26.9.2019   

SL

Uradni list Evropske unije

L 247/1


UREDBA KOMISIJE (EU) 2019/1390

z dne 31. julija 2019

o spremembi Priloge k Uredbi (ES) št. 440/2008 o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) zaradi njene prilagoditve tehničnemu napredku

(Besedilo velja za EGP)

EVROPSKA KOMISIJA JE –

ob upoštevanju Pogodbe o delovanju Evropske unije,

ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) ter o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije in o spremembi Direktive 1999/45/ES ter o razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES (1) ter zlasti člena 13(2) Uredbe,

ob upoštevanju naslednjega:

(1)

Uredba Komisije (ES) št. 440/2008 (2) vsebuje preskusne metode za ugotavljanje fizikalno-kemijskih lastnosti, toksičnosti in ekotoksičnosti kemikalij, ki se uporabljajo za namene Uredbe (ES) št. 1907/2006.

(2)

Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj (OECD) razvija harmonizirane in mednarodno dogovorjene smernice za preskušanje kemikalij za regulativne namene. OECD redno izdaja nove in revidirane smernice za preskušanje ob upoštevanju znanstvenega napredka na tem področju.

(3)

Da bi se upošteval tehnični napredek in bi se, kjer je to mogoče, v skladu s členom 13(2) Uredbe (ES) št. 1907/2006 zmanjšalo število živali, ki se uporabljajo za poskuse, bi bilo treba po sprejetju ustreznih smernic OECD za preskušanje določiti dve novi preskusni metodi za oceno ekotoksičnosti in devet novih preskusnih metod za ugotavljanje toksičnosti za zdravje ljudi ter posodobiti sedem preskusnih metod. Enajst od navedenih preskusnih metod se nanaša na preskuse in vitro za draženje kože in oči/jedkost za kožo in oči, preobčutljivost kože, genotoksičnost in endokrine učinke. O predlagani spremembi so bila opravljena posvetovanja z deležniki.

(4)

Uredbo (ES) št. 440/2008 bi bilo zato treba ustrezno spremeniti.

(5)

Ukrepi iz te uredbe so v skladu z mnenjem odbora, ustanovljenega v skladu s členom 133 Uredbe (ES) št. 1907/2006 –

SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:

Člen 1

Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni v skladu s Prilogo k tej uredbi.

Člen 2

Ta uredba začne veljati dvajseti dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.

V Bruslju, 31. julija 2019

Za Komisijo

Predsednik

Jean-Claude JUNCKER


(1)  UL L 396, 30.12.2006, str. 1.

(2)  Uredba Komisije (ES) št. 440/2008 z dne 30. maja 2008 o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) (UL L 142, 31.5.2008, str. 1).


PRILOGA

Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni:

(1)

Poglavje B.4 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.4   AKUTNO DRAŽENJE KOŽE/JEDKOST ZA KOŽO

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici OECD za preskušanje (TG) 404 (2015). Smernice OECD za preskušanje kemikalij se redno preverjajo, s čimer se zagotovi, da izražajo najboljša razpoložljiva znanstvena spoznanja. Pri preverjanju Smernice OECD za preskušanje 404 je bila posebna pozornost namenjena možnim izboljšavam v zvezi s pomisleki glede dobrobiti živali in ocenjevanju vseh obstoječih podatkov o preskusni kemikaliji, da bi se izognili nepotrebnim testiranjem na laboratorijskih živalih. Posodobljena različica Smernice OECD za preskušanje 404 (prvotno sprejeta leta 1981, revidirana v letih 1992, 2002 in 2015) vključuje sklic na dokument s smernicami za celostne pristope k testiranju in ocenjevanju (Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA)) v zvezi z draženjem kože/jedkostjo za kožo (1), pri čemer je predlagan modularen pristop k preskušanju draženja kože in jedkosti za kožo. S pristopi IATA se opisuje več modulov, v katerih so zbrani viri informacij in orodja za analizo, ter (i) zagotavljajo smernice o tem, kako obstoječe podatke, pridobljene s preskušanjem, in podatke, ki ne temeljijo na preskušanju, združiti in uporabiti pri ocenjevanju potenciala kemikalij za draženje kože in jedkost za kožo, poleg tega je (ii) predlagan pristop, kadar je potrebno dodatno preskušanje (1). Poleg tega je v navedeni smernici, kjer je to potrebno, namesto sočasne priporočena zaporedna namestitev treh preskusnih obližev na žival v začetnem preskusu in vivo.

2.

Opredelitvi pojmov draženje kože in jedkost za kožo sta navedeni v dodatku k tej preskusni metodi.

ZAČETNI PREUDARKI

3.

Za znanstveno zanesljivost in dobrobit živali je koristno, da se preskusi in vivo začnejo izvajati šele, ko se z analizo, ki temelji na zanesljivosti dokazov, kot je predstavljena v dokumentu s smernicami za celostne pristope k testiranju in ocenjevanju v zvezi z draženjem kože in jedkostjo za kožo, tj. v vseh treh delih teh smernic in njihovih ustreznih modulih (1), ocenijo vsi razpoložljivi podatki, ki se nanašajo na potencial preskusne kemikalije za draženje kože/jedkost za kožo. Na kratko, v prvem delu se obstoječi podatki obravnavajo na podlagi sedmih modulov, ki zajemajo podatke za ljudi, podatke in vivo, podatke in vitro, podatke o fizikalno-kemijskih lastnostih (npr. vrednost pH, zlasti močna kislost ali alkalnost) in nepreskusne metode. V drugem delu se opravi analiza, ki temelji na zanesljivosti dokazov. Če ta analiza še vedno ni prepričljiva, je treba tretji del izvesti z dodatnim preskušanjem, pri čemer se začne z metodami in vitro, preskušanje in vivo pa se uporabi kot zadnja možnost. S to analizo bi se morala torej zmanjšati potreba po in vivo preskušanju jedkosti za kožo/draženja kože v zvezi s preskusnimi kemikalijami, za katere je glede navedenih dveh končnih točk na voljo že dovolj dokazov iz drugih študij.

NAČELO PRESKUSA IN VIVO

4.

Preskusna kemikalija, ki jo je treba preskusiti, se nanese na kožo preskusne živali v enkratnem odmerku; netretirane površine kože preskusne živali služijo za kontrolo. Stopnja dražilnosti/jedkosti se odčita in evidentira v določenih intervalih in nadalje opiše, da se vsi učinki celovito ocenijo. Študija mora trajati dovolj dolgo, da se oceni popravljivost ali nepopravljivost opaženih učinkov.

5.

Živali, ki v kateri koli fazi preskusa kažejo trajne znake hudega trpljenja in/ali bolečine, je treba humano usmrtiti, preskusno kemikalijo pa oceniti skladno s tem. Merila za sprejetje odločitve o humani usmrtitvi umirajočih in hudo trpečih živali so navedena v ločenem dokumentu s smernicami (2).

PRIPRAVA ZA PRESKUS IN VIVO

Izbira živalskih vrst

6.

Kunec beličnik je najbolj zaželena laboratorijska žival; uporabljajo se zdravi mladi odrasli kunci. Uporabo drugih vrst je treba obrazložiti.

Priprava živali

7.

Približno 24 ur pred začetkom preskusa je treba živalim skrbno ostriči dlako s hrbtnega dela trupa. Paziti je treba, da se koža ne odrgne, in uporabiti le živali z zdravo, nepoškodovano kožo.

8.

Nekateri kunčji sevi imajo goste zaplate dlak, ki so bolj izrazite v nekaterih obdobjih med letom. Takšni predeli goste rasti dlak se ne smejo uporabiti kot preskusni predeli.

Pogoji nastanitve in hranjenja

9.

Živali morajo biti nastanjene posamično. Temperatura v prostoru s poskusnimi živalmi mora biti za kunce 20 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, si je treba prizadevati za 50–60-odstotno vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporabi običajna predpisana laboratorijska prehrana z neomejeno količino pitne vode.

PRESKUSNI POSTOPEK

Nanašanje preskusne kemikalije

10.

Preskusno kemikalijo je treba nanesti na del površine kože (približno 6 cm2) in pokriti z obližem iz gaze, ki se pritrdi z nedražilnim trakom. Kadar neposredna aplikacija ni mogoča (npr. tekoče snovi ali nekatere kašnate zmesi), je treba preskusno kemikalijo najprej nanesti na obliž iz gaze, ki se nato uporabi na koži. Obliž mora biti v ohlapnem stiku s kožo, pritrjen z ustrezno napol zapiralno obvezo med trajanjem izpostavitve. Če se preskusna kemikalija nanese na obliž, jo je treba pritrditi na kožo tako, da je stik dober in preskusna kemikalija enakomerno razporejena po koži. Živali je treba preprečiti dostop do obliža in zaužitje ali vdihavanje preskusne kemikalije.

11.

Tekoče preskusne kemikalije se običajno uporabljajo nerazredčene. Kadar se preskušajo trdne snovi (ki jih je mogoče zdrobiti, če je to po presoji potrebno), je treba preskusno kemikalijo navlažiti z zelo majhno količino vode (ali, kadar je potrebno, z drugim ustreznim vehiklom), ki zadostuje za zagotavljanje dobrega stika s kožo. Kadar se uporabljajo drugi vehikli, ne voda, mora biti možen vpliv vehikla na dražilnost kože zaradi preskusne kemikalije minimalen, če sploh obstaja.

12.

Na koncu obdobja izpostavljenosti, ki traja običajno 4 ure, je treba z uporabo vode ali ustreznega topila odstraniti preostalo preskusno kemikalijo, kjer je to izvedljivo, ne da bi se spremenil obstoječi odziv ali integriteta epidermisa.

Velikost odmerka

13.

Na preskusni predel se nanese odmerek 0,5 ml tekoče snovi ali 0,5 g trdne snovi ali kašnate zmesi.

Začetni preskus (in vivo preskus draženja kože/jedkosti za kožo z uporabo ene živali)

14.

Kadar se presodi, da je preskusna kemikalija jedka, dražilna ali nerazvrščena, na podlagi analiz, ki temeljijo na zanesljivosti dokazov, ali predhodnega preskušanja in vitro, običajno ni potrebno dodatno preskušanje in vivo. Kadar se kljub temu zdi potrebno zagotoviti dodatne podatke, se izvede preskus in vivo z uporabo ene živali in na podlagi naslednjega pristopa. Na žival se zaporedoma nanesejo do trije preskusni obliži. Prvi obliž se odstrani po treh minutah. Če ni opažena nobena resna reakcija kože, se na drug predel nanese drugi obliž in se odstrani po eni uri. Če opazovanja v tej fazi pokažejo, da se lahko humano dopusti podaljšanje izpostavljenosti na štiri ure, se nanese še tretji obliž in se odstrani po štirih urah, odziv pa se razvrsti po stopnjah.

15.

Če se opazi jedek učinek po kateri koli izmed teh treh zaporednih izpostavitev, se preskus nemudoma zaključi. Če se jedek učinek ne opazi po tem, ko se odstrani zadnji obliž, se žival opazuje 14 dni, razen če se jedkost razvije prej.

16.

Kadar se ne pričakuje, da bo preskusna kemikalija povzročila jedkost, vendar bi lahko bila dražilna, je treba nanesti le en obliž na eno žival za štiri ure.

Potrditveni preskus (in vivo preskus draženja kože z dodatnimi živalmi)

17.

Če se jedek učinek v začetnem preskusu ne opazi, je treba dražilni ali negativni odziv potrditi z uporabo do dveh dodatnih živali, s po enim obližem za vsako, v obdobju izpostavitve štirih ur. Če se v začetnem preskusu opazi dražilen učinek, se potrditveni preskus lahko izvede zaporedoma ali s sočasno izpostavitvijo dveh dodatnih živali. Izjemoma, ko se začetni preskus ne izvede, se lahko dve ali tri živali tretirajo le z enim obližem, ki se odstrani po štirih urah. Kadar se uporabljata dve živali, ni potrebno dodatno preskušanje, če obe kažeta enak odziv. V nasprotnem primeru se preskusi tudi tretja žival. Dvoumne odzive je morda treba oceniti z uporabo dodatnih živali.

Obdobje opazovanja

18.

Obdobje opazovanja mora biti dovolj dolgo, da se lahko v celoti ovrednoti popravljivost opaženih učinkov. Preskus je treba zaključiti, kadar koli žival pokaže znake hude bolečine ali trpljenja. Za določitev povračljivosti učinkov je treba živali opazovati 14 dni po odstranitvi obližev. Če se povračljivost opazi pred 14. dnem, je treba preskus zaključiti takrat.

Klinična opazovanja in razvrščanje kožnih reakcij v stopnje

19.

Pri vseh živalih je treba preveriti znake rdečine in edemov ter odzive evidentirati po 60 minutah ter nato po 24, 48 in 72 urah po odstranitvi obliža. Pri začetnih preskusih na eni živali se preskusni predel preveri tudi takoj po odstranitvi obliža. Kožne reakcije se razvrstijo v stopnje in evidentirajo v skladu s stopnjami iz spodnje tabele. Če po 72 urah nastane poškodba kože, ki je ni mogoče opredeliti kot dražilnost ali jedkost, so morda potrebna opazovanja do 14. dne, da se opredeli povračljivost učinkov. Poleg opazovanja dražilnosti je treba v celoti opisati in evidentirati vse lokalne toksične učinke, npr. tanjšanje kože, in vse sistemske nasprotne učinke (npr. učinke na klinične znake toksičnosti in telesno težo). Za razjasnitev dvoumnih odzivov je morda treba opraviti histopatološki pregled.

20.

Razvrščanje kožnih odzivov je nujno subjektivno. Da bi se izboljšala usklajenost pri določanju stopnje kožnega odziva ter bi se preskuševalnim laboratorijem in vsem sodelujočim pomagalo pri oblikovanju in razlagi rezultatov opazovanj, mora biti osebje, ki izvaja ta opazovanja, ustrezno usposobljeno za uporabo sistema določanja stopnje (glej tabelo spodaj). Pri tem bi lahko bil v pomoč ilustriran priročnik za določanje stopnje dražilnosti kože in drugih lezij (3).

PODATKI IN POROČANJE

21.

Rezultate študije je treba v obliki preglednice povzeti v končnem poročilu o preskusu, zajemati pa morajo vse postavke s seznama v odstavku 24.

Vrednotenje rezultatov

22.

Rezultate draženja kože je treba vrednotiti v povezavi z vrsto in resnostjo lezij ter njihovo povračljivostjo ali nepovračljivostjo. Posamezni rezultati ne pomenijo absolutnega standarda za dražilne lastnosti materiala, ker se ocenjujejo tudi drugi učinki preskusnega materiala. Pač pa je treba posamezne rezultate obravnavati kot referenčne vrednosti, ki jih je treba vrednotiti v povezavi z vsemi drugimi opažanji iz študije.

23.

Pri oceni dražilnih odzivov je treba upoštevati povračljivost kožnih lezij. Kadar so odzivi, npr. alopecija (omejen predel), hiperkeratoza, hiperplazija in luščenje, vidni do konca 14-dnevnega obdobja opazovanja, je treba preskusno kemikalijo obravnavati kot dražilno.

Poročilo o preskusu

24.

Poročilo o preskusu mora vsebovati informacije, navedene v nadaljevanju.

 

Utemeljitev preskusa in vivo:

analiza, ki temelji na zanesljivosti dokazov in se nanaša na obstoječe preskusne podatke, vključno z rezultati strategije zaporednega preskušanja;

opis pomembnih podatkov, ki so na voljo iz prejšnjih preskušanj;

podatki, pridobljeni v vsaki fazi strategije preskušanja;

opis izvedenih preskusov in vitro, vključno s podrobnimi podatki o postopkih, rezultati, dobljenimi s preskusnimi/referenčnimi snovmi;

analiza, ki temelji na zanesljivosti dokazov, za izvedbo študije in vivo.

 

Preskusna kemikalija:

snov iz ene sestavine: kemijski identifikacijski podatki, kot so ime po nomenklaturi IUPAC ali ime CAS, številka CAS, koda po sistemu SMILES ali identifikatorju InChI, strukturna formula, čistost, kemijska identiteta nečistoč, kot je ustrezno in praktično izvedljivo, itd.;

snov z več sestavinami, zmes in snovi z neznano ali spremenljivo sestavo, kompleksni reakcijski produkti ali biološki materiali (UVCB): čim obsežnejša opredelitev lastnosti s kemijsko identiteto (glej zgoraj), kvantitativnim pojavljanjem in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi sestavin;

fizični videz, topnost v vodi in dodatne ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti;

vir, številka serije, če je na voljo;

obdelava preskusnih/kontrolnih kemikalij pred preskušanjem, če je ustrezno (npr. segrevanje, drobljenje);

stabilnost preskusne kemikalije, rok uporabe ali datum za ponovno analizo, če je znan;

pogoji skladiščenja.

 

Vehikel:

identifikacija, koncentracija (kjer je ustrezno), uporabljena količina;

utemeljitev izbire vehikla.

 

Preskusne živali:

uporabljena vrsta/sev, obrazložitev za uporabo živali, če to ni kunec beličnik;

število živali po spolu;

teža posamezne živali ob začetku in zaključku preskusa;

starost na začetku študije;

izvor živali, nastanitvene razmere, prehrana itd.

 

Preskusni pogoji:

tehnika priprave območja nanosa obliža;

podrobnosti o uporabljenih materialih ter tehniki priprave in nanosa obliža,

podrobnosti o pripravi, nanosu in odstranitvi preskusne kemikalije.

 

Rezultati:

preglednica doseženih rezultatov odziva na dražilnost/jedkost za vsako žival na vseh izmerjenih časovnih točkah;

opis vseh opaženih lezij;

podroben opis vrste in stopnje opažene dražilnosti ali jedkosti in morebitne histopatološke ugotovitve;

opis drugih neželenih lokalnih (npr. tanjšanje kože) in sistemskih učinkov poleg dražilnosti kože ali jedkosti za kožo.

 

Obravnava rezultatov

 

Sklepne ugotovitve

VIRI

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 203), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(2)

OECD (1998). Usklajen celostni sistem razvrstitve kemijskih snovi glede na nevarnosti za zdravje ljudi in vplive na okolje, kot sta ga novembra 1998 na 28. skupnem zasedanju potrdila Odbor za kemikalije in Delovna skupine za kemikalije.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 19), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

Preglednica

RAzvrščanje Kožnih Reakcij v Stopnje

Rdečine ni…

0

Neznatna rdečina (komajda opazna)…

1

Zelo razločna rdečina…

2

Zmerna do resna rdečina…

3

Resna rdečina (goveja rdečina) in nastanek krast, ki ovira razvrstitev rdečine……

4

Najvišja možna stopnja: 4

Kožnih edemov ni…

0

Neznaten kožni edem (komajda opazen)…

1

Rahel edem (robovi predela dobro vidni, ker so izbočeni)…

2

Zmeren kožni edem (izbočen približno 1 mm)…

3

Resen kožni edem (izbočen več kakor 1 mm in razširjen zunaj predela izpostavitve)…

4

Najvišja možna stopnja: 4

Za razjasnitev dvoumnih odzivov se lahko opravi histopatološki pregled.

Dodatek

OPREDELITVE POJMOV

Kemikalija je snov ali zmes.

Draženje kože je nastanek povračljive poškodbe kože po nanosu preskusne kemikalije za največ 4 ure.

Jedkost za kožo je nastanek nepovračljivih poškodb kože, zlasti vidnega odmiranja prek povrhnjice v usnjico po nanosu preskusne kemikalije za največ 4 ure. Za reakcije jedkosti so značilne razjede, krvavitve, krvave hraste in do konca 14-dnevnega opazovanja izguba barve zaradi beljenja kože, celi predeli alopecije in brazgotine. Dvoumne lezije je morda treba preiskati histopatološko.

Preskusna kemikalija je vsaka snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo.

(2)

Poglavje B.17 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.17    IN VITRO PRESKUSI GENSKIH MUTACIJ V CELICAH SESALCEV Z UPORABO GENOV HPRT IN XPRT

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici OECD za preskušanje 476 (2016). Preskusne metode se redno preverjajo ob upoštevanju znanstvenega napredka, spreminjajočih se regulativnih zahtev in dobrobiti živali. V tej revidirani različici preskusne metode B.17 se upoštevajo skoraj tridesetletne izkušnje s tem preskusom, pa tudi rezultati razvijanja ločene nove metode za in vitro preskuse genskih mutacij v celicah sesalcev z uporabo gena za timidin kinazo. Preskusna metoda B.17 je del sklopa preskusnih metod v zvezi z genetsko toksikologijo. OECD je pripravila dokument z jedrnatimi informacijami o preskušanju v zvezi z genetsko toksikologijo in pregledom nedavnih sprememb smernic OECD za preskušanje v zvezi z genetsko toksikologijo (1).

2.

Namen in vitro preskusa genskih mutacij v celicah sesalcev je zaznati genske mutacije, katerih nastanek povzročajo kemikalije. S celičnimi linijami, uporabljenimi pri teh preskusih, se merijo napredne mutacije na poročevalskih genih, natančneje endogenem genu za hipoksantin-gvanin-fosforibozil-transferazo (Hprt v celicah glodavcev, HPRT v človeških celicah; pri tej preskusni metodi v nadaljnjem besedilu skupaj: gen Hprt in preskus HPRT) in transgenu za ksantin-gvanin-fosforibozil-transferazo (gpt) (v nadaljnjem besedilu: preskus XPRT). S preskusi mutacij HPRT in XPRT se zaznajo različne vrste genskih pojavov. Poleg mutacijskih pojavov, zaznanih s preskusom HPRT (npr. substitucije baznih parov, premiki bralnega okvira, majhne delecije in insercije), lahko lokacija transgena gpt na avtosomih omogoči zaznavo mutacij, ki so posledica obsežnih delecij, in morebitne mitotične rekombinacije, ki se ne zazna s preskusom HPRT, ker je gen Hprt na kromosomu X (2) (3) (4) (5) (6) (7). Preskus XPRT se za regulativne namene trenutno uporablja manj pogosto kot preskus HPRT.

3.

Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.

ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE

4.

Pri preskusih, izvedenih in vitro, je običajno treba uporabiti zunanji vir presnovne aktivacije. Zunanji sistem presnovne aktivacije ne posnema pogojev in vivo v celoti.

5.

Paziti je treba, da se izogibamo pogojem, ki bi vodili do lažno pozitivnih rezultatov (tj. morebitnemu medsebojnemu delovanju s preskusnim sistemom), ki jih ne bi povzročilo neposredno medsebojno delovanje preskusnih kemikalij in genetskega materiala celice; med take pogoje spadajo spremembe vrednosti pH ali osmolarnosti (8) (9) (10), medsebojno delovanje s sestavinami gojišča (11) (12) ali previsoke ravni citotoksičnosti (13). Za citotoksičnost, ki presega priporočene najvišje ravni citotoksičnosti, kot so opredeljene v odstavku 19, se šteje, da je prevelika za preskus HPRT.

6.

Preden se preskusna metoda uporabi na zmesi, da bi se pridobili podatki za predvideni regulativni namen, je treba preučiti, ali in zakaj lahko zagotovi ustrezne rezultate za navedeni namen. Kadar obstaja regulativna zahteva za preskušanje zmesi, taki preudarki niso potrebni.

NAČELO PRESKUSA

7.

Mutirane celice brez aktivnosti encima Hprt pri preskusu HPRT ali aktivnosti encima xprt pri preskusu XPRT so odporne proti citostatskim učinkom analoga purina 6-tiogvanina (TG). Celice s Hprt (pri preskusu HPRT) ali gpt (pri preskusu XPRT) so občutljive za TG, ki zavira celično presnovo in ustavi celično delitev. Mutirane celice so tako sposobne množitve v navzočnosti TG, medtem ko normalne celice, ki vsebujejo encim Hprt (pri preskusu HPRT) ali gpt (pri preskusu XPRT), niso.

8.

Celice v suspenziji ali enoplastni kulturi se za ustrezno obdobje (3–6 ur) izpostavijo preskusni kemikaliji, in sicer z zunanjim virom presnovne aktivacije (glej odstavek 14) in brez njega, nato pa se kultivirajo na novem gojišču, da se določi citotoksičnost in omogoči izražanje fenotipa pred selekcijo mutant (14) (15) (16) (17). Citotoksičnost se določi glede na relativno preživetje, tj. učinkovitost tvorbe klonov, izmerjeno takoj po tretiranju in prilagojeno glede na morebitno izgubo celic med tretiranjem v primerjavi z negativno kontrolo (odstavek 18 in Dodatek 2). Tretirane kulture se vzdržujejo v gojišču dovolj dolgo obdobje, ki je značilno za vsako vrsto celic, da se omogoči skoraj optimalno izražanje fenotipa induciranih mutacij (običajno najmanj 7–9 dni). Po izražanju fenotipa se pogostnost mutant določi z nasaditvijo znanega števila celic v gojišče s selektivno snovjo, da se zaznajo mutirane kolonije, in v gojišče brez selektivne snovi, da se določi učinkovitost tvorbe klonov (viabilnost). Po ustrezno dolgi inkubaciji se preštejejo kolonije. Pogostnost mutant se izračuna iz števila mutiranih kolonij, korigiranega z učinkovitostjo tvorbe klonov ob selekciji mutant.

OPIS METODE

Pripravki

Celice

9.

Vrste celic, uporabljene pri preskusih HPRT in XPRT, morajo imeti dokazano občutljivost za kemične mutagene, veliko učinkovitost tvorbe klonov, stabilen kariotip in stabilno pogostnost spontanih mutant. Med najpogosteje uporabljenimi celicami za preskus HPRT so linije celic kitajskega hrčka CHO, CHL in V79, celice limfoma miši L5178Y in človeške limfoblastoidne celice TK6 (18) (19). Pri preskusu XPRT se uporabljajo celice AS52, pridobljene iz CHO, ki vsebujejo transgen gpt (in v katerih je izbrisan gen Hprt) (20) (21); preskusa HPRT ni mogoče izvesti s celicami AS52, ker je bil gen hprt izbrisan. Uporaba drugih celičnih linij mora biti utemeljena in validirana.

10.

Redno je treba preverjati, ali je modalno kromosomsko število v celičnih linijah stabilno in ali te linije niso okužene z mikoplazmo (22) (23); celice se ne smejo uporabljati, če so okužene ali če se je spremenilo modalno kromosomsko število. Določiti je treba običajno trajanje celičnega cikla, uporabljenega v preskuševalnem laboratoriju, ki mora biti skladno z objavljenimi lastnostmi celic. Preveriti je treba tudi pogostnost spontanih mutant v zalogi matičnih celic, pri čemer se zaloga ne sme uporabiti, če pogostnost mutant ni sprejemljiva.

11.

Pred uporabo pri tem preskusu je iz kultur morda treba odstraniti že obstoječe mutirane celice, npr. z gojenjem v gojišču HAT za preskus HPRT in MPA za preskus XPRT (5) (24) (glej Dodatek 1). Očiščene celice se lahko shranijo z zamrzovanjem in nato odtalijo, da se uporabijo kot delovne zaloge. Novoodtaljena delovna zaloga se lahko uporabi za preskus, ko so doseženi običajni podvojitveni časi. Pri izvajanju preskusa XPRT je treba pri rutinskem gojenju celic AS52 uporabiti pogoje, ki zagotavljajo vzdrževanje transgena gpt (20).

Gojišča in pogoji kultiviranja

12.

Za vzdrževanje kultur je treba uporabiti ustrezno gojišče in pogoje inkubacije (posode za gojenje, vlažno ozračje s 5 % CO2 in temperatura inkubacije 37 °C). Celične kulture je treba vedno vzdrževati v pogojih, ki zagotavljajo njihovo rast v logaritemski fazi. Posebno pomembno je, da se izberejo takšna gojišča in pogoji kultiviranja, ki zagotavljajo optimalno rast celic v času izražanja in optimalno učinkovitost tvorbe klonov mutiranih, pa tudi nemutiranih celic.

Priprava kultur

13.

Celične linije se namnožijo iz osnovnih kultur ter nasadijo v gojišče tako na gosto, da celice v suspenzijah ali monosloju med obdobji tretiranja in izražanja še naprej eksponentno rastejo (npr. pri celicah, ki rastejo v monosloju, se je treba izogibati konfluenci).

Presnovna aktivacija

14.

Pri uporabi celic, ki nimajo ustrezne notranje sposobnosti presnavljanja, je treba uporabiti zunanje presnovne sisteme. Najpogosteje uporabljeni sistem, ki je priporočen kot privzet, razen če ni drugače utemeljeno, je s kofaktorjem dopolnjena postmitohondrijska frakcija (S9), pripravljena iz jeter glodavcev (običajno podgan), ki so bila obdelana s sredstvi za encimsko indukcijo, kot je Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28), ali z mešanico fenobarbitala in β-naftoflavona (29) (30) (31) (32). Zadnjenavedena mešanica ni v nasprotju s Stockholmsko konvencijo o obstojnih organskih onesnaževalih (33) ter se je v primerjavi s sredstvom Aroclor 1254 izkazala kot enako učinkovita za povzročanje oksidaz z mešano funkcijo (29) (31). Frakcija S9 se v končnem preskusnem gojišču običajno uporablja v koncentracijah, ki se gibljejo v razponu od 1 do 2 vol. %, lahko pa se poveča na 10 vol. %. Na izbiro vrste in koncentracije zunanjega sistema presnovne aktivacije ali sredstva za indukcijo presnove lahko vpliva razred snovi, ki se preskušajo (34) (35) (36).

Priprava preskusne kemikalije

15.

Trdne preskusne kemikalije je treba pred tretiranjem celic pripraviti v ustreznih topilih in razredčiti, če je to ustrezno (glej odstavek 16). Tekoče preskusne kemikalije se lahko dodajo neposredno v preskusni sistem in/ali razredčijo pred tretiranjem preskusnega sistema. Plinaste ali hlapne preskusne kemikalije je treba preskusiti z ustrezno prilagojenimi standardnimi protokoli, kot je tretiranje v zatesnjenih posodah za gojenje (37) (38). Preskusne kemikalije je treba pripraviti tik pred tretiranjem, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.

PRESKUSNI POGOJI

Topila

16.

Izbrati je treba tako topilo, ki optimira topnost preskusne kemikalije in ne vpliva negativno na izvedbo preskusa, npr. ne spremeni rasti celic, ne vpliva na celovitost preskusne kemikalije, ne reagira s posodami za gojenje, ne ovira sistema presnovne aktivacije. Priporočljivo je, da se, kadar koli je to mogoče, najprej razmisli o uporabi vodnega topila (ali gojišča). Zelo uveljavljeni topili sta na primer voda ali dimetil sulfoksid. Organska topila v končnem obdelovalnem gojišču v splošnem ne smejo presegati 1 vol. %, vodna topila (fiziološka raztopina ali voda) pa ne 10 vol. %. Če uporabljena topila niso uveljavljena (npr. etanol ali aceton), je treba njihovo uporabo podpreti s podatki, ki dokazujejo njihovo združljivost s preskusnimi kemikalijami in preskusnim sistemom ter neobstoj genotoksičnosti pri uporabljeni koncentraciji. Če takšnih podpornih podatkov ni, je treba dodati netretirane kontrole (glej Dodatek 1), ki dokazujejo, da izbrano topilo ne povzroča škodljivih ali mutagenih učinkov.

Merjenje citotoksičnosti in izbiranje koncentracij izpostavljenosti

17.

Pri določanju najvišje koncentracije preskusne kemikalije se je treba izogibati koncentracijam, pri katerih se lahko pojavijo lažni pozitivni odzivi, kot so tisti, ki povzročajo preveliko citotoksičnost (glej odstavek 20), obarjanje v gojiščih (glej odstavek 21) ali znatne spremembe vrednosti pH ali osmolarnosti (glej odstavek 5). Če preskusna kemikalija ob dodajanju povzroči znatno spremembo vrednosti pH v gojišču, se lahko vrednost pH prilagodi z dodajanjem pufra v končno obdelovalno gojišče, da se preprečijo lažno pozitivni rezultati in vzdržujejo ustrezni pogoji kultiviranja.

18.

Izbira koncentracije temelji na citotoksičnosti in drugih preudarkih (glej odstavke 20–22). Čeprav je lahko koristno, da se zaradi boljšega določanja koncentracij, ki jih je treba uporabiti v glavnem preskusu, citotoksičnost oceni v začetnem preskusu, ta preskus ni obvezen. Tudi če se izvede začetna ocena citotoksičnosti, je treba pri glavnem preskusu še vedno izmeriti citotoksičnost vsake kulture. Oceniti jo je treba na podlagi relativnega preživetja, tj. učinkovitosti tvorbe klonov celic, nasajenih na ploščo takoj po tretiranju, prilagojeni z morebitno izgubo celic med tretiranjem na podlagi štetja celic, v primerjavi s prilagojeno učinkovitostjo tvorbe klonov pri negativnih kontrolah (ki se jim pripiše 100-odstotno preživetje) (za formulo glej Dodatek 2).

19.

Oceniti je treba vsaj štiri preskusne koncentracije (v kar niso vključeni topilo in pozitivne kontrole), ki izpolnjujejo merila za sprejemljivost (ustrezna citotoksičnost, število celic itd.). Čeprav je priporočljiva uporaba podvojenih kultur, se lahko pri vsaki preskušeni koncentraciji uporabi ponovljeni vzorec kulture ali le ena sama tretirana kultura. Rezultate, pridobljene pri neodvisnih ponovljenih vzorcih kultur za zadevno koncentracijo, je treba navesti ločeno, vendar se lahko za podatkovno analizo združijo (17). Za preskusne kemikalije, ki kažejo malo ali nič citotoksičnosti, so ustrezni približno 2- do 3-kratni intervali med koncentracijami. V primeru citotoksičnosti morajo izbrane preskusne koncentracije zajemati območje od koncentracije, ki povzroča citotoksičnosti, do koncentracij, pri katerih je citotoksičnost zmerna oziroma majhna ali je ni. Pri številnih preskusnih kemikalijah so vidne strme krivulje odziva na koncentracijo, zato je za zajem celotnega območja citotoksičnosti ali podrobno preučitev razmerja med koncentracijo in odzivom morda treba uporabiti večje število koncentracij, ki so tesno skupaj, in več kot štiri koncentracije, zlasti kadar je treba poskus ponoviti (glej odstavek 43). Uporaba več kot štirih koncentracij je lahko še zlasti pomembna, če se uporabi ena sama kultura.

20.

Če največja koncentracija temelji na citotoksičnosti, si je treba pri najvišji koncentraciji prizadevati za od 20- do 10-odstotno relativno preživetje. Pazljivost je potrebna pri razlagi pozitivnih rezultatov, dobljenih samo pri 10-odstotnem ali manjšem relativnem preživetju (odstavek 43).

21.

Pri slabo topnih preskusnih kemikalijah, ki pri koncentracijah, nižjih od najnižje netopne koncentracije, niso citotoksične, mora najvišja analizirana koncentracija ob koncu tretiranja s preskusno kemikalijo povzročiti nastanek motnosti ali oborine, ki je vidna s prostim očesom ali pod invertnim mikroskopom. Tudi če se citotoksičnost pojavi nad najnižjo netopno koncentracijo, je priporočljivo, da se preskusi le pri eni koncentraciji, ki povzroči nastanek motnosti ali vidne oborine, saj lahko oborina povzroči lažne učinke. Pri koncentraciji, ki povzroči nastanek oborine, je treba paziti, da oborina ne vpliva na izvedbo preskusa. Koristno je lahko, če se pred preskusom določi topnost v gojišču.

22.

Če oborina ni vidna ali ni opažene mejne citotoksičnosti, mora najvišja preskusna koncentracija ustrezati 10 mM, 2 mg/ml ali 2 μl/ml, pri čemer se upošteva najnižja od teh koncentracij (39) (40). Če preskusna kemikalija nima določene sestave, kot so snovi z neznano ali spremenljivo sestavo, kompleksni reakcijski produkti ali biološki materiali (tj. kemijske snovi z neznano ali spremenljivo sestavo (UVCB)) (41), okoljski ekstrakti itd., je v primeru odsotnosti ustrezne citotoksičnosti morda treba povečati najvišjo koncentracijo (npr. 5 mg/ml), da bi se povečala koncentracija vsake posamezne sestavine. Vendar je treba opozoriti, da se lahko pri zdravilih za uporabo v humani medicini te zahteve razlikujejo (42).

Kontrole

23.

Za vsak preskusni pogoj je treba vključiti sočasne negativne kontrole (glej odstavek 16), sestavljene le iz topila v obdelovalnem gojišču in obdelane enako kot kulture za tretiranje.

24.

Sočasne pozitivne kontrole so potrebne, da se dokažeta zmožnost laboratorija, da odkrije mutagene pod pogoji uporabljenega preskusnega protokola, in učinkovitost zunanjega sistema presnovne aktivacije, če je ustrezno. Primeri pozitivnih kontrol so navedeni v preglednici 1. Za pozitivno kontrolo se lahko uporabijo tudi druge snovi, če je to utemeljeno. Ker so in vitro preskusi genotoksičnosti za celice sesalcev dovolj standardizirani, se lahko preskusi, pri katerih se uporablja tretiranje z zunanjim sistemom presnovne aktivacije in brez njega, izvedejo tudi samo s pozitivno kontrolo, pri kateri je potrebna presnovna aktivacija. V tem primeru en sam odziv pri pozitivni kontroli dokaže tako dejavnost sistema presnovne aktivacije kot tudi odzivnost preskusnega sistema. Vsako pozitivno kontrolo je treba uporabiti pri eni ali več koncentracijah, pri katerih se pričakuje obnovljivo in zaznavno povečanje glede na ozadje, da se dokaže občutljivost preskusnega sistema, odziva pa ne sme ogroziti citotoksičnost, ki bi presegla meje, določene za to preskusno metodo (glej odstavek 20).

Preglednica 1

Referenčne snovi, ki se priporočajo za ocenjevanje usposobljenosti laboratorija in izbor pozitivne kontrole

Stanje presnovne aktivacije

Lokus

Snov in št. CAS

Ni zunanje presnovne aktivacije

Hprt

Etilmetansulfonat [št. CAS 62-50-0] Etilnitrozourea [št. CAS 759-73-9] 4-nitrokvinolin 1-oksid [št. CAS 56-57-5]

 

xprt

Streptonigrin [št. CAS 3930-19-6] Mitomicin C [št. CAS 50-07-7]

Zunanja presnovna aktivacija

Hprt

3-metilkolantren [št. CAS 56-49-5] 7,12-dimetilbenzantracen [št. CAS 57-97-6] Benzo[a]piren [št. CAS 50-32-8]

 

xprt

Benzo[a]piren [št. CAS 50-32-8]

POSTOPEK

Tretiranje s preskusno kemikalijo

25.

Množeče se celice se tretirajo s preskusno kemikalijo v prisotnosti in odsotnosti sistema presnovne aktivacije. Čas izpostavljenosti naj bo ustrezno dolg (navadno je ustrezno 3–6 ur).

26.

Najmanjše število celic, ki se za vsako preskusno kulturo (kontrolno in tretirano) uporabijo v vsaki fazi preskusa, mora temeljiti na pogostnosti spontanih mutant. Splošno vodilo je, da se tretira in pasažira dovolj celic, da se v vseh fazah preskusa v vsaki kulturi vzdržuje 10 spontanih mutant (17). Pogostnost spontanih mutant običajno znaša med 5 in 20 × 10-6. Za pogostnost spontanih mutant 5 × 10-6 in vzdrževanje zadostnega števila spontanih mutant (10 ali več) tudi za kulture, tretirane pri koncentracijah, ki povzročijo 90-odstotno citotoksičnost med tretiranjem (10-odstotno relativno preživetje), bi bilo treba tretirati vsaj 20 × 10-6 celic. Poleg tega je treba v obdobju izražanja kultivirati in nasaditi na ploščo zadostno število celic (vendar nikoli manj kot 2 milijona) za selekcijo mutant (17).

Čas izražanja fenotipa in merjenje pogostnosti mutant

27.

Po obdobju tretiranja se celice kultivirajo, da se omogoči izražanje fenotipa mutant. Najmanj 7–9 dni običajno zadostuje za skoraj optimalno izražanje fenotipa na novo induciranih mutant Hprt in xprt (43) (44). V tem obdobju se celice redno kultivirajo v novem gojišču, da se vzdržujejo v fazi eksponentne rasti. Po izražanju fenotipa se celice znova nasadijo v gojišče s selektivno snovjo (6-tiogvanin) in gojišče brez take snovi, da se določita število mutant oziroma učinkovitost tvorbe klonov ob selekciji. Za to nasaditev se lahko uporabijo posode za monoslojne kulture ali mikrotitrske plošče za celice v suspenziji. Za selekcijo mutant je treba celice nasaditi tako na gosto, da se zagotovi optimalna pridobitev mutant (tj. da se prepreči metabolično sodelovanje) (17). Plošče se inkubirajo primerno dolgo za optimalno rast kolonije (npr. 7–12 dni), kolonije pa se preštejejo. Pogostnost mutant se izračuna iz števila mutiranih kolonij, korigiranega z učinkovitostjo tvorbe klonov ob selekciji mutant (za formule glej Dodatek 2).

Usposobljenost laboratorija

28.

Preden se začne laboratorij uporabljati za rutinsko preskušanje, mora izvesti sklop preskusov z referenčnimi pozitivnimi snovmi, ki delujejo z različnimi mehanizmi (vsaj ena aktivna s presnovno aktivacijo in ena aktivna brez nje, pri čemer sta snovi izbrani med snovmi s seznama v preglednici 1) in različnimi negativnimi kontrolami (z uporabo različnih topil/vehiklov), s čimer dokaže, da ima zadostne izkušnje s preskusom. Ti odzivi pozitivnih in negativnih kontrol morajo biti skladni z viri. To ne velja za laboratorije, ki imajo izkušnje, tj. ki imajo na voljo zbirko podatkov iz preteklih preskusov, kot je opredeljena v odstavkih od 30 do 33.

29.

Izbor snovi za pozitivno kontrolo (glej preglednico 1 v odstavku 25) je treba preiskati brez presnovne aktivacije in ob presnovni aktivaciji, da se dokažejo usposobljenost za zaznavanje mutagenih kemikalij in določanje učinkovitosti sistema presnovne aktivacije, ustreznost pogojev za rast celic med tretiranjem, izražanjem fenotipa in selekcijo mutant ter ustreznost postopkov štetja. Izbrati je treba območje koncentracij izbranih kemikalij, kar omogoča ponovljiva in s koncentracijo povezana povečanja glede na ozadje, da se pokažeta občutljivost in dinamično območje preskusnega sistema.

Podatki o kontrolah iz preteklih preskusov

30.

Laboratorij mora določiti:

območje in porazdelitev pozitivnih kontrol iz preteklih preskusov ter

območje in porazdelitev negativnih kontrol (netretirane, topilo) iz preteklih preskusov.

31.

Ko se podatki za porazdelitev negativnih kontrol iz preteklih preskusov pridobivajo prvič, morajo biti sočasne negativne kontrole skladne z objavljenimi podatki o kontrolah (22). Ko se k porazdelitvi kontrol dodaja več podatkov o preskusu, sočasne negativne kontrole po možnosti ne smejo presegati 95-odstotne kontrolne meje za navedeno porazdelitev (17) (45) (46).

32.

Zbirka podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov mora sprva temeljiti na vsaj 10 preskusih, po možnosti pa mora biti sestavljena iz vsaj 20 preskusov, izvedenih v primerljivih preskusnih pogojih. Laboratoriji morajo uporabljati metode nadzora kakovosti, kot so kontrolne karte (npr. c-karte ali karte ‚X-črta‘ (47)), da opredelijo, kako variabilni so njihovi podatki o pozitivnih in negativnih kontrolah, ter pokažejo, da je metodologija v njihovem laboratoriju ‚pod nadzorom‘ (46). Nadaljnja priporočila o načinu oblikovanja in uporabe podatkov iz preteklih preskusov (npr. merila za vključitev podatkov med podatke iz preteklih preskusov in njihovo izključitev iz teh podatkov ter merila za sprejemljivost za zadevni poskus) so navedena v virih (45).

33.

V podatke o negativnih kontrolah je treba vključiti pogostnost mutant iz ene kulture ali po možnosti ponovljenih vzorcev kulture, kot je opisano v odstavku 23. Sočasne negativne kontrole po možnosti ne smejo presegati 95-odstotne kontrolne meje porazdelitve iz zbirke podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (17) (45) (46). Kadar podatki o sočasni negativni kontroli presežejo 95-odstotno kontrolno mejo, jih je sprejemljivo vključiti v porazdelitev kontrol iz preteklih preskusov, če ti podatki niso izjemni osamelci ter če obstaja dokaz, da je preskusni sistem ‚pod nadzorom‘ (glej zgoraj), in dokaz o odsotnosti tehničnih ali človeških napak.

34.

Vsako spremembo v protokolu preskusa je treba preučiti glede na skladnost z obstoječimi zbirkami podatkov laboratorija o kontrolah iz preteklih preskusov. Če se pojavijo večje neskladnosti, je treba ustvariti novo zbirko podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov.

PODATKI IN POROČANJE

Predstavitev rezultatov

35.

V predstavitev rezultatov je treba vključiti vse podatke, potrebne za izračun citotoksičnosti (izražene kot relativno preživetje). Podatki za tretirane in kontrolne kulture morajo vključevati število celic ob koncu tretiranja, število celic, nasajenih na ploščo takoj po tretiranju, in število kolonij (ali število jamic brez kolonij pri metodi z mikrotitrsko ploščo). Relativno preživetje za vsako kulturo je treba izraziti kot delež glede na hkratno kontrolo s topilom (za opredelitve pojmov glej Dodatek 1).

36.

V predstavitev rezultatov je treba vključiti tudi vse podatke, potrebne za izračun pogostnosti mutant. Podatki za tretirane in kontrolne kulture morajo vključevati: (1) število celic, nasajenih na ploščo s selektivno snovjo in brez take snovi (ob nasaditvi celic na ploščo za selekcijo mutant), ter (2) število preštetih kolonij (ali število jamic brez kolonij pri metodi z mikrotitrsko ploščo) na ploščah s selektivno snovjo in brez take snovi. Pogostnost mutant se izračuna iz števila mutiranih kolonij (na ploščah s selektivno snovjo), korigiranega z učinkovitostjo tvorbe klonov (s plošč brez selektivne snovi). Pogostnost mutant je treba izraziti kot število mutiranih celic na milijon viabilnih celic (za opredelitve pojmov glej Dodatek 1).

37.

Navesti je treba podatke za posamezne kulture. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v obliki preglednice.

Merila za sprejemljivost

38.

Sprejemljivost preskusa temelji na merilih, navedenih v nadaljevanju.

Šteje se, da je sočasna negativna kontrola sprejemljiva za vključitev v zbirko podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov, kot je opisano v odstavku 33.

Sočasne pozitivne kontrole (glej odstavek 24) morajo povzročiti odzive, skladne z odzivi iz zbirke podatkov o pozitivnih kontrolah iz preteklih preskusov, in statistično značilno povečanje v primerjavi s sočasno negativno kontrolo.

Preskušena sta bila dva preskusna pogoja (tj. s presnovno aktivacijo in brez nje), razen če so pri enem nastali pozitivni rezultati (glej odstavek 25).

Analizirati je mogoče ustrezno število celic in koncentracij (odstavki 25, 26 in 19).

Merila za izbor najvišje koncentracije so skladna z merili, opisanimi v odstavkih 20, 21 in 22.

Vrednotenje in razlaga rezultatov

39.

Če so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje kot jasno pozitivna, če se v katerem koli od preučevanih preskusnih pogojev:

pri vsaj eni od preskusnih koncentracij pokaže statistično značilno povečanje v primerjavi s sočasno negativno kontrolo;

pojavi povečanje, povezano s koncentracijo, kadar se ocenjuje z ustreznim trendnostnim testom;

pojavijo rezultati zunaj porazdelitve podatkov o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (npr. 95-odstotna kontrolna meja, ki temelji na Poissonovi porazdelitvi; glej odstavek 33).

Ko so izpolnjena vsa ta merila, se nato šteje, da lahko preskusna kemikalija povzroči nastanek genskih mutacij v kultiviranih celicah sesalcev v tem preskusnem sistemu. Priporočila glede najustreznejših statističnih metod so navedena v virih (46) (48).

40.

Če so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno negativno, če se v katerem koli od preučevanih preskusnih pogojev:

pri nobeni od preskusnih koncentracij ne pokaže statistično značilno povečanje v primerjavi s sočasno negativno kontrolo;

ne pojavi povečanje, povezano s koncentracijo, kadar se ocenjuje z ustreznim trendnostnim testom;

vsi rezultati nahajajo znotraj porazdelitve podatkov o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (npr. 95-odstotna kontrolna meja, ki temelji na Poissonovi porazdelitvi; glej odstavek 33).

Nato se šteje, da preskusna kemikalija ne more povzročiti nastanka genskih mutacij v kultiviranih celicah sesalcev v tem preskusnem sistemu.

41.

Preverjanje jasno pozitivnega ali jasno negativnega odziva ni potrebno.

42.

Če odziv ni niti jasno negativen niti jasno pozitiven, kot je opisano zgoraj, ali za podporo pri ugotavljanju biološke pomembnosti rezultatov je treba podatke oceniti s strokovno presojo in/ali nadaljnjimi preiskavami. Izvedba ponovitve poskusa je lahko koristna, po možnosti z uporabo spremenjenih preskusnih pogojev (npr. razmik med koncentracijami, drugi pogoji za presnovno aktivacijo (tj. koncentracija ali izvor S9)).

43.

Zbirka podatkov v redkih primerih celo po izvedbi nadaljnjih preiskav onemogoča sprejetje sklepa o pozitivnih ali negativnih rezultatih. Zato je treba zaključiti, da je odziv na preskusno kemikalijo dvoumen (kar pomeni, da je enako verjetno pozitiven ali negativen).

Poročilo o preskusu

44.

V poročilo o preskusu se vključijo podatki, navedeni v nadaljevanju.

 

Preskusna kemikalija:

vir, številka serije, rok uporabe, če je na voljo;

stabilnost preskusne kemikalije, če je znana;

topnost in stabilnost preskusne kemikalije v topilu, če sta znani;

meritve vrednosti pH, osmolarnosti in oborine v gojišču, ki mu je bila dodana preskusna kemikalija, če je ustrezno.

 

Snov iz ene sestavine

fizični videz, topnost v vodi in dodatne ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti;

 

kemijski identifikacijski podatki, kot so ime po nomenklaturi IUPAC ali ime CAS, številka CAS, koda po sistemu SMILES ali identifikatorju InChI, strukturna formula, čistost, kemijska identiteta nečistoč, kot je ustrezno in praktično izvedljivo, itd.

Snov z več sestavinami, UVCB in zmesi:

čim obsežnejša opredelitev lastnosti s kemijsko identiteto (glej zgoraj), kvantitativnim pojavljanjem in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi sestavin.

 

Topilo:

utemeljitev izbire topila;

delež topila v končnem gojišču.

 

Celice:

 

za laboratorijske izvorne kulture:

vrsta, izvor celičnih linij;

število pasaž, če je na voljo, in pretekli rezultati v laboratoriju;

lastnosti kariotipa in/ali modalno število kromosomov;

metode vzdrževanja celičnih kultur;

odsotnost mikoplazem;

podvojitveni čas celic.

 

Preskusni pogoji:

razlogi za izbiro koncentracij in števila kultur, vključno z npr. podatki o citotoksičnosti in mejami topnosti;

sestava gojišča, koncentracija CO2, stopnja vlažnosti;

koncentracija preskusne kemikalije, izražena kot končna koncentracija v gojišču (npr. v μg ali mg/ml ali mM gojišča);

koncentracija (in/ali količina) topila in preskusne kemikalije, ki se dodata v gojišče;

temperatura inkubacije;

čas inkubacije;

trajanje tretiranja;

gostota celic med tretiranjem;

vrsta in sestava sistema presnovne aktivacije (vir S9, način priprave zmesi S9, koncentracija ali količina zmesi S9 in S9 v končnem gojišču, nadzor kakovosti S9); snovi pozitivne in negativne kontrole, končne koncentracije za vsak pogoj tretiranja;

dolžina časa izražanja (skupaj s številom nasajenih celic ter programom kultiviranja na novem gojišču in dodajanja hranil, če je to primerno);

identiteta selektivne snovi in njena koncentracija;

merila za sprejemljivost preskusov;

uporabljene metode za določanje števila viabilnih in mutiranih celic;

uporabljene metode za merjenje citotoksičnosti;

vsi dodatni podatki, pomembni za citotoksičnost in uporabljeno metodo;

trajanje inkubacije po nasaditvi na ploščo;

merila za obravnavanje študij kot pozitivnih, negativnih ali dvoumnih;

uporabljene metode za določitev vrednosti pH, osmolarnosti in obarjanja.

 

Rezultati:

število tretiranih celic in število celic, kultiviranih na novem gojišču, za vsako kulturo;

meritve citotoksičnosti in morebitna druga opažanja;

znaki obarjanja in čas odkritja;

število celic, nasajenih v selektivno in neselektivno gojišče;

število kolonij v neselektivnem gojišču in število odpornih kolonij v selektivnem gojišču ter s tem povezani pogostnosti mutant;

razmerje med koncentracijo in odzivom, kadar je mogoče;

podatki o sočasnih negativnih (s topilom) in pozitivnih kontrolah (koncentracije in topila);

podatki o negativnih (s topilom) in pozitivnih kontrolah iz preteklih preskusov, razponi, srednje vrednosti in standardni odkloni ter interval zaupanja (npr. 95 %), pa tudi število podatkov;

statistične analize (za posamezne kulture in združene ponovljene vzorce, če je ustrezno) in p-vrednosti, če obstajajo.

 

Razprava o rezultatih

 

Sklepna ugotovitev

VIRI

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, št. 234, OECD, Pariz.

(2)

Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J., in Tindall, K. R. (ur.). (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(3)

Chu, E. H. Y., in Malling, H. V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., ZDA, 61, 1306–1312.

(4)

Moore, M. M., Harrington-Brock, K., Doerr, C. L., in Dearfield, K. L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394–403.

(5)

Aaron, C. S., in Stankowski, L. F., Jr. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121–128.

(6)

Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, L., Theiss, J., in Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235-239.

(7)

Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H., in Wasson, J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. Mutation Res., 196, 17–36.

(8)

Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J., in Myhr, B. C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147–204.

(9)

Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I., in Okumura, K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10)

Brusick, D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789–886.

(11)

Nesslany, F., Simar-Meintieres, S., Watzinger, M., Talahari, I., in Marzin, D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439–452.

(12)

Long, L. H., Kirkland, D., Whitwell, J., in Halliwell, B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177–183.

(13)

Kirkland, D., Aardema, M., Henderson, L., in Müller, L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14)

Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O’Neill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F., Jr., in Yang, L. L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15)

Liber, H. L., Yandell, D. W., in Little, J. B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16)

Stankowski, L. F., Jr., Tindall, K. R., in Hsie, A. W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17)

Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B., in Asquith, J. C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. V: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J. (ur.). CambridgeUniversity Press, str. 66–101.

(18)

Hsie, A. W., Casciano, D. A., Couch, D. B., Krahn, D. F., O’Neill, J. P., in Whitfield, B. L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193–214.

(19)

Li, A. P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165–175.

(20)

Tindall, K. R., Stankowski, L. F., Jr., Machanoff, R., in Hsie, A. W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411–1415.

(21)

Hsie, A. W., Recio, L., Katz, D. S., Lee, C. Q., Wagner, M., in Schenley, R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.

(22)

Lorge, E., Moore, M., Clements, J., Donovan, M. O., Honma, M., Kohara, A., Van Benthem, J., Galloway, S., Armstrong, M. J., Thybaud, V., Gollapudi, B., Aardema, M., Kim, J., Sutter, A., in Kirkland, D. J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Rokopis v pripravi).

(23)

Coecke, S., Balls, M., Bowe, G., Davis, J., Gstraunthaler, G., Hartung, T., Hay, R., Merten, O. W., Price, A., Schechtman, L., Stacey, G., in Stokes, W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261–287.

(24)

Rosen, M. P., San, R. H. C., in Stich, H. F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299–305.

(25)

Natarajan, A. T., Tates, A. D., Van Buul, P. P. W., Meijers, M., in de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens After Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26)

Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N., in Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27)

Ames, B. N., McCann, J., in Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28)

Maron, D. M., in Ames, B. N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)

Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., in Wolf, R. C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., in Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. V: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. De Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R., in Philpot, R. M. (ur.). Elsevier, North-Holland, str. 85–88.

(31)

Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C. R., in Zeiger, E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55–65.

(32)

Johnson, T. E., Umbenhauer, D. R., in Galloway, S. M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51–59.

(33)

UNEP. (2001). Stockholmska konvencija o obstojnih organskih onesnaževalih, Program Združenih narodov za okolje (UNEP). Na voljo na: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan, E.-L., in Hsie, A. W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)

O’Neill, J. P., Machanoff, R., San Sebastian, J. R., in Hsie, A. W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7–18.

(36)

Li, A. P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37)

Krahn, D. F., Barsky, F. C., in McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. V: Tice, R. R., Costa, D. L., in Schaich, K. M. (ur.). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, str. 91–103.

(38)

Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P., in Brooks, A. L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795–801.

(39)

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (smernice za preskušanje 473, 476 in 487). Na voljo na zahtevo pri Organizaciji za gospodarsko sodelovanje in razvoj.

(40)

Brookmire, L., Chen, J. J., in Levy, D. D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Na voljo na: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill, J. P., in Hsie, A. W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109–118.

(44)

Chiewchanwit, T., Ma, H., El Zein, R., Hallberg, L., in Au, W. W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121–8.

(45)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J., in Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87–90.

(46)

OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 199), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(47)

Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O., in Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. V: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D. J. (ur.). Cambridge University Press, Cambridge, str. 141–154.

(48)

Fleiss, J. L., Levin, B., in Paik, M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, 3. izdaja, New York: John Wiley & Sons.

Dodatek 1

OPREDELITVE POJMOV

Mutageni substitucije baznih parov: kemikalije, ki povzročijo zamenjavo baznih parov v DNK.

Kemikalija: snov ali zmes.

Učinkovitost tvorbe klonov: delež celic, nasajenih na ploščo pri nizki gostoti in sposobnih zrasti v kolonijo, ki jo je mogoče prešteti.

Koncentracije: se nanašajo na končne koncentracije preskusne kemikalije v gojišču.

Citotoksičnost: za poskuse, zajete v to preskusno metodo, je citotoksičnost opredeljena kot zmanjšanje relativnega preživetja tretiranih celic v primerjavi z negativnimi kontrolami (glej zadevni odstavek).

Napredna mutacija: genska mutacija starševskega tipa mutirane oblike, ki povzroči spremembo ali izgubo encimskega delovanja ali funkcije kodiranega proteina.

Mutageni premika bralnega okvira: kemikalije, ki povzročijo adicijo ali delecijo enega ali več baznih parov v molekuli DNK.

Genotoksično: splošni izraz, ki zajema vse poškodbe DNK ali kromosomov, vključno s prelomi DNK, prerazporeditvijo aduktov, mutacijami, aberacijami kromosomov in anevploidijo. Vsi genotoksični učinki ne vplivajo na nastanek mutacij ali trajnih kromosomskih poškodb.

Gojišče HAT: gojišče, ki vsebuje hipoksantin, aminopterin in timidin ter se uporablja za čiščenje mutant Hprt.

Mitotična rekombinacija: med mitozo rekombinacija med homolognimi kromatidi, ki lahko povzroči indukcijo prelomov dvojne vijačnice DNK ali izgubo heterozigotnosti.

Gojišče MPA: gojišče, ki vsebuje ksantin, adenin, timidin, aminopterin in mikofenolno kislino ter se uporablja za čiščenje mutant Xprt.

Mutageno: povzroča dedno spremembo zaporedij baznih parov DNK v genih ali strukture kromosomov (kromosomske aberacije).

Pogostnost mutant: število opaženih mutiranih kolonij, deljeno s številom celic, nasajenih na ploščah v selektivnem gojišču, korigirano z učinkovitostjo tvorbe klonov (ali viabilnostjo) ob selekciji.

Čas izražanja fenotipa: čas po tretiranju, v katerem je gensko spreminjanje fiksirano znotraj genoma, vsi morebitni predhodno obstoječi genski produkti pa so odstranjeni, tako da se spremeni fenotipska lastnost.

Relativno preživetje: relativno preživetje se uporablja kot merilo za citotoksičnost, povezano s tretiranjem. Pomeni učinkovitost tvorbe klonov celic, nasajenih na ploščo takoj po tretiranju, prilagojeno z morebitno izgubo celic med tretiranjem, v primerjavi z učinkovitostjo tvorbe klonov pri negativnih kontrolah (ki se jim pripiše 100-odstotno preživetje).

Frakcije S9, pripravljene iz jeter: supernatant iz homogenata jeter po centrifugiranju pri 9 000 g, tj. izvleček surovih jeter.

Mešanica S9: mešanica frakcije S9, pripravljene iz jeter, in kofaktorjev, potrebnih za dejavnosti presnovnih encimov.

Kontrola s topilom: splošni pojem za opredelitev kontrolnih kultur, ki prejmejo samo topilo, uporabljeno za raztopitev preskusne kemikalije.

Preskusna kemikalija: vsaka snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo.

Netretirana kontrola: kulture, ki se ne tretirajo (tj. niti s preskusno kemikalijo niti s topilom), temveč se sočasno obdelujejo enako kot kulture, v katere se doda preskusna kemikalija.

UVCB: snovi z neznano ali spremenljivo sestavo, kompleksni reakcijski produkti in biološki materiali.

Dodatek 2

FORMULE ZA OCENO CITOTOKSIČNOSTI IN POGOSTNOSTI MUTANT

Citotoksičnost se oceni z relativnim preživetjem, tj. učinkovitostjo tvorbe klonov (CE) celic, nasajenih na ploščo takoj po tretiranju, prilagojeno z morebitno izgubo celic med tretiranjem, v primerjavi s prilagojeno učinkovitostjo tvorbe klonov pri negativnih kontrolah (ki se jim pripiše 100-odstotno preživetje) (glej formulo za relativno preživetje (RS) v nadaljevanju).

Prilagojena učinkovitost tvorbe klonov za kulturo, tretirano s preskusno kemikalijo, se izračuna kot:

Formula

Relativno preživetje za kulturo, tretirano s preskusno kemikalijo, se izračuna kot:

Formula

Pogostnost mutant je učinkovitost tvorbe klonov v mutiranih kolonijah v selektivnem gojišču, deljena z učinkovitostjo tvorbe klonov v neselektivnem gojišču, ob selekciji izmerjeno za isto kulturo.

Formula

Kadar se za učinkovitost tvorbe klonov uporabljajo plošče:

učinkovitost tvorbe klonov = število kolonij/število celic, nasajenih na ploščo.

Kadar se za učinkovitost tvorbe klonov uporabljajo mikrotitrske plošče:

število kolonij na vsako jamico na mikrotitrskih ploščah sledi Poissonovi porazdelitvi.

Učinkovitost tvorbe klonov = –LnP(0)/število celic, nasajenih na ploščo, na jamico

Kjer je –LnP(0) verjetno število praznih jamic med nasajenimi celicami, opisano z naslednjo formulo

LnP(0) = –Ln (število praznih jamic/število nasajenih jamic)

(3)

Poglavje B.22 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.22   PRESKUS DOMINANTNE SMRTNOSTI NA GLODAVCIH

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici OECD za preskušanje (TG) 478 (2016). Preskusne metode se redno preverjajo ob upoštevanju znanstvenega napredka, spreminjajočih se regulativnih zahtev in preudarkov v zvezi z dobrobitjo živali. Pri tej spremenjeni različici preskusne metode se upoštevajo več kot tridesetletne izkušnje s tem preskusom ter možnosti za združevanje ali kombiniranje tega preskusa z drugimi preskusi toksičnosti, kot sta razvojna in reproduktivna toksičnost, ali študijami genotoksičnosti; vendar ta preskus zaradi svojih omejitev in uporabe velikega števila živali ni namenjen temu, da bi se uporabljal kot glavna metoda, temveč kot dopolnilna preskusna metoda, ki se lahko uporabi samo, kadar ni druge možnosti glede na regulativne zahteve. S kombiniranjem preskušanja toksičnosti bi bilo mogoče velikemu številu živali prizanesti z uporabo v preskusih toksičnosti. OECD je pripravila dokument z jedrnatimi informacijami o preskušanju v zvezi z genetsko toksikologijo in pregledom nedavnih sprememb smernic OECD za preskušanje v zvezi z genetsko toksikologijo (1).

2.

Namen preskusa dominantne smrtnosti je raziskati, ali kemikalije povzročajo mutacije, ki so posledica kromosomskih aberacij v zarodnih celicah. Poleg tega je preskus dominantne smrtnosti primeren za ocenjevanje genotoksičnosti, saj so pri tem aktivni dejavniki metabolizma in vivo, farmakokinetike in popravljanja DNK, ki prispevajo k odzivu, čeprav se lahko med posameznimi vrstami razlikujejo. Indukcija dominantne smrtne mutacije po izpostavljenosti preskusni kemikaliji kaže, da kemikalija deluje na zarodno tkivo preskusne živali.

3.

Dominantne smrtne mutacije povzročajo embrionalno ali fetalno smrt. Indukcija dominantne smrtne mutacije po izpostavljenosti preskusni kemikaliji kaže, da je kemikalija vplivala na zarodne celice preskusne živali.

4.

Poskus dominantne smrtnosti je koristen za potrditev pozitivnih rezultatov preskusov s somatskimi končnimi točkami in vivo ter je ustrezna končna točka za napoved nevarnosti za ljudi in tveganje genskih bolezni, ki se prenašajo prek zarodne linije. Vendar je za ta preskus potrebnih veliko živali in je delovno intenziven; posledično je njegova izvedba zelo draga in zamudna. Ker je spontana pogostnost dominantnih smrtnih mutacij precej visoka, je občutljivost preskusa za zaznavo majhnih povečanj pogostnosti mutacij na splošno omejena.

5.

Opredelitve ključnih pojmov so navedene v Dodatku 1.

ZAČETNI PREUDARKI

6.

Preskus se najpogosteje izvaja na miših (2) (3) (4), vendar so lahko v nekaterih primerih primerne tudi druge vrste, kot so podgane (5) (6) (7) (8), če je to znanstveno utemeljeno. Dominantne smrtnosti so običajno posledica velikih kromosomskih aberacij (strukturne in numerične anomalije) (9) (10) (11), vendar genskih mutacij ni mogoče izključiti. Dominantna smrtna mutacija je mutacija, ki nastane v sami zarodni celici ali se po oploditvi fiksira v zgodnjem zarodku in ne povzroči nepravilnega delovanja gamete, vendar je smrtonosna za oplojeno jajčece ali razvijajoči se zarodek.

7.

Posamezni samci se v ustreznih časovnih presledkih zaporedno parijo s samicami, ki se še niso parile. Število parjenj po tretiranju je odvisno od glavnega namena študije dominantne smrtnosti (odstavek 23) in mora zagotavljati, da se za dominantne smrtnosti ocenijo vse faze zorenja moške zarodne celice (12).

8.

Če obstajajo dokazi, da preskusna kemikalija ali njeni metaboliti ne bodo dosegli moda, ta preskus ni primeren.

NAČELO PRESKUSA

9.

Na splošno se samci izpostavijo preskusni kemikaliji z ustreznim načinom izpostavljenosti in parijo z netretiranimi samicami, ki se še niso parile. Z zaporednimi intervali parjenja se lahko preskušajo različne vrste zarodnih celic. Po parjenju se samice po ustreznem času evtanazirajo, njihove maternice pa se pregledajo, da se določi število ugnezditev ter živih in mrtvih zarodkov. Dominantna smrtnost preskusne kemikalije se določi s primerjavo živih ugnezditev na samico v tretirani skupini z živimi ugnezditvami na samico v kontrolni skupini z vehiklom/topilom. Porast števila mrtvih ugnezditev na samico v tretirani skupini nad število mrtvih ugnezditev na samico v kontrolni skupini kaže na izgubo po ugnezditvi, povzročeno s preskusno kemikalijo. Izguba po ugnezditvi se izračuna z določitvijo razmerja med mrtvimi ugnezditvami in skupnim številom ugnezditev v tretirani skupini v primerjavi z razmerjem med mrtvimi ugnezditvami in skupnim številom ugnezditev v kontrolni skupini. Izguba pred ugnezditvijo se lahko oceni s primerjavo števila rumenih telesc, od katerega se odšteje skupno število ugnezditev, ali skupnega števila ugnezditev na samico v tretirani in kontrolni skupini.

PREVERJANJE USPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA

10.

Usposobljenost za ta poskus je treba dokazati tako, da se pokaže sposobnost za ponovitev pogostnosti dominantne smrtnosti iz objavljenih podatkov (npr. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) s snovmi za pozitivno kontrolo (vključno z blagimi odzivi), kot so tiste iz preglednice 1, in kontrolami z vehiklom, pri čemer se dobijo pogostnosti iz negativnih kontrol, ki so v skladu s sprejemljivim razponom podatkov (glej vire zgoraj) ali s porazdelitvijo kontrol iz preteklih preskusov laboratorija, če je na voljo.

OPIS METODE

Pripravki

Izbira živalskih vrst

11.

Uporabiti je treba splošno uporabljane laboratorijske seve zdravih spolno zrelih živali. Običajno se uporabljajo miši, primerne pa so lahko tudi podgane. Uporabi se lahko katera koli druga ustrezna vrsta sesalcev, če je to v poročilu znanstveno utemeljeno.

Pogoji nastanitve in hranjenja živali

12.

Pri glodavcih mora biti temperatura v prostoru s poskusnimi živalmi 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 40-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, si je treba prizadevati za 50–60-odstotno vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne mešanice preskusne kemikalije, kadar se daje na ta način. Pred tretiranjem ali parjenjem je treba glodavce nastaniti v majhnih skupinah (ne več kot pet na kletko), tako da so razporejeni glede na spol, če agresivno vedenje ni pričakovano ali opaženo, in tretirano skupino, in sicer po možnosti v kletke s trdimi tlemi z ustrezno okoljsko obogatitvijo. Živali so lahko nastanjene posamično le, če je to znanstveno utemeljeno.

Priprava živali

13.

Zdravi in spolno zreli odrasli samci in samice se naključno dodelijo kontrolni in tretirani skupini. Posamezne živali se označijo z edinstvenimi oznakami s humano, čim manj invazivno metodo (npr. z namestitvijo obročkov ali trakov, z vsaditvijo mikročipa ali biometrično identifikacijo, ne pa z zarezovanjem ušesa in prsta) ter se vsaj pet dni prilagajajo laboratorijskim pogojem. Kletke je treba razporediti tako, da se čim bolj zmanjšajo morebitni učinki, ki nastanejo zaradi razporeditve kletk. Izogibati se je treba navzkrižni kontaminaciji s pozitivno kontrolo in preskusno kemikalijo. Ob začetku študije mora biti razlika med težami živali čim manjša in ne sme presegati ± 20 % srednje vrednosti teže za vsak spol.

Priprava odmerkov

14.

Trdne preskusne kemikalije je treba raztopiti ali suspendirati v ustreznih topilih ali vehiklih ali primešati hrani ali pitni vodi, preden se odmerijo živalim. Tekoče preskusne kemikalije se lahko odmerijo neposredno ali pa se pred odmerjanjem razredčijo. Pri izpostavljenosti z vdihavanjem se lahko preskusne kemikalije glede na svoje fizikalno-kemijske lastnosti dajejo v obliki plina, pare ali trdnega/tekočega aerosola. Uporabiti je treba sveže pripravljene preskusne kemikalije, razen če je iz podatkov o stabilnosti razvidno, da je shranjevanje sprejemljivo, in so v njih opredeljeni ustrezni pogoji shranjevanja.

Preskusni pogoji

Topilo/vehikel

15.

Topilo/vehikel ne sme imeti toksičnih učinkov pri uporabljenih odmerkih in ne sme zbujati suma, da lahko kemično reagira s preskusno kemikalijo. Če se uporabijo druga, manj znana topila/vehikli, je treba njihovo uporabo podpreti z referenčnimi podatki, ki dokazujejo njihovo združljivost. Priporočljivo je, da se, kadar koli je to mogoče, najprej razmisli o uporabi vodnega topila/vehikla. Primeri pogosto uporabljenih, združljivih topil/vehiklov so voda, fiziološka raztopina, raztopina metilceluloze, raztopina natrijeve soli karboksimetil celuloze, oljčno olje in koruzno olje.

Pozitivne kontrole

16.

Vedno je treba uporabiti živali za sočasne pozitivne kontrole, razen če je laboratorij dokazal usposobljenost za izvedbo preskusa in je v zadnjem času preskus redno uporabljal (npr. v zadnjih petih letih). Vendar živali za pozitivne kontrole ni treba tretirati enako kot živali, ki prejmejo preskusno kemikalijo, niti ni treba vzorčiti vseh intervalov parjenja. Za snovi za pozitivno kontrolo mora biti znano, da povzročajo dominantne smrtnosti v pogojih, uporabljenih pri preskusu. Z živalmi v kontrolnih skupinah je treba ravnati enako kot z živalmi v tretiranih skupinah, le da se ne tretirajo.

17.

Odmerki snovi za pozitivno kontrolo morajo biti izbrani tako, da povzročajo blage ali zmerne učinke, ki kritično ocenijo uspešnost in občutljivost preskusa, vendar dosledno povzročajo pozitivne učinke dominantne smrtnosti. Primeri snovi za pozitivno kontrolo in ustrezni odmerki so navedeni v preglednici 1.

Preglednica 1

Primeri snovi za pozitivno kontrolo

SNOV [št. CAS]

(referenčna št.)

Razpon efektivne doze (mg/kg)

(vrsta glodavcev)

Čas dajanja (v dnevih)

Trietilenmelamin [51-18-3] (15)

0,25 (miši)

1

Ciklofosfamid [50-18-0] (19)

50–150 (miši)

5

Ciklofosfamid [50-18-0] (5)

25–100 (podgane)

1

Etil metansulfonat [62-50-0] (13)

100-300 (miši)

5

Monomerni akrilamid [79-06-1] (17)

50 (miši)

5

Klorambucil [305-03-3] (14)

25 (miši)

1

Negativne kontrole

18.

Živali za negativno kontrolo, tretirane samo s topilom ali vehiklom, sicer pa tretirane enako kot tretirane skupine, je treba vključiti za vsak čas vzorčenja (20). Če ni kontrolnih podatkov iz preteklih preskusov ali objavljenih podatkov, iz katerih bi bilo razvidno, da izbrano topilo/vehikel ne povzroča dominantnih smrtnosti ali drugih škodljivih učinkov, je treba za vsak čas vzorčenja vključiti tudi netretirane kontrolne živali, da se dokaže sprejemljivost kontrol z vehiklom.

POSTOPEK

Število živali

19.

Posamezni samci se parijo v ustreznih vnaprej določenih intervalih (npr. tedenskih, odstavka 21 in 23), po možnosti z eno samico, ki se še ni parila. Število samcev na skupino je treba določiti vnaprej, da zadostuje (v povezavi s številom sparjenih samic pri vsakem intervalu parjenja) za zagotovitev statistične moči, potrebne za zaznavo vsaj podvojitve pogostnosti dominantne smrtnosti (odstavek 44).

20.

Tudi število samic na interval parjenja je treba določiti vnaprej z izračuni statistične moči, da se omogoči zaznava vsaj podvojitve pogostnosti dominantne smrtnosti (tj. dovolj brejih samic, da se zagotovi vsaj 400 vseh ugnezditev) (20) (21) (22) (23) in da se pričakuje vsaj ena mrtva ugnezditev na enoto analize (tj. paritvena skupina na odmerek) (24).

Obdobje dajanja odmerkov in intervali parjenja

21.

Število intervalov parjenja po tretiranju je določeno s časovnim razporedom tretiranja in mora zagotavljati, da se v vseh fazah zorenja moške zarodne celice oceni indukcija dominantne smrtnosti (12) (25). Pri enkratnem tretiranju z dajanjem največ petih dnevnih odmerkov je treba po zadnjem tretiranju v tedenskih intervalih izvesti osem (pri miših) ali deset (pri podganah) parjenj. Pri dajanju večkratnih odmerkov se lahko število intervalov parjenja zmanjša sorazmerno s podaljšanjem obdobja dajanja, pri čemer je treba ohraniti cilj, da se ocenijo vse faze spermatogeneze (npr. po 28-dnevni izpostavljenosti zadostujejo samo štiri tedenska parjenja, da se ocenijo vse faze spermatogeneze pri miših). Vsi časovni razporedi tretiranj in parjenj morajo biti znanstveno utemeljeni.

22.

Samice morajo ostati pri samcih vsaj v času enega pojatvenega ciklusa (npr. en teden zajema en pojatveni ciklus pri miših in podganah). Samice, ki se med enotedenskim intervalom niso parile, se lahko uporabijo za naslednji interval parjenja. Ali dokler se ne zgodi parjenje, kar se ugotovi ob prisotnosti semenčic v vagini ali ob prisotnosti vaginalnega zamaška.

23.

Uporabljeni režim izpostavljenosti in parjenja je odvisen od glavnega namena študije dominantne smrtnosti. Če je cilj ugotoviti, ali zadevna kemikalija povzroča dominantne smrtne mutacije same po sebi, bi bila sprejemljiva metoda z izpostavitvijo celotnega kroga spermatogeneze (npr. sedem tednov pri miših, 5–7 tretiranj na teden) in parjenjem enkrat ob koncu zadevnega kroga. Če pa je cilj opredeliti vrsto zarodnih celic, občutljivo za indukcijo dominantne smrtnosti, potem je priporočljiva enkratna ali petdnevna izpostavljenost, ki ji sledi tedensko parjenje.

Velikost odmerkov

24.

Če se izvede predhodna študija za določanje območja, ker ustrezni podatki, ki bi bili v pomoč pri izbiri odmerkov, niso na voljo, jo je treba izvesti v istem laboratoriju ter pri tem uporabiti iste vrste, sev, spol in režim tretiranja kot v glavni študiji (26). S študijo je treba določiti največji tolerančni odmerek (MTD), ki je opredeljen kot največji odmerek, ki ga je mogoče prenesti, ne da bi se pri tem pokazala toksičnost, ki bi v povezavi z obdobjem trajanja študije slednjo omejevala (na primer nenormalno vedenje ali odzivi, manjša upočasnitev pridobivanja telesne teže ali citotoksičnost za hematopoetski sistem), ne pa smrt ali znaki bolečine ali trpljenja, zaradi katerih je potrebna humana evtanazija (27).

25.

Največji tolerančni odmerek tudi ne sme negativno vplivati na uspešnost parjenja (21).

26.

Preskusne kemikalije s specifičnim biološkim delovanjem pri majhnih, netoksičnih odmerkih (kakor so hormoni in mitogeni) in kemikalije, ki kažejo nasičenost toksokinetičnih lastnosti, so lahko izjeme pri merilih za določanje odmerkov in jih je treba oceniti za vsak primer posebej.

27.

Da se pridobijo informacije o odzivu na odmerek, je treba v popolno študijo vključiti skupino negativne kontrole in vsaj tri velikosti odmerkov, ki so običajno ločeni s faktorjem 2, vendar ne več kot 4. Če preskusna kemikalija v študiji za določanje območja ali na podlagi obstoječih podatkov ne povzroča toksičnosti, mora biti najvišji odmerek pri enkratnem dajanju enak 2 000 mg/kg telesne teže. Če pa preskusna kemikalija povzroča toksičnost, mora biti največji tolerančni odmerek najvišji dani odmerek, v uporabljene velikosti odmerkov pa je treba po možnosti zajeti razpon od največjega odmerka do odmerka, ki povzroča malo ali nič toksičnosti. Pri kemikalijah, ki niso toksične, je mejni odmerek za obdobje dajanja, ki traja vsaj 14 dni, 1 000 mg/kg telesne teže na dan, za obdobja dajanja, krajša od 14 dni, pa je mejni odmerek 2 000 mg/kg telesne teže na dan.

Dajanje odmerkov

28.

Pri načrtovanju preskusa je treba upoštevati predvideni način izpostavljenosti pri ljudeh. Zato se lahko ob ustrezni utemeljitvi izberejo načini izpostavljenosti, kot so s prehrano, pitno vodo, podkožno, intravenozno, topično, z vdihavanjem, oralno (z gavažo) ali z vsadkom. V vsakem primeru je treba način izpostavljenosti izbrati tako, da se zagotovi ustrezna izpostavljenost ciljnih tkiv. Dajanje z intraperitonealno injekcijo običajno ni priporočljivo, saj to ni predvideni način izpostavljenosti pri ljudeh, in se lahko uporabi samo na podlagi posebne znanstvene utemeljitve. Če je preskusna kemikalija primešana hrani ali pitni vodi, zlasti v primeru enega samega odmerka, je treba paziti, da med zaužitjem hrane in vode ter parjenjem preteče dovolj časa, da se lahko odkrijejo učinki (odstavek 31). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat z gavažo ali injekcijo, je odvisna od velikosti preskusne živali. Količina običajno ne sme presegati 1 ml na 100 g telesne teže, razen pri vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi največ 2 ml na 100 g telesne teže. Uporabo večjih količin (če to dovoljuje zakonodaja o dobrobiti živali) je treba utemeljiti. Variabilnost preskusne količine je treba s prilagajanjem koncentracije obdržati na čim najnižji ravni, da se zagotovi konstantna količina glede na telesno težo pri vseh velikostih odmerka.

Opažanja

29.

Vsaj enkrat na dan je treba opraviti splošna klinična opazovanja preskusnih živali in evidentirati klinične znake, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka. Vse živali je treba med obdobjem odmerjanja vsaj dvakrat na dan opazovati za odkrivanje obolevnosti in smrtnosti. Vse živali je treba stehtati ob začetku študije, vsaj enkrat na teden med študijami s ponavljajočimi se odmerki in ob evtanaziji. Porabo hrane je treba meriti vsaj tedensko. Če se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba izmeriti porabo vode ob vsaki menjavi vode in vsaj tedensko. Živali, ki kažejo nesmrtonosne znake čezmerne toksičnosti, je treba evtanazirati pred koncem preskusnega obdobja (27).

Odvzem in obdelava tkiv

30.

Samice se evtanazirajo v drugi polovici brejosti, in sicer miši na 13. dan brejosti (DB), podgane pa na 14.–15. dan brejosti. Maternice se pregledajo za dominantne smrtne učinke, da se določi število ugnezditev, živih in mrtvih zarodkov ter rumenih telesc.

31.

Roga maternice in jajčnika se razkrijejo, da se preštejejo rumena telesca, zarodki pa se odstranijo, preštejejo in stehtajo. Paziti je treba, da se v maternicah preverijo resorpcije, ki jih zakrivajo živi zarodki, in da se zagotovi, da so preštete vse resorpcije. Evidentira se fetalna smrtnost. Evidentirata se tudi število uspešno oplojenih samic ter število vseh ugnezditev, izgub pred ugnezditvijo in smrtnost po ugnezditvi (vključene zgodnje in pozne resorpcije). Poleg tega se lahko vidni zarodki v Bouinovem fiksativu ohranijo še vsaj dva tedna po pregledu večjih zunanjih nepravilnosti (28), da se zagotovijo dodatne informacije o reproduktivnih in razvojnih učinkih preskusne snovi.

PODATKI IN POROČANJE

Obdelava rezultatov

32.

Podatke je treba povzeti v obliki preglednice, da se prikažejo število sparjenih samcev, število brejih samic in število nebrejih samic. Posebej je treba navesti rezultate vsakega parjenja, vključno z identiteto vsakega samca in samice. Za vsakega tretiranega samca je treba navesti interval parjenja in velikost odmerka, za vsako samico pa število živih in mrtvih ugnezditev.

33.

Izguba po ugnezditvi se izračuna z določitvijo razmerja med mrtvimi ugnezditvami in skupnim številom ugnezditev iz tretirane skupine v primerjavi z razmerjem med mrtvimi ugnezditvami in skupnim številom ugnezditev iz kontrolne skupine z vehiklom/topilom.

34.

Izguba pred ugnezditvijo se izračuna kot razlika med številom rumenih telesc in številom ugnezditev ali kot zmanjšanje povprečnega števila ugnezditev na samico v primerjavi s parjenji v kontrolah. Če je izguba pred ugnezditvijo ocenjena, je treba navesti tudi to.

35.

Faktor dominantne smrtnosti se oceni kot: (pogini po ugnezditvi/skupno število ugnezditev na samico) × 100.

36.

Navesti je treba podatke o toksičnosti in kliničnih znakih (v skladu z odstavkom 29).

Merila za sprejemljivost

37.

Sprejemljivost preskusa je določena z naslednjimi merili.

Sočasna negativna kontrola je skladna z objavljenimi standardi za podatke o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov in podatki laboratorija o kontrolah iz preteklih preskusov, če so na voljo (glej odstavka 10 in 18).

Sočasne pozitivne kontrole povzročajo odzive, ki so skladni z objavljenimi standardi za podatke o pozitivnih kontrolah iz preteklih preskusov ali podatkovno zbirko laboratorija o pozitivnih kontrolah iz preteklih preskusov, če je na voljo, in statistično značilno povečanje v primerjavi z negativno kontrolo (glej odstavka 17 in 18).

Analizirano je bilo ustrezno število vseh ugnezditev in odmerkov (odstavek 20).

Merila za izbor največjega odmerka so skladna z merili, opisanimi v odstavkih 24 in 27.

Vrednotenje in razlaga rezultatov

38.

Da bi dobili dovolj podatkov za analizo odziva na odmerek, je treba analizirati vsaj tri tretirane skupine, ki prejemajo odmerke.

39.

Če so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno pozitivno, če:

se vsaj pri enem od preskusnih odmerkov pokaže statistično značilno povečanje v primerjavi s sočasno negativno kontrolo;

je pri vsaj enem poskusnem pogoju (npr. tedenskem intervalu parjenja) povečanje povezano z odmerkom, kadar se ocenjuje z ustreznim testom, in

če se pojavijo rezultati zunaj sprejemljivega razpona podatkov o negativnih kontrolah ali porazdelitve podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (npr. 95-odstotna kontrolna meja, ki temelji na Poissonovi porazdelitvi), če so na voljo.

Za preskusno kemikalijo se nato šteje, da lahko povzroči dominantne smrtne mutacije v zarodnih celicah preskusnih živali. Priporočila glede najustreznejših statističnih metod so opisana v odstavku 44; drugi priporočeni statistični pristopi so navedeni tudi v virih (20) (21) (22) (24) (29). V uporabljenih statističnih preskusih se mora kot poskusna enota preučiti žival.

40.

Če so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno negativno, če:

se pri nobenem od preskusnih odmerkov ne pokaže statistično značilno povečanje v primerjavi s sočasno negativno kontrolo;

pri nobenem poskusnem pogoju ni z odmerkom povezanega povečanja in

če so vsi rezultati znotraj sprejemljivega razpona podatkov o negativnih kontrolah ali podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (npr. 95-odstotna kontrolna meja, ki temelji na Poissonovi porazdelitvi), če so na voljo.

Za preskusno kemikalijo se nato šteje, da ne more povzročiti dominantnih smrtnih mutacij v zarodnih celicah preskusnih živali.

41.

Preverjanje jasno pozitivnega in jasno negativnega odziva ni potrebno.

42.

Če odziv ni jasno negativen ali pozitiven in za pomoč pri opredelitvi biološke pomembnosti rezultatov (npr. šibko ali mejno povečanje) je treba podatke oceniti s strokovno presojo in/ali nadaljnjimi preiskavami z uporabo obstoječih podatkov o poskusih, kot je upoštevanje, ali je pozitivni rezultat zunaj sprejemljivega razpona podatkov o negativnih kontrolah ali podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (30).

43.

Zbirka podatkov v redkih primerih celo po izvedbi nadaljnjih preiskav onemogoča sprejetje sklepa o pozitivnih ali negativnih rezultatih, zato se zaključi, da je dvoumna.

44.

V uporabljenih statističnih preskusih se mora kot poskusna enota preučiti samec. Čeprav je mogoče, da so podatki o številu (npr. število ugnezditev na samico) porazdeljeni po Poissonu in/ali da so deleži (npr. delež mrtvih ugnezditev) binomsko porazdeljeni, so taki podatki pogosto nadrazpršeni (31). Tako je treba pri statistični analizi najprej uporabiti preskus prevelike in premajhne razpršenosti z uporabo testov variance, kot je Cochranov test binomske variance (32) ali Taronejev C(α)-test za binomsko nadrazpršenost (31) (33). Če se ne zazna odstopanje od binomske razpršenosti, se lahko trendi deležev med velikostmi odmerkov preverijo z uporabo Cochran-Armitageevega trendnostnega testa (34), parne primerjave s kontrolno skupino pa se lahko preverijo z uporabo Fisherjevega eksaktnega testa (35). Če se ne zazna odstopanje od Poissonove razpršenosti, se lahko trendi pri štetju preverijo tudi z uporabo Poissonove regresije (36), parne primerjave s kontrolno skupino pa se lahko preverijo v okviru Poissonovega modela z uporabo parnih nasprotij (36). Če se zazna znatna nadrazpršenost ali podrazpršenost, se priporočajo neparametrične metode (23) (31). Mednje spadajo testi, ki temeljijo na rangih, kot so test po Jonckheere-Terpstraju za trend (37) in Mann-Whitneyjev testi (38) za parne primerjave s kontrolno skupino z vehiklom/topilom ter testi s permutacijami, ponovnim vzorčenjem ali samovzorčenjem za primerjave trendov in parne primerjave s kontrolno skupino (31) (39).

45.

Pozitivni preskus dominantne smrtnosti zagotavlja dokaze o genotoksičnosti preskusne kemikalije v zarodnih celicah tretiranega samca preskusne vrste.

46.

Upoštevanje tega, ali so dobljene vrednosti v razponu preteklih kontrol ali zunaj njega, lahko zagotovi smernice pri ocenjevanju biološke pomembnosti odziva (40).

Poročilo o preskusu

47.

V poročilo o preskusu se vključijo podatki, navedeni v nadaljevanju.

Povzetek.

 

Preskusna kemikalija:

vir, številka serije, rok uporabe, če je na voljo;

stabilnost preskusne kemikalije, če je znana;

topnost in stabilnost preskusne kemikalije v topilu, če sta znani;

meritve vrednosti pH, osmolarnosti in oborine v gojišču, ki mu je bila dodana preskusna kemikalija, če je ustrezno.

 

Snov iz ene sestavine

fizični videz, topnost v vodi in dodatne ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti;

kemijski identifikacijski podatki, kot so ime po nomenklaturi IUPAC ali ime CAS, številka CAS, koda po sistemu SMILES ali identifikatorju InChI, strukturna formula, čistost, kemijska identiteta nečistoč, kot je ustrezno in praktično izvedljivo, itd.

 

Snov z več sestavinami, UVCB in zmesi:

čim obsežnejša opredelitev lastnosti s kemijsko identiteto (glej zgoraj), kvantitativnim pojavljanjem in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi sestavin.

 

Priprava preskusne kemikalije:

utemeljitev izbire vehikla;

topnost in stabilnost preskusne kemikalije v topilu/vehiklu, če je znana;

priprava pripravkov hrane in pitne vode ali pripravkov za vdihavanje;

analitsko določanje sestave (npr. stabilnost, homogenost, nominalne koncentracije), če je na voljo.

 

Preskusne živali:

uporabljena vrsta/sev in utemeljitev izbire;

število, starost in spol živali;

izvor, nastanitvene razmere, prehrana itd.;

metoda edinstvene identifikacije živali;

pri kratkotrajnih študijah: telesna teža posameznih samcev ob začetku in koncu preskusa; pri študijah, ki trajajo več kot en teden: teža posameznih živali med študijo in poraba hrane. Vključiti je treba razpon, srednjo vrednost in standardni odklon telesne teže za vsako skupino.

