02009R0152 — SV — 24.05.2017 — 006.001

Den här texten är endast avsedd som ett dokumentationshjälpmedel och har ingen rättslig verkan. EU-institutionerna tar inget ansvar för innehållet. De autentiska versionerna av motsvarande rättsakter, inklusive ingresserna, publiceras i Europeiska unionens officiella tidning och finns i EUR-Lex. De officiella texterna är direkt tillgängliga via länkarna i det här dokumentet

Ändrad genom:

▼B

KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 152/2009

av den 27 januari 2009

om provtagnings- och analysmetoder för offentlig kontroll av foder

(Text av betydelse för EES)

▼M3

Artikel 1

Provtagning för offentlig kontroll av foder, särskilt när det gäller bestämning av beståndsdelar, inbegripet material som innehåller eller består av eller har framställts av genetiskt modifierade organismer (GMO), fodertillsatser enligt definitionen i Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1831/2003 ( 1 ) och främmande ämnen enligt definitionen i Europaparlamentets och rådets direktiv 2002/32/EG ( 2 ) ska utföras enligt de metoder som anges i bilaga I.

Den provtagningsmetod som anges i bilaga I är tillämplig på kontroll av foder vad gäller bestämning av bekämpningsmedelsrester enligt definitionen i Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 396/2005 ( 3 ) och kontrollen av efterlevnaden av förordning (EU) nr 619/2011.

▼B

Artikel 2

Beredning av analysprov och resultatangivelse ska följa metoderna i bilaga II.

Artikel 3

Analyser för offentlig kontroll av foder ska utföras enligt metoderna i bilaga III (Analysmetoder för kontroll av foderråvarors och foderblandningars sammansättning), bilaga IV (Analysmetoder för kontroll av halten godkända fodertillsatser), bilaga V (Analysmetoder för kontroll av främmande ämnen i foder) och bilaga VI (Analysmetoder för bestämning av beståndsdelar av animaliskt ursprung för offentlig kontroll av foder).

Artikel 4

Energivärdet i foderblandningar till fjäderfä ska beräknas i enlighet med bilaga VII.

Artikel 5

De analysmetoder för kontroll av förekomst av otillåtna fodertillsatser som anges i bilaga VIII ska användas som konfirmeringsmetoder.

Artikel 6

Direktiven 71/250/EEG, 71/393/EEG, 72/199/EEG, 73/46/EEG, 76/371/EEG, 76/372/EEG, 78/633/EEG, 81/715/EEG, 84/425/EEG, 86/174/EEG, 93/70/EEG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG och 2003/126/EG ska upphöra att gälla.

Hänvisningar till de upphävda direktiven ska anses som hänvisningar till denna förordning och ska läsas i enlighet med jämförelsetabellerna i bilaga IX.

Artikel 7

Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Den ska tillämpas från och med den 26 augusti 2009.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

▼M3

BILAGA I

PROVTAGNINGSMETODER

1.   SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Prov som är avsedda för offentlig kontroll av foder ska tas med de metoder som beskrivs nedan. Prov som har tagits på detta sätt ska anses vara representativa för provmängderna.

Syftet med representativ provtagning är att ta ut en liten fraktion av ett parti på ett sådant sätt att bestämningen av en viss egenskap hos denna fraktion representerar medelvärdet av denna egenskap i partiet. Partiet ska provtas genom att det upprepade gånger tas delprov på olika enskilda positioner i partiet. Dessa delprov ska blandas så att det bildas ett enda samlingsprov, från vilket representativa slutliga prov ska beredas genom representativ delning.

Om det vid en okulärbesiktning visar sig att delar av det foder som ska provtas skiljer sig i kvalitet från resten av fodret från samma parti, ska sådana delar skiljas från resten av fodret och behandlas som ett separat delparti. Om det inte är möjligt att dela upp fodret i separata delpartier ska fodret provtas som ett parti. I sådana fall ska detta nämnas i provtagningsrapporten.

Om det har konstaterats att ett foder som provtagits i enlighet med bestämmelserna i denna förordning inte uppfyller EU-kraven, och detta ingår i ett foderparti av samma kategori eller varuslag, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

2.   DEFINITIONER

3.   ALLMÄNNA BESTÄMMELSER

4.   UTRUSTNING

5.   KVANTITATIVA KRAV FÖR ANTALET DELPROV

5.1    Kvantitativa krav för delprov vid kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret

5.1.1    Fast foder i lös vikt

5.1.2    Löst flytande foder

5.1.3    Förpackat foder

Foder (fast och flytande) kan förpackas i påsar, säckar, burkar, tunnor etc. som i tabellen anges som enheter. Stora enheter (≥ 500 kg eller liter) ska provtas i enlighet med bestämmelserna för löst foder (se 5.1.1 och 5.1.2.)

5.1.4    Foderblock och saltstenar

Prov ska tas på minst ett block eller en sten per provmängd om 25 enheter, som mest fyra block eller stenar.

För block eller stenar på högst 1 kg styck ska ett delprov utgöras av innehållet i ett block eller en sten.

5.1.5    Grovfoder/vallfoder

5.2    Kvantitativa krav för delprov vid kontroll av beståndsdelar eller ämnen som kan vara ojämnt fördelade i foder

Dessa kvantitativa krav för delprov ska användas i följande situationer:

Om kontrollmyndigheten har en stark misstanke om att det finns en sådan ojämn fördelning även vid korskontaminering av en beståndsdel eller ett ämne i en foderblandning kan de kvantitativa kraven enligt nedanstående tabell tillämpas.

5.3    Kvantitativa krav för delprov i fråga om mycket stora partier

När det gäller stora provmängder (provmängder > 500 ton) är antalet delprov som ska tas = 40 delprov + √ton vid kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret eller 100 delprov + √ton vid kontroll av beståndsdelar eller ämnen som kan vara ojämnt fördelade i foderråvara.

6.   KVANTITATIVA KRAV FÖR SAMLINGSPROV

7.   KVANTITATIVA KRAV FÖR SLUTLIGA PROV

Slutliga prov

Minst ett slutligt prov ska analyseras. Det slutliga prov som analyseras ska vara av minst följande mängd:

8.   PROVTAGNINGSMETOD FÖR MYCKET STORA PARTIER ELLER PARTIER SOM LAGRAS OCH TRANSPORTERAS PÅ ETT SÄTT SOM INNEBÄR ATT PROVTAGNING PÅ HELA PARTIET ÄR OMÖJLIG

8.1    Allmänna principer

Om det inte är möjligt att ta delprov på hela partiet på grund av det sätt som partiet transporteras eller lagras på bör provtagning på sådana partier helst ske när partiet är i flöde.

För stora lagerlokaler avsedda för lagring av foder bör företagarna uppmuntras att installera utrustning i lagerlokalen som möjliggör (automatisk) provtagning på hela det lagrade partiet.

Om man använder de provtagningsförfaranden som anges i detta kapitel, ska foderföretagaren eller dennes företrädare informeras om provtagningsförfarandet. Om detta provtagningsförfarande ifrågasätts av foderföretagaren eller dennes företrädare ska foderföretagaren eller dennes företrädare ge den behöriga myndigheten möjlighet att ta prov på hela partiet på dennes bekostnad.

8.2    Stora partier som transporteras med fartyg

8.2.1    Dynamisk provtagning på stora partier som transporteras med fartyg

Provtagning på stora partier på fartyg ska företrädesvis ske när produkten är i flöde (dynamisk provtagning).

Provtagningen ska göras per lastrum (enhet som kan separeras fysiskt). Lastrum töms dock delvis det ena efter det andra, vilket innebär att den ursprungliga fysiska separationen inte längre föreligger efter att lasten överförts till lagringsanläggningar. Provtagning kan därför ske i förhållande till den ursprungliga fysiska separationen eller i förhållande till separationen efter överföring till lagringsanläggningarna.

Lossning av ett fartyg kan pågå i flera dagar. Normalt ska provtagning ske med jämna mellanrum under hela lossningen. Det är dock inte alltid möjligt eller lämpligt att en officiell inspektör är närvarande för provtagning under hela lossningen. Därför får provtagning ske på en del (provmängd) av hela partiet. Antalet delprov bestäms med hänsyn till provmängdens storlek.

Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

Även om det officiella provet tas automatiskt är det nödvändigt att en inspektör är närvarande. Om den automatiska provtagningen utförs med förinställda parametrar som inte kan ändras under provtagningen och delproven samlas i ett förseglat kärl, varigenom eventuella bedrägerier förebyggs, krävs det enbart att en inspektör är närvarande i början av provtagningen, varje gång kärlet för proven behöver bytas och i slutet av provtagningen.

8.2.2    Provtagning på partier som transporteras med fartyg genom stationär provtagning

Om provtagningen utförs stationärt ska man tillämpa samma förfarande som föreskrivs för lagringsanläggningar (silor) som kan nås ovanifrån (se punkt 8.4.1).

Provtagningen ska utföras på den tillgängliga delen (ovanifrån) av partiet/rumslasten. Antalet delprov bestäms med hänsyn till provmängdens storlek. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.3    Provtagning på stora partier som förvaras i lager

Provtagningen ska utföras på den åtkomliga delen av partiet. Antalet delprov bestäms med hänsyn till provmängdens storlek. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.4    Provtagning på lagringsanläggningar (silor)

8.4.1    Provtagning på silor som (lätt) kan nås ovanifrån

Provtagningen ska utföras på den åtkomliga delen av partiet. Antalet delprov bestäms med hänsyn till provmängdens storlek. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.4.2    Provtagning på silor som inte kan nås ovanifrån (slutna silor)

8.4.2.1    Silor som inte kan nås ovanifrån (slutna silor) i storleken > 100 ton

Prov på foder som lagras i sådana silor kan inte tas statiskt. Om prov måste tas på fodret i silon och det inte finns någon möjlighet att flytta varupartiet ska det därför avtalas med företagaren att han eller hon ska informera inspektören om när silon kommer att tömmas för att göra det möjligt att ta prov på fodret när det är i flöde.

8.4.2.2    Silor som inte kan nås ovanifrån (slutna silor) i storleken < 100 ton

Provtagningsförfarandet innebär att en kvantitet av 50–100 kg överförs till ett kärl och att provet tas från detta. Storleken på samlingsprovet motsvarar hela partiet och antalet delprov står i relation till de kvantiteter i silon som överförs till ett kärl för provtagning. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.5    Provtagning på löst foder i stora slutna behållare

Prov på sådana partier kan ofta enbart tas när de lossas. Det är i vissa fall omöjligt att lossa vid importstället eller kontrollpunkten och därför bör provtagningen ske när sådana behållare lossas.

9.   ANVISNINGAR OM UTTAGNING, BEREDNING OCH FÖRPACKNING AV PROVEN

9.1    Allmänt

Proven ska tas och beredas utan onödigt dröjsmål med beaktande av de försiktighetsåtgärder som krävs för att produkten varken ska förändras eller kontamineras. Instrument, ytor och behållare som kommer i kontakt med proven ska vara rena och torra.

9.2    Delprov

Delprov ska tas slumpvis i hela provmängden och ha ungefär samma storlek.

Delprovets storlek ska vara minst 100 gram eller, för grovfoder eller vallfoder med låg specifik vikt, 25 gram.

Om färre än 40 delprov ska uttas enligt bestämmelserna om provtagningsförfarande i punkt 8 ska delprovens storlek fastställas i förhållande till den storlek som krävs för samlingsprovet (se punkt 6).

Om det utförs provtagning på små partier av förpackat foder, där det enligt de kvantitativa kraven ska uttas ett begränsat antal delprov, ska ett delprov utgöras av innehållet i en ursprunglig enhet med ett innehåll på högst 1 kg eller 1 liter.

Om det utförs provtagning på förpackat foder som består av små enheter (t.ex. < 250 g) beror delprovets storlek på enhetens storlek.

9.2.1    Löst foder

Provtagningen kan, om så är lämpligt, göras medan provmängden är i rörelse (vid lastning eller lossning).

9.2.2    Förpackat foder

När det antal enheter som krävs för provtagning enligt kapitel 5 har valts ut ska en del av innehållet i varje enhet tas ut med spjut eller skyffel. Vid behov tas proven efter det att enheterna har tömts separat.

9.2.3    Flytande eller halvflytande foder som är homogent eller kan homogeniseras

När det antal enheter som krävs för provtagning enligt kapitel 5 har valts ut ska innehållet vid behov homogeniseras och en mängd tas från varje enhet.

Delproven får tas när innehållet lossas.

9.2.4    Flytande eller halvflytande foder som inte kan homogeniseras

När det antal enheter som krävs för provtagning enligt kapitel 5 har valts ut ska prov tas från olika nivåer.

Proven får också tas när innehållet lossas, men de första fraktionerna ska då kastas.

I båda fallen ska den totala volymen vara minst tio liter.

9.2.5    Foderblock och saltstenar

När det antal block eller stenar som krävs för provtagning enligt kapitel 5 har valts ut får en del av varje block eller sten tas ut. Om det finns en misstanke om att ett block eller en sten inte är homogen får hela blocket eller stenen tas ut som prov.

För block eller stenar på högst 1 kg styck ska ett delprov utgöras av innehållet i ett block eller en sten.

9.3    Beredning av samlingsprov

Delproven ska blandas till ett enda samlingsprov.

9.4    Beredning av slutliga prov

Materialet i samlingsprovet ska blandas omsorgsfullt ( 4 ):

9.5    Förpackning av prov

Behållarna eller förpackningarna ska förseglas och märkas på sådant sätt att de inte kan öppnas utan att förseglingen skadas. Hela märkningen ska ingå i förseglingen.

9.6    Sändning av proven till laboratoriet

Provet ska utan onödigt dröjsmål sändas till det utsedda analyslaboratoriet tillsammans med de upplysningar som den som utför analysen behöver.

10.   REGISTRERING AV PROV

Alla prov ska registreras så att varje provmängd och dess storlek entydigt kan identifieras.

I registret ska också anges varje avvikelse från det provtagningsförfarande som anges i den här förordningen.

Förutom att registret ska hållas tillgängligt för det officiella kontrollaboratoriet, ska det hållas tillgängligt för foderföretagaren och/eller det laboratorium som utsetts av foderföretagaren.

BILAGA II

ALLMÄNNA BESTÄMMELSER OM ANALYSMETODER FÖR FODER

A.   BEREDNING AV ANALYSPROV

1.    Syfte

De metoder som beskrivs nedan gäller beredning för analys av prov som skickats till kontrollaboratorierna efter provtagning i enlighet med bilaga I.

Laboratorieproven ska beredas så att den uppvägda mängden enligt analysmetoden är homogen och representativ för de slutliga proven.

2.    Försiktighetsåtgärder

Vilken provberedningsmetod som ska användas beror på analysmetoden och de beståndsdelar eller ämnen som ska kontrolleras. Det är därför viktigt att man ser till att provberedningsmetoden lämpar sig för den analysmetod som används och för de beståndsdelar eller ämnen som ska kontrolleras.

Alla nödvändiga moment ska utföras på ett sådant sätt att man i görligaste mån undviker att provet kontamineras eller att dess sammansättning ändras.

Malning, blandning och siktning bör göras utan dröjsmål så att provet i minsta möjliga utsträckning utsätts för luft och ljus. Kvarnar och rivare som avsevärt kan hetta upp provet bör inte användas.

Malning för hand rekommenderas för foder som är särskilt känsliga för värme. Man bör också se till att apparaten inte i sig själv är en källa till kontaminering.

Om provet inte kan beredas utan betydande förändringar av dess vattenhalt ska vattenhalten före och efter beredningen bestämmas med den metod som anges i bilaga III del A.

3.    Förfarande

3.1    Allmänt förfarande

Testdelprovet tas från det slutliga provet. Koning och kvartering rekommenderas inte eftersom det kan ge testdelproven större neddelningsfel.

3.1.1    Foder som kan malas i befintligt tillstånd

3.1.2    Foder som kan malas efter torkning

3.1.3    Flytande eller halvflytande foder

3.1.4    Öviga foder

3.2    Särskilt förfarande vid undersökning genom okulärbesiktning eller genom mikroskopi eller om hela samlingsprovet homogeniserats

4.    Provförvaring

Proven ska förvaras vid en temperatur som inte påverkar deras sammansättning. Prov avsedda för analys av vitaminer eller ämnen som är särskilt ljuskänsliga ska förvaras under sådana förhållanden att provet inte påverkas negativt av ljus.

B.   BESTÄMMELSER OM REAGENS OCH UTRUSTNING FÖR ANALYS

C.   VAL AV ANALYSMETOD OCH RESULTATANGIVELSE

1.    Extraktion

I flera fall anges en specifik extraktionsmetod för en viss analysmetod. I allmänhet kan andra extraktionsmetoder än den som finns i metodbeskrivningen användas om det kan visas att den använda extraktionsmetoden har samma extraktionseffektivitet för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden.

2.    Rening

I många fall anges en specifik reningsmetod för en viss analysmetod. I allmänhet kan andra reningsmetoder än den som finns i metodbeskrivningen användas om det kan visas att den använda reningsmetoden ger samma analysresultat för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden.

3.    Antal bestämningar

När det gäller analys av främmande ämnen gäller att om resultatet från den första bestämningen är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras så behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används. I andra fall behövs två analyser (en andra bestämning) för att utesluta möjligheten till intern korskontaminering eller oavsiktlig hopblandning av prov. Medelvärdet av de två bestämningarna, där mätosäkerheten beaktas, används för kontroll av att kraven är uppfyllda.

I fråga om kontroll av det deklarerade innehållet av ett ämne eller en beståndsdel gäller att om resultatet från den första bestämningen bekräftar det deklarerade innehållet, dvs. analysresultatet hamnar inom ett intervall för acceptabel variation jämfört med det deklarerade innehållet, behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används. I andra fall behövs två analyser (en andra bestämning) för att utesluta möjligheten till intern korskontaminering eller oavsiktlig hopblandning av prov. Medelvärdet av de två bestämningarna, där mätosäkerheten beaktas, används för kontroll av att kraven är uppfyllda.

I en del fall definieras detta acceptabla variationsintervall, t.ex. i Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 767/2009 av den 13 juli 2009 om utsläppande på marknaden och användning av foder, om ändring av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1831/2003 och om upphävande av rådets direktiv 79/373/EEG, kommissionens direktiv 80/511/EEG, rådets direktiv 82/471/EEG, 83/228/EEG, 93/74/EEG, 93/113/EG och 96/25/EG samt kommissionens beslut 2004/217/EG ( 7 ).

4.    Angivande av analysmetod som använts

I analysrapporten ska anges vilken analysmetod som använts.

5.    Rapportering av analysresultat

Analysresultatet ska uttryckas med lämpligt antal värdesiffror på det sätt som anges i metodbeskrivningen och ska vid behov korrigeras för vattenhalten i det slutliga provet före beredning.

6.    Mätosäkerhet och utbyte vid analys av främmande ämnen

I fråga om främmande ämnen enligt direktiv 2002/32/EG ska en produkt avsedd som foder inte anses uppfylla kraven på högsta tillåtna halt om analysresultatet, för foder med en vattenhalt på 12 %, bedöms överstiga högsta tillåtna halt med hänsyn tagen till den utvidgade mätosäkerheten och korrigering för utbytet. För att bedöma om kraven uppfylls använder man den analyserade halten, korrigerad för utbyte, minus den utvidgade mätosäkerheten. Denna metod kan bara användas om det går att uppskatta mätosäkerheten och korrigering för utbyte med hjälp av analysmetoden (den kan exempelvis inte användas för mikroskopisk analys).

Analysresultatet ska rapporteras enligt följande (om analysmetoden gör det möjligt att uppskatta mätosäkerhet och utbyte):

Om analysresultatet är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras, och förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden använts och att analysen endast syftar till att kontrollera om fodret uppfyller kraven i lagstiftningen, får analysresultatet rapporteras utan korrigering för utbyte. Utbyte och mätosäkerhet behöver inte anges i dessa fall.

▼B

BILAGA III

ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV FODERRÅVARORS OCH FODERBLANDNINGARS SAMMANSÄTTNING

A.   BESTÄMNING AV VATTENHALT

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan vattenhalten i foder bestämmas. Det bör framhållas att när det gäller foder som innehåller flyktiga ämnen, exempelvis organiska syror, bestäms också en betydande mängd flyktiga ämnen tillsammans med vatteninnehållet.

Metoden omfattar inte analys av mjölkprodukter som används som foderråvaror, analys av mineralämnen och blandningar som främst består av mineralämnen, analys av animaliska och vegetabiliska fetter och oljor eller analys av oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter.

2.   Princip

Provet torkas på angivet sätt, alltefter fodrets beskaffenhet. Viktförlusten bestäms genom vägning. När det gäller fast foder med hög vattenhalt är det nödvändigt att göra en förberedande torkning.

3.   Utrustning

4.   Utförande

4.1   Beredning

4.1.1    Andra fodertyper än de som behandlas i 4.1.2 och 4.1.3

Ta minst 50 g av provet. Krossa eller sönderdela vid behov för att göra provet homogent med avseende på vattenhalt (se 6).

4.1.2    Spannmål och gröpe

Ta minst 50 g av provet. Mal till partiklar som till minst 50 % passerar genom en sikt med en maskvidd av 0,5 mm och som lämnar högst 10 % återstod på en rundmaskig sikt med en maskvidd av 1 mm.

4.1.3    Foder i flytande form eller pastaform samt foder som till större delen består av oljor och fetter

Ta ca 25 g av provet och väg med en noggrannhet av 10 mg. Tillsätt lämplig mängd vattenfri sand som vägts med en noggrannhet av 10 mg och blanda tills en homogen massa erhålls.

4.2   Torkning

4.2.1    Andra fodertyper än de som behandlas i 4.2.2 och 4.2.3

Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 1 mg. Väg upp ca 5 g av provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 103 oC. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i 4 timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 103 oC. Sätt på locket på behållaren, ta ut denna ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg.

Foder som till större delen består av oljor och fetter torkas i ugnen i ytterligare 30 minuter vid 130 oC. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överstiga 0,1 %.

4.2.2    Spannmål, mjöl och gröpe

Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg upp ca 5 g av det krossade provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 130 oC. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i två timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 130 oC. Sätt på locket på behållaren, ta ut denna ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg.

Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg upp ca 5 g av provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i vakuumugnen (3.5) som förvärmts till 80–85 oC. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket.

Ställ in trycket på 100 torr och låt torka vid detta tryck i 4 timmar, antingen med en torr varmluftsström eller med användning av torkmedel (ca 300 g till 20 prov). Om det senare alternativet väljs ska vakuumpumpen frånkopplas när det angivna trycket har uppnåtts. Räkna torkningstiden från det att ugnstemperaturen åter har nått 80–85 oC. Låt försiktigt ugnen återgå till atmosfärstryck. Öppna ugnen, sätt omedelbart lock på behållaren, ta ut den ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg. Låt torka i ytterligare 30 minuter i vakuumugnen vid 80–85 oC och väg på nytt. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överstiga 0,1 %.

4.3   Förberedande torkning

4.3.1    Andra foder än de som behandlas i 4.3.2

Fasta foder med hög vattenhalt som försvårar krossning måste genomgå en förberedande torkning enligt följande:

Väg upp 50 g okrossat prov med en noggrannhet av 10 mg (pellets och briketter kan vid behov delas grovt) i en lämplig behållare (t.ex. en 20 × 12 cm aluminiumplåt med 0,5 cm upphöjd kant). Låt torka i ugn vid 60–70 oC tills vattenhalten har reducerats till 8–12 %. Ta ut provet ur ugnen, låt svalna utan lock i laboratoriet i 1 timme och väg med en noggrannhet av 10 mg. Krossa provet omedelbart enligt 4.1.1 och torka enligt 4.2.1 eller 4.2.3 beroende på fodrets beskaffenhet.

4.3.2    Spannmål

Spannmål med en vattenhalt över 17 % måste genomgå en förberedande torkning enligt följande:

Väg upp 50 g omalda spannmålskärnor med en noggrannhet av 10 mg i en lämplig behållare (t.ex. en 20 × 12 cm aluminiumplåt med 0,5 cm upphöjd kant). Låt torka i ugn i 5–7 minuter vid 130 oC. Ta ut provet ur ugnen, låt svalna utan lock i laboratoriet i två timmar och väg med en noggrannhet av 10 mg. Mal omedelbart enligt 4.1.2 och torka enligt 4.2.2.

5.   Beräkning av resultat

Vattenhalten (X) i procent av provet beräknas med nedanstående formler.

5.1   Torkning utan förberedande torkning

där:

5.2   Torkning med förberedande torkning

där:

5.3   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,2 % av den absoluta vattenhalten.

6.   Anmärkning

Om det är nödvändigt att krossa provet och detta medför en iakttagbar förändring av vattenhalten, måste resultaten av analyserna av fodrets beståndsdelar korrigeras på grundval av provets ursprungliga vattenhalt.

B.   BESTÄMNING AV VATTENHALT I ANIMALISKA OCH VEGETABILISKA OLJOR OCH FETTER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod är det möjligt att bestämma halter av vatten och flyktiga ämnen i animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

2.   Princip

Provet torkas till konstant vikt (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg) vid 103 oC. Viktförlusten bestäms genom vägning.

3.   Utrustning

4.   Utförande

Väg med 1 mg noggrannhet upp ca 20 g av det homogeniserade provet på den torra, vägda skålen (3.1) där termometern (3.2) placerats. Upphetta på sandbadet eller värmeplattan (3.3) under ständig omrörning med termometern så att temperaturen stiger till 90 oC på ca 7 minuter.

Sänk värmen och ge akt på mängden bubblor som stiger från skålens botten. Temperaturen får inte överstiga 105 oC. Fortsätt att röra om och skrapa skålens botten tills det inte längre bildas några bubblor.

För att försäkra sig om att vattnet helt har avlägsnats upphettar man upprepade gånger till 103 ± 2 oC och kyler till 93 oC mellan upphettningarna. Därefter får provet svalna till rumstemperatur i exsickatorn (3.4) varefter det vägs. Detta upprepas tills viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar inte längre överstiger 2 mg.

5.   Beräkning av resultat

Provets vattenhalt X i procent beräknas med formeln

där:

Resultat under 0,05 % ska redovisas som ”under 0,05 %”.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,05 % av den absoluta vattenhalten.

C.   BESTÄMNING AV RÅPROTEINHALT

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan råproteinhalten i foder bestämmas på grundval av kvävehalten, bestämd med Kjeldahlmetoden.

2.   Princip

Provet uppsluts med svavelsyra i närvaro av en katalysator. Syralösningen görs basisk med natriumhydroxidlösning. Ammoniaken destilleras av och samlas upp i en uppmätt kvantitet svavelsyra varefter syraöverskottet titreras med en standardlösning av natriumhydroxid.

Alternativt destilleras den frigjorda ammoniaken till ett överskott av borsyralösning, som sedan titreras med saltsyra eller svavelsyra.

3.   Reagens

Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkten ska indikatorerna metylrött och bromkresolgrönt tillsättas borsyralösningarna. För beredning av 1 liter borsyralösning tillsätts 7 ml lösning av metylrött (3.16) och 10 ml lösning av bromkresolgrönt (3.17) innan volymen justeras.

Beroende på det vatten som används kan borsyralösningens pH variera mellan olika satser. Det är ofta nödvändigt med en liten tillsats av bas för att få ett positivt blankprov.

4.   Utrustning

Lämplig utrustning för uppslutning, destillation och titrering enligt Kjeldahlmetoden.

5.   Utförande

5.1   Uppslutning

Väg upp 1 g av provet med 0,001 g noggrannhet och överför detta till uppslutningsapparatens kolv. Tillsätt 15 g kaliumsulfat (3.1), en lämplig mängd katalysator (3.2) (0,3 –0,4 g koppar(II)oxid eller 0,9 –1,2 g koppar(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svavelsyra (3.4) och vid behov några korn pimpsten (3.12). Blanda.

Upphetta kolven först måttligt, och rotera den vid behov då och då tills innehållet har förkolnat och skummet försvunnit. Upphetta sedan intensivare tills vätskan kommit i konstant kokning. Värmen är tillräcklig om den kokande syran kondenserar på kolvens väggar. Se till att kolvens väggar inte blir överhettade och att organiska partiklar inte fastnar på dem.

När lösningen har blivit klar och ljusgrön fortsätts kokningen i ytterligare två timmar, varefter lösningen får svalna.

5.2   Destillation

Tillsätt försiktigt tillräckligt med vatten för att sulfaterna ska lösas upp fullständigt. Låt svalna. Tillsätt sedan några korn zinkgranulat (3.3) om så behövs. Fortsätt enligt 5.2.1 eller 5.2.2.

5.2.1    Destillation till svavelsyra

Tillför en exakt uppmätt mängd av 25 ml svavelsyra (3.5) eller (3.7), beroende på den förmodade kvävehalten, till destillationsapparatens uppsamlingskolv. Tillsätt några droppar metylrött (3.8).

Förbind kolven med destillationsapparatens kylare och sänk ned kylarens ände minst 1 cm (se anmärkning 8.3) i vätskan i uppsamlingskolven. Häll långsamt 100 ml natriumhydroxidlösning (3.9) i kolven utan att ammoniak försvinner (se anmärkning 8.1). Upphetta kolven tills ammoniaken har destillerats färdigt.

5.2.2    Destillation till borsyra

Om destillatets ammoniakinnehåll titreras manuellt används nedanstående förfarande. Om destillationsenheten är helautomatisk och inkluderar titrering av destillatets ammoniakinnehåll, ska tillverkarens bruksanvisning följas.

Ställ en uppsamlingskolv innehållande 25–30 ml borsyralösning (3.18) under kylarens utlopp på ett sådant sätt att utloppsröret mynnar under ytan i ett överskott av borsyralösning. Ställ in destillationsenheten så att 50 ml natriumhydroxidlösning (3.9) tillsätts. Använd destillationsenheten enligt tillverkarens bruksanvisning och destillera av den ammoniak som frigjorts genom tillsatsen av natriumhydroxidlösning. Samla upp destillatet i borsyralösningen. Mängden destillat (tiden för ångdestillation) beror på mängden kväve i provet. Följ tillverkarens bruksanvisning.

5.3   Titrering

Fortsätt enligt 5.3.1 eller 5.3.2.

5.3.1    Svavelsyra

Överskottet av svavelsyra titreras i uppsamlingskolven med natriumhydroxidlösning (3.10 eller 3.11), beroende på vilken koncentration av svavelsyra som använts, tills ekvivalenspunkten är nådd.

5.3.2    Borsyra

Uppsamlingskolvens innehåll titreras med standardlösning av saltsyra (3.19) eller med standardlösning av svavelsyra (3.6) med hjälp av en byrett. Den använda mängden titrator avläses.

Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkten nås denna så snart provet börjar skifta färg till rosa. Avläs byretten med 0,05 ml noggrannhet. En upplyst magnetomrörare eller en fotometer kan göra det lättare att påvisa färgomslaget.

Detta kan också göras automatiskt med hjälp av en ångdestillationsapparat med automatisk titrering.

Följ tillverkarens bruksanvisning för den använda destillationsapparaten eller destillations-/titreringsapparaten.

5.4   Blankprov

För att säkerställa att reagensen är fria från kväve utförs ett blankprov (uppslutning, destillation och titrering) med 1 g sackaros (3.14) i stället för provet.

6.   Beräkning av resultat

Beräkningarna görs enligt 6.1 eller 6.2.

6.1   Beräkning för titrering enligt 5.3.1

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där:

6.2   Beräkning för titrering enligt 5.3.2

6.2.1    Titrering med saltsyra

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där:

6.2.2    Titrering med svavelsyra

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där:

7.   Verifiering av metoden

7.1   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

7.2   Noggrannhet

Utför analysen (uppslutning, destillation och titrering) på 1,5 –2,0 g acetanilid (3.13) i närvaro av 1 g sackaros (3.14). 1 g acetanilid förbrukar 14,80 ml svavelsyra (3.5). Utbytet ska vara minst 99 %.

8.   Anmärkningar

D.   BESTÄMNING AV UREA

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan ureahalten i foder bestämmas.

2.   Princip

Provet slammas upp i vatten med klarmedel. Suspensionen filtreras. Ureahalten i filtratet bestäms efter tillsats av 4-dimetylaminobensaldehyd (4-DMAB) genom mätning av absorbansen vid våglängden 420 nm.

3.   Reagens

4.   Utrustning

5.   Utförande

5.1   Analys av provet

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2 g av provet i en 500 ml mätkolv tillsammans med 1 g aktivt kol (3.4). Tillsätt 400 ml vatten och 5 ml Carrez-lösning I (3.2), blanda i ca 30 sekunder och tillsätt 5 ml Carrez-lösning II (3.3). Blanda i 30 minuter på skakapparaten. Späd med vatten till full volym, skaka om och filtrera.

För över 5 ml av de transparenta, färglösa filtraten till provrör med slipade glasproppar, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (3.1) och blanda. Ställ provrören i ett vattenbad som håller 20 oC (+/– 4 oC). Mät efter 15 minuter provlösningens absorbans med spektrofotometer vid 420 nm. Jämför med blankprovslösningen av reagensen.

5.2   Kalibreringskurva

För över volymer på 1, 2, 4, 5 och 10 ml av urealösningen (3.5) till 100 ml mätkolvar och späd med vatten till full volym. Avlägsna 5 ml från varje lösning, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (3.1) till var och en av dem, homogenisera och mät absorbansen enligt ovan jämfört med en kontrollösning som innehåller 5 ml 4-DMAB-lösning och 5 ml ureafritt vatten. Konstruera kalibreringskurvan.

6.   Beräkning av resultat

Bestäm ureamängden i provet med hjälp av kalibreringskurvan.

Uttryck resultatet i procent av provet.

7.   Anmärkningar

E.   BESTÄMNING AV FLYKTIGA KVÄVEFÖRENINGAR

I.   GENOM MIKRODIFFUSION

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten flyktiga kväveföreningar, uttryckt som ammoniak, bestämmas i foder.

2.   Princip

Provet extraheras med vatten och lösningen klaras och filtreras. De flyktiga kväveföreningarna avskiljs genom mikrodiffusion med kaliumkarbonatlösning, samlas upp i borsyrelösning och titreras med svavelsyra.

3.   Reagens

4.   Utrustning

5.   Utförande

Väg upp 10 g av provet med en noggrannhet av 1 mg och överför det tillsammans med 100 ml vatten till en 200 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i 30 minuter. Tillsätt 50 ml triklorättiksyralösning (3.1), späd med vatten till full volym, skaka kraftigt och filtrera genom ett veckat filtrerpapper.

Tillsätt med pipett 1 ml borsyrelösning (3.3) i den inre delen av Conwaycellen och 1 ml av provfiltratet i cellens krona. Täck delvis med det infettade locket. Droppa snabbt 1 ml mättad kaliumkarbonatlösning (3.4) i kronan och tillslut locket lufttätt. Rotera försiktigt cellen i horisontellt läge så att de två reagensen blandas. Inkubera antingen vid rumstemperatur i minst fyra timmar eller vid 40 oC i en timme.

Titrera med hjälp av en mikrobyrett (4.3) de flyktiga föreningarna i borsyralösningen med svavelsyra (3.5).

Utför ett blankprov med samma metod men utan analysprov.

6.   Beräkning av resultat

1 ml 0,01 M H2SO4 motsvarar 0,34 mg ammoniak.

Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

7.   Anmärkning

Om provets ammoniakhalt överstiger 0,6 % ska det ursprungliga filtratet spädas ut.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   GENOM DESTILLATION

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten flyktiga kväveföreningar, uttryckt som ammoniak, bestämmas i fiskmjöl som är i det närmaste ureafritt. Den kan endast användas vid ammoniakhalter under 0,25 %.

2.   Princip

Provet extraheras med vatten och lösningen klaras och filtreras. De flyktiga kväveföreningarna avskiljs vid kokpunkten genom tillsats av magnesiumoxid och samlas upp i en bestämd mängd svavelsyra. Överskottet av svavelsyra återtitreras med natriumhydroxidlösning.

3.   Reagens

4.   Utrustning

5.   Utförande

Väg upp 10 g av provet med en noggrannhet av 1 mg och överför det tillsammans med 100 ml vatten till en 200 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i 30 minuter. Tillsätt 50 ml triklorättiksyralösning (3.1), späd med vatten till full volym, skaka om kraftigt och filtrera genom ett veckat filtrerpapper.

Ta ut klart filtrat i en volym avpassad för den förmodade halten flyktiga kväveföreningar (100 ml brukar vara lämpligt). Späd till 200 ml och tillsätt 2 g magnesiumoxid (3.2) och några droppar skumdämpande emulsion (3.3). Lösningen ska ge basisk reaktion med lackmuspapper; om så inte är fallet tillsätts lite magnesiumoxid (3.2). Fortsätt enligt 5.2 och 5.3 i analysmetoden för bestämning av råproteinhalten (del C i denna bilaga).

Utför ett blankprov med samma metod men utan analysprov.

6.   Beräkning av resultat

1 ml 0,05 mol/l H2SO4 motsvarar 1,7 mg ammoniak.

Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % (relativt värde).

F.   BESTÄMNING AV AMINOSYROR (UTOM TRYPTOFAN)

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan fria aminosyror (syntetiska och naturliga) och totalhalten aminosyror (peptidbundna och fria) i foder bestämmas med hjälp av en aminosyraanalysator. Den är tillämplig på följande aminosyror: cyst(e)in, metionin, lysin, treonin, alanin, arginin, asparaginsyra, glutaminsyra, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin och valin.

Metoden skiljer inte mellan aminosyrornas salter och kan inte skilja mellan aminosyrornas D- och L-former. Den är inte användbar för bestämning av tryptofan eller hydroxyanaloger av aminosyror.

2.   Princip

2.1   Fria aminosyror

De fria aminosyrorna extraheras med utspädd saltsyra. Samextraherade kvävehaltiga makromolekyler fälls ut med sulfosalicylsyra och avlägsnas genom filtrering. Den filtrerade lösningens pH justeras till 2,20 . Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm genom reaktion med ninhydrin.

2.2   Totalhalt aminosyror

Valet av förfarande beror på vilka aminosyror som ska bestämmas. Cyst(e)in och metionin måste oxideras till cysteinsyra respektive metioninsulfon före hydrolys. Tyrosin måste bestämmas i hydrolysat av ooxiderade prov. Alla övriga aminosyror som räknas upp i punkt 1 kan bestämmas i antingen det oxiderade eller ooxiderade provet.

Oxidation utförs vid 0 oC med en blandning av permyrsyra och fenol. Överskott av oxidationsreagens avlägsnas genom tillsats av dinatriumdisulfit. Det oxiderade eller ooxiderade provet hydrolyseras med saltsyra (3.20) i 23 timmar. Hydrolysatet justeras till pH 2,20 . Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm (440 nm för prolin) genom reaktion med ninhydrin.

3.   Reagens

Dubbeldestillerat vatten eller vatten av likvärdig kvalitet ska användas (konduktivitet < 10 μS/cm).

Lös 300 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter.

Lös 40 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter.

Blanda 889 g myrsyra (3.2) med 111 g vatten och tillsätt 4,73 g fenol (3.3).

Tillsätt 1 g fenol (3.3) till 492 ml HCl (3.7) och späd med vatten till 1 liter.

Lös 60 g 5-sulfosalicylsyra (3.6) i vatten och späd till 1 liter.

Blanda 0,5 ml väteperoxid (3.1) med 4,5 ml myrsyra-fenollösning (3.19) i en liten bägare. Inkubera i 20–30 oC i 1 timme för att permyrsyra ska bildas, kyl sedan i isvattenbad (15 min.) före tillsats till provet.

Varning: Undvik hudkontakt, använd skyddskläder.

Lös 19,61 g natriumcitrat (3.8), 5 ml tiodiglykol (3.9), 1 g fenol (3.3) och 16,50 ml HCl (3.7) i ca 800 ml vatten. Justera pH till 2,20 . Späd med vatten till 1 liter.

c = 2,5 μmol/ml av var och en i saltsyra.

Finns att köpa i handeln.

Lös 0,2115 g cysteinsyra (3.16.2) och 0,2265 g metioninsulfon (3.16.3) i citratbuffert (3.24) i en 1 000 ml mätkolv och späd till märket med citratbuffert. Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst tolv månader. Denna lösning används ej om stamlösningen (3.27.1) innehåller cysteinsyra och metioninsulfon.

Lös 0,6560 g norleucin (3.13) i citratbuffert (3.24) i en mätkolv och späd till 250 ml med citratbuffert. Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst 6 månader.

Överför kvantitativt till en 50 ml mätkolv, späd till märket med citratbuffert (3.24) och blanda.

Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst 3 månader.

Se även punkt 9.1.

Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst 3 månader.

4.   Utrustning

Kolonnen fylls med sulfonerad polystyrenharts som kan separera aminosyrorna från varandra och från andra ninhydrinpositiva material. Flödet i buffert- och ninhydrinledningarna ombesörjs av pumpar vars flödesstabilitet är ± 0,5 % under en period som täcker både standardkalibreringskörningen och analysen av provet.

Med vissa aminosyraanalysatorer kan man använda hydrolysmetoder där hydrolysatet har en natriumkoncentration på c = 0,8 mol/l och innehåller all överskottsmyrsyra från oxidationssteget. Andra ger inte en tillfredsställande separation av vissa aminosyror i hydrolysat med ett överskott av myrsyra och/eller hög natriumkoncentration. I detta fall reduceras syravolymen genom indunstning till ca 5 ml efter hydrolysen och före pH-justeringen. Indunstningen ska utföras i vakuum vid högst 40 oC.

5.   Utförande

5.1   Provberedning

Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prov med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 oC eller frystorkas före malningen. Prov med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (3.12) före malningen.

5.2   Bestämning av fria aminosyror i foder och förblandningar

Väg med 0,2 mg noggrannhet upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (5.1) i en E-kolv och tillsätt 100,0 ml av extraktionsblandningen (3.21). Blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (4.8). Låt sedimentera och pipettera över 10,0 ml av supernatanten till en 100 ml bägare.

Tillsätt 5,0 ml sulfosalicylsyralösning (3.22) under omrörning och fortsätt röra om med hjälp av en magnetomrörare i fem minuter. Filtrera eller centrifugera supernatanten för att avlägsna eventuella fällningar. Överför 10,0 ml av den kvarvarande lösningen till en 100 ml bägare och justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (3.18), överför till en mätkolv av lämplig volym med citratbuffert (3.24) och späd till märket med buffertlösningen (3.24).

Om en intern standard används, tillsätt 1,00 ml av denna (3.27.3) för varje 100 ml färdig lösning och späd till märket med buffertlösningen (3.24).

Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Om extrakten inte kromatograferas samma dag måste de förvaras vid en temperatur under 5 oC.

5.3   Bestämning av totalhalt aminosyror.

5.3.1    Oxidation

Väg med 0,2 mg noggrannhet upp 0,1 –1 g av det beredda provet (5.1) i

Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve, och vattenhalten får inte överstiga 100 mg.

Ställ kolven/flaskan i ett isvattenbad och kyl till 0 oC, tillsätt 5 ml oxidationsblandning (3.23) och blanda med hjälp av en glasspatel med böjd spets. Tillslut kolven/flaskan innehållande spateln med en lufttät folie, ställ isvattenbadet innehållande den tillslutna behållaren i ett kylskåp vid 0 oC och låt stå i 16 timmar. Avlägsna provet ur kylskåpet efter 16 timmar och avlägsna överskottet av oxidationsreagens genom tillsats av 0,84 g dinatriumdisulfit (3.4).

Fortsätt till 5.3.2.1.

5.3.2    Hydrolys

5.3.2.1    Hydrolys av oxiderade prov

Tillsätt 25 ml av hydrolysblandningen (3.20) till det oxiderade prov som beretts enligt 5.3.1. Skölj ned eventuella provrester som fastnat på kärlets sidor och på spateln.

Fortsätt enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4, beroende på vilken hydrolysmetod som används.

5.3.2.2    Hydrolys av ooxiderade prov

Väg med 0,2 mg noggrannhet upp 0,1 –1 g av det beredda provet (5.1) i antingen en 100 ml eller 250 ml rundkolv (4.1) eller en 100 ml flaska med skruvkork (4.2). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt försiktigt 25 ml av hydrolysblandningen (3.20) och blanda med provet. Fortsätt enligt antingen 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.3    Öppen hydrolys

Tillsätt tre glaspärlor till blandningen i kolven (beredd enligt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2) och återloppskoka i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, skölj kylaren med 5 ml citratbuffert (3.24). Koppla bort kolven och kyl den i ett isvattenbad.

Fortsätt enligt 5.3.3.

5.3.2.4    Sluten hydrolys

Sätt in flaskan med blandningen, beredd enligt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2, i en ugn (4.3) vid 110 oC. För att förhindra tryckökning (på grund av gasutveckling) och explosion bör skruvkorken sättas löst på flaskan under den första timmen. Tillslut inte flaskan med skruvkorken. Efter 1 timme dras skruvkorken åt och flaskan med får stå i ugnen (4.3) i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, ta ut flaskan ur ugnen, öppna försiktigt skruvkorken och ställ flaskan i ett isvattenbad. Låt svalna.

Beroende på metod för pH-justering (5.3.3), överför flaskans innehåll kvantitativt till en 250 ml bägare eller till en 250 ml rundkolv med citratbuffert (3.24).

Fortsätt enligt 5.3.3.

5.3.3    Justering av pH

Beroende på aminosyraanalysatorns (4.9) natriumtolerans, fortsätt enligt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2 för pH-justeringen.

5.3.3.1    Kromatografiska system (4.9) som kräver en låg natriumkoncentration

Det är tillrådligt att använda en stamlösning av intern standard (3.27.3) om aminosyraanalysatorn kräver en låg natriumkoncentration (om syravolymen måste reduceras).

Tillsätt i detta fall 2,00 ml stamlösning av intern standard (3.27.3) till hydrolysatet före indunstningen.

Tillsätt 2 droppar 1-oktanol (3.15) till det hydrolysat som erhållits enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

Låt provet indunsta i rotationsindunstare (4.7) till 5–10 ml i vakuum vid 40 oC. Om volymen av någon anledning reduceras till mindre än 5 ml måste hydrolysatet kastas och analysen göras om.

Justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (3.18) och fortsätt till 5.3.4.

5.3.3.2    Alla övriga aminosyraanalysatorer (4.9)

Ta det hydrolysat som erhölls enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 och neutralisera det delvis genom att försiktigt och under omrörning tillsätta 17 ml natriumhydroxidlösning (3.17), och se till att temperaturen hålls under 40 oC.

Justera pH till 2,20 vid rumstemperatur med natriumhydroxidlösning (först 3.17 och sedan 3.18). Fortsätt till 5.3.4.

5.3.4    Provlösning för kromatografi

Överför kvantitativt det pH-justerade hydrolysatet (5.3.3.1 eller 5.3.3.2) med citratbuffert (3.24) till en 200 ml mätkolv och späd till märket med buffert (3.24).

Om en intern standard inte redan använts, tillsätt 2,00 ml av denna (3.27.3) och späd till märket med citratbuffert (3.24). Blanda omsorgsfullt.

Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Om provlösningarna inte kromatograferas samma dag måste de förvaras vid en temperatur under 5 oC.

5.4   Kromatografi

Före kromatografin, låt extraktet (5.2) eller hydrolysatet (5.3.4) anta rumstemperatur. Skaka blandningen och filtrera en lämplig mängd genom ett 0,22 μm membranfilter (4.5). Den klara lösning som erhålls får genomgå jonbyteskromatografi i en aminosyraanalysator (4.9).

Injektionen kan utföras antingen manuellt eller automatiskt. Det är viktigt att samma mängd lösning ± 0,5 % alltid tillsätts kolonnen för analys av standardlösning och prov, utom när en intern standard används, och att kvoten natrium/aminosyra i standard- och provlösning är så lika som möjligt.

Hur ofta kalibreringsprov behöver köras beror i allmänhet på ninhydrinreagensens stabilitet och typen av analyssystem. Standarden eller provet späds med citratbuffert (3.24) för att ge en topparea för standarden på 30–200 % av provets aminosyratopparea.

Kromatografin av aminosyror varierar något beroende på typen av analysator och harts. Det valda systemet måste kunna separera aminosyrorna från varandra och från ninhydrinpositiva material. Kromatografisystemet bör i driftsområdet ge en linjär respons på förändringar i de aminsyramängder som tillförs kolonnen.

Under kromatografisteget gäller de botten/toppkvoter som anges nedan när en ekvimolär lösning (av de aminosyror som mäts) analyseras. Denna ekvimolära lösning måste innehålla minst 30 % av den maximala mängd av varje aminosyra som med noggrannhet kan bestämmas med analyssystemet (4.9).

För separering av treonin-serin bör botten/toppkvoten för den lägre av de två överlappande aminosyrorna på kromatogrammet inte överstiga 2:10. (Om endast cyst(e)in, metionin, treonin och lysin bestäms kommer otillräcklig separation från angränsande toppar att påverka bestämningen). För alla andra aminosyror måste separationen vara bättre än 1:10.

Systemet måste kunna separera lysin från ”lysinartefakter” och ornitin.

6.   Beräkning av resultat

Arean för provets och standardens toppar mäts för varje enskild aminosyra, och mängden (X) i gram aminosyra per kg prov beräknas med formeln

Om intern standard används, multiplicera med

Cystin och cystein bestäms båda som cysteinsyra i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som cystin (C6H12N2O4S2, molvikt 240,30 g/mol) med hjälp av molvikten 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionin bestäms som metioninsulfon i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som metionin med hjälp av molvikten för metionin: 149,21 g/mol.

Tillsatt fritt metionin bestäms efter extraktion som metionin, för beräkningen används samma molvikt.

7.   Utvärderingen av metoden

Metoden testades i en internationell provningsjämförelse 1990 med fyra olika fodertyper (blandat grisfoder, foderblandning för slaktkycklingar, proteinkoncentrat, förblandning). Resultaten, efter eliminering av extremvärden, i form av medelvärden och standardavvikelser redovisas i nedanstående tabeller.

7.1   Repeterbarhet

Repeterbarheten uttryckt som ”standardavvikelse inom laboratoriet” i ovannämnda provningsjämförelse redovisas i nedanstående tabell.

7.2   Reproducerbarhet

Standardavvikelsen mellan laboratorier i ovannämnda provningsjämförelse redovisas i nedanstående tabell.

8.   Användning av referensmaterial

Korrekt tillämpning av metoden ska verifieras genom analys av certifierade referensmaterial om sådana finns tillgängliga. Kalibrering med godkända kalibreringslösningar för aminosyror rekommenderas.

9.   Anmärkningar

Det intervall där sambandet mellan det verkliga värdet och det med apparaten uppmätta värdet är linjärt, måste kontrolleras för alla aminosyror.

Standardlösningen späds med citratbuffert så att man får toppar i mitten av intervallet.

G.   BESTÄMNING AV TRYPTOFAN

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan totalhalten tryptofan och halten fritt tryptofan bestämmas i foder. Ingen åtskillnad görs mellan D- och L-formerna.

2.   Princip

För bestämning av totalhalten tryptofan hydrolyseras provet i alkalisk miljö med mättad bariumhydroxidlösning och upphettas till 110 oC i 20 timmar. Efter hydrolysen tillsätts en intern standard.

För bestämning av halten fritt tryptofan extraheras provet i lätt sur miljö i närvaro av den interna standarden.

Halten av tryptofan och intern standard i hydrolysatet eller extraktet bestäms med HPLC med fluorescensdetektion.

3.   Reagens

Lös 40,0 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter med vatten (3.1).

Späd 492 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

Späd 82 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

Späd 8,2 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

Späd 34 ml ortofosforsyra (3.6) med vatten (3.1) till slutvolymen 1 liter.

Lös 0,2553 g tryptofan (3.2) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid - 18 oC i högst 4 veckor.

Lös 0,2728 g α-metyltryptofan (3.3) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid - 18 oC i högst 4 veckor.

Tag 2,00 ml koncentrerad tryptofanlösning (3.15) och 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (3.16). Späd med vatten (3.1) och metanol (3.8) till ungefär samma volym och metanolkoncentration (10–30 %) som det färdiga hydrolysatet.

Denna lösning ska vara nyberedd.

Den ska skyddas från direkt solljus under beredningen.

4.   Utrustning

5.   Utförande

5.1   Provberedning

Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prov med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 oC eller frystorkas före malningen. Prov med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (3.9) före malning.

5.2   Bestämning av fritt tryptofan (extrakt)

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (5.1) i en E-kolv. Tillsätt 100,0 ml saltsyra (3.13) och 5,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (3.16). Skaka eller blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (4.7). Låt sedimentera och pipettera sedan över 10,0 ml av supernatanten till en bägare. Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (3.14). Justera pH till 3 med natriumhydroxid (3.10). Tillsätt så mycket metanol (3.8) att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (ungefär samma volym som standardkalibreringslösningen [3.17]).

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Skydda standardlösning och extrakt från direkt solljus. Om extrakten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 oC i högst 3 dagar.

5.3   Bestämning av totalhalt tryptofan (hydrolysat)

Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 0,1 –1 g av det beredda provet (5.1) i en polypropylenflaska (4.4). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt 8,4 g bariumhydroxidoktahydrat (3.4) och 10 ml vatten. Blanda på en vortexblandare (4.8) eller med magnetomrörare (4.7). Lämna kvar den teflonbelagda magneten i blandningen. Skölj kärlets väggar med 4 ml vatten. Sätt på skruvkorken och skruva åt den löst. Sätt kärlet i en autoklav (4.6) med kokande vatten och låt ånga i 30–60 minuter. Stäng autoklaven och autoklavera vid 110 (± 2) oC i 20 timmar.

Sänk temperaturen till strax under 100 oC innan autoklaven öppnas. Tillsätt 30 ml rumstempererat vatten till den varma blandningen för att undvika kristallisering av Ba(OH)2·8 H2O. Skaka eller rör försiktigt. Tillsätt 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (3.16). Kyl kärlet i isvattenbad i 15 minuter.

Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (3.14). Låt kärlet vara kvar i kylbadet och neutralisera lösningen med saltsyra (3.11) under omrörning. Justera pH till 3,0 med saltsyra (3.12). Tillsätt så mycket metanol att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (t.ex. 100 ml). Tillsatsen av metanol bör göras utan att någon fällning bildas.

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Skydda standardlösning och hydrolysat mot direkt solljus. Om hydrolysaten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 oC i högst tre dagar.

5.4   HPLC-bestämning

Följande betingelser för isokratisk eluering anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat (se även 9.1 och 9.2).

6.   Beräkning av resultat

Mängden tryptofan (X) i gram per 100 g prov beräknas med formeln

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % av det högre värdet.

8.   Resultat av en provningsjämförelse

I en provningsjämförelse inom EU (fjärde jämförelsen) analyserades tre prov av upp till tolv laboratorier för att hydrolysmetoden skulle kunna certifieras. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell.

I en annan provningsjämförelse inom EU (tredje jämförelsen) analyserades två prov av upp till tretton laboratorier för certifiering av extraktionsmetoden för fritt tryptofan. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell.

I ytterligare en provningsjämförelse inom EU analyserades fyra prov av upp till sju laboratorier för certifiering av metoden för tryptofanhydrolys. Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Varje prov analyserades fem gånger.

9.   Anmärkningar

Isokratisk eluering följt av gradientkolonnrening:

Kromatografisystemet måste ge linjär respons i driftsintervallet. Den linjära responsen ska mätas med en konstant koncentration (den normala) av intern standard och varierande koncentrationer av tryptofan. Det är viktigt att topparna för både tryptofan och intern standard ligger inom det linjära intervallet för HPLC-/fluorescenssystemet. Om topparna för tryptofan och/eller intern standard är för låga eller för höga bör bestämningen göras om med annan provstorlek och/eller slutvolym.

Bariumhydroxid blir mer svårlösligt när det åldras. Detta ger en grumlig lösning för HPLC-bestämning, vilket kan ge alltför låga värden för tryptofan.

H.   BESTÄMNING AV RÅFETT

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan råfetthalten i foder bestämmas. Metoden omfattar inte analys av oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter.

Beroende på fodrets egenskaper och sammansättning samt bestämningens syfte används en av nedanstående två metoder.

1.1   Metod A – direkt extraherbart råfett

Denna metod är tillämplig på foderråvaror av vegetabiliskt ursprung, utom dem som omfattas av metod B.

1.2   Metod B – total råfetthalt

Denna metod är tillämplig på foderråvaror av animaliskt ursprung och på alla foderblandningar. Den ska användas för alla råvaror från vilka fett inte kan extraheras helt utan föregående hydrolys, till exempel gluten, jäst, potatisprotein och produkter som genomgår processer såsom extrudering, bearbetning till flingor samt uppvärmning.

1.3   Tolkning av resultaten

I samtliga fall där ett högre resultat fås genom metod B än metod A, ska resultatet av metod B räknas som det sanna värdet.

2.   Princip

2.1   Metod A

Provet extraheras med petroleumeter. Lösningsmedlet destilleras av och återstoden torkas och vägs.

2.2   Metod B

Provet behandlas under uppvärmning med saltsyra. Blandningen kyls och filtreras. Återstoden sköljs och torkas och bestäms enligt metod A.

3.   Reagens

4.   Utrustning

5.   Utförande

5.1   Metod A (se punkt 8.1)

Väg 5 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg, överför det till en extraktionshylsa (4.2) och täck med en fettfri bomullstuss.

Placera hylsan i en extraktionsapparat (4.1) och extrahera i sex timmar med petroleumeter (3.1). Samla upp petroleumeterextraktet i en torr, vägd kolv med pimpstensskärvor ( 9 ).

Destillera av lösningsmedlet. Torka återstoden i 1,5 timmar i torkugnen (4.3). Kyl i en exsickator och väg. Torka igen i 30 minuter för att säkerställa att fettets vikt är konstant (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg).

5.2   Metod B

Väg upp 2,5 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg (se punkt 8.2) i en 400 ml bägare eller en 300 ml E-kolv. Tillsätt 100 ml saltsyra (3.3) och pimpstensskärvor. Täck över bägaren med ett urglas eller koppla E-kolven till en återloppskylare. Låt blandningen koka sakta i 1 timme över en svag låga eller värmeplatta. Låt inte produkten fastna på behållarens insida.

Kyl och tillsätt så mycket filtreringshjälpmedel (3.4) att inget fett förloras under filtreringen. Filtrera genom ett fuktat, fettfritt, dubbelt filtrerpapper. Skölj återstoden i kallt vatten tills ett neutralt filtrat erhålls. Kontrollera att filtratet inte innehåller något fett. Om så ändå är fallet ska provet extraheras med petroleumeter, enligt metod A, före hydrolys.

Lägg det dubbla filtrerpappret med återstoden på ett urglas och torka i 1,5 timmar i varmluftsugnen (4.3) vid 100 ± 3 oC.

Placera det dubbla filtrerpappret med den torra återstoden i en extraktionshylsa (4.2) och täck med en fettfri bomullstuss. Placera hylsan i en extraktionsapparat (4.1) och följ anvisningarna i punkt 5.1 andra och tredje styckena.

6.   Resultatangivelse

Återstodens vikt uttrycks i procent av provet.

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov av samma person får inte överstiga

8.   Anmärkningar

Väg upp 20 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg och blanda med minst 10 gram vattenfritt natriumsulfat (3.2). Extrahera med petroleumeter (3.1) enligt punkt 5.1. Späd extraktet med petroleumeter (3.1) till 500 ml och blanda. Överför 50 ml av lösningen till en liten, torr, vägd kolv som innehåller pimpstensskärvor. Destillera bort lösningsmedlet, torka och följ anvisningarna i punkt 5.1 sista stycket.

Avlägsna lösningsmedlet från extraktionsåterstoden i hylsan, krossa återstoden till 1 mm partikelstorlek, återför till extraktionshylsan (tillsätt inte natriumsulfat) och följ anvisningarna i punkt 5.1 andra och tredje styckena.

Provets fetthalt i procent beräknas med formeln

(10m1 + m2) × 5

där:

I.   BESTÄMNING AV VÄXTTRÅD

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod är det möjligt att bestämma foders halt av fettfria organiska ämnen som är olösliga i sur och basisk miljö och som vanligen betecknas växttråd.

2.   Princip

Provet, som vid behov avfettas, behandlas i tur och ordning med kokande lösningar av svavelsyra och kaliumhydroxid i bestämda koncentrationer. Återstoden separeras genom filtrering på ett sintrat glasfilter och sköljs, torkas, vägs och föraskas vid en temperatur på 475–500 oC. Viktförlusten efter föraskning motsvarar andelen växttråd i analysprovet.

3.   Reagens

4.   Utrustning

5.   Utförande

Väg med 1 mg noggrannhet upp 1 g av det beredda provet i filterdegeln (4.2), (jfr punkterna 8.1, 8.2 och 8.3) och tillsätt 1 g filtreringshjälpmedel (3.3).

Montera ihop värmeenheten (4.1) och filterdegeln (4.2) och anslut sedan cylindern (4.3) till filterdegeln. Häll 150 ml kokande svavelsyra (3.1) i cylinder/degeluppställningen och tillsätt vid behov några droppar skumdämpningsmedel (3.2).

Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt i exakt 30 minuter.

Öppna kranen till utloppsröret (4.1) och vakuumfiltrera svavelsyran genom filterdegeln. Tvätta återstoden tre gånger med 30 ml kokande vatten per gång och se till att återstoden vakuumfiltreras torr efter varje tvättning.

Stäng utloppskranen och häll 150 ml kokande kaliumhydroxidlösning (3.7) i cylinder/degeluppställningen. Tillsätt några droppar skumdämpningsmedel (3.2). Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt i exakt 30 minuter. Filtrera och tvätta på samma sätt som vid behandlingen med svavelsyra.

Efter den sista tvättningen och torkningen kopplas degeln med innehåll loss och ansluts till extraktionsenheten (4.6). Anslut vakuum, tvätta återstoden i degeln tre gånger med 25 ml aceton (3.4) per gång och se till att återstoden vakuumfiltreras torr efter varje tvättning.

Torka degeln till konstant vikt i ugnen vid 130 oC. Låt den svalna i exsickator efter varje torkning och väg snabbt. Sätt in degeln i en muffelugn och föraska till konstant vikt (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 2 mg) vid 475–500 oC i minst 30 minuter.

Efter varje upphettning ska degeln först svalna i ugnen och sedan i exsickatorn innan den vägs.

Gör ett blankprov utan provet. Viktförlusten till följd av föraskningen får inte överstiga 4 mg.

6.   Beräkning av resultat

Provets växttrådhalt i procent beräknas med formeln

där:

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

8.   Anmärkningar

J.   BESTÄMNING AV SOCKER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod är det möjligt att bestämma halten av reducerande socker och totalhalten socker efter invertering, uttryckt som glukos eller, om så är lämpligt, sackaros med omvandlingsfaktorn 0,95 . Metoden är tillämplig på foderblandningar. För andra typer av foder finns särskilda metoder. Om så krävs ska laktos bestämmas separat och tas med i resultatberäkningen.

2.   Princip

Sockerarterna extraheras i utspädd etanol. Lösningen klaras med Carrez-lösning I och II. Efter det att etanolen eliminerats bestäms kvantiteterna före och efter invertering med Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagens

Häll citronsyralösningen (3.8.2) i natriumkarbonatlösningen (3.8.3) under noggrann omrörning. Tillsätt kopparsulfatlösningen (3.8.1) och späd med vatten till 1 liter. Låt stå över natten och filtrera.

Kontrollera koncentrationen hos det erhållna reagenset (Cu 0,05 mol/l, Na2CO3 1 mol/l), se punkt 5.4 sista stycket. Lösningens pH ska vara ca 9,4 .

4.   Utrustning

Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

5.   Utförande

5.1   Extraktion av provet

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2,5 g av provet i en 250 ml mätkolv. Tillsätt 200 ml etanol (3.1) och blanda på skakapparaten i 1 timme. Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (3.2) och rör om i ca 30 sekunder. Tillsätt 5 ml Carrez-lösning II (3.3) och rör om i 1 minut. Späd med etanol (3.1) till full volym, homogenisera och filtrera. Ta undan 200 ml av filtratet och låt indunsta till ungefär halv volym så att det mesta av etanolen elimineras. Överför återstoden efter avdunstningen kvantitativt, med varmt vatten, till en 200 ml mätkolv, kyl, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera vid behov. Denna lösning används för att bestämma halten av reducerande socker och, efter invertering, totalhalten socker.

5.2   Bestämning av reducerande socker

Pipettera av högst 25 ml av lösningen med ett innehåll av mindre än 60 mg reducerande socker uttryckt som glukos. Späd vid behov med destillerat vatten till 25 ml och bestäm halten reducerande socker med Luff-Schoorl-metoden. Resultatet uttrycks som procent glukos i provet.

5.3   Bestämning av totalhalten socker efter invertering

Pipettera över 50 ml av lösningen till en 100 ml mätkolv. Tillsätt några droppar metylorangelösning (3.4) och därefter – försiktigt och under ständig omrörning – saltsyra (3.5) tills vätskan blir tydligt röd. Tillsätt 15 ml saltsyra (3.6), sänk ned kolven i ett kraftigt kokande vattenbad och låt stå i 30 minuter. Kyl hastigt till ca 20 oC och tillsätt 15 ml natriumhydroxidlösning (3.7). Späd med vatten till 100 ml och homogenisera. Avlägsna högst 25 ml av lösningen med ett innehåll av mindre än 60 mg reducerande socker uttryckt som glukos. Späd vid behov med destillerat vatten till 25 ml och bestäm halten reducerande socker med Luff-Schoorl-metoden. Resultatet uttrycks som procent glukos i provet eller, om så är lämpligt, sackaros, genom att multiplicera med faktorn 0,95 .

5.4   Titrering med Luff-Schoorl-metoden

Pipettera över 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.8) till en 300 ml E-kolv. Tillsätt exakt 25 ml av den klarade sockerlösningen. Tillsätt två korn pimpsten (3.13), hetta upp under omrörning för hand över medelstor öppen låga och låt vätskan koka i cirka två minuter. Ställ omedelbart E-kolven på ett asbestklätt trådnät med ett hål med ca 6 cm diameter under vilket en låga brinner. Lågan ska justeras så att endast E-kolvens botten hettas upp. Anslut en återloppskylare till E-kolven. Låt koka i exakt 10 minuter. Kyl omedelbart i kallt vatten och titrera efter ca 5 minuter på följande sätt:

Tillsätt 10 ml kaliumjodidlösning (3.12) och omedelbart därefter (försiktigt, på grund av risken för kraftig skumbildning) 25 ml svavelsyra (3.11). Titrera med natriumtiosulfatlösning (3.9) tills en matt gul färg uppträder, tillsätt stärkelseindikatorn (3.10) och slutför titreringen.

Utför samma titrering på en noggrant uppmätt blandning av 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.8) och 25 ml vatten efter tillsats av 10 ml kaliumjodidlösning (3.12) och 25 ml svavelsyra (3.11) utan kokning.

6.   Beräkning av resultat

Fastställ med hjälp av tabellen nedan den glukosmängd i mg som motsvarar skillnaden mellan resultaten av de båda titreringarna, uttryckt i mg 0,1 M natriumtiosulfat. Uttryck resultatet i procent av provet.

7.   Särskilda förfaranden

Homogenisera och filtrera. Avlägsna etanolen enligt beskrivningen i 5.1. Om det inte finns någon dextrinerad stärkelse, tillsätts destillerat vatten till full volym.

8.   Anmärkningar

I båda fallen bestäms mängden befintligt socker med Luff-Schoorl-metoden och beräknas i mg glukos. Det ena av värdena dras från det andra och skillnaden uttrycks i procent av provet.

Exempel

De två valda volymerna motsvarar vid varje bestämning ett prov på 250 mg.

I det första fallet förbrukas 17 ml 0,1 M natriumtiosulfatlösning, vilket motsvarar 44,2 mg glukos, och i det andra fallet 11 ml, vilket motsvarar 27,6 mg glukos.

Skillnaden är 16,6 mg glukos.

Halten reducerande socker (med undantag av laktos) beräknad som glukos är alltså:

K.   BESTÄMNING AV LAKTOS

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan laktoshalten bestämmas i foder som innehåller mer än 0,5 % laktos.

2.   Princip

Sockerarterna löses upp i vatten. Lösningen fermenteras med jästen Saccharomyces cerevisiae som lämnar laktosen opåverkad. Efter klarning och filtrering bestäms laktoshalten i filtratet med Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagens

Häll citronsyralösningen (3.4.2) i natriumkarbonatlösningen (3.4.3) under noggrann omrörning. Tillsätt kopparsulfatlösningen (3.4.1) och späd med vatten till 1 liter. Låt stå över natten och filtrera. Kontrollera koncentrationen hos det erhållna reagenset (Cu 0,05 mol/l, Na2CO3 1 mol/l). Lösningens pH ska vara ca 9,4 .

4.   Utrustning

Vattenbad med termostaten inställd på 38–40 oC.

5.   Utförande

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 1 g av provet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25–30 ml vatten. Låt kolven stå i ett kokande vattenbad i 30 minuter och kyl sedan till ca 35 oC. Tillsätt 5 ml jästsuspension (3.1) och homogenisera. Låt kolven stå i vattenbad i två timmar vid en temperatur av 38–40 oC. Kyl därefter till ca 20 oC.

Tillsätt 2,5 ml Carrez-lösning I (3.2), rör om i 30 sekunder och tillsätt sedan 2,5 ml Carrez-lösning II (3.3) och rör om i ytterligare 30 sekunder. Späd med vatten till 100 ml, blanda och filtrera. Pipettera upp högst 25 ml av filtratet som bör innehålla 40–80 mg laktos och överför detta till en 300 ml E-kolv. Späd vid behov med vatten till 25 ml.

Utför ett blankprov på samma sätt med 5 ml jästsuspension (3.1). Fastställ laktoshalten enligt Luff-Schoorl på följande sätt: tillsätt exakt 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) och två korn pimpsten (3.5). Rör om för hand medan innehållet hettas upp över medelstor öppen låga och låt vätskan koka i ca 2 minuter. Ställ omedelbart E-kolven på ett asbestklätt trådnät med ett hål med ca 6 cm diameter under vilket en låga brinner. Lågan ska justeras så att endast E-kolvens botten hettas upp. Anslut en återloppskylare till E-kolven. Låt koka i exakt 10 minuter. Kyl omedelbart i kallt vatten och titrera efter ca 5 minuter på följande sätt:

Tillsätt 10 ml kaliumjodidlösning (3.6) och omedelbart därefter (försiktigt, på grund av risken för kraftig skumbildning) 25 ml svavelsyra (3.7). Titrera med natriumtiosulfatlösning (3.8) tills en matt gul färg uppträder, tillsätt stärkelseindikatorn (3.9) och slutför titreringen.

Utför samma titrering på en noggrant uppmätt blandning av 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) och 25 ml vatten efter tillsats av 10 ml kaliumjodidlösning (3.6) och 25 ml svavelsyra (3.7) utan kokning.

6.   Beräkning av resultat

Fastställ med hjälp av tabellen nedan den laktosmängd i mg som motsvarar skillnaden mellan resultaten av de båda titreringarna, uttryckt i ml 0,1 M natriumtiosulfat.

Uttryck resultatet som halten vattenfri laktos i procent av provet.

7.   Anmärkning

För produkter som innehåller mer än 40 % jäsbart socker används mer än 5 ml jästsuspension (3.1).

L.   BESTÄMNING AV STÄRKELSE

POLARIMETRISK METOD

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod är det möjligt att bestämma halten av stärkelse och nedbrytningsprodukter av stärkelse med hög molekylvikt i foder, i syfte att kontrollera att det deklarerade energivärdet är korrekt (bestämmelser i bilaga VII) och att rådets direktiv 96/25/EG ( 10 ) efterlevs.

2.   Princip

Metoden omfattar två bestämningar. I den första behandlas provet med utspädd saltsyra. Efter klarning och filtrering mäts lösningens optiska rotation polarimetriskt.

I den andra extraheras provet med 40 % etanol. Efter att filtratet surgjorts med saltsyra, klarats och filtrerats mäts den optiska rotationen på samma sätt som vid den första bestämningen.

Genom att multiplicera skillnaden mellan de båda mätningarna med en känd faktor erhålls provets stärkelsehalt.

3.   Reagens

Koncentrationen måste kontrolleras genom titrering med 0,1 M natriumhydroxidlösning i närvaro av 0,1 % (w/v) metylrött i 94 % (v/v) etanol. För att neutralisera 10 ml krävs 30,94 ml 0,1 M NaOH.

4.   Utrustning

5.   Utförande

5.1   Provberedning

Krossa provet tills det är tillräckligt finfördelat för att helt kunna passera genom en sikt med 0,5 mm runda maskor.

5.2   Bestämning av den totala optiska rotationen (P eller S) (se anmärkning 7.1)

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2,5 g av det krossade provet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25 ml saltsyra (3.2), skaka om så att provet fördelas jämnt och tillsätt ytterligare 25 ml saltsyra (3.2). Sänk ned kolven i ett kokande vattenbad under kraftig och jämn omskakning under de tre första minuterna för att förhindra agglomeratbildning. Vattenbadet måste innehålla så mycket vatten att det fortsätter att koka då kolven sänks ned i det. Kolven får inte tas upp ur vattenbadet vid omskakningen. Ta upp kolven ur vattenbadet efter exakt 15 minuter, tillsätt 30 ml kallt vatten och kyl omedelbart till 20 oC.

Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (3.3) och skaka i ca 30 sekunder. Tillsätt sedan 5 ml Carrez-lösning II (3.4) och skaka i ytterligare ca 30 sekunder. Späd med vatten till full volym, blanda och filtrera. Om filtratet inte är fullständigt klart (vilket är sällsynt) upprepas bestämningen med en större kvantitet Carrez-lösning I och II, till exempel 10 ml.

Lösningens optiska rotation mäts i ett 200 mm rör med polarimeter eller sackarimeter.

5.3   Bestämning av den optiska rotationen (P' eller S') hos ämnen som är lösliga i 40 % etanol

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 5 g av provet i en 100 ml mätkolv och tillsätt ca 80 ml etanol (3.5) (se anmärkning 7.2). Låt kolven stå i en timme i rumstemperatur och skaka under denna tid om kraftigt vid sex tillfällen så att provet blandas väl med etanolen. Späd med etanol (3.5) till full volym, blanda och filtrera.

Pipettera över 50 ml av filtratet (motsvarar 2,5 g av provet) till en 250 ml E-kolv, tillsätt 2,1 ml saltsyra (3.1) och skaka kraftigt. Anslut en återloppskylare till E-kolven och sänk därefter ned E-kolven i ett kokande vattenbad. Ta efter exakt 15 minuter upp E-kolven ur vattenbadet, överför innehållet till en 100 ml mätkolv (skölj med lite kallt vatten) och kyl till 20 oC.

Klara provet med Carrez-lösning I (3.3) och II (3.4), späd med vatten till full volym, blanda, filtrera och mät den optiska rotationen på det sätt som anges i 5.2 andra och tredje styckena.

6.   Beräkning av resultat

Stärkelsehalten ( %) beräknas på följande sätt:

6.1   Mätning med polarimeter

6.2   Mätning med sackarimeter

6.3   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,4 i absoluta tal om stärkelsehalten är under 40 %, och 1 % i relativt värde om stärkelsehalten är 40 % eller högre.

7.   Anmärkningar

M.   BESTÄMNING AV RÅASKA

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten råaska i foder bestämmas.

2.   Princip

Provet föraskas vid 550 oC. Återstoden vägs.

3.   Reagens

Ammoniumnitrat, lösning 20 % (w/v).

4.   Utrustning

5.   Utförande

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g av provet (2,5 g för produkter som har benägenhet att svälla) i en degel som först har upphettats till 550 oC, svalnat och tarerats. Ställ degeln på värmeplattan och upphetta sakta tills provet förkolnar. Föraska enligt 5.1 eller 5.2.

6.   Beräkning av resultat

Beräkna återstodens vikt med taran fråndragen.

Resultatet uttrycks i procent av provet.

7.   Anmärkningar

N.   BESTÄMNING AV ASKA SOM ÄR OLÖSLIG I SALTSYRA

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten i foder av mineralämnen som är olösliga i saltsyra bestämmas. Två metoder kan användas beroende på typen av prov.

2.   Princip

3.   Reagens

4.   Utrustning

5.   Utförande

5.1   Metod A:

Föraska provet med samma metod som för bestämning av råaska. Aska som erhållits vid den analysen kan också användas.

Överför askan till en 250–400 ml bägare med 75 ml saltsyra (3.1). Koka upp långsamt och låt koka försiktigt i 15 minuter. Filtrera den varma lösningen genom ett askfritt filtrerpapper och skölj återstoden med varmt vatten tills ingen syrareaktion längre är märkbar. Torka filtret med återstoden och föraska i en tarerad degel vid lägst 550 oC och högst 700 oC. Kyl i exsickator och väg.

5.2   Metod B:

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 5 g av provet i en 250–400 ml bägare. Tillsätt 25 ml vatten och därefter 25 ml saltsyra (3.1), blanda och vänta tills gasutvecklingen upphör. Tillsätt ytterligare 50 ml saltsyra (3.1). Vänta tills gasutvecklingen upphör och ställ sedan bägaren i ett kokande vattenbad i 30 minuter eller längre så att eventuell stärkelse hydrolyseras fullständigt. Filtrera den fortfarande varma lösningen genom ett askfritt filter och tvätta filtret i 50 ml varmt vatten (jfr punkt 7). Lägg filtret med återstod i en degel, torka och föraska vid en temperatur av lägst 550 oC och högst 700 oC. Överför askan till en 250–400 ml bägare med 75 ml saltsyra (3.1). Fortsätt enligt beskrivningen i punkt 5.1 andra stycket.

6.   Beräkning av resultat

Beräkna återstodens vikt med taran fråndragen. Resultatet uttrycks i procent av provet.

7.   Anmärkning

Om filtreringen visar sig svår att genomföra ska analysen påbörjas på nytt, varvid de 50 ml saltsyra (3.1) ersätts med 50 ml 20 % triklorättiksyra (3.2) och filtret sköljs med en varm lösning av 1 % triklorättiksyra (3.3).

O.   BESTÄMNING AV KARBONATER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan mängden karbonater, konventionellt uttryckt som kalciumkarbonat, bestämmas i de flesta fodertyper.

I vissa fall (t.ex. för järnkarbonat) måste dock en särskild metod användas.

2.   Princip

Karbonaterna löses upp i saltsyra. Den koldioxid som frigörs samlas upp i ett mätglas, och dess volym jämförs med den som under samma förhållanden frigörs av en känd mängd kalciumkarbonat.

3.   Reagens

4.   Utrustning

Scheibler-Dietrichapparat (se figur) eller motsvarande.

5.   Utförande

Väg upp en provmängd som beroende på dess karbonathalt ska vara

Placera provet i apparatens specialkolv (4), som är utrustad med ett litet rör av okrossbart material som innehåller 10 ml saltsyra (3.1) och anslut kolven till apparaten. Vrid trevägskranen (5) så att röret (1) öppnas. Ställ in vätskenivån på nollmarkeringen med hjälp av det flyttbara röret (2) som är fyllt med färgad svavelsyra (3.3) och anslutet till mätglaset (1). Vrid kranen (5) så att rören (1) och (3) förbinds och kontrollera att nivån är noll.

Luta kolven (4) så att saltsyran (3.1) sprids långsamt över provet. Jämna ut trycket genom att sänka röret (2). Skaka kolven (4) tills ingen koldioxid längre frigörs.

Återställ trycket genom att justera tillbaka vätskenivån till den ursprungliga i rören (1) och (2). Avläs efter några minuter när gasvolymen har blivit konstant.

Utför ett kontrolltest under samma förhållanden med 0,5 g kalciumkarbonat (3.2).

6.   Beräkning av resultat

Karbonathalten, uttryckt som kalciumkarbonat, beräknas med formeln

där:

7.   Anmärkningar

P.   BESTÄMNING AV TOTALFOSFOR

FOTOMETRISK METOD

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan totalfosforhalten bestämmas i foder. Metoden är särskilt lämplig för analys av produkter med låg fosforhalt. I vissa fall (fosforrika produkter) kan en gravimetrisk metod användas.

2.   Princip

Provet mineraliseras antingen genom torrföraskning (organiska foder) eller genom uppslutning med syra (mineralfoderblandningar och flytande foder) och läggs i en syralösning. Lösningen behandlas med molybdovanadatreagens. Absorbansen hos den gula lösning som då bildas mäts i spektrofotometer vid 430 nm.

3.   Reagens

4.   Utrustning

5.   Utförande

5.1   Beredning av lösningen

Lösningen bereds enligt 5.1.1 eller 5.1.2 beroende på typ av prov.

5.1.1    Vanlig metod

Väg upp 1 g eller mer av provet med en noggrannhet av 1 mg. Placera provet i en Kjeldahlkolv, tillsätt 20 ml svavelsyra (3.5), skaka om så att materialet helt impregneras med syra och så att den inte fastnar på kolvens väggar, upphetta och låt koka i 10 minuter. Låt svalna något, tillsätt 2 ml salpetersyra (3.4), upphetta försiktigt, låt svalna något, tillsätt lite mer salpetersyra (3.4) och upphetta åter till kokpunkten. Upprepa detta förfarande tills en färglös lösning erhålls. Kyl, tillsätt lite vatten, häll över vätskan i en 500 ml mätkolv och skölj ur Kjeldahlkolven med varmt vatten. Låt svalna, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera.

5.1.2    Prov som innehåller organiska ämnen och som är fria från kalcium- och magnesiumdivätefosfat

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 2,5 g av provet i en degel. Blanda provet fullständigt med 1 g kalciumkarbonat (3.1). Föraska i ugnen vid 550 oC tills en vit eller grå aska erhålls (visst inslag av träkol har ingen betydelse). Överför askan till en 250 ml bägare. Tillsätt 20 ml vatten och saltsyra (3.2) tills skumningen upphör. Tillsätt ytterligare 10 ml saltsyra (3.2). Ställ bägaren i sandbad och indunsta fullständigt så att kiseldioxiden blir olöslig. Lös åter upp återstoden i 10 ml salpetersyra (3.3) och koka på sandbadet eller på en värmeplatta i 5 minuter utan fullständig indunstning. Häll över vätskan i en 500 ml mätkolv och skölj ur bägaren flera gånger med varmt vatten. Låt svalna, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera.

5.2   Färgutveckling och mätning av absorbans

Späd ut en alikvot av det filtrat som erhållits enligt 5.1.1 eller 5.1.2 så att en fosforhalt av högst 40 μg/ml erhålls. Överför 10 ml av denna lösning till ett provrör (4.6) och tillsätt 10 ml molybdovanadatreagens (3.6). Homogenisera och låt stå i minst 10 minuter vid 20 oC. Mät absorbansen i spektrofotometer vid 430 nm mot en lösning av 10 ml molybdovanadatreagens (3.6) i 10 ml vatten.

5.3   Kalibreringskurva

Av standardlösningen (3.7) bereds lösningar som innehåller 5, 10, 20, 30 och 40 μg fosfor per ml. Ta 10 ml av var och en av dessa lösningar och tillsätt 10 ml molybdovanadatreagens (3.6). Homogenisera och låt stå i minst 10 minuter vid 20 oC. Mät absorbansen på det sätt som anges i 5.2. Konstruera kalibreringskurvan genom att avsätta absorbansvärdena mot motsvarande kvantiteter fosfor. Vid koncentrationer mellan 0 och 40 μg/ml är kurvan linjär.

6.   Beräkning av resultat

Bestäm mängden fosfor i provet med hjälp av kalibreringskurvan.

Resultatet uttrycks i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

Q.   BESTÄMNING AV KLOR I KLORIDER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan mängden klor i vattenlösliga klorider, konventionellt uttryckt som natriumklorid, bestämmas. Metoden är tillämplig på alla foder.

2.   Princip

Kloriderna löses upp i vatten. Om produkten innehåller organiskt material ska den klaras. Lösningen surgörs något med salpetersyra och kloriderna fälls ut som silverklorid genom tillsats av silvernitratlösning. Överskottet av silvernitrat titreras med ammoniumtiocyanatlösning enligt Volhardmetoden.

3.   Reagens

4.   Utrustning

Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

5.   Utförande

5.1   Beredning av lösningen

Beroende på typ av prov bereds en lösning enligt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3.

Utför samtidigt ett blankprov utan det prov som ska analyseras.

5.1.1    Prov som är fria från organiskt material

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ett prov på högst 10 g som innehåller högst 3 g klor i kloridform. Överför provet och 400 ml vatten till en 500 ml mätkolv vid ca 20 oC. Blanda på skakapparaten i 30 minuter, späd till full volym, homogenisera och filtrera.

5.1.2    Prov som innehåller organiskt material med undantag av produkterna i 5.1.3

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g av provet tillsammans med 1 g aktivt kol i en 500 ml mätkolv. Tillsätt 400 ml vatten (ca 20 oC) och 5 ml Carrez-lösning I (3.7), rör om i 30 sekunder och tillsätt därefter 5 ml Carrez-lösning II (3.8). Blanda på skakapparaten i 30 minuter, späd till full volym, homogenisera och filtrera.

5.1.3    Kokt foder, linfrökakor och linfrömjöl, produkter med hög halt linfrömjöl och andra produkter med hög halt mucilago eller kolloider (till exempel dextrinerad stärkelse)

Bered lösningen enligt beskrivningen i 5.1.2 men filtrera inte. Dekantera (centrifugera vid behov) och överför 100 ml av supernatanten till en 200 ml mätkolv. Blanda med aceton (3.6) och späd med detta lösningsmedel till full volym, homogenisera och filtrera.

5.2   Titrering

Pipettera över 25–100 ml (beroende på den förmodade klorhalten) av det filtrat som erhållits enligt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3 till en E-kolv. Analysprovet får inte innehålla mer än 150 mg klor (Cl). Späd vid behov med vatten till minst 50 ml, tillsätt 5 ml salpetersyra (3.4), 20 ml mättad ammoniumjärnsulfatlösning (3.3) och två droppar ammoniumtiocyanatlösning (3.1) som tillförs med hjälp av en byrett som är fylld till nollmarkeringen. Tillför silvernitratlösningen (3.2) med en byrett så att ett överskott på 5 ml erhålls. Tillsätt 5 ml dietyleter (3.5) och skaka kraftigt så att fällningen koagulerar. Titrera överskottet av silvernitrat med ammoniumtiocyanatlösningen (3.1) tills den rödbruna färgen har bestått i 1 minut.

6.   Beräkning av resultat

Mängden klor (X) uttryckt som procent natriumklorid beräknas med formeln

där:

Om blankprovet visar att silvernitratlösning, 0,1 mol/l, har förbrukats ska detta värde dras från volymen (V1 – V2).

7.   Anmärkningar

BILAGA IV

ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV HALTEN GODKÄNDA FODERTILLSATSER

A.   BESTÄMNING AV VITAMIN A

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten av vitamin A (retinol) i foder och förblandningar bestämmas. Med vitamin A avses all-trans-retinylalkohol och dess cis-isomerer som bestäms med denna metod. Halten av vitamin A uttrycks som internationella enheter (IE) per kg, där 1 IE motsvarar aktiviteten hos 0,300 μg all-trans-vitamin A-alkohol eller 0,344 μg all-trans-vitamin A-acetat eller 0,550 μg all-trans-vitamin A-palmitat.

Kvantifieringsgränsen för vitamin A är 2 000 IE/kg.

2.   Princip

Provet hydrolyseras med kaliumhydroxid som lösts i etanol, och vitamin A extraheras sedan över till petroleumeter. Lösningsmedlet får därefter avdunsta, och återstoden av provet löses i metanol och späds vid behov till lämplig koncentration. Halten av vitamin A bestäms genom omvänd fas-kromatografi (RP-HPLC) med UV- eller fluorescensdetektor. De kromatografiska parametrarna väljs så att all-trans-vitamin A-alkohol inte separeras från sina cis-isomerer.

3.   Reagens

4.   Utrustning

5.   Utförande

5.1   Provberedning

Mal provet så att det kan passera genom en 1 mm sikt, men undvik friktionsvärme. För att undvika förlust av vitamin A måste malningen göras omedelbart innan provet vägs och förtvålas.

5.2   Förtvålning

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2–25 g av provet, beroende på halten av vitamin A, i en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1). Tillsätt – i tur och ordning, och samtidigt som flaskan eller kolven roteras – 130 ml etanol (3.1), ca 100 mg BHT (3.13), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.5) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.6). Flaskan eller kolven kopplas till en kylare (4.3) och ställs därefter i ett vattenbad med magnetomrörare (4.7). Värm till kokpunkten och låt återloppskoka i 5 minuter. Tillsätt 25 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) genom kylaren (4.3) och låt återloppskoka i ytterligare 25 minuter under omrörning och i ett långsamt flöde av kvävgas. Skölj sedan kylaren med ca 20 ml vatten och kyl innehållet i flaskan eller kolven till rumstemperatur.

5.3   Extraktion

Överför genom dekantering den förtvålade lösningen kvantitativt till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) eller till en extraktionsapparat (4.8) genom att skölja med sammanlagt 250 ml vatten. Skölj ur förtvålningskärlet först med 25 ml etanol (3.1) och sedan med 100 ml petroleumeter (3.2) och överför sköljvätskan till separertratten eller extraktionsapparaten. Förhållandet mellan vatten och etanol i de sammanslagna lösningarna bör vara omkring 2:1. Skaka kraftigt i 2 minuter och låt sedan stå i 2 minuter.

5.3.1    Extraktion med separertratt (4.2.3)

När skikten har separerat (jfr punkt 7.3) överförs skiktet med petroleumeter till en annan separertratt (4.2.3). Upprepa extraktionen två gånger med 100 ml petroleumeter (3.2) och två gånger med 50 ml petroleumeter (3.2).

Tvätta de sammanslagna extrakten i separertratten två gånger genom att tillsätta portioner på 100 ml vatten och sedan försiktigt rotera tratten (för att undvika att emulsioner bildas). Skaka sedan tratten upprepade gånger med portioner på 100 ml vatten, tills vattnet inte längre färgas vid tillsats av fenolftaleinlösning (3.7) (fyra tvättningar brukar räcka). Avlägsna vatten i suspension genom att filtrera det tvättade extraktet genom ett torrt veckat filtrerpapper för fasseparation (4.4) till en 500 ml mätkolv (4.2.2). Skölj ur separertratten och filtret med 50 ml petroleumeter (3.2), späd till märket med petroleumeter (3.2) och blanda omsorgsfullt.

5.3.2    Extraktion med extraktionsapparat (4.8)

När skikten har separerat (jfr punkt 7.3) ersätts glascylinderns (4.8.1) propp med adaptern av slipat glas (4.8.2). Den U-formade nederdelen av det justerbara röret ska mynna precis ovanför gränsytan mellan skikten. Överför det övre skiktet av petroleumeter till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) genom att föra in kvävgas via sidoröret. Tillsätt 100 ml petroleumeter (3.2) till glascylindern, sätt i proppen och skaka kraftigt. Låt skikten separera och överför det övre skiktet till separertratten som ovan. Upprepa extraktionen med ytterligare 100 ml petroleumeter (3.2) och sedan två gånger med 50 ml-portioner av petroleumeter (3.2). Överför petroleumeterskikten till separertratten.

Tvätta de sammanslagna extrakten av petroleumeter enligt 5.3.1 och gå vidare enligt instruktionen i den punkten.

5.4   Beredning av provlösning för HPLC

Pipettera över en alikvot av petroleumeterlösningen (från 5.3.1 eller 5.3.2) till en 250 ml rundkolv (4.2.4). Låt lösningsmedlet avdunsta nästan fullständigt i en rotationsindunstare (4.1) med reducerat tryck och en temperatur på vattenbadet som inte överstiger 40 oC. Återställ atmosfärstryck genom att släppa in kvävgas (3.10) och ta sedan bort kolven från rotationsindunstaren. Avlägsna återstående lösningsmedel med en kvävgasström (3.10) och lös omedelbart upp återstoden av provet i en känd volym (10–100 ml) metanol (3.3). (Halten av vitamin A bör ligga i intervallet 5–30 IE/ml.)

5.5   Bestämning med HPLC

Vitamin A separeras i en kolonn för omvänd fas-kromatografi, C18, (4.5.1) och halten bestäms med en UV-detektor (325 nm) eller fluorescensdetektor (excitation: 325 nm, emission: 475 nm) (4.5.2).

Injicera en alikvot (t.ex. 20 μl) av den metanollösning som erhölls i 5.4 och eluera med den mobila fasen (3.9). Beräkna den genomsnittliga topphöjden (arean) för flera injektioner av samma provlösning och de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för flera injektioner av kalibreringslösningarna (5.6.2).

HPLC-betingelser

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

5.6   Kalibrering

5.6.1    Beredning av arbetslösningar

Pipettera över 20 ml stamlösning av vitamin A-acetat (3.11.1) eller 20 ml stamlösning av vitamin A-palmitat (3.12.1) till en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1) och hydrolysera enligt 5.2 men utan tillsats av BHT. Extrahera sedan med petroleumeter (3.2) enligt 5.3 och späd till 500 ml med petroleumeter (3.2). Låt 100 ml av extraktet indunsta i en rotationsindunstare (jfr punkt 5.4) tills provet är nästan torrt. Avlägsna resterande lösningsmedel i en kvävgasström (3.10) och lös provet på nytt i 10,0 ml metanol (3.3). Den nominella halten av vitamin A i lösningen är 560 IE/ml. Den exakta halten ska bestämmas enligt 5.6.3.3. Arbetslösningen ska vara nyberedd.

Pipettera över 2,0 ml av arbetslösningen till en 20 ml mätkolv, späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av vitamin A i denna utspädda arbetslösning är 56 IE/ml.

5.6.2    Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva

För över 1,0 , 2,0 , 5,0 och 10,0 ml av den utspädda arbetslösningen till ett antal 20 ml mätkolvar, späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av vitamin A i dessa lösningar är 2,8 – 5,6 – 14,0 respektive 28,0 IE/ml.

Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna). Använd de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva med beaktande av resultatet av UV-kontrollen (5.6.3.3).

5.6.3    UV-standardisering av standardlösningar

5.6.3.1    Stamlösning av vitamin A-acetat

Pipettera över 2,0 ml stamlösning av vitamin A-acetat (3.11.1) till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 56 IE/ml. Pipettera över 3,0 ml av den utspädda vitamin A-acetatlösningen till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IE/ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i en spektrofotometer (4.6) mellan 300 och 400 nm. Extinktionsmaximum ska ligga mellan 325 och 327 nm.

Beräkning av halten av vitamin A:

Halten vitamin A (IE/ml) = E326 × 19,0

(

för vitamin A-acetat = 1 530 vid 326 nm i 2-propanol)

5.6.3.2    Stamlösning av vitamin A-palmitat

Pipettera över 2,0 ml stamlösning av vitamin A-palmitat (3.12.1) till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 56 IE/ml. Pipettera över 3,0 ml av den utspädda vitamin A-palmitatlösningen till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IE/ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i en spektrofotometer (4.6) mellan 300 och 400 nm. Extinktionsmaximum ska ligga mellan 325 och 327 nm.

Beräkning av halten av vitamin A:

Halten vitamin A (IE/ml) = E326 × 19,0

(

för vitamin A-palmitat = 957 vid 326 nm i 2-propanol)

5.6.3.3    Arbetslösning av vitamin A

Pipettera över 3,0 ml av den outspädda arbetslösning av vitamin A som beretts enligt 5.6.1 till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Pipettera över 5,0 ml av denna lösning till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IE/ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i en spektrofotometer (4.6) mellan 300 och 400 nm. Extinktionsmaximum ska ligga mellan 325 och 327 nm.

Beräkning av halten av vitamin A:

Halten vitamin A (IE/ml) = E325 × 18,3

(

för vitamin A-alkohol = 1821 vid 325 nm i 2-propanol)

6.   Beräkning av resultat

Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens vitamin A-toppar för att bestämma halten i IE/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.6.2).

Halten av vitamin A (IE/kg) i provet beräknas med formeln

[UI/kg]

där:

7.   Anmärkningar

Gör ett utbytesförsök på ett separat prov för att kontrollera att bestämningsmetoden ger tillförlitliga resultat för just denna matris (mjölkersättning). Om utbytet är lägre än 80 % måste resultatet av bestämningen korrigeras för detta.

8.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 15 % av det högre värdet.

9.   Resultat av en provningsjämförelse ( 11 )

B.   BESTÄMNING AV VITAMIN E

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten av vitamin E i foder och förblandningar bestämmas. Halten av vitamin E uttrycks som mg DL-alfa-tokoferolacetat/kg. 1 mg DL-alfa-tokoferolacetat motsvarar 0,91 mg DL-alfa-tokoferol (vitamin E).

Kvantifieringsgränsen för vitamin E är 2 mg/kg. Denna gräns kan bara uppnås med fluorescensdetektor. Med UV-detektor ligger kvantifieringsgränsen på 10 mg/kg.

2.   Princip

Provet hydrolyseras med kaliumhydroxid som lösts i etanol, och vitamin E extraheras över till petroleumeter. Lösningsmedlet får därefter avdunsta, och återstoden av provet löses i metanol och späds vid behov till lämplig koncentration. Halten av vitamin E bestäms genom omvänd fas-kromatografi (RP-HPLC) med fluorescens- eller UV-detektor.

3.   Reagens

4.   Utrustning

5.   Utförande

5.1   Provberedning

Mal provet så att det kan passera genom en 1 mm sikt, men undvik friktionsvärme. För att undvika förlust av vitamin E måste malningen göras omedelbart innan provet vägs och förtvålas.

5.2   Förtvålning

Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp 2–25 g av provet, beroende på halten av vitamin E, i en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1). Tillsätt – i tur och ordning, och samtidigt som flaskan eller kolven roteras – 130 ml etanol (3.1), ca 100 mg BHT (3.12), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.5) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.6). Flaskan eller kolven kopplas till en kylare (4.3) och ställs därefter i ett vattenbad med magnetomrörare (4.7). Värm till kokpunkten och låt återloppskoka i 5 minuter. Tillsätt därefter 25 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) genom kylaren (4.3) och låt återloppskoka i ytterligare 25 minuter under omrörning och ett långsamt flöde av kvävgas. Skölj sedan kylaren med ca 20 ml vatten och kyl innehållet i flaskan eller kolven till rumstemperatur.

5.3   Extraktion

Överför genom dekantering den förtvålade lösningen kvantitativt till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) eller till en extraktionsapparat (4.8) genom att skölja med sammanlagt 250 ml vatten. Skölj ur förtvålningskärlet först med 25 ml etanol (3.1) och sedan med 100 ml petroleumeter (3.2) och överför sköljvätskan till separertratten eller extraktionsapparaten. Förhållandet mellan vatten och etanol i de sammanslagna lösningarna bör vara omkring 2:1. Skaka kraftigt i 2 minuter och låt sedan stå i 2 minuter.

5.3.1    Extraktion med separertratt (4.2.3)

När skikten har separerat (se punkt 7.3) överförs skiktet med petroleumeter till en annan separertratt (4.2.3). Upprepa extraktionen två gånger med 100 ml petroleumeter (3.2) och två gånger med 50 ml petroleumeter (3.2).

Tvätta de sammanslagna extrakten i separertratten två gånger genom att tillsätta portioner på 100 ml vatten och sedan försiktigt rotera tratten (för att undvika att emulsioner bildas). Skaka sedan tratten upprepade gånger med portioner på 100 ml vatten, tills vattnet inte längre färgas vid tillsats av fenolftaleinlösning (3.7) (fyra tvättningar brukar räcka). Avlägsna vatten i suspension genom att filtrera det tvättade extraktet genom ett torrt veckat filtrerpapper för fasseparation (4.4) till en 500 ml mätkolv (4.2.2). Skölj ur separertratten och filtret med 50 ml petroleumeter (3.2), späd till märket med petroleumeter (3.2) och blanda omsorgsfullt.

5.3.2    Extraktion med extraktionsapparat (4.8)

När skikten har separerat (jfr punkt 7.3) ersätts glascylinderns (4.8.1) propp med adaptern av slipat glas (4.8.2). Den U-formade nederdelen av det justerbara röret ska mynna precis ovanför gränsytan mellan skikten. Överför det övre skiktet av petroleumeter till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) genom att föra in kvävgas via sidoröret. Tillsätt 100 ml petroleumeter (3.2) till glascylindern, sätt i proppen och skaka kraftigt. Låt skikten separera och överför det övre skiktet till separertratten som ovan. Upprepa extraktionen med ytterligare 100 ml petroleumeter (3.2) och sedan två gånger med 50 ml-portioner av petroleumeter (3.2). Överför petroleumeterskikten till separertratten.

Tvätta de sammanslagna extrakten av petroleumeter enligt 5.3.1 och gå vidare enligt instruktionen i den punkten.

5.4   Beredning av provlösning för HPLC

Pipettera över en alikvot av petroleumeterlösningen (från 5.3.1 eller 5.3.2) till en 250 ml rundkolv (4.2.4). Låt lösningsmedlet avdunsta nästan fullständigt i en rotationsindunstare (4.1) med reducerat tryck och en temperatur på vattenbadet som inte överstiger 40 oC. Återställ atmosfärstryck genom att släppa in kvävgas (3.9) och ta sedan bort kolven från rotationsindunstaren. Avlägsna återstående lösningsmedel med en kvävgasström (3.9) och lös omedelbart upp återstoden av provet i en känd volym (10–100 ml) metanol (3.3). (Halten av DL-alfa-tokoferol bör ligga i intervallet 5–30 μg/ml.)

5.5   Bestämning med HPLC

Vitamin E separeras i en kolonn för omvänd fas-kromatografi, C18, (4.5.1) och halten bestäms med fluorescensdetektor (excitation: 295 nm, emission: 330 nm) eller UV-detektor (292 nm) (4.5.2).

Injicera en alikvot (t.ex. 20 μl) av den metanollösning som erhölls i 5.4 och eluera med den mobila fasen (3.8). Beräkna de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för flera injektioner av samma provlösning och de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för flera injektioner av kalibreringslösningarna (5.6.2).

HPLC-betingelser

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

5.6   Kalibrering (DL-alfa-tokoferolacetat eller DL-alfa-tokoferol)

5.6.1    Standardlösning av DL-alfa-tokoferolacetat

5.6.1.1    Beredning av arbetslösning

Pipettera över 25 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferolacetat (3.10.1) till en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1) och hydrolysera enligt 5.2. Extrahera sedan med petroleumeter (3.2) enligt 5.3 och späd till 500 ml med petroleumeter. Låt 25 ml av extraktet indunsta i en rotationsindunstare (jfr punkt 5.4) tills provet är nästan torrt. Avlägsna resterande lösningsmedel i en kvävgasström (3.9) och lös provet på nytt i 25,0 ml metanol (3.3). Den nominella halten av DL-alfa-tokoferol i lösningen är 45,5 μg/ml, vilket motsvarar 50 μg DL-alfa-tokoferolacetat/ml. Arbetslösningen ska vara nyberedd.

5.6.1.2    Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva

Överför 1,0 –2,0 –4,0 och 10,0 ml av arbetslösningen till ett antal 20 ml mätkolvar. Späd till märket med metanol (3.3) och blanda. De nominella halterna av DL-alfa-tokoferolacetat i dessa lösningar är 2,5 –5,0 –10,0 och 25,0 μg/ml, vilket motsvarar 2,28 –4,55 –9,10 respektive 22,8 μg DL-alfa-tokoferol/ml.

Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna). Använd de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva.

5.6.1.3    UV-standardisering av stamlösningen av DL-alfa-tokoferolacetat (3.10.1)

Späd 5,0 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferolacetat (3.10.1) till 25,0 ml med etanol och mät UV-spektrumet för denna lösning mot etanol (3.1) i en spektrofotometer (4.6) mellan 250 och 320 nm.

Absorptionsmaximum bör ligga vid 284 nm:

= 43,6 vid 284 nm i etanol 1 cm

Vid denna spädning bör extinktionskoefficienten ligga mellan 0,84 och 0,88 .

5.6.2    Standardlösning av DL-alfa-tokoferol

5.6.2.1    Beredning av arbetslösning

Pipettera över 2 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferol (3.11.1) till en 50 ml mätkolv. Lös tokoferolet i metanol (3.3) och späd till märket med samma lösningsmedel. Den nominella halten av DL-alfa-tokoferol i lösningen är 40 μg/ml, vilket motsvarar 44,0 μg DL-alfa-tokoferolacetat/ml. Arbetslösningen ska vara nyberedd.

5.6.2.2    Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva

Överför 1,0 –2,0 –4,0 och 10,0 ml av arbetslösningen till ett antal 20 ml mätkolvar. Späd till märket med metanol (3.3) och blanda. De nominella halterna av DL-alfa-tokoferol i dessa lösningar är 2,0 –4,0 –8,0 och 20,0 μg/ml, vilket motsvarar 2,20 –4,40 –8,79 respektive 22,0 μg DL-alfa-tokoferolacetat/ml.

Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna). Använd de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva.

5.6.2.3    UV-standardisering av stamlösningen av DL-alfa-tokoferol (3.11.1)

Späd 2,0 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferol (3.11.1) till 25,0 ml med etanol och mät UV-spektrumet för denna lösning mot etanol (3.1) i en spektrofotometer (4.6) mellan 250 och 320 nm. Absorptionsmaximum bör ligga vid 292 nm:

= 75,8 vid 292 nm i etanol 1 cm

Vid denna spädning bör extinktionskoefficienten ligga på 0,6 .

6.   Beräkning av resultat

Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens vitamin E-toppar för att bestämma halten i μg/ml (beräknat som alfa-tokoferolacetat) med hjälp av kalibreringskurvan (5.6.1.2 eller 5.6.2.2).

Halten av vitamin E, w (mg/kg) i provet beräknas med formeln

[mg/kg]

där:

7.   Anmärkningar

8.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 15 % av det högre värdet.

9.   Resultat av en provningsjämförelse ( 12 )

C.   BESTÄMNING AV SPÅRELEMENTEN JÄRN, KOPPAR, MANGAN OCH ZINK

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten av spårelementen järn, koppar, mangan och zink i foder bestämmas. Kvantifieringsgränser:

2.   Princip

Provet löses upp i saltsyra efter destruktion av eventuellt organiskt material. Grundämnena järn, koppar, mangan och zink bestäms efter lämplig spädning genom atomabsorptionsspektrometri.

3.   Reagens

Inledande anmärkningar

Vid beredning av reagens och analyslösningar ska man använda vatten som är fritt från de katjoner som ska bestämmas, genom att det antingen har dubbeldestillerats i en destillationsapparat av borosilikatglas eller kvartsglas eller har genomgått dubbel behandling med jonbytarharts.

Reagensen måste minst vara av p.a.-kvalitet. Det ska kontrolleras genom ett blankprov att de är fria från det grundämne som ska bestämmas. Om det visar sig nödvändigt måste reagensen renas ytterligare.

I stället för de standardlösningar som beskrivs nedan kan i handeln förekommande standardlösningar användas, förutsatt att de är garanterade och att de kontrolleras före användning.

4.   Utrustning

5.   Utförande ( 13 )

5.1   Prov som innehåller organiskt material

5.1.1    Föraskning och beredning av lösningen för analys ( 14 )

Fukta askan med vatten och för över den till en 250 ml bägare. Tvätta ur degeln med sammanlagt ca 5 ml saltsyra (3.1) och tillför sedan detta långsamt och försiktigt i bägaren. (CO2-bildning kan leda till en kraftig reaktion.) Tillsätt saltsyra (3.1) droppvis under skakning tills all bubbelbildning upphört. Låt provet indunsta fullständigt, under omrörning då och då med glasstav.

Tillsätt 15 ml 6 M saltsyra (3.2) till återstoden, därefter ca 120 ml vatten. Rör med glasstaven, som ska stå kvar i bägaren, och täck över bägaren med ett urglas. Koka upp försiktigt och håll lösningen vid kokpunkten tills askan är fullständigt upplöst. Filtrera genom askfritt filtrerpapper och samla upp filtratet i en 250 ml mätkolv. Skölj bägaren och filtret en gång med 5 ml varm 6 M saltsyra (3.2) och två gånger med kokande vatten. Fyll mätkolven till märket med vatten (HCl-koncentration ca 0,5 M).

Anmärkningar:

För att minska den allmänna risken för kontaminering ska bestämningen utföras i dammfri miljö med ytterst noggrant rengjord utrustning och omsorgsfullt diskade glaskärl. Bestämning av zink är särskilt känslig för många slag av kontaminering, t.ex. genom glas, reagens och damm.

5.1.2    Spektrofotometrisk bestämning

5.1.2.1    Beredning av kalibreringslösningar

Bered, för vart och ett av de spårelement som ska bestämmas, en serie kalibreringslösningar utifrån arbetslösningarna (3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 och 3.10.1) med en HCl-koncentration på ca 0,5 M för varje kalibreringslösning och, i fråga om järn, mangan och zink, en lantankloridkoncentration motsvarande 0,1 % La (w/v).

Koncentrationerna av spårelement måste väljas så att de ligger inom känslighetsområdet för den spektrofotometer som används. Följande tabeller ger exempel på sammansättningen hos typiska serier av kalibreringslösningar. Beroende på typen av spektrofotometer och dess känslighet kan det dock vara nödvändigt att välja andra koncentrationer.

5.1.2.2    Beredning av lösning för analys

Vid bestämning av koppar kan den lösning som beretts enligt 5.1.1 normalt sett användas direkt. Om det är nödvändigt att justera dess koncentration så att den ligger i intervallet för kalibreringslösningarna pipetteras en alikvot till en 100 ml mätkolv och späds till märket med 0,5 M saltsyra (3.3).

Vid bestämning av järn, mangan och zink pipetteras en alikvot av den lösning som beretts enligt 5.1.1 till en 100 ml mätkolv. Tillsätt 10 ml lantankloridlösning (3.11) och späd till märket med 0,5 M saltsyra (3.3) (jfr punkt 8).

5.1.2.3    Blankprov

Blankprovet måste omfatta samtliga moment som anges i denna metod med den enda skillnaden att analysprovet utesluts. Kalibreringslösningen ”0” får inte användas som blankprov.

5.1.2.4    Mätning av atomabsorption

Mät atomabsorptionen hos kalibreringslösningarna och hos den lösning som ska analyseras med en oxiderande luft-acetylenlåga vid följande våglängder:

Utför varje mätning fyra gånger.

5.2   Mineralfoder

Om provet inte innehåller något organiskt material behövs ingen föregående föraskning. Följ anvisningarna från och med 5.1.1.1 andra stycket. Indunstning med fluorvätesyra kan uteslutas.

6.   Beräkning av resultat

Beräkna med hjälp av en kalibreringskurva halten av spårelementet i den lösning som ska analyseras och uttryck resultatet i milligram spårelement per kilogram prov (ppm).

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov av samma person får inte överstiga

8.   Anmärkning

Höga halter av fosfater kan påverka bestämningen av järn, mangan och zink. Sådana interferenser måste korrigeras genom tillsats av lantankloridlösning (3.11). Denna tillsats behöver dock inte göras, vare sig till den lösning som ska analyseras eller till kalibreringslösningarna, om viktförhållandet Ca + Mg/P i provet är > 2.

D.   BESTÄMNING AV HALOFUGINON

DL-trans-7-brom-6-klor-3-[3-(3-hydroxi-2-piperidyl)acetonyl]quinazolin-4-(3H)-on-hydrobromid

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten av halofuginon i foder bestämmas. Kvantifieringsgränsen är 1 mg/kg.

2.   Princip

Efter behandling med varmt vatten extraheras halofuginon, i form av den fria basen, till etylacetat och extraheras därefter, i form av hydroklorid, till en syralösning. Extraktet renas med jonbyteskromatografi. Halten av halofuginon bestäms genom omvänd fas-kromatografi (HPLC) med UV-detektor.

3.   Reagens

Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 50 mg halofuginon (3.6) i en 500 ml mätkolv. Lös i ammoniumacetatbuffertlösning (3.18) och späd sedan med samma lösning till märket och blanda. Lösningen är stabil i tre veckor om den förvaras mörkt vid 5 oC.

För över 1,0 –2,0 –3,0 –4,0 respektive 6,0 ml stamlösning (3.6.1) till en serie 100 ml mätkolvar. Späd till märket med den mobila fasen (3.21) och blanda. Koncentrationen av halofuginon i dessa lösningar är 1,0 –2,0 –3,0 –4,0 respektive 6,0 μg/ml. Lösningarna ska vara nyberedda.

Lös 50 g natriumkarbonat (3.11) i vatten. Späd till 1 liter och tillsätt natriumklorid (3.12) tills lösningen är mättad.

Späd 10 ml HCl (3.7) med vatten till 1 liter.

Lös 19,3 g ammoniumacetat (3.3) och 30 ml ättiksyra (3.5) i vatten (3.14) och späd till 1 liter.

Skölj en lämplig mängd amberlit (3.2) med vatten tills alla kloridjoner har tvättats ur. Detta bekräftas genom en kontroll med silvernitrat (3.20) på sköljvattnet. Skölj därefter hartsen med 50 ml metanol (3.8). Häll bort metanolen och lagra hartsen i färsk metanol.

Lös 0,17 g silvernitrat (3.9) i 10 ml vatten.

Blanda 500 ml acetonitril (3.1) med 300 ml ammoniumacetatbuffertlösning (3.18) och 1 200 ml vatten (3.14). Justera pH till 4,3 med ättiksyra (3.5). Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter (4.8) och avlufta den (t.ex. i ultraljudsbad i 10 minuter). Lösningen är stabil i en månad om den förvaras mörkt i ett slutet kärl.

4.   Utrustning

5.   Utförande

5.1   Allmänt

5.2   Extraktion

Väg med en noggrannhet av 0,1 g upp 10 gram av det beredda provet i ett 200 ml centrifugrör. Tillsätt 0,5 g natriumaskorbat (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) samt 20 ml vatten och blanda. Ställ röret i vattenbad (80 oC) i 5 minuter. Låt svalna till rumstemperatur. Tillsätt därefter 20 ml natriumkarbonatlösning (3.15) och blanda. Tillsätt omedelbart därefter 100 ml etylacetat (3.4) och skaka röret kraftigt för hand i 15 sekunder. Ställ röret i ultraljudsbadet (4.1) i 3 minuter och lossa proppen. Centrifugera i 2 minuter och dekantera etylacetatfasen genom ett glasfiberfilter (4.6) till en 500 ml separertratt. Upprepa extraktionen av provet med en ny volym på 100 ml etylacetat. Tvätta de kombinerade extrakten i 1 minut med 50 ml natriumkloridmättad natriumkarbonatlösning (3.16). Häll bort vattenskiktet.

Extrahera det organiska skiktet i 1 minut med 50 ml saltsyra (3.17). Det undre syraskiktet tappas av till en 250 ml separertratt. Extrahera det organiska skiktet en gång till i 1,5 minuter med ytterligare 50 ml saltsyra och slå samman med det första extraktet. Tvätta de kombinerade syraextrakten genom att rotera kärlet i ca 10 sekunder med 10 ml etylacetat (3.4).

Överför vattenskiktet kvantitativt till en 250 ml rundkolv och häll bort den organiska fasen. Avlägsna allt resterande etylacetat från syralösningen i en rotationsindunstare (4.2). Vattenbadets temperatur bör inte överstiga 40 oC. Vid ett tryck på ca 25 mbar avdunstar allt resterande etylacetat inom 5 minuter vid 38 oC.

5.3   Rening

5.3.1    Förberedelse av amberlitkolonnen

Förbered en XAD-2-kolonn för varje provextrakt. För över 10 g förbehandlad amberlit (3.19) till en glaskolonn (4.5) med metanol (3.8). Sätt en liten propp av glasull i toppen av hartskolonnen. Låt metanolen rinna ur kolonnen och skölj hartsen med 100 ml vatten. Stoppa flödet när vätskan når toppen av hartskolonnen. Låt kolonnen komma i jämvikt i 10 minuter före användning. Se till att kolonnen aldrig torkar ut.

5.3.2    Rening av prov

För över extraktet (5.2) kvantitativt till toppen av den förberedda amberlitkolonnen (5.3.1) och eluera. Häll bort eluatet. Flödeshastigheten vid elueringen bör inte överskrida 20 ml/minut. Skölj rundkolven med 20 ml saltsyra (3.17) som därefter används för att skölja hartskolonnen. Avlägsna kvarvarande syralösning med en luftström. Häll bort sköljresterna. Tillsätt 100 ml metanol (3.8) i kolonnen och eluera 5–10 ml. Samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv. Vänta i 10 minuter så att den återstående metanolen kommer i jämvikt med hartsen. Fortsätt elueringen med en flödeshastighet på högst 20 ml/minut och samla upp eluatet i samma rundkolv. Låt metanolen avdunsta i en rotationsindunstare (4.2). Vattenbadets temperatur bör inte överskrida 40 oC. Överför återstoden kvantitativt till en 10 ml mätkolv genom att använda den mobila fasen (3.21). Späd med den mobila fasen till märket och blanda. En alikvot av lösningen filtreras genom ett membranfilter (4.7). Denna lösning används sedan för HPLC-bestämningen (5.4).

5.4   HPLC-bestämning

5.4.1    Parametrar

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

HPLC-kolonn (4.4.1)

Mobil fas för HPLC (3.21)

Flödeshastighet: 1,5 –2 ml/minut

Detektionsvåglängd: 243 nm

Injektionsvolym: 40–100 μl.

Kontrollera att det kromatografiska systemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera en kalibreringslösning (3.6.2) med koncentrationen 3,0 μg/ml tills topphöjder (areor) och retentionstider är konstanta.

5.4.2    Kalibreringskurva

Injicera varje kalibreringslösning (3.6.2) upprepade gånger och mät topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjder (areor) längs y-axeln och motsvarande koncentrationerna i μg/ml längs x-axeln.

5.4.3    Provlösning

Provextraktet (5.3.2) injiceras upprepade gånger, varvid samma volym ska användas som för kalibreringslösningarna. Bestäm därefter den genomsnittliga topphöjden (arean) för halofuginon.

6.   Beräkning av resultat

Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens halofuginontoppar för att bestämma koncentrationen i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan.

Provets halofuginonhalt w (mg/kg) beräknas med formeln

där:

7.   Validering av resultat

7.1   Identitet

Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet och den kalibreringslösning (3.6.2) som innehåller 6,0 μg/ml jämförs.

7.1.1    Co-kromatografi

Ett provextrakt spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.6.2). Mängden tillsatt halofuginon bör motsvara den uppskattade mängden halofuginon i provextraktet.

Endast halofuginontoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden.

7.1.2    Diod-array-detektion

Resultaten utvärderas enligt följande kriterier:

Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats.

7.2   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,5 mg/kg för halofuginonhalter till och med 3 mg/kg.

7.3   Utbyte

För ett spikat blankprov ska utbytet vara minst 80 %.

8.   Resultat av en provningsjämförelse

I en provningsjämförelse ( 15 ) analyserades tre prov av åtta laboratorier.

E.   BESTÄMNING AV ROBENIDIN

1,3-bis[(4-klorbensyliden)amin]guanidinhydroklorid

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan robenidinhalten i foder bestämmas. Kvantifieringsgränsen är 5 mg/kg.

2.   Princip

Provet extraheras med surgjord metanol. Extraktet torkas och en alikvot renas i en kolonn med aluminiumoxid. Robenidinet elueras från kolonnen med metanol och koncentreras. Den erhållna lösningen späds med en lämplig volym av den mobila fasen. Halten av robenidin bestäms genom omvänd fas-kromatografi (HPLC) med UV-detektor.

3.   Reagens

För över 4,0 ml saltsyra (ρ20 = 1,18 g/ml) till en 500 ml mätkolv. Späd med metanol (3.1) till märket och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd.

Typ 3A, 8–12 mesh (1,6 –2,5 mm kulor, kristallint aluminiumsilikat, pordiameter 0,3 nm).

För över 100 g aluminiumoxid till ett lämpligt kärl och tillsätt 2,0 ml vatten. Förslut kärlet och skaka i ca 20 minuter. Förvara sedan i ett väl tillslutet kärl.

Lös 3,40 g kaliumdivätefosfat i vatten (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml mätkolv. Späd till märket och blanda.

Lös 3,55 g vattenfri (eller 4,45 g dihydrat eller 8,95 g dodekahydrat) dinatriumvätefosfat i vatten (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml mätkolv. Späd till märket och blanda.

Blanda följande reagens:

Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter (4.6) och avlufta den (t.ex. i ultraljudsbad i 10 minuter).

Rent robenidin: 1,3 -bis[(4-klorbensyliden)amin]guanidin-hydroklorid.

Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 30 mg referenssubstans av robenidin (3.9). Lös i surgjord metanol (3.2) i en 100 ml mätkolv. Späd till märket med samma lösningsmedel och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie och förvara mörkt.

För över 10,0 ml stamlösning (3.9.1) till en 250 ml mätkolv. Späd till märket med mobil fas (3.8) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie och förvara mörkt.

För över 5,0 –10,0 –15,0 –20,0 respektive 25,0 ml arbetsstandardlösning (3.9.2) till en serie 50 ml mätkolvar. Späd till märket med den mobila fasen (3.8) och blanda. Koncentrationen av robenidin i dessa lösningar är 1,2 –2,4 –3,6 –4,8 respektive 6,0 μg/ml. Lösningarna ska vara nyberedda.

4.   Utrustning

Kolonn i brunt glas, med avstängningsventil och en behållare med ca 150 ml volym, invändig diameter 10–15 mm, längd 250 mm.

5.   Utförande

5.1   Allmänt

5.2   Extraktion

Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp ca 15 gram av det beredda provet och för över till en 250 ml E-kolv. Tillsätt 100,0 ml surgjord metanol (3.2), tillslut kolven och låt stå i 1 timme i skakapparat (4.2). Filtrera lösningen genom ett glasfiberfilter (4.5) och samla upp allt filtrat i en 150 ml E-kolv. Tillsätt 7,5 g molekylsikt (3.4), tillslut kolven och skaka i 5 minuter. Filtrera omedelbart genom ett glasfiberfilter. Spara lösningen för reningen (5.3).

5.3   Rening

5.3.1    Förberedelse av aluminiumoxidkolonnen

Sätt en liten propp av glasull i glaskolonnens (4.1) nedre öppning och pressa ihop den med en glasstav. Väg upp 11,0 g av den förbehandlade aluminiumoxiden (3.5) och för över till kolonnen. Försök minimera exponeringen för luft under detta arbetsmoment. Knacka försiktigt på kolonnens nederdel så att aluminiumoxiden sätter sig.

5.3.2    Rening av prov

Pipettera över 5,0 ml av det provextrakt som beretts enligt 5.2 till kolonnen. Håll pipettens spets nära kolonnväggen och låt lösningen absorberas av aluminiumoxiden. Eluera robenidinet från kolonnen med 100 ml metanol (3.1), flödeshastighet 2–3 ml/minut, och samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv. Låt metanollösningen indunsta fullständigt i rotationsindunstaren (4.3) under reducerat tryck vid 40 oC. Lös upp återstoden i 3–4 ml mobil fas (3.8) och överför kvantitativt till en 10 ml mätkolv. Skölj kolven med flera volymer mobil fas om 1–2 ml och överför sköljvätskan till mätkolven. Späd till märket med samma lösningsmedel och blanda. En alikvot av lösningen filtreras genom ett 0,45 μm membranfilter (4.7). Denna lösning används sedan för HPLC-bestämningen (5.4).

5.4   HPLC-bestämning

5.4.1    Parametrar

Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat.

HPLC-kolonn (4.4.1),

Mobil fas för HPLC (3.8),

Flödeshastighet: 1,5 –2 ml/minut,

Detektionsvåglängd: 317 nm,

Injektionsvolym: 20–50 μl.

Kontrollera att det kromatografiska systemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera en kalibreringslösning (3.9.3) med koncentrationen 3,6 μg/ml tills topphöjder och retentionstider är konstanta.

5.4.2    Kalibreringskurva

Injicera varje kalibreringslösning (3.9.3) upprepade gånger och mät topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjder (areor) längs y-axeln och motsvarande koncentrationer i μg/ml längs x-axeln.

5.4.3    Provlösning

Provextraktet (5.3.2) injiceras upprepade gånger, varvid samma volym ska användas som för kalibreringslösningarna. Bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för robenidin.

6.   Beräkning av resultat

Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens robenidintoppar för att bestämma koncentrationen i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.4.2).

Provets robenidinhalt w (mg/kg) beräknas med formeln

där:

7.   Validering av resultat

7.1   Identitet

Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet och den kalibreringslösning (3.9.3) som innehåller 6 μg/ml jämförs.

7.1.1    Co-kromatografi

Ett provextrakt spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.9.3). Mängden tillsatt robenidin bör motsvara den uppskattade mängden robenidin i provextraktet.

Endast robenidintoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden

7.1.2    Diod-array-detektion

Resultaten utvärderas enligt följande kriterier:

Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats.

7.2   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % av det högre värdet för robenidinhalter över 15 mg/kg.

7.3   Utbyte

För ett spikat blankprov ska utbytet vara minst 85 %.

8.   Resultat av en provningsjämförelse

I en provningsjämförelse inom EU fick tolv laboratorier analysera fyra prov av fjäderfä- och kaninfoder i form av mjöl eller pellets. För varje prov gjordes dubbla analyser. Resultaten redovisas i nedanstående tabell: