KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2188/81 av den 28 juli 1981 om ändring av förordning (EEG) nr 625/78 om tillämpningsföreskrifter för offentlig lagring av skummjölkspulver

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets förordning (EEG) nr 804/68 av den 27 juni 1968 om den gemensamma organisationen av marknaden för mjölk och mjölkprodukter (), senast ändrad genom Anslutningsakten för Grekland, särskilt artikel 7.5 i denna, och

med beaktande av följande:

I bilaga 1 till kommissionens förordning (EEG) nr 625/78 (), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 2937/80 (), fastställs kvalitetskrav som skummjölkspulver skall uppfylla för att få utbjudas till intervention samt fastställs vissa krav beträffande analysmetoderna för påvisande av vassle genom bestämning av halterna av vissa beståndsdelar i skummjölkspulvret. I fotnot 2 i nämnda bilaga ges möjlighet att fastställa gemenskapsgränsvärden för nämnda beståndsdelar efter en viss försökstid inom medlemsstaterna.

Det är nu möjligt att på gemenskapsnivå fastställa en analysmetod för bestämning av löpevassle i skummjölkspulver genom kvantitetsbestämning av den fria sialinsyran. Denna kontrollmetod bör emellertid inte bli obligatorisk förrän kontrollmyndigheterna och producenterna fått viss tid på sig att sätta sig in denna analysmetod.

De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från Förvaltningskommittén för mjölk och mjölkprodukter.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

1. Bilaga 1 till förordning (EEG) nr 625/78 ändras på följande sätt:

a) I punkt 2 b skall den andra strecksatsen ersättas med följande:

" P vassle:

Bestämning av fri sialinsyra (2) och/eller av cystein-cystinkomplexet i fall där minst ett av de tre obligatoriska testerna, dvs. testet för glykomakropeptiderna i vassle (bestämda genom ett förenklat test), testet för laktathalten eller testet för askhalten, överstiger 3 % respektive 150 mg/100 g respektive 8 %."

b) fotnot 2 skall ersättas med följande:

"() Vad avser påvisande av löpevassle genom kvantitetsbestämning av fri sialinsyra skall från och med den 1 januari 1982 den analysmetod tillämpas som fastställs i bilaga 4."

2. Bilagan till denna förordning skall läggas till som bilaga 4 till förordning (EEG) nr 625/78.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 28 juli 1981.

På kommissionens vägnar

Gaston THORN

Ordförande

()) EGT nr L 148, 28.6.1968, s. 13.

()) EGT nr L 84, 31.3.1978, s. 19.

()) EGT nr L 305, 14.11.1980, s. 13.

BILAGA

"BILAGA 4

PÅVISANDE AV LÖPEVASSLEFÖREKOMST I SKUMMJÖLKSPULVER AVSETT FÖR

OFFENTLIG LAGRING GENOM KVANTITATIV BESTÄMNING AV FRI SIALINSYRA

1. Syfte och tillämpningsområde

Denna metod möjliggör upptäckt av löpevassle i skummjölkspulver avsett för offentlig lagring.

2. Princip för metoden

När mjölk koagulerar vid tillsats av löpe, frigörs vissa kaseinglykomakropeptider med hög halt av sialinsyra. Mängden sialinsyra (N-acetylneuraminsyra) möjliggör upptäckt av löpevassle som kan finnas i skummjölkspulver. När mjölk framställts av pulvret, avlägsnas glykomakropetiderna, inklusive sialinsyra, från ett filtrat som innehåller 12 % triklorättiksyra genom utfällning med fosforvolframsyra. Sialinsyra som frigjorts genom hydrolys i sur lösning bildar med resorcinol ett färgat komplex som mäts med synlig spektrofotometri vid 580 nm.

3. Reagenser

Alla reagenser skall vara av för analytiska ändamål godkänd klass. Vattnet skall vara destillerat vatten eller avjoniserat vatten.

3.1 Triklorättiksyralösning

Lös 240 g triklorättiksyra i vatten och späd till 1 000 ml.

3.2 Fosforvolframsyra

Lös 20 g fosforvolframsyra i vatten och späd till 100 ml.

3.3 Etanol 95 % (v/v).

3.4 Svavelsyra, ca 0,1 N.

Bered 1 N svavelsyra genom att späda 28,1 ml koncentrerad svavelsyra (95 % H2SO4) med vatten till 1 000 ml. Bered 0,1 N svavelsyra genom att späda 100 ml 1 N svavelsyra med vatten till 1 000 ml.

3.5 Acetatbuffert, pH = 4,8.

Lös 19,7 g vattenfri natriumacetat i vatten, tillsätt 9 ml isättika och späd med vatten till 1 000 ml. Kontrollera och justera pH-värdet vid behov.

3.6 Kopparsulfatlösning, 0,1 M.

Lös 2,497 g kopparsulfat (CuSO4 7 5H2O) i vatten och späd till 100 ml.

3.7 Resorcinlösning, 2 %.

Lös 2 g resorcinol i vatten och späd till 100 ml. Vid 5 P8 oC kan denna lösning förvaras i fyra månader.

3.8 Resorcinolreagens.

Blanda 10 ml av resorcinlösningen (3.7) och 80 ml koncentrerad saltsyra (d20 °C = 1,19 g/l) med 0,25 ml kopparsulfatlösning (3.6) och späd till 100 ml med vatten. Lösningen skall vara nyberedd samma dag som den används.

3.9 Isoamylalkohol.

3.10 N-acetylneuraminsyra-(sialinsyra)-lösning.

Lös 20 mg N-neuraminsyralösning i vatten och späd till 100 ml. Vid +4 oC får denna lösning förvaras högst en vecka.

4. Utrustning

4.1 Analysvåg.

4.2 Magnetomrörare med 2 cm långa magneter belagda med teflon.

4.3 pH-mätare.

4.4 Centrifug med kapacitet för en centrifugalkraft på 3 000 g.

4.5 Centrifugrör som rymmer ca 75 ml.

4.6 Termostatstyrt vattenbad, inställt på 80 oC.

4.7 Kokande vattenbad .

4.8 Filtrerpapper, diameter 125 mm (Schleicher und Schüll, nr 5892, typ "Weissband" eller motsvarande filter).

4.9 Glastrattar, diameter ca 7 cm.

4.10 Glasbägare som rymmer 100 och 150 ml.

4.11 Mätkolvar med volymerna 50, 100 och 1 000 ml.

4.12 Provrör med skruvlock och en volym av 10 ml.

4.13 Spektrofotometer.

4.14 Glaskyvett (4.13) med strålgång på 10 mm.

4.15 Graderade pipetter som medger tillförsel av 1, 2, 5, 10, 20, 25 och 50 ml.

4.16 Glasstavar.

4.17 Termostatstyrd torkugn, inställd på 35 oC.

5. Beredning av provet

Efter homogenisering skall provet undersökas i enlighet med anvisningarna under punkt 6 och framåt.

6. Förfarande

6.1 Isolering av fri sialinsyra.

6.1.1 Väg upp 5 ± 0,005 g skummjölkspulver i en 150 ml glasbägare.

Tillsätt 50 ml vatten och rör med magnetomrörare (4.2) till dess att provet är fullständigt löst.

Tillsätt 50 ml triklorättiksyralösning (3.1) under omrörning.

Låt stå i ca 30 minuter (i rumstemperatur).

6.1.2 Rör om och filtrera omedelbart (4.8).

6.1.3. Överför 50 ml av det filtrat som erhållits 60 minuter efter det att filtreringen påböjades till ett centrifugrör (4.5).

Tillsätt 1 ml fosforvolframsyralösning (3.2). Gör lösningen homogen genom omrörning. Låt stå i 10 minuter i rumstemperatur och separera därefter fällningen genom centrifugering i 10 min vid 3 000 g.

6.1.4 Supernatantvätskan slås bort. Sedimentet tvättas två gånger med 5 ml etanol (3.3). Var noga med att blanda väl med magnetomrörare eller glasstav (4.16). (Om glasstav används skall 2 ml etanol tillsättas för att lösa fällningen och resterande 3 ml används till att tvätta glasstaven.)

Efter varje tvättning centrifugeras provet i 10 minuter vid 3 000 g. Sedimentet torkas antingen över natten vid rumstemperatur eller vid 35 oC i 90 minuter.

6.1.5 Tillsätt 4 ml 0,1 N svavelsyra (3.4) till det torkade sedimentet, blanda väl så att det löses.

Förslut behållarna och placera dem under 40 minuter i vattenbad med temperaturen 80 oC. Rör om då och då för att säkerställa att sedimentet löses fullständigt. Kyl till rumstemperatur. Tillsätt därefter 4 ml acetatbuffert (3.5) och blanda väl.

6.1.6 Centrifugera i 10 minuter vid 3 000 g. Bestämningen av sialinsyra eller N-neuraminsyra utförs i supernatantvätskan.

6.2 Spektrofotometrisk bestämning av fri sialinsyra

6.2.1 Häll 2 ml av supernatanten i ett provrör (4.12) och tillsätt 2 ml resorcinolreagens (3.8).

6.2.2 Förslut röret och blanda väl. Låt röret stå i exakt 15 minuter i vattenbad med temperaturen 100 oC (4.7) och kyl därefter till rumstemperatur i rinnande vatten.

6.2.3 Tillsätt 5 ml isoamylalkohol (3.9). Förslut rören, blanda genom att skaka rören kraftigt och sätt dem i isvatten i 15 minuter.

6.2.4 Centrifugera rören i 2 minuter vid 1 000 g så att två skikt erhålls.

6.2.5 Överför ca 3 ml av det översta skiktet (isoamylalkoholskiktet) till en glaskyvett och mät absorptionen vid 580 nm mot kontrollprovet senast 30 minuter efter det att rören tagits ur isvattnet.

6.3 Kontrollprov

Bered ett kontrollprov enligt 6.2.1 P6.2.5 med användning av 1 ml 0,1 N svavelsyra (3.4) och 1 ml acetatbuffert (3.5) istället för 2 ml filtrat enligt 6.2.1.

6.4 Kalibreringskurva

6.4.1 Häll exakt 0-2-5-10-20 och 30 ml, motsvarande 0-0,4-1-2-4-6 mg sialinsyra, av lösningen (3.10) i mätkolvar som rymmer 50 ml. Späd till 50 ml med 0,1 N (3.4) svavelsyra och blanda genom kraftig skakning.

6.4.2 Blanda 1 ml lösning från varje mätkolv i ett provrör (4.12) med 1 ml acetatbuffert (3.5) så att en rad standardlösningar som innehåller 0 (0-värde), 8, 20, 40, 80 respektive 120 mikrogram sialinsyra erhålls. Blanda väl och följ förfarandet enligt 6.2.2 P6.2.5.

6.4.3 Fastställ en kalibreringskurva genom att ta fram en absorptionskurva enligt 6.4.2 mot respektive sialinsyrakoncentration i mikrogram enligt 6.4.2.

7. Resultatangivelse

7.1 Beräkning

Beräkna sialinsyrahalten uttryckt som mikrogram per gram med användning av följande formel:

C 7 8

E

där C är sialinsyrans massa i mikrogram, bedömd på grundval av kalibreringskurvan över absorptionen erhållen enligt 6.2.5 och E är provmängden (6.1.1) i gram. Avrunda resultatet till närmaste hela mikrogram.

7.2 Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två analyser som samtidigt eller med kort tidsintervall utförts av samma kemist får inte överstiga 5 % av det aritmetiska medelvärdet.

8. Tolkning av resultatet

Med denna metod kan förekomsten av vassle i skummjölkspulver kvantitetsbestämmas.

8.1 Beräkning av medelvärdet för fri sialinsyra i mikrogram per gram i provet i relation till proteinhalten uttryckt i procent (m/m):

Y = 40 + 3(X P 34)2

där

40 = den genomsnittliga sialinsyrahalten i mikrogram per gram för skummjölkspulver som innehåller minst 34 % protein,

X = total proteinhalt (%) fastställd med Kjeldahl-metoden FIL IDF 20:1962.

8.2 Beräkning av procentsatsen vasslepulver som kan förekomma:

% vasslepulver = Z P Y

% vasslepulver 10

där

Z = sialinsyrahalten i provet enligt 7.1 uttryckt i mikrogram per gram

Y = den genomsnittliga sialinsyrahalten i provet beräknad enligt 8.1

10 = sialinsyrahalten enligt normerna uttryckt i mikrogram per ett gram löpevasslepulver.

8.3 Med förbehåll för fel i metoden och naturliga variationer i provets sammansättning kan slutsatsen dras att vassle inte förekommer i provet när det värde som erhålls i 8.2 är högst 2,0.

Om högre värden erhålls är förekomst av vassle bekräftad och vasslen kvantitetsbestäms enligt formeln i 8.2."