BILAGA I

DE TEKNISKA ANVISNINGAR SOM AVSES I ARTIKEL 4

DEL A:

Urvalsram

För att undvika åldersrelaterade effekter skall övervakningen utföras på slaktpartier vid slakteriet.

Då prevalens av Campylobacter spp. visats variera betydligt med årstiden, motiverar detta stratifiering. I detta syfte skall en tolvmånadersperiod indelas i tolv perioder om en månad. Under var och en av dessa perioder skall 1/12 av den totala provstorleken tas.

Provtagningen skall i andra hänseenden utgå från ett slumpmässigt urval såväl i fråga om slakterier, provtagningsdagar varje månad som om vilka partier som skall provas under en vald provtagningsdag. Slumpmässighetsschemat skall i synnerhet säkerställa ett urval av slaktpartier som står i proportion till det antal flockar som götts enligt olika uppfödningssätt (konventionella, frigående, biodynamiska). Statusen för Salmonella spp. eller Campylobacter spp. får, om den är känd vid slakten, inte heller påverka slumpmässigheten. Den behöriga myndigheten skall ta ansvar för att slumpmässighetsschemat genereras och säkerställa att det genomförs korrekt. Ett exempel på ett slumpmässighetsförfarande ges i rapporten från EFSA:s arbetsgrupp för övervakning av insamling av uppgifter om zoonoser om de tekniska anvisningar som föreslagits för ett samordnat övervakningsprogram för salmonella och campylobacter i slaktkycklingkött inom EU. Närmare uppgifter om slumpmässighetsschemat skall rapporteras till kommissionen.

DEL B:

Provstorlek

1.   Primär provstorlek

a)	Den primära provstorleken tillhandahåller det antal slaktpartier som skall provas.

b)	Minst 384 slaktpartier skall provas. Uteblivet svar skall förekommas genom provtagning på mer än 10 % av de angivna antalen.

c)	Genom undantag från punkt b skall följande antal slaktpartier (1) uttas i Estland, Lettland och Luxemburg: i) I Estland, minst 96 slaktpartier. ii) I Lettland, minst 120 slaktpartier. iii) I Luxemburg, minst 12 slaktpartier.

2.   Sekundär provstorlek

Den sekundära provstorleken tillhandahåller det antal enskilda slaktkycklingar per slaktparti som skall provas. Detta antal skall vara tio fåglar för detektion av campylobacter i blindtarmar och en fågel för detektion av campylobacter och salmonella i slaktkroppar. Dessa blindtarmsprov och slaktkroppsprov skall komma från samma slaktparti.

DEL C:

Insamling av provexemplar, hantering och analys för detektion och antimikrobiell provning av Campylobacter spp. i slaktkycklingsflockar

1.   Insamling och transport

Campylobacter är relativt känsliga organismer som snabbt dör utanför värdtarmen. Aktsamhet skall därför iakttas för att säkerställa att proven tas på lämpligt sätt och snabbt analyseras. Extrema temperaturer skall undvikas och transporten skall gå så fort som möjligt.

De prov som skall tas skall vara hela blindtarmar. Blindtarmsprov skall tas i samband med urtagning.

Endast personal med utbildning för standardprovtagningsförfaranden skall ta prover. Det viktigaste målet skall vara att under provtagningen göra den yttre föroreningen från blindtarmsinnehållet så liten som möjligt. Detta uppnås bäst genom varsam manuell sträckning vid förbindelsepunkten med tarmen. En intakt blindtarm skall tas per fågel och provtagarna skall kontrollera att blindtarmen är full och om den inte är det skall den inte beaktas. Fåglar skall helst uttas slumpmässigt i hela partiet (där den första delen av det parti som skall slaktas bör undvikas) genom att prover från fåglar som inte kommer i följd insamlas. De tio blindtarmar som insamlats får placeras i en enda steril påse/förpackning för transport.

Alla relevanta uppgifter som erhålls från provet skall registreras i ett provtagningsformulär som framställs av den behöriga myndigheten för att göra det möjligt att uppfylla rapporteringskraven i del E. Varje prov och dess provformulär skall märkas med ett unikt nummer som skall användas från provtagning till provning. Den behöriga myndigheten skall se till att ett system för unik numrering utformas och används. Samma identitetsbeteckning som används för slaktpartiet skall användas för slaktkroppsprovet.

Blindtarmsproverna skall transporteras som hela blindtarmar till laboratoriet inom 24 timmar (dvs. prioriterad post eller ilbud) och genast analyseras där. I de fall där detta inte kan ordnas skall proven hållas nedkylda minst tills de transporteras till laboratoriet och de skall analyseras senast 72-80 timmar efter provtagningen. Prover som inte kan provas ankomstdagen skall hållas nedkylda på laboratoriet fram till analysen.

Blindtarmsinnehållet skall avlägsnas aseptiskt och förenas till ett samlingsprov på laboratoriet.

2.   Diagnosmetod

2.1   Odling

Direkt odling på ett selektivt substrat ger en god uppskattning av prevalensen för campylobacter. Direkt odling av provet skall göras på ett selektivt substrat som är lämpat för campylobacter, (dvs. ett modifierat blodfritt selektivt substrat för campylobacter; Karmali; eller Preston Agar).

Plattorna skall inkuberas vid 41,5 ± 1 °C i en mikroaerob atmosfär under minst 48 ± 2 timmar. Tillväxt kan detekteras efter 24 timmar.

Den mikroaeroba atmosfären kan erhållas i kommersiellt tillgängliga mikroaeroba inkubatorer (gasblandning 10 % CO2/6 % O2). I avsaknad av sådana inkubatorer kan mikroaeroba odlingssystem användas, dvs. gasflaskor. Gasförvaringsystem som ger den lämpliga mikroaeroba atmosfären finns tillgängliga kommersiellt.

Lämpliga positiva och negativa kontrollgrupper skall införas för varje provparti som odlas.

2.2   Bekräftelse på och speciering av genus campylobacter

Isolering av och bekräftelse på organismer av campylobacter skall utföras enligt beskrivning i ISO 10272–1:2006(E). Minst ett isolat av campylobacter per parti skall specieras med användning av fenotypmetoder enligt beskrivning i ISO 10272–1:2006(E) eller offentliggjorda molekylära metoder som polymeraskedjereaktionsteknik. Den metod som använts skall anges. Det isolat som specierats skall användas för påföljande antimikrobiell provning.

Om ett laboratorium har mindre erfarenhet av speciering skall det lagra isolatet såsom föreskrivs i 2.4 i avvaktan på ytterligare utbildning eller efter samråd med gemenskapens referenslaboratorium för campylobacter sända det till ett laboratorium med större erfarenhet.

2.3   Kvalitetskontroll

För kvalitetssäkring skall en sats av isolaten av Campylobacter spp., högst åtta isolat, sändas till gemenskapens laboratorium för campylobacter för bekräftelse och speciering.

En sats av dessa isolat skall sändas till detta laboratorium antingen i ett parti eller kvartalsvis. Om isolat skall transporteras mellan laboratorier skall det ske under lämpliga förhållanden (t.ex. träkolsbelagd provtagningspinne).

2.4   Lagring

Minst ett isolat per positivt prov skall lagras vid de nationella referenslaboratorierna med användning av den normala metoden för ett nationellt referenslaboratoriums odlingsinsamling, så länge det säkerställer stammarnas livskraft under minst två år.

2.5   Provning av antimikrobiell resistens

Det antal isolat av campylobacter som skall ingå i övervakningen av den antimikrobiella resistensen skall uppgå till 170 per medlemsstat. Högst ett isolat per art av campylobacter från samma slaktparti skall ingå i övervakningen.

I de medlemsstater där det under ett givet år finns ett mindre antal isolat än målprovets storlek skall alla dessa isolat ingå i övervakningen av den antimikrobiella resistensen.

I de medlemsstater där det finns ett större antal isolat skall alla isolat eller ett representativt slumpmässigt urval som är lika stort eller större större än målprovets storlek ingå.

Medlemsstaterna skall prova minst de antimikrobiella medel som anges i tabell 1 med användning av de angivna brytpunktsvärdena och ett lämpligt koncentrationsintervall för att bestämma känsligheten hos campylobacter.

Tabell 1

	Antimikrobiellt medel	Brytpunktsvärde (mg/L) R >
Campylobacter jejuni	Erytromycin	4
	Ciprofloxacin	1
	Tetracyclin	2
	Streptomycin	2
	Gentamicin	1
Campylobacter coli	Erytromycin	16
	Ciprofloxacin	1
	Tetracyclin	2
	Streptomycin	4
	Gentamicin	2

Utspädningsmetoderna skall motsvara de metoder som beskrivs i CLSI:s riktlinjer ”M31-A3 – Third Edition, Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals” och ”M100 – S16, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing; Sixteenth International Supplement”.

DEL D:

Insamling av provexemplar, hantering och analys för detektion av Campylobacter spp. och Salmonella spp. i slaktkroppar av slaktkycklingar

1.   Insamling och transport

En hel slaktkropp per slaktparti skall insamlas omedelbart efter nedkylning men före ytterligare bearbetning såsom nedfrysning, styckning eller emballering. I vissa slakterier kan detta betyda att proven tas efter förhandsnedkylning när detta är det sista steget före ytterligare bearbetning.

Det insamlade provet skall placeras i en separat steril plastpåse under undvikande av korskontaminering och sändas till det laboratorium där provtagning i skinnet skall utföras.

Korskontaminering med andra slaktkroppar eller blindtarmsprov skall undvikas vid insamlingen av slaktkropparna. Försiktighet skall därför iakttas i alla led för att säkerställa att den utrustning som används för provtagning, transport och lagring inte kontamineras av de patogener som undersöks i studien.

Alla relevanta uppgifter som erhålls från provet skall registreras i ett provtagningsformulär som framställs av den behöriga myndigheten för att göra det möjligt att uppfylla rapporteringskraven i del E.

Varje prov och dess provtagningsformulär skall märkas med ett unikt nummer som skall användas från provtagning till provning. Den behöriga myndigheten skall se till att ett system för unik numrering utformas och används. Samma identitetsbeteckning som används för slaktpartiet skall användas för blindtarmsproven.

Proven skall under transporten hållas vid + 2-8 °C och fria från extern kontaminering.

Alla prov skall helst nå laboratoriet inom 24 timmar efter provtagning. I undantagsfall (t.ex. vid långa resor, veckoslut och allmänna helgdagar) får denna frist ökas till 80 timmar.

Om olika laboratorier används för provning av campylobacter och salmonella skall laboratorieprovningen av campylobacter gå före vid mottagandet av provet.

2.   Provtagning i laboratoriet och analysmetoder

2.1   Mottagande av prov

Vid mottagandet av proven skall laboratorierna kontrollera de uppgifter som registrerats av provtagaren och ifylla tillämpliga delar av provformuläret.

Proven skall hållas vid + 2-8 °C i laboratoriet och provtagningsförfarandet i laboratoriet skall inledas så snart som möjligt efter provens ankomst till laboratoriet och i varje fall inom 72-80 timmar efter provtagningstillfället.

2.2   Förberedelse av provet

Alla prov som mottagits skall undersökas för att säkerställa att transportemballaget är oskadat före provningen.

De som hanterar proven skall i alla led undvika korskontaminering mellan proven och omgivningen.

Kycklingen skall avlägsnas från sin provpåse med engångshandskar samtidigt som försiktighet iakttas så att kycklingens yttre yta inte kontamineras.

Nackskinnet skall, i förekommande fall, avlägsnas med användning av ett sterilt instrument och aseptisk metod tillsammans med skinnet från en sida av slaktkroppen och med undvikande av något fett för att bilda en analysdel om 27 g och placeras i en Stomacher-påse (eller pulsifier).

2.3   Ursprunglig suspension

Analysdelen om 27 g skall tillföras nio volymer (243 ml) buffrat peptonvatten som i förväg uppvärmts till rumstemperatur. Blandningen skall behandlas i en Stomacher-påse eller pulsifier under ca 1 minut (27 g krävs för att parallellt analysera Salmonella spp. och Campylobacter spp. från ett prov). Skumbildning skall undvikas genom att luften så mycket som möjligt avlägsnas ur Stomacher-påsen.

Denna ursprungliga suspension skall användas enligt följande:

a)	10 ml (~1 g) skall tillföras 90 ml anrikningssubstrat för detektion av Campylobacter spp.,

b)	10 ml (~1 g) skall införas i ett tomt sterilt provrör; 1 ml används för räkning av Campylobacter spp. på selektionsplattor.

Återstoden av den ursprungliga suspensionen (250 ml ~ 25 g) skall användas för detektion av Salmonella spp.

2.4   Detektion, identifieringsmetoder för Salmonella spp.

2.4.1   Detektion av Salmonella spp.

Detektionen av Salmonella spp. skall utföras enligt ISO 6579–2002 (E). ”Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of Salmonella spp.”

2.4.2   Serotypning av Salmonella spp.

Minst ett isolat från varje positivt prov skall av det nationella referenslaboratoriet serotypas för salmonella enligt Kaufmann-White-schemat.

För kvalitetssäkring skall en sats av de icke-typningsbara isolaten sändas till gemenskapens referenslaboratorium för salmonella med högst 16 icke-typningsbara isolat. En sats av dessa isolat skall kvartalsvis sändas till detta laboratorium.

2.4.3   Fagtypning av Salmonella spp.

För S. enteritidis och S. typhimurium rekommenderas att minst ett isolat från varje positivt prov skall fagtypas med användning av det protokoll som fastställts av Health Protection Agency, Colindale, London.

2.5   Detektion, identifierings- och kvantifieringsmetoder för Campylobacter spp.

2.5.1   Detektion av Campylobacter spp.

Isolering av och bekräftelse på organismer av campylobacter skall utföras enligt beskrivning i ISO 10272–1:2006(E). Minst ett isolat av campylobacter per parti skall specieras med användning av fenotypmetoder enligt beskrivning i ISO 10272–1:2006(E) eller offentliggjorda molekylära metoder som polymeraskedjereaktionsteknik. Den metod som använts skall anges.

För kvalitetssäkring skall en sats av isolaten av Campylobacter spp., högst åtta isolat, sändas till gemenskapens referenslaboratorium för campylobacter för bekräftelse och speciering.

En sats av dessa isolat skall kvartalsvis sändas till detta laboratorium. Om isolat skall transporteras mellan laboratorier skall det ske under lämpliga förhållanden (t.ex. träkolsbelagda provtagningspinnar).

2.5.2   Kvantifiering av Campylobacter spp.

Den kvantitativa detektionen av Campylobacter spp. skall utföras enligt ISO/TS 10272–2:2006 ”Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. Part 2: Colony-count technique”. Utgående från 10 ml ursprunglig suspension skall 0,1 ml av denna ursprungliga suspension och ytterligare utspädningar därav undersökas för att möjliggöra räkning av upp till 106 cfu/g. Dessutom skall 1 ml av den outspädda ursprungliga suspensionen undersökas för att få ett gränsvärde för att räkna 10 cfu/g. Alla bestämningar av plattorna skall göras i två exemplar.

För att möjliggöra en korrekt jämförelse och bedömning av uppgifterna (för kommande riskbedömning) skall mätosäkerheten hos den kvantitativa bestämningsmetoden bedömas för varje laboratorium.

För att bedöma mätosäkerheten skall den tekniska anvisningen ISO/TS 19036:2006 användas med undantag för att de parallella utspädningarna från den ursprungliga suspensionen tillämpas för bedömning av mätosäkerheten.

Mätosäkerheten härleds ur reproducerbarhetens standardavvikelse mellan laboratorierna. Uppgifter om bedömning av mätosäkerhet skall insamlas från maj till september för att säkerställa positiva prov. Sammanlagt tolv positiva prov skall undersökas i två exemplar och parallella utspädningar färdigställas ur den ursprungliga suspensionen av 10 ml. Rådata om bedömning av mätosäkerhet skall rapporteras separat som en del av den övergripande beskrivning av studiens genomförande som anges i del E.

3.   Lagring av isolat

För att möjliggöra t.ex. senare provning av antimikrobiell känslighet rekommenderas lagring av en representativ delmängd isolat. Ett isolat per positivt prov skall lagras. Det isolat av campylobacter som erhålls vid den kvantitativa analysen skall ha företräde. Isolaten skall lagras i de nationella referenslaboratorierna med användning av den normala metoden för ett nationellt referenslaboratoriums odlingsinsamling så länge det säkerställer stammarnas livskraft under minst två år.

DEL E:

Rapportering

Rapporterna skall upprättas innehållande minst följande uppgifter:

1.

En övergripande beskrivning av studiens genomförande: — Slakterier: det totala antalet per land och det antal som utvaldes. — Den primära provstorlek som tillämpats. — Beskrivning av stratifierings- och slumpmässighetsförfarandena. — Beskrivning av kvalitetskontrollverksamheten, inkl. en rapport om de tolv bedömningarna av mätosäkerhet per laboratorium vid kvantifieringen av campylobacter. — Övergripande resultat.

2.

Specifika upplysningar med avseende på uppgifterna om prevalens Medlemsstaterna skall överlämna resultaten av undersökningen i form av rådata med användning av den dataordlista och de datainsamlingsformulär som tillhandahålls av kommissionen. Dessa uppgifter skall innehålla minst följande upplysningar: — Slakteriets namn/kod. — Slaktpartiets identitetsbeteckning. — Namn/kod för slaktpartiets ursprungsanläggning (gård). — Anläggningens storlek, om den är känd. — Flockens salmonellavaccinationsstatus, om den är känd. — Slaktkycklingarnas ålder vid provtagningen (slakten). — Upplysningar om huruvida detta var det första eller ett senare parti ur flocken som skall slaktas (föregående gallring eller inte). — Uppfödningssätt (dvs. konventionella, frigående, biodynamiska). — Resultat av tidigare provning av salmonella och campylobacter i samma flock. — Provtagningsdatum. — Det antal fåglar som slaktas per år i detta slakteri. — Den nedkylningsmetod som använts (luft, neddoppning, sprej). — Närmare uppgifter ur transportprotokollet (enligt specifikation: J/N); — Datum för mottagandet vid laboratoriet. — Provningsdatum. — Identifiering av laboratoriet. — Provtyp. — Beskrivning av de odlingsmetoder som använts, i synnerhet det (de) selektiva substratet/substraten; — Isolat av campylobacter: den specieringsmetod som använts. — campylobacter: resultat av den bakteriologiska provningen, inkl. speciering från blindtarmsprovet. — campylobacter: resultat av den bakteriologiska provningen, inkl. speciering och kvantifiering från slaktkroppsprovet. — salmonella: resultat av bakteriologisk provning och serotypning. — Tidsåtgång mellan provtagning och analys (per tolvtimmarsperiod).

3.

Specifika upplysningar i fråga om provning av antimikrobiell resistens för blindtarmsprovsisolat av campylobacter. Resultaten av övervakningen av den antimikrobiella resistensen skall bedömas och rapporteras i enlighet med artikel 9 i direktiv 2003/99/EG i den årliga rapporten om trender för och källor till zoonoser, zoonotiska smittämnen och antimikrobiell resistens. Utan att tillämpningen av bestämmelserna i bilaga IV i direktiv 2003/99/EG påverkas skall följande uppgifter rapporteras: — Isolatens ursprung dvs. grundläggande studie, kontrollprogram, passiv övervakning. — Det antal isolat vars känslighet provats per art av campylobacter. — Det antal isolat som befunnits resistenta per antimikrobiellt medel per art av campylobacter. — Det antal isolat som är fullt känsliga och det antal isolat som är resistenta mot de 1, 2, 3, 4 och > 4 antimikrobiella medel som förtecknas i tabell 1 per art av campylobacter.

---

(1)  Beräkning: antal anläggningar (4 i Estland, 5 i Lettland) × 2 flockar per anläggning × 2 slaktpartier per flock × 6 omgångar per år. I Luxemburg slaktas endast slaktkycklingar från 3 små flockar. Ett slaktparti från var och en av dem skall provas varje tremånadersperiod.

BILAGA II

Största ekonomiska bidrag från gemenskapen till medlemsstaterna

(euro)
Medlemsstat	Största totalbelopp för samfinansiering av provtagning och analyser
Belgien – BE	58 092
Bulgarien – BG	58 092
Tjeckien – CZ	58 092
Danmark – DK	58 092
Tyskland – DE	58 092
Estland – EE	14 688
Irland – IE	58 092
Grekland – EL	58 092
Spanien – ES	58 092
Frankrike – FR	58 092
Italien – IT	58 092
Cypern – CY	58 092
Lettland – LV	18 360
Litauen – LT	58 092
Luxemburg – LU	1 836
Ungern – HU	58 092
Malta – MT	58 092
Nederländerna – NL	58 092
Österrike – AT	58 092
Polen – PL	58 092
Portugal – PT	58 092
Rumänien – RO	58 092
Slovenien – SI	58 092
Slovakien – SK	58 092
Finland – FI	58 092
Sverige – SE	58 092
Förenade kungariket – UK	58 092
Totalt	1 429 092

BILAGA III

Styrkt ekonomisk redovisning av genomförandet av en studie om prevalensen av Campylobacter spp. i slaktkycklingflockar och deras antimikrobiella resistens och om prevalensen av Campylobacter spp. och Salmonella spp. i slaktkroppar av slaktkycklingar

Redovisningsperiod: … till …

Redovisning av kostnader som uppkommit under studien och som berättigar till ekonomiskt bidrag från gemenskapen:

Referensnummer för kommissionens beslut att bevilja ekonomiskt bidrag från gemenskapen:

…

…

Kostnader som uppkommit och som hänför sig till	Antal provningar	De totala kostnader för provning som uppkommit under redovisningsperioden (nationell valuta)
Bakteriologisk detektion av Campylobacter spp.
Bakteriologisk detektion av Salmonella spp.
Bekräftelse av Campylobacter spp.
Speciering av isolat av campylobacter
Räkning av isolat av campylobacter
Serotypning av isolat av salmonella
Provning av antimikrobiell resistens hos isolat av campylobacter

Bidragsmottagarens försäkran

Härmed intygas att

—	ovanstående kostnader utgör faktiska kostnader som uppkommit i samband med de arbetsuppgifter som föreskrivs i beslutet och att de var väsentliga för det korrekta utförandet av dessa arbetsuppgifter,

—	alla handlingar som styrker kostnaderna finns tillgängliga för revisionsändamål,

—	inget annat bidrag från gemenskapen begärdes för detta program.

Datum: …

Ekonomiansvarig: …

Namnteckning: …