 

Preskusni pogoji:

podatki o pozitivnih in negativnih kontrolah (z vehiklom/topilom);

podatki iz študije za določanje območja;

utemeljitev izbire velikosti odmerkov;

podrobnosti o pripravi preskusne kemikalije;

podrobnosti o dajanju preskusne kemikalije;

utemeljitev načina dajanja;

metode za merjenje toksičnosti za živali, vključno s histopatološko ali hematološko analizo, če sta bili uporabljeni, ter pogostnost opazovanja živali in tehtanja;

metode za preverjanje, ali je preskusna kemikalija dosegla ciljno tkivo ali krvni obtok, v primeru negativnih rezultatov;

dejanski odmerek (v mg/kg telesne teže/dan), izračunan glede na koncentracijo preskusne kemikalije (v ppm) v hrani/pitni vodi in porabo hrane/pitne vode, če je ustrezno;

podrobnosti o kakovosti hrane in vode;

podrobnosti o obogatitvi okolja v kletki;

podroben opis časovnega razporeda tretiranj in vzorčenj ter utemeljitev izbir;

metoda za analgezijo;

metoda za evtanazijo;

postopki za izolacijo in hrambo tkiv;

izvor in številka serij za vse komplete in reagente (kjer je primerno);

metode za štetje dominantnih smrtnosti;

časovni razpored parjenja;

uporabljene metode za določitev, ali je prišlo do parjenja;

čas evtanazije;

merila za štetje učinkov dominantne smrtnosti, vključno z rumenimi telesci, ugnezditvami, resorpcijami in izgubami pred ugnezditvijo, živimi ugnezditvami in mrtvimi ugnezditvami.

 

Rezultati:

stanje živali pred preskusnim obdobjem in med njim, vključno z znaki toksičnosti;

telesna teža samcev v obdobjih tretiranja in parjenja;

število sparjenih samic;

razmerje med odmerkom in odzivom, če je mogoče;

podatki o sočasnih in preteklih negativnih kontrolah z območji, srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni;

podatki o sočasni pozitivni kontroli;

tabelaričen prikaz podatkov za vsako samico, vključno s: številom rumenih telesc na samico; številom ugnezditev na samico; številom resorpcij in izgub pred ugnezditvijo na samico; številom živih ugnezditev na samico; številom mrtvih ugnezditev na samico; težo zarodkov;

povzetek zgoraj navedenih podatkov za vsako obdobje parjenja in odmerek, s pogostnostmi dominantnih smrtnosti;

uporabljene statistične analize in metode.

 

Razprava o rezultatih

 

Sklepna ugotovitev

VIRI

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, št. 234, OECD, Pariz.

(2)

Bateman, A. J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures. Kilbey, B. J., et. al. (ur.) str. 235–334, Elsevier, Amsterdam.

(3)

Ehling, U. H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., in Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group ‚Dominant‘ lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173–185.

(4)

Shelby, M. D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res., 352:159–167.

(5)

Knudsen, I., Hansen, E. V., Meyer, O. A., in Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267–270.

(6)

Anderson, D., Hughes, J. A., Edwards, A. J., in Brinkworth, M. H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)

Shively, C. A., White, D. M., Blauch, J. L., in Tarka, S. M., Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.

(8)

Rao, K. S., Cobel-Geard, S. R., Young, J. T., Hanley, T. R., Jr., Hayes, W. C., John, J. A., in Miller, R. R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80–85.

(9)

Brewen, J. G., Payne, H. S., Jones, K. P., in Preston, R. J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239–249.

(10)

Marchetti, F., Bishop, J. B., Cosentino, L., Moore, II, D., in Wyrobek, A. J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616–624.

(11)

Marchetti, F., in Wyrobek, A. J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112–129.

(12)

Adler, I. D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13)

Favor, J., in Crenshaw, J. W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21-27.

(14)

Generoso, W. M., Witt, K. L., Cain, K. T., Hughes, L., Cacheiro, N. L. A, Lockhart, A. M. C., in Shelby, M. D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15)

Hastings, S. E., Huffman, K. W., in Gallo, M. A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371–378.

(16)

James, D. A., in Smith, D. M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303–314.

(17)

Shelby, M. D., Cain, K. T., Hughes, L. A., Braden, P. W., in Generoso, W. M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

(18)

Sudman, P. D., Rutledge, J. C., Bishop, J. B., in Generoso, W. M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

(19)

Holstrom, L. M., Palmer, A. K., in Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland, D. J., in Fox, M. (ur.), Cambridge University Press, str. 129–156.

(20)

Adler, I.-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I., in Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)

Adler, I. D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T., in Tanaka, N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

(22)

Generoso, W. M., in Piegorsch, W. W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124–141.

(23)

Haseman, J. K., in Soares, E. R. (1976). The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24)

Whorton, E. B., Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353–360.

(25)

Anderson, D., Hodge, M. C. E., Palmer, S., in Purchase, I. F. H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417–429.

(26)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., in Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313–319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 19), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(28)

Barrow, M. V., Taylor, W. J., in Morphol, J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

(29)

Kirkland, D. J. (ur.).(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J., in Thybaud, V. (2011). ‚Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data‘, Mutation. Res., 723:87–90.

(31)

Lockhart, A. C., Piegorsch, W. W., in Bishop, J. B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35–58.

(32)

Cochran, W. G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33)

Tarone, R. E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34)

Margolin, B. H. (1988). Test for Trend in Proportions. V: Encyclopedia of Statistical Sciences, zvezek 9, Kotz, S., in Johnson, N. L. (ur.), str. 334–336. John Wiley and Sons, New York.

(35)

Cox, D. R. Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36)

Neter, J. M., Kutner, H. C., Nachtsheim, J., in Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, četrta izdaja, poglavji 14 in 17. McGraw-Hill, Boston.

(37)

Jonckheere, R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133–145.

(38)

Conover, W. J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York.

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Filadelfija, PA.

(40)

Fleiss, J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

Dodatek 1

OPREDELITVE POJMOV

Kemikalija: snov ali zmes.

Rumeno telesce: struktura, ki izloča hormone, nastala na jajčniku na mestu folikla, iz katerega se je sprostilo jajčece. Število rumenih telesc v jajčnikih ustreza številu ovuliranih jajčec.

Dominantna smrtna mutacija: mutacija, ki nastane v zarodni celici ali se fiksira po oploditvi in povzroči smrt zarodka ali plodu.

Stopnja rodnosti: število sparjenih brejih samic glede na število sparjenih samic.

Interval parjenja: čas med koncem izpostavljenosti in parjenjem tretiranih samcev. Z uravnavanjem tega intervala se lahko ocenijo učinki kemikalij na različne vrste zarodnih celic. Pri miših, ki se parijo v 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. in 8. tednu po koncu izpostavljenosti, se merijo učinki na semenčice, kondenzirane spermatide, okrogle spermatide, pahitenske spermatocite, zgodnje spermatocite, diferencirane spermatogonije, diferenciacijske spermatogonije in spermatogonije iz matičnih celic.

Izguba pred ugnezditvijo: razlika med številom ugnezditev in številom rumenih telesc. Lahko se tudi oceni s primerjavo med skupnim številom ugnezditev na samico v tretirani in kontrolni skupini.

Izguba po ugnezditvi: razmerje med mrtvimi ugnezditvami v tretirani skupini v primerjavi z razmerjem med mrtvimi ugnezditvami in skupnim številom ugnezditev v kontrolni skupini.

Preskusna kemikalija: vsaka snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo.

UVCB: snovi z neznano ali spremenljivo sestavo, kompleksni reakcijski produkti in biološki materiali.

Dodatek 2

ČAS SPERMATOGENEZE PRI SESALCIH

Image 1

Slika 1: Primerjava med trajanjem (v dnevih) razvoja moške zarodne celice pri miših, podganah in ljudeh. Popravljanje DNK se ne pojavi v osenčenih obdobjih.

Shematski prikaz spermatogeneze pri miših, podganah in ljudeh je naveden zgoraj (povzeto po Adlerju, 1996). Med nediferencirane spermatogonije spadajo: A-enojni; A-parni; in A-poravnani spermatogoniji (Hess in de Franca, 2008). A-enojni se štejejo za dejanske matične celice; zato mora za oceno učinkov na matične celice preteči vsaj 49 dni (pri miši) med zadnjim injiciranjem preskusne kemikalije in parjenjem.

Viri

Adler, I. D (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169–172.

Hess, R. A., in De Franca, L. R. (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. V: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (ur.), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

(4)

Poglavje B.23 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.23   PRESKUS KROMOSOMSKIH ABERACIJ V SPERMATOGONIJIH SESALCEV

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici OECD za preskušanje 483 (2016). Preskusne metode se redno preverjajo ob upoštevanju znanstvenega napredka, spreminjajočih se regulativnih zahtev in preudarkov v zvezi z dobrobitjo živali. Pri tej spremenjeni različici preskusne metode se upoštevajo večletne izkušnje s tem preskusom ter možnosti za združevanje ali kombiniranje tega preskusa z drugimi študijami toksičnosti ali genotoksičnosti. S kombiniranjem študij toksičnosti bi se lahko zmanjšalo število živali, uporabljenih pri preskušanju toksičnosti. Ta preskusna metoda je del sklopa preskusnih metod v zvezi z genetsko toksikologijo. OECD je pripravila dokument z jedrnatimi informacijami o preskušanju v zvezi z genetsko toksikologijo in pregledom nedavnih sprememb smernic OECD za preskušanje v zvezi z genetsko toksikologijo (1).

2.

Namen in vivo preskusa kromosomskih aberacij v spermatogonijih sesalcev je opredeliti kemikalije, ki povzročijo strukturne kromosomske aberacije v spermatogonijskih celicah sesalcev (2) (3) (4). Poleg tega je ta preskus primeren za ocenjevanje genotoksičnosti, saj so pri tem aktivni dejavniki metabolizma in vivo, farmakokinetike in procesi popravljanja DNK, ki prispevajo k odzivu, čeprav se lahko med posameznimi vrstami razlikujejo. Ta preskusna metoda ni zasnovana za merjenje numeričnih anomalij; preskus se običajno ne uporablja za ta namen.

3.

S tem preskusom se merijo strukturne kromosomske aberacije (kromosomskega in kromatidnega tipa) pri delitvi spermatogonskih zarodnih celic, zato se pričakuje, da se s preskusom napove povzročitev dednih mutacij v teh zarodnih celicah.

4.

Opredelitve ključnih pojmov so navedene v Dodatku.

ZAČETNI PREUDARKI

5.

V tem preskusu se običajno uporabljajo glodavci, vendar so lahko v nekaterih primerih primerne tudi druge vrste, če je to znanstveno upravičeno. Standardni citogenetski pripravki mod glodavcev povzročajo mitotično (spermatogoniji) in mejotično (spermatociti) metafazo. Mitotična in mejotična metafaza se opredelita na podlagi morfologije kromosomov (4). S tem citogenetskim preskusom in vivo se zaznajo strukturne kromosomske aberacije pri mitozi spermatogonijev. Druge tarčne celice niso predmet te preskusne metode.

6.

Da se zaznajo aberacije kromatidnega tipa v spermatogonijih, je treba pregledati prvo mitotsko delitev celic po tretiranju, preden se te aberacije v naslednjih celičnih delitvah pretvorijo v aberacije kromosomskega tipa. Dodatne informacije o tretiranih spermatocitih se lahko pridobijo z analizo kromosomskih strukturnih aberacij pri mejotskih kromosomih v diakinezi-metafazi I in metafazi II.

7.

V modu so številne generacije spermatogonijev (5), te različne vrste zarodnih celic pa so lahko različno občutljive za tretiranje s kemikalijami. Zaznane aberacije tako pomenijo skupni odziv tretiranih populacij spermatogonijev. Večina mitotičnih celic v pripravkih mod so spermatogoniji B, katerih celični cikel traja približno 26 ur (3).

8.

Če obstajajo dokazi, da preskusna kemikalija ali njeni metaboliti ne bodo dosegli moda, ta preskus ni primeren.

NAČELO PRESKUSNE METODE

9.

Običajno se živali preskusni kemikaliji izpostavijo z ustreznim načinom izpostavljenosti, ob primernem času po tretiranju pa se evtanazirajo. Pred evtanazijo se živali tretirajo z zaviralcem metafaze (npr. kolhicinom ali Colcemidom®). Nato se pripravijo in obarvajo preparati kromosomov iz zarodnih celic ter analizirajo kromosomske aberacije v celicah v metafazi.

PREVERJANJE USPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA

10.

Usposobljenost za ta preskus je treba dokazati tako, da se pokaže sposobnost za ponovitev pričakovanih rezultatov v zvezi s pogostnostjo strukturnih kromosomskih aberacij v spermatogonijih s snovmi za pozitivno kontrolo (vključno z blagimi odzivi), kot so tiste iz preglednice 1, ter dobijo pogostnosti iz negativnih kontrol, ki so v skladu s sprejemljivim razponom podatkov o kontrolah v objavljenih virih (npr. (2) (3) (6) (7) (8) (9) (10)) ali s porazdelitvijo kontrol iz preteklih preskusov laboratorija, če je na voljo.

OPIS METODE

Pripravki

Izbira živalskih vrst

11.

Uporabiti je treba splošno uporabljane laboratorijske seve zdravih mladih odraslih živali. Običajno se uporabljajo samci miši; lahko pa se uporabijo tudi samci drugih ustreznih vrst sesalcev, kadar je to znanstveno utemeljeno in da se lahko ta preskus izvede v povezavi z drugo preskusno metodo. Uporabo drugih vrst, ki niso glodavci, je treba znanstveno utemeljiti v poročilu.

Pogoji nastanitve in hranjenja živali

12.

Pri glodavcih mora biti temperatura v prostoru z živalmi 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 40-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, si je treba prizadevati za 50–60-odstotno vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne mešanice preskusne kemikalije, kadar se daje na ta način. Glodavce je treba nastaniti v majhnih skupinah (ne več kot pet na kletko), če ni pričakovati agresivnega vedenja, in sicer po možnosti v kletke s trdimi tlemi z ustrezno okoljsko obogatitvijo. Živali so lahko nastanjene posamično le, če je to znanstveno utemeljeno.

Priprava živali

13.

Običajno se uporabljajo zdravi mladi samci (ob začetku tretiranja stari od 8 do 12 tednov), ki se naključno razporedijo v kontrolno in tretirano skupino. Posamezne živali se označijo z edinstvenimi oznakami s humano, čim manj invazivno metodo (npr. z namestitvijo obročkov ali trakov, z vsaditvijo mikročipa ali biometrično identifikacijo, ne pa z zarezovanjem ušesa ali prsta) ter se vsaj pet dni prilagajajo laboratorijskim pogojem. Kletke je treba razporediti tako, da se čim bolj zmanjšajo morebitni učinki, ki nastanejo zaradi razporeditve kletk. Izogibati se je treba navzkrižni kontaminaciji med pozitivno kontrolo in preskusno kemikalijo. Ob začetku študije mora biti razlika med težami posameznih živali čim manjša in ne sme presegati ± 20 %.

Priprava odmerkov

14.

Trdne preskusne kemikalije je treba raztopiti ali suspendirati v ustreznih topilih ali vehiklih ali primešati hrani ali pitni vodi, preden se odmerijo živalim. Tekoče preskusne kemikalije se lahko odmerijo neposredno ali pa se pred odmerjanjem razredčijo. Pri izpostavljenosti z vdihavanjem se lahko preskusne kemikalije glede na svoje fizikalno-kemijske lastnosti dajejo v obliki plina, pare ali trdnega/tekočega aerosola. Uporabiti je treba sveže pripravljene preskusne kemikalije, razen če je iz podatkov o stabilnosti razvidno, da je shranjevanje sprejemljivo, in so v njih opredeljeni ustrezni pogoji shranjevanja.

Pogoji preskusa – topilo/vehikel

15.

Topilo/vehikel ne sme imeti toksičnih učinkov pri uporabljenih odmerkih in ne sme biti sposoben kemično reagirati s preskusnimi kemikalijami. Če se uporabijo druga, manj znana topila/vehikli, je treba njihovo uporabo podpreti z referenčnimi podatki, ki dokazujejo njihovo združljivost. Priporočljivo je, da se, kadar koli je to mogoče, najprej razmisli o uporabi vodnega topila/vehikla. Primeri pogosto uporabljenih, združljivih topil/vehiklov so voda, fiziološka raztopina, raztopina metilceluloze, raztopina natrijeve soli karboksimetil celuloze, oljčno olje in koruzno olje. Če ni podatkov iz preteklih preskusov ali objavljenih podatkov, iz katerih bi bilo razvidno, da izbrano neobičajno topilo/vehikel ne povzroča strukturnih kromosomskih aberacij ali drugih škodljivih učinkov, je treba izvesti začetno študijo, da se dokaže sprejemljivost kontrol s topilom/vehiklom.

Pozitivne kontrole

16.

Vedno je treba uporabiti živali za sočasne pozitivne kontrole, razen če je laboratorij dokazal usposobljenost za izvedbo preskusa in je v zadnjem času preskus redno uporabljal (npr. v zadnjih petih letih). Če sočasna pozitivna kontrolna skupina ni vključena, je treba v vsak poskus vključiti kontrole za štetje (fiksirani in nebarvani mikroskopski preparati). Ti se lahko pridobijo tako, da se pri študiji v štetje vključijo ustrezni referenčni vzorci, pridobljeni in shranjeni v okviru ločenega poskusa s pozitivnimi kontrolami, ki se v laboratoriju, kjer se preskus izvaja, redno izvaja (npr. vsakih 6 do 18 mesecev); na primer med preverjanjem usposobljenosti in po tem redno, če je to potrebno.

17.

Snovi za pozitivno kontrolo morajo zanesljivo povzročiti zaznavno povečanje pogostnosti celic s spontanimi strukturnimi kromosomskimi aberacijami. Odmerke za pozitivno kontrolo je treba izbrati tako, da so učinki jasni, vendar osebi, ki ugotovitve evidentira, ne razkrijejo takoj identitete označenih mikroskopskih preparatov. Primeri snovi za pozitivno kontrolo so navedeni v preglednici 1.

Preglednica 1

Primeri snovi za pozitivno kontrolo

Snovi [št. CAS] (referenčna št.)

Ciklofosfamid (monohidrat) [št. CAS 50-18-0 (št. CAS 6055-19-2)] (9)

Cikloheksilamin [št. CAS 108-91-8] (7)

Mitomicin C [št. CAS 50-07-7] (6)

Monomerni akrilamid [CAS 79-06-1] (10)

Trietilenmelamin [CAS 51-18-3] (8)

Negativne kontrole

18.

Živali za negativne kontrole, tretirane samo s topilom ali vehiklom, sicer pa obravnavane enako kot tretirane skupine, je treba vključiti za vsak čas vzorčenja. Če ni podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov ali objavljenih podatkov, iz katerih bi bilo razvidno, da izbrano topilo/vehikel ne povzroča kromosomskih aberacij ali drugih škodljivih učinkov, je treba za vsak čas vzorčenja vključiti tudi netretirane kontrolne živali, da se dokaže sprejemljivost kontrol z vehiklom.

POSTOPEK

Število živali

19.

Velikosti skupine ob začetku študije je treba določiti z namenom, da se zagotovi vsaj pet samcev na skupino. To število živali na skupino se šteje za zadostno, da se zagotovi ustrezna statistična moč (tj. običajno sposobna zaznati vsaj podvojitev pogostnosti kromosomskih aberacij, ko je stopnja negativne kontrole 1,0-odstotna ali več z 80-odstotno verjetnostjo pri stopnji značilnosti 0,05) (3) (11). Praviloma je za študijo pri dveh časih vzorčenja s tremi skupinami, ki prejemajo odmerke, ter sočasno negativno in pozitivno kontrolno skupino (pri čemer je vsaka skupina sestavljena iz vsaj petih živali) običajno potrebnih 45 živali.

Časovni razpored tretiranja

20.

Preskusne kemikalije se običajno dajo enkrat (tj. kot eno tretiranje); lahko se uporabijo tudi drugi režimi odmerjanja, če so znanstveno utemeljeni.

21.

Pri skupini z največjim odmerkom se vzorci vzamejo dvakrat po tretiranju. Čas, potreben za sprejem in metabolizem preskusnih kemikalij ter njihov učinek na dinamiko celičnega cikla, lahko vpliva na optimalni čas za zaznavo kromosomskih aberacij, zato je eno vzorčenje zgodnje in drugo pozno, izvedeno približno 24 oziroma 48 ur po tretiranju. Pri vseh drugih odmerkih je treba zgodnje vzorčenje opraviti 24 ur (tj. času, krajšem od trajanja ali enakem trajanju celičnega cikla spermatogonijev B, s čimer se izboljša verjetnost štetja prvih metafaz po tretiranju) po tretiranju, razen če je znano, da so primernejši in utemeljeni drugi časi vzorčenja.

22.

Uporabijo se lahko tudi drugi časi vzorčenja. Na primer pri kemikalijah, ki povzročijo učinke, neodvisne od faze S, bi bilo lahko primerno vzorčiti bolj zgodaj (tj. prej kot v 24 urah).

23.

Uporabi se lahko režim tretiranja s ponovljenimi odmerki, na primer v povezavi s preskusom na drugi končni točki, ki uporablja 28-dnevno obdobje dajanja (npr. preskusna metoda B.58); vendar bi bile za izvedbo različnih časov vzorčenja potrebne dodatne skupine živali. Tako je treba ustreznost takega časovnega razporeda znanstveno utemeljiti za vsak primer posebej.

24.

Živalim se pred evtanazijo intraperitonealno vbrizga ustrezen odmerek zaviralca metafaze (npr. Colcemid® ali kolhicin). Zatem se živali vzorčijo v ustreznem časovnem intervalu. Pri miših in podganah je ta interval približno 3–5 ur.

Velikost odmerkov

25.

Če se izvede predhodna študija za določanje območja, ker ustrezni podatki, ki bi bili v pomoč pri izbiri odmerkov, niso na voljo, jo je treba izvesti v istem laboratoriju, pri tem uporabiti iste vrste, sev in režim tretiranja kot v glavni študiji ter upoštevati priporočila za izvedbo študij za določanje območja (12). S to študijo je treba določiti največji tolerančni odmerek (MTD), ki je opredeljen kot odmerek, ki povzroči blage toksične učinke, povezane s trajanjem študije (na primer nenormalno vedenje ali odzivi, manjša upočasnitev pridobivanja telesne teže ali citotoksičnost za hematopoetski sistem), ne pa smrti ali znakov bolečine, trpljenja ali stiske, zaradi katerih je treba živali evtanazirati (13).

26.

Največji odmerek se lahko opredeli tudi kot odmerek, ki povzroči nekaj znakov toksičnosti v spermatogonijih (npr. zmanjšanje razmerja med mitozami spermatogonijev v prvi in drugi mejotski metafazi). To zmanjšanje naj ne bi presegalo 50 %.

27.

Preskusne kemikalije s specifičnim biološkim delovanjem pri majhnih, netoksičnih odmerkih (kakor so hormoni in mitogeni) in kemikalije, ki kažejo nasičenost toksokinetičnih lastnosti, so lahko izjeme pri merilih za določanje odmerkov in jih je treba oceniti za vsak primer posebej.

28.

Da se pridobijo informacije o odzivu na odmerek, je treba v popolno študijo vključiti skupino negativne kontrole (odstavek 18) in vsaj tri velikosti odmerkov, ki so običajno ločeni s faktorjem 2, vendar ne več kot 4. Če preskusna kemikalija v študiji za določanje območja ali na podlagi obstoječih podatkov ne povzroča toksičnosti, mora biti najvišji odmerek pri enkratnem dajanju enak 2 000 mg/kg telesne teže. Če pa preskusna kemikalija povzroča toksičnost, mora biti največji tolerančni odmerek najvišji dani odmerek, v uporabljenih velikostih odmerkov pa je treba po možnosti zajeti razpon od največjega odmerka do odmerka, ki povzroča malo ali nič toksičnosti. Kadar se toksičnost za ciljno tkivo (tj. modo) opazi pri vseh preskušenih velikostih odmerkov, je priporočljiva dodatna študija pri netoksičnih odmerkih. Pri študijah, namenjenih celovitejši opredelitvi kvantitativnih informacij o razmerju med odmerkom in odzivom, so morda potrebne dodatne skupine, ki prejemajo odmerke. Za določene vrste preskusnih kemikalij (npr. zdravila za uporabo v humani medicini), za katere veljajo posebne zahteve, se lahko te meje razlikujejo. Če preskusna kemikalija povzroča toksičnost, je treba izbrati mejni odmerek in dva nižja odmerka (kot je opisano zgoraj). Mejni odmerek pri obdobju dajanja, ki traja vsaj 14 dni, je 1 000 mg/kg telesne teže na dan, pri obdobjih dajanja, krajših od 14 dni, pa je mejni odmerek 2 000 mg/kg telesne teže na dan.

Dajanje odmerkov

29.

Pri načrtovanju preskusa je treba upoštevati predvideni način izpostavljenosti pri ljudeh. Zato se lahko ob ustrezni utemeljitvi izberejo načini izpostavljenosti, kot so s prehrano, pitno vodo, lokalno podkožno, intravenozno, oralno (z gavažo), z vdihavanjem ali vsadkom. Vsekakor pa je treba način izbrati tako, da zagotovi ustrezno izpostavljenost ciljnih tkiv. Dajanje z intraperitonealno injekcijo običajno ni priporočljivo, razen če je znanstveno utemeljeno, saj navadno ni fiziološko ustrezen način izpostavljenosti pri ljudeh. Če je preskusna kemikalija primešana hrani ali pitni vodi, zlasti v primeru enega samega odmerka, je treba paziti, da med zaužitjem hrane in vode ter vzorčenjem preteče dovolj časa, da se lahko zaznajo učinki (glej odstavek 33). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat z gavažo ali injekcijo, je odvisna od velikosti preskusne živali. Količina običajno ne sme presegati 1 ml/100 g telesne teže, razen pri vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi največ 2 ml/100 g telesne teže. Uporabo večjih količin (če to dovoljuje zakonodaja o dobrobiti živali) je treba utemeljiti. Variabilnost preskusne količine je treba s prilagajanjem koncentracije obdržati na čim najnižji ravni, da se zagotovi konstantna količina glede na telesno težo pri vseh velikostih odmerka.

Opažanja

30.

Vsaj enkrat na dan je treba opraviti splošna klinična opazovanja preskusnih živali in evidentirati klinične znake, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka. Vse živali je treba vsaj dvakrat na dan opazovati za odkrivanje obolevnosti in smrtnosti. Vse živali je treba stehtati ob začetku študije, vsaj enkrat na teden med študijami s ponavljajočimi se odmerki in ob evtanaziji. V študijah, ki trajajo en teden ali več, je treba vsaj enkrat na teden izmeriti porabo hrane. Če se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba izmeriti porabo vode ob vsaki menjavi vode in vsaj tedensko. Živali, ki kažejo nesmrtonosne znake čezmerne toksičnosti, je treba evtanazirati pred koncem preskusnega obdobja (13).

Priprava kromosomov

31.

Takoj po evtanaziji se iz enega ali obeh mod pridobijo suspenzije zarodnih celic, ki se nato izpostavijo hipotonični raztopini in fiksirajo po ustaljenih protokolih (npr. (2) (14) (15)). Celice se nato nanesejo na objektna stekelca in obarvajo (16) (17). Vsa stekelca morajo biti označena tako, da oseba, ki evidentira ugotovitve, ne pozna njihove identitete.

Analiza

32.

Za vsako žival je treba v štetje vključiti vsaj 200 dobro vidnih metafaz (3) (11). Če je pogostnost preteklih negativnih kontrol < 1 %, je treba v štetje vključiti več kot 200 celic/žival, da se poveča statistična moč (3). Uporabiti je treba metode obarvanja, ki omogočajo opredelitev centromere.

33.

Aberacije kromosomskega in kromatidnega tipa je treba evidentirati posebej in razvrstiti glede na podvrste (prelomi, izmenjave). Vrzeli je treba evidentirati, vendar jih ni treba upoštevati pri ugotavljanju, ali kemikalija povzroča znatno povečanje pojava celic s kromosomskimi aberacijami. S postopki, ki se uporabljajo v laboratoriju, je treba zagotoviti, da analizo kromosomskih aberacij izvajajo osebe, ki so dobro usposobljene za štetje. Ob priznavanju, da postopki pripravljanja preparatov pogosto povzročijo pretrganje dela metafaz in posledično izgubo kromosomov, število centromer v štetih celicah torej ne sme biti manjše od 2n± 2, pri čemer je n haploidno število kromosomov za zadevno vrsto.

34.

Čeprav je preskus namenjen zaznavanju strukturnih kromosomskih aberacij, je pomembno, da se pogostnosti poliploidnih celic in celic z endoredupliciranimi kromosomi evidentirata, ko se opazita (glej odstavek 44).

PODATKI IN POROČANJE

Obdelava rezultatov

35.

Podatke za posamezne živali je treba prikazati v obliki preglednic. Za vsako žival je treba oceniti število celic s strukturnimi kromosomskimi aberacijami in število kromosomskih aberacij na celico. Ločeno je treba navesti aberacije kromatidnega in kromosomskega tipa, razvrščene glede na podvrste (prelomi, izmenjave), skupaj z njihovim številom in pogostnostmi za poskusne in kontrolne skupine. Vrzeli se evidentirajo ločeno. O pogostnosti vrzeli se poroča, vendar se običajno ne vključi v analizo celotne pogostnosti strukturnih kromosomskih aberacij. Ko se opazijo poliploidija in/ali celice z endoredupliciranimi kromosomi, se poroča o njihovem deležu.

36.

Navesti je treba podatke o toksičnosti in kliničnih znakih (v skladu z odstavkom 30).

Merila za sprejemljivost

37.

Sprejemljivost preskusa je določena z naslednjimi merili.

Sočasna negativna kontrola je skladna z objavljenimi standardi za podatke o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov, ki naj bi na splošno znašali > 0 % in ≤ 1,5 % celic s kromosomskimi aberacijami, ter podatki laboratorija o kontrolah iz preteklih preskusov, če so na voljo (glej odstavka 10 in 18).

Sočasne pozitivne kontrole povzročajo odzive, ki so skladni z objavljenimi standardi za podatke o pozitivnih kontrolah iz preteklih preskusov ali zbirko podatkov laboratorija o pozitivnih kontrolah iz preteklih preskusov, če je na voljo, in statistično značilno povečanje v primerjavi z negativno kontrolo (glej odstavka 17 in 18).

Analizirano je bilo ustrezno število celic in odmerkov (glej odstavka 28 in 32).

Merila za izbor največjega odmerka so skladna z merili, opisanimi v odstavkih 25 in 26.

38.

Če se opazita mitoza in mejoza, je treba določiti razmerje med mitozami spermatogonijev v prvi in drugi mejotski metafazi kot merilo citotoksičnosti za vse tretirane živali in živali negativne kontrole v celem vzorcu 100 delečih se celic na žival. Če se opazi le mitoza, je treba določiti mitotični indeks v vsaj 1 000 celicah za vsako žival.

Vrednotenje in razlaga rezultatov

39.

Da bi dobili dovolj podatkov za analizo odziva na odmerek, je treba analizirati vsaj tri tretirane skupine, ki prejemajo odmerke.

40.

Če so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno pozitivno, če:

se vsaj pri enem od preskusnih odmerkov pokaže statistično značilno povečanje v primerjavi s sočasno negativno kontrolo;

je povečanje povezano z odmerkom pri vsaj enem času vzorčenja in

je kateri koli od rezultatov zunaj sprejemljivega razpona podatkov o negativnih kontrolah ali porazdelitve podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (npr. 95-odstotna kontrolna meja, ki temelji na Poissonovi porazdelitvi), če je na voljo.

Za preskusno kemikalijo se nato šteje, da lahko povzroča kromosomske aberacije v spermatogonijih preskusnih živali. Priporočila glede najustreznejših statističnih metod so navedena tudi v virih (11) (18). V uporabljenih statističnih preskusih se mora kot poskusna enota preučiti žival.

41.

Če so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno negativno, če:

se pri nobenem od preskusnih odmerkov ne pokaže statistično značilno povečanje v primerjavi s sočasno negativno kontrolo;

pri nobenem poskusnem pogoju ni z odmerkom povezanega povečanja in

če so vsi rezultati znotraj sprejemljivega razpona podatkov o negativnih kontrolah ali podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (npr. 95-odstotna kontrolna meja, ki temelji na Poissonovi porazdelitvi), če so na voljo.

Za preskusno kemikalijo se nato šteje, da ne more povzročiti nastanka kromosomskih aberacij v spermatogonijih preskusnih živali. Priporočila glede najustreznejših statističnih metod so navedena tudi v virih (11) (18). Negativen rezultat ne izključuje možnosti, da lahko kemikalija povzroči kromosomske aberacije v poznejših razvojnih fazah, ki niso preučene, ali genske mutacije.

42.

Preverjanje jasno pozitivnega in jasno negativnega odziva ni potrebno.

43.

Če odziv ni jasno negativen ali pozitiven in za pomoč pri opredelitvi biološke pomembnosti rezultatov (npr. šibko ali mejno povečanje) je treba podatke oceniti s strokovno presojo in/ali nadaljnjimi preiskavami z uporabo obstoječih podatkov o poskusih, kot je upoštevanje, ali je pozitivni rezultat zunaj sprejemljivega razpona podatkov o negativnih kontrolah ali podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (19).

44.

Zbirka podatkov v redkih primerih celo po izvedbi nadaljnjih preiskav onemogoča sprejetje sklepa o pozitivnih ali negativnih rezultatih, zato se zaključi, da je dvoumna.

45.

Povečanje števila poliploidnih celic lahko kaže na to, da ima preskusna kemikalija potencial za zaviranje mitotičnih procesov in povzročanje numeričnih kromosomskih aberacij (20). Povečanje števila celic z endoredupliciranimi kromosomi lahko pomeni, da ima preskusna kemikalija potencial za zaviranje poteka celičnega cikla (21) (22), kar je drugačen mehanizem povzročanja numeričnih kromosomskih sprememb kot zaviranje mitotičnih procesov (glej odstavek 2). Pojav poliploidnih celic in celic z endoredupliciranimi kromosomi je zato treba evidentirati ločeno.

Poročilo o preskusu

46.

V poročilo o preskusu se vključijo podatki, navedeni v nadaljevanju.

 

Povzetek.

 

Preskusna kemikalija:

vir, številka serije, rok uporabe, če je na voljo;

stabilnost preskusne kemikalije, če je znana;

topnost in stabilnost preskusne kemikalije v topilu, če sta znani;

meritve vrednosti pH, osmolarnosti in oborine v gojišču, ki mu je bila dodana preskusna kemikalija, če je ustrezno.

 

Snov iz ene sestavine:

fizični videz, topnost v vodi in dodatne ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti;

kemijski identifikacijski podatki, kot so ime po nomenklaturi IUPAC ali ime CAS, številka CAS, koda po sistemu SMILES ali identifikatorju InChI, strukturna formula, čistost, kemijska identiteta nečistoč, kot je ustrezno in praktično izvedljivo, itd.

 

Snov z več sestavinami, UVCB in zmesi:

čim obsežnejša opredelitev lastnosti s kemijsko identiteto (glej zgoraj), kvantitativnim pojavljanjem in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi sestavin.

 

Priprava preskusne kemikalije:

utemeljitev izbire vehikla;

topnost in stabilnost preskusne kemikalije v topilu/vehiklu;

priprava pripravkov hrane in pitne vode ali pripravkov za vdihavanje;

analitsko določanje sestave (npr. stabilnost, homogenost, nominalne koncentracije), kadar se izvaja.

 

Preskusne živali:

uporabljena vrsta/sev in utemeljitev izbire;

število in starost živali;

izvor, nastanitvene razmere, prehrana itd.;

metoda edinstvene identifikacije živali;

pri kratkotrajnih študijah: teža posameznih živali ob začetku in koncu preskusa; pri študijah, ki trajajo več kot en teden: teža posameznih živali med študijo in poraba hrane. Vključiti je treba razpon, srednjo vrednost in standardni odklon telesne teže za vsako skupino.

 

Preskusni pogoji:

podatki o pozitivnih in negativnih kontrolah (z vehiklom/topilom);

podatki iz študije za določanje območja, če je bila izvedena;

utemeljitev izbire velikosti odmerkov;

utemeljitev načina dajanja;

podrobnosti o pripravi preskusne kemikalije;

podrobnosti o dajanju preskusne kemikalije;

razlogi za čas usmrtitve;

metode za merjenje toksičnosti za živali, vključno s histopatološko ali hematološko analizo, če sta bili uporabljeni, ter pogostnost opazovanja živali in tehtanja;

metode za preverjanje, ali je preskusna kemikalija dosegla ciljno tkivo ali krvni obtok, v primeru negativnih rezultatov;

dejanski odmerek (v mg/kg telesne teže/dan), izračunan glede na koncentracijo preskusne kemikalije (v ppm) v hrani/pitni vodi in porabo hrane/pitne vode, če je ustrezno;

podrobnosti o kakovosti hrane in vode;

podroben opis časovnega razporeda tretiranj in vzorčenj ter utemeljitev izbir;

metoda za evtanazijo;

metoda za analgezijo (če se uporablja);

postopki za izolacijo tkiv;

identiteta kemikalije, ki zavira metafazo, njena koncentracija in čas tretiranja;

metode za pripravo preparatov;

merila za štetje aberacij;

število analiziranih celic na žival;

merila za obravnavanje študij kot pozitivnih, negativnih ali dvoumnih.

 

Rezultati:

stanje živali pred preskusnim obdobjem in med njim, vključno z znaki toksičnosti;

telesna teža in teža organov ob usmrtitvi (če se uporabljajo večkratna tretiranja, telesne teže med režimom tretiranja);

znaki toksičnosti;

mitotični indeks;

razmerje med mitozami spermatogonijev v prvi in drugi mejotski metafazi ali drugi dokazi o izpostavljenosti ciljnemu tkivu;

vrsta in število aberacij, navedena za vsako žival posebej;

skupno število aberacij na skupino s srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni;

število celic z aberacijami na skupino s srednjimi vrednostmi in standardnimi odkloni;

razmerje med odmerkom in odzivom, če je mogoče;

uporabljene statistične analize in metode;

podatki o sočasni negativni kontroli;

podatki o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov z območji, srednjimi vrednostmi, standardnimi odkloni in 95-odstotnim intervalom zaupanja (kadar je na voljo) ali objavljeni podatki o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov, uporabljeni za sprejemljivost rezultatov preskusa;

podatki o sočasni pozitivni kontroli;

spremembe v ploidnosti, če so opažene, vključno s pogostnostjo poliploidije in/ali endoredupliciranih celic.

 

Razprava o rezultatih

 

Sklepna ugotovitev

VIRI

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, št. 234, OECD, Pariz.

(2)

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. V: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. ur. Venitt, S., in Parry, J. M. IRL Press, Oxford, Washington DC, str. 275–306.

(3)

Adler, I.-D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T., in Tanaka, N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

(4)

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)

Hess, R. A., in de Franca, L. R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. V: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis. Cheng, C. Y. (ur.). Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, str. 1–15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368–379. Adler, I.-D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. V: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B., in Magnusson, J. (ur.). Liss, New York, str. 477–484.

(7)

Cattanach, B. M., in Pollard, C. E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472–474.

(8)

Cattanach, B. M., in Williams, C. E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371–375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135–140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313-324.

(11)

Adler, I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I., in Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., in Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313–319.

(13)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment (št. 19), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(14)

Yamamoto, K., in Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207–209.

(15)

Hsu, T. C., Elder, F., in Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

(16)

Evans, E. P., Breckon, G., in Ford, C. E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289–294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G., in Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays. V: Kirkland, D. J. (ur.). Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 115–141.

(18)

Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G., in Savage, J. R. K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. V: Kirkland, D. J. (ur.). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, str. 184–232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J., in Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87–90.

(20)

Warr, T. J., Parry, E. M., in Parry, J. M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29–46.

(21)

Huang, Y., Change, C., in Trosko, J. E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362–1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Dodatek

OPREDELITVE POJMOV

Anevploidija: vsako odstopanje od normalnega diploidnega (ali haploidnega) števila kromosomov za en ali več kot en kromosom, vendar ne za celotni set kromosomov (poliploidija).

Centromera: del kromosoma, s katerim se med delitvijo celic povežejo niti delitvenega vretena, kar omogoči urejeno gibanje hčerinskih kromosomov proti poloma hčerinskih celic.

Kemikalija: snov ali zmes.

Raznolikost kromosomov: raznolikost oblik (npr. metacentrični, akrocentrični itd.) in velikosti kromosomov.

Aberacija kromatidnega tipa: strukturna poškodba kromosoma, izražena kot prelom posamezne kromatide ali prelom in združitev med kromatidama.

Aberacija kromosomskega tipa: strukturna poškodba kromosoma, izražena kot prelom ali prelom in združitev obeh kromatid na istem mestu.

Klastogen: vsaka kemikalija, ki povzroči strukturne kromosomske aberacije v populacijah celic ali organizmih.

Vrzel: akromatska lezija, ki je manjša od širine ene kromatide, z zelo majhno neporavnanostjo kromatid.

Genotoksično: splošni pojem, ki zajema vse vrste poškodb DNK ali kromosomov, vključno s prelomi, delecijami, adukti, nukleotidnimi spremembami in povezavami, prerazporeditvami, mutacijami, kromosomskimi aberacijami in anevploidijo. Vsi genotoksični učinki ne vplivajo na nastanek mutacij ali trajnih poškodb kromosomov.

Mitotični indeks (MI): razmerje med številom celic v metafazi in skupnim številom celic v opazovani populaciji celic; kazalnik stopnje proliferacije te populacije.

Mitoza: delitev celičnega jedra, ki je običajno razdeljena na profazo, prometafazo, metafazo, anafazo in telofazo.

Mutageno: povzroča dedno spremembo zaporedij baznih parov DNK v genih ali strukture kromosomov (kromosomske aberacije).

Numerična anomalija: sprememba števila kromosomov, ki se razlikuje od normalnega števila, ki je značilno za uporabljene živali.

Poliploidija: večkratnik haploidnega števila kromosomov (n), razen diploidnega števila (tj. 3n, 4n in tako naprej).

Strukturna aberacija: sprememba v strukturi kromosoma, ki se lahko zazna pri mikroskopskem pregledu metafaze celične delitve in je vidna v obliki delecij in fragmentov, izmenjav.

Preskusna kemikalija: vsaka snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo.

UVCB: snovi z neznano ali spremenljivo sestavo, kompleksni reakcijski produkti in biološki materiali.

(5)

Poglavje B.40 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.40   JEDKOST ZA KOŽO IN VITRO: PRESKUSNA METODA TRANSKUTANE ELEKTRIČNE UPORNOSTI (TER)

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici OECD za preskušanje (TG) 430 (2015). Jedkost za kožo pomeni nastanek nepovračljive poškodbe kože, ki se kaže kot vidno odmiranje prek povrhnjice v usnjico po nanosu preskusne kemikalije (kot je opredeljeno v globalno usklajenem sistemu Združenih narodov za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS ZN) (1) ter Uredbi (ES) št. 1272/2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi (uredba CLP) (1)). Pri tej posodobljeni preskusni metodi B.40 se izvede postopek in vitro, ki omogoča opredelitev nejedkih in jedkih snovi ter zmesi v skladu z GHS ZN (1) in uredbo CLP.

2.

Ocena jedkosti za kožo se je običajno izvajala z uporabo laboratorijskih živali (preskusna metoda B.4, enakovredna Smernici OECD za preskušanje 404, ki je bila prvotno sprejeta leta 1981 ter revidirana v letih 1992, 2002 in 2015) (2). Poleg sedanje preskusne metode B.40 so bile validirane še druge preskusne metode in vitro za preskušanje potenciala kemikalij za povzročanje jedkosti za kožo, ki so bile sprejete kot preskusna metoda B.40a (enakovredna Smernici OECD za preskušanje 431) (3) in preskusna metoda B.65 (enakovredna Smernici OECD za preskušanje 435) (4), s katerima se lahko po potrebi opredelijo tudi podkategorije jedkih kemikalij. Več validiranih preskusnih metod in vitro je bilo sprejetih kot preskusna metoda B.46 (enakovredna Smernici OECD za preskušanje 439) (5), ki naj bi se uporabljala za preskušanje draženja kože. V Smernici OECD za celostne pristope k testiranju in ocenjevanju (IATA) v zvezi z jedkostjo za kožo in draženjem kože je opisanih več modulov, v katerih so zbrani različni viri informacij in orodja za analizo, zagotovljene smernice o tem, (i) kako obstoječe podatke, pridobljene s preskušanjem, in podatke, ki ne temeljijo na preskušanju, združiti in uporabiti pri ocenjevanju potenciala kemikalij za draženje kože in jedkost za kožo, (ii) predlagan pa je tudi pristop, kadar je potrebno dodatno preskušanje (6).

3.

S to preskusno metodo se obravnava končna točka jedkost za kožo z vidika zdravja ljudi. Temelji na preskusni metodi transkutane električne upornosti (TER) pri podganah, pri kateri se z uporabo kožnih ploščic opredelijo jedke snovi glede na njihovo zmožnost zmanjšati celovitost in pregradno funkcijo rožene plasti pokožnice. Ustrezna smernica OECD za preskušanje je bila prvotno sprejeta leta 2004, leta 2015 pa je bila posodobljena zaradi sklicevanja na dokument s smernicami IATA.

4.

Za oceno preskušanja in vitro v zvezi z jedkostjo za kožo za regulativne namene so bile izvedene predvalidacijske študije (7), ki jim je sledila uradna validacijska študija preskusne metode TER na podganji koži za oceno jedkosti za kožo (8) (9) (10) (11). Na podlagi izidov teh študij je bilo izdelano priporočilo, da se lahko preskusna metoda TER (imenovana validirana referenčna metoda – VRM) uporabi za regulativne namene za oceno jedkosti za kožo in vivo (12) (13) (14).

5.

Preden se omogoči uporaba predlagane podobne ali spremenjene preskusne metode TER in vitro v zvezi z jedkostjo za kožo, ki ni VRM, za regulativne namene, je treba določiti njeno zanesljivost, ustreznost (točnost) in omejitve, kar zadeva predlagano uporabo, da se zagotovi njena podobnost z VRM v skladu s standardi izvajanja (15). Medsebojno priznavanje podatkov OECD bo zagotovljeno šele, ko bo predlagana nova ali posodobljena preskusna metoda v skladu s standardi izvajanja pregledana in vključena v ustrezno smernico OECD za preskušanje.

OPREDELITVE POJMOV

6.

Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku.

ZAČETNI PREUDARKI

7.

V validacijski študiji (10) in drugih objavljenih študijah (16) (17) so ugotovili, da se lahko pri preskusni metodi TER na podganji koži razlikuje med znanimi snovmi, ki so jedke za kožo, in znanimi snovmi, ki niso jedke, s splošno 94-odstotno občutljivostjo (51/54) in 71-odstotno specifičnostjo (48/68) za zbirko podatkov o 122 snoveh.

8.

S to preskusno metodo se obravnava jedkost za kožo in vitro. Omogoča opredelitev nejedkih in jedkih preskusnih kemikalij v skladu z GHS ZN/uredbo CLP. Kot so pokazale validacijske študije (8) (9) (10) (11), je omejitev te preskusne metode ta, da ne omogoča razvrstitve jedkih snovi in zmesi v podkategorije v skladu z GHS ZN/uredbo CLP. Uporaba te preskusne metode bo odvisna od veljavnega regulativnega okvira. Čeprav ta preskusna metoda ne zagotavlja ustreznih informacij o dražilnosti za kožo, je treba opozoriti, da se s preskusno metodo B.46 izrecno obravnava učinek dražilnosti za kožo in vitro na zdravje (5). Za popolno vrednotenje lokalnih učinkov na kožo po enkratni izpostavljenosti kože je treba uporabiti Smernico OECD v zvezi z IATA (6).

9.

V validacijski študiji, na kateri temelji ta preskusna metoda, je bil preizkušen širok nabor kemikalij, ki predstavljajo predvsem snovi, v empirično zbirko podatkov validacijske študije pa je vključenih 60 snovi, ki zajemajo najrazličnejše kemijske razrede (8) (9). Na podlagi vseh razpoložljivih podatkov se preskusna metoda uporablja za najrazličnejše kemijske razrede in agregatna stanja, vključno s tekočimi snovmi, poltrdnimi snovmi, trdnimi snovmi in voski. Ker pa za posamezna agregatna stanja preskusne snovi z ustreznimi referenčnimi podatki niso na voljo, je treba opozoriti, da je bilo med validacijo ocenjeno podobno majhno število voskov in jedkih trdnih snovi. Tekoče snovi so lahko vodne raztopine ali ne, trdne snovi so lahko topne ali netopne v vodi. Kadar se lahko dokaže, da preskusne metode ni mogoče uporabljati za posamezno kategorijo snovi, se ta preskusna metoda zanje ne sme uporabiti. Poleg tega se predpostavlja, da se ta preskusna metoda uporablja za zmesi kot razširitev njene uporabe za snovi. Ker pa zmesi zajemajo širok spekter kategorij in sestave in ker so v zvezi s preskušanjem zmesi trenutno na voljo samo omejene informacije, se ta preskusna metoda v primerih, ko se lahko dokaže, da je ni mogoče uporabiti za posamezno kategorijo zmesi (npr. v skladu s strategijo, kot jo predlagajo Eskes et al., 2012) (18), ne sme uporabiti za to posamezno kategorijo zmesi. Preden se preskusna metoda uporabi na zmesi, da bi se pridobili podatki za predvideni regulativni namen, je treba preučiti, ali in zakaj lahko zagotovi ustrezne rezultate za navedeni namen. Kadar obstaja regulativna zahteva za preskušanje zmesi, taki preudarki niso potrebni. Plini in aerosoli še niso bili ocenjeni v validacijskih študijah (8) (9). Čeprav se lahko preskusijo z uporabo preskusne metode TER, veljavna preskusna metoda ne dovoljuje preskušanja plinov in aerosolov.

NAČELO PRESKUSA

10.

Preskusna kemikalija se nanese za največ 24 ur na epidermalne površine kožnih ploščic v preskusnem sistemu z dvema komorama, v katerem kožne ploščice delujejo kot pregrada med komorami. Kožne ploščice se odvzamejo s humano usmrčenih podgan, starih 28–30 dni. Jedke kemikalije se opredelijo glede na zmožnost zmanjšati celovitost in pregradno funkcijo rožene plasti pokožnice, ki se meri kot znižanje TER pod raven praga (16) (glej odstavek 32). Za TER na koži podgan je bil na podlagi obsežnih podatkov za širok obseg snovi izbran prag 5 kΩ, kjer je bila velika večina vrednosti precej nad pragom (pogosto > 10 kΩ) ali precej pod njim (pogosto < 3 kΩ) (16). Na splošno preskusne kemikalije, ki niso jedke za živali, ampak so dražilne ali nedražilne, ne znižujejo TER pod ta prag. Prav tako lahko uporaba drugih kožnih pripravkov ali druge opreme spremeni vrednost praga, kar zahteva dodatne validacije.

11.

V preskusni postopek je vključena stopnja vezave barvila za potrjevanje pozitivnih rezultatov preskusa TER, kadar so vrednosti okoli 5 kΩ. V stopnji vezave barvila se ugotovi, ali je povečanje ionske prepustnosti posledica fizičnega uničenja rožene plasti pokožnice. Metoda TER je na podganji koži pokazala, da lahko pri kuncih napove jedkost in vivo, določeno s preskusno metodo B.4 (2).

DOKAZOVANJE USPOSOBLJENOSTI

12.

Pred redno uporabo preskusne metode TER na koži podgan, ki izpolnjuje zahteve te preskusne metode, morajo laboratoriji dokazati tehnično usposobljenost tako, da pravilno razvrstijo 12 snovi za preverjanje tehnične usposobljenosti, priporočenih v preglednici 1. V primerih, ko snov s seznama ni na voljo ali ko je to utemeljeno, se lahko uporabi druga snov, za katero so na voljo ustrezni referenčni podatki in vivo in in vitro (npr. s seznama referenčnih kemikalij (16)), če se uporabijo enaka merila za izbor, kot so opisana v preglednici 1.

Preglednica 1

Seznam snovi za preverjanje usposobljenosti  (2)

Snov

Št. CAS

Kemijski razred (3)

GHS ZN/uredba CLP Kat. na podlagi rezultatov in vivo  (4)

VRM Kat. na podlagi rezultatov in vitro

Agregatno stanje

pH (5)

Jedke snovi in vivo

N,N’-dimetil dipropilentriamin

10563-29-8

organska baza

1A

6 × J

tekoče

8,3

1,2-diaminopropan

78-90-0

organska baza

1A

6 × J

tekoče

8,3

Žveplova kislina (10-odstotna)

7664-93-9

anorganska kislina

(1A/)1B/1C

5 × J 1 × x NJ

tekoče

1,2

Kalijev hidroksid (10-odstotni vodni)

1310-58-3

anorganska baza

(1A/)1B/1C

6 × J

tekoče

13,2

Oktanojska (kaprilska) kislina

124-07-2

organska kislina

1B/1C

4 × J 2 × NJ

tekoče

3,6

2-terc-butilfenol

88-18-6

fenol

1B/1C

4 × J 2 × NJ

tekoče

3,9

Nejedke snovi in vivo

Izostearinska kislina

2724-58-5

organska kislina

NJ

6 × NJ

tekoče

3,6

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

organska baza

NJ

6 × NJ

trdno

5,5

Fenetil bromid

103-63-9

elektrofil

NJ

6 × NJ

tekoče

3,6

4-(metiltio)-benzaldehid

3446-89-7

elektrofil

NJ

6 × NJ

tekoče

6,8

1,9-dekadien

1647-16-1

nevtralna organska snov

NJ

6 × NJ

tekoče

3,9

Tetrakloroetilen

127-18-4

nevtralna organska snov

NJ

6 × NJ

tekoče

4,5

Kratice: aq = vodni; št. CAS = registrska številka Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS); VRM = validirana referenčna metoda; J = jedko; NJ = nejedko.

POSTOPEK

13.

Na voljo so standardni delovni postopki za preskusno metodo TER v zvezi z jedkostjo za kožo na koži podgan (19). Preskusne metode TER na koži podgan, zajete s to preskusno metodo, morajo izpolnjevati pogoje, navedene v nadaljevanju.

Živali

14.

Uporabiti je treba podgane, ker je bila občutljivost kože podgan za snovi pri tej preskusni metodi predhodno dokazana (12) in so edini vir kože, ki je bil uradno validiran (8) (9). Zagotoviti je treba, da so mešički dlak v dormantni fazi, preden se začne rast odraslih dlak, pri čemer sta zlasti pomembna starost (ob odvzemu kože) in sev podgane.

15.

Dlaka na hrbtu in bokih mladih približno 22 dni starih samcev ali samic (Wistar ali podobnega seva podgan) se previdno odstrani z majhnimi škarjami. Nato se živali s pazljivim brisanjem umijejo, ostrižena površina pa se potopi v antibiotično raztopino (ki denimo vsebuje streptomicin, penicilin, kloramfenikol in amfotericin v koncentracijah, ki učinkovito preprečujejo rast bakterij). Živali se z antibiotično raztopino ponovno umijejo tretji ali četrti dan po prvem umivanju, uporabijo pa se v 3 dneh po drugem umivanju, ko rožena plast okreva po odstranitvi dlak.

Priprava kožnih ploščic

16.

Živali se humano usmrtijo, ko so stare 28–30 dni; ta starost je ključna. Z vsake posamezne živali se nato odstrani hrbtno-bočna koža, s katere se previdno odlušči vsa odvečna podkožna maščoba. Nato se izrežejo kožne ploščice v premeru približno 20 mm. Koža se lahko shrani pred uporabo ploščic, kadar se dokaže, da so podatki pozitivnih in negativnih kontrol enaki kot pri sveži koži.

17.

Vsaka kožna ploščica se namesti čez konec cevi iz PTFE (politetrafluoroetilena), pri čemer se mora površina pokožnice dotikati cevi. Čez konec cevi se tesno namesti gumijast obroč, s katerim se koža pričvrsti, nato se obreže odvečno tkivo. Gumijasti obroč se nato z naravnim vazelinom pazljivo pritesni na konec PTFE-cevi. Cev se z vzmetno sponko namesti v receptorsko komoro, ki vsebuje raztopino MgSO4 (154 mM) (slika 1). Kožne ploščice morajo biti popolnoma potopljene v raztopino MgSO4. Iz kože ene podgane je mogoče pridobiti od 10 do 15 kožnih ploščic. Mere cevi in obroča so prikazane na sliki 2.

18.

Na dveh kožnih ploščicah iz kože vsake živali se pred začetkom preskušanja za namene kontrole kakovosti izmeri TER. Preostale ploščice se lahko uporabijo pri preskusni metodi, če je električna upornost obeh ploščic večja od 10 kΩ. Če je upornost manjša od 10 kΩ, je treba preostale ploščice, pripravljene iz iste kože, zavreči.

Nanos preskusne kemikalije in kontrolnih snovi

19.

Pri vsaki ponovitvi (poskusu) je treba uporabiti istočasne pozitivne in negativne kontrole, da se zagotovi ustreznost izvedbe modela poskusa. Pri vsaki ponovitvi (poskusu) se lahko uporabijo le kožne ploščice ene živali. Predlagana preskusna kemikalija za pozitivno kontrolo je 10-molarna klorovodikova kislina, za negativno kontrolo pa destilirana voda.

20.

Tekoče preskusne kemikalije (150 μl) se enakomerno nanesejo na površino pokožnice v cevi. Pri preskušanju trdnega materiala se na kožno ploščico enakomerno nanese dovolj trdne snovi, da se zagotovi, da je prekrita celotna površina pokožnice. Nato se na trdno snov doda deionizirana voda (150 μl), cevka pa se rahlo pretrese. Za največji stik s kožo bo morda treba trdno snov segrevati do 30 °C, da se preskusna kemikalija stali ali zmehča, ali zmleti, da nastane granulat ali prašek.

21.

Za vsako preskusno in kontrolno kemikalijo se pri vsaki ponovitvi (poskusu) uporabijo tri kožne ploščice. Preskusne kemikalije se za 24 ur nanesejo pri 20–23 °C. Preskusna kemikalija se odstrani tako, da se toliko časa spira s curkom tekoče vode pri največ sobni temperaturi, dokler ni več mogoče odstraniti materiala.

Meritve TER

22.

Impedanca kože se izmeri kot TER z Wheatstonovim mostičem nizke napetosti in izmeničnega toka (18). Splošne specifikacije za mostič so: delovna napetost 1–3 volte, izmenični tok 50–1 000 Hz v obliki sinusa ali pravokotnika in merilno območje najmanj 0,1–30 kΩ. Merilni mostič v validacijski študiji je meril induktivnost do 2 000 H, kapacitivnost do 2 000 μF in upornost do 2 MΩ pri frekvencah 100 Hz ali 1 kHz v zaporednih ali vzporednih meritvah. V preskusu jedkosti TER se meritve evidentirajo v obliki upornosti pri frekvenci 100 Hz in z zaporednimi vrednostmi. Pred merjenjem električne upornosti se površinska napetost kože zmanjša, tako da se doda zadostna količina 70-odstotnega etanola, da prekrije pokožnico. Po nekaj sekundah se etanol odstrani iz cevi, tkivo pa se nato navlaži s 3 ml raztopine MgSO4 (154 mM). Za merjenje upornosti v kΩ/kožno ploščico se elektrode merilnega mostiča namestijo na vsako stran kožne ploščice (slika 1). Mere elektrod in dolžina elektrode pod krokodilsko sponko so navedene na sliki 2. Sponka notranje (debele) elektrode med merjenjem upornosti leži na vrhu PTFE-cevi, s čimer se zagotovi, da je v raztopino MgSO4 ves čas potopljena enaka dolžina elektrode. Zunanja elektroda je v receptorski komori, in sicer se dotika njenega dna. Razdalja med vzmetno sponko in dnom PTFE-cevi je konstantna (slika 2), saj ta razdalja vpliva na dobljeno vrednost upornosti. Zato mora biti razdalja med notranjo elektrodo in kožno ploščico konstantna in minimalna (1–2 mm).

23.

Če je izmerjeni upor večji od 20 kΩ, je to morda posledica tega, da ostanki preskusne kemikalije prekrivajo površino pokožnice kožne ploščice. Za dodatno odstranitev te plasti se lahko na primer začepi PTFE-cev z orokavičenim palcem in jo stresa približno 10 sekund; raztopina MgSO4 se zavrže, merjenje upornosti pa se ponovi s svežim MgSO4.

24.

Lastnosti in mere preskusne naprave in uporabljenega poskusnega postopka lahko vplivajo na pridobljene vrednosti TER. Prag za jedkost 5 kΩ je bil ugotovljen na podlagi podatkov, pridobljenih s posebnimi napravami in postopkom, opisanim v tej metodi. Če se preskusni pogoji bistveno spremenijo ali če se uporabi drugačna naprava, lahko veljajo drugačni pragovi in kontrolne vrednosti. Zaradi tega je treba metodologijo in prag upornosti obvezno umerjati s preskušanjem vrste snovi za preverjanje usposobljenosti, ki se izberejo med snovmi, uporabljenimi v validacijski študiji (8) (9), ali skupinami snovi, ki so podobne preskušani. Nabor primernih snovi za preverjanje usposobljenosti je prikazan v preglednici 1.

Metode vezave barvila

25.

Izpostavljenost določenim nejedkim materialom lahko povzroči zmanjšanje upornosti pod prag 5 kΩ, pri čemer je omogočen prehod ionov skozi roženo plast in s tem zmanjšanje električne upornosti (9). Npr. nevtralne organske snovi in snovi, ki so površinsko aktivne (med drugim detergenti, emulgatorji in druge površinsko aktivne snovi), lahko odstranjujejo kožne lipide in povzročijo večjo prepustnost za ione. Zato je treba pri vrednostih TER za preskusne kemikalije pod 5 kΩ ali okoli te vrednosti in brez vidnih poškodb kožnih ploščic opraviti oceno penetracije barvila na kontrolnih in tretiranih tkivih, da se ugotovi, ali so vrednosti TER posledica povečane prepustnosti kože ali jedkosti za kožo (7) (9). V slednjem primeru barvilo sulforodamin B pretrga roženo plast, pri čemer barvilo po nanosu na površino kože hitro penetrira in obarva pod njim ležeče tkivo. To specifično barvilo je odporno proti širokemu razponu snovi in nanj ne vpliva ekstrakcijski postopek, opisan spodaj.

Nanos in odstranitev barvila sulforodamin B

26.

Po oceni TER se magnezijev sulfat odstrani iz cevi, kožo pa je treba natančno pregledati za vidne poškodbe. Če očitnih večjih poškodb (npr. perforacije) ni, se na površino pokožnice vsake kožne ploščice za 2 uri nanese 150 μl 10-odstotne (m/V) raztopine barvila sulforodamin B (Acid Red 52; C.I. 45100; št. CAS 3520-42-1) v destilirani vodi. Te kožne ploščice se nato približno 10 sekund spirajo s tekočo vodo pri največ sobni temperaturi, da se odstrani morebitno odvečno/nevezano barvilo. Vsaka kožna ploščica se pazljivo odstrani iz PTFE-cevi in prenese v vialo (npr. 20-mililitrsko stekleničko za scintilacijsko tekočino), ki vsebuje deionizirano vodo (8 ml). Viale se 5 minut rahlo stresajo, da se odstrani preostalo odvečno nevezano barvilo. Postopek izpiranja se ponovi, nato pa se kožne ploščice odstranijo in prenesejo v viale, ki vsebujejo 5 ml 30-odstotnega (m/V) natrijevega dodecil sulfata (SDS) v destilirani vodi, ter v inkubatorju čez noč shranijo pri 60 °C.

27.

Po inkubaciji se vse kožne ploščice odstranijo in zavržejo, preostala raztopina pa se 8 minut centrifugira pri 21 °C (relativna centrifugalna sila ~ 175 × g). 1 ml vzorca supernatanta se nato razredči v razmerju 1 proti 5 (V/V) (tj. 1 ml + 4 ml) s 30-odstotnim SDS (m/V) v destilirani vodi. Optična gostota raztopine se meri pri 565 nm.

Izračun vsebnosti barvila

28.

Vsebnost barvila sulforodamin B v ploščici se izračuna iz vrednosti optične gostote (9) (koeficient molarne ekstinkcije barvila sulforodamin B pri 565 nm = 8,7 × l04; molekulska masa = 580). Vsebnost barvila se določi za vsako kožno ploščico s pomočjo ustrezne umeritvene krivulje, nato pa se izračuna srednja vrednost vsebnosti barvila za ponovljene vzorce.

Merila za sprejemljivost

29.

Povprečni rezultati TER se sprejmejo pod pogojem, da so vrednosti istočasne pozitivne in negativne kontrole v mejah sprejemljivosti za to metodo v preskusnem laboratoriju. Meje sprejemljivosti za metodologijo in naprave, opisane zgoraj, so prikazane v naslednji preglednici.

Kontrola

Snov

Mejni upor (kΩ)

Pozitivna

10-molarna klorovodikova kislina

0,5–1,0

Negativna

destilirana voda

10–25

30.

Povprečni rezultati vezanja barvila se sprejmejo, če so vrednosti istočasne kontrole v mejah sprejemljivosti za metodo. Predlagane sprejemljive meje vsebnosti barvila za kontrolne snovi za zgoraj opisano metodologijo in napravo so navedene v spodnji preglednici.

Kontrola

Snov

Meje vsebnosti barvila (μg/košček)

Pozitivna

10-molarna klorovodikova kislina

40–100

Negativna

destilirana voda

15–35

Razlaga rezultatov

31.

Mejna vrednost TER, ki se uporablja za razlikovanje med jedkimi in nejedkimi preskusnimi kemikalijami, je bila določena med optimiranjem preskusne metode, preskušena v predvalidacijski fazi in potrjena v uradni validacijski študiji.

32.

Napovedni model za preskusno metodo TER v zvezi z jedkostjo za kožo na koži podgan (9) (19), povezan s sistemom za razvrščanje GHS ZN/uredbe CLP, je naveden v nadaljevanju.

Za preskusno kemikalijo se šteje, da ni jedka za kožo:

i)

če je srednja vrednost TER, dobljena za preskusno kemikalijo, večja od (>) 5 kΩ ali

ii)

če je srednja vrednost TER, dobljena za preskusno kemikalijo, manjša ali enaka (≤) 5 kΩ in

če na kožnih ploščicah ni vidnih poškodb (npr. perforacije) ter

je srednja vrednost vsebnosti barvila v kožni ploščici manjša (<) od istočasno določene srednje vrednosti vsebnosti barvila v kožni ploščici iz pozitivne kontrole z 10-molarno HCl (za vrednosti pozitivne kontrole glej odstavek 30).

Za preskusno kemikalijo se šteje, da je jedka za kožo:

i)

če je srednja vrednost TER, dobljena za preskusno kemikalijo, manjša ali enaka (≤) 5 kΩ in so kožne ploščice vidno poškodovane (npr. perforirane) ali

ii)

če je srednja vrednost TER, dobljena za preskusno kemikalijo, manjša ali enaka (≤) 5 kΩ in

če na kožnih ploščicah ni vidnih poškodb (npr. perforacije), vendar

je srednja vrednost vsebnosti barvila v kožni ploščici večja ali enaka (≥) istočasno določeni srednji vrednosti vsebnosti barvila v kožni ploščici iz pozitivne kontrole z 10-molarno HCl (za vrednosti pozitivne kontrole glej odstavek 30).

33.

Kadar je razvrstitev nedvoumna, bi moralo za preskusno kemikalijo zadoščati eno preskušanje (poskus), sestavljeno iz vsaj treh ponovljenih vzorcev kožnih ploščic. V primeru mejnih rezultatov, kot so neskladne ponovne meritve in/ali povprečni TER, enak 5 ± 0,5 k Ω, je treba preučiti možnost izvedbe druge neodvisne ponovitve preskušanja (poskusa) in nato še tretje, če so rezultati prvih dveh ponovitev preskušanj (poskusov) neskladni.

PODATKI IN POROČANJE

Podatki

34.

Vrednosti upornosti (kΩ), in kadar je primerno, vrednosti vsebnosti barvila (μg/ploščico) za preskusno kemikalijo skupaj s podatki pozitivnih in negativnih kontrol je treba prikazati v obliki preglednice, vključno s podatki za vsak ponovljeni vzorec ploščice pri vsaki ponovitvi preskušanja (poskusa) in srednjimi vrednostmi ± standardni odklon. Vse ponovljene poskuse je treba navesti. Za vsako preskusno kemikalijo je treba navesti opažene poškodbe kožnih ploščic.

Poročilo o preskusu

35.

V poročilo o preskusu se vključijo podatki, navedeni v nadaljevanju.

 

Preskusna kemikalija in kontrolne snovi:

Snov iz ene sestavine kemijski identifikacijski podatki, kot so ime po nomenklaturi IUPAC ali ime CAS, številka CAS, koda po sistemu SMILES ali identifikatorju InChI, strukturna formula, čistost, kemijska identiteta nečistoč, kot je ustrezno in praktično izvedljivo, itd.

Snov z več sestavinami, UVCB in zmesi: čim obsežnejša opredelitev lastnosti s kemijsko identiteto (glej zgoraj), kvantitativnim pojavljanjem in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi sestavin;

fizični videz, topnost v vodi in dodatne ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti;

vir, številka serije, če je na voljo;

obdelava preskusnih/kontrolnih kemikalij pred preskušanjem, če je ustrezno (npr. segrevanje, drobljenje);

stabilnost preskusne kemikalije, rok uporabe ali datum za ponovno analizo, če je znan;

pogoji skladiščenja.

 

Preskusne živali:

uporabljeni sev in spol;

starost živali, ko so bile uporabljene kot donorke;

izvor, nastanitvene razmere, prehrana itd.;

podrobnosti o pripravi kože.

 

Preskusni pogoji:

umeritvene krivulje za preskusne aparature;

umeritvene krivulje za izvedbo preskusa vezave barvila, filtrirana valovna dolžina, uporabljena za merjenje vrednosti optične gostote, in razpon linearnosti optične gostote merilne naprave (npr. spektrofotometra), če je primerno;

podrobnosti o preskusnem postopku, uporabljenem za meritve TER;

podrobnosti o preskusnem postopku, uporabljenem za oceno vezave barvila, če je primerno;

uporabljeni preskusni odmerki, trajanje obdobij izpostavljenosti in temperature izpostavljenosti;

podrobnosti o postopku spiranja, uporabljenem po obdobju izpostavljenosti;

število ponovljenih vzorcev kožnih ploščic, uporabljenih na preskusno kemikalijo, in kontrol (pozitivnih in negativnih kontrol);

opis morebitnih prilagoditev preskusnega postopka;

navedba podatkov o modelu iz preteklih preskusov. To mora med drugim vključevati:

i)

sprejemljivost vrednosti TER (v k Ω) za pozitivno in negativno kontrolo z navedbo mejnega uporna za pozitivne in negativne kontrole;

ii)

sprejemljivost vrednosti vsebnosti barvila (v μg/ploščico) za pozitivno in negativno kontrolo z navedbo mej vsebnosti barvila za pozitivno in negativno kontrolo;

iii)

sprejemljivost rezultatov preskusov z navedbo variabilnosti med ponovljenimi vzorci kožnih ploščic v preteklih preskusih;

opis uporabljenih meril za odločanje/uporabljenega napovednega modela.

 

Rezultati:

preglednice s podatki iz preskusov TER in vezave barvila (če je ustrezno) za posamezne preskusne kemikalije in kontrole, za vsako ponovitev preskušanja (poskusa) in vsak ponovljeni vzorec kožne ploščice (posamezne živali in posamezni vzorci kože), srednje vrednosti, standardni odkloni in koeficienti variacije;

opis vseh opaženih učinkov;

izpeljana razvrstitev z navedbo uporabljenega napovednega modela/meril za odločitev.

 

Razprava o rezultatih

 

Sklepne ugotovitve

VIRI

(1)

Združeni narodi (ZN) (2013). Globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS), druga revidirana izdaja, ZN New York in Ženeva, 2013. Na voljo na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Poglavje B.4 te priloge, Akutno draženje kože, jedkost za kožo.

(3)

Poglavje B.40a te priloge, Model kože in vitro.

(4)

Poglavje B.65 te priloge, Preskusna metoda membranske pregrade in vitro.

(5)

Poglavje B.46 te priloge, Draženje kože in vitro: preskusna metoda rekonstruirane človeške pokožnice.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 203), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(7)

Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P., in Balls, M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219–255.

(8)

Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., Walker, A. P., in Worth, A. P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471–482.

(9)

Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhütter, H.-G., in Liebsch, M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483–524.

(10)

Balls, M., Blaauboer, B. J., Fentem, J. H., Bruner, L., Combes, R. D., Ekwall, B., Fielder, R. J., Guillouzo, A., Lewis, R. W., Lovell, D. P., Reinhardt, C. A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., in Zucco, F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129–147.

(11)

ICCVAM (Medagencijski koordinacijski odbor ZDA za validacijo alternativnih metod). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. Publikacija NIH št. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, ZDA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), izdal ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3. april 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.

(14)

ICCVAM (Medagencijski koordinacijski odbor ZDA za validacijo alternativnih metod) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. Publikacija NIH št. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, ZDA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, št. 218. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(16)

Oliver, G. J. A., Pemberton, M. A., in Rhodes, C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507–512.

(17)

Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D. J., in Gardner, J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191–194.

(18)

Eskes, C., Detappe, V., Koëter, H., Kreysa, J., Liebsch, M., Zuang, V., Amcoff, P., Barroso, J., Cotovio, J., Guest, R., Hermann, M., Hoffmann, S., Masson, P., Alépée, N., Arce, L. A., Brüschweiler, B., Catone, T., Cihak, R., Clouzeau, J., D‘Abrosca, F., Delveaux, C., Derouette, J. P., Engelking, O., Facchini, D., Fröhlicher, M., Hofmann, M., Hopf, N., Molinari, J., Oberli, A., Ott, M., Peter, R., Sá-Rocha, V. M., Schenk, D., Tomicic, C., Vanparys, P., Verdon, B., Wallenhorst, T., Winkler, G. C., in Depallens, O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (december 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 34), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

Slika 1

Naprava za preskus ter na koži podgane

Image 2

Slika 2

Mere uporabljenih cevi iz politetrafluoroetilena (PTFE), receptorskih cevi in elektrod

Image 3

Ključni dejavniki zgoraj prikazane naprave:

Notranji premer PTFE-cevi,

dolžina elektrod relativno na PTFE-cev in receptorsko cev, tako da se kožna ploščica ne dotika elektrod in da je v stiku z raztopino MgSO4 standardna dolžina elektrode,

višina raztopine MgSO4 v receptorski cevki mora biti relativna na gladino raztopine v PTFE-cevi, kakor je prikazano na sliki 1,

kožna ploščica mora biti v PTFE-cev dovolj dobro fiksirana, da je električni upor resnično merilo lastnosti kože.

Dodatek

OPREDELITVE POJMOV

Točnost : stopnja ujemanja rezultatov preskusne metode s sprejetimi referenčnimi vrednostmi. Je merilo učinkovitosti preskusne metode in eden od vidikov ustreznosti. Ta izraz in izraz ,skladnost‘ se pogosto uporabljata kot sopomenki in pomenita delež pravilnih rezultatov preskusne metode (20).

J : jedko.

Kemikalija : snov ali zmes.

Skladnost : je merilo učinkovitosti za preskusne metode, s katerimi se pridobijo kategorični rezultati, in eden od vidikov ustreznosti. Ta izraz in izraz točnost se včasih uporabljata kot sopomenki in pomenita delež vseh preskušenih kemikalij, ki so pravilno razvrščene kot pozitivne ali negativne. Skladnost je zelo odvisna od razširjenosti pozitivnih rezultatov v vrstah preučevane preskusne kemikalije (20).

GHS (globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij (ZN)) : sistem za razvrščanje kemikalij (snovi in zmesi) v skladu s standardiziranimi vrstami in stopnjami fizičnih, zdravstvenih in okoljskih nevarnosti ter za obravnavanje ustreznega označevanja, na primer s piktogrami, opozorilnimi besedami, stavki o nevarnosti, previdnostnimi stavki in varnostnimi listi, da bi se razširile informacije o škodljivih učinkih kemikalij ter s tem zaščitili ljudje (vključno z delodajalci, delavci, prevozniki, potrošniki in reševalci) in okolje (1).

IATA : Integrated Approach to Testing and Assessment (celostni pristop k testiranju in ocenjevanju).

Zmes : zmes ali raztopina iz dveh ali več snovi.

Snov iz ene sestavine : snov, ki jo opredeljuje njena kvantitativna sestava in v kateri je vsaj 80 mas. % glavne sestavine.

Snov z več sestavinami : snov, ki jo opredeljuje njena kvantitativna sestava in v kateri je več glavnih sestavin s koncentracijo ≥ 10 mas. % in < 80 mas. %. Snov z več sestavinami je rezultat proizvodnega postopka. Razlika med zmesjo in snovjo z več sestavinami je v tem, da je zmes pridobljena z mešanjem dveh ali več snovi brez kemične reakcije. Snov z več sestavinami je rezultat kemične reakcije.

NJ : nejedko.

OD : optična gostota.

PC : pozitivna kontrola: ponovljen vzorec, ki vsebuje vse sestavine preskusnega sistema in se tretira s snovjo, za katero je znano, da povzroči pozitiven odziv. Za zagotovitev, da se lahko variabilnost odziva pozitivne kontrole oceni v daljšem časovnem obdobju, pa stopnja pozitivnega odziva ne sme biti prevelika.

Standardi izvajanja (SI) : standardi, ki temeljijo na validirani preskusni metodi in so podlaga za oceno primerljivosti predlagane preskusne metode, ki je funkcijsko in mehanistično podobna. Vključujejo: (i) nujne elemente preskusne metode; (ii) najkrajši možni seznam referenčnih kemikalij, izbranih iz skupine kemikalij, ki se uporabljajo za dokazovanje sprejemljive učinkovitosti validirane preskusne metode, ter (iii) podobne stopnje zanesljivosti in točnosti, ki temeljijo na rezultatih validirane preskusne metode, kar mora dokazati predlagana preskusna metoda pri ocenjevanju ob uporabi najkrajšega možnega seznama referenčnih kemikalij.

Ustreznost : opis razmerja med preskusno metodo in preiskovanim učinkom ter njegovega pomena in uporabnosti za določen namen. Pomeni stopnjo, do katere preskusna metoda pravilno izmeri ali napove preiskovani biološki učinek. Ustreznost upošteva tudi točnost (skladnost) preskusne metode (20).

Zanesljivost : stopnja obnovljivosti preskusne metode v enem ali več laboratorijih v daljšem časovnem obdobju ob uporabi istega protokola. Oceni se z izračunom obnovljivosti v enem ali več laboratorijih (20).

Občutljivost : delež vseh pozitivnih/aktivnih kemikalij, ki se s preskusno metodo pravilno razvrstijo. Je merilo točnosti za preskusno metodo, s katero se pridobijo kategorični rezultati, in pomemben dejavnik pri ocenjevanju ustreznosti preskusne metode (20).

Jedkost za kožo in vivo : nastanek nepovračljivih poškodb kože: zlasti vidnega odmiranja prek povrhnjice v usnjico po nanosu preskusne kemikalije za največ 4 ure. Za reakcije jedkosti so značilne razjede, krvavitve, krvave hraste in do konca 14-dnevnega opazovanja izguba barve zaradi beljenja kože, celi predeli alopecije in brazgotine. Dvoumne lezije je morda treba preiskati histopatološko.

Specifičnost : delež vseh negativnih/neaktivnih kemikalij, ki se s preskusno metodo pravilno razvrstijo. Je merilo točnosti za preskusno metodo, s katero se pridobijo kategorični rezultati, in pomemben dejavnik pri ocenjevanju ustreznosti preskusne metode (20).

Snov : kemijski elementi in njihove spojine, ki so v naravnem stanju ali pridobljeni s katerim koli proizvodnim postopkom, vključno z vsemi dodatki, potrebnimi za ohranitev stabilnosti produkta, in kakršnimi koli nečistotami, ki so nastale v uporabljenem postopku, vendar brez kakršnega koli topila, ki ga je mogoče ločiti, ne da bi to vplivalo na stabilnost snovi ali spremenilo njeno sestavo.

Ponovitev (preskusa) : sočasno preskušanje iste preskusne kemikalije na vsaj treh ponovljenih vzorcih kožnih ploščic.

Preskusna kemikalija : vsaka snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo.

transkutana električna upornost (TER). : merilo električne impedance kože, ki je izražena kot upornost v kiloohmih. Preprosta in robustna metoda za ocenjevanje pregradne funkcije z evidentiranjem prehoda ionov preko kože z napravo z Wheatstonovim mostičem.

UVCB : snovi z neznano ali spremenljivo sestavo, kompleksni reakcijski produkti ali biološki materiali.

(6)

Poglavje B.40bis dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.40bis   JEDKOST ZA KOŽO IN VITRO: PRESKUSNA METODA REKONSTRUIRANE ČLOVEŠKE POKOŽNICE

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici OECD za preskušanje (TG) 431 (2016). Jedkost za kožo pomeni nastanek nepovračljive poškodbe kože, ki se kaže kot vidno odmiranje prek povrhnjice v usnjico po nanosu preskusne kemikalije (kot je opredeljeno v globalno usklajenem sistemu Združenih narodov za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS ZN) (1) ter Uredbi (ES) št. 1272/2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi (uredba CLP) (6)). Pri tej posodobljeni preskusni metodi B.40a se izvede postopek in vitro, ki omogoča opredelitev nejedkih in jedkih snovi in zmesi v skladu z GHS ZN in uredbo CLP. Omogoča tudi delno razvrstitev jedkih snovi v podkategorije.

2.

Ocena potenciala kemikalij za povzročanje jedkosti za kožo se je običajno izvajala z uporabo laboratorijskih živali (preskusna metoda B.4, enakovredna Smernici OECD za preskušanje 404, ki je bila prvotno sprejeta leta 1981 ter revidirana v letih 1992, 2002 in 2015) (2). Poleg sedanje preskusne metode B.40a sta bili validirani še dve drugi preskusni metodi in vitro za preskušanje potenciala kemikalij za povzročanje jedkosti, ki sta bili sprejeti kot preskusna metoda B.40 (enakovredna Smernici OECD za preskušanje 430) (3) in preskusna metoda B.65 (enakovredna Smernici OECD za preskušanje 435) (4). Poleg tega je bila preskusna metoda in vitro B.46 (enakovredna Smernici OECD za preskušanje 439) (5) sprejeta za preskušanje potenciala za draženje kože. V smernici OECD za celostne pristope k testiranju in ocenjevanju (IATA) v zvezi z jedkostjo za kožo in draženjem kože je opisanih več modulov, v katerih so zbrani viri informacij in orodja za analizo, zagotovljene smernice o tem, (i) kako obstoječe podatke, pridobljene s preskušanjem, in podatke, ki ne temeljijo na preskušanju, združiti in uporabiti pri ocenjevanju potenciala kemikalij za draženje kože in povzročanje jedkosti za kožo, (ii) predlagan pa je tudi pristop, kadar je potrebno dodatno preskušanje (6).

3.

S to preskusno metodo se obravnava končna točka jedkost za kožo z vidika zdravja ljudi. Pri njej se uporablja rekonstruirana človeška pokožnica (pridobljena iz netransformiranih keratinocitov človeške pokožnice), ki ima zelo podobne histološke, morfološke, biokemijske in fiziološke značilnosti kot zgornji deli človeške kože, tj. pokožnica. Ustrezna smernica OECD za preskušanje je bila prvotno sprejeta leta 2004, leta 2013 je bila posodobljena zaradi vključitve dodatnih preskusnih metod z uporabo modelov rekonstruirane človeške pokožnice in možnosti uporabe metod za pomoč pri razvrščanju jedkih kemikalij v podkategorije, leta 2015 pa je bila posodobljena zaradi sklicevanja na dokument s smernicami IATA in uvedbe uporabe alternativnega postopka za merjenje viabilnosti.

4.

V to preskusno metodo so vključeni štirje validirani, na trgu dostopni modeli rekonstruirane človeške pokožnice. Predvalidacijske študije (7), ki jim je sledila uradna validacijska študija za oceno jedkosti za kožo (8) (9) (10), so bile izvedene (11) (12) za dva od teh na trgu dostopnih preskusnih modelov, EpiSkin™ Standard Model (SM) in EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (v nadaljnjem besedilu: validirani referenčni metodi – VRM). Na podlagi rezultatov teh študij je bilo izdano priporočilo, da se lahko obe zgoraj navedeni metodi VRM uporabita za regulativne namene za razlikovanje med jedkimi (J) in nejedkimi (NJ) snovmi ter da se lahko model EpiSkin™ poleg tega uporablja kot pomoč pri razvrščanju jedkih snovi v podkategorije (13) (14) (15). Glede na validacijo na podlagi standardov izvajanja sta podobne rezultate kot VRM EpiDerm™ pokazala še dva druga na trgu dostopna modela rekonstruirane človeške pokožnice za preskušanje jedkosti za kožo in vitro (16) (17) (18). To sta SkinEthic™ RHE (7) in epiCS® (ki se je prej imenoval EST-1000), ki ju je prav tako mogoče uporabiti za regulativne namene za razlikovanje med jedkimi in nejedkimi snovmi (19) (20). S povalidacijskimi študijami, ki so jih proizvajalci modela rekonstruirane človeške pokožnice izvedli v obdobju 2012–2014 z izpopolnjenim protokolom za odpravo interferenc nespecifične redukcije MTT s preskusnimi kemikalijami, sta se izboljšali uspešnost razlikovanja med jedkimi in nejedkimi snovmi ter pomoč pri razvrščanju jedkih snovi v podkategorije (21) (22). Opravljene so bile dodatne statistične analize povalidacijskih podatkov, pridobljenih z modeli EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE in EpiCS®, da bi se opredelili alternativni napovedni modeli, s katerimi se je izboljšala napovedna zmogljivost za razvrstitev v podkategorije (23).

5.

Preden se omogoči uporaba predlagane podobne ali spremenjene preskusne metode z rekonstruirano človeško pokožnico in vitro v zvezi z jedkostjo za kožo, ki ni VRM, za regulativne namene, je treba določiti njeno zanesljivost, ustreznost (točnost) in omejitve, kar zadeva predlagano uporabo, da se zagotovi njena podobnost z VRM v skladu s standardi izvajanja (24), navedenimi v skladu z načeli Smernic OECD 34 (25). Medsebojno priznavanje podatkov bo zagotovljeno šele, ko bo predlagana nova ali posodobljena preskusna metoda v skladu s standardi izvajanja pregledana in vključena v ustrezno smernico za preskušanje. Preskusni modeli, vključeni v navedeno smernico za preskušanje, se lahko uporabijo za obravnavanje zahtev držav po rezultatih preskusov v zvezi s preskusno metodo in vitro za jedkost za kožo, hkrati pa se izkoristi medsebojno priznavanje podatkov.

OPREDELITVE POJMOV

6.

Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.

ZAČETNI PREUDARKI

7.

Ta preskusna metoda omogoča opredelitev nejedkih in jedkih snovi ter zmesi v skladu z GHS ZN in uredbo CLP. Ta preskusna metoda dodatno pomaga pri razvrstitvi jedkih snovi in zmesi v neobvezno podkategorijo 1A v skladu z GHS ZN (1) ter kombinacijo podkategorij 1B in 1C (21) (22) (23). Omejitev te preskusne metode je, da ne omogoča razlikovanja med podkategorijo snovi, ki so jedke za kožo, 1B in podkategorijo 1C v skladu z GHS ZN in uredbo CLP zaradi omejenega nabora znanih kemikalij, ki so jedke in vivo, iz podkategorije 1C. Preskusne modele EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE in epiCS® je mogoče razvrstiti v podkategorije (tj. 1A, 1B ali 1C ali NJ).

8.

V validacijski študiji v podporo preskusnim modelom, vključenim v to preskusno metodo, ko se uporabljajo za opredelitev nejedkih in jedkih snovi, je bil preskušen širok nabor kemikalij, ki večinoma predstavljajo posamezne snovi; v empirično zbirko podatkov validacijske študije je vključenih 60 kemikalij, ki zajemajo najrazličnejše kemijske razrede (8) (9) (10). Preskušanje za dokaz občutljivosti, specifičnosti in točnosti preskusa ter njegove obnovljivosti v laboratoriju za razvrstitev v podkategorije so izvedli raziskovalci, ki so razvili preskusno metodo, rezultate pa je pregledala OECD (21) (22) (23). Na podlagi vseh razpoložljivih podatkov se preskusna metoda uporablja za najrazličnejše kemijske razrede in agregatna stanja, vključno s tekočimi snovmi, poltrdnimi snovmi, trdnimi snovmi in voski. Tekoče snovi so lahko vodne raztopine ali ne, trdne snovi so lahko topne ali netopne v vodi. Če je mogoče, je treba trdne snovi pred nanosom zmleti v fin prah; druga predhodna obdelava vzorca ni potrebna. Kadar se lahko dokaže, da preskusnih modelov, vključenih v to preskusno metodo, za posamezno kategorijo preskusnih kemikalij ni mogoče uporabiti, se zanjo ne smejo uporabljati. Poleg tega se predpostavlja, da se ta preskusna metoda uporablja za zmesi kot razširitev njene uporabe za snovi. Ker pa zmesi zajemajo širok spekter kategorij in sestave in ker so v zvezi s preskušanjem zmesi trenutno na voljo samo omejene informacije, se ta preskusna metoda v primerih, ko se lahko dokaže, da je ni mogoče uporabiti za posamezno kategorijo zmesi (npr. v skladu s strategijo, kot je predlagana v (26)), za to posamezno kategorijo zmesi ne sme uporabljati. Preden se preskusna metoda uporabi na zmesi, da bi se pridobili podatki za predvideni regulativni namen, je treba preučiti, ali in zakaj lahko zagotovi ustrezne rezultate za navedeni namen. Kadar obstaja regulativna zahteva za preskušanje zmesi, taki preudarki niso potrebni. Plini in aerosoli še niso bili ocenjeni v validacijskih študijah (8) (9) (10). Čeprav se lahko preskusijo z uporabo tehnologije rekonstruirane človeške pokožnice, veljavna preskusna metoda ne dovoljuje preskušanja plinov in aerosolov.

9.

Preskusne kemikalije, ki absorbirajo svetlobo v istem razponu kot formazan MTT, in preskusne kemikalije, ki lahko povzročijo neposredno redukcijo vitalnega barvila MTT (glede na formazan MTT), lahko vplivajo na meritve viabilnosti tkiva, zato je treba za popravke uporabiti prilagojene kontrole. Vrsta prilagojenih kontrol, ki so lahko potrebne, je odvisna od vrste interference, ki jo povzroča preskusna kemikalija, in postopka za merjenje formazana MTT (glej odstavke 25–31).

10.

Čeprav ta preskusna metoda ne prinaša ustreznih informacij o draženju kože, je treba opozoriti, da se s preskusno metodo B.46 izrecno obravnava učinek draženja kože in vitro na zdravje in temelji na istem sistemu rekonstruirane človeške pokožnice, čeprav uporablja drug protokol (5). Za popolno vrednotenje lokalnih učinkov na kožo po enkratni izpostavljenosti kože je treba uporabiti dokument s smernico OECD v zvezi s celostnimi pristopi k testiranju in ocenjevanju (IATA) (6). Ta pristop IATA vključuje opravljanje preskusov jedkosti za kožo in vitro (kot je opisano v tej preskusni metodi) in preskusov draženja kože pred preskušanjem na živih živalih. Razumljivo je, da se pri uporabi človeške kože upoštevajo nacionalna in mednarodna etična načela in pogoji.

NAČELO PRESKUSA

11.

Preskusna kemikalija se lokalno nanese na tridimenzionalni model rekonstruirane človeške pokožnice, ki vključuje netransformirane keratinocite pokožnice iz človeškega tkiva, gojene za večplastni, zelo raznolik model človeške pokožnice. Sestavljajo ga organizirane bazalne, spinalne in zrnate plasti ter večplastna rožena plast, ki vključuje medcelične lamelarne maščobne plasti, ki predstavljajo glavne razrede maščob in so podobni strukturi in vivo.

12.

Preskusna metoda z rekonstruirano človeško pokožnico temelji na predpostavki, da lahko jedke kemikalije prodrejo v roženo plast z difuzijo ali erozijo in so citotoksične za spodaj ležeče plasti celic. Viabilnost celic se meri z encimsko pretvorbo vitalnega barvila MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol bromid, tiazolil modro tetrazol bromid; številka CAS 298–93-1) v soli modrega formazana, katere količina se izmeri po ekstrakciji iz tkiv (27). Jedke kemikalije se opredelijo glede na njihovo zmožnost zmanjšanja viabilnosti celic pod opredeljene vrednosti praga (glej odstavka 35 in 36). Preskusna metoda jedkosti za kožo, ki temelji na rekonstruirani človeški pokožnici, je pokazala, da lahko pri kuncih napove učinke jedkosti za kožo in vivo v skladu s preskusno metodo B.4 (2).

DOKAZOVANJE USPOSOBLJENOSTI

13.

Pred redno uporabo katerega koli od štirih validiranih preskusnih modelov rekonstruirane človeške pokožnice, ki izpolnjujejo zahteve te preskusne metode, morajo laboratoriji dokazati tehnično usposobljenost tako, da pravilno razvrstijo 12 snovi za preverjanje usposobljenosti, navedenih v preglednici 1. Če se uporabi metoda za razvrščanje v podkategorije, je treba dokazati tudi pravilno razvrščanje v podkategorije. V primerih, ko snov s seznama ni na voljo ali ko je to utemeljeno, se lahko uporabi druga snov, za katero so na voljo ustrezni referenčni podatki in vivo in in vitro (npr. s seznama referenčnih kemikalij (24)), če se uporabijo enaka merila za izbor, kot so opisana v preglednici 1.

Preglednica 1

Seznam snovi za preverjanje usposobljenosti  (8)

Snov

Št. CAS

Kemijski razred (9)

Kat. po GHS ZN/uredbi CLP na podlagi rezultatov in vivo  (10)

VRM Kat. na podlagi Rezultatiin vitro  (11)

MTT: MTT (12)

Agregatno stanje

Podkategorija 1A za jedke snovi in vivo

Bromoocetna kislina

79-08-3

organska kislina

1A

(3) 1A

trdno

Borov trifluorid dihidrat

13319-75-0

anorganska kislina

1A

(3) 1A

tekoče

fenol

108-95-2

fenol

1A

(3) 1A

trdno

Dikloroacetil klorid

79-36-7

elektrofil

1A

(3) 1A

tekoče

Kombinacija podkategorij 1B in 1C za jedke snovi in vivo

Monohidrat glioksilne kisline

563-96-2

organska kislina

1B in 1C

(3) 1B in 1C

trdno

Mlečna kislina

598-82-3

organska kislina

1B in 1C

(3) 1B in 1C

tekoče

Etanolamin

141-43-5

organska baza

1B

(3) 1B in 1C

da

viskozno

Klorovodikova kislina (14,4 %)

7647-01-0

anorganska kislina

1B in 1C

(3) 1B in 1C

tekoče

Nejedke snovi in vivo

Fenetil bromid

103-63-9

elektrofil

NJ

(3) NJ

da

tekoče

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

organska baza

NJ

(3) NJ

trdno

4-(metiltio)-benzaldehid

3446-89-7

elektrofil

NJ

(3) NJ

da

tekoče

Lavrinska kislina

143-07-7

organska kislina

NJ

(3) NJ

trdno

Kratice: št. CAS = registrska številka Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS); VRM = validirana referenčna metoda; NJ = nejedko.

14.

V okviru dokazovanja usposobljenosti se priporoča, da uporabnik po prejetju preveri pregrado tkiv, kakor to določa proizvajalec modela rekonstruirane človeške pokožnice. To je zlasti pomembno, če tkiva potujejo na dolge razdalje/dalj časa. Potem ko je preskusna metoda uspešno vzpostavljena in je dokazana usposobljenost glede njene uporabe, redno preverjanje tkiv ni več potrebno. Vendar je priporočljivo, da se ob redni uporabi metode še naprej ocenjujejo značilnosti pregrade tkiv v rednih časovnih razmikih.

POSTOPEK

15.

V nadaljevanju so na splošno opisani elementi in postopki preskusnih modelov rekonstruirane človeške pokožnice za ocenjevanje jedkosti za kožo, zajetih s to preskusno metodo. Modele rekonstruirane človeške pokožnice, potrjene kot znanstveno veljavne za uporabo v okviru te preskusne metode, in sicer modele EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE in epiCS® (16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33), je mogoče dobiti od komercialnih virov. Za te štiri modele rekonstruirane človeške pokožnice so na voljo standardni delovni postopki (34) (35) (36) (37), njihovi glavni elementi preskusne metode pa so povzeti v Dodatku 2. Priporočljivo je, da se pri izvajanju in uporabi enega od teh modelov v laboratoriju preveri ustrezni standardni delovni postopek. Preskušanje s štirimi preskusnimi modeli rekonstruirane človeške pokožnice, zajetimi s to preskusno metodo, se mora izvajati v skladu z zahtevami, navedenimi v nadaljevanju.

ELEMENTI PRESKUSNE METODE REKONSTRUIRANE ČLOVEŠKE POKOŽNICE

Splošni pogoji

16.

Za rekonstrukcijo epitelija se uporabijo netransformirani človeški keratinociti. Pod funkcionalno roženo plastjo je več slojev živih epitelijskih celic (bazalna plast, trnasta plast, zrnata plast). Rožena plast mora biti razdeljena na več plasti in vsebovati lipidni profil za močno funkcionalno pregrado za zaustavitev hitre penetracije primerjalnih kemikalij citotoksičnosti, npr. natrijevega dodecil sulfata (SDS) ali Tritona X-100. Pregradna funkcija mora biti dokazana in se lahko oceni z določitvijo koncentracije, pri kateri se zaradi primerjalne kemikalije po določenem času izpostavljenosti zmanjša viabilnost tkiv za 50 % (IC50), ali z določitvijo časa izpostavljenosti, ki je potreben za zmanjšanje viabilnosti celic za 50 % (ET50) po nanosu določene stalne koncentracije primerjalne kemikalije (glej odstavek 18). Zadrževalne značilnosti modela rekonstruirane človeške pokožnice morajo preprečevati prehod materiala okoli rožene plasti v živo tkivo, kar bi preprečilo učinkovitost modelov za raziskovanje v zvezi z izpostavljenostjo kože. V modelu rekonstruirane človeške pokožnice ne sme biti bakterij, virusov, mikoplazme ali gliv.

Pogoji za funkcionalnost

Viabilnost

17.

Analiza, ki se uporablja za kvantifikacijo viabilnosti tkiva, je analiza MTT (27). Viabilne celice konstrukcije tkiva rekonstruirane človeške pokožnice reducirajo vitalno barvilo MTT v oborino modrega formazana MTT, ki se nato ekstrahira iz tkiva z uporabo izopropanola (ali podobnega topila). Optična gostota (OD) izvlečka ekstrakcijskega topila mora biti dovolj majhna, tj. OD < 0,1. Ekstrahirani formazan MTT se lahko kvantitativno določi bodisi z uporabo meritve standardne absorbance (OD) bodisi z uporabo postopka spektrofotometrije HPLC/UPLC (38). Uporabniki modela rekonstruirane človeške pokožnice morajo zagotoviti, da vsaka serija zadevnega modela izpolnjuje merila, določena za negativno kontrolo. Razpon sprejemljivosti (zgornja in spodnja meja) za vrednosti optične gostote pri negativni kontroli mora določiti razvijalec/dobavitelj modela rekonstruirane človeške pokožnice. Razponi sprejemljivosti za vrednosti optične gostote pri negativni kontroli za štiri validirane preskusne modele rekonstruirane človeške pokožnice, vključene v to preskusno metodo, so navedeni v preglednici 2. Uporabnik spektrofotometrije HPLC/UPLC mora razpone optične gostote pri negativni kontroli, navedene v preglednici 2, uporabiti kot merilo za sprejemljivost negativne kontrole. Evidentirati je treba, da je negativno kontrolno tkivo, kar zadeva celične kulture, v obdobju izpostavljenosti stabilno (meritve optične gostote so podobne).

Preglednica 2

Razponi sprejemljivosti za vrednosti optične gostote pri negativni kontroli za kontrolo kakovosti serije

 

Spodnja meja sprejemljivosti

Zgornja meja sprejemljivosti

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Pregradna funkcija

18.

Rožena plast in njena maščobna sestava morata zadostovati za zaustavitev hitre penetracije nekaterih citotoksičnih primerjalnih kemikalij, npr. SDS ali Tritona X-100, kot se ocenjuje z IC50 ali ET50 (preglednica 3). Pregradno funkcijo vsake serije uporabljenega modela rekonstruirane človeške pokožnice mora dokazati razvijalec/prodajalec zadevnega modela ob dobavi tkiv končnemu uporabniku (glej odstavek 21).

Morfologija

19.

Opravljen mora biti histološki pregled modela rekonstruirane človeške pokožnice za prikaz večplastne strukture, podobne človeški pokožnici, ki vključuje bazalno plast, trnasto plast, zrnato plast in roženo plast ter ima podoben lipidni profil kot človeška pokožnica. Histološki pregled vsake serije uporabljenega modela rekonstruirane človeške pokožnice, s katerim se dokaže ustrezna morfologija tkiv, mora zagotoviti razvijalec/prodajalec zadevnega modela ob dobavi tkiv končnemu uporabniku (glej odstavek 21).

Obnovljivost

20.

Uporabniki preskusnih metod morajo dokazati obnovljivost preskusnih metod v daljšem časovnem obdobju s pozitivnimi in negativnimi kontrolami. Poleg tega se lahko preskusna metoda uporabi samo, če razvijalec/dobavitelj modela rekonstruirane človeške pokožnice zagotovi podatke, ki dokazujejo obnovljivost v daljšem časovnem obdobju z jedkimi in nejedkimi kemikalijami, na primer s seznama snovi za preverjanje usposobljenosti (preglednica 1). Če se preskusna metoda uporabi za razvrščanje v podkategorije, je treba dokazati tudi obnovljivost v zvezi z razvrščanjem v podkategorije.

Kontrola kakovosti

21.

Model rekonstruirane človeške pokožnice se lahko uporabi samo, če razvijalec/dobavitelj dokaže, da vsaka serija zadevnega modela izpolnjuje opredeljena merila za sprostitev proizvodnje, med katerimi so najpomembnejša merila za viabilnost (odstavek 17), pregradno funkcijo (odstavek 18) in morfologijo (odstavek 19). Ti podatki se zagotovijo uporabnikom preskusne metode, da lahko te informacije vključijo v poročilo o preskusu. Za zanesljivo napoved razvrstitve med jedke snovi se lahko štejejo le rezultati, doseženi s tkivi iz serij, potrjenih s kontrolo kakovosti. Razpon sprejemljivosti (zgornja in spodnja meja) za IC50 ali ET50 določi razvijalec/dobavitelj modela rekonstruirane človeške pokožnice. Razponi sprejemljivosti za štiri validirane preskusne modele so navedeni v preglednici 3.

Preglednica 3

Merila za kontrolo kakovosti ob sprostitvi serij

 

Spodnja meja sprejemljivosti

Zgornja meja sprejemljivosti

EpiSkin™ (SM) (18-urno tretiranje s SDS) (33)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1-odstotni Triton X-100) (34)

ET50 = 4,0 ure

ET50 = 8,7 ure

SkinEthic™ RHE (1-odstotni Triton X-100) (35)

ET50 = 4,0 ure

ET50 = 10,0 ure

epiCS® (1-odstotni Triton X-100) (36)

ET50 = 2,0 ure

ET50 = 7,0 ure

Nanos preskusne kemikalije in kontrolnih kemikalij

22.

Za vsako preskusno kemikalijo in kontrole je treba za vsak čas izpostavljenosti uporabiti vsaj dva ponovljena vzorca tkiva. Za tekoče in trdne kemikalije je treba nanesti zadostno količino preskusne kemikalije, da se površina pokožnice enakomerno prekrije, pri čemer mora biti odmerek natančno določen, tj. najmanj 70 μl/cm2 ali 30 mg/cm2. Odvisno od modela je treba za boljši stik med preskusno kemikalijo in površino pokožnice pred nanosom trdnih kemikalij površino pokožnice navlažiti z deionizirano ali destilirano vodo (34) (35) (36) (37). Če je mogoče, je treba trdne snovi preskusiti v obliki finega prahu. Metoda nanosa mora biti primerna glede na preskusno kemikalijo (glej npr. reference (34–37). Ob koncu časa izpostavljenosti je treba preskusno kemikalijo skrbno sprati s pokožnice z vodnim pufrom ali 0,9-odstotnim NaCl. Odvisno od tega, kateri od štirih validiranih preskusnih modelov rekonstruirane človeške pokožnice se uporabi, se za vsako preskusno kemikalijo uporabita dve ali tri obdobja izpostavljenosti (za vse štiri ustrezne modele rekonstruirane človeške pokožnice: 3 minute in 1 ura; za model EpiSkin™ dodatni čas izpostavljenosti traja 4 ure). Glede na uporabljeni preskusni model rekonstruirane človeške pokožnice in ocenjevano obdobje izpostavljenosti lahko inkubacijska temperatura znaša od sobne temperature do 37 °C.

23.

Pri vsaki ponovitvi je treba uporabiti sočasno negativno in pozitivno kontrolo (PC), da se dokaže, da so viabilnost celic (z negativnimi kontrolami), pregradna funkcija in posledična občutljivost tkiva (s PC) v okviru opredeljenega območja sprejemljivosti iz preteklih preskusov. Predlagana kemikalija za pozitivno kontrolo je ledocetna kislina ali 8-normalni KOH, odvisno od uporabljenega modela rekonstruirane človeške pokožnice. Opozoriti je treba, da je 8-normalni KOH snov, ki neposredno zmanjšuje MTT in ki lahko zahteva prilagojene kontrole, kot je opisano v odstavkih 25 in 26. Predlagani negativni kontroli sta 0,9-odstotni NaCl ali voda.

Meritve viabilnosti celic

24.

Analizo MTT, ki je kvantitativna analiza, je treba v okviru te preskusne metode uporabljati za merjenje viabilnosti celic (27). Vzorec tkiva se za 3 ure potopi v ustrezno koncentracijo raztopine MTT (npr. 0,3 ali 1 mg/ml). S topilom (npr. izopropanolom, kislim izopropanolom) se izvleče oborina modrega formazana, potem pa se koncentracija formazana izmeri tako, da se določi optična gostota pri valovni dolžini 570 nm z uporabo filtrirane valovne dolžine največ ±30 nm, ali z uporabo postopka spektrofotometrije HPLC/UPLC (glej odstavka 30 in 31) (38).

25.

Preskusne kemikalije lahko vplivajo na analizo MTT ali z neposredno redukcijo MTT v modri formazan in/ali z barvno interferenco, če preskusna kemikalija naravno ali zaradi postopkov tretiranja absorbira v istem razponu optične gostote formazana (570 ± 30 nm, predvsem modre in vijoličaste kemikalije). Dodatne kontrole je treba uporabiti, da se zazna in popravi morebitno vplivanje teh preskusnih kemikalij, kot sta kontrola z nespecifično redukcijo MTT (NSMTT) in kontrola z nespecifično barvo (NSC) (glej odstavke od 26 do 30). To je še zlasti pomembno, če se določena preskusna kemikalija z izpiranjem s tkiva ne odstrani v celoti ali če prodre v pokožnico, tako da je med preskusom viabilnosti MTT prisotna v tkivu. Za podrobnejši opis načina popravka neposredne redukcije MTT in vpliva barvil glej standardne delovne postopke za preskusne modele (34) (35) (36) (37).

26.

Za opredelitev snovi, ki neposredno zmanjšujejo MTT, je treba vsako preskusno kemikalijo dodati sveže pripravljenemu mediju MTT (34) (35) (36) (37). Če se zmes MTT, ki vsebuje preskusno kemikalijo, obarva modro/vijolično, se šteje, da preskusna kemikalija neposredno zmanjšuje MTT, zato je treba izvesti dodatno funkcionalno preverjanje na neviabilni pokožnici, in to neodvisno od uporabe meritve standardne absorbance (OD) ali postopka spektrofotometrije HPLC/UPLC. Pri tem dodatnem funkcionalnem preverjanju se uporabijo odmrla tkiva, ki imajo samo rezidualno presnovno aktivnost, vendar absorbirajo podobno količino preskusne kemikalije kot viabilna tkiva. Vsaka kemikalija, ki zmanjšuje MTT, se nanese na vsaj dva dvojnika odmrlega tkiva za vsak čas izpostavljenosti, nato se na teh dvojnikih opravi celoten preskus jedkosti za kožo. Dejanska viabilnost tkiva se nato izračuna kot delež viabilnosti tkiva, dobljen z živimi tkivi, izpostavljenimi snovi, ki zmanjšuje MTT, od katerega se odšteje delež nespecifične redukcije MTT, dobljen z odmrlimi tkivi, izpostavljenimi isti snovi, ki zmanjšuje MTT, izračunan glede na negativno kontrolo, izvedeno sočasno s preskusom, ki se popravlja (% NSMTT).

27.

Za opredelitev morebitnega vplivanja obarvanih preskusnih kemikalij ali preskusnih kemikalij, ki so se obarvale v stiku z vodo ali izopropanolom, in odločitev, ali so potrebne dodatne kontrole, je treba opraviti spektralno analizo preskusne kemikalije v vodi (okolje med izpostavljenostjo) in/ali izopropanolu (raztopina za ekstrahiranje). Če preskusna kemikalija v vodi in/ali izopropanolu absorbira svetlobo v razponu 570 ± 30 nm, je treba izvesti dodatne kontrole z barvilom ali pa uporabiti postopek spektrofotometrije HPLC/UPLC, pri čemer v tem primeru te kontrole niso potrebne (glej odstavka 30 in 31). Pri izvajanju meritve standardne absorbance (OD) se vsaka moteča obarvana preskusna kemikalija nanese na vsaj dva ponovljena vzorca viabilnega tkiva za vsak čas izpostavljenosti, nato se na teh ponovljenih vzorcih izvede celoten preskus jedkosti za kožo, vendar se v fazi inkubacije MTT inkubirata z medijem namesto z raztopino MTT, da se ustvari kontrola z nespecifično barvo (NSCživo). Kontrolo z nespecifično barvo (NSCživo) je treba zaradi inherentne biološke variabilnosti živih tkiv izvesti sočasno za vsak čas izpostavljenosti za vsako obarvano preskusno kemikalijo (pri vsaki ponovitvi). Dejanska viabilnost tkiva se nato izračuna kot delež viabilnosti tkiva, dobljen z živimi tkivi, izpostavljenimi moteči preskusni kemikaliji in inkubiranimi z raztopino MTT, od katerega se odšteje delež nespecifične barve, dobljen z živimi tkivi, izpostavljenimi moteči preskusni kemikaliji in inkubiranimi z medijem brez MTT, pri čemer se ta preskus izvede sočasno s preskusom, ki se popravlja (% NSCživo).

28.

Pri preskusnih kemikalijah, za katere je ugotovljeno, da neposredno zmanjšujejo MTT (glej odstavek 26) in povzročajo barvno interferenco (glej odstavek 27), je potreben tudi tretji niz kontrol poleg NSMTT in NSCživo, opisanih v prejšnjih odstavkih, ko se izvaja meritev standardne absorbance (OD). To po navadi velja za temno obarvane preskusne kemikalije, ki motijo analizo MTT (npr. modre, vijoličaste, črne), ker njihova lastna barva ovira oceno njihove zmožnosti za neposredno redukcijo MTT, kot je opisana v odstavku 26. Te preskusne kemikalije se lahko vežejo na živa in odmrla tkiva, zato se s kontrolo NSMTT ne le popravi potencialna neposredna redukcija MTT zaradi preskusne kemikalije, ampak tudi barvna interferenca, ki nastane zaradi vezave preskusne kemikalije na odmrla tkiva. To bi lahko vodilo do dvojnega popravka barvne interference, saj se s kontrolo NSCživo že popravi barvna interferenca, ki jo povzroča vezava preskusne kemikalije na živa tkiva. Za preprečitev morebitnega dvojnega popravka barvne interference je treba izvesti še tretjo kontrolo za nespecifično barvo v odmrlih tkivih (NSCodmrlo). Pri tej dodatni kontroli se preskusna kemikalija nanese na vsaj dva ponovljena vzorca odmrlega tkiva za vsak čas izpostavljenosti, nato pa se na teh ponovljenih vzorcih izvede celoten postopek preskušanja, pri čemer pa se v fazi inkubacije MTT inkubirajo z medijem namesto z raztopino MTT. Za vsako preskusno kemikalijo zadostuje ena sama kontrola NSCodmrlo ne glede na število izvedenih neodvisnih preskusov/ponovitev, vendar jo je treba izvesti sočasno s kontrolo NSMTT in po možnosti z isto serijo tkiva. Dejanska viabilnost tkiva se nato izračuna kot delež viabilnosti tkiva, dobljen z živimi tkivi, izpostavljenimi preskusni kemikaliji, od katerega se odštejeta % NSMTT in % NSCživo, prišteje pa se mu delež nespecifične barve, dobljen z odmrlimi tkivi, izpostavljenimi moteči preskusni kemikaliji in inkubiranimi z medijem brez MTT, izračunan glede na negativno kontrolo, izvedeno sočasno s preskusom, ki se popravlja (% NSCodmrlo).

29.

Pomembno je poudariti, da se lahko zaradi nespecifične redukcije MTT in nespecifičnih barvnih interferenc povečajo odčitki izvlečka tkiva nad razponom linearnosti spektrofotometra. Na tej podlagi mora vsak laboratorij najprej določiti razpon linearnosti svojega spektrofotometra s formazanom MTT (št. CAS 57360-69-7) iz komercialnega vira, šele nato lahko začne preskušanje preskusnih kemikalij za regulativne namene. Natančneje, meritev standardne absorbance (OD) z uporabo spektrofotometra je ustrezna za oceno preskusnih kemikalij, ki neposredno zmanjšujejo MTT in povzročajo barvno interferenco, ko so optične gostote izvlečkov tkiv, dobljene s preskusno kemikalijo brez kakršnega koli popravka za neposredno redukcijo MTT in/ali barvno interferenco, znotraj linearnega razpona spektrofotometra ali ko nepopravljeni delež viabilnosti, dobljen s preskusno kemikalijo, to že opredeljuje kot jedko (glej odstavka 35 in 36). Vendar je treba rezultate za preskusne kemikalije, ki povzročajo % NSMTT in/ali % NSCživo > 50 % negativne kontrole, obravnavati previdno.

30.

Za obarvane preskusne kemikalije, ki zaradi premočnega vplivanja na analizo MTT niso združljive z meritvijo standardne absorbance (OD), se lahko uporabi alternativni postopek spektrofotometrije HPLC/UPLC za merjenje formazana MTT (glej odstavek 31) (37). Sistem spektrofotometrije HPLC/UPLC omogoča, da se formazan MTT loči od preskusne kemikalije pred njegovo kvantifikacijo (38). Iz tega razloga kontrole NSCživo ali NSCodmrlo pri uporabi spektrofotometrije HPLC/UPLC niso nikoli potrebne, in to ne glede na to, katera kemikalija se preskuša. Kljub temu je treba kontrole NSMTT uporabiti v primeru suma, da preskusna kemikalija neposredno zmanjšuje MTT ali da njena barva ovira oceno sposobnosti za neposredno redukcijo MTT (kot je opisano v odstavku 26). Kadar se za merjenje formazana MTT uporabi spektrofotometrija HPLC/UPLC, se delež viabilnosti tkiva izračuna kot razmerje med površino vrha formazana MTT, dobljeno z živimi tkivi, izpostavljenimi preskusni kemikaliji, in površino vrha formazana MTT, dobljeno s sočasno negativno kontrolo. Za preskusne kemikalije, ki lahko neposredno zmanjšajo MTT, se dejanska viabilnost tkiva izračuna kot delež viabilnosti tkiva, dobljen z živimi tkivi, izpostavljenimi preskusni kemikaliji, od katerega se odšteje % NSMTT. Nazadnje, opozoriti je treba, da snovi, ki neposredno zmanjšujejo MTT in lahko povzročijo tudi barvno interferenco ter ki ostanejo v tkivih po tretiranju in zmanjšujejo MTT tako močno, da optične gostote (z uporabo standardne meritve optične gostote) ali površine vrha (z uporabo spektrofotometrije UPLC/HPLC) preskušenih izvlečkov tkiv, ki presegajo razpon linearnosti spektrofotometra, ni mogoče oceniti, čeprav naj bi se to zgodilo samo v zelo redkih primerih.

31.

Spektrofotometrija HPLC/UPLC se lahko uporabi tudi z vsemi vrstami preskusnih kemikalij (obarvanimi, neobarvanimi, kemikalijami, ki zmanjšujejo MTT, in tistimi, ki ne zmanjšujejo MTT) za merjenje formazana MTT (38). Zaradi raznovrstnosti sistemov spektrofotometrije HPLC/UPLC je treba ustreznost sistema spektrofotometrije HPLC/UPLC dokazati pred njegovo uporabo za kvantifikacijo formazana MTT iz izvlečkov tkiv, tako da izpolnjuje merila za sprejemljivost za niz standardnih parametrov ustreznosti na podlagi tistih, ki so opisani v smernicah ameriške uprave za hrano in zdravila za industrijo (U.S. Food and Drug Administration) v zvezi z bioanalitično metodo validacije (38) (39). Ti ključni parametri in njihova merila za sprejemljivost so prikazani v Dodatku 4. Ko so izpolnjena merila za sprejemljivost, opredeljena v Dodatku 4, se sistem spektrofotometrije HPLC/UPLC šteje za ustrezen in je pripravljen za merjenje formazana MTT v poskusnih pogojih, opisanih v tej preskusni metodi.

Merila za sprejemljivost

32.

Za vsako preskusno metodo, pri kateri se uporabljajo veljavni modeli rekonstruirane človeške pokožnice, morajo negativna kontrolna tkiva izražati optično gostoto, iz katere je razvidna kakovost tkiv, kot je opisana v preglednici 2 in ki ne sme biti nižja od mej, določenih s preteklimi preskusi. Iz tkiv, tretiranih s pozitivno kontrolo, tj. ledocetno kislino ali 8-normalnim KOH, mora biti razvidna sposobnost tkiv, da se odzovejo na jedko kemikalijo v pogojih preskusnega modela (glej Dodatek 2). Variabilnost med ponovljenimi vzorci tkiv preskusne kemikalije in/ali kontrolnih kemikalij mora biti znotraj sprejemljivih mej za zahteve vsakega ustreznega modela rekonstruirane človeške pokožnice (glej Dodatek 2) (npr. razlika v viabilnosti med dvema ponovljenim vzorcema tkiva ne sme presegati 30 %). Če negativna ali pozitivna kontrola, vključena v ponovitev, ni znotraj sprejemljivih razponov, se ponovitev šteje za neveljavno in jo je treba ponoviti. Če je variabilnost preskusnih kemikalij zunaj opredeljenega razpona, je treba njeno preskušanje ponoviti.

Razlaga rezultatov in napovedni model

33.

Vrednosti optične gostote, pridobljene za vsako preskusno kemikalijo, je treba uporabiti za izračun deleža viabilnosti celic glede na negativno kontrolo, katere viabilnost znaša 100 %. Če se uporabi spektrofotometrija HPLC/UPLC, se delež viabilnosti tkiva izračuna kot delež površine vrha formazana MTT, dobljene z živimi tkivi, izpostavljenimi preskusni kemikaliji, glede na vrh formazana MTT, dobljen s sočasno negativno kontrolo. V spodnjih odstavkih 35 in 36 so za vsak preskusni model, zajet s to preskusno metodo, opredeljene mejne vrednosti deleža viabilnosti celic, ki se uporabljajo za razlikovanje med jedkimi in nejedkimi preskusnimi kemikalijami (ali za razlikovanje med različnimi podkategorijami jedkosti), ki jih je treba uporabiti pri razlagi rezultatov.

34.

Kadar je razvrstitev nedvoumna, bi moralo za preskusno kemikalijo zadoščati eno samo preskušanje, sestavljeno iz vsaj dveh ponovljenih vzorcev tkiv. V primeru mejnih rezultatov, kot so neskladne ponovne meritve, je morda treba preučiti drugo preskušanje in nato še tretje, če rezultati prvih dveh preskušanj niso skladni.

35.

Napovedni model za preskusni model EpiSkin™ za jedkost za kožo (9) (34) (22), povezan s sistemom za razvrščanje GHS ZN/uredbe CLP, je prikazan v preglednici 4.

Preglednica 4

Napovedni model EpiSkin™

Viabilnost, izmerjena po časovnih točkah izpostavljenosti (t = 3, 60 in 240 minut)

Napoved, ki se upošteva

< 35-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti

Jedko:

Neobvezna podkategorija 1A (*1)

≥ 35-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti IN

< 35-odstotna po 60-minutni izpostavljenosti

ALI

≥ 35-odstotna po 60-minutni izpostavljenosti IN

< 35-odstotna po 240-minutni izpostavljenosti

Jedko:

Kombinacija neobveznih podkategorij 1B in 1C

≥ 35-odstotna po 240-minutni izpostavljenosti

Nejedka snov

36.

Napovedni modeli za preskusne modele jedkosti za kožo EpiDerm™ SCT (10) (23) (35), SkinEthic™ RHE (17) (18) (23) (36) in epiCS® (16) (23) (37), povezani s sistemom za razvrščanje GHS ZN/uredbe CLP, so prikazani v preglednici 5.

Preglednica 5

EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE in epiCS®

Viabilnost, izmerjena po časovnih točkah izpostavljenosti (t = 3 in 60 minut)

Napoved, ki se upošteva

1. KORAK za EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE in epiCS®

< 50-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti

Jedka snov

≥ 50-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti IN < 15-odstotna po 60-minutni izpostavljenosti

Jedka snov

≥ 50-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti IN ≥ 15-odstotna po 60-minutni izpostavljenosti

Nejedka snov

2. KORAK za EpiDerm™ SCT – za snovi/zmesi, v 1. koraku opredeljene kot jedke

< 25-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti

Neobvezna podkategorija 1A *

≥ 25-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti

Kombinacija neobveznih podkategorij 1B in 1C

2. KORAK za SkinEthic™ RHE – za snovi/zmesi, v 1. koraku opredeljene kot jedke

< 18-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti

Neobvezna podkategorija 1A *

≥ 18-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti

Kombinacija neobveznih podkategorij 1B in 1C

2. KORAK za epiCS® – za snovi/zmesi, v 1. koraku opredeljene kot jedke

< 15-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti

Neobvezna podkategorija 1A *

≥ 15-odstotna po 3-minutni izpostavljenosti

Kombinacija neobveznih podkategorij 1B in 1C

PODATKI IN POROČANJE

Podatki

37.

Za vsako preskušanje je treba podatke o posameznih ponovljenih vzorcih tkiv (npr. vrednosti optične gostote in izračunani delež viabilnih celic za vsako preskusno kemikalijo, vključno z razvrstitvijo) v poročilu navesti v obliki preglednice, po potrebi vključno s podatki iz ponovljenih poskusov. Poleg tega je treba v poročilu za vsak preskus navesti srednje vrednosti in razpone viabilnosti in KV med ponovljenimi vzorci tkiv. Za vsako preskusno kemikalijo je treba navesti opažene interakcije med reagentom MTT in snovmi, ki neposredno zmanjšujejo MTT, ali obarvanimi preskusnimi kemikalijami.

Poročilo o preskusu

38.

V poročilo o preskusu se vključijo podatki, navedeni v nadaljevanju.

 

Preskusna kemikalija in kontrolne kemikalije:

Snov iz ene sestavine kemijski identifikacijski podatki, kot so ime po nomenklaturi IUPAC ali ime CAS, številka CAS, koda po sistemu SMILES ali identifikatorju InChI, strukturna formula, čistost, kemijska identiteta nečistoč, kot je ustrezno in praktično izvedljivo, itd.

Snov z več sestavinami, UVCB in zmesi: čim obsežnejša opredelitev lastnosti s kemijsko identiteto (glej zgoraj), kvantitativnim pojavljanjem in ustreznimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi sestavin;

fizični videz, topnost v vodi in morebitne dodatne pomembne fizikalno-kemijske lastnosti;

vir, številka serije, če je na voljo;

obdelava preskusnih/kontrolnih kemikalij pred preskušanjem, če je ustrezno (npr. segrevanje, drobljenje);

stabilnost preskusne kemikalije, rok uporabe ali datum za ponovno analizo, če je znan;

pogoji skladiščenja.

 

Uporabljena model in protokol rekonstruirane človeške pokožnice ter njuna utemeljitev (če je ustrezno)

 

Preskusni pogoji:

uporabljeni model rekonstruirane človeške pokožnice (vključno s številko serije);

podatki o umerjanju za merilno napravo (npr. spektrofotometer), valovna dolžina in filtrirana valovna dolžina (če je ustrezno), ki se uporabljajo za kvantifikacijo formazana MTT, ter razpon linearnosti merilne naprave;

opis metode, uporabljene za kvantifikacijo formazana MTT;

opis ustreznosti sistema spektrofotometrije HPLC/UPLC, če je ustrezno;

popolne informacije v podporo specifičnemu uporabljenemu modelu rekonstruirane človeške pokožnice, vključno z njegovo učinkovitostjo. To mora med drugim vključevati:

i)

viabilnost;

ii)

pregradno funkcijo;

iii)

morfologijo;

iv)

obnovljivost in napovedljivost;

v)

kontrole kakovosti modela:

navedba podatkov o modelu iz preteklih preskusov. To mora med drugim vključevati sprejemljivost podatkov o kontroli kakovosti s sklicevanjem na podatke o seriji, pridobljene v preteklosti;

dokaz o usposobljenosti za izvajanje preskusne metode pred redno uporabo s preskušanjem snovi za preverjanje usposobljenosti.

 

Preskusni postopek:

podrobnosti o uporabljenem preskusnem postopku (vključno s postopki spiranja, ki se uporabijo po obdobju izpostavljenosti);

odmerki uporabljene preskusne kemikalije in kontrolnih kemikalij;

trajanje obdobij izpostavljenosti in temperature izpostavljenosti;

navedba kontrol, uporabljenih za snovi, ki neposredno zmanjšajo MTT, in/ali barvilnih preskusnih kemikalij, če je ustrezno;

število ponovljenih vzorcev tkiv, uporabljenih za vsako preskusno kemikalijo in kontrole (pozitivna kontrola, negativna kontrola in NSMTT, NSCživo in NSCodmrlo, če je ustrezno), za vsak čas izpostavljenosti;

opis uporabljenih meril za odločanje/napovednega modela na podlagi uporabljenega modela rekonstruirane človeške pokožnice;

opis morebitnih prilagoditev preskusnega postopka (vključno s postopki spiranja).

 

Merila za sprejemljivost ponovitve in preskusa:

srednje vrednosti pozitivne in negativne kontrole ter razponi sprejemljivosti na podlagi podatkov iz preteklih preskusov;

sprejemljiva variabilnost med ponovljenimi vzorci tkiv za pozitivne in negativne kontrole;

sprejemljiva variabilnost med ponovljenimi vzorci tkiv za preskusno kemikalijo.

 

Rezultati:

preglednice s podatki o posameznih preskusnih kemikalijah in kontrolah za vsako obdobje izpostavljenosti, vsako ponovitev preskusa in vsako ponovljeno meritev, vključno z optično gostoto ali površino vrha formazana MTT, deležem viabilnosti tkiv, povprečnim deležem viabilnosti tkiv, razlikami med ponovljenimi vzorci, standardnimi odkloni in/ali KV, če je ustrezno;

če je ustrezno, rezultati kontrol, uporabljenih za snovi, ki neposredno zmanjšujejo MTT, in/ali barvilne preskusne kemikalije, vključno z optično gostoto ali površino vrha formazana MTT, % NSMTT, % NSCživo, % NSCodmrlo, razlikami med ponovljenimi vzorci tkiv, standardnimi odkloni in/ali KV (če je ustrezno), ter končni pravilni delež viabilnosti tkiv;

rezultati, dobljeni s preskusnimi kemikalijami in kontrolnimi kemikalijami, glede na opredeljena merila za sprejemljivost ponovitve in preskusa;

opis drugih opaženih učinkov;

izpeljana razvrstitev z navedbo uporabljenega napovednega modela/meril za odločitev.

 

Razprava o rezultatih

 

Sklepne ugotovitve

VIRI

(1)

ZN (2013). Globalno usklajeni sistem Združenih narodov za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS). Peta revidirana izdaja, ZN New York in Ženeva. Na voljo na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html

(2)

Poglavje B.4 te priloge, Akutno draženje kože, jedkost za kožo.

(3)

Poglavje B.40 te priloge, Jedkost za kožo in vitro.

(4)

Poglavje B.65 te priloge, Preskusna metoda membranske pregrade in vitro.

(5)

Poglavje B.46 te priloge, Draženje kože in vitro: preskusna metoda rekonstruirane človeške pokožnice.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 203), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(7)

Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P., in Balls, M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23:219–255.

(8)

Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., Walker, A. P., in Worth, A. P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and distribution of the Test Chemicals. Toxicol.In Vitro 12:471–482.

(9)

Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H.-G., in Liebsch, M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for SkinCorrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol.in Vitro 12:483–524.

(10)

Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., Wilkins, S., Wiemann, C., Kaufmann, T., Remmele, M., in Holzhütter, H. G. (2000). The ECVAM Prevalidation Study on the Use of EpiDerm for Skin Corrosivity Testing, ATLA 28: 371-401.

(11)

Balls, M., Blaauboer, B. J., Fentem, J. H., Bruner, L., Combes, R. D., Ekwall, B., Fielder, R. J., Guillouzo, A., Lewis, R. W., Lovell, D. P., Reinhardt, C. A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., in Zucco, F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops, ATLA 23:129–147.

(12)

ICCVAM (Medagencijski koordinacijski odbor ZDA za validacijo alternativnih metod) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. Publikacija NIH št. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, ZDA.

(13)

ICCVAM (Medagencijski koordinacijski odbor ZDA za validacijo alternativnih metod) (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. Publikacija NIH št. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NJ, ZDA.

(14)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the EpiSkin™ Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), izdal ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3. april 1998.

(15)

EC-ECVAM (2000). Statement on the Application of the EpiDerm™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, izdal ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC14), 21. marec 2000.

(16)

Hoffmann, J., Heisler, E., Karpinski, S., Losse, J., Thomas, D., Siefken, W., Ahr, H. J., Vohr, H. W., in Fuchs, H. W. (2005). Epidermal-Skin-Test 1000 (EST-1000)-A New Reconstructed Epidermis for In Vitro Skin Corrosivity Testing. Toxicol.In Vitro 19: 925-929.

(17)

Kandárová, H., Liebsch, M., Spielmann, H., Genschow, E., Schmidt E., Traue, D., Guest, R., Whittingham, A., Warren, N., Gamer, A. O., Remmele, M., Kaufmann, T., Wittmer, E., De Wever, B., in Rosdy, M. (2006). Assessment of the Human Epidermis Model SkinEthic RHE for In Vitro Skin Corrosion Testing of Chemicals According to New OECD TG 431. Toxicol.In Vitro 20: 547-559.

(18)

Tornier, C., Roquet, M., in Fraissinette, A. B. (2010). Adaptation of the Validated SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (RHE) Skin Corrosion Test Method to 0,5 cm2 Tissue Sample. Toxicol. In Vitro 24: 1379-1385.

(19)

EC-ECVAM (2006). Statement on the Application of the SkinEthic™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, izdal ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC25), 17. november 2006.

(20)

EC-ECVAM (2009). ESAC Statement on the Scientific Validity of an In-Vitro Test Method for Skin Corrosivity Testing: the EST-1000, izdal ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 12. junij 2009.

(21)

OECD (2013). Summary Document on the Statistical Performance of Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-categorisation. Environment, Health, and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 190). Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(22)

Alépée, N., Grandidier, M. H., in Cotovio, J. (2014). Sub-Categorisation of Skin Corrosive Chemicals by the EpiSkin™ Reconstructed Human Epidermis Skin Corrosion Test Method According to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicol. In Vitro 28:131–145.

(23)

Desprez, B., Barroso, J., Griesinger, C., Kandárová, H., Alépée, N., in Fuchs, H. (2015). Two Novel Prediction Models Improve Predictions of Skin Corrosive Sub-categories by Test Methods of OECD Test Guideline No 431. Toxicol. In Vitro 29:2055-2080.

(24)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Methods For Skin Corrosion in Relation to OECD TG 431. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 219). Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(25)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (št. 34), Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(26)

Eskes, C., et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62:393-403.

(27)

Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65:55–63.

(28)

Tinois, E., et al. (1994). The Episkin Model: Successful Reconstruction of Human Epidermis In Vitro. V: In Vitro Skin Toxicology. Rougier, A., Goldberg, A. M., in Maibach, H. I. (ur.): 133-140.

(29)

Cannon, C. L., Neal, P. J., Southee, J. A., Kubilus, J., in Klausner M. (1994). New Epidermal Model for Dermal Irritancy Testing. Toxicol.in Vitro 8:889–891.

(30)

Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Bouwstra, J., in Mommaas, M. (2000). Lipid and Ultrastructural Characterization of Reconstructed Skin Models. Inter. J. Pharmaceu. 203:211–225.

(31)

Tinois, E., Tillier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M., in Thivolet, J. (1991). In Vitro and Post - Transplantation Differentiation of Human Keratinocytes Grown on the Human Type IV Collagen Film of a Bilayered Dermal Substitute. Exp. Cell Res. 193:310–319.

(32)

Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., in Rosenberg, M. (1992). The Organotypic Culture of Human Skin Keratinocytes and Fibroblasts to Achieve Form and Function. Cytotech. 9:163-171.

(33)

Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., in Parenteau, N. L. (1994). Development of a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Biotech. Bioeng. 43/8:747–756.

(34)

EpiSkin™ SOP (december 2011). INVITTOX Protocol (št. 118). EpiSkin™ Skin Corrosivity Test.

(35)

EpiDerm™ SOP (februar 2012). Version MK-24-007-0024 Protocol for: In Vitro EpiDerm™ Skin Corrosion Test (EPI-200-SCT), for Use with MatTek Corporation’s Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm.

(36)

SkinEthic™ RHE SOP (januar 2012). INVITTOX Protocol SkinEthic™ Skin Corrosivity Test.

(37)

EpiCS® SOP (januar 2012). Version 4.1 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Epidermal Skin Test 1000 (epiCS® ) CellSystems.

(38)

Alépée, N., Barroso, J., De Smedt, A., De Wever, B., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K. R., Millet, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Templier, M., in McNamee, P. Use of HPLC/UPLC- spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)- based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 29: 741-761.

(39)

US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. (maj 2001). Na voljo na: [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

Dodatek 1

OPREDELITVE POJMOV

Točnost : stopnja ujemanja rezultatov preskusne metode s sprejetimi referenčnimi vrednostmi. Je merilo učinkovitosti preskusne metode in eden od vidikov ustreznosti. Ta izraz in izraz ,skladnost‘ se pogosto uporabljata kot sopomenki in pomenita delež pravilnih rezultatov preskusne metode (25).

Viabilnost celic : parameter za merjenje celotne dejavnosti celične populacije, npr. zmožnosti celičnih mitohondrijskih dehidrogenaz za redukcijo vitalnega barvila MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil modro), ki se glede na izmerjeno končno točko in uporabljeni načrt preskusa ujema s skupnim številom in/ali viabilnostjo živih celic.

Kemikalija : snov ali zmes.

Skladnost : je merilo učinkovitosti za preskusne metode, s katerimi se pridobijo kategorični rezultati, in eden od vidikov ustreznosti. Ta izraz in izraz točnost se včasih uporabljata kot sopomenki in pomenita delež vseh preskušenih kemikalij, ki so pravilno razvrščene kot pozitivne ali negativne. Skladnost je zelo odvisna od razširjenosti pozitivnih rezultatov v vrstah preučevane preskusne kemikalije (25).

ET50 : lahko se oceni z določanjem časa izpostavljenosti, ki je potreben za zmanjšanje viabilnosti celic za 50 % po nanosu določene stalne koncentracije primerjalne kemikalije, glej tudi IC50.

GHS (globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij) : sistem za razvrščanje kemikalij (snovi in zmesi) v skladu s standardiziranimi vrstami in stopnjami fizičnih, zdravstvenih in okoljskih nevarnosti ter za obravnavanje ustreznega označevanja, na primer s piktogrami, opozorilnimi besedami, stavki o nevarnosti, previdnostnimi stavki in varnostnimi listi, da bi se razširile informacije o škodljivih učinkih kemikalij ter s tem zaščitili ljudje (vključno z delodajalci, delavci, prevozniki, potrošniki in reševalci) in okolje (1).

HPLC : tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (High Performance Liquid Chromatography).

IATA : Integrated Approach to Testing and Assessment (celostni pristop k testiranju in ocenjevanju).

IC50 : lahko se oceni z določanjem koncentracije, pri kateri primerjalna kemikalija po določenem času izpostavljenosti zmanjša viabilnost tkiv za 50 % (IC50), glej tudi ET50.

Prevelik odmerek : količina na pokožnico nanesene preskusne kemikalije, ki je večja od količine, potrebne za celotno in enakomerno prekritje površine pokožnice.

Zmes : zmes ali raztopina iz dveh ali več snovi, ki v njej ne reagirajo.

Snov iz ene sestavine : snov, ki jo opredeljuje njena kvantitativna sestava in v kateri je vsaj 80 mas. % glavne sestavine.

MTT : 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid; tiazolil modro tetrazol bromid.

Snov z več sestavinami : snov, ki jo opredeljuje njena kvantitativna sestava in v kateri je več glavnih sestavin s koncentracijo ≥ 10 mas. % in < 80 mas. %. Snov z več sestavinami je rezultat proizvodnega postopka. Razlika med zmesjo in snovjo z več sestavinami je v tem, da je zmes pridobljena z mešanjem dveh ali več snovi brez kemične reakcije. Snov z več sestavinami je rezultat kemične reakcije.

NJ : nejedko.

Kontrola NSCodmrlo : kontrola z nespecifično barvo v odmrlih tkivih.

Kontrola NSCživo : kontrola z nespecifično barvo v živih tkivih.

NSMTT : nespecifična redukcija MTT.

OD : optična gostota.

PC : pozitivna kontrola, ponovljen vzorec, ki vsebuje vse sestavine preskusnega sistema in se tretira s kemikalijo, za katero je znano, da povzroči pozitiven odziv. Za zagotovitev, da se lahko variabilnost odziva pozitivne kontrole oceni v daljšem časovnem obdobju, pa stopnja pozitivnega odziva ne sme biti prevelika.

Standardi izvajanja (SI) : standardi, ki temeljijo na validirani preskusni metodi in so podlaga za oceno primerljivosti predlagane preskusne metode, ki je funkcijsko in mehanistično podobna. Vključujejo: (i) nujne elemente preskusne metode; (ii) najkrajši možni seznam referenčnih kemikalij, izbranih iz skupine kemikalij, ki se uporabljajo za dokazovanje sprejemljive učinkovitosti validirane preskusne metode, ter (iii) podobne stopnje zanesljivosti in točnosti, ki temeljijo na rezultatih validirane preskusne metode, ki jih mora dokazati predlagana preskusna metoda pri ocenjevanju ob uporabi najkrajšega možnega seznama referenčnih kemikalij (25).

Ustreznost : opis razmerja med preskusno metodo in preiskovanim učinkom ter njegovega pomena in uporabnosti za določen namen. Pomeni stopnjo, do katere preskusna metoda pravilno izmeri ali napove preiskovani biološki učinek. Ustreznost upošteva tudi točnost (skladnost) preskusne metode (25).

Zanesljivost : stopnja obnovljivosti preskusne metode v enem ali več laboratorijih v daljšem časovnem obdobju ob uporabi istega protokola. Oceni se z izračunom obnovljivosti v enem ali več laboratorijih (25).

Ponovitev : ponovitev zajema eno ali več preskusnih kemikalij, preskušenih sočasno z negativno kontrolo in pozitivno kontrolo.

Občutljivost : delež vseh pozitivnih/aktivnih kemikalij, ki se s preskusno metodo pravilno razvrstijo. Je merilo točnosti za preskusno metodo, s katero se pridobijo kategorični rezultati, in pomemben dejavnik pri ocenjevanju ustreznosti preskusne metode (25).

Jedkost za kožo in vivo : nastanek nepovračljivih poškodb kože: zlasti vidnega odmiranja prek povrhnjice v usnjico po nanosu preskusne kemikalije za največ 4 ure. Za reakcije jedkosti so značilne razjede, krvavitve, krvave hraste in do konca 14-dnevnega opazovanja izguba barve zaradi beljenja kože, celi predeli alopecije in brazgotine. Dvoumne lezije je morda treba preiskati histopatološko.

Specifičnost : delež vseh negativnih/neaktivnih kemikalij, ki se s preskusno metodo pravilno razvrstijo. Je merilo točnosti za preskusno metodo, s katero se pridobijo kategorični rezultati, in pomemben dejavnik pri ocenjevanju ustreznosti preskusne metode (25).

Snov : kemijski elementi in njihove spojine, ki so v naravnem stanju ali pridobljeni s katerim koli proizvodnim postopkom, vključno z vsemi dodatki, potrebnimi za ohranitev stabilnosti produkta, in kakršnimi koli nečistotami, ki so nastale v uporabljenem postopku, vendar brez kakršnega koli topila, ki ga je mogoče ločiti, ne da bi to vplivalo na stabilnost snovi ali spremenilo njeno sestavo.

Preskusna kemikalija : vsaka snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo.

UPLC : tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti (Ultra-High Performance Liquid Chromatography).

UVCB : snovi z neznano ali spremenljivo sestavo, kompleksni reakcijski produkti ali biološki materiali.

Dodatek 2

GLAVNI ELEMENTI PRESKUSNIH MODELOV REKONSTRUIRANE ČLOVEŠKE POKOŽNICE, VALIDIRANIH ZA PRESKUŠANJE JEDKOSTI ZA KOŽO

Elementi preskusnega modela

EpiSkinTM

EpiDermTM SCT

SkinEthicTM RHE

epiCS®

Površina modela

0,38 cm2

0,63 cm2

0,5 cm2

0,6 cm2

Število ponovljenih vzorcev tkiv

Najmanj 2 za vsak čas izpostavljenosti.

2–3 za vsak čas izpostavljenosti.

Najmanj 2 za vsak čas izpostavljenosti.

Najmanj 2 za vsak čas izpostavljenosti.

Odmerki pri tretiranju in nanos

Tekočine in viskozne snovi: 50 μl ± 3 μl (131,6 μl/cm2).

Trdne snovi: 20 ± 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 μl ± 5 μl raztopine NaCl (9 g/l).

Voskaste/lepljive snovi: 50 ± 2 mg (131,6 mg/cm2) z najlonsko mrežico.

Tekočine: 50 μl (79,4 μl/cm2) z najlonsko mrežico ali brez nje.

Preverjanje združljivosti preskusne kemikalije z najlonsko mrežico pred preskusom.

Poltrdne snovi: 50 μl (79,4 μl/cm2)

Trdne snovi: 25 μl H2O (ali več, če je potrebno) + 25 mg (39,7 mg/cm2).

Voski: ploščat ,kolutast‘ kos premera približno 8 mm, nameščen na vrhu tkiva, namočenega v 15 μl H2O.

Tekočine in viskozne snovi: 40 μl ± 3 μl (80 μl/cm2) z uporabo najlonske mrežice.

Preverjanje združljivosti preskusne kemikalije z najlonsko mrežico pred preskusom.

Trdne snovi: 20 μl ± 2μl H2O + 20 ± 3 mg (40 mg/cm2).

Voskaste/lepljive snovi: 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) z uporabo najlonske mrežice.

Tekočine: 50 μl (83,3 μl/cm2) z uporabo najlonske mrežice.

Preverjanje združljivosti preskusne kemikalije z najlonsko mrežico pred preskusom.

Poltrdne snovi: 50 μl (83,3 μl/cm2)

Trdne snovi: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 μl H2O (ali več, če je potrebno).

Voskaste snovi: ploščat okrogel kos premera približno 8 mm, nameščen na vrhu tkiva, namočenega v 15 μl H2O.

Predhodno preverjanje neposredne redukcije MTT

50 μl (tekočina) ali 20 mg (trdna snov)+ 2 ml MTT

0,3 mg/ml raztopine 180 ± 5 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost

→ če se raztopina obarva modro/vijolično, je treba izvesti prilagojene kontrole s tkivi, odmrlimi v vodi.

50 μl (tekočina) ali 25 mg (trdna snov)+ 1 ml MTT

1 mg/ml raztopine 60 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost

→ če se raztopina obarva modro/vijolično, je treba izvesti prilagojene kontrole s tkivi, odmrlimi zaradi zamrznitve.

40 μl (tekočina) ali 20 mg (trdna snov)+ 1 ml MTT

1 mg/ml raztopine 180 ± 15 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost

→ če se raztopina obarva modro/vijolično, je treba izvesti prilagojene kontrole s tkivi, odmrlimi zaradi zamrznitve.

50 μl (tekočina) ali 25 mg (trdna snov)+ 1 ml MTT

1 mg/ml raztopine 60 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost

→ če se raztopina obarva modro/vijolično, je treba izvesti prilagojene kontrole s tkivi, odmrlimi zaradi zamrznitve.

Predhodno preverjanje barvne interference

10 μl (tekočina) ali 10 mg (trdna snov) + 90 μl H2O se 15 min mešata pri sobni temperaturi

→ če se raztopina obarva, je treba izvesti prilagojene kontrole z živimi tkivi.

50 μl (tekočina) ali 25 mg (trdna snov) + 300 μl H2O 60 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost

→ če se raztopina obarva, je treba izvesti prilagojene kontrole z živimi tkivi.

40 μl (tekočina) ali 20 mg (trdna snov) + 300 μl H2O se 60 min mešata pri sobni temperaturi

→ če je preskusna kemikalija obarvana, je treba izvesti prilagojene kontrole z živimi tkivi.

50 μl (tekočina) ali 25 mg (trdna snov) + 300 μl H2O 60 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost

→ če se raztopina obarva, je treba izvesti prilagojene kontrole z živimi tkivi.

Izpostavljenost in temperatura izpostavljenosti

3 min, 60 min (± 5 min) in 240 min (± 10 min)

v prezračevanem prostoru, sobna temperatura (18–28 oC).

3 min pri sobni temperaturi in 60 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost

3 min pri sobni temperaturi in 60 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost

3 min pri sobni temperaturi in 60 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost

Spiranje

25 ml 1x PBS (2 ml/posamezno spiranje).

20-krat z neprekinjenim rahlim curkom 1x PBS.

20-krat z neprekinjenim rahlim curkom 1x PBS.

20-krat z neprekinjenim rahlim curkom 1x PBS.

Negativna kontrola

50 μl raztopine NaCl (9 g/l)

preskušeno z vsakim časom izpostavljenosti.

50 μl H2O

preskušeno z vsakim časom izpostavljenosti.

40 μl H2O

preskušeno z vsakim časom izpostavljenosti.

50 μl H2O

preskušeno z vsakim časom izpostavljenosti.

Pozitivna kontrola

50 μl ledocetne kisline

preskuša se samo 4 ure.

50 μl 8-normalnega KOH

preskušeno z vsakim časom izpostavljenosti.

40 μl 8-normalnega KOH

preskuša se samo 1 uro.

50 μl 8-normalnega KOH

preskušeno z vsakim časom izpostavljenosti.

Raztopina MTT

2 ml 0,3 mg/ml.

300 μl s koncentracijo 1 mg/ml

300 μl s koncentracijo 1 mg/ml

300 μl s koncentracijo 1 mg/ml

Čas in temperatura inkubacije MTT

180 min (± 15 min) pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost.

180 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost.

180 min (±15 min) pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost.

180 min pri 37 oC, 5 % CO2, 95-odstotna relativna vlažnost.

Ekstrakcijsko topilo

500 μl nakisanega izopropanola

(0,04 N HCl v izopropanolu)

(izolirano tkivo v celoti potopljeno).

2 ml izopropanola

(ekstrakcija iz zgornjega in spodnjega dela vstavka).

1,5 ml izopropanola

(ekstrakcija iz zgornjega in spodnjega dela vstavka).

2 ml izopropanola

(ekstrakcija iz zgornjega in spodnjega dela vstavka).

Čas in temperatura ekstrakcije

Čez noč pri sobni temperaturi, zaščiteno pred svetlobo.

Čez noč brez stresanja pri sobni temperaturi ali 120 min s stresanjem (~ 120 vrt/min) pri sobni temperaturi.

Čez noč brez stresanja pri sobni temperaturi ali 120 min s stresanjem (~ 120 vrt/min) pri sobni temperaturi.

Čez noč brez stresanja pri sobni temperaturi ali 120 min s stresanjem (~ 120 vrt/min) pri sobni temperaturi.

Odčitek optične gostote

570 nm (545–595 nm) brez referenčnega filtra

570 nm (ali 540 nm) brez referenčnega filtra

570 nm (540–600 nm) brez referenčnega filtra

540–570 nm brez referenčnega filtra

Kontrola kakovosti tkiva

18-urno tretiranje s SDS

1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,0 mg/ml.

Tretiranje z 1-odstotnim Tritonom X-100

4,08 ure ≤ ET50 ≤ 8,7 ure.

Tretiranje z 1-odstotnim Tritonom X-100

4,0 ure ≤ ET50 ≤ 10,0 ure.

Tretiranje z 1-odstotnim Tritonom X-100

2,0 ure ≤ ET50 ≤ 7,0 ure.

Merila za sprejemljivost

1.

Srednja optična gostota ponovljenih vzorcev tkiv, tretiranih z negativno kontrolo (NaCl), mora biti ≥ 0,6 in ≤ 1,5 za vsak čas izpostavljenosti.

2.

Srednja viabilnost ponovljenih vzorcev tkiv, 4 ure izpostavljenih pozitivni kontroli (ledocetna kislina), izražena kot delež negativne kontrole, mora biti ≤ 20 %.

3.

V razponu 20–100-odstotne viabilnosti in za optične gostote ≥ 0,3 razlika v viabilnosti med dvema ponovljenima vzorcema tkiv ne sme presegati 30 %.

1.

Srednja optična gostota ponovljenih vzorcev tkiv, tretiranih z negativno kontrolo (H2O), mora biti ≥ 0,8 in ≤ 2,8 za vsak čas izpostavljenosti.

2.

Srednja viabilnost ponovljenih vzorcev tkiv, 1 uro izpostavljenih pozitivni kontroli (8-normalni KOH), izražena kot delež negativne kontrole, mora biti < 15 %.

3.

V razponu 20–100-odstotne viabilnosti mora biti koeficient variacije (KV) med ponovljenimi vzorci tkiv ≤ 30 %.

1.

Srednja optična gostota ponovljenih vzorcev tkiv, tretiranih z negativno kontrolo (H2O), mora biti ≥ 0,8 in ≤ 3,0 za vsak čas izpostavljenosti.

2.

Srednja viabilnost ponovljenih vzorcev tkiv, 1 uro (in 4 ure, če je to ustrezno) izpostavljenih pozitivni kontroli (8-normalni KOH), izražena kot delež negativne kontrole, mora biti < 15 %.

3.

V razponu 20–100-odstotne viabilnosti in za optične gostote ≥ 0,3 razlika v viabilnosti med dvema ponovljenima vzorcema tkiv ne sme presegati 30 %.

1.

Srednja optična gostota ponovljenih vzorcev tkiv, tretiranih z negativno kontrolo (H2O), mora biti ≥ 0,8 in ≤ 2,8 za vsak čas izpostavljenosti.

2.

Srednja viabilnost ponovljenih vzorcev tkiv, 1 uro izpostavljenih pozitivni kontroli (8-normalni KOH), izražena kot delež negativne kontrole, mora biti < 20 %.

3.

V razponu 20–100-odstotne viabilnosti in za optične gostote ≥ 0,3 razlika v viabilnosti med dvema ponovljenima vzorcema tkiv ne sme presegati 30 %.

Dodatek 3

UČINKOVITOST PRESKUSNIH MODELOV PRI RAZVRŠČANJU V PODKATEGORIJE

V spodnji preglednici je prikazana učinkovitost štirih preskusnih modelov, izračunana na podlagi skupine 80 kemikalij, ki so jih preskusili razvijalci štirih preskusov. Izračune je opravil sekretariat OECD, pregledala in potrdila pa jih je podskupina strokovnjakov (21) (23).

Preskusni modeli EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™ in epiCS® omogočajo razvrščanje v podkategorije (tj. 1A, 1B ali 1C ali NJ).

Učinkovitosti, stopnje razvrstitve v previsoko podkategorijo, stopnje razvrstitve v prenizko podkategorijo in točnost (napovedovalna zmogljivost) štirih preskusnih modelov na podlagi skupine 80 kemikalij, ki so bile vse preskušene z dvema ali tremi ponovitvami pri vsakem preskusnem modelu, so navedene v spodnji preglednici.

STATISTIČNI PODATKI O NAPOVEDIH, DOBLJENIH NA PODLAGI CELOTNE SKUPINE KEMIKALIJ

(n = 80 kemikalij, preskušenih v dveh neodvisnih ponovitvah za epiCS® ali treh neodvisnih ponovitvah za EpiDerm™ SCT, EpiSkin™ in SkinEthic™ RHE, tj. 159 (*2) oziroma 240 razvrstitev)

 

EpiSkin™

EpiDermTM

SkinEthic™

epiCS®

Razvrstitve v previsoko podkategorijo:

 

 

 

 

1B in 1C previsoko razvrščeni v podkategorijo 1A

21,50 %

29,0 %

31,2 %

32,8 %

NJ previsoko razvrščena v podkategoriji 1B in 1C

20,7 %

23,4 %

27,0 %

28,4 %

NJ previsoko razvrščena v podkategorijo 1A

0,00 %

2,7 %

0,0 %

0,00 %

Popr. razvrstitev v previsoko podkat.

20,7 %

26,1 %

27,0 %

28,4 %

Skupna stopnja razvrstitve v previsoko podkategorijo (vse kategorije)

17,9 %

23,3 %

24,5 %

25,8 %

Razvrstitve v prenizko podkategorijo:

 

 

 

 

1A prenizko razvrščena v podkategoriji 1B in 1C

16,7 %

16,7 %

16,7 %

12,5 %

1A prenizko razvrščena v podkategorijo NJ

0,00 %

0,00 %

0,00 %

0,00 %

1B in 1C prenizko razvrščeni v podkategorijo NJ

2,2 %

0,00 %

7,5 %

6,6 %

Skupna stopnja razvrstitve v prenizko podkategorijo (vse kategorije)

3,3 %

2,5 %

5,4 %

4,4 %

Pravilne razvrstitve v podkategorije: