1.

Fördelningskoefficienten (P) definieras som förhållandet mellan jämviktskoncentrationerna för ett ämne som lösts i ett tvåfassystem bestående av två i stort sett icke blandbara lösningsmedel. När det gäller n-oktanol och vatten är

Eftersom fördelningskoefficienten är kvoten av två koncentrationer är den dimensionslös. Den uttrycks vanligen i form av en 10-logaritm.

2.

Pow är en viktig parameter i studier av kemiska ämnens omvandling, spridning och fördelning i miljön. Ett högsignifikant förhållande mellan Pow för icke-joniserade ämnen och deras bioackumulering i fisk har påvisats. Det har också visats att Pow är en användbar parameter vid uppskattning av adsorption till jord och sediment och för fastställande av kvantitativa struktur-aktivitetssamband för ett stort antal biologiska effekter.

3.

Det ursprungliga förslaget till denna testmetod grundades på en artikel av C. V. Eadsforth och P. Moser (1). Utvecklingen av testmetoden och OECD:s jämförelse mellan laboratorier samordnades av den federala tyska miljöskyddsmyndigheten (Umweltbundesamt) under 1986

4.

Värden för log Pow i området – 2 till 4 (ibland upp till 5 eller däröver) (1) kan bestämmas experimentellt genom skakkolvmetoden (kapitel A.8 i denna bilaga, OECD:s testriktlinje 107). HPLC-metoden omfattar log Pow i intervallet 0 till 6 (1) (2) (3) (4) (5). Denna metod kan kräva en uppskattning av Pow för att välja ut lämpliga referensämnen och underbygga de slutsatser som dras utifrån erhållna testdata. Beräkningsmetoderna diskuteras kortfattat i tillägget till denna testmetod. HPLC-driftläget är isokratiskt.

5.

Värdena för Pow beror på miljöfaktorer såsom temperatur, pH, jonstyrka osv., och dessa bör definieras i experimentet för en korrekt tolkning av Pow-data. För joniserbara ämnen kan en annan metod (t.ex. utkast till OECD-riktlinjer för den pH-metriska metoden för joniserade ämnen (6)) komma att bli tillgänglig och skulle kunna användas som alternativ metod. Även om detta utkast till OECD-riktlinjer kan vara lämpligt för att bestämma Pow för sådana joniserbara ämnen är det i vissa fall lämpligare att använda HPLC-metoden vid ett miljömässigt relevant pH-värde (se punkt 9).

6.

Omvänd-fas-kromatografi utförs på analyskolonner som är packade med en kommersiellt tillgänglig fast fas innehållande långa kolvätekedjor (t.ex. C8, C18), vilka är kemiskt bundna till kiseldioxid.

7.

En kemikalie som injiceras i en sådan kolonn kommer att fördelas mellan den mobila lösningsmedelsfasen och den stationära kolvätefasen när den transporteras genom kolonnen av den mobila fasen. Ämnena hålls kvar i proportion till sin fördelningskoefficient kolväte/vatten. Hydrofila ämnen elueras ut först och lipofila ämnen sist. Retentionstiden beskrivs av kapacitetsfaktorn k, som ges av formeln

där tR är testämnets retentionstid och t0 är dödtiden, dvs. den genomsnittliga tid det tar för en lösningsmedelsmolekyl att passera genom kolonnen. Det krävs inga kvantitativa analysmetoder, och endast bestämningen av retentionstiderna är nödvändig.

8.

Fördelningskoefficienten oktanol/vatten för ett testämne kan beräknas genom att man experimentellt bestämmer dess kapacitetsfaktor k och därefter för in k i formeln

där

Ovanstående formel kan erhållas genom linjär regression av log av fördelningskoefficienterna oktanol/vatten för referensämnena mot log av kapacitetsfaktorerna för referensämnena.

9.

Metoden med omvänd-fas-kromatografi gör det möjligt att uppskatta fördelningskoefficienter i log Pow-området mellan 0 och 6, men kan i undantagsfall utvidgas till att omfatta log Pow-området mellan 6 och 10. Detta kan innebära att den mobila fasen måste modifieras (3). Metoden kan inte användas för starka syror och baser, metallkomplex, ämnen som reagerar med eluenten eller ytaktiva medel. Mätningar på joniserbara ämnen kan utföras på den icke-joniserade formen (fri syra eller fri bas) endast genom användning av en lämplig buffert med ett pH-värde under pKa för en fri syra eller över pKa för en fri bas. Alternativt kan den pH-metriska metoden för testning av joniserbara ämnen (6) komma att bli tillgänglig och skulle kunna användas som alternativ metod (6). Om log Pow-värdet fastställs för att användas i en miljöfarlighetsklassificering eller miljöriskbedömning, bör testet utföras med ett pH-värde som är relevant för den naturliga miljön, dvs. på mellan 5,0 och 9.

10.

I vissa fall kan orenheter göra det svårt att tolka resultaten, eftersom toppvärdena blir osäkra. För blandningar med ett oupplöst band anges en övre och nedre gräns för log Pow, och areaprocenten för varje log Pow-topp ska rapporteras. För blandningar som utgörs av en grupp homologer bör även det vägda genomsnittet för log Pow anges (7), beräknat på de enskilda Pow-värdena och motsvarande areaprocentvärden (8). Alla toppar som bidrar med minst 5 % av den totala topparean bör beaktas i beräkningen (9):

Det vägda genomsnittet för log Pow gäller endast för ämnen eller blandningar (t.ex. talloljor) som består av homologer (t.ex. alkanserier). Blandningar kan mätas med meningsfulla resultat förutsatt att den analytiska detektor som används har samma känslighet för alla ämnen i blandningen och en lämplig upplösning kan erhållas.

11.

Dissociationskonstant, strukturformel och löslighet i den mobila fasen bör vara kända innan metoden används. Dessutom kan information om hydrolys vara till nytta.

12.

För att öka mätningens tillförlitlighet ska dubbla bestämningar göras.

13.

Jämförelsen mellan laboratorier har visat att man med HPLC-metoden kan erhålla värden på log Pow som ligger inom ± 0,5 enheter av värdena från skakkolvmetoden (2). Andra jämförelser återfinns i referenserna (4) (5) (10) (11) (12). Korrelationsdiagram baserade på strukturellt besläktade referensämnen ger tillförlitligast resultat (13).

14.

För att kunna korrelera den uppmätta kapacitetsfaktorn k för ett ämne med dess Pow måste en kalibreringskurva med minst 6 punkter upprättas (se punkt 24). Det är upp till användaren att välja lämpliga referensämnen. Referensämnena bör normalt sett ha log Pow-värden som omger testämnets log Pow-värde, dvs. minst ett referensämne bör ha ett Pow-värde som ligger över testämnets, och minst ett bör ha ett Pow-värde som ligger under testämnets. Extrapolering bör endast användas i undantagsfall. Referensämnena ska helst vara strukturellt besläktade med testämnet. Referensämnenas log Pow-värden för kalibreringen bör baseras på tillförlitliga experimentella data. För ämnen med högt log Pow-värde (normalt över 4) kan dock beräknade värden användas om tillförlitliga experimentella data inte finns tillgängliga. Om extrapolerade värden används bör ett gränsvärde anges.

15.

Det finns omfattande listor över log Pow-värden för många grupper av kemikalier (14) (15). Om data rörande fördelningskoefficienter för strukturellt besläktade ämnen inte finns att tillgå kan en mer allmän kalibrering med andra referensämnen användas. Rekommenderade referensämnen och deras Pow-värden anges i tabell 1. För joniserbara ämnen gäller de angivna värdena den icke-joniserade formen. Värdena kontrollerades i fråga om trovärdighet och kvalitet i samband med jämförelsen mellan laboratorierna.

Tabell 1

Rekommenderade referensämnen

16.

Om det är nödvändigt att uppskatta testämnets fördelningskoefficient kan detta företrädesvis göras genom en beräkning (se tillägg) eller, i förekommande fall, genom att använda testämnets lösningsgrad i rena lösningsmedel.

17.

För testet krävs en vätskekromatograf försedd med en pulsfri pump och lämplig detekteringsutrustning. En UV-detektor för våglängden 210 nm eller en RI-detektor kan användas för ett stort antal kemiska grupper. Närvaron av polära grupper i den stationära fasen kan avsevärt försämra HPLC-kolonnens effektivitet. De stationära faserna bör därför ha lägsta möjliga procentuella innehåll av polära grupper (16). Ett kommersiellt mikroniserat packmaterial med omvänd fas eller färdigpackade kolonner kan användas. Eventuellt kan en förkolonn placeras mellan injektionssystemet och analyskolonnen.

18.

Metanol av HPLC-kvalitet och destillerat eller avjonat vatten används för att framställa elueringsvätskan, som avgasas före användning. Isokratisk eluering bör användas. Den använda metanol/vattenblandningen ska innehålla minst 25 % vatten. Vanligtvis är en 3:1 (v/v) blandning av metanol/vatten lämplig för eluering av ämnen med ett log P-värde på 6 inom en timme, om flödeshastigheten är 1 ml/min. För ämnen med log P-värden över 6 kan det vara nödvändigt att minska elueringstiden (även för referensämnena) genom att använda en mindre polär mobil fas eller en kortare kolonn.

19.

Testämnet och referensämnena ska vara lösliga i den mobila fasen i en tillräckligt hög koncentration för att de ska kunna påvisas. Tillsatser får endast i undantagsfall användas i metanol/vattenblandningen, eftersom de ändrar kolonnens egenskaper. I sådana fall måste man se till att retentionstiden för test- och referensämnena inte påverkas. Om en metanol/vattenblandning inte är lämplig kan andra organiska lösningsmedel/vattenblandningar användas, t.ex. etanol/vatten, acetonitril/vatten eller isopropylalkohol (2-propanol)/vatten.

20.

Elueringsvätskans pH-värde är av största vikt för joniserbara ämnen. Värdet ska ligga inom kolonnens pH-värde under drift, normalt mellan 2 och 8. Det rekommenderas att man använder en buffert. Det är viktigt att undvika saltutfällning och försämring av kolonnen, vilket kan förekomma med vissa blandningar av organisk fas och buffert. HPLC-mätningar med kiseldioxidbaserade stationära faser med pH över 8 rekommenderas normalt inte, eftersom användning av en alkalisk mobil fas kan leda till att kolonnens effektivitet snabbt försämras.

21.

Test- och referensämnena ska vara tillräckligt rena för att topparna i kromatogrammen ska kunna tillskrivas respektive ämne. Ämnen avsedda att användas för testning och kalibrering löses i den rörliga fasen om så är möjligt. Om ett annat lösningsmedel än den mobila fasen används för test- och referensämnena bör den mobila fasen användas för den slutliga utspädningen före injicering.

22.

Temperaturen under mätningarna bör inte variera med mer än ± 1 °C.

23.

Dödtiden t0 kan mätas med hjälp av organiska ämnen som inte hålls kvar (t.ex. tiourea eller formamid). En mer exakt dödtid kan härledas från de uppmätta retentionstiderna eller en uppsättning på ungefär sju komponenter i en homolog serie (t.ex. n-alkylmetylketoner) (17). Retentionstiderna tR (nC + 1) plottas mot tR (nC), där nC är antalet kolatomer. En rak linje, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, erhålls, där A, som motsvarar k(nC + 1)/k(nC), är konstant. Dödtiden t0 erhålls från skärningspunkten mellan (1 – A)t0 och riktningskoefficienten A.

24.

Nästa steg består i att plotta en korrelation log k mot log P för lämpliga referensämnen med log P-värden som ligger nära det förväntade värdet för testämnet. I praktiken injiceras mellan 6 och 10 referensämnen samtidigt. Retentionstiderna bestäms, helst med en integrationsskrivare som är kopplad till detektionssystemet. Motsvarande logaritmer för kapacitetsfaktorerna, log k, plottas som en funktion av log P. Regressionsformeln beräknas regelbundet, minst en gång om dagen, så att hänsyn kan tas till eventuella ändringar i kolonnens effektivitet.

25.

Minsta detekterbara mängd av testämnet injiceras. Dubbla bestämningar av retentionstiden görs. Fördelningskoefficienten för testämnet erhålls genom att interpolera den beräknade kapacitetsfaktorn på kalibreringskurvan. Vid mycket låga och mycket höga fördelningskoefficienter är det nödvändigt att extrapolera. Särskilt i dessa fall måste regressionslinjens konfidensgränser beaktas. Om retentionstiden för ett prov ligger utanför intervallet för de retentionstider som erhållits för referensämnena bör ett gränsvärde anges.

26.

Följande ska ingå i rapporten:

(1)

C. V. Eadsforth och P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss och H. J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C. V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt och R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol/Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Utkast till riktlinje, november 2000.

(7)

OSPAR (1995). ’Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995’, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), bilaga 10, Oviedo, 20–24 februari 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez och C. C. Karman. (1999). A User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3 augusti.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke och K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, s. 529–537.

(10)

L. O. Renberg, S. G. Sundström och K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W. E. Hammers, G. J.Meurs och C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J. E. Haky och A. M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa och E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates, Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch och A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York.

(15)

C. Hansch, ordförande; A. J. Leo, direktör. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity. Kan rekvireras från Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker och H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G. E. Berendsen, P. J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony och J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

1.

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 201 (2006, bilaga rättad 2011). Det finns ett behov av att utvidga testmetoden till att omfatta ytterligare arter och att uppdatera den för att uppfylla kraven beträffande farobedömning och klassificering av kemikalier. Revideringen har gjorts på grundval av betydande praktisk erfarenhet, den vetenskapliga utvecklingen när det gäller toxicitetstester på alger, samt en omfattande användning av den tidigare versionen av dokumentet för normerande ändamål.

2.

De definitioner som används finns i tillägg 1.

3.

Syftet med testet är att bestämma vilka effekter ett kemiskt ämne har på tillväxten hos sötvattenslevande mikroalger och/eller cyanobakterier. De exponentiellt tillväxande testorganismerna exponeras för testämnet i batchkulturer under en tidsperiod på vanligen 72 timmar. Trots att testperioden är relativt kort kan effekterna på flera generationer bedömas.

4.

Systemets respons innebär att tillväxten i en serie algkulturer (testenheter) som exponeras för olika koncentrationer av en testkemikalie minskar. Responsen betraktas som en funktion av exponeringskoncentrationen jämfört med den genomsnittliga tillväxten för icke-exponerade kontrollreplikat. För att testsystemet ska kunna ge full respons på en toxisk testkemikalie (optimal känslighet) får kulturerna tillväxa exponentiellt utan några begränsningar, samt med tillräcklig näringstillgång och i kontinuerligt ljus, under den tid som krävs för att minskningen i specifik tillväxthastighet ska bli mätbar.

5.

Tillväxtens och tillväxtminskningens storlek bestäms genom mätningar av algbiomassans förändring över tiden. Algbiomassa definieras som torrvikten alger per volymenhet, t.ex. mg alger/liter testlösning. Torrvikt är dock svårt att mäta, varför man kan använda sig av olika alternativa parametrar. Av dessa används oftast cellantal. Andra alternativa parametrar inbegriper cellvolym, flourescens, optisk täthet etc. En omvandlingsfaktor mellan den uppmätta alternativa parametern och biomassan bör vara känd.

6.

Endpoint i testet är tillväxthämning, där tillväxt uttrycks som den logaritmiska ökningen av biomassan (den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten) under exponeringsperioden. Från de genomsnittliga specifika tillväxthastigheter som uppmätts i en serie testlösningar fastställer man den koncentration av testkemikalien som ger upphov till en bestämd minskning av tillväxthastigheten, x % (t.ex. 50 %). Värdet uttrycks som ErCx (t.ex. ErC50).

7.

I den här testmetoden används även producerad mängd biomassa som responsvariabel, något som kan vara nödvändigt för att uppfylla gällande krav i vissa länder. Denna variabel definieras som biomassans storlek vid exponeringstidens slut minus biomassans storlek vid exponeringstidens början. Med utgångspunkt i den mängd biomassa som producerats i en serie testlösningar beräknar man den koncentration av testämnet som ger upphov till en bestämd minskning av mängden producerad biomassa, x % (t.ex. 50 %). Detta värde uttrycks som EyCx (t.ex. EyC50).

8.

Den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC) och den högsta koncentrationen utan observerad effekt (NOEC) kan också bestämmas statistiskt.

9.

Information om testkemikalien som kan vara av värde när man fastställer testbetingelserna är bland annat strukturformel, renhetsgrad, ljusbeständighet, stabilitet under testbetingelserna, ljusabsorberande förmåga, pKa samt resultat från undersökningar av kemikaliens omvandling, inklusive bionedbrytbarhet i vatten.

10.

Testkemikaliens vattenlöslighet, fördelningskoefficient oktanol/vatten (Pow) och ångtryck ska vara kända, och det ska finnas en validerad metod för kvantitativ bestämning av kemikalien i testlösningarna. Metodens utbyte och detektionsgräns ska vara kända.

11.

För att testresultaten ska vara giltiga måste följande effektivitetskriterier vara uppfyllda:

12.

Referenskemikalie(r), t.ex. 3,5-diklorfenol, som används i det internationella ringtestet (1), kan testas för att kontrollera testförfarandet. För grönalger kan även kaliumdikromat användas som referenskemikalie. Referenskemikalier bör testas minst två gånger per år.

13.

Denna testmetod är lättast att tillämpa på vattenlösliga kemikalier som under testförhållandena sannolikt kommer att stanna kvar i vattnet. Om man vill testa kemikalier som är flyktiga, starkt adsorberande, färgade, svårlösliga i vatten eller som kan påverka tillgången på näringsämnen och mineraler i testmediet kan det krävas vissa modifieringar av den beskrivna metoden (t.ex. slutna system, anpassningar av testkärlen). Några exempel på lämpliga modifieringar ges i (2) (3) och (4).

14.

Testkärl och annan utrustning som kommer i kontakt med testlösningarna ska vara tillverkade uteslutande av glas eller något annat kemiskt inert material. Utrustningen rengörs noggrant, så att inga organiska eller oorganiska föroreningar påverkar algernas tillväxt eller testlösningarnas sammansättning.

15.

Testkärlen är normalt glaskolvar vars storlek tillåter mätningar på en tillräckligt stor volym av testkulturen under testet och ett tillräckligt högt utbyte av CO2 med den omgivande luften (se punkt 30). Observera att vätskevolymen måste vara tillräckligt stor för analytiska bestämningar (se punkt 37).

16.

Dessutom behövs åtminstone en del av följande utrustning:

17.

Ett stort antal arter icke-fastsittande mikroalger och cyanobakterier kan användas. De stammar som förtecknas i tillägg 2 har visat sig vara lämpliga för denna testmetod.

18.

Om man använder sig av andra arter ska stammen och/eller ursprunget anges. Bekräfta att de alger som används kan tillväxa exponentiellt under hela testperioden under rådande testförhållanden.

19.

Det rekommenderas att man använder antingen OECD-mediet eller AAP-mediet som odlingsmedium. Sammansättningen av dessa medier framgår av tillägg 3. Observera att de två medierna har olika utgångsvärde för pH och olika buffringsförmåga (motverkar pH-ökningar). Testresultaten kan därför variera beroende på vilket medium som används, särskilt när man testar joniserande kemikalier.

20.

Det kan ibland vara nödvändigt att modifiera odlingsmediet, t.ex. då man testar metaller eller kelatbildare, eller då testerna görs vid skilda pH-värden. Användning av modifierade medier ska beskrivas i detalj och motiveras (3) (4).

21.

Biomassans startkoncentration ska vara densamma för alla testkulturer. Den ska också vara tillräckligt låg för att möjliggöra exponentiell tillväxt under hela inkuberingen utan att några näringsämnen tar slut. Startvärdet får inte överskrida 0,5 mg/l, räknat på torrvikt. Följande cellkoncentrationer rekommenderas:

22.

Det koncentrationsområde där det är troligt att testkemikalien ger effekt kan bestämmas på grundval av resultat från preliminära tester (range-finding tests). För det slutliga testet bör minst fem koncentrationer väljas i en geometrisk serie vars faktor inte överstiger 3,2. För testkemikalier med plan dos-responskurva kan det vara befogat att använda en högre faktor. Koncentrationsserien bör helst omfatta ett intervall som minskar algernas tillväxthastighet med 5–75 %.

23.

För varje koncentration av testkemikalien ska det finnas tre replikat. Om NOEC inte behöver bestämmas kan man ändra testupplägget så att antalet koncentrationer ökas medan antalet replikat per koncentration minskas. Minst tre kontrollreplikat ska användas, och helst bör de vara dubbelt så många som antalet replikat för varje koncentration av testkemikalien.

24.

En extra serie testlösningar kan beredas för analytisk bestämning av testkemikaliens koncentrationer (se punkterna 36 och 38).

25.

Om ett lösningsmedel används för att lösa upp testkemikalien måste man ta med ytterligare kontroller där koncentrationen av lösningsmedel är densamma som i testkulturerna.

26.

En ympkultur bereds i testmedium 2–4 dagar innan testet påbörjas. Syftet med detta är att algerna ska kunna anpassa sig till testförhållandena och befinna sig i en exponentiell tillväxtfas när de senare ympas i testlösningarna. Algbiomassan bör regleras så att ympkulturen fortsätter att tillväxa exponentiellt till dess att testet inleds. Ympkulturen inkuberas under samma förhållanden som testkulturerna. En mätning görs av ökningen av ympkulturens biomassa, så att man kan förvissa sig om att tillväxten befinner sig inom det normala intervallet för den använda stammen under rådande odlingsbetingelser. I tillägg 4 ges ett exempel på en metod för algodling. Det kan krävas ett andra förökningssteg för ympkulturen för att undvika synkron celldelning under testet.

27.

Alla testlösningar ska innehålla samma koncentration av odlingsmediet och samma startkoncentration av algbiomassan. Testlösningar av de valda koncentrationerna bereds vanligen genom att man blandar en stamlösning av testkemikalien med odlingsmedium och ympkultur. Stamlösningar brukar beredas genom upplösning av kemikalien i testmediet.

28.

Lösningsmedel som aceton, tert-butylalkohol och dimetylformamid kan användas som bärare när man tillsätter kemikalier med låg vattenlöslighet till testmediet (2) (3). Lösningsmedlets koncentration får inte överstiga 100 μl/l, och det tillsatta lösningsmedlet ska vara av samma koncentration för alla kulturer (inklusive kontroller) i testserien.

29.

Testkärlen försluts med luftgenomsläppliga proppar. Kärlen skakas och placeras sedan i odlingsutrustningen. Under testet måste man hålla algerna i suspension och underlätta ett tillräckligt stort utbyte av CO2. Därför ska innehållet hela tiden skakas eller röras om. Temperaturen i kulturerna ska vara 21–24 °C, och den ska kunna regleras med en noggrannhet av ± 2 °C. När det gäller arter som inte förtecknas i tillägg 2 (t.ex. tropiska arter) kan det vara lämpligt med en högre temperatur. Detta förutsätter dock att kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda. Kolvarna bör placeras slumpvis i inkubatorn och flyttas om dagligen.

30.

Kontrollmediets pH får inte öka med mer än 1,5 enheter under testet. När det gäller metaller samt ämnen som delvis joniseras vid det använda pH-värdet kan det vara nödvändigt att begränsa pH-förskjutningen för att få fram reproducerbara och tydliga resultat. Det går att begränsa förskjutningen till mindre än 0,5 enheter om man ser till att utbytet av CO2 mellan testlösningen och den omgivande luften är tillräckligt högt, t.ex. genom att öka skakapparatens hastighet. En annan möjlighet är att reducera behovet av CO2 genom att minska biomassans startkoncentration eller testets längd.

31.

Den yta där kulturerna inkuberas ska kontinuerligt belysas med fluorescerande ljus av enhetligt slag, t.ex. kallt vitt ljus eller dagsljus. Olika stammar av alger och cyanobakterier kan ha olika ljuskrav. Ljusets intensitet ska anpassas efter den testorganism som används. För de rekommenderade grönalgsarterna ska intensiteten mätt vid testlösningarna ligga inom intervallet 60–120 μE · m– 2 · s– 1 när mätningen görs i det fotosyntetiskt verksamma våglängdsområdet 400–700 nm med lämplig sensor. Vissa arter, särskilt Anabaena flos-aquae, tillväxer utan problem vid låga ljusintensiteter och kan även skadas vid höga intensiteter. För sådana arter ska den genomsnittliga ljusintensiteten ligga på 40–60 μE · m– 2 · s– 1. (För mätinstrument som kalibrerats i lux motsvarar den rekommenderade ljusintensiteten 60–120 μE · m– 2 · s– 1 för kallt vitt ljus ungefär 4 440–8 880 lux.) Ljusintensiteten över inkuberingsytan ska ligga inom ± 15 % från genomsnittsvärdet.

32.

Testet ska normalt pågå i 72 timmar. Man kan dock använda kortare eller längre testperioder, förutsatt att samtliga kriterier för testresultatens giltighet i punkt 11 är uppfyllda.

33.

Algbiomassan i varje kolv bestäms minst en gång per dag under testperioden. Om mätningarna görs på små volymer som pipetterats från testlösningarna ska dessa volymer inte ersättas.

34.

Biomassan bestäms genom manuell cellräkning i mikroskop eller med hjälp av en elektronisk partikelräknare (mätning av cellantal och/eller biovolym). Alternativa metoder, t.ex. flödescytometri, klorofyllfluorescens in vitro eller in vivo (5) (6) eller optisk täthet, kan också användas om man kan påvisa en tillfredsställande korrelation med biomassan för de värden på densamma som kan förekomma i testet.

35.

Lösningarnas pH mäts i början och slutet av testet.

36.

Om det finns en analytisk bestämningsmetod för testkemikalien i det valda koncentrationsintervallet ska testlösningarna analyseras för att kontrollera startkoncentrationerna och för att se till att exponeringskoncentrationerna inte förändras under testet.

37.

Om det är troligt att exponeringskoncentrationerna under testet kommer att variera med mindre än 20 % från de nominella värdena kan det räcka med att man i början och slutet av testet bestämmer testkemikaliens koncentration på tre nivåer: en hög koncentration, en låg koncentration och en koncentration runt det förväntade EC50-värdet. Om koncentrationerna av testkemikalien sannolikt inte kommer att hålla sig inom 80–120 % av de nominella värdena bör man i stället bestämma samtliga koncentrationer av testkemikalien vid testets början och slut. För flyktiga, instabila eller starkt adsorberande testkemikalier bör ytterligare prov för analys tas med 24 timmars mellanrum under hela exponeringstiden. På så vis får man ett säkrare mått på hur mycket av testkemikalien som försvinner. För dessa kemikalier kan extra replikat behövas. Under alla omständigheter behöver bestämningar av testkemikaliens koncentration bara göras på ett replikatkärl för varje testkoncentration (eller på det samlade innehållet från samtliga replikat).

38.

Testmedier som beretts särskilt för bestämning av exponeringskoncentrationer under testet ska behandlas på samma sätt som dem som används för tester, dvs. de ympas med alger och inkuberas under identiska förhållanden. Om den lösta testkemikaliens koncentration måste bestämmas kan det vara nödvändigt att isolera algerna från mediet. Isoleringen bör helst göras genom centrifugering vid lågt g-tal (men tillräckligt högt för att algerna ska kunna avskiljas).

39.

