(1)

V delu A se doda naslednje poglavje:

„A.25   DISOCIACIJSKE KONSTANTE V VODI (TITRACIJSKA METODA – SPEKTROFOTOMETRIČNA METODA – KONDUKTOMETRIČNA METODA)

UVOD

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD 112 (1981).

Predpogoji

Napotki

Omejitvene izjave

Standardni dokumenti

Ta preskusna metoda temelji na metodah iz virov, navedenih v oddelku „Viri“, in na Predhodnem osnutku smernic za prijavo nove snovi (Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification) Agencije za varstvo okolja ZDA (EPA), 18. avgust 1978.

METODA – UVOD, NAMEN, PODROČJE UPORABE, POMEN, UPORABA IN OMEJITVE PRESKUSA

Pri oceni vpliva snovi na okolje je pomembna njena disociacija v vodi. Ta vpliva na obliko snovi, ki določa njeno vedenje in transport. Lahko vpliva na adsorpcijo kemikalije v tla in sedimente ter absorpcijo v biološke celice.

Opredelitve in enote

Disociacija je reverzibilen razcep v eno ali več kemijskih oblik, ki so lahko ionske. Proces je običajno označen z enačbo:

RX ⇌ R ++ X –

in konstanta ravnotežnih koncentracij, ki vpliva na reakcijo, je

Na primer v posebnem primeru, v katerem je R vodik (snov je kislina), je konstanta:

ali

Referenčne snovi

Naslednjih referenčnih snovi ni treba uporabiti vsakič, ko se preučuje nova snov. Navedene so zlasti zato, da se lahko občasno izvede kalibracija metode ter da se lahko v primeru uporabe druge metode primerjajo rezultati.

Koristno bi bilo imeti snov z več vrednostmi pK, kot je navedeno v Načelu metode v nadaljevanju. Taka snov bi lahko bila:

Načelo preskusne metode

Opisani kemijski proces je na splošno le malo odvisen od temperature v okoljsko ustreznem temperaturnem območju. Za določanje konstante disociacije je potrebno merjenje koncentracij disociiranih in nedisociiranih oblik kemijske snovi. Ustrezna konstanta se lahko določi na podlagi poznavanja stehiometrije disociacijske reakcije, kot je navedeno v Opredelitvah in enotah. V posebnem primeru, opisanem pri tej preskusni metodi, se snov vede kot kislina ali baza, in najprimernejši način za določitev je ugotovitev relativnih koncentracij ioniziranih in neioniziranih oblik snovi ter vrednosti pH raztopine. Razmerje med temi elementi se izračuna po enačbi za pKa, ki je navedena v Opredelitvah in enotah. Nekatere snovi imajo več kot eno konstanto disociacije in razviti je mogoče podobne enačbe. Nekatere tukaj opisane metode so primerne tudi za disociacijo nekislin/baz.

Merila kakovosti

Ponovljivost

Konstanto disociacije bi bilo treba ponoviti (najmanj tri določanja) v območju ± 0,1 logaritemske enote.

OPIS PRESKUSNEGA POSTOPKA

Za določitev vrednosti pKa obstajata dva osnovna pristopa. Eden vključuje titracijo znane količine snovi s standardno kislino ali bazo, kot je ustrezno; drugi pa ugotovitev relativne koncentracije ioniziranih in neioniziranih oblik ter njihove odvisnosti od vrednosti pH.

Priprave

Metode, ki temeljijo na navedenih načelih, se lahko razvrstijo kot titracija, spektrofotometrični in konduktometrični postopek.

Preskusne raztopine

Pri titracijski in konduktometrični metodi je treba kemično snov raztopiti v destilirani vodi. Pri spektrofotometrični metodi in drugih metodah se uporabljajo pufrske raztopine. Koncentracija preskusne snovi ne sme presegati 0,01 M ali polovice koncentracije nasičenosti in pri pripravi raztopin je treba uporabiti najčistejšo obliko snovi, ki je na voljo. Če je snov le težko topna, se lahko raztopi v majhni količini topila, ki se meša z vodo, preden se doda k zgoraj navedenim koncentracijam.

Z uporabo Tyndallovega pramena svetlobe je treba preveriti, ali so v raztopinah prisotne emulzije, zlasti če je bilo za povečanje topnosti uporabljeno sotopilo. Kadar se uporabljajo pufrske raztopine, koncentracija pufra ne bi smela presegati 0,05 M.

Preskusni pogoji

Temperatura

Temperaturo je treba nadzorovati pri vsaj ± 1 °C. Določanje bi bilo treba po možnosti izvesti pri 20 °C.

Če obstaja sum odvisnosti od temperature, je treba določanje izvesti pri vsaj še dveh drugih temperaturah. V tem primeru morajo biti temperaturni intervali 10 °C, nadzor temperature pa pri ± 0,1 °C.

Analize

Metoda se določi glede na naravo snovi, ki se preskuša. Biti mora dovolj občutljiva, da se lahko pri vsaki posamezni koncentraciji preskusne raztopine določijo različne oblike.

Izvedba preskusa

Titracijska metoda

Preskusna raztopina se določi s titracijo s raztopino standardne baze ali kisline, kot je ustrezno, pri čemer se po vsakem dodajanju titranta izmeri vrednost pH. Pred ekvivalentno točko ga je treba posamično dodati vsaj desetkrat. Če je ravnotežje doseženo dokaj hitro, se lahko uporabi zapisovalni potenciometer. Pri tej metodi mora biti natančno znana skupna količina snovi in njena koncentracija. Izvajati je treba ukrepe za preprečitev vdora ogljikovega dioksida. Podrobnosti o postopku, ukrepih in izračunu so navedene v standardnih preskusih, npr. v virih (1) (2) (3) (4).

Spektrofotometrična metoda

Kadar se koeficienti ekstinkcije ioniziranih in neioniziranih oblik snovi znatno razlikujejo, se določi valovna dolžina. Absorpcijski spekter UV/vidne svetlobe se pridobi iz raztopin s konstantno koncentracijo pri vrednosti pH, pri kateri je snov v glavnem neionizirana in popolnoma ionizirana, ter pri več vmesnih vrednostih pH. To je mogoče izvesti bodisi tako, da se v razmeroma veliko količino raztopine snovi v večkomponentnem pufru postopoma dodaja koncentrirana kislina (baza), sprva pri visoki (nizki) vrednosti pH (ref. 5), bodisi tako, da se v konstantne količine različnih pufrskih raztopin, ki obsegajo želeni razpon vrednosti pH, dodajajo enake količine osnovne raztopine snovi v npr. vodi, metanolu. Zadostno število vrednosti za pKa se iz vrednosti pH in absorbance pri izbrani valovni dolžini izračuna tako, da se uporabijo podatki za vsaj 5 vrednosti pH, pri katerih je snov ionizirana v razponu od vsaj 10 % do manj kot 90 %. Nadaljnje podrobnosti o preskusu in metodi izračuna so na voljo v viru (1).

Konduktometrična metoda

Z uporabo celice z majhno, znano celično konstanto se izmeri prevodnost približno 0,1 M raztopine snovi v prevodni vodi. Izmerijo se tudi prevodnosti določenega števila natančno narejenih razredčitev te raztopine. Koncentracija se vsakič prepolovi, serije pa bi morale obsegati vsaj en red velikosti v koncentraciji. Omejena prevodnost pri neskončni razredčitvi se ugotovi z izvedbo podobnega poskusa z natrijevo soljo in ekstrapolacijo. Nato se lahko z Onsagerjevo enačbo iz prevodnosti vsake raztopine izračuna stopnja disociacije, iz česar se lahko z Ostwaldovim zakonom razredčenja izračuna konstanta disociacije po enačbi K = α2C / (1 – α), pri čemer je C koncentracija v molih na liter, α pa disociirana frakcija. Izvajati je treba ukrepe za preprečitev vdora CO2. Nadaljnje podrobnosti o preskusu in metodi izračuna so na voljo v standardnih besedilih ter virih (1) (6) (7).

PODATKI IN POROČANJE

Obdelava rezultatov

Titracijska metoda

Vrednost pKa se izračuna za 10 merjenih točk na titracijski krivulji. Izračunata se odklon srednje vrednosti in standardni odklon takih vrednosti pKa. Poleg predstavitve v preglednicah bi bilo treba vključiti grafični prikaz vrednosti pH glede na volumen standardne baze ali kisline.

Spektrofotometrične metode

Absorbanco in vrednost pH je treba za vsak spekter predstaviti v preglednicah. Vsaj pet vrednosti za vrednost pKa se izračuna iz podatkovnih točk znotraj spektra, izračunata se tudi srednja vrednost in standardni odklon teh rezultatov.

Konduktometrična metoda

Za vsako koncentracijo kisline in vsako koncentracijo mešanice enega ekvivalenta kisline in 0,98 ekvivalenta natrijevega hidroksida brez karbonatov, se izračuna ekvivalent prevodnosti Λ. Kislina je v presežku, da se prepreči presežni OH– zaradi hidrolize. Razmerje 1 / Λ je grafično prikazano glede na √C in Λo soli se lahko ugotovi z ekstrapolacijo na nično koncentracijo.

Vrednost Λo kisline se lahko izračuna z uporabo vrednosti za H+ in Na+ iz virov. Vrednost pKa za vsako koncentracijo se lahko izračuna po enačbi α = Λi / Λo in Ka = α2C / (1 – α). Za Ka se lahko dobijo boljše vrednosti s popravki za mobilnost in aktivnost. Izračunati bi bilo treba srednjo vrednost in standardni odklon vrednosti pKa.

Poročilo o preskusu

Vse neobdelane podatke in izračunane vrednosti pKa je treba predložiti skupaj z metodo izračuna (po možnosti v obliki preglednic, kot je predlagano v ref. 1) ter opisanimi statističnimi parametri. Pri titracijski metodi je treba navesti podrobnosti o standardizaciji titrantov.

Pri spektrofotometrični metodi je treba navesti vse spektre. Pri konduktometrični metodi je treba poročati o podrobnostih določanja konstante celice. Navesti bi bilo treba informacije o uporabljeni tehniki, analitski metodi in naravi vseh uporabljenih pufrov.

Poročati bi bilo treba o preskusnih temperaturah.

VIRI

(2)

Poglavje B.5 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.5   AKUTNO DRAžENJE OČI/JEDKOST ZA OČI

UVOD

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 405 (2012). Smernice OECD za preskušanje kemikalij se redno preverjajo, s čimer se zagotovi, da izražajo najboljša razpoložljiva znanstvena spoznanja. Pri prejšnjih preverjanjih te smernice za preskušanje je bila posebna pozornost namenjena možnim izboljšavam z ocenjevanjem vseh obstoječih podatkov o preskusni kemikaliji, da bi se izognili nepotrebnim testiranjem na živalih v laboratoriju in tako obravnavali pomisleke glede dobrobiti živali. V smernico TG 405 (sprejeto leta 1981 ter posodobljeno v letih 1987, 2002 in 2012) je vključeno priporočilo, da je treba pred začetkom izvajanja opisanega preskusa akutnega draženja oči/jedkosti za oči in vivo izvesti analizo, ki temelji na zanesljivosti dokazov (1), na podlagi ustreznih obstoječih podatkov. Kadar ni na voljo dovolj podatkov, je priporočljivo, da se pridobijo z uporabo zaporednega preskušanja (2) (3). Strategija preskušanja vključuje izvajanje validiranih in sprejetih preskusov in vitro ter se zagotovi kot dodatek k tej preskusni metodi. Celovita strategija preskušanja je za namen Uredbe (ES) št. 1907/2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) (2) vključena tudi v ustrezne smernice agencije ECHA (21). Testiranja na živalih je treba izvesti šele, če se po proučitvi razpoložljivih alternativnih metod ugotovi, da so nujni in da je uporaba navedenih metod primerna. Ob pripravi te posodobljene preskusne metode se pojavljajo primeri, ko je njena uporaba še vedno potrebna ali se zahteva v skladu z nekaterimi regulativnimi okviri.

Zadnja posodobitev je bila v glavnem usmerjena na uporabo analgetikov in anestetikov ter ni vplivala na osnovni koncept in strukturo smernice za preskušanje. ICCVAM (3) in neodvisna mednarodna znanstvena strokovna skupina za ocenjevanje sta pregledala uporabnost in omejitve redne uporabe topičnih anestetikov, sistemskih analgetikov in humanih končnih točk med oceno varnosti draženja oči in vivo (12). V pregledu sta ugotovila, da bi se z uporabo topičnih anestetikov in sistemskih analgetikov lahko izognili večini bolečine in trpljenja ali vsej bolečini in trpljenju, ne da bi to vplivalo na rezultate poskusa, ter priporočila, da bi bilo treba te snovi vedno uporabljati. Pri tej preskusni metodi se upošteva ta pregled. Med preskušanjem akutnega draženja oči in jedkosti za oči in vivo bi bilo treba redno uporabljati topične anestetike, sistemske analgetike in humane končne točke. Izjeme glede njihove uporabe bi bilo treba utemeljiti. Z izboljšanji, opisanimi v tej metodi, se bosta v večini primerov preskušanja, pri katerih je še vedno potrebno in vivo preskušanje varnosti za oči, bolečina in trpljenje živali znatno zmanjšala ali se bo bolečini in trpljenju živali mogoče izogniti.

Uravnoteženo vnaprejšnje lajšanje bolečin bi moralo vključevati (i) redno dajanje topičnih anestetikov (npr. proparakain ali tetrakain) in sistemskih analgetikov (npr. buprenorfin) pred preskušanjem, (ii) redni program dajanja sistemskih analgetikov po tretiranju (npr. buprenorfin in meloksikam), (iii) načrt opazovanja, spremljanja in evidentiranja živali za odkrivanje kliničnih znakov bolečine in/ali trpljenja ter (iv) načrt opazovanja, spremljanja in evidentiranja narave, resnosti in napredovanja poškodb oči. Nadaljnje podrobnosti so navedene v posodobljenih postopkih v nadaljevanju. Po dajanju preskusne kemikalije se ne smejo uporabiti nobeni dodatni topični anestetiki ali analgetiki, da ne bi prihajalo do motenja študije. Protivnetni analgetiki (npr. meloksikam) se ne smejo nanašati topično, sistemsko uporabljeni odmerki pa ne smejo vplivati na učinke na oči.

Opredelitve so navedene v dodatku k preskusni metodi.

ZAČETNI PREUDARKI

Za znanstveno zanesljivost in dobrobit živali je koristno, da se preskusi in vivo začnejo izvajati šele, ko se z analizo, ki temelji na zanesljivosti dokazov, ocenijo vsi razpoložljivi podatki, ki se nanašajo na potencial kemikalije za draženje oči/jedkost za oči. V take podatke so vključeni dokazi iz obstoječih študij na ljudeh in/ali laboratorijskih živalih, dokazi o draženju oči/jedkosti za oči ene ali več strukturno sorodnih snovi ali mešanic takih snovi, podatki, ki kažejo visoko kislost ali alkalnost kemikalije (4) (5), ter rezultati iz potrjenih in sprejetih preskusov jedkosti za kožo in jedkosti za oči/draženje oči in vitro ali ex vivo (6) (13) (14) (15) (16) (17). Študije se lahko izvedejo pred analizo, ki temelji na zanesljivosti dokazov, ali kot posledica take analize.

S tako analizo se lahko pri nekaterih kemikalijah nakaže potreba po in vivo študijah potenciala kemikalije za jedkost za oči/draženje oči. V vseh takih primerih je treba pred proučitvijo uporabe očesne študije in vivo po možnosti najprej izvesti študijo in vitro in/ali in vivo učinkov jedkosti za kožo, ki jih ima kemikalija, ter jih oceniti v skladu s strategijo zaporednega preskušanja s preskusno metodo B.4 (7) ali celovito strategijo preskušanja, opisano v smernicah agencije ECHA (21).

Strategija zaporednega preskušanja, v katero so vključeni potrjeni preskusi in vitro ali ex vivo jedkosti za oči/draženja oči, je k tej preskusni metodi vključena kot dodatek, za namen uredbe REACH pa v smernice agencije ECHA (21). Priporočljivo je, da se ta strategija preskušanja upošteva pred izvedbo preskusa in vivo. Za nove kemikalije je priporočljivo, da se znanstveno zanesljivi podatki o jedkosti/draženju kemikalije pridobijo s postopnim načinom preskušanja. Za obstoječe kemikalije, za katere ni na voljo dovolj podatkov o jedkosti za kožo in oči/draženju kože in oči, se lahko s to strategijo zapolnijo vrzeli v podatkih. Uporabo drugačne strategije ali postopka preskušanja ali odločitev o tem, da se ne bo uporabil postopen način preskušanja, je treba utemeljiti.

NAČELO PRESKUSA IN VIVO

Po predhodnem tretiranju s sistemskimi analgetiki in nanosu ustreznih topičnih anestetikov se kemikalija, ki jo je treba preskusiti, v enkratnem odmerku nanese na eno oko poskusne živali; netretirano oko se uporablja za kontrolo. Stopnja dražilnosti/jedkosti za oči se oceni s seštevanjem lezij na očesni veznici, roženici in šarenici, v točno določenih intervalih. Drugi učinki na oko in škodljivi sistemski učinki se prav tako opišejo, da se vsi učinki celovito ocenijo. Študija mora trajati dovolj dolgo, da se oceni popravljivost ali nepopravljivost učinkov.

Živali, ki kažejo znake hudega trpljenja in/ali bolečine v kateri koli fazi poskusa ali imajo lezije, skladne s humanimi končnimi točkami, opisanimi v tej preskusni metodi (glej odstavek 26), je treba humano usmrtiti in kemikalijo skladno s tem oceniti. Merila za sprejem odločitve o humani usmrtitvi umirajočih in hudo trpečih živali so navedena v dokumentu s smernicami OECD (8).

PRIPRAVA ZA PRESKUS IN VIVO

Izbira vrst

Kunec beličnik je najbolj zaželena laboratorijska žival in uporabljajo se zdrave mlade odrasle živali. Uporabo drugih sevov ali vrst je treba obrazložiti.

Priprava živali

Obe očesi vsake poskusne živali, začasno izbrane za poskus, je treba pregledati v 24 urah pred začetkom poskusa. Živali, pri katerih so vidni draženje oči, očesne napake ali že prej nastala poškodba roženice, se ne smejo uporabiti.

Pogoji nastanitve in hranjenja

Živali morajo biti nastanjene posamično. Temperatura v prostoru s poskusnimi živalmi mora biti za kunce 20 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, si je treba prizadevati za 50–60-odstotno vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Izogibati se je treba preveč intenzivni svetlobi. Za hranjenje se lahko uporabijo običajne predpisane laboratorijske vrste hrane z neomejeno količino pitne vode.

PRESKUSNI POSTOPEK

Uporaba topičnih anestetikov in sistemskih analgetikov

V postopkih ocene varnosti za oči so priporočljivi naslednji postopki, da se bolečini in trpljenju izogne ali se ju zmanjša. Nadomestijo jih lahko alternativni postopki, ki so bili določeni kot dobra ali boljša možnost za izogibanje bolečini in trpljenju ali njuno lajšanje.

Nanašanje preskusne kemikalije

Preskusno kemikalijo je treba dati v mešiček veznice enega očesa vsake živali, potem ko se spodnja veka nežno potegne stran od zrkla. Veke se nato nežno držijo skupaj približno eno sekundo, da se prepreči izguba materiala. Drugo oko, ki ni tretirano, se uporablja za kontrolo.

Izpiranje

Oči poskusnih živali se ne smejo umivati najmanj 24 ur po vkapanju preskusne kemikalije, z izjemo trdnih snovi (glej odstavek 18) in v primeru takojšnjih jedkih ali dražilnih učinkov. Po 24 urah se lahko oko izpere, če je to ustrezno.

Uporaba satelitske skupine živali za raziskovanje vpliva izpiranja ni priporočena, razen če je znanstveno upravičena. Če je satelitska skupina potrebna, je treba uporabiti dva kunca. Pogoje izpiranja je treba skrbno dokumentirati, npr. čas izpiranja, sestava in temperatura raztopine za izpiranje, trajanje, volumen in hitrost nanašanja.

Velikost odmerka

(1)   Preskušanje tekočih snovi

Za preskušanje tekočih snovi se uporablja odmerek v višini 0,1 ml. Razpršila se ne smejo uporabljati za vkapanje kemikalije neposredno v oko. Tekoče razpršilo je treba iztisniti in zbrati v posodo pred vkapanjem odmerka v višini 0,1 ml v oko.

(2)   Preskušanje trdnih snovi

Pri preskušanju trdnih snovi, kašnatih zmesi in zdrobljenih kemikalij, mora imeti uporabljena količina volumen 0,1 ml ali težo, ki ne presega 100 mg. Preskusno kemikalijo je treba zdrobiti v fin prah. Volumen trdnega materiala je treba izmeriti po rahlem zgoščevanju, npr. z rahlim potrkavanjem na merilno posodo. Če fiziološki mehanizmi trdne preskusne kemikalije niso odstranili iz očesa poskusne živali na prvi časovni točki opazovanja 1 uro po nanosu, se lahko oko izplakne s fiziološko raztopino ali destilirano vodo.

(3)   Preskušanje razpršil

Priporočeno je, da se vsa utekočinjena razpršila in razpršila pod pritiskom zberejo v posodo pred vkapanjem v oko. Izjema so kemikalije v posodah za razpršila pod pritiskom, ki jih ni mogoče zbrati zaradi izhlapevanja. V takih primerih je treba držati oko odprto in preskusno kemikalijo nanesti v oko z enostavnim vbrizgom, ki traja približno eno sekundo, z razdalje 10 cm neposredno pred očesom. Ta razdalja se lahko spreminja glede na pritisk razpršila in njegovo vsebino. Paziti je treba, da se oko ne poškoduje zaradi pritiska razpršila. V ustreznih primerih bo morda treba oceniti potencial za nastanek „mehanske“ poškodbe očesa zaradi moči razpršila.

Oceno odmerka iz razpršila je mogoče dobiti z naslednjim poskusom: kemikalija se razprši na tehtalni papir skozi odprtino velikosti kunčjega očesa, ki je nameščena neposredno pred papir. Povečanje teže papirja se uporabi za določitev približne količine, razpršene v oko. Za hlapne kemikalije je odmerek mogoče oceniti s tehtanjem v zbirni posodi pred odstranitvijo preskusne kemikalije ali po njej.

Začetni preskus (in vivo preskus draženja oči/jedkosti za oči z uporabo ene živali)

Zelo priporočljivo je, da se poskus in vivo izvede najprej na eni živali (glej dodatek k tej preskusni metodi: Strategija zaporednega preskušanja draženja oči in jedkosti za oči). Na podlagi opazovanj je mogoče določiti resnost in popravljivost učinkov pred izvedbo potrditvenega poskusa na drugi živali.

Če rezultati tega poskusa pokažejo, da je kemikalija z uporabo opisanega postopka jedka ali zelo dražilna za oko, se nadaljnji poskusi o dražilnosti za oko ne izvedejo.

Potrditveni preskus (in vivo preskus draženja oči z dodatnimi živalmi)

Če se jedek ali zelo dražilen učinek ne opazi v začetnem poskusu, je treba dražilni ali negativni odziv potrditi z uporabo do dveh dodatnih živali. Če se pri začetnem poskusu opazi dražilni učinek, je priporočljivo, da se potrditveni poskus izvede zaporedoma – najprej na eni in šele nato na drugi živali, namesto da se dve dodatni živali izpostavita hkrati. Če se pri drugi živali pojavijo jedki ali zelo dražilni učinki, se poskus ne nadaljuje. Če rezultati pri drugi živali zadostujejo, da se določi razvrstitev glede na nevarnosti, se ne sme izvesti noben poskus več.

Obdobje opazovanja

Obdobje opazovanja mora biti dovolj dolgo, da se lahko v celoti ovrednoti obseg in popravljivost opaženih učinkov. Preskus je treba zaključiti, kadar koli žival pokaže znake hude bolečine ali trpljenja (8). Za določitev popravljivosti učinkov je običajno treba živali opazovati 21 dni po nanašanju preskusne kemikalije. Če se popravljivost opazi pred 21. dnem, je treba poskus takrat zaključiti.

Klinična opazovanja in uvrstitev očesnih reakcij v stopnje

Podrobno je treba oceniti, ali so eno uro po nanosu preskusne kemikalije na očeh prisotne ali odsotne očesne lezije, tako ocenjevanje pa je treba nato ponoviti vsaj enkrat dnevno. Živali je treba prve 3 dni ocenjevati večkrat na dan zaradi pravočasnega sprejetja odločitve o zaključku preskusa. Poskusne živali je treba v celotnem trajanju študije vsaj dvakrat dnevno – ali po potrebi pogosteje – redno ocenjevati, da se odkrijejo klinični znaki bolečine in/ali trpljenja (npr. ponavljajoče se praskanje ali drgnjenje očesa, čezmerno mežikanje, čezmerno solzenje) (9) (10) (11), pri čemer mora med opazovanji preteči vsaj 6 ur. To je potrebno, (i) da se ustrezno oceni, ali živali kažejo znake bolečine in trpljenja, da se sprejmejo informirane odločitve o potrebi po povečanju odmerka analgetikov, ter (ii) da se oceni, ali živali kažejo znake določenih humanih končnih točk, da se sprejmejo informirane odločitve o tem, ali jih je ustrezno humano evtanazirati, in da se zagotovi pravočasno sprejetje takih odločitev. Redno je treba uporabljati obarvanost s fluoresceinom in biomikroskop, kadar je to ustrezno (npr. pri ocenjevanju globine poškodbe v primeru ulceracije roženice), kot pripomoček pri odkrivanju in merjenju očesne poškodbe ter pri oceni, ali so bila izpolnjena določena merila za humano evtanazijo. Za referenčne namene in za trajno evidenco obsega očesnih poškodb se lahko zbirajo digitalne fotografije opaženih lezij. Testiranja na živalih se lahko izvajajo le toliko časa, kolikor je potrebno za pridobitev dokončnih informacij. Živali, ki kažejo hudo bolečino ali trpljenje, je treba nemudoma humano usmrtiti, kemikalijo pa oceniti skladno s tem.

Humano je treba usmrtiti živali z naslednjimi očesnimi lezijami, nastalimi po vkapanju kemikalije (za opis stopenj lezije glej preglednico 1): perforacija roženice ali značilna ulceracija roženice vključno s stafilomom, kri v sprednjem delu očesa, stopnja 4 motnjave roženice, odsotnost svetlobnega refleksa (odziv šarenice stopnje 2), ki traja 72 ur, ulceracija veznične vrečke, nekroza veznične membrane ali žmurke ali odstopanje. Te lezije so namreč na splošno nepopravljive. Poleg tega se priporoča, da se naslednje očesne lezije uporabijo kot humane končne točke za zaključek študij pred koncem načrtovanega 21-dnevnega obdobja opazovanja. Šteje se, da take lezije napovedujejo resne poškodbe, ki jih povzroči draženje ali jedkost, in poškodbe, za katere se pričakuje, da do konca 21-dnevnega obdobja opazovanja ne bodo popolnoma popravljive: velika globina poškodbe (npr. ulceracija roženice, ki se širi prek zgornjih plasti strome), uničenje limbusa > 50 % (kar je razvidno iz bledice veznega tkiva) in resna okužba očesa (gnojni izcedek). Ali kombinacija: vaskularizacije površine roženice (npr. panus), površine obarvanosti s fluoresceinom, ki se na podlagi dnevne ocene sčasoma ne zmanjšuje, in/ali odsotnosti reepitelizacije 5 dni po nanosu preskusne kemikalije se prav tako lahko štejejo kot morebitno uporabna merila, ki vplivajo na klinično odločitev o prezgodnjem zaključku študije. Vendar pa take ugotovitve posamično ne zadostujejo za utemeljitev predčasnega zaključka študije. Ko se ugotovijo resni učinki na oči, se je treba z lečečim veterinarjem ali veterinarjem, usposobljenim za laboratorijske živali, ali osebjem, usposobljenim za odkrivanje kliničnih lezij, posvetovati za klinični pregled, da se oceni, ali bi bilo treba zaradi kombinacije teh učinkov študijo predčasno zaključiti. Pridobiti je treba stopnje očesne reakcije (veznice, roženice in šarenice) ter jih zabeležiti po 1 uri, 24, 48 in 72 urah po nanosu preskusne kemikalije (preglednica 1). Živali, pri katerih se očesne lezije ne pojavijo, se ne smejo usmrtiti prej kot 3 dni po vkapanju. Živali z zmernimi očesnimi lezijami je treba opazovati, dokler lezije ne izginejo ali 21 dni, tj. do takrat, ko se raziskava zaključi. Izvesti in zabeležiti je treba opazovanja vsaj po 1 uri, 24 urah, 48 urah, 72 urah, 7 dneh, 14 dneh in 21 dneh, da se ugotovi status lezij in njihova popravljivost oziroma nepopravljivost. Opazovanja morajo biti po potrebi pogostejša, da se ugotovi, ali je treba poskusno žival iz humanih razlogov evtanazirati ali izključiti iz študije zaradi negativnih rezultatov.

Stopnje očesne reakcije (preglednica 1) je treba zabeležiti pri vsakem pregledu. Poročati je treba tudi o vseh drugih očesnih lezijah (npr. panus, obarvanost, spremembe v sprednjem delu očesa) ali škodljivih sistemskih učinkih.

Za lažji pregled reakcij se lahko uporablja binokularna lupa, ročni oftalmoskop, biomikroskop ali drug ustrezen pripomoček. Potem ko se po 24 urah zabeležijo rezultati opazovanja, se lahko oči nadalje pregledajo s fluoresceinom.

Določanje stopnje očesnih odzivov je neizogibno subjektivno. Da bi izboljšali usklajenost pri določanju stopnje očesnega odziva in pomagali preskuševalnim laboratorijem ter vsem sodelujočim pri oblikovanju in razlagi rezultatov opazovanj, mora biti osebje, ki izvaja ta opazovanja, ustrezno usposobljeno za uporabo sistema določanja stopnje.

PODATKI IN POROČANJE

Vrednotenje rezultatov

Rezultate draženja oči je treba oceniti v povezavi z vrsto in resnostjo lezij ter njihovo popravljivostjo oziroma nepopravljivostjo. Posamezni rezultati ne pomenijo absolutnega standarda za dražilne lastnosti kemikalije, ker se ocenjujejo tudi drugi učinki preskusne kemikalije. Namesto tega je treba posamezne rezultate obravnavati kot referenčne vrednosti, ki so pomembni le, če so potrjeni s popolnim opisom in vrednotenjem vseh opažanj.

Poročilo o preskusu

V poročilo o preskusu se vključijo naslednji podatki:

Razlaga rezultatov

Sklepanje o veljavnosti rezultatov študij draženja oči na laboratorijskih živalih za ljudi je veljavno le v omejeni meri. V mnogih primerih je kunec beličnik bolj občutljiv na snovi, ki dražijo oči ali so jedke za oči, kot ljudje.

Pri razlagi podatkov je treba paziti, da se izključi draženje, ki je posledica sekundarne infekcije.

VIRI

Preglednica 1

Razvrščanje očesnih lezij v stopnje

DODATEK K PRESKUSNI METODI B.5  (4)

ZAPOREDNO TESTIRANJE DRAŽENJA OČI IN JEDKOSTI ZA OČI

Splošni preudarki

Za znanstveno zanesljivost in dobrobit živali se je treba izogniti nepotrebni uporabi živali in zmanjšati število poskusov, ki bi najverjetneje povzročili resne odzive pri živalih. Vse informacije o kemikalijah, ki se nanašajo na njihovo morebitno dražilnost/jedkost za oči, je treba oceniti pred odločitvijo o preskušanju in vivo. Morda že obstaja dovolj dokazov za razvrstitev preskusne kemikalije glede na njen potencial jedkosti za oči ali draženja oči, ne da bi bilo treba izvesti poskuse na laboratorijskih živalih. Analiza, ki temelji na zanesljivosti dokazov, in zaporedno testiranje bosta zato zmanjšala potrebo po preskušanju in vivo, zlasti če bi kemikalija verjetno povzročila resne reakcije.

Priporočljivo je, da se z analizo, ki temelji na zanesljivosti dokazov, ocenijo obstoječe informacije v zvezi s tem, ali kemikalija draži oči in je jedka za oči, ter za odločitev, ali je treba poleg študij in vivo na očeh izvesti dodatne študije, ki bi pomagale opredeliti takšen potencial. Kadar so potrebne nadaljnje študije, je priporočljiva uporaba zaporednega preskušanja, da se pridobijo ustrezni eksperimentalni podatki. Pri snoveh, ki nimajo zgodovine preskušanja, je treba za pridobitev podatkov, potrebnih za oceno njihovega potenciala jedkosti za oči/draženja oči, uporabiti strategijo zaporednega preskušanja. Prvotna strategija preskušanja, opisana v tem dodatku, je bila razvita na delavnici OECD (1). Kasneje je bila potrjena in razširjena v Usklajen celostni sistem razvrstitve kemijskih snovi glede na nevarnosti za zdravje ljudi in vplive na okolje, kot sta ga novembra 1998 na 28. skupnem zasedanju potrdila Odbor za kemikalije in Delovna skupine za kemikalije (2) ter kot ga je leta 2011 posodobila skupina strokovnjakov OECD.

Čeprav to testiranje ni sestavni del preskusne metode B.5, predstavlja priporočeni pristop za določitev lastnosti, ki se nanašajo na draženje oči/jedkost za oči. Ta pristop je hkrati dobra praksa in etično merilo uspešnosti za preskušanje draženja oči/jedkosti za oči in vivo. Preskusna metoda vsebuje smernice za izvajanje preskusa in vivo in povzema dejavnike, ki jih je treba obravnavati pred začetkom takega preskusa. Z zaporednim testiranjem se zagotavlja, da se s pristopom, ki temelji na zanesljivosti dokazov, ocenijo obstoječi podatki o lastnostih kemikalij, ki dražijo oči/so jedke za oči, in da se s stopenjskim pristopom pridobijo ustrezni podatki o kemikalijah, za katere so potrebne dodatne študije ali študije niso bile izvedene. V testiranje je najprej vključena izvedba potrjenih in sprejetih preskusov in vitro ali ex vivo, nato pa študije v okviru preskusne metode B.4 v posebnih okoliščinah (3) (4).

Opis postopnega preskušanja

Preden se začnejo izvajati preskusi kot deli zaporednega testiranja (diagram), je treba oceniti vse razpoložljive podatke, da se določi potreba po preskušanju in vivo na očeh. Čeprav se pomembne informacije lahko pridobijo iz ocene posameznih parametrov (npr. najvišje vrednosti pH), je treba oceniti vse obstoječe podatke. Pri sprejemanju odločitve, ki temelji na zanesljivosti dokazov, je treba oceniti vse ustrezne podatke o učinkih zadevne kemikalije ali strukturno podobnih kemikalij in navesti obrazložitev za tako odločitev. Glavni poudarek mora biti namenjen obstoječim podatkom o vplivu kemikalije na ljudi in živali, čemur sledijo rezultati preskušanja in vitro ali ex vivo. Študijam in vivo jedkih kemikalij je treba izogibati, kadar koli je to mogoče. Dejavniki, ki se upoštevajo v strategiji preskušanja, so med drugim:

STRATEGIJA PRESKUŠANJA IN OCENJEVANJA DRAŽENJA OČI/JEDKOSTI ZA OČI

VIRI

(3)

Poglavje B.10 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.10    In vitro preskus kromosomskih aberacij pri sesalcih

UVOD

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD 473 (2016). Je del sklopa preskusnih metod o genetski toksikologiji. Pripravljen je dokument OECD, ki zagotavlja jedrnate informacije o preskušanju v zvezi z genetsko tokskikologijo in pregled nedavnih sprememb teh preskusnih smernic (1).

Namen in vitro preskusa kromosomskih aberacij je opredeliti kemikalije, ki povzročajo strukturne kromosomske aberacije v kultiviranih celicah sesalcev (2) (3) (4). Ločimo dva tipa strukturnih aberacij, in sicer: kromosomski in kromatidni tip. Pri preskusih in vitro bi se lahko pojavila poliploidija (vključno z endoreduplikacijo). Čeprav lahko anevgene snovi povzročijo poliploidijo, ta sama ne pomeni anevgenega potenciala in lahko samo nakazuje motnjo celičnega cikla ali citotoksičnost (5). Ta preskus ni zasnovan za merjenje anevploidije. Za odkrivanje anevploidije je priporočljiv preskus mikronukleusov in vitro (6).

Pri in vitro preskusu kromosomskih aberacij se lahko uporabijo kulture trajnih celičnih linij ali primarne celične kulture človeškega ali glodalskega izvora. Uporabljene celice je treba izbrati glede na zmožnost rasti v kulturi, stabilnost kariotipa (vključno s kromosomskim številom) in pogostnost spontanih kromosomskih aberacij (7). Na podlagi razpoložljivih podatkov za zdaj ni mogoče navesti trdnih priporočil, vendar je iz njih razvidno, da je treba pri ocenjevanju kemične nevarnosti upoštevati status beljakovine p53, gensko stabilnost (stabilnost kariotipa), sposobnost popravljanja DNK in izvor (glodalski/človeški) celic, izbranih za preskušanje. Uporabnikom te preskusne metode se torej priporoča, naj upoštevajo vpliv te in drugih lastnosti celic na vpliv celične linije pri odkrivanju indukcije kromosomskih aberacij, saj se znanje na tem področju razvija.

Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.

ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE

Pri preskusih, izvedenih in vitro, je običajno treba uporabiti zunanji vir presnovne aktivacije, razen če so celice v zvezi s preskusno kemikalijo sposobne presnavljanja. Zunanji sistem presnovne aktivacije ne posnema pogojev in vivo v celoti. Paziti je treba, da se izogibamo pogojem, ki bi lahko vodili do lažno pozitivnih rezultatov, tj. kromosomskih poškodb, ki jih ne bi povzročilo neposredno medsebojno delovanje preskusnih kemikalij in kromosomov; med take pogoje so vključene spremembe vrednosti pH ali osmolarnosti (8) (9) (10), medsebojno delovanje sestavin gojišča (11) (12) ali previsoke ravni citotoksičnosti (13) (14) (15) (16).

Ta preskus se uporablja za odkrivanje kromosomskih aberacij, ki so lahko posledica klastogenih dogodkov. Analizo indukcije kromosomskih aberacij je treba izvesti z uporabo celic v metafazi. Zato je bistveno, da v celicah tretiranih in netretiranih kultur poteka mitoza. Pri proizvedenih nanomaterialih so morda potrebne posebne prilagoditve te preskusne metode, ki pa pri tej metodi niso opisane.

Pred uporabo te preskusne metode za preskušanje zmesi in pridobivanje podatkov za predvideni regulativni namen bi bilo treba proučiti, ali bo zagotovila sprejemljive rezultate za navedeni namen in, če jih bo, zakaj. Kadar obstaja regulativna zahteva za preskušanje zmesi, taki preudarki niso potrebni.

NAČELO PRESKUSA

Človeške celične kulture ali celične kulture drugih sesalcev so preskusni kemikaliji izpostavljene z zunanjim virom presnovne aktivacije ali brez njega, razen če se uporabijo celice, ki imajo ustrezno sposobnost presnavljanja (glej odstavek 13). Po tem ko so celične kulture izpostavljene preskusni kemikaliji, se v ustreznih, vnaprej določenih intervalih tretirajo s kemikalijo, ki zavira metafazo (npr. kolcemidom ali kolhicinom), nato se odvzamejo in obarvajo, celice v metafazi pa se mikroskopsko analizirajo, da se ugotovi prisotnost aberacij kromatidnega in kromosomskega tipa.

OPIS METODE

Priprave

Celice

Uporabijo se lahko različne celične linije (npr. celice jajčnikov kitajskega hrčka (CHO), pljuča kitajskega hrčka V79, pljuča kitajskega hrčka (CHL)/IU, TK6) ali primarne celične kulture, vključno z limfociti periferne krvi človeka ali drugih sesalcev (7). Izbiro celičnih linij je treba znanstveno utemeljiti. Pri uporabi primarnih celic je treba zaradi dobrobiti živali razmisliti o uporabi človeških primarnih celic, če je to izvedljivo, ter jih vzorčiti v skladu s človeškimi etičnimi načeli in predpisi. Limfocite periferne krvi človeka je treba pridobiti od mladih oseb (starih med približno 18 in 35 let), ki ne kadijo, nimajo znanih bolezni ali niso bili nedavno izpostavljeni takim stopnjam genotoksičnih snovi (npr. kemikalijam, ionizirajočemu sevanju), zaradi katerih bi se povečala pojavnost kromosomskih aberacij v ozadju. Tako se zagotovi, da je pojavnost kromosomskih aberacij v ozadju nizka in konsistentna. Osnovna pojavnost kromosomskih aberacij se povečuje s starostjo in ta trend je izrazitejši pri ženskah kot pri moških (17) (18). Če se za uporabo zberejo celice več kot enega darovalca, je treba navesti število darovalcev. Prikazati je treba, da so se celice delile od začetka tretiranja s preskusno kemikalijo do njihovega vzorčenja. Celične kulture se vzdržujejo v eksponentni fazi rasti celic (celične linije) ali se stimulira njihova delitev (primarne kulture limfocitov), da se izpostavijo celice v različnih fazah celičnega cikla, saj morda ni znano, kako so posamezne faze celičnega cikla občutljive na preskusne kemikalije. Primarne celice, katerih delitev je treba stimulirati z mitogeni, med izpostavljenostjo preskusni kemikaliji v splošnem niso več sinhronizirane (npr. človeški limfociti po 48-urni stimulaciji z mitogeni). Uporaba sinhronih celic med tretiranjem ni priporočljiva, vendar je lahko na podlagi utemeljitve sprejemljiva.

Gojišča in pogoji kultiviranja

Za vzdrževanje kultur je treba uporabiti ustrezno gojišče in pogoje inkubacije (posode za gojenje, vlažno ozračje s 5 % CO2, če je ustrezno, temperatura inkubacije 37 °C). Redno je treba preverjati, ali je modalno kromosomsko število v celičnih linijah stabilno in ali te linije niso okužene z mikoplazmo (7) (19); celice se ne smejo uporabljati, če so okužene ali če se je spremenilo modalno kromosomsko število. Določiti je treba običajno trajanje celičnega cikla celičnih linij ali primarnih kultur, uporabljenih v preskuševalnem laboratoriju, ki mora biti skladno z objavljenimi lastnostmi celic (20).

Priprava kultur

Celične linije: celice se namnožijo iz osnovnih kultur, nasadijo v gojišče tako na gosto, da celice v suspenzijah ali monosloju še naprej eksponentno rastejo do odvzema celic (npr. pri celicah, ki rastejo v monosloju, se je treba izogibati konfluenci).

Limfociti: celotna kri, obdelana z antikoagulantom (npr. heparinom), ali ločeni limfociti se dodajo v gojišče (človeški limfociti npr. za 48 ur), ki vsebuje mitogen [za človeške limfocite npr. fitohemaglutinin], da se spodbudi delitev celic pred izpostavitvijo preskusni kemikaliji.

Presnovna aktivacija

Pri uporabi celic, ki nimajo ustrezne notranje sposobnosti presnavljanja, je treba uporabiti zunanje presnovne sisteme. Najpogosteje uporabljani sistem, ki je priporočen kot privzet, razen če ni drugače utemeljeno, je s kofaktorjem dopolnjena postmitohondrijska frakcija (S9), pripravljena iz jeter glodalcev (običajno podgan), ki so bila obdelana s sredstvi za encimsko indukcijo, kot je Aroclor 1254 (21) (22) (23), ali z mešanico fenobarbitala in β–naftoflavona (24) (25) (26) (27) (28) (29). Ta mešanica ni v nasprotju s Stockholmsko konvencijo o obstojnih organskih onesnaževalih (30) ter se je v primerjavi s sredstvom Aroclor 1254 izkazala kot enako učinkovita za induciranje oksidaz z mešano funkcijo (24) (25) (26) (28). Frakcija S9 se v končnem preskusnem gojišču običajno uporablja v koncentracijah, ki se gibljejo v razponu od 1 do 2 vol. %, lahko pa se poveča na 10 vol. %. Med tretiranjem se je treba izogibati kemičnim izdelkom, ki zmanjšujejo mitotični indeks, zlasti snovem, ki tvorijo kalcijev kompleks (31). Na izbiro vrste in koncentracije zunanjega sistema presnovne aktivacije ali sredstva za indukcijo presnove lahko vpliva razred kemikalij, ki se preskušajo.

Priprava preskusne kemikalije

Trdne preskusne kemikalije je treba pred tretiranjem celic pripraviti v ustreznih topilih in, če je ustrezno, razredčiti (glej odstavek 23). Tekoče preskusne kemikalije se lahko dodajo neposredno v preskusni sistem in/ali razredčijo pred tretiranjem preskusnega sistema. Plinaste ali hlapne preskusne kemikalije je treba preskusiti z ustrezno prilagojenimi standardnimi protokoli, kot je tretiranje v zatesnjenih posodah za gojenje (32) (33) (34). Preskusne kemikalije je treba pripraviti tik pred tretiranjem, razen če podatki o stabilnosti kažejo, da je shranjevanje sprejemljivo.

Preskusni pogoji

Topila

Izbrati je treba tako topilo, ki optimizira topnost preskusne kemikalije in ne vpliva negativno na izvedbo preskusa, npr. ne spremeni rast celic, ne vpliva na celovitost preskusne kemikalije, ne reagira s posodami za gojenje, ne ovira sistema presnovne aktivacije. Priporočljivo je, da se, kadar koli je to mogoče, najprej razmisli o uporabi vodnega topila (ali gojišča). Zelo uveljavljeni topili sta na primer voda ali dimetil sulfoksid. Organska topila v končnem obdelovalnem gojišču v splošnem ne smejo presegati 1 vol. %, vodna topila (fiziološka raztopina ali voda) pa ne 10 vol. %. Če se uporabljajo neuveljavljena topila (npr. etanol ali aceton), je treba njihovo uporabo podpreti s podatki, ki dokazujejo njihovo združljivost s preskusnimi kemikalijami in preskusnim sistemom ter odsotnost genotoksičnosti pri uporabljeni koncentraciji. Če takšnih podpornih podatkov ni, je treba vključiti netretirane kontrole (glej Dodatek 1), ki dokazujejo, da izbrano topilo ne povzroča škodljivih ali klastogenih učinkov.

Merjenje celične proliferacije in citotoksičnosti ter izbira koncentracij za tretiranje

Pri določanju najvišje koncentracije preskusne kemikalije se je treba izogibati koncentracijam, pri katerih se lahko pojavijo lažni pozitivni odzivi, kot so tisti, ki povzročajo preveliko citotoksičnost (glej odstavek 22), obarjanje v gojiščih (glej odstavek 23) ali znatne spremembe vrednosti pH ali osmolarnosti (glej odstavek 5). Če preskusna kemikalija ob dodajanju povzroči znatno spremembo vrednosti pH v gojišču, se lahko vrednost pH prilagodi z dodajanjem pufra v končno obdelovalno gojišče, da se izogne lažno pozitivnim rezultatom in vzdržujejo ustrezni pogoji kultiviranja.

Z meritvami celične proliferacije se zagotovi, da med preskusom poteka mitoza v zadostnem številu tretiranih celic in da se tretiranja izvedejo pri ustreznih ravneh citotoksičnosti (glej odstavka 18 in 22). Citotoksičnost je treba v glavnem preskusu določiti s presnovno aktivacijo ali brez nje, pri čemer je treba uporabiti ustrezni kazalnik celične smrti in rasti. Čeprav je lahko koristno, da se zaradi boljšega določanja koncentracij, ki jih je treba uporabiti v glavnem preskusu, citotoksičnost oceni v začetnem preskusu, ta preskus ni obvezen. Če se izvede, ne sme nadomestiti merjenja citotoksičnosti v glavnem preskusu.

Za oceno citotoksičnosti v citogenetskih preskusih sta ustrezni metodi relativna podvojitev populacije ali relativno povečanje števila celic (13) (15) (35) (36) (55) (glej Dodatek 2 za formule). V primeru dolgotrajnega tretiranja in časov vzorčenja po začetku tretiranja, ki so daljši od 1,5 dolžine normalnega celičnega cikla (tj. daljši od skupaj 3 celičnih ciklov), se lahko pri relativni podvojitvi populacije vrednost citotoksičnosti podceni (37). V tem primeru je boljše merilo relativno povečanje števila celic ali je v pomoč ocena citotoksičnosti po 1,5 dolžine normalnega celičnega cikla, pri čemer se uporabi relativna podvojitev populacije.

Glede limfocitov v primarnih kulturah je mitotični indeks, čeprav je merilo citotoksičnih/citostatskih učinkov, odvisen od časa meritve po tretiranju, uporabljenega mitogena in morebitne motnje celičnega cikla. Vendar je mitotični indeks sprejemljiv, ker so druge meritve citotoksičnosti lahko težavne in nepraktične ter jih morda ni mogoče uporabiti za ciljno populacijo limfocitov, ki rastejo zaradi stimulacije s fitohemaglutininom.

Čeprav sta relativno povečanje števila celic in relativna podvojitev populacije priporočena parametra citotoksičnosti za celične linije, mitotični indeks pa za primarno kulturo limfocitov, lahko drugi kazalniki (npr. celična neokrnjenost, nekroza, apoptoza, celični cikel) zagotovijo koristne dodatne podatke.

Oceniti je treba vsaj tri preskusne koncentracije (v kar niso vključeni topilo in pozitivne kontrole), ki izpolnjujejo merila za sprejemljivost (ustrezna citotoksičnost, število celic itd.). Ne glede na vrsto celic (celične linije ali primarne kulture limfocitov) se lahko pri vsaki preskušeni koncentraciji tretira ponovitev kulture ali le ena sama kultura. Čeprav je priporočljiva uporaba podvojenih kultur, je sprejemljiva tudi ena sama kultura, če je skupno število celic v eni kulturi ali ponovitvah kulture enako. Uporaba ene kulture je zlasti pomembna, če se ocenjujejo več kot 3 koncentracije (glej odstavek 31). Za analizo podatkov se lahko zberejo rezultati, pridobljeni pri neodvisnih ponovitvah kulture za zadevno koncentracijo (38). Za preskusne kemikalije, ki kažejo malo ali nič citotoksičnosti, bodo ustrezni približno 2- do 3-kratni intervali med koncentracijami. V primeru citotoksičnosti morajo izbrane preskusne koncentracije zajemati območje iz navedene nastale citotoksičnosti, kot je opisano v odstavku 22, ter vključevati koncentracije, pri katerih je citotoksičnost zmerna oziroma majhna ali je ni. Pri številnih preskusnih kemikalijah so vidne strme krivulje odziva na koncentracijo, zato je treba za pridobitev podatkov za nizko in zmerno citotoksičnost ali podrobno proučevanje razmerja med odzivom in odmerkom uporabiti večje število koncentracij, ki so tesno skupaj, in/ali več kot tri koncentracije (ena kultura ali ponovitve kultur), zlasti kadar je treba poskus ponoviti (glej odstavek 47).

Če največja koncentracija temelji na citotoksičnosti, si je treba pri najvišji koncentraciji prizadevati, da citotoksičnost ne preseže razpona 55 ± 5 %, pri čemer se uporabljajo priporočeni parametri citotoksičnosti (tj. zmanjšanje relativnega povečanja števila celic in relativne podvojitve populacije za celične linije ter zmanjšanje mitotičnega indeksa za primarne kulture limfocitov na razpon 45 ± 5 % sočasne negativne kontrole). Pozitivne rezultate, ki se nahajajo le na višjem koncu tega razpona citotoksičnosti, ki znaša 55 ± 5 %, je treba razlagati previdno (13).

Pri slabo topnih preskusnih kemikalijah, ki pri koncentracijah, nižjih od najnižje netopne koncentracije, niso citotoksične, mora najvišja analizirana koncentracija ob koncu tretiranja s preskusno kemikalijo povzročiti nastanek motnosti ali oborine, ki je vidna s prostim očesom ali pod invertnim mikroskopom. Tudi če se citotoksičnost pojavi nad najnižjo netopno koncentracijo, je priporočljivo, da se preskusi le pri eni koncentraciji, ki povzroči nastanek motnosti ali vidne oborine, saj lahko oborina povzroči lažne učinke. Pri koncentraciji, ki povzroči nastanek oborine, je treba paziti, da oborina ne vpliva na izvedbo preskusa (npr. barvanje ali štetje). Koristno je lahko, če se pred preskusom določi topnost v gojišču.

Če oborina ni vidna ali ni opažene mejne citotoksičnosti, mora biti najvišja preskusna koncentracija 10 mM, 2 mg/ml ali 2 μl/ml, pri čemer se upošteva najnižja od teh koncentracij (39) (40) (41). Če preskusna kemikalija nima določene sestave, kot so npr. snovi z neznano ali spremenljivo sestavo, kompleksni reakcijski produkti ali biološki materiali (UVCB) (42), okoljski ekstrakt itd., je v primeru odsotnosti ustrezne citotoksičnosti morda treba povečati najvišjo koncentracijo (npr. 5 mg/ml), da bi se povečala koncentracija vsake posamezne sestavine. Vendar je treba opozoriti, da se lahko pri zdravilih za uporabo v humani medicini te zahteve razlikujejo (43).

Kontrole

V vsak odvzem celic je treba vključiti sočasne negativne kontrole (glej odstavek 15), sestavljene le iz topila v obdelovalnem gojišču, ki je obdelano enako kot kulture za tretiranje.

Sočasne pozitivne kontrole so potrebne, da se dokaže zmožnost laboratorija, da odkrije klastogene pod pogoji uporabljenega preskusnega protokola, in učinkovitost zunanjega sistema presnovne aktivacije, če je ustrezno. Primeri pozitivnih kontrol so navedeni v preglednici 1. Za pozitivno kontrolo se lahko uporabijo tudi druge kemikalije, če je to utemeljeno. Ker in vitro preskusi genotoksičnosti za celice sesalcev niso dovolj standardizirani, je lahko uporaba pozitivnih kontrol omejena na klastogen, pri katerem je potrebna presnovna aktivacija. Če se izvaja sočasno z neaktiviranim preskusom, pri katerem se uporablja enak čas tretiranja, se pri tem enem odzivu pozitivne kontrole pokaže tako delovanje sistema presnovne aktivacije kot tudi odzivnost preskusnega sistema. Vendar je treba pri dolgotrajnem tretiranju (brez S9) uporabiti lastno pozitivno kontrolo, saj se trajanje tretiranja razlikuje od preskusa, pri katerem se uporablja presnovna aktivacija. Vsako pozitivno kontrolo je treba uporabiti pri eni ali več koncentracijah, pri katerih se pričakuje obnovljivo in zaznavno povečanje glede na ozadje, da se dokaže občutljivost preskusnega sistema (kar pomeni, da so učinki jasni, vendar pri odčitavanju ne razkrijejo takoj identitete označenih mikroskopskih preparatov), odziva pa ne sme ogroziti citotoksičnost, ki bi presegla meje, določene za to preskusno metodo.

Preglednica 1

Referenčne kemikalije, ki se priporočajo za ocenjevanje usposobljenosti laboratorija in izbor pozitivne kontrole

POSTOPEK

Tretiranje s preskusno kemikalijo

Množeče se celice se tretirajo s preskusno kemikalijo v prisotnosti in odsotnosti sistema presnovne aktivacije.

Čas odvzema celic iz kulture

Za temeljito oceno, ki bi bila potrebna za sklep o negativnem rezultatu, je treba izvesti vse tri naslednje preskusne pogoje ter pri tem uporabiti kratkotrajno tretiranje s presnovno aktivacijo in brez nje ter dolgotrajno tretiranje brez presnovne aktivacije (glej odstavke 43, 44 in 45):

Če so pri katerem koli od navedenih preskusnih pogojev rezultati pozitivni, morda ni treba raziskovati nobenih drugih režimov tretiranja.

Priprava kromosomov

Celične kulture se obdelajo s kolcemidom ali kolhicinom, in sicer običajno eno do tri ure pred odvzemom celic. Celice se odvzamejo in obdelajo za pripravo kromosomov iz vsake kulture posebej. Priprava kromosomov vključuje hipotonično obdelavo celic, fiksiranje in barvanje. V monosloju so lahko po zaključku obdelave, ki traja od 3 do 6 ur, prisotne mitotične celice (so okrogle in se ločujejo od površine). Ker se te mitotične celice zlahka ločijo, se lahko ob odstranitvi gojišča s preskusno kemikalijo izgubijo. Če obstaja dokaz o znatnem povečanju števila mitotičnih celic v primerjavi s kontrolnimi vzorci, ki kažejo verjetno mitotično zaviranje, je treba celice zbrati s centrifugiranjem in jih dodati nazaj h kulturam, da ne bi izgubili celic, v katerih poteka mitoza in pri katerih ob odvzemu obstaja tveganje kromosomske aberacije.

Analiza

Vse preparate, vključno s pozitivnimi in negativnimi kontrolami, je treba pred mikroskopsko analizo kromosomskih aberacij neodvisno označiti. Ker fiksiranje pogosto povzroči pretrganje dela celic v metafazi, ki imajo izgubljene kromosome, mora biti število centromer v štetih celicah pri vseh vrstah celic enako modalnemu številu ± 2.

Na vsako koncentracijo in vsako kontrolo je treba v štetje vključiti vsaj 300 dobro vidnih metafaz, da se lahko sklepa, da je preskusna kemikalija jasno negativna (glej odstavek 45). Če se uporabljajo ponovitve kulture, mora biti teh 300 celic enakomerno porazdeljenih med ponovitvami. V primeru uporabe ene kulture na koncentracijo (glej odstavek 21) je treba v tej kulturi v štetje vključiti vsaj 300 dobro vidnih metafaz. Prednost štetja 300 celic je v tem, da poveča statistično moč preskusa in da se redko opazijo ničelne vrednosti (po pričakovanjih le 5 %) (44). Število štetih metafaz se lahko zmanjša, če se opazi veliko število celic s kromosomskimi aberacijami in se sklepa, da je preskusna kemikalija jasno pozitivna.

Šteti je treba celice s strukturnimi kromosomskimi aberacijami, vključno z vrzelmi in brez njih. Prelomi in vrzeli so opredeljeni v Dodatku 1 v skladu s (45) (46). Kromatidne in kromosomske aberacije je treba zabeležiti posebej in jih razvrstiti v podvrste (prelomi, izmenjave). S postopki, ki se uporabljajo v laboratoriju, je treba zagotoviti, da analizo kromosomskih aberacij izvajajo osebe, ki so zelo usposobljene za štetje, in da se po potrebi izvede medsebojni strokovni pregled.

Čeprav je preskus namenjen odkrivanju strukturnih kromosomskih aberacij, je pomembno, da se poliploidija in endoreduplikacija zabeležita, ko se opazita. (Glej odstavek 2.)

Usposobljenost laboratorija

Preden se začne laboratorij uporabljati za rutinsko preskušanje, mora izvesti sklop preskusov z referenčnimi pozitivnimi kemikalijami, ki delujejo z različnimi mehanizmi in različnimi negativnimi kontrolami (z uporabo različnih topil/vehiklov), s čimer dokaže, da ima zadostne izkušnje s preskusom. Ti odzivi pozitivnih in negativnih kontrol morajo biti skladni z viri. To ne velja za laboratorije, ki imajo izkušnje, tj. ki imajo na voljo zbirko podatkov iz preteklih preskusov, kot je opredeljena v odstavku 37.

Izbor kemikalij za pozitivno kontrolo (glej preglednico 1 v odstavku 26) je treba preiskati s kratkotrajnim ali dolgotrajnim tretiranjem brez presnovne aktivacije ter kratkotrajnim tretiranjem ob presnovni aktivaciji, da se dokaže usposobljenost za odkrivanje klastogenih snovi in določi učinkovitost sistema presnovne aktivacije. Izbrati je treba območje koncentracij izbranih kemijskih snovi, kar omogoča ponovljiva in s koncentracijo povezana povečanja glede na ozadje, da se pokaže občutljivost in dinamično območje preskusnega sistema.

Podatki o kontroli iz preteklih preskusov

Laboratorij mora določiti:

Ko se podatki za porazdelitev negativnih kontrol iz preteklih preskusov pridobivajo prvič, morajo biti sočasne negativne kontrole skladne z objavljenimi podatki o kontrolah, če obstajajo. Ko se k porazdelitvi kontrol dodaja več podatkov o preskusu, sočasne negativne kontrole po možnosti ne bi smele preseči 95-odstotne kontrolne meje za navedeno porazdelitev (44) (47). Zbirka podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov mora sprva temeljiti na vsaj 10 preskusih, po možnosti pa mora biti sestavljena iz vsaj 20 preskusov, izvedenih v primerljivih preskusnih pogojih. Laboratoriji morajo uporabljati metode nadzora kakovosti, kot so kontrolne karte (npr. c-karte ali „X-črta“ karte (48)), da opredelijo, kako variabilni so njihovi podatki o pozitivnih in negativnih kontrolah, in pokažejo, da je metodologija v njihovem laboratoriju „pod nadzorom“ (44). Nadaljnja priporočila o načinu oblikovanja in uporabe podatkov iz preteklih preskusov (npr. merila za vključitev podatkov med podatke iz preteklih preskusov in njihovo izključitev iz teh podatkov ter merila za sprejemljivost za zadevni poskus) so navedena v virih (47).

Vsako spremembo v protokolu preskusa je treba proučiti glede na skladnost z obstoječimi zbirkami podatkov laboratorija o kontrolah iz preteklih preskusov. Če se pojavijo večje neskladnosti, je treba ustvariti novo zbirko podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov.

V podatke o negativnih kontrolah je treba vključiti pojav celic s kromosomskimi aberacijami iz ene kulture ali vsote ponovitev kulture, kot je opisano v odstavku 21. Sočasne negativne kontrole po možnosti ne smejo preseči 95-odstotne kontrolne meje porazdelitve iz zbirke podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (44) (47). Kadar podatki o sočasni negativni kontroli presežejo 95-odstotno kontrolno mejo, jih je sprejemljivo vključiti v porazdelitev kontrol iz preteklih preskusov, če ti podatki niso izjemni osamelci ter če obstaja dokaz, da je preskusni sistem „pod nadzorom“ (glej odstavek 37), in dokaz o odsotnosti tehničnih ali človeških napak.

PODATKI IN POROČANJE

Predstavitev rezultatov

Oceniti je treba odstotek celic s strukturnimi kromosomskimi aberacijami. Ločeno je treba navesti kromatidne in kromosomske aberacije, razvrščene glede na podvrste (prelomi, izmenjave), skupaj z njihovim številom in pogostostmi za poskusne in kontrolne kulture. Vrzeli se zabeležijo in o njih se poroča ločeno, vendar se ne vključijo v skupno število pogostnosti aberacij. Ko se opazi poliploidija in/ali endoreduplicirane celice, se poroča o njihovem odstotku.

Zabeležiti je treba sočasne meritve citotoksičnosti za vse tretirane, negativne in pozitivne kontrolne kulture v glavnih poskusih, ki se nanašajo na aberacije.

Navedejo se podatki za posamezne kulture. Poleg tega se vsi podatki povzamejo v obliki preglednice.

Merila za sprejemljivost

Sprejemljivost preskusa temelji na naslednjih merilih:

Vrednotenje in razlaga rezultatov

Pod pogojem, da so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno pozitivno, če se v katerem koli od proučevanih preskusnih pogojev (glej odstavek 28):

Ko so izpolnjena vsa ta merila, se nato šteje, da lahko preskusna kemikalija povzroči nastanek kromosomskih aberacij v kultiviranih celicah sesalcev v tem preskusnem sistemu. Priporočila glede najustreznejših statističnih metod so navedena v virih (49) (50) (51).

Pod pogojem, da so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno negativno, če se v katerem koli od proučevanih preskusnih pogojev (glej odstavek 28):

Nato se šteje, da preskusna kemikalija ne more povzročiti nastanka kromosomskih aberacij v kultiviranih celicah sesalcev v tem preskusnem sistemu.

Preverjanje jasno pozitivnega ali jasno negativnega odziva ni potrebno.

Če odziv ni niti jasno negativen niti jasno pozitiven, kot je opisano zgoraj, ali za podporo pri ugotavljanju biološke pomembnosti rezultatov, je treba podatke oceniti s strokovno presojo in/ali nadaljnjimi preiskavami. Štetje dodatnih celic (po potrebi) ali izvedba ponovitve poskusa je lahko koristna, po možnosti z uporabo spremenjenih preskusnih pogojev (npr. razmik med koncentracijami, drugi pogoji za presnovno aktivacijo (tj. koncentracija ali izvor S9)).

Zbirka podatkov v redkih primerih celo po izvedbi nadaljnjih preiskav onemogoča sprejetje sklepa o pozitivnih ali negativnih rezultatih, zato se zaključi, da je odziv na preskusno kemikalijo dvoumen.

Povečanje števila poliploidnih celic kaže na to, da ima preskusna kemikalija potencial za zaviranje mitotičnih procesov in povzročanje numeričnih kromosomskih aberacij (52). Povečanje števila celic z endoredupliciranimi kromosomi lahko pomeni, da lahko preskusne kemikalije zavirajo potek celičnega cikla (53) (54) (glej odstavek 2). Pojav poliploidnih celic in celic z endoredupliciranimi kromosomi je zato treba zabeležiti ločeno.

Poročilo o preskusu

V poročilo o preskusu se vključijo naslednji podatki:

VIRI

(4)

Poglavje B.11 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.11   Preskus kromosomskih aberacij v kostnem mozgu sesalcev

UVOD

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD 475 (2016). Je del sklopa preskusnih metod o genetski toksikologiji. Pripravljen je dokument OECD, ki zagotavlja jedrnate informacije o preskušanju v zvezi z genetsko tokskikologijo in pregled nedavnih sprememb teh preskusnih smernic (1).

Preskus kromosomskih aberacij in vivo v kostnem mozgu sesalcev je posebej primeren za ocenjevanje genotoksičnosti, saj so pri tem aktivni dejavniki metabolizma in vivo, farmakokinetike in popravljanja DNK, ki prispevajo k odzivom, čeprav se lahko od vrste do vrste razlikujejo. Preskus in vivo je uporaben tudi za nadaljnjo preiskavo genotoksičnosti, odkrite s sistemom in vitro.

Preskus kromosomskih aberacij in vivo pri sesalcih se uporablja za odkrivanje strukturnih kromosomskih aberacij, ki jih povzroči preskusna kemikalija v celicah kostnega mozga živali, običajno glodalcev (2) (3) (4) (5). Ločimo dva tipa strukturnih kromosomskih aberacij, in sicer: kromosomski in kromatidni tip. Večina genotoksičnih, kemijsko induciranih aberacij je kromatidnih, lahko pa se pojavijo tudi aberacije kromosomskega tipa. Kromosomske poškodbe in podobni pojavi so vzrok številnih genskih bolezni pri človeku in obstajajo tehtni dokazi, da so te lezije in podobni pojavi, ki povzročajo spremembe v onkogenih in genih zaviralcih rasti tumorjev, povezani z rakom pri človeku in v poskusnih sistemih. Pri in vivo preskusih kromosomske aberacije lahko pride do poliploidije (vključno z endoreduplikacijo). Poliplodija sama po sebi še ne pomeni anevgenega potenciala, pač pa lahko samo nakazuje motnjo celičnega cikla ali citotoksičnost. Ta preskus ni zasnovan za merjenje anevploidije. Preskus mikronukleusov v eritrocitih sesalcev in vivo (poglavje B.12 te priloge) ali preskus mikronukleusov in vitro pri celicah sesalcev (poglavje B.49 te priloge) sta preskus in vivo oziroma in vitro, ki se priporočata za odkrivanje anevploidije.

Opredelitve ključnih pojmov so navedene v Dodatku 1.

ZAČETNI PREUDARKI

V tem preskusu se običajno uporabljajo glodalci, vendar so lahko v nekaterih primerih primerne tudi druge vrste, če je to znanstveno upravičeno. Ciljno tkivo pri tem preskusu je kostni mozeg, saj je zelo vaskularizirano in vsebuje populacijo celic s hitrim potekom cikla, ki se z lahkoto izolirajo in obdelajo. V poročilu je treba znanstveno utemeljiti uporabo drugih vrst glodalcev, ki niso podgane in miši. Če se ne uporabljajo glodalci, temveč druge vrste, je priporočljivo, da se merjenje kromosomskih aberacij v kostnem mozgu vključi v drug ustrezen preskus toksičnosti.

Če obstajajo dokazi, da preskusne kemikalije ali njihovi metaboliti ne bodo dosegli ciljnega tkiva, ta preskus morda ni primeren.

Pred uporabo te preskusne metode za preskušanje zmesi in pridobivanje podatkov za predvideni regulativni namen bi bilo treba proučiti, ali bo zagotovila sprejemljive rezultate za navedeni namen in, če jih bo, zakaj. Kadar obstaja regulativna zahteva za preskušanje zmesi, taki preudarki niso potrebni.

NAČELO PRESKUSNE METODE

Živali se preskusni kemikaliji izpostavijo z ustreznim načinom izpostavljenosti in se humano evtanazirajo ob primernem času po tretiranju. Pred evtanazijo se živali tretirajo z zaviralcem metafaze (npr. kolhicinom ali kolcemidom). Nato se pripravijo in obarvajo preparati kromosomov iz celic kostnega mozga ter se analizirajo kromosomske aberacije v celicah v metafazi.

PREVERJANJE USPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA

Preverjanje usposobljenosti

Preden se začne laboratorij uporabljati za rutinsko preskušanje, mora dokazati, da je sposoben ponoviti pričakovane rezultate iz objavljenih podatkov (npr. (6)) za pogostost kromosomskih aberacij z vsaj dvema kemikalijama za pozitivno kontrolo (vključno z blagimi odzivi, ki jih povzročijo majhni odmerki v pozitivnih kontrolah), kot so tiste iz preglednice 1, in z združljivimi kontrolami z vehiklom/topilom (glej odstavek 22); s tem laboratorij tudi dokaže, da ima zadostne izkušnje z izvajanjem poskusov. Pri teh poskusih je treba uporabiti odmerke, pri katerih se omogočajo ponovljiva in z odmerkom povezana povečanja ter se pokažeta občutljivost in dinamično območje preskusnega sistema v zadevnem tkivu (kostni mozeg) in uporabi metoda štetja, ki jo je treba uporabljati v laboratoriju. To ne velja za laboratorije, ki imajo izkušnje, tj. ki imajo na voljo zbirko podatkov iz preteklih preskusov, kot je opredeljeno v odstavkih 10 do 14.

Podatki o kontrolah iz preteklih preskusov

Med preverjanjem usposobljenosti mora laboratorij določiti:

Ko se podatki o porazdelitvi negativnih kontrol iz preteklih preskusov pridobivajo prvič, morajo biti sočasne negativne kontrole skladne z objavljenimi podatki o kontrolah, če ti obstajajo. Ko se k porazdelitvi kontrol iz preteklih preskusov dodaja več podatkov o preskusu, sočasne negativne kontrole po možnosti ne bi smele preseči 95-odstotne kontrolne meje za navedeno porazdelitev. Zbirka podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov mora biti statistično zanesljiva, s čimer se zagotovi, da je laboratorij sposoben oceniti porazdelitev svojih podatkov o negativnih kontrolah. Iz virov je razvidno, da je potrebnih vsaj 10 preskusov, po možnosti pa mora biti zbirka sestavljena iz vsaj 20 preskusov, izvedenih v primerljivih preskusnih pogojih. Laboratoriji morajo uporabljati metode nadzora kakovosti, kot so kontrolne karte (npr. c-karte ali „X-črta“ karte (7)), da opredelijo, kako variabilni so njihovi podatki, in pokažejo, da je metodologija v njihovem laboratoriju „pod nadzorom“. Nadaljnja priporočila o načinu oblikovanja in uporabe podatkov iz preteklih preskusov (npr. merila za vključitev podatkov med podatke iz preteklih preskusov in njihovo izključitev iz teh podatkov ter merila za sprejemljivost za zadevni poskus) so navedena v virih (8).

Kadar laboratorij med preverjanjem usposobljenosti (opisanim v odstavku 9) ne izvede zadostnega števila preskusov za določitev statistično zanesljive porazdelitve negativnih kontrol (glej odstavek 11), je sprejemljivo, da se lahko porazdelitev razvije med prvimi rutinskimi preskusi. Pri tem pristopu je treba upoštevati priporočila, navedena v virih (8), rezultati negativnih kontrol, pridobljeni pri teh poskusih, pa morajo ostati skladni z objavljenimi podatki o negativnih kontrolah.

Vsako spremembo v protokolu poskusa je treba proučiti glede na vpliv, ki ga ima na to, da pridobljeni podatki ostanejo skladni z obstoječo zbirko podatkov laboratorija o kontrolah iz preteklih preskusov. Novo zbirko podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov je treba ustvariti le v primeru večjih neskladnosti, kadar se s strokovno presojo oceni, da se razlikuje od prejšnje porazdelitve (glej odstavek 11). Ko se zbirka podatkov ustvarja na novo, za izvedbo dejanskega preskusa ni potrebna celotna zbirka podatkov o negativnih kontrolah, če lahko laboratorij dokaže, da vrednosti njegovih sočasnih negativnih kontrol ostajajo skladne s prejšnjo zbirko podatkov ali z ustreznimi objavljenimi podatki.

V podatke o negativnih kontrolah je treba vključiti pojav strukturnih kromosomskih aberacij (razen vrzeli) za vsako žival. Sočasne negativne kontrole po možnosti ne smejo preseči 95-odstotne kontrolne meje porazdelitve iz zbirke podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov. Kadar podatki o sočasni negativni kontroli presežejo 95-odstotno kontrolno mejo, jih je sprejemljivo vključiti v porazdelitev kontrole iz preteklih preskusov, če ti podatki niso izjemni osamelci ter če obstaja dokaz, da je preskusni sistem „pod nadzorom“ (glej odstavek 11), in dokaz o odsotnosti tehničnih ali človeških napak.

OPIS METODE

Priprave

Izbira živalske vrste

Uporabiti je treba splošno uporabljane laboratorijske seve mladih zdravih odraslih živali. Običajno se uporabljajo podgane, primerne pa so lahko tudi miši. Uporabi se lahko katera koli druga ustrezna vrsta sesalcev, če je to v poročilu znanstveno utemeljeno.

Pogoji nastanitve in hranjenja živali

Pri glodalcih mora biti temperatura v prostoru s poskusnimi živalmi 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 40-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, si je treba prizadevati za 50–60-odstotno vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne mešanice preskusne kemikalije, kadar se daje na ta način. Glodalce je treba nastaniti v majhnih skupinah (ne več kot pet na kletko), tako da so razporejeni glede na spol in tretirano skupino, če ni pričakovati agresivnega vedenja, in sicer po možnosti v kletke s trdimi tlemi z ustrezno okoljsko obogatitvijo. Živali so lahko nastanjene posamično le, če je to znanstveno utemeljeno.

Priprava živali

Običajno se uporabljajo zdrave mlade živali (kar pri glodalcih pomeni, da so ob začetku tretiranja stare po možnosti od 6 do 10 tednov, čeprav so sprejemljive tudi nekoliko starejše živali), ki se naključno razporedijo v kontrolno in tretirano skupino. Posamezne živali se označijo z edinstvenimi oznakami s humano, čim manj invazivno metodo (npr. z namestitvijo obročkov ali trakov, z vsaditvijo mikročipa ali biometrično identifikacijo, ne pa z zarezovanjem ušesa ali prsta) ter se vsaj pet dni prilagajajo laboratorijskim pogojem. Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Izogibati se je treba navzkrižni kontaminaciji s pozitivno kontrolo in preskusno kemikalijo. Ob začetku študije mora biti razlika med težami živali čim manjša in ne sme presegati ± 20 % srednje vrednosti teže za vsak spol.

Priprava odmerkov

Trdne preskusne kemikalije je treba raztopiti ali suspendirati v ustreznih topilih ali vehiklih ali primešati hrani ali pitni vodi, preden se odmerijo živalim. Tekoče preskusne kemikalije se lahko odmerijo neposredno ali pa se pred odmerjanjem razredčijo. Pri izpostavljenosti z vdihavanjem se lahko preskusne kemikalije dajejo v obliki plina, pare ali trdnega/tekočega aerosola, in sicer odvisno od njihovih fizikalno-kemijskih lastnosti. Uporabiti je treba sveže pripravljene preskusne kemikalije, razen če je iz podatkov o stabilnosti razvidno, da je shranjevanje sprejemljivo, in so v njih opredeljeni ustrezni pogoji shranjevanja.

Topilo/vehikel

Topilo/vehikel ne sme imeti toksičnih učinkov pri uporabljenih odmerkih in ne sme zbujati suma, da lahko kemično reagira s preskusnimi kemikalijami. Če se uporabijo druga, manj znana topila/vehikli, je treba njihovo uporabo podpreti z referenčnimi podatki, ki dokazujejo njihovo združljivost. Priporočljivo je, da se, kadar koli je to mogoče, najprej razmisli o uporabi vodnega topila/vehikla. Primeri pogosto uporabljenih, združljivih topil/vehiklov so voda, fiziološka raztopina, raztopina metilceluloze, raztopina natrijeve soli karboksimetil celuloze, oljčno olje ali koruzno olje. Če ni podatkov iz preteklih preskusov ali objavljenih podatkov, iz katerih bi bilo razvidno, da izbrano neobičajno topilo/vehikel ne povzroča strukturnih aberacij ali drugih škodljivih učinkov, je treba izvesti začetno študijo, da se dokaže sprejemljivost kontrol s topilom/vehiklom.

Kontrole

Pozitivne kontrole

V vsak preskus je treba običajno vključiti skupino živali, tretiranih s kemikalijo za pozitivno kontrolo. To se lahko odpravi, ko preskusni laboratorij dokaže svojo usposobljenost za izvajanje preskusov in določi območje pozitivnih kontrol iz preteklih preskusov. Če sočasna pozitivna kontrolna skupina ni vključena, je treba v vsak poskus vključiti kontrole za štetje (fiksirani in nebarvani mikroskopski preparati). Ti se lahko pridobijo tako, da se pri študiji v štetje vključijo ustrezni referenčni vzorci, pridobljeni in shranjeni v okviru ločenega poskusa s pozitivnimi kontrolami, ki se redno izvaja (npr. vsakih 6 do 18 mesecev) v laboratoriju, kjer se preskus izvaja; na primer med preverjanjem usposobljenosti in po tem redno, če je to potrebno.

Kemikalije za pozitivno kontrolo morajo zanesljivo povzročiti zaznavno povečanje pogostosti celic s spontanimi strukturnimi kromosomskimi aberacijami. Odmerke za pozitivno kontrolo je treba izbrati tako, da so učinki jasni, vendar osebi, ki ugotovitve beleži, ne razkrijejo takoj identitete označenih mikroskopskih preparatov. Sprejemljivo je, da se odmerki v pozitivno kontrolo dajejo na način, ki ni enak kot pri preskusni kemikaliji, in da se pri tem uporabi drugačen časovni razpored tretiranja ter se vzorčenje opravi le enkrat. Poleg tega se lahko, če je ustrezno, za pozitivno kontrolo uporabijo kemikalije, ki spadajo v isto skupino nevarnosti kot preskusna kemikalija. Primeri kemikalij za pozitivno kontrolo so navedeni v preglednici 1.

Preglednica 1

Primeri kemikalij za pozitivno kontrolo

Negativne kontrole

V vsak čas vzorčenja je treba vključiti negativno kontrolno skupino živali, ki jo je treba sicer obravnavati enako kot tretirane skupine, vendar se je ne sme tretirati s preskusno kemikalijo. Če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja topilo/vehikel, ga mora prejeti tudi kontrolna skupina. Toda če sta iz podatkov o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov pri vsakem času vzorčenja za preskusni laboratorij razvidni konsistentna variabilnost med posameznimi živalmi in pogostost celic s strukturnimi aberacijami, potem za negativno kontrolo zadostuje le eno samo vzorčenje. Če se za negativne kontrole uporablja eno samo vzorčenje, mora biti to prvi čas vzorčenja, uporabljen v študiji.

POSTOPEK

Število in spol živali

Na splošno je odziv mikronukleusov pri živalih moškega in ženskega spola podoben (9) in pričakovati je, da bo to veljajo tudi za strukturne kromosomske aberacije; zato se lahko študije izvajajo na živalih enega ali drugega spola. Če se pri podatkih pokažejo pomembne razlike med moškim in ženskim spolom (npr. razlike v sistemski toksičnosti, metabolizmu, biološki razpoložljivosti, toksičnosti za kostni mozeg itd., vključno s študijo za ugotavljanje območja), je treba spodbujati uporabo obeh spolov. V takem primeru je študijo primerno izvajati na živalih obeh spolov, npr. kot del toksikološke študije s ponavljajočim odmerkom. V primeru uporabe obeh spolov je primerno uporabiti zasnovo preskusa z več dejavniki. Podrobnosti o tem, kako analizirati podatke z uporabo te zasnove, so navedene v Dodatku 2.

Ob začetku študije je treba določiti skupine, v katerih je vsaj 5 živali enega spola ali vsakega od spolov, če se uporabljata oba, ki jih je mogoče analizirati, na skupino. Kadar bi bila lahko izpostavljenost ljudi kemikalijam omejena na en spol, na primer pri nekaterih farmacevtskih izdelkih, je treba preskus opraviti na živalih ustreznega spola. Praviloma je za študijo kostnega mozga pri dveh časih vzorčenja s tremi skupinami, ki prejemajo odmerke, ter sočasno negativno in pozitivno kontrolo (pri čemer je vsaka skupina sestavljena iz vsaj petih živali enega spola) običajno potrebnih 45 živali.

Velikost odmerkov

Če se izvede predhodna študija za določanje območja, ker ustrezni podatki, ki bi bili v pomoč pri izbiri odmerkov, niso na voljo, jo je treba izvesti v istem laboratoriju ter pri tem uporabiti iste vrste, sev, spol in režim tretiranja kot v glavni študiji (10). S študijo je treba določiti največji tolerančni odmerek (MTD), ki je opredeljen kot največji odmerek, ki ga je mogoče prenesti, ne da bi se pri tem pokazala toksičnost, ki bi v povezavi z obdobjem trajanja študije slednjo omejevala (na primer s povzročitvijo upočasnitve pridobivanja telesne teže ali citotoksičnosti za hematopoetski sistem, ne pa smrti ali znakov bolečine ali trpljenja, zaradi katerih je potrebna humana evtanazija (11)).

Največji odmerek se lahko opredeli tudi kot odmerek, ki povzroči nastanek nekaterih znakov toksičnosti za kostni mozeg.

Kemikalije, ki kažejo nasičenost toksikokinetičnih lastnosti ali povzročajo procese razstrupljanja, zaradi katerih se lahko po dolgotrajnem tretiranju zmanjša izpostavljenost, so lahko izjeme pri merilih za določanje odmerkov in jih je treba oceniti za vsak primer posebej.

Da se pridobijo informacije o odzivu na odmerek, je treba v popolno študijo vključiti skupino negativne kontrole in vsaj tri velikosti odmerkov, ki so običajno ločeni s faktorjem 2, vendar ne več kot 4. Če preskusna kemikalija v študiji za ugotavljanje območja ali na podlagi obstoječih podatkov ne povzroča toksičnosti, mora biti najvišji odmerek pri enkratnem dajanju enak 2 000 mg/kg telesne teže. Če pa preskusna kemikalija povzroča toksičnost, mora biti največji tolerančni odmerek najvišji dani odmerek, v uporabljene velikosti odmerkov pa je treba po možnosti zajeti razpon od največjega odmerka do odmerka, ki povzroča malo ali nič toksičnosti. Kadar se toksičnost za ciljno tkivo (kostni mozeg) opazi pri vseh preskušanih velikostih odmerkov, je priporočljiva dodatna študija pri netoksičnih odmerkih. Pri študijah, namenjenih celovitejši opredelitvi kvantitativnih informacij o razmerju med odmerkom in odzivom, so morda potrebne dodatne skupine, ki prejemajo odmerke. Za določene vrste preskusnih kemikalij (npr. zdravila za uporabo v humani medicini), za katere veljajo posebne zahteve, se lahko te meje razlikujejo.

Mejni preskus

Če poskusi za ugotavljanje območja odmerka ali obstoječi podatki iz povezanih živalskih sevov kažejo, da režim tretiranja z vsaj mejnim odmerkom (opisan v nadaljevanju) ne povzroči vidnih toksičnih učinkov (tudi brez upočasnitve proliferacije kostnega mozga ali drugih dokazov o citotoksičnosti za ciljno tkivo), ter če genotoksičnost na podlagi in vitro študij genotoksičnosti ali podatkov o strukturno sorodnih kemikalijah ni pričakovana, ni potrebna popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov, če se dokaže, da preskusne kemikalije dosežejo ciljno tkivo (kostni mozeg). V takih primerih morda zadostuje že ena velikost odmerka pri mejnem odmerku. Pri obdobju dajanja, ki presega 14 dni, je mejni odmerek 1 000 mg/kg telesne teže na dan. Pri obdobju odmerjanja, ki je enako 14 dnem ali manj, je mejni odmerek 2 000 mg/kg telesne teže na dan.

Dajanje odmerkov

Pri načrtovanju preskusa je treba upoštevati predvideni način izpostavljenosti pri ljudeh. Zato se lahko ob ustrezni utemeljitvi izberejo načini izpostavljenosti, kot so s prehrano, pitno vodo, topično podkožno, intravenozno, oralno (z gavažo), z vdihavanjem, intratrahealno ali z vsadkom. V vsakem primeru je treba način izpostavljenosti izbrati tako, da se zagotovi ustrezna izpostavljenost ciljnih tkiv. Dajanje z intraperitonealno injekcijo v splošnem ni priporočljivo, saj to ni predvideni način izpostavljenosti pri ljudeh, in se lahko uporabi samo na podlagi posebne znanstvene utemeljitve. Če je preskusna kemikalija primešana hrani ali pitni vodi, zlasti v primeru enega samega odmerka, je treba paziti, da med zaužitjem hrane in vode ter vzorčenjem preteče dovolj časa, da se lahko odkrijejo učinki (glej odstavka 33 in 34). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat z gavažo ali injekcijo, je odvisna od velikosti poskusne živali. Količina običajno ne sme presegati 1 ml na 100 g telesne teže, razen pri vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi največ 2 ml na 100 g telesne teže. Uporabo večjih količin je treba utemeljiti. Razen pri dražilnih ali jedkih preskusnih kemikalijah, ki pri višjih koncentracijah običajno povzročajo močnejše učinke, je treba variabilnost preskusne količine s prilagajanjem koncentracije obdržati na čim nižji ravni, da se zagotovi konstanten volumen glede na telesno težo pri vseh odmerkih.

Časovni razpored tretiranja

Preskusne kemikalije se običajno dajo v enem odmerku, lahko pa tudi v razdeljenem odmerku (kar pomeni dva ali več odmerkov v istem dnevu na največ 2 do 3 ure), s čimer se olajša dajanje velike količine kemikalije. V teh okoliščinah ali v primeru dajanja preskusne kemikalije z vdihavanjem je treba čas vzorčenja načrtovati glede na čas zadnjega odmerka ali konca izpostavljenosti.

Za ta preskus je na voljo malo podatkov o ustreznosti protokola s ponavljajočimi se odmerki. Vendar je treba v okoliščinah, v katerih je ta preskus zaželeno vključiti v preskus s ponavljajočimi se odmerki, paziti, da se izognemo izgubi kromosomsko poškodovanih mitotičnih celic, ki se lahko pojavi pri toksičnih odmerkih. Taka vključitev je sprejemljiva, kadar je najvišji odmerek enak ali večji od mejnega odmerka (glej odstavek 29) in se skupini, ki prejema odmerke, med celotnim obdobjem tretiranja daje mejni odmerek. Preskus mikronukleusov (preskusna metoda B.12) je treba šteti kot priporočeni in vivo preskus kromosomskih aberacij, kadar je zaželeno, da se vključi v druge študije.

Vzorce kostnega mozga je treba odvzeti dvakrat ob različnih časih po prejemu posameznih odmerkov. Pri glodalcih je prvi čas vzorčenja enak času, ki potreben za dokončanje 1,5 dolžine normalnega celičnega cikla (pri čemer je slednji običajno 12 do 18 ur po obdobju tretiranja). Čas, potreben za sprejem in metabolizem preskusnih kemikalij ter njihov učinek na dinamiko celičnega cikla, lahko vpliva na optimalni čas za odkritje kromosomskih aberacij, zato je priporočljivo, da se vzorci ponovno odvzamejo 24 ur po prvem času vzorčenja. Pri prvem času vzorčenja je treba tretirati vse skupine, ki prejemajo odmerke, in vzeti vzorce za analizo; pri poznejših časih vzorčenja pa je treba dati le najvišje odmerke. Če se na podlagi znanstvene utemeljitve uporabljajo režimi odmerjanja, ki trajajo več kot en dan, je treba na splošno uporabljati en čas vzorčenja ob približno 1,5 dolžine normalnega celičnega cikla po zadnjem tretiranju.

Živalim se po tretiranju in pred vzorčenjem intraperitonealno vbrizga ustrezen odmerek zaviralca metafaze (npr. kolcemid ali kolhicin), nato pa se ob ustreznem intervalu odvzamejo vzorci. Pri miših je ta interval približno 3 do 5 ur, pri podganah pa 2 do 5 ur pred vzorčenjem. Celice se odvzamejo iz kostnega mozga, nabreknejo, fiksirajo in obarvajo ter analizirajo, da se odkrijejo kromosomske aberacije (12).

Opazovanja

Vsaj enkrat na dan je treba opraviti splošna klinična opazovanja preskusnih živali in zabeležiti klinične znake, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka. Vse živali je treba med obdobjem odmerjanja vsaj dvakrat na dan opazovati za odkrivanje obolevnosti in smrtnosti. Vse živali je treba stehtati ob začetku študije, vsaj enkrat na teden med študijami s ponavljajočimi se odmerki in ob evtanaziji. V študijah, ki trajajo en teden ali več, je treba vsaj enkrat na teden izmeriti porabo hrane. Če se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba izmeriti porabo vode ob vsaki menjavi vode in vsaj tedensko. Živali, ki kažejo neletalne znake čezmerne toksičnosti, je treba humano evtanazirati pred koncem preskusnega obdobja (11).

Izpostavljenost ciljnega tkiva

Ob ustreznih časih je treba odvzeti vzorec krvi, da se lahko preišče raven preskusnih kemikalij v plazmi, s čimer se dokaže, da je prišlo do izpostavljenosti kostnega mozga, če je to utemeljeno in če ne obstajajo drugi podatki o izpostavljenosti (glej odstavek 44).

Preparati kostnega mozga in kromosomov

Takoj po humani evtanaziji se pridobijo celice kostnega mozga iz stegnenic ali golenic živali in se nato izpostavijo hipotonični raztopini in fiksirajo. Celice v metafazi so nato nanesejo na objektna stekelca in obarvajo z uporabo uveljavljenih metod (glej (3) in (12)).

Analiza

Vse mikroskopske preparate, vključno s tistimi s pozitivnimi in negativnimi kontrolami, je treba pred analizo neodvisno označiti in naključno razdeliti, tako da oseba, ki beleži ugotovitve, ne pozna pogojev tretiranja.

Kot merilo citotoksičnosti je treba določiti mitotični indeks v vsaj 1 000 celicah na žival za vse tretirane živali (vključno s pozitivnimi kontrolami), netretirane živali negativne kontrole ali živali negativne kontrole z nosilcem/vehiklom.

Pri vsaki živali je treba analizirati vsaj 200 metafaz za strukturne kromosomske aberacije, vključno z vrzelmi in brez njih (6). Če je v zbirki podatkov o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov v preskusnem laboratoriju srednja vrednost pogostosti strukturnih kromosomskih aberacij v ozadju < 1 %, je treba razmisliti o štetju dodatnih celic. Kromatidne in kromosomske aberacije je treba zabeležiti posebej in razvrstiti v podvrste (prelomi, izmenjave). S postopki, ki se uporabljajo v laboratoriju, je treba zagotoviti, da analizo kromosomskih aberacij izvajajo osebe, ki so zelo usposobljene za štetje, in da se po potrebi izvede medsebojni strokovni pregled. Ob priznavanju, da postopki pripravljanja preparatov pogosto povzročijo pretrganje dela metafaz in posledično izgubo kromosomov, število centromer v štetih celicah torej ne sme biti manjše od 2n ± 2, pri čemer je n haploidno število kromosomov za zadevno vrsto.

PODATKI IN POROČANJE

Obdelava rezultatov

Podatke za posamezne živali je treba prikazati v obliki preglednic. Za vsako žival je treba oceniti mitotični indeks, število štetih metafaznih celic, število aberacij na celico v metafazi in odstotek celic s strukturnimi kromosomskimi aberacijami. Različne vrste strukturnih kromosomskih aberacij je treba navesti skupaj z njihovimi števili in pogostostjo za tretirane in kontrolne skupine. Vrzeli ter poliploidne celice in celice z endoredupliciranimi kromosomi je treba zabeležiti ločeno. O pogostosti vrzeli se poroča, vendar se tega običajno ne vključi v analizo celotne pogostosti strukturnih aberacij. Če ni dokaza o razliki v odzivu med spoloma, se lahko pri statistični analizi podatki za oba spola združijo. Sporočiti je treba tudi podatke o toksičnosti za živali in klinične znake.

Merila za sprejemljivost

Sprejemljivost preskusa je določena z naslednjimi merili:

Vrednotenje in razlaga rezultatov

Pod pogojem, da so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno pozitivno, če:

Če se pri določenem času vzorčenja prouči le najvišji odmerek, se preskusna kemikalija šteje kot jasno pozitivna, če obstaja statistično značilno povečanje v primerjavi s sočasno negativno kontrolo in so rezultati zunaj porazdelitve podatkov o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (npr. 95-odstotna kontrolna meja, ki temelji na Poissonovi porazdelitvi). Priporočila glede najustreznejših statističnih metod so navedena v virih (13). Pri analizi razmerja med odmerkom in odzivom je treba analizirati vsaj tri tretirane skupine, ki prejemajo odmerke. V statističnih preskusih se kot poskusna enota uporabi žival. Pozitivni rezultati preskusa kromosomskih aberacij kažejo, da preskusna kemikalija povzroči nastanek strukturnih kromosomskih aberacij v kostnem mozgu preskušane vrste.

Pod pogojem, da so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno negativno, če se v katerem koli od proučevanih preskusnih pogojev:

Priporočila glede najustreznejših statističnih metod so navedena v virih (13). Dokazi o izpostavljenosti kostnega mozga preskusni kemikaliji lahko vključujejo zmanjšanje mitotičnega indeksa ali meritve ravni preskusnih kemikalij v plazmi ali krvi. Pri intravenoznem dajanju dokaz o izpostavljenosti ni potreben. Druga možnost za dokaz izpostavljenosti kostnega mozga je uporaba podatkov ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion – absorpcija, porazdelitev, metabolizem in izločanje), pridobljenih v neodvisni študiji, ki je bila opravljena z enakim načinom izpostavljenosti in istimi vrstami. Negativni rezultati pomenijo, da preskusna kemikalija pri preskusnih pogojih ne povzroča strukturnih kromosomskih aberacij v kostnem mozgu preskušane vrste.

Preverjanje jasno pozitivnega ali jasno negativnega odziva ni potrebno.

V primerih, ko odziv ni jasno negativen ali pozitiven, in za pomoč pri opredelitvi biološke pomembnosti rezultatov (npr. šibko ali mejno povečanje), je treba podatke oceniti s strokovno presojo in/ali nadaljnjimi preiskavami zaključenih obstoječih poskusov. V nekaterih primerih je koristno, če se analizira več celic ali poskus ponovi s spremenjenimi preskusnimi pogoji.

Podatki v redkih primerih celo po izvedbi nadaljnjih preiskav ne omogočajo sklepa o tem, ali preskusna kemikalija povzroča pozitivne ali negativne rezultate, zato se zaključi, da je odziv dvoumen.

Pogostost poliploidnih in endoredupliciranih metafaz med skupnim številom metafaz je treba zabeležiti posebej. Povečanje števila poliploidnih/endoredupliciranih celic kaže na to, da ima preskusna kemikalija potencial za zaviranje mitotičnih procesov ali poteka celičnega cikla (glej odstavek 3).

Poročilo o preskusu

V poročilo o preskusu se vključijo naslednji podatki:

Povzetek

VIRI

(5)

Poglavje B.12 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.12   Preskus mikronukleusov v eritrocitih sesalcev

UVOD

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD 474 (2016). Je del sklopa preskusnih metod o genetski toksikologiji. Pripravljen je dokument OECD, ki zagotavlja jedrnate informacije o preskušanju v zvezi z genetsko tokskikologijo in pregled nedavnih sprememb teh preskusnih smernic (1).

Preskus mikronukleusov in vivo pri sesalcih je posebej primeren za ocenjevanje genotoksičnosti, saj so pri tem aktivni dejavniki metabolizma in vivo, farmakokinetike in procesi popravljanja DNK, ki prispevajo k odzivom, čeprav se lahko med posameznimi vrstami razlikujejo. Preskus in vivo je uporaben tudi za nadaljnjo preiskavo genotoksičnosti, odkrite s sistemom in vitro.

Preskus mikronukleusov in vivo pri sesalcih se uporablja za odkrivanje škode, ki jo preskusna kemikalija povzroči na kromosomih ali mitotičnem aparatu eritroblastov. Pri preskusu se ocenjuje nastajanje mikronukleusov v eritrocitih, vzorčenih v kostnem mozgu ali celicah periferne krvi živali, običajno glodalcev.

Namen preskusa mikronukleusov je opredeliti kemikalije, ki povzročajo citogenetske poškodbe, zaradi katerih nastanejo mikronukleusi, ki vsebujejo zaostale fragmente kromosomov ali cele kromosome.

Kadar se eritroblast kostnega mozga razvije v nezrel eritrocit (ki se včasih imenuje tudi polikromatski eritrocit ali retikulocit), se jedro izvrže; vsak nastali mikronukleus lahko ostane v citoplazmi. V teh celicah je lažje videti ali odkriti mikronukleuse, saj nimajo jedra. Povečanje pogostosti nezrelih eritrocitov z mikronukleusi pri tretiranih živalih je znak nastanka strukturnih ali numeričnih kromosomskih aberacij.

Novo nastali eritrociti z mikronukleusi se opredelijo in količinsko določijo z barvanjem, čemur sledi bodisi vizualno štetje z mikroskopom bodisi z avtomatizirano analizo. Štetje zadostnega števila nezrelih eritrocitov v periferni krvi ali kostnem mozgu odraslih živali se precej olajša z uporabo avtomatizirane platforme za štetje. Take platforme so sprejemljive alternative ročnemu ocenjevanju (2). Iz primerjalnih študij je razvidno, da lahko take metode, pri katerih so uporabljeni ustrezni kalibracijski standardi, zagotovijo boljšo ponovljivost in občutljivost v enem in več laboratorijih kot ročno štetje pod mikroskopom (3) (4). Avtomatizirani sistemi, s katerimi se lahko izmeri pogostost eritrocitov z mikronukleusi, vključujejo, niso pa omejeni na pretočne citometre (5), platforme za analizo slike (6) (7) in laserske vrstične citometre (8).

Čeprav se to običajno ne izvaja kot del preskusa, se lahko fragmenti kromosomov od celih kromosomov razlikujejo po številnih merilih. Mednje je vključena opredelitev prisotnosti ali odsotnosti kinetohora ali centromerne DNK, kar je oboje lastnost nepoškodovanih kromosomov. Če kinetohor ali centromerna DNK nista prisotna, to pomeni, da mikronukleusi vsebujejo samo fragmente kromosomov, če pa eden od njiju je, to označuje izgubo kromosomov.

Opredelitve ključnih pojmov so navedene v Dodatku 1.

ZAČETNI PREUDARKI

Ciljno tkivo za genetske poškodbe v tem preskusu je kostni mozeg mladih odraslih glodalcev, saj v tem tkivu nastajajo eritrociti. Sprejemljive so tudi meritve mikronukleusov v nezrelih eritrocitih periferne krvi pri drugih sesalcih, za katere je bila dokazana ustrezna občutljivost za odkrivanje kemikalij, ki v teh celicah povzročajo strukturne in numerične kromosomske aberacije (z nastajanjem mikronukleusov v nezrelih eritrocitih), in podana znanstvena utemeljitev. Glavna končna točka je pogostost nezrelih eritrocitov z mikronukleusi. Kot končna točka pri vrstah brez močne vranične selekcije proti celicam z mikronukleusi in v primeru, ko se živali tretirajo nepretrgano v obdobju, ki presega življenjsko dobo eritrocita v uporabljenih vrstah (npr. 4 tedne ali več za miš), se lahko uporabi tudi pogostost zrelih eritrocitov periferne krvi, ki vsebujejo mikronukleuse.

Če obstajajo dokazi, da preskusne kemikalije ali njihovi metaboliti ne bodo dosegli ciljnega tkiva, ta preskus morda ni primeren.

Pred uporabo te preskusne metode za preskušanje zmesi in pridobivanje podatkov za predvideni regulativni namen bi bilo treba proučiti, ali bo zagotovila sprejemljive rezultate za navedeni namen in, če jih bo, zakaj. Kadar obstaja regulativna zahteva za preskušanje zmesi, taki preudarki niso potrebni.

NAČELO PRESKUSNE METODE

Živali se primerno izpostavijo preskusni kemikaliji. Če se uporabi kostni mozeg, se živali ob primernem času po tretiranju humano evtanazirajo, nato se ekstrahira kostni mozeg ter naredijo in obarvajo preparati (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Če se uporabi periferna kri, se ta odvzame ob primernem času po tretiranju, nato se pripravijo in obarvajo preparati (12) (16) (17) (18). Pri akutnem dajanju odmerka je pomembno izbrati kostni mozeg ali čas odvzema krvi, pri katerem se lahko odkrije nastanek s tretiranjem povezanih nezrelih eritrocitov z mikronukleusi. V primeru vzorčenja periferne krvi mora preteči dovolj časa, da se ti dogodki pojavijo tudi v krvnem obtoku. Preparati se analizirajo, da se določi prisotnost mikronukleusov, in sicer z vizualizacijo z mikroskopom, analizo slike, pretočnim citometrom ali laserskim vrstičnim citometrom.

PREVERJANJE USPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA

Preverjanje usposobljenosti

Preden se začne laboratorij uporabljati za rutinsko preskušanje, mora dokazati, da je sposoben ponoviti pričakovane rezultate iz objavljenih podatkov (17) (19) (20) (21) (22) za pogostost mikronukleusov z vsaj dvema kemikalijama pozitivne kontrole (vključno z blagimi odzivi, ki jih povzročijo majhni odmerki v pozitivnih kontrolah), kot so tiste iz preglednice, 1 in z združljivimi kontrolami z vehiklom/topilom (glej odstavek 26); s tem laboratorij tudi dokaže, da ima zadostne izkušnje z izvajanjem preskusa. Pri teh poskusih je treba uporabiti odmerke, pri katerih se omogočajo ponovljiva in z odmerkom povezana povečanja ter se pokažeta občutljivost in dinamično območje preskusnega sistema v zadevnem tkivu (kostni mozeg ali periferna kri) in uporabi metoda štetja, ki jo je treba uporabljati v laboratoriju. To ne velja za laboratorije, ki imajo izkušnje, tj. ki imajo na voljo zbirko podatkov iz preteklih preskusov, kot je opredeljeno v odstavkih 14 do 18.

Podatki o kontrolah iz preteklih preskusov

Med preverjanjem usposobljenosti mora laboratorij določiti:

Ko se podatki o porazdelitvi negativnih kontrol iz preteklih preskusov pridobivajo prvič, morajo biti sočasne negativne kontrole skladne z objavljenimi podatki o kontrolah, če ti obstajajo. Ko se k porazdelitvi kontrol iz preteklih preskusov dodaja več podatkov o preskusu, sočasne negativne kontrole po možnosti ne bi smele preseči 95-odstotne kontrolne meje za navedeno porazdelitev. Zbirka podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov mora biti statistično zanesljiva, s čimer se zagotovi, da je laboratorij sposoben oceniti porazdelitev svojih podatkov o negativnih kontrolah. Iz virov je razvidno, da je potrebnih vsaj 10 preskusov, po možnosti pa mora biti zbirka sestavljena iz vsaj 20 preskusov, izvedenih v primerljivih preskusnih pogojih. Laboratoriji morajo uporabljati metode nadzora kakovosti, kot so kontrolne karte (npr. c-karte ali „X-črta“ karte (23)), da opredelijo, kako variabilni so njihovi podatki, in pokažejo, da je metodologija v njihovem laboratoriju „pod nadzorom“. Nadaljnja priporočila o načinu oblikovanja in uporabe podatkov iz preteklih preskusov (tj. merila za vključitev podatkov med podatke iz preteklih preskusov in njihovo izključitev iz teh podatkov ter merila za sprejemljivost za zadevni poskus) so navedena v virih (24).

Kadar laboratorij med preverjanjem usposobljenosti (opisanim v odstavku 13) ne izvede zadostnega števila preskusov za določitev statistično zanesljive porazdelitve negativnih kontrol (glej odstavek 15), je sprejemljivo, da se lahko porazdelitev razvije med prvimi rutinskimi preskusi. Pri tem pristopu je treba upoštevati priporočila, navedena v virih (24), rezultati negativnih kontrol, pridobljeni pri teh poskusih, pa morajo ostati skladni z objavljenimi podatki o negativnih kontrolah.

Vsako spremembo v protokolu poskusa je treba proučiti glede na vpliv, ki ga ima na to, da pridobljeni podatki ostanejo skladni z obstoječo zbirko podatkov laboratorija o kontrolah iz preteklih preskusov. Novo zbirko podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov je treba ustvariti le v primeru večjih neskladnosti, kadar se s strokovno presojo oceni, da se razlikuje od prejšnje porazdelitve (glej odstavek 15). Ko se zbirka podatkov ustvarja na novo, za izvedbo dejanskega preskusa ni potrebna celotna zbirka podatkov o negativnih kontrolah, če lahko laboratorij dokaže, da vrednosti njegovih sočasnih negativnih kontrol ostajajo skladne s prejšnjo zbirko podatkov ali z ustreznimi objavljenimi podatki.

V podatke o negativnih kontrolah je treba vključiti pojav nezrelih eritrocitov z mikronukleusi za vsako žival. Sočasne negativne kontrole po možnosti ne smejo preseči 95-odstotne kontrolne meje porazdelitve iz zbirke podatkov laboratorija o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov. Kadar podatki o sočasni negativni kontroli presežejo 95-odstotno kontrolno mejo, jih je sprejemljivo vključiti v porazdelitev kontrole iz preteklih preskusov, če ti podatki niso izjemni osamelci ter če obstaja dokaz, da je preskusni sistem „pod nadzorom“ (glej odstavek 15), in dokaz o odsotnosti tehničnih ali človeških napak.

OPIS METODE

Priprave

Izbira živalske vrste

Uporabiti je treba splošno uporabljane laboratorijske seve mladih zdravih odraslih živali. Uporabijo se lahko miši, podgane ali druge ustrezne vrste sesalcev. Če se uporablja periferna kri, je treba zagotoviti, da odstranjevanje vraničnih celic z mikronukleusi iz krvnega obtoka ne vpliva na odkrivanje nastalih mikronukleusov pri izbranih vrstah. To je bilo jasno prikazano za periferno kri pri miših in podganah (2). V poročilu je treba znanstveno utemeljiti uporabo drugih vrst glodalcev, ki niso podgane in miši. Če se ne uporabljajo glodalci, temveč druge vrste, je priporočljivo, da se merjenje nastalih mikronukleusov vključi v drug ustrezen preskus toksičnosti.

Pogoji nastanitve in hranjenja živali

Pri glodalcih mora biti temperatura v prostoru s poskusnimi živalmi 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 40-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, si je treba prizadevati za 50–60-odstotno vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne mešanice preskusne kemikalije, kadar se daje na ta način. Glodalce je treba nastaniti v majhnih skupinah (ne več kot pet na kletko), tako da so razporejeni glede na spol in tretirano skupino, če ni pričakovati agresivnega vedenja, in sicer po možnosti v kletke s trdimi tlemi z ustrezno okoljsko obogatitvijo. Živali so lahko nastanjene posamično le, če je to znanstveno utemeljeno.

Priprava živali

Običajno se uporabljajo zdrave mlade živali (kar pri glodalcih pomeni, da so ob začetku tretiranja stare po možnosti od 6 do 10 tednov, čeprav so sprejemljive tudi nekoliko starejše živali), ki se naključno razporedijo v kontrolno in tretirano skupino. Posamezne živali se označijo z edinstvenimi oznakami s humano, čim manj invazivno metodo (npr. z namestitvijo obročkov ali trakov, z vsaditvijo mikročipa ali biometrično identifikacijo, ne pa z zarezovanjem ušesa ali prsta) ter se vsaj pet dni prilagajajo laboratorijskim pogojem. Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Izogibati se je treba navzkrižni kontaminaciji s pozitivno kontrolo in preskusno kemikalijo. Ob začetku študije mora biti razlika med težami živali čim manjša in ne sme presegati ± 20 % srednje vrednosti teže za vsak spol.

Priprava odmerkov

Trdne preskusne kemikalije je treba raztopiti ali suspendirati v ustreznih topilih ali vehiklih ali primešati hrani ali pitni vodi, preden se odmerijo živalim. Tekoče preskusne kemikalije se lahko odmerijo neposredno ali pa se pred odmerjanjem razredčijo. Pri izpostavljenosti z vdihavanjem se lahko preskusne kemikalije dajejo v obliki plina, pare ali trdnega/tekočega aerosola, in sicer odvisno od njihovih fizikalno-kemijskih lastnosti. Uporabiti je treba sveže pripravljene preskusne kemikalije, razen če je iz podatkov o stabilnosti razvidno, da je shranjevanje sprejemljivo, in so v njih opredeljeni ustrezni pogoji shranjevanja.

Preskusni pogoji

Topilo/vehikel

Topilo/vehikel ne sme imeti toksičnih učinkov pri uporabljenih odmerkih in ne sme biti sposoben kemično reagirati s preskusnimi kemikalijami. Če se uporabijo druga, manj znana topila/vehikli, je treba njihovo uporabo podpreti z referenčnimi podatki, ki dokazujejo njihovo združljivost. Priporočljivo je, da se, kadar koli je to mogoče, najprej razmisli o uporabi vodnega topila/vehikla. Primeri pogosto uporabljenih, združljivih topil/vehiklov so voda, fiziološka raztopina, raztopina metilceluloze, raztopina natrijeve soli karboksimetil celuloze, oljčno olje ali koruzno olje. Če ni podatkov iz preteklih preskusov ali objavljenih podatkov, iz katerih bi bilo razvidno, da izbrano neobičajno topilo/vehikel ne povzroča nastanka mikronukleusov ali drugih škodljivih učinkov, je treba izvesti začetno študijo, da se dokaže sprejemljivost kontrol s topilom/vehiklom.

Kontrole

Pozitivne kontrole

V vsak preskus je treba običajno vključiti skupino živali, tretiranih s kemikalijo za pozitivno kontrolo. To se lahko odpravi, ko preskusni laboratorij dokaže svojo usposobljenost za izvajanje preskusov in določi območje pozitivnih kontrol iz preteklih preskusov. Če sočasna pozitivna kontrolna skupina ni vključena, je treba v vsak poskus vključiti kontrole za štetje (fiksirane in nebarvane mikroskopske preparate ali vzorce celične suspenzije, kar je ustrezno za metodo štetja). Ti se lahko pridobijo tako, da se pri študiji v štetje vključijo ustrezni referenčni vzorci, pridobljeni in shranjeni v okviru ločenega poskusa s pozitivnimi kontrolami, ki se redno izvaja (npr. vsakih 6 do 18 mesecev); na primer med preverjanjem usposobljenosti in po tem redno, če je to potrebno.

Kemikalije za pozitivno kontrolo morajo zanesljivo povzročiti zaznavno spontano povečanje pogostosti mikronukleusov. Pri ročnem štetju z mikroskopijo je treba odmerke pozitivnih kontrol izbrati tako, da so učinki jasni, vendar osebi, ki ugotovitve beleži, ne razkrijejo takoj identitete označenih mikroskopskih preparatov. Sprejemljivo je, da se odmerki v pozitivno kontrolo dajejo na način, ki ni enak kot pri preskusni kemikaliji, in da se pri tem uporabi drugačen časovni razpored tretiranja ter se vzorčenje opravi le enkrat. Poleg tega se lahko, če je ustrezno, za pozitivno kontrolo uporabijo kemikalije, ki spadajo v isto skupino nevarnosti kot preskusna kemikalija. Primeri kemikalij za pozitivno kontrolo so navedeni v preglednici 1.

Preglednica 1

Primeri kemikalij za pozitivno kontrolo

Kemikalije in št. CAS

etil metansulfonat [št. CAS: 62-50-0]

metil metansulfonat [št. CAS: 66-27-3]

etilnitrozourea [št. CAS: 759-73-9]

mitomicin C [št. CAS: 50-07-7]

ciklofosfamid (monohidrat) [št. CAS: 50-18-0 (št. CAS: 6055-19-2)]

trietilenmelamin [št. CAS: 51-18-3]

kolhicin [št. CAS: 64-86-8] ali vinblastin [št. CAS: 865-21-4] – kot anevgena

Negativne kontrole

V vsak čas vzorčenja je treba vključiti negativno kontrolno skupino živali, ki jo je treba sicer obravnavati enako kot tretirane skupine, vendar se je ne sme tretirati s preskusno kemikalijo. Če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja topilo/vehikel, ga mora prejeti tudi kontrolna skupina. Toda če sta iz podatkov o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov pri vsakem času vzorčenja za preskusni laboratorij razvidni konsistentna variabilnost med posameznimi živalmi in pogostost celic z mikronukleusi, potem za negativno kontrolo zadostuje le eno samo vzorčenje. Če se za negativne kontrole uporablja eno samo vzorčenje, mora biti to prvi čas vzorčenja, uporabljen v študiji.

Če se uporablja periferna kri, je namesto sočasne negativne kontrole sprejemljiv vzorec, vzet pred tretiranjem, kadar so podatki, ki iz tega izhajajo, skladni z zbirko podatkov o kontrolah iz preteklih preskusov za preskusni laboratorij. Za podgane se je pokazalo, da ima vzorčenje majhnih količin (npr. pod 100 μl na dan) pred tretiranjem minimalen učinek na pogostost mikronukleusov v ozadju (25).

POSTOPEK

Število in spol živali

Na splošno je odziv mikronukleusov pri živalih moškega in ženskega spola podoben, zato se lahko študije izvajajo na živalih enega ali drugega spola (26). Če se pri podatkih pokažejo pomembne razlike med moškim in ženskim spolom (npr. razlike v sistemski toksičnosti, metabolizmu, biološki razpoložljivosti, toksičnosti za kostni mozeg itd., vključno na primer v študiji za ugotavljanje območja), je treba spodbujati uporabo obeh spolov. V takem primeru je študijo primerno izvajati na živalih obeh spolov, npr. kot del toksikološke študije s ponavljajočim odmerkom. V primeru uporabe obeh spolov je primerno uporabiti zasnovo preskusa z več dejavniki. Podrobnosti o tem, kako analizirati podatke z uporabo te zasnove, so navedene v Dodatku 2.

Ob začetku študije je treba določiti skupine, v katerih je vsaj 5 živali enega spola ali vsakega od spolov, če se uporabljata oba, ki jih je mogoče analizirati, na skupino. Kadar bi bila lahko izpostavljenost ljudi kemikalijam omejena na en spol, na primer pri nekaterih farmacevtskih izdelkih, je treba preskus opraviti na živalih ustreznega spola. Praviloma je za študijo kostnega mozga, izvedeno v skladu s parametri iz odstavka 37 s tremi skupinami, ki prejemajo odmerke, ter sočasno negativno in pozitivno kontrolo (pri čemer je vsaka skupina sestavljena iz vsaj petih živali enega spola), potrebnih od 25 do 35 živali.

Velikost odmerkov

Če se izvede predhodna študija za določanje območja, ker ustrezni podatki, ki bi bili v pomoč pri izbiri odmerkov, niso na voljo, jo je treba izvesti v istem laboratoriju ter pri tem uporabiti iste vrste, sev, spol in režim tretiranja kot v glavni študiji (27). S študijo je treba določiti največji tolerančni odmerek (MTD), ki je opredeljen kot največji odmerek, ki ga je mogoče prenesti, ne da bi se pri tem pokazala toksičnost, ki bi v povezavi z obdobjem trajanja študije slednjo omejevala (na primer s povzročitvijo upočasnitve pridobivanja telesne teže ali citotoksičnosti za hematopoetski sistem, ne pa smrti ali znakov bolečine ali trpljenja, zaradi katerih je potrebna humana evtanazija (28)).

Največji odmerek se lahko opredeli tudi kot odmerek, ki povzroči toksičnost za kostni mozeg (npr. zmanjšanje deleža nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti v kostnem mozgu ali periferni krvi za več kot 50 %, vendar ne za manj kot 20 % kontrolne vrednosti). Vendar se pri analiziranju CD71-pozitivnih celic v perifernem krvnem obtoku (npr. s pretočno citometrijo) ta zelo mlada frakcija nezrelih eritrocitov hitreje odziva na toksične učinke kot večja RNK-pozitivna kohorta nezrelih eritrocitov. Zato je lahko pri proučevanju frakcije CD71-pozitivnih nezrelih eritrocitov z zasnovami akutne izpostavljenosti vidna višja očitna toksičnost v primerjavi s tistimi, pri katerih se nezreli eritrociti opredelijo na podlagi vsebnosti RNK. Kadar tretiranje pri poskusih traja pet dni ali manj, se zato lahko najvišja velikost odmerka preskusnih kemikalij, ki povzroča toksičnost, opredeli kot odmerek, ki povzroča statistično značilno zmanjšanje deleža CD71-pozitivnih nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti, vendar ne na manj kot 5 % vrednosti v kontroli (29).

Kemikalije, ki kažejo nasičenost toksikokinetičnih lastnosti ali povzročajo procese razstrupljanja, zaradi katerih se lahko po dolgotrajnem tretiranju zmanjša izpostavljenost, so lahko izjeme pri merilih za določanje odmerkov in jih je treba oceniti za vsak primer posebej.

Da se pridobijo informacije o odzivu na odmerek, je treba v popolno študijo vključiti skupino negativne kontrole in vsaj tri velikosti odmerkov, ki so običajno ločeni s faktorjem 2, vendar ne več kot 4. Če preskusna kemikalija v študiji za ugotavljanje območja ali na podlagi obstoječih podatkov ne povzroča toksičnosti, je največji odmerek za 14- ali večdnevno obdobje dajanja kemikalije 1 000 mg/kg telesne teže na dan, za manj kot 14-dnevno obdobje dajanja kemikalije pa 2 000 mg/kg telesne teže na dan. Če pa preskusna kemikalija povzroča toksičnost, mora biti največji tolerančni odmerek najvišji dani odmerek, v uporabljene velikosti odmerkov pa je treba po možnosti zajeti razpon od največjega odmerka do odmerka, ki povzroča malo ali nič toksičnosti. Kadar se toksičnost za ciljno tkivo (kostni mozeg) opazi pri vseh preskušanih velikostih odmerkov, je priporočljiva dodatna študija pri netoksičnih odmerkih. Pri študijah, namenjenih celovitejši opredelitvi kvantitativnih informacij o razmerju med odmerkom in odzivom, so morda potrebne dodatne skupine, ki prejemajo odmerke. Za določene vrste preskusnih kemikalij (npr. zdravila za uporabo v humani medicini), za katere veljajo posebne zahteve, se lahko te meje razlikujejo.

Mejni preskus

Če poskusi za ugotavljanje območja odmerka ali obstoječi podatki iz povezanih živalskih sevov kažejo, da režim tretiranja z vsaj mejnim odmerkom (opisan v nadaljevanju) ne povzroči vidnih toksičnih učinkov (tudi brez upočasnitve proliferacije kostnega mozga ali drugih dokazov o citotoksičnosti za ciljno tkivo), ter če genotoksičnost na podlagi in vitro študij genotoksičnosti ali podatkov o strukturno sorodnih kemikalijah ni pričakovana, ni potrebna popolna študija z uporabo treh velikosti odmerkov, če se dokaže, da preskusne kemikalije dosežejo ciljno tkivo (kostni mozeg). V takih primerih morda zadostuje že ena velikost odmerka pri mejnem odmerku. Kadar se kemikalija daje 14 dni ali več, je mejni odmerek 1 000 mg/kg telesne teže na dan. Pri obdobju odmerjanja, krajšem od 14 dni, je mejni odmerek 2 000 mg/kg telesne teže na dan.

Dajanje odmerkov

Pri načrtovanju preskusa je treba upoštevati predvideni način izpostavljenosti pri ljudeh. Zato se lahko ob ustrezni utemeljitvi izberejo načini izpostavljenosti, kot so s prehrano, pitno vodo, topično podkožno, intravenozno, oralno (z gavažo), z vdihavanjem, intratrahealno ali z vsadkom. V vsakem primeru je treba način izpostavljenosti izbrati tako, da se zagotovi ustrezna izpostavljenost ciljnih tkiv. Dajanje z intraperitonealno injekcijo v splošnem ni priporočljivo, saj to ni predvideni način izpostavljenosti pri ljudeh, in se lahko uporabi samo na podlagi posebne znanstvene utemeljitve. Če je preskusna kemikalija primešana hrani ali pitni vodi, zlasti v primeru enega samega odmerka, je treba paziti, da med zaužitjem hrane in vode ter vzorčenjem preteče dovolj časa, da se lahko odkrijejo učinki (glej odstavek 37). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat z gavažo ali injekcijo, je odvisna od velikosti poskusne živali. Količina običajno ne sme presegati 1 ml na 100 g telesne teže, razen pri vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi največ 2 ml na 100 g telesne teže. Uporabo večjih količin je treba utemeljiti. Razen pri dražilnih ali jedkih preskusnih kemikalijah, ki pri višjih koncentracijah običajno povzročajo močnejše učinke, je treba variabilnost preskusne količine s prilagajanjem koncentracije obdržati na čim nižji ravni, da se zagotovi konstanten volumen glede na telesno težo pri vseh odmerkih.

Časovni razpored tretiranja

Po možnosti se izvedeta 2 tretiranji ali več s preskusno kemikalijo, ki se daje v 24-urnih intervalih, zlasti kadar je ta preskus vključen v druge študije toksičnosti. Druga možnost je dajanje posamičnih odmerkov, če je to znanstveno utemeljeno (npr. če je za preskusne kemikalije znano, da zavirajo celični cikel). Preskusne kemikalije se lahko dajejo tudi v razdeljenem odmerku, kar pomeni dva ali več odmerkov v istem dnevu na največ 2 do 3 ure, s čimer se olajša dajanje velike količine kemikalije. V teh okoliščinah ali v primeru dajanja preskusne kemikalije z vdihavanjem je treba čas vzorčenja načrtovati glede na čas zadnjega odmerka ali konca izpostavljenosti.

Preskus na miših ali podganah se lahko izvede na enega od naslednjih treh načinov:

Uporabljajo se lahko tudi drugi režimi odmerjanja in vzorčenja, če so ustrezni in znanstveno utemeljeni, da se olajša povezovanje z drugimi študijami toksičnosti.

Opazovanja

Vsaj enkrat na dan je treba opraviti splošna klinična opazovanja preskusnih živali in zabeležiti klinične znake, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka. Vse živali je treba med obdobjem odmerjanja vsaj dvakrat na dan opazovati za odkrivanje obolevnosti in smrtnosti. Vse živali je treba stehtati ob začetku študije, vsaj enkrat na teden med študijami s ponavljajočimi se odmerki in ob evtanaziji. V študijah, ki trajajo en teden ali več, je treba vsaj enkrat na teden izmeriti porabo hrane. Če se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba izmeriti porabo vode ob vsaki menjavi vode in vsaj tedensko. Živali, ki kažejo neletalne znake čezmerne toksičnosti, je treba humano evtanazirati pred koncem preskusnega obdobja (28). Pod določenimi pogoji se lahko spremlja telesna temperatura živali, saj sta v nastajanje napačnih rezultatov vključeni hiper- in hipotermija, ki ju povzroči tretiranje (32) (33) (34).

Izpostavljenost ciljnega tkiva

Ob ustreznih časih je treba odvzeti vzorec krvi, da se lahko preišče raven preskusnih kemikalij v plazmi, s čimer se dokaže, da je prišlo do izpostavljenosti kostnega mozga, če je to utemeljeno in če ne obstajajo drugi podatki o izpostavljenosti (glej odstavek 48).

Priprava kostnega mozga/krvi

Takoj po humani evtanaziji se celice kostnega mozga običajno pridobijo iz stegnenic ali golenic živali. Celice se običajno odstranijo, preparirajo in obarvajo z uporabo uveljavljenih metod. Majhne količine periferne krvi se lahko v skladu z ustreznimi standardi dobrobiti živali pridobijo z metodo, ki omogoča preživetje poskusne živali, kot je s puščanjem krvi iz repne vene ali druge primerne žile, ali pa s punkcijo srca ali vzorčenjem iz velike žile pri evtanaziji živali. Pri kostnem mozgu ali eritrocitih iz periferne krvi se lahko celice glede na metodo analize takoj supravitalno obarvajo (16) (17) (18) ali pa se pripravijo razmazi, ki se nato obarvajo za mikroskopijo ali fiksirajo in ustrezno obarvajo za analizo s pretočnim citometrom. Uporaba DNK-specifičnega barvila [npr. akridin oranž (35) ali Hoechst 33258 plus pyronin-Y (36)] lahko prepreči nastajanje nekaterih artefaktov, povezanih z uporabo barvila, ki ni DNK-specifično. Kljub tej prednosti pa se lahko uporabijo običajna barvila (npr. Giemsa za mikroskopsko analizo). Lahko se uporabijo tudi dodatni sistemi [npr. celulozne kolone za odstranitev celic z jedri (37) (38)], če je bilo dokazano, da so ti sistemi združljivi s pripravo vzorcev v laboratoriju.

Če se uporabljajo te metode, se lahko za opredelitev narave mikronukleusov (kromosom/fragment kromosoma) uporabijo antikinetohorna protitelesa (39), fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) s pancentromernimi DNK-sondami (40) ali označevanje začetnih oligonukleotidov in situ s premazi, specifičnimi za centromere, skupaj z ustreznim nasprotnim barvanjem DNK (41), zato da se določi, ali mehanizem nastajanja mikronukleusov povzroča klastogena in/ali anevgena dejavnost. Za razlikovanje med anevgeni in klastogeni se lahko uporabijo druge metode, če so se izkazale za učinkovite.

Analiza (ročna in avtomatizirana)

Vse mikroskopske preparate ali vzorce, vključno s tistimi s pozitivnimi in negativnimi kontrolami, je treba pred analizo neodvisno označiti in naključno razdeliti, tako da oseba, ki beleži ugotovitve, ne pozna pogojev tretiranja; če se uporablja avtomatiziran sistem štetja, ki se ne opira na vizualne preglede in nanj izvajalec ne more vplivati, tako označevanje ni potrebno. Za vsako žival se določi delež nezrelih eritrocitov med vsemi (nezrelimi + zrelimi) eritrociti, tako da se prešteje skupno vsaj 500 eritrocitov pri kostnem mozgu in 2 000 eritrocitov pri periferni krvi (42). V določanje pojavnosti nezrelih eritrocitov z mikronukleusi je treba vključiti vsaj 4 000 nezrelih eritrocitov na žival (43). Če je v zbirki podatkov o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov v preskusnem laboratoriju srednja vrednost pogostosti nezrelih eritrocitov z mikronukleusi v ozadju < 0,1 %, je treba razmisliti o štetju dodatnih celic. Pri analiziranju vzorcev delež nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti v tretiranih živalih pri štetju z mikroskopijo ne sme biti nižji od 20 % deleža v kontroli z vehiklom/topilom, pri štetju CD71-pozitivnih nezrelih eritrocitov s citometričnimi metodami pa nižji od približno 5 % deleža v kontroli z vehiklom/topilom (glej odstavek 31) (29). Če je na primer pri preskusu kostnega mozga pri štetju z mikroskopijo kontrolni delež nezrelih eritrocitov v kostnem mozgu 50 %, je zgornja meja toksičnosti enaka 10 % nezrelih eritrocitov.

Ker vranica podgane zadrži in uniči eritrocite z mikronukleusi, je za vzdrževanje visoke občutljivosti poskusa pri analiziranju periferne krvi podgane analizo nezrelih eritrocitov z mikronukleusi bolje omejiti na najmlajšo frakcijo. Pri metodah za avtomatizirano analizo je mogoče te najbolj nezrele eritrocite opredeliti na podlagi njihove visoke vsebnosti RNK ali visoke ravni receptorjev transferina (CD71-pozitivni), izraženih na njihovi površini (31). Vendar je neposredna primerjava različnih metod obarvanja pokazala, da je zadovoljive rezultate mogoče dobiti z različnimi metodami, vključno z običajnim barvanjem z barvilom akridin oranž (3) (4).

PODATKI IN POROČANJE

Obdelava rezultatov

Podatke za posamezne živali je treba prikazati v obliki preglednic. Za vsako analizirano žival posebej je treba navesti število štetih nezrelih eritrocitov, število nezrelih eritrocitov z mikronukleusi in število nezrelih eritrocitov med vsemi eritrociti. Kadar se miši tretirajo neprekinjeno 4 tedne ali več, je treba navesti tudi podatke o številu in deležu zrelih eritrocitov z mikronukleusi, če so zbrani. Sporočiti je treba tudi podatke o toksičnosti za živali in klinične znake.

Merila za sprejemljivost

Sprejemljivost preskusa je določena z naslednjimi merili:

Vrednotenje in razlaga rezultatov

Pod pogojem, da so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno pozitivno, če:

Če se pri določenem času vzorčenja prouči le najvišji odmerek, se preskusna kemikalija šteje kot jasno pozitivna, če obstaja statistično značilno povečanje v primerjavi s sočasno negativno kontrolo in so rezultati zunaj porazdelitve podatkov o negativnih kontrolah iz preteklih preskusov (npr. 95-odstotna kontrolna meja, ki temelji na Poissonovi porazdelitvi). Priporočila glede najustreznejših statističnih metod so navedena v virih (44) (45) (46) (47). Pri analizi razmerja med odmerkom in odzivom je treba analizirati vsaj tri tretirane skupine, ki prejemajo odmerke. V statističnih preskusih se kot poskusna enota uporabi žival. Pozitivni rezultati pri preskusu mikronukleusov kažejo, da preskusna kemikalija povzroča nastanek mikronukleusov, ki so posledica poškodb kromosomov ali mitotičnega aparata v eritroblastih preskušane vrste. Če je preskus izveden za odkrivanje centromer v mikronukleusih, je preskusna kemikalija, ki povzroča nastanek mikronukleusov s centromerami (centromerne DNK ali kinetohora, ki so znak izgube celih kromosomov), dokaz, da je preskusna kemikalija anevgen.

Pod pogojem, da so izpolnjena vsa merila za sprejemljivost, se preskusna kemikalija šteje za jasno negativno, če se v katerem koli od proučevanih preskusnih pogojev:

Priporočila glede najustreznejših statističnih metod so navedena v virih (44) (45) (46) (47). Dokazi o izpostavljenosti kostnega mozga preskusni kemikaliji lahko vključujejo zmanjšanje razmerja nezrelih eritrocitov ali meritve ravni preskusne kemikalije v plazmi ali krvi. Pri intravenoznem dajanju dokaz o izpostavljenosti ni potreben. Druga možnost za dokaz izpostavljenosti kostnega mozga je uporaba podatkov ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion – absorpcija, porazdelitev, metabolizem in izločanje), pridobljenih v neodvisni študiji, ki je bila opravljena z enakim načinom izpostavljenosti in istimi vrstami. Negativni rezultati pomenijo, da preskusna kemikalija pri preskusnih pogojih ne povzroča nastanka mikronukleusov v nezrelih eritrocitih preskušane vrste.

Preverjanje jasno pozitivnega ali jasno negativnega odziva ni potrebno.

V primerih, ko odziv ni jasno negativen ali pozitiven, in za pomoč pri opredelitvi biološke pomembnosti rezultatov (npr. šibko ali mejno povečanje), je treba podatke oceniti s strokovno presojo in/ali nadaljnjimi preiskavami zaključenih obstoječih poskusov. V nekaterih primerih je koristno, če se analizira več celic ali poskus ponovi s spremenjenimi preskusnimi pogoji.

Podatki v redkih primerih celo po izvedbi nadaljnjih preiskav ne omogočajo sklepa o tem, ali preskusna kemikalija povzroča pozitivne ali negativne rezultate, zato se zaključi, da je odziv dvoumen.

Poročilo o preskusu

V poročilo o preskusu se vključijo naslednji podatki:

VIRI

(6)

Poglavje B.15 dela B se črta.

(7)

Poglavje B.16 dela B se črta.

(8)

Poglavje B.18 dela B se črta.

(9)

Poglavje B.19 dela B se črta.

(10)

Poglavje B.20 dela B se črta.

(11)

Poglavje B.24 dela B se črta.

(12)

Poglavje B.47 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.47   Preskusna metoda za določanje motnjave in prepustnosti roženice goveda za opredelitev i) kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči, in ii) kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči

UVOD

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 437 (2013). Preskusno metodo za določanje motnjave in prepustnosti roženice goveda (Bovine Corneal Opacity and Permeability – preskusna metoda BCOP) je v letih 2006 in 2010 ocenil Medagencijski koordinacijski odbor za validacijo alternativnih metod (ICCVAM) v sodelovanju z Evropskim centrom za validacijo alternativnih metod (ECVAM) ter Japonskim centrom za validacijo alternativnih metod (JaCVAM) (1) (2). Pri prvem ocenjevanju je bila preskusna metoda BCOP ocenjena glede na svojo uporabnost za opredelitev kemikalij (snovi in zmesi), ki povzročajo hude poškodbe oči (1). Pri drugem ocenjevanju je bila navedena preskusna metoda ocenjena glede na svojo uporabnost za opredelitev kemikalij (snovi in zmesi), ki niso razvrščene glede na draženje oči ali hude poškodbe oči (2). Validacijska zbirka podatkov preskusne metode BCOP je vsebovala skupaj 113 snovi in 100 zmesi (2) (3). Na podlagi obeh ocenjevanj in njunega medsebojnega strokovnega pregleda je bilo ugotovljeno, da se lahko s preskusno metodo pravilno opredelijo kemikalije (snovi in zmesi), ki povzročajo hude poškodbe oči (kategorija 1), ter tiste, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči, kot je opredeljeno v globalno usklajenem sistemu Združenih narodov za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS) (4) ter Uredbi (ES) št. 1272/2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi (CLP) (7), zato je bila za oba namena podprta kot znanstveno veljavna. Huda poškodba oči je povzročitev poškodbe očesnega tkiva ali resne fizične okvare vida po nanosu preskusne kemikalije na sprednjo površino očesa, ki ni v celoti popravljiva v 21 dneh po nanosu. Preskusne kemikalije, ki povzročajo hude poškodbe oči, so razvrščene v kategorijo 1 po sistemu GHS ZN. Kemikalije, ki niso razvrščene glede na draženje oči ali hude poškodbe oči, so opredeljene kot kemikalije, ki ne izpolnjujejo meril za razvrstitev v kategorijo 1 ali 2 (2A ali 2B) po GHS ZN, kar pomeni da se nanje sklicuje kot na kemikalije brez kategorije po GHS ZN. Ta preskusna metoda vključuje priporočeno uporabo in omejitve preskusne metode BCOP, ki temeljijo na njenih ocenah. Najpomembnejše razlike med prvotno različico smernic za preskušanje OECD iz leta 2009 in posodobljeno različico iz leta 2013 se nanašajo, niso pa omejene na: uporabo preskusne metode BCOP za opredelitev kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na sistem GHS ZN (odstavka 2 in 7); pojasnila o uporabnosti preskusne metode BCOP za preskušanje alkoholov, ketonov in trdnih snovi (odstavka 6 in 7) ter snovi in zmesi (odstavek 8): pojasnila o tem, kako je treba preskušati površinsko aktivne snovi in zmesi, ki vsebujejo površinsko aktivne snovi (odstavek 28); najnovejše informacije in pojasnila o pozitivnih kontrolah (odstavka 39 in 40); posodobitev meril za odločanje o preskusni metodi BCOP (odstavek 47); posodobitev meril za sprejemljivost študije (odstavek 48); posodobitev elementov poročila o preskusu (odstavek 49); posodobitev Dodatka 1 o opredelitvah pojmov; vključitev Dodatka 2 o napovedovalni zmogljivosti preskusne metode BCOP v okviru različnih sistemov za razvrščanje; posodobitev Dodatka 3 o seznamu kemikalij za preverjanje usposobljenosti ter posodobitev Dodatka 4 o držalu za roženico pri preskusni metodi BCOP (odstavek 1) ter opacitometru (odstavka 2 in 3).

Zdaj na splošno velja, da Draizovega preskusa draženja oči in vivo v bližnji prihodnosti ne bo mogoče nadomestiti z enim samim preskusom draženja oči in vitro, da bi se predvidel celoten razpon dražilnih učinkov za različne kemijske razrede. Draizov preskus draženja oči pa bi morda lahko nadomestile strateške kombinacije več alternativnih preskusnih metod v okviru (večstopenjske) strategije preskušanja (5). Pristop od zgoraj navzdol (5) je treba uporabiti takrat, ko se na podlagi obstoječih informacij pričakuje, da bo imela kemikalija visok potencial draženja, pristop od spodaj navzgor (5) pa takrat, ko se na podlagi obstoječih informacij pričakuje, da kemikalija ne bo povzročila tolikšnega draženja oči, da bi jo bilo treba razvrstiti. Preskusna metoda BCOP je metoda preskušanja in vitro, ki se lahko pod določenimi pogoji in s posebnimi omejitvami uporabi za razvrstitev glede na nevarnosti za oči in označevanje kemikalij. Čeprav se preskusna metoda BCOP ne obravnava kot veljaven samostojen nadomestek za preskus draženja oči in vivo na kuncih, se vseeno priporoča kot prvi korak preskusne strategije, kot je pristop od zgoraj navzdol, ki ga priporoča Scott idr. (5), za opredelitev kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči, tj. kemikalij, ki jih je treba v kategorijo 1 po GHS ZN razvrstiti brez nadaljnjega preskušanja (4). Ta metoda je priporočljiva tudi za opredelitev kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči, kot je opredeljeno v sistemu GHS ZN (brez kategorije po GHS ZN) (4), v okviru strategije preskušanja, kot je pristop od spodaj navzgor (5). Vendar če se s preskusno metodo BCOP ne predvidi, da kemikalija povzroča hude poškodbe oči ali razvrstitev glede na draženje oči/hude poškodbe oči, bi bilo treba to kemikalijo dodatno preskusiti (in vitro in/ali in vivo), da se določi končna razvrstitev.

V tej preskusni metodi so opisani postopki za oceno potencialne nevarnosti preskusne kemikalije za oči glede na njeno zmožnost, da v izolirani roženici goveda povzroča motnjavo in povečano prepustnost. Toksični učinki na roženico se merijo z: (i) zmanjšanim prenosom svetlobe (motnjava) in (ii) povečanim prehajanjem barvila natrijevega fluoresceina (prepustnost). Oceni motnjave in prepustnosti roženice po izpostavljenosti preskusni kemikaliji se združita, iz tega rezultata pa se nato izpelje stopnja draženja in vitro (IVIS), ki se uporablja za razvrstitev preskusne kemikalije v različne stopnje draženja.

Opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.

ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE

Ta preskusna metoda temelji na protokolu preskusne metode BCOP odbora ICCVAM (6) (7), ki je bil prvotno razvit na podlagi informacij, pridobljenih iz protokola Inštituta za raziskave in vitro (IIVS) in protokola INVITTOX št. 124 (8). Slednji se je uporabil za predvalidacijsko študijo, ki je bila izvedena med letoma 1997–1998 in jo je sponzorirala Evropska skupnost. Oba protokola temeljita na preskusni metodi BCOP, o kateri so prvi poročali Gautheron idr. (9).

Preskusna metoda BCOP se lahko uporabi za opredelitev kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči, kot je opredeljeno v sistemu GHS ZN, tj. kemikalij, ki jih je treba razvrstiti v kategorijo 1 po GHS ZN (4). Kadar se uporablja za ta namen, je v primerjavi s podatki preskusa draženja oči in vivo na kuncih, razvrščenimi glede na sistem za razvrščanje GHS ZN, njena splošna točnost 79-odstotna (150/191), delež lažno pozitivnih rezultatov je 25-odstoten (32/126), delež lažno negativnih rezultatov pa 14-odstoten (9/65) (3) (glej preglednico 1 v Dodatku 2). Kadar so iz zbirke podatkov izključene preskusne kemikalije iz določenega kemijskega (npr. alkoholi, ketoni) ali fizikalnega (tj. trdne snovi) razreda, je splošna točnost preskusne metode BCOP glede na sistem za razvrščanje GHS ZN 85-odstotna (111/131), delež lažno pozitivnih rezultatov je 20-odstoten (16/81), delež lažno negativnih rezultatov pa 8-odstoten (4/50) (3). Morebitne pomanjkljivosti preskusne metode BCOP, kadar se uporablja za opredelitev kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči (kategorija 1 po GHS ZN), temeljijo na visokem deležu lažno pozitivnih rezultatov za alkohole in ketone ter visokem deležu lažno negativnih rezultatov za trdne snovi, kot kaže validacijska zbirka podatkov (1) (2) (3). Vendar ker s preskusno metodo BCOP niso precenjene vrednosti vseh alkoholov in ketonov, pač pa so nekatere napovedane pravilno, tj. da spadajo v kategorijo 1 po GHS ZN, se ne šteje, da sta ti dve organski funkcionalni skupini izločeni s področij uporabe preskusne metode. Uporabnik te preskusne metode se mora odločiti, ali so morebitne precenjene vrednosti alkohola ali ketona sprejemljive ali je treba izvesti nadaljnje preskušanje po pristopu, ki temelji na zanesljivosti dokazov. Glede lažno negativnih rezultatov za trdne snovi je treba opozoriti, da lahko trdne snovi pri Draizovem preskusu draženja oči in vivo povzročijo spremenljive in ekstremne pogoje izpostavljenosti, zaradi česar je napoved njihovega resničnega potenciala draženja lahko brezpredmetna (10). Opozoriti je treba tudi na to, da noben od lažno negativnih rezultatov, opredeljenih v validacijski zbirki podatkov odbora ICCVAM (2) (3) v okviru opredeljevanja kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči (kategorija 1 po GHS ZN), ni povzročil stopnje IVIS ≤ 3, kar je merilo, ki se uporablja za opredelitev preskusne kemikalije kot brez kategorije po GHS ZN. Poleg tega lažno negativni rezultati preskusne metode BCOP v tem okviru niso ključni, saj se vse preskusne kemikalije, pri katerih se stopnja IVIS giblje v razponu od 3 do 55, naknadno preskusijo z drugimi ustrezno potrjenimi preskusi in vitro ali – kot zadnja možnost – s preskusom na kuncih, in sicer glede na regulativne zahteve, pri čemer se uporabi strategija zaporednega preskušanja s pristopom, ki temelji na zanesljivosti dokazov. Ob upoštevanju dejstva, da je mogoče za nekatere trdne kemikalije s preskusno metodo BCOP pravilno napovedati, da spadajo v kategorijo 1 po GHS ZN, se za to fizikalno stanje ne šteje, da je zunaj področja uporabe preskusne metode. Raziskovalci lahko razmislijo o uporabi te preskusne metode za vse vrste kemikalij, pri čemer je treba stopnjo IVIS > 55 sprejeti kot kazalnik za odziv, ki povzroča hude poškodbe oči, ki bi jih bilo treba razvrstiti v kategorijo 1 po GHS ZN brez nadaljnjega preskušanja. Kot je bilo že navedeno, pa je treba pozitivne rezultate, pridobljene z uporabo alkoholov ali ketonov, razlagati previdno zaradi morebitne precenitve vrednosti.

Preskusna metoda BCOP se lahko uporabi tudi za opredelitev kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči v skladu s sistemom za razvrščanje GHS ZN (4). Kadar se uporablja za ta namen, je v primerjavi s podatki preskusa draženja oči in vivo na kuncih, razvrščenimi glede na sistem za razvrščanje GHS ZN, njena splošna točnost 69-odstotna (135/196), delež lažno pozitivnih rezultatov je 69-odstoten (61/89), delež lažno negativnih rezultatov pa 0-odstoten (0/107) (3) (glej preglednico 2 v Dodatku 2). Delež dobljenih lažno negativnih rezultatov (kemikalije in vivo, razvrščene kot brez kategorije po GHS ZN, ki povzročajo stopnjo IVIS > 3, glej odstavek 47) je sorazmerno visok, vendar v tem okviru ni ključen, saj se vse preskusne kemikalije, pri katerih se stopnja IVIS giblje v razponu od 3 do 55, naknadno preskusijo z drugimi ustrezno potrjenimi preskusi in vitro ali – kot zadnja možnost – s preskusom na kuncih, in sicer glede na regulativne zahteve, pri čemer se uporabi strategija zaporednega preskušanja s pristopom, ki temelji na zanesljivosti dokazov. Pri preskusni metodi BCOP niso vidne nobene posebne pomanjkljivosti za preskušanje alkoholov, ketonov in trdnih snovi, kadar je namenjena opredelitvi kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči (brez kategorije po GHS ZN) (3). Raziskovalci lahko to preskusno metodo uporabijo za vse vrste kemikalij, pri čemer je treba negativni rezultat (stopnja IVIS ≤ 3) sprejeti kot kazalnik za to, da razvrstitev ni potrebna (brez kategorije po GHS ZN). Ker se lahko s preskusno metodo BCOP pravilno opredeli le 31 % kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči, ta preskusna metoda ne sme biti prva izbira za začetek pristopa od spodaj navzgor (5), če so na voljo druge potrjene in sprejete metode in vitro s podobno visoko občutljivostjo, a večjo specifičnostjo.

Validacijska zbirka podatkov preskusne metode BCOP je vsebovala skupaj 113 snovi in 100 zmesi (2) (3). Zato se lahko ta metoda uporabi za preskušanje snovi in zmesi.

Preskusna metoda BCOP ni priporočljiva za opredelitev preskusnih kemikalij, ki jih je treba razvrstiti kot dražilne za oči (kategorija 2 ali kategorija 2A po GHS ZN), ali preskusnih kemikalij, ki jih je treba razvrstiti kot zmerno dražilne za oči (kategorija 2B po GHS ZN), saj je precejšnje število kemikalij kategorije 1 po GHS ZN razvrščenih prenizko, in sicer v kategorije 2, 2A ali 2B po GHS ZN, precejšnje število kemikalij brez kategorije po GHS ZN pa je razvrščenih previsoko, in sicer v kategorije 2, 2A ali 2B po GHS ZN (2) (3). Zato je morda potrebno nadaljnje preskušanje z drugo ustrezno metodo.

Pri vseh postopkih na očeh in roženicah goveda je treba upoštevati veljavna pravila in postopke preskusnega laboratorija o ravnanju z živalskim materialom, kamor spadajo med drugim tudi tkiva in tkivne tekočine. Priporočajo se splošni previdnostni ukrepi za laboratorije (11).

Čeprav se pri preskusni metodi BCOP ne proučujejo poškodbe veznice in šarenice, se obravnavajo učinki na roženico, ki so pomembno gonilo pri razvrščanju in vivo ob upoštevanju razvrščanja po GHS ZN. Popravljivosti poškodb roženice kot take v preskusni metodi BCOP ni mogoče oceniti. Na podlagi očesnih študij na kuncih je bilo predlagano, da se za opredelitev nekaterih vrst nepopravljivih učnikov lahko uporabi ocena prvotne globine poškodbe roženice (12). Vendar je potrebno nadaljnje znanstveno znanje, da bi razumeli, kako nastanejo nepopravljivi učinki, ki niso povezani z začetno hudo poškodbo. Treba je tudi opozoriti, da s preskusno metodo BCOP ni mogoče oceniti potencialne sistemske toksičnosti, povezane z izpostavljenostjo oči.

Ta preskusna metoda se bo redno posodabljala ob upoštevanju novih informacij in podatkov. Kadar je potrebna popolnejša opredelitev poškodbe roženice, se je lahko uporabna na primer histopatologija. Kot je navedeno v Dokumentu s smernicami OECD št. 160 (13), se uporabnikom priporoča, naj roženice shranijo in pripravijo histopatološke vzorce, ki se lahko uporabijo pri ustvarjanju zbirke podatkov in oblikovanju meril za odločanje, s katerimi se lahko nadalje izboljša točnost te preskusne metode.

Vsak laboratorij, ki to preskusno metodo izvaja prvič, mora uporabiti kemikalije za preverjanje usposobljenosti iz Dodatka 3. Laboratorij lahko te kemikalije uporabi kot dokaz svoje tehnične usposobljenosti za izvajanje preskusne metode BCOP, preden pošlje podatke o tej metodi za regulativno razvrstitev glede na nevarnosti.

NAČELO PRESKUSA

Preskusna metoda BCOP je organotipski model, s katerim se običajna fiziološka in biokemijska funkcija roženice goveda za kratek čas ohrani in vitro. Pri tej preskusni metodi se poškodba, ki jo povzroči preskusna kemikalija, oceni tako, da se spremembe motnjave in prepustnosti roženice merijo kvantitativno z opacitometrom oziroma spektrofotometrom vidne svetlobe. Obe meritvi se uporabita za izračun stopnje IVIS, na podlagi katere je kemikalija razporejena v kategorijo razvrstitve glede na nevarnost draženja in vitro, da se predvidi zmožnost preskusne kemikalije za draženje oči in vivo (glej merila za odločanje, odstavek 48).

Pri preskusni metodi BCOP se uporabljajo izolirane roženice oči sveže zaklanega goveda. Motnjava roženice se meri kvantitativno in ustreza količini svetlobe, ki prodre skozi roženico. Prepustnost se meri kvantitativno in ustreza količini barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre skozi celotno debelino roženice in se zazna v mediju v zadnjem delu držala. Preskusne kemikalije se dodajo v sprednji del držala za roženico in se tako nanesejo na epitelno površino roženice. Dodatek 4 vsebuje opis in sliko držala, ki se uporablja za preskusno metodo BCOP. Držala za roženico na trgu ponujajo različna podjetja, laboratoriji pa jih lahko izdelajo tudi sami.

Izvor in starost oči goveda ter izbor živalskih vrst

Govedo, ki se zakolje v klavnicah, je običajno namenjeno za človeško prehrano ali druge komercialne uporabe. Pri preskusni metodi BCOP se kot vir roženic uporabljajo samo zdrave živali, primerne za vstop v prehransko verigo človeka. Ker so goveda glede na pasmo, starost in spol različno težka, ni priporočene teže v trenutku zakola.

Velikost roženice se lahko pri očeh različno starih živali razlikuje. Roženice z vodoravnim premerom > 30,5 mm in centralno debelino roženice (CCT) ≥ 1 100 μm ima običajno govedo, starejše od osem let, roženice z navpičnim premerom < 28,5 mm in CCT < 900 μm, pa govedo, mlajše od pet let (14). Zato se oči goveda, starejšega od 60 mesecev, običajno ne uporabljajo. Oči goveda, mlajšega od 12 mesecev, se običajno prav tako ne uporabljajo, saj še niso popolnoma razvite, debelina in premer roženice pa sta bistveno manjša kot pri očeh starejšega goveda. Kljub temu se lahko uporabljajo roženice mladih živali (tj. starih od 6 do 12 mesecev), saj ima njihova uporaba nekatere prednosti, kot so večja razpoložljivost, manjši starostni razpon in manjša nevarnost izpostavljenosti goveji spongiformni encefalopatiji za osebje klavnice (15). Ker bi bilo koristno nadaljnje ocenjevanje učinka, ki ga imata velikost in debelina roženice na odzivnost na jedke in zelo dražilne snovi za oči, se uporabnikom priporoča, da poročajo o približni starosti in/ali teži živali, katerih roženice so uporabili v študiji.

Odvzem in prevoz oči v laboratorij

Oči odvzame osebje klavnice. Da bi bilo čim manj mehanskih in drugih vrst poškodb oči, jih je treba odvzeti čim prej po zakolu ter jih takoj po odvzemu in med prevozom hraniti na hladnem. Da oči ne bi bile izpostavljene potencialno dražilnim kemikalijam, osebje klavnice pri spiranju glav živali ne sme uporabljati detergentov.

Oči je treba v dovolj veliki posodi popolnoma potopiti v ohlajeno Hanksovo uravnoteženo raztopino soli (HBSS) in prepeljati v laboratorij tako, da se njihovo stanje čim manj poslabša in/ali da ne pride do bakterijske okužbe. Ker se oči odvzamejo med zakolom, lahko pridejo v stik s krvjo in drugimi biološkimi snovmi, vključno z bakterijami in drugimi mikroorganizmi. Zato je treba zagotoviti, da je tveganje kontaminacije čim manjše (npr. tako da je posoda, v kateri so oči, med odvzemom in prevozom na mokrem ledu ter da se v Hanksovo uravnoteženo raztopino soli, ki se uporablja za shranjevanje oči med prevozom, dodajo antibiotiki [npr. 100 IU/ml penicilina in 100 μg/ml streptomicina]).

Čas med odvzemom oči in uporabo roženic mora biti pri preskusni metodi BCOP čim krajši (običajno se odvzamejo in uporabijo isti dan) in ne sme vplivati na zanesljivost rezultatov preskusa. Ti temeljijo na merilih za izbor oči ter odzivih pozitivnih in negativnih kontrol. Vse oči, uporabljene v preskusu, morajo pripadati isti skupini oči, odvzeti na določeni dan.

Merila za izbor oči, uporabljenih v preskusni metodi BCOP

Po prihodu v laboratorij se skrbno pregleda, ali so oči poškodovane, vključno s povečano motnjavo, praskami in neovaskularizacijo. Uporabljajo se lahko samo roženice nepoškodovanih oči.

Kakovost vsake roženice se oceni tudi v poznejši fazi preskusa. Roženice z motnjavo, večjo od sedmih enot ali enakovredne stopnje v primeru uporabe opacitometra in držala za roženice. se po začetnem enournem umerjanju zavržejo (OPOZORILO: opacitometer je treba umeriti v skladu s standardi za določevanje enot motnjave, glej Dodatek 4).

Vsaka tretirana skupina (preskusna kemikalija, sočasne negativne in pozitivne kontrole) je sestavljena iz najmanj treh oči. Pri preskusni metodi BCOP je treba za negativno kontrolo uporabiti tri roženice. Ker se roženice odstranijo s celotnega zrkla in pritrdijo v držala za roženice, se lahko zaradi artefaktov, ki nastanejo zaradi prijemanja, vrednosti motnjave in prepustnosti v posameznih primerih spremenijo (vključno z negativno kontrolo). Poleg tega se vrednosti motnjave in prepustnosti roženic iz roženic za negativno kontrolo uporabljajo za popravljanje vrednosti motnjave in prepustnosti roženic, tretiranih s preskusno kemikalijo, in za pozitivno kontrolo pri izračunih stopenj IVIS.

POSTOPEK

Priprava oči

Nepoškodovane roženice se secirajo tako, da se ohrani 2 do 3 mm širok rob beločnice, kar olajša nadaljnje ravnanje, pri čemer je treba paziti, da se epitelij in endotelij roženice ne poškodujeta. Izolirane roženice se pritrdijo v posebej za to izdelana držala, sestavljena iz sprednjega in zadnjega dela, na katera je roženica pripeta z epitelno oziroma endotelno stranjo. Oba dela držala se do roba napolnita z ogretim Eaglovim minimalnim osnovnim medijem (EMEM) brez fenol rdečega (in sicer najprej zadnji del držala), pri čemer je treba paziti, da ne nastajajo mehurčki. Naprava se nato vsaj eno uro uravnotežuje pri 32 ± 1 °C, kar omogoči, da se roženice uravnotežijo z medijem in da se doseže čim bolj normalna metabolna dejavnost (približna temperatura na površini roženice in vivo je 32 °C).

Po uravnoteženju se v oba dela držala doda svež, ogret medij EMEM brez fenol rdečega, za vsako roženico pa se zabeležijo odčitki izhodiščne vrednosti motnjave. Roženice z makroskopskimi poškodbami tkiva (npr. praskami, pigmentacijo, neovaskularizacijo) ali motnjavo, večjo od sedmih enot ali enakovredne stopnje v primeru uporabe opacitometra in držala za roženice, se zavržejo. Vsaj tri roženice se izberejo kot roženice za negativno kontrolo (ali kontrolo s topilom). Preostale roženice se nato razdelijo v tretirano skupino in skupine za pozitivno kontrolo.

Ker ima voda večjo toplotno kapaciteto kot zrak, zagotavlja stabilnejše temperaturne pogoje za inkubacijo. Zato je za ohranjanje držala za roženice in njegove vsebine pri temperaturi 32 ± 1 °C priporočljiva uporaba vodne kopeli. Lahko se uporabljajo tudi inkubatorji za vzdrževanje temperature zraka, če zagotavljajo stabilno temperaturo (tj. s predogrevanjem držal in medijev).

Uporaba preskusne kemikalije

Uporabljata se dva različna protokola tretiranja, in sicer eden za tekočine in površinsko aktivne snovi (trdne snovi ali tekočine), drugi pa za površinsko neaktivne snovi (trdne snovi).

Tekočine se preskušajo nerazredčene. Poltrdne snovi, kreme in voski se običajno preskušajo kot tekočine. Nerazredčene površinsko aktivne snovi se preskusijo pri 10-odstotni masni koncentraciji v 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida, destilirani vodi ali drugem topilu, za katerega je dokazano, da nima škodljivih učinkov na preskusni sistem. Če se uporabljajo druge koncentracije raztopin, jih je treba ustrezno utemeljiti. Zmesi, ki vsebujejo površinsko aktivne snovi, se lahko preskušajo nerazredčene ali razredčene v ustrezni koncentraciji, in sicer odvisno od ustreznega scenarija izpostavljenosti in vivo. Če se uporabljajo druge koncentracije raztopin, jih je treba ustrezno utemeljiti. Roženice so tekočinam in površinsko aktivnim snovem izpostavljene 10 minut. Če je čas izpostavljenosti drugačen, ga je treba ustrezno znanstveno utemeljiti. Za opredelitev površinsko aktivnih snovi in zmesi, ki vsebujejo površinsko aktivne snovi, glej Dodatek 1.

Površinsko neaktivne trdne snovi se običajno preskušajo kot raztopine ali suspenzije pri 20-odstotni masni koncentraciji v 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida, destilirani vodi ali drugem topilu, za katerega je dokazano, da nima škodljivih učinkov na preskusni sistem. V določenih okoliščinah in ob ustrezni znanstveni utemeljitvi se lahko trdne snovi preskušajo tudi nerazredčene, tako da se neposredno nanesejo na površino roženice, pri čemer se uporablja odprta metoda (glej odstavek 32). Roženice so trdnim snovem izpostavljene štiri ure, čas izpostavljenosti pa se lahko tako kot pri tekočinah in površinsko aktivnih snoveh spremeni na podlagi ustrezne znanstvene utemeljitve.

Uporabljajo se lahko različne metode tretiranja, in sicer glede na fizikalne in kemijske lastnosti preskusne kemikalije (npr. trdne snovi, tekočine, viskozne ali neviskozne tekočine). Najpomembneje je, da preskusna kemikalija dovolj dobro pokriva epitelno površino in da se med spiranjem ustrezno odstrani. Zaprta metoda se običajno uporablja za neviskozne do nekoliko viskozne tekoče preskusne kemikalije, medtem ko se odprta metoda običajno uporablja za polviskozne in viskozne tekoče preskusne kemikalije in nerazredčene trdne snovi.

Pri zaprti metodi se prek dozirnih odprtin v zgornji površini v sprednji del držala doda toliko preskusne kemikalije (750 μl), da ta prekrije epitelno stran roženice, odprtine pa se nato med obdobjem izpostavljenosti zatesnijo s tesnilnimi čepki. Vsaka roženica mora biti preskusni kemikaliji izpostavljena dovolj dolgo.

Pri odprti metodi se pred tretiranjem s sprednjega dela držala odstranita obroček za zapiranje okenca in stekleno okence. Kontrolna ali preskusna kemikalija (750 μl ali dovolj preskusne kemikalije, da je prekrita celotna roženica) se nanese neposredno na epitelno površino roženice z mikropipeto. Če se preskusna kemikalija težko pipetira, se jo lahko zaradi lažjega doziranja nanese s pipeto za neposredno izpodrivanje tlaka. Konica pipete za neposredno izpodrivanje tlaka se vstavi v dozirno konico brizge, da se material napolni v konico za izpodrivanje pod tlakom. Ob tem ko se potisni bat počasi sprošča, se vlečni bat pipete pomakne navzgor. Če v konici pipete začnejo nastajati zračni mehurčki, se preskusna kemikalija odstrani (zavrže) in postopek ponovi, dokler konica ni polna in v njej ni zračnih mehurčkov. Po potrebi se lahko uporabi običajna brizga (brez igle), saj omogoča merjenje natančne količine preskusne kemikalije in lažji nanos na epitelno površino roženice. Po odmerjanju se na sprednji del držala ponovno namesti stekleno okence in tako ponovno ustvari zaprt sistem.

Inkubacija po izpostavljenosti

Po obdobju izpostavljenosti se preskusna kemikalija, kemikalija za negativno kontrolo ali kemikalija za pozitivno kontrolo odstrani iz sprednjega dela držala, epitelij pa se najmanj trikrat (oziroma dokler preskusna snov ni več vidna) spere z EMEM (ki vsebuje fenol rdeče). Za spiranje se uporablja medij, ki vsebuje fenol rdeče, saj se lahko s spreminjanjem barv v fenol rdečem nadzoruje, ali je bilo spiranje kislih ali alkalnih preskusnih kemikalij učinkovito. Če je fenol rdeče še vedno razbarvano (rumeno ali vijoličasto) ali če je preskusna kemikalija še vedno vidna, se roženice sperejo več kot trikrat. Ko v mediju ni več preskusne kemikalije, se roženice še zadnjič sperejo z EMEM (brez fenol rdečega). Pri zadnjem spiranju se uporabi EMEM (brez fenol rdečega), s čimer se zagotovi, da je bilo fenol rdeče odstranjeno iz sprednjega dela držala pred merjenjem motnjave. Nato se sprednji del držala ponovno napolni s svežim EMEM brez fenol rdečega.

Pri tekočinah ali površinsko aktivnih snoveh se roženice po spiranju dajo v inkubator še za dve dodatni uri pri 32 ± 1 °C. V določenih okoliščinah je po obdobju izpostavljenosti koristna tudi daljša inkubacija, vendar je to odvisno od vsakega primera posebej. Roženice, ki se preskušajo s trdnimi snovmi, se po štirih urah izpostavljenosti temeljito sperejo, vendar pri njih nadaljnja inkubacija ni potrebna.

Po koncu inkubacije, ki sledi obdobju izpostavljenosti, za tekočine in površinsko aktivne snovi in po koncu štiriurne izpostavljenosti za površinsko neaktivne trdne snovi se zabeležita motnjava in prepustnost vsake roženice. Poleg tega se vsaka roženica vizualno pregleda in se zabeležijo vsa pomembnejša opažanja (npr. lupljenje tkiva, prisotnost ostanka preskusne kemikalije, neenotni vzorci motnjave). Ta opažanja so lahko pomembna, saj se lahko izražajo z odkloni pri odčitkih opacitometra.

Kontrolne kemikalije

V vsak poskus sta vključeni sočasna negativna kontrola ali kontrola s topilom/vehiklom ter pozitivna kontrola.

Pri preskušanju 100-odstotne tekoče snovi se v preskusno metodo BCOP vključi sočasna negativna kontrola (npr. 0,9-odstotna raztopina natrijevega klorida ali destilirana voda), da se odkrijejo nespecifične spremembe preskusnega sistema in zagotovijo izhodiščne vrednosti za končne točke preskusa. Ta kontrola tudi zagotavlja, da preskusni pogoji ne povzročajo dražilnih reakcij.

Pri preskušanju razredčene tekočine, površinsko aktivne ali trdne snovi se v preskusno metodo BCOP vključi primerjalna kontrolna skupina s topilom/vehiklom, da se odkrijejo nespecifične spremembe preskusnega sistema in zagotovijo izhodiščne vrednosti za končne točke preskusa. Uporablja se lahko samo tako topilo/vehikel, za katerega je dokazano, da nima škodljivih učinkov na preskusni sistem.

Kemikalija, za katero je znano, da povzroča pozitiven odziv, se v vsak poskus vključi kot sočasna pozitivna kontrola, da se preveri celovitost preskusnega sistema in njegova pravilna izvedba. Da se lahko oceni variabilnost odziva pozitivne kontrole v daljšem časovnem obdobju pa stopnja dražilnega odziva ne sme biti prevelika.

Primer pozitivne kontrole za tekoče preskusne kemikalije je 100-odstotni etanol ali 100-odstotni dimetilformamid. Primer pozitivne kontrole za trdne preskusne kemikalije je 20-odstotna masna koncentracija imidazola v 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida.

Primerjalne kemikalije so primerne za ocenjevanje potenciala za draženje oči, ki ga imajo neznane kemikalije določenega kemijskega ali proizvodnega razreda, ali za ocenjevanje relativnega potenciala snovi za draženje oči v določenem razponu dražilnih učinkov.

Merjene končne točke

Motnjava je odvisna od količine svetlobe, ki prodre skozi roženico. Motnjava roženice se meri kvantitativno s pomočjo opacitometra, pri čemer se meri neprekinjeno.

Prepustnost je odvisna od količine barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre skozi vse celične sloje roženice (tj. od epitelija na zunanji površini roženice do endotelija na notranji površini roženice). V sprednji del držala za roženico, na katerega je pripeta epitelna stran roženice, se doda 1 ml raztopine natrijevega fluoresceina (4 ali 5 mg/ml pri testiranju tekočin in površinsko aktivnih snovi oziroma površinsko neaktivnih snovi), medtem ko se zadnji del držala, na katerega je pripeta endotelna stran roženice, napolni s svežim EMEM. Držalo se nato da v inkubator v vodoravnem položaju za 90 ± 5 minut pri 32 ± 1 °C. Količina natrijevega fluoresceina, ki prodre v zadnji del držala, se meri kvantitativno s pomočjo spektrofotometrije UV/VIS. Spektrofotometrične meritve pri 490 nm se beležijo kot neprekinjeno merjene vrednosti optične gostote (OD490) ali absorbance. Prepuščanje fluoresceina se določa z vrednostmi OD490, ki so bile izmerjene s spektrofotometrom vidne svetlobe pri standardni dolžini poti 1 cm.

Namesto spektrofotometra se lahko uporabi tudi bralnik 96-jamičnih mikrotitrskih plošč, pod pogojem, da: (i) se lahko določi linearno merilno območje bralnika za določevanje vrednosti fluoresceina OD490 in (ii) se v 96-jamični mikrotitrski plošči uporablja pravilna količina vzorcev fluoresceina, zaradi česar vrednosti OD490 ustrezajo standardni dolžini poti 1 cm (za to so lahko potrebne popolnoma napolnjene posode [navadno 360 μl]).

PODATKI IN POROČANJE

Ocenjevanje podatkov

Potem ko se popravita vrednost motnjave in srednja vrednost prepustnosti (OD490) za vrednosti ozadja za motnjavo in vrednosti prepustnosti negativne kontrole OD490, se srednji vrednosti motnjave in prepustnosti OD490 za vsako tretirano skupino združita v empirično izpeljani formuli, s katero se izračuna stopnja IVIS za vsako tretirano skupino, kot sledi:

stopnja IVIS = srednja vrednost motnjave + (15 × srednja vrednost prepustnosti OD490).

Sina idr. (16) so poročali, da je bila ta formula izpeljana na podlagi študij v enem in več laboratorijih. Podatki za 36 spojin, pridobljeni med študijo, izvedeno v več laboratorijih, so bili ocenjeni z multivariantno analizo, s katero se je določila najustreznejša enačba za podatke in vivo ter in vitro. To analizo so izvedli znanstveniki dveh različnih podjetij, ki so izpeljali skoraj identični enačbi.

Vrednosti motnjave in prepustnosti je treba oceniti tudi neodvisno, da se ugotovi, ali preskusna kemikalija skozi eno od dveh končnih točk učinkuje jedko ali zelo dražilno (glej merila za odločanje).

Merila za odločanje

Mejne vrednosti stopnje draženja in vitro (IVIS) za opredelitev preskusnih kemikalij kot takih, ki povzročajo hude poškodbe oči (kategorija 1 po GHS ZN), in takih, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči (brez kategorije po GHS ZN), so:

Merila za sprejemljivost študije

Preskus se šteje za sprejemljivega, če je pri pozitivni kontroli stopnja IVIS znotraj dveh standardnih odklonov veljavne srednje vrednosti iz preteklih preskusov, ki jo je treba posodobiti vsaj vsake tri mesece ali vedno, kadar preskus izvajajo laboratoriji, ki preskuse izvajajo redko (tj. manj kot enkrat mesečno). Iz odzivov negativnih kontrol s topilom/vehiklom morajo biti razvidne vrednosti motnjave in prepustnosti, ki so manjše od veljavnih zgornjih omejitev vrednosti ozadja za motnjavo in prepustnost roženic goveda, obdelanih z zadevnimi negativnimi kontrolami ali kontrolami s topilom/vehiklom. Kadar je razvrstitev nedvoumna, bi moralo za preskusno kemikalijo zadoščati eno samo preskušanje, sestavljeno iz vsaj treh roženic. Vendar je treba v primeru mejnih rezultatov pri prvi ponovitvi preskušanja razmisliti o drugi ponovitvi (ki pa ni nujno potrebna), pa tudi tretji, če srednje vrednosti stopnje IVIS iz prvih dveh ponovitvah niso skladne. V tem okviru se rezultat prve ponovitve preskušanja šteje za mejnega, če napovedi pri treh roženicah niso bile skladne, tako da:

Poročilo o preskusu

V poročilo o preskusu se vključijo naslednji podatki, če so pomembni za izvedbo študije:

VIRI

Dodatek 4

DRŽALO ZA ROŽENICO ZA DOLOČANJE MOTNJAVE IN PREPUSTNOSTI ROŽENICE GOVEDA (BCOP)

Držala za roženico za BCOP so narejena iz inertnega materiala (npr. polipropilena). Sestavljena so iz dveh polovic (sprednje in zadnje komore) ter dveh podobnih cilindričnih notranjih posodic. Vsaka komora je zasnovana tako, da je njena prostornina približno 5 ml in se konča s steklenim okencem, skozi katerega se beležijo meritve prepustnosti. Premer posamezne notranje komore je 1,7 cm, globina pa 2,2 cm (11). Tesnilni obroček na zadnji komori preprečuje iztekanje. Roženice se z endotelno stranjo navzdol položijo na tesnilni obroček zadnje komore, sprednja komora pa se položi na epitelno stran roženice. Obe komori sta pritrjeni skupaj s tremi vijaki iz nerjavnega jekla, ki so nameščeni na zunanjih robovih komore. Na koncu vsake komore je stekleno okence, ki ga je mogoče za lažji dostop do roženice odstraniti. Med steklenim okencem in komoro je tesnilni obroček, ki preprečuje iztekanje. Skozi luknjici na vrhu vsake komore se vnašajo in odstranjujejo medij in preskusne kemikalije. Med tretiranjem in inkubacijo sta zaprti z gumijastimi čepki. Prenos svetlobe skozi držala za roženice se lahko spremeni, saj lahko učinki fizične obrabe ali kopičenja ostankov preskusnih kemikalij v luknjah notranje komore ali na steklenih okencih vplivajo na razpršitev svetlobe ali odbojnost. Posledice tega so lahko povečanje ali zmanjšanje izhodiščne vrednosti prenosa svetlobe (in, nasprotno, odčitkov izhodiščne vrednosti motnjave) skozi držala za roženice, kar se lahko opazi kot znatne spremembe pri pričakovanih meritvah izhodiščne začetne vrednosti motnjave roženice v posameznih komorah (to pomeni, da se lahko začetne vrednosti motnjave roženice v posebnih posameznih držalih za roženice od pričakovanih izhodiščnih vrednosti redno razlikujejo za več kot dve ali tri enote motnjave). Vsak laboratorij mora razmisliti o vzpostavitvi programa za ocenjevanje sprememb pri prenosu svetlobe skozi držala za roženice, in sicer glede na naravo preskušenih kemijskih lastnosti in pogostost uporabe komor. Za določitev izhodiščnih vrednosti se lahko držala za roženice pregledajo pred redno uporabo, tako da se izmerijo izhodiščne vrednosti motnjave (ali prenosa svetlobe) komor, popolnoma napolnjenih z medijem brez roženic. Držala za roženice se med obdobji uporabe nato redno pregledujejo, da se ugotovi, ali je pri prenosu svetlobe prišlo do sprememb. Vsak laboratorij lahko določi pogostost pregledovanja držal za roženice, in sicer glede na preskušene kemikalije, pogostost uporabe in opažene spremembe v izhodiščnih vrednostih motnjave roženice. Če se opazijo znatne spremembe pri prenosu svetlobe skozi držala za roženice, je treba razmisliti o ustreznih postopkih čiščenja in/ali poliranja notranje površine držal za roženice ali njihovi zamenjavi.

Držalo za roženico: tridimenzionalna risba držala z grafično ločenimi deli

(13)

Poglavje B.48 dela B se nadomesti z naslednjim:

„B.48   Preskusna metoda na izoliranih očeh piščancev za opredelitev i) kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči, in ii) kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči

UVOD

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 438 (2013). Preskusno metodo na izoliranih očeh piščancev (Isolated Chicken Eye – preskusna metoda ICE) je v letih 2006 in 2010 ocenil Medagencijski koordinacijski odbor za validacijo alternativnih metod (ICCVAM) v sodelovanju z Evropskim centrom za validacijo alternativnih metod (ECVAM) ter Japonskim centrom za validacijo alternativnih metod (JaCVAM) (1) (2) (3). Pri prvem ocenjevanju je bila preskusna metoda ICE potrjena kot znanstveno veljavna preskusna metoda, ki se uporablja kot presejalni test za opredelitev kemikalij (snovi in zmesi), ki povzročajo hude poškodbe oči (kategorija 1), kot je opredeljeno v globalno usklajenem sistemu Združenih narodov za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS ZN) (1) (2) (4) ter Uredbi (ES) št. 1272/2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi (CLP) (12). Pri drugem ocenjevanju je bila preskusna metoda ICE ocenjena glede na svojo uporabnost kot presejalni test za opredelitev kemikalij, ki niso razvrščene glede na draženje oči ali hude poškodbe oči, kot je opredeljeno v GHS ZN (3) (4). Rezultati validacijske študije in priporočila odbora za medsebojni strokovni pregled so podprli prvotno priporočilo za uporabo preskusne metode ICE za razvrščanje kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči (kategorija 1 po GHS ZN), saj se razpoložljiva zbirka podatkov od prvotne validacije odbora ICCVAM ni spremenila. Na tej stopnji nadaljnja priporočila za razširitev področja uporabe preskusne metode ICE, da bi se vanjo vključile tudi druge kategorije, niso bila predlagana. Ponovno se je ocenila zbirka podatkov in vitro ter in vivo, uporabljenih v validacijski študiji, pri čemer se je osredotočilo na oceno uporabnosti preskusne metode ICE za opredelitev kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči (5). Pri tej ponovni oceni je bilo ugotovljeno, da se preskusna metoda ICE lahko uporabi tudi za opredelitev kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči, kot je opredeljeno v GHS ZN (4) (5). Ta preskusna metoda vključuje priporočeno uporabo in omejitve preskusne metode ICE, ki temeljijo na teh ocenah. Najpomembnejše razlike med prvotno različico smernic za preskušanje OECD iz leta 2009 in posodobljeno različico iz leta 2013 se nanašajo, niso pa omejene na: uporabo preskusne metode ICE za opredelitev kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na sistem za razvrščanje GHS ZN, posodobitev elementov poročila o preskusu, posodobitev Dodatka 1 o opredelitvah pojmov ter posodobitev Dodatka 2 o seznamu kemikalij za preverjanje usposobljenosti.

Zdaj na splošno velja, da Draizovega preskusa draženja oči in vivo v bližnji prihodnosti ne bo mogoče nadomestiti z enim samim preskusom draženja oči in vitro, da bi se predvidel celoten razpon dražilnih učinkov za različne kemijske razrede. Draizov preskus draženja oči pa bi morda lahko nadomestile strateške kombinacije več alternativnih preskusnih metod v okviru (večstopenjske) strategije preskušanja (6). Pristop od zgoraj navzdol (7) je treba uporabiti takrat, ko se na podlagi obstoječih informacij pričakuje, da bo imela kemikalija visok potencial draženja, pristop od spodaj navzgor (7) pa takrat, ko se na podlagi obstoječih informacij pričakuje, da kemikalija ne bo povzročila tolikšnega draženja oči, da bi jo bilo treba razvrstiti. Preskusna metoda ICE je metoda preskušanja in vitro, ki se lahko pod določenimi pogoji in s posebnimi omejitvami, kot so opisane v odstavkih od 8 do 10, uporabi za razvrstitev glede na nevarnosti za oči in označevanje kemikalij. Čeprav se preskusna metoda ICE ne obravnava kot veljaven samostojen nadomestek preskusa draženja oči in vivo na kuncih, se vseeno priporoča kot prvi korak preskusne strategije, kot je pristop od zgoraj navzdol, ki ga priporoča Scott idr. (7), za opredelitev kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči, tj. kemikalij, ki jih je treba v kategorijo 1 po GHS ZN razvrstiti brez nadaljnjega preskušanja (4). Ta metoda je priporočljiva tudi za opredelitev kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči ali hude poškodbe oči, kot je opredeljeno v sistemu GHS ZN (brez kategorije) (4), zaradi česar se lahko uporabi kot prvi korak v okviru strategije preskušanja od spodaj navzgor (7). Vendar če se s preskusno metodo ICE ne predvidi, da kemikalija povzroča hude poškodbe oči ali razvrstitev glede na draženje oči/hude poškodbe oči, bi bilo treba to kemikalijo dodatno preskusiti (in vitro in/ali in vivo), da se določi končna razvrstitev. Poleg tega se je treba pred uporabo pristopa od spodaj navzgor pri preskusni metodi ICE v okviru drugih sistemov za razvrščanje, ki niso GHS ZN, posvetovati z ustreznimi regulativnimi organi.

V tej preskusni metodi so opisani postopki za oceno potencialne nevarnosti preskusne kemikalije za oči glede na njeno (ne)zmožnost, da v izoliranem očesu piščanca povzroči toksičnost. Toksični učinki na roženico se merijo s: (i) kvalitativnim ocenjevanjem motnjave, (ii) kvalitativnim ocenjevanjem poškodbe epitelija na podlagi nanosa fluoresceina na oko (zadrževanje fluoresceina), (iii) kvantitativnim merjenjem povečane debeline (nabreklosti) in (iv) kvalitativnim ocenjevanjem makroskopske morfološke poškodbe na površini. Motnjava roženice, nabreklost in ocenjevanje poškodb po izpostavljenosti preskusni kemikaliji se najprej ocenijo posamično, nato pa združijo, da se lahko določi razvrstitev glede na draženje oči.

Opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.

ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE

Ta preskusna metoda temelji na protokolu, predlaganem v Dokumentu s smernicami OECD št. 160 (8), ki je bil razvit na podlagi mednarodne validacijske študije (1) (3) (9) odbora ICCVAM, pri kateri so sodelovali Evropski center za validacijo alternativnih metod (ECVAM), Japonski center za validacijo alternativnih metod (JaCVAM) ter Oddelek za toksikologijo in uporabno farmakologijo nizozemskega Inštituta za raziskave TNO (Nizozemska). Protokol temelji na informacijah iz objavljenih protokolov ter protokolu, ki ga trenutno uporablja TNO (10) (11) (12) (13) (14).

V validacijski študiji, na kateri temelji ta preskusna metoda, je bil preizkušen širok nabor kemikalij, in v empirično zbirko podatkov validacijske študije je vključenih 152 kemikalij, od tega 72 snovi in 80 zmesi (5). Ta preskusna metoda se uporablja za trdne snovi, tekočine, emulzije in gele. Tekoče snovi so lahko vodne raztopine ali ne, trdne snovi so lahko topne ali netopne v vodi. Plini in aerosoli še niso bili ocenjeni v validacijski študiji.

Preskusna metoda ICE se lahko uporabi za opredelitev kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči, tj. kemikalij, ki jih je treba razvrstiti v kategorijo 1 po GHS ZN (4). Ko se opredeljene omejitve za preskusno metodo ICE uporabljajo za ta namen, temeljijo na visokem deležu lažno pozitivnih rezultatov za alkohole ter lažno negativnih rezultatov za trdne in površinsko aktivne snovi (1) (3) (9). Vendar delež lažno negativnih rezultatov v tem okviru (kategorija 1 po GHS ZN, ki je opredeljena, kot da ni kategorija 1 po GHS ZN) ni ključen, saj se vse preskusne kemikalije, ki se izkažejo za negativne, naknadno preskusijo z drugimi ustrezno potrjenimi preskusi in vitro ali –kot zadnja možnost – s preskusom na kuncih, in sicer glede na regulativne zahteve, pri čemer se uporabi strategija zaporednega preskušanja s pristopom, ki temelji na zanesljivosti dokazov. Opozoriti je treba, da lahko trdne snovi pri Draizovem preskusu draženja oči in vivo povzročijo spremenljive in ekstremne pogoje izpostavljenosti, zaradi česar je napoved njihovega resničnega potenciala draženja lahko brezpredmetna (15). Raziskovalci lahko razmislijo o uporabi te preskusne metode za vse vrste kemikalij, pri čemer je treba pozitivni rezultat sprejeti kot kazalnik za odziv, ki povzroča hude poškodbe oči, kar pomeni razvrstitev v kategorijo 1 po GHS ZN brez nadaljnjega preskušanja. Vendar je treba pozitivne rezultate, pridobljene z uporabo alkoholov, razlagati previdno, saj obstaja tveganje, da je njihova vrednost precenjena.

Kadar se preskusna metoda ICE uporablja za opredelitev kemikalij, ki povzročajo hude poškodbe oči (kategorija 1 po GHS ZN), je v primerjavi s podatki preskusa draženja oči in vivo na kuncih, razvrščenimi glede na sistem za razvrščanje GHS ZN (4) (5), njena splošna točnost 86-odstotna (120/140), delež lažno pozitivnih rezultatov je 6-odstoten (7/113), delež lažno negativnih rezultatov pa 48-odstoten (13/27).

Preskusna metoda ICE se lahko uporabi tudi za opredelitev kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na nevarnost draženja oči ali hudih poškodb oči v skladu s sistemom za razvrščanje GHS ZN (4). Preden se pri preskusni metodi ICE uporabi pristop od spodaj navzgor v okviru drugih sistemov za razvrščanje, se je treba posvetovati z ustreznimi regulativnimi organi. Ta preskusna metoda se lahko uporabi za vse vrste kemikalij, pri čemer se lahko negativni rezultat sprejme, kot da ne razvršča kemikalije glede na draženje oči ali hude poškodbe oči. Vendar se lahko na podlagi enega rezultata iz validacijske zbirke podatkov vrednosti za barve, ki vsebujejo organsko topilo proti obraščanju, podcenijo (5).

Kadar se preskusna metoda ICE uporablja za opredelitev kemikalij, ki jih ni treba razvrstiti glede na draženje oči in hude poškodbe oči, je v primerjavi s podatki preskusa draženja oči in vivo na kuncih, razvrščenimi glede na sistem za razvrščanje GHS ZN (4) (5), njena splošna točnost 82-odstotna (125/152), delež lažno pozitivnih rezultatov je 33-odstoten (26/79), delež lažno negativnih rezultatov pa 1-odstoten (1/73). Kadar so iz zbirke podatkov izključene preskusne kemikalije iz določenih razredov (npr. organsko topilo proti obraščanju, ki ga vsebujejo barve), je točnost preskusne metode ICE glede na sistem za razvrščanje GHS ZN (4) (5) 83-odstotna (123/149), delež lažno pozitivnih rezultatov je 33-odstoten (26/78), delež lažno negativnih rezultatov pa 0-odstoten (0/71).

Preskusna metoda ICE ni priporočljiva za opredelitev preskusnih kemikalij, ki jih je treba razvrstiti kot dražilne za oči (kategorija 2 ali kategorija 2A po GHS ZN), ali preskusnih kemikalij, ki jih je treba razvrstiti kot zmerno dražilne za oči (kategorija 2B po GHS ZN), saj je precejšnje število kemikalij kategorije 1 po GHS ZN razvrščenih prenizko, in sicer v kategorije 2, 2A ali 2B po GHS ZN, precejšnje število kemikalij brez kategorije po GHS ZN pa je razvrščenih previsoko, in sicer v kategorije 2, 2A ali 2B po GHS ZN. Zato je morda potrebno nadaljnje preskušanje z drugo ustrezno metodo.

Pri vseh postopkih na očeh piščancev je treba upoštevati veljavna pravila in postopke preskusnega laboratorija o ravnanju s človeškim ali živalskim materialom, kamor spadajo med drugim tudi tkiva in tkivne tekočine. Priporočajo se splošni previdnostni ukrepi za laboratorije (16).

Čeprav se pri preskusni metodi ICE ne proučujejo poškodbe veznice in šarenice, kot se ocenjuje pri preskusu draženja oči na kuncih, se obravnavajo učinki na roženico, ki so pomembno gonilo pri razvrščanju in vivo ob upoštevanju razvrščanja po GHS ZN. Čeprav s preskusno metodo ICE ni mogoče oceniti popravljivosti poškodb roženice kot take, je bilo na podlagi študij na očeh kuncev predlagano, da se lahko za opredelitev nekaterih vrst nepopravljivih učinkov uporabi ocena prvotne globine poškodbe roženice (17). Zlasti je potrebno nadaljnje znanstveno znanje, da bi razumeli, kako nastanejo nepopravljivi učinki, ki niso povezani z začetno hudo poškodbo. Treba je tudi opozoriti, da s preskusno metodo ICE ni mogoče oceniti potencialne sistemske toksičnosti, povezane z izpostavljenostjo oči.

Ta preskusna metoda se bo redno posodabljala ob upoštevanju novih informacij in podatkov. Kadar je potrebna popolnejša opredelitev poškodbe roženice, se je lahko uporabna na primer histopatologija. Za oceno te možnosti se uporabnikom priporoča, naj oči shranijo in pripravijo histopatološke vzorce, ki se lahko uporabijo pri ustvarjanju zbirke podatkov in oblikovanju meril za odločanje, s katerimi se lahko nadalje izboljša točnost te preskusne metode. OECD je pripravila dokument s smernicami za uporabo preskusnih metod in vitro za ugotavljanje toksičnosti za oči, ki vključuje podrobne postopke o zbirki histopatoloških vzorcev in informacije o tem, kam poslati vzorce in/ali histopatološke podatke (8).

Vsak laboratorij, ki ta preskus izvaja prvič, mora uporabiti kemikalije za preverjanje usposobljenosti iz Dodatka 2. Laboratorij lahko te kemikalije uporabi, da dokaže svojo tehnično usposobljenost za izvajanje preskusne metode ICE, preden podatke o tej metodi predloži za namene regulativne razvrstitve glede na nevarnosti.

NAČELO PRESKUSA

Preskusna metoda ICE je organotipski model, s katerim se piščančje oko za kratek čas ohrani in vitro. Pri tej preskusni metodi se poškodba, ki jo povzroči preskusna kemikalija, oceni tako, da se določijo nabreklost roženice, njena prepustnost in zadrževanje fluoresceina. Medtem ko se slednja parametra ocenjujeta kvalitativno, je treba nabreklost roženice oceniti kvantitativno. Vsaka meritev se bodisi pretvori v kvantitativni rezultat, ki se uporabi za izračun splošnega indeksa dražilnosti, bodisi kvalitativno razvrsti v kategorijo, ki se uporabi za razvrstitev glede na nevarnosti za oči in vitro kot kategorija 1 po GHS ZN ali brez kategorije po GHS ZN. Kateri koli od teh rezultatov se lahko uporabi za napoved, da je preskusna kemikalija zmožna povzročiti hude poškodbe oči in vivo ali da preskusne kemikalije ne bo treba razvrstiti glede na nevarnosti za oči (glej merila za odločanje). Vendar kemikalij, pri katerih se napove, da ne bodo povzročile hudih poškodb oči, ali ki glede na preskusno metodo ICE niso razvrščene (glej odstavek 11), ni mogoče razvrstiti.

Izvor in starost oči piščancev

Za ta preskus se običajno uporabljajo oči piščancev, ki so bili zaklani v klavnicah in namenjeni za človeško prehrano, kar pomeni, da poskusne živali niso potrebne. Uporabljajo se samo oči zdravih živali, primernih za vstop v prehransko verigo človeka.

Čeprav kontrolirana študija za ocenjevanje najprimernejše starosti piščancev ni bila opravljena, so se v preteklih preskusih po tej metodi uporabljali mladi piščanci, ki so bili zaklani v klavnicah (tj. piščanci, stari približno 7 tednov in težki od 1,5 do 2,5 kg).

Odvzem in prevoz oči v laboratorij

Glave se odstranijo neposredno po omamljanju piščancev, običajno z električnim šokom, in po izkrvavitvi zaradi prereza vratu. Piščanci morajo izhajati iz lokalnega vira v bližini laboratorija, tako da se njihove glave iz klavnice v laboratorij pripeljejo tako hitro, da se njihovo stanje čim manj poslabša in/ali čim bolj zmanjša možnost bakterijske okužbe. Čas od odvzema glav piščancev in vstavitve oči v komoro naprave za superfuzijo po odvzemu oči mora biti čim krajši (običajno manj kot dve uri), da se izpolnijo merila za sprejemljivost preskusa. Vse oči, uporabljene v preskusu, morajo pripadati isti skupini oči, odvzeti na določeni dan.

Ker se oči secirajo v laboratoriju, se nepoškodovane glave iz klavnice v laboratorij prepeljejo pri sobni temperaturi (običajno med 18 °C in 25 °C) v plastičnih posodah, ki so navlažene s krpami, prepojenimi s fiziološko raztopino.

Merila za izbor in število oči, uporabljenih v preskusni metodi ICE

Oči z močno izhodiščno obarvanostjo s fluoresceinom (tj. > 0,5) ali motno roženico (tj. > 0,5) po odvzemu se zavržejo.

Vsaka tretirana skupina in sočasna pozitivna kontrola sta sestavljeni iz vsaj treh oči. Za negativno kontrolno skupino ali kontrolo s topilom (če se namesto fiziološke raztopine uporablja drugo topilo) se uporabi vsaj eno oko.

V primeru trdnih materialov, pri katerih se pojavi rezultat brez kategorije po GHS ZN, je priporočljiva druga ponovitev s tremi očmi, da se negativni rezultat potrdi ali zavrže.

POSTOPEK

Priprava oči

Veke se pazljivo odstranijo, pri čemer je treba paziti, da se ne poškoduje roženica. Celovitost roženice se hitro oceni tako, da se na njeno površino za nekaj sekund nanese kapljica 2-odstotnega (m/v) natrijevega fluoresceina, površina pa se nato spere s fiziološko raztopino. Oči, obdelane s fluoresceinom, se nato pregledajo z biomikroskopom s špranjsko svetilko, da se preveri, ali je roženica nepoškodovana (tj. zadrževanje fluoresceina in motnjava roženice ≤ 0,5).

Če je oko nepoškodovano, se izreže iz lobanje, pri čemer je treba paziti, da se roženica ne poškoduje. Zrklo se iz očesne votline potegne tako, da se žmurka trdno zagrabi s kirurškimi prijemalkami, očesne mišice pa se prerežejo z ukrivljenimi škarjami s topo konico. Tako se prepreči, da bi se roženica zaradi prevelikega tlaka poškodovala (tj. artefakti zaradi stisnjenja).

Ko se oko odstrani iz očesne votline, se ga mora še vedno držati viden del vidnega živca. Po odstranitvi iz očesne votline se oko položi na vpojno podlago, nato pa se odrežeta žmurka in preostalo vezno tkivo.

Izolirano oko se namesti v prijemalko iz nerjavnega jekla, tako da je roženica v navpičnem položaju. Prijemalka se nato prenese v komoro naprave za superfuzijo (18). Prijemalke je treba v napravi za superfuzijo namestiti tako, da kapljice fiziološke raztopine močijo celotno roženico (3 do 4 kapljice na minuto ali od 0,1 do 0,15 ml na minuto). Komore naprave za superfuzijo morajo imeti nadzorovano temperaturo, in sicer pri 32 ± 1,5 °C. V Dodatku 3 je diagram običajne naprave za superfuzijo s prijemalkami za oči, ki je na voljo na trgu, laboratoriji pa jo lahko izdelajo tudi sami. Naprava se lahko prilagodi potrebam posameznega laboratorija (tj. za različno število oči).

V napravi za superfuzijo se oči še enkrat pregledajo z biomikroskopom s špranjsko svetilko, s čimer se zagotovi, da se med seciranjem niso poškodovale. Pri tem se z nastavkom za merjenje globine na biomikroskopu na apeksu roženice izmeri tudi debelina roženice. Oči z (i) vrednostjo zadržanega fluoresceina > 0,5, (ii) motnjavo roženice > 0,5, ali (iii) dodatnimi znaki poškodb je treba zamenjati. Za oči, ki se na podlagi katerega koli od teh meril ne zavržejo, velja, da jih je treba vseeno zavreči, če se debelina roženice za več kot 10 % razlikuje od srednje vrednosti vseh oči. Uporabniki se morajo zavedati, da se lahko z biomikroskopi s špranjsko svetilko pri različnih širinah špranje pridobijo različne vrednosti meritev debeline roženice. Širino špranje je treba nastaviti na 0,095 mm.

Po tem ko se vse oči pregledajo in odobrijo, se inkubirajo za približno 45 do 60 minut, da se pred odmerjanjem uravnotežijo s preskusnim sistemom. Po obdobju uravnoteženja se kot izhodiščna vrednost za debelino in motnjavo roženice zabeleži nična vrednost (tj. čas = 0). Vrednost fluoresceina, določena pri seciranju, se uporabi kot izhodiščna vrednost za to končno točko.

Uporaba preskusne kemikalije

Takoj po meritvi z ničnimi referenčnimi vrednostmi se oko (skupaj z držalom) vzame iz naprave za superfuzijo in položi vodoravno, nato pa se na roženico nanese preskusna kemikalija.

Tekoče preskusne kemikalije se običajno preskusijo nerazredčene, po potrebi pa se lahko tudi razredčijo (tj. kot del zasnove študije). Kot topilo pri razredčenih preskusnih kemikalijah se najpogosteje uporablja fiziološka raztopina. V nadzorovanih pogojih pa se lahko uporabijo tudi druga topila, vendar je ustreznost topil, ki niso fiziološka raztopina, treba dokazati.

Tekoče preskusne kemikalije se na roženico nanesejo tako, da je celotna površina roženice enakomerno prekrita z njimi, pri čemer je standardna količina 0,03 ml.

Če je mogoče, se trdne preskusne kemikalije čim bolj zdrobijo v terilnici s pestilom ali primerljivim orodjem za drobljenje. Prašek se nanese na roženico tako, da je njena površina enakomerno prekrita s preskusno kemikalijo, pri čemer je standardna količina 0,03 g.

Preskusna kemikalija (tekoča ali trdna) se pusti učinkovati 10 sekund, nato pa se z očesa spere s fiziološko raztopino (približno 20 ml) pri sobni temperaturi. Nato se oko (skupaj z držalom) ponovno vstavi v napravo za superfuzijo, in sicer v prvotnem, pokončnem položaju. Po potrebi se lahko dodatno spere po 10-sekundnem učinkovanju in v poznejših časovnih točkah (npr. v primeru odkritja ostankov preskusne kemikalije na roženici). V splošnem dodatno uporabljena količina fiziološke raztopine ni ključnega pomena, pač pa je pomembno to, ali se opazi oprijemanje kemikalije na roženico.

Kontrolne kemikalije

V vsak poskus je treba vključiti sočasno negativno kontrolo ali kontrolo s topilom/vehiklom ter pozitivne kontrole.

Pri preskušanju 100-odstotnih tekočin ali trdnih snovi se kot primerjalna negativna kontrola pri preskusni metodi ICE uporablja fiziološka raztopina, da se odkrijejo nespecifične spremembe preskusnega sistema in da preskusni pogoji ne povzročajo neustreznih dražilnih reakcij.

Pri preskušanju razredčenih tekočin se v preskusno metodo vključi sočasna kontrolna skupina s topilom/vehiklom, da se odkrijejo nespecifične spremembe preskusnega sistema in da preskusni pogoji ne povzročajo neustreznih dražilnih reakcij. Kot je navedeno v odstavku 31, se lahko uporablja samo topilo/vehikel, za katerega je dokazano, da na preskusni sistem nima škodljivih učinkov.

V vsak poskus se kot sočasna pozitivna kontrola vključi znana dražilna snov za oči, da se preveri, ali se sproži želena reakcija. Ker se preskus ICE pri tej preskusni metodi uporablja za opredelitev jedkih ali zelo dražilnih snovi, je treba za pozitivno kontrolo uporabiti tako referenčno kemikalijo, ki pri tej preskusni metodi povzroči močno reakcijo. Da se lahko oceni variabilnost odziva pozitivne kontrole v daljšem časovnem obdobju pa stopnja močnega odziva ne sme biti prevelika. Za pozitivno kontrolo je treba pridobiti dovolj podatkov in vitro, da se lahko izračuna statistično opredeljeno sprejemljivo območje pozitivne kontrole. Če za določeno pozitivno kontrolo ni na voljo ustreznih podatkov o preskusni metodi ICE iz preteklih preskusov, je treba opraviti študije, v katerih se bodo ti podatki zbrali.

Primera pozitivnih kontrol za tekoče preskusne kemikalije sta 10-odstotna ocetna kislina ali 5-odstoten benzalkonijev klorid, primera pozitivnih kontrol za trdne preskusne kemikalije pa natrijev hidroksid in imidazol.

Primerjalne kemikalije so primerne za ocenjevanje potenciala za draženje oči, ki ga imajo neznane kemikalije določenega kemijskega ali proizvodnega razreda, ali za ocenjevanje relativnega potenciala snovi za draženje oči v določenem razponu dražilnih učinkov.

Merjene končne točke

Tretirane roženice se ocenijo pred tretiranjem in nato 30, 75, 120, 180 in 240 minut (± 5 minut) po spiranju, opravljenem po tretiranju. S temi časovnimi točkami se omogoči ustrezno število meritev med štiriurnim tretiranjem in hkrati zagotovi dovolj časa, da se oči med posameznimi meritvami ustrezno pregledajo.

Končne točke, ki se ocenijo, so motnjava in nabreklost roženice, zadrževanje fluoresceina in morfološki učinki (tj. luknjičavost ali odstopanje epitelija). Vse končne točke razen zadrževanja fluoresceina (ki se oceni samo pred tretiranjem in 30 minut po izpostavljenosti preskusni kemikaliji) se ocenijo pri vsaki od navedenih časovnih točk.

Priporoča se, da se motnjava roženice, zadrževanje fluoresceina, morfološki učinki in morebitni histopatološki izvidi dokumentirajo.

Po tem ko se po štirih urah opravi končni pregled, se uporabnikom priporoča, naj oči shranijo v ustrezni fiksirni raztopini (tj. v nevtralnem formalinskem pufru), da se lahko po potrebi opravi histopatološki pregled (za podrobnosti glej odstavek 14 in vir (8)).

Nabreklost roženice se določi na podlagi meritev debeline roženice, opravljenih z optičnim pahimetrom na biomikroskopu s špranjsko svetilko. Izrazi se v odstotkih in izračuna iz meritev debeline roženice z naslednjo formulo:

Srednja odstotna vrednost nabreklosti roženice vseh preskusnih oči se izračuna za vse časovne točke opazovanja. Na podlagi najvišje srednje vrednosti nabreklosti roženice, kot je bila opažena v kateri koli časovni točki, se za vsako preskusno kemikalijo določi skupna vrednost za posamezno kategorijo (glej odstavek 51).

Pri oceni motnjave roženice se upošteva predel roženice, ki je pri beleženju rezultatov najbolj moten (glej preglednico 1). Za vse časovne točke opazovanja se izračuna srednja vrednost motnjave roženice vseh preskusnih oči. Na podlagi najvišje srednje vrednosti motnjave roženice, kot je bila opažena v kateri koli časovni točki, se za vsako preskusno kemikalijo določi skupna vrednost za posamezno kategorijo (glej odstavek 51).

Preglednica 1

Vrednosti motnjave roženice

Zadrževanje fluoresceina se oceni samo v časovni točki opazovanja po 30 minutah, kot je prikazano v preglednici 2. Nato se izračuna srednja vrednost zadržanega fluoresceina vseh preskusnih oči za časovno točko opazovanja po 30 minutah, ki se pri vsaki preskusni kemikaliji uporabi kot skupna vrednost za posamezno kategorijo (glej odstavek 51).

Preglednica 2

Vrednost zadržanega fluoresceina

Morfološki učinki vključujejo „luknjičaste“ epitelne celice roženice, epitelij, ki odstopa, „grobo“ roženično površino in „prilepljenost“ preskusne kemikalije na roženico. Te ugotovitve so lahko različno resne in se lahko pojavijo istočasno. Razvrščanje teh ugotovitev poteka subjektivno v skladu z razlago raziskovalca.

PODATKI IN POROČANJE

Ocenjevanje podatkov

Rezultate za motnjavo in nabreklost roženice ter zadrževanje fluoresceina je treba oceniti ločeno, da se ustvari razred ICE za vsako končno točko. Razredi ICE za vsako končno točko se nato združijo, da se vsaka preskusna kemikalija lahko razvrsti v razred dražilnosti.

Merila za odločanje

Po oceni vsake končne točke se na podlagi vnaprej določenega območja določijo razredi ICE. Pri razlagi debeline roženice (preglednica 3), motnjave roženice (preglednica 4) in zadrževanja fluoresceina (preglednica 5) se uporabljajo štirje razredi ICE v skladu z spodnjimi lestvicami. Opozoriti je treba, da so vrednosti nabreklosti roženice iz preglednice 3 uporabne le, če je debelina izmerjena z biomikroskopom s špranjsko svetilko (npr. z modelom Haag-Streit BP900) z napravo za merjenje globine št. 1 in nastavitvijo širine špranje na 9, kar ustreza 0,095 mm. Uporabniki se morajo zavedati, da se lahko z biomikroskopi pri različnih širinah špranje pridobijo različne vrednosti meritev debeline roženice.

Preglednica 3

Merila ICE za razvrstitev glede na nabreklost roženice

Preglednica 4

Merila ICE za razvrstitev motnjave roženice

Preglednica 5

Merila ICE za razvrstitev glede na srednjo vrednost zadržanega fluoresceina

Razvrstitev preskusne kemikalije in vitro se oceni na podlagi razvrstitve po GHS ZN, ki ustreza kombinaciji kategorij, pridobljenih za nabreklost in motnjavo roženice ter zadrževanje fluoresceina, kot je navedeno v preglednici 6.

Preglednica 6

Splošne razvrstitve in vitro

Merila za sprejemljivost študije

Preskus se šteje za sprejemljivega, če so sočasne negativne kontrole ali kontrole z vehiklom/topilom opredeljene kot brez kategorije po GHS ZN, sočasne pozitivne kontrole pa kot kategorija 1 po GHS ZN.

Poročilo o preskusu

V poročilo o preskusu se vključijo naslednji podatki, če so pomembni za izvedbo študije: