Dodatek I

POSNETO MLEKO V PRAHU: KOLIČINSKO DOLOČANJE FOSFATIDILSERINA IN FOSFATIDILETANOLAMINA

Metoda: HPLC na reverzni fazi

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Metoda navaja postopek za količinsko določanje fosfatidilserina (PS) in fosfatidiletanolamina (PE) v posnetem mleku v prahu in je primerna za zaznavanje trdnih snovi pinjenca v posnetem mleku v prahu.

2.   OPREDELITEV

Vsebnost PS + PE: masni delež snovi, določen s tukaj opisanim postopkom. Rezultat se izrazi v miligramih fosfatidiletanolamina dipalmitola (PEDP) na 100 g prahu.

3.   PRINCIP METODE

Ekstrakcija aminofosfolipidov iz rekonstruiranega mleka v prahu z uporabo metanola. Določitev PS in PE kot derivatov o-ftaldialdehida (OPA) s HPLC na reverzni fazi (RP) in fluorescenčno detekcijo. Količinska opredelitev vsebnosti PS in PE v preskusnem vzorcu glede na standardni vzorec, ki vsebuje znano količino PEDP.

4.   REAGENTI

Vsi reagenti dosegajo priznano analitsko čistost. Uporabljena voda je destilirana voda ali voda vsaj enakovredne čistosti, če ni navedeno drugače.

4.1   Standardni material: PEDP s čistostjo najmanj 99 %

Opomba: Standardni material se hrani pri – 18 °C.

4.2   Reagenti za pripravo standardnega in preskusnega vzorca

4.2.1   Metanol, HPLC-čistost

4.2.2   Kloroform, HPLC-čistost

4.2.3   Triptamin-monohidroklorid

4.3   Reagenti za o-ftalaldehidno derivatizacijo

4.3.1   Natrijev hidroksid, 12 M vodna raztopina

4.3.2   Borova kislina, 0,4 M vodna raztopina, uravnana na pH 10,0 z natrijevim hidroksidom (4.3.1)

4.3.3   2-merkaptoetanol

4.3.4   o-ftalaldehid (OPA)

4.4   Reagenti za HPLC (eluenti)

4.4.1   Eluente je treba pripraviti z uporabo reagentov HPLC-čistost.

4.4.2   Voda, HPLC-čistost

4.4.3   Metanol, čistost za fluorimetrijo

4.4.4   Tetrahidrofuran

4.4.5   Natrijev dihidrogen fosfat

4.4.6   Natrijev acetat

4.4.7   Ocetna kislina

5.   OPREMA

5.1   Analitska tehtnica, ki lahko tehta na 1 mg natančno, s čitljivostjo 0,1 mg

5.2   Čaše s prostornino 25 in 100 ml

5.3   Pipete, ki lahko prepuščajo 1 ml in 10 ml

5.4   Magnetni mešalnik

5.5   Polnilne pipete, ki lahko prepuščajo 0,2, 0,5 in 5 ml

5.6   Merilne bučke s prostornino 10, 50 in 100 ml

5.7   Brizgalke s prostornino 20 in 100 μl

5.8   Ultrazvočna kopel

5.9   Centrifuga, delujoča pri 27 000 × g

5.10   Reakcijske stekleničke s prostornino približno 5 ml

5.11   Merilni valj s prostornino 25 ml

5.12   pH-meter z natančnostjo do 0,1 pH-enot

5.13   HPLC-oprema

5.13.1   Gradientni sistem črpalk z možnostjo delovanja pri pretoku 1,0 ml/min pri 200 barih

5.13.2   Avtomatski vzorčevalnik z možnostjo izvajanja derivatizacije

5.13.3   Grelnik kolone, ki lahko temperaturo ohranja na 30 °C ± 1 °C

5.13.4   Fluorescenčni detektor z valovno dolžino vzbujanja 330 nm in valovno dolžino emisije 440 nm

5.13.5   Integrator ali programska oprema za obdelavo podatkov, ki lahko meri površino vrha

5.13.6   Kolona LiChrospher ® – 100 (250 × 4,6 mm) ali enakovredna kolona, polnjena z oktadecilsilanom (C 18), velikost delcev 5 μm

6.   VZORČENJE

Vzorčenje mora biti izvedeno v skladu s standardom ISO 707.

7.   POSTOPEK

7.1   Priprava raztopine internega standarda

7.1.1   Natehtajte 30,0 ± 0,1 mg triptamin-monohidroklorida (4.2.3) v 100-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1).

7.1.2   Odpipetirajte 1 ml (5.3) te raztopine v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1), da dobite raztopino s koncentracijo 0,15 mM triptamina.

7.2   Priprava raztopine preskusnega vzorca

7.2.1   Odtehtajte 1,000 ± 0,001 g vzorca posnetega mleka v prahu v 25-mililitrsko čašo (5.2). S pipeto (5.3) dodajte 10 ml destilirane vode pri 40 °C ± 1 °C in mešajte 30 minut z magnetnim mešalnikom (5.4), da raztopite morebitne grudice.

7.2.2   Odpipetirajte 0,2 ml (5.5) rekonstruiranega vzorca mleka v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6), dodajte 100 μl 0,15 mM raztopine triptamina (7.1) z brizgalko (5.7) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Previdno zmešajte z obračanjem bučke in postavite v ultrazvočno kopel (5.8) za 15 min.

7.2.3   Centrifugirajte (5.9) 10 minut pri 27 000 × g in zberite bistro tekočino v stekleno vialo (5.10).

Opomba: Raztopino preskusnega vzorca je treba do HPLC-analize hraniti pri 4 °C.

7.3   Priprava raztopine eksternega standarda

7.3.1   Odtehtajte 55,4 mg PEDP (4.1) v 50-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dodajte z merilnim valjem (5.11) približno 25 ml kloroforma (4.2.2). Zaprto bučko segrejte do 50 °C ± 1 °C in previdno premešajte, da se PEDP raztopi. Ohladite bučko na 20 °C in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1) ter zmešajte z obračanjem.

7.3.2   Odpipetirajte 1 ml (5.3) te raztopine v 100-mililitrsko merilno bučko (5.6) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Odpipetirajte 1 ml (5.3) te raztopine v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6), dodajte 100 μl (5.7) 0,15 mM raztopine triptamina (7.1) in dopolnite do oznake z metanolom (4.2.1). Zmešajte z obračanjem bučke.

Opomba: Raztopino referenčnega vzorca je treba do HPLC-analize hraniti pri 4 °C.

7.4   Priprava reagenta za derivatizacijo

Odtehtajte 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4) v 10-mililitrsko merilno bučko (5.6), dodajte 0,5 ml (5.5) metanola (4.2.1) in previdno premešajte, da se OPA raztopi. Dopolnite do oznake z raztopino borove kisline (4.3.2) in dodajte z brizgalko (5.7) 20 μl 2-merkaptoetanola (4.3.3).

Opomba: Reagent za derivatizacijo je treba hraniti v temni viali pri 4 °C in je stabilen en teden.

7.5   HPLC-določitev

7.5.1   Topila (eluenti) (4.4)

Topilo A: 0,3 mM raztopina natrijevega dihidrogen fosfata in 3 mM natrijevega acetata (pH uravnan na 6,5 ± 0,1 z ocetno kislino): metanol: tetrahidrofuran = 558:440:2 (v/v/v)

Topilo B: metanol

7.5.2   Predlagani elucijski gradient

Čas (min)	Topilo A (%)	Topilo B (%)	Pretok (ml/min)
Začetek	40	60	0
0,1	40	60	0,1
5,0	40	60	0,1
6,0	40	60	1,0
6,5	40	60	1,0
9,0	36	64	1,0
10,0	20	80	1,0
11,5	16	84	1,0
12,0	16	84	1,0
16,0	10	90	1,0
19,0	0	100	1,0
20,0	0	100	1,0
21,0	40	60	1,0
29,0	40	60	1,0
30,0	40	60	0

Opomba: Elucijski gradient je morda treba rahlo spremeniti, da bi dobili ločljivost, kakor je prikazana na sliki 1.

Temperatura kolone: 30 °C.

7.5.3   Prostornina vbrizganja: 50 μl reagenta za derivatizacijo in 50 μl raztopine vzorca

7.5.4   Vzpostavitev ravnotežja v koloni

Če se sistem začne dnevno, se kolona spira 15 minut s 100-odstotnim topilom B, potem nastavi A:B = 40:60 in 15 minut vzpostavlja ravnotežje pri pretoku 1 ml/min. Slepa določitev se izvede z vbrizganjem metanola (4.2.1).

Opomba: Pred daljšim hranjenjem je treba kolono spirati 30 minut z mešanico metanol: kloroform = 80:20 (v/v).

7.5.5   Določitev vsebnosti PS + PE v preskusnem vzorcu

7.5.6   Izvedite zaporedje kromatografskih analiz s konstantnim časom med dvema analizama, da s tem zagotovite konstanten retenzijski čas. Vsakih 5–10 preskusnih vzorcev vbrizgajte raztopino eksternega standarda (7.3) za ovrednotenje odzivnega faktorja

Opomba: Na vsakih 20–25 analiz se kolona očisti, tako da se najmanj 30 minut spira s 100-odstotnim topilom B (7.5.1).

7.6   Način integracije

7.6.1   Vrh PEDP

Vrh PEDP se pojavi samostojno. Njegova površina se določi z integracijo dolina–dolina.

7.6.2   Vrh triptamina

Vrh triptamina se pojavi samostojno (slika 1). Njegova površina se določi z integracijo dolina–dolina.

7.6.3   Skupine vrhov PS in PE

Pri opisanih pogojih (slika 1) se PS eluira v obliki dveh delno neločenih vrhov, pred katerima je še en manjši vrh. PE se eluira v obliki treh glavnih delno neločenih vrhov. Površina vsake skupine vrhov se določi z nastavitvijo bazne linije, kakor je prikazano na sliki 1.

8.   IZRAČUN IN IRAŽANJE REZULTATOV

Vsebnost PS in PE v preskusnem vzorcu se izračuna, kakor sledi:

C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2))

kjer je:

C	=	vsebnost PS ali PE (v mg/100 g prahu) v preskusnem vzorcu
A1	=	površina vrha PEDP raztopine standardnega vzorca (7.3)
A2	=	površina vrha PS ali PE raztopine preskusnega vzorca (7.2)
T1	=	površina vrha triptamina v raztopini standardnega vzorca (7.3)
T2	=	površina vrha triptamina v raztopini preskusnega vzorca (7.2)

9.   TOČNOST METODE

Opomba: Vrednosti za ponovljivost so bile izračunane v skladu z mednarodnim standardom IDF (*).

9.1   Ponovljivost

Relativni standardni odmik ponovljivosti, izražajoč variabilnost neodvisnih analitskih rezultatov, ki jih dobi isti analitik z isto opremo pri enakih pogojih na istem preskusnem vzorcu v kratkem časovnem intervalu, ne sme presegati vrednosti 2 % relativno. Če sta dve določitvi pridobljeni pri teh pogojih, relativna razlika med dvema rezultatoma ne sme biti večja od 6 % aritmetične sredine teh rezultatov.

9.2   Obnovljivost

Če sta dve določitvi pridobljeni v različnih laboratorijih z različno opremo pri različnih pogojih analize na enakem preskusnem vzorcu, relativna razlika med dvema rezultatoma ne sme biti večja od 11 % aritmetične sredine teh rezultatov.

10.   VIRI

10.1   Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., „Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids.“ Sci. Tech. Latt.-Cas., 39, 395(1988).

Slika 1

HPLC vzorec derivatov o-ftaldialdehida (OPA), fosfatidilserina (PS) in fosfatidiletanolamina (PE) v ekstraktu metanola rekonstruiranega posnetega mleka v prahu. Prikazan je način integracije vrhov PS, PE in triptamina (interni standard)

Dodatek II

ZAZNAVANJE SLADKE SIROTKE V POSNETEM MLEKU V PRAHU ZA JAVNO SKLADIŠČENJE Z DOLOČITVIJO MAKROPEPTIDOV KAZEINA S TEKOČINSKO KROMATOGRAFIJO VISOKE ZMOGLJIVOSTI (HPLC)

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Ta metoda omogoča zaznavanje sladke sirotke v posnetem mleku v prahu, ki je namenjeno javnemu skladiščenju, z ugotavljanjem makropeptidov kazeina.

2.   SKLIC

Mednarodni standard ISO 707 – Mleko in mlečni proizvodi – Smernice o vzorčenju

3.   OPREDELITEV

Vsebnost trdnih snovi sladke sirotke je opredeljena kot masni odstotek, ki se določi z vsebnostjo makropeptidov kazeina v skladu z opisanim postopkom.

4.   PRINCIP

—	Rekonstitucija posnetega mleka v prahu, odstranitev maščob in beljakovin s trikloroocetno kislino, ki ji sledi centrifugacija ali filtracija.

—	Določitev količine makropeptidov kazeina (CMP) v supernatantu se izvede s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC).

—	Ocenjevanje rezultatov, dobljenih za vzorce, glede na standardne vzorce posnetega mleka v prahu z dodatkom znanega odstotka sirotke v prahu ali brez njega.

5.   REAGENTI

Vsi reagenti dosegajo priznano analitsko čistost. Uporabljena voda je destilirana voda ali voda vsaj enakovredne čistosti.

5.1   Raztopina trikloroocetne kisline

Raztopite 240 g trikloroocetne kisline (CCl3COOH) v vodi in dopolnite do prostornine 1 000 ml. Raztopina mora biti bistra in brezbarvna.

5.2   Raztopina eluenta, pH 6,0

Raztopite 1,74 g dikalijevega hidrogen fosfata (K2HPO4), 12,37 g kalijevega dihidrogen fosfata (KH2PO4) in 21,41 g natrijevega sulfata (Na2SO4) v približno 700 ml vode. Če je potrebno, uravnajte pH na vrednost 6,0 z uporabo raztopin fosforjeve kisline ali kalijevega hidroksida.

Dopolnite z vodo do 1 000 ml in homogenizirajte.

Opomba: Sestava eluenta se lahko posodobi tako, da ustreza spričevalu v skladu s standardi ali priporočili proizvajalca materiala za polnitev kolone.

Raztopino eluenta pred uporabo filtrirajte skozi membranski filter s premerom por 0,45 μm.

5.3   Raztopina za izpiranje

Zmešajte eno volumsko enoto acetonitrila (CH3CN) z devetimi volumskimi enotami vode. Pred uporabo filtrirajte zmes z membranskimi filtrom s premerom por 0,45 μm.

Opomba: Uporabi se lahko katera koli druga raztopina za izpiranje z baktericidnim učinkom, ki ne poslabša ločljivosti kolone.

5.4   Standardni vzorci

5.4.1   Posneto mleko v prahu, ki ustreza zahtevam te uredbe (npr. [0])

5.4.2   Enako posneto mleko v prahu z dodatkom 5 % (m/m) sladke sirotke v prahu s standardno sestavo (tj. [5]).

6.   OPREMA

6.1   Analitska tehtnica

6.2   Neobvezna centrifuga, ki lahko razvije centrifugalno silo 2 200 g, z epruvetami za centrifugiranje z zamaški ali pokrovčki s prostornino približno 50 ml

6.3   Mehanični stresalnik

6.4   Magnetni mešalnik

6.5   Stekleni lijaki s premerom približno 7 cm

6.6   Filtrirni papir, srednje porozen, s premerom približno 12,5 cm

6.7   Oprema za filtriranje iz stekla s premerom por membranskega filtra 0,45 μm

6.8   Graduirana pipeta, ki prepušča 10 ml (ISO 648, razred A, ali ISO/R 835) ali razdelilni sistem, ki lahko prepušča 10,0 ml v dveh minutah

6.9   Razdelilni sistem, ki lahko prepušča 20,0 ml vode pri pribl. 50 °C

6.10   Termostatska vodna kopel, nastavljena na 25 ± 0,5 °C

6.11   HPLC-oprema, ki jo sestavljajo:

6.11.1

Črpalka

6.11.2

Ročni ali avtomatski injektor s prostornino 15 do 30 μl

6.11.3

Dve serijski koloni TSK 2 000-SW (dolžina 30 cm, notranji premer 0,75 cm) ali istovrstni koloni (tj. enojna TSK 2 000-SWxl, enojna Agilent Technologies Zorbax GF 250) in predkolona (3 cm × 0,3 cm), polnjena z I 125 ali enako učinkovitim materialom

6.11.4

Termostatski grelnik kolone, nastavljen na 35 ± 1 °C

6.11.5

UV-detektor z nastavljivo valovno dolžino z možnostjo merjenja pri 205 nm z občutljivostjo 0,008 Å.

6.11.6

Integrator z integracijo dolina–dolina Opomba: Mogoče je delo s kolonami pri sobni temperaturi, vendar je njihova moč ločljivosti nekoliko manjša. V tem primeru mora biti obseg temperature manjši od ± 5 °C v kateri koli stopnji analize.

7.   VZORČENJE

7.1   Vzorci se vzamejo v skladu s postopkom, določenim v mednarodnem standardu ISO 707. Vendar lahko države članice uporabijo drugo metodo vzorčenja, če je skladna z navedenim standardom.

7.2   Vzorec hranite pri pogojih, ki izključujejo kakršno koli kvarjenje ali spremembo sestave.

8.   POSTOPEK

8.1   Priprava preskusnega vzorca

Prenesite mlečni prah v posodo z nepredušnim pokrovom s približno dvakrat večjo prostornino, kakor je prostornina prahu. Posodo takoj zaprite. Zmešajte mlečni prah s ponavljajočim obračanjem posode.

8.2   Preskusni delež

Odtehtajte 2,000 ± 0,001 g preskusnega vzorca v centrifugalno epruveto (6.2) ali ustrezno zaprto bučko (50 ml).

8.3   Odstranitev maščob in beljakovin

8.3.1   Preskusnemu deležu dodajte 20,0 ml tople vode (50 °C). Raztopite prah s petminutnim stresanjem na mehaničnem stresalniku (6.3). Postavite epruveto v vodno kopel (6.10) in pustite, da se temperatura uravna na 25 °C.

8.3.2   V dveh minutah dodajte 10,0 ml raztopine trikloroocetne kisline (5.1) s temperaturo približno 25 °C in pri tem intenzivno mešajte z magnetnim mešalnikom (6.4). Postavite epruveto v vodno kopel (6.10) in pustite 60 minut.

8.3.3   Centrifugirajte (6.2) 10 minut pri 2 200 g ali filtrirajte skozi filter (6.6) in zavrzite prvih 5 ml filtrata.

8.4   Kromatografsko določanje

8.4.1   Vbrizgajte 15 do 30 μl natančno odmerjenega supernatanta ali filtrata (8.3.3) v HPLC-opremo (6.11), ki deluje s pretokom 1,0 ml raztopine eluenta (5.2) na minuto.

Opomba 1: Uporabiti je mogoče tudi drugačen pretok, odvisno od notranjega premera kolon, ki so uporabljene, ali navodil proizvajalca kolon.

Opomba 2: Med vsako prekinitvijo sperite kolone z vodo. Nikoli ne pustite v njih raztopine eluenta (5.2).

Pred kakršno koli prekinitvijo, ki traja več kot 24 ur, spirajte kolone z vodo in nato z raztopino (5.3) pri pretoku 0,2 ml na minuto najmanj tri ure.

8.4.2   Rezultati kromatografske analize preskusnega vzorca [E] so dobljeni v obliki kromatogramov, pri katerih je vsak vrh opredeljen z retenzijskim časom RT, kakor sledi:

Vrh II:	Drugi vrh kromatograma z retenzijskim časom približno 12,5 minute.
Vrh III:	Tretji vrh kromatograma, ki ustreza CMP z retenzijskim časom približno 15,5 minute.

Izbira kolon(-e) lahko bistveno vpliva na retenzijski čas posameznih vrhov.

Integrator (6.11.6) samodejno izračuna površino A vsakega vrha:

AII:	površina vrha II
AIII:	površina vrha III

Pred kvantitativno interpretacijo je treba pregledati videz vsakega kromatograma, da bi tako lahko izsledili kakršne koli nepravilnosti kot posledice slabega delovanja bodisi kromatografa ali kolon ali pa kot posledico izvora in narave analiziranega vzorca.

V primeru dvoma analizo ponovite.

8.5   Kalibracija

8.5.1   Za standardne vzorce (5.4) uporabite postopek, opisan od točke 8.2 do točke 8.4.2.

Uporabite sveže pripravljene raztopine, ker se CMP razgradi v 8-odstotnem trikloroocetnem okolju. Izguba je ocenjena na 0,2 % na uro pri 30 °C.

8.5.2   Pred kromatografskim določanjem vzorcev pripravite kolone s ponavljajočim vbrizgavanjem standardnega vzorca (5.4.2) v raztopino (8.5.1), dokler nista površina in retenzijski čas vrha, ki ustreza CMP, stalna.

8.5.3   Z vbrizganjem enake prostornine filtrata (8.5.1), kakor je uporabljen pri vzorcih, določite odzivne faktorje R.

9.   IZRAŽANJE REZULTATOV

9.1   Metoda za izračun in enačbe

9.1.1   Izračun odzivnih faktorjev R:

Vrh II:

RII = 100/(AII[0])

kjer je:

RII	=	odzivni faktorji vrhov II,
AII [0]	=	površine vrhov II standardnega vzorca [0], pridobljene v 8.5.3.

Vrh III:

RIII = W/(AIII[5] - AIII[0])

kjer je:

RIII	=	odzivni faktor vrha III,
AIII [0] in AIII [5]	=	površine vrha III standardnega vzorca [0] in [5], pridobljene v 8.5.3,
W	=	količina sirotke v standardnem vzorcu [5], tj. 5.

9.1.2   Izračun relativnih površin vrhov vzorca [E]

SII[E] = RII × AII[E]

SIII[E] = RIII × AIII[E]

SIV[E] = RIV × AIV[E]

kjer je:

SII [E], SIII [E], SIV [E]	=	relativne površine vrhov II, III in IV v vzorcu [E],
AII [E], AIII [E]	=	površine vrhov II in III v vzorcu [E], pridobljene v 8.4.2,
RII, RIII	=	odzivni faktorji, izračunani v 9.1.1.

9.1.3   Izračun relativnega retenzijskega časa vrha III v vzorcu [E]:

RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])

kjer je:

RRTIII [E]	=	relativni retenzijski čas vrha III v vzorcu [E],
RTIII [E]	=	retenzijski čas vrha III v vzorcu [E], pridobljen v 8.4.2,
RTIII [5]	=	retenzijski čas vrha III v kontrolnem vzorcu [5], pridobljen v 8.5.3.

9.1.4   Preskusi so pokazali, da obstaja linearna povezava med relativnim retenzijskim časom vrha III, npr. RRTIII [E], in odstotkom dodane sirotke v prahu do 10 %

—	RRTIII [E] je < 1,000, ko je vsebnost sirotke > 5 %,

—	RRTIII [E] je ≥ 1,000, ko je vsebnost sirotke ≤ 5 %.

Dovoljena negotovost za vrednosti RRTIII je ± 0,002.

Običajno se vrednost RRTIII [0] giblje malo okoli 1,034. Odvisno od stanja kolon se vrednost lahko približa 1,000, ampak mora biti vedno večja od 1,000.

9.2   Izračun deleža sladke sirotke v prahu v vzorcu:

W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)]

kjer je:

W	=	odstotek m/m sladke sirotke v vzorcu [E];
SIII [E]	=	relativna površina vrha III preskusnega vzorca [E], pridobljena v 9.1.2;
1,3	=	predstavlja relativno povprečno površino vrha III, izraženo v gramih sladke sirotke na 100 g določene v posnetem mleku v prahu brez primesi različnega izvora. Ta podatek je bil pridobljen eksperimentalno;
SIII [0]	=	predstavlja relativno površino vrha III, ki je enaka RIII × AIII [0]. Te vrednosti so pridobljene v 9.1.1 in 8.5.3;
(SIII [0] – 0,9)	=	predstavlja popravek za relativno povprečno površino 1,3, ko SIII [0] ni enako 0,9. Eksperimentalno je relativna povprečna površina vrha III kontrolnega vzorca [0] 0,9.

9.3   Zanesljivost postopka

9.3.1   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju izvede simultano ali po kratkem času isti analitik z isto opremo in na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,2 % m/m.

9.3.2   Obnovljivost

Razlika med dvema posamičnima in neodvisnima rezultatoma, dobljenima v dveh različnih laboratorijih na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,4 % m/m.

9.4   Interpretacija

9.4.1   Če je relativna površina vrha III, SIII [E], izražena v gramih sladke sirotke na 100 g proizvoda ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9), je treba zanikati obstoj sirotke,

kjer je:

2,0	največja dovoljena vrednost relativne površine vrha III ob upoštevanju relativne povprečne površine vrha III, npr. 1,3, negotovosti zaradi sprememb v sestavi posnetega mleka v prahu in obnovljivosti metode (9.3.2);
(SIII [0] – 0,9)	popravek, ki ga je treba upoštevati, ko se površina SIII [0] razlikuje od 0,9 (glej točko 9.2).

9.4.2   Če je relativna površina vrha III, SIII [E] > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) in relativna površina vrha II, SII [E] ≤ 160, določite vsebnost sladke sirotke, kot je navedeno v točki 9.2.

9.4.3   Če je relativna površina vrha III, SIII [E] > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) in relativna površina vrha II, SII [E] ≤ 160, določite vsebnost skupnih beljakovin (P %); nato preučite grafa 1 in 2.

9.4.3.1   Podatki, dobljeni po analizi nepotvorjenih vzorcev posnetega mleka v prahu z visoko vsebnostjo skupnih beljakovin, so zbrani v grafih 1 in 2.

Neprekinjena črta predstavlja linearno regresijo, katere koeficienti so izračunani z metodo najmanjših kvadratov.

Prekinjena ravna črta označuje zgornjo mejo relativne površine vrha III z verjetnostjo, da v 90 % primerov ni presežena.

Enačbi prekinjenih ravnih črt v grafih 1 in 2 sta:

SIII = 0,376 P % – 10,7	(graf 1),
SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93	(graf 2),

kjer je:

SIII	relativna površina vrha III, izračunana bodisi v skladu z vsebnostjo skupnih beljakovin bodisi v skladu z relativno površino vrha SII [E],
P %	vsebnost skupnih beljakovin, izražena v masnih odstotkih,
SII [E]	relativna površina vzorca, izračunana v točki 9.1.2.

Te enačbe so enakovredne vrednosti 1,3, navedeni v točki 9.2.

Odstopanje (T1 in T2) med relativno površino SIII [E] in relativno površino SIII je prikazano z naslednjimi vrednostmi: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% - 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)]

Če je T1 in/ali T2	nič ali manj, prisotnosti sladke sirotke ni mogoče določiti.
Če sta T1 in T2	večji kot nič, je sladka sirotka prisotna.

Vsebnost sladke sirotke se izračuna v skladu z naslednjo enačbo: W = T2 + 0,91

kjer je:

0,91 razdalja navpičnih osi med neprekinjenimi in pikčastimi ravnimi črtami.

Dodatek III

DOLOČANJE TRDNIH SNOVI SLADKE SIROTKE V POSNETEM MLEKU V PRAHU

1.   NAMEN: ZAZNAVANJE DODATKA TRDNIH SNOVI SLADKE SIROTKE K POSNETEMU MLEKU V PRAHU

2.   SKLICI: MEDNARODNI STANDARD ISO 707

3.   OPREDELITEV

Vsebnost trdnih snovi sladke sirotke je opredeljena kot masni odstotek, ki se določi z vsebnostjo makropeptidov kazeina v skladu z opisanim postopkom.

4.   PRINCIP

Pri vzorcih se analizira vsebnost makropeptida kazeina A s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z reverzno fazo (HPLC-postopek). Rezultati se ocenijo glede na standardne vzorce posnetega mleka v prahu z znanim deležem in brez znanega deleža sirotke v prahu. Rezultati, ki presegajo 1 % masnega deleža, kažejo na prisotnost trdnih snovi sladke sirotke.

5.   REAGENTI

Vsi reagenti dosegajo priznano analitsko čistost. Uporabljena voda je destilirana voda ali voda vsaj enakovredne čistosti. Kakovost acetonitrila mora biti primerna za spektroskop ali HPLC.

5.1   Raztopina trikloroocetne kisline

Raztopite 240 g trikloroocetne kisline (CCl3COOH) v vodi in dopolnite do prostornine 1 000 ml. Raztopina mora biti bistra in brezbarvna.

5.2   Eluenta A in B

Eluent A: V 1 000-mililitrsko merilno bučko dodajte 150 ml acetonitrila (CH3CN), 20 ml izopropanola (CH3CHOHCH3) in 1,00 ml trifluoroocetne kisline (TFA, CF3COOH). Dopolnite z vodo do 1 000 ml.

Eluent B: V 1 000-mililitrsko merilno bučko dodajte 550 ml acetonitrila, 20 ml izopropanola in 1,00 ml TFA. Dopolnite z vodo do 1 000 ml. Raztopino eluenta pred uporabo filtrirajte skozi membranski filter s premerom por 0,45 μm.

5.3   Shranitev kolone

Po analizi kolono sperete z eluentom B (gradientno) in potem še z acetonitrilom (gradientno v 30 minutah.). Kolona se shrani v acetonitrilu.

5.4   Standardni vzorci

5.4.1   Posneto mleko v prahu, ki ustreza zahtevam za javno skladiščenje (npr. [0]).

5.4.2   Enako posneto mleko v prahu z dodatkom 5 % (m/m) sladke sirotke v prahu s standardno sestavo (tj. [5]).

5.4.3   Enako posneto mleko v prahu z dodatkom 50 % (m/m) sladke sirotke v prahu s standardno sestavo (tj. [50]).

6.   OPREMA

6.1   Analitska tehtnica

6.2   Neobvezna centrifuga, ki lahko razvije centrifugalno silo 2 200 g, z epruvetami za centrifugiranje z zamaški ali pokrovčki s prostornino približno 50 ml

6.3   Mehanični stresalnik

6.4   Magnetni mešalnik

6.5   Stekleni lijaki s premerom približno 7 cm

6.6   Filtrirni papir, srednje porozen, s premerom približno 12,5 cm

6.7   Oprema za filtriranje iz stekla s premerom por membranskega filtra 0,45 μm

6.8   Graduirana pipeta, ki prepušča 10 ml (ISO 648, razred A, ali ISO/R 835) ali razdelilni sistem, ki lahko prepušča 10,0 ml v dveh minutah

6.9   Razdelilni sistem, ki lahko prepušča 20,0 ml vode pri pribl. 50 °C

6.10   Termostatska vodna kopel, nastavljena na 25 ± 0,5 °C

6.11   HPLC-oprema, ki jo sestavljajo:

6.11.1

Binarni gradientni sistem črpalk

6.11.2

Ročni ali avtomatski injektor s prostornino 100 μl

6.11.3

Kolona Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (dolžina 25 cm, notranji premer 0,46 cm) ali enakovredna silicijeva kolona s širokimi porami za reverzno kromatografijo

6.11.4

Termostatiran grelnik kolone, nastavljen na 35 ± 1 °C

6.11.5

UV-detektor z nastavljivo valovno dolžino in z možnostjo merjenja pri 210 nm (če je potrebno, se lahko uporabi višja valovna dolžina do 220 nm) z občutljivostjo 0,02 Å

6.11.6

Integrator, ki lahko določi integracijo na splošni bazni liniji ali dolina–dolina Opomba: Delo s kolonami je mogoče tudi pri sobni temperaturi, če temperatura niha manj kot ± 1 °C, sicer nastane preveliko nihanje retenzijskega časa CMPA.

7.   VZORČENJE

7.1   Vzorci se vzamejo v skladu s postopkom, določenim v mednarodnem standardu ISO 707. Vendar lahko države članice uporabijo drugo metodo vzorčenja, če je skladna z navedenim standardom.

7.2   Vzorec hranite pri pogojih, ki izključujejo kakršno koli kvarjenje ali spremembo sestave.

8.   POSTOPEK

8.1   Priprava preskusnega vzorca

Prenesite mlečni prah v posodo z nepredušnim pokrovom s približno dvakrat večjo prostornino, kakor je prostornina prahu. Posodo takoj zaprite. Zmešajte mlečni prah s ponavljajočim obračanjem posode.

8.2   Preskusni delež

Odtehtajte 2,00 ± 0,001 g preskusnega vzorca v epruveto za centrifugiranje (6.2) ali ustrezno zaprto bučko (50 ml).

Opomba: V primeru mešanic odtehtajte takšno količino preskusnega vzorca, da razmaščeni vzorec deleža ustreza 2,00 g.

8.3   Odstranitev maščob in beljakovin

8.3.1   Preskusnemu deležu dodajte 20,0 ml tople vode (50 °C). Raztopite prah s petminutnim stresanjem na mehaničnem stresalniku (6.3). Postavite epruveto v vodno kopel (6.10) in pustite, da se temperatura uravna na 25 °C.

8.3.2   V dveh minutah dodajte 10,0 ml raztopine triklorocetne kisline s temperaturo približno 25 °C (5.1) in pri tem intenzivno mešajte z magnetnim mešalnikom (6.4). Postavite epruveto v vodno kopel (6.10) in pustite 60 minut.

8.3.3   Centrifugirajte (6.2) 10 minut pri 2 200 g ali filtrirajte skozi filter (6.6) in zavrzite prvih 5 ml filtrata.

8.4   Kromatografsko določanje

8.4.1   Metoda HPLC na reverzni fazi izključuje možnost lažno pozitivnih rezultatov zaradi prisotnosti kislega pinjenca v prahu.

8.4.2   Pred izvedbo HPLC-analize na reverzni fazi je treba optimizirati gradientne pogoje. Retenzijski čas CMPA 26 ± 2 minuti je optimalen za gradientne sisteme z mrtvo prostornino približno 6 ml (prostornina od točke, na kateri pridejo skupaj topila, do vključno s prostornino injekcijske zanke). Gradientni sistemi z manjšo mrtvo prostornino (npr. 2 ml) naj uporabijo 22 minut kot optimalen retenzijski čas.

Odvzem raztopine standardnih vzorcev (5.4) brez sladke sirotke in s 50 % sladke sirotke.

Vbrizgajte 100 μl supernatanta ali filtrata (8.3.3) v instrument HPLC, ki deluje pri predlaganih gradientnih pogojih, danih v tabeli 1.

Tabela 1

Predlagani gradientni pogoji za optimizacijo kromatografije

Čas (minute)	Pretok (ml/min)	% A	% B	Krivulja
Začetek	1,0	90	10	*
27	1,0	60	40	linearna
32	1,0	10	90	linearna
37	1,0	10	90	linearna
42	1,0	90	10	linearna

Iz primerjave dveh kromatogramov se razbere lokacija vrha CMPΑ.

Po navedeni enačbi se lahko izračuna sestava začetnega topila, ki se uporabi za normalni gradient (glej 8.4.3): % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*1,11,

kjer je:

RTcmpA	:	retenzijski čas CMPΑ v predlaganem gradientu
10	:	začetni % B v predlaganem gradientu
2,5	:	% B na sredini minus % B na začetku normalnega gradienta
13,5	:	srednji čas predlaganega gradienta
26	:	zahtevani retenzijski čas CMPΑ
6	:	razmerje naklonov predlaganega in normalnega gradienta
30	:	% B na začetku minus % B pri 27 minutah predlaganega gradienta
27	:	celotni čas predlaganega gradienta.

8.4.3   Odvzem raztopin preskusnih vzorcev

Vbrizgajte 100 μl natančno odmerjenega supernatanta ali filtrata (8.3.3) v instrument HPLC, ki deluje pri pretoku 1,0 ml raztopine eluenta (5.2) na minuto.

Sestavo eluenta na začetku analize dobite iz 8.4.2. Ponavadi je blizu A:B = 76:24 (5.2). Takoj po vbrizgavanju se vklopi linearni gradient, ki ima po 27 minutah za 5 % višji delež B. Nato se vklopi linearni gradient, ki v petih minutah spremeni sestavo eluenta na 90 % B. Ta sestava se ohrani pet minut, potem pa se prek linearnega gradienta v petih minutah spremeni v začetno sestavo. Odvisno od notranje prostornine sistema črpalk lahko naslednje vbrizgavanje sledi 15 minut zatem, ko dosežete začetno sestavo.

Opomba 1: Retenzijski čas CMPA je 26 ± 2 minuti. To je mogoče doseči s spreminjanjem začetnih in končnih pogojev prvega gradienta. Vendar mora razlika % B pri začetnih in končnih pogojih prvega gradienta ostati 5 % B.

Opomba 2: Eluente je treba primerno razpliniti in morajo ostati razplinjeni. To je nujno za pravilno delovanje gradientnega sistema črpalk. Standardni odmik retenzijskega časa CMPA vrha naj bo manjši od 0,1 minute (n = 10).

Opomba 3: Vsakih pet vzorcev je treba vbrizgati referenčni vzorec [5] in ga uporabiti za izračun novega odzivnega faktorja R (9.1.1).

8.4.4   Rezultati kromatografske analize preskusnega vzorca (E) so dobljeni v obliki kromatograma, v katerem je vrh CMPA prepoznan z retenzijskim časom približno 26 minut.

Integrator (6.11.6) samodejno izračuna višino vrha H vrha CMPA. Na vsakem kromatogramu je treba preveriti položaj bazne linije. Analizo ali integracijo je treba ponoviti, če je bazna linija nepravilno določena.

Opomba: Če je vrh CMPA dovolj ločen od drugih vrhov, je treba uporabiti bazno linijo dolina–dolina, v nasprotnem primeru uporabite padajoče navpičnice za splošno bazno linijo, ki mora imeti izhodišče blizu vrha CMPA (torej ne pri t = 0 min!).Za standard in vzorec uporabite enako vrsto integracije in v primeru splošne bazne linije preverite skladnost vrste za vzorce in standard.

Pred kvantitativno interpretacijo je treba pregledati videz vsakega kromatograma, da bi tako lahko izsledili kakršne koli nepravilnosti kot posledice slabega delovanja bodisi kromatografa ali kolone ali pa kot posledico izvora in narave analiziranega vzorca. V primeru dvoma analizo ponovite.

8.5   Kalibracija

8.5.1   Za standardne vzorce uporabite postopek, opisan od točke 8.2 do točke 8.4.4 (od 5.4.1 do 5.4.2). Uporabite sveže pripravljene raztopine, ker se CMP razgradi v 8-odstotni triklorocetni kislini pri sobni temperaturi. Pri 4 °C ostane raztopina stabilna 24 ur. Pri veliki seriji analiz je zaželena uporaba hlajenega pladnja za vzorce v avtomatskem injektorju.

Opomba: Točko 8.4.2 je mogoče izpustiti, če je % B pri začetnih pogojih znan iz prejšnjih analiz.

Kromatogram referenčnega vzorca [5] mora biti analogen sliki 1. Na tej sliki sta pred vrhom CMPA dva majhna vrhova. Nujno je, da dobite podobno ločevanje.

8.5.2   Pred kromatografskim določanjem vzorcev vbrizgajte 100 μl standardnega vzorca brez sladke sirotke [0] (5.4.1).

Kromatogram ne sme imeti vrha pri retenzijskem času vrha CMPA.

8.5.3   Z vbrizganjem enake prostornine filtrata (8.5.1), kakor je uporabljen pri vzorcih, določite odzivne faktorje R.

9.   IZRAŽANJE REZULTATOV

9.1   Metoda za izračun in enačbe

9.1.1   Izračun odzivnega faktorja R:

vrh CMPA: R = W/H,

kjer je:

R	=	R odzivni faktor vrha CMPA,
H	=	višina vrha CMPA,
W	=	količina sirotke v standardnem vzorcu [5].

9.2   Izračun deleža sladke sirotke v prahu v vzorcu

W(E) = R × H(E)

kjer je:

W(E)	=	odstotek (m/m) sladke sirotke v vzorcu (E);
R	=	odzivni faktor vrha CMPA (9.1.1)
H(E)	=	višina vrha CMPA iz vzorca (E)

Če je W(E) večji od 1 % in razlika med retenzijskim časom pri vzorcu in standardnem vzorcu [5] manjša od 0,2 minute, potem je trdna snov sladke sirotke prisotna.

9.3   Zanesljivost postopka

9.3.1   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh določitev, ki ju izvede simultano ali po kratkem času isti analitik z isto opremo in na enakem preskusnem materialu, ne sme presegati 0,2 % m/m.

9.3.2   Obnovljivost

Ni določena.

9.3.3   Linearnost

Linearno zvezo s korelacijskim koeficientom > 0,99 je treba dobiti v območju od 0 do 16 % sladke sirotke.

9.4   Interpretacija

Meja 1 % vključuje negotovost zaradi obnovljivosti.

Slika 1

Ni – standard 4.6

PRILOGA VI

Metode za analizo masla za zasebno skladiščenje

Parameter	Metoda
Maščoba (6)	ISO 17189 ali ISO 3727, del 3
Voda	ISO 3727, del 1
Nemastna trdna snov (razen soli)	ISO 3727, del 2
Sol	ISO 15648

PRILOGA VII

Metode za analizo posnetega mleka v prahu za zasebno skladiščenje

Parameter	Metoda
Maščoba	ISO 1736
Beljakovine	ISO 8968, del 1
Voda	ISO 5537

PRILOGA VIII

Metode za analizo sira za zasebno skladiščenje

1.

Za zagotovitev, da sir, izdelan izključno iz ovčjega, kozjega ali bivoličjega mleka ali iz mešanice ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka, dejansko ne vsebuje kazeina kravjega mleka, se uporablja analitska metoda iz dodatka. Če je vsebnost kazeina kravjega mleka v analiziranem vzorcu enaka ali višja od vsebnosti v referenčnem vzorcu, ki vsebuje 1 % kravjega mleka, kakor je opisano v dodatku, se šteje, da je kazein kravjega mleka prisoten.

2.

Metode za zaznavanje kazeina kravjega mleka v siru, kakor je navedeno v odstavku 1, se lahko uporabijo, če: (a) je meja zaznavnosti največ 0,5 % in (b) ni napačnih pozitivnih rezultatov ter (c) se kazein kravjega mleka lahko zazna z zahtevano občutljivostjo tudi po daljših obdobjih zorenja, do česar lahko pride v običajnih trgovinskih pogojih. Če katera od navedenih zahtev ni izpolnjena, se uporabijo referenčne metode iz dodatka.

Dodatek

METODA ZA ZAZNAVANJE KRAVJEGA MLEKA IN KAZEINATA V SIRIH IZ OVČJEGA, KOZJEGA ALI BIVOLIČJEGA MLEKA ALI MEŠANIC OVČJEGA, KOZJEGA IN BIVOLIČJEGA MLEKA

1.   NAMEN

Zaznavanje kravjega mleka in kazeinata v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka ali mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka z izoelektričnim fokusiranjem γ-kazeinov po plazminolizi.

2.   PODROČJE UPORABE

Ta metoda je primerna za občutljivo, specifično zaznavanje surovega in toplotno obdelanega kravjega mleka in kazeinata v svežih in zorenih sirih iz ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka ter iz mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka. Ni pa primerna za zaznavanje mlečnih ali sirnih ponaredkov s toplotno obdelanimi proteinskimi koncentrati govejega sirila.

3.   PRINCIP METODE

3.1   Izolacija kazeinov iz sira in referenčni standardi

3.2   Raztopitev izoliranih kazeinov in izpostavitev v plazminsko cepitev (EC.3.4.21.7)

3.3   Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov v prisotnosti sečnine in obarvanje proteinov

3.4   Ocenjevanje obarvanih γ3 in γ2-kazeinskih profilov (dokaz kravjega mleka) s primerjavo primerka, pridobljenega iz vzorca, s primerki, pridobljenimi v istem gelu iz referenčnih standardov, ki vsebujejo 0 % in 1 % kravjega mleka.

4.   REAGENTI

Razen če ni določeno drugače, se uporabijo analitsko čiste kemikalije. Voda je dvakrat destilirana ali enakovredne čistosti.

Opomba: Naslednje podrobnosti veljajo za laboratorijsko pripravljene poliakrilamidne gele v velikosti 265 × 125 × 0,25 mm, ki vsebujejo sečnino. Če so uporabljene druge velikosti in vrste gelov, se lahko pogoji ločitve prilagodijo.

Izoelektrično fokusiranje

4.1   Reagenti za izdelavo poliakrilamidnih gelov z vsebnostjo sečnine

4.1.1   Osnovna gelska raztopina

V vodi raztopite:

4,85 g akrilamida,

0,15 g N, N′-metilen-bis-akrilamida (BIS),

48,05 g sečnine,

15,00 g glicerola (87 % w/w)

in dopolnite do 100 ml ter raztopino shranite v rjavi steklenici v hladilniku.

Opomba: Namesto navedenih določenih količin nevrotoksičnih akrilamidov se lahko uporabi tudi komercialo dostopna mešanica akrilamidne/BIS raztopine. Če taka raztopina vsebuje 30 % w/v akrilamida in 0,8 % w/v BIS, se namesto navedenih količin za pripravek vzame 16,2 ml. Rok uporabnosti raztopine je največ 10 dni. Če je njena prevodnost več kot 5 μS, raztopino deionizirajte z mešanjem 2 g amberlita MB-3 30 minut, nato filtrirajte skozi membrano 0,45 μm.

4.1.2   Gelska raztopina

Gelsko raztopino pripravite z mešanjem dodatkov, amfolitov (*) in gelske raztopine iz zaloge (glej 4.1.1).

9,0 ml osnovne gelske raztopine,

24 mg β-alanina,

500 μl amfolita pH 3,5–9,5,

250 μl amfolita pH 5-7,

250 μl amfolita pH 6-8.

Zmešajte gelsko raztopino in jo dve do tri minute razplinjajte v ultrazvočni kopeli ali vakuumu.

Opomba: Gelsko raztopino pripravite, tik preden jo nalijete (glej 6.2).

4.1.3   Katalizatorske raztopine

4.1.3.1   N, N, N′ N′ – tetrametiletilendiamin (Temed)

4.1.3.2   40 % w/v amonijev persulfat (PER):

Raztopite 800 mg PER v vodi in dopolnite do 2 ml.

Opomba: Vedno uporabite sveže pripravljeno raztopino PER.

4.2   Kontaktna tekočina

Kerozen ali tekoči parafin.

4.3   Anodna raztopina

Raztopite 5,77 g fosforjeve kisline (85 % w/w) v vodi in dopolnite do 100 ml.

4.4   Katodna raztopina

Raztopite 2,00 g natrijevega hidroksida v vodi in dopolnite do 100 ml.

Priprava vzorca

4.5   Reagent za izolacijo proteinov

4.5.1   Razredčena ocetna kislina (25,0 ml ledocetne kisline dopolnite z vodo do 100 ml).

4.5.2   Diklorometan

4.5.3   Aceton

4.6   Pufer za raztapljanje proteinov

V vodi raztopite

5,75 g glicerola (87 % w/w),

24,03 g sečnine,

250 mg ditiotreitola

in dopolnite do 50 ml.

Opomba: Hranite v hladilniku; najdaljši rok uporabnosti je en teden.

4.7   Reagenti za plazminsko cepitev kazeinov

4.7.1   Pufer amonijevega hidrogenkarbonata

Titrirajte 0,2 mol/l raztopine amonijevega hidrogenkarbonata (1,58 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l etilendiamintetraocetne kisline (EDTA, 1,46 g/100 ml) z 0,2 mol/l raztopine amonijevega karbonata (1,92 g/100 ml vode), ki vsebuje 0,05 mol/l EDTA do pH 8.

4.7.2   Goveji plazmin (EC. 3.4.21.7) z aktivnostjo najmanj 5 U/ml.

4.7.3   Raztopina ε-aminokapronske kisline za inhibiranje encimov.

Raztopite 2,624 g ε-aminokapronske kisline (6-amino-n-heksanojske kisline) v 100 ml 40 % (v/v) etanola.

4.8   Standardi

4.8.1   Certificirani referenčni standardi mešanice sesirjenega posnetega ovčjega in kozjega mleka, ki vsebuje 0 % in 1 % kravjega mleka, so na voljo na Inštitutu za referenčne materiale in meritve Komisije, 2440 Geel, Belgija.

4.8.2   Priprava laboratorijskih delovnih standardov sesirjenega bivoličjega mleka, ki vsebuje 0 % in 1 % kravjega mleka.

Posneto mleko se pripravi z 20-minutnim centrifugiranjem vzorca surovega bivoličjega mleka ali mleka goveda pri 37 °C in 2 500 g. Po hitri ohladitvi epruvete in vsebine na 6 do 8 °C se popolnoma odstrani zgornja plast maščobe. Za pripravo 1 % standarda v litrski čaši k 495 ml posnetega bivoličjega mleka dodajte 5,00 ml posnetega mleka goveda, uravnajte pH na 6,4 z dodajanjem razredčene mlečne kisline (10 % w/v). Nastavite temperaturo na 35 °C in dodajte 100 μl telečjega sirila (aktivnost sirila je 1: 10 000, pribl. 3 000 U/ml), mešajte eno minuto in nato čašo pustite eno uro pokrito z aluminijasto folijo pri 35 °C, da se naredi sirna gruda. Ko se je naredila sirna gruda, se celotno sesirjeno mleko posuši z zmrzovanjem (freeze-dry) brez predhodne homogenizacije ali odcejanja sirotke. Po tem postopku sirno grudo fino zmeljite, da dobite homogen prah. Za pripravo 0 % standarda uporabite isti postopek z naravnim posnetim bivoličjim mlekom. Standard se shrani pri – 20 °C.

Opomba: Pred pripravo standardov je priporočljivo, da se preveri čistost bivoličjega mleka z izoelektričnim fokusiranjem plazminsko obdelanih kazeinov.

Reagenti za obarvanje proteinov

4.9   Fiksir

Raztopite 150 g trikloroocetne kisline v vodi in dopolnite do 1 000 ml.

4.10   Raztopina za razbarvanje

500 ml metanola in 200 ml ledocetne kisline razredčite z destilirano vodo do 2 000 ml.

Opomba: Vsak dan pripravite svežo raztopino za razbarvanje. Lahko jo pripravite z mešanjem enakih prostornin osnovnih raztopin 50 % (v/v) metanola in 20 % (v/v) ocetne kisline.

4.11   Raztopine za obarvanje

4.11.1   Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 1)

Raztopite 3,0 g Coomassie Brillant Blue G-250 (C.I. 42655) v 1 000 ml 90 % (v/v) metanola z magnetnim mešalom (približno 45 minut), filtrirajte skozi dva srednje hitra nagubana filtra.

4.11.2   Raztopina za obarvanje (osnovna raztopina 2)

Raztopite 5,0 g bakrovega sulfata pentahidrata v 1 000 ml 20 % (v/v) ocetne kisline.

4.11.3   Raztopina za obarvanje (delovna raztopina)

Tik pred obarvanjem zmešajte skupaj 125 ml vsake osnovne raztopine (4.11.1, 4.11.2).

Opomba: Raztopino za obarvanje je treba pripraviti na dan uporabe.

5.   OPREMA

5.1   Steklene ploščice (265 × 125 × 4 mm); valjček iz gume (širine 15 cm); nivelirna miza

5.2   Nosilna folija za gel (265 × 125 mm)

5.3   Pokrivna folija (280 × 125 mm). Na vsak dolgi rob zalepite trak lepilnega traku (280 × 6 × 0,25 mm) (glej sliko 1)

5.4   Elektrofokusirna komora s hladilno ploščo (npr. 265 × 125 mm) in ustrezen vir energije (≥ 2,5 kV) ali avtomatska elektroforezna naprava

5.5   Cirkulacijski kriostat, termostatsko nadzorovan na 12 ± 0,5 °C

5.6   Centrifuga, nastavljiva do 3 000 g

5.7   Elektrodni trakovi (≥ 265 mm dolgi)

5.8   Plastične kapalke za anodne in katodne raztopine

5.9   Trakovi za nanos vzorca (10 × 5 mm, iz viskoze ali nizkoadsorpcijski filtrirni papir)

5.10   Posode iz nerjavnega jekla ali steklene posode za obarvanje in razbarvanje (npr. pladnji za instrumente 280 × 150 mm)

5.12   Prilagodljiv palični homogenizator (premer osi 10 mm), v razponu od 8 000 do 20 000 vrtljajev/minuto

5.13   Magnetni mešalnik

5.14   Ultrazvočna kopel

5.15   Varilnik folije

5.16   Mikropipete s prostornino 25 μl

5.17   Vakuumski koncentrator ali – zamrzovalni sušilnik

5.18   Termostatsko nadzorovana vodna kopel, prilagodljiva na 35 in 40 ± 1 °C, z mešalnikom

5.19   Denzitometer za odčitavanje pri λ = 634 nm

6.   POSTOPEK

6.1   Priprava vzorca

6.1.1   Izolacija kazeinov

Stehtajte količino, enakovredno 5 g suhe mase sira ali referenčnih standardov v 100-mililitrski epruveti za centrifugiranje, dodajte 60 ml destilirane vode in homogenizirajte s paličnim homogenizatorjem (8 000 do 10 000 vrt./min). Uravnajte na pH 4,6 z razredčeno ocetno kislino (4.5.1) in centrifugirajte (5 minut, 3 000 g). Odlijte maščobo in sirotko, homogenizirajte ostanek pri 20 000 vrt./min v 40 ml destilirane vode s pH 4,5, dobljenim z razredčeno ocetno kislino (4.5.1); dodajte 20 ml diklorometana (4.5.2), znova homogenizirajte in centrifugirajte (5 minut, 3 000 g). Z lopatico odstranite kazeinsko plast, ki leži med vodno in organsko fazo (glej sliko 2), in odlijte obe fazi. Znova homogenizirajte kazein v 40 ml destilirane vode (glej zgoraj) in 20 ml diklorometana (4.5.2) in centrifugirajte. Nadaljujte postopek (dva- do trikrat), dokler obe ekstrakcijski fazi ne postaneta brezbarvni. Homogenizirajte proteinski preostanek s 50 ml acetona (4.5.3) in filtrirajte prek srednje hitrega nagubanega filtrirnega papirja. Ostanek na filtru vsakič sperite z dvema ločenima 25-mililitrskima odmerkoma acetona in pustite, da se posuši na zraku ali v toku dušika, nato ga v terilnici zdrobite v fin prah.

Opomba: Izoliran suh kazein je treba hraniti pri – 20 °C.

6.1.2   Plazminsko cepljenje β-kazeinov za okrepitev γ-kazeinov

Disperzirajte 25 mg izoliranih kazeinov (6.1.1) v 0,5 ml pufra amonijevega karbonata (4.7.1) in 20 minut homogenizirajte, npr. z uporabo ultrazvočnega postopka. Ogrejte na 40 °C in dodajte 10 μl plazmina (4.7.2), zmešajte in eno uro inkubirajte pri 40 °C z neprestanim tresenjem. Za inhibicijo encima dodajte 20 μl raztopine ε-aminokapronske kisline (4.7.3), nato dodajte 200 mg sečnine v trdi obliki in 2 ml ditiotreitola.

Opomba: Da bi dobili več simetrije v fokusiranih kazeinskih trakovih, je priporočljivo, da raztopino sušite z zmrzovanjem, potem ko ste dodali ε-aminokapronsko kislino, in nato raztopite preostanek v 0,5 ml pufra za raztapljanje proteinov (4.6).

6.2   Priprava sečnine, ki vsebuje poliakrilamidne gele

Z nekaj kapljicami vode povaljajte nosilno folijo za gel (5.2) po stekleni plošči (5.1), odstranite vso odvečno vodo s papirnato brisačo ali tkanino. Na enak način povaljajte pokrivno folijo (5.3) z distančniki (0,25 mm) po drugi stekleni plošči. Položite ploščo vodoravno na nivelirno mizo.

Dodajte 10 μl Temeda (4.1.3.1) v pripravljeno in razplinjeno gelsko raztopino (4.1.2), pomešajte in dodajte 10 μl raztopine PER (4.1.3.2), dobro premešajte in takoj enakomerno nalijte na sredino pokrivne folije. En rob nosilne plošče gela (folija naj bo obrnjena navzdol) položite na pokrivno folijo in jo počasi spuščajte, tako da se med folijami naredi film gela in se enakomerno ter brez mehurčkov razširi (slika 3). Pazljivo do konca spustite nosilno ploščo gela s tanko lopatico in nanjo položite še tri steklene plošče, ki bodo namenjene za uteži. Potem ko je polimerizacija končana (po približno 60 minutah), premestite polimerizirani gel na nosilno folijo skupaj s pokrivno folijo, tako da rahlo udarite po steklenih ploščah. Skrbno očistite hrbtno stran nosilne folije ostankov gela in sečnine. Zavarite gelov sendvič v filmski tulec in shranite v hladilnik (največ šest tednov).

Opomba: Pokrivna folija z distančniki se lahko uporabi znova. Poliakrilamidni gel se lahko razreže v manjše kose, kar je priporočljivo zlasti, kadar je vzorcev malo ali če uporabljate avtomatsko elektroforezno napravo (dva gela, velikost 4,5 × 5 cm).

6.3   Izoelektrično fokusiranje

Nastavite termostat za hlajenje na 12 °C. S kerozinom zbrišite hrbtno stran nosilne folije in kapnite nekaj kapljic kerozina (4.2) na sredo hladilnega bloka. Nato po njem povaljajte gelov sendvič z nosilno stranjo navzdol in pazite, da ne nastanejo mehurčki. Obrišite ves odvečni kerozin in odstranite pokrivno folijo. Prepojite elektrodna trakova z elektrodnima raztopinama (4.3, 4.4), odrežite ju v dolžini gela in postavite v pripravljene položaje (razdalja elektrod 9,5 cm).

Pogoji za izoelektrično fokusiranje:

6.3.1   Velikost gela 265 × 125 × 0,25 mm

Korak	Čas (min)	Napetost (V)	Tok (mA)	Moč (W)	Volt ure (Vh)
1. Predhodno fokusiranje	30	največ 2 500	največ 15	konstan. 4	pribl. 300
2. Vzorčno fokusiranje (7)	60	največ 2 500	največ 15	konstan. 4	pribl. 1 000
3. Končno fokusiranje	60	največ 2 500	največ 5	največ 20	pribl. 3 000
	40	največ 2 500	največ 6	največ 20	pribl. 3 000
	30	največ 2 500	največ 7	največ 25	pribl. 3 000

Opomba: Če sta debelina ali širina gela spremenjeni, se morata ustrezno prilagoditi vrednosti za tok in moč (npr. podvojite vrednosti za električni tok in moč, če se uporabi gel 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2   Primer programa napetosti za avtomatsko elektroforezno napravo (2 gela 5,0 × 4,5 cm), elektrodi brez trakov, ki se neposredno naneseta na gel

Korak	Napetost	Tok	Moč	Začasna	Volt ure
1. Predhodno fokusiranje	1 000 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	85 Vh
2. Vzorčno fokusiranje	250 V	5,0 mA	2,5 W	8 °C	30 Vh
3. Fokusiranje	1 200 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	80 Vh
4. Fokusiranje	1 500 V	5,0 mA	7,0 W	8 °C	570 Vh

V koraku 2 postavite trak za nanos vzorca na 0 Vh.

V koraku 2 odstranite trak za nanos vzorca pri 30 Vh.

6.4   Proteinsko obarvanje

6.4.1   Proteinsko fiksiranje

Po izključitvi elektrike takoj odstranite elektrodna trakova in dajte gel v posodo za obarvanje/razbarvanje, napolnjeno z 200 ml fiksirja (4.9); pustite 15 minut in neprestano stresajte.

6.4.2   Umivanje in obarvanje gelske plošče

Temeljito odtočite fiksir in dvakrat vsakič po 30 sekund spirajte gelsko ploščo s 100 ml raztopine za razbarvanje (4.10). Odlijte raztopino za razbarvanje in dopolnite posodo z 250 ml raztopine za obarvanje (4.11.3); počakajte 45 minut in z rahlim tresenjem omogočite, da se obarva.

6.4.3   Razbarvanje gelske plošče

Odlijte raztopino za obarvanje, dvakrat sperite gelsko ploščo, pri čemer vsakič uporabite 100 ml raztopine za razbarvanje (4.10), nato 15 minut tresite z 200 ml raztopine za razbarvanje in najmanj dvakrat ali trikrat ponovite korak razbarvanja, dokler ozadje ne postane čisto in brezbarvno. Nato splaknite gelsko ploščo z destilirano vodo (2 × 2 minuti) in sušite na zraku (2 do 3 ure) ali s sušilnikom za lase (10–15 minut).

Opomba 1: Fiksiranje, pomivanje, obarvanje in razbarvanje opravite pri temperaturi 20 °C. Ne uporabljajte visokih temperatur.

Opomba 2: Če raje uporabljate bolj občutljivo obarvanje s srebrom (npr. oprema za obarvanje s srebrom, protein, Pharmacia Biotech, št. kode 17–1150–01), morate plazminsko obdelane kazeinske vzorce razredčiti do 5 mg/ml.

7.   OCENJEVANJE

Ocenjevanje se izvaja s primerjavo proteinskih profilov neznanega vzorca z referenčnimi standardi na istem gelu. Zaznavanje kravjega mleka v sirih iz ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka in mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka se izvaja prek y3- in y2-kazeinov, katerih izoelektrične točke so v razponu med pH 6,5 in pH 7,5 (slike 4a, 4b in 5). Meja zaznavnosti je manj kot 0,5 %.

7.1   Vizualna ocena

Za vizualno ocenitev količine mleka goveda je priporočljivo, da se koncentracije vzorcev in standardov prilagodijo za pridobitev iste stopnje intenzitete ovčjih, kozjih in/ali bivoličjih γ2- in γ3-kazeinov (glej „γ2 E,G,B“ in „γ3 E,G,B“ na slikah 4a, 4b in 5). Po tem se lahko neposredno presodi količina mleka goveda (manj kot, enako ali več kot 1 %) v neznanem vzorcu s primerjavo intenzitete kravjih γ3- in γ2-kazeinov (glej „γ3 C“ in „γ2 C“ na slikah 4a, 4b in 5) s tistimi od 0 % in 1 % referenčnih standardov (ovca, koza) ali laboratorijskimi vmesnimi standardi (bivolica).

7.2   Denzitometrijska ocena

Za določitev razmerja površin pod vrhovi za goveja, ovčja, kozja in/ali bivoličja kazeina γ2 in γ3 (glej sliko 5) uporabite denzitometrijo (5.19), če je na voljo. Primerjajte to vrednost z razmerjem površin pod vrhovi γ2- in γ3-kazeinov 1-odstotnega referenčnega standarda (ovca, koza) ali laboratorijskega vmesnega standarda (bivolica), analiziranega na istem gelu.

Opomba: Metoda deluje zadovoljivo, če se pokaže jasen pozitiven znak za goveja kazeina γ2 in γ3 v 1-odstotnem referenčnem standardu, vendar ne v 0-odstotnem referenčnem standardu. V nasprotnem primeru optimizirajte postopek tako, da natančno sledite podrobnostim metode.

Vzorec se šteje za pozitivnega, če sta oba goveja kazeina γ2 in γ3 ali ustrezajoče razmerje površin pod vrhovi enako ali večje, kot je stopnja 1-odstotnega referenčnega standarda.

8.   VIRI

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A. in Bocca A., „Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins“, Milchwissenschaft 45, 1990, str. 708–711.

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A. in Del Giovine L., „A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting“, Milchwissenschaft 50, 1995, str. 83–85.

Krause I., Berner I. in Klostermeyer H., „Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier“, v: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ur.), Bode-Verlag, München, 1989, str. 389–393.

Krause Ι., Belitz H.–D. in Kaiser K.–P., „Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen“, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 1982, str. 195–199.

Radola, B. J., „Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50–100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films“, Electrophoresis 1, 1980, str. 43–56.

Slika 1

Shematska risba pokrivne folije

Slika 2

Kazeinska plast, ki po centrifugiranju plava med vodno in organsko fazo

Slika 3

Poklopna tehnika za ulivanje zelo tankih poliakrilamidnih gelov

a = lepilni trak na distančniku (0,25 mm); b = pokrivna folija (5.3); c, e = stekleni plošči (5.1); d = gelska raztopina (4.1.2); f = nosilna folija gela (5.2)

Slika 4a

Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov iz ovčjega in kozjega sira, ki vsebuje različne količine kravjega mleka

% CM = odstotek kravjega mleka, C = krava, E = ovca, G = koza

Prikazan je zgornji del gela izoelektričnega fokusiranja (IEF)

Slika 4b

Izoelektrično fokusiranje plazminsko obdelanih kazeinov iz sira, narejenega iz mešanic ovčjega, kozjega in bivoličjega mleka z vsebnostjo različnih količin kravjega mleka

% CM = odstotek kravjega mleka; 1+ = vzorec vsebuje 1 % kravjega mleka, v sredini sledi pa ima dodatek čistega govejega kazeina. C = krava, E = ovca, G = koza, B = bivol

Prikazana je skupna razdalja separacije za gel IEF.

Slika 5

Superpozicija denzitogramov standardnih vzorcev (SDT) in vzorcev sira, narejenega iz mešanice ovčjega, kozjega in bivoljega mleka po izometričnem fokusiranju

a, b = standardi, ki vsebujejo 0 in 1 % kravjega mleka; c–g = vzorci sirov, ki vsebujejo 0, 1, 2, 3 in 7 % kravjega mleka. C = krava, E = ovca, G = koza.

Zgornja polovica gela IEF je bila obdelana pri λ = 634 nm.

PRILOGA IX

Ocenjevanje analiz

1.   Zagotavljanje kakovosti

Analize se opravijo v laboratorijih, ki so določeni v skladu s členom 12 Uredbe (ES) št. 882/2004 (**), ali jih določijo pristojni organi države članice.

2.   Vzorčenje in nesoglasja glede rezultatov analiz

1.

Vzorčenje se izvaja v skladu z ustrezno uredbo za zadevne proizvode. Če ni določb o vzorčenju, se uporabljajo določbe iz standarda ISO 707, mleko in mlečni proizvodi – smernice o vzorčenju.

2.

Laboratorijska poročila o rezultatih analiz vsebujejo zadostne podatke za oceno rezultatov, ki se opravi v skladu z dodatkom.

3.

Za analize, ki jih določajo pravila Unije, se vzamejo dvojni vzorci.

4.

Če pride do spora glede rezultatov, plačilna agencija poskrbi za ponovno izvedbo potrebne analize na zadevnem proizvodu, stroške pa krije stranka, ki spor izgubi. Zgoraj navedena analiza se opravi, če so na voljo zapečatene kopije vzorcev proizvoda, ki jih ustrezno hranijo pristojni organi. Proizvajalec plačilni agenciji pošlje zahtevek za izvedbo analize v 7 delovnih dneh po objavi rezultatov prve analize. Plačila agencija analizo izvede v 21 delovnih dneh po prejemu zahtevka.

5.

Rezultat pritožbe je dokončen.

6.

Če lahko proizvajalec v petih dneh po vzorčenju dokaže, da postopek vzorčenja ni potekal pravilno, se vzorčenje ponovi, kadar je mogoče. Če vzorčenja ni mogoče ponoviti, se analizirana pošiljka sprejme.

Dodatek

Ocena skladnosti pošiljke s pravno omejitvijo

1.   Princip

Če zakonodaja o javni intervenciji in zasebnem skladiščenju podrobno določa postopke vzorčenja, se upoštevajo navedeni postopki. V vseh drugih primerih se uporabi vzorec vsaj treh vzorčnih enot, naključno izbranih iz pošiljke, ki se predloži v pregled. Pripravi se lahko sestavljen vzorec. Pridobljeni rezultat se primerja s pravnimi omejitvami z izračunom 95-odstotne stopnje natančnosti kot dvakratnega standardnega odmika, pri čemer je ustrezni standardni odmik odvisen od tega, (1) ali se metoda potrdi z mednarodnim sodelovanjem z vrednostmi za σr in σR ali (2) se v primeru znotrajlaboratorijske validacije izračuna interna obnovljivost. Ta stopnja natančnosti bo nato enaka merilni negotovosti rezultata.

2.   Metoda je validirana z mednarodnim sodelovanjem

V tem primeru se določita standardni odmik ponovljivosti σr in standardni odmik obnovljivosti σR, medtem ko lahko laboratorij dokaže skladnost z učinkovitostjo validirane metode.

Izračunajte aritmetično sredino za n ponovljenih meritev.

Izračunajte razširjeno negotovost (k = 2) kot

Če se končni rezultat x merjenja izračuna s formulo v obliki x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 ali x = y 1/y 2, je treba uporabiti običajne postopke za združevanje standardnih odmikov v takšnih primerih.

Šteje se, da pošiljka ni v skladu z zgornjo pravno omejitvijo UL, če je

;

sicer se šteje, da je v skladu z UL.

Šteje se, da pošiljka ni v skladu s spodnjo pravno omejitvijo LL, če je

;

sicer se šteje, da je v skladu z LL.

3.   Znotrajlaboratorijska validacija z izračunom standardnega odmika interne obnovljivosti

Če se uporabljajo metode, ki niso določene v tej uredbi, in niso določene meritve za natančnost, se izvede znotrajlaboratorijska validacija. V formulah za izračun razširjene negotovosti U je treba ustrezno uporabiti standardni odmik interne ponovljivosti sir in standardni odmik interne obnovljivosti si R namesto σr in σ R .

Pravila, ki jih je treba upoštevati za določitev skladnosti s pravno omejitvijo, so navedena v točki 1. Če se pošiljka šteje kot neskladna s pravno omejitvijo, je treba meritve ponoviti na podlagi metode iz te uredbe ter rezultat oceniti v skladu s točko 1.