Om man kan visa att testkemikaliens koncentration på ett tillfredsställande sätt har hållits inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta startkoncentrationen genom hela testet kan analysen av resultaten baseras på nominella eller uppmätta startvärden. Om avvikelsen från den nominella eller uppmätta startkoncentrationen inte ligger inom intervallet ± 20 % ska analysen av resultaten baseras på det geometriska medelvärdet av koncentrationen under exponeringen, eller på modeller som beskriver testkemikaliens avtagande koncentration (3) (7).

40.

Bestämning av tillväxthämning hos alger är en mer dynamisk testmetod än de flesta andra akvatiska toxicitetstester med kort testperiod. De faktiska exponeringskoncentrationerna kan därför vara svåra att bestämma, särskilt för adsorberande kemikalier som testas vid låga koncentrationer. Om kemikalien i sådana fall adsorberas till den ökande algbiomassan och därför inte längre återfinns i lösning innebär det dock inte att den försvinner från testsystemet. Vid analysen av testresultatet ska man undersöka om en minskad koncentration av testkemikalien under testperioden kan korreleras med en reducerad tillväxthämning. Om så är fallet bör man överväga att genom en lämplig modell beskriva testkemikaliens minskande koncentration (7). I annat fall kan det vara motiverat att basera resultatanalysen på testkemikaliens nominella eller uppmätta startkoncentration.

41.

Kontrollera i mikroskop att ympkulturen ser normal och frisk ut. I slutet av testet ska man också notera eventuella avvikelser från algernas normala utseende (som kan ha orsakats av exponeringen för testkemikalien).

42.

Under vissa omständigheter, t.ex. när ett preliminärt test tyder på att testkemikalien inte har några toxiska effekter vid koncentrationer upp till 100 mg/l eller upp till dess löslighetsgräns i testmediet (om denna är lägre), kan man utföra ett toleranstest. Man jämför då responsen mellan en kontrollgrupp och en testgrupp (med en koncentration på 100 mg/l eller motsvarande löslighetsgränsen). Det rekommenderas starkt att jämförelsen kompletteras med en bestämning av exponeringskoncentrationen. Alla testbetingelser samt kriterier för testresultatens giltighet som beskrivits tidigare gäller även för toleranstestet, med undantaget att antalet testreplikat ska vara minst sex. Responsvariablerna i kontroll- och testgruppen kan analyseras med hjälp av ett statistiskt test där man jämför medelvärden, t.ex. Students t-test. Om de båda grupperna inte har samma varians måste t-testet anpassas efter detta.

43.

Mängden biomassa i testkärlen kan uttryckas i enheten för den alternativa parameter som används vid mätningen (t.ex. cellantal, fluorescens).

44.

De framräknade värdena för biomassans koncentration i testkulturerna och kontrollerna förs in i en tabell tillsammans med testmaterialets koncentrationer och mättidpunkterna (noterade med en upplösning på minst hela timmar). Tabellvärdena används sedan för att ta fram plottade tillväxtkurvor. Både logaritmiska och linjära skalor kan vara användbara på detta inledande stadium, men logaritmiska skalor är obligatoriska, och de ger också i allmänhet en bättre uppfattning om variationer i tillväxtmönstret under testperioden. Observera att exponentiell tillväxt motsvaras av en rak linje när den plottas på en logaritmisk skala, och att kurvans lutning anger den specifika tillväxthastigheten.

45.

Kontrollera med hjälp av plottarna om kontrollkulturerna har tillväxt exponentiellt och med förväntad hastighet under hela testet. Alla datapunkter och kurvor bör undersökas kritiskt, och rådata samt metoder bör kontrolleras med avseende på eventuella fel. Kontrollera särskilt alla datapunkter som verkar avvika på grund av systematiska fel. Om man konstaterar uppenbara eller mycket sannolika fel i testutförandet ska de berörda datapunkterna markeras som avvikande värden (’outliers’) och inte tas med i den efterföljande statistiska analysen. (Om algkoncentrationen är noll i hälften eller en tredjedel av kärlen med replikat kan detta tyda på att kärlen inte ympats på rätt sätt eller inte rengjorts ordentligt.) Det ska tydligt framgå av testrapporten varför en datapunkt betraktats som avvikande och därför inte använts. Det enda giltiga skälet är (enstaka) misstag i utförandet av testet. Dålig precision räknas däremot inte som ett giltigt skäl. Statistiska metoder för att identifiera avvikande värden är av begränsat värde när det gäller den här typen av problem, och de kan inte ersätta expertbedömningar. Avvikande värden (som markerats som sådana) bör helst behållas bland de datapunkter som visas i senare presentationer av data i grafisk form eller tabellform.

46.

Syftet med testet är att bestämma testkemikaliens effekter på tillväxten hos alger. Eftersom olika jurisdiktioner har olika prioriteringar och lagstiftningsbehov används två responsvariabler i denna testmetod. För att testresultaten ska kunna godtas i alla jurisdiktioner ska effekterna bedömas med hjälp av båda de responsvariabler (a och b) som beskrivs nedan.

(a)    Genomsnittlig specifik tillväxthastighet : responsvariabel som beräknas utifrån den logaritmiska ökningen i biomassa under testperioden, uttryckt per dygn.

(b)    Producerad mängd biomassa : responsvariabel som motsvarar skillnaden mellan den ursprungliga mängden biomassa och biomassan vid testets slut.

47.

Observera att toxicitetsvärden som beräknats utifrån de två responsvariablerna inte är jämförbara, och att denna skillnad måste framgå när man tillämpar testresultaten. ECx-värden som grundar sig på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten (ErCx) är i allmänhet högre än de som grundar sig på den producerade mängden biomassa (EyCx) om de föreskrivna testbetingelserna i denna metod är uppfyllda, beroende på den matematiska grunden i respektive fall. Detta ska dock inte tolkas som skillnader i känslighet mellan de två responsvariablerna; avvikelserna beror i stället på att de båda metoderna är olika matematiskt konstruerade. Variabeln genomsnittlig specifik tillväxthastighet är baserad på den allmänna exponentiella tillväxten hos alger i obegränsade kulturer, där toxiciteten bestäms utifrån dess effekter på tillväxthastigheten, utan att vara beroende av vare sig det absoluta värdet på kontrollens specifika tillväxthastighet, på dos-respons-kurvans lutning, eller på testets varaktighet. Resultat som i stället grundar sig på producerad mängd biomassa är däremot beroende av alla dessa övriga variabler. EyCx är beroende av den specifika tillväxthastigheten för den algart som används i varje enskilt test samt av den maximala specifika tillväxthastigheten – som kan variera mellan olika arter och t.o.m. mellan olika stammar. Denna responsvariabel ska därför inte användas för att jämföra känsligheten för toxiska ämnen mellan olika arter, eller ens olika stammar. Ur vetenskaplig synpunkt är värdet på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten att föredra för bestämning av toxiciteten, men toxicitetsbestämning med hjälp av värdet på producerad mängd biomassa har tagits med i testmetoden för att tillgodose vissa länders nuvarande lagstiftningskrav.

48.

Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten under en period beräknas som den logaritmiska ökningen i biomassa för varje enskilt kärl med kontroller och testlösningar, enligt formeln [1]:

där

Beräkna ett medelvärde av tillväxthastigheten för varje testgrupp och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar.

49.

Beräkna den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten för hela testperioden (vanligen dag 0–3). Som startvärde används det nominella värdet för ympad biomassa. Motsvarande uppmätta värde bör inte användas eftersom det i regel minskar precisionen. Om utrustningen för mätning av biomassa (t.ex. flödescytometer) ger ett tillräckligt noggrant värde på den lilla mängd som ympats kan dock biomassans uppmätta startkoncentration användas. Bestäm också den sektionsvisa tillväxthastigheten genom att beräkna den specifika tillväxthastigheten för varje dag under hela testperioden (dag 0–1, 1–2 och 2–3), och undersök om kontrollens tillväxthastighet förblir konstant (se kriterierna för testresultatens giltighet i punkt 11). En påtagligt lägre specifik tillväxthastighet under dag 1 jämfört med totalvärdet för genomsnittlig specifik tillväxthastighet kan tyda på att kulturen befinner sig i lagfas. I kontrollkulturer kan lagfasen praktiskt taget elimineras genom att förkulturen förökas på lämpligt sätt. I exponerade kulturer kan en lagfas däremot tyda på att algerna återhämtar sig efter inledande toxisk stress eller på att exponeringen minskat på grund av förlust av testkemikalien (t.ex. genom adsorption till algbiomassan) efter den inledande exponeringen. Den sektionsvisa tillväxthastigheten kan därför användas när man bestämmer testkemikaliens effekter under exponeringstiden. Stora skillnader mellan den sektionsvisa tillväxthastigheten och den genomsnittliga tillväxthastigheten tyder på att tillväxten inte varit konstant exponentiell. I sådana fall bör tillväxtkurvorna undersökas noggrant.

50.

Beräkna den procentuella minskningen av tillväxthastigheten för varje replikat med testlösning genom formeln [2]:

där

51.

Om man använder sig av lösningsmedel vid beredning av testlösningarna ska man vid beräkningen av procentuell tillväxthämning använda kontrollerna med lösningsmedel och inte kontrollerna utan lösningsmedel.

52.

Den producerade mängden biomassa motsvarar biomassan i slutet av testet minus den ursprungliga biomassan. Beräkningen görs för varje enskilt kärl med kontroller och testlösningar. Beräkna ett medelvärde av den producerade mängden biomassa för varje testkoncentration och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar. Den procentuella minskningen av den producerade mängden biomassa (%Iy) beräknas för varje replikat med testlösning med hjälp av formeln

där

53.

Plotta den procentuella tillväxthämningen mot logaritmen för testkemikaliens koncentration och undersök plotten noggrant. Datapunkter som konstaterats vara avvikande i den första fasen ska inte beaktas. För att man ska få en preliminär uppfattning om förhållandet mellan koncentration och respons sammanbinds datapunkterna med en jämn linje, antingen på fri hand eller med hjälp av datorbaserad interpolation. Använd därefter en mer ingående metod, helst en datorbaserad statistisk sådan. Beroende på ett flertal faktorer – t.ex. det avsedda användningsområdet för data, datakvalitet (precision), datamängd och tillgängliga analysverktyg för data – kan man (ibland på goda grunder) bestämma sig för att avsluta analysen av data på det här stadiet och enbart avläsa nyckeltalen EC50 och EC10 (och/eller EC20) från kurvan som ritats på fri hand (se även avsnittet om tillväxtstimulering nedan). Det finns flera giltiga skäl för att inte använda en statistisk metod, bland annat följande:

54.

Målet är att bestämma det kvantitativa förhållandet mellan koncentration och respons med hjälp av regressionsanalys. Man kan använda viktad linjär regression efter att ha gjort en linjär transformation av responsdata, t.ex. till probit-, logit- eller Weibullvärden (8). Icke-linjära regressionsmetoder är dock att föredra, eftersom de är bättre anpassade för att hantera oundvikliga oregelbundenheter i data och avvikelser från jämna fördelningskurvor. I närheten av nollpunkten (ingen tillväxthämning) och fullständig tillväxthämning kan sådana oregelbundenheter bli felaktigt uppförstorade genom linjäriseringen och därigenom störa analysen (8). Observera att standardmetoder för analys med probit-, logit- eller Weibulltransformationer är avsedda för dikotoma data (dvs. tvåpunktsfördelade data, t.ex. dödlighet–överlevnad) och därför måste modifieras för att kunna användas för data om tillväxt eller producerad mängd biomassa. Speciella metoder för bestämning av ECx-värden ur kontinuerliga data återfinns i (9), (10) och (11). Tillämpningen av icke-linjär regressionsanalys beskrivs utförligare i tillägg 5.

55.

För varje analyserad responsvariabel används förhållandet mellan koncentration och respons för att göra punktskattningar av ECx-värden. Om möjligt ska 95-procentiga konfidensgränser bestämmas för varje skattning. Anpassningsgraden (’goodness of fit’) mellan responsdata och regressionsmodellen ska bestämmas antingen grafiskt eller statistiskt. Regressionsanalysen ska göras på responsvärden från enskilda replikat, inte på medelvärden från testgrupper. Om det är svårt eller omöjligt att göra en icke-linjär kurvanpassning på grund av alltför stor spridning av data kan man i stället göra regressionen utifrån gruppmedelvärdena. Detta är en praktisk metod för att minska påverkan från misstänkta avvikande värden. Om man använder sig av denna möjlighet ska det tas med i testrapporten som en avvikelse från det normala förförandet, och motiveras med att kurvanpassningar med enskilda replikat inte gav tillfredsställande resultat.

56.

När tillgängliga regressionsmodeller eller regressionsmetoder inte lämpar sig för de aktuella dataserierna kan skattningar av EC50-värden och konfidensgränser också bestämmas genom linjär interpolation och bootstrapping (13).

57.

För skattningar av LOEC (och därmed även av NOEC) för testkemikaliens inverkan på tillväxthastigheten jämförs medelvärden från testlösningarna med hjälp av variansanalysmetoder (ANOVA). Medelvärdet för varje koncentration jämförs sedan med medelvärdet för kontrollerna med hjälp av en lämplig metod för multipeljämförelse eller trendtest, t.ex. Dunnetts eller Williams test (12) (14) (15) (16) och (17). Man måste avgöra om antagandet för ANOVA om varianshomogenitet är uppfyllt. Detta kan göras grafiskt eller med ett etablerat test (17), t.ex. Levenes eller Bartletts test. Skulle antagandet om varianshomogenitet inte vara uppfyllt kan man ibland korrigera för detta genom logaritmisk transformation av data. Om heterogeniteten i variansen är extremt stor och inte kan korrigeras genom transformation, ska man överväga att göra analysen med t.ex. Jonkheeres trendtester av ’step-down’-typ. Mer information om bestämning av NOEC finns i (11).

58.

Nya forskningsrön har lett till att man avråder från användning av NOEC-värden. I stället rekommenderas att man använder punktskattningar av ECx baserade på regressionsanalys. För detta algtest har ännu inget passande värde på x fastställts. Ett intervall på 10–20 % förefaller dock vara lämpligt, beroende på vilken responsvariabel som används. Både EC10 och EC20 bör anges i testrapporten.

59.

Ibland förekommer tillväxtstimulering (negativ hämning) vid låga koncentrationer. Detta kan antingen bero på hormesis (’toxisk stimulering’) eller på att stimulerande tillväxtfaktorer överförts från testmaterialet till det minimalmedium som används. Observera att tillsats av oorganiska näringsämnen inte bör ha någon direkt effekt, eftersom testmediet bör innehålla ett överskott av näringsämnen i förhållande till algernas behov under hela testperioden. Vid beräkningen av EC50 kan man vanligen bortse från stimulering vid låga koncentrationer, såvida inte stimuleringen är extremt stor. I det senare fallet – samt då man beräknar ECx för låga värden på x – kan det dock krävas särskilda åtgärder. Man ska så långt det är möjligt ta med stimulerande responser vid analysen av data, och om befintliga dataprogram för kurvanpassning inte kan hantera låggradig stimulering kan man i stället använda sig av linjär interpolation med bootstrapping. Om stimuleringen är extremt stor kan man överväga att använda en hormesis-modell (18).

60.

Ljusabsorberande testmaterial kan påverka tillväxthastigheten negativt eftersom de minskar mängden tillgängligt ljus. Sådana fysikaliska effekter måste kunna särskiljas från toxiska effekter genom att man ändrar testförhållandena, och fysikaliska effekter ska rapporteras separat. Riktlinjer återfinns i (2) och (3).

61.

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter:

(1)

Internationella standardiseringsorganisationen (1993). ISO 8692 Vattenundersökningar – Metod för bestämning av tillväxthämning hos encelliga sötvattenslevande grönalger.

(2)

Internationella standardiseringsorganisationen (1998). ISO/DIS 14442. Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, nr 23. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

(4)

Internationella standardiseringsorganisationen (1998). ISO 5667-16 Vattenundersökningar – Provtagning – Del 16: Riktlinjer för biologiska tester.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. och Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.

(6)

Slovacey, R. E. och Hanna, P. J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll. Limnology & Oceanography 22: 919–925.

(7)

Simpson, S. L., Roland, M. G. E., Stauber, J. L. och Batley, G. E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073–2079.

(8)

Christensen, E. R. och Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713–718.

(9)

Nyholm, N., Sørensen, P. S., Kusk, K. O. och Christensen, E. R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157–167.

(10)

Bruce, R. D. och Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485–1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD), Paris.

(12)

Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096–1121.

(13)

Norberg-King, T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.

(15)

Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.

(16)

Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531.

(17)

Draper, N. R. och Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, andra upplagan. Wiley, New York.

(18)

Brain P. och Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research 29, 93–96.

1.

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 209 (2010). Genom denna testmetod kan man bestämma effekterna av en kemikalie på mikroorganismer (främst bakterier) från aktiverat slam, genom att man mäter deras respirationshastighet (kol- och/eller ammoniumoxidation) under definierade förhållanden vid olika koncentrationer av testkemikalien. Testmetoden bygger på ETAD:s (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing Industry) test (1) (2), på den tidigare OECD-testriktlinjen TG 209 (3) och på den reviderade ISO-standarden 8192 (4). Testets syfte är att tillhandahålla en snabb screeningmetod för bedömning av kemikaliers effekter på mikroorganismerna i sådant aktivt slam som används för biologisk (aerob) nedbrytning i avloppsreningsverk. Testresultaten kan även fungera som en indikator på lämpliga icke-hämmande koncentrationer för testkemikalier som ska användas i tester av bionedbrytbarhet (t.ex. kapitlen C.4 A–F, C.9, C.10, C.12 och C.29 i denna bilaga samt OECD:s testriktlinje 302C). I detta fall kan testet utföras som ett screeningtest, liknande ett preliminärt test eller ett toleranstest (se punkt 39), som endast beaktar den totala respirationen. Denna information bör dock användas med försiktighet när det gäller tester av lätt bionedbrytbarhet (kapitlen C.4 A–F och C.29 i denna bilaga) i vilka inokulatkoncentrationen är betydligt lägre än den som används i denna testmetod. Frånvaro av hämning i detta respirationstest innebär inte automatiskt icke-hämmande förhållanden i testerna av lätt bionedbrytbarhet i kapitel C.4 A–F eller C.29 i denna bilaga.

2.

I allmänhet verkar respirationshämningstestet ha tillämpats framgångsrikt ända sedan det först offentliggjordes, men i vissa fall har felaktiga resultat rapporterats, t.ex. (2) (4) (5). Koncentrationsrelaterade respirationskurvor blir ibland bifasiska, dos-responsplottar har förvanskats och EC50-värden har varit oväntat låga (5). Undersökningar har visat att sådana resultat uppstår när det aktiverade slam som används i testet genomgår betydande nitrifikation och testkemikalien har avsevärt större inverkan på oxidationen av ammonium än på den allmänna heterotrofa oxidationen. Man kan därför få bukt med dessa felaktiga resultat genom att utföra ytterligare tester med en särskild nitrifikationshämmare. Genom att mäta syreupptagningshastigheten både i närvaro och frånvaro av en sådan hämmare, t.ex. N-allyltiourea (ATU), kan man beräkna de separata totala syreupptagningshastigheterna för heterotrof oxidation och nitrifikation (4) (7) (8). De hämmande effekterna av en testkemikalie på dessa två processer kan fastställas och EC50-värden för både heterotrof oxidation av organiskt kol och ammoniumoxidation (nitrifikation) kan beräknas på vanligt sätt. Det bör noteras att den hämmande inverkan av N-allyltiourea i vissa sällsynta fall helt eller delvis kan upphävas genom komplexbildning med testkemikalier eller tillsatser till testmediet, t.ex. Cu++-joner (6). Cu++-joner är essentiella för Nitrosomonas, men giftiga i högre koncentrationer.

3.

Behovet av nitrifikation i den aeroba reningen av avloppsvatten, ett nödvändigt steg i processen för att avlägsna kväve från avloppsvattnet genom denitrifikation till gasformiga produkter, har blivit mycket akut, särskilt i europeiska länder. EU har nu fastställt lägre gränsvärden för kvävekoncentrationen i behandlat avloppsvatten som släpps ut i mottagande vattenmassor (5).

4.

För de flesta ändamål är det lämpligt att bara använda den metod som gäller effekter på oxidationen av organiskt kol. I vissa fall kan det dock krävas en undersökning av effekterna enbart på nitrifikationen, eller på både nitrifikationen och oxidationen av organiskt kol, fast var för sig, för att man ska kunna tolka resultaten och förstå effekterna.

5.

Respirationshastigheterna i proven med aktiverat slam till vilka syntetiskt avloppsvatten tillförts mäts i en sluten cell med en syreelektrod efter en kontakttid på 3 timmar. Om exponeringsscenariot ska vara realistiskt kan det vara lämpligt med längre kontakttider. Om testkemikalien snabbt bryts ned, t.ex. abiotiskt genom hydrolys, eller är instabil och koncentrationen inte kan upprätthållas tillräckligt väl, kan även en kortare exponeringstid, t.ex. 30 minuter, användas. Känsligheten i varje parti aktiverat slam bör kontrolleras med en lämplig referenskemikalie på exponeringsdagen. Testet används vanligtvis för att bestämma ECx-värden (t.ex. EC50) för testkemikalien och/eller NOEC-värdet.

6.

Hämningen av syreupptagningen för mikroorganismer som oxiderar organiskt kol kan uttryckas separat från hämningen för mikroorganismer som oxiderar ammonium genom mätning av syreförbrukningshastigheten med och utan tillsats av n-allyltiourea, ett ämne som specifikt hämmar oxidationen av ammonium till nitrit hos de bakterier som utför första steget i nitrifikationen. I detta fall beräknas den procentuella hämningen av syreupptagningshastigheten genom en jämförelse av syreupptagningen i närvaro av testkemikalien med ett medelvärde för syreupptagningen i motsvarande kontrollprover utan testkemikalie, både i närvaro och frånvaro av n-allyltiourea.

7.

Eventuell syreupptagning till följd av abiotiska processer kan påvisas genom en bestämning av hastigheten i blandningar bestående av testkemikalie, syntetiskt avloppsvattensmedium och vatten, i vilka aktiverat slam utelämnats.

8.

Testkemikaliens identifiering (helst CAS-nummer), namn (IUPAC), renhetsgrad, vattenlöslighet, ångtryck, flyktighet och adsorptionsegenskaper bör vara kända för att möjliggöra en korrekt tolkning av resultaten. I regel kan flyktiga kemikalier inte testas på lämpligt sätt om inte särskilda åtgärder vidtas (se punkt 21).

9.

Testmetoden kan tillämpas på vattenlösliga, svårlösliga och flyktiga kemikalier. Det är dock inte alltid möjligt att få fram EC50-värden med kemikalier som har begränsad löslighet, och giltiga resultat med flyktiga kemikalier kan endast uppnås om merparten (till exempel > 80 %) av testkemikalien återstår i reaktionsblandningen i slutet av exponeringsperioden eller -perioderna. Uppgifter som utgör ytterligare analytiskt stöd bör lämnas in så att bestämningen av ECx-koncentrationen kan förbättras om man är osäker på testkemikaliens stabilitet eller flyktighet.

10.

Referenskemikalier bör regelbundet testas för att säkerställa att testmetoden och testbetingelserna är tillförlitliga, och för att på exponeringsdagen kontrollera känsligheten hos varje parti aktiverat slam som används som mikrobiellt inokulat. Kemikalien 3,5-diklorfenol (3,5-DCP) är lämplig att använda som referensinhibitorsubstans, eftersom man vet att den hämmar respirationen och används i många olika typer av tillväxthämnings- och toxicitetstester (4). Även koppar(II)sulfatpentahydrat kan användas som referensämne för hämning av den totala respirationen (9). N-metylanilin kan användas som särskild referensinhibitorsubstans för nitrifikation (4).

11.

Blankproven (utan testkemikalie eller referenskemikalie) bör inte ha en syreupptagningshastighet som är mindre än 20 mg syre per gram aktiverat slam (torrvikt suspenderade fasta ämnen) per timme. Om hastigheten är lägre bör testet upprepas med tvättat aktiverat slam eller med slam från en annan källa. Variationskoefficienten för syreupptagningshastigheten i kontrollreplikaten bör inte vara mer än 30 % i slutet av det definitiva testet.

12.

I ett internationellt ringtest från 2004 som organiserades av ISO (4) och där man använde aktiverat slam från avloppsvatten från hushåll, befanns EC50 för 3,5-DCP ligga i intervallet 2–25 mg/l för den totala respirationen, 5–40 mg/l för den heterotrofa respirationen och 0,1–10 mg/l för respirationen vid nitrifikation. Om EC50 för 3,5-DCP inte ligger inom det förväntade intervallet bör testet upprepas med aktiverat slam från en annan källa. EC50 för koppar(II)sulfatpentahydrat bör ligga i intervallet 53–155 mg/l för den totala respirationen (9).

13.

Vanlig laboratorieutrustning samt följande krävs:

14.

Reagens av analyskvalitet bör användas genomgående.

15.

Destillerat eller avjonat vatten som innehåller mindre än 1 mg/l DOC bör användas, utom då klorfritt kranvatten anges.

16.

Mediet bör beredas med följande beståndsdelar i angivna mängder:

17.

Lösningens pH bör vara 7,5 ± 0,5. Om det framställda mediet inte används omedelbart ska det förvaras mörkt vid 0–4 °C i högst en vecka eller under förhållanden som inte ändrar dess sammansättning. Det bör noteras att detta syntetiska avloppsvatten är 100 gånger mer koncentrerat än det som beskrivs i OECD:s tekniska rapport Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents av den 11 juni 1976, och att dikaliumvätefosfat dessutom har tillsatts.

18.

Alternativt kan beståndsdelarna i mediet steriliseras var för sig innan förvaring, eller så kan pepton och köttextrakt tillsättas strax innan testet utförs. Mediet bör blandas grundligt före användning och pH-värdet justeras vid behov till pH 7,5 ± 0,5.

19.

En stamlösning ska beredas för lätt vattenlösliga testämnen endast upp till maximal vattenlöslighet (utfällning får inte ske). Ämnen med låg vattenlöslighet, blandningar med komponenter av olika vattenlöslighet och adsorberande ämnen bör vägas direkt i testkärlen. I dessa fall kan användning av stamlösningar vara ett alternativ om de lösta koncentrationerna av testkemikalien bestäms analytiskt i testkärlen (innan det aktiverade slammet tillsätts). Om man bereder en WAF (water accommodated fraction), är det också viktigt att göra en analytisk bestämning av de lösta koncentrationerna av testkemikalierna i testkärlen. Man bör undvika att använda organiska lösningsmedel, emulgeringsmedel eller dispergeringsmedel för att förbättra lösligheten. Behandling med ultraljud av stamlösningar och suspensioner innan de rörs om, t.ex. över natten, är möjligt när det finns tillräcklig information om testkemikaliens stabilitet under sådana förhållanden.

20.

Testkemikalien kan ha en negativ inverkan på pH-värdet i testsystemet. pH-värdet i blandningar som behandlats med testkemikalien bör fastställas före testet i ett preliminärt försök, för att ta reda på om det är nödvändigt att göra en justering av pH-värdet innan huvudtestet, och återigen på samma dag som huvudtestet. Lösningar eller suspensioner av testkemikalien i vatten bör vid behov neutraliseras innan inokulatet tillsätts. Beroende på undersökningens syfte kan dock ytterligare tester utföras för att bedöma effekten av testkemikalien på slammet utan pH-justering, eftersom neutraliseringen kan påverka kemikaliens kemiska egenskaper.

21.

De toxiska effekterna av flyktiga kemikalier, i synnerhet i tester där luft bubblas genom systemet, kan leda till att varierande effekter uppstår på grund av förlust av ämnet under exponeringstiden. Försiktighet bör iakttas när sådana ämnen används genom att man utför en ämnesspecifik analys av kontrollblandningar som innehåller ämnet och genom att man ändrar genomluftningen.

22.

Om 3,5-diklorfenol används som referenskemikalie bereds en lösning med 1,00 g 3,5-diklorfenol i 1 000 ml vatten (15). Varmt vatten och/eller ultraljud används för att påskynda upplösningen och späda lösningen till önskad volym när den har svalnat till rumstemperatur. Det bör dock säkerställas att referenskemikalien inte förändras strukturellt. Lösningens pH-värde kontrolleras och justeras vid behov med NaOH eller H2SO4 till pH 7–8.

23.

Om koppar(II)sulfatpentahydrat används som referenskemikalie bereds lösningar med koncentrationerna 58 mg/l, 100 mg/l och 180 mg/l (en faktor 1,8). Ämnet vägs upp direkt i testkärlen (29 – 50 – 90 mg för en total volym på 500 ml) och löses sedan upp i 234 ml autoklaverat kranvatten. Koppar(II)sulfatpentahydrat är lättlösligt. När testet inleds tillsätts 16 ml syntetiskt avloppsvatten och 250 ml aktiverat slam.

24.

En 2,32 g/l stamlösning av n-allyltiourea (ATU) bereds. Om 2,5 ml av denna lösning tillsätts i en inkuberingsblandning med slutlig volym på 500 ml blir resultatet en slutkoncentration på 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), vilket är tillräckligt (4) för att orsaka en 100-procentig hämning av nitrifikationen i ett nitrifierande aktiverat slam som innehåller 1,5 g/l suspenderade fasta ämnen.

25.

I vissa sällsynta fall kan en testkemikalie med starkt reducerande egenskaper orsaka en mätbar abiotisk syreförbrukning. I sådana fall kan det vara nödvändigt att ha abiotiska kontroller för att skilja mellan testkemikaliens abiotiska syreförbrukning och mikrobiell respiration. Abiotiska kontroller kan beredas genom att man utelämnar inokulatet från testblandningarna. På samma sätt kan abiotiska kontroller utan inokulat inkluderas när analytiska stödmätningar utförs för att fastställa den uppnådda koncentrationen under testets exponeringsfas, t.ex. när man använder stamlösningar med kemikalier som är svårlösliga i vatten tillsammans med komponenter som har olika vattenlöslighet. I särskilda fall kan det vara nödvändigt att bereda en abiotisk kontroll med ett sterilt inokulat (t.ex. genom autoklavering eller tillsättning av steriliserande toxiska ämnen). Vissa kemikalier kan endast producera eller förbruka syre om ytarean är tillräckligt stor för att en reaktion ska inträffa, även om de normalt sett behöver mycket högre temperatur eller tryck för detta. I detta avseende bör särskild uppmärksamhet ägnas åt peroxidiska ämnen. Steriliserade inokulat ger en stor yta.

26.

Aktiverat slam för allmän användning samlas in från (eller nära) utloppet på luftningstanken hos ett väl fungerande reningsverk som huvudsakligen behandlar avloppsvatten från hushåll. Beroende på testets syfte kan även andra lämpliga typer av eller källor för aktiverat slam användas, t.ex. slam som framställts i laboratoriet. Slammet ska ha en lämplig koncentration av suspenderade fasta ämnen, 2–4 g/l. Slam från olika reningsverk har dock ofta olika egenskaper och känslighet.

27.

Slammet kan användas som det är när det samlas in, men grova partiklar bör avlägsnas genom sedimentering under en kort period, t.ex. 5–15 minuter, följt av dekantering av det översta skiktet med finkornigare fasta ämnen eller sållning (t.ex. genom en sikt med maskstorleken 1 mm). Alternativt kan slammet homogeniseras i blandare i ca 15 sekunder eller längre, men försiktighet krävs med tanke på de skjuvkrafter och temperaturförändringar som kan uppstå vid långa blandningstider.

28.

Det är ofta nödvändigt att tvätta slammet, t.ex. om den endogena respirationshastigheten är låg. Slammet bör först centrifugeras, t.ex. i 10 minuter vid ca 10 000 m/s2, så att det bildas en klar supernatant samt en pellet bestående av avloppsvattnets fasta beståndsdelar. Supernatanten kasseras och slammet återsuspenderas i klorfritt kranvatten under skakning. Tvättvattnet avlägsnas sedan genom att slammet åter centrifugeras och supernatanten kasseras. Tvätt och centrifugering upprepas vid behov. Torrvikten hos en känd volym av det återsuspenderade slammet fastställs, och slammet ska antingen koncentreras genom att vätska avlägsnas eller spädas ytterligare i klorfritt kranvatten så att man uppnår den erforderliga koncentrationen för slammets fasta beståndsdelar på 3 g/l. Det aktiverade slammet luftas kontinuerligt (t.ex. 2 l/minut) vid testtemperaturen, och det bör helst användas samma dag som det samlas in. Om detta inte är möjligt ska syntetiskt avloppsvatten (50 ml syntetiskt avloppsvatten/liter aktiverat slam) tillföras slammet dagligen i ytterligare två dagar. Slammet används därefter i testet och resultaten betraktas som giltiga, förutsatt att inga betydande förändringar av slammets aktivitet har inträffat. Detta avgörs genom en bestämning av slammets endogena heterotrofa och nitrifierande respirationshastighet.

29.

Svårigheter kan uppstå om skumbildning inträffar under inkuberingsfasen i sådan omfattning att skummet och de partiklar från slammet som är suspenderade i skummet svämmar ut ur luftningskärlen. Ibland förekommer skumbildning på grund av närvaron av syntetiskt avloppsvatten, men man måste räkna med skumbildning om testkemikalien består av eller innehåller ett ytaktivt ämne. Förlust av fasta ämnen i slammet från testblandningarna leder till artificiellt minskade respirationshastigheter som felaktigt kan tolkas som en följd av hämning. Det ytaktiva ämnet koncentreras dessutom i skumlagret vid luftning av lösningen med det ytaktiva ämnet. Förlust av skum från testsystemet sänker exponeringskoncentrationerna. Skumbildningen kan kontrolleras genom enkla mekaniska metoder (t.ex. sporadisk manuell omrörning med en glasstav) eller genom att tillsätta ett skumdämpande ämne bestående av en silikonemulsion som är fri från ytaktiva ämnen och/eller genom att lufta lösningen med skakkolvmetoden. Om problemet härrör från närvaron av syntetiskt avloppsvatten bör sammansättningen av avloppsvattnet modifieras genom att man tillsätter en skumdämpande reagens, med en mängd på t.ex. 50 μl/l. Om skumbildningen orsakas av testkemikalien bör den kvantitet som behövs för att dämpa skumbildningen fastställas vid den högsta testkoncentrationen, och därefter bör alla enskilda luftningskärl behandlas identiskt (inklusive kärl i vilka inget skum förekommer, t.ex. blankprov och referenskärl). Om skumdämpande medel används bör det inte förekomma någon interaktion med inokulatet och/eller testkemikalien.

30.

Man kan fastställa hämningen av tre olika syreupptagningar: totalt, endast heterotrof, och syreupptagning på grund av nitrifikation. Normalt bör det räcka att mäta hämningen av den totala syreupptagningen. Man behöver känna till effekterna på den heterotrofa syreupptagningen vid oxidering av organiskt kol och på grund av oxidation av ammonium om det finns ett särskilt krav på dessa två endpoints för en viss kemikalie eller (alternativt) för att förklara atypiska dos-responskurvor genom hämning av den totala syreupptagningen.

31.

Testet bör utföras vid en temperatur på 20 ± 2 °C.

32.

Testblandningar (FT som i tabell 1) som innehåller vatten, syntetiskt avloppsvatten och testkemikalien bereds så att olika nominella koncentrationer av testkemikalien erhålls (se tabell 1 för exempel på beståndsdelarnas mängder). Vid behov justeras pH-värdet till 7,5 ± 0,5. Blandningarna späds med vatten och inokulatet tillsätts så att lika slutvolymer i kärlen uppnås och luftningen kan inledas.

33.

Blandningar (FR) bereds på samma sätt som testblandningarna, med referenskemikalien, t.ex. 3,5-diklorfenol, som ersättare för testkemikalien.

34.

Blankprov (FB) bereds i början och slutet av exponeringstiden i prov där testbägarna upprättas sekventiellt med jämna mellanrum. Vid tester som görs med utrustning som möjliggör samtidiga mätningar av syreförbrukningen inkluderas minst två blankprov i varje parti som analyseras samtidigt. Blankproven ska innehålla samma volym aktiverat slam och syntetiskt medium men inga test- eller referenskemikalier. De späds med vatten till samma volym som test- och referensblandningarna.

35.

Vid behov, t.ex. om testkemikalien är känd för eller misstänks ha starkt reducerande egenskaper, bör en blandning FA beredas för mätning av den abiotiska syreförbrukningen. Blandningen bör ha samma mängd testämne och syntetiskt avloppsvatten och samma volym som testblandningarna, men sakna aktiverat slam.

36.

Testblandningar, referensblandningar, blankprov och abiotiska kontroller inkuberas vid testtemperaturen under forcerad luftning (0,5–1 l/min) så att halten löst syre hålls över 60–70 % mättnad och det flockade slammet förblir suspenderat. Det är också nödvändigt med omrörning i kulturerna för att se till att det flockade slammet förblir suspenderat. Inkuberingen påbörjas när inokulatet med aktiverat slam för första gången kommer i kontakt med övriga beståndsdelar i den slutliga blandningen. Vid inkuberingens slut, efter den angivna exponeringstiden på vanligtvis 3 timmar, ska prover tas för mätning av hur snabbt halten löst syre avtar i den cell som utformats för detta ändamål (figur 2 i tillägg 3) eller i en helt fylld BOD-kolv. Det sätt på vilket inkuberingarna inleds beror också på den använda utrustningens kapacitet att mäta syreförbrukningshastigheten. Om det till exempel ingår en enda syresond görs mätningarna var och en för sig. I förevarande fall måste de olika blandningar som behövs för testet av syntetiskt avloppsvatten beredas men inokulatet bör inte tillsättas, och de erforderliga volymerna slam bör tillsättas i varje kärl i satsen. Varje inkubering bör inledas successivt efter lämpligt valda intervaller på t.ex. 10–15 minuter. Alternativt kan mätsystemet utgöras av flera sonder som möjliggör flera samtidiga mätningar. I sådana fall kan inokulatet tillsättas samtidigt i lämpliga grupper med kärl.

37.

Koncentrationen för det aktiverade slammet i alla test- och referensblandningar samt blankproven (men inte de abiotiska kontrollerna) är nominellt 1,5 g/l för suspenderade fasta ämnen. Syreförbrukningen bör mätas efter 3 timmars exponering. Ytterligare mätningar efter 30 minuters exponering bör utföras om så är lämpligt och på det sätt som beskrivs ovan i punkt 5.

38.

För att avgöra om slam nitrifieras och, om så är fallet, med vilket hastighet, bör man bereda blandningar (FB) som i blankproven och ytterligare ’kontroll’-blandningar (FN) men som även innehåller 11,6 mg/l n-allyltiourea. Blandningarna luftas och inkuberas vid 20 ± 2 °C i 3 timmar. Därefter mäts syreupptagningshastigheten, och hastigheten för syreupptagning på grund av nitrifikation beräknas.

39.

Ett preliminärt test används vid behov för att uppskatta de koncentrationer av testkemikalien som behövs i det definitiva testet för bestämning av hämningen av syreförbrukningen. Alternativt kan det faktum att testkemikalien inte hämmar syreförbrukningen i ett preliminärt test visa att det definitiva testet är onödigt, men tre exemplar vid den högsta testade koncentrationen i det preliminära testet (vanligen 1 000 mg/l, men kravet på data avgör) bör inkluderas.

Tabell 1

Exempel på blandningar för det inledande testet

40.

Testet bör utföras med minst tre koncentrationer av testkemikalien, t.ex. 10 mg/l, 100 mg/l och 1 000 mg/l med ett blankprov och, vid behov, minst tre abiotiska kontroller med den högsta koncentrationen av testkemikalien (se tabell 1 som exempel). Helst ska de lägsta koncentrationerna inte ha någon inverkan på syreförbrukningen. Syreupptagningshastigheterna och nitrifikationshastigheten bör beräknas (om tillämpligt), och därefter bör den procentuella hämningen beräknas. Beroende på testets syfte är det även möjligt att helt enkelt fastställa toxiciteten för en koncentrationsgräns, t.ex. 1 000 mg/l. Om det inte förkommer några statistiskt signifikanta toxiska effekter vid denna koncentration är det inte nödvändigt att utföra ytterligare tester vid högre eller lägre koncentrationer. Det bör noteras att ämnen som är svårlösliga i vatten, blandningar med komponenter som har olika vattenlöslighet och adsorberande ämnen bör vägas upp direkt i testkärlen. I detta fall ska den volym som reserverats för stamlösningen med testämnet ersättas med utspädningsvatten.

41.

Testet bör utföras med en serie koncentrationer som härleds från det preliminära testet. För att få fram både NOEC och ECx (t.ex. EC50) bör man i de flesta fall ha sex kontroller och fem testkoncentrationer i en geometrisk serie med fem replikat. Den abiotiska kontrollen behöver inte upprepas om det inte förelåg någon syreupptagning i det preliminära testet, men om det förekom betydande syreupptagning bör abiotiska kontroller inkluderas för varje koncentration av testkemikalien. Slammets känslighet bör kontrolleras med hjälp av referenskemikalien 3,5-diklorfenol. Slammets känslighet bör kontrolleras för varje testserie, eftersom känsligheten ofta varierar. Under alla omständigheter ska prover tas från testkärlen efter 3 timmar, och vid behov efter ytterligare 30 minuter, för mätning av syreupptagningshastigheten i syreelektrodcellen. På basis av insamlade data kan kontrollens och testblandningarnas särskilda respirationshastigheter beräknas, och den procentuella hämningen beräknas sedan med hjälp av ekvation 7 nedan.

42.

Genom användning av den särskilda nitrifikationshämmaren, ATU, kan man direkt bedöma de hämmande effekterna av testkemikalierna på den heterotrofa oxideringen, och genom att subtrahera syreupptagningshastigheten med ATU från den totala upptagningshastigheten (utan ATU), kan effekterna på nitrifikationshastigheten beräknas. Två uppsättningar med reaktionsblandningar bör beredas i enlighet med de testupplägg för ECx eller NOEC som beskrivs i punkt 41, men ATU bör dessutom läggas till för varje blandning i en uppsättning med en slutlig koncentration på 11,6 mg/l, vilket har visat sig hämma nitrifikationen helt i slam med koncentrationer för suspenderade fasta ämnen på upp till 3 000 mg/l (4). Syreupptagningshastigheterna bör mätas efter exponeringstiden. Dessa direkta värden representerar endast den heterotrofa respirationen, och skillnaderna mellan dessa och motsvarande värden för den totala respirationen utgörs av nitrifikationen. De olika graderna av hämning ska därefter beräknas.

43.

Efter exponeringstiden överförs ett prov från det första luftningskärlet till syreelektrodcellen (figur 1 i tillägg 2) och halten löst syre mäts omedelbart. Om ett system med flera elektroder finns att tillgå kan mätningarna göras samtidigt. Det är av avgörande betydelse att omrörning (med hjälp av en belagd magnet) sker i samma takt som när elektroden kalibrerades för att se till att sonden svarar med minimal fördröjning på de växlande syrekoncentrationerna och för att möjliggöra regelbundna och reproducerbara mätningar av syre i mätkärlet. Det är ofta tillräckligt med det självomrörande sondsystem som vissa syreelektroder är utrustade med. Cellen bör sköljas med vatten mellan mätningarna. Alternativt kan provet användas för att fylla en BOD-kolv (figur 2 i tillägg 3) försedd med en magnetisk omrörare. En syresond med en övergångsmuff förs sedan in i flaskans hals och magnetomröraren sätts på. I båda fallen mäts halten löst syre kontinuerligt och registreras under en viss tid, vanligen fem till tio minuter eller till dess att syrekoncentrationen fallit under 2 mg/l. Elektroden avlägsnas därefter, och blandningen återförs till luftningskärlet, där luftningen och omrörningen fortsätter om det är nödvändigt att göra mätningar efter längre exponeringstider.

44.

För vissa ändamål kan det vara nödvändigt att mäta koncentrationen av testkemikalien i testkärlen. Det bör noteras att om stamlösningar av

används är den lösta delen okänd, och den verkliga koncentrationen av testkemikalien som överförs till testkärlen är okänd. För att karakterisera exponeringen är det nödvändigt att göra en analytisk bedömning av testkemikaliens koncentrationer i testkärlen. För att förenkla saken bör den analytiska bedömningen utföras innan inokulatet tillsätts. Eftersom endast upplösta fraktioner överförs till testkärlen kan de uppmätta koncentrationerna vara mycket låga.

45.

För att undvika tidsödande och dyra analyser är det bäst att helt enkelt väga testkemikalien i testkärlen och att hänvisa till den ursprungliga vägda nominella koncentrationen för påföljande beräkningar. Det är inte nödvändigt att differentiera mellan upplösta, oupplösta eller adsorberade fraktioner av testkemikalien eftersom alla dessa fraktioner förekommer även under verkliga förhållanden i ett reningsverk, och de kan variera beroende på sammansättningen av avloppsvattnet. Syftet med testmetoden är att göra en bedömning av en icke-hämmande koncentration under realistiska förhållanden, och det är inte lämpligt att i detalj undersöka vilka fraktioner som bidrar till hämningen av organismerna i det aktiverade slammet. Slutligen bör de adsorptiva ämnena också vägas direkt i testkärlen, och kärlen bör silaniseras för att minimera förlusterna genom adsorption.

46.

Syreupptagningshastigheterna bör beräknas utifrån medelvärdet av de uppmätta värdena, t.ex. utifrån den linjära delen av kurvorna för syrekoncentrationen avsatt mot tiden, och beräkningarna bör då inskränkas till syrekoncentrationer på mellan 2,0 mg/l och 7,0 mg/l eftersom högre och lägre koncentrationer i sig kan påverka förbrukningshastigheten. Avvikelser till koncentrationsintervaller under eller över dessa värden är ibland oundvikliga och nödvändiga, t.ex. när respirationen är starkt hämmad och följaktligen mycket långsam, eller om ett visst aktiverat slam respirerar mycket snabbt. Detta kan godtas under förutsättning att de utvidgade delarna av upptagningskurvan är raka och deras lutningar inte ändras när de passerar gränsvärdena på 2,0 mg/l eller 7,0 mg/l O2. Alla böjda delar av kurvan visar att mätsystemet håller på att stabiliseras eller att upptagningshastigheten håller på att ändras, och de bör inte användas för beräkning av respirationen. Syreupptagningshastigheten bör uttryckas i milligram per liter per timme (mg/lh) eller milligram per gram torrt slam per timme (mg/gh). Syreförbrukningshastigheten, R, i mg/lh kan beräknas eller interpoleras från den linjära delen av den registrerade syreminskningskurvan enligt ekvation 1:

där

47.

Den särskilda respirationshastigheten (RS) uttrycks som mängden förbrukat syre per g torrvikt slam per timme (mg/gh) enligt ekvation 2:

där SS är koncentrationen av de suspenderade fasta ämnena i testblandningen (g/l).

48.

De olika exponenterna för R som kan kombineras är följande:

49.

Förhållandet mellan den totala resprationen (RT), respirationen genom nitrifikation (RN) och den heterotrofa respirationen (RH) beräknas med formel 3:

där

50.

Detta förhållande gäller för blankvärden (RNB, RTB, RHB), abiotiska kontroller (RNA, RTA, RHA) och prover med testkemikalier (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Särskilda respirationshastigheter beräknas utifrån

51.

Om RN är obetydligt stor (t.ex. < 5 % av RT i blankproven) i ett preliminärt test kan man utgå från att den heterotrofa syreupptagningen är lika med den totala upptagningen och att ingen nitrifikation pågår. En alternativ källa för aktiverat slam behövs om testerna ska ta hänsyn till effekterna på heterotrofa och nitrifierande mikroorganismer. Ett definitivt test utförs om det finns tecken på hämmade syreupptagningshastigheter med olika koncentrationer av testkemikalien.

52.

Den procentuella hämningen IT av den totala syreförbrukningen vid varje koncentration av testkemikalien kan beräknas med ekvation 7:

53.

På samma sätt kan den procentuella hämningen av den heterotrofa syreupptagningen IH vid varje koncentration av testkemikalien beräknas med ekvation 8:

54.

Slutligen kan hämningen av syreupptagningen på grund av nitrifikation IN vid varje koncentration beräknas med ekvation 9:

55.

Den procentuella hämningen av syreupptagningen plottas mot logaritmen av testkemikaliens koncentration (hämningskurva, se figur 3 i tillägg 4). Hämningskurvor plottas för varje luftningsperiod på 3 timmar eller dessutom efter ytterligare 30 minuter. Den koncentration av testkemikalien som hämmar syreupptagningen med 50 % (EC50) bör beräknas eller interpoleras utifrån kurvan. Om lämpliga data finns tillgängliga, kan de 95-procentiga konfidensgränserna för EC50, kurvans lutning, och lämpliga värden som markerar början (till exempel EC10 eller EC20) och slutet av hämningsintervallet (till exempel EC80 eller EC90) beräknas eller interpoleras.

56.

Det bör noteras att det mot bakgrund av den variabilitet som ofta förekommer i resultaten i många fall kan vara tillräckligt att redovisa resultaten i storleksordning, till exempel

57.

ECx-värden, inklusive deras sammanhörande nedre och övre 95-procentiga konfidensgränser för parametern i fråga, beräknas med hjälp av lämpliga statistiska metoder (t.ex. probit-analys, logistiska funktioner eller Weibull-funktioner, den modifierade Spearman-Kärbermetoden eller enkel interpolering (11)). ECx beräknas genom att ett värde som motsvarar x % av medelvärdet för kontrollen införs i den ekvation som erhållits. För att beräkna EC50 eller något annat ECx-värde bör en regressionsanalys utföras på medelvärdena för varje testkärl (x).

58.

Om en statistisk analys används för att bestämma NOEC är det nödvändigt att sammanställa statistiska uppgifter för varje enskilt kärl (enskilda kärl anses utgöra replikat). Lämpliga statistiska metoder bör användas i enlighet med OECD:s dokument Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (11). I allmänhet ska negativa effekter av testkemikalien jämfört med kontrollsubstansen undersökas genom en ensidig (mindre) hypotesprövning vid p ≤ 0,05.

59.

Testrapporten ska innehålla följande information:

(1)

Brown, D., Hitz, H. R. och Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245–261.

(2)

King, E. F. och Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27–39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test. Testriktlinje nr 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Vattenundersökningar – Metod för bestämning av hämning av syreförbrukning hos mikroorganismer i aktivt slam (kol- och ammonium-oxidation), Internationella standardiseringsorganisationen.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Dokument ISO/TC147/WGI/N.183, Internationella standardiseringsorganisationen.

(6)

Painter, H. A. och Jones, K. (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471–483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1: 515–524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. och Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 Nr 12b: 1556–1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Vattenundersökningar – Handledning för beredning och handhavande av i vatten svårlösliga organiska föreningar för efterföljande utvärdering av deras bionedbrytbarhet i vattenlösning, Internationella standardiseringsorganisationen.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment nr 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1.

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 221 (2006). Den är avsedd för bestämning av kemikaliers toxicitet för sötvattensväxter av släktet Lemna (andmat). Den bygger på befintliga metoder (1) (2) (3) (4) (5) (6), men har modifierats på några viktiga punkter i enlighet med nya forskningsrön och till följd av samråd. Testmetoden har validerats genom ett internationellt ringtest, dvs. en testjämförelse mellan olika laboratorier i världen (7).

2.

Metoden används för toxicitetstest på arterna Lemna gibba och Lemna minor. Båda dessa arter har studerats ingående och använts i test med de standardmetoder som det hänvisas till ovan. Taxonomin för Lemna spp. är komplicerad på grund av mångfalden fenotyper. Hos Lemna kan responsen på toxiska substanser variera p.g.a. genetiska skillnader, men för närvarande finns det inte tillräckligt med data om denna källa till variation för att man ska kunna rekommendera en bestämd klon för användning i den aktuella testmetoden. Observera att testet inte utförs axeniskt (dvs. med en monokultur fri från infektion av mikroorganismer), men åtgärder vidtas vid ett antal tillfällen under testets gång för att hålla kontaminationen från andra organismer så låg som möjligt.

3.

Dokumentet innehåller ingående beskrivningar av testförfaranden med regelbunden förnyelse av testlösningar (semistatiskt test och genomflödestest) och utan förnyelse av testlösningar (statiskt test). Beroende på lagstadgade krav och syftet med testet kan semistatiskt test eller genomflödestest komma i fråga i vissa fall, t.ex. för kemikalier som snabbt försvinner ur lösningen genom avdunstning, ljusnedbrytning, utfällning eller bionedbrytning. Närmare riktlinjer finns i (8).

4.

De definitioner som används finns i tillägg 1.

5.

Exponentiellt växande växtkulturer av släktet Lemna får växa som monokulturer i olika koncentrationer av testkemikalien under loppet av sju dagar. Syftet är att genom bestämning av utvalda mätvariabler kvantifiera testkemikaliens effekter på tillväxten under tiden för testets genomförande. Antalet fronder är den primära mätvariabeln. Minst ytterligare en mätvariabel – total frondarea, torrvikt eller färskvikt – mäts, eftersom en del kemikalier kan påverka andra mätvariabler mer än de påverkar frondantalet. För att kvantifiera testkemikaliens effekter jämförs tillväxten i testlösningarna med tillväxten i kontrollerna. Därefter bestäms den koncentration som åstadkommer en bestämd procent (x) av tillväxthämning, t.ex. 50 %. Denna koncentration betecknas som ECx, t.ex. EC50 i fallet med 50 % tillväxthämning.

6.

Endpoint i testet är tillväxthämning, uttryckt som den logaritmiska ökningen av mätvariabeln (den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten) under exponeringstiden. Från de genomsnittliga specifika tillväxthastigheter som uppmätts i en serie testlösningar fastställer man den koncentration av testkemikalien som ger upphov till en specificerad minskning av tillväxthastigheten, x % (t.ex. 50 %). Värdet uttrycks som ErCx (t.ex. ErC50).

7.

I den här testmetoden används även producerad mängd biomassa som responsvariabel, något som kan vara nödvändigt för att uppfylla gällande krav i vissa länder. Den definieras som storleken på en mätvariabel vid exponeringstidens slut minus storleken på samma mätvariabel vid exponeringstidens början. Med utgångspunkt i den mängd biomassa som producerats i en serie testlösningar beräknar man den koncentration av testkemikalien som ger upphov till en viss, fastställd minskning av mängden producerad biomassa, x % (t.ex. 50 %). Detta värde uttrycks som EyCx (t.ex. EyC50).

8.

Den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC) och den högsta koncentrationen utan observerad effekt (NOEC) kan också bestämmas statistiskt.

9.

Man bör ha tillgång till en analysmetod som är tillräckligt känslig för kvantitetsbestämning av testkemikalien i testmediet.

10.

Bland annat följande uppgifter om testkemikalien kan vara av värde när man fastställer testbetingelserna: strukturformel, renhetsgrad, vattenlöslighet, stabilitet i vatten och ljus, pKa, Kow, ångtryck och bionedbrytbarhet. Löslighet i vatten och ångtryck kan användas för att beräkna Henrys konstant, som visar om det är sannolikt att förlusterna av testkemikalien under testets genomförande kommer att vara betydande. Detta ger en indikation på om man behöver vidta åtgärder för att kontrollera dessa förluster. Om uppgifterna om testkemikaliens löslighet och stabilitet är osäkra, bör man bedöma dessa egenskaper under testbetingelserna, dvs. i det odlingsmedium, vid den temperatur och under de belysningsförhållanden som används i testet.

11.

När det är särskilt viktigt att reglera testmediets pH, t.ex. vid test av hydrolytiskt instabila metaller eller kemikalier (dvs. sådana som bryts ned i vatten), bör man tillsätta en buffert i odlingsmediet (se punkt 21). Närmare vägledning för testning av kemikalier vars fysikalisk-kemiska egenskaper gör dem svåra att testa finns i (8).

12.

För att testresultaten ska vara giltiga måste fördubblingstiden för frondantalet i kontrollen vara mindre än 2,5 dagar (60 timmar). Det motsvarar en ökning på ca 700 % på 7 dagar och en genomsnittlig specifik tillväxthastighet på 0,275 d– 1. Med de testmedier och testbetingelser som beskrivs för den aktuella testmetoden kan detta kriterium uppfyllas med ett statiskt testförfarande (5). Kriteriet bör också kunna uppfyllas vid semistatiskt testförfarande och genomflödestest. Beräkningen av fördubblingstiden beskrivs i punkt 49.

13.

Referenskemikalie(r), t.ex. 3,5-diklorfenol, som används i det internationella ringtestet (7), kan testas för att kontrollera testförfarandet. Det är lämpligt att testa en referenskemikalie minst två gånger per år eller, om testen utförs mer sällan, parallellt med fastställandet av en testkemikalies toxicitet.

14.

All utrustning som befinner sig i kontakt med testmedier ska vara av glas eller annat kemiskt inert material. Glasutrustning som används för odling och test ska vara rengjord från kemiska föroreningar som kan läcka in i testmediet, och glaset ska vara sterilt. Provkärlen ska vara så vida att fronderna från de olika kolonierna i kontrollerna kan växa utan att de täcker varandra i slutet av testet. Det gör inget om rötterna vidrör botten av provkärlen, men alla provkärl bör vara minst 20 mm djupa och ha en volym på minst 100 ml. Så länge dessa krav är uppfyllda har valet av provkärl ingen avgörande betydelse. Glasbägare och kristalliseringsskålar samt petriskålar av glas – alla med passande storlekar – har alla visat sig vara lämpliga. Provkärlen måste vara tillslutna för att avdunstning och oavsiktlig kontamination ska hållas så låg som möjlig, samtidigt som erforderlig luftväxling ska vara möjlig. Provkärlen – framför allt lock, proppar eller andra typer av förslutningar – måste vara sådana att det inte förekommer någon skuggverkan eller förändringar av ljusets spektrala egenskaper.

15.

Odlingar och provkärl får inte förvaras tillsammans. Bäst är att använda separata klimatodlingskammare, inkubatorer eller klimatrum. Belysning och temperatur måste kunna regleras och hållas på konstant nivå (se punkterna 35–36).

16.

Som organism för testet används Lemna gibba eller Lemna minor. Tillägg 2 innehåller kortfattade beskrivningar av andmatsarter som har använts för toxicitetstest. Växtmaterial kan tas från en kultursamling, införskaffas från ett annat laboratorium eller samlas in i naturen. Innan de används ska plantor som samlats in i naturen hållas i samma medium som används för testet under minst åtta veckor. Det får inte finnas några uppenbara kontaminationskällor på platser som används för insamling i naturen. Växtmaterial som införskaffas från andra laboratorier eller från kultursamlingar ska förvaras under minst tre veckor på samma sätt som plantor från naturen. Om ursprunget är känt ska detta alltid redovisas för växtmaterialet, de arter och den klon som används för testet.

17.

Man ska använda monokulturer utan synliga föroreningar i form av andra organismer såsom alger och protozoer. Friska plantor av L. minor består av kolonier med mellan två och fem fronder, medan friska kolonier av L. gibba kan omfatta upp till sju fronder.

18.

Kvaliteten och enhetligheten hos plantorna som används för testet har stor betydelse för testresultatet, och de bör därför väljas ut med omsorg. Man bör använda unga, snabbväxande plantor utan synliga skador eller missfärgningar (p.g.a. kloros). Att en kultur är av god kvalitet kännetecknas av att den har en stor andel kolonier med minst två fronder. Ett stort antal enstaka fronder är ett tecken på miljöstress, t.ex. på grund av näringsbrist. Växtmaterial från sådana kulturer bör inte användas för tester.

19.

För att göra odlingen mindre arbetskrävande – t.ex. när inga test av Lemna är inplanerade under en längre tid – kan kulturerna förvaras under reducerad belysning och temperatur (4–10 °C). Uppgifter om behandling av stamkulturer finns i tillägg 3. Om det finns tydliga tecken på föroreningar i form av alger eller andra organismer krävs ytsterilisering av ett delprov av fronder från Lemna. Detta förs sedan över till ett färskt medium (se tillägg 3). I detta fall måste den återstående delen av den kontaminerade kulturen kasseras.

20.

Minst sju dagar före testet förs en tillräcklig mängd kolonier aseptiskt över till färskt medium och odlas under 7–10 dagar under testbetingelser.

21.

För Lemna minor och Lemna gibba rekommenderas olika medier (se nedan). Man bör noggrant överväga om man ska tillsätta en pH-buffert i testmediet (MOPS (4-morfolinopropansulfonsyra, CAS-nr 1132-61-2) i mediet för L. minor och NaHCO3 i mediet för L. gibba) när man misstänker att mediet kan reagera med testkemikalien och påverka dess toxicitetseffekt. Steinbergs medium (9) kan också användas förutsatt att kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda.

22.

En modifierad form av det odlingsmedium för Lemna som är standardiserat av det svenska standardiseringsorganet SIS rekommenderas för odling av och test med L. minor. Sammansättningen av detta medium återfinns i tillägg 4.

23.

Odlingsmediet 20X-AAP, som beskrivs i tillägg 4, rekommenderas för odling av och test med L. gibba.

24.

Steinbergs medium, som beskrivs i tillägg 4, passar också för L. minor men kan också användas för L. gibba så länge kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda.

25.

Testlösningarna bereds vanligtvis genom utspädning av en stamlösning. Stamlösningar av testkemikalien bereds normalt genom att kemikalien löses upp i ett odlingsmedium.

26.

Den högsta koncentrationen av testkemikalien bör normalt inte överskrida dess vattenlöslighet under testbetingelserna. Observera dock att Lemna spp. flyter på vätskeytan och kan exponeras för kemikalier som samlas i gränsytan mellan vatten och luft, t.ex. hydrofoba eller ytaktiva kemikalier eller kemikalier med låg vattenlöslighet. Under sådana omständigheter kommer plantan att exponeras för andra koncentrationer av kemikalien än de som förekommer i lösningen. Koncentrationerna kan därför – beroende på testkemikaliens egenskaper – överskrida vattenlösligheten. För testkemikalier med låg vattenlöslighet kan det bli nödvändigt att bereda en koncentrerad stamlösning eller en dispersion med hjälp av ett organiskt lösningsmedel eller dispergeringsmedel för att underlätta tillsatsen av exakta mängder testkemikalie i testmediet och bidra till dispergeringen och upplösningen av kemikalien. Man bör därför så långt som möjligt undvika att använda sådana ämnen. Det får inte uppstå fytotoxicictet på grund av att man tvingas använda lösnings- eller dispergeringsmedel för att bereda testlösningen. Exempel på vanliga lösningsmedel som inte förorsakar fytotoxicitet vid koncentrationer upp till 100 μl/l är aceton och dimetylformamid. Om ett lösnings- eller dispergeringsmedel används bör dess slutkoncentration redovisas och hållas så låg som möjligt (≤ 100 μl/l). Alla test- och kontrollösningar bör ha samma koncentration av lösnings- eller dispergeringsmedel. Mer information om användningen av dispergeringsmedel finns i (8).

27.

Förkunskap om testkemikaliens toxicitet för Lemna, t.ex. erhållen genom ett preliminärt test av koncentrationsintervallet för toxiciteten, underlättar valet av lämpliga testkoncentrationer. I det slutliga toxicitetstestet ska det normalt finnas minst fem koncentrationer ordnade i geometrisk serie. Separationsfaktorn mellan testkoncentrationerna bör inte överskrida 3,2, men om dos-respons-kurvan är flack kan en större separationsfaktor användas. Om färre än fem koncentrationer används måste detta motiveras. Minst tre replikat ska användas för respektive testkoncentration.

28.

När man fastställer intervallet av testkoncentrationer (för det preliminära testet eller för det slutliga toxicitetstestet), ska man beakta följande:

29.

I varje test ska ingå kontroller med samma näringsmedium, frondantal, antal kolonier, miljöbetingelser och förfaranden som för provkärlen, men utan testkemikalien. Om ett lösnings- eller dispergeringsmedel används som hjälpmedel i testet krävs ytterligare ett kontrollprov, nu med samma koncentration av lösnings- eller dispergeringsmedlet som i provkärlen med testkemikalien. Antalet replikatkärl med kontroller – och i tillämpliga fall kärl med lösnings- eller dispergeringsmedel – ska vara minst lika med, eller helst dubbelt så många som, antalet kärl som används för respektive testkoncentration.

30.

Om NOEC inte behöver bestämmas kan man ändra testupplägget så att antalet koncentrationer ökas medan antalet replikat per koncentration minskas. Antalet kontrollreplikat måste dock vara minst tre.

31.

Kolonier med 2–4 synliga fronder förs över från ympkulturen och fördelas slumpmässigt i provkärlen under aseptiska förhållanden. Alla provkärl ska innehålla sammanlagt 9–12 fronder vardera. Antalet fronder och kolonier ska vara detsamma i alla provkärl. Erfarenheter från användning av denna metod och resultat från ringtest har visat att tre replikat per testlösning (testkoncentration), där alla replikat från början innehåller 9–12 fronder, är tillräckligt för att man ska upptäcka skillnader i tillväxt mellan testlösningarna på cirka 4–7 procents tillväxthämning (beräknad enligt tillväxthastighet) och 10–15 procents tillväxthämning (beräknad enligt producerad mängd biomassa) (7).

32.

Provkärlen måste placeras slumpmässigt i inkubatorn för att minimera inflytandet av rumsbetingade skillnader i ljusintensitet och temperatur. Det krävs också blockvis fördelning eller slumpmässig omplacering av kärlen vid varje mättillfälle, eller oftare.

33.

Om ett preliminärt stabilitetstest visar att koncentrationen av testkemikalien inte kan upprätthållas (dvs. den uppmätta koncentrationen sjunker under 80 % av den uppmätta startkoncentrationen) under tiden för testets genomförande (7 dagar), bör ett semistatiskt testförfarande användas. I det fallet exponeras kolonierna för nyberedda test- och kontrollösningar vid minst två tillfällen under testet, t.ex. på dag tre och dag fem. Intervallen för byte till färskt medium beror på stabiliteten hos testkemikalien. Det kan krävas kortare intervall för att upprätthålla nära nog konstanta koncentrationer av mycket instabila eller flyktiga kemikalier. I visa fall måste man använda genomflödestest (8)(10).

34.

Exponering genom besprutning av fronderna ingår inte i denna testmetod; se istället (11).

35.

Kontinuerlig belysning med varmt eller kallt vitt ljus från lysrör används för att åstadkomma en ljusintensitet i intervallet 85–135 μE · m– 2s– 1, varvid intensiteten ska mätas inom ett fotosyntetiskt aktivt våglängdsområde (400–700 nm) i punkter på samma avstånd från ljuskällan som Lemna-fronderna (denna intensitet motsvarar en belysningsstyrka på 6 500–10 000 lux). Ljusintensiteten över testytan får inte variera med mer än ± 15 %. Metoden för detektering och mätning av ljuset, framför allt typen av ljussensor, påverkar mätvärdet. Sfäriska sensorer – som mäter ljuset från alla vinklar ovanför och under mätplanet – och sensorer av solsensortyp (med cosinuskoefficient för infallsvinkeln) – som mäter ljuset från alla vinklar ovanför mätplanet – är att föredra framför riktade sensorer. De förstnämnda sensorerna ger större mätutslag för en diffus ljuskälla av den typ som beskrivits här.

36.

Temperaturen i testkärlen bör vara 24 ± 2 °C. Kontrollmediets pH får inte öka med mer än 1,5 enheter under testet. En avvikelse på mer än 1,5 gör dock inte testresultaten ogiltiga om det kan visas att kriterierna för testresultatens giltighet är uppfyllda. I speciella fall, t.ex. vid test av instabila kemikalier eller metaller, måste förskjutningen av pH kontrolleras extra noggrant. Se vidare (8).

37.

Testet ska avslutas sju dagar efter det att plantorna har placerats i provkärlen.

38.

Räkna och registrera frondantalet i provkärlen vid testets början. Se noga till att ta med alla uppstickande, väl synliga fronder. Bestäm antalet fronder – både sådana som framstår som normala och sådana som framstår som onormala – vid början av testet och därefter minst var tredje dag under exponeringstiden (dvs. vid minst två tillfällen under sjudagarsperioden), samt när testet avslutas. Registrera förändringar i plantutvecklingen. Det kan t.ex. gälla frondstorlek, utseende, tecken på nekros, kloros eller svullna fronder, kollaps av kolonier eller försämrad flytförmåga samt rötternas längd och utseende. Registrera också betydelsefulla iakttagelser från testmediet, t.ex. förekomst av oupplöst material och algtillväxt i provkärlet.

39.

Utöver bestämningar av frondantalet under testet ska de effekter testkemikalien har på en eller flera av följande mätvariabler bestämmas:

40.

Fördelen med variabeln ’total frondarea’ är att den kan bestämmas för alla prov- och kontrollkärl vid början, under och vid slutet av testet. Torr- eller färskvikt måste bestämmas vid början av testet med hjälp av ett prov från ympkulturen som är representativt för vad som används för att starta testet, och vid slutet av testet med hjälp av växtmaterial från alla prov- och kontrollkärl. Om frondarean inte bestäms är det bättre att fastställa torrvikten än färskvikten.

41.

Total frondarea, torrvikt och färskvikt kan bestämmas på följande sätt:

42.

Vid statiskt testförfarande ska pH-värdet i alla testlösningar (testkoncentrationer) mätas vid början och slutet av testet. Vid semistatiskt testförfarande mäts pH-värdet i varje färsk testlösning innan byte till ny lösning och i motsvarande förbrukade lösning.

43.

Ljusintensiteten ska mätas i odlingskammaren, inkubatorn eller klimatrummet i punkter på samma avstånd från ljuskällan som Lemna-fronderna. Mätningar ska göras minst en gång under testets genomförande. Temperaturen hos mediet i ett ersättningskärl med enbart testmedium som hålls under samma betingelser i odlingskammaren, inkubatorn eller klimatrummet ska registreras minst en gång per dag.

44.

Under testets gång ska testkemikaliens koncentrationer bestämmas med lämpliga intervaller. Vid ett statiskt testförfarande är minimikravet att koncentrationerna ska bestämmas vid början och slutet av testet.

45.

Om man vid ett semistatiskt testförfarande bedömer att koncentrationen av testkemikalien inte kommer att ligga kvar inom ± 20 % av den nominella koncentrationen, måste man analysera alla nyberedda testlösningar liksom alla förbrukade lösningar vid byte till ny färsk lösning (se punkt 33). För test i vilka den uppmätta startkoncentrationen av testkemikalien inte ligger inom ± 20 % av den nominella koncentrationen men tillräckliga bevis kan framläggas för att visa att startkoncentrationerna är repeterbara och stabila (dvs. inom intervallet 80–120 % av startkoncentrationen), räcker det om kemiska bestämningar utförs enbart för de högsta och lägsta testkoncentrationerna. I samtliga fall behöver bestämning av testkemikaliens koncentrationer före byte till färsk testlösning bara utföras på ett enda replikatkärl för varje testkoncentration (eller på det samlade innehållet från samtliga replikat för respektive testkoncentration).

46.

Vid genomflödestest kan man använda ett liknande förfarande som vid ett semistatiskt testförfarande – inklusive analys vid början, halvvägs igenom testet och vid slutet av testet – men i detta fall har mätning av förbrukade lösningar inte någon relevans. Vid genomflödestest ska daglig kontroll göras av flödeshastigheten hos spädningsmedlet och testkemikalien, eller hos stamlösningen av testkemikalien.

47.

Om man kan visa att testkemikaliens koncentration har hållits tillfredsställande inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta startkoncentrationen genom hela testet kan analysen av resultaten baseras på nominella eller uppmätta startvärden. Om avvikelsen från den nominella eller uppmätta startkoncentrationen inte ligger inom ± 20 %, ska analysen av resultaten baseras på det geometriska medelvärdet av koncentrationen under exponeringen, eller på modeller som beskriver testkemikaliens avtagande koncentration (8).

48.

Under vissa omständigheter, t.ex. när ett preliminärt test tyder på att testkemikalien inte har några toxiska effekter vid koncentrationer upp till 100 mg/l eller upp till dess löslighetsgräns i testmediet (om denna är lägre), kan man utföra ett toleranstest. Man jämför då responsen mellan en kontrollgrupp och en testgrupp (med en koncentration på 100 mg/l eller lika med löslighetsgränsen). Det rekommenderas starkt att jämförelsen kompletteras med en bestämning av exponeringskoncentrationen. Alla testbetingelser samt kriterier för testresultatens giltighet som beskrivits tidigare gäller även för toleranstest, med undantaget att antalet testreplikat ska vara dubbelt så stort. Tillväxten i kontrollgruppen och testgruppen kan analyseras med en statistisk metod för jämförelse av medelvärden, t.ex. t-test (Students t-test).

49.

Fördubblingstiden (Td ) för frondantalet är ett kriterium på testresultatens giltighet (se punkt 12). Den bestäms genom att infoga data från kontrollkärlen i följande formel:

Td = ln 2/μ

där μ är den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten enligt beskrivningen i punkterna 54–55.

50.

Syftet med testet är att bestämma testkemikaliens effekter på tillväxten av Lemna. I denna testmetod används två responsvariabler, eftersom olika jurisdiktioner har olika prioriteringar och lagstiftningsbehov. För att testresultaten ska kunna godtas i alla jurisdiktioner ska effekterna bedömas med hjälp av båda de responsvariabler (a och b) som beskrivs nedan.

51.

Observera att toxicitetsvärden som beräknats utifrån de två responsvariablerna inte är jämförbara, och att denna skillnad måste framgå när man tillämpar testresultaten. ECx-värden som grundar sig på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten (ErCx) är i allmänhet högre än de som grundar sig på den producerade mängden biomassa (EyCx) förutsatt att testmetodens föreskrivna testbetingelser är uppfyllda, på grund av de matematiska förutsättningarna för respektive metod. Detta ska dock inte tolkas som skillnader i känslighet mellan de två responsvariablerna. Avvikelserna beror i stället på att värdena är olika ur matematisk synvinkel. Variabeln genomsnittlig specifik tillväxthastighet grundar sig på den allmänna exponentiella tillväxtutvecklingen hos andmat i obegränsade kulturer, där toxiciteten bestäms på basis av testkemikaliens inverkan på tillväxthastigheten, oberoende av den absoluta nivån på den specifika tillväxthastigheten i kontrollen, dos-responskurvans lutning och tiden för testets genomförande. Resultat som i stället grundar sig på producerad mängd biomassa är däremot beroende av alla dessa övriga variabler. EyCx är beroende både av den specifika tillväxthastigheten hos de andmatsarter som används i varje enskilt test och av den maximala specifika tillväxthastigheten, som kan variera mellan olika arter och till och med mellan olika kloner. Denna responsvariabel får inte användas för jämförelser av känsligheten för toxiska substanser mellan olika andmatsarter, inte ens mellan olika kloner. Ur vetenskaplig synpunkt är värdet på den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten att föredra för bestämning av toxiciteten, men toxicitetsbestämning med hjälp av värdet på producerad mängd biomassa har tagits med i testmetoden för att tillgodose de nuvarande lagstiftningskraven i vissa jurisdiktioner.

52.

Toxiciteten ska bestämmas med hjälp av frondantalet och ytterligare en mätvariabel (total frondarea, torrvikt eller färskvikt), eftersom vissa kemikalier kan påverka andra mätvariabler mycket mer än de påverkar frondantalet. Om man bara höll sig till frondantalet skulle man inte märka denna påverkan.

53.

Frondantalet samt övriga registrerade mätvariabler för respektive mättillfälle, t.ex. total frondarea, torrvikt eller färskvikt, förs in i en tabell tillsammans med koncentrationerna av testkemikalien. De efterföljande beräkningarna för att bestämma t.ex. LOEC, NOEC eller ECx ska grundas på värdena för de enskilda replikaten, inte på beräknade medelvärden för respektive testgrupp.

54.

Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten för en given tidsperiod beräknas som den logaritmiska ökningen av två tillväxtvariabler: frondantal och ytterligare en mätvariabel (total frondarea, torrvikt eller färskvikt). Använd nedanstående formel för alla replikat av kontroll- och testlösningar:

där

Beräkna ett medelvärde av tillväxthastigheten för varje testgrupp och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar.

55.

Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten ska beräknas för hela tiden för testets genomförande (’i’ i formeln betecknar början av tiden för testets genomförande, och ’j’ slutet). Beräkna ett medelvärde av den genomsnittliga tillväxthastigheten för varje testkoncentration och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar. Bestäm dessutom den sektionsvisa tillväxthastigheten för att kunna bedöma testkemikaliens effekter under exponeringstiden (t.ex. genom analys av logaritmiska tillväxtkurvor). Stora skillnader mellan den sektionsvisa tillväxthastigheten och den genomsnittliga tillväxthastigheten tyder på att tillväxten inte varit konstant exponentiell. I sådana fall bör tillväxtkurvorna undersökas noggrant. Vid en konservativ bedömning kan man i detta fall jämföra testlösningarnas specifika tillväxthastigheter under det tidsintervall som har den största tillväxthämningen med tillväxthastigheterna för kontrollerna under samma tidsintervall.

56.

Den procentuella tillväxthämningen (Ir) beräknas sedan för varje testkoncentration (testgrupp) med formeln

där

57.

Effekterna på den producerade mängden biomassa bestäms med hjälp av två mätvariabler, varav den ena är frondantalet och den andra någon av variablerna total frondarea, torrvikt eller färskvikt. Mätningarna görs vid början och slutet av testet. För torrvikt och färskvikt bestäms den initiala biomassan med hjälp av ett prov bestående av fronder från samma kultur som används för att ympa provkärlen (se punkt 20). Beräkna ett medelvärde av den producerade mängden biomassa för varje testkoncentration och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar. Den genomsnittliga procentuella minskningen av den producerade mängden biomassa (%Iy) beräknas för varje testgrupp med formeln

där

58.

Dos-respons-kurvor ska plottas som visar förhållandet mellan den genomsnittliga procentuella hämningen av responsvariabeln (Ir eller Iy, beräknad enligt punkt 56 eller 57) och logaritmen för testkemikaliens koncentration.

59.

Bestämningar av ECx – t.ex. EC50 – ska baseras både på genomsnittlig specifik tillväxthastighet (ErCx) och på producerad mängd biomassa (EyCx). De sistnämnda två responsvariablerna ska i sin tur bestämmas med hjälp av frondantal och en ytterligare mätvariabel (total frondarea, torrvikt eller färskvikt). Detta beror på att det finns testkemikalier vars inverkan på frondantalet skiljer sig från deras inverkan på andra mätvariabler. Toxicitetsparametrarna bör därför vara fyra ECx-värden för varje beräknad tillväxthämningsnivå x: ErCx (frondantal), ErCx (total frondarea, torrvikt eller färskvikt), EyCx (frondantal) och EyCx (total frondarea, torrvikt eller färskvikt).

60.

Målet är att bestämma det kvantitativa förhållandet mellan koncentration och respons med hjälp av regressionsanalys. Man kan använda viktad linjär regression efter att ha gjort en linjär transformation av responsdata, t.ex. till probit-, logit- eller Weibullvärden (13). Icke-linjära regressionsmetoder är dock att föredra, eftersom de är bättre anpassade för att hantera oundvikliga oregelbundenheter i data och avvikelser från jämna fördelningskurvor. I närheten av nollpunkten (ingen tillväxthämning) och fullständig tillväxthämning kan sådana oregelbundenheter bli uppförstorade genom linjäriseringen och därigenom störa analysen (13). Observera att standardmetoder för analys med probit-, logit- eller Weibulltransformationer är avsedda för dikotoma data (dvs. tvåpunktsfördelade data, såsom dödlighet–överlevnad) och därför måste modifieras för att kunna användas för data rörande tillväxthastighet eller producerad mängd biomassa. Speciella metoder för bestämning av ECx-värden ur kontinuerliga data återfinns i (14), (15) och (16).

61.

För varje analyserad responsvariabel används förhållandet mellan koncentration och respons för att göra punktskattningar av ECx-värden. Om möjligt ska 95-procentiga konfidensgränser bestämmas för varje skattning. Anpassningsgraden (’goodness of fit’) mellan responsdata och regressionsmodellen ska bestämmas antingen grafiskt eller statistiskt. Regressionsanalysen ska göras på responsvärden från enskilda replikat, inte på medelvärden från testgrupper.

62.

När tillgängliga regressionsmodeller eller regressionsmetoder inte lämpar sig för de aktuella dataserierna kan skattningar av EC50-värden och konfidensgränser också bestämmas genom linjär interpolation och bootstrapping (17).

63.

För skattning av LOEC (och därmed även av NOEC) jämförs medelvärden från testlösningarna med hjälp av variansanalysmetoder (ANOVA). Medelvärdet för varje koncentration jämförs sedan med medelvärdet för kontrollerna med hjälp av en lämplig metod för multipeljämförelse eller trendtest, t.ex. Dunnetts eller Williams test (18) (19) (20) (21). Man måste avgöra om antagandet för ANOVA om varianshomogenitet är uppfyllt. Detta kan göras grafiskt eller med ett etablerat test (22). t.ex. Levenes eller Bartletts test. Skulle antagandet om varianshomogenitet inte vara uppfyllt kan man ibland korrigera för detta genom logaritmisk transformation av data. Om heterogeniteten i variansen är extremt stor och inte kan korrigeras genom transformation, ska man överväga att göra analysen med t.ex. Jonkheeres trendtester av ’step-down’-typ. Mer information om bestämning av NOEC finns i (16).

64.

Nya forskningsrön har lett till att man avråder från användning av NOEC-värden. I stället rekommenderas att man använder punktskattningar av ECx baserade på regressionsanalys. För detta Lemna-test har ännu inget passande värde på x fastställts. Ett intervall på 10–20 % förefaller dock vara lämpligt, beroende på vilken responsvariabel som används. Både EC10 och EC20 bör redovisas.

65.

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter: