1.3.2016   

SL

Uradni list Evropske unije

L 54/1


UREDBA KOMISIJE (EU) 2016/266

z dne 7. decembra 2015

o spremembi Uredbe (ES) št. 440/2008 o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) zaradi njene prilagoditve tehničnemu napredku

(Besedilo velja za EGP)

EVROPSKA KOMISIJA JE –

ob upoštevanju Pogodbe o delovanju Evropske unije,

ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 1907/2006 Evropskega Parlamenta in Sveta z dne 18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH), o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije ter spremembi Direktive 1999/45/ES ter razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES (1) ter zlasti člena 13(2) Uredbe,

ob upoštevanju naslednjega:

(1)

Uredba Komisije (ES) št. 440/2008 (2) določa preskusne metode za ugotavljanje fizikalno-kemijskih lastnosti, toksičnosti in ekotoksičnosti kemikalij, ki jih je treba uporabiti za namene Uredbe (ES) št. 1907/2006.

(2)

Uredbo (ES) št. 440/2008 je treba posodobiti tako, da se vanjo vključijo nove in posodobljene preskusne metode, ki jih je pred kratkim sprejela OECD, in da se v skladu z Direktivo 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta (3) zagotovi zmanjšanje števila živali za poskusne namene. Opravljena so bila posvetovanja z deležniki o tem osnutku.

(3)

Prilagoditev zajema dvajset preskusnih metod: eno novo metodo za določanje fizikalno-kemijske lastnosti, enajst novih in tri posodobljene preskusne metode za oceno ekotoksičnosti ter pet novih preskusnih metod za oceno usode in obnašanja v okolju.

(4)

Uredbo (ES) št. 440/2008 bi bilo zato treba ustrezno spremeniti.

(5)

Ukrepi iz te uredbe so v skladu z mnenjem odbora, ustanovljenega v skladu s členom 133 Uredbe (ES) št. 1907/2006 –

SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:

Člen 1

Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni v skladu s Prilogo k tej uredbi.

Člen 2

Ta uredba začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije.

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.

V Bruslju, 7. decembra 2015

Za Komisijo

Predsednik

Jean-Claude JUNCKER


(1)  UL L 396, 30.12.2006, str. 1.

(2)  Uredba Komisije (ES) št. 440/2008 z dne 30. maja 2008 o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) (UL L 142, 31.5.2008, str. 1).

(3)  Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (UL L 276, 20.10.2010, str. 33).


PRILOGA

Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni:

(1)

Na začetku priloge pred delom A se vstavi opomba:

„Opomba:

Pred uporabo katere koli od naslednjih preskusnih metod za preskušanje snovi, ki jo sestavlja več sestavin (MCS), snovi neznane ali spremenljive sestave, kompleksnega produkta reakcije ali biološkega materiala (UVCB) ali zmesi in kadar uporaba navedenih metod za preskušanje MCS, UVCB ali zmesi v zadevni preskusni metodi ni navedena, je treba proučiti, ali je metoda ustrezna za predvideni regulativni namen.

Če se preskusna metoda uporablja za preskušanje MCS, UVCB ali zmesi, mora biti na voljo čim več zadostnih informacij o njeni sestavi, npr. z navedbo kemijske identitete, kvantitativnega pojavljanja in relevantnih lastnosti njenih sestavin.“

(2)

Doda se poglavje A.24:

A.24.   PORAZDELITVENI KOEFICIENT (N-OKTANOL/VODA), METODA TEKOČINSKE KROMATOGRAFIJE VISOKE LOČLJIVOSTI (HPLC)

UVOD

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 117 (2004).

1.

Porazdelitveni koeficient (P) je opredeljen kot razmerje ravnotežnih koncentracij (c) raztopljene snovi v dvofaznem sistemu, sestavljenem iz dveh topil, ki se v glavnem ne mešata. V primeru n-oktanola in vode:

Formula

Porazdelitveni koeficient (P) je količnik dveh koncentracij, je brez enote in se navadno navede v obliki logaritma z osnovo 10.

2.

V študijah usode kemičnih snovi v okolju je Pow ključni parameter. Dokazano je zelo značilno razmerje med koeficientom Pow neionizirane oblike snovi in bioakumulacijo teh oblik snovi v ribah. Dokazano je bilo tudi, da je koeficient Pow uporaben parameter pri napovedovanju adsorpcije v tleh in usedlinah ter pri določitvi kvantitativnih razmerij med strukturo in aktivnostjo za širok nabor bioloških učinkov.

3.

Prvotni predlog za to preskusno metodo je temeljil na članku C. V. Eadsfortha in P. Moserja (1). Razvoj preskusne metode in preskus s primerjavo med laboratoriji OECD je usklajevala Zvezna agencija za okolje Zvezne republike Nemčije v letu 1986 (2).

ZAČETNI POMISLEKI

4.

Vrednosti log Pow v območju od – 2 do 4 (občasno pa do 5 in več) (1) je mogoče določiti s poskusi z metodo stresanja bučke (poglavje A.8 te priloge, Smernica za preskušanje OECD 107). Metoda HPLC zajema vrednost log Pow v območju od 0 do 6 (1)(2)(3)(4)(5). Za določitev primernih referenčnih snovi in v podporo morebitnim zaključkom, ki se izpeljejo iz podatkov, pridobljenih s preskusom, je pri tej metodi morda potrebno ocenjevanje Pow. Računske metode so na kratko obravnavane v Dodatku k tej preskusni metodi. Način delovanja HPLC je izokratski.

5.

Vrednosti Pow so odvisne od okoljskih pogojev, kot so temperatura, pH, ionska moč itd., za pravilno razlago podatkov Pow pa morajo biti ti pogoji v poskusu opredeljeni. Pri snoveh, ki disociirajo na ione, bo morda na voljo druga metoda (npr. osnutek smernice OECD o metodi merjenja pH za ionizirane snovi (6)), ki bi jo bilo mogoče uporabljati kot alternativno. Čeprav je pri snoveh, ki disociirajo na ione, osnutek smernice OECD morda primeren za določanje Pow, je v nekaterih primerih primerneje uporabiti metodo HPLC pri okoljsko ustreznem pH (glej odstavek 9).

NAČELO METODE

6.

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z reverzno fazo se izvaja z analitskimi kolonami, napolnjenimi z na trgu dostopno trdno fazo, ki vsebuje dolge verige ogljikovodikov (npr. C8, C18), vezane na silicijev dioksid.

7.

Kemikalijo, injicirano na tako kolono, po koloni prenaša mobilna faza; med tem prenosom se kemikalija porazdeli med mobilno fazo topila in stacionarno fazo ogljikovodika. Snovi se zadržijo sorazmerno s svojim porazdelitvenim koeficientom ogljikovodik/voda, pri čemer se prve eluirajo hidrofilne snovi, zadnje pa lipofilne. Retencijski čas opisuje faktor kapacitete k, ki je določen z enačbo:

Formula

pri čemer je tR retencijski čas preskusne snovi, t0 pa mrtvi čas, tj. povprečni čas, ki ga molekula topila potrebuje, da pride skozi kolono. Kvantitativna analiza ni potrebna, treba je določiti le retencijske čase.

8.

Porazdelitveni koeficient oktanol/voda preskusne snovi je mogoče izračunati z določitvijo njegovega faktorja kapacitete k s poskusi in nato z vnosom faktorja k v naslednjo enačbo:

Formula

pri čemer sta:

a, b

=

koeficienta linearne regresije.

Zgornjo enačbo je mogoče izračunati z linearno regresijo logaritma porazdelitvenih koeficientov oktanol/voda referenčnih snovi glede na logaritem faktorjev kapacitete referenčnih snovi.

9.

S tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z reverzno fazo je mogoče porazdelitvene koeficiente oceniti v območju vrednosti log Pow med 0 in 6, kar je v izjemnih primerih mogoče razširiti tako, da zajame območje vrednosti log Pow med 6 in 10. Zaradi tega je morda treba prilagoditi mobilno fazo (3). Ta metoda ni uporabna za močne kisline in baze, kovinske komplekse, snovi, ki reagirajo z eluentom, ali površinsko aktivne snovi. Meritve je na neionizirani obliki snovi, ki disociirajo na ione (prosta kislina ali prosta baza), mogoče izvesti le z uporabo ustreznega pufra s pH, ki je pri prosti kislini najmanj eno enoto pod vrednostjo pKa, pri prosti bazi pa najmanj eno enoto nad vrednostjo pKa. Namesto tega bo morda na voljo metoda merjenja pH za preskušanje snovi, ki disociirajo na ione (6); to metodo bi bilo mogoče uporabljati kot alternativno (6). Če je vrednost log Pow določena za uporabo pri razvrščanju nevarnosti za okolje ali ocenjevanju okoljskega tveganja, je treba preskus izvesti v območju pH, ki ustreza naravnemu okolju, tj. v območju pH od 5,0 do 9.

10.

V nekaterih primerih lahko nečistote otežijo razlago rezultatov, ker postanejo določitve vrhov negotove. Za zmesi, ki dajo nedoločen pas, je treba sporočiti zgornjo in spodnjo mejo vrednosti log Pow ter površinski odstotek vsakega vrha vrednosti log Pow. Pri zmeseh, ki so skupina homologov, mora biti navedeno tudi tehtano povprečje vrednosti log Pow (7), izračunano na podlagi posameznih vrednosti koeficienta Pow in ustreznih vrednosti površinskega odstotka (8). Vse vrhove, ki k skupni površini vrhov prispevajo površino 5 % ali več, je treba upoštevati pri izračunu (9):

Formula

Tehtano povprečje vrednosti log Pow velja le za snovi ali zmesi (npr. talova olja), ki so sestavljene iz homologov (npr. vrste alkanov). Zmesi je mogoče meriti in pri tem dobiti smiselne rezultate, če ima uporabljeni analitski detektor enako občutljivost na vse snovi v zmesi in jih v zadostni meri razločuje.

INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI

11.

Disociacijska konstanta, strukturna formula in topnost v mobilni fazi morajo biti znane pred uporabo metode. Poleg tega bi bile v pomoč informacije o hidrolizi.

MERILA KAKOVOSTI

12.

Za povečanje zanesljivosti meritve je treba izvesti dve vzporedni določitvi.

Ponovljivost: vrednost log Pow, določena s ponavljajočimi se meritvami, izvedenimi v enakih pogojih in z uporabo enake skupine referenčnih snovi, mora biti v območju ± 0,1 log enot.

Obnovljivost: če so meritve ponovljene z drugo skupino referenčnih snovi, se rezultati lahko razlikujejo. Običajno je korelacijski koeficient R za razmerje med vrednostma log k in log Pow za skupino preskusnih snovi približno 0,9, kar ustreza porazdelitvenemu koeficientu oktanol/voda vrednosti log Pow ± 0,5 log enot.

13.

Preskus s primerjavo med laboratoriji je dokazal, da je mogoče z metodo HPLC pridobiti vrednosti log Pow do ± 0,5 enote vrednosti, dobljenih z metodo stresanja bučke (2). Druge primerjave je mogoče najti v literaturi (4)(5)(10)(11)(12). Najbolj natančne rezultate dajo korelacijske krivulje, ki temeljijo na strukturno sorodnih referenčnih snoveh (13).

REFERENČNE SNOVI

14.

Za določitev soodvisnosti izmerjenega faktorja kapacitete (k) snovi in njenega koeficienta Pow je treba izdelati umeritveno krivuljo z uporabo najmanj 6 referenčnih točk (glej odstavek 24). Uporabnik sam izbere primerne referenčne snovi. Referenčne snovi morajo običajno imeti vrednosti log Pow, ki zajemajo vrednosti log Pow preskusne snovi, tj. mora biti koeficient Pow pri vsaj eni referenčni snovi večji, kot ga ima preskusna snov, pri vsaj eni drugi pa mora biti koeficient Pow manjši, kot ga ima preskusna snov. Ekstrapolacija se uporablja le izjemoma. Zaželeno je, da so te referenčne snovi strukturno sorodne preskusni snovi. Vrednosti log Pow referenčnih snovi, ki se uporabljajo za kalibracijo, morajo temeljiti na zanesljivih preskusnih podatkih. Vendar pa se lahko za snovi z visoko vrednostjo log Pow (običajno večjo od 4) uporabljajo izračunane vrednosti, razen če so na voljo zanesljivi preskusni podatki. Če se uporabljajo ekstrapolirane vrednosti, mora biti navedena mejna vrednost.

15.

Na voljo so izčrpni seznami vrednosti log Pow za številne skupine kemikalij (14)(15). Če ni podatkov o porazdelitvenih koeficientih strukturno sorodnih snovi, se lahko uporabi bolj splošna kalibracija, določena z drugimi referenčnimi snovmi. Priporočene referenčne snovi in njihove vrednosti Pow so navedene v preglednici 1. Za snovi, ki disociirajo na ione, dane vrednosti veljajo za neionizirano obliko. Med preskusom s primerjavo med laboratoriji sta bili preverjeni verodostojnost in kakovost vrednosti.

Preglednica 1

Priporočene referenčne vrednosti

 

Številka CAS

Referenčna snov

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanon

(metil etil keton)

0,3

 

2

1122-54-9

4-acetilpiridin

0,5

 

3

62-53-3

anilin

0,9

 

4

103-84-4

acetanilid

1,0

 

5

100-51-6

benzil alkohol

1,1

 

6

150-76-5

4-metoksifenol

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

fenoksiocetna kislina

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

fenol

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

benzonitril

1,6

 

11

140-29-4

fenilacetonitril

1,6

 

12

589-18-4

4-metilbenzil alkohol

1,6

 

13

98-86-2

acetofenon

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

3-nitrobenzojska kislina

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-kloroanilin

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

nitrobenzen

1,9

 

18

104-54-1

cinamil alkohol

(cimetov alkohol)

1,9

 

19

65-85-0

benzojska kislina

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-krezol

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

cimetova kislina

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

anizol

2,1

 

23

93-58-3

metil benzoat

2,1

 

24

71-43-2

benzen

2,1

 

25

99-04-7

3-metilbenzojska kislina

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-klorofenol

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

trikloroetilen

2,4

 

28

1912-24-9

atrazin

2,6

 

29

93-89-0

etil benzoat

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-diklorobenzonitril

2,6

 

31

535-80-8

3-klorobenzojska kislina

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

toluen

2,7

 

33

90-15-3

1-naftol

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dikloroanilin

2,8

 

35

108-90-7

klorobenzen

2,8

 

36

1746-13-0

alil fenil eter

2,9

 

37

108-86-1

bromobenzen

3,0

 

38

100-41-4

etilbenzen

3,2

 

39

119-61-9

benzofenon

3,2

 

40

92-69-3

4-fenilfenol

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

timol

3,3

 

42

106-46-7

1,4-diklorobenzen

3,4

 

43

122-39-4

difenilamin

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

naftalen

3,6

 

45

93-99-2

fenil benzoat

3,6

 

46

98-82-8

izopropilbenzen

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-triklorofenol

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

bifenil

4,0

 

49

120-51-4

benzil benzoat

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-sek-butilfenol

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-triklorobenzen

4,2

 

52

143-07-7

dodekanojska kislina

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

difenileter

4,2

 

54

85-01-8

fenantren

4,5

 

55

104-51-8

n-butilbenzen

4,6

 

56

103-29-7

dibenzil

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenilpiridin

4,9

 

58

206-44-0

fluoranten

5,1

 

59

603-34-9

trifenilamin

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

OPIS METODE

Predhodna ocena porazdelitvenega koeficienta

16.

Po potrebi se lahko porazdelitveni koeficient oceni, po možnosti z računsko metodo (glej Dodatek) ali, kadar je primerno, na podlagi razmerja topnosti preskusne snovi v čistih topilih.

Naprava

17.

Potreben je tekočinski kromatograf, opremljen z nizkozmogljivostno črpalko in primernim detektorjem. Detektor UV z valovno dolžino 210 nm ali detektor RI je mogoče uporabiti pri različnih kemijskih skupinah. Prisotnost polarnih skupin v stacionarni fazi lahko resno zmanjša učinkovitost kolone HPLC. Zato mora imeti stacionarne faze le minimalni odstotek polarnih skupin (16). Lahko se uporabijo na trgu dostopna mikropolnila za kolone za kromatografijo z reverzno fazo ali že pripravljene kolone. Med injektorskim sistemom in analitsko kolono se lahko namesti predkolona.

Mobilna faza

18.

Topilo za eluiranje se pripravi iz metanola za HPLC in deionizirane vode ter se pred uporabo razplini. Uporabiti je treba izokratsko elucijo. Uporabiti je treba razmerja metanol/voda z deležem vode najmanj 25 %. Običajno je zmes metanol/voda v razmerju 3: 1 (v/v) zadovoljiva za eluiranje snovi z log P = 6 v eni uri pri pretoku 1 ml/min. Pri snoveh, katerih vrednost log P je 6 ali več (in referenčnih snoveh), bo morda treba elucijski čas skrajšati z zmanjšanjem polarnosti mobilne faze ali skrajšanjem kolone.

19.

Preskusne in referenčne snovi morajo biti topne v mobilni fazi v zadostnih koncentracijah, da je omogočena njihova detekcija. Dodatke v zmesi metanol/voda je mogoče uporabiti le izjemoma, saj spremenijo lastnosti kolone. V teh primerih mora biti potrjeno, da ni prišlo do vpliva na retencijski čas preskusnih in referenčnih snovi. Če zmes metanol/voda ni primerna, je mogoče uporabiti druge zmesi topilo/voda, npr. etanol/voda, acetonitril/voda ali izopropil alkohol (2-propanol)/voda.

20.

Pri snoveh, ki disociirajo na ione, je pH eluenta zelo pomemben. Biti mora v delovnem območju pH kolone, ki je običajno med 2 in 8. Priporočeno je dodajanje pufra. Preprečiti je treba obarjanje soli in razpadanje kolone, ki lahko nastaneta pri nekaterih zmeseh organske faze in pufra. Meritve HPLC s stacionarnimi fazami z osnovo iz silicijevega dioksida in pH nad 8 običajno niso priporočljive, saj uporaba alkalne mobilne faze lahko povzroči hitro poslabšanje učinkovitosti kolone.

Topljenci

21.

Za dodeljevanje vrhov v kromatogramih ustreznim snovem morajo biti preskusne in referenčne snovi dovolj čiste. Snovi, ki se bodo uporabile za preskus ali kalibracijo, se po možnosti raztopijo v mobilni fazi. Če je za topljenje preskusnih in referenčnih snovi uporabljeno drugo topilo, ne mobilna faza, mora biti mobilna faza uporabljena pri končnem redčenju pred injiciranjem.

Preskusni pogoji

22.

Med merjenjem se temperatura ne sme spreminjati za več kot ± 1 °C.

Določanje mrtvega časa to

23.

Mrtvi čas t0 je mogoče izračunati z organskimi spojinami, ki se ne zadržijo v koloni (npr. tiosečnino ali formamidom). Natančnejšo vrednost mrtvega časa je mogoče izpeljati iz izmerjenih retencijskih časov ali z nizom približno sedmih spojin homologne vrste (n-alkilmetil-ketoni) (17). Izriše se krivulja dobljenih retencijskih časov tR (nC + 1) v odvisnosti od tR (nC), pri čemer je nC število ogljikovih atomov. Dobljena je ravna črta, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, pri čemer je A, ki predstavlja k(nC + 1)/k(nC), konstanta. Mrtvi čas t0 je dobljen iz presečišča (1 – A)t0 in naklona A.

Regresijska enačba

24.

Naslednji korak je izdelava krivulje vrednosti log k v odvisnosti od log P za ustrezne referenčne snovi, pri čemer morajo biti vrednosti log P blizu pričakovane vrednosti za preskusno snov. V praksi se od 6 do 10 referenčnih snovi injicira hkrati. Določijo se retencijski časi, po možnosti na zapisovalnem integratorju, povezanem z detektorjem. Ustrezni logaritmi faktorjev kapacitete, log k, se izrišejo kot krivulja v odvisnosti od log P. V rednih časovnih razmikih, vsaj enkrat dnevno, se izračunava regresijska enačba, tako da je mogoče upoštevati morebitne spremembe v učinkovitosti kolone.

DOLOČITEV KOEFICIENTA POW PRESKUSNE SNOVI

25.

Preskusna snov se injicira v najmanjših še zaznavnih količinah. Retencijski čas se določa v dvojniku. Porazdelitveni koeficient preskusne snovi je pridobljen z interpolacijo izračunanega faktorja kapacitete na umeritveni krivulji. Pri zelo majhnih in zelo velikih porazdelitvenih koeficientih je potrebna ekstrapolacija. V takih primerih je treba še posebej upoštevati meje zaupanja regresijske premice. Če je retencijski čas vzorca zunaj obsega retencijskih časov, pridobljenih za standarde, je treba navesti mejno vrednost.

PODATKI IN POROČANJE

Poročilo o preskusu

26.

Poročilo mora vsebovati naslednje:

predhodno oceno porazdelitvenega koeficienta, če je določena, ocenjene vrednosti in uporabljeno metodo, če je bila uporabljena računska metoda, pa tudi njen celotni opis, vključno z določitvijo zbirke podatkov in podrobnimi informacijami o izbiri fragmentov,

preskusne in referenčne snovi: čistost, strukturno formulo in številko CAS,

opis opreme in delovnih pogojev: analitske kolone, predkolone,

mobilno fazo, detekcijsko sredstvo, temperaturni razpon, pH,

elucijske diagrame (kromatograme),

mrtvi čas in podatke o tem, kako je bil izmerjen,

podatke o retenciji in vrednosti log Pow iz literature za referenčne snovi, uporabljene za kalibracijo,

podrobnosti o prilagojeni regresijski premici (log k v odvisnosti od log Pow) in korelacijski koeficient premice, vključno z intervali zaupanja,

podatke o povprečni retenciji in interpolirano vrednost log Pow za preskusno snov,

v primeru zmesi: elucijski diagram/kromatogram z označenimi mejnimi vrednostmi,

vrednosti log Pow v odvisnosti od površinskega odstotka vrha log Pow,

izračun z uporabo regresijske premice,

izračun tehtanega povprečja vrednosti log Pow, kadar je to primerno.

LITERATURA

(1)

Eadsforth, C. V., in Moser, P. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

Klein, W., Kördel, W., Weiss, M., in Poremski, H. J. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

Eadsforth, C. V. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

Ellgehausen, H., D'Hondt, C., in Fuerer, R. (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

McDuffie, B. (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Osnutek smernice, november 2000.

(7)

OSPAR (1995). ‚Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995‘, Oslo and Pariz Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Priloga 10, Oviedo, od 20. do 24. februarja 1995.

(8)

Thatcher, M., Robinson, M., Henriquez, L. R., in Karman, C. C. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Različica 1.0, 3. avgust.

(9)

Vik, E. A., Bakke, S., in Bansal, K. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, str. 529–537.

(10)

Renberg, L. O., Sundstroem, S. G., in Sundh-Nygård, K. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

Hammers, W. E., Meurs,G. J., in De-Ligny, C. L. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

Haky, J. E., in Young, A. M. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

Fujisawa, S., in Masuhara, E. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

Hansch, C., in Leo, A. J. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

Hansch, C., predsednik; Leo, A. J., dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Na voljo v projektu Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

Rekker, R. F., de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

Berendsen, G. E., Schoenmakers, P. J., de Galan, L., Vigh, G., Varga-Puchony, Z., in Inczédy, J. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Dodatek

Računske metode POW

UVOD

1.

V tem dodatku je kratek uvod v izračun koeficienta Pow. Več informacij za bralca je v literaturi (1)(2).

2.

Izračunane vrednosti Pow se uporabljajo za:

odločanje o tem, katero eksperimentalno metodo uporabiti: metodo stresanja bučke za vrednosti log Pow med – 2 in 4 in metodo HPLC za vrednosti log Pow med 0 in 6,

izbiro pogojev za uporabo pri metodi HPLC (referenčnih snovi, razmerja metanol/voda),

preverjanje sprejemljivosti vrednosti, pridobljenih z eksperimentalnimi metodami,

določanje ocene, kadar preskusnih metod ni mogoče uporabiti.

Načelo računskih metod

3.

Tu predlagane računske metode temeljijo na teoretični fragmentaciji molekule na ustrezne podstrukture, za katere so znane zanesljive vrednosti povečanja log Pow. Vrednost log Pow je pridobljena s seštevanjem vrednosti fragmentov in členov korekcije za intramolekularne interakcije. Na voljo so seznami konstant fragmentov in členov korekcije (1)(2)(3)(4)(5)(6). Nekateri se redno dopolnjujejo (3).

Zanesljivost izračunanih vrednosti

4.

Na splošno se zanesljivost računskih metod manjša z večanjem kompleksnosti proučevane snovi. Pri enostavnih molekulah z majhno molekulsko maso in eno ali dvema funkcionalnima skupinama se lahko pričakuje odstopanje med rezultati različnih metod fragmentacije in izmerjenimi vrednostmi, ki znaša od 0,1 do 0,3 enote log Pow. Območje napake je odvisno od zanesljivosti konstant fragmentov, zmožnosti prepoznavanja intramolekularnih interakcij (npr. vodikovih vezi) in pravilne uporabe členov korekcije. Pri snoveh, ki lahko ionizirajo, je pomembno, da se pravilno upošteva naboj ali stopnja ionizacije (10).

Metoda Fujita-Hansch π

5.

Konstanta hidrofobnih substituentov, π, ki so jo vpeljali Fujita in drugi (7), je opredeljena kot:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

pri čemer je PhX porazdelitveni koeficient aromatskega derivata in PhH porazdelitveni koeficient izhodne spojine.

npr.

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

Metoda π je uporabna predvsem za aromatske snovi. Na voljo so vrednosti π za veliko število substituentov (4)(5).

Rekkerjeva metoda

6.

Z Rekkerjevo metodo (8) se vrednost log Pow izračuna na naslednji način:

Formula

pri čemer ai pomeni pogostnost pojavljanja danega fragmenta v molekuli, fi pa je vrednost povečanja log Pow fragmenta. Členi interakcije se lahko izrazijo kot skupni zmnožek ene same konstante Cm (tako imenovane ‚magične konstante‘). Konstante fragmentov fi in Cm so določene na podlagi seznama 1 054 vrednosti Pow, dobljenih s poskusi z multiplo regresijsko analizo, ki so zajemali 825 spojin (6)(8). Členi interakcije se določijo v skladu s pravili, opisanimi v literaturi (6)(8)(9).

Hansch-Leova metoda

7.

S Hansch-Leovo metodo (4) se vrednost log Pow izračuna po enačbi:

Formula

pri čemer fi predstavlja konstante različnih fragmentov molekule, Fj je člen korekcije (faktor), ai in bj pa sta ustrezni pogostnosti pojavljanja. Z metodo poskusa in napake ter z izpeljavo iz vrednosti Pow, dobljenih s poskusi, sta bila sestavljena seznam vrednosti za atome in skupine ter seznam členov korekcije Fj. Členi korekcije so bili razvrščeni v več različnih razredov (1)(4). Za upoštevanje vseh pravil in členov korekcije so bili razviti programski paketi (3).

KOMBINIRANA METODA

8.

Izračunavanje log Pow kompleksnih molekul se lahko znatno izboljša, če se molekula razdeli na večje podstrukture, za katere so na voljo zanesljive vrednosti log Pow iz preglednic (3)(4) ali iz obstoječih meritev. Taki fragmenti (npr. heterocikli, antrakinon, azobenzen) se nato lahko kombinirajo s Hanschevimi vrednostmi π ali z Rekkerjevimi ali Leovimi konstantami fragmentov.

Opombe

(i)

Računske metode se za delno ali popolnoma ionizirane snovi lahko uporabijo le, kadar je mogoče upoštevati potrebne korekcijske faktorje.

(ii)

Če se lahko predpostavlja, da so prisotne intramolekularne vodikove vezi, je treba prišteti ustrezne člene korekcije (pribl. od + 0,6 do + 1,0 enot log Pow) (1). Znaki prisotnosti takih vezi se lahko pridobijo iz stereo modelov ali spektroskopskih podatkov o molekuli.

(iii)

Če je možnih več tavtomernih oblik, mora izračun temeljiti na najbolj verjetni obliki.

(iv)

Pozorno je treba spremljati spremembe seznamov konstant fragmentov.

LITERATURA O RAČUNSKIH METODAH

(1)

Lyman, W. J., Reehl, W. F., in Rosenblatt, D. H. (ur.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

(2)

Dunn, W. J., Block, J. H., in Pearlman, R. S. (ur.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) in Oxford (1986).

(3)

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, ZDA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

(4)

Hansch, C., in Leo, A. J. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

(5)

Leo, A. J, Hansch, C., in Elkins, D. (1971). Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

(6)

Rekker, R. F., de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(7)

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa in Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

(8)

Rekker, R. F. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

(9)

Eadsforth, C. V., in Moser, P. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(10)

Scherrer, R. A. ACS – Symposium Series 255, str. 225, American Chemical Society, Washington, D. C. (1984).

(3)

Poglavje C.3 se nadomesti z naslednjim:

C.3   SLADKOVODNE ALGE IN CIANOBAKTERIJE, PRESKUS ZAVIRANJA RASTI

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 201 (2006; priloga je bila popravljena leta 2011). Ugotovljeno je bilo, da je treba preskusno metodo razširiti, tako da se vanjo vključijo dodatne vrste, in posodobiti, da bo izpolnjevala pogoje za oceno nevarnosti in razvrstitev kemikalij. Te spremembe so bile izvedene na podlagi izčrpnih praktičnih izkušenj, znanstvenega napredka na področju študij strupenosti za alge in ob široki uporabi ustreznih predpisov od njenega prvotnega sprejetja.

2.

Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.

NAČELO PRESKUSA

3.

Namen tega preskusa je določiti učinke kemikalij na rast sladkovodnih mikroalg in/ali cianobakterij. Preskusni organizmi v eksponentni fazi rasti se v šaržnih kulturah izpostavijo preskusni kemikaliji navadno za 72 ur. Kljub relativno kratkemu trajanju preskusa je mogoče oceniti učinke na več generacijah.

4.

Odziv sistema je zmanjšanje rasti pri vrsti kultur alg (preskusnih enot), ki so izpostavljene različnim koncentracijam preskusne kemikalije. Odziv je ocenjen v odvisnosti od koncentracije izpostavljenosti v primerjavi s povprečno rastjo ponovitvenih, neizpostavljenih kontrolnih kultur. Za popolno izražanje odziva sistema na strupene učinke (optimalna občutljivost) se kulturam v zadostnem časovnem obdobju za merjenje zmanjšanja specifične hitrosti rasti omogoči neomejena eksponentna rast pri zadostnih prehranskih pogojih ter stalna svetloba.

5.

Rast in zaviranje rasti sta določena z meritvami biomase alg v odvisnosti od časa. Biomasa alg je opredeljena kot suha teža na prostornino, npr. miligram alg na liter preskusne raztopine. Vendar je suho težo težko meriti, zato se uporabljajo nadomestni parametri. Od teh nadomestkov se najpogosteje uporablja število celic. Drugi nadomestni parametri vključujejo prostornino celic, fluorescenco, optično gostoto itd. Pretvorni faktor med izmerjenim nadomestnim parametrom in biomaso mora biti znan.

6.

Končna točka preskusa je zaviranje rasti, izraženo kot logaritemsko povečanje biomase (povprečne specifične hitrosti rasti) med obdobjem izpostavljenosti. Iz povprečnih specifičnih hitrosti rasti, zabeleženih v nizu preskusnih raztopin, se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje hitrosti rasti (npr. 50-odstotno); ta koncentracija se izrazi kot ErCx (npr. ErC50).

7.

Dodatna spremenljivka odziva, ki se uporablja v tej preskusni metodi, je prirast, ki jo je morda treba določiti, da se izpolnijo specifične zakonske zahteve nekaterih držav. Opredeljena je kot biomasa na koncu obdobja izpostavljenosti, od katere je odšteta biomasa na začetku obdobja izpostavljenosti. Iz prirasti, zabeležene v nizu preskusnih raztopin, se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje prirasti (npr. 50-odstotno), ta koncentracija se izrazi kot EyCx (npr. EyC50).

8.

Poleg navedenega se lahko statistično določita tudi najnižja koncentracija z opaznim učinkom (LOEC) in koncentracija brez opaznega učinka (NOEC).

PODATKI O PRESKUSNI KEMIKALIJI

9.

Podatki o preskusni kemikaliji, ki so lahko uporabni pri vzpostavitvi preskusnih pogojev, vključujejo strukturno formulo, stopnjo čistosti, stabilnost na svetlobi, stabilnost v pogojih preskusa, lastnosti absorpcije svetlobe, pKa in rezultate študij o preoblikovanju, vključno z biološko razgradljivostjo v vodi.

10.

Topnost v vodi, porazdelitveni koeficient oktanol/voda (Pow) in parni tlak preskusne kemikalije morajo biti znani, razpoložljiva pa mora biti tudi validirana metoda za kvantifikacijo kemikalije v preskusnih raztopinah skupaj z navedeno rekuperacijo in mejo zaznavnosti.

VELJAVNOST PRESKUSA

11.

Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjena naslednja izvedbena merila:

Biomasa v kontrolnih kulturah se mora v 72 urah preskusnega obdobja eksponentno povečati najmanj za faktor 16. To ustreza specifični hitrosti rasti v 0,92 dan– 1. Za najpogosteje uporabljene vrste je hitrost rasti navadno bistveno višja (glej Dodatek 2). Merilo morda ne bo izpolnjeno, kadar se uporabijo vrste, ki rastejo počasneje od tistih, ki so navedene v Dodatku 2. V tem primeru se mora preskusno obdobje podaljšati, da se zagotovi 16-kratna rast v kontrolnih kulturah, medtem ko mora biti rast eksponentna skozi celotno preskusno obdobje. Preskusno obdobje se lahko skrajša na najmanj 48 ur, da se ohrani neomejena eksponentna rast med preskusom, pod pogojem, da je dosežen minimalni faktor pomnoževanja 16.

Srednji koeficient variacije za posamične specifične hitrosti rasti (dnevi 0–1, 1–2 in 2–3, za 72-urne preskuse) v kontrolnih kulturah (glej ‚koeficient variacije‘ v Dodatku 1) ne sme prekoračiti 35 %. Za računanje posamičnih specifičnih hitrosti rasti glej odstavek 49. Merilo se uporablja za srednjo vrednost koeficientov variacije, izračunanih za ponovitvene kontrolne kulture.

Koeficient variacije za povprečne specifične hitrosti rasti med celotnim preskusnim obdobjem v ponovitvenih kontrolnih kulturah ne sme prekoračiti 7 % v preskusih z zelenimi algami Pseudokirchneriella subcapitata in Desmodesmus subspicatus. Za druge manj pogosto preskušane vrste vrednost ne sme prekoračiti 10 %.

REFERENČNA KEMIKALIJA

12.

Referenčne kemikalije, kot je na primer 3,5-diklorofenol, ki se uporablja za mednarodni krožni preskus (1), se lahko preskušajo z namenom preverjanja preskusnega postopka. Kot referenčna kemikalija za zelene alge se prav tako lahko uporabi kalijev dikromat. Referenčno kemikalijo je zaželeno preskusiti vsaj dvakrat letno.

UPORABNOST PRESKUSA

13.

Ta preskusna metoda se najlažje uporabi pri vodotopnih kemikalijah, za katere je verjetno, da bodo v pogojih preskusa ostale v vodi. Za preskušanje kemikalij, ki so hlapne, močno adsorptivne, obarvane in slabo topne v vodi, ali kemikalij, ki lahko vplivajo na razpoložljivost hranilnih snovi ali mineralov v preskusnem mediju, so morda potrebne nekatere prilagoditve opisanega postopka (npr. zaprt sistem ali kondicioniranje preskusnih posod). Navodila za nekaj primernih prilagoditev so navedena v (2), (3) in (4).

OPIS PRESKUSNE METODE

Naprava

14.

Preskusne posode in druge naprave, ki pridejo v stik s preskusnimi raztopinami, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala. Predmete je treba temeljito umiti, da organska ali anorganska onesnaževala ne ovirajo rasti alg ali sestave preskusnih raztopin.

15.

Preskusne posode so navadno steklene bučke z dimenzijami, ki dopuščajo zadostno prostornino kulture za meritve med preskusom in zadosten prenos mase CO2 iz ozračja (glej odstavek 30). Količina tekočine mora biti zadostna za analitsko določanje (glej odstavek 37).

16.

Morda bo potrebna tudi nekatera ali vsa oprema v nadaljevanju:

Inkubator za kultiviranje: priporočena je omara ali soba, v kateri se lahko izbrana temperatura inkubacije vzdržuje na ± 2 °C.

Naprave za merjenje svetlobe: treba je poudariti, da lahko metoda za merjenje obsevanosti in še zlasti vrsta sprejemnika (odjemnika) vpliva na izmerjeno vrednost. Meritve naj se po možnosti izvajajo z uporabo okroglega (4 π) sprejemnika (ki reagira na neposredno in odbito svetlobo iz vseh kotov nad in pod ravnino meritve) ali sprejemnika 2 π (ki reagira na svetlobo iz vseh kotov nad ravnino meritve).

Naprava za določanje biomase alg. Število celic, ki je najpogosteje uporabljen nadomestni parameter za biomaso alg, se lahko pridobi z uporabo elektronskega števca delcev, mikroskopa s števno komoro ali pretočnega citometra. Za merjenje drugih nadomestkov biomase je mogoče uporabiti pretočni citometer, fluorimeter, spektrofotometer ali kolorimeter. Pretvorni faktor, ki povezuje število celic s suho težo, je koristen za preračunavanje. Za zagotovitev uporabnih meritev pri nizkih koncentracijah biomase, ko se uporablja spektrofotometer, bo morda treba uporabiti kivete s svetlobno potjo vsaj 4 cm.

Preskusni organizmi

17.

Uporabi se lahko nekaj vrst nepritrjenih mikroalg in cianobakterij. Sevi, navedeni v Dodatku 2, so se izkazali kot primerni za uporabo preskusnega postopka, določenega v tej preskusni metodi.

18.

Pri uporabi drugih vrst je treba poročati o sevu in/ali izvoru. Treba je potrditi, da se lahko eksponentna rast izbrane preskusne alge ohrani skozi celotno preskusno obdobje pri prevladujočih pogojih.

Gojišče

19.

Priporočata se dve alternativni gojišči; gojišče OECD in gojišče AAP. Sestavi teh gojišč sta prikazani v Dodatku 3. Začetna vrednost pH in kapaciteta pufrov (ki ureja porast pH) sta v teh dveh gojiščih različni. Zato so rezultati preskusov lahko različni, odvisno od uporabljenega gojišča, zlasti pri preskušanju ionizirajočih kemikalij.

20.

Morda bo za nekatere namene, npr. pri preskušanju kovin in kelatnih reagentov ali pri preskušanju pri različnih vrednostih pH, treba prilagoditi gojišče. Uporaba prilagojenega gojišča mora biti podrobno opisana in utemeljena (3)(4).

Začetna koncentracija biomase

21.

Začetna biomasa v preskusnih kulturah mora biti enaka v vseh preskusnih kulturah in zadostno nizka, da dopušča eksponentno rast skozi celotno inkubacijsko obdobje brez tveganja izčrpanja hranilnih snovi. Začetna biomasa kot suha teža ne sme prekoračiti 0,5 mg/l. Priporočene so naslednje začetne koncentracije celic:

Pseudokirchneriella subcapitata

5 × 103 – 104 celic/ml

Desmodesmus subspicatus

2 – 5 × 103 celic/ml

Navicula pelliculosa

104 celic/ml

Anabaena flos-aquae

104 celic/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 celic/ml

Koncentracija preskusne kemikalije

22.

Razpon koncentracije, v katerem se lahko pojavijo učinki, je lahko določen na osnovi rezultatov iz preskusov za določanje območja delovanja. Za zadnji dokončni preskus naj se izbere najmanj pet koncentracij, razvrščenih v geometrijski vrsti s faktorjem, ki ne presega 3,2. Za preskusno kemikalijo, ki kaže ravno krivuljo odziva na koncentracijo, je lahko določen višji faktor. Serije koncentracij naj po možnosti pokrivajo razpon, ki povzroča 5–75-odstotno zaviranje hitrosti rasti alg.

Ponovitve in kontrole

23.

Načrt preskusa mora vključevati tri ponovitve za vsako preskusno koncentracijo. Če ni zahtevana določitev NOEC, se lahko načrt preskusa prilagodi, da se poveča število koncentracij in zmanjša število ponovitev na koncentracijo. Izvedejo se najmanj tri kontrolne ponovitve, v idealnih razmerah pa naj se uporabi dvakratno število ponovitev za vsako preskusno koncentracijo.

24.

Za analitsko določanje koncentracij preskusne kemikalije se lahko pripravi ločena serija preskusnih raztopin (glej odstavka 36 in 38).

25.

Kadar se za raztapljanje preskusne kemikalije uporabi topilo, morajo biti v načrt preskusa vključene dodatne kontrolne kulture, ki vsebujejo topilo v enaki koncentraciji, kot je bila uporabljena pri preskusnih kulturah.

Priprava kulture inokuluma

26.

Kultura inokuluma se pripravi v preskusnem mediju 2–4 dni pred začetkom preskusa zaradi prilagoditve preskusnih alg preskusnim pogojem in zagotovitve, da so alge v fazi eksponentne rasti, ko se uporabijo za inokulacijo preskusnih raztopin. Biomaso alg je treba prilagoditi, da lahko eksponentna rast do začetka preskusa prevlada v kulturi inokuluma. Kultura inokuluma se inkubira pri enakih pogojih kot preskusne kulture. V kulturi inokuluma se meri porast biomase, da se zagotovi rast znotraj normalnega obsega za preskusni sev v pogojih kultiviranja. Primer postopka za kultiviranje alg je opisan v Dodatku 4. Da ne pride do sinhrone delitve celic med preskusom, se lahko zahteva še drugi korak razmnoževanja kulture inokuluma.

Priprava preskusnih raztopin

27.

Vse preskusne raztopine morajo vsebovati enake koncentracije gojišč in začetno biomaso preskusnih alg. Preskusne raztopine izbranih koncentracij se navadno pripravijo z mešanjem založne raztopine preskusne kemikalije z gojiščem in kulturo inokuluma. Založne raztopine se navadno pripravijo tako, da se kemikalija raztopi v preskusnem mediju.

28.

Topila, npr. aceton, t-butil alkohol in dimetilformamid, je mogoče uporabljati kot nosilce za dodajanje kemikalij z nizko topnostjo v vodi preskusnemu mediju (2)(3). Koncentracija topila naj ne prekorači 100 μl/l in enaka koncentracija topila naj bo dodana vsem kulturam (tudi kontrolnim) v preskusni seriji.

Inkubacija

29.

Preskusne posode se zaprejo z zamaški, ki prepuščajo zrak. Posode se pretresejo in postavijo v inkubator za kultiviranje. Med preskusom je treba imeti alge v suspenziji in omogočiti prenos CO2. V ta namen je potrebno nenehno tresenje ali mešanje. Kulture naj se ohranjajo pri temperaturi med 21 in 24 °C, kontrolirani pri ± 2 °C. Za vrste, ki niso naštete v Dodatku 2, npr. tropske, so lahko primerne višje temperature, pod pogojem, da je mogoče izpolniti merila za veljavnost. Priporočeno je, da se bučke v inkubatorju naključno razporedijo in dnevno prestavljajo.

30.

Vrednost pH kontrolnega medija se med preskusom ne bi smela povečati za več kot 1,5 enote. Za kovine in spojine, ki delno ionizirajo pri vrednosti pH, približno enaki preskusni vrednosti pH, je morda treba omejiti premik (drift) pH, da se zagotovijo ponovljivi in natančni rezultati. Premik za < 0,5 enote pH je tehnično izvedljiv in ga je mogoče doseči tako, da se v preskusni raztopini zagotovi primerna stopnja prenosa mase CO2 iz okoliškega zraka, npr. s povečanjem stopnje tresenja. Druga možnost je zmanjšanje potrebe po CO2 z zmanjšanjem začetne biomase ali skrajšanjem trajanja preskusa.

31.

Površina, na kateri so kulture inkubirane, naj prejema stalno, enotno fluorescentno osvetljenost, npr. ‚hladno belo‘ svetlobo ali ‚dnevno svetlobo‘. Sevi alg in cianobakterij se razlikujejo glede svojih zahtev po svetlobi. Izbrana obsevanost naj ustreza uporabljenemu preskusnemu organizmu. Za priporočene vrste zelenih alg izberite obsevanost na stopnji preskusnih raztopin v območju 60–120 μE·m– 2 s– 1, kadar se z uporabo primernega sprejemnika meri v fotosintetično učinkovitem obsegu valovne dolžine 400–700 nm. Nekatere vrste, zlasti Anabaena flos-aquae, dobro rastejo pri nižjih obsevanostih in se pri visokih obsevanostih lahko poškodujejo. Za takšne vrste naj bo izbrana povprečna obsevanost v območju 40–60 μE·m– 2 · s– 1. (Pri merilnikih svetlobe, umerjenih v luksih, enakovredno območje 4 440–8 880 luksov za hladno belo svetlobo približno ustreza priporočeni obsevanosti 60– 120 μE·m– 2 · s– 1). V inkubacijskem območju vzdržujte obsevanost v razponu ± 15 % povprečne obsevanosti.

Trajanje preskusa

32.

Preskus navadno traja 72 ur. Lahko traja tudi več ali manj časa, pod pogojem da so izpolnjena vsa merila za veljavnost, navedena v odstavku 11.

Meritve in analitske določitve

33.

Biomasa alg v vsaki bučki se med preskusnim obdobjem določa najmanj enkrat dnevno. Če se merjenje izvaja na majhnih količinah, vzetih iz preskusne raztopine s pipeto, je treba te ohranjati nespremenjene.

34.

Merjenje biomase se izvaja z ročnim štetjem celic s pomočjo mikroskopa ali z elektronskim števcem delcev (s štetjem celic in/ali biovolumnom). Alternativne tehnike, npr. pretočno citometrijo, klorofilno fluorescenco in vitro ali in vivo (5)(6) ali optično gostoto, se lahko uporabijo, če je mogoče v območju biomase v preskusu ugotoviti zadovoljivo povezavo z biomaso.

35.

Vrednost pH raztopin se izmeri na začetku in koncu preskusa.

36.

Če je na voljo analitski postopek za določanje preskusne kemikalije v uporabljenem razponu koncentracije, je treba preskusne raztopine analizirati, da se preverijo začetne koncentracije in vzdrževanje koncentracij izpostavljenosti med preskusom.

37.

Analiza koncentracije preskusne kemikalije na začetku in koncu preskusa nizke in visoke preskusne koncentracije ter koncentracija okrog pričakovane EC50 lahko zadoščata, če je verjetno, da se bodo koncentracije izpostavljenosti med preskusom od nominalnih vrednosti razlikovale za manj kot 20 %. Analiza vseh preskusnih koncentracij na začetku in koncu preskusa je priporočljiva, če je malo verjetno, da bodo koncentracije ostale znotraj območja 80– 120 % nominalne koncentracije. Za hlapne, neobstojne ali močno adsorptivne preskusne kemikalije se med obdobjem izpostavljenosti priporoča dodatno vzorčenje za analizo v 24-urnih intervalih, da se bolje določijo izgube preskusne kemikalije. Za te kemikalije so morda potrebne posebne ponovitve. V vseh primerih je treba izvesti določanje koncentracije preskusne kemikalije samo na eni ponovitveni posodi pri vsaki preskusni koncentraciji (ali vsebinah posod, zbranih s ponovitvijo).

38.

Preskusno gojišče, pripravljeno posebej za analizo koncentracij izpostavljenosti med preskusom, naj se obravnava enako kot tisto, uporabljeno za preskušanje; npr. naj se inokulira z algami in inkubira pri enakih pogojih. Če je zahtevana analiza raztopljene koncentracije preskusne kemikalije, je morda treba ločiti alge od gojišča. Najbolje je, da se ločitev izvede s centrifugiranjem z nizkim pospeškom g, ki zadošča, da se alge usedejo.

39.

Če so na voljo dokazi, da so se koncentracije preskusne kemikalije zadovoljivo vzdrževale v območju ± 20 % nominalne ali izmerjene začetne koncentracije ves čas preskusa, lahko analiza rezultatov temelji na nominalnih ali izmerjenih začetnih vrednostih. Če odklon od nominalne ali izmerjene začetne koncentracije ni v območju ± 20 %, se analiza rezultatov utemelji na geometrijski srednji koncentraciji med izpostavljenostjo ali na modelih, ki opisujejo upad koncentracije preskusne kemikalije (3)(7).

40.

Preskus zaviranja rasti alge je bolj dinamičen preskusni sistem od večine drugih kratkoročnih preskusov strupenosti za vodno okolje. Posledično je morda težko določiti dejanske koncentracije izpostavljenosti, zlasti za adsorptivne kemikalije, preskušane pri nizkih koncentracijah. Izginevanje preskusne kemikalije iz raztopine z adsorpcijo v naraščajočo biomaso alg v takih primerih ne pomeni, da se je kemikalija izgubila iz preskusnega sistema. Ko je rezultat preskusa analiziran, je treba preveriti, ali upadanje koncentracije preskusne kemikalije med preskusom spremlja upadanje v zaviranju rasti. Če je tako, se lahko prouči uporaba primernega modela, ki opisuje upadanje koncentracije preskusne kemikalije (7). Če ne, je morda primerno utemeljiti analizo rezultatov na začetnih (nominalnih ali izmerjenih) koncentracijah.

Druga opazovanja

41.

Izvesti je treba mikroskopsko opazovanje, da se preveri normalna in zdrava navzočnost kulture inokuluma in opazi vsako nenormalno pojavljanje alg (ki ga lahko povzroči izpostavljenost preskusni kemikaliji) na koncu preskusa.

Mejni preskus

42.

V nekaterih okoliščinah, npr. kadar predhodni preskus pokaže, da preskusna kemikalija nima strupenih učinkov pri koncentracijah do 100 mg/l ali do svoje meje topnosti v preskusnem mediju (kar je nižje), se lahko izvede mejni preskus, ki vključuje primerjavo odzivov v kontrolni skupini in eni tretirani skupini (100 mg/l ali koncentracija, ki je enaka meji topnosti). Zelo se priporoča, da se ta preskus podpre z analizo koncentracije izpostavljenosti. Za mejni preskus se uporabljajo vsi prej opisani preskusni pogoji in merila za veljavnost, razen da je število tretiranih ponovitev najmanj šest. Spremenljivke odziva v kontrolni in tretirani skupini se lahko analizirajo z uporabo statističnega preskusa za primerjavo sredin, npr. s t-preskusom. Če so variance obeh skupin neenake, je treba izvesti t-preskus, prilagojen za neenake variance.

PODATKI IN POROČANJE

Izris rastnih krivulj

43.

Biomasa v preskusnih posodah je lahko izražena v enotah nadomestnega parametra, uporabljenega za merjenje (npr. število celic, fluorescenca).

44.

V preglednici se predstavi ocenjena koncentracija biomase v preskusnih kulturah in kontrolnih skupinah skupaj s koncentracijami preskusnega materiala in časom meritev, zabeleženim z ločljivostjo vsaj celih ur, da se izdela izris rastnih krivulj. V tej fazi so lahko uporabne tako logaritemske kot linearne lestvice, vendar so logaritemske lestvice obvezne in na splošno podajo boljšo predstavitev variacij rastnega vzorca med preskusnim obdobjem. Eksponentna rast pri izrisu na logaritemski lestvici kaže ravno črto in naklon (nagib) črte prikazuje specifično hitrost rasti.

45.

Z uporabo izrisov se preveri, ali kontrolne kulture skozi celotni preskus rastejo eksponentno in s pričakovano hitrostjo. Zaradi možnih napak se preverijo vse podatkovne točke in videz krivulj ter neobdelani podatki in postopki. Zlasti se preverijo vse podatkovne točke, za katere se zdi, da odstopajo zaradi sistematične napake. Če je mogoče postopkovne napake očitno prepoznati in/ali so zelo verjetne, se specifična podatkovna točka označi kot osamelec in se ne vključi v kasnejšo statistično analizo. (Koncentracija alg nič v eni od dveh ali treh ponovitvenih posod lahko pokaže, da posoda ni bila pravilno inokulirana ali da je bila neprimerno očiščena.) Razlogi za zavrnitev podatkovnih točk kot osamelcev morajo biti jasno navedeni v poročilu o preskusu. Veljavni razlogi so samo (redko) postopkovne napake, ne pa nenatančnost. Statistični postopki za prepoznavanje osamelcev imajo za to vrsto problema omejeno uporabnost in ne morejo nadomestiti strokovne presoje. Osamelci (označeni kot taki) naj se po možnosti ohranijo med podatkovnimi točkami, ki so prikazane v katerikoli grafični ali tabelarni predstavitvi podatkov.

Spremenljivke odziva

46.

Namen preskusa je določiti učinke preskusne kemikalije na rast alg. Ta preskusna metoda opisuje dve spremenljivki odziva, saj imajo države članice različne preference in zakonske zahteve. Da bi bili rezultati preskusa sprejemljivi v vseh državah članicah, se morajo učinki ovrednotiti z obema spremenljivkama odziva, (a) in (b), ki sta opisani spodaj.

(a)    Povprečna specifična hitrost rasti : ta spremenljivka odziva se izračuna na osnovi logaritemskega naraščanja biomase med preskusnim obdobjem, ki je izraženo dnevno.

(b)    Prirast : ta spremenljivka odziva je biomasa na koncu preskusa, od katere je odšteta začetna biomasa.

47.

Opozoriti je treba, da vrednosti strupenosti, ki se izračunajo iz teh dveh spremenljivk odziva, niso primerljive. To razliko je treba upoštevati pri uporabi rezultatov preskusa. Če se upoštevajo pogoji preskusa iz te preskusne metode, bodo vrednosti ECx, ki temeljijo na povprečni specifični hitrosti rasti (ErCx), navadno višje od rezultatov, ki temeljijo na prirasti (EyCx), zaradi matematične osnove teh dveh pristopov. To se ne sme razlagati kot razlika v občutljivosti obeh spremenljivk odziva. Razlika enostavno izvira iz različne matematične narave vrednosti. Pojem povprečne specifične hitrosti rasti temelji na splošnem vzorcu eksponentne rasti alg v nelimitiranih kulturah, ko se strupenost ocenjuje na osnovi učinkov na hitrost rasti brez odvisnosti od absolutne ravni specifične hitrosti rasti v kontrolnem vzorcu, naklona krivulje koncentracija-odziv ali od trajanja preskusa. Nasprotno pa so rezultati, ki temeljijo na prirasti kot spremenljivki odziva, odvisni od vseh teh drugih spremenljivk. EyCx je odvisna od specifične hitrosti rasti vrst alg, uporabljenih v vsakem preskusu, in od maksimalne specifične hitrosti rasti, ki je lahko različna glede na vrsto in celo glede na seve alg. Ta spremenljivka odziva se ne uporablja za primerjanje občutljivosti na strupene snovi med vrstami alg ali celo različnimi sevi. Z znanstvenega vidika ima uporaba povprečne specifične hitrosti rasti prednost pri ocenjevanju strupenosti, vendar so ocene strupenosti na osnovi prirasti vključene v to preskusno metodo, da se izpolnijo trenutne zakonske zahteve nekaterih držav.

Povprečna hitrost rasti

48.

Povprečna specifična hitrost rasti za določeno obdobje se izračuna kot logaritemsko povečanje biomase za vsako posamezno posodo kontrolnih in tretiranih skupin iz enačbe [1]:

Formula

[1],

pri čemer je:

μi – j

povprečna specifična hitrost rasti od časa i do j,

Xi

biomasa v času i,

Xj

biomasa v času j.

Srednja vrednost hitrosti rasti skupaj z ocenami razhajanj se izračuna za vsako tretirano in kontrolno skupino.

49.

Povprečna specifična hitrost rasti se izračuna za celotno preskusno obdobje (navadno dnevi 0–3) z uporabo nominalno inokulirane biomase kot začetne vrednosti in ne izmerjene začetne vrednosti, saj je v tem primeru dosežena večja natančnost. Če oprema za merjenje biomase dopušča zadovoljivo natančno določanje nizke biomase inokuluma (npr. pretočni citometer), potem se lahko uporabi začetna izmerjena koncentracija biomase. Prav tako se ocenijo posamične hitrosti rasti, izračunane kot specifične hitrosti rasti za vsak dan med potekom preskusa (dneve 0– 1, 1–2 in 2–3) in pregleda se, ali kontrolna hitrost rasti ostaja konstantna (glej merila za veljavnost, odstavek 11). Od celotne povprečne specifične hitrosti rasti znatno nižja specifična hitrost rasti prvega dne lahko nakazuje lag fazo (fazo prilagajanja). Medtem ko je lahko lag faza v kontrolnih skupinah s pravilnim razmnoževanjem predkultur zmanjšana in praktično izničena, lahko lag faza v izpostavljenih kulturah nakazuje obnovitev po začetnem toksičnem stresu ali zmanjšani izpostavljenosti zaradi izgube preskusne kemikalije (vključno s sorpcijo na biomaso alg) po začetni izpostavljenosti. Zaradi tega se lahko oceni posamična hitrost rasti, da se ocenijo učinki preskusne kemikalije, ki se pojavijo med obdobjem izpostavljenosti. Znatne razlike med presečno hitrostjo rasti in povprečno hitrostjo rasti kažejo odklon od konstantne eksponentne rasti in da je utemeljeno natančno preverjanje rastnih krivulj.

50.

Odstotek zaviranja hitrosti rasti za vsako tretirano ponovitev se izračuna po enačbi [2]:

Formula

[2],

pri čemer je:

%Ir

=

odstotek zaviranja povprečne specifične hitrosti rasti,

μC

=

srednja vrednost za povprečno specifično hitrost rasti (μ) v kontrolni skupini,

μT

=

povprečna specifična hitrost rasti za tretirano ponovitev.

51.

Če se za pripravo preskusnih raztopin uporabijo topila, naj se pri izračunu odstotka zaviranja namesto kontrol brez topil uporabi kontrole s topilom.

Prirast

52.

Prirast se računa kot biomasa ob koncu preskusa, od katere je odšteta začetna biomasa za vsako posodo kontrolnega in tretiranega vzorca. Za vsako preskusno koncentracijo in kontrolno skupino se izračuna srednja vrednost prirasti in oceni varianca. Odstotek zaviranja prirasti ( % Iy) se lahko izračuna za vsako tretirano ponovitev po enačbi:

Formula

[3]

pri čemer je:

% Iy

=

odstotek zaviranja prirasti,

YC

=

srednja vrednost prirasti v kontrolni skupini,

YT

=

vrednost prirasti za tretirano ponovitev.

Izris krivulje koncentracija-odziv

53.

Izriše se odstotek zaviranja glede na logaritem koncentracije preskusne kemikalije in se natančno pregleda izris, pri čemer se ne upošteva vsaka takšna podatkovna točka, ki je bila kot osamelec izločena v prvi fazi. Skozi podatkovne točke se potegne ravna črta, in sicer ročno ali z računalniško interpolacijo, da se dobi prvi vtis o razmerju koncentracija-odziv, nato pa se nadaljuje z bolj podrobno metodo, po možnosti z računalniško statistično metodo. Odvisno od predvidene uporabe podatkov, kakovosti (natančnosti) in količine podatkov ter razpoložljivosti orodij za analizo podatkov se je mogoče odločiti (in včasih povsem upravičeno), da se ustavi analiza podatkov na tej stopnji in se preprosto preberejo ključne vrednosti EC50 in EC10 (in/ali EC20) iz ročno narisane krivulje (glej tudi spodnji oddelek o spodbujevalnih učinkih). Utemeljeni razlogi za neuporabo statistične metode lahko vključujejo naslednje:

podatki niso primerni za računalniške metode, saj le-te ne izdelajo nobenih bolj zanesljivih rezultatov, kot jih lahko pridobi strokovna presoja – nekateri računalniški programi v takšnih situacijah celo ne morejo izdelati zanesljive rešitve (ponovitve se ne združujejo itd.);

spodbujevalni odzivi rasti se z uporabo razpoložljivih računalniških programov ne morejo ustrezno obravnavati (glej spodaj).

Statistični postopki

54.

Cilj je količinsko ovrednotiti odziv na koncentracijo z regresijsko analizo. Lahko se uporabi tehtana linearna regresija, po tem ko se izvede linearizacijska pretvorba podatkov o odzivu – na primer v verjetnostnih ali logističnih ali Weibullovih enotah (8), vendar so nelinearni regresijski postopki prednostne metode, ki bolje obravnavajo neizogibne podatkovne nepravilnosti in odklone od enakomerne porazdelitve. Če se te nepravilnosti približujejo ničelnemu ali popolnemu zaviranju, se lahko s pretvorbo povečajo in ovirajo analizo (8). Upoštevati je treba, da so standardne metode za analizo, ki uporabljajo analize probit, analize logit ali Weibullove pretvorbe, namenjene za uporabo na kvantiziranih podatkih (npr. umrljivost ali preživetje) in morajo biti ustrezno prirejene zaradi upoštevanja podatkov o rasti ali o biomasi. Specifični postopki za določevanje vrednosti ECx iz kontinuiranih podatkov so na voljo v (9), (10) in (11). Uporaba nelinearne regresijske analize je podrobneje opisana v Dodatku 5.

55.

Za vsako analizirano spremenljivko odziva se izračuna točkovna ocena vrednosti ECx, pri čemer se uporabi razmerje med odzivom in koncentracijo. Kadar je to mogoče, se za vsako oceno določi 95-odstotne meje zaupanja. Grafično ali statistično je treba določiti ustreznost prileganja podatkov odziva na regresijski model. Regresijska analiza se mora opraviti na odzivih posameznih ponovitev in ne na srednjih vrednostih tretiranih skupin. Če pa je nelinearno prilagajanje krivulj težavno ali zaradi preveč razpršenih podatkov ne uspe, se težavo lahko zaobide z izvedbo regresije na skupinskih srednjih vrednostih kot praktičnim načinom zmanjševanja vpliva pričakovanih osamelcev. Uporaba te možnosti naj se navede v poročilu kot odmik od normalnega postopka, ker ujemanje krivulje s posamičnimi ponovitvami ni dalo dobrih rezultatov.

56.

Ocene EC50 in meje zaupanja se prav tako lahko pridobi z uporabo linearne interpolacije z metodo vezanja (13), če so razpoložljivi regresijski modeli/metode za podatke neustrezni.

57.

Za ocenjevanje LOEC in zato tudi NOEC za učinke preskusne kemikalije na hitrost rasti je treba primerjati srednje vrednosti tretiranih skupin z uporabo tehnik analize variance (ANOVA). Srednja vrednost za vsako koncentracijo se nato primerja s srednjo vrednostjo kontrole z ustrezno metodo večkratne primerjave ali trendnostnega preskusa. Uporabna sta lahko Dunnettov ali Williamsov preskus (12)(14)(15)(16)(17). Treba je ugotoviti, ali velja domneva homogenosti variance v analizi variance. Ta ocena se lahko izvede grafično ali s formalnim preskusom (17). Primerna preskusa sta preskus po Levenu ali preskus po Bartlettu. Če domneva homogenosti variance ni izpolnjena, lahko to odpravimo z logaritemsko pretvorbo podatkov. Če je heterogenost variance skrajna in je ni mogoče odpraviti s pretvorbo, je treba proučiti možnosti analize z metodami, kot so večstopenjski trendnostni preskusi po Jonkheeru. Dodatna navodila o določanju NOEC so navedena v (11).

58.

Nedavni razvoj znanosti je privedel do priporočila o opuščanju koncepta NOEC in njegovi zamenjavi z regresijsko določenimi točkovnimi ocenami ECx. Za ta preskus alg ni bila določena primerna vrednost x. Primerno je območje od 10 do 20 % (odvisno od izbrane spremenljivke odziva) in po možnosti naj se poroča tako o EC10 kot tudi o EC20.

Spodbujanje rasti

59.

Pri nizkih koncentracijah je včasih opaženo spodbujanje rasti (negativno zaviranje). To je lahko posledica hormeze (‚spodbujevalni učinek strupenosti‘) ali dodajanja spodbujevalnih rastnih faktorjev s preskusnim materialom minimalnemu uporabljenemu gojišču. Upoštevati je treba, da naj dodajanje anorganskih hranil ne bi imelo nobenih neposrednih učinkov, saj naj bi preskusni medij ohranjal presežek hranil skozi celoten preskus. Nizek odmerek spodbujanja se navadno ne upošteva pri računanju EC50, razen če je zelo velik. Če pa je zelo velik ali če se izračuna vrednost ECx za nizek x, so potrebni posebni postopki. Brisanju spodbujevalnih odzivov iz analize podatkov se je treba izogibati, če je mogoče; če razpoložljiva programska oprema za prilagajanje krivulje ne more sprejeti manjših spodbujanj, je mogoče uporabiti linearno interpolacijo z metodo vezanja. Če je spodbujanje zelo veliko, naj se obravnava model hormeze (18).

Nestrupeno zaviranje rasti

60.

Preskusni materiali, ki absorbirajo svetlobo, lahko povzročijo zmanjšanje hitrosti rasti, ker senčenje zmanjša količino razpoložljive svetlobe. Takšne fizikalne učinke je treba s prilagoditvijo preskusnih pogojev ločiti od strupenih učinkov in o njih ločeno poročati. Navodila so navedena v (2) in (3).

POROČILO O PRESKUSU

61.

V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije:

 

Preskusna kemikalija:

fizične značilnosti in fizikalno-kemijske lastnosti, vključno z mejo topnosti v vodi,

kemijski identifikacijski podatki (npr. številka CAS), vključno s čistostjo (nečistote).

 

Preskusne vrste:

sev, dobavitelj ali vir in uporabljeni pogoji gojenja.

 

Preskusni pogoji:

datum začetka preskusa in njegovo trajanje,

opis načrta preskusa: preskusnih posod, volumnov kultur, gostote biomase na začetku preskusa,

sestava medija,

preskusne koncentracije in ponovitve (npr. število ponovitev, število uporabljenih preskusnih koncentracij in geometrijskih naraščanj),

opis priprave preskusnih raztopin, vključno z uporabo topil itd.,

inkubator za kultiviranje,

obsevanost in kakovost svetlobe (vir, homogenost),

temperatura,

preskušene koncentracije: nominalne preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za določevanje koncentracije preskusne kemikalije v preskusnih posodah. Poroča naj se o analitskem izkoristku metode in meji določanja v preskusni matrici,

vsi odkloni od te preskusne metode,

metoda za določanje biomase in dokazi o korelaciji med izmerjenim parametrom in suho težo.

 

Rezultati:

vrednosti pH na začetku in koncu preskusa za vsa tretiranja,

biomasa za vsako bučko pri vsaki točki meritve in metoda za merjenje biomase,

rastne krivulje (izris biomase glede na čas),

izračunane spremenljivke odziva za vsako tretirano ponovitev, s srednjimi vrednostmi in koeficienti variacij za ponovitve,

grafična predstavitev razmerja koncentracija/učinek,

ocene strupenosti za spremenljivke odziva, npr. EC50, EC10, EC20, in pripadajoči intervali zaupanja. Če sta izračunani, vrednosti LOEC in NOEC, ter statistične metode, uporabljene za njuno določitev,

če je bila uporabljena analiza variance, velikost opaženega učinka (npr. najmanj pomembna razlika),

vsako spodbujanje rasti, ki se je pokazalo pri katerem koli tretiranju,

vsi drugi opaženi učinki, npr. morfološke spremembe alg,

razprava o rezultatih, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode.

LITERATURA

(1)

Mednarodna organizacija za standardizacijo (1993). ISO 8692 Kakovost vode – Preskus zaviranja rasti sladkovodnih alg.

(2)

Mednarodna organizacija za standardizacijo (1998). ISO/DIS 14442. Kakovost vode – Smernice za preskuse zaviranja rasti alg s slabo topnimi materiali, hlapnimi spojinami, kovinami in odpadno vodo.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, št. 23. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(4)

Mednarodna organizacija za standardizacijo (1998). ISO 5667-16 Kakovost vode – Vzorčenje – 16. del: Navodilo za biološke preskuse vzorcev.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R., in Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.

(6)

Slovacey, R. E., in Hanna, P. J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919–925

(7)

Simpson, S. L., Roland, M. G. E., Stauber, J. L., in Batley, G. E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Environ. Chem. 22: 2073–2079.

(8)

Christensen, E. R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713–718.

(9)

Nyholm, N., Sørensen, P. S., Kusk, K. O., in Christensen, E. R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Environ. Chem. 11: 157– 167.

(10)

Bruce, R. D., in Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Environ. Chem. 11: 1485– 1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(12)

Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096– 1121.

(13)

Norberg-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.

(15)

Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103– 117.

(16)

Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531.

(17)

Draper, N. R., in Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, druga izdaja. Wiley, New York.

(18)

Brain, P., in Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.

Dodatek 1

Opredelitve pojmov

Za namene te preskusne metode se uporabljajo naslednje opredelitve in okrajšave:

 

Biomasa je suha teža žive snovi, prisotne v populaciji, izražena v dani prostornini; npr. miligram alg na liter preskusne raztopine. ‚Biomasa‘ je običajno opredeljena kot masa, vendar se v tem preskusu ta beseda uporablja za označevanje mase na prostornino. V tem preskusu se običajno merijo tudi nadomestki za biomaso, kot so npr. število celic, fluorescenca itd., zato se izraz ‚biomasa‘ uporablja tudi za meritve teh nadomestkov.

 

Kemikalija pomeni snov ali zmes.

 

Koeficient variacije je merilo variabilnosti parametra brez razsežnosti, opredeljeno kot razmerje med standardnim odklonom in srednjo vrednostjo. Izraziti ga je mogoče tudi kot odstotno vrednost. Srednji koeficient variacije povprečne specifične hitrosti rasti v ponovitvenih kontrolnih kulturah se izračuna, kot sledi:

1.

izračuna se KV v odstotkih povprečne specifične hitrosti rasti na dan/po posamičnih delih za vsakokratno ponovitev;

2.

izračuna se srednja vrednost vseh izračunanih vrednosti v točki 1, da se pridobi srednji koeficient variacije specifične hitrosti rasti na dan/po posamičnih delih v ponovitvenih kontrolnih kulturah.

 

ECx je koncentracija preskusne kemikalije, raztopljene v preskusnem mediju, katere rezultat je x-odstotno (npr. 50-odstotno) zmanjšanje rasti preskusnega organizma v ustreznem obdobju izpostavljenosti (navesti v primeru odstopanja od polnega ali običajnega trajanja preskusa). Za nedvoumno označitev vrednosti EC, pridobljene iz hitrosti rasti ali prirasti, se uporabljata simbola ‚ErC‘ za hitrost rasti in ‚EyC‘ za prirast.

 

Gojišče je povsem sintetično gojišče, v katerem rastejo preskusne alge med izpostavljenostjo preskusni kemikaliji. Običajno se preskusna kemikalija raztopi v preskusnem mediju.

 

Hitrost rasti (povprečna specifična hitrost rasti) je logaritemsko povečanje biomase v obdobju izpostavljenosti.

 

Najnižja koncentracija z opaznim učinkom (LOEC) je najnižja preskušena koncentracija kemikalije, pri kateri je opaziti statistično značilen učinek zmanjšanja rasti (pri p < 0,05) v primerjavi s kontrolo v navedenem obdobju izpostavljenosti. Vendar morajo imeti vse koncentracije nad vrednostjo LOEC škodljiv učinek, ki je enak ali večji od škodljivega učinka, opaženega pri vrednosti LOEC. Če teh dveh pogojev ni možno izpolniti, je treba podrobno pojasniti izbiro LOEC (in posledično NOEC).

 

Koncentracija brez opaznega učinka (NOEC) je preskušena koncentracija neposredno pod vrednostjo LOEC.

 

Spremenljivka odziva je spremenljivka za ocenitev strupenosti, izpeljana iz katerih koli izmerjenih parametrov, ki opisujejo biomaso z drugačno računsko metodo. Za to metodo sta hitrost rasti in prirast spremenljivki odziva, neposredno izpeljani iz izmerjene biomase ali katerega koli omenjenega nadomestka.

 

Specifična hitrost rasti je spremenljivka odziva, opredeljena kot količnik razlike naravnih logaritmov opazovanega parametra (v tej preskusni metodi je to biomasa) in upoštevanega časovnega obdobja.

 

Preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo.

 

Prirast je vrednost izmerjene spremenljivke ob koncu obdobja izpostavljenosti, od česar je odšteta vrednost izmerjene spremenljivke ob začetku obdobja izpostavljenosti, s katero se izrazi povečanje biomase med preskusom.

Dodatek 2

Sevi, dokazano primerni za preskušanje

Zelene alge

 

Pseudokirchneriella subcapitata (prej znana kot Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG.

 

Desmodesmus subspicatus (prej znana kot Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG.

Kremenaste alge

Navicula pelliculosa, UTEX 664.

Cianobakterije

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A.

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1.

Viri sevov

Priporočeni sevi so na voljo v kulturah z eno samo vrsto alg v naslednjih zbirkah (po abecednem vrstnem redu):

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

ZDA

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

Združeno kraljestvo

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

University of Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

NEMČIJA

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

ZDA

Videz in značilnosti priporočenih vrst

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Videz

upognjene, zvite posamezne celice

ovalne, v glavnem posamezne celice

paličice

verige ovalnih celic

paličice

Velikost (D × Š) μm

8 – 14 × 2 – 3

7 – 15 × 3 – 12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Prostornina celice (μm3/celico)

40–60 (2)

60–80 (2)

40–50 (2)

30–40 (2)

2,5 (3)

Suha teža celice (mg/celico)

2 – 3 × 10– 8

3 – 4 × 10– 8

3 – 4 × 10– 8

1 – 2 × 10– 8

2 – 3 × 10– 9

Hitrost rasti (4) (dan– 1)

1,5–1,7

1,2–1,5

1,4

1,1–1,4

2,0–2,4

Posebna Priporočila o kultiviranju in ravnanju s priporočenimi preskusnimi vrstami

Pseudokirchneriella subcapitata in Desmodesmus subspicatus

Te zelene alge se na splošno lahko vzdržuje v različnih gojiščih kultur. Podatki o primernih gojiščih so na voljo v zbirkah kultur. Celice so navadno samotarske, meritve celične gostote pa se lahko izvedejo na enostaven način z uporabo elektronskega števca delcev ali mikroskopa.

Anabaena flos-aquae

Za gojenje založne kulture se lahko uporabijo različna gojišča. Zelo pomembno je, da se šaržni kulturi ne dopusti, da gre preko logaritemske faze rasti, kadar se obnavlja, saj je na tej stopnji obnova težka.

Anabaena flos-aquae razvije skupke ugnezdenih verig celic. Velikost teh skupkov je glede na pogoje kultiviranja lahko različna. Te skupke je pri štetju s pomočjo mikroskopa ali ob uporabi elektronskega števca delcev za določanje biomase morda treba ločiti.

Za ločevanje verig se lahko uporabi ultrazvočno razbijanje verig, da se zmanjša variabilnost štetja. Daljše ultrazvočno razbijanje od priporočenega za ločevanje verig v krajše dolžine lahko uniči celice. Jakost in trajanje ultrazvočnega razbijanja morata biti enaka za vse tretirane skupine.

Na hemocitometru se prešteje dovolj polj (najmanj 400 celic), da se nadomesti variabilnost. To bo izboljšalo zanesljivost mikroskopskega določanja gostote.

Za določanje celotnega volumna celic alg Anabaena po ločevanju celičnih verig z natančnim ultrazvočnim razbijanjem se lahko uporabi elektronski števec delcev. Energijo ultrazvočnega razbijanja je treba prilagoditi, da se prepreči razkroj celic.

Da se zagotovi dobro premešano in homogeno suspenzijo alg, ki se uporabi za inokulacijo preskusnih posod, se uporabi vorteks mešalnik ali podobna primerna metoda.

Preskusne posode naj se postavijo na krožno in recipročno stresalno mizo pri približno 150 obratih na minuto. Alternativno se lahko uporabi prekinjeno mešanje za zmanjšanje težnje Anabaene po oblikovanju grud. Če se grude pojavijo, je treba paziti, da se doseže reprezentativne vzorce za merjenje biomase. Za razdrobitev grud je morda pred vzorčenjem potrebno močno mešanje.

Synechococcus leopoliensis

Za gojenje založne kulture je mogoče uporabiti različna gojišča. Podatki o primernih gojiščih so na voljo v zbirkah kultur.

Synechococcus leopoliensis raste kot samotarske celice v obliki paličic. Celice so zelo majhne, kar otežuje uporabo mikroskopskega štetja za merjenje biomase. Uporabni so elektronski števci delcev, opremljeni za štetje delcev do najmanjše velikosti približno 1 μm. Primerne so tudi in vitro fluorometrične meritve.

Navicula pelliculosa

Za gojenje založne kulture je mogoče uporabiti različna gojišča. Podatki o primernih gojiščih so na voljo v zbirkah kultur. Pomembno si je zapomniti, da je v gojišču zahtevan silikat.

Navicula pelliculosa lahko pri določenih rastnih pogojih oblikuje skupke. Celice alg se zaradi proizvajanja lipidov včasih kopičijo na površinski prevleki. V teh okoliščinah je potrebno zagotoviti posebne ukrepe, ko so za pridobitev reprezentativnih vzorcev odvzeti podvzorci za določanje biomase. Morda je potrebno močno stresanje, npr. z uporabo vorteks mešalnika.

Dodatek 3

Gojišče

Uporabi se lahko eno od naslednjih dveh gojišč:

Gojišče OECD: originalno gojišče OECD TG 201, tudi v skladu z ISO 8692.

US EPA gojišče AAP, tudi v skladu z ASTM.

Pri pripravi teh gojišč je treba uporabiti kemikalije s čistostjo reagenta ali analitsko čiste kemikalije in deionizirano vodo.

Sestava gojišča AAP (US EPA) in gojišča OECD TG 201.

Element

AAP

OECD.

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 ·6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2·2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4·7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3·6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA·2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MgCl2 ·4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2·6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4·2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2·2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

Molsko razmerje med EDTA in železom je malenkost večje od ena. To preprečuje usedline železa in istočasno zmanjšuje kelacijo ionov težkih kovin.

V preskusu s kremenasto algo Navicula pelliculosa morata biti obe gojišči dopolnjeni z Na2SiO3 · 9H20, da je pridobljena koncentracija 1,4 mg Si/l.

Vrednost pH gojišča je pridobljena z ravnotežjem med karbonatnim sistemom gojišča in parcialnim tlakom CO2 v atmosferskem zraku. Približno razmerje med vrednostjo pH pri 25 °C in molsko koncentracijo bikarbonata je:

pHeq = 11,30 + log[HCO3].

Pri 15 mg NaHCO3/l je pHeq = 7,5 (gojišče US EPA), pri 50 mg NaHCO3/l je pHeq = 8,1 (gojišče OECD).

Elementna sestava v preskusnih gojiščih

Element

AAP

OECD

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Priprava gojišča OECD

Hranilna snov

Koncentracija v založni raztopini

založna raztopina 1:

makrohranilne snovi

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

založna raztopina 2:

železo

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

založna raztopina 3:

elementi v sledovih

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

založna raztopina 4:

bikarbonat

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Založne raztopine se sterilizirajo z membransko filtracijo (s povprečnim premerom por 0,2 μm) ali avtoklaviranjem (120 °C, 15 min). Raztopine se shranijo v temnem prostoru pri 4 °C.

Raztopin 2 in 4 se ne avtoklavira, temveč le sterilizira z membransko filtracijo.

Gojišče se pripravi z dodajanjem primerne količine založnih raztopin 1–4 vodi.

 

K 500 ml sterilizirane vode se doda:

 

10 ml založne raztopine 1,

 

1 ml založne raztopine 2,

 

1 ml založne raztopine 3,

 

1 ml založne raztopine 4.

 

Do 1 000 ml se dopolni s sterilizirano vodo.

Za vzpostavljanje ravnovesja gojišča z atmosferskim CO2 se dopusti dovolj časa; če je potrebno, s pomočjo prepihovanja sterilnega filtriranega zraka za nekaj ur.

Priprava gojišča US EPA

1.

Po 1 ml vsake založne raztopine 2.1–2.7 se dolije v približno 900 ml deionizirane ali destilirane vode, nato se raztopina razredči na 1 liter.

2.

Makrohranilne založne raztopine se pridobijo z raztapljanjem spodaj navedenih snovi v 500 ml deionizirane ali destilirane vode. Reagenti 2.1, 2.2, 2.3 in 2.4 se lahko združijo v eno založno raztopino.

2.1

NaNO3

12,750 g.

2.2

MgCl2 · 6H2O

6,082 g.

2.3

CaCl2 · 2H2O

2,205 g.

2.4

Mikrohranilna založna raztopina (glej 3).

2.5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g.

2.6

K2HPO4

0,522 g.

2.7

NaHCO3

7,500 g.

2.8

Na2SiO3 · 9H2O

glej opombo 1.

Opomba 1: uporablja se samo za preskusne vrste kremenastih alg. Doda se lahko neposredno (202,4 mg) ali z dodajanjem založne raztopine do končne koncentracije 20 mg/l Si v gojišču.

3.

Mikrohranilna založna raztopina se pridobi z raztapljanjem spodaj navedenih snovi v 500 ml deionizirane ali destilirane vode.

3.1

H3BO3

92,760 mg.

3.2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg.

3.3

ZnCl2

1,635 mg.

3.4

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg.

3.5

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg.

3.6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg.

3.7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg.

3.8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg. [dinatrijev (etilenedinitril) tetraacetat].

3.9

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg (glej opombo 2).

Opomba 2: uporablja se samo za gojišča za založne kulture vrst kremenastih alg.

4.

Vrednost pH se uravna na 7,5 ± 0,1 z 0,1 N ali 1,0 N NaOH ali HCl.

5.

Gojišče se filtrira v sterilni vsebnik skozi 0,22-mikronski membranski filter, če se uporabi števec delcev, ali skozi 0,45-mikronski filter, če se števec delcev ne uporabi.

6.

Gojišče se do uporabe shrani v temnem prostoru pri temperaturi približno 4 °C.

Dodatek 4

Primer postopka kultiviranja alg

Splošna opažanja

Namen kultiviranja po naslednjem postopku je pridobiti kulture alg za preskuse strupenosti.

Uporabiti je treba primerne metode, s katerimi se zagotovi, da se kulture alg ne okužijo z bakterijami. Morda so zaželene aksenične kulture, vsekakor pa je treba uvesti in uporabiti kulture z eno samo vrsto alg.

Vse postopke je treba izvesti v sterilnih pogojih, da se prepreči kontaminacija z bakterijami in drugimi algami.

Oprema in materiali

Glej v poglavju o preskusni metodi: Naprava.

Postopki za pridobivanje kultur alg

Priprava hranilnih raztopin (gojišča):

Vse hranilne soli gojišča se pripravi kot koncentrirane založne raztopine ter hrani v temnem in hladnem prostoru. Te raztopine se sterilizirajo s filtracijo ali avtoklaviranjem.

Gojišče se pripravi z dodajanjem pravilne količine založne raztopine sterilni destilirani vodi, pri čemer se pazi, da ne pride do okužbe. Za trdno gojišče se doda 0,8 % agarja.

Založna kultura:

Založne kulture so majhne kulture alg, ki se redno prenašajo v sveža gojišča in se uporabljajo kot začetni preskusni material. Če se kulture ne uporabljajo redno, se nanesejo na poševna agarska gojišča v epruvetah. Nato se najmanj enkrat na dva meseca prenesejo na sveže gojišče.

Založne kulture se gojijo v erlenmajericah z ustreznim gojiščem (volumen približno 100 ml). Kadar se alge inkubirajo pri 20 °C ob stalni osvetljenosti, jih je treba na sveže gojišče prenesti enkrat na teden.

Med prenosom se del ‚stare‘ kulture s sterilno pipeto prenese v erlenmajerico s svežim gojiščem, tako da je pri hitro rastoči vrsti začetna koncentracija približno 100-krat manjša kot v stari kulturi.

Hitrost rasti vrste se lahko določi iz rastne krivulje. Če je ta znana, se lahko oceni gostota, pri kateri je treba kulturo prenesti v novo gojišče. To je treba storiti, preden kultura doseže fazo odmiranja.

Predkultura:

Predkultura je namenjena pridobivanju količine alg, primerne za inokulacijo preskusnih kultur. Predkultura se inkubira v pogojih preskusa in uporabi, ko je še v eksponentni fazi rasti, običajno po inkubaciji, ki traja od 2 do 4 dni. Kulture alg, ki vsebujejo deformirane ali nenormalne celice, je treba zavreči.

Dodatek 5

Analiza podatkov z nelinearno regresijo

Splošni pomisleki

Odziv v preskusih alg in drugih mikrobioloških preskusih rasti – rast biomase – je po naravi stalna ali metrična spremenljivka: hitrost postopka, če se uporabi hitrost rasti, in njen integral v času, če je izbrana biomasa. Obe sta v povezavi z ustreznim povprečnim odzivom ponovitvenih neizpostavljenih kontrol in kažeta največji odziv pri uvedenih pogojih – s svetlobo in temperaturo kot osnovnima določevalnima dejavnikoma v preskusu alg. Sistem je porazdeljen ali homogen in biomasa lahko velja za kontinuum ne glede na posamezne celice. Porazdelitev variance vrste odziva za takšen sistem se nanaša izključno na eksperimentalne dejavnike (običajno opisane z logaritemsko normalno ali normalno porazdelitvijo napake). To je v nasprotju s tipičnimi biološkimi odzivi s kvantiziranimi podatki, pri katerih se pogosto pričakuje, da bo toleranca (tipično binominalno porazdeljena) posameznih organizmov prevladujoča komponenta variance. Odzivi kontrole so nič ali raven naravnega ozadja.

V enostavnih razmerah se normiran ali relativni odziv, r, monotono zmanjša od 1 (ničelno zaviranje) do 0 (100-odstotno zaviranje). Zapomniti si je treba, da vse odzive spremlja napaka, tako da je mogoče navidezno negativna zaviranja izračunati samo kot rezultat naključne napake.

Regresijska analiza

Modeli:

Regresijska analiza je namenjena kvantitativnemu opisovanju krivulje koncentracija-odziv v obliki matematične regresijske funkcije Y = f (C) ali bolj pogoste F(Z), kjer je Z = log C. Če se jo uporabi inverzno, potem C = f– 1(Y) dopušča izračun številk ECx, vključno z EC50, EC10 in EC20 in njihovimi 95-odstotnimi mejami zaupanja. Za več preprostih matematičnih funkcijskih oblik se je izkazalo, da uspešno opisujejo razmerja koncentracija-odziv, ki nastanejo v preskusih zaviranja rasti alg. Funkcije na primer vključujejo logistično enačbo, nesimetrično Weibullovo enačbo in funkcijo logaritemsko normalne porazdelitve, ki so vse sigmoidne krivulje, ki se asimptotično približujejo nič za C → 0 in ena za C → neskončno.

Uporaba stalnih funkcijskih modelov praga (npr. Kooijmanovega modela za ‚zaviranje rasti populacije‘, Kooijman idr., 1996) je nedavno predlagana ali alternativna možnost asimptotičnim modelom. Ta model ne pričakuje učinkov pri koncentracijah pod določenim pragom, EC0+, ki je ocenjen z ekstrapolacijo razmerja odziv-koncentracija pri preseku osi koncentracije z uporabo enostavne zvezne funkcije, ki je v začetni točki nediferenciabilna.

Treba je upoštevati, da je analiza lahko enostavno zmanjšanje vsot preostalih kvadratov (pričakovana konstantna varianca) ali tehtanih kvadratov, če se izravnava heterogenost variance.

Postopek

Ta postopek se izvede, kot sledi: izberemo ustrezno funkcijsko enačbo, Y = f(C), in jo z nelinearno regresijo prilagodimo podatkom. Raje kot srednje vrednosti ponovitev uporabimo meritve iz vsake posamezne bučke, da zberemo toliko podatkov, kot je le mogoče. Če je varianca visoka, praktične izkušnje kažejo, da lahko srednje vrednosti ponovitev zagotavljajo bolj robustno matematično oceno, na katero manj vplivajo naključne napake v podatkih, kot pa pri vsaki ohranjeni posamezni podatkovni točki.

Izrišemo prilagojeno krivuljo in izmerjene podatke ter preverimo, ali je krivulja ustrezno prilagojena. Analiza ostankov je lahko za ta namen še posebej koristno orodje. Če izbrano funkcijsko razmerje, ki naj ustreza odzivu pri posameznih koncentracijah, ne odraža celotne krivulje ali njenega pomembnega dela, na primer odziva pri nizkih koncentracijah, namesto simetrične izberemo drugo možnost prilagajanja krivulje – npr. nesimetrično krivuljo, kot je Weibullova funkcija. Negativna zaviranja rasti lahko povzročajo težave, na primer pri logaritemsko normalni porazdelitveni funkciji, ki prav tako zahteva alternativno regresijsko funkcijo. Takšnim negativnim vrednostim ni priporočeno dodeliti ničelne ali majhne pozitivne vrednosti, ker to izkrivi porazdelitve napak. Morda je primerno narediti ločene prilagoditve krivulj na delih krivulje, kot je del z nizkim zaviranjem rasti, da se oceni številke EClowx. Iz prilagojene enačbe (z ‚inverzno oceno‘, C = f– 1(Y)) izračunamo karakteristične ocenjene vrednosti ECx ter poročamo najmanj o ocenah EC50 in eni ali dveh ocenah EClow x. Izkušnje s praktičnim preskušanjem so pokazale, da natančnost preskusov alg navadno dopušča sprejemljivo natančno ovrednotenje pri 10-odstotni stopnji zaviranja rasti, če so podatkovne točke zadovoljive – razen če se pri nizkih koncentracijah kot moteč dejavnik pojavi spodbujanje rasti. Natančnost ocene EC20 je pogosto znatno boljša kot ocena EC10, ker je EC20 navadno na približno linearnem delu osrednje krivulje koncentracija-odziv. Včasih je EC10 težko razložiti zaradi spodbujanja rasti. Zato je, medtem ko je EC10 navadno dosežena z zadostno natančnostjo, priporočeno tudi stalno poročanje o EC20.

Utežni faktorji

Eksperimentalna varianca pogosto ni konstantna in značilno vsebuje sorazmerno komponento, zato je bolj primerna rutinsko izvedena tehtana regresija. Utežni faktorji za takšno analizo se navadno predpostavljajo kot obratno sorazmerni varianci.

Wi = 1/Var(ri)

Veliko regresijskih programov dopušča možnost analize tehtane regresije z utežnimi faktorji, ki so navedeni v preglednici. Ustrezno naj se utežni faktorji normalizirajo tako, da se jih pomnoži z n/Σ wi (n je število podatkovnih točk), tako da je njihova vsota enaka ena.

Normalizacija odzivov

Normaliziranje s povprečnim odzivom kontrole povzroča nekatere temeljne težave in prinaša precej zapleteno strukturo variance. Z deljenjem odzivov s povprečnim odzivom kontrole za pridobitev deleža zaviranja rasti uvedemo dodatno napako, ki jo povzroči napaka pri srednji vrednosti kontrole. Razen če je napaka zanemarljivo majhna, morajo biti utežni faktorji v regresiji in meje zaupanja popravljeni za kovarianco s kontrolo (Draper in Smith, 1981). Treba je upoštevati, da je velika natančnost pri ocenjenem povprečnem odzivu kontrole pomembna, da se lahko zmanjša celotna varianca za relativni odziv. Ta varianca je:

(podpisani i se nanaša na raven koncentracije i in podpisana 0 na kontrole)

Yi = relativni odziv = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

z varianco Var(Y i) = Var (ri/r0) ≅ (∂Yi/∂ ri)2 · Var(ri) + ((∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)

in ker je (∂ Yi/∂ ri) = 1/r0 in (∂ Y i/∂ r0) = ri/r0 2

z normalno porazdeljenimi podatki ter mi in m0 ponovitvami: Var(ri) = σ2/mi

celotna varianca relativnega odziva, Yi postane:

Var (Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

Napaka srednje vrednosti kontrole je obratno sorazmerna s kvadratnim korenom števila povprečnih kontrolnih ponovitev in se včasih lahko določi, da se vključi podatke preteklih študij in tako zelo zmanjša napake. Alternativni postopek ni normaliziranje podatkov in prilagajanje absolutnih odzivov, vključno s podatki odziva kontrole, temveč predstavitev vrednosti odziva kontrole kot dodatnega parametra, ki ga je treba prilagoditi z nelinearno regresijo. Z običajno 2-parametrsko regresijsko enačbo je pri tej metodi potrebno prilagajanje 3 parametrov in zato zahteva več podatkovnih točk kot nelinearna regresija na podatkih, ki so normalizirani z uporabo vnaprej določenega odziva kontrole.

Obratni intervali zaupanja

Izračun intervalov zaupanja nelinearne regresije z obratno oceno je bolj zapleten in v navadnih statističnih računalniških programskih paketih ni razpoložljiv kot standardna možnost. Približne meje zaupanja se lahko pridobijo s standardnimi programi nelinearne regresije s ponovno parameterizacijo (Bruce in Versteeg, 1992), ki vključuje predelavo matematične enačbe z želenimi ocenjenimi vrednostmi, npr. EC10 in EC50, kot parametri, ki se jih mora oceniti. (Naj bo funkcija I = f (α, β, koncentracija) in izkoristimo razmerja definicij f (α, β, EC10) = 0,1 in f (α, β, EC50) = 0,5, da nadomestimo f (α, β, koncentracija) z enakovredno funkcijo g (EC10, EC50, koncentracija).)

Bolj neposredni izračun (Andersen idr., 1998) se izvede tako, da obdržimo izvirno enačbo in uporabimo Taylorjev raztezek pri srednjih vrednostih za ri in r0.

Nedavno so postale priljubljene metode vezanja. Take metode uporabljajo izmerjene podatke in naključno ponovno vzorčenje, ki se izbere z generatorjem naključnih števil, da se oceni empirična porazdelitev variance.

VIRI

Kooijman, S. A. L. M., Hanstveit, A. O., Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.

Draper, N. R., in Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, druga izdaja. Wiley, New York.

Bruce, R. D., in Versteeg, D. J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485–1494.

Andersen, J. S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A., in Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.

(4)

Poglavje C.11 se nadomesti z naslednjim:

C.11.   AKTIVNO BLATO, PRESKUS ZAVIRANJA DIHANJA (OKSIDACIJA OGLJIKA IN AMONIJA)

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 209 (2010). Opisana preskusna metoda ocenjuje učinek kemikalije na mikroorganizme iz aktivnega blata (večinoma bakterije) z merjenjem hitrosti dihanja (oksidacije ogljika in/ali amonija) v določenih pogojih pri različnih koncentracijah preskusne kemikalije. Ta metoda temelji na preskusu ETAD (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing Industry – Združenja za ekologijo in toksikologijo industrije proizvodnje barvil) (1)(2), na prejšnji smernici OECD TG 209 (3) in na revidiranem standardu ISO 8192 (4). Namen tega preskusa je omogočiti hitro presejalno metodo, s katero je mogoče oceniti vplive kemikalij na mikroorganizme aktivnega blata v biološki (aerobni) fazi čistilnih naprav za odpadne vode. Rezultati tega preskusa lahko služijo tudi kot kazalnik ustreznih koncentracij preskusnih kemikalij, ki niso zaviralne, za uporabo v preskusih biološke razgradljivosti (na primer poglavja C.4 A–F, C.9, C.10, C.12 in C.29 te priloge, OECD TG 302C). V tem primeru se preskus lahko izvede kot presejalni, podobno kot preskus za določanje območja delovanja ali mejni preskus (glej odstavek 39), pri čemer se upošteva samo celotno dihanje. Vendar je treba te informacije pri preskusih lahke biološke razgradljivosti (poglavji C.4 A–F in C.29 te priloge), za katere je koncentracija inokuluma znatno nižja od koncentracije, uporabljene pri tej preskusni metodi, vzeti z rezervo. Vsekakor odsotnost zaviranja pri tem preskusu dihanja ne pomeni samodejno, da bodo pogoji pri preskusu lahke biološke razgradljivosti iz poglavja C.4 A–F ali C.29 te priloge nezaviralni.

2.

V splošnem se zdi, da je bil preskus zaviranja dihanja, odkar je bil prvič objavljen, uspešno uporabljen, v nekaterih primerih pa je bilo poročano o lažnih rezultatih (2)(4)(5). Od koncentracije odvisne krivulje dihanja so včasih dvofazne, krivulje odmerek-odziv se popačijo in vrednosti EC50 so nepričakovano nizke (5). Preiskave so pokazale, da do takih rezultatov pride, če aktivno blato v preskusih znatno nitrira in če ima preskusna kemikalija na oksidacijo amonija večji vpliv kot na splošno heterotrofno oksidacijo. Te lažne rezultate je zato mogoče preseči z dodatnim preskušanjem, pri katerem se uporabi ustrezen zaviralec nitrifikacije. Z merjenjem hitrosti privzema kisika v prisotnosti in odsotnosti takšnega zaviralca, npr. n-aliltiouree (ATU), je mogoče ločeno izračunati skupno, heterotrofno in nitrifikacijsko hitrost privzema kisika (4)(7)(8). Tako je mogoče določiti zaviralne učinke preskusne kemikalije na dveh procesih in na običajen način izračunati vrednosti EC50 za oksidacijo organskega ogljika (heterotrofno) in oksidacijo amonija (nitrifikacijo). Opozoriti je treba, da je v nekaterih redkih primerih zaviralni učinek n-aliltiouree delno ali popolnoma izničen zaradi kompleksacije s preskusnimi kemikalijami ali dodatki gojišču, npr. z ioni Cu++ (6). Ioni Cu++ so bistveni za bakterije vrste Nitrosomonas, vendar so v višjih koncentracijah strupeni.

3.

Potreba po nitrifikaciji pri aerobnem čiščenju odpadnih voda kot nujni korak pri odstranjevanju dušikovih spojin iz odpadnih voda z denitrifikacijo plinastih produktov je postala nuja, še posebej v evropskih državah; Evropska unija je zdaj za koncentracijo dušika v prečiščenih iztokih, odvajanih v sprejemne vode, določila nižje meje (5).

4.

Za večino namenov zadošča že samo metoda ocenjevanja vpliva na procese oksidacije organskega ogljika. Vendar pa je v nekaterih primerih za razlago rezultatov in razumevanje vplivov potrebna preiskava vpliva samo na nitrifikacijo ali pa na oboje, nitrifikacijo in oksidacijo organskega ogljika, pri čemer se to izvede ločeno.

NAČELO PRESKUSNE METODE

5.

Hitrost dihanja vzorcev aktivnega blata, hranjenega s hranili iz sintetičnih odplak, se meri po treh urah stika v zaprti celici, ki vsebuje kisikovo elektrodo. Ob upoštevanju realističnega scenarija izpostavljenosti so lahko primerni daljši časi stika. Če se preskusna kemikalija hitro razkraja, npr. abiotsko s hidrolizo, ali če je hlapna in koncentracije ni mogoče zadovoljivo vzdrževati, je čas izpostavljenosti lahko krajši, npr. 30 minut. Občutljivost vsake šarže aktivnega blata je treba na dan izpostavljenosti preveriti s primerno referenčno kemikalijo. Preskus se običajno uporablja za določanje ECx (npr. EC50) preskusne kemikalije in/ali koncentracije brez opaznega učinka (NOEC).

6.

Zaviranje privzema kisika z mikroorganizmi, ki oksidirajo organski ogljik, je mogoče izraziti ločeno od tistega z mikroorganizmi, ki oksidirajo amonij, in sicer z merjenjem hitrosti privzema kisika v prisotnosti in odsotnosti n-aliltiouree, posebnega zaviralca oksidacije amonija v nitrit, ki na prvi stopnji poteka z nitrifikacijskimi bakterijami. V tem primeru se odstotek zaviranja hitrosti privzema kisika izračuna s primerjavo hitrosti privzema kisika v prisotnosti preskusne kemikalije s srednjo vrednostjo hitrosti privzema kisika ustreznih kontrol, ki ne vsebujejo preskusne kemikalije, v prisotnosti in odsotnosti specifičnega zaviralca, n-aliltiouree.

7.

Z določanjem hitrosti v zmeseh preskusne kemikalije, gojišča iz sintetičnih odplak in vode, pri čemer se zanemari aktivno blato, je mogoče zaznati kakršen koli privzem kisika, ki izvira iz abiotskih procesov.

INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI

8.

Za pravilno razlago rezultatov morajo biti znani identifikacija (po možnosti številka CAS), poimenovanje (IUPAC), čistost, topnost v vodi, parni tlak, hlapnost in adsorpcijske lastnosti preskusne kemikalije. Hlapnih kemikalij običajno ni mogoče zadovoljivo preskusiti, če niso upoštevani posebni varnostni ukrepi (glej odstavek 21).

UPORABNOST PRESKUSNE METODE

9.

Preskusno metodo je mogoče uporabiti pri vodotopnih, slabo topnih in hlapnih kemikalijah. Vendar pa pri kemikalijah z omejeno topnostjo ni vedno mogoče pridobiti vrednosti EC50, veljavne rezultate pri hlapnih kemikalijah pa je mogoče pridobiti le, če večina (recimo > 80 %) preskusne kemikalije ob koncu obdobij izpostavljenosti ostane v reakcijski zmesi. Če obstaja kakršna koli negotovost glede stabilnosti preskusne kemikalije ali njene hlapnosti, je treba za natančnejšo določitev koncentracije ECx predložiti dodatne analitske podporne podatke.

REFERENČNE KEMIKALIJE

10.

Za zagotovitev zanesljivosti preskusne metode in preskusnih pogojev ter za preverjanje občutljivosti vsake šarže aktivnega blata, ki se na dan izpostavljenosti uporablja kot mikrobni inokulum, je treba referenčne kemikalije redno preskušati. Kot referenčna zaviralna kemikalija se priporoča 3,5-diklorofenol (3,5-DCP), saj je znan zaviralec dihanja in se uporablja pri mnogih vrstah preskusov zaviranja/strupenosti (4). Kot referenčno kemikalijo pri zaviranju celotnega dihanja (9) je mogoče uporabiti tudi bakrov (II) sulfat pentahidrat. Kot specifični referenčni zaviralec nitrifikacije se lahko uporabi N-metilanilin (4).

MERILA ZA VELJAVNOST IN OBNOVLJIVOST

11.

Hitrost privzema kisika slepe kontrole (brez preskusne ali referenčne kemikalije) ne sme biti manjša od 20 mg kisika na gram aktivnega blata (suhe teže suspendiranih trdnih snovi) v eni uri. Če je hitrost nižja, je treba preskus ponoviti s spranim aktivnim blatom ali blatom iz drugega vira. Koeficient variacije hitrosti privzema kisika pri kontrolnih ponovitvah na koncu dokončnega preskusa ne sme biti večji od 30 %.

12.

V mednarodnem krožnem preskusu, ki ga je leta 2004 organizirala Mednarodna organizacija za standardizacijo ISO (4) in v kateri je bilo uporabljeno aktivno blato iz gospodinjskih odplak, je bilo ugotovljeno, da se vrednost EC50 kemikalije 3,5-DCP pri celotnem dihanju giblje med 2 mg/l in 25 mg/l, pri heterotrofnem dihanju med 5 mg/l in 40 mg/l in pri nitrifikacijskem dihanju med 0,1 mg/l in 10 mg/l. Če vrednost EC50 kemikalije 3,5-DCP ni v pričakovanem območju, je treba preskus ponoviti z aktivnim blatom iz drugega vira. Vrednost EC50 bakrovega (II) sulfata pentahidrata mora biti za celotno dihanje v območju med 53 mg/l in 155 mg/l (9).

OPIS PRESKUSNE METODE

Preskusne posode in naprave

13.

Uporabljena mora biti običajna laboratorijska oprema in naslednje:

(a)

preskusne posode – na primer 1 000-ml čaše za 500 ml reakcijske zmesi (glej št. 5 na sliki 1);

(b)

celica in dodatki za merjenje koncentracije raztopljenega kisika, primerna kisikova elektroda, zaprta celica brez prostora nad fazno mejo plin-kapljevina, v kateri bo vzorec, in zapisovalnik (npr. št. 7, 8 in 9 na sliki 1 v Dodatku 2); druga možnost je uporaba BPK-steklenice s primerno prilagoditvijo v obliki obojke za zatesnitev kisikove elektrode na vrat steklenice (glej sliko 2 v Dodatku 3). Priporočljivo je, da skozi obojko najprej potisnete pipeto ali stekleno cevko ali pa uporabite posode z navzven razširjenimi robovi; s tem pri vstavljanju kisikove elektrode preprečite izgubo izpodrinjene tekočine. V obeh primerih je treba uporabiti metodo z magnetnim mešalom ali kakšno drugo metodo z mešalom, npr. metodo sonde za samodejno mešanje;

(c)

magnetna mešala in magneti, prekriti z inertnim materialom, za uporabo v merilni komori in/ali preskusnih posodah;

(d)

naprava za prezračevanje: po potrebi mora stisnjeni zrak preiti skozi ustrezen filter, ki odstrani prah in olje, ter skozi steklenice za pranje, ki vsebujejo vodo za vlaženje zraka. Vsebino posod je treba prezračiti s Pasteurjevimi pipetami ali drugimi napravami za prezračevanje, ki ne adsorbirajo kemikalij. Za zadovoljevanje potrebe po kisiku za blato in premagovanje težav s kemikalijami, ki se preveč penijo, so hlapne in se zato izgubijo ali pa jih je pri prezračevanju z razprševanjem zraka težko razpršiti, je mogoče uporabiti krožni stresalnik, ki deluje pri hitrostih kroženja med 150 in 250 vrtljaji na minuto in katerega stekleničke imajo prostornino na primer 2 000 ml. Preskusni sistem običajno sestavlja več čaš, ki so nenehno prezračevane in nameščene zaporedno (npr. v 10- do 15-minutnih časovnih razmikih), nato pa so zaporedno analizirane. Lahko se uporabljajo tudi validirani instrumenti, ki omogočajo hkratno prezračevanje in merjenje hitrosti porabe kisika v zmeseh;

(e)

merilnik vrednosti pH;

(f)

centrifuga, splošna namizna centrifuga za blato, ki zmore hitrost 10 000 m/s2.

Reagenti

14.

Vseskozi je treba uporabljati analitsko čiste reagente.

Voda

15.

Uporabljati je treba destilirano ali deionizirano vodo, ki vsebuje manj kot 1 mg/l raztopljenega organskega ogljika (DOC), razen če je navedeno, naj se uporablja neklorirana vodovodna voda.

Hranila iz sintetičnih odplak

16.

Gojišče mora biti pripravljeno tako, da vsebuje naslednje sestavine v navedenih količinah:

pepton

16 g,

mesni ekstrakt (ali primerljiv rastlinski ekstrakt)

11 g,

sečnino

3 g,

natrijev klorid (NaCl)

0,7 g,

kalcijev klorid dihidrat (CaC12, 2H2O)

0,4 g,

magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO4, 7H2O)

0,2 g,

brezvodni kalijev dihidrogen fosfat (K2HPO4)

2,8 g,

destilirano ali deionizirano vodo do 1 litra.

 

17.

Vrednost pH te raztopine mora biti 7,5 ± 0,5. Če se pripravljeno gojišče ne uporabi takoj, ga je treba najdlje en teden hraniti v temi pri temperaturi od 0 °C do 4 °C ali v pogojih, ki ne povzročajo nikakršnih sprememb v njegovi sestavi. Opozoriti je treba, da so te sintetične odplake 100-kratni koncentrat odplak, opisanih v Tehničnem poročilu OECD z naslovom ‚Predlagana metoda za določitev biološke razgradljivosti površinsko aktivnih snovi, uporabljenih v sintetičnih detergentih‘ z dne 11. junija 1976, tudi z dodatkom dikalijevega hidrogen fosfata.

18.

Druga možnost je, da se sestavine gojišča pred shranitvijo sterilizirajo posamezno ali pa se tik pred izvajanjem preskusa dodata pepton in mesni ekstrakt. Pred uporabo je treba gojišče dobro premešati, vrednost pH pa po potrebi prilagoditi na 7,5 ± 0,5.

Preskusna kemikalija

19.

Založna raztopina mora biti pripravljena za preskusne snovi, ki so brez težav topne v vodi, samo do največje topnosti v vodi (oborine niso sprejemljive). Snovi, ki so slabo topne v vodi, zmesi, katerih sestavine imajo različno topnost v vodi, in adsorptivne snovi je treba odtehtati neposredno v preskusne posode. V teh primerih je druga možnost lahko uporaba založnih raztopin, če so raztopljene koncentracije preskusnih kemikalij analitsko določene v preskusnih posodah (pred dodajanjem aktivnega blata). Če so pripravljeni pripravki Water Accommodated Fraction (WAF), je nujna tudi analitska določitev raztopljenih koncentracij preskusnih kemikalij v preskusnih posodah. Pri uporabi organskih topil se je treba izogibati disperzijskim sredstvom/emulgatorjem. Obdelava založnih raztopin z ultrazvokom in predhodno mešanje suspenzij, npr. čez noč, sta možna, če je na voljo dovolj informacij o stabilnosti preskusne kemikalije v takšnih pogojih.

20.

Preskusna kemikalija lahko škodljivo vpliva na vrednost pH v preskusnem sistemu. Vrednost pH zmesi, obdelanih s preskusno kemikalijo, je treba določiti pred pripravo preskusa, v predhodnem preskusu, da se določi, ali je vrednost pH pred glavnim preskusom in še enkrat na dan glavnega preskusa treba prilagoditi. Raztopine/suspenzije preskusne kemikalije v vodi morajo biti pred dodajanjem inokuluma po potrebi nevtralizirane. Ker pa lahko nevtralizacija spremeni kemijske lastnosti kemikalije, se lahko, odvisno od namena študije, izvede dodatno preskušanje, s katerim se oceni učinek preskusne kemikalije na blato brez prilagoditve vrednosti pH.

21.

Strupeni učinki hlapnih kemikalij lahko zaradi izgub snovi v obdobju izpostavljenosti povzročijo, da so ravni učinkov različne, še posebej pri preskusih, pri katerih zrak skozi sistem steče v obliki mehurčkov. Pri takšnih snoveh je potrebna previdnost; pri kontrolnih zmeseh, ki vsebujejo snov, je treba izvesti specifično analizo za snov in spremeniti režim prezračevanja.

Referenčna kemikalija

22.

Če se kot referenčna kemikalija uporablja 3,5-diklorofenol, je treba pripraviti raztopino 1,00 g 3,5-diklorofenola v 1 000 ml vode (15). Za pospešitev raztapljanja in dopolnitev raztopine do volumna, ko se raztopina ohladi na sobno temperaturo, je treba uporabiti toplo vodo in/ali obdelavo z ultrazvokom. Vendar je treba poskrbeti, da se struktura referenčne kemikalije ne spremeni. Treba je preveriti vrednost pH raztopine in jo po potrebi prilagoditi z NaOH ali H2SO4 tako, da vrednost pH znaša 7–8.

23.

Če se kot referenčna kemikalija uporablja bakrov (II) sulfat pentahidrat, se uporabijo koncentracije 58 mg/l, 100 mg/l in 180 mg/l (faktor 1,8). Snov se tehta neposredno v preskusnih posodah (29–50–90 mg za celoten volumen 500 ml). Nato se raztopi z 234 ml avtoklavirane vodovodne vode. Bakrov (II) sulfat pentahidrat je zlahka topen. Ob začetku preskusa je dodanih 16 ml sintetičnih odplak in 250 ml aktivnega blata.

Specifični zaviralec nitrifikacije

24.

Pripraviti je treba založno raztopino 2,32 g n-aliltiouree (ATU) na liter. Z dodajanjem 2,5 ml te založne raztopine zmesi za inkubacijo s končno prostornino 500 ml znaša končna koncentracija 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l); znano je, da to zadošča (4) za 100-odstotno zaviranje nitrifikacije v nitrifikacijskem aktivnem blatu, ki vsebuje 1,5 g/l suspendiranih trdnih snovi.

Abiotska kontrola

25.

Pri nekaterih pogojih, ki se sicer redko pojavijo, lahko preskusna kemikalija z močno izraženimi redukcijskimi lastnostmi povzroči merljiv abiotski privzem kisika. V takih primerih so za razlikovanje med abiotsko porabo kisika preskusne kemikalije in mikrobnim dihanjem potrebne abiotske kontrole. Abiotske kontrole je mogoče pripraviti z izpustitvijo inokuluma iz preskusnih zmesi. Podobno je abiotske kontrole brez inokuluma mogoče vključiti pri izvajanju podpornih analitskih meritev za določanje dosežene koncentracije med preskusnim obdobjem izpostavljenosti, npr. pri uporabi založnih raztopin kemikalij, ki so slabo topne v vodi, skupaj s sestavinami, ki imajo drugačno topnost v vodi. V posebnih primerih je morda treba pripraviti abiotsko kontrolo s steriliziranim inokulumom (npr. z avtoklaviranjem ali dodajanjem sterilizirajočih strupenih snovi). Nekatere kemikalije lahko proizvajajo ali porabljajo kisik le, če je površina dovolj velika za reakcijo, tudi če zanjo običajno potrebujejo precej višjo temperaturo ali tlak. V tem pogledu je treba posebno pozornost nameniti snovem s peroksidno vezjo. Sterilizirani inokulum zagotavlja veliko površino.

Inokulum

26.

Za splošno uporabo je treba aktivno blato zbrati na izhodu ali v bližini izhoda prezračevalnega bazena dobro delujoče čistilne naprave za odpadne vode, ki v glavnem sprejema gospodinjske odplake. Glede na namen preskusa je mogoče pri primernih koncentracijah suspendiranih trdnih snovi, ki znašajo od 2 g/l do 4 g/l, uporabiti tudi druge primerne vrste virov aktivnega blata, npr. blato, vzgojeno v laboratoriju. Vendar pa bodo vrste blata iz drugih čistilnih naprav najverjetneje imele drugačne lastnosti in občutljivost.

27.

Blato je mogoče uporabiti tako, kot je bilo zbrano, vendar je treba odstraniti grobe delce s kratkotrajnim usedanjem, ki traja npr. od 5 do 15 minut, poleg tega pa je treba tudi odliti ali presejati (npr. z mrežo, katere odprtine merijo 1 mm2) zgornje plasti drobnejših trdih delcev. Druga možnost je homogeniziranje blata v mešalu pribl. 15 sekund ali dlje, vendar je pri tem potrebna previdnost v zvezi s strižnimi silami in spremembami temperature, do katerih lahko pride pri daljšem mešanju.

28.

Blato je pogosto treba oprati, npr. če je hitrost endogenega dihanja nizka. Blato je treba najprej nekaj časa, npr. 10 minut, centrifugirati pri pribl. 10 000 m/s2, da nastaneta čist supernatant in pelet trdnih snovi iz odplak. Tekočino supernatanta je treba zavreči, blato pa z mešanjem ponovno suspendirati v neklorirani vodovodni vodi; vodo za pranje je nato s ponovnim centrifugiranjem treba odstraniti in jo ponovno zavreči. Po potrebi je treba postopek pranja in centrifugiranja ponoviti. Določiti je treba suho maso znanega volumna ponovno suspendiranega blata, blato pa je treba koncentrirati z odstranitvijo bistre raztopine nad usedlino ali pa ga dodatno razredčiti v neklorirani vodovodni vodi, tako da bo koncentracija trdnih snovi v blatu dosegla zahtevano vrednost 3 g/l. Aktivno blato je treba pri preskusni temperaturi nenehno prezračevati (npr. s hitrostjo 2 l/minuto) in ga, kadar je le mogoče, uporabiti na dan zbiranja. Če to ni mogoče, je treba blatu dva dodatna dneva vsak dan dovajati hranila iz sintetičnih odplak (50 ml hranila iz sintetičnih odplak/liter aktivnega blata). Blato se nato uporabi za preskus, rezultati pa so sprejeti kot veljavni, če ni prišlo do nobenih pomembnih sprememb v njegovi aktivnosti, ki se ocenijo prek hitrosti endogenega heterotrofnega in nitrifikacijskega dihanja.

29.

Če se med inkubacijo pojavi penjenje v takšni meri, da so pena in trdne snovi v blatu, ki jih pena nosi, iztisnjene iz prezračevalnih posod, lahko pride do težav. Občasno se penjenje pojavi samo zato, ker so prisotne sintetične odplake, če pa je preskusna kemikalija površinsko aktivna snov ali če preskusna kemikalija vsebuje površinsko aktivno snov, je penjenje treba pričakovati. Zaradi izgube trdnih snovi v blatu iz preskusnih zmesi pride do umetno znižane hitrosti dihanja, kar se lahko napačno razlaga kot rezultat zaviranja. Poleg tega prezračevanje raztopine površinsko aktivne snovi skoncentrira površinsko aktivno snov v plasti pene; zaradi izgube pene iz preskusnega sistema se bodo koncentracije izpostavljenosti znižale. Penjenje je mogoče nadzorovati s preprostimi mehanskimi metodami (npr. z občasnim ročnim mešanjem s stekleno paličico) ali pa z dodajanjem antipenilca iz silikonske emulzije brez površinsko aktivne snovi in/ali z metodo prezračevanja s stresanjem bučke. Če je težava povezana s prisotnostjo sintetičnih odplak, je treba sestavo odplak spremeniti z dodajanjem antipenilca v razmerju npr. 50 μl/l. Če penjenje povzroča preskusna kemikalija, je treba količino, potrebno za zmanjšanje penjenja, določiti pri maksimalni preskusni koncentraciji, nato pa morajo biti vse posamezne prezračevalne posode enako obdelane (vključno s tistimi, ki npr. vsebujejo slepe kontrole, in referenčnimi posodami, v katerih ni pene). Če se uporabljajo antipenilci, ne sme priti do interakcije z inokulumom in/ali preskusno kemikalijo.

PRESKUSNI POSTOPEK

30.

Določiti je mogoče zaviranje pri treh različnih privzemih kisika: pri celotni porabi, samo pri heterotrofni porabi in pri porabi, do katere pride zaradi nitrifikacije. Običajno zadošča merjenje zaviranja celotnega privzema kisika. Treba je poznati učinke na heterotrofni privzem kisika, ki nastanejo zaradi oksidacije organskega ogljika in oksidacije amonija, če za določeno kemikalijo obstaja posebna zahteva za dve takšni ločeni končni točki ali (neobvezno) za razlago atipičnih krivulj ‚odmerek-odziv‘ zaradi zaviranja celotnega privzema kisika.

Preskusni pogoji

31.

Preskus je treba izvesti pri temperaturi v območju 20 ± 2 °C.

Preskusne zmesi

32.

Za pridobitev različnih nominalnih koncentracij preskusne kemikalije (za primere prostornin sestavin glej preglednico 1) je treba pripraviti preskusne zmesi (FT, kot je navedeno v preglednici 1), ki vsebujejo vodo, hranila iz sintetičnih odplak in preskusno kemikalijo. Vrednost pH mora biti po potrebi spremenjena na 7,5 ± 0,5; da bodo končne prostornine v posodah enake in da bo mogoče začeti prezračevanje, je treba zmesi razredčiti z vodo in dodati inokulum.

Referenčne zmesi

33.

Zmesi (FR) morajo biti z referenčno kemikalijo, npr. s 3,5-diklorofenolom, ki nadomešča preskusno kemikalijo, pripravljene na enak način kot preskusne zmesi.

Slepe kontrole

34.

Slepe kontrole (FB) morajo biti v preskusih, pri katerih so preskusne čaše v časovnih razmikih pripravljene zaporedno, pripravljene na začetku in na koncu obdobja izpostavljenosti. Pri preskusih, izvajanih z opremo, ki omogoča sočasne meritve porabe kisika, je treba v vsako serijo sočasne analize vključiti vsaj dve slepi kontroli. Slepe kontrole vsebujejo enako količino aktivnega blata in sintetičnega gojišča, ne pa preskusne ali referenčne kemikalije. Treba jih je razredčiti z vodo do enake prostornine, kot jo imajo preskusne in referenčne zmesi.

Abiotska kontrola

35.

Če je znano ali če se domneva, da ima preskusna kemikalija močno izražene redukcijske lastnosti, je treba za merjenje abiotske porabe kisika po potrebi pripraviti zmes FA. Zmes mora imeti enake količine preskusne kemikalije in hranil iz sintetičnih odplak ter enako prostornino kot preskusne zmesi, vendar brez aktivnega blata.

Splošni postopek in meritve

36.

Preskusne zmesi, referenčne zmesi ter slepe in abiotske kontrole se inkubirajo pri preskusni temperaturi v pogojih prisiljenega prezračevanja (od 0,5 do 1 l/min), da se koncentracija raztopljenega kisika ohranja nad 60–70-odstotno nasičenostjo in da kosmi blata ostajajo v suspenziji. Za to, da kosmi blata ostajajo v suspenziji, je treba kulture tudi mešati. Velja, da se inkubacija začne z začetnim stikom inokuluma aktivnega blata z drugimi sestavinami končne zmesi. Ob koncu inkubacije, po določenem času izpostavljenosti, ki navadno znaša 3 ure, se odvzamejo vzorci za merjenje hitrosti upadanja koncentracije raztopljenega kisika v celici, zasnovani za ta namen (slika 2 v Dodatku 3), ali v do konca napolnjeni BPK-steklenici. Način, na katerega se inkubacije začnejo, je odvisen tudi od zmogljivosti opreme, uporabljene pri merjenju hitrosti porabe kisika. Če jo na primer sestavlja ena sama kisikova sonda, se meritve izvajajo posamezno. V tem primeru morajo biti pripravljene različne zmesi, potrebne za preskus v sintetičnih odplakah, inokulum pa je treba zadržati in v vsako posodo serije je treba dodati zahtevane odmerke blata. Inkubacije se morajo začenjati po vrsti, v ustrezno določenih časovnih razmikih, ki znašajo npr. od 10 do 15 minut. Namesto tega lahko sistem za merjenje sestavlja več sond, ki omogočajo več sočasnih meritev; v tem primeru je mogoče inokulum v ustrezne skupine posod dodati hkrati.

37.

Koncentracija aktivnega blata v vseh preskusnih, referenčnih in slepih zmeseh (ne pa v abiotskih kontrolah) nominalno znaša 1,5 g/l suspendiranih trdnih snovi. Porabo kisika je treba izmeriti po 3 urah izpostavljenosti. Izvesti je treba dodatne, 30-minutne meritve izpostavljenosti, kot je ustrezno in opisano zgoraj v odstavku 5.

Možnost nitrifikacije blata

38.

Za ugotavljanje, ali blato nitrificira in če da, s kakšno hitrostjo, je treba pripraviti zmesi (FB) kot v slepi kontroli in dodatne ‚kontrolne‘ zmesi (FN), ki pa vsebujejo tudi n-aliltioureo v koncentraciji 11,6 mg/l. Zmesi je treba 3 ure zračiti in inkubirati pri 20 ± 2 °C. Nato je treba izmeriti hitrosti privzema kisika in izračunati hitrost privzema kisika zaradi nitrifikacije.

Načrti preskusov

Preskus za določanje območja delovanja

39.

Predhodni preskus se po potrebi uporablja za ocenjevanje območja koncentracij preskusne kemikalije, potrebne pri dokončnem preskusu za ugotavljanje zaviranja porabe kisika. Druga možnost je, da odsotnost zaviranja porabe kisika preskusne kemikalije v predhodnem preskusu lahko kaže na nepotrebnost dokončnega preskusa, vendar je treba vključiti tri ponovitve pri najvišji preskušani koncentraciji predhodnega preskusa (običajno 1 000 mg/l, odvisno pa je od zahteve po podatkih).

Preglednica 1

Primeri zmesi za predhodni preskus

Reagent

Prvotna koncentracija

založna raztopina preskusne kemikalije

10 g/l

založna raztopina sintetičnega gojišča

glej odstavek 16

založna suspenzija aktivnega blata

3 g/l suspendiranih trdnih snovi

sestavine zmesi

odmerjanje v preskusne posode (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

založna raztopina preskusne kemikalije (ml)

(odstavki od 19 do 21)

0,5

5

50

0

50

založna raztopina hranil iz sintetičnih odplak (ml)

(odstavek 16)

16

16

16

16

16

suspenzija aktivnega blata (ml)

(odstavki od 26 do 29)

250

250

250

250

0

voda

(odstavek 15)

233,5

229

184

234

434

skupna prostornina zmesi (ml)

500

500

500

500

500

koncentracije v zmesi

 

 

 

 

 

preskusna suspenzija (mg/l)

aktivno blato

10

10

1 000

0

1 000

(suspendirane trdne snovi) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Preskus je treba izvesti z vsaj tremi koncentracijami preskusne kemikalije, na primer 10 mg/l, 100 mg/l in 1 000 mg/l, s slepo kontrolo in po potrebi z vsaj tremi abiotskimi kontrolami z najvišjimi koncentracijami preskusne kemikalije (kot primer glej preglednico 1). V idealnem primeru najnižja koncentracija ne bi smela imeti nikakršnega učinka na privzem kisika. Izračunati je treba hitrosti porabe kisika in hitrost nitrifikacije, če je to smiselno; nato je treba izračunati odstotek zaviranja. Odvisno od namena preskusa je mogoče tudi samo določiti strupenost mejne koncentracije, npr. 1 000 mg/l. Če pri tej koncentraciji ni nobenega statistično značilnega strupenega učinka, nadaljnje preskušanje pri višjih ali nižjih koncentracijah ni potrebno. Velja pripomniti, da je treba snovi, ki so slabo topne v vodi, zmesi, katerih sestavine imajo različno topnost v vodi, in adsorptivne snovi odtehtati neposredno v preskusne posode. V tem primeru je treba količino, rezervirano za založno raztopino preskusne snovi, nadomestiti z vodo za redčenje.

Dokončni preskus

Zaviranje celotnega privzema kisika

41.

Preskus je treba izvesti s serijo koncentracij, izpeljanih iz predhodnega preskusa. Za pridobitev vrednosti NOEC in ECx (npr. EC50) se v večini primerov priporoča šest kontrolnih koncentracij in pet koncentracij tretiranih vzorcev v geometrijski vrsti s petimi ponovitvami. Abiotske kontrole ni treba ponavljati, če v predhodnem preskusu ni bilo privzema kisika, če pa pride do znatnega privzema, je treba vključiti abiotske kontrole za vsako koncentracijo preskusne kemikalije. Občutljivost blata je treba preveriti z referenčno kemikalijo 3,5-diklorofenol. Občutljivost blata je treba preveriti za vsako preskusno serijo, saj je znano, da se spreminja. V vseh primerih se za merjenje hitrosti privzema kisika v celici s kisikovo elektrodo vzorci iz preskusnih posod odvzamejo po 3 urah in, po potrebi, dodatnih 30 minutah. Iz zbranih podatkov se izračunajo specifične hitrosti dihanja kontrolnih in preskusnih zmesi; odstotek zaviranja se nato izračuna na podlagi spodnje enačbe 7.

Razlikovanje med zaviranjem heterotrofnega dihanja in nitrifikacijo

42.

Z uporabo posebnega zaviralca nitrifikacije, ATU, je mogoča neposredna ocena zaviralnih učinkov preskusnih kemikalij na heterotrofno oksidacijo, z odštetjem hitrosti privzema kisika v prisotnosti ATU od celotne hitrosti privzema (brez prisotnosti ATU) pa je mogoče izračunati učinke na hitrost nitrifikacije. Treba je pripraviti dve seriji reakcijskih zmesi v skladu z načrti preskusov za vrednost ECx ali NOEC, opisano v odstavku 41, dodatno pa mora biti vsaki zmesi ene serije pri končni koncentraciji 11,6 mg/l dodana ATU, ki dokazano popolnoma zavira nitrifikacijo v blatu s koncentracijami suspendiranih trdnih snovi do 3 000 mg/l (4). Po obdobju izpostavljenosti je treba izmeriti hitrosti privzema kisika; te neposredne vrednosti predstavljajo le heterotrofno dihanje, razlika med njimi in ustreznimi hitrostmi celotnega dihanja pa predstavlja nitrifikacijo. Nato se izračunajo različne stopnje zaviranja.

Meritve

43.

Po obdobju(-ih) izpostavljenosti je treba vzorec iz prve prezračevalne posode prenesti v celico s kisikovo elektrodo (slika 1 v Dodatku 2) in takoj izmeriti koncentracijo raztopljenega kisika. Če je na voljo sistem z več elektrodami, je mogoče meritve izvesti sočasno. Mešanje (s prekritim magnetom) je nujno pri isti hitrosti kot takrat, ko se elektroda umerja; s tem se zagotovi, da se sonda na spreminjajoče se koncentracije kisika odziva z minimalno zamudo in da so omogočene redne in ponovljive meritve kisika v merilni posodi. Navadno zadošča sistem s samodejno mešalno sondo, ki ga imajo nekatere kisikove elektrode. Med meritvami je treba celico splakniti z vodo. Namesto tega se za polnjenje BPK-steklenice (slika 2 v Dodatku 3), opremljene z magnetnim mešalom, lahko uporabi vzorec. Nato je treba v vrat steklenice vstaviti kisikovo sondo s prilagoditvijo v obliki obojke in zagnati magnetno mešalo. V obeh primerih je treba nenehno meriti koncentracijo raztopljenega kisika in jo določeno obdobje, običajno 5– 10 minut ali dokler koncentracija kisika ne pade pod 2 mg/l, beležiti. Elektrodo je treba odstraniti, zmes vrniti v prezračevalno posodo, če pa so nujne meritve po daljšem obdobju izpostavljenosti, je treba nadaljevati s prezračevanjem in mešanjem.

Preverjanje koncentracije preskusne kemikalije

44.

Pri nekaterih namenih je morda nujno merjenje koncentracije preskusne kemikalije v preskusnih posodah. Če se uporabljajo založne raztopine:

snovi, ki so slabo topne v vodi,

zmesi s sestavinami, ki imajo različne topnosti v vodi, ali

snovi, ki so dobro topne v vodi, pri katerih pa je koncentracija založne raztopine skoraj enaka največji topnosti v vodi,

je treba opozoriti, da raztopljeni del ni znan in da tudi ni znana prava koncentracija preskusne kemikalije, ki je prenesena v preskusne posode. Za opis izpostavljenosti je nujna analitična ocena koncentracij preskusne kemikalije v preskusnih posodah. Zaradi poenostavitve je treba analitično oceno izvesti pred dodajanjem inokuluma. Ker bodo v preskusne posode preneseni le raztopljeni deli, bodo izmerjene koncentracije morda zelo nizke.

45.

Da se izognemo časovno potratnim in dragim analizam, je preskusno kemikalijo priporočljivo samo odtehtati neposredno v preskusne posode in se za poznejše izračune zanesti na prvotno tehtano nominalno koncentracijo. Razlikovanje med raztopljenimi, neraztopljenimi in adsorbiranimi deli preskusne kemikalije ni potrebno, ker se vsi ti deli prav tako pojavljajo v resničnih pogojih v čistilni napravi za odpadne vode in se lahko spreminjajo glede na sestavo odplak. Cilj te metode je realistična ocena neinhibitorne koncentracije in ni primerna za podrobno raziskovanje tega, kateri deli prispevajo k zaviranju organizmov v aktivnem blatu. Na koncu je treba neposredno v preskusnih posodah tehtati tudi adsorptivne snovi, posode pa je treba silanizirati, da so izgube, ki nastanejo zaradi adsorpcije, kar najmanjše.

PODATKI IN POROČANJE

Izračun hitrosti privzema kisika

46.

Hitrosti privzema kisika je treba izračunati iz srednje vrednosti izmerjenih vrednosti, npr. iz linearnega dela krivulj koncentracije kisika v odvisnosti od časa, s čimer se omeji izračune na koncentracije kisika med 2,0 mg/l in 7,0 mg/l, saj lahko višje in nižje koncentracije vplivajo na hitrosti porabe. Odklonu v razpone koncentracije pod ali nad temi vrednostmi se občasno ni mogoče izogniti in je nujen, na primer, kadar je dihanje močno zadušeno in zato zelo počasno ali pa, če določeno aktivno blato diha zelo hitro. To je sprejemljivo, če so podaljšani deli krivulje privzema ravni in se njihovi nakloni ob prehodu meje 2,0 mg/l ali 7,0 mg/l O2 ne spreminjajo. Vsi ukrivljeni deli krivulje kažejo, da se sistem za merjenje stabilizira ali pa, da se hitrost privzema spreminja in se je ne sme uporabiti pri izračunu hitrosti dihanja. Hitrost privzema kisika mora biti izražena v miligramih na liter na uro (mg/lh) ali v miligramih na gram suhega blata na uro (mg/gh). Hitrost porabe kisika, R, v mg/lh je mogoče izračunati ali interpolirati iz linearnega dela krivulje zabeleženega upada kisika v skladu z enačbo 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

pri čemer je:

Q1

koncentracija kisika na začetku izbranega dela linearne faze (mg/l),

Q2

koncentracija kisika na koncu izbranega dela linearne faze (mg/l),

Δt

časovni razmik med tema dvema meritvama (min.).

47.

Specifična hitrost dihanja (Rs) je izražena kot količina kisika, porabljenega na gram suhe teže blata na uro (mg/gh) v skladu z enačbo 2:

Rs = R/SS

(2)

pri čemer je SS koncentracija suspendiranih trdnih snovi v preskusni zmesi (g/l).

48.

Različni kazalniki R, ki jih je mogoče kombinirati, so:

S

specifična hitrost,

T

hitrost celotnega dihanja,

N

hitrost zaradi nitrifikacijskega dihanja,

H

hitrost zaradi heterotrofnega dihanja,

A

hitrost zaradi abiotskih procesov,

B

hitrost, ki temelji na slepih poskusih (srednja vrednost).

Izračun hitrosti privzema kisika zaradi nitrifikacije

49.

Razmerje med celotnim dihanjem (RT), nitrifikacijskim dihanjem (RN) in heterotrofnim dihanjem (RH) je podano z enačbo 3:

RN = RT – RH

(3)

pri čemer je:

RN

hitrost privzema kisika zaradi nitrifikacije (mg/lh),

RT

izmerjena hitrost privzema kisika slepe kontrole (brez ATU; FB) (mg/lh),

RT

izmerjena hitrost privzema kisika slepe kontrole z dodano ATU (FN) (mg/lh).

50.

To razmerje velja za vrednosti slepih kontrol (RNB, RTB, RHB), abiotskih kontrol (RNA, RTA, RHA) in preskusov s preskusnimi kemikalijami (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Specifične hitrosti dihanja se izračunajo iz enačb:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Če je vrednost RN v predhodnem preskusu zanemarljiva (npr. < 5 % RT v slepih kontrolah), je mogoče predpostaviti, da je heterotrofni privzem kisika enak celotnemu privzemu in da ni prišlo do nitrifikacije. Če bi morali preskusi upoštevati učinke na heterotrofne in nitrifikacijske mikroorganizme, bi bil potreben alternativni vir aktivnega blata. Dokončni preskus se izvede, če so na voljo dokazi o zadušenih hitrostih privzema kisika pri drugih koncentracijah preskusne kemikalije.

Izračun odstotka zaviranja

52.

Odstotek zaviranja, IT, celotne porabe kisika pri vsaki koncentraciji preskusne kemikalije je podan z enačbo 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Podobno je odstotek zaviranja heterotrofnega privzema kisika, IH, pri vsaki koncentraciji preskusne kemikalije podan z enačbo 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] × 100 %

(8)

54.

Zaviranje privzema kisika zaradi nitrifikacije, IN, je pri vsaki koncentraciji podano z enačbo 9:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Odstotek zaviranja privzema kisika je treba izrisati v odvisnosti od logaritma koncentracije preskusne kemikalije (krivulja zaviranja, glej sliko 3 v Dodatku 4). Krivulje zaviranja se izrišejo za vsako 3-urno obdobje prezračevanja ali dodatno po 30 minutah. Koncentracijo preskusne kemikalije, ki zavira privzem kisika za 50 % (EC50), je treba iz krivulje izračunati ali pridobiti z interpolacijo. Če so na voljo primerni podatki, je mogoče izračunati ali z interpolacijo pridobiti 95-odstotne meje zaupanja vrednosti EC50, naklon krivulje in primerne vrednosti, ki označujejo začetek območja zaviranja (na primer, EC10 ali EC20) in konec območja zaviranja (na primer, EC80 ali EC90).

56.

Treba je opozoriti, da je z vidika variabilnosti, ki jo je mogoče pogosto opaziti pri rezultatih, v mnogih primerih dovolj dodatno izraziti rezultate po velikosti:

EC50

< 1 mg/l,

EC50

od 1 mg/l do 10 mg/l,

EC50

od 10 mg/l do 100 mg/l,

EC50

> 100 mg/l.

Razlaga rezultatov

ECx

57.

Vrednosti ECx, vključno z njihovimi pripadajočimi zgornjimi in spodnjimi 95-odstotnimi mejami zaupanja za parameter, se izračunajo z ustreznimi statističnimi metodami (npr. z analizo probit, logistično ali Weibullovo funkcijo, prilagojeno metodo Spearman-Karber ali enostavno interpolacijo (11)). Vrednost ECx je pridobljena tako, da je v navedeno enačbo vstavljena vrednost, ki ustreza x % srednje vrednosti kontrole. Za izračun vrednosti EC50 ali katere koli druge vrednosti ECx je treba srednjo vrednost glede na tretirano skupino (x) analizirati z regresijsko analizo.

Ocena vrednosti NOEC

58.

Če je statistična analiza namenjena določanju vrednosti NOEC, je potrebna statistika glede na posodo (posamezne posode se štejejo za ponovitve). Uporabljene morajo biti ustrezne statistične metode glede na dokument OECD z naslovom ‚Sodobni pristopi pri statistični analizi podatkov o ekotoksičnosti: smernice za uporabo‘ (11). V splošnem se s pomočjo enostransko zastavljenega (manj obsežnega) preskušanja domnev pri p ≤ 0,05 proučijo škodljivi učinki preskusne kemikalije v primerjavi s kontrolo.

Poročilo o preskusu

59.

Poročilo o preskusu mora vključevati naslednje informacije:

 

Preskusna kemikalija

splošno ime, kemijsko ime, številka CAS, čistost,

fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije (npr. log Kow, topnost v vodi, parni tlak, konstanta Henryjevega zakona (H) in morebitne informacije o usodi preskusne kemikalije, npr. adsorpciji, na aktivno blato).

 

Preskusni sistem:

vir, pogoji delovanja čistilne naprave za odpadne vode in vtok, ki ga čistilna naprava prejema, koncentracija, predhodno čiščenje in vzdrževanje aktivnega blata.

 

Preskusni pogoji

preskusna temperatura, vrednost pH med preskusom in trajanje faz(-e) izpostavljenosti.

 

Rezultati:

specifična poraba kisika v kontrolah (mg O2/(g blata × h),

vsi izmerjeni podatki, krivulje zaviranja in metoda za izračun EC50,

EC50 in, po možnosti, 95-odstotne meje zaupanja, po možnosti EC20, EC80; po možnosti NOEC in uporabljene statistične metode, če ni mogoče določiti vrednosti EC50,

rezultati za zaviranje celotnega in, če je primerno, heterotrofnega in nitrifikacijskega dihanja,

abiotski privzem kisika v fizikalno-kemijskem kontrolnem vzorcu (če je uporabljen),

ime referenčne kemikalije in rezultati s to kemikalijo,

vsa opažanja in vsi odkloni od standardnega postopka, ki bi lahko vplivali na rezultat.

LITERATURA

(1)

Brown, D., Hitz, H. R., in Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245–261.

(2)

King, E. F., in Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27–39.

(3)

OECD (1984). Aktivno blato, preskus zaviranja dihanja. Smernica za preskušanje št. 209, Smernice za preskušanje kemikalij, OECD, Pariz.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Kakovost vode – Preskus inhibicije porabe kisika z aktivnim blatom za oksidacijo ogljika in amonija. Mednarodna organizacija za standardizacijo.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Dokument ISO/TC147/WGI/N.183. Mednarodna organizacija za standardizacijo.

(6)

Painter, H. A, Jones, K. (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471–483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515–524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig, S., in Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13, št. 12b: 1556–1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v vodi slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove biorazgradljivosti v vodi. Mednarodna organizacija za standardizacijo.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment, št. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Pariz.

Dodatek 1

Opredelitve

Pri tej preskusni metodi se uporabljajo naslednje opredelitve:

 

Kemikalija pomeni snov ali zmes.

 

ECx (učinkovita koncentracija za x-odstotni učinek) je koncentracija, ki na preskusnih organizmih v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo učinkuje x-odstotno. Vrednost EC50 je, na primer, koncentracija, pri kateri je ocenjeno, da na končno točko preskusa učinkuje 50-odstotno glede na izpostavljeno populacijo v določenem obdobju izpostavljenosti.

 

NOEC (koncentracija brez opaznega učinka) je koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri ni opaznega učinka. V tem preskusu koncentracija, ki ustreza vrednosti NOEC, v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05).

 

Preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo.

Dodatek 2

Slika 1:   Primeri za merilno enoto

Image

Legenda

1

aktivno blato

2

sintetično gojišče

3

preskusna kemikalija

4

zrak

5

posoda za mešanje

6

magnetno mešalo

7

celica za merjenje kisika

8

kisikova elektroda

9

instrument za merjenje kisika

10

zapisovalnik

Dodatek 3

Slika 2:   Primeri merilne enote z uporabo BPK-steklenice

Image

Legenda

1

preskusna posoda

2

kisikova elektroda

3

instrument za merjenje kisika

Dodatek 4

Slika 3:   Primer krivulj zaviranja

Image

Legenda

X

koncentracija 3,5-diklorofenola (mg/l)

Y

zaviranje (%)

Image

zaviranje heterotrofnega dihanja z nitrifikacijskim blatom

Image

zaviranje nitrifikacije z nitrifikacijskim blatom

(5)

Poglavje C.26 se nadomesti z naslednjim:

C.26   PRESKUS ZAVIRANJA RASTI VRSTE LEMNA

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 221 (2006). Zasnovana je za določanje strupenosti kemikalij za sladkovodne rastline iz rodu Lemna (vodolečevke). Temelji na obstoječih metodah (1)(2)(3)(4)(5)(6), vendar zaradi upoštevanja nedavnih raziskav in posvetovanj o številnih ključnih vprašanjih vključuje spremembe navedenih metod. Ta preskusna metoda je bila validirana v mednarodnem krožnem preskusu (7).

2.

Ta preskusna metoda opisuje preskušanje strupenosti z organizmoma Lemna gibba in Lemna minor. Oba organizma sta bila obsežno proučena in sta predmet zgoraj navedenih standardov. Taksonomija vrst Lemna je težavna zaradi prisotnosti velike množice fenotipov. Čeprav lahko pride do genetske variabilnosti kot odziv na strupene snovi, trenutno ni dovolj podatkov o tej vrsti variabilnosti, na podlagi katerih bi bilo za to preskusno metodo mogoče priporočiti uporabo specifičnega klona. Opozoriti je treba, da se preskus ne opravlja aksenično, temveč se med preskusom uporabljajo ukrepi za čim manjšo kontaminacijo z drugimi organizmi.

3.

Podrobno je opisano preskušanje z obnavljanjem preskusne raztopine (polstatično ali pretočno) ali brez obnavljanja le-te (statično). Glede na cilje preskusa in zakonske zahteve je priporočljivo proučiti možnosti uporabe polstatičnih ali pretočnih metod, npr. za kemikalije, ki hitro izginjajo iz raztopine zaradi izhlapevanja, svetlobne razgradnje, obarjanja ali biorazgradnje. Več smernic je na voljo v (8).

4.

Uporabljene opredelitve so navedene v Dodatku 1.

NAČELO PRESKUSA

5.

Kulturam rastlin iz rodu Lemna v eksponentni fazi rasti se omogoči, da sedem dni rastejo kot monokulture v prisotnosti različnih koncentracij preskusne snovi. Cilj preskusa je količinsko opredeliti učinke kemikalije na vegetativno rast v tem obdobju na osnovi izbranih merjenih spremenljivk. Primarna merjena spremenljivka je število listov. Poleg nje se meri vsaj še ena merjena spremenljivka (skupna površina listov, suha ali sveža teža), saj lahko nekatere kemikalije bolj vplivajo na druge merjene spremenljivke kot na število listov. Učinki, ki so odvisni od kemikalije, se količinsko opredelijo tako, da se rast v preskusni raztopini primerja z rastjo kontrol, nato pa se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje rasti (npr. 50-odstotno). Ta koncentracija se izrazi kot ECx (npr. EC50).

6.

Končna točka preskusa je zaviranje rasti, ki je izraženo kot logaritemsko povečanje merjene spremenljivke (povprečne specifične hitrosti rasti) v obdobju izpostavljanja. Iz povprečnih specifičnih hitrosti rasti, zabeleženih v nizu preskusnih raztopin, se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje hitrosti rasti (npr. 50-odstotno); ta koncentracija se izrazi kot ErCx (npr. ErC50).

7.

Dodatna spremenljivka odziva, ki se uporablja v tej preskusni metodi, je prirast, ki jo je morda treba določiti, da se izpolnijo specifične zakonske zahteve nekaterih držav. Določi se kot vrednost merjenih spremenljivk na koncu obdobja izpostavljanja, od česar se odšteje vrednost merjenih spremenljivk na začetku obdobja izpostavljanja. Iz prirasti, zabeležene v nizu preskusnih raztopin, se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje prirasti (npr. 50-odstotno); ta koncentracija se izrazi kot EyCx (npr. EyC50).

8.

Poleg navedenega se lahko statistično določita tudi najnižja koncentracija z opaznim učinkom (LOEC) in koncentracija brez opaznega učinka (NOEC).

PODATKI O PRESKUSNI KEMIKALIJI

9.

Na voljo mora biti analitska metoda z zadostno občutljivostjo za kvantifikacijo kemikalije v preskusnem mediju.

10.

Podatki o preskusni kemikaliji, ki so morda uporabni za določitev preskusnih pogojev, so med drugim strukturna formula, čistost, topnost v vodi, obstojnost v vodi in na svetlobi, pKa, Kow, parni tlak in biorazgradljivost. Topnost v vodi in parni tlak se lahko uporabita za izračun Henryjeve konstante, ki pokaže, ali so v časovnem obdobju preskusa verjetne bistvene izgube preskusne kemikalije. To pripomore k odločitvi o uvedbi posameznih postopkov za nadzorovanje takšnih izgub. Če so podatki o topnosti in obstojnosti preskusne kemikalije negotovi, je priporočljivo, da se te vrednosti določijo v pogojih preskusa, tj. v gojišču, pri temperaturi in režimu osvetljevanja, ki se uporabijo v preskusu.

11.

Kadar je zlasti pomembno nadzorovanje vrednosti pH preskusnega medija, npr. pri preskušanju kovin ali kemikalij, ki so hidrolitično neobstojne, je priporočljivo dodajanje pufra v gojišče (glej odstavek 21). Več smernic za preskusne kemikalije s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskušanje oteženo, je navedenih v (8).

VELJAVNOST PRESKUSA

12.

Za veljavnost preskusa mora biti podvojitveni čas števila listov v kontrolnem vzorcu krajši od 2,5 dni (60 ur), kar ustreza približno sedemkratnemu povečanju v sedmih dneh in povprečni specifični hitrosti rasti 0,275 dan– 1. Ta kriterij je mogoče doseči z mediji in preskusnimi pogoji, ki so opisani v tej preskusni metodi, ter statičnim preskusnim režimom (5). Pričakovati je, da bo ta kriterij dosegljiv tudi v polstatičnih in pretočnih pogojih preskusa. Izračun podvojitvenega časa je prikazan v odstavku 49.

REFERENČNA KEMIKALIJA

13.

Referenčne kemikalije, kot je na primer 3,5-diklorofenol, ki se uporablja za mednarodni krožni preskus (7), se lahko preskušajo z namenom preverjanja preskusnega postopka. Referenčno kemikalijo je priporočljivo preskusiti najmanj dvakrat letno oz. vzporedno z določanjem strupenosti preskusne snovi, kadar se preskušanja opravljajo redkeje.

OPIS METODE

Naprava

14.

Vsa oprema v stiku s preskusnimi mediji mora biti izdelana iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala. Steklovino za gojenje in preskušanje je treba očistiti kemijskih onesnaževal, ki bi se lahko sprala v preskusni medij; steklovina mora biti sterilna. Preskusne posode morajo biti dovolj široke, da listi posameznih kolonij v posodah kontrol rastejo brez prekrivanja do konca preskusa. Ni pomembno, ali se korenine dotikajo dna preskusnih posod, vendar je najmanjša priporočljiva globina vsake preskusne posode 20 mm, najmanjša priporočljiva prostornina vsake preskusne posode pa 100 ml. Če so te zahteve izpolnjene, izbira preskusnih posod ni ključna. Kot primerne so se izkazale steklene čaše, kristalizacijske posodice in steklene petrijevke ustreznih mer. Preskusne posode morajo biti pokrite, da se čim bolj zmanjšata izhlapevanje in nenamerna kontaminacija, hkrati pa se omogoči potrebna izmenjava zraka. Primerne preskusne posode in zlasti pokrovi ne smejo senčiti ali spremeniti spektralnih lastnosti svetlobe.

15.

Kulture in preskusne posode se ne smejo hraniti skupaj. To je najbolje doseči z ločenimi okoljskimi gojitvenimi komorami, inkubatorji ali prostori. Omogočeno mora biti nadzorovanje osvetljenosti in temperature ter ohranjanje teh parametrov na konstantni ravni (glej odstavka 35 in 36).

Preskusni organizem

16.

V tem preskusu se uporabi Lemna gibba ali Lemna minor. Kratki opisi vrst vodne leče, ki so bile uporabljene pri preskušanju strupenosti, so navedeni v Dodatku 2. Rastlinski material je možno dobiti iz zbirke kultur, drugega laboratorija ali na terenu. Če se rastlinski material odvzame na terenu, je treba rastline najmanj osem tednov pred uporabo ohranjati v kulturi v istem mediju, v kakršnem se uporablja za preskus. Terenska mesta, kjer se jemljejo začetne kulture, morajo biti brez očitnih virov kontaminacije. Če se kulture pridobijo iz drugega laboratorija ali zbirke kultur, jih je treba na podoben način ohranjati najmanj tri tedne. V poročilu je treba vedno navesti v preskusu uporabljen vir rastlinskega materiala ter vrsto in klon (če sta znana).

17.

Uporabiti je treba monokulture, za katere se s prostim očesom oceni, da niso kontaminirane z drugimi organizmi, npr. algami in praživalmi. Zdrave rastline vrste L. minor bodo sestavljale kolonije, ki imajo od dva do pet listov. Zdrave kolonije vrste L. gibba pa lahko imajo do sedem listov.

18.

Kakovost in enakomernost rastlin, ki se uporabijo v preskusu, bosta pomembno vplivali na izid preskusa, zato je treba rastline natančno izbrati. Uporabiti je treba mlade, hitrorastoče rastline brez vidnih lezij ali sprememb barve (kloroze). Kulture dobre kakovosti nakazuje visoka pojavnost kolonij, ki imajo najmanj dva lista. Veliko število posameznih listov kaže na okoljski stres, npr. omejitev hranil, in rastlinski material, katerega kulture se ne smejo uporabiti za preskušanje.

Gojenje

19.

Kulture se lahko hranijo pri zmanjšani osvetljenosti in znižani temperaturi (4–10 °C), da se zmanjša pogostnost vzdrževanja kultur (npr. kadar se za neko obdobje ne načrtuje preskusov z vrsto Lemna). Podrobnosti gojenja so navedene v Dodatku 3. Kadar se pojavijo očitni znaki kontaminacije z algami ali drugimi organizmi, je morda treba podvzorec listov vodne leče površinsko sterilizirati ter nato prenesti v svež medij (glej Dodatek 3). V tem primeru je treba preostalo kontaminirano kulturo zavreči.

20.

Najmanj sedem dni pred preskušanjem je treba zadostno število kolonij aseptično prenesti v svež sterilni medij in gojiti 7–10 dni v pogojih preskusa.

Preskusni medij

21.

Kot je opisano spodaj, so za Lemna minor in Lemna gibba priporočeni različni mediji. Natančno je treba proučiti vključitev pufra v preskusni medij (MOPS (4-morfolinpropan sulfonska kislina, št. CAS: 1132-61-2) v medij za L. minor in NaHCO3 v medij za L. gibba), kadar sumimo, da bi lahko reagiral s preskusno kemikalijo in vplival na izražanje njene strupenosti. Če so izpolnjena merila za veljavnost, je sprejemljiv tudi medij po Steinbergu (9).

22.

Za gojenje L. minor in preskušanje z L. minor je priporočljiva modifikacija gojišča za vodno lečo iz švedskega standarda (SIS). Sestava tega medija je navedena v Dodatku 4.

23.

Za gojenje L. gibba in preskušanje z L. gibba je priporočljivo gojišče 20X – AAP, kot je opisano v Dodatku 4.

24.

Za L. minor je primeren tudi medij po Steinbergu, kot je opisan v Dodatku 4, lahko pa se ga uporabi tudi za L. gibba pod pogojem, da so izpolnjena merila za veljavnost.

Preskusne raztopine

25.

Preskusne raztopine se navadno pripravijo z razredčitvijo založnih raztopin. Založne raztopine preskusne kemikalije se običajno pripravijo z raztopitvijo kemikalije v gojišču.

26.

Najvišja preskušana koncentracija preskusne kemikalije običajno ne sme preseči topnosti te kemikalije v vodi v pogojih preskusa. Vendar je treba opozoriti, da vrste Lemna plavajo na gladini in so lahko izpostavljene kemikalijam, ki se zbirajo na mejni ploskvi med vodo in zrakom (npr. slabo vodotopnim, hidrofobnim ali površinsko aktivnim kemikalijam). V takšnih pogojih bo izpostavitev posledica snovi, ki niso iz raztopine, in preskusne koncentracije lahko, odvisno od lastnosti preskusne kemikalije, presežejo topnost v vodi. Za preskusne kemikalije z majhno topnostjo v vodi bo morda treba pripraviti koncentrirano založno raztopino ali dispergirati kemikalijo s pomočjo organskega topila ali disperzijskega sredstva, da se omogoči dodajanje točnih količin preskusne kemikalije v preskusni medij ter da se olajša njeno razprševanje in raztapljanje. Čim bolj si je treba prizadevati, da se izognemo uporabi takšnih snovi. Uporaba pomožnih topil ali disperzijskih sredstev ne sme povzročiti fitotoksičnosti. Pogosto uporabljeni topili, ki ne povzročata fitotoksičnosti pri koncentracijah do 100 μl/l, sta na primer aceton in dimetilformamid. Če se uporabi topilo ali disperzijsko sredstvo, je treba končno koncentracijo te snovi navesti v poročilu in jo ohranjati na najnižji ravni (≤ 100 μl/l), in vse tretirane in kontrolne skupine morajo vsebovati enako koncentracijo topila ali disperzijskega sredstva. Več smernic o uporabi disperzijskih sredstev je na voljo v (8).

Preskusne in kontrolne skupine

27.

Pri izbiri primernih preskusnih koncentracij pripomore predhodno poznavanje strupenosti preskusne kemikalije za vodno lečo, npr. podatki iz preskusa za določanje območja delovanja. V dokončnem preskusu strupenosti naj bi bilo običajno najmanj pet preskusnih koncentracij, ki so urejene v geometrijski vrsti. Geometrijsko razmerje med preskusnimi koncentracijami naj po možnosti ne presega 3,2, vendar je mogoče uporabiti večje vrednosti, če je krivulja koncentracija-odziv ravna. Če se uporabi manj kot pet koncentracij, je treba to utemeljiti. Za vsako preskusno koncentracijo je treba uporabiti najmanj tri ponovitve.

28.

Pri določevanju območja preskusnih koncentracij (pri ugotavljanju območja in/ali v dokončnem preskusu strupenosti) je treba proučiti naslednje možnosti:

Za določitev ECx z ustrezno ravnijo zaupanja morajo preskusne koncentracije oklepati vrednost ECx. Če, na primer, ocenjujemo EC50, mora biti najvišja preskusna koncentracija višja od vrednosti EC50. Če vrednost EC50 leži zunaj območja preskusnih koncentracij, bodo povezani intervali zaupanja veliki in pravilna ocena statističnega ujemanja modela morda ne bo možna.

Če je cilj določitev vrednosti LOEC/NOEC, mora biti najnižja preskusna koncentracija dovolj nizka, da rast ni bistveno manjša od rasti v kontrolni skupini. Poleg tega mora biti najvišja preskusna koncentracija dovolj visoka, da je rast bistveno manjša od rasti v kontrolni skupini. V nasprotnem primeru bo treba preskus ponoviti z drugačnim razponom koncentracij (razen če je najvišja koncentracija na meji topnosti ali najvišji zahtevani mejni koncentraciji, npr. 100 mg/l).

29.

Vsak preskus mora vključevati kontrolne skupine, ki so sestavljene iz enakega hranilnega gojišča, števila listov in kolonij, okoljskih pogojev in postopkov, kot se uporabljajo za preskusne posode, vendar brez preskusne kemikalije. Če se uporablja pomožno topilo ali disperzijsko sredstvo, je treba vključiti dodatno tretiranje kontrolne skupine s topilom/disperzijskim sredstvom, ki je prisotno v enaki koncentraciji kot v posodah s preskusno kemikalijo. Število ponovitvenih kontrolnih posod (in posod s topilom, če je smiselno) mora biti najmanj enako številu posod za vsako preskusno koncentracijo, idealno pa je, če je dvakrat večje.

30.

Če določevanje vrednosti NOEC ni zahtevano, se načrt preskusa lahko spremeni tako, da se poveča število koncentracij in zmanjša število ponovitev na koncentracijo. Kljub temu morajo imeti kontrolne skupine najmanj tri ponovitve.

Izpostavljenost

31.

Iz inokulacijske kulture se prenesejo kolonije, ki obsegajo od 2 do 4 vidne liste, in naključno določijo preskusnim posodam v aseptičnih pogojih. Vsaka preskusna posoda mora vsebovati skupno od 9 do 12 listov. Število listov in kolonij mora biti v vsaki preskusni posodi enako. Izkušnje, pridobljene s to metodo, in podatki iz krožnih preskusov kažejo, da tri ponovitve na tretiranje, pri čemer vsaka ponovitev na začetku vsebuje od 9 do 12 listov, zadostujejo za odkritje razlike v rasti med tretiranji, ki znaša približno 4–7 % zaviranja, izračunano na podlagi hitrosti rasti (10–15 % zaviranja, izračunano na podlagi prirasti) (7).

32.

Za inkubator je treba pripraviti naključno porazdelitev položajev preskusnih posod, da se čim bolj zmanjša vpliv prostorskih razlik v temperaturi in obsevanosti. Pri beleženju opažanj se zahteva tudi blokovska zasnova oz. naključna prerazporeditev (ali pogostejše premeščanje) posod.

33.

Če predhodni preskus obstojnosti kaže, da koncentracije preskusne kemikalije ni možno ohranjati (tj. izmerjena koncentracija pade pod 80 % začetno izmerjene koncentracije) v obdobju trajanja preskusa (7 dni), je priporočljiv polstatični režim preskusa. V tem primeru je treba kolonije najmanj dvakrat med preskusom (npr. 3. in 5. dan) izpostaviti sveže pripravljenim preskusnim in kontrolnim raztopinam. Pogostost izpostavitve svežemu mediju je odvisna od obstojnosti preskusne kemikalije: za ohranjanje približno konstantnih koncentracij zelo neobstojnih ali hlapnih kemikalij bo potrebna večja pogostnost. V določenih okoliščinah bo morda treba uporabiti pretočni postopek (8)(10).

34.

Izpostavitev s foliarnim nanosom (pršenjem) ni obravnavana v tej preskusni metodi; namesto tega glej (11).

Pogoji inkubacije

35.

Uporabiti je treba neprekinjeno toplo ali hladno belo fluorescentno osvetlitev, da je obsevanost v območju 85–135 μE · m– 2s– 1, če se meri v fotosintetsko aktivnem sevanju (400–700 nm) v točkah, ki so enako oddaljene od vira svetlobe kot listi vodne leče (enakovredno 6 500 – 10 000 luksom). Razlike v izbrani obsevanosti prek preskusnega območja ne smejo preseči ± 15 %. Metoda zaznavanja in merjenja svetlobe, zlasti vrsta tipala, vpliva na izmerjeno vrednost. Sferična tipala (ki se odzivajo na svetlobo iz vseh kotov nad in pod ravnino merjenja) in ‚kosinusnih‘ tipal (ki se odzivajo na svetlobo iz vseh kotov nad ravnino merjenja) so bolj primerna od enosmernih tipal in dajejo višje odčitke v primeru več točkovnih virov svetlobe, ki so takšne vrste, kot je opisano tu.

36.

Temperatura v preskusnih posodah mora biti 24 °C ± 2 °C. Vrednost pH kontrolnega medija se med preskusom ne bi smela povečati za več kot 1,5 enote. Vendar odstopanje za več kot 1,5 enote ne razveljavi preskusa, če se dokaže, da preskus ustreza merilom za veljavnost. Posebno pozornost je treba posvetiti premiku vrednosti pH v posebnih primerih, ko se preskušajo neobstojne kemikalije ali kovine. Glej (8) za dodatne smernice.

Trajanje

37.

Preskus se prekine 7 dni po prenosu rastlin v preskusne posode.

Meritve in analitske določitve

38.

Ob začetku preskusa se prešteje in zabeleži število listov v preskusnih posodah, pri čemer je treba zajeti štrleče, razločno vidne liste. Število listov, ki so videti normalni ali nenormalni, je treba določiti na začetku preskusa, najmanj vsake 3 dni v obdobju izpostavljanja (tj. najmanj dvakrat v 7-dnevnem obdobju) in ob prekinitvi preskusa. Zabeležiti je treba spremembe v razvoju rastline, npr. v velikosti in videzu listov, indikacije nekroze, kloroze ali grbavosti, razpadanje kolonij ali izgubo zmožnosti plavanja na gladini ter spremembe dolžine korenin in videza. Zabeležiti je treba tudi bistvene značilnosti preskusnega medija (npr. prisotnost neraztopljenih snovi, rast alg v preskusni posodi).

39.

Poleg določitev števila listov med preskusom je treba določiti tudi učinke preskusne kemikalije na eno (ali več) od naslednjih merjenih spremenljivk:

(i)

skupno površino listov,

(ii)

suho težo,

(iii)

svežo težo.

40.

Skupna površina listov ima prednost v tem, da jo je mogoče določiti za vsako preskusno in kontrolno posodo na začetku preskusa, med preskusom in na koncu preskusa. Suho ali svežo težo je treba določiti na začetku preskusa iz vzorca inokulacijske kulture, ki je reprezentativen za material, s katerim se preskus začne, in na koncu preskusa z rastlinskim materialom iz vsake preskusne in kontrolne posode. Če se površina listov ne izmeri, ima suha teža prednost pred svežo težo.

41.

Skupna površina listov, suha teža in sveža teža se lahko izračunajo po naslednjih postopkih:

(i)

Skupna površina listov: skupna površina listov vseh kolonij se lahko določi s slikovno analizo. Obris preskusne posode in rastlin je mogoče zajeti z videokamero (npr. z osvetlitvijo posode od spodaj) in nastalo sliko nato digitalizirati. S kalibracijo s ploskimi oblikami znane površine je mogoče določiti skupno površino listov v preskusni posodi. Paziti je treba, da se izključijo motnje, ki jih povzroča rob preskusne posode. Druga možnost, ki je delovno zahtevnejša, pa je fotografiranje preskusnih posod in rastlin, izrezovanje nastalih obrisov kolonij in določevanje njihove površine z analizatorjem površine listov ali milimetrskim papirjem. Druge tehnike (npr. razmerje teže papirja s površino obrisa kolonij in površine merske enote) so lahko tudi primerne.

(ii)

Suha teža: zberejo se vse kolonije iz vsake preskusne posode in se sperejo z destilirano ali deionizirano vodo. Kolonije se popivnajo, da se odstrani odvečna voda. Nato se posušijo pri 60 °C do konstantne teže. Vključiti je treba vse fragmente korenin. Suho težo je treba izraziti z natančnostjo najmanj 0,1 mg.

(iii)

Sveža teža: vse kolonije se prenesejo v zatehtane epruvete iz polistirena (ali iz drugega inertnega materiala) z majhnimi (1 mm) odprtinami v zaobljenem dnu. Epruvete se nato pri sobni temperaturi 10 minut centrifugirajo pri 3 000 vrtljajih/minuto. Epruvete, ki vsebujejo sedaj posušene kolonije, se ponovno stehtajo, sveža teža pa se izračuna z odštevanjem mase prazne epruvete.

Pogostost meritev in analitskih določitev

42.

Če se uporabi statična zasnova preskusa, je treba na začetku in na koncu preskusa izmeriti vrednost pH vsake obdelave. Če se uporabi polstatična zasnova preskusa, je treba vrednost pH izmeriti za vsako serijo ‚sveže‘ preskusne raztopine pred obnovitvijo in za ustrezno ‚iztrošeno‘ raztopino.

43.

Obsevanost je treba meriti v rastni komori, inkubatorju ali prostoru v točkah, ki so enako oddaljene od vira svetlobe kot listi vodne leče. Obsevanost je treba izmeriti najmanj enkrat med preskusom. Najmanj dnevno je treba beležiti temperaturo medija v nadomestni posodi, ki je v enakih pogojih v rastni komori, inkubatorju ali sobi.

44.

Med preskusom se v primernih časovnih razmikih določajo koncentracije preskusne kemikalije. V statičnih preskusih je treba določiti koncentracije najmanj na začetku in na koncu preskusa.

45.

V polstatičnih preskusih se ne pričakuje, da bo koncentracija preskusne kemikalije ostala v območju ± 20 % nominalne koncentracije, zato je treba analizirati vse sveže pripravljene preskusne raztopine in enake raztopine pri vsaki obnovitvi (glej odstavek 33). Pri tistih preskusih, v katerih izmerjena začetna koncentracija preskusne kemikalije ni v območju ± 20 % nominalne koncentracije, vendar obstajajo zadostni dokazi, da so začetne koncentracije ponovljive in obstojne (tj. v območju 80–120 % začetne koncentracije), se lahko kemijske določitve opravijo le na najvišji in najnižji koncentraciji. V vseh primerih je treba določitev koncentracije preskusne kemikalije pred obnovitvijo opraviti le za eno ponovitev vsake preskusne koncentracije (ali združene vsebine posod posameznih ponovitev).

46.

Če se uporabi pretočni preskus, je treba izvajati podoben režim vzorčenja, kakor je opisan za polstatične preskuse, vključno za analizo na začetku, na sredini in na koncu preskusa, če je smiselno. Vendar meritve ‚iztrošenih‘ raztopin v tem primeru niso primerne. V preskusu te vrste je treba pretok redčila in preskusne kemikalije ali založne raztopine preskusne kemikalije preverjati dnevno.

47.

Če so na voljo dokazi, da so se koncentracije preskusne kemikalije zadovoljivo vzdrževale v območju ± 20 % nominalne ali izmerjene začetne koncentracije ves čas preskusa, lahko analiza rezultatov temelji na nominalnih ali izmerjenih začetnih vrednostih. Če odklon od nominalne ali izmerjene začetne koncentracije ni v območju ± 20 %, mora analiza rezultatov temeljiti na geometrijskem povprečju koncentracije med izpostavljanjem ali modelih, ki opisujejo zmanjševanje koncentracije preskusne kemikalije (8).

Mejni preskus

48.

V nekaterih okoliščinah, npr. kadar predhodni preskus pokaže, da preskusna kemikalija nima strupenih učinkov pri koncentracijah do 100 mg/l ali do svoje meje topnosti v preskusnem mediju (kar je nižje), se lahko izvede mejni preskus, ki vključuje primerjavo odzivov v kontrolni skupini in eni tretirani skupini (100 mg/l ali koncentracija, ki je enaka meji topnosti). Zelo se priporoča, da se ta preskus podpre z analizo koncentracije izpostavljanja. Vsi predhodni pogoji preskusa in merila za veljavnost veljajo tudi za mejni preskus, le število ponovitev v tretirani skupini je treba podvojiti. Rast v kontrolni in tretirani skupini je mogoče analizirati s statističnim preskusom za primerjavo sredin, npr. s t-preskusom.

PODATKI IN POROČANJE

Podvojitveni čas

49.

Podvojitveni čas (Td) števila listov in izpolnjevanje tega merila za veljavnost študije (odstavek 12) se določi po naslednji enačbi skupaj s podatki iz kontrolnih posod:

Td = ln 2/μ,

pri čemer je μ povprečna specifična hitrost, določena, kot je opisano v odstavkih 54 in 55.

Spremenljivke odziva

50.

Namen tega preskusa je določiti učinke preskusne kemikalije na vegetativno rast vrst rodu Lemna. Ta preskusna metoda opisuje dve spremenljivki odziva, saj imajo države članice različne preference in zakonske zahteve. Da bi bili rezultati preskusa sprejemljivi v vseh državah članicah, se morajo učinki ovrednotiti z obema spremenljivkama odziva, (a) in (b), ki sta opisani spodaj.

(a)

Povprečna specifična hitrost rasti: ta spremenljivka odziva se izračuna na osnovi spremembe logaritmov števila listov in na osnovi spremembe logaritmov drugega merjenega parametra (skupne površine listov, suhe teže ali sveže teže) skozi čas (izražen v dnevih) v kontrolah in vsaki tretirani skupini. Včasih se to imenuje relativna hitrost rasti (12).

(b)

Prirast: ta spremenljivka odziva se izračuna na osnovi spremembe števila listov in na osnovi spremembe drugega merjenega parametra (skupne površine listov, suhe teže ali sveže teže) v kontrolah in vsaki tretirani skupini.

51.

Opozoriti je treba, da vrednosti strupenosti, ki se izračunajo iz teh dveh spremenljivk odziva, niso primerljive, kar je treba upoštevati pri uporabi rezultatov preskusa. Če se upoštevajo pogoji preskusa iz te preskusne metode, bodo vrednosti ECx, ki temeljijo na povprečni specifični hitrosti rasti (ErCx), navadno višje od rezultatov, ki temeljijo na prirasti (EyCx), zaradi matematične osnove teh dveh pristopov. To se ne sme razlagati kot razlika v občutljivosti obeh spremenljivk odziva, temveč razlika enostavno izvira iz različne matematične narave vrednosti. Pojem povprečne specifične hitrosti rasti temelji na splošnem vzorcu eksponentne rasti vodne leče v nelimitiranih kulturah, ko se strupenost ocenjuje na osnovi učinkov na hitrost rasti brez odvisnosti od absolutne ravni specifične hitrosti rasti v kontrolni skupini, naklona krivulje koncentracija-odziv ali od trajanja preskusa. Nasprotno pa so rezultati, ki temeljijo na prirasti kot spremenljivki odziva, odvisni od vseh teh drugih spremenljivk. Vrednost EyCx je odvisna od specifične hitrosti rasti vrst vodne leče, uporabljenih v vsakem preskusu, in od maksimalne specifične hitrosti rasti, ki je lahko različna glede na vrsto in celo glede na klone. Ta spremenljivka odziva se ne sme uporabiti za primerjanje občutljivosti za strupene snovi med vrstami vodne leče ali celo med kloni. Z znanstvenega vidika ima uporaba povprečne specifične hitrosti rasti prednost pri ocenjevanju strupenosti, vendar so ocene strupenosti na osnovi prirasti vključene v to preskusno metodo, da se izpolnijo trenutne zakonske zahteve nekaterih držav.

52.

Ocene strupenosti morajo temeljiti na številu listov in še eni dodatni merjeni spremenljivki (skupni površini listov, suhi teži ali sveži teži), saj lahko nekatere kemikalije bolj vplivajo na druge merjene spremenljivke kot na število listov. V primeru izračunavanja le števila listov te razlike ne bi zaznali.

53.

Pri vsaki meritvi se število listov in vse druge zabeležene merjene spremenljivke, tj. skupna površina listov, suha teža ali sveža teža, predstavijo v preglednici skupaj s koncentracijami preskusne kemikalije. Naknadna analiza podatkov, npr. za oceno LOEC, NOEC ali ECx, mora temeljiti na vrednostih posameznih ponovitev in ne na izračunanih povprečnih vrednostih vsake tretirane skupine.

Povprečna specifična hitrost rasti

54.

Povprečna specifična hitrost rasti se za določeno obdobje za vsako ponovitev kontrole in tretirane skupine izračuna kot logaritemsko povečanje spremenljivk rasti – števila listov in še druge merjene spremenljivke (skupna površina listov, suha teža ali sveža teža) – po spodnji enačbi:

Formula

pri čemer je:

:

μi – j

:

povprečna specifična hitrost rasti od časa i do časa j,

:

Ni

:

merjena spremenljivka v preskusni posodi ali kontrolni posodi v času i,

:

Nj

:

merjena spremenljivka v preskusni posodi ali kontrolni posodi v času j,

:

t

:

časovno obdobje od i do j.

Srednja vrednost hitrosti rasti skupaj z ocenami varianc se izračuna za vsako tretirano in kontrolno skupino.

55.

Povprečna specifična hitrost rasti se izračuna za celotno preskusno obdobje (čas ‚i‘ v zgornji enačbi pomeni začetek preskusa, čas ‚j‘ pa konec preskusa). Za vsako preskusno koncentracijo in kontrolno skupino se izračuna srednja vrednost povprečne specifične hitrosti rasti in ocenjena varianca. Ovrednoti se tudi presečna hitrost rasti, da se ocenijo učinki preskusne kemikalije, ki se pojavljajo med obdobjem izpostavljenosti (npr. pregledovanje logaritemsko pretvorjenih rastnih krivulj). Znatne razlike med presečno hitrostjo rasti in povprečno hitrostjo rasti kažejo odstopanje od konstantne eksponentne rasti in da je utemeljeno natančno preverjanje rastnih krivulj. Konservativni pristop v tem primeru je primerjanje specifičnih hitrosti rasti tretiranih kultur v času največjega zaviranja s specifičnimi hitrostmi rasti kontrolnih kultur v istem času.

56.

Nato se lahko za vsako koncentracijo preskusne kemikalije (tretirano skupino) izračuna odstotek zaviranja hitrosti rasti (Ir) po naslednji enačbi:

Formula

pri čemer je:

:

% Ir

:

odstotek zaviranja povprečne specifične hitrosti rasti,

:

μC

:

srednja vrednost za μ v kontrolni skupini,

:

μT

:

srednja vrednost za μ v tretirani skupini.

Prirast

57.

Učinki na prirast se določijo na osnovi dveh merjenih spremenljivk, števila listov in še ene druge merjene spremenljivke (skupne površine listov, suhe teže ali sveže teže), ki jo je mogoče določiti v vsaki preskusni posodi na začetku in na koncu preskusa. V primeru suhe teže ali sveže teže se določi začetna biomasa na osnovi vzorca listov, odvzetih iz iste šarže, kot se uporabi za inokulacijo preskusnih posod (glej odstavek 20). Za vsako preskusno koncentracijo in kontrolno skupino se izračuna srednja vrednost prirasti in oceni varianca. Srednji odstotek zaviranja prirasti ( % Iy) se lahko za vsako tretirano skupino izračuna po enačbi:

Formula

pri čemer je:

:

% Iy

:

odstotek zmanjšanja prirasti,

:

bC

:

končna biomasa minus začetna biomasa v kontrolni skupini,

:

bT

:

končna biomasa minus začetna biomasa v tretirani skupini.

Izdelava krivulj koncentracija-odziv

58.

Izrisati je treba krivuljo koncentracija-odziv, ki prikazujejo srednjo vrednost odstotka zaviranja spremenljivke odziva (Ir ali Iy, ki se izračuna, kot je prikazano v odstavku 56 ali 57), in krivuljo logaritemsko pretvorjene koncentracije preskusne kemikalije.

Ocena vrednosti ECx

59.

Ocene vrednosti ECx (npr. EC50) morajo temeljiti na povprečni specifični hitrosti rasti (ErCx) in prirasti (EyCx), vsaka od teh vrednosti pa temelji na številu listov in še eni dodatni merjeni spremenljivki (skupni površini listov, suhi teži ali sveži teži). Postopek je takšen, ker obstajajo preskusne kemikalije, ki različno vplivajo na število listov in druge merjene spremenljivke. Želeni parametri strupenosti so torej štiri vrednosti ECx za vsako izračunano raven zaviranja x: ErCx (število listov), ErCx (skupna površina listov, suha teža ali sveža teža), EyCx (število listov) in EyCx (skupna površina listov, suha teža ali sveža teža).

Statistični postopki

60.

Cilj je količinsko ovrednotiti odziv na koncentracijo z regresijsko analizo. Lahko se uporabi tehtana linearna regresija, po tem ko se izvede linearizacijska pretvorba podatkov o odzivu, na primer v verjetnostnih ali logaritemskih ali Weibullovih enotah (13), vendar so nelinearni regresijski postopki prednostne metode, ki bolje obravnavajo neizogibne podatkovne nepravilnosti in odklone od enakomerne porazdelitve. Če se te nepravilnosti približujejo ničelnemu ali popolnemu zaviranju, se lahko s pretvorbo povečajo in ovirajo analizo (13). Opozoriti je treba, da so standardne metode analize probit, analize logit ali Weibullove pretvorbe namenjene uporabi na kvantnih podatkih (npr. umrljivost ali preživetje), zato jih je treba prilagoditi za uporabo na podatkih o hitrosti rasti ali prirasti. Specifični postopki za določevanje vrednosti ECx iz kontinuiranih podatkov so na voljo v (14), (15) in (16).

61.

Za vsako analizirano spremenljivko odziva se izračuna točkovna ocena vrednosti ECx, pri čemer se uporabi razmerje med odzivom in koncentracijo. Kadar je to mogoče, se za vsako oceno določijo 95-odstotne meje zaupanja. Grafično ali statistično je treba določiti ustreznost prileganja podatkov odziva na regresijski model. Regresijska analiza se mora opraviti na odzivih posameznih ponovitev in ne na srednjih vrednostih tretiranih skupin.

62.

Ocene EC50 in meje zaupanja se prav tako lahko pridobijo z uporabo linearne interpolacije z metodo vezanja (17), če so razpoložljivi regresijski modeli/metode za podatke neustrezni.

63.

Za oceno LOEC in zato tudi NOEC je treba primerjati srednje vrednosti tretiranih skupin s tehnikami analize variance (ANOVA). Srednja vrednost za vsako koncentracijo se nato primerja s srednjo vrednostjo kontrole z ustrezno metodo večkratne primerjave ali trendnostnega preskusa. Uporabna sta lahko Dunnettov ali Williamsov preskus (18)(19)(20)(21). Treba je ugotoviti, ali velja domneva homogenosti variance v analizi variance. Ta ocena se lahko izvede grafično ali s formalnim preskusom (22). Primerna preskusa sta preskus po Levenu ali preskus po Bartlettu. Če domneva homogenosti variance ni izpolnjena, lahko to odpravimo z logaritemsko pretvorbo podatkov. Če je heterogenost variance skrajna in je ni mogoče odpraviti s pretvorbo, je treba proučiti možnosti analize z metodami, kot so večstopenjski trendnostni preskusi po Jonkheeru. Dodatna navodila o določanju NOEC so navedena v (16).

64.

Nedavni razvoj znanosti je privedel do priporočila o opuščanju koncepta NOEC in njegovi zamenjavi z regresijsko določenimi točkovnimi ocenami ECx. Za ta preskus z vodno lečo ustrezna vrednost x še ni določena. Zdi se, da je primerno območje od 10 do 20 % (odvisno od izbrane spremenljivke odziva), in po možnosti naj se poroča o EC10 in EC20.

Poročanje

65.

V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije:

 

Preskusna kemikalija:

fizične značilnosti in fizikalno-kemijske lastnosti, vključno z mejo topnosti v vodi,

kemijski identifikacijski podatki (npr. številka CAS), vključno s čistostjo (nečistote).

 

Preskusne vrste:

znanstveno ime, klon (če je znan) in vir.

 

Preskusni pogoji:

uporabljeni preskusni postopek (statični, polstatični ali pretočni),

podatki o začetku preskusa in njegovo trajanje,

preskusni medij,

opis načrta poskusa: preskusne posode in pokrovi, volumni raztopin, število kolonij in listov na preskusno posodo na začetku preskusa,

preskusne koncentracije (nominalne in izmerjene, kot je smiselno) in število ponovitev na posamezno koncentracijo,

metode priprave založnih in preskusnih raztopin, vključno z uporabo kakršnih koli topil ali disperzivnih sredstev,

temperatura med preskusom,

vir svetlobe, obsevanost in homogenost svetlobe,

vrednosti pH preskusnega in kontrolnega medija,

koncentracije preskusne kemikalije in analizna metoda z ustreznimi podatki za vrednotenje kakovosti (validacijske študije, standardni odkloni in meje zaupanja analiz),

metode za določevanje števila listov in drugih merjenih spremenljivk, npr. suhe teže, sveže teže ali površine listov,

vsa odstopanja od te preskusne metode.

 

Rezultati:

neobdelani podatki: število listov in druge merjene spremenljivke v vsaki preskusni in kontrolni posodi za vsa opazovanja in analize,

srednje vrednosti in standardni odkloni za vsako merjeno spremenljivko,

rastne krivulje za vsako koncentracijo (priporočljivo z logaritemsko pretvorjeno merjeno spremenljivko, glej odstavek 55),

podvojitveni čas/hitrost rasti v kontroli na podlagi števila listov,

izračunane spremenljivke odziva za vsako tretirano ponovitev, s srednjimi vrednostmi in koeficienti variacij za ponovitve,

grafična predstavitev razmerja koncentracija-učinek,

ocene strupenih končnih točk za spremenljivke odziva, npr. EC50, EC10, EC20, in pripadajoči intervali zaupanja. Vrednosti LOEC in/ali NOEC, če sta izračunani, in statistične metode za njuno določitev,

če je bila uporabljena analiza variance, velikost opaženega učinka (npr. najmanj pomembna razlika),

vsako spodbujanje rasti, ki se je pokazalo pri katerem koli tretiranju,

kakršni koli vidni znaki fitotoksičnosti ter opažanja preskusne raztopine,

razprava o rezultatih, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode.

LITERATURA

(1)

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). str. 733–742. V: Annual Book of ASTM Standards. Zvezek 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

(2)

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft‘. EPA 712-C-96-156. 8 str.

(3)

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90–337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 str.

(4)

SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 str. (v švedščini).

(5)

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 – 120 str.

(6)

Environment Canada. (1993). Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series, št. 145.

(7)

Sims, I., Whitehouse, P., in Lacey, R. (1999). The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

(8)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, No. 23. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(9)

Mednarodna organizacija za standardizacijo. ISO DIS 20079. Kakovost vode – Določevanje toksičnih učinkov sestavin vode in odpadnih voda na vodno lečo (Lemna minor) – Preskus zaviranja rasti vodne leče.

(10)

Walbridge, C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report, št. EPA-600/3-77 108. September 1977.

(11)

Lockhart, W. L., Billeck, B. N., in Baron, C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353–359.

(12)

Huebert, D. B., in Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481–483.

(13)

Christensen, E. R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713–718.

(14)

Nyholm, N., Sørensen, P. S., Kusk, K. O., in Christensen, E. R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.

(15)

Bruce, R. D., in Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485–1494.

(16)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(17)

Norberg-King, T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. US EPA, Duluth, MN.

(18)

Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096–1121.

(19)

Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482–491.

(20)

Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.

(21)

Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.

(22)

Brain, P., in Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.

Dodatek 1

Opredelitve pojmov

Za namene te preskusne metode se uporabljajo naslednje opredelitve in okrajšave:

 

Biomasa je suha teža žive snovi, prisotne v populaciji. V tem preskusu se kot nadomestek za biomaso običajno meri število listov oziroma površina listov, zato se izraz ‚biomasa‘ nanaša tudi na meritve teh nadomestkov.

 

Kemikalija pomeni snov ali zmes.

 

Kloroza je porumenelost listnega tkiva.

 

Klon je organizem ali celica, ki se z nespolnim razmnoževanjem razvije iz enega organizma. Zato so osebki iz istega klona gensko identični.

 

Kolonija je skupek materinskih in hčerinskih listov (navadno od 2 do 4), ki so pritrjeni eden na drugega. V nekaterih primerih jo imenujemo tudi rastlina.

 

ECx je koncentracija preskusne snovi, raztopljene v preskusnem mediju, katere rezultat je x-odstotno (npr. 50-odstotno) zmanjšanje rasti organizma Lemna v ustreznem obdobju izpostavljenosti (navesti v primeru odstopanja od polnega ali običajnega trajanja preskusa). Za nedvoumno označitev vrednosti EC, pridobljene iz hitrosti rasti ali prirasti, se uporabi simbol ‚ErC‘ za hitrost rasti in simbol ‚EyC‘ za prirast, sledi pa merjena spremenljivka, npr. ErC (število listov).

 

Pretočni preskus je preskus, v katerem se preskusna raztopina neprekinjeno menja.

 

List je posamezna/ena ‚listu podobna‘ struktura rastline vodne leče. Je najmanjša enota, tj. osebek, ki je zmožen razmnoževanja.

 

Grbavost pomeni liste, ki so grbasti ali otekli.

 

Rast je povečanje merjene spremenljivke, npr. števila listov, suhe teže, mokre teže ali površine listov, v času preskusa.

 

Hitrost rasti (povprečna specifična hitrost rasti) je logaritemsko povečanje biomase v obdobju izpostavljenosti.

 

Najnižja koncentracija z opaznim učinkom (LOEC) je najnižja preskušena koncentracija kemikalije, pri kateri je opaziti statistično značilen učinek zmanjšanja rasti (pri p < 0,05) v primerjavi s kontrolo v navedenem obdobju izpostavljenosti. Vendar morajo imeti vse koncentracije nad vrednostjo LOEC škodljiv učinek, ki je enak ali večji od škodljivega učinka, opaženega pri vrednosti LOEC. Če teh dveh pogojev ni možno izpolniti, je treba podrobno pojasniti izbiro LOEC (in s tem NOEC).

 

Merjene spremenljivke so vse vrste spremenljivk, ki se merijo, da se izrazi končna točka preskusa z eno ali več različnimi spremenljivkami odziva. V tej metodi so merjene spremenljivke število listov, površina listov, sveža teža in suha teža.

 

Monokultura je kultura z eno rastlinsko vrsto.

 

Nekroza je odmrlo (tj. belo ali z vodo prepojeno) listno tkivo.

 

Koncentracija brez opaznega učinka (NOEC) je preskušena koncentracija neposredno pod vrednostjo LOEC.

 

Fenotip so opazne lastnosti organizma, ki jih določajo njegovi geni v interakciji z okoljem.

 

Spremenljivke odziva so spremenljivke za oceno strupenosti, ki so izpeljane iz katere koli merjene spremenljivke, za opis biomase z različnimi postopki izračuna. V tej preskusni metodi sta hitrost rasti in prirast spremenljivki odziva, ki sta izpeljani iz merjenih spremenljivk, kot so število listov, površina listov, sveža teža in suha teža.

 

Polstatični (obnovitveni) preskus je preskus, v katerem se preskusna raztopina v danih časovnih razmikih med preskusom redno menja.

 

Statični preskus je preskusna metoda, v kateri se preskusna raztopina med preskusom ne obnavlja.

 

Preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušena s to preskusno metodo.

 

Končna točka preskusa opisuje splošen dejavnik, ki ga preskusna kemikalija spremeni relativno glede na kontrolni vzorec in je cilj preskusa. V tej preskusni metodi je končna točka zaviranje rasti, ki ga lahko izrazimo z različnimi spremenljivkami odziva, katere temeljijo na eni ali več merjenih spremenljivk.

 

Preskusni medij je popolnoma sintetično gojišče, na katerem preskusne rastline rastejo ob izpostavitvi preskusni kemikaliji. Običajno se preskusna kemikalija raztopi v preskusnem mediju.

 

Prirast je vrednost merjene spremenljivke za izražanje biomase na koncu obdobja izpostavljenosti, od česar se odšteje vrednost merjene spremenljivke na začetku obdobja izpostavljenosti.

Dodatek 2

Opis vrst Lemna

Vodne rastline vrst Lemna, ki se običajno imenujejo vodna leča, pripada družini Lemnaceae, v kateri je v štiri rodove razvrščenih več vrst z vsega sveta. Njihov različni videz in taksonomija sta podrobno opisana (1)(2). Vrsti Lemna gibba in L. minor sta značilni iz zmernega podnebja in se pogosto uporabljata v preskusih strupenosti. Diskoidna stebla (listi) obeh vrst plavajo na površini vode ali pa so potopljena, iz središča spodnje površine vsakega lista pa izhaja zelo tanka korenina. Vrste Lemna redko cvetijo, rastline pa se razmnožujejo z vegetativnim ustvarjanjem novih listov (3). V primerjavi s starejšimi rastlinami so mlajše bolj blede barve, imajo krajše korenine, sestavljene pa so iz dveh ali treh listov različnih velikosti. Zaradi majhnosti, preproste strukture, nespolnega razmnoževanja in kratkega generacijskega časa so rastline vrst Lemna zelo primerne za laboratorijsko preskušanje (4)(5).

Zaradi verjetnih variacij med vrstami glede občutljivosti so veljavne le primerjave občutljivosti znotraj vrste.

Primeri vrst Lemna, uporabljenih za preskušanje: viri o vrsti

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major: Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935–941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft‘. EPA 712-C-96-156. 8 str.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 str.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 str. (v švedščini).

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). str. 733–742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft‘. EPA 712-C-96-156. 8 str.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959–1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R., idr. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481–483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T. C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102–2111.

Viri vrst Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Kanada, M5S 3 B2

Telefon: + 1 4169783641

Telefaks:+1 4169785878

E-naslov: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

Združene države Amerike

Telefon: + 1 9195157572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

Stockholm

Švedska

Telefon: + 46 86747240

Telefaks: + 46 86747636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

Nemčija

E-naslov: lemna@uba.de

LITERATURA

(1)

Hillman, W. S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221–287.

(2)

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Švica.

(3)

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4)

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1–14.

(5)

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7–22.

Dodatek 3

Vzdrževanje založne kulture

Založne kulture je mogoče dlje časa vzdrževati pri nižjih temperaturah (4–10 °C), ne da bi jih bilo treba ponovno pripravljati. Gojišče za vrste Lemna je lahko enako kot gojišče, uporabljeno za preskušanje, za založne kulture pa je mogoče uporabiti druga s hranili bogata gojišča.

Z aseptično tehniko se več mladih, svetlo zelenih rastlin redno odstranjuje in prenaša v nove posode za gojenje, ki vsebujejo sveže gojišče. V predlaganih ohlajenih pogojih je presajanje mogoče izvesti v časovnih razmikih, ki trajajo do tri mesece.

Uporabiti je treba kemično čiste (v kislini oprane) in sterilne steklene posode za gojenje ter z njimi ravnati po aseptičnih metodah. Če pride do kontaminacije založne kulture, npr. z algami ali glivami, je treba z ustreznimi ukrepi odstraniti kontaminirajoče organizme. Pri algah in večini drugih kontaminirajočih organizmov je to mogoče doseči s sterilizacijo površine. Odvzame se vzorec kontaminiranega rastlinskega materiala in odrežejo se korenine. Nato se material močno stresa v čisti vodi, nato pa se potopi v 0,5-odstotno (v/v) raztopino, kar naj traja od 30 sekund do 5 minut. Rastlinski material se nato splakne s sterilno vodo in v več šaržah prenese v posode za gojenje s svežim gojiščem. Zaradi te obdelave bo veliko listov odmrlo, še posebej pri daljših obdobjih izpostavljenosti, nekaj preživelih pa bo navadno nekontaminiranih. Z njimi je nato mogoče ponovno inokulirati nove kulture.

Dodatek 4

Gojišča

Za L. minor in L. gibba se priporočajo različna gojišča. Za L. minor se priporoča prilagojeno gojišče po švedskem standardu (SIS), za L. gibba, pa se priporoča gojišče 20X AAP. Spodaj sta opisani sestavi obeh gojišč. Pri pripravi teh gojišč je treba uporabiti kemikalije s čistostjo reagenta ali analitsko čiste kemikalije in deionizirano vodo.

Gojišče za vrsto Lemna po švedskem standardu (SIS)

Založne raztopine I–V se sterilizirajo z avtoklaviranjem (120 °C, 15 minut) ali z membransko filtracijo (velikost por približno 0,2 μm).

Založna raztopina VI (in neobvezna VII) se sterilizira samo z membransko filtracijo in se je ne sme avtoklavirati.

Sterilne založne raztopine je treba hraniti v hladnem in temnem prostoru. Založne raztopine I–V je treba zavreči po šestih mesecih, založna raztopina VI (in neobvezna VII) pa ima rok uporabnosti en mesec.

Št. založne raztopine:

Snov

Koncentracija v založni raztopini

(g/l)

Koncentracija v pripravljenem gojišču

(mg/ · l)

Pripravljeno gojišče

 

 

 

 

element

koncentracija

(mg/ · l)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3. 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (pufer)

490

490

Za pripravo enega litra gojišča SIS se 900 ml deionizirane vode doda naslednje:

10 ml založne raztopine I,

5 ml založne raztopine II,

5 ml založne raztopine III,

5 ml založne raztopine IV,

1 ml založne raztopine V,

5 ml založne raztopine VI,

1 ml založne raztopine VII (neobvezno).

Opomba: Za določene preskusne kemikalije je morda potrebna dodatna založna raztopina VII (pufer MOPS) (glej odstavek 11).

Vrednost pH se z 0,1 mola ali 1 molom HCl ali NaOH prilagodi na 6,5 ± 0,2, količina pa se z deionizirano vodo prilagodi na en liter.

Gojišče 20X AAP

Založne raztopine se pripravijo v sterilni destilirani ali deionizirani vodi.

Sterilne založne raztopine je treba hraniti v hladnem in temnem prostoru. Pri teh pogojih je rok uporabnosti založnih raztopin vsaj 6–8 tednov.

Za gojišče 20X-AAP se s kemikalijami čistosti reagenta pripravi pet založnih raztopin hranilnih snovi (A1, A2, A3, B in C). Za izdelavo gojišča se 20 ml vsake založne raztopine hranilnih snovi doda približno 850 ml deionizirane vode. Vrednost pH se z 0,1 mola ali 1 molom HCl ali NaOH prilagodi na 7,5 ± 0,1, količina pa se z deionizirano vodo prilagodi na en liter. Nato se gojišče filtrira skozi membranski filter z velikostjo por (približno) 0,2 μm v sterilno posodo.

Gojišče, namenjeno preskušanju, je treba pripraviti 1–2 dni pred uporabo, da se vrednost pH stabilizira. Pred uporabo je treba vrednost pH gojišča preveriti in po potrebi prilagoditi z dodajanjem 0,1 ali 1 mola NaOH ali HCl, kot je opisano zgoraj.

Št. založne raztopine:

Snov

Koncentracija v založni raztopini

(g/ · l) (7)

Koncentracija v pripravljenem gojišču

(mg/ · l) (7)

Pripravljeno gojišče

 

 

 

 

element

koncentracija

(mg/ · l) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na; N

190; 84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2O

1,4

30

K; P

9,4; 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA · 2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na; C

220; 43

Gojišče po Steinbergu (po standardu ISO 20079)

Koncentracije in založne raztopine

Prilagojeno gojišče po Steinbergu se v standardu ISO 20079 uporablja le za vrsto Lemna minor (saj je v njem dovoljena le vrsta Lemna minor), preskusi pa so pokazali, da je mogoče dobre rezultate doseči tudi z vrsto Lemna gibba.

Pri pripravi gojišča je treba uporabiti kemikalije s čistostjo reagenta ali analitsko čiste kemikalije in deionizirano vodo.

Hranilno gojišče se pripravi iz založnih raztopin ali 10-kratno koncentriranega gojišča, ki omogoča največjo koncentracijo gojišča brez obarjanja.

Preglednica 1

Gojišče po Steinbergu s stabiliziranim pH (prilagojeno po Altenburgerju)

Element

Hranilno gojišče

makroelementi

molska masa

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

mikroelementi

molska masa

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O

287,43

180,00

0,63

Na2MoO4 · 2H2O

241,92

44,00

0,18

MnCl2 · 4H2O

197,84

180,00

0,91

FeCl3 · 6H2O

270,21

760,00

2,81

EDTA dinatrijev dihidrat

372,24

1 500,00

4,03


Preglednica 2

Založne raztopine (makroelementi)

1.

Makroelementi (50-kratno koncentrirani)

g/l

založna raztopina 1:

KNO3

17,50

KH2PO4

4,5

K2HPO4

0,63

založna raztopina 2:

MgSO4 · 7H2O

5,00

založna raztopina 3:

Ca(NO3)2 · 4H2O

14,75


Preglednica 3

Založne raztopine (mikroelementi)

2.

Mikroelementi (1 000-kratno koncentrirani)

mg/l

založna raztopina 4:

H3BO3

120,0

založna raztopina 5:

ZnSO4 · 7H2O

180,0

založna raztopina 6:

Na2MoO4 · 2H2O

44,0

založna raztopina 7:

MnCl2 · 4H2O

180,0

založna raztopina 8:

FeCl3 · 6H2O

760,00

EDTA dinatrijev dihidrat

1 500,00

Založni raztopini 2 in 3 in ločeno založne raztopine od 4 do 7 se lahko združijo (z upoštevanjem zahtevanih koncentracij).

Za daljši rok uporabnosti založne raztopine 20 minut avtoklavirajte pri 121 °C ali pa jih namesto tega sterilno filtrirajte (pore naj merijo 0,2 μm). Za založno raztopino 8 je sterilna filtracija (s porami, ki merijo 0,2 μm) močno priporočljiva.

Priprava končne koncentracije gojišča po Steinbergu (prilagojenega)

Dodajte 20 ml založnih raztopin 1, 2 in 3 (glej preglednico 2) približno 900 ml deionizirane vode, da preprečite obarjanje.

Dodajte 1,0 ml založnih raztopin 4, 5, 6, 7 in 8 (glej preglednico 3).

Vrednost pH mora biti v območju 5,5 ± 0,2 (prilagodite jo z dodajanjem kar najmanjše količine raztopine NaOH ali HCl).

Z dodajanjem vode povečajte količino na 1 000 ml.

Če so založne količine sterilizirane in če je uporabljena ustrezna voda, dodatna sterilizacija ni potrebna. Če je končni medij steriliziran, je treba po avtoklaviranju (pri 121 °C za 20 min) dodati založno raztopino 8.

Priprava 10-kratno koncentriranega gojišča po Steinbergu (prilagojenega) za vmesno skladiščenje

Približno 30 mililitrom vode dodajte 20 ml založnih raztopin 1, 2 in 3 (glej preglednico 2), da preprečite obarjanje.

Dodajte 1,0 ml založnih raztopin 4, 5, 6, 7 in 8 (glej preglednico 3). Z dodajanjem vode povečajte količino na 100 ml.

Če so založne količine sterilizirane in če je uporabljena ustrezna voda, dodatna sterilizacija ni potrebna. Če je končni medij steriliziran, je treba po avtoklaviranju (pri 121 °C za 20 min) dodati založno raztopino 8.

Vrednost pH medija (pri končni koncentraciji) mora biti 5,5 ± 0,2.

(6)

Dodajo se naslednja poglavja od C.31 do C.46:

C.31   PRESKUS KOPENSKIH RASTLIN: PRESKUS VZNIKA IN RASTI SEJANCEV:

UVOD

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 208 (2006). Preskusne metode se ob upoštevanju znanstvenega napredka in uporabnosti za zakonodajno uporabo redno preverjajo. Ta posodobljena preskusna metoda je zasnovana za ocenjevanje potencialnih učinkov kemikalij na vznik in rast sejancev. Kot taka ne zajema kroničnih učinkov ali učinkov na razmnoževanje (npr. oploditev in razvoj semen, oblikovanje cvetov, zorenje plodov). Treba je upoštevati pogoje izpostavljenosti in lastnosti kemikalije, ki bo preskušena, s čimer se zagotovi uporaba ustreznih preskusnih metod (pri preskušanju kovin/kovinskih spojin je npr. treba upoštevati učinke vrednosti pH in povezanih protiionov) (1). Ta preskusna metoda ni namenjena rastlinam, ki so izpostavljene hlapom kemikalij. To preskusno metodo je mogoče uporabiti pri preskušanju splošnih kemikalij, biocidov in fitofarmacevtskih sredstev (ki so znani tudi kot izdelki za zaščito rastlin ali pesticidi). Razvita je bila na osnovi obstoječih metod (2)(3)(4)(5)(6)(7). Upoštevani so bili tudi drugi viri, ki se nanašajo na preskušanje rastlin (8)(9)(10). Uporabljene opredelitve so navedene v Dodatku 1.

NAČELO PRESKUSA

2.

Preskus ocenjuje učinke na vznik sejancev in zgodnjo rast višjih rastlin po izpostavljenosti preskusni kemikaliji v tleh (ali drugem primernem matriksu tal). Semena se namestijo v stik s tlemi, tretiranimi s preskusno kemikalijo, po obdobju od 14 do 21 dni po 50-odstotnem vzniku sejancev v kontrolni skupini pa se ocenijo učinki nanje. Merjene končne točke so vizualna ocena vznika sejancev, suha teža poganjkov (alternativno sveža teža poganjkov) in v določenih primerih višina poganjkov ter ocena vidnih škodljivih učinkov na različne dele rastline. Meritve in opažanja se primerjajo s tistimi pri netretiranih kontrolnih rastlinah.

3.

Odvisno od pričakovanega načina izpostavljenosti se preskusna kemikalija vnese v tla (ali v morebitni matriks umetnih tal) ali pa se nanese na površino tal; izbere se možnost, ki ustrezno predstavlja potencialni način izpostavljenosti kemikaliji. Vnos v tla se izvede s tretiranjem tal v razsutem stanju. Po nanosu se tla prenesejo v posode, nato pa se vanje posejejo semena dane rastlinske vrste. Nanosi na površino se izvedejo na tleh, prenesenih v posode, v katerih so že posejana semena. Preskusne enote (kontrole ter tretirana tla in semena) se nato namestijo v ustrezne pogoje, ki podpirajo kalitev/rast rastlin.

4.

Lahko se izvede preskus za določanje krivulje odmerek-odziv ali pri eni sami koncentraciji/stopnji aplikacije kot mejni preskus v skladu s cilji študije. Če rezultati preskusa z eno samo koncentracijo/stopnjo aplikacije presegajo določeno raven strupenosti (npr. če so opaženi učinki večji od x %), se izvede preskus za določanje območja delovanja, s katerim se določijo zgornje in spodnje meje za strupenost, sledi pa mu preskus z več koncentracijami/stopnjami aplikacije za pridobitev krivulje odmerek-odziv. Uporabi se ustrezna statistična analiza za pridobitev učinkovite koncentracije ECx ali učinkovite stopnje aplikacije ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) za najbolj občutljive zadevne parametre. V tem preskusu je mogoče izračunati tudi koncentracijo brez opaznega učinka (NOEC) in najnižjo koncentracijo z opaznim učinkom (LOEC).

PODATKI O PRESKUSNI KEMIKALIJI

5.

Naslednji podatki so uporabni za ugotavljanje pričakovanega načina izpostavljenosti in pri načrtovanju preskusa: strukturna formula, čistost, topnost v vodi, obstojnost v organskih topilih, porazdelitveni koeficient 1-oktanol/voda, vedenje pri sorpciji v tleh, parni tlak, kemijska stabilnost v vodi in na svetlobi ter biorazgradljivost.

VELJAVNOST PRESKUSA

6.

Da bi bil preskus veljaven, morajo kontrole izpolnjevati naslednja merila:

vznik sejancev je vsaj 70-odstoten,

sejanci ne kažejo vidnih fitotoksičnih učinkov (npr. kloroze, nekroze, venenja, deformacij listov in stebel), rastline pa izkazujejo le normalno variacijo rasti in morfologije za to določeno vrsto,

srednja stopnja preživetja vzniknjenih kontrolnih sejancev v času trajanja študije je vsaj 90 %,

okoljski pogoji za določeno vrsto so enaki in rastni substrati vsebujejo enako količino matriksa tal, podpornih substratov ali substrata iz istega vira.

REFERENČNA KEMIKALIJA

7.

Referenčno kemikalijo je v rednih časovnih razmikih mogoče preskusiti, da se preveri, ali se izvedba preskusa ter odziv določenih preskusnih rastlin in preskusni pogoji skozi čas niso znatno spremenili. Namesto tega je mogoče za oceno učinkovitosti preskusnega sistema v določenih laboratorijih uporabiti pretekle meritve biomase ali rasti, kar lahko služi kot interni laboratorijski ukrep kontrole kakovosti.

OPIS METODE

Naravna tla – umetni substrat

8.

Rastline je mogoče gojiti v posodah s peščeno ilovico, ilovnatim peskom ali peščeno glinasto ilovico, ki vsebuje do 1,5 odstotka organskega ogljika (pribl. 3 odstotke organske snovi). Uporabi se lahko tudi komercialna prst za sajenje lončnic ali sintetična mešanica tal, ki vsebuje do 1,5 odstotka organskega ogljika. Če je znano, da ima preskusna kemikalija visoko afiniteto za glino, se glinenih tal ne sme uporabljati. Naravna tla je treba presejati na 2-milimetrske delce, da se homogenizirajo in da se odstranijo grobi delci. Poročati je treba o vrsti in teksturi, odstotku organskega ogljika, vrednosti pH in vsebnosti soli, izmerjeni kot električna prevodnost končnih pripravljenih tal. Tla je treba razvrstiti v skladu s standardnim sistemom za razvrščanje (11). Tla se lahko pasterizirajo ali toplotno obdelajo, da se zmanjša učinek talnih patogenov.

9.

Pri naravnih tleh je zaradi spreminjajočih se fizikalnih/kemijskih lastnosti in mikrobnih populacij razlaga rezultatov lahko bolj zapletena. Te spremenljivke spreminjajo sposobnost zadrževanja vlage, sposobnost vezave kemikalije, zračnost ter vsebino hranil in elementov v sledovih. Poleg variacij teh fizikalnih dejavnikov bo obstajala tudi variacija kemijskih lastnosti, kot sta vrednost pH in redoks potencial, ki lahko vpliva na biološko razpoložljivost preskusne kemikalije (12)(13)(14).

10.

Umetni substrati se običajno ne uporabljajo za preskušanje fitofarmacevtskih sredstev, lahko pa so uporabni pri preskušanju splošnih kemikalij ali tam, kjer se želi kar najbolj zmanjšati variabilnost naravnih tal in povečati primerljivost rezultatov preskusa. Uporabljeni substrati morajo biti iz inertnih materialov, ki kar najbolj zmanjšajo interakcijo s preskusno kemikalijo ali topilom kot nosilcem ali pa z obema. Ugotovljeno je, da so s kislino opran kremenov pesek, mineralna volna in steklene kroglice (npr. s premerom od 0,35 do 0,85 mm) primerni inertni materiali, ki kar najmanj absorbirajo preskusno kemikalijo (15), kar omogoča, da je kemikalija z vsrkavanjem prek korenin v kar največji meri na voljo sejancu. Med neprimernimi substrati so vermikulit, perlit in drugi zelo absorptivni materiali. Zagotovljene morajo biti hranilne snovi za rast rastlin, ki poskrbijo, da rastline niso v stresu zaradi pomanjkanja hranilnih snovi, to pa je treba, kadar je le mogoče, oceniti s kemijsko analizo ali z vizualno oceno kontrolnih rastlin.

Merila za izbiro preskusnih vrst

11.

Da izbrana vrsta razvije niz odzivov, mora biti razumno obsežna, npr. glede svoje taksonomske pestrosti v rastlinskem kraljestvu, svoje porazdelitve, pogostnosti, značilnosti življenjskega cikla posamezne vrste in območja pojavljanja v naravi (8)(10)(16)(17)(18)(19)(20). Pri izbiri je treba upoštevati naslednje značilnosti potencialnih preskusnih vrst:

vrste imajo enotna semena, ki so lahko dostopna pri zanesljivih standardnih virih semen ter ki dosegajo skladno, zanesljivo in enakomerno kalivost ter enotno rast sejancev,

rastlino je mogoče preskusiti v laboratoriju ter lahko daje zanesljive in ponovljive rezultate v okviru preskusnih infrastruktur in primerjalno med njimi,

občutljivost preskušane vrste mora biti skladna z odzivi rastlin, odkritih v okolju, ki je izpostavljeno kemikaliji,

vrste so bile do neke mere uporabljene v predhodnih preskusih strupenosti, njihova uporaba, npr. pri bioloških preskusih herbicidov, presejanju za težke kovine, obremenitvenih preskusih za slanost in minerale ali študijah alelopatije, pa kaže občutljivost na mnogo različnih obremenilnih dejavnikov,

vrste so združljive z rastnimi pogoji preskusne metode,

zadoščajo merilom za veljavnost preskusa.

Nekatere od preskusnih vrst, ki so bile v preteklosti najbolj uporabljane, so navedene v Dodatku 2, potencialne nekmetijske rastline pa v Dodatku 3.

12.

Število vrst, ki bodo preskušene, je odvisno od ustreznih zakonskih zahtev, zato v tej preskusni metodi ni navedeno.

Uporaba preskusne kemikalije

13.

Kemikalijo je treba nanesti v ustreznem nosilcu (npr. vodi, acetonu, etanolu, polietilen glikolu, gumi arabikumu, pesku). Mogoče je preskusiti tudi zmesi (formulirane produkte ali formulacije), ki vsebujejo aktivne snovi in različne adjuvanse.

Vnos v tla/umetni substrat

14.

Kemikalije, ki so topne v vodi ali suspendirane v vodi, se lahko dodajo vodi, nato pa se raztopina z ustrezno napravo za mešanje zmeša s tlemi. Ta vrsta preskusa je lahko ustrezna, če izpostavljenost kemikaliji poteka prek tal ali porne vode v tleh in če obstajajo pomisleki glede vsrkavanja prek korenin. Zmogljivost tal za zadrževanje vode zaradi dodajanja preskusne kemikalije ne sme biti presežena. Količina dodane vode mora biti enaka za vsako preskusno koncentracijo, vendar mora biti omejena, da se prepreči zbiranje aglomeratov tal v skupkih.

15.

Kemikalije z nizko topnostjo v vodi je treba raztopiti v ustreznem hlapnem topilu (npr. acetonu, etanolu) in zmešati s peskom. Nato se med nenehnim mešanjem peska topilo lahko iz peska odstrani s tokom zraka. Tretirani pesek se zmeša z eksperimentalnimi tlemi. Vzpostavi se drug kontrolni vzorec, ki prejme le pesek in topilo. Vsem stopnjam tretiranja in drugi kontroli so dodane enake količine peska z zmešanim in odstranjenim topilom. Pri trdnih, netopnih preskusnih kemikalijah se suha tla in kemikalija zmešajo v ustrezni napravi za mešanje. Nato se tla dodajo v posode, v katere se takoj posejejo semena.

16.

Če se namesto tal uporablja umetni substrat, je mogoče kemikalije, ki so topne v vodi, tik pred začetkom preskusa raztopiti v hranilni raztopini. Kemikalije, ki niso topne v vodi, a jih je mogoče v vodi suspendirati z nosilcem topila, je treba z nosilcem dodati hranilni raztopini. Kemikalije, ki niso topne v vodi in za katere ni na voljo nobenega nestrupenega nosilca, topnega v vodi, je treba raztopiti v ustreznem hlapnem topilu. Raztopina se zmeša s peskom ali steklenimi kroglicami in se namesti v rotavapor ter upari; na pesku oziroma kroglicah ostane enakomerna obloga kemikalije. Pred polnjenjem sadilne posode je treba tehtane deleže kroglic ekstrahirati z istim organskim topilom in preskušeno kemikalijo.

Nanos na površino

17.

Za nanos preskusne kemikalije se pri fitofarmacevtskih sredstvih pogosto uporablja škropljenje površine tal s preskusno raztopino. Vsa oprema, uporabljena pri izvajanju preskusov, vključno z opremo za pripravo in dodajanje preskusne kemikalije, mora imeti takšni zasnovo in zmogljivost, da je mogoče preskuse, ki vključujejo to opremo, izvesti natančno, pokritost pa bo ponovljiva. Pokritost mora biti enotna prek celotne površine tal. Poskrbeti je treba, da ni možnosti adsorpcije kemikalije v opremo ali reagiranja kemikalije z opremo (npr. s plastičnimi cevmi in z lipofilnimi kemikalijami ali jeklenimi deli in elementi). Preskusna kemikalija se razprši na površino tal s posnemanjem značilnega nanašanja s škropilnico. V splošnem morajo biti količine razpršila v območju, ki se običajno uporablja v kmetijski praksi, o količinah (količini vode itd.) pa je treba poročati. Izbrati je treba tako vrsto šobe, ki bo omogočala enakomerno pokritost površine tal. Če se nanašajo topila in nosilci, je treba pripraviti drugo skupino kontrolnih rastlin, ki prejemajo le topilo/nosilec. To pri fitofarmacevtskih sredstvih, preskušanih v obliki formulacij, ni potrebno.

Preverjanje koncentracije/stopnje aplikacije preskusne kemikalije

18.

Koncentracije/stopnje aplikacije je treba potrditi z ustreznim analitskim preverjanjem. Pri topnih kemikalijah je mogoče potrditi preverjanje koncentracij/stopenj aplikacije vseh preskusnih kemikalij z analizo preskusne raztopine z najvišjo koncentracijo, uporabljene pri preskusu, z dokumentacijo o naknadni razredčitvi in z uporabo umerjene opreme za nanos (npr. umerjenih steklenih posod za analizo, umerjene opreme za nanos s škropilnikom). Pri netopnih kemikalijah mora biti navedeno preverjanje spojin, poleg tega pa še mase preskusne kemikalije, dodane tlom. Če se zahteva dokazovanje homogenosti, bo morda potrebno analizirati tla.

POSTOPEK

Načrt preskusa

19.

Semena istih vrst se posejejo v posode. Število semen, posejanih v posodo, je odvisno od vrste, velikosti posode in trajanja preskusa. Število rastlin na posodo mora biti takšno, da so v času trajanja preskusa omogočeni primerni rastni pogoji in da se prepreči nagnetenost. Največja gostota rastlin znaša približno 3–10 semen na 100 cm2, odvisno od velikosti semen. Kot primer se za 15-centimetrsko posodo priporočajo od ena do dve sadiki koruze, soje, paradižnika, kumar ali sladkorne pese, tri sadike oljne ogrščice ali graha in od 5 do 10 sadik čebule, pšenice ali drugih sejancev z majhnimi semeni. Število semen in posod za ponovitve (ponovitev je opredeljena kot posoda, zato rastline v isti posodi ne predstavljajo ponovitve) mora biti zadostno za optimalno statistično analizo (21). Treba je opozoriti, da bo variabilnost večja za preskusne vrste, pri katerih je uporabljenih manj večjih semen na posodo (ponovitev), v primerjavi s preskusnimi vrstami, pri katerih je mogoče uporabljati večje število manjših semen na posodo. Ta variabilnost se lahko kar najbolj zmanjša s sejanjem enakega števila semen v vsako posodo.

20.

Z uporabo kontrolnih skupin se zagotovi, da so opazni učinki povezani samo z izpostavljenostjo preskusni kemikaliji ali se jih lahko pripiše tej izpostavljenosti. Ustrezna kontrolna skupina mora biti v vseh vidikih identična preskusni skupini, razen glede izpostavljenosti preskusni kemikaliji. V okviru danega preskusa morajo biti vse preskusne rastline, vključno s kontrolnimi, iz istega vira. Za preprečevanje pristranskosti se zahteva naključno dodeljevanje preskusnih in kontrolnih posod.

21.

Izogibati se je treba semenom, prevlečenim z insekticidom ali fungicidom (tj. ‚obloženim‘ semenom). Vendar nekateri regulativni organi dovoljujejo uporabo določenih nesistemskih kontaktnih fungicidov (npr. kaptana, tirama) (22). Če obstaja skrb glede patogenov, ki se prenašajo s semeni, se semena lahko za kratek čas namočijo v razredčeno 5-odstotno raztopino hipoklorita, nato pa se dobro sperejo pod tekočo vodo in posušijo. Sanacija z drugimi fitofarmacevtskimi sredstvi ni dovoljena.

Preskusni pogoji

22.

Preskusni pogoji se morajo približati pogojem, potrebnim za normalno rast preskušenih vrst in sort (v Dodatku 4 so navedeni primeri preskusnih pogojev). Rastline, ki vznikajo, se morajo vzdrževati glede na dobro vrtnarsko prakso v komorah, fitotronih ali rastlinjakih s kontroliranim okoljem. Pri uporabi prostorov, namenjenih za rast, te prakse običajno vključujejo nadzor in ustrezno pogosto (npr. dnevno) beleženje temperature, vlažnosti, koncentracije ogljikovega dioksida, svetlobe (obsevanosti, valovne dolžine, fotosintetsko aktivnega sevanja) in obdobja osvetljenosti, sredstev za zalivanje itd., s čimer se zagotovi zdrava rast, ki se presoja s kontrolnimi rastlinami izbranih vrst. Temperaturo v rastlinjakih je treba nadzirati z zračenjem, ogrevanjem in/ali hladilnimi sistemi. Za preskušanje v rastlinjakih se v splošnem priporočajo naslednji pogoji:

temperatura: 22 °C ± 10 °C,

vlažnost; 70 % ± 25 %,

obdobje osvetljenosti: najmanj 16 ur svetlobe,

obsevanost: 350 ± 50 μE/m2/s. Če obsevanost pade pod 200 μE/m2/s, valovna dolžina pa je 400–700 nm, je potrebna dodatna osvetlitev, razen pri določenih vrstah, ki ne potrebujejo toliko svetlobe.

Med trajanjem študije je treba spremljati okoljske pogoje in poročati o njih. Rastline je treba gojiti v neporoznih plastičnih ali glaziranih posodah, pod katere so podstavljeni pladnji ali krožnički. Posode se lahko redno premešča, da je variabilnost pri rasti rastlin (zaradi razlik v preskusnih pogojih v prostorih, namenjenih za rast) čim manjša. Posode morajo biti dovolj velike, da se omogoči normalna rast.

23.

Za ohranjanje vitalnosti rastlin se lahko hranilnim snovem v tleh dodajajo dodatki. O potrebah po dodatnih hranilnih snoveh in času njihovega dodajanja je mogoče presoditi z opazovanjem kontrolnih rastlin. Priporočeno je zalivanje preskusnih posod od spodaj (npr. s stenjem iz steklenih vlaken). Vendar je mogoče z začetnim zalivanjem od zgoraj spodbuditi kalivost semen, pri nanosu na površino tal pa takšno zalivanje olajša prehod kemikalije v tla.

24.

Specifični rastni pogoji morajo biti ustrezni za preskušane vrste in preiskovano preskusno kemikalijo. Kontrolne in tretirane rastline je treba gojiti v enakih okoljskih pogojih, vendar je treba izvesti ustrezne ukrepe za preprečevanje navzkrižne izpostavljenosti (npr. hlapnim kemikalijam) med različnimi tretiranji in izpostavljenosti kontrolnih rastlin preskusnim kemikalijam.

Preskušanje pri eni sami koncentraciji/stopnji aplikacije

25.

Za določanje ustrezne koncentracije/stopnje aplikacije kemikalije za izvedbo preskusa z eno samo koncentracijo ali stopnjo (provokacijskega/mejnega preskusa) je treba upoštevati več dejavnikov. Pri splošnih kemikalijah ti dejavniki vključujejo fizikalne/kemijske lastnosti kemikalije. Za fitofarmacevtska sredstva je treba upoštevati fizikalne/kemijske lastnosti in vzorec uporabe preskusne kemikalije, njeno največjo koncentracijo ali stopnjo aplikacije, število aplikacij na sezono in/ali obstojnost preskusne kemikalije. Za ugotavljanje, ali ima splošna kemikalija fitotoksične lastnosti, je lahko primerno preskušanje pri najvišji ravni 1 000 mg/kg suhih tal.

Preskus za določanje območja delovanja

26.

Po potrebi je mogoče izvesti preskus za določanje območja delovanja, s katerim so pridobljene smernice za koncentracije/stopnje, ki bodo preskušane v dokončni študiji odziva v odvisnosti od odmerka. Pri preskusu za določanje območja delovanja morajo biti med vrednostmi preskusnih koncentracij/stopenj precejšnji razmiki (znašati morajo npr. 0,1, 1,0, 10, 100 in 1 000 mg/kg suhih tal). Koncentracije/stopnje pri fitofarmacevtskih sredstvih lahko temeljijo na največji koncentraciji ali stopnji aplikacije, npr. 1/100, 1/10, 1/1 priporočene največje koncentracije ali stopnje aplikacije.

Preskušanje z več koncentracijami/stopnjami aplikacije

27.

Namen preskusa z več koncentracijami/stopnjami aplikacije je ugotoviti razmerje med odmerkom in odzivom ter določiti vrednost ECx ali ERx za vznik, biomaso in/ali vizualne učinke v primerjavi z neizpostavljenimi kontrolami, kot zahtevajo regulativni organi.

28.

Število in razmiki koncentracij ali stopenj aplikacije morajo biti zadostni, da se ustvari zanesljivo razmerje med odmerkom in odzivom ter regresijska enačba in da se poda ocena vrednosti ECx ali ERx. Izbrane koncentracije/stopnje aplikacije morajo zajemati vrednosti ECx ali ERx, ki se bodo ugotavljale. Če je, na primer, zahtevana vrednost EC50, je zaželeno preskušanje pri stopnjah, ki dosegajo od 20- do 80-odstotni učinek. Priporočeno število preskusnih koncentracij/stopenj aplikacij za doseganje tega je vsaj pet v geometrijski vrsti in še netretirana kontrola, faktor razmika med njimi pa ne sme biti večji kot tri. Za vsako tretirano ali kontrolno skupino mora biti število ponovitev vsaj štiri, skupno število semen pa vsaj 20. Za večjo statistično moč preskusa bo morda potrebnih več ponovitev določenih rastlin s slabo kalivostjo ali spremenljivo rastjo. Če se uporablja več preskusnih koncentracij/stopenj aplikacije, se lahko število ponovitev zmanjša. Če se ocenjuje vrednost NOEC, bo za doseganje želene statistične moči morda potrebnih več ponovitev (23).

Opažanja

29.

Med obdobjem opazovanja, tj. od 14 do 21 dni po vzniku 50 % kontrolnih rastlin (tudi kontrol s topili, če je to smiselno), se pri rastlinah pogosto (vsaj tedensko in, če je mogoče, dnevno) opazuje, ali je prišlo do vznika, vidnih znakov fitotoksičnosti in umrljivosti. Ob koncu preskusa je treba zabeležiti meritev odstotka vznika in biomase preživelih rastlin ter vidne znake škodljivih učinkov na različne dele rastline. Med slednjimi so anomalije videza vzniknjenih sejancev, zakrnela rast, kloroza, razbarvanje, umrljivost in učinki na razvoj rastline. Končno biomaso je mogoče meriti s končno povprečno suho težo poganjkov preživelih rastlin, s spravilom poganjkov na površini tal in s sušenjem teh poganjkov pri 60 °C do konstantne teže. Namesto tega je končno biomaso mogoče meriti s svežo težo poganjkov. Če tako zahtevajo regulativni organi, je druga končna točka lahko višina poganjka. Za ocenjevanje opaznih strupenih učinkov je treba uporabljati enoten sistem točkovanja za vidne poškodbe. Primeri kvalitativnih in kvantitativnih vizualnih ocen so podani v virih (23)(24).

PODATKI IN POROČANJE

Statistična analiza

Preskus z eno samo koncentracijo/stopnjo

30.

Podatke o vsaki rastlinski vrsti je treba analizirati z ustrezno statistično metodo (21). Treba je poročati o ravni učinka pri preskusni koncentraciji/stopnji ali nedoseganju danega učinka pri preskusni koncentraciji/stopnji (npr. o učinku, ki je < x % učinka, opaženega pri koncentraciji ali stopnji y).

Preskus z več koncentracijami/stopnjami

31.

Z regresijsko enačbo se ugotovi razmerje med odmerkom in odzivom. Uporabljajo se lahko različni modeli: na primer, za oceno vrednosti ECx ali ERx (npr. EC25, ER25, EC50, ER50) in njenih meja zaupanja za vznik v obliki kvantnih podatkov so lahko primerne metode analiza logit in analiza probit, Weibullova metoda, metoda Spearman-Karber, prilagojena metoda Spearman-Karber itd. Za rast sejancev (težo in višino) kot zvezno končno točko je vrednost ECx ali ERx in njene meje zaupanja mogoče oceniti z ustrezno regresijsko analizo (npr. z Bruce-Versteegovo nelinearno regresijsko analizo (25)). Kadar je