollodlingar.

Tidigare användes RCC (dvs. antalet celler i behandlade kulturer/antalet celler i kontrollkulturer) som cytotoxicitetsparameter, men rekommenderas inte längre eftersom cytotoxiciteten kan underskattas enligt detta mått.

I negativa kontrollkulturer bör populationsfördubblingstiden överensstämma med kravet på provtagning av celler efter behandling vid en tidpunkt som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd. Det mitotiska indexet bör vara tillräckligt högt för att få ett tillräckligt antal celler i mitos och tillförlitligt beräkna en minskning med 50 %.

(4)

I del B ska kapitel B.11 ersättas med följande:

”B.11   Test av kromosomavvikelser i benmärg hos däggdjur

INLEDNING

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 475 (2016). Det är en del av en serie av testmetoder för genetisk toxikologi. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

Tester av kromosomavvikelser i benmärg hos däggdjur är särskilt relevanta för att bedöma gentoxicitet, eftersom faktorer rörande in vivo-metabolism, farmakokinetik och DNA-reparationsprocesser är aktiva och bidrar till responsen, även om de varierar mellan arterna. Ett test in vivo är även användbart för fortsatta undersökningar av gentoxicitet, med detektion i ett in vitro-system.

Testet in vivo av kromosomavvikelser hos däggdjur används för att detektera strukturella kromosomavvikelser inducerade av testkemikalier i benmärgsceller hos djur, vanligen hos gnagare (2) (3) (4) (5). Strukturella kromosomavvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. Huvuddelen av de gentoxiska kemikalieinducerade avvikelserna är av kromatidtyp, men även avvikelser av kromosomtyp förekommer. Kromosomskada och liknande händelser är orsaken till många genetiska sjukdomar hos människa och det finns omfattande bevis för att sådana skador och liknande händelser, när de ger upphov till förändringar i onkogener och tumörsuppressorgener, är inblandade i cancer hos människa och i experimentella system. Polyploidi (inklusive endoreduplicering) kan uppstå vid tester av kromosomavvikelser in vivo. En ökning av polyploidi tyder inte i sig på aneugener, och kan helt enkelt tyda på störningar i cellcykeln eller cytotoxicitet. Detta test är inte utformat för att mäta aneuploidi. Mikrokärntest in vivo av erytrocyter hos däggdjur (kapitel B.12 i denna bilaga) och däggdjurmikrokärntest in vivo av erytrocyter (kapitel B.49) i denna bilaga är det in vivo- respektive in vitro-test som rekommenderas för detektion av aneuploidi.

Definitioner av använd terminologi anges i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

Gnagare används rutinmässigt i detta test, men även andra arter kan vara lämpliga i vissa fall om det är vetenskapligt motiverat. Benmärg är målvävnaden i detta test, eftersom det är en mycket kärlrik vävnad som innehåller en cellpopulation med en snabb cellcykel, och där cellerna enkelt kan isoleras och bearbetas. Om andra arter än råttor och möss används bör en vetenskaplig motivering lämnas i rapporten. Om andra arter än gnagare används bör mätningen av kromosomavvikelser i benmärg integreras i ett annat lämpligt toxicitetstest.

Om det finns bevis för att testkemikalien eller dess metaboliter inte kommer att nå målvävnaden kan detta test vara olämpligt att använda.

Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.

TESTMETODENS PRINCIP

Försöksdjuren exponeras för testkemikalien genom en lämplig exponeringsväg och avlivas sedan humant vid en lämplig tid efter behandlingen. Innan de avlivas behandlas djuren med ett ämne som gör att celler stannar upp i metafas (t.ex. colchicin eller colcemid). Kromosomberedningar görs sedan från benmärgscellerna och färgas in, varpå celler i metafas analyseras med avseende på kromosomavvikelser.

KONTROLL AV LABORATORIEKOMPETENS

Kompetensundersökningar

För att fastställa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det används för rutintestning bör laboratoriet visa sin förmåga att reproducera förväntade resultat från publicerade data (för kromosomavvikelser (6) t.ex. frekvenser med minst två positiva kontrollkemikalier (inklusive svag respons inducerad av låga doser av positiva kontroller) enligt tabell 1 och med förenliga vehikel-/lösningsmedelskontroller (se punkt 22). I försöken bör man använda doser som ger reproducerbara och dosrelaterade ökningar och visar testsystemets sensitivitet och dynamiska omfång när det gäller den berörda vävnaden (benmärg), med användning av den klassificeringsmetod som laboratoriet tillämpar. Detta gäller inte laboratorier som redan har erfarenhet, dvs. har en historisk databas enligt punkterna 10–

Historiska kontrolldata

Laboratoriet bör fastställa följande i kompetenundersökningarna:

Ett historiskt positivt kontrollintervall och fördelning.

Ett historiskt negativt kontrollintervall och fördelning.

Om data för en historisk negativ kontrollfördelning samlas in först bör de parallella negativa kontrollerna överensstämma med publicerade kontrolldata om sådana finns. Allteftersom den historiska kontrollfördelningen kompletteras med fler försöksdata bör de parallella negativa kontrollerna i idealfallet ligga inom fördelningens kontrollgräns på 95 %. Laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas bör vara statistiskt robust för att säkerställa laboratoriets förmåga att bedöma fördelningen av negativa kontrolldata. Enligt litteraturen kan minst 10 försök behövas, men databasen bör helst bestå av minst 20 försök utförda under jämförbara försöksbetingelser. Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex. C-diagram eller X-stapeldiagram (7)), för att fastställa hur variabla deras data är och för att visa att metoden är ”under kontroll”. Fler rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska kontrolldatabaser (t.ex. kriterier för att innefatta och utesluta data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (8).

Om laboratoriet inte slutför ett tillräckligt antal försök för att fastställa en statistiskt robust negativ kontrollfördelning (se punkt 11) under kompetensundersökningarna (beskrivs i punkt 9) kan fördelningen byggas upp under de första rutintesterna. Denna strategi bör följa rekommendationerna i litteraturen (8) och de negativa kontrollresultat som erhållits i dessa experiment bör överensstämma med publicerade negativa kontrolldata.

Eventuella ändringar av försöksprotokollen bör övervägas för att se till att resulterande data fortfarande överensstämmer med laboratoriets befintliga historiska kontrolldatabas. Endast stora inkonsekvenser bör leda till upprättandet av en ny historisk kontrolldatabas om en fackgranskning fastslår att den skiljer sig från den föregående fördelningen (se punkt 11). Om en ny databas byggs upp kanske inte en fullständig negativ kontrolldatabas behövs för att utföra ett faktiskt test, under förutsättning att laboratoriet kan visa att dess parallella negativa kontrollvärden fortfarande överensstämmer med den tidigare databasen eller motsvarande publicerade data.

Negativa kontrolldata bör bestå av förekomsten av strukturella kromosomavvikelser (exklusive luckor) hos varje djur. Parallella negativa kontroller bör helst ligga inom kontrollgränsen på 95 % för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas. Om parallella negativa kontrolldata faller utanför kontrollgränserna på 95 % kan de ändå ingå i den historiska kontrollfördelningen så länge de inte är extremt avvikande och det finns bevis för att testsystemet är under kontroll (se punkt 11) och att inga tekniska eller mänskliga fel begåtts.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Förberedelser

Val av djurart

Unga och friska vuxna exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Oftast används råttor, men även möss kan vara lämpliga. Andra lämpliga däggdjursarter kan användas om en vetenskaplig motivering anges i rapporten.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

För gnagare bör temperaturen i djurens rum bör vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör helst vara 50–60 %, men minst 40 % och bör helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodring kan konventionellt laboratoriefoder användas med obegränsad tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna väg. Gnagare bör hållas i små grupper (högst fem per bur) av samma kön och behandlingsgrupp, om inget aggressivt beteende kan förväntas, företrädesvis i fasta golvburar med lämplig miljöberikning. Djuren får endast hållas individuellt om det är vetenskapligt motiverat.

Förberedelse av djuren

Normalt används friska unga vuxna djur (6–10 veckor gamla vid behandlingsstarten, även om något äldre djur också är godtagbara) som slumpvis väljs ut till kontroll- och behandlingsgrupperna. Djuren ska ha en unik identifiering som appliceras med en human och minimalt invasiv metod (t.ex. ringmärkning, taggar, mikrochip eller biometrisk identifiering, men inte öron- eller tassclips). De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar. Burarna bör placeras så att eventuella verkningar på grund av placeringen minimeras. Korskontaminering av den positiva kontrollen och testkemikalien bör undvikas. Vid undersökningens början bör viktskillnaderna mellan försöksdjuren vara minimal och inte överskrida ± 20 % av medelvikten för varje kön.

Beredning av doser

Fasta testkemikalier bör lösas upp i, eller blandas med, lämpliga lösningsmedel eller vehiklar eller blandas i foder eller dricksvatten innan dosen administreras till djuren. Testkemikalier i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före doseringen. Vid inhalationexponering kan testkemikalier administreras såsom gas, ånga eller en fast/flytande aerosol, beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper. Nygjorda beredningar av testkemikalien bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel och lämpliga lagringsförhållanden bör fastställas.

Lösningsmedel/vehikel

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testkemikalien. Om andra lösningsmedel/vehiklar än väl kända används bör det finnas referensdata som visar att de är kompatibla. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar. Exempel på vanliga kompatibla lösningsmedel/vehiklar är vatten, fysiologisk saltlösning, metylcellulosalösning, karboximetylcellulosa natriumsaltlösning, olivolja och majsolja. I avsaknad av historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga strukturella avvikelser eller andra skadliga effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehikeln bör en preliminär undersökning utföras för att fastställa acceptansen för vehikelkontrollen.

Kontroller

Positiva kontroller

En grupp djur som behandlas med en positiv kontrollkemikalie bör normalt ingå i varje test. Denna regel kan frångås om testlaboratoriet har visat att det är kvalificerat att utföra testet och har fastställt ett historiskt positivt kontrollintervall. Om en parallell positiv kontrollgrupp inte ingår bör klassificeringskontroller (fasta och ofläckade utstryksglas) inkluderas i varje försök. Detta kan åstadkommas genom att inbegripa lämpliga referensprover i klassificeringen av undersökningen som har erhållits och lagrats från ett separat positivt kontrollförsök som utförs med jämna mellanrum (.tex var 6:e till 18 månad) på det laboratorium där testet utförs, t.ex. under kvalifikationsprövning och vid behov med jämna mellanrum därefter.

Positiva kontrollkemikalier bör på ett tillförlitligt sätt ge en detekterbar ökning i frekvensen av celler med strukturella kromosomavvikelser över den spontana nivån. Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos de kodade proverna för bedömaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testkemikalien och enligt ett annat behandlingsschema, och att provtagningen endast sker vid ett tillfälle. Dessutom kan användningen av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier övervägas i förekommande fall. Exempel på positiva kontrollkemikalier ges i tabell 1.

Tabell 1

Exempel på positiva kontrollkemikalier

Kemikalie

CASRN

Etylmetansulfonat

62-50-0

Metylmetansulfonat

66-27-3

Etylnitrosourea

759-73-9

Mitomycin C

50-07-7

Cyklofosfamid (monohydrat)

50-18-0 (6055-19-2)

Trietylenmelamin

51-18-3

Negativa kontroller

Djur från den negativa kontrollgruppen bör inkluderas vid varje provtagningstillfälle och i övrigt hanteras på samma sätt som behandlingsgrupperna, med undantag för att de inte behandlas med testkemikalien. Om lösningsmedel/vehikel används för att tillföra testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras lösningsmedlet/vehikeln. Om testlaboratoriet påvisar enhetliga variationer mellan djur och frekvenser av celler med strukturella avvikelser genom historiska negativa kontrolldata vid varje provtagningstillfälle kan det dock vara tillräckligt med en enda provtagning för den negativa kontrollen. Om en enda provtagning används för negativa kontroller bör den vara det första provtagningstillfället i undersökningen.

FÖRFARANDET

Djurens antal och kön

I regel är responsen när det gäller mikrokärnor liknande mellan han- och hondjur (9), och detta förväntas även gälla strukturella kromosomavvikelser. De flesta försök kan därför utföras på båda könen. Om det finns data som visar på relevanta skillnader mellan hanar och honor (t.ex. skillnader i systemisk toxicitet, metabolism, biotillgänglighet, benmärgstoxicitet osv., inklusive ett preliminärt test) bör båda könen användas. I detta fall kan det vara lämpligt att göra en undersökning av båda könen, t.ex. som en del av en upprepad dostoxicitetsundersökning. Om båda könen används kan ett faktorförsök vara lämpligt. En närmare beskrivning av hur man analyserar data med användning av faktorförsök ges i tillägg 2.

Gruppernas storlek vid försöksstarten bör fastställas. Målet bör vara minst fem analyserbara djur av ett kön, eller av varje kön om båda könen används, per grupp. I de fall där exponering av människa för kemikalier kan ge könsspecifika resultat, som t.ex. för vissa läkemedel, bör testet utföras med försöksdjur av lämpligt kön. Som en vägledning för ett vanligt krav på maximalt antal djur skulle det krävas 45 djur för en benmärgsundersökning med två provtagningstillfällen, tre dosgrupper och en parallell negativ kontrollgrupp plus en positiv kontrollgrupp (fem djur av ett kön i varje grupp).

Dosnivåer

Om det inte redan finns lämpliga data som kan ge vägledning om dosval och en preliminär undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvudundersökningen (10). Syftet med undersökningen bör vara att identifiera högsta tolererbara dos (MTD), som definieras som den dos som tolereras utan bevis för toxicitet som begränsar undersökningen i förhållande till dess varaktighet (t.ex. genom att inducera minskad kroppsvikt eller hematopoietisk systemcytotoxicitet, men inte dödlighet eller tecken på smärta, lidande eller ångest som kräver human avlivning (11)).

Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken producerar en indikation på toxicitet för benmärgen.

Kemikalier som uppvisar mättnad av toxikokinetiska egenskaper eller inducerar avgiftningsprocesser som kan leda till minskad exponering efter långtidsbehandling kan vara undantag från kriterierna för dosbestämning och bör utvärderas från fall till fall.

För att inhämta data om dosrespons bör en fullständig undersökning omfatta en negativ kontrollgrupp och minst tre dosnivåer som vanligen separeras av en faktor på 2, men inte högre än 4. Om testkemikalien inte visar toxicitet i en preliminär undersökning eller baserat på befintliga uppgifter bör den högsta dosen för engångsdosering vara 2 000 mg/kg kroppsvikt. Om testkemikalien orsakar toxicitet bör MTD vara den högsta dosen och de dosnivåer som används bör helst omfatta ett intervall från maxdos till en dos som producerar liten eller ingen toxicitet. När toxicitet i målvävnaden (benmärg) observeras vid alla testade dosnivåer rekommenderas fortsatta undersökningar med icke-toxiska doser. Undersökningar som syftar till att mer grundligt karakterisera kvantitativ information om dosrespons kan kräva ytterligare dosgrupper. Dessa gränser kan variera för vissa typer av testkemikalier (t.ex. humanläkemedel) som omfattas av särskilda krav.

Toleranstest

Om försök för att fastställa dosering eller befintliga data från besläktade djurstammar tyder på att ett behandlingssystem med minst gränsdosen (beskrivs nedan) inte ger några observerbara toxiska effekter (ingen minskning av benmärgens proliferation eller andra bevis på cytotoxicitet i målvävnaden), och om ingen gentoxicitet förväntas baserat på in vitro-undersökningar av gentoxicitet eller data från strukturellt besläktade kemikalier, anses det kanske inte nödvändigt med ett fullständigt test med tre dosnivåer, under förutsättning att det har påvisats att testkemikalien når målvävnaden (benmärg). I sådana fall kan en enda dosnivå, vid gränsdosen, vara tillräcklig. För en administrationsperiod på > 14 dagar är gränsdosen 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag. För administrationsperioder på 14 dagar eller mindre är gränsdosen 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag.

Tillförsel av doser

Den förväntade exponeringsvägen för människor bör beaktas vid utformningen av en analys. Därför kan exponeringsvägar (t.ex. föda, dricksvatten, lokalt, subkutant, intravenöst, oralt (via sond), inhalation, intratrakealt eller implantation) väljas som motiverad exponering. Exponeringsvägen bör i alla händelser väljas för att säkerställa lämplig exponering av målvävnaden. Intraperitoneal injektion rekommenderas generellt inte eftersom den inte är en avsedd exponeringsväg för människor, och bör endast användas med specifik vetenskaplig motivering. Om testkemikalien blandas i födan eller dricksvattnet bör man, särskilt i fråga om engångsdosering, se till att fördröjningen mellan födo- och vattenintag och provtagning är tillräcklig för att upptäcka effekterna (se punkterna 33–34). Den maximala vätskevolymen som kan administreras genom sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör normalt inte överstiga 1 ml per 100 g kroppsvikt, utom för vattenlösningar där högst 2 ml/100 g får användas. Användning av volymer som är större än så bör motiveras. Med undantag för irriterande eller frätande testkemikalier, som normalt kommer att ge stegrade verkningar vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa att en konstant volym ges i förhållande till kroppsvikten vid alla dosnivåer.

Behandlingsschema

Testkemikalierna ges normalt som en enstaka behandling, men kan även ges som en delad dos (dvs två eller flera behandlingar samma dag med högst 2–3 timmars mellanrum) för att underlätta tillförsel av stora volymer. Under dessa omständigheter eller när tillförseln av testkemikalien sker via inhalation bör provtagningstiden planeras baserat på tidpunkten för den sista doseringen eller när exponeringen upphör.

Det finns få uppgifter om huruvida ett protokoll med upprepade doser är lämpligt för detta test. Under omständigheter där det är önskvärt att integrera detta test med ett toxicitetstest med upprepade doser bör man dock vara noga med att undvika förlust av mitotiska celler med kromosomskador, som kan förekomma vid toxiska doser. Integrering är godtagbar när den högsta dosen är större eller motsvarar gränsdosen (se punkt 29) och en dosgrupp ges som gränsdos under behandlingsperiodens varaktighet. Mikrokärntest (testmetod B.12) bör vara det in vivo-test som väljs för kromosomavvikelser när integrering med andra undersökningar är önskvärt.

Benmärgsprov bör tas vid två separata tillfällen efter enstaka behandlingar. För gnagare bör det första provtagningsintervallet vara den tid som krävs för att slutföra 1,5 normala cellcykellängder (normalt 12–18 timmar efter behandlingsperioden). Eftersom den tid som krävs för upptag och metabolism av testkemikalien och dess effekt på cellcykelns kinetik kan påverka den optimala tiden för detektion av kromosomavvikelser, rekommenderas att provtagningen senareläggs till 24 timmar efter det första provtagningstillfället. Vid det första provtagningstillfället bör alla dosgrupper behandlas och prover samlas in för analys. Vid senare provtagningstillfällen behöver endast den högsta dosen ges. Om doseringar på mer än en dag används baserat på en vetenskaplig motivering bör man ha ett provtagningstillfälle vid upp till cirka 1,5 gånger den normala cellcykelns längd efter den slutliga behandlingen.

Efter behandling och före provtagning injiceras försöksdjuren intraperitonealt med en lämplig dos av ett metafashämmande medel (t.ex. colcemid eller colchicin), och prover samlas in vid ett lämpligt intervall därefter. För möss är detta intervall ungefär 3–5 timmar före insamlingen och för råttor 2–5 timmar. Celler skördas från benmärgen, svullna, fixerade och färgade, och analyseras med avseende på kromosomavvikelser (12).

Observationer

Allmänna kliniska observationer av testdjuren bör göras och kliniska tecken registreras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen. Djuren bör observeras minst två gånger dagligen under doseringsperioden beträffande morbiditet och mortalitet. Alla djur bör vägas när undersökningen inleds, åtminstone en gång i veckan under undersökningar med upprepad dosering och vid avlivning. För undersökningar som varar minst en vecka bör mätning av foderkonsumtion göras minst en gång i veckan. Om testkemikalien tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas vid varje byte av vatten och minst en gång i veckan. Djur som uppvisar icke-dödliga indikatorer på överskottstoxicitet bör avlivas på ett humant sätt innan testperiodens slut (11).

Exponering av målvävnaden

Blodprov tas vid lämpliga tidpunkter för att möjliggöra undersökningar av testkemikaliens plasmanivåer. Syftet med detta är att visa att benmärgen har exponerats om så krävs och om det inte finns andra exponeringsdata (se punkt 44).

Benmärg och kromosompreparat

Omedelbart efter det att djuren avlivats humant tas benmärgsceller från djurens lår- eller skenben, exponeras för hypoton lösning och fixeras. Metafascellerna sprids sedan ut på utstryksglas och färgas med användning av etablerade metoder (se (3) (12)).

Analys

Alla utstryksglas, inklusive utstryksglas med positiva och negativa kontroller, bör ges en oberoende kodning före analysen och bör randomiseras så att bedömaren inte känner till behandlingsbetingelserna.

Det mitotiska indexet bör fastställas som ett mått på cytotoxicitet hos minst 1 000 celler per djur för alla behandlade försöksdjur (inklusive positiva kontroller), obehandlade försöksdjur eller djur för negativ kontroll med vehikel/lösningsmedel.

Minst 200 metafaser bör analyseras för varje djur med avseende på strukturella kromosomavvikelser, inklusive och exklusive luckor (6). Om den historiska databasen över negativa kontroller visar att bakgrundsmedelvärdet för frekvensen för strukturella kromosomavvikelser är < 1 % på testlaboratoriet bör man överväga att klassificera ytterligare celler. Avvikelser av kromatid- och kromosomtyp bör registreras separat och klassificeras enligt subtyper (brott, utbyten). Laboratoriets förfaranden ska säkerställa att analysen av kromosomavvikelser utförs av välutbildade bedömare och fackgranskas vid behov. Eftersom beredningen av utstryksglas ofta resulterar i brott på en del av de celler som är i metafas med förlust av kromosomer som följd, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromererantal på minst 2n ± 2, där n är antalet haploider för kromosomerna hos den arten.

DATA OCH RAPPORTERING

Behandling av resultaten

Individuella djurdata bör presenteras i tabellform. Mitotiskt index, antalet metafasceller som påträffas, antalet avvikelser per metafascell och procentandelen celler med strukturella kromosomavvikelser utvärderas för varje djur. Olika typer av strukturella kromosomavvikelser bör listas med antal och frekvenser för behandlade grupper och kontrollgrupper. Luckor samt polyploida celler och celler med endoreduplicerade kromosomer registreras separat. Frekvensen av luckor rapporteras men tas i regel inte med i analysen av den totala strukturella avvikelsefrekvensen. Om det inte finns några bevis för en skillnad i resultaten mellan könen, kan data kombineras för statistisk analys. Uppgifter om toxicitet för djur och kliniska tecken bör också rapporteras.

Kriterier för godkännande

Följande kriterier avgör om testet är godtagbart:

a)

Parallella negativa kontrolldata anses godtagbara för registrering i laboratoriets historiska databas (se punkterna 11–14).

b)

Parallella positiva kontroller eller klassificeringskontroller bör framkalla reaktioner som överensstämmer med de kontroller som genereras i den historiska databasen över positiva kontroller och ge en statistiskt signifikant ökning jämfört med den negativa kontrollen (se punkterna 20–21).

c)

Ett lämpligt antal doser och celler har analyserats.

d)

Urvalskriterierna för högsta dos överensstämmer med de kriterier som beskrivs i punkterna 25–28.

Utvärdering och tolkning av resultaten

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart positiv om följande gäller:

a)

Åtminstone en av behandlingsgrupperna uppvisar en statistiskt signifikant ökning av frekvensen av celler med strukturella kromosomavvikelser (exklusive luckor) jämfört med den parallella negativa kontrollen.

b)

Ökningen är dosrelaterad vid minst ett provtagningstillfälle när den utvärderas med ett lämpligt trendtest.

c)

Något av resultaten ligger utanför fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser.

Om endast den högsta dosen undersöks vid ett visst provtagningstillfälle anses en testkemikalie vara klart positiv om det finns en statistiskt säkerställd ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen och resultaten ligger utanför fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser). Rekommendationer om lämpliga statistiska metoder finns i litteraturen (13). Om en dos-responsanalys genomförs bör minst tre behandlade dosgrupper analyseras. Statistiska tester som används bör betrakta djuret som den experimentella enheten. Positiva resultat i testet av kromosomavvikelser visar att testkemikalien inducerar strukturella kromosomavvikelser i benmärgen hos de arter som testades.

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart negativ om följande gäller för samtliga undersökta försöksbetingelser:

a)

Ingen av behandlingsgrupperna uppvisar en statistiskt signifikant ökning av frekvensen av celler med strukturella kromosomavvikelser (exklusive luckor) jämfört med den parallella negativa kontrollen.

b)

Ingen dosrelaterad ökning förekommer vid något provtagningstillfälle vid utvärdering med ett lämpligt trendtest.

c)

Alla resultat ligger inom fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser.

d)

Benmärgen exponerades för testkemikalien.

Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns i litteraturen (13). Bevis för att benmärgen exponerats för en testkemikalie kan vara en minskning av det mitotiska indexet eller mätningar av plasma- och blodnivåerna i förhållande till testkemikalien. Vid intravenös tillförsel behövs inga bevis på exponering. Alternativt kan ADME-data, som erhållits i en oberoende undersökning med samma exponeringsväg och samma arter, användas för att visa benmärgsexponering. Negativa resultat indikerar att testkemikalien, under dessa försöksbetingelser, inte inducerar strukturella kromosomavvikelser i benmärgen hos de arter som testades.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller negativt svar.

Om responsen varken är klart negativ eller klart positiv och för att göra det lättare att fastställa resultatets biologiska relevans (t.ex. en svag ökning eller en ökning som ligger på gränsen) bör de försök som slutförts fackgranskas och/eller undersökas ytterligare. I vissa fall kan analys av fler celler eller ett upprepat försök med modifierade försöksbetingelser vara användbart.

I sällsynta fall är det inte möjligt att dra en slutsats om huruvida testkemikalien ger positiva eller negativa resultat trots ytterligare undersökningar, och i dessa fall anses undersökningen vara tvetydig.

Frekvenserna av polyploida och endoreduplicerade metafaser bland det totala antalet metafaser bör registreras separat. En ökning av antalet polyploida/endoreduplicerade celler kan utgöra en indikation på att testkemikalierna har potential att inhibera mitotiska processer eller cellcykelns förlopp (se punkt 3).

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande information:

Sammanfattning

 

Testkemikalie:

Källa, satsnummer, sista förbrukningsdag om detta anges.

Testkemikaliens stabilitet, om den är känd.

 

Monokomponentämne:

fysiskt utseende, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper,

kemiska beteckningar, såsom IUPAC- eller CAS-beteckning, CAS-nummer, SMILES- eller InChI-kod, strukturell formel, renhet, kemisk beteckning på föroreningar i förekommande fall och om möjligt osv.

 

Multikomponentämne, UVCB och blandningar:

Karakteriseras så långt som möjligt genom kemisk beteckning (se ovan), kvantitativ förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper hos beståndsdelarna.

 

Beredning av testkemikalien:

Motivering för val av vehikel.

Löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt.

Beredning av foder-, dricksvatten- eller inandningsberedningar.

Analytiska bestämningar av beredningar (t.ex. stabilitet, homogenitet, nominella koncentrationer, om sådana bereds.

 

Försöksdjur:

Art/stam som används och motivering av valet.

Djurens antal, ålder och kön.

Ursprung, inhysning, foder etc.

Metod för unik identifiering av djuren.

För korttidsstudier: individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början och slutet av testet; för studier längre än en vecka: individuella kroppsvikter under studien och foderförbrukning. Kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp bör inkluderas.

 

Testbetingelser:

Positiva och negativa kontroller (vehikel/lösningsmedel).

Data från en dosfinnande studie, om en sådan har utförts.

Grund för valet av dosnivå.

Uppgifter om beredning av testkemikalien.

Uppgifter om administreringen av testkemikalien.

Grund för administreringssätt och varaktighet.

Metoder för att verifiera att testkemikalien nådde det stora kretsloppet eller benmärgen.

Faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag) som beräknats genom födans/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (ppm) och konsumtion, i tillämpliga fall.

Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.

Metod för avlivning.

Smärtlindringsmetod (i förekommande fall).

Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman samt motivering av valen.

Metoder för preparation av utstryksglas.

Metoder för mätningar av toxicitet.

Identitet för den metafashämmande kemikalien, koncentration, dos och tidpunkt för tillförsel före provtagning.

Förfaranden för att isolera och bevara prover.

Kriterier för hur avvikelser påvisas.

Antal analyserade metafasceller per djur och antal analyserade celler för bestämning av mitotiskt index.

Acceptanskriterier för undersökningen.

Kriterier för att bedöma om undersökningarna är positiva, negativa eller ofullständiga.

 

Resultat:

Djurens skick före och under hela testperioden, inklusive tecken på toxicitet.

Mitotiskt index, angivet separat för varje djur.

Typ och antal avvikelser och avvikande celler, angivna separat för varje djur.

Totalt antal avvikelser per grupp med medelvärden och standardavvikelser.

Antal celler med avvikelser per grupp med medelvärden och standardavvikelser.

Förändringar i ploiditet om sådana påvisas, inklusive frekvenser för polyploida och/eller endoreduplicerade celler.

Dos/respons-förhållandet, där detta är möjligt.

De statistiska analyser och metoder som använts.

Uppgifter som styrker att exponering av benmärgen skedde.

Parallella negativa och positiva kontrolldata, med omfattning, medelvärden och standardavvikelser.

Historiska negativa och positiva kontrolldata med intervall, medelvärden, standardavvikelser och 95 % kontrollgränser för distribution, den tidsperiod som omfattas och antalet observationer.

Kriterier som uppfyllts för positiv eller negativ respons.

 

Diskussion av resultaten.

 

Slutsatser

 

Litteraturhänvisningar

LITTERATUR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Adler, I.D. (1984), ”Cytogenetic Tests in Mammals”, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275–306.

(3)

Preston, R.J. m.fl. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, vol. 189/2, s. 157–165.

(4)

Richold, M. m.fl. (1990), ”In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115–141.

(5)

Tice, R.R. m.fl. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, vol. 312/3, s. 305–312.

(6)

Adler, I.D. m.fl. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 417/1, s. 19–30.

(7)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(8)

Hayashi, M. m.fl. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 723/2, s. 87–90.

(9)

Hayashi, M. m.fl. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, vol. 312/3, s. 293–304.

(10)

Fielder, R.J. m.fl. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, vol. 7/5, s. 313–319.

(11)

OECD (2000), ”Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No19, OECD Publishing, Paris.

(12)

Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, vol. 1044, s. 147–163.

(13)

Lovell, D.P. m.fl. (1989), ”Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184–232.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Aneuploidi : alla avvikelser från det normala antalet diploida (eller haploida) kromosomer med en eller flera kromosomer, men inte med hela uppsättningar kromosomer (jfr polyploidi).

Centromer : region på en kromosom där kärnspolefibrer är fästa under celldelning, vilket möjliggör en ordnad rörelse av dotterkromosomerna mot dottercellernas poler.

Kemikalie : ett ämne eller en blandning.

Avvikelse av kromatidtyp : strukturell kromosomskada uttryckt som brott på enstaka kromatider eller brott och återförening mellan kromatider.

Avvikelse av kromosomtyp : strukturell kromosomskada uttryckt som brott och återförening, på båda kromatiderna på samma ställe.

Endoreduplikation : en process där kärnan efter en S-fas under DNA-replikationen inte övergår i mitos utan inleder ännu en S-fas. Resultatet är kromosomer med 4,8,16,… kromatider.

Lucka : en akromatisk skada som är mindre än bredden på en kromatid, och med ett minimum av missanpassning hos kromatiderna.

Mitotiskt index : förhållandet mellan antalet celler i mitos och det totala antalet celler i en population, vilket är ett mått på cellpopulationens proliferationsstatus.

Numerisk avvikelse : en förändring av antalet kromosomer från det normala antalet karakteristiskt för det försöksdjur som används (aneuploidi).

Polyploidi : en numerisk kromosomavvikelse med en ändring av kromosomuppsättningens antal, jämfört med en numerisk ändring i en del av kromosomuppsättningen (jfr aneuploidi).

Strukturell kromosomavvikelse : en förändring i kromosomstrukturen som kan detekteras genom en mikroskopisk undersökning av celldelningens metafasstadium, och som uppträder i form av deletioner och fragment, interna eller externa utbyten.

Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Tillägg 2

UTFORMNING AV FAKTORFÖRSÖK FÖR IDENTIFIERING AV SKILLNADER MELLAN KÖNEN I IN VIVO-TEST MED AVSEENDE PÅ KROMOSOMAVVIKELSER

Utformning och analys av faktorförsök

I denna utformning testas minst fem hanar och fem honor vid varje koncentrationsnivå, vilket innebär att minst 40 djur måste användas (20 hanar och 20 honor plus relevanta positiva kontroller).

Detta är ett av de enklaste faktorförsöken och det motsvarar en tvåvägs-variansanalys med kön och koncentrationsnivå som huvudsakliga effekter. Data kan analyseras med hjälp av många vanliga statistiska programvarupaket såsom SPSS, SAS, STATA, Genstat samt med hjälp av R.

Analysen delar upp variationen i datauppsättningen mellan kön, koncentrationer och interaktionen mellan kön och koncentrationer. Var och en av termerna testas mot en uppskattning av variationerna mellan replikatdjuren inom djurgrupper av samma kön som ges samma koncentration. Fullständig information om den underliggande metoden finns i många statistiska läroböcker (se litteraturhänvisningar) och i hjälpavsnitt i statistiska paket.

Nästa steg i analysen är att kontrollera interaktionstermen ”kön x koncentration” i ANOVA tabellen (5). I avsaknad av en signifikant interaktionsterm ger de kombinerade värdena mellan könen eller koncentrationsnivåerna giltiga statistiska test mellan nivåerna, baserat på den sammanslagna inomgruppsvariationen enligt ANOVA.

Nästa steg i analysen är att dela upp uppskattningen av variationen mellan koncentrationerna i kontraster, som möjliggör ett test avseende linjära och kvadratiska kontraster i responsen mellan koncentrationsnivåerna. Om en signifikant variation i kön x koncentration förekommer kan även denna term delas upp i interaktionskontraster enligt följande: linjära kontraster x kön och kvadratiska kontraster x kön. Med hjälp av dessa termer kan man testa om koncentrationsresponsen är parallell för de två könen eller om den skiljer sig åt.

Uppskattningen av den sammanslagna inomgruppsvariationen kan användas för parvisa test av skillnaderna mellan medelvärdena. Dessa jämförelser kan göras mellan medelvärdena för könen och medelvärdena för de olika koncentrationsnivåerna, t.ex. för jämförelser med de negativa kontrollnivåerna. Om det finns en signifikant interaktion kan man jämföra medelvärden för olika koncentrationer för samma kön eller medelvärden för båda könen vid samma koncentration.

Litteraturhänvisningar

Teori, utformning, metod, analys och tolkning av faktorförsök diskuteras i många statistiska läroböcker, från den enklaste tvåfaktorsanalysen till mer komplexa former som används i försöksutformningsmetoder. Följande förteckning är icke-uttömmande: Vissa böcker innehåller etablerade exempel på jämförbara utformningar, i vissa fall med koder för att köra analysen med hjälp av olika programvarupaket.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. och Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

 

Box G.E.P. och Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J och Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

(5)

I del B ska kapitel B.12 ersättas med följande:

”B.12   Mikrokärntest av erytrocyter hos däggdjur

INLEDNING

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 474 (2016). Det är en del av en serie av testmetoder för genetisk toxikologi. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

Mikrokärntest in vivo hos däggdjur är särskilt relevanta för att bedöma gentoxicitet, eftersom faktorer rörande in vivo-metabolism, farmakokinetik och DNA-reparationsprocesser är aktiva och bidrar till responsen, även om de varierar mellan arterna. Ett test in vivo är även användbart för fortsatta undersökningar av gentoxicitet, med detektion i ett in vitro-system.

Mikrokärntest in vivo hos däggdjur används för att detektera skador som testkemikalien inducerar på kromosomerna i den mitotiska funktionen hos erytroblaster. Testet utvärderar bildning av mikrokärnor i erytrocyter som antingen tas från benmärgen eller perifera blodceller hos djur, vanligen gnagare.

Avsikten med testet av mikrokärnor är att identifiera kemikalier som orsakar cytogen skada, vilket resulterar i bildning av mikrokärnor som antingen innehåller isolerade kromosomfragment eller hela kromosomer.

När en erytroblast från benmärg utvecklas till en omogen erytrocyt (ibland även kallad polykromatisk erytrocyt eller retikulocyt) stöts huvudkärnan ut. Eventuella mikrokärnor som har bildats kan stanna kvar i cytoplasman. Visualisering eller detektering av mikrokärnor underlättas i dessa celler eftersom de saknar en huvudkärna. En ökning av frekvensen av omogna erytrocyter med mikrokärnor hos behandlade försöksdjur utgör en indikation på inducerade strukturella eller numeriska kromosomavvikelser.

Nybildade erytrocyter med mikrokärnor identifieras och kvantifieras genom färgning, följt av antingen visuell klassificering med mikroskop eller genom automatisk analys. Ett tillräckligt stort antal erytrocyter måste räknas i perifert blod eller benmärgen hos vuxna djur. Räkningen underlättas avsevärt om man använder en automatisk klassificeringsplattform. Användningen av sådana plattformar är godtagbara alternativ till manuell utvärdering (2). Jämförande studier har visat att sådana metoder, med användning av lämpliga kalibreringsstandarder, kan ge bättre reproducerbarhet och sensitivitet inom laboratoriet än manuell klassificering med mikroskop (3) (4). Automatiska system som kan mäta frekvenser för erytrocyter med mikrokärnor är bland annat flödescytometrar (5), bildanalysplattformar (6) (7) och laserskanningcytometrar, även om det finns andra alternativ (8).

Även om det normalt inte görs under testet kan kromosomfragment särskiljas från hela kromosomer med hjälp av ett antal kriterier. Dessa innefattar identifiering av närvaron eller frånvaron av en kinetokor eller av centromer-DNA, som båda är karakteristiska för intakta kromosomer. Frånvaro av kinetokor eller av centromer-DNA tyder på att mikrokärnorna endast innehåller kromosomfragment, medan närvaro är ett tecken på kromosomförlust.

Definitioner av använd terminologi anges i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

Målvävnaden för genetisk skada i detta test är benmärg hos unga vuxna gnagare, eftersom erytrocyter bildas i denna vävnad. Mätning av mikrokärnor i omogna erytrocyter i perifert blod hos andra däggdjursarter är godtagbart om det har visats att arten är tillräckligt känslig för att detektera kemikalier som orsakar strukturella eller numeriska kromosomavvikelser hos dessa celler (genom induktion av mikrokärnor i omogna erytrocyter) och en vetenskaplig motivering ges. Frekvensen av omogna erytrocyter med mikrokärnor utgör den huvudsakliga slutpunkten. Frekvensen av mogna erytrocyter som innehåller mikrokärnor i perifert blod kan också användas som endpoint hos arter utan stark selektion i mjälten mot celler med mikrokärnor och när djuren behandlas kontinuerligt under en period som är längre än livslängden för erytrocyter hos den använda arten (t.ex. fyra veckor eller mer hos möss).

Om det finns bevis för att testkemikalien eller dessa metaboliter inte kommer att nå målvävnaden kan detta test vara olämpligt att använda.

Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.

TESTMETODENS PRINCIP

Försöksdjuren exponeras för testkemikalien på ett lämpligt sätt. Om benmärg används bör försöksdjuren avlivas humant vid en lämplig tidpunkt efter behandling, varvid benmärgen extraheras och beredningar görs och färgas (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Om perifert blod används samlas blodet upp vid lämpliga tidpunkter efter behandling och beredningar görs, vilka sedan färgas in (12) (16) (17) (18). När behandlingen ges akut är det viktigt att välja lämpliga tidpunkter för skörd av benmärg eller blod så att behandlingsrelaterad induktion av omogna erytrocyter kan detekteras. Vid provtagning av perifert blod måste tillräckligt lång tid ha gått för att dessa händelser ska vara synliga i det cirkulerande blodet. Beredningarna analyseras med avseende på närvaro av mikrokärnor, antingen genom visualisering med användning av mikroskop, bildanalys, flödescytometri eller laserskanningcytometri.

KVALIFIKATIONSPRÖVNING AV LABORATORIET

Kvalifikationsprövning

För att fastställa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det används för rutintestning bör laboratoriet visa sin förmåga att reproducera förväntade resultat från publicerade data (17) (19) (20) (21) (22) för frekvenser av mikrokärnor med minst två positiva kontrollkemikalier (inklusive svag respons som induceras av låga doser av positiva kontroller) enligt tabell 1 och med förenliga vehikel-/lösningsmedelskontroller (se punkt 26). I försöken bör man använda doser som ger reproducerbara och dosrelaterade ökningar och visar testsystemets sensitivitet och dynamiska omfång när det gäller den berörda vävnaden (benmärg eller perifert blod), med användning av den klassificeringsmetod som laboratoriet tillämpar. Detta gäller inte laboratorier som redan har erfarenhet, dvs. har en historisk databas enligt punkterna 14–18.

Historiska kontrolldata

Laboratoriet bör fastställa följande i kvalifikationsprövningen:

Ett historiskt positivt kontrollintervall och fördelning.

Ett historiskt negativt kontrollintervall och fördelning.

Om data för en historisk negativ kontrollfördelning samlas in först bör de parallella negativa kontrollerna överensstämma med publicerade kontrolldata om sådana finns. Allteftersom den historiska kontrollfördelningen kompletteras med fler försöksdata bör de parallella negativa kontrollerna i idealfallet ligga inom fördelningens kontrollgräns på 95 %. Laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas bör vara statistiskt robust för att säkerställa laboratoriets förmåga att bedöma fördelningen av negativa kontrolldata. Enligt litteraturen kan minst 10 försök behövas, men databasen bör helst bestå av minst 20 försök utförda under jämförbara försöksbetingelser. Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex. C-diagram eller X-stapeldiagram (23)), för att fastställa hur variabla deras data är och för att visa att metoden är ”under kontroll”. Fler rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska kontrolldatabaser (t.ex. kriterier för att innefatta och utesluta data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (24).

Om laboratoriet inte slutför ett tillräckligt antal försök för att fastställa en statistiskt robust negativ kontrollfördelning (se punkt 15) under kompetensundersökningarna (beskrivs i punkt 13) kan fördelningen byggas upp under de första rutintesterna. Denna strategi bör följa rekommendationerna i litteraturen (24) och de negativa kontrollresultat som erhållits i dessa experiment bör överensstämma med publicerade negativa kontrolldata.

Eventuella ändringar av försöksprotokollen bör övervägas för att se till att resulterande data fortfarande överensstämmer med laboratoriets befintliga historiska kontrolldatabas. Endast stora inkonsekvenser bör leda till upprättandet av en ny historisk kontrolldatabas om en fackgranskning fastslår att den skiljer sig från den föregående fördelningen (se punkt 15). Om en ny databas byggs upp kanske inte en fullständig negativ kontrolldatabas behövs för att utföra ett faktiskt test, under förutsättning att laboratoriet kan visa att dess parallella negativa kontrollvärden fortfarande överensstämmer med den tidigare databasen eller motsvarande publicerade data.

Negativa kontrolldata bör bestå av förekomsten av omogna erytrocyter med mikrokärnor hos varje djur. Parallella negativa kontroller bör helst ligga inom kontrollgränsen på 95 % för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas. Om parallella negativa kontrolldata faller utanför kontrollgränserna på 95 % kan de ändå ingå i den historiska kontrollfördelningen så länge de inte är extremt avvikande och det finns bevis för att testsystemet är under kontroll (se punkt 15) och att inga tekniska eller mänskliga fel begåtts.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Förberedelser

Val av djurart

Unga och friska vuxna exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Möss, råttor eller andra lämpliga däggdjursarter kan användas. När perifert blod används måste det fastställas att avlägsnandet av celler med mikrokärnor i mjälten från cirkulationen inte gör det svårare att detektera inducerade mikrokärnor i de arter som valts ut. Detta har tydligt visats hos perifert blod från möss och råttor (2). Om andra arter än råttor och möss används bör en vetenskaplig motivering lämnas i rapporten. Om andra arter än gnagare används bör mätningen av inducerade mikrokärnor integreras i ett annat lämpligt toxicitetstest.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

För gnagare bör temperaturen i försöksdjurens rum vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör helst vara 50–60 %, men minst 40 % och bör helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodring kan konventionellt laboratoriefoder användas med obegränsad tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna väg. Gnagare bör hållas i små grupper (högst fem per bur) av samma kön och behandlingsgrupp, om inget aggressivt beteende kan förväntas, företrädesvis i fasta golvburar med lämplig miljöberikning. Djuren får endast hållas individuellt om det är vetenskapligt motiverat.

Förberedelse av djuren

Normalt används friska unga vuxna djur (6–10 veckor gamla vid behandlingsstarten, även om något äldre djur också är godtagbara) som slumpvis väljs ut till kontroll- och behandlingsgrupperna. Djuren ska ha en unik identifiering som appliceras med en human och minimalt invasiv metod (t.ex. ringmärkning, taggar, mikrochip eller biometrisk identifiering, men inte öron- eller tassclips). De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar. Burarna bör placeras i sådan ordning att eventuella verkningar på grund av placeringen minimeras. Korskontaminering av den positiva kontrollen och testkemikalien bör undvikas. Vid undersökningens början bör viktskillnaderna mellan försöksdjuren vara minimal och inte överstiga ± 20 % av medelvikten för varje kön.

Beredning av doser

Fasta testkemikalier bör lösas upp i, eller blandas med, lämpliga lösningsmedel eller vehiklar eller blandas i foder eller dricksvatten innan dosen administreras till djuren. Testkemikalier i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före doseringen. Vid inhalationexponering kan testkemikalier administreras såsom gas, ånga eller en fast/flytande aerosol, beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper. Nygjorda beredningar av testkemikalien bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel och lämpliga lagringsförhållanden bör fastställas.

Testbetingelser

Lösningsmedel/vehikel

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används bör det finnas referensdata som visar att de är kompatibla. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar. Exempel på vanliga kompatibla lösningsmedel/vehiklar är vatten, fysiologisk saltlösning, metylcellulosalösning, karboximetylcellulosa natriumsaltlösning, olivolja och majsolja. I avsaknad av historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga effekter på mikrokärnor eller andra skadliga effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehikeln bör en preliminär undersökning utföras för att fastställa acceptansen för vehikelkontrollen.

Kontroller

Positiva kontroller

En grupp djur som behandlas med en positiv kontrollkemikalie bör normalt ingå i varje test. Denna regel kan frångås om testlaboratoriet har visat att det är kvalificerat att utföra testet och har fastställt ett historiskt positivt kontrollintervall. Om en parallell positiv kontrollgrupp inte ingår bör klassificeringskontroller (fixerade och ofläckade utstryksglas eller prover med cellsuspensioner, beroende på vad som är lämpligt för klassificeringsmetoden) inkluderas i varje försök. Detta kan åstadkommas genom att inbegripa lämpliga referensprover i klassificeringen av undersökningen som har erhållits och lagrats från ett separat positivt kontrollförsök som utförs med jämna mellanrum (.tex var 6:e till 18 månad), t.ex. under kvalifikationsprövning och vid behov med jämna mellanrum därefter.

Positiva kontrollkemikalier bör på ett tillförlitligt sätt ge en detekterbar ökning i frekvensen av mikrokärnor över den spontana nivån. Om klassificeringen görs manuellt med mikroskop bör positiva kontrolldoser väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos de kodade proverna för bedömaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testkemikalien och enligt ett annat behandlingsschema, och att provtagningen endast sker vid ett tillfälle. Dessutom kan användningen av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier övervägas i förekommande fall. Exempel på positiva kontrollkemikalier ges i tabell 1.

Tabell 1

Exempel på positiva kontrollkemikalier.

Kemikalier och CASRN

Etylmetansulfonat [CASRN 62-50-0]

Metylmetansulfonat [CASRN 66-27-3]

Etylnitrosourea [CASRN 759-73-9]

Mitomycin C [CASRN 50-07-7]

Cyklofosfamid (monohydrat) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Trietylenmelamin [CASRN 51-18-3]

Colchicin [CASRN 64-86-8] eller vinblastin [CASRN 865-21-4] – som aneugens

Negativa kontroller

Djur från den negativa kontrollgruppen bör inkluderas vid varje provtagningstillfälle och i övrigt hanteras på samma sätt som behandlingsgrupperna, med undantag för att de inte behandlas med testkemikalien. Om lösningsmedel/vehikel används för att tillföra testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras lösningsmedlet/vehikeln. Om testlaboratoriet påvisar konsekventa variationer mellan djur och frekvenser av celler med mikrokärnor genom historiska negativa kontrolldata vid varje provtagningstillfälle kan det dock vara tillräckligt med en enda provtagning för den negativa kontrollen. Om en enda provtagning används för negativa kontroller bör den vara det första provtagningstillfället i undersökningen.

Om perifert blod används är ett förbehandlat prov godtagbart i stället för en parallell negativ kontroll för kortvariga undersökningar om de resulterande uppgifterna överensstämmer med testlaboratoriets historiska kontrolldatabas. Det har visats att förbehandling av prov med små volymer (t.ex. under 100 μl/dag) hos råttor har en minimal inverkan på bakgrundsfrekvensen av mikrokärnor (25).

FÖRFARANDE

Djurens antal och kön

I regel är mikrokärnornas respons liknande mellan han- och hondjur och de flesta undersökningar kan därför utföras på endera könet (26). Om det finns data som visar på relevanta skillnader mellan hanar och honor (t.ex. skillnader i systemisk toxicitet, metabolism, biotillgänglighet, benmärgstoxicitet osv., inklusive ett preliminärt test) bör båda könen användas. I detta fall kan det vara lämpligt att göra en undersökning av båda könen, t.ex. som en del av en upprepad dostoxicitetsundersökning. Om båda könen används kan ett faktorförsök vara lämpligt. En närmare beskrivning av hur man analyserar data med användning av faktorförsök ges i tillägg 2.

Gruppernas storlek vid försöksstarten bör fastställas. Målet bör vara minst fem analyserbara djur av ett kön, eller av vardera könet om båda används, per grupp. I de fall där exponering av människa för kemikalier kan ge könsspecifika resultat, som t.ex. för vissa läkemedel, bör testet utföras med försöksdjur av lämpligt kön. Som en vägledning för ett vanligt krav på maximalt antal djur skulle det krävas 25–35 djur för en benmärgsundersökning som utförs enligt de parametrar som fastställs i punkt 37, med tre dosgrupper och parallella negativa och positiva kontrollgrupper (fem djur av ett kön i varje grupp)

Dosnivåer

Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvudundersökningen (27). Syftet med undersökningen bör vara att identifiera högsta tolererbara dos (MTD), som definieras som den dos som tolereras utan bevis för toxicitet som begränsar undersökningen i förhållande till dess varaktighet (t.ex. genom att inducera minskad kroppsvikt eller hematopoietisk systemcytotoxicitet, men inte dödlighet eller tecken på smärta, lidande eller ångest som kräver human avlivning (28)).

Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger upphov till toxicitet i benmärgen (t.ex. en reduktion av andelen omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter i benmärgen eller i perifert blod på mer än 50 % men inte mindre än 20 % av kontrollvärdet). Om man analyserar CD71-positiva celler i den perifera blodcirkulationen (dvs. genom flödescytometri) reagerar denna mycket unga fraktion av omogna erytrocyter dock mycket snabbare på toxiska utmaningar än större RNA-positiva kohorter av omogna erytrocyter. Därför kan en skenbart högre toxicitet framträda i utformningar med akut exponering som undersöker CD71-positiva fraktioner av omogna erytrocyter jämfört med undersökningar som identifierar omogna erytrocyter baserat på RNA-innehåll. Om försökens behandlingstider är fem dagar eller kortare kan därför den högsta dosnivån för testkemikalier som orsakar toxicitet definieras som den dos som ger en statistiskt signifikant minskning av andelen CD71-positiva omogna erytrocyter av det totala antalet erytrocyter, men inte mindre än 5 % av kontrollvärdet (29).

Kemikalier som uppvisar mättnad av toxikokinetiska egenskaper eller inducerar avgiftningsprocesser som kan leda till minskad exponering efter långtidstillförsel kan vara undantag från kriterierna för dosbestämning och bör utvärderas från fall till fall.

För att inhämta data om dosrespons bör en fullständig undersökning omfatta en negativ kontrollgrupp och minst tre dosnivåer som vanligen skiljer sig med en faktor 2, men inte högre än 4. Om testkemikalien inte orsakar toxicitet i en preliminär undersökning eller baserat på befintliga uppgifter är den högsta dosen 1 000 mg/kg/kroppsvikt/dag för administrationsperioder på 14 dagar eller 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag för administrationsperioder på mindre än 14 dagar. Om testkemikalien orsakar toxicitet bör MTD vara den högsta dosen och de dosnivåer som används bör helst omfatta ett intervall från maxdos till en dos som producerar liten eller ingen toxicitet. När toxicitet i målvävnaden (benmärg) observeras vid alla testade dosnivåer rekommenderas fortsatta undersökningar med icke-toxiska doser. Undersökningar som syftar till att mer grundligt karakterisera kvantitativ information om dosrespons kan kräva ytterligare dosgrupper. Dessa gränser kan variera för vissa typer av testkemikalier (t.ex. humanläkemedel) som omfattas av särskilda krav.

Toleranstest

Om försök för att fastställa dosering eller befintliga data från besläktade djurstammar tyder på att ett behandlingssystem med minst gränsdosen (beskrivs nedan) inte ger några observerbara toxiska effekter (ingen minskning av benmärgens proliferation eller andra bevis på cytotoxicitet i målvävnaden), och om ingen gentoxicitet förväntas baserat på in vitro-undersökningar av gentoxicitet eller data från strukturellt besläktade kemikalier, anses det kanske inte nödvändigt med ett fullständigt test med tre dosnivåer, under förutsättning att det har påvisats att testkemikalien når målvävnaden (benmärg). I sådana fall kan en enda dosnivå, vid gränsdosen, vara tillräcklig. För administrationsperioder på 14 dagar eller mer är gränsdosen 1 000 mg/kg/kroppsvikt/dag. För administrationsperioder på mindre än 14 dagar är gränsdosen 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag.

Tillförsel av doser

Den förväntade exponeringsvägen för människor bör beaktas vid utformningen av en analys. Därför kan exponeringsvägar (t.ex. föda, dricksvatten, lokalt subkutant, intravenöst, oralt (via sond), inhalation, intratrakealt eller implantation) väljas som motiverad exponering. Exponeringsvägen bör i alla händelser väljas för att säkerställa lämplig exponering av målvävnaden. Intraperitoneal injektion rekommenderas generellt inte eftersom den inte är en avsedd exponeringsväg för människor, och bör endast användas med specifik vetenskaplig motivering. Om testkemikalien blandas i födan eller dricksvattnet bör man, särskilt i fråga om engångsdosering, se till att fördröjningen mellan födo- och vattenintag och provtagning är tillräcklig för att upptäcka effekterna (se punkt 37). Den maximala vätskevolymen som kan administreras genom sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör normalt inte överstiga 1 ml per 100 g kroppsvikt, utom för vattenlösningar där högst 2 ml/100 g får användas. Användning av volymer som är större än den bör motiveras. Med undantag för irriterande eller frätande testkemikalier, som normalt kommer att ge stegrade verkningar vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa att en konstant volym ges i förhållande till kroppsvikten vid alla dosnivåer.

Behandlingsschema

Företrädesvis utförs två eller fler behandlingar som ges i 24-timmarsintervaller, särskilt om detta test integreras i andra toxicitetsundersökningar. Alternativt kan enstaka behandlingar ges om det är vetenskapligt motiverat (om det t.ex. är känt att testkemikalien blockerar cellcykeln). Testkemikalierna kan också ges som en enstaka behandling, men kan även ges som en delad dos (dvs två eller flera behandlingar samma dag med högst 2–3 timmars mellanrum) för att underlätta tillförsel av stora volymer. Under dessa omständigheter eller när tillförseln av testkemikalien sker via inhalation bör provtagningstiden planeras baserat på tidpunkten för den sista doseringen eller när exponeringen upphör.

Testet kan utföras på möss eller råttor på ett av följande tre sätt:

a.

Djuren behandlas med testkemikalien en gång. Prover på benmärg tas ut minst två gånger (från oberoende djurgrupper) med början tidigast 24 timmar men senast 48 timmar efter behandling och med passande intervall mellan proven, om inte testkemikalien är känd för att ha en exceptionellt lång halveringstid. Om prover tas tidigare än 24 timmar efter behandling bör detta motiveras. Prover på perifert blod tas ut minst två gånger (från samma grupp av djur), med början tidigast 36 timmar efter behandling, och med passande intervall efter det första provet, men inte senare än efter 72 timmar. Vid det första provtagningstillfället bör alla dosgrupper behandlas och prover samlas in för analys. Vid senare provtagningstillfälle(n) behöver endast den högsta dosen ges. När ett positivt svar identifieras vid ett provtagningstillfälle är ytterligare provtagning inte nödvändig om inte kvantitativ dos-responsinformation behövs. De beskrivna skördetidpunkterna är följden av kinetiken, dvs. hur mikrokärnorna framträder och försvinner i de två vävnadsdelarna.

b.

Om två dagliga behandlingar utförs (t.ex. två behandlingar med 24 timmars intervall), bör prover tas ut en gång mellan 18 och 24 timmar efter den slutliga behandlingen av benmärgen eller en gång mellan 36 och 48 timmar efter den slutliga behandlingen av det perifera blodet (30). De beskrivna skördetidpunkterna är följden av kinetiken, dvs. hur mikrokärnorna framträder och försvinner i de två vävnadsdelarna.

c.

Om tre eller fler dagliga behandlingar utförs (t.ex. tre eller flera behandlingar med cirka 24 timmars intervall) bör benmärgsprov samlas in senast 24 timmar efter den sista behandlingen och perifert blod samlas in senast 40 timmar efter den sista behandlingen (31). Detta behandlingsalternativ utgör en kombination av Comet Assay (t.ex. provtagning 2–6 timmar efter den sista behandlingen) och mikrokärntestet, vilket integreras i toxicitetsundersökningar med upprepade doser. Befintliga uppgifter tyder på att induktion av mikrokärnor kan observeras under dessa längre tidsramar när testkemikalien har tillförts tre eller fler gånger (15).

Andra doserings- eller provtagningssystem kan användas när det är relevant, vetenskapligt motiverat och underlättar integration med andra toxicitetstester.

Observationer

Allmänna kliniska observationer av testdjuren bör göras och kliniska tecken registreras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen. Djuren bör observeras minst två gånger dagligen under doseringsperioden beträffande morbiditet och mortalitet. Alla djur bör vägas när undersökningen inleds, åtminstone en gång i veckan under undersökningar med upprepad dosering och vid avlivning. För undersökningar som varar minst en vecka bör mätning av foderkonsumtion göras minst en gång i veckan. Om testkemikalien tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas vid varje byte av vatten och minst en gång i veckan. Djur som uppvisar icke-dödliga indikatorer på överskottstoxicitet bör avlivas på ett humant sätt innan testperiodens slut (28). Under vissa omständigheter kan djurens kroppstemperatur övervakas, eftersom det är känt att hyper- och hypotermi till följd av behandling ger felaktiga resultat (32) (33) (34).

Exponering av målvävnaden

Blodprov tas vid lämpliga tidpunkter för att möjliggöra undersökningar av testkemikaliens plasmanivåer. Syftet med detta är att visa att benmärgen har exponerats om så krävs och om det inte finns andra exponeringsdata (se punkt 48).

Preparation av benmärg/blod

Benmärgsceller erhålls vanligen från lårbenet eller skenbenet omedelbart efter det att djuret avlivats på ett humant sätt. Normalt avlägsnas cellerna, prepareras och färgas in med hjälp av etablerade metoder. Små volymer av perifert blod kan erhållas enligt lämpliga djurskyddsnormer, antingen med hjälp av en metod där testdjuret överlever, t.ex. blödning från svansådern eller något annat lämpligt blodkärl, eller genom hjärtpunktering eller provtagning från ett stort blodkärl vid avlivning. Både för erytrocyter från benmärg och perifert blod, beroende på analysmetod, kan cellerna färgas in omedelbart supravitalt (16) (17) (18). Utstrykspreparat görs och färgas sedan in för mikroskopundersökning eller fixeras och färgas på lämpligt sätt för analys med flödescytometri. Användningen av ett DNA-specifikt färgämne (t.ex. akridinorange (35) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (36)) kan eliminera några av de artefakter som ar associerade med användning av ett färgämne som inte är DNA-specifikt. Denna fördel utesluter inte användningen av konventionella färgämnen (t.ex. Giemsa för mikroskopanalys). Ytterligare system (t.ex. cellulosakolonner för att avlägsna celler med kärnor (37) (38) kan även användas, förutsatt att dessa system har visat sig vara förenliga med beredningen av prov i laboratoriet.

Om sådana metoder är tillämpliga kan system med anti-kinetokor-antikroppar (39), FISH-teknik med pancentromera DNA-prober (40) eller primad in situ-märkning med pancentromerspecifik primer, tillsammans med lämplig DNA-motfärgning (41), användas för att identifiera mikrokärnans karaktär (kromosom/kromosomfragment) för att fastställa om induktionen av mikrokärnor beror på klastogen och/eller aneugen aktivitet. Andra metoder för differentiering mellan klastogener och aneugener kan användas om de har visat sig vara effektiva.

Analys (manuell och automatisk)

Alla utstryksglas eller analysprover, inklusive glasen från de positiva och negativa kontrollerna, bör ges en oberoende kodning före analysen och bör randomiseras så att den manuella bedömaren inte känner till behandlingsbetingelserna. Kodning är inte nödvändig vid användning av automatiska klassificeringssystem som inte bygger på visuell kontroll och inte kan påverkas av bedömarens förutfattade mening. Andelen omogna erytrocyter bland det totala antalet erytrocyter (omogna + mogna) bestäms för varje djur genom att totalt räkna minst 500 erytrocyter för benmärg och 2 000 erytrocyter för perifert blod (42). Minst 4 000 omogna erytrocyter per djur bör undersökas med avseende på förekomst av omogna erytrocyter med mikrokärnor (43). Om den historiska databasen över negativa kontroller visar att bakgrundsmedelvärdet för frekvensen för omogna erytrocyter i mikrokärnor är < 0,1 % på testlaboratoriet bör man överväga att klassificera ytterligare celler. När proverna analyseras bör andelen omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter hos de behandlade djuren inte vara mindre än 20 % av andelen vehikel-/lösningskontroll vid klassificering med mikroskop, och inte mindre än cirka 5 % av andelen vehikel-/lösningskontroll när CD71 + omogna erytrocyter klassificeras med cytometriska metoder (se punkt 31) (29). Exempel: I ett försök med benmärg som klassificeras med mikroskop där kontrollandelen omogna erytrocyter i benmärgen uppgår till 50 % skulle den övre toxicitetsgränsen vara 10 % omogna erytrocyter.

Råttans mjälte isolerar och förstör erytrocyter med mikrokärnor. För att upprätthålla en hög sensitivitet vid analyser av perifert blod från råttor bör analysen av omogna erytrocyter med mikrokärnor därför begränsas till den yngsta fraktionen. Vid användning av automatiska analysmetoder kan de mest omogna erytrocyterna identifieras via deras höga RNA-halt eller den höga nivån av transferrinreceptorer (CD71+), uttryckt på deras yta (31). En direkt jämförelse av olika färgningsmetoder har dock visat att tillfredsställande resultat kan erhållas med olika metoder, inklusive konventionell färgning med akridinorange (3) (4).

DATA OCH RAPPORTERING

Behandling av resultaten

Individuella djurdata bör presenteras i tabellform. Antalet omogna erytrocyter som påträffas, antalet omogna erytrocyter med mikrokärnor, och andelen omogna bland det totala antalet erytrocyter bör listas separat för varje djur som analyseras. Om möss behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller mer bör även uppgifter om antal och andel mogna erytrocyter med mikrokärnor anges om sådana uppgifter samlas in. Uppgifter om toxicitet för djur och kliniska tecken bör också rapporteras.

Kriterier för godkännande

Följande kriterier avgör om testet är godtagbart:

a.

Parallella negativa kontrolldata anses godtagbara för registrering i laboratoriets historiska databas (se punkterna 15–18).

b.

Parallella positiva kontroller eller klassificeringskontroller bör framkalla reaktioner som överensstämmer med de kontroller som genereras i den historiska databasen över positiva kontroller och ge en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen (se punkterna 24–25).

c.

Ett lämpligt antal doser och celler har analyserats.

d.

Urvalskriterierna för högsta dos överensstämmer med de kriterier som beskrivs i punkterna 30–33.

Utvärdering och tolkning av resultaten

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart positiv om följande gäller:

a.

Åtminstone en av behandlingsgrupperna uppvisar en statistiskt signifikant ökning av frekvensen av omogna erytrocyter med mikrokärnor jämfört med den parallella negativa kontrollen.

b.

Ökningen är dosrelaterad vid minst ett provtagningstillfälle när den utvärderas med ett lämpligt trendtest.

c.

Något av resultaten ligger utanför fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser.

Om endast den högsta dosen undersöks vid ett visst provtagningstillfälle anses en testkemikalie vara klart positiv om det finns en statistiskt säkerställd ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen och resultaten ligger utanför fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser). Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns i litteraturen (44) (45) (46) (47). Om en dos-responsanalys genomförs bör minst tre behandlade dosgrupper analyseras. Statistiska tester som används bör betrakta djuret som den experimentella enheten. Positiva resultat i testet av mikrokärnor tyder på att testkemikalien inducerar mikrokärnor som är ett resultat av en kromosomskada eller skada på den mitotiska apparaten i erytroblasterna hos den art som testas. Om ett test utfördes för att detektera centromerer i mikrokärnorna är en testkemikalie som producerar mikrokärnor med centromerer (centromerisk DNA eller kinetokor, som visar på fullständig kromosomförlust) bevis på att testkemikalien är en aneugen.

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart negativ om följande gäller för samtliga undersökta försöksbetingelser:

a.

Ingen av behandlingsgrupperna uppvisar en statistiskt signifikant ökning av frekvensen av omogna erytrocyter med mikrokärnor jämfört med den parallella negativa kontrollen.

b.

Ingen dosrelaterad ökning förekommer vid något provtagningstillfälle vid utvärdering med ett lämpligt trendtest.

c.

Alla resultat ligger inom fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser.

d.

Benmärgen exponerades för testkemikalien.

Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns i litteraturen (44) (45) (46) (47). Bevis för att benmärgen exponerats för en testkemikalie kan vara en minskning av förhållandet mellan omogna och mogna erytrocyter eller mätningar av plasma- och blodnivåerna i förhållande till testkemikalien. Vid intravenös tillförsel behövs inga bevis på exponering. Alternativt kan ADME-data, som erhållits i en oberoende undersökning med samma exponeringsväg och samma arter, användas för att visa benmärgsexponering. Negativa resultat indikerar att testkemikalien, under dessa försöksbetingelser, inte ger upphov till mikrokärnor i de omogna erytrocyterna hos den art som testas.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller negativt svar.

Om responsen varken är klart negativ eller klart positiv och för att göra det lättare att fastställa resultatets biologiska relevans (t.ex. en svag ökning eller en ökning som ligger på gränsen) bör de försök som slutförts fackgranskas och/eller undersökas ytterligare. I vissa fall kan analys av fler celler eller ett upprepat försök med modifierade försöksbetingelser vara användbart.

I sällsynta fall är det inte möjligt att dra en slutsats om huruvida testkemikalien ger positiva eller negativa resultat trots ytterligare undersökningar, och i dessa fall anses undersökningen vara tvetydig.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande information:

 

Sammanfattning

 

Testkemikalie:

Källa, partinummer, sista förbrukningsdag om detta anges.

Testkemikaliens stabilitet, om den är känd.

 

Monokomponentämne:

Fysiskt utseende, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

Kemiska beteckningar, såsom IUPAC- eller CAS-beteckning, CAS--nummer, SMILES- eller InChI-kod, strukturell formel, renhet, kemisk beteckning på föroreningar i förekommande fall och om möjligt osv.

 

Multikomponentämne, UVCB och blandningar:

Karakteriseras så långt som möjligt genom kemisk beteckning (se ovan), kvantitativ förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper hos beståndsdelarna.

 

Beredning av testkemikalien:

motivering för val av vehikel,

löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt,

beredning av foder-, dricksvatten- eller inandningsberedningar,

analytiska bestämningar av beredningar (t.ex. stabilitet, homogenitet, nominella koncentrationer) om sådana görs,

 

Försöksdjur:

Art/stam som används och motivering av valet.

Djurens antal, ålder och kön.

Ursprung, inhysning, foder osv.

Metod för unik identifiering av djuren.

För korttidsundersökningar: individuell vikt hos försöksdjuren vid testets början och slut, för undersökningar som pågår längre än en vecka: individuella kroppsvikter under undersökningen samt foderkonsumtion, kroppsviktsintervall samt medelvärde och standardavvikelse för varje grupp bör inkluderas.

 

Testbetingelser:

Positiva och negativa kontrolldata (vehikel/lösningsmedel).

Data från en preliminär undersökning, om en sådan har utförts.

Grund för valet av dosnivå.

Uppgifter om beredning av testkemikalien.

Uppgifter om administreringen av testkemikalien.

Grund för administreringsväg och varaktighet.

Metoder för att verifiera att testkemikalien nådde det stora kretsloppet eller målvävnaden.

Faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag) som beräknats genom dietens/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (ppm) och konsumtion, i tillämpliga fall.

Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.

Metod för avlivning.

Smärtlindringsmetod (i förekommande fall).

Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman samt motivering av valen.

Metoder för preparation av utstryksglas.

Förfaranden för att isolera och bevara prover.

Metoder för mätningar av toxicitet.

Kriterier för bestämning av omogna erytrocyter med mikrokärnor.

Antal analyserade celler per djur för bestämning av frekvensen av omogna erytrocyter i mikrokärnor samt andelen omogna erytrocyter jämfört med andelen mogna erytrocyter.

Acceptanskriterier för undersökningen.

Metoder, såsom användning av anti-kinetokor-antikroppar eller centromerspecifika DNA-prober, för att fastställa om mikrokärnorna innehåller hela eller fragmenterade kromosomer, om tillämpligt.

 

Resultat:

Djurens skick före och under hela testperioden, inklusive tecken på toxicitet.

Andelen omogna erytrocyter av det totala antalet erytrocyter.

Antalet omogna erytrocyter med mikrokärnor, angett separat för varje djur.

Medelvärde ± standardavvikelse för omogna erytrocyter med mikrokärnor per grupp.

Dos/respons-förhållandet, där detta är möjligt.

De statistiska analyser och metoder som användes.

Parallella negativa och positiva kontrolldata, med omfattning, medelvärden och standardavvikelser.

Historiska negativa och positiva kontrolldata med intervall, medelvärden, standardavvikelser och 95 % kontrollgränser för distribution, den tidsperiod som omfattas och antalet datapunkter.

Uppgifter som styrker att exponering av benmärgen inträffade.

Karakteriseringsdata som visar om mikrokärnorna innehåller hela eller fragmenterade kromosomer, i förekommande fall.

Kriterier som uppfyllts för positiv eller negativ respons.

 

Diskussion av resultaten.

 

Slutsatser

 

Litteraturhänvisningar

LITTERATURHÄNVISNINGAR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Hayashi, M. m.fl. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 627/1, s. 10–30.

(3)

MacGregor, J.T. m.fl. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, vol. 94/1, s. 92–107.

(4)

Dertinger, S.D. m.fl. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, vol. 94/1, s. 83–91.

(5)

Dertinger, S.D. m.fl. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, vol. 26/1, s. 139–145.

(6)

Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, vol. 370/1, s. 65–73.

(7)

Asano, N. m.fl. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 404/1-2, s. 149–154.

(8)

Styles, J.A. m.fl. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, vol. 44/2, s. 153–155.

(9)

Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 18/2, s. 187–190.

(10)

Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, vol. 31/1, s. 9–15.

(11)

Heddle, J.A. m.fl. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, vol. 123/1, s. 61–118.

(12)

Mavournin, K.H. m.fl. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, vol. 239/1, s. 29–80.

(13)

MacGregor, J.T. m.fl. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, vol. 11, s. 555–558.

(14)

MacGregor, J.T. m.fl. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, vol. 189/2, s. 103–112.

(15)

MacGregor, J.T. m.fl. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, vol. 14/3, s. 513–522.

(16)

Hayashi, M. m.fl. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, vol. 245/4, s. 245–249.

(17)

CSGMT/JEMS.MMS – The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, vol. 278/2-3, s. 83–98.

(18)

CSGMT/JEMS.MMS – The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, vol. 10/3, s. 153–159.

(19)

Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 23/4, s. 239–273.

(20)

Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 453/1, s. 45–50.

(21)

Hayes, J. m.fl. (2009), The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power, Mutagenesis, vol. 24/5, s. 419–424.

(22)

Wakata, A. m.fl. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 32/1, s. 84–100.

(23)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(24)

Hayashi, M. m.fl. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 723/2, s. 87–90.

(25)

Rothfuss, A. m.fl. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 723/2, s. 108–120.

(26)

Hayashi, M. m.fl. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, vol. 312/3, s. 293–304.

(27)

Fielder, R.J. m.fl. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, vol. 7/5, s. 313–319.

(28)

OECD (2000), ”Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.

(29)

LeBaron, M.J. m.fl. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 54/3, s. 222–228.

(30)

Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/– 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, vol. 10/4, s. 313–319.

(31)

Hayashi, M. m.fl. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 35/3, s. 234–252.

(32)

Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 390/1-2, s. 79–83.

(33)

Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 413/1, s. 7–14.

(34)

Spencer, P.J. m.fl. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, vol. 97/1, s. 120–127.

(35)

Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, vol. 120/4, s. 241–247.

(36)

MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, vol. 120/4, s. 269–275.

(37)

Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, vol. 213/1, s. 91–104.

(38)

Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, vol. 439/1, s. 121–126.

(39)

Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, vol. 5/4, s. 411–415.

(40)

Miller, B.M. m.fl. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, vol. 6/4, s. 297–302.

(41)

Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, vol. 107/2, s. 99–104.

(42)

Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, vol. 347/2, s. 97–99.

(43)

OECD (2014), ”Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(44)

Richold, M. m.fl. (1990), ”In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115–141.

(45)

Lovell, D.P. m.fl. (1989), ”Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184–232.

(46)

Hayashi, M. m.fl. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, vol. 102/Suppl 1, s. 49–52.

(47)

Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, vol. 469/2, s. 233–241.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Centromer : region(er) på en kromosom där kärnspolefibrer är fästa under celldelning, vilket möjliggör en ordnad rörelse av dotterkromosomerna mot dottercellernas poler.

Kemikalie : ett ämne eller en blandning.

Erytroblast : ett tidigt stadium i erytrocytens utveckling, omedelbart före det att den omogna erytrocyten bildas, där cellen fortfarande har en kärna.

Kinetokor : en proteinstruktur som bildas vid centromeren hos eukaryota celler vilken binder kromosomen till kärnspolens mikrotubuli under mitos och meios och som drar isär systerkromatiderna under celldelningen.

Mikrokärnor : små extra kärnor som är separata från cellernas huvudkärna, och som produceras under mitosens telofas (meios) från isolerade kromosomfragment eller hela kromosomer.

Normokromatisk eller mogen erytrocyt : fullt mogna erytrocyter som har förlorat det rest-RNA som kvarstår efter kärnbildningen och/eller har förlorat andra kortlivade cellmarkörer som vanligen försvinner efter kärnbildningen efter den slutliga delningen av erytroblasterna.

Polykromatisk eller omogen erytrocyt : nybildad erytrocyt i ett mellansteg i utvecklingen, som färgas med både de blå och röda komponenterna i klassisk blodinfärgning såsom Wrights Giemsa på grund av förekomsten av rest-RNA i den nybildade cellen. Sådana nybildade celler motsvarar ungefär retikulocyter, vilka visualiseras med hjälp av vitalfärgning som får rest-RNA att klumpas ihop till ett retikel. Nu för tiden används ofta andra metoder, bland annat monokromatisk färgning av RNA med fluorescerande färger eller märkning av kortlivade ytmarkörer som CD71 med fluorescerande antikroppar, för att identifiera nybildade röda blodceller. Polykromatiska erytrocyter, retikulocyter och CD71-positiva erytrocyter är alla omogna erytrocyter, men har en något annorlunda åldersfördelning.

Retikulocyt : nybildad erytrocyt som färgats med vitalfärgning som får rest-RNA i cellen att klumpa ihop sig till ett karakteristiskt retikel. Retikulocyter och polykromatiska erytrocyter har en liknande cellulär åldersfördelning.

Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Tillägg 2

UTFORMNING AV FAKTORFÖRSÖK FÖR IDENTIFIERING AV SKILLNADER MELLAN KÖNEN I IN VIVO-TEST MED AVSEENDE PÅ MIKROKÄRNOR

Utformning och analys av faktorförsök

I denna utformning testas minst fem hanar och fem honor vid varje koncentrationsnivå, vilket innebär att minst 40 djur måste användas (20 hanar och 20 honor plus relevanta positiva kontroller).

Detta är ett av de enklaste faktorförsöken och det motsvarar en tvåvägs-variansanalys med kön och koncentrationsnivå som huvudsakliga effekter. Data kan analyseras med hjälp av många vanliga statistiska programvarupaket såsom SPSS, SAS, STATA, Genstat samt med hjälp av R.

Analysen delar upp variationen i datauppsättningen mellan kön, koncentrationer och interaktionen mellan kön och koncentrationer. Var och en av termerna testas mot en uppskattning av variationerna mellan replikatdjuren inom djurgrupper av samma kön som ges samma koncentration. Fullständig information om den underliggande metoden finns i många statistiska läroböcker (se litteraturhänvisningar) och i hjälpavsnitt i statistiska paket.

Nästa steg i analysen är att kontrollera interaktionstermen ”kön x koncentration” i ANOVA tabellen (6). I avsaknad av en signifikant interaktionsterm ger de kombinerade värdena mellan könen eller koncentrationsnivåerna giltiga statistiska test mellan nivåerna, baserat på den sammanslagna inomgruppsvariationen enligt ANOVA.

Nästa steg i analysen är att dela upp uppskattningen av variationen mellan koncentrationerna i kontraster, som möjliggör ett test avseende linjära och kvadratiska kontraster i responsen mellan koncentrationsnivåerna. Om en signifikant variation i kön x koncentration förekommer kan även denna term delas upp i interaktionskontraster enligt följande: linjära kontraster x kön och kvadratiska kontraster x kön. Med hjälp av dessa termer kan man testa om koncentrationsresponsen är parallell för de två könen eller om den skiljer sig åt.

Uppskattningen av den sammanslagna inomgruppsvariationen kan användas för parvisa test av skillnaderna mellan medelvärdena. Dessa jämförelser kan göras mellan medelvärdena för könen och medelvärdena för de olika koncentrationsnivåerna, t.ex. för jämförelser med de negativa kontrollnivåerna. Om det finns en signifikant interaktion kan man jämföra medelvärden för olika koncentrationer för samma kön eller medelvärden för båda könen vid samma koncentration.

Litteraturhänvisningar

Teori, utformning, metod, analys och tolkning av faktorförsök diskuteras i många statistiska läroböcker, från den enklaste tvåfaktorsanalysen till mer komplexa former som används i försöksutformningsmetoder (”Design of Experiment”). Följande förteckning är icke-uttömmande: Vissa böcker innehåller etablerade exempel på jämförbara utformningar, i vissa fall med koder för att köra analysen med hjälp av olika programvarupaket.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. och Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

 

Box, G.E.P. och Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J och Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc

(6)

I del B ska kapitel B.15 utgå.

(7)

I del B ska kapitel B.16 utgå.

(8)

I del B ska kapitel B.18 utgå.

(9)

I del B ska kapitel B.19 utgå.

(10)

I del B ska kapitel B.20 utgå.

(11)

I del B ska kapitel B.24 utgå.

(12)

I del B ska kapitel B.47 ersättas med följande:

”B.47   Testmetoden BCOP (Bovine Corneal Opacity and Permeability) för identifiering av i) kemikalier som orsakar allvarlig ögonskada och ii) kemikalier för vilka det inte krävs klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada

INLEDNING

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 437 (2013). BCOP-testmetoden utvärderades 2006 och 2010 (1)(2) av amerikanska ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) tillsammans med Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM) och det japanska centret för validering av alternativa metoder (JaCVAM). I den första utvärderingen undersökte man om BCOP-testmetoden var användbar för att identifiera kemikalier (ämnen och blandningar) som framkallar allvarliga ögonskador (1). I den andra utvärderingen undersökte man om BCOP-testmetoden var användbar för att identifiera kemikalier (ämnen och blandningar) som inte är klassificerade för ögonirritation eller allvarliga ögonskador (2). BCOP-valideringsdatabasen innehöll totalt 113 ämnen och 100 blandningar (2) (3). Av dessa utvärderingar och granskningarna av dessa drog man slutsatsen att testmetoden korrekt kan identifiera kemikalier (både ämnen och blandningar) som inducerar allvarlig ögonskada (kategori 1) samt kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt FN:s globala harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (4) och förordning (EG) nr 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) (7). Metoden ansågs därför vara vetenskapligt giltig för båda ändamålen. Med allvarlig ögonskada avses vävnadsskada i ögat eller allvarlig synnedsättning som uppstår efter applicering av ett en testkemikalie på ögats främre yta och som inte är fullt reversibel inom 21 dagar från appliceringen. Testkemikalier som inducerar allvarliga ögonskador klassificeras som GHS-kategori 1 enligt FN:s system. Kemikalier som inte klassificerats för ögonirritation eller allvarliga ögonskador definieras som kemikalier som inte uppfyller kraven för att klassificeras som GHS-kategori 1 eller 2 (2A eller 2B), dvs. klassificeringen GHS Ingen klassificering. Denna testmetod beskriver rekommenderad användning av och begränsningar hos BCOP-testmetoden baserat på utvärderingarna. De största skillnaderna mellan den ursprungliga versionen från 2009 och den uppdaterade versionen från 2013 av OECD-testriktlinje avser, men är inte begränsade till, användning av BCOP-testmetoden för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering enligt GHS (punkterna 2 och 7), förtydliganden av tillämpningen av BCOP-testmetoden för testning av alkoholer, ketoner och fasta ämnen (punkterna 6 och 7) och av ämnen och blandningar (punkt 8), förtydliganden av hur ytaktiva ämnen och blandningar som innehåller ytaktiva ämnen bör testas (punkt 28), uppdateringar och förtydliganden av positiva kontroller (punkterna 39 och 40), uppdatering av beslutskriterierna för BCOP-testmetoden (punkt 47), en uppdatering av acceptanskriterier för undersökningar (punkt 48), en uppdatering av de uppgifter som ska ingå i provningsrapporten (punkt 49), en uppdatering av definitionerna i bilaga 1, en ny bilaga 2 om BCOP-testmetodens prediktionsförmåga enligt olika klassificeringssystem, en uppdatering av förteckningen över kemikalier för kvalitetstest samt en uppdatering av tillägg 4 om BCOP-hornhinnehållaren (punkt 1) och opacitetsmätaren (punkterna 2 och 3).

Det är allmänt vedertaget att inget ögonirritationstest in vitro inom överskådlig framtid kommer att kunna ersätta Draizes ögontext in vivo för att förutsäga alla typer av ögonirritation för olika kemiska klasser. Strategiska kombinationer av flera alternativa testmetoder inom ramen för en (differentierad) teststrategi kan dock ersätta Draizes ögontest (5). Uppifrån och ned-strategin (5) är utformad för att användas när en kemikalie förväntas vara mycket irriterande baserat på befintlig information, medan botten-upp-strategin (5) å sin sida är utformad för att användas när en kemikalie inte förväntas orsaka tillräcklig ögonirritation för att kräva en klassificering baserat på befintlig information. BCOP-testmetoden är en testmetod in vitro som kan användas under vissa omständigheter och med särskilda begränsningar för klassificering och märkning av kemikalier som är farliga för ögonen. BCOP-testmetoden anses i sig inte vara en giltig ersättning för test på kaninögon in vivo, men rekommenderas som ett första steg i en teststrategi såsom den uppifrån och ned-strategi som föreslagits av Scott m.fl. (5) För att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada, dvs. kemikalier som klassificeras som GHS-kategori 1, utan ytterligare testning (4). BCOP-testmetoden rekommenderas också för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt definitionen i GHS (GHS Ingen klassificering) (4) inom ramen för en teststrategi som botten-upp-strategin (5). Kemikalier som inte förutsägs orsaka allvarlig ögonskada eller inte klassificeras för ögonirritation/allvarlig ögonskada enligt BCOP-testmetoden kräver dock ytterligare testning (in vitro och/eller in vivo) för att fastställa en definitiv klassificering.

Syftet med denna testmetod är att beskriva de förfaranden som används för att utvärdera om kemikalien kan vara skadlig för ögonen, mätt som kemikaliens förmåga att framkalla opacitet och öka permeabiliteten i en isolerad hornhinna från nötkreatur. De toxiska effekterna på hornhinnan mäts med hjälp av i) minskad ljustransmission (opacitet) och ii) ökad passage av natriumfluorescein (permeabilitet). Bedömningen av hornhinnans opacitet och permeabilitet efter exponeringen för testkemikalien kombineras till ett IVIS-värde (In Vitro Irritancy Score), som används för att klassificera testkemikaliens förmåga att framkalla irritation.

Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

Testmetoden baserar sig på BCOP-testmetodsprotokollet från amerikanska ICCVAM (6) (7), som i sin tur ursprungligen utvecklades på grundval av information från IIVS:s protokoll (Institute for In Vitro Sciences) och INVITTOX-protokollet 124 (8), som representerar det protokoll som användes för den förvalideringsstudie av BCOP-test som genomfördes 1997–1998 och sponsrades av Europeiska gemenskapen. Båda dessa protokoll baserades på den BCOP-testmetod som först rapporterades av Gautheron m.fl. (9).

BCOP-testmetoden kan användas för att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada enligt GHS, dvs. kemikalier som klassificeras som GHS-kategori 4 (4). När BCOP-testmetoden används för detta syfte har den en övergripande noggrannhet på 79 % (150/191), ett falskt positivt värde på 25 % (32/126) och ett falskt negativt värde på 14 % (9/65) jämfört med in vivo-testning på kaninögon enligt klassificeringssystemet GHS (3) (se tillägg 2, tabell 1). När testkemikalier inom en viss kemikalie (dvs. alkoholer, ketoner) eller fysiska (dvs. fasta) klasser undantas från databasen har BCOP-testmetoden en övergripande noggrannhet på 85 % (111/131), ett falskt positivt värde på 20 % (16/81) och ett falskt negativt värde på 8 % (4/50) enligt klassificeringssystemet GHS (3). BCOP-testmetodens begränsningar när den används för att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1) baserar sig på höga falska positiva värden för alkoholer och ketoner och höga falska negativa värden för fasta ämnen som observerats i valideringsdatabasen (1)(2)(3). Alla alkoholer och ketoner överskattas dock inte av BCOP-testmetoden och vissa klassificeras korrekt som GHS-kategori 1, vilket innebär att dessa två organiska funktionella grupper inte anses gå utöver testmetodens tillämpningsområde. Det är upp till användaren av testmetoden att avgöra om en eventuell överprediktion av en alkohol eller en keton kan godtas eller om ytterligare testning krävs enligt en weight-of-the-evidence-metod. När det gäller falska negativa värden för fasta ämnen bör det noteras att fasta ämnen kan leda till varierande och extrema exponeringsförhållanden i Draizes ögonirritationstest in vivo, vilket i sin tur kan leda till irrelevanta förutsägelser om ämnets verkliga irritationspotential (10). När det gäller identifiering av kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1) bör det också noteras att inget av de falska negativa värden som identifieras i ICCVAM-validationsdatabasen (2)(3) ledde till IVIS ≤ 3, vilket är det kriterium som används för att identifiera en testkemikalie i GHS-kategorin Ingen klassificering. Falska negativa värden är inte kritiska i detta sammanhang, eftersom alla testkemikalier som ger ett värde på 3 < IVIS ≤ 55 därefter testas med andra lämpligt validerade in vitro-test och som ett sista alternativ på kaniner, beroende på kraven i tillämpliga bestämmelser, med tillämpning av en strategi med stegvis testning enligt principen om sammanvägd bedömning Med tanke på att vissa fasta kemikalier korrekt klassificeras som GHS-kategori 1 enligt BCOP-testmetoden anses inte heller detta fysiska tillstånd gå utöver testmetodens tillämpningsområde. Forskare kan överväga att använda denna testmetod för alla kemikalier. I ett sådant fall bör IVIS > 55 godtas som en indikation på en respons som inducerar allvarlig ögonskada och kemikalien bör klassificeras som GHS-kategori 1 utan ytterligare testning. Som redan nämnts bör positiva resultat från test med alkoholer eller ketoner dock tolkas försiktigt på grund av risken för överprediktion.

BCOP-testmetoden kan också användas för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt GHS-klassificeringssystemet (4). När BCOP-testmetoden används för detta syfte har den en övergripande noggrannhet på 69 % (135/196), ett falskt positivt värde på 69 % (61/89) och ett falskt negativt värde på 0 % (0/107) jämfört med in vivo-testning på kaninögon enligt klassificeringssystemet GHS (3) (se tillägg 2, tabell 2). Det falska positiva värde som erhålls (in vivo, kemikalier som klassificeras som GHS Ingen klassificering och som ger värdet IVIS > 3, se punkt 47) är högt, men inte kritiskt i detta sammanhang, eftersom alla testkemikalier som ger ett värde på 3 < IVIS ≤ 55 testas vidare med andra lämpligt validerade in vitro-test, eller som ett sista alternativ på kaniner beroende på lagstadgade krav, med användning av en stegvis teststrategi enligt en weight-of-evidence-metod. BCOP-testmetoden visar inga specifika brister när det gäller testning av alkoholer, ketoner och fasta ämnen när syftet är att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada (GHS Ingen klassificering) (3). Forskarna bör överväga att använda denna testmetod för alla typer av kemikalier. Ett negativt resultat (IVIS ≤ 3) bör godtas som en indikation på att ingen klassificering krävs (GHS Ingen klassificering). Eftersom endast 31 % av de kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada kan identifieras med hjälp av BCOP-testmetoden, bör denna testmetod inte vara förstahandsvalet för en botten-upp-strategi (5), om andra validerade och godkända in vitro-metoder med liknande hög sensitivitet men högre specificitet finns tillgängliga.

BCOP-valideringsdatabasen innehöll totalt 113 ämnen och 100 blandningar (2) (3). BCOP-testmetoden anses därför vara tillämplig på testning av både ämnen och blandningar.

BCOP-testmetoden rekommenderas inte för identifiering av testkemikalier som bör klassificeras som irriterande för ögonen (GHS-kategori 2 eller 2A) eller testkemikalier som bör klassificeras som måttligt irriterande för ögonen (GHS-kategori 2b), eftersom det finns ett stort antal kemikalier i GHS-kategori 1 som är underklassificerade som GHS-kategori 2, 2A eller 2B medan andra kemikalier i GHS-kategorin Ingen klassificering är överklassificerade som GHS-kategori 2, 2A eller 2B (2) (3). Därför kan det krävas ytterligare testning med en annan passande metod.

Alla förfaranden som omfattar ögon och hornhinnor från nötkreatur bör respektera testningslaboratoriets tillämpliga regler och förfaranden för hantering av material som kommer från djur, omfattande men inte begränsat till vävnader och vävnadsvätskor. Likaså rekommenderas allmänna försiktighetsåtgärder för laboratorier (11).

BCOP-testmetoden beaktar inte skador på ögats bindhinna (konjunktiva) eller iris, men däremot skador på hornhinnan, som är den viktigaste in vivo-klassificeringen med avseende på GHS-klassificeringen. Reversibiliteten hos hornhinneskador kan i sig inte utvärderas med BCOP-test. På grundval av studier av kaninögon har det föreslagits att en bedömning av det initiala djupet för hornhinneskada kan användas för att identifiera vissa typer av irreversibla effekter (12). Det krävs dock ytterligare vetenskaplig kunskap för att man ska kunna förstå hur irreversibla effekter som inte är kopplade till en initialt allvarlig skada kan uppstå. Slutligen gäller att BCOP inte ger möjlighet att bedöma potentialen för systemisk toxicitet associerad med okulär exponering.

Testmetoden kommer att uppdateras regelbundet allteftersom ny information och data övervägs. Histopatologi kan t.ex. eventuellt vara användbart om en mer fullständig karakterisiering av skador på hornhinnan krävs. Såsom anges i OECD:s vägledningsdokument nr 160 (13) uppmuntras användarna att bevara hornhinnor och bereda histopatologiska prover som kan användas för att utveckla en databas och beslutskriterier för att ytterligare förbättra metodens noggrannhet.

Laboratorier som tar denna testmetod i bruk för första gången bör använda de kvalifikationskemikalier som förtecknas i bilaga 3. Ett laboratorium kan använda dessa kemikalier för att påvisa sin tekniska kompetens att genomföra BCOP-testmetoden innan det lämnar in BCOP-testdata avsedda för lagstadgad faroklassificering.

TESTMETODENS PRINCIP

BCOP-testmetoden är en organotypisk modell enligt vilken hornhinnan från nötkreatur under kort tid bibehåller normal fysiologisk och biokemisk funktion in vitro. Testmetoden innebär att skador framkallade av testkemikalien bedöms med kvantitativa mätningar av ändringar i korneal opacitet och permeabilitet med opacitetsmätare respektive spektrofotometer för synligt ljus. Med hjälp av resultaten från de två mätningarna beräknas ett IVIS-värde som används för att bestämma en in vitro-klassificering av farokategori för prognos av testkemikaliens potential att framkalla ögonirritation in vivo (se beslutskriterierna i punkt 48).

För BCOP-testmetoden används isolerade hornhinnor från ögon som tillvaratagits från nyligen slaktade nötkreatur. Den korneala opaciteten mäts kvantitativt som ljustransmissionen genom hornhinnan. Permeabiliteten mäts kvantitativt som mängden natriumfluorescein som passerar genom hornhinnans hela djup enligt mätning i mediet i hornhinnehållarens bakre kammare. Kemikalierna appliceras på hornhinnans epitelyta via den främre kammaren. I tillägg 4 finns en beskrivning och en schematisk bild av den hornhinnehållare som används vid BCOP-testmetoden. Hornhinnehållare finns att köpa på marknaden hos olika leverantörer eller kan konstrueras i laboratoriet.

Källa och ålder för ögon från nötkreatur, val av djurart

Nötkreatur som sänds till slakterier avlivas i regel för användning som livsmedel eller för andra kommersiella ändamål. Endast friska djur som anses vara lämpliga för användning i livsmedelskedjan får användas för tillvaratagande av hornhinnor som används vid BCOP-testmetoden. Eftersom nötkreaturens vikt kan variera stort beroende på ras, ålder och kön finns det ingen rekommenderad slaktvikt för de djur som används.

Hornhinnornas dimensioner kan variera beroende på djurens ålder. Hornhinnor med en horisontell diameter > 30,5 mm och en central hornhinnetjocklek (CCT) ≥ 1100 μm kommer i regel från nötkreatur som är äldre än åtta år, medan hornhinnor med en horisontell diameter < 28,5 mm och CCT < 900 μm i regel kommer från nötkreatur som är yngre än fem år (14). Därför används normalt inte ögon från nötkreatur som är äldre än 60 månader. Ögon från nötkreatur som är yngre än 12 månader används i regel inte eftersom ögonen fortfarande håller på att utvecklas och hornhinnans tjocklek och diameter är betydligt mindre än de värden som rapporteras för ögon från vuxna nötkreatur. Hornhinnor från unga djur (6–12 månader) får dock användas eftersom det medför vissa fördelar såsom bättre tillgänglighet, smalare åldersintervall och lägre risker för att de anställda exponeras för bovin spongiform encefalopati (15). Det vore värdefullt med ytterligare utvärdering av hur hornhinnans storlek eller tjocklek påverkar responsen från frätande och irriterande kemikalier, och därför uppmanas användarna att rapportera uppskattad ålder och/eller vikt för de djur vars hornhinna använts för undersökningen.

Tillvaratagande och transport av ögon till laboratoriet

Ögonen tas till vara av slakteriets personal. För att minimera mekaniska och andra typer av skador på ögonen bör dessa tas till vara så snart som möjligt efter slakten och kylas omedelbart efter tillvaratagande och under transport. För att hindra att ögonen exponeras för potentiellt irriterande kemikalier bör rengöringsmedel inte användas vid sköljning av djurets huvud vid slakteriet.

Ögonen bör hållas helt nedsänkta i kylda HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) i ett kärl av lämplig storlek, och transporteras till laboratoriet på sådant sätt att skador och/eller bakterieförorening minimeras. Eftersom ögonen tas till vara under slaktningen utsätts de eventuellt för blod och andra biologiska material, inbegripet bakterier och andra mikroorganismer. Det är därför viktigt att minimera föroreningsrisken (t.ex. genom att hålla kärlet med ögonen på krossad is under insamling och transport samt lägga till antibiotika i HBSS-förvaringslösningen, t.ex. 100 IE/ml penicillin eller 100 μg/ml streptomycin).

Tiden mellan tillvaratagande av ögonen och användningen av hornhinnorna i BCOP-testmetoden bör minimeras (normalt bör tillvaratagande och användning ske samma dag) och det måste påvisas att väntetiden inte stör analysresultaten. Dessa baserar sig på urvalskriterierna för ögonen såväl som på positiv och negativ kontrollrespons. Alla ögon som används för testning bör komma från samma grupp av ögon som har tillvaratagits en viss dag.

Urvalskriterier för ögon som används för BCOP-testmetoden

När ögonen har tagits emot vid laboratoriet ska de undersökas omsorgsfullt för skador såsom ökad opacitet, repor och nykärlsbildning. Endast hornhinnor från oskadade ögon får användas.

De individuella hornhinnornas kvalitet utvärderas också i senare steg i testningen. Hornhinnor vars opacitet efter en inledande jämviktsperiod på en timme är högre än sju opacitetsenheter eller motsvarande för opacitetsmätaren och använda hornhinnehållare ska förkastas (OBS: opacitetsmätaren ska kalibreras med opacitetsstandarder för opacitetsenheter, se tillägg 4).

Varje behandlingsgrupp (testkemikalie, parallella negativa och positiva kontroller) ska bestå av minst tre ögon. För den negativa kontrollen enligt BCOP-testmetoden ska tre hornhinnor användas. Eftersom hornhinnorna skärs ut från globen som helhet och därefter monteras i hornhinnekamrarna, finns det en risk för att de individuella värdena för korneal opacitet och permeabilitet (inbegripet negativ kontroll) påverkas av artefakter från hanteringen. Vidare används opacitets- och permeabilitetsvärden från de negativa kontrollernas hornhinnor för att korrigera de opacitets- och permeabilitetsvärden från testade kemiskt behandlade och positivkontrollerade hornhinnor som används för IVIS-beräkningarna.

FÖRFARANDE

Förberedelse av ögonen

Defektfria hornhinnor skärs ut med en 2–3 mm omgivande kant av senhinna som är avsedd att underlätta efterföljande hantering. Var noga med att undvika skador på hornhinnans epitel och endotel. Hornhinnorna monteras en och en i särskilt utformade hornhinnehållare som har en bakre och en främre kammare som angränsar mot hornhinnans epitelsida respektive endotelsida. Båda kamrarna fylls med förvärmt EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) i överskott (bakre kammaren först). Se till så att det inte bildas bubblor. Därefter hålls utrustningen vid 32 ± 1 °C i minst en timme så att jämvikt nås mellan mediet och hornhinnorna och normal metabolisk aktivitet uppstår i den mån det är möjligt (en hornhinna in vivo har en ungefärlig temperatur på 32 °C).

Efter jämviktsperioden tillsätts färskt förvärmt EMEM fritt från fenolrött till båda kamrarna och grundvärden för opacitet mäts på varje hornhinna. Efter jämviktsperioden tillsätts färskt förvärmt EMEM fritt från fenolrött till båda kamrarna och grundvärden för opacitet mäts på varje hornhinna. Alla hornhinnor som uppvisar en makroskopisk vävnadsskada (t.ex. repor, pigmentering, kärlnybildning) eller opacitet över 7 opacitetsenheter eller motsvarande för opacitetsmätaren och hornhinnehållarna ska förkastas. Opacitetsmedelvärdet beräknas för alla jämviktsbehandlade hornhinnor. Minst tre hornhinnor väljs ut som exemplar för negativa kontroller (eller lösningsmedelskontroller). Återstående hornhinnor delas upp i behandlingsgrupp och positiv kontrollgrupp.

Eftersom vatten har en högre värmekapacitet än luft, ger vatten stabilare temperaturförhållanden för inkubation. Därför rekommenderas vattenbad för att hålla hornhinnehållaren och dess innehåll vid 32 ± 1 °C. Luftinkubatorer kan dock också användas under förutsättning att temperaturen hålls stabil (t.ex. genom förvärmning av hållare och media).

Applicering av testkemikalien

Två olika behandlingsprotokoll används, ett för vätskor och ytaktiva ämnen (fasta eller flytande) och ett för fasta ämnen som inte är ytaktiva.

Vätskor testas i outspädd form. Halvfasta ämnen, krämer och vaxer testas normalt som vätskor. Rena ytaktiva ämnen testas vid en koncentration på 10 % vikt/volym i en 0,9 % natriumkloridlösning, destillerat vatten eller annat lösningsmedel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet. Om andra utspädningskoncentrationer används bör detta motiveras. Blandningar som innehåller ytaktiva ämnen kan testas outspädda eller utspädda till en lämplig koncentration, beroende på det aktuella exponeringsscenariot in vivo. Lämplig motivering bör ges för den testade koncentrationen. Hornhinnorna exponeras för vätskor och ytaktiva ämnen under 10 minuter. Om avvikande exponeringstider används bör tillbörlig vetenskaplig motivering ges. Definitioner av ytaktiva ämnen och blandningar innehållande ytaktiva ämnen ges i tillägg 1.

Fasta ämnen som inte är ytaktiva testas normalt som lösningar eller suspensioner vid 20 % vikt/volym i en 0,9 % natriumkloridlösning, destillerat vatten eller annat lösningsmedel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet. I vissa förhållanden och med angivande av tillbörlig vetenskaplig motivering kan fasta ämnen också testas i ren form med direkt applicering på hornhinnans yta med användning av metoden med öppen kammare (se punkt 32). Hornhinnorna exponeras för fasta ämnen under fyra timmar, och på samma sätt som med vätskor och ytaktiva ämnen måste avvikande exponeringstider motiveras med tillbörliga vetenskapliga grunder.

Olika behandlingsmetoder kan användas, beroende på testkemikaliens fysikaliska natur och kemiska egenskaper (t.ex. fasta ämnen, vätskor och viskösa respektive icke-viskösa vätskor). Den kritiska faktorn är att se till att testkemikalien täcker epitelytan tillräckligt och att det avlägsnas effektivt under sköljningsstegen. Metoden med sluten kammare används normalt vid testning av icke-viskösa till lätt viskösa kemikalier, medan metoden med öppen kammare normalt används för semiviskösa och viskösa kemikalier och rena fasta ämnen.

När sluten kammare används tillförs testkemikalien i den främre kammaren genom doseringshålen på kammarens övre yta i tillräcklig mängd (750 μl) för att täcka hornhinnans epitelsida och därefter hålls hålen förslutna med pluggar under exponeringen. Det är viktigt att varje hornhinna exponeras för testkemikalien under avsedd tidslängd.

När öppen kammare används ska den främre kammarens fönsterlåsring och glasfönster avlägsnas före behandlingen. Kontroll- eller testkemikalien (750 μl eller tillräckligt för att täcka hornhinnan helt) tillförs direkt på hornhinnans epitelyta med hjälp av en mikropipett. Om testkemikalien är svår att pipettera kan den i stället appliceras med en s.k. positive displacement-pipett. Positive displacement-pipettens spets införs i sprutans doseringsspets så att ämnet kan tryckas in i positive displacement-spetsen. Samtidigt dras sprutkolven ut medan pipettens pistong dras uppåt. Om det uppstår bubblor i pipettspetsen ska testkemikalien avlägsnas (tryckas ut) och förfarandet upprepas till dess att spetsen fylls utan att det uppstår luftbubblor. Vid behov kan man använda en vanlig spruta (utan nål) eftersom den ger möjlighet att mäta en exakt volym av testkemikalien och underlättar appliceringen på hornhinnans epitelyta. Efter doseringen monteras glasfönstret tillbaka på den främre kammaren så att systemet återförsluts.

Inkubation efter exponering

Efter exponeringsperioden avlägsnas testkemikalien, eller den kemikalie som används för negativ eller positiv kontroll, från den främre kammaren och epitelytan tvättas minst tre gånger (eller till dess att ingen testkemikalie kan observeras visuellt på ytan) med EMEM (med fenolrött). Medium innehållande fenolrött används för sköljning eftersom färgändringen av fenolrött kan användas som indikator på effektiv sköljning av sura eller alkaliska testkemikalier. Hornhinnorna ska tvättas mer än tre gånger om färgförändringen av fenolrött kvarstår (gult eller purpurrött) eller om rester av testkemikalien kan observeras. När mediet är rent från testkemikalien görs en slutsköljning av hornhinnorna med EMEM (utan fenolrött). EMEM (utan fenolrött) används som slutsköljning för att säkerställa att allt fenolrött avlägsnas från den främre kammaren före opacitetsmätningen. Därefter fylls den främre kammaren på nytt med färskt EMEM utan fenolrött.

För vätskor och ytaktiva ämnen ska hornhinnorna efter sköljning inkuberas i ytterligare två timmar vid 32 ± 1 °C. Längre tider kan vara till fördel under vissa omständigheter och kan övervägas från fall till fall. Hornhinnor som exponerats för fasta ämnen sköljs grundligt efter den fyra timmar långa exponeringen och kräver ingen efterföljande inkubation.

Efter den inkubationsperiod som följer på exponeringen (vätskor och ytaktiva ämnen) eller efter slutet av den fyra timmar långa exponeringsperioden (icke-ytaktiva fasta ämnen) görs mätningar av opaciteten och permeabiliteten för varje hornhinna. Varje hornhinna granskas också visuellt och relevanta observationer noteras (t.ex. avflagning av vävnad, rester av testkemikalien, oenhetliga opacitetsmönster). Sådana observationer kan vara viktiga eftersom de också är kopplade till variationer av opacitetsmätarens avläsningar.

Kontrollkemikalier

Parallella negativa kontroller eller lösningsmedels-/vehikelkontroller och positiva kontroller ingår i varje försök.

Vid testning av ett vätskeformigt ämne vid 100 % ska BCOP-testmetoden inbegripa en parallell negativ kontroll (t.ex. 0,9 % natriumkloridlösning eller destillerat vatten) så att icke-specifika ändringar i testsystemet kan upptäckas och för att ge en bakgrundsnivå för testningens endpoint. På så sätt säkerställs också att testningsförhållandena inte i onödan framkallar irritation.

Vid testning av en utspädd vätska, ett ytaktivt ämne eller ett fast ämne ska BCOP-testmetoden omfatta en parallell kontrollgrupp med lösningsmedel/vehikel så att icke-specifika ändringar i testsystemet kan upptäckas och för att ge en bakgrundsnivå för testningens endpoint. Endast lösningsmedel/vehikel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet får användas.

En kemikalie som är känd att inducera positiv respons inkluderas som en parallell positiv kontroll i varje försök för att kontrollera testsystemets integritet och se till att det tillämpas korrekt. För att säkerställa att den positiva kontrollresponsen kan bedömas över tiden bör den irritation som framkallas inte vara för stark.

Exempel på en positiv kontrollkemikalie för testning av flytande testkemikalier är 100 % etanol eller 100 % dimetylformamid. Exempel på en positiv kontrollkemikalie för testning av fasta ämnen är 20 % (vikt/volym) imidazol i 0,9 % natriumkloridlösning.

Referenskemikalier kan användas för utvärdering av förmågan att framkalla ögonirritation hos okända kemikalier tillhörande en specifik kemisk klass eller produktklass, eller för utvärdering av den relativa irritationspotentialen hos ett ögonirriterande ämne inom ett specifikt responsområde.

Mätning av endpoints

Opaciteten bestäms enligt ljustransmissionen genom hornhinnan. Hornhinnans opacitet mäts kvantitativt med hjälp av en opacitetsmätare som mäter opacitetsvärden på en kontinuerlig skala.

Permeabiliteten bestäms med hjälp av mängden natriumfluorescein som passerar hela hornhinnan (dvs. epitelet på hornhinnans yttre yta och genom hornhinnan till endotelet på hornhinnans inre yta). 1 ml natriumfluoresceinlösning (4 eller 5 mg/ml vid testning av vätskor och ytaktiva ämnen respektive icke-ytaktiva fasta ämnen) tillförs hornhinnehållarens främre kammare (den som angränsar mot hornhinnans epitelsida) medan den bakre kammaren (den som angränsar mot hornhinnans endotelsida) fylls med färskt EMEM. Därefter inkuberas hållaren i horisontellt läge i 90 ± 5 minuter vid 32 ± 1 °C. Mängden natriumfluorescein som kommer in i den bakre kammaren mäts kvantitativt med hjälp av UV/VIS-spektrofotometri. De spektrofotometriska mätningarna vid 490 nm noteras som optisk densitet (OD490) eller absorbansvärden som mäts på en kontinuerlig skala. Permeabilitetsvärdena för fluorescein bestäms genom OD490-värden med en spektrofotometer för synligt ljus och en standardvåglängd på 1 cm.

Alternativt kan man använda en 96-håls mikrotiterplatta förutsatt att i) det linjära området för avläsning av plattan när det gäller fluorescein OD490-värden kan fastställas och ii) korrekt volym fluoresceinprover används i mikrotiterplattan för att få OD490-värden som motsvarar standardväglängden 1 cm (för detta krävs eventuellt att brunnen är helt full, i regel 360 l).

DATA OCH RAPPORTERING

Utvärdering av data

När opacitetsvärdena och permeabilitetsmedelvärdena (OD490) har korrigerats för bakgrundsopacitet och den negativa kontrollens permeabilitetsvärden (OD490), ska varje behandlingsgrupps medelvärden för opacitet och permeabilitet (OD490) kombineras i en empiriskt härledd formel för beräkning av IVIS-värdet (In Vitro Irritancy Score) enligt följande:

IVIS = medelvärdet för opacitet + (15 × medelvärdet för permeabilitet OD490)

Sina m.fl. (16) har rapporterat att denna formel härleddes under försök som utfördes inom och mellan laboratorier. Data som genererades för en serie med 36 föreningar i en undersökning som omfattade flera laboratorier användes som indata i en multivariat analys för bestämning av vilken ekvation som ger den bästa anpassningen mellan in vivo- och in vitro-data. Analysen genomfördes av forskare på två separata företag och de resulterande ekvationerna var nästan identiska.

Opacitets- och permeabilitetsvärdena bör också utvärderas fristående för att fastställa huruvida en testkemikalie har en frätande eller kraftigt irriterande verkan endast genom en av de två endpoints (se beslutskriterierna).

Beslutskriterier

IVIS-brytpunktsvärden för att identifiera testkemikalier som framkallar allvarliga ögonskador (GHS-kategori 1) och testkemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarliga ögonskador (GHS Ingen klassificering) ges nedan:

IVIS

GHS

≤ 3

Ingen klassificering

> 3, ≤ 55

Ingen förutsägelse kan göras

> 55

Kategori 1

Kriterier för godkännande av ett försök

Ett försök anses vara godkänt om den positiva kontrollen ger ett IVIS-värde som faller inom två standardavvikelser för det aktuella historiska medelvärdet, som måste uppdateras minst var tredje månad, eller varje gång ett godkänt test genomförs i laboratorier där försök genomförs oregelbundet (mindre än en gång per månad). Responsen från den negativa kontrollen eller lösningsmedels-/vehikelkontrollen bör ge opacitets- och permeabilitetsvärden som är lägre än de fastställda övre gränserna för bakgrundsvärden för opacitet och permeabilitet för nötkreaturshornhinnor behandlade med negativa kontrollämnen eller lösningsmedel/vehikler. En enda testomgång med minst tre hornhinnor bör vara tillräcklig för en testkemikalie förutsatt att den resulterande klassificeringen är otvetydig. Om den första testomgången ger resultat som ligger på gränsen bör en andra testomgång övervägas (men är inte alltid nödvändig). Om medelvärdet för IVIS-resultaten inte överensstämmer mellan de två första testomgångarna bör en tredje testomgång övervägas. I detta sammanhang anses resultat i den första testomgången vara gränsfall om förutsägelserna för de tre hornhinnorna inte överensstämde, om

två av tre hornhinnor gav förutsägelser som inte överensstämde med medelvärdet för samtliga tre hornhinnor, ELLER

om en av de tre hornhinnorna gav en förutsägelse som inte överensstämde med medelvärdet för samtliga tre hornhinnor OCH det icke-överensstämmande resultatet var > 10 IVIS enheter från brytpunkten 55.

Om en upprepad testomgång bekräftar förutsägelsen från den första testomgången (baserat på IVIS-medelvärdet) kan ett slutligt beslut fattas utan ytterligare testning. Om resultaten från den upprepade testomgången ger en förutsägelse som inte överensstämmer med den första testomgången (baserat på IVIS-medelvärdet) bör en tredje och slutlig testomgång utföras för att lösa tvetydiga förutsägelser och klassificera testkemikalien. Undantag från kravet på ytterligare testning för klassificering och märkning kan göras om en testomgång ger en förutsägelse som överensstämmer med GHS-kategori 1.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter i den mån de är relevanta:

 

Test- och kontrollkemikalier:

Kemisk beteckning såsom den strukturella beteckning som används i Chemical Abstracts Service (CAS) och eventuella andra kända beteckningar samt CAS-registreringsnummer om det är känt.

Test-/kontrollkemikaliens renhet och sammansättning (viktprocent) i den mån uppgifterna finns att tillgå.

Fysikalisk-kemiska egenskaper, t.ex. fysikaliskt tillstånd, flyktighet, pH, stabilitet, kemisk klass och vattenlöslighet, i den mån de är relevanta.

Behandling av test-/kontrollämnen före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning, finfördelning).

Stabilitet, om den är känd.

 

Uppgifter om sponsor och testanläggning

Namn och adress för sponsor, testanläggning och försöksledare.

 

Testmetodens betingelser

Opacitetsmätare (t.ex. modell och specifikationer) samt instrumentinställningar.

Kalibreringsinformation för utrustning som använts för mätning av opacitet och permeabilitet (t.ex. opacitetsmätare och spektrofotometer) för att säkerställa att mätningarna är linjära.

Typ av hornhinnehållare (t.ex. modell och specifikationer).

Beskrivning av annan använd utrustning.

Det förfarande som används för att säkerställa testmetodens integritet (dvs. noggrannhet och tillförlitlighet) över tiden (t.ex. periodisk testning med kvalifikationskemikalier).

 

Kriterier för godtagbart försök

Godtagbara intervaller för parallella positiva och negativa kontroller på grundval av historiska data.

Om tillämpligt, godtagbara intervaller för parallella referenskontroller på grundval av historiska data.

 

Insamling och förberedelse av ögon

Angivelse av ögonkällan (den anläggning där ögonen togs till vara).

Hornhinnans diameter som ett mått på djurets ålder och lämplighet för försöket.

Förvarings- och transportförhållanden för ögonen (t.ex. datum och tidpunkt för tillvaratagande, tidsperiod före inledning av försöket, transportmedium och temperaturförhållanden, eventuella antibiotika som använts).

Förberedelse och montering av de nötkreaturshornhinnor som använts, inbegripet utlåtanden om deras kvalitet, temperatur för hornhinnehållare samt urvalskriterier för de hornhinnor som valts ut för testning.

 

TESTFÖRFARANDE

Antal använda replikat.

Uppgift om använda negativa och positiva kontroller (i förekommande fall även lösningsmedel och referenskontroller).

Testkemikaliens koncentration(er), applicering, exponeringstid samt inkubationstid efter exponering.

Beskrivning av utvärderings- och beslutskriterierna.

Beskrivning av acceptanskriterierna för undersökningen.

Beskrivning av eventuella modifieringar av försöksförfarandet.

Beskrivning av beslutskriterierna.

 

Resultat

Data i tabellform för enskilda testprover (t.ex. opacitet och OD490-värden och beräknade IVIS-värden för testkemikalien och de positiva och negativa kontrollerna samt referenskontroller om sådana ingått, inbegripet data från replikat och upprepade försök, beroende på vad som är lämpligt, och medelvärden inklusive standardavvikelse för varje försök).

Beskrivning av övriga observerade effekter.

Härledd GHS-klassificering in vitro, i förekommande fall.

 

Diskussion av resultaten

 

Slutsats

LITTERATUR

(1)

ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07–4517. Finns på http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(2)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No.10–7553. Research Triangle Park, NC:National Institute of Environmental Health Sciences. Finns på http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(3)

OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.

(4)

FN (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York och Genève: Förenta nationerna. Finns på http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.

(5)

Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P. och Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in vitro 24, 1–9.

(6)

ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. I: ICCVAM Test Method Evaluation Report – in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Finns på http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(7)

ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. I: ICCVAM testmetod utvärderingsrapport – Aktuellt Validering status in vitro Testmetoder som föreslås för identifiering ögonskada farlighet av kemikalier och produkter. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No: 99–4494. 10-7553A. Finns på http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(8)

JAGNVJAGTTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italien: Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM).

(9)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. och Sina, J.F. (1992). Bovjagne corneal OPACjagty och permEABjaglDety test: enn jagn vjagtro enssay av ocular jagrrDetenncy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442–449.

(10)

Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78–81.

(11)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(12)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106–117.

(13)

OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, No. 160. Antagen 25 oktober 2011. Paris Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159–2165.

(15)

Collee, J. och Bradley, R. (1997). BSE: A decade on – Part I. The Lancet 349: 636–641.

(16)

Sjagna, JF., Genler, D.M., Sussmen, R.S., Genutheron, P.D., Senrgsvt, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., Och Mjagller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20–31.

(17)

Kapitel B.5 i denna bilaga, Akut ögonirritation/ögonkorrosion.

(18)

ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06–4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Finns på [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].

(19)

OECD (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD:s principer om god laboratoriesed (omarbetade 1997).

Finns på http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html

Tillägg 1

DEFINITIONER

Noggrannhet : mått på hur väl testmetodresultaten och de godtagna referensvärdena överensstämmer med varandra. Noggrannhet är ett mått på testmetodens prestanda och relevansaspekt. Detta begrepp används ofta omväxlande med ”konkordans” för att beskriva andelen korrekta resultat med en testmetod.

Referenskemikalie : en kemikalie som används som standard för jämförelse med en testkemikalie. En referenskemikalie bör ha följande egenskaper: i) eller flera enhetliga och tillförlitliga källor, ii) strukturell och funktionell likhet med den kemikalieklass som testas, iii) kända fysikalisk-kemiska egenskaper, iv) stödjande data om kända effekter och v) känd styrka inom det önskade responsområdet.

Botten-upp-strategi : stegvis metod som tillämpas på kemikalier som inte tros kräva klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada. Det första steget är att skilja kemikalier som inte behöver klassificeras (negativt utfall) från andra kemikalier (positivt utfall).

Kemikalie : ett ämne eller en blandning.

Hornhinna (kornea) : den transparenta delen på ögonglobens framsida som täcker iris och pupillen och släpper igenom ljus in i ögat.

Korneal opacitet : mått för den grad av opacitet som hornhinnan har efter exponering för en testkemikalie. Ökad korneal opacitet tyder på skador på hornhinnan. Opaciteten kan utvärderas subjektivt (Draizes test på kaninögon) eller objektivt med ett instrument såsom en opacitetsmätare.

Korneal permeabilitet : kvantitativt mått på skada på hornhinnans epitel genom bestämning av den mängd natriumfluorescein som passerar genom hornhinnans alla cellager.

Ögonirritation : ändringar som uppstår i ögat efter applicering av en testkemikalie på ögats främre yta och som inte är fullt reversibla inom 21 dagar från appliceringen. Utbytbart mot ”Reversibla effekter på ögat” och ”GHS-kategori 2” (4).

Falskt negativt värde : den andel av alla positiva ämnen som av en testmetod felaktigt identifieras som negativ. Det är en indikator på testmetodens prestanda.

Falskt positivt värde : den andel av alla negativa (icke-aktiva) ämnen som av en testmetod felaktigt identifieras som positiva. Det är en indikator på testmetodens prestanda.

Fara : inneboende egenskap hos ett ämne eller en situation som har potential att orsaka skadliga effekter när en organism, ett system eller en (del-)population exponeras för ämnet.

In Vitro Irritancy Score (IVIS) : en empiriskt härledd formel som används vid BCOP-testmetoden och där medelvärdet för opacitet och medelvärdet för permeabilitet för varje behandlingsgrupp kombineras till ett enda in vitro-värde. IVIS = medelvärdet för opacitet + (15 × medelvärdet för permeabilitet)

Irreversibla effekter på ögat : Se ”Allvarliga ögonskador”.

Blandning : En blandning eller en lösning som består av två eller flera ämnen i vilka de inte reagerar (4)

Negativ kontroll : ett obehandlat replikat som innehåller alla komponenter i ett testsystem. Detta prov hanteras tillsammans med testkemikaliebehandlade prover och andra kontrollprover för att avgöra huruvida lösningsmedlet påverkar testsystemet.

Ej klassificerad : Kemikalier som inte är klassificerade som ögonirriterande (GHS-kategori 2, 2A eller 2B) eller för allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1). Utbytbart mot ”GHS Ingen klassificering”.

Opacitetsmätare : ett instrument för mätning av korneal opacitet genom en kvantitativ utvärdering av ljustransmissionen genom hornhinnan. Det har i regel två kamrar med var sin ljuskälla och var sin fotocell. Ena kammaren används för den behandlade hornhinnan och den andra används för kalibrering och nollställning av instrumentet. Ljus från en halogenlampa sänds genom kontrollkammaren (en tom kammare utan fönster eller vätska) till en fotocell och jämförs med ljuset som sänds genom försökskammaren (i vilken hornhinnan finns) till en fotocell. Instrumentet mäter skillnaden mellan fotocellernas ljustransmission och visar ett numeriskt värde på en digital display.

Positiv kontroll : ett replikat som innehåller testsystemets alla komponenter och behandlas med ett ämne som veterligen inducerar positiv respons. För att säkerställa att den positiva kontrollresponsens variationer kan bedömas över tiden, bör den kraftiga irritation som framkallas inte vara för stark.

Reversibla effekter på ögat : se ”ögonirritation”.

Tillförlitlighet : mått på i vilken utsträckning en testmetod kan reproduceras inom och mellan laboratorier över tiden när den utförs med hjälp av samma protokoll. Tillförlitligheten bedöms genom att man beräknar reproducerbarheten inom och mellan laboratorier och repeterbarheten inom laboratorier.

Allvarliga ögonskador : vävnadsskada i ögat eller kraftig synnedsättning som uppstår efter applicering av en testkemikalie på ögats främre yta och som inte är fullt reversibel inom 21 dagar från appliceringen (2). Utbytbart mot ”Irreversibla effekter på ögat” och ”GHS kategori 1” (4).

Lösningsmedels-/vehikelkontroll : ett obehandlat prov som innehåller testsystemets alla komponenter, inbegripet lösningsmedlet eller vehikeln som behandlas tillsammans med testkemikaliebehandlade prover och andra kontrollprover i syfte att fastställa bakgrundsrespons för de prover som behandlas med testkemikalien upplöst i samma lösningsmedel eller vehikel. När detta prov testas med en parallell negativ kontroll visar provet också huruvida lösningsmedlet eller vehikeln påverkar testsystemet.

Ämne : kemiska grundämnen och deras föreningar i naturlig eller framställd form, inklusive eventuella tillsatser nödvändiga för att bevara produktens stabilitet och sådana föroreningar som härrör från framställningsprocessen, men exklusive eventuella lösningsmedel som kan avskiljas utan att det påverkar ämnets stabilitet eller ändrar dess sammansättning (4).

Ytaktivt ämne : Ett ämne, såsom ett rengöringsmedel, som kan minska en vätskas ytspänning så att lödder bildas eller fasta ämnen penetrerar. Även kallat tensid eller vätmedel.

Blandning innehållande ytaktiva ämnen : inom ramen för denna testmetod, en blandning som innehåller ett eller flera ytaktiva ämnen med en slutlig koncentration på > 5 %.

Uppifrån och ned-strategi : stegvis metod som tillämpas på kemikalier som misstänks orsaka allvarlig ögonskada. Det första steget är att skilja kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada (positivt utfall) från andra kemikalier (negativt utfall).

Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Stegvis testningsstrategi : en strategi för stegvis testning där all befintlig information om en testkemikalie granskas i en angiven ordning, med användning av förfarandet med sammanvägd bedömning (weight of evidence) för att avgöra om det finns tillräckligt med information till hands för att besluta om faroklassificering innan man går vidare till nästa steg. Om testkemikaliens förmåga att framkalla irritation kan fastställas på grundval av befintlig information behövs ingen ytterligare testning. Om testkemikaliens förmåga att framkalla irritation inte kan fastställas på grundval av befintlig information genomförs ett stegvis sekventiellt djurförsöksförfarande tills att det går att fastställa en otvetydig klassificering.

GHS (globalt harmoniserat system för klassificering och märkning av kemikalier : ett system för att klassificera ämnen och blandningar enligt standardiserade typer och nivåer av fysiska risker, hälsorisker och miljörisker och informera om resultaten genom t.ex. piktogram, signalord, faroangivelser, skyddsangivelser och säkerhetsdatablad i syfte att informera om ämnenas skadliga effekter för att skydda personer (inklusive arbetsgivare, arbetstagare, transportörer, konsumenter och personal inom räddningstjänsten) och miljön (4).

GHS-kategori 1 : se ”allvarliga ögonskador”.

GHS-kategori 2 : se ”ögonirritation”.

GHS Ingen klassificering : Kemikalier som inte uppfyller kraven för att klassificeras som GHS-kategori 1 eller 2 (2A eller 2B). Utbytbart mot ”Ej klassificerad”.

Validerad testmetod : en testmetod för vilken valideringsstudier har genomförts för att fastställa relevans (inbegripet noggrannhet) och tillförlitlighet för ett specifikt ändamål. Det är viktigt att notera att en validerad testmetod kanske inte är tillräckligt noggrann och tillförlitlig när det gäller ett visst föreslaget ändamål

Sammanvägd bedömning : (weight of evidence) ett förfarande där man bedömer styrkor och svagheter hos flera uppgifter för att nå fram till och motivera en slutsats rörande en testkemikalies faropotential.

Tillägg 2

BCOP-TESTMETODENS FÖRUTSÄGANDE KAPACITET

Tabell 1

BCOP-testmetodens prediktionsförmåga att identifiera kemikalier som inducerar allvarliga ögonskador [GHS/EU CLP kat. 1 jämfört med Ingen kat. 1 (kat. 2 + Ingen kat.), US EPA kat. I jämfört med Ingen kat. I (kat. II + kat. III + kat. IV)]

Klassificerings system

Nr

Noggrannhet

Känslighet

Falskt negativ

Specificitet

Falskt positiv

%

Nr

%

Nr

%

Nr

%

Nr

%

Nr

GHS

EU CLP

191

78,53

150/191

86,15

56/65

13,85

9/65

74,60

94/126

25,40

32/126

US EPA

190

78,95

150/190

85,71

54/63

14,29

9/63

75,59

96/127

24,41

31/127


Tabell 2

BCOP-testmetodens prediktionsförmåga att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering som ögonirriterande eller för allvarlig ögonskada (”icke-irriterande ämnen”) [GHS EU CLP Ingen kat. mot Ingen kat. (kat. 1 + kat. 2), US EPA kat. IV mot Ingen kat. IV (kat. I + kat. II + kat. III)]

Klassificerings system

Nr

Noggrannhet

Känslighet

Falskt negativ

Specificitet

Falskt positiv

%

Nr

%

Nr

%

Nr

%

Nr

%

Nr

GHS

EU CLP

196

68,88

135/196

100

107/107

0

0/107

31,46

28/89

68,54

61/89

US EPA

190

82,11

156/190

93,15

136/146

6,85

10/146

45,45

20/44

54,55

24/44

Tillägg 3

KVALIFIKATIONSÄMNEN FÖR BCOP-TESTMETODEN

Före rutinanvändning av en testmetod bör laboratoriet påvisa den tekniska kvaliteten genom att korrekt identifiera klassificeringen av kemikalier som är farliga för ögonen för de 13 kemikalier som rekommenderas i tabell 1. Dessa ämnen har valts ut för att representera responsskalan för ämnen som är farliga för ögonen enligt resultaten från in vivo-test på kaninögon (TG 405) (17) och GHS-kategorierna 1, 2A, 2B eller ingen klassificering (4). Till övriga kriterier hör att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att det finns tillgång till in vivo-referensdata av hög kvalitet och att det finns data av hög kvalitet från BCOP-testmetoden. Referensdata finns i Streamlined Summary Document (SSD) (3) och i ICCVAM Background Review Document för BCOP-testmetoden (2)(18).

Tabell 1

Rekommenderade ämnen för att påvisa teknisk kvalitet med BCOP-testmetoden

Kemikalie

CASRN

Kemisk klass (8)

Fysikalisk form

In vivo-klassificering (9)

BCOP-klassificering

Bensalkoniumklorid (5 %)

8001-54-5

Oniumförening

Vätskor

Kategori 1

Kategori 1

Klorhexidin

55-56-1

Amin, amidin

Fast ämne

Kategori 1

Kategori 1

Dibensoyl-L-tartarsyra

2743-38-6

Karboxylsyra, ester

Fast ämne

Kategori 1

Kategori 1

Imidazol

288-32-4

Heterocyklisk förening

Fast ämne

Kategori 1

Kategori 1

Triklorättiksyra (30 %)

76-03-9

Karboxylsyra

Vätskor

Kategori 1

Kategori 1

2,6-dimetylbensoylklorid

4659-45-4

Acylhalid

Vätskor

Kategori 2A

Ingen exakt/tillförlitlig förutsägelse kan göras

Etyl-2-metylacetoacetat

609-14-3

Keton, ester

Vätskor

Kategori 2B

Ingen exakt/tillförlitlig förutsägelse kan göras

Ammoniumnitrat

6484-52-2

Oorganiskt salt

Fast ämne

Kategori 2 (10)

Ingen exakt/tillförlitlig förutsägelse kan göras

EDTA, di-kaliumsalt

25102-12-9

Amin, karboxylsyra (salt)

Fast ämne

Ej klassificerat

Ej klassificerat

Tween 20

9005-64-5

Ester, polyeter

Vätskor

Ej klassificerat

Ej klassificerat

2-merkaptopyrimidin

1450-85-7

Acylhalid

Fast ämne

Ej klassificerat

Ej klassificerat

Fenylbutazon

50-33-9

Heterocyklisk förening

Fast ämne

Ej klassificerat

Ej klassificerat

Polyoxieten-23-lauryleter (BRIJ-35) (10 %)

9002-92-0

Alkohol

Vätska

Ej klassificerat

Ej klassificerat

Förkortningar: CASRN = Chemical Abstracts Service Registry Number

Tillägg 4

HORNHINNEHÅLLARE FÖR BCOP-TESTMETODEN

Hornhinnehållare för BCOP är gjorda av ett inert material (t.ex. polypropen). De består av två halvor (en främre och en bakre kammare) och har två likadana cylindriska inre kammare. Varje kammare rymmer 5 ml och har ett glasfönster genom vilket opacitetsmätningarna görs. De inre kamrarna mäter 1,7 cm i diameter och 2,2 cm i djup (11). Den bakre kammaren har en o-ring för att förhindra läckor. Hornhinnorna placeras med endotelsidan nedåt på den bakre kammarens o-ring och den främre kammaren placeras på hornhinnornas epitelsida. Kamrarna hålls på plats med hjälp av tre rostfria stålskruvar på kammarens ytterkanter. Varje kammare har ett glasfönster som kan tas bort för att enkelt nå hornhinnan. Det finns också en o-ring mellan glasfönstret och kammaren för att förhindra läckor. Upptill på varje kammare finns två hål för att tillsätta och ta bort medium och testkemikalier. Hålen försluts med gummiproppar under behandlings- och inkubationsperioderna. Ljustransmissionen genom hornhinnehållarna kan eventuellt ändras eftersom slitage eller ackumulering av specifika kemikaliska rester på den inre kammarens diameter eller på glasfönstren kan påverka ljusspridningen eller reflektansen. Följden kan bli ökningar eller minskningar i grundvärden för ljustransmission (och omvänt grundvärden för opacitet) genom hornhinnehållarna, och kan vara uppenbar som anmärkningsvärda förändringar i de förväntade grundvärdena vid initiala mätningar av hornhinneopacitet i individuella kammare (dvs, de initiala hornhinneopacitetsvärdena i särskilda individuella hornhinnehållare kan rutinmässigt skilja sig åt med mer än 2 eller 3 opacitetsenheter från de förväntade grundvärdena). Laborationerna bör införa program för att utvärdera ändringar i ljustransmissionen genom hornhinnehållarna, beroende på vilken typ av kemikalier som testas och hur ofta kamrarna används. För att fastställa jämförelsevärden kan man kontrollera hornhinnehållarna före rutinmässig användning genom att mäta grundvärden för opacitet (eller ljustransmission) i kamrarna, fyllda med komplett medium utan hornhinnor. Hornhinnehållarna kontrolleras därefter regelbundet för att upptäcka ändringar i ljustransmissionen under användningsperioderna. Laboratorierna kan fastställa kontrollintervaller för hornhinnehållarna baserat på testade kemikalier, användningsfrekvens och observationer av ändringar i grundvärdena för hornhinnornas opacitet. Om märkbara förändringar i ljustransmissionen genom hornhinnehållarna observeras måste laboratoriet överväga lämpliga rengörings- och/eller poleringsrutiner för hornhinnehållarnas yta eller byta ut hornhinnehållarna.

Hornhinnehållare: sprängskiss

Image

Tillägg 5

OPACITETSMÄTARE

Opacitetsmätaren används för mätning av ljustransmission. För OP-KIT-utrustningen från Electro Design (Riom, Frankrike) som användes för valideringen av BCOP-testmetoden, sänds t.ex. ljus från en halogenlampa sänds genom kontrollkammaren (en tom kammare utan fönster eller vätska) till en fotocell och jämförs med ljuset som sänds genom försökskammaren (i vilken hornhinnan finns) till en fotocell. Instrumentet mäter skillnaden mellan fotocellernas ljustransmission och visar ett numeriskt värde på en digital display. Opacitetsenheterna fastställs. Andra typer av opacitetsmätare med andra inställningar (som t.ex. inte kräver parallella mätningar av kontroll- och försökskamrarna) kan användas om de har visat sig ge samma resultat som den validerade utrustningen.

Opacitetsmätaren bör ge en linjär respons genom ett område av opacitetsmätningar som omfattar de brytpunkter som används för de olika klassificeringar som beskrivs i prognosmodellen (dvs. upp till brytpunkten för frätande verkan/kraftig irritation). För att säkerställa linjära och exakta avläsningar upp till 75–80 opacitetsenheter är det nödvändigt att kalibrera opacitetsmätaren med en serie kalibratorer. Kalibratorerna placeras i kalibreringskammaren (en hornhinnekammare utformad för kalibratorer) och avläsning görs på opacitetsmätaren. Kalibratorerna placeras i kalibreringskammaren med mer eller mindre det avstånd mellan ljus och fotocell som motsvarar hornhinnans placering vid opacitetsmätningarna. Referensvärden och initialt börvärde beror på vilken typ av utrustning som används. Opacitetsmätningars linjäritet bör säkerställas genom lämpliga (instrumentspecifika) förfaranden. För OP-KIT-utrustningen från Electro Design (Riom, Frankrike) kalibreras opacitetsmätaren först till 0 opacitetsenheter med hjälp av kalibreringskammaren utan en kalibrator. Därefter placeras tre olika kalibratorer en i sänder i kalibreringskammaren och avläsning görs av opacitetsvärdena. Kalibratorerna 1, 2 och 3 bör ge opacitetsavläsningar som motsvarar deras riktvärden på 75, 150 respektive 225 opacitetsenheter ± 5 %.

(13)

I del B ska kapitel B.48 ersättas med följande:

”B.48   Testmetoden ICE (Isolated Chicken Eye Test) för identifiering av i) kemikalier som orsakar allvarlig ögonskada och ii) kemikalier för vilka det inte krävs klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada

INLEDNING

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 438 (2013). ICE-testmetoden (Isolated Chicken Eye) utvärderades 2006 and 2010 (1)(2) av amerikanska ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) tillsammans med Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM) och det japanska centret för validering av alternativa metoder (JaCVAM) 1) (2) (3). I den första utvärderingen godkändes ICE som en vetenskapligt giltig testmetod för användning som ett screeningtest för att identifiera kemikalier (ämnen och blandningar) som inducerar allvarlig ögonskada (kategori 1) enligt definitionen i FN:s globala harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (1) (2) (4) och förordning (EG) 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) (12). I den andra utvärderingen undersökte man om ICE-testmetoden var användbar som ett screeningtest för att identifiera kemikalier som inte är klassificerade för ögonirritation eller allvarliga ögonskador enligt GHS (3) (4). Enligt resultaten från valideringsstudien och rekommendationerna från den expertpanel som granskat metoden behölls den ursprungliga rekommendationen om att använda ICE för klassificering av kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1), eftersom dem tillgängliga databasen inte ändrats sedan den ursprungliga ICCVAM-rekommendationen. I detta skede föreslås inga ytterligare rekommendationer om att utöka ICE-metodens tillämpningsområde till att även omfatta andra kategorier. En förnyad utvärdering gjordes av de in vitro- och in vivo-datauppsättningar som använts för att bedöma om ICE-metoden är användbar för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada (5). Denna förnyade utvärdering visade att ICE-testmetoden även kan användas för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation och allvarlig ögonskada enligt definitionen i GHS (4) (5). Denna testmetod beskriver rekommenderad användning av och begränsningar hos ICE-testmetoden baserat på dessa utvärderingar. De största skillnaderna mellan den ursprungliga versionen från 2009 och den uppdaterade versionen från 2013 av OECD-testriktlinjen avser, men är inte begränsade till, användning av ICE-testmetoden för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering enligt GHS-klassificeringen, en uppdatering av de uppgifter som ska ingå i testrapporten, en uppdatering av tillägg 1 om definitioner och en uppdatering av tillägg 2 om kvalifikationskemikalier.

Det är allmänt vedertaget att inget ögonirritationstest in vitro inom överskådlig framtid kommer att kunna ersätta Draizes ögontext in vivo för att förutsäga alla typer av ögonirritation för olika kemiska klasser. Strategiska kombinationer av flera alternativa testmetoder inom ramen för en (differentierad) teststrategi kan dock ersätta Draizes ögontest (6). Uppifrån och ned-strategin (7) är utformad för att användas när en kemikalie förväntas vara mycket irriterande baserat på befintlig information, medan botten-upp-strategin (7) å sin sida är utformad för att användas när en kemikalie inte förväntas orsaka tillräcklig ögonirritation för att kräva en klassificering baserat på befintlig information. ICE-testmetoden är en testmetod in vitro som kan användas under vissa omständigheter och med särskilda begränsningar (som beskrivs i punkterna 8–10) för klassificering och märkning av kemikalier som är farliga för ögonen. ICE-testmetoden anses i sig inte vara en giltig ersättning för test på kaninögon in vivo, men rekommenderas som ett första steg i en teststrategi såsom den uppifrån och ned-strategi som föreslagits av Scott m.fl. (7) För att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada, dvs. kemikalier som klassificeras som GHS-kategori 1, utan ytterligare provning (4). ICE-testmetoden rekommenderas också för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt definitionen i GHS (GHS ingen klassificering, NC) (4) och kan därför användas som ett första steg i en teststrategi som botten-upp-strategin (7). Kemikalier som inte förutsägs orsaka allvarlig ögonskada eller inte klassificeras för ögonirritation/allvarlig ögonskada enligt ICE-testmetoden kräver dock ytterligare testning (in vitro och/eller in vivo) för att fastställa en definitiv klassificering. Dessutom bör berörda tillsynsmyndigheter rådfrågas innan man använder ICE-metoden inom ramen för en botten-upp-strategi enligt andra klassificeringssystem än FN:s GHS.

Syftet med denna testmetod är att beskriva de förfaranden som används för att utvärdera om kemikalien kan vara skadlig för ögonen, mätt som kemikaliens förmåga att inducera toxicitet eller ej i ett isolerat kycklingöga. De toxiska verkningarna på hornhinnan mäts genom i) kvalitativ bedömning av opacitet, ii) kvalitativ bedömning av skadan på epitel efter applicering av fluorescein på ögat (fluoresceinfärgning), iii) kvantitativ mätning av ökad tjocklek (svullnad) och iv) kvalitativ utvärdering av makroskopisk morfologisk skada på ytan. Korneal opacitet, svullnad och skadebedömning efter exponering för en testkemikalie utvärderas var för sig och kombineras till ett resultat som används för klassificering av ämnet med avseende på ögonirritation.

Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

Testmetoden baserar sig på det protokoll som föreslås i OECD:s vägledningsdokument 160 (8) som har tagits fram enligt ICCVAM:s internationella valideringsstudie (1) (3) (9), med bidrag från Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM), det japanska centret för validering av alternativa metoder (JaCVAM) och TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology (Nederländerna). Protokollet grundar sig på uppgifter från offentliggjorda protokoll och från det protokoll som för närvarande används av TNO (10) (11) (12) (13) (14).

En omfattande mängd olika kemikalier har testats vid den validering som ligger till grund för denna testmetod och valideringsstudiens empiriska databas uppgick till totalt 152 kemikalier, inklusive 72 ämnen och 80 blandningar (5). Testmetoden är tillämplig på fasta ämnen, vätskor, emulsioner och geler. Vätskorna kan vara vattenbaserade eller icke-vattenbaserade och de fasta ämnena kan vara vattenlösliga eller icke-vattenlösliga. Gaser och aerosoler har ännu inte bedömts genom valideringsstudier.

ICE-testmetoden kan användas för att identifiera kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada, dvs. kemikalier som klassificeras som GHS-kategori 1 (4). När den används för detta syfte baserar de identifierade begränsningarna för ICE-testmetoden sig på höga falska positiva värden för alkoholer och höga falska negativa värden för fasta ämnen och ytaktiva ämnen (1) (3) (9). Falska negativa värden är dock inte kritiska i detta sammanhang (GHS-kategori 1, identifierade som inte tillhörande GHS-kategori 1), eftersom alla testkemikalier som ger ett negativt resultat därefter testas med andra lämpligt validerade in vitro-test och som ett sista alternativ på kaniner, beroende på kraven i tillämpliga bestämmelser, med tillämpning av en strategi med stegvis testning enligt principen om sammanvägd bedömning Det bör noteras att fasta ämnen kan leda till varierande och extrema exponeringsförhållanden i Draizes ögonirritationstest in vivo, vilket i sin tur kan leda till irrelevanta förutsägelser om ämnets verkliga irritationspotential (15). Forskare kan överväga att använda denna testmetod för alla kemikalier. I ett sådant fall bör ett positivt resultat godtas som en indikation allvarlig ögonskada, dvs. klassificering i GHS-kategori 1 utan ytterligare testning. Positiva resultat från test med alkoholer bör dock tolkas försiktigt på grund av risken för överprediktion.

När ICE-testmetoden används för att identifiera kemikalier som ger upphov till allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1) har den en övergripande noggrannhet på 86 % (120/140), ett falskt positivt värde på 6 % (7/113) och ett falskt negativt värde på 48 % (13/27) jämfört med in vivo-testning på kaninögon enligt klassificeringssystemet GHS (4) (5).

ICE-testmetoden kan också användas för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada enligt GHS-klassificeringssystemet (4). Berörda tillsynsmyndigheter bör rådfrågas innan man använder ICE-metoden inom ramen för en botten-upp-strategi enligt andra klassificeringssystem. Denna testmetod kan användas för alla typer av kemikalier, och ett negativt resultat kan godtas för att inte klassificera en kemikalie för ögonirritation och allvarlig ögonskada. På grundval av ett resultat från valideringsdatabasen kan organiska lösningsmedel med antifoulingeffekt som innehåller färg dock vara underskattade (5).

När ICE-testmetoden används för att identifiera kemikalier som inte kräver klassificering för ögonirritation och allvarlig ögonskada har de en övergripande noggrannhet på 82 % (125/152), ett falskt positivt värde på 33 % (26/79) och ett falskt negativt värde på 1 % (1/73) jämfört med data från metoden för in vivo-testning på kaninögon enligt GHS (4) (5). När testkemikalier inom vissa klasser (t.ex. organiska lösningsämnen med antifoulingeffekt som innehåller färg) undantas från databasen har ICE-testmetoden en noggrannhet på 83 % (123/149), ett falskt positivt värde på 33 % (26/78) och ett falskt negativt värde på 0 % (0/71) enligt GHS (4) (5).

ICE-testmetoden rekommenderas inte för identifiering av testkemikalier som bör klassificeras som irriterande för ögonen (dvs. GHS-kategori 2 eller 2A) eller testkemikalier som bör klassificeras som måttligt irriterande för ögonen (GHS-kategori 2b), eftersom det finns ett stort antal kemikalier i GHS-kategori 1 som är underklassificerade som GHS-kategori 2, 2A eller 2B medan andra kemikalier i GHS-kategorin Ingen klassificering är överklassificerade som GHS-kategori 2, 2A eller 2B. Därför kan det krävas ytterligare testning med en annan passande metod.

Alla förfaranden som omfattar ögon från kycklingar bör respektera testningslaboratoriets tillämpliga regler och förfaranden för hantering av material som kommer från människor eller djur, omfattande men inte begränsat till vävnader och vävnadsvätskor. Likaså rekommenderas allmänna försiktighetsåtgärder för laboratorier (16).

ICE-testmetoden beaktar inte skador på ögats bindhinna (konjunktiva) eller iris, vilka utvärderas enligt testmetoden för öronirritation hos kaniner, men däremot skador på hornhinnan, som är den viktigaste in vivo-klassificeringen med avseende på FN:s GHS-klassificering. Dessutom gäller att även om reversibiliteten hos hornhinneskador i sig inte kan utvärderas vid ICE-test, har det på grundval av studier av kaninögon föreslagits att en bedömning av det initiala djupet för hornhinneskada kan användas för att identifiera vissa typer av irreversibla effekter (17). Det krävs i synnerhet ytterligare vetenskaplig kunskap för att man ska kunna förstå hur irreversibla effekter som inte är kopplade till en initialt allvarlig skada kan uppstå. Slutligen gäller att ICE inte ger möjlighet att bedöma potentialen för systemisk toxicitet associerad med okulär exponering.

Denna testmetod kommer att uppdateras regelbundet allteftersom ny information och data övervägs. Till exempel kan histopatologi vara potentiellt användbart när det behövs en mer fullständig karakterisering av skador på hornhinnan. För att utvärdera denna möjlighet uppmuntras användarna att bevara ögon och bereda histopatologiska prover som kan användas för att utveckla en databas och beslutskriterier för att ytterligare förbättra metodens noggrannhet. OECD har tagit fram ett vägledningsdokument om användning av okulära toxicitetsmetoder in vivo, som innehåller detaljerade förfaranden om insamling av histopatologiska prover och information om var prover och/eller histopatologiska data ska lämnas in (8).

Laboratorier som tar denna testmetod i bruk för första gången bör använda de kvalifikationskemikalier som förtecknas i tillägg 2. Ett laboratorium kan använda dessa kemikalier för att påvisa sin tekniska kompetens att genomföra ICE-testmetoden innan laboratoriet lämnar in ICE-testdata avsedda för lagstadgad faroklassificering.

TESTPRINCIP

ICE-testmetoden är en organotypisk modell enligt vilken kycklingögon under kort tid bibehåller normal fysiologisk och biokemisk funktion in vitro. Med denna testmetod utvärderas den skada som framkallats av testkemikalien genom bestämning av hornhinnans svullnad, opacitet och fluoresceinfärgning. De två senare parametrarna bedöms kvalitativt medan analysen av hornhinnans svullnad görs kvantitativt. Varje mätning konverteras till ett kvantitativt värde som används för att kalkylera ett övergripande irritationsindex eller för att tilldela en kvalitativ kategorisering som används för att fastställa en klassificering in vitro av kemikalier som är farliga för ögonen, antingen som GHS-kategori 1 eller GHS ingen klassificering. Dessa resultat kan sedan användas för att förutsäga risken för allvarlig ögonskada in vivo eller om testkemikalien inte behöver klassificeras som farlig för ögonen (se beslutskriterierna). Kemikalier som inte förutsägs orsaka allvarlig ögonskada eller inte klassificeras med ICE-testmetoden kan dock inte klassificeras (se punkt 11).

Källa och ålder för kycklingögon

I regel används ögon tillvaratagna från kycklingar som kommer från ett slakteri där de avlivats för användning som livsmedel, vilket eliminerar behovet av försöksdjur. Endast ögon från friska djur som anses lämpliga för livsmedelskedjan får användas.

Det har inte gjorts någon kontrollerad undersökning för att utvärdera optimal ålder för kycklingarna för testmetoden, men i regel används kycklingar som slaktats på vanligt sätt i ett fjäderfäslakteri (cirka 7 veckor gamla, 1,5–2,5 kg).

Tillvaratagande och transport av ögon till laboratoriet

Kycklingarnas huvuden ska avlägsnas omedelbart efter bedövning (i regel med elchock) med snitt i halsen för blödning. Kycklinghuvudena bör komma från en lokal källa nära laboratoriet så att de tillräckligt snabbt kan transporteras från slakteriet till laboratoriet för att minimera risken för skador och/eller bakterieförorening. Tidsintervallet mellan tillvaratagandet av kycklinghuvudena och placeringen av ögonen i superfusionsapparatens kammare efter isolering bör minimeras (i regel högst två timmar) för att säkerställa att försökskriterierna är uppfyllda. Alla ögon som används för testning bör komma från samma grupp av ögon som har tillvaratagits på en viss dag.

Ögonen avlägsnas i laboratoriet, och de orörda kycklinghuvudena ska därför transporteras från slakteriet vid rumstemperatur(normalt 18–25 °C) i plastlådor som fuktas med pappershanddukar indränkta i fysiologisk koksaltlösning.

Urvalskriterier och antal ögon som används för ICE-test

Ögon med högt grundvärde för fluoresceinfärgning (> 0,5) eller korneal opacitet (> 0,5) efter tillvaratagandet ska förkastas.

Varje behandlingsgrupp med parallell positiv kontroll består av minst tre ögon. Den negativa kontrollgruppen eller lösningsmedelskontrollen (om annat lösningsmedel än saltlösning används) ska bestå av minst ett öga.

När det gäller fasta material som leder till ett GHS NC-resultat rekommenderas en andra provomgång för att bekräfta eller avvisa det negativa resultatet.

FÖRFARANDE

Förberedelse av ögonen

Ögonlocken skärs bort försiktigt med undvikande av skador på hornhinnan. Hornhinnans intakta skick kan utvärderas snabbt med en droppe 2 % natriumfluorescein (vikt/volym) som appliceras på hornhinnans yta för några sekunder och därefter sköljs bort med fysiologisk koksaltlösning. De fluoresceinbehandlade ögonen undersöks därefter med spaltlampa för att kontrollera att hornhinnan är intakt (värdet för fluoresceinfärgning och korneal opacitet ≤ 0,5).

Förutsatt att hornhinnan är intakt skärs ögat ut från skallen med varsamhet så att hornhinnan inte skadas. Ögongloben dras ut ur ögonhålan med ett stadigt grepp om blinkhinnan med hjälp av kirurgisk tång och ögonmusklerna klipps av med en böjd trubbig sax. Det är viktigt att greppet om hornhinnan inte är så starkt att det uppstår skador (t.ex. kompressionsartefakter).

När ögat har tagits ut ur hålan bör det finnas kvar en vidfäst synlig del av synnerven. Därefter placeras ögat på ett absorberande underlag och blinkhinnan och annan bindvävnad skärs bort.

Därefter monteras ögat i en klämma av rostfritt stål med hornhinnan i upprätt riktning. Klämman med ögat överförs till superfusionsapparaten (18). Klämmorna ska placeras i superfusionsapparaten så att droppet med fysiologisk koksaltlösning når hela hornhinnan (3–4 droppar per minut eller 0,1–0,15 ml/min.). Superfusionsapparatens kammare ska ha en kontrollerad temperatur på 32 ± 1,5 °C. I tillägg 3 finns en schematisk bild av en typisk superfusionsapparat med ögonklämmor. Utrustningen kan anskaffas kommersiellt eller konstrueras i laboratoriet. Apparaten kan också anpassas efter behoven vid ett enskilt laboratorium (t.ex. för att hålla ett avvikande antal ögon).

Efter att ögonen placerats i superfusionsapparaten granskas de på nytt med spaltlampa för att kontrollera att de inte har fått skador under dissektionen. Samtidigt ska även hornhinnans tjocklek mätas vid hornhinnans apex med hjälp av spaltlampans tillbehör för djupmätning. Ögon som har i) fluoresceinfärgningsvärde > 0,5, ii) värde för korneal opacitet > 0,5 eller iii) andra tecken på skada ska bytas ut. Ögon som inte har förkastats enligt något av dessa kriterier men där hornhinnans tjocklek avviker mer än 10 % från medelvärdet för alla ögon ska förkastas. Det är viktigt att vara medveten om att spaltlampan kan ge olika värden på hornhinnans tjocklek beroende på inställningen för spaltbredd. Spaltbredden ska ställas in på 0,095 mm.

Undersökta och godkända ögon inkuberas i cirka 45–60 minuter för att få dem i jämvikt med testsystemet före doseringen. Efter jämviktsperioden görs en referensmätning av hornhinnans tjocklek och opacitet för att få ett grundvärde (tid = 0). Fluoresceinvärdet som uppmättes vid dissektionen används som grundvärde för denna endpoint.

Applicering av testkemikalien

Omedelbart efter mätningarna av nollreferens tas ögonen (i sina hållare) bort ur superfusionsapparaten, placeras i liggande läge och testkemikalien appliceras på hornhinnan.

Vätskeformiga testkemikalier används i regel i outspädd form men kan spädas ut om det bedöms vara nödvändigt (t.ex. som en del av försöksutformningen). Eventuell utspädning ska helst göras med fysiologisk koksaltlösning. Andra lösningsmedel än fysiologisk koksaltlösning kan användas under kontrollerade förhållanden men då bör lämpligheten påvisas.

Vätskeformiga testkemikalier appliceras på hornhinnan så att hela ytan är jämnt täckt med testkemikalien (standardvolymen är 0.03 ml).

Fasta testkemikalier ska så långt det är möjligt finfördelas i mortel eller motsvarande redskap. Pulvret appliceras så att hornhinnan blir jämnt täckt med testkemikalien. Standardmängden är 0,03 g.

Testkemikalien (vätska eller fast ämne) får verka på hornhinnan i 10 sekunder och sköljs sedan bort från ögat med rumstempererad fysiologisk koksaltlösning (cirka 20 ml). Ögat (i sin hållare) återförs därefter till superfusionsapparaten i ursprunglig upprätt position. Vid behov kan en ytterligare sköljning göras efter 10 sekunders applicering och vid olika tidpunkter därefter (t.ex. om man upptäcker rester av testkemikalien på hornhinnan). I regel är den mängd saltlösning som används för sköljning inte en kritisk faktor, men det är viktigt att kontrollera att kemikalien fäster vid hornhinnan.

Kontrollkemikalier

Parallella negativa kontroller eller lösningsmedels-/vehikelkontroller och positiva kontroller ska ingå i varje försök.

Vid testning av outspädda vätskor eller fasta ämnen med ICE-testmetoden ska fysiologisk koksaltlösning användas som parallell negativ kontroll för att upptäcka icke-specifika ändringar i testsystemet och för att säkerställa att testningsförhållandena inte i onödan framkallar irritation.

Vid testning av utspädda vätskor ska en parallell negativ kontrollgrupp för lösningsmedel/vehikel inbegripas för att upptäcka icke-specifika ändringar i testsystemet och för att säkerställa att testningsförhållandena inte i onödan framkallar irritation. Som det konstateras i punkt 31 får endast lösningsmedel/vehikel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet användas.

Ett känt ögonirriterande ämne ska ingå som parallell positiv kontroll i varje försök för att bekräfta att rätt slags respons framkallas. Eftersom ICE används i denna testmetod för att identifiera frätande eller kraftigt irriterande ämnen, ska den positiva kontrollen göras med en referenskemikalie som framkallar kraftig respons. För att säkerställa att den positiva kontrollresponsens variationer över tiden kan bedömas, bör den kraftiga irritation som framkallas inte vara för stark. Tillräckliga in vitro-data bör genereras för den positiva kontrollen så att det går att beräkna ett godtagbart intervall för denna. Om det inte finns tillbörliga historiska ICE-testmetodsdata för en särskild positiv kontroll måste man eventuellt genomföra försök för att få fram denna information.

Exempel på positiva kontroller för vätskeformiga testkemikalier är 10 % ättiksyra eller 5 % bensalkoniumklorid, och exempel på positiva kontroller för fasta testkemikalier är natriumhydroxid eller imidazol.

Referenskemikalier kan användas för utvärdering av förmågan att framkalla ögonirritation hos okända kemikalier tillhörande en specifik kemisk klass eller produktklass, eller för utvärdering av den relativa irritationspotentialen hos ett ögonirriterande ämne inom ett specifikt responsområde.

Mätning av endpoints

Hornhinnorna utvärderas före behandlingen och vid 30, 75, 120, 180 och 240 minuter (± 5 minuter) efter den sköljning som görs efter behandlingen. Dessa tidpunkter ger ett tillbörligt antal mätningar under den fyra timmar långa behandlingsperioden och ger tillräckligt med tid mellan mätningarna för att genomföra observationerna av alla ögon.

De endpoints som ska bedömas är korneal opacitet, svullnad, fluoresceinfärgning och morfologiska effekter (t.ex. gropbildning eller avlossning av epitel). Alla endpoints, med undantag av fluoresceinfärgning (som endast bestäms före behandlingen och 30 minuter efter exponering av testkemikalien) bestäms vid alla de ovan nämnda tidpunkterna.

Fotografier rekommenderas för dokumentering av korneal opacitet, fluoresceinfärgning, morfologiska verkningar och, i förekommande fall, histopatologi.

Efter den sista granskningen vid tidpunkten fyra timmar är det rekommendabelt att hålla ögonen i lämpligt konserveringsmedel (t.ex. neutralt formalin med buffert) med tanke på eventuell histopatologisk undersökning (se punkt 14 och hänvisning 8 för närmare uppgifter).

Hornhinnans svullnad bestäms genom mätningar av hornhinnans tjocklek med en pachymeter eller spaltlampa. Svullnaden uttrycks som ett procenttal och beräknas på grundval av mätningarna enligt följande formel:

Formula

Medelvärdet för hornhinnans svullnad för alla testögon beräknas för alla observationstidpunkter. Det högsta medelvärdet för svullnad oavsett observationstidpunkt används som grund för en övergripande kategorisering av testkemikalien (se punkt 51).

Den korneala opaciteten utvärderas på grundval av mätningarna på det område av hornhinnan som har den tätaste opaciteten enligt tabell 1. Medelvärdet för den korneala opaciteten för alla testögon beräknas för alla observationstidpunkter. Det högsta medelvärdet för korneal opacitet oberoende av tidpunkt används som grund för en övergripande kategorisering av testkemikalien (se punkt 51).

Tabell 1

Värden för korneal opacitet.

Gradering

Observation

0

Ingen opacitet.

0,5

Mycket svag opacitet.

1

Spridda eller diffusa områden med opacitet, alla detaljer i iris är klart synliga.

2

Enkelt skönjbart translucent område, detaljerna i iris är lätt förmörkade.

3

Kraftig korneal opacitet, inga detaljer i iris är synliga, pupillens storlek kan knappat urskiljas.

4

Fullständig korneal opacitet, iris syns inte.

Fluoresceinfärgningen utvärderas efter 30 minuters observationstid enligt tabell 2. Medelvärdet för fluoresceinfärgning för alla testögon beräknas därefter för observationstidpunkten 30 minuter och används för övergripande kategorivärde som ges för varje testkemikalie (se punkt 51).

Tabell 2

Värden för fluoresceinfärgning.

Gradering

Observation

0

Ingen fluoresceinfärgning.

0,5

Mycket svag färgning av enskilda celler.

1

Färgning av enskilda celler spridda över hornhinnans behandlade yta.

2

Fokal eller konfluent tät färgning av enskilda celler.

3

Konfluenta stora områden av hornhinnan har färgats av fluorescein

Till de morfologiska effekterna hör gropbildning i hornhinnans epitel, avlossning av epitel, uppruggning av hornhinnans yta och vidfästning av testkemikalien vid hornhinnan. Dessa observationer kan ha olika allvarlighetsgrad och kan förekomma samtidigt. Klassificeringen av observationerna är subjektiva och beror på personlig tolkning.

DATA OCH RAPPORTERING

Utvärdering av data

Resultaten för korneal opacitet, svullnad och fluoresceinfärgning bör utvärderas separat för att ge en ICE-klass för varje endpoint. ICE-klasserna för varje endpoint kombineras därefter, så att man får en klassificering av varje testkemikalie med avseende på irritationsframkallande egenskaper.

Beslutskriterier

Efter att varje endpoint har utvärderats kan ICE-klasser tilldelas i enlighet med en på förhand fastställd skala. Tolkningen av hornhinnans svullnad (tabell 3), opacitet (tabell 4) och fluoresceinfärgning (tabell 5) med användning av fyra ICE-klasser görs enligt de skalor som visas nedan. Det är viktigt att notera att de värden för hornhinnans svullnad som anges i tabell 3 endast gäller om tjockleken mäts med en spaltlampa (t.ex. Haag-Streit BP900) med djupmätanordning nr 1 och spaltbredd på 9Formula, motsvarande 0,095 mm. Det är viktigt att vara medveten om att spaltlampan kan ge olika värden på hornhinnans tjocklek beroende på inställningen för spaltbredd.

Tabell 3

ICE-klassificeringskriterier för hornhinnans svullnad.

Medelvärde för svullnad (%) (*2)

ICE-klass

0 till 5

I

> 5 till 12

II

> 12 till 18 (> 75 min. efter behandling)

II

> 12 till 18 (≤ 75 min. efter behandling)

III

> 18 till 26

III

> 26 till 32 (> 75 min. efter behandling)

III

> 26 till 32 (≤ 75 min. efter behandling)

IV

> 32

IV


Tabell 4

ICE-klassificeringskriterier för opacitet.

Medelvärde för högsta opacitet (*3)

ICE-klass

0,0–0,5

I

0,6–1,5

II

1,6–2,5

III

2,6–4,0

IV


Tabell 5

ICE-klassificeringskriterier för fluoresceinfärgning.

Medelvärde för fluoresceinfärgning 30 minuter efter behandlingen (*4)

ICE-klass

0,0–0,5

I

0,6–1,5

II

1,6–2,5

III

2,6–3,0

IV

Testkemikaliens övergripande klassificering in vitro bedöms genom avläsning av den GHS-klassificering som motsvarar kombinationen av kategorier för hornhinnan i fråga om svullnad, korneal opacitet och fluoresceinfärgning enligt beskrivningen i tabell 6.

Tabell 6

Övergripande in vitro-klassificeringar.

Klassificering enligt FN GHS

Kombinationer av tre endpoints

Ingen klassificering

3 × I

2 × I, 1 × II

Ingen förutsägelse kan göras

Andra kombinationer

Kategori 1

3 × IV

2 × IV, 1 × III

2 × IV, 1 × II (*5)

2 × IV, 1 × I (*5)

Korneal opacitet ≥ 3 vid 30 min. (minst två ögon)

Korneal opacitet = 4 oavsett tidpunkt (minst två ögon)

Kraftig avlossning av epitel (minst ett öga)

Kriterier för godkännande av ett försök

Testet anses godtagbart om de parallella negativa kontrollerna eller vehikel-/lösningsmedelskontrollerna och de parallella positiva kontrollerna identifieras som GHS ingen klassificering respektive GHS-kategori 1.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter i den mån de är relevanta:

 

Testkemikalie och kontrollkemikalier

Kemisk beteckning såsom den strukturella beteckning som används i Chemical Abstracts Service (CAS) och eventuella andra kända beteckningar

CAS-registernummer (RN), om det är känt.

Test-/kontrollkemikaliens renhet och sammansättning (viktprocent) i den mån uppgifterna finns att tillgå.

Fysikalisk-kemiska egenskaper, t.ex. fysikaliskt tillstånd, flyktighet, pH, stabilitet, kemisk klass och vattenlöslighet, i den mån de är relevanta.

Behandling av test-/kontrollämnen före testning, om detta är tillämpligt (t.ex. uppvärmning, finfördelning).

Stabilitet, om den är känd.

 

Uppgifter om sponsor och testanläggning

Namn och adress för sponsor, testanläggning och försöksledare.

Angivelse av ögonkällan (t.ex. den anläggning där ögonen togs till vara).

 

Testmetodens betingelser

Beskrivning av testsystemet.

Spaltlampa (t.ex. modell) och instrumentinställningar för detta.

Hänvisning till historiska negativa och positiva kontrollresultat och, i förekommande fall, historiska data som visar godtagbara parallella intervaller för referenskontroller.

Det förfarande som används för att säkerställa testmetodens integritet (dvs. noggrannhet och tillförlitlighet) över tiden (t.ex. periodisk testning med kvalifikationskemikalier).

 

Insamling och förberedelse av ögon

Ålder och vikt för djuren och om möjligt, andra specifika egenskaper för de djur från vilka ögonen togs till vara.

Lagrings- och transportförhållanden för ögonen (t.ex. datum och tidpunkt för insamling, tidsintervall mellan insamling av kycklinghuvuden och placering av de isolerade ögonen i superfusionskammaren).

Förberedelse och montering av de ögon som använts, inbegripet utlåtanden om deras kvalitet, temperatur för ögonkammare samt urvalskriterier för de ögon som valts ut för testning.

 

Testförfarande

Antal använda replikat.

Uppgift om använda negativa och positiva kontroller (i förekommande fall även lösningsmedel och referenskontroller).

Testkemikaliens dos, applicering och exponeringstid.

Observationstidpunkter (före och efter behandling).

Beskrivning av utvärderings- och beslutskriterierna.

Beskrivning av acceptanskriterierna för undersökningen.

Beskrivning av eventuella modifieringar av försöksförfarandet.

 

Resultat

Data i tabellform över värden för svullnad av hornhinnan, opacitet och fluoresceininfärgning som erhållits för varje öga vid varje observationstidpunkt, inklusive medelvärden vid varje observationstidpunkt för samtliga testade ögon.

Det högsta observerade medelvärdet för svullnad av hornhinnan, opacitet och fluoresceininfärgning (vid alla tidpunkter) samt relaterad ICE-klass.

Beskrivning av eventuella andra observerade verkningar.

Härledd in vitro GHS-klassificering.

Fotografier av ögat, om det är lämpligt.

 

Diskussion av resultaten.

 

Slutsats

LITTERATUR

(1)

ICCVAM (2007. Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Finns på http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm

(2)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Finns på http://ecvam.jrc.it/index.htm.

(3)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Finns på http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(4)

Förenta nationerna (FN) (2011). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), fjärde reviderade utgåvan, FN New York och Genève, 2011. Finns på http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.

(5)

Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment nr 188 (del 1 och 2), OECD, Paris.

(6)

Kapitel B.5 i denna bilaga, Akut ögonirritation/korrosion.

(7)

Scott L., Eskes C., Hoffman S., Adriaens E., Alepee N., Bufo M., Clothier R., Facchini D., Faller C., Guest R., Hamernik K., Harbell J., Hartung T., Kamp H., Le Varlet B., Meloni M., Mcnamee P., Osborn R., Pape W., Pfannenbecker U., Prinsen M., Seaman C., Spielmann H., Stokes W., Trouba K., Vassallo M., Van den Berghe C., Van Goethem F., Vinardell P., Zuang V. (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches. Toxicology In Vitro 24, 1–9.

(8)

OECD (2011) Guidance Document on ”The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants”. Series on Testing and Assessment nr 160, OECD, Paris.

(9)

ICCVAM. (2006). Background review document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Finns på http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm.

(10)

Prinsen, M.K. och Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69–76.

(11)

DB-ALM (INVITTOX) (2009). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET) / Isolated Chicken Eye Test, 13pp. Finns på http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. och Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871–929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291–296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. och Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23–37.

(15)

Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology in Vitro 20,78–81.

(16)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L. och Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Finns på http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf.

(17)

Maurer, J.K., Parker, R.D. och Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106–117.

(18)

Burton, A.B.G., M. York och R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.Toxicol.– 19, 471–480.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Noggrannhet : Ett mått på hur väl testmetodresultaten och de godtagna referensvärdena överensstämmer med varandra. Den är ett mått på testmetodens prestanda och relevansaspekt. Detta begrepp används ofta omväxlande med ”konkordans” för att beskriva andelen korrekta resultat med en testmetod (38).

Referenskemikalie : En kemikalie som används som en standard för jämförelse med en testkemikalie. En referenskemikalie bör ha följande egenskaper: i) en eller flera enhetliga och tillförlitliga källor, ii) strukturell och funktionell likhet med den ämnesklass som testas, iii) kända fysikalisk-kemiska egenskaper, iv) stödjande data om kända effekter och v) känd styrka inom det önskade responsområdet.

Botten-upp-strategi : stegvis metod som tillämpas på kemikalier som inte tros kräva klassificering för ögonirritation eller allvarlig ögonskada. Det första steget är att skilja kemikalier som inte behöver klassificeras (negativt utfall) från andra kemikalier (positivt utfall).

Kemikalie : ett ämne eller en blandning.

Hornhinna (kornea) : den transparenta delen på ögonglobens framsida som täcker iris och pupillen och släpper igenom ljus in i ögat.

Korneal opacitet : mått för den grad av opacitet som hornhinnan har efter exponering för en testkemikalie. Ökad korneal opacitet tyder på skador på hornhinnan.

Svullnad av hornhinnan : en objektiv mätning vid ICE-test av hur mycket hornhinnan sväller efter exponering för en testkemikalie. Den uttrycks som ett procenttal och beräknas utifrån ett grundvärde som fås vid mätning av hornhinnans tjocklek före exponering och den tjocklek som uppmäts med regelbundna intervaller efter exponering för testkemikalien. Graden av svullnad är en indikation på skadan på hornhinnan.

Ögonirritation : Ändringar som uppstår i ögat efter applicering av testkemikalien på ögats främre yta och som inte är fullt reversibla inom 21 dagar från appliceringen. Utbytbart mot ”Reversibla effekter på ögat” och ”GHS kategori 2” (4).

Falskt negativt värde : den andel av alla positiva ämnen som av en testmetod felaktigt identifieras som negativ. Det är en indikator på testmetodens prestanda.

Falskt positivt värde : den andel av alla negativa (icke-aktiva) ämnen som av en testmetod felaktigt identifieras som positiva. Det är en indikator på testmetodens prestanda.

Fluoresceinfärgning: : en subjektiv mätning vid ICE-test av den mängd natriumfluorescein som hornhinnans epitelceller håller kvar efter exponering för ett testämne. Mängden fluorescein som hålls kvar är en indikation på skada på hornhinnan.

Fara : inneboende egenskap hos ett ämne eller en situation som har potential att orsaka skadliga effekter när en organism, ett system eller en (del)population exponeras för ämnet.

Irreversibla effekter på ögat : se ”Allvarlig ögonskada” och ”GHS kategori 1”.

Blandning : En blandning eller en lösning som består av två eller flera ämnen i vilken de inte reagerar (4)

Negativ kontroll : ett obehandlat replikat som innehåller alla komponenter i ett testsystem. Detta prov hanteras tillsammans med testkemikaliebehandlade prover och andra kontrollprover för att avgöra huruvida lösningsmedlet påverkar testsystemet.

Ej klassificerad : Ämnen som inte är klassificerade som ögonirriterande (GHS-kategori 2) eller för allvarlig ögonskada (GHS-kategori 1). Utbytbart mot ”GHS Ingen klassificering”.

Positiv kontroll : ett replikat som innehåller testsystemets alla komponenter och behandlas med en kemikalie som veterligen inducerar positiv respons. För att säkerställa att den positiva kontrollresponsens variationer kan bedömas över tiden, bör den kraftiga irritation som framkallas inte vara för stark.

Tillförlitlighet : mått på i vilken utsträckning en testmetod kan reproduceras inom och mellan laboratorier över tiden när den utförs med hjälp av samma protokoll. Tillförlitligheten bedöms genom att man beräknar reproducerbarheten inom och mellan laboratorier och repeterbarheten inom laboratorier.

Irreversibla effekter på ögat : se ”Ögonirritation” och ”GHS kategori 2”.

Allvarliga ögonskador : vävnadsskada i ögat eller kraftig synnedsättning som uppstår efter applicering av en testkemikalie på ögats främre yta och som inte är fullt reversibel inom 21 dagar från appliceringen (2). Utbytbart mot ”Irreversibla effekter på ögat” och ”GHS kategori 1” (4).

Spaltlampa : ett instrument som används för direkt undersökning av ögat under förstoring genom ett binokulärt mikroskop och som visar en stereoskopisk, topografisk bild. Vid ICE-test används instrumentet för att granska kycklingögats främre struktur och för objektiv mätning av hornhinnans tjocklek med tillbehöret för mätning av djup.

Lösningsmedels-/vehikelkontroll : ett obehandlat prov som innehåller testsystemets alla komponenter, inbegripet lösningsmedlet eller vehikeln som behandlas tillsammans med testkemikaliebehandlade prover och andra kontrollprover i syfte att fastställa bakgrundsrespons för de prover som behandlas med testkemikalien upplöst i samma lösningsmedel eller vehikel. När detta prov testas med en parallell negativ kontroll, visar provet också huruvida lösningsmedlet eller vehikeln påverkar testsystemet.

Ämne : kemiska grundämnen och deras föreningar i naturlig eller framställd form, inklusive eventuella tillsatser nödvändiga för att bevara produktens stabilitet och sådana föroreningar som härrör från framställningsprocessen, men exklusive eventuella lösningsmedel som kan avskiljas utan att det påverkar ämnets stabilitet eller ändrar dess sammansättning (4).

Ytaktivt ämne : Ett ämne, såsom ett rengöringsmedel, som kan minska en vätskas ytspänning så att lödder bildas eller fasta ämnen penetrerar. Även kallat tensid eller vätmedel.

Uppifrån och ned-strategi : stegvis metod som tillämpas på kemikalier som misstänks orsaka allvarlig ögonskada. Det första steget är att skilja kemikalier som inducerar allvarlig ögonskada (positivt utfall) från andra kemikalier (negativt utfall).

Testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Stegvis testningsstrategi : en strategi för stegvis testning där all befintlig information om en testkemikalie granskas i en angiven ordning, med användning av förfarandet med sammanvägd bedömning (weight of evidence) för att avgöra om det finns tillräckligt med information till hands för att besluta om faroklassificering innan man går vidare till nästa steg. Om testkemikaliens förmåga att framkalla irritation kan fastställas på grundval av befintlig information behövs ingen ytterligare testning. Om testkemikaliens förmåga att framkalla irritation inte kan fastställas på grundval av befintlig information genomförs ett stegvis sekventiellt djurförsöksförfarande tills att det går att fastställa en otvetydig klassificering.

GHS (globalt harmoniserat system för klassificering och märkning av kemikalier : ett system för att klassificera ämnen och blandningar enligt standardiserade typer och nivåer av fysiska risker, hälsorisker och miljörisker och informera om resultaten genom t.ex. piktogram, signalord, faroangivelser, skyddsangivelser och säkerhetsdatablad i syfte att informera om ämnenas skadliga effekter för att skydda personer (inklusive arbetsgivare, arbetstagare, transportörer, konsumenter och personal inom räddningstjänsten) och miljön (4).

GHS-kategori 1 : se ”Allvarlig ögonskada” och/eller ”irreversibla effekter på ögat”.

GHS-kategori 2 : se ”Ögonirritation” och eller ”Reversibla effekter på ögat”.

GHS Ingen kategori : Ämnen som inte uppfyller kraven för att klassificeras som GHS-kategori 1 eller 2 (2A eller 2B). Utbytbart mot ”Ej klassificerad”.

Validerad testmetod : en testmetod för vilken valideringsstudier har genomförts för att fastställa relevans (inbegripet noggrannhet) och tillförlitlighet för ett specifikt ändamål. Det är viktigt att notera att en validerad testmetod kanske inte är tillräckligt noggrann och tillförlitlig när det gäller ett visst föreslaget ändamål.

Sammanvägd bedömning : (weight of evidence) ett förfarande där man bedömer styrkor och svagheter hos flera uppgifter för att nå fram till och motivera en slutsats rörande en kemikalies faropotential.

Tillägg 2

KVALIFIKATIONSÄMNEN FÖR ICE-TESTMETODEN

Före rutinanvändning av ett test som följer denna testmetod bör laboratoriet påvisa den tekniska kvaliteten genom att korrekt identifiera klassificeringen av kemikalier som är farliga för ögonen för de 13 kemikalier som rekommenderas i tabell 1. Dessa ämnen har valts ut att representera responsskalan för ämnen som är farliga för ögonen enligt resultaten från in vivo-test på kaninögon (TG 405) och FN:s GHS-klassificieringssystem (dvs. GHS-kategorierna 1, 2A, 2B eller ingen klassificering) (4)(6). Till övriga kriterier hör att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att det finns tillgång till in vivo-referensdata av hög kvalitet och att det finns data av hög kvalitet från ICE-testmetoden in vitro. Referensdata finns i SSD (5) och i ICCVAM Background Review Document för ICE-testmetoden (9).

Tabell 1

Rekommenderade kemikalier för att påvisa teknisk kvalitet med ICE-testmetoden

Kemikalie

CASRN

Kemisk klass (13)

Fysikalisk form

In vivo-klassificering (14)

In vitro-klassificering (15)

Bensalkoniumklorid (5 %)

8001-54-5

Oniumförening

Vätska

Kategori 1

Kategori 1

Klorhexidin

55-56-1

Amin, amidin

Fast ämne

Kategori 1

Kategori 1

Dibensoyl-L-tartarsyra

2743-38-6

Karboxylsyra, ester

Fast ämne

Kategori 1

Kategori 1

Imidazol

288-32-4

Heterocyklisk förening

Fast ämne

Kategori 1

Kategori 1

Triklorättiksyra (30 %)

76-03-9

Karboxylsyra

Vätska

Kategori 1

Kategori 1

2,6-Diklorbensoylklorid

4659-45-4

Acylhalid

Vätska

Kategori 2A

Inga förutsägelser kan göras (16)

Ammoniumnitrat

6484-52-2

Oorganiskt salt

Fast ämne

Kategori 2A (17)

Inga förutsägelser kan göras (16)

Etyl-2-metylacetoacetat

609-14-3

Keton, ester

Vätska

Kategori 2B

Inga förutsägelser kan göras (16)

Dimetylsulfoxid

67-68-5

Organisk svavelförening

Vätska

Ingen klassificering

Ingen klassificering

Glycerol

56-81-5

Alkohol

Vätska

Ingen klassificering

Ingen klassificering (gränsfall)

Metylcyklopentan

96-37-7

Kolväte (cykliskt)

Vätska

Ingen klassificering

Ingen klassificering

n-hexan

110-54-3

Kolväte (acykliskt)

Vätska

Ingen klassificering

Ingen klassificering

Triacetin

102-76-1

Fett

Vätska

Inte klassificerad

Ingen klassificering

Förkortningar: CASRN = Chemical Abstracts Service Registry Number

Tillägg 3

SUPERFUSIONSAPPARAT OCH ÖGONKLÄMMOR FÖR ICE-TESTMETODEN

(Se Burton m.fl. (18) för ytterligare allmänna beskrivningar av superfusionsapparaten och ögonklämmorna) (18)

Image

Post nr

Beskrivning

Post nr

Beskrivning

1

Varmvattenutlopp

9

Fack

2

Skjutdörr

10

Ögonhållare

3

Superfusionsapparat

11

Kycklingöga

4

Optiskt mätinstrument

12

Utgående koksaltlösning

5

Ingående varmvatten

13

Ställskruv

6

Saltlösning

14

Justerbar överarm

7

Varmvatten

15

Fast underarm

8

Ingående koksaltlösning

 

(14)

I del B ska kapitel B.49 ersättas med följande:

”B.49   Mikrokärntest av däggdjursceller in vitro

INLEDNING

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 487 (2016). Den ingår i en serie testmetoder avseende genetisk toxikologi. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

Mikrokärntest in vitro (MNvit) är ett genotoxicitetstest för att upptäcka mikrokärnor i cytoplasmat i interfasceller. Mikrokärnor kan härröra från acentriska kromosomfragment (dvs. en centromer saknas) eller från hela kromosomer som inte kan migrera till polerna under det anafasa steget av celldelningen. MNvit-testet är en in vitro-metod som ger tillgång till en omfattande bas för undersökning av kromosomskadepotentialen in vitro eftersom både aneugener och klastogener kan upptäckas (2) (3) i celler som har genomgått celldelning under eller efter exponering för testkemikalien (närmare uppgifter ges i punkt 13). Mikrokärnorna representerar skador som har förmedlats till dotterceller, medan kromosomavvikelser som detekteras i metafasceller inte alltid förmedlas. Cellen överlever inte alltid dessa förändringar.

Denna testmetod ger möjlighet att använda protokoll med och utan aktinpolymeriseringsinhibitorn cytokalasin B (cytoB). Tillsättning av cytoB före mitosen gör det möjligt att identifiera och analysera mikrokärnor endast i celler som har slutfört en mitos eftersom sådana celler är binukleära (4) (5). Denna testmetod gör det också möjligt att använda protokoll utan blockering av cytokines, förutsatt att det finns belägg för att den analyserade cellpopulationen har genomgått mitos.

Utöver MNvit-testet för att identifiera kemikalier som inducerar mikrokärnor kan man även använda immunokemisk märkning av kinetokorer eller hybridisering med centromeriska/telomeriska prober (FISH-teknik, Fluorescens In Situ Hybridisation) för att få ytterligare information om mekanismerna för kromosomskador och bildningen av mikrokärnor (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Dessa märknings- och hybridiseringsförfaranden kan användas när det förekommer ökad bildning av mikrokärnor och man vill slå fast om ökningen är resultatet av klastogena och/eller aneugena händelser.

Eftersom mikrokärnor i interfasceller kan bedömas relativt objektivt behöver laboratoriepersonalen bara bestämma antalet binukleära celler om cytoB används. Förekomsten av celler med mikrokärnor i ska bestämmas samtliga fall. Detta innebär att utstryksglasen kan klassificeras relativt snabbt och analysen kan automatiseras. Det är därför praktiskt att klassificera tusentals i stället för hundratals celler per behandling, vilket ökar testets styrka. Eftersom mikrokärnor kan uppstå från isolerade kromosomer finns det också möjlighet att detektera aneuploidiframkallande ämnen som är svåra att undersöka genom konventionella kromosomavvikelsetest, t.ex. Kapitel B.10 i denna bilaga (18). MNvit-testet som det beskrivs i denna testmetod ger dock inte möjlighet att utan särskilda tekniker såsom FISH (se punkt 4) skilja mellan kemikalier som inducerar ändringar av kromosomantalet och/eller polyploidi från sådana kemikalier som inducerar klastogenicitet.

MNvit-testet är robust och kan utföras på ett flertal celltyper, med eller utan tillsats av cytoB. Det finns omfattande data som underbygger giltigheten av MNvit testet med användning av olika celltyper (odlingar av cellinjer eller primära cellkulturer) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Dessa data kommer bland annat från internationella valideringsstudier samordnade av Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (19) (20) (21) (22) (23) och rapporter från International Workshop on Genotoxicity Testing (5) (17). Tillgängliga data har också omvaliderats i en retrospektiv sammanvägd (weight-of-evidence) valideringsstudie vid Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM), och testmetoden har erkänts som vetenskapligt giltig av ECVAM:s vetenskapliga rådgivande kommitté (ESAC) (37) (38) (39).

MNvit-testet på däggdjursceller kan göras med kulturer av cellinjer eller primära cellkulturer från människor eller gnagare. Eftersom bakgrundsfrekvensen av mikrokärnor påverkar testets känslighet, rekommenderas att man använder celltyper med en stabil och definierad bakgrundsfrekvens av mikrokärnbildning. De celler som används bör väljas ut på grundval av god tillväxtförmåga vid odling, karyotypens stabilitet (inklusive antalet kromosomer) och den spontana frekvensen av mikrokärnor (40). De uppgifter som finns tillgängliga för närvarande tillåter inte bestämda rekommendationer, men de tyder på att det i utvärderingen av kemiska faror är viktigt att överväga p53-status, genetisk stabilitet (karyotyp) samt DNA-cellernas återhämtningskapacitet och ursprung (gnagare jämfört med människa) hos de celler som väljs ut för testning. Om denna testmetod används bör man överväga hur dessa och andra cellegenskaper inverkar på en cellinjes förmåga att upptäcka induktionen av mikrokärnor, allteftersom kunskapen utvecklas på detta område.

Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

För testning in vitro krävs i regel ett exogent system för metabolisk aktivering, om cellerna inte är metaboliskt kompetenta i fråga om de kemikalier som testas. Det exogena metaboliska aktiveringssystemet efterliknar inte helt förhållandena in vivo. Man bör se till att undvika sådana förhållanden som leder till artefaktiska positiva resultat som inte avspeglar testkemikaliernas gentoxicitet. Sådana förhållanden omfattar ändringar av pH (41) (42) (43) eller osmolalitet, interaktion med cellodlingsmediet (44) (45) eller överdrivet höga nivåer av cytotoxicitet (se punkt 29).

För analysen av induktion av mikrokärnor är det av central betydelse att mitos har inträffat i både de behandlade och obehandlade odlingarna. Det mest informativa stadiet för detektering av mikrokärnor är när cellerna har slutfört en mitos under eller efter behandling med testkemikalien. Tillverkade nanomaterial kräver särskilda anpassningar av testmetoden, men de beskrivs inte här.

Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.

TESTPRINCIP

Cellodlingar från människa eller andra däggdjur exponeras för testkemikalien både med och utan ett exogent metaboliskt aktiveringssystem, utom om de celler som används har tillräcklig metaboliserande kapacitet (se punkt 19).

Under eller efter exponering för testkemikalien odlas cellerna tillräckligt länge för att kromosomskador eller andra effekter på cellcykeln/celldelningen ska leda till att mikrokärnor bildas i interfascellerna. För induktion av aneuploidi bör testkemikalien i regel finnas närvarande under mitosen. Interfascellerna skördas och färgas in och närvaron av mikrokärnor analyseras. Idealiskt sett bör man för detekteringen av mikrokärnor endast använda celler som har slutfört mitosen under exponeringen för testkemikalien eller under perioden efter behandlingen, om en sådan används. I odlingar som har behandlats med en cytokinesinhibitor uppnås detta enkelt genom att endast analysera binukleära celler. Om blockering av cytokines inte används är det viktigt att påvisa att de analyserade cellerna sannolikt har genomgått celldelning, baserat på en ökning av cellpopulationen, under eller efter exponeringen för testkemikalien. Oavsett protokoll är det viktigt att påvisa att cellproliferation har skett både i kontrollodlingarna och de behandlade odlingarna, och omfattningen av testkemikalieinducerad cytotoxicitet eller cytostas ska bedömas i alla odlingar som är föremål för analys av mikrokärnor.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Celler

Man kan använda odlade primära perifera blodlymfocyter från människa eller andra däggdjur (7) (20) (46) (47) och celler från ett antal gnagarcellinjer såsom CHO, V79, CHL/IU och L5178Y (19) (20) eller humana cellinjer såsom TK6 (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (se punkt 6). Andra cellinjer, såsom HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), HepG2-celler (52) (53), A549 och primära embryoceller från syrisk hamster (54) har använts för testning av mikrokärnor, men har inte genomgått en omfattande validering ännu. Användning av dessa cellinjer och celltyper bör därför motiveras på grundval av deras påvisade prestanda i testet enligt beskrivningen i avsnittet om kriterier för godkännande. Cyto B rapporterades potentiellt påverka celltillväxten för L5178Y och rekommenderas inte för denna cellinje (23). Om primära celler används av djurskyddsskäl bör man när så är möjligt överväga användning av celler med mänskligt ursprung som samlas in enligt humana etiska principer och regler.

Humana perifera blodlymfocyter bör tas från unga rökfria personer (cirka 18–35 år) utan kända sjukdomar som inte nyligen har exponerats för genotoxiska agens (t.ex. kemikalier, joniserande strålning) vid nivåer som skulle öka den bakomliggande incidensen av celler med mikrokärnor. Detta garanterar att den bakomliggande incidensen av celler med mikrokärnor är låg och konstant. Förekomsten av celler med mikrokärnor ökar med åldern och denna tendens är mer markerad hos kvinnor än hos män (55). Om celler från fler än en givare poolas för användning bör antalet givare anges. Man måste kunna påvisa att cellerna har delat sig från det att behandlingen med testkemikalien påbörjades fram till provtagningen av cellerna. Cellodlingarna hålls i en exponentiell tillväxtfas (cellinjer) eller stimuleras så att de delar sig (primära lymfocytodlingar). Syftet med detta är att exponera cellerna i olika stadier av cellcykeln eftersom cellstadiernas sensitivitet för testkemikalierna kanske inte är känd. De primära celler som måste stimuleras med mitogena agens för att dela sig är i regel inte längre synkroniserade under exponeringen för testkemikalien (t.ex. humana lymfocyter efter mitogenisk stimulans i 48 timmar). Användning av synkroniserade celler under behandling med testkemikalien rekommenderas inte, men kan vara godtagbar om det är motiverat.

Medier och odlingsbetingelser

Lämpliga odlingsmedier och inkubationsförhållanden (odlingskärl, luftfuktighet på 5 % CO2 i förekommande fall, en temperatur på 37 °C) bör väljas för odlingarna. Cellinjer bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på det modala kromosomantalets stabilitet och frånvaro av kontaminerad mykoplasma, och cellerna får inte användas om kontamination har skett eller om det modala kromosomantalet har ändrats. Cellernas normala cellcykeltid eller den normala cellcykeltiden hos de primära kulturer som används i testlaboratoriet bör fastställas och bör överensstämma med kända cellegenskaper.

Beredning av odlingarna

Cellinjer: celler dras upp från stamkulturer, sås ut i ett odlingsmedium som har en sådan densitet att celler i suspension eller monolager fortsätter att växa exponentiellt fram till skörd (konfluens av celler som växer i monolager bör undvikas).

Lymfocyter: helblod, behandlat med en antikoagulant (t.ex. heparin), eller separerade lymfocyter odlas (t.ex. 48 timmar för humana lymfocyter) i närvaro av ett mitogen (t.ex. fytohemaglutinin [PHA] för humana lymfocyter) för att framkalla celldelning innan cellerna exponeras för testkemikalien och cytoB.

Metabolisk aktivering

Exogena metaboliserande system bör användas när cellerna inte har tillräcklig endogen metabolisk kapacitet. Det mest använda systemet, som rekommenderas som standard om inte annat kan motiveras, är en kofaktorstödd post-mitokondriell fraktion (S9) beredd ur lever från gnagare (vanligen råttor) som behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (56) (57) eller en kombination av fenobarbital och b-naftoflavon (58) (59) (60). Den senare kombinationen bryter inte mot Stockholmskonventionen om långlivade organiska föroreningar (61) och har visat sig vara lika effektiv som Aroclor 1254 när det gäller att inducera monooxygenaser (”mixed-function oxidases”) (58) (59) (60). S9-fraktionen används vanligen i koncentrationer mellan 1–2 volymprocent men kan ökas till 10 volymprocent i det slutliga testmediet. Användning av produkter som minskar det mitotiska indexet, särskilt kalciumkomplexprodukter (62), bör undvikas under behandlingen. Valet av typ och koncentration av använt exogent metaboliskt aktiveringssystem eller metabolisk induktion kan påverkas av den kemikalieklass som testas.

Beredning av testkemikalien

Fasta testkemikalier bör beredas med lämpliga lösningsmedel och vid behov spädas ut innan cellerna behandlas. Flytande testkemikalier kan tillsättas direkt till testsystemet och/eller spädas ut före behandling av testsystemet. Gaser eller flyktiga testkemikalier bör testas genom lämpliga modifikationer av standardprotokollen, såsom behandling i slutna kärl (63) (64) (65). Testkemikalien bör beredas strax innan behandling om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel.

Testbetingelser

Lösningsmedel

Man bör välja ett lösningsmedel som optimerar testkemikaliens löslighet utan att testet påverkas negativt, t.ex. genom förändringar i celltillväxten som påverkar testkemikaliens integritet, reaktion med odlingskärlen eller försämrad metabolisk aktivering. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel (eller odlingsmedier). Vedertagna lösningsmedel är vatten eller dimetylsulfoxid (DMSO). Organiska lösningsmedel bör i regel inte överstiga 1 volymprocent. Om cytoB löses upp i DMSO får den totala mängden organiskt lösningsmedel som används för både testkemikalien och cytoB inte överstiga 1 volymprocent. I annat fall bör obehandlade kontroller användas för att se till att procentandelen organiskt lösningsmedel inte ger en negativ effekt. Vattenhaltiga lösningsmedel (saltlösningar eller vatten) bör inte överstiga 10 volymprocent i det slutliga behandlingsmediet. Om man använder lösningsmedel som inte är vedertagna (t.ex. etanol eller aceton) bör detta stödjas av uppgifter om att de är förenliga med testkemikalierna och testsystemet och att de inte är genetiskt toxiska vid den använda koncentrationen. Om ett sådant underlag saknas är det viktigt att inkludera obehandlade kontroller (se tillägg 1) och lösningsmedelskontroller som påvisar att inga skadliga effekter eller kromosomeffekter (t.ex. aneuplodi eller klastogenitet) induceras av det valda lösningsmedlet.

Användning av cytoB som cytokinesinhibitor

En av de viktigaste faktorerna när det gäller MNvit-testets resultat är att se till att de celler som analyseras har slutfört mitosen under behandlingen eller under eventuell inkubationsperiod efter behandlingen. Analysen av mikrokärnor bör då begränsas till celler som har genomgått mitos under eller efter behandlingen. CytoB är det ämne som oftast används för blockering av cytokines eftersom det hindrar aktinbildning och således hindrar separationen av dotterceller efter mitosen så att binukleära celler kan bildas (6) (66) (67). Samtidigt kan man mäta testkemikaliens effekt på cellproliferationskinetiken när cytoB används. CytoB ska användas som cytokinesinhibitor när humana lymfocyter används eftersom cellcykeltiderna varierar mellan givare och eftersom inte alla lymfocyter ger respons på PHA-stimulans. CytoB är inte obligatoriskt för andra celltyper om det kan fastställas att de har genomgått uppdelning enligt beskrivningen i punkt 27. CytoB används normalt inte när proverna utvärderas med avseende på mikrokärnor med användning av flödescytometriska metoder.

Laboratoriet bör fastställa lämplig koncentration av cytoB för varje celltyp i syfte att nå optimal förekomst av binukleära celler i kontrollodlingarna för lösningsmedel/vehikel och bör visa att det kan producera en tillräcklig mängd binukleära kärnor för klassificering. Lämplig cytoB-koncentration är i regel 3–6 μg/ml (19).

Mätning av cellproliferation och cytotoxicitet och val av exponeringskoncentrationer

Vid bestämning av den högsta testkemikaliekoncentrationen ska man undvika koncentrationer som kan ge artefaktiska positiva resultat, t.ex. för kraftig cytotoxicitet (se punkt 29), utfällning i odlingsmediet (se punkt 30) och markerade ändringar av pH eller osmolalitet (se punkt 9). Om testkemikalien orsakar en markerad ändring av pH i mediet vid tillsättningstidpunkten kan pH justeras, företrädesvis genom buffring av det slutliga behandlingsmedlet för att undvika artefaktiska positiva resultat och upprätthålla lämpliga odlingsförhållanden.

Cellproliferationen bör mätas för att se till att tillräckligt många behandlade celler har genomgått mitos under testet och att behandlingarna görs på lämpliga nivåer av cytotoxicitet (se punkt 29). Cytotoxicitet bör fastställas med och utan metabolisk aktivering i huvudförsöket med hjälp av lämplig indikation på celldöd och tillväxt (se punkterna 26 och 27). Även om det kan vara användbart att utvärdera cytotoxicitet i ett preliminärt test för att bättre definiera de koncentrationer som ska användas i huvudförsöket är ett preliminärt test inte obligatoriskt. Om ett preliminärt test utförs bör det inte ersätta mätning av cytotoxicitet i huvudförsöket.

Behandling av odlingarna med cytoB och mätning av de relativa frekvenserna av mononukleära, binukleära och multinukleära celler i odlingen är en noggrann metod för kvantifiering av effekten på cellproliferationen och behandlingens cytotoxiska eller cytostatiska aktivitet (6) och säkerställer att endast celler som har delat sig under eller efter behandlingen analyseras mikroskopiskt. CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation Index) (6) (27) (68) eller replikeringsindex (RI) från minst 500 celler per odling (se tillägg 2 för formler) rekommenderas för att uppskatta behandlingens cytotoxiska eller cytostatiska aktivitet genom en jämförelse av värdena i de behandlade odlingarna och kontrollodlingarna. Bedömning av andra indikatorer på cytotoxicitet (t.ex. cellernas integritet, apoptos, nekros, antalet metafaser, men bör inte användas i stället för CBPI eller RI.

I studier utan cytoB är det nödvändigt att påvisa att cellerna i odlingen har genomgått delning, så att en avsevärd andel av de klassificerade cellerna har genomgått delning under eller efter behandling med testkemikalien. Annars kan man få falsk negativ respons. Mätning av relativ populationsfördubbling (RPD) eller relativ ökning av celltal (RICC) rekommenderas för att uppskatta den cytotoxiska eller cytostatiska aktiviteten i behandlingen (17) (68) (69) (70) (71) (se tillägg 2 för formler). Vid förlängda provningstider (t.ex. behandling för 1,5–2 gånger den normala cellcykelns längd och skörd efter ytterligare 1,5–2 gånger den normala cellcykelns längd som leder till provtagningstider som är längre än totalt 3–4 normala cellcykellängder enligt beskrivningen i punkterna 38 och 39) kan cytotoxiciteten underskattas med RPD (71). Under dessa omständigheter kan RICC vara ett bättre mått. Det kan också vara användbart att utvärdera utvecklingen av cytotoxicitet efter 1,5–2 gånger den normala cellcykelns längd. Bedömning av andra markörer för cytotoxicitet eller cytostas (t.ex. cellintegritet, apoptos, nekros, antalet metafaser, proliferationsindex (PI), cellcykel, nukleoplasmabryggor eller nukleära knoppar kan ge värdefull information, men bör inte användas i stället för RPD eller RICC.

Minst tre testkoncentrationer (exklusive lösningsmedel och positiva kontroller) som uppfyller acceptanskriterierna (lämplig cytotoxicitet, antal celler osv.) bör utvärderas. Oavsett celltyp (cellinjer eller primära odlingar av lymfocyter) kan antingen replikat eller så kan enstaka behandlade kulturer användas för varje testad koncentration. Två odlingar rekommenderas, men enstaka odlingar är också godtagbara under förutsättning att samma totala antal celler registreras för antingen enstaka eller dubbla kulturer. Användningen av en enstaka odling är särskilt relevant när fler än tre koncentrationer bedöms (se punkterna 44–45). De resultat som erhölls i de oberoende replikatodlingarna vid en given koncentration kan slås ihop för dataanalysen. För testkemikalier med låg eller ingen cytotoxicitet är två- till trefaldiga koncentrationsintervaller vanligen lämpliga. Där cytotoxicitet uppträder bör de valda testkoncentrationerna omfatta intervallet från att producera cytotoxicitet som beskrivs i punkt 29 och inkludera koncentrationer vid vilka det är måttlig och liten eller ingen cytotoxicitet. Många testkemikalier uppvisar koncentrationsreponskurvor. För att få uppgifter vid låg och måttlig cytotoxicitet eller undersöka dos-responsförhållandet i detalj är det därför nödvändigt att använda mer nära varandra liggande koncentrationer och/eller fler än tre koncentrationer (enstaka kulturer eller replikat) i situationer där försöket måste upprepas (se punkt 60).

Om den maximala koncentrationen baseras på cytotoxicitet bör den högsta koncentrationen syfta till att uppnå 55 ± 5 % cytotoxicitet med hjälp av de rekommenderade cytotoxicitetparametrarna (dvs. minskning av RICC och RPD för cellinjer när cytoB inte används och minskning av CBPI eller RI när cytoB används till 45 ± 5 % av den parallella negativa kontrollen) (72). Man bör vara försiktig i tolkningen av positiva resultat som endast återfinns i den övre delen av detta cytotoxicitetsintervall på 55 ± 5 % (71).

För svårlösliga testkemikalier som inte är cytotoxiska vid koncentrationer som är lägre än den lägsta olösliga koncentrationen bör den högsta analyserade koncentrationen framkalla grumlighet eller en fällning som är synlig med blotta ögat eller med hjälp av ett inverterat mikroskop vid slutet av behandlingen med testkemikalien. Även om cytotoxicitet förekommer över den lägsta olösliga koncentrationen är det lämpligt att testa endast en koncentration som inducerar grumlighet eller har en synlig fällning, eftersom fällningen kan ge artefaktiska effekter. När det gäller koncentrationer som ger fällningar bör man se till att detta inte stör testet (t.ex. färgning eller bestämning). Bestämning av löslighet i odlingsmediet före försöket kan vara användbart.

Om ingen cytotoxicitet eller utfällning observeras ska de högsta testkoncentrationerna motsvara 10 mM, 2 mg/ml eller 2 μl/ml, enligt det som är lägst (73) (74) (75). Om testkemikalien inte har en definierad sammansättning, t.ex. ett ämne med okänd eller variabel sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiskt material (UVCB) (76), miljöextrakt osv., kan man behöva använda en högre toppkoncentration (t.ex. 5 mg/ml) om inte cytotoxiciteten är tillräckligt hög så att koncentrationen för varje komponent ökas. Det bör dock noteras att dessa krav kan skilja sig för humanläkemedel (93).

Kontroller

Parallella negativa kontroller (se punkt 21), bestående av lösningsmedel eller enbart en vehikel i behandlingsmediet, och hanterade på samma sätt som behandlingsodlingarna, bör inkluderas var gång som odlingen skördas.

Parallella positiva kontroller behövs för att visa laboratoriets förmåga att identifiera klastogener och aneugener enligt villkoren i det använda testprotokollet och, i förekommande fall, effektiviteten hos det exogena systemet för metabolisk aktivering. Exempel på positiva kontroller ges i tabell 1 nedan. Alternativa positiva kontrollkemikalier kan användas om det är motiverat.

För närvarande känner man inte till några aneugener som kräver metabolisk aktivering för sin genotoxiska aktivitet (17). Tester in vitro av däggdjursceller med avseende på genetisk toxicitet är tillräckligt standardiserade för de kortvariga behandlingar som görs parallellt med och utan metabolisk aktivering med samma behandlingslängd. Användningen av positiva kontroller kan därför begränsas till en klastogen som kräver metabolisk aktivering. I detta fall visar en enda klastogen positiv kontrollrespons både aktiviteten hos det metaboliska aktiveringssystemet och testsystemets responsivitet. Separata positiva kontroller bör dock göras av långvariga behandlingar (utan S9) eftersom behandlingstiden skiljer sig från tester med metabolisk aktivering. Om en klastogen används som den enda positiva kontrollen för en kortvarig behandling med eller utan metabolisk aktivering bör en aneugen väljas för den långvariga behandlingen utan metabolisk aktivering. Positiva kontroller för både klastogenicitet och aneugenicitet bör användas för metaboliskt kompetenta celler som inte kräver S9.

Varje positiv kontroll bör användas för en eller flera koncentrationer som förväntas ge ökningar över bakgrunden som går att reproducera och detektera. Syftet med detta är att visa testsystemets sensitivitet (dvs. verkningarna är tydliga men avslöjar inte omedelbart identiteten hos de kodade utstryksglasen för avläsaren), och responsen får inte äventyras av cytotoxicitet som överskrider de gränser som anges i testmetoden.

Tabell 1

Rekommenderade referenskemikalier för utvärdering av laboratoriets kompetens att välja positiva kontroller.

Kategori

Kemikalie

CASRN

1.   Klastogener utan metabolisk aktivering

 

Metylmetansulfonat

66-27-3

 

Mitomycin C

50-07-7

 

4-nitrokinolin-N-oxid

56-57-5

 

Cytosinarabinosid

147-94-4

2.   Klastogener som kräver metabolisk aktivering

 

Benso(a)pyren

50-32-8

 

Cyklofosfamid

50-18-0

3.   Aneugener

 

Colchicin

64-86-8

 

Vinblastin

143-67-9

FÖRFARANDE

Behandlingsschema

För att maximera sannolikheten för att detektera en aneugen eller klastogen som agerar i ett visst skede av cellcykeln är det viktigt att ett tillräckligt antal celler som representerar alla de olika skedena i cellcykeln behandlas med testkemikalien. Alla behandlingar bör inledas och avslutas medan cellerna växer exponentiellt och cellerna bör fortsätta att växa fram till provtagningen. Behandlingsschemat för cellinjer och primära cellodlingar kan därför avvika något från behandlingsschemat för lymfocyter som kräver mitogen stimulering för att inleda sin cellcykel (17). För lymfocyter är det effektivast att inleda behandlingen med testkemikalien 44–48 timmar efter PHA-stimulering, när cellerna delar sig på ett asynkront sätt (6).

Offentliggjorda data (19) tyder på att de flesta aneugener och klastogener detekteras med en kortvarig behandlingsperiod på 3–6 timmar med och utan tillsats av S9, åtföljd av borttagning av testkemikalien och provtagning vid en tidpunkt som motsvarar ungefär 1,5–2,0 gånger den normala cellcykelns längd efter inledandet av behandlingen (7).

För en grundlig utvärdering, vilket krävs för en slutsats om ett negativt resultat, bör dock samtliga tre försöksförhållanden som anges nedan tillämpas i en korttidsbehandling med och utan metabolisk aktivering samt en långtidsbehandling utan metabolisk aktivering (se punkterna 56, 57 och 58):

Cellerna bör exponeras för testkemikalien utan metabolisk aktivering, under 3–6 timmar och prov bör tas ut vid en tid som motsvarar cirka 1,5–2,0 gånger den normala cellcykelns längd efter det att behandlingen har påbörjats (19).

Celler bör exponeras för testkemikalien med metabolisk aktivering i 3-6 timmar, och provtas vid en tidpunkt som motsvarar cirka 1,5–2,0 gånger den normala cellcykelns längd efter behandlingens början (19),

Cellerna bör exponeras kontinuerligt utan metabolisk aktivering tills provtagning under en tidsperiod som motsvarar cirka 1,5–2,0 gånger de normala cellcykellängderna.

Om något av de ovannämnda försöksförhållandena leder till en positiv respons kan andra behandlingssystem behöva övervägas.

Om det är känt eller man misstänker att testkemikalien påverkar cellcykellängden (t.ex. vid testning av nukleosidanaloger), särskilt för p53-kompetenta celler (35) (36) (77), kan provtagnings- eller återhämtningstiderna förlängas med upp till ytterligare 1,5–2,0 gånger den normala cellcykelns längd (dvs. totalt 3,0–4,0 gånger den normala cellcykelns längd efter inledandet av kort- och långvariga behandlingar). Dessa alternativ gäller för situationer där det kan finnas tvivel rörande eventuell växelverkan mellan testkemikalien och cytoB. Om förlängda provtagningstider används (dvs. totalt 3,0–4,0 gånger den normala cellcykelns längd) är det viktigt att säkerställa att cellerna fortfarande aktivt delar på sig. Lymfocyters exponentiella tillväxt kan t.ex. minska vid 96 timmar efter stimulering och celler som växer i monolager kan bli konfluenta.

Förslag till cellbehandlingsscheman sammanfattas i tabell 2. Dessa allmänna behandlingsscheman kan modifieras (och bör motiveras) beroende på testkemikaliens stabilitet eller reaktivitet eller de särskilda tillväxtegenskaper som gäller för de celler som används.

Tabell 2

Tidpunkter för cellbehandling och skörd när MNvit-testet används

Lymfocyter, primära celler och cellinjer behandlade med cytoB

+ S9

Kort behandling

Behandla 3–6 timmar med tillsats av S9,

avlägsna S9 och behandlingsmedium,

tillsätt färskt medium och cytoB,

skörda efter 1,5–2,0 normala cellcykler efter inledandet av behandlingen.

– S9 Kort

behandling

Behandla 3–6 timmar,

avlägsna behandlingsmedium,

tillsätt färskt medium och cytoB,

skörda efter 1,5–2,0 normala cellcykler efter inledandet av behandlingen.

– S9 Utvidgad

behandling

Behandla under 1,5–2 normala cellcykellängder med tillsats av cytoB,

skörda i slutet av behandlingsperioden.

Cellinjer som behandlas utan cytoB

(samma som de behandlingsscheman som anges ovan utom att cytoB inte tillsätts)

I monolagerodlingar kan det finnas mitotiska celler (som identifieras genom att de är runda och lösgör sig från ytan) i slutet av behandlingen på 3–6 timmar. Eftersom dessa mitotiska celler enkelt lösgörs, kan de förloras när mediet som innehåller testkemikalien avlägsnas. Om det finns bevis för en betydande ökning av antalet mitotiska celler jämfört med kontrollerna, vilket tyder på en sannolik mitotisk hämning, bör cellerna samlas in genom centrifugering och tillsättas till odlingarna igen, så att man undviker risken att förlora celler i mitos och risken för mikrokärn-/kromosomavvikelser vid skördetidpunkten.

Skörd av celler och beredning av utstryksglas

Varje odling bör skördas och hanteras separat. Cellerna kan förberedas med hypoton behandling, men detta steg är inte nödvändigt om lämplig cellspridning kan åstadkommas på annat sätt. Olika tekniker kan användas för beredningen av utstryksglasen, förutsatt att cellberedningar av hög kvalitet för klassificeringen erhålls. Celler med intakta cellmembran och cytoplasma bör behållas för att ge möjlighet att detektera mikrokärnor och (vid metoden med blockering av cytokines) tillförlitlig identifiering av binukleära celler.

Utstryksglasen kan färgas med olika metoder, såsom Giemsa eller fluorescerande DNA-specifika färgämnen. Användningen av lämplig fluoresceinfärgning (t.ex. akridinorange (78) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)) kan eliminera några av de artefakter som ar associerade med användning av ett färgämne som inte är DNA-specifikt. Anti-kinetokor-antikroppar, FISH-teknik med pancentromera DNA-prober eller primad in situ-märkning med pancentromerspecifik primer, tillsammans med lämplig DNA-motfärgning kan användas för att identifiera innehållet (hela kromosomer färgas medan acentriska kromosomfragment inte färgas) av mikrokärnor om man är intresserad av mekanismer för hur de bildas (16) (17). Andra metoder för differentiering mellan klastogener och aneugener kan användas om de har visat sig vara effektiva och är validerade. För vissa cellinjer kan t.ex. mätningar av kärnor av typen sub-2N som hypodiploida händelser med hjälp av tekniker som bildanalys, laserskanningcytometri eller flödescytometri också ge användbar information (80) (81) (82). Morfologiska observationer av kärnor kan också ge indikationer på eventuell aneuploidi. Ett test avseende metafas-kromosomavvikelser, företrädesvis av samma celltyp och protokoll med jämförbar sensitivitet, kan också vara ett användbart sätt att avgöra om mikrokärnorna beror på kromosombrott (med vetskap om att kromosomförlust inte upptäcks i testet avseende kromosomavvikelser).

Analys

Alla utstryksglas, inklusive glasen från lösningsmedelskontrollerna och de obehandlade kontrollerna (om sådana används) samt de positiva kontrollerna, bör ges en oberoende kodning före mikroskopanalysen av mikrokärnornas frekvenser. Om ett automatiskt klassificeringssystem används bör lämpliga tekniker tillämpas för att kontrollera eventuella avvikelser eller drift, t.ex. flödescytometri, laserskanningcytometri eller bildanalys. Oavsett om en automatisk plattform används för att räkna mikrokärnorna, bör CBPI, RI, RPD eller RICC bedömas samtidigt.

I cytoB-behandlade odlingar bör mikrokärnornas frekvenser analyseras i minst 2 000 binukleära celler per koncentration och kontroll (83), lika fördelade mellan replikaten om sådana används. När det gäller enstaka odlingar per dos (se punkt 28) bör åtminstone 2 000 binukleära celler per odling (83) klassificeras i den enstaka odlingen. Om betydligt mindre antal än 1 000 binukleära celler per odling (för dubbla odlingar), eller 2 000 (för enstaka odlingar) finns att tillgå för analys för varje koncentration och en väsentlig ökning av mikrokärnor inte upptäcks, bör testet upprepas med användning av flera celler eller vid mindre cytotoxiska koncentrationer, enligt det som är lämpligt. Man bör vara noga med att inte klassificera binukleära celler med oregelbundna former eller om de två kärnorna skiljer sig betydligt i storlek. Dessutom får binukleära celler inte sammanblandas med dåligt spridda flerkärniga celler. Celler som innehåller fler än två huvudkärnor bör inte analyseras för mikrokärnor, eftersom grundvärdet för mikrokärnornas frekvenser kan vara högre i dessa celler (84). Klassificering av enkärniga celler är godtagbart om testkemikalien har visat sig störa cytoB-aktiviteten. I sådana fall kan ett upprepat test utan cytoB vara användbart. Klassificering av enkärniga celler förutom binukleära celler kan ge användbar information (85) (86), men är inte obligatoriskt.

I cellinjer som testas utan cytoB-behandling bör mikrokärnorna klassificeras i minst 2 000 celler per testkoncentration och kontroll (83), lika fördelade mellan replikaten om sådana används. Om enstaka odlingar används per koncentration (se punkt28) bör minst 2 000 celler per odling klassificeras i den enstaka odlingen. Om betydligt mindre antal än 1 000 celler per odling (för dubbla odlingar), eller 2 000 (för enstaka odlingar) finns att tillgå för analys för varje koncentration och en väsentlig ökning av mikrokärnor inte upptäcks, bör testet upprepas med användning av flera celler eller vid mindre cytotoxiska koncentrationer, enligt det som är lämpligt.

När cytoB används bör proliferationsindex vid cytokinesinhibering (CBPI) eller replikeringsindex (RI) bestämmas för bedömning av cellproliferationen (se tillägg 2) med användning av minst 500 celler per odling. När behandlingar görs utan tillsats av cytoB är det väsentligt att belägg ges för att cellerna i odlingen har delats, enligt beskrivningen punkterna 24–28.

Laboratoriets kompetens

För att fastställa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det används för rutintestning bör laboratoriet ha utfört en serie försök med positiva referenskemikalier som agerar via olika mekanismer (åtminstone ett med och ett utan metabolisk aktivering och ett som agerar via en aneugenisk mekanism, valt från kemikalierna i tabell 1) och flera negativa kontroller (inklusive obehandlade odlingar och olika lösningsmedel/vehiklar). Dessa positiva och negativa kontrollresponser bör överensstämma med litteraturen. Detta gäller inte laboratorier som redan har erfarenhet, dvs. har en historisk databas enligt punkterna 49–52.

Laboratoriet bör undersöka ett urval av positiva kontrollkemikalier (se tabell 1) med korta och långa behandlingar utan metabolisk aktivering, och även med kort behandlingstid med metabolisk aktivering, för att visa att det har kompetens att upptäcka klastogena och aneugena kemikalier, bestämma effektiviteten hos det metaboliska aktiveringssystemet och visa att klassificeringsförfarandena är lämpliga (visuell mikroskopanalys, flödescytometri, laserskanningcytometri eller bildanalys). En rad koncentrationer av de valda kemikalierna bör användas för att ge reproducerbara och koncentrationsrelaterade ökningar över bakgrunden i syfte att visa testsystemets sensitivitet och dynamiska omfång.

Historiska kontrolldata

Laboratoriet bör fastställa följande:

Historiskt positivt kontrollintervall samt fördelning.

Historiskt negativt (obehandlad, lösningsmedel) kontrollintervall samt fördelning.

Om data för en historisk negativ kontrollfördelning samlas in först bör de parallella negativa kontrollerna överensstämma med publicerade data för negativa kontroller om sådana finns. Allteftersom kontrollfördelningen kompletteras med fler försöksdata bör de parallella negativa kontrollerna i idealfallet ligga inom fördelningens kontrollgräns på 95 % (87) (88). Laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas kontroll bör inledningsvis baseras på minst 10 försök, men bör helst bestå av minst 20 försök utförda under jämförbara försöksbetingelser. Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex. C-diagram eller X-stapeldiagram (88)), för att fastställa hur variabla deras positiva och negativa kontrolldata är och för att visa att metoden är ”under kontroll” (83). Fler rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska kontrolldatabaser (t.ex. kriterier för att innefatta och utesluta data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (87).

Eventuella ändringar av försöksprotokollen bör övervägas när det gäller uppgifternas överensstämmelse med laboratoriets befintliga historiska kontrolldatabaser. Alla större inkonsekvenser bör leda till att en ny historisk kontrolldatabas upprättas.

Negativa kontrolldata bör bestå av förekomsten av celler med mikrokärnor från en enda odling eller summan av replikatodlingar enligt beskrivningen i punkt 28. Parallella negativa kontroller bör helst ligga inom kontrollgränsen på 95 % för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas (87) (88). Om parallella negativa kontrolldata faller utanför kontrollgränserna på 95 % kan de ändå ingå i den historiska kontrollfördelningen så länge de inte är extremt avvikande och det finns bevis för att testsystemet är under kontroll (se punkt 50) och att inga tekniska eller mänskliga fel begåtts.

DATA OCH RAPPORTERING

Presentation av resultaten

Om blockering av cytokines används ska endast förekomsten av binukleära celler med mikrokärnor (oavsett antalet mikrokärnor per cell) användas för utvärderingen av inducering av mikrokärnor. Analysen av antalet celler med en, två eller flera mikrokärnor kan rapporteras separat och kan ge användbar information, men är inte obligatorisk.

Parallella mått på cytotoxicitet och/eller cytostas för alla behandlade odlingar och negativa och positiva kontrollodlingar bör bestämmas (16). Proliferationsindex vid cytokinesinhibering (CBPI) eller replikeringsindex (RI) bör beräknas för alla behandlade odlingar och kontrollodlingar som mått på cellcykelfördröjning när blockering av cytokines används. Om cytoB inte tillsätts bör relativ populationsfördubbling (RPD) eller relativ ökning av celltal (RICC) användas (se tillägg 2).

Data bör anges per enskild odling. Dessutom bör alla data sammanfattas i tabellform.

Kriterier för godkännande

Testet måste uppfylla följande kriterier för att godkännas:

Den parallella negativa kontrollen måste anses godtagbar för registrering i laboratoriet historiska databas över negativa kontroller enligt punkt 50.

Parallella positiva kontroller (se punkt 50) bör framkalla reaktioner som överensstämmer med de kontroller som genereras i laboratoriets historiska databas över positiva kontroller och ge en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

Cellproliferationskriterierna i lösningsmedelskontrollen bör vara uppfyllda (punkterna 25–27).

Samtliga försöksbetingelser testades om inte ett gav positiva resultat (punkterna 36–40).

Tillräckligt många celler och koncentrationer finns tillgängliga för analys (punkterna 28 och 44–46).

Urvalskriterierna för toppkoncentrationen överensstämmer med de kriterier som beskrivs i punkterna 24–

Utvärdering och tolkning av resultaten

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart positiv om något av följande gäller för någon av de undersökta försöksbetingelserna (se punkterna 36–39):

Åtminstone en av testkoncentrationerna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen (89).

Ökningen är dosrelaterad i åtminstone en försöksbetingelse vid utvärdering med ett lämpligt trendtest (se punkt 28).

Något av resultaten ligger utanför fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser, se punkt 52).

Om alla dessa kriterier är uppfyllda anses testkemikalien kunna inducera kromosombrott och/eller vinst eller förlust hos odlade däggdjursceller i detta testsystem. Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns även i litteraturen (90) (91) (92).

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses testkemikalien vara klart negativ om följande gäller för samtliga undersökta försöksbetingelser (se punkterna 36–39):

Ingen av testkoncentrationerna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

Det finns ingen koncentrationsrelaterad ökning vid utvärdering med ett lämpligt trendtest.

Alla resultat ligger inom fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser, se punkt 52).

Testkemikalien anses inte kunna inducera kromosombrott och/eller vinst eller förlust hos odlade däggdjursceller i detta testsystem. Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns även i litteraturen (90) (91) (92).

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller negativt svar.

Om responsen varken är klart negativ eller klart positiv enligt beskrivningen ovan och/eller för att göra det lättare att fastställa resultatets biologiska relevans bör uppgifterna fackgranskas och/eller undersökas ytterligare. Det kan även vara användbart att klassificera ytterligare celler (i förekommande fall) eller upprepa försöket, eventuellt med ändrade försöksbetingelser (t.ex. koncentrationsavstånd, andra metaboliska aktiveringsbetingelser [dvs. S9 koncentration eller S9-ursprung]) kan vara användbart.

I sällsynta fall är det, trots ytterligare undersökningar, inte möjligt att dra en slutsats om huruvida testkemikalien ger positiva eller negativa resultat och i dessa fall anses undersökningen vara tvetydig.

Att testkemikalier inducerar mikrokärnor i MNvit-testet kan bero på att de inducerar kromosombrott, kromosomförlust eller en kombination av dessa två. Ytterligare analys med användning av anti-kinetokor-antikroppar, centromerspecifika in situ-prober eller andra metoder kan göras för att avgöra huruvida mekanismen för inducering av mikrokärnor beror på klastogen och/eller aneugen aktivitet.

Testrapport

Testrapporten ska innehålla följande information:

 

Testkemikalie:

Källa, satsnummer, sista förbrukningsdag om detta anges.

Testkemikaliens stabilitet i sig, om den är känd.

Testkemikaliernas reaktionsbenägenhet med lösningsmedel/vehikel eller cellodlingsmedier.

Löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet, om detta är känt.

Mätning av pH, osmolalitet och utfällningar i det odlingsmedium till vilket testkemikalien tillsattes, i förekommande fall.

 

Monokomponentämne:

fysiskt utseende, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper,

kemiska beteckningar, såsom IUPAC- eller CAS-beteckning, CAS--nummer, SMILES- eller InChI-kod, strukturell formel, renhet, kemisk beteckning på föroreningar i förekommande fall och om möjligt osv.

 

Multikomponentämne, UVCB och blandningar:

Karakteriseras så långt som möjligt genom kemisk beteckning (se ovan), kvantitativ förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper hos beståndsdelarna.

 

Lösningsmedel:

Motivering av valet av lösningsmedel.

Procentandelen lösningsmedel i den slutliga odlingsmediet.

 

Celler:

Cellernas typ och källa.

Den använda celltypens lämplighet.

Avsaknad av mykoplasma för cellinjer.

Uppgifter om cellcykelns längd eller proliferationsindex.

Om lymfocyter används, blodgivarnas kön, ålder och annan relevant information om givarna, helblod eller separerade lymfocyter, använd mitogen substans.

Normal cellcykellängd (negativ kontroll).

Antal passager för cellinjer om sådan information finns.

Metoder för underhållet av cellodlingar för cellinjer.

Det modala antalet kromosomer för cellinjer.

 

Testbetingelser:

Identitet för cytokinesinhiberande ämne (t.ex. cytoB), om sådant används, och ämnets koncentration samt cellexponeringens varaktighet

Testkemikaliens koncentration, uttryckt som slutlig koncentration i odlingsmediet (t.ex. μg eller mg/mL eller mM av odlingsmediet).

Grund för val av koncentrationer och antalet kulturer inklusive data för cytotoxicitet och löslighetsbegränsningar.

Mediets sammansättning, CO2-koncentration, om detta är tillämpligt, fuktighetsnivå.

Koncentration (och/eller volym) av det lösningsmedel och den testkemikalie som tillsätts odlingsmediet.

Inkubationstemperatur och tid.

Behandlingens varaktighet.

Tidpunkten för skörd efter behandlingen.

Celldensitet vid inokulering, om tillämpligt.

Typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk aktivering (S9-källa, beredningsmetod för S9-blandningen, koncentration eller volym för S9-blandningen, S9 i det slutliga odlingsmediet, kvalitetskontroller av S9, t.ex. enzymatisk aktivitet, sterilitet, metabolisk kapacitet).

Positiva och negativa kontrollkemikalier, slutkoncentrationer, behandlingsbetingelser och behandlingslängder samt återhämtningsperioder.

Metoder för preparering av utstryksglas och färgningsteknik.

Kriterier för klassificering av mikrokärnor i celler (urval av analyserbara celler samt identifiering av mikrokärnor).

Antalet analyserade celler.

Metoder för mätning av cytotoxicitet.

All tilläggsinformation som är relevant rörande cytotoxicitet samt använd metod.

Kriterier för att bedöma om testresultaten är positiva, negativa eller tvetydiga.

Metod(er) för statistisk analys.

Metoder, såsom användning av anti-kinetokor-antikroppar eller pancentromerspecifika prober, för att fastställa om mikrokärnorna innehåller hela eller fragmenterade kromosomer, om tillämpligt.

Använda metoder för att bestämma pH, osmolalitet och utfällningar.

 

Resultat:

Definition av godkända celler för analys.

Utan cytoB, antal behandlade celler och antal skördade celler för varje odling om cellinjer används.

Mätning av använd cytotoxicitet, t.ex. CBPI eller RI när det gäller metoden för blockering av cytokines, RICC eller RPD när metoden för blockering av cytokines inte används, eventuella andra observationer (t.ex. cellkonfluens, apoptos, nekros, antal metafaser, frekvens för binukleära celler).

Tecken på utfällning och tid för bestämningen.

Data om behandlingsmediets pH och osmolalitet, om uppmätt.

Fördelningen av mono-, bi- och multinukleära celler i fall där blockering av cytokines har använts.

Antalet celler med mikrokärnor angivet separat för varje behandlad odling och kontrollodling och, där det är lämpligt, angivelse av huruvida det gäller binukleära eller mononukleära celler.

Koncentration-responsförhållande, där det är möjligt.

Data om parallella negativa (lösningsmedel) och positiva kontroller (koncentrationer och lösningsmedel).

Historiska negativa (lösningsmedel) och positiva kontrolldata med intervall, medelvärden, standardavvikelser och 95 %-kontrollgränser för distribution samt antalet uppgifter.

Statistisk analys, p-värden om sådana finns.

 

Diskussion av resultaten.

 

Slutsatser.

LITTERATUR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Research, vol. 392/1-2, s. 1–4.

(3)

Parry, J.M., A. Sors (1993). The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Research, vol. 287/1, s. 3–15.

(4)

Fenech, M., A.A. Morley (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios, vol. 43/172-173, s. 233–246.

(5)

Kirsch-Volders, M. m.fl. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group. Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 35/3, s. 167–172.

(6)

Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols, vol. 2/5, s. 1084–1104.

(7)

Fenech, M., A.A. Morley (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Research, vol. 161/2, s. 193–198.

(8)

Eastmond, D.A., J.D. Tucker (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environmental and Molecular Mutagenesis, vol. 13/1, s. 34–43.