Kommissionens förordning (EG) nr 440/2003

av den 10 mars 2003

om ändring av förordning (EEG) nr 2676/90 om fastställande av gemensamma analysmetoder för vin

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets förordning (EG) nr 1493/1999 av den 17 maj 1999 om den gemensamma organisationen av marknaden för vin(1), senast ändrad genom förordning (EG) nr 2585/2001(2), särskilt artikel 46.3 första stycket i denna, och

av följande skäl:

(1) I bilagan till kommissionens förordning (EEG) nr 2676/90(3), senast ändrad genom förordning (EG) nr 1622/2000(4), beskrivs de aktuella analysmetoderna.

(2) En analysmetod för D-äppelsyra avpassad för att mäta låga halter av D-äppelsyra i vin har utvecklats och validerats enligt internationellt erkända kriterier. Beskrivningen av denna nya metod antogs av Internationella vinkontoret vid dess generalförsamling i juni 2002.

(3) En ny metod för analys av kolisotopkvoten i vinetanol eller i etanol som erhållits genom jäsning av druvmust, koncentrerad druvmust eller rektifierad, koncentrerad druvmust har utvecklats och validerats enligt internationellt erkända kriterier. Beskrivningen av denna nya metod antogs av Internationella vinkontoret vid dess generalförsamling 2001.

(4) Genom att använda dessa analysmetoder kan man få en bättre kontroll av kvalitet och äkthet hos vin och undvika tvister till följd av mindre noggranna kontrollmetoder, bland annat när det gäller berikning med blandningar av socker av olika ursprung och kontroll av syrning av vin med äppelsyra.

(5) Den befintliga metoden för bestämning av D-äppelsyra, som beskrivs i bilagan till förordning (EEG) nr 2676/90, bör kompletteras med en beskrivning av det förfarande som skall användas för att påvisa svaga halter och i bilagan bör det införas en beskrivning av den nya metoden för analys av kolisotoper i etanol.

(6) De åtgärder som avses i denna förordning är förenliga med yttrandet från Förvaltningskommittén för vin.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till förordning (EEG) nr 2676/90 ändras på följande sätt:

1. I kapitel 20 "D-äppelsyra" skall punkt 8 ersättas med texten i bilaga I till denna förordning.

2. Kapitel 45 som återfinns i bilaga II till denna förordning skall läggas till.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den sjunde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 10 mars 2003.

På kommissionens vägnar

Franz Fischler

Ledamot av kommissionen

(1) EGT L 179, 14.7.1999, s. 1.

(2) EGT L 345, 29.12.2001, s. 10.

(3) EGT L 272, 3.10.1990, s. 1.

(4) EGT L 194, 31.7.2000, s. 1.

BILAGA I

"8. BESTÄMNING AV D-ÄPPELSYRA (D(+)-ÄPPELSYRA), I VIN MED LÅGA HALTER

8.1 Användningsområde

Den beskrivna metoden används för enzymatisk bestämning av D-äppelsyra i vin med halter under 50 mg/l.

8.2 Princip

Principen för metoden beskrivs i punkt 1. Bildningen av NADH mäts genom den ökade absorbansen vid våglängden 340 nm, och den bildade mängden NADH är proportionell mot den ursprungliga mängden D-malat efter det att en mängd D-äppelsyra motsvarande 50 mg/l tillsatts i mätkyvetten.

8.3 Reagens

En lösning av D-äppelsyra med koncentrationen 0,199 g/l och de reagens som anges i punkt 2.

8.4 Utrustning

Utrustningen anges i punkt 3.

8.5 Beredning av provet

Provets beredning beskrivs i punkt 4.

8.6 Utförande

Utförande enligt punkt 5, men i mätkyvetten tillsätts en mängd D-äppelsyra motsvarande 50 mg/l (tillsats av 0,025 ml D-äppelsyralösning med koncentrationen 0,199 g/l, i stället för samma volym vatten); de erhållna värdena minskas med 50 mg/l.

8.7 Intern validering

I följande tabell sammanfattas protokollet för intern validering av metoden för bestämning av D-äppelsyra efter tillsats av 50 mg/l av isomeren.

>Plats för tabell>"

BILAGA II

"45. BESTÄMNING AV ISOTOPKVOTEN 13C/12C GENOM ISOTOPKVOTSMASSPEKTROMETRI AV VINETANOL ELLER ETANOL SOM ERHÅLLITS GENOM JÄSNING AV MUST, KONCENTRERAD MUST ELLER REKTIFIERAD, KONCENTRERAD MUST

1. ANVÄNDNINGSOMRÅDE

Metoden möjliggör mätning av isotopkvoten 13C/12C i vinetanol och i etanol som erhållits efter jäsning av produkter från vindruvor (must, koncentrerad must, rektifierad koncentrerad must).

2. STANDARDER

ISO: 5725:1994 'Noggrannhet i mätmetoder och resultat: Grundläggande metod för att bestämma repeterbarhet och reproducerbarhet hos en standardiserad mätmetod.'

V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372).

Metod 8 i bilagan till denna förordning: 'Detektion av berikning av must, koncentrerad must, rektifierad koncentrerad must och av vin med hjälp av kärnmagnetisk resonans hos deuterium (SNIF-NMR).'

3. TERMER OCH DEFINITIONER

13C/12C: Kvoten mellan isotoperna kol-13 (13C) och kol-12 (12C) i ett givet prov.

δ13C: Halten av kol-13 (13C) uttryckt i promille ([permil ]).

SNIF-NMR: Site-Specific Natural Isotope Fractionation studied by Nuclear Magnetic Resonance (lokalitetsspecifik naturlig isotopfraktionering undersökt genom kärnmagnetisk resonans).

V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite. PDB är primärstandard för mätning av naturliga variationer i halten av isotopen kol-13 och utgörs av kalciumkarbonat från rostrum hos belemniter från krita i formationen Pee-Dee i Syd-Carolina (Förenta staterna). Dess isotopkvot 13C/12C eller RPDB är lika med 0,0112372. Reserverna av PDB är slut sedan länge men PDB är fortfarande primärstandard för att uttrycka naturliga variationer i halten av isotopen kol-13, och mot denna kalibreras de referensmaterial som finns tillgängliga vid Internationella atomenergiorganet (IAEA) i Wien (Österrike). Isotopbestämningar av naturlig förekomst av kol-13 uttrycks därför av konvention i förhållande till V-PDB.

m/z: Kvoten mellan massa och laddning.

4. PRINCIP

Vid fotosyntesen sker växternas koldioxidassimilation genom två principiellt olika typer av metabolism, nämligen C3-metabolism (Calvincykeln) och C4-metabolism (Hatch och Slack). Dessa båda fotosyntesmekanismer har olika isotopfraktionering. De produkter som kommer från C4-växter, såsom sockerarter och alkohol som framställs genom jäsning, har högre halt av kol-13 än motsvarande produkter från C3-växter. De flesta växter, däribland vinranka och beta, hör till C3-gruppen. Sockerrör och majs hör till C4-gruppen. Genom att mäta halten kol-13 kan man alltså påvisa och uppskatta tillsatser av socker med C4-ursprung (rörsocker eller isoglukos från majs) i produkter som kommer från druvor (druvmust, vin m.fl.). Genom att kombinera uppgifter om halten kol-13 med uppgifter från SNIF-NMR är det också möjligt att bestämma hur stora kvantiteter som har tillsatts av blandningar av sockerarter eller alkoholer som kommer från C3- och C4-växter.

Halten av kol-13 bestäms på den koldioxid som bildas vid fullständig förbränning av provet. Förekomsten av de viktigaste isotopomererna med masstal 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 och 12C17O16O) och 46 (12C16O18O), som kan bildas genom kombination av isotoperna 18O, 17O, 16O, 13C och 12C, bestäms utifrån de jonströmmar som mäts i tre olika kollektorer i en isotopkvotsmasspektrometer. Bidragen från isotopomererna 13C17O16O och 12C17O2 är mycket små och därmed försumbara. Jonströmmen för m/z = 45 korrigeras för bidraget från 12C17O16O som beräknas utifrån strömmens intensitet mätt för m/z = 46 med beaktande av de relativa förekomsterna av 18O och 17O (Craigs korrektion). Genom jämförelse med en standard som är kalibrerad mot den internationella standarden V-PDB kan halten kol-13 beräknas på den relativa δ13C-skalan.

5. REAGENS

Material och förbrukningsartiklar hänger samman med vilken utrustning (6) laboratoriet använder. De mest använda systemen baseras på en elementaranalysator. Den kan vara utformad antingen för införing av prov i förseglade metallkapslar eller för insprutning av flytande prov genom ett membran med hjälp av en injektionsspruta.

Allt efter typ av instrument, kan följande referensmaterial, reagens och förbrukningsartiklar användas:

- Referensmaterial

- tillgängliga hos IAEA:

>Plats för tabell>

- tillgängliga hos IRMM i Geel (B) (Institutet för referensmaterial och referensmätningar):

>Plats för tabell>

- Standardprov med en känd 13C/12C-kvot kalibrerad mot internationella referensmaterial.

- För genomströmningssystem har följande vägledande förteckning upprättats:

- Helium för analys (CAS 07440-59-7).

- Syre för analys (CAS 07440-44-7).

- Koldioxid för analys, använd som sekundär standard för halten kol-13 (CAS 00124-38-9).

- Oxidationsreagens till ugnen i förbränningssystemet, t.ex. koppar(II)oxid för grundämnesanalys (CAS 1317-38-0).

- Torkmedel för att avlägsna vatten som bildas vid förbränningen, t.ex. anhydrone för grundämnesanalys (magnesiumperklorat) (CAS 10034-81-8). (Detta är inte nödvändigt för apparater med ett system som avlägsnar vatten med hjälp av en kylfälla eller ett kapillärrör med selektiv permeabilitet.)

6. UTRUSTNING OCH MATERIAL

6.1 Isotopkvotsmasspektrometer (IRMS)

Isotopkvotsmasspektrometer (IRMS) som kan bestämma det relativa innehållet av naturligt förekommande 13C i CO2-gas, med en intern noggrannhet på 0,05 [permil ] eller bättre, uttryckt som ett relativt värde (9). Den interna noggrannheten definieras här som skillnaden mellan två mätningar av samma CO2-prov. En masspektrometer för mätning av isotopkvoter är i allmänhet försedd med en tredubbel kollektor för samtidig mätning av intensiteter för m/z = 44, 45 och 46. Isotopkvotsmasspektrometern skall antingen ha ett system med dubbla insläpp, för alternerande mätning av det okända provet och ett referensprov, eller ett integrerat system där proven förbränns kvantitativt och där koldioxiden avskiljs från de övriga förbränningsprodukterna före mätningen i masspektrometern.

6.2 Förbränningsapparat

Förbränningsapparat som kan omvandla etanol kvantitativt till koldioxid och avlägsna alla andra förbränningsprodukter, inbegripet vatten, utan någon isotopfraktionering. Apparaten kan vara antingen ett genomströmningssystem som är integrerat i masspektrometern (6.2.1) eller ett separat förbränningssystem (6.2.2). Apparaten skall göra det möjligt att uppnå minst den noggrannhet som anges i punkt 11.

6.2.1 Genomströmningssystem

Ett genomströmningssystem utgörs antingen av en elementaranalysator eller av en gaskromatograf direkt ansluten till ett förbränningssystem.

För system som är utformade för införing av prov i metallkapslar behövs följande laboratorieutrustning:

- Kalibrerad mikrospruta eller mikropipett med lämpliga spetsar.

- Laboratorievåg med en noggrannhet på 1 μg eller bättre.

- Pincett för förslutning av kapslar.

- Tennkapslar för flytande provmaterial.

- Tennkapslar för fast provmaterial.

Anm.:

För att minska risken att etanolproven avdunstar kan ett absorberande material (t.ex. Chromosorb W 45-60 mesh) placeras i kapslarna, efter att ha genomgått ett blindprov för att kontrollera att det inte innehåller kol i så betydande mängd att det kan påverka mätresultaten.

Vid användning av en elementaranalysator försedd med insprutningsenhet för vätskor eller ett system med gaskromatograf och förbränningsenhet behövs följande laboratorieutrustning:

- Injektionsspruta för vätskor.

- Kolvar med tät förslutning och inerta membran.

Den laboratorieutrustning som anges i ovanstående förteckningar är endast exempel och kan ersättas med annan likvärdig utrustning beroende på vilken typ av förbränningsapparat och masspektrometer som används på laboratoriet.

6.2.2 Separat system för provberedning

Koldioxiden från förbränningen av analysproven och referensprovet samlas upp i ampuller som sedan placeras i spektrometerns båda kanaler för isotopanalys. Flera olika typer av förbränningsapparater som finns beskrivna i litteraturen kan användas:

- Slutet förbränningssystem fyllt med cirkulerande syrgas.

- Elementaranalysator med helium- och syregenomströmning.

- Förseglad glasampull fylld med koppar(II)oxid som oxidationsmedel.

7. BEREDNING AV ANALYSPROV

Etanolen måste extraheras från vinet före isotopbestämningen. Extraktionen sker genom destillering av vin enligt beskrivningen i punkt 3.1 i metod nr 8 (SNIF-NMR).

När det gäller druvmust, koncentrerad druvmust och rektifierad, koncentrerad druvmust måste sockret först jäsas till etanol enligt beskrivningen i punkt 3.2 i metod nr 8.

8. UTFÖRANDE

Alla moment i beredningen måste utföras utan att etanolförlusten genom avdunstning blir så stor att provets isotopsammansättning ändras.

Följande beskrivning bygger på förfaranden som allmänt används vid förbränning av etanolprov i kommersiellt tillgängliga automatiska förbränningssystem. Alla andra metoder som säkerställer en kvantitativ omvandling av etanolprovet till koldioxid utan etanolförlust genom avdunstning kan användas för beredning av koldioxid för isotopanalys.

Tillvägagångssätt vid användning av en elementaranalysator:

a) Inkapsling av proven:

- Kapslar, pincett och arbetsbord skall vara rena.

- Ta en kapsel av lämplig storlek med hjälp av pincetten.

- Tillsätt erforderlig mängd vätska i kapseln med hjälp av mikropipetten.

- Anm.:

För att få 2 mg kol krävs 3,84 mg absolut etanol eller 4,17 mg destillat med en alkoholhalt på 92 viktprocent. Den erforderliga mängden destillat beräknas på motsvarande sätt och med hänsyn till den mängd kol som masspektrometerns känslighet kräver.

- Förslut kapseln med hjälp av pincetten.

- Varje kapsel skall vara helt tätt försluten. I annat fall måste den kasseras och ersättas med en ny.

- Bered två kapslar för varje prov.

- Placera kapslarna på lämpligt ställe på arbetsbordet på elementaranalysatorns automatiska provväxlare. Varje kapsel skall vara noggrant märkt med ett löpnummer.

- Placera systematiskt kapslar med standardprov först och sist i provserien.

- Gör kontrollprov med regelbundna mellanrum i provserien.

b) Kontroll och justering av instrument för grundämnesanalys och masspektrometri:

- Temperaturen i elementaranalysatorns förbränningsenheter samt helium- och syreströmmen ställs in för optimal förbränning av provet.

- Kontrollera att det inte finns några läckor i systemet för grundämnesanalys och masspektrometri (exempelvis genom att kontrollera jonströmmen för m/z = 28, vilket motsvarar N2).

- Ställ in masspektrometern för mätning av jonströmsintensiteten för m/z = 44, 45 och 46.

- Kontrollera systemet med hjälp av kända kontrollprov före mätning av analysproven.

c) Genomförande av en mätserie:

Proven på elementaranalysatorns (eller kromatografens) automatiska provväxlare förs in ett i taget. Koldioxiden från förbränningen av de enskilda proven leds vidare mot masspektrometern som mäter jonströmmarna. Datorn som är kopplad till instrumentet registrerar jonströmmarnas intensitet och beräknar δ-värdena för varje enskilt prov.

9. BERÄKNING

Metodens syfte är att mäta isotopkvoten 13C/12C i etanol som har extraherats från vin eller från produkter framställda av druvor efter jäsning. Isotopkvoten 13C/12C kan uttryckas genom avvikelsen från ett standardprov. Avvikelsen för isotopen kol-13 (δ 13C) beräknas sedan på en delta-promilleskala (δ/1000) genom att resultaten för analysprovet jämförs mot resultaten för standardprovet, som dessförinnan har kalibrerats mot den internationella primärstandarden (V-PDB). δ 13C-värdena uttrycks i förhållande till standardprovet enligt följande formel:

δ13Cprov/std [permil ] = 1000 × (Rprov-Rstd)/Rstd

där Rprov och Rstd är isotopkvoterna 13C/12C för provet respektive den koldioxid som används som standard.

δ 13C-värdena uttrycks i förhållande till V-PDB enligt följande formel:

δ13Cprov/V-PDB [permil ] = δ13Cprov/std δ13Cstd/V-PDB + (δ13Cprov/std × δ13Cstd/V-PDB)/1000,

där δ13Cstd/V-PDB är den isotopavvikelse som tidigare bestämts för standardprovet i förhållande till V-PDB.

Under mätningens gång kan en viss drift förekomma till följd av ändrade förhållanden för instrumenten. I så fall måste δ 13C-värdena för proven korrigeras efter skillnaden mellan det δ 13C-värde som uppmätts för standardprovet och det riktiga värdet, som fastställdes vid den föregående kalibreringen mot V-PDB genom jämförelse med ett internationellt referensmaterial. Mellan två mätningar på standardprovet kan driften, och därmed den korrigering som skall göras av provresultaten, antas vara linjär. Standardprovet skall mätas i början och i slutet av varje provserie. Utifrån detta kan en korrigering beräknas för varje prov genom linjär interpolation.

10. KVALITETSSÄKRING OCH KONTROLL

Kontrollera att 13C-värdet för standardprovet inte avviker mer än 0,5 [permil ] från det tillåtna värdet. Om det gör det måste spektrometerns inställning kontrolleras och eventuellt justeras.

Kontrollera för varje enskilt prov att skillnaden i resultat mellan de två kapslar som har mätts efter varandra är mindre än 0,3 [permil ]. Det slutliga resultatet för ett givet prov är genomsnittet för de båda kapslarna. Om avvikelsen är större än 0,3 [permil ] måste mätningen göras om.

Att mätningen fungerar korrekt kan kontrolleras utifrån jonströmmens intensitet för m/z = 44, som är proportionell mot den mängd kol som sprutas in i elementaranalysatorn. Under standardförhållanden torde intensiteten av denna jonström vara praktiskt taget konstant för de analyserade proven. En betydande avvikelse kan tyda på avdunstning av etanol (t.ex. från en otät kapsel) eller instabilitet i elementaranalysatorn eller masspektrometern.

11. METODENS PRESTANDA (NOGGRANNHET)

Olika laboratorier har gjort ett första ringtest (11.1) av destillat som innehåller alkohol från vin, sockerrör och betor samt olika blandningar av dessa tre ursprung. Eftersom denna undersökning inte tog hänsyn till destillationsprocessen, har kompletterande information från andra ringtest avseende vin (11.2) och särskilt provserier för bedömning av lämplighet (11.3) att utföra isotopmätningar också beaktats. Resultaten visar att olika destillationssystem som används under tillfredsställande förhållanden, i synnerhet de som tillämpas vid mätning med SNIF-NMR, inte ger upphov till någon betydande variation vid bestämning av δ13C-värdet hos vinetanol. Värdena på de parametrar för noggrannhet som har observerats för vin är nästan identiska med dem som erhölls i ringtestet (11.1) av destillat.

11.1 Ringtest av destillat

År då interkalibreringen gjordes: 1996

Antal laboratorier: 20

Antal prov: 6 dubbla blindprov

Analyt: δ 13C för etanol

>Plats för tabell>

>Plats för tabell>

11.2 Interkalibrering på två viner och en alkohol

År då interkalibreringen gjordes: 1996

Antal laboratorier: 14 för destillering av vin, varav 7 även för mätning av δ 13C i vinetanol

8 för mätning av δ 13C i alkoholprov

Antal prov: 3 (vitt vin med 9,3 volymprocent alkohol, vitt vin med 9,6 volymprocent alkohol samt alkohol med styrkan 93 viktprocent).

Analyt: δ 13C för etanol

>Plats för tabell>

De deltagande laboratorierna använde olika system för destillation. De isotopbestämningar (δ 13C) som ett enskilt laboratorium utfört på alla de destillat som deltagarna skickade tillbaka uppvisar varken avvikande värden eller värden som skiljer sig signifikativt från medelvärdena. Resultatens varians (S2 = 0,0059) är jämförbar med variansen för repeterbarhet Sr2 i ringtestet av destillat (11.1).

11.3 Resultat av undersökningar för bedömning av lämplighet för isotopanalyser

Sedan december 1994 anordnas regelbundet internationella undersökningar för att bedöma lämplighet att utföra isotopbestämningar på vin och alkohol (destillat med 96 volymprocent alkohol). Resultaten gör det möjligt för deltagande laboratorier att kontrollera sina analysers kvalitet. Genom en statisk behandling av resultaten kan man göra en bedömning av bestämningarnas variation under reproducerbarhetsbetingelser och därigenom göra en uppskattning av parametrarna varians och reproducerbarhetsgräns. De erhållna resultaten för bestämningarna av δ 13C i etanol från vin och destillat sammanfattas i följande tabell:

>Plats för tabell>

N Antal deltagande laboratorier.

11.4 Repeterbarhets- och reproducerbarhetsgränser

På grundval av de uppgifter från olika interkalibreringar som presenteras i ovanstående tabeller kan följande repeterbarhets- och reproducerbarhetsgränser fastställas för denna metod, inbegripet destillationsstadiet:

Repeterbarhetsgräns r: 0,24.

Reproducerbarhetsgräns R: 0,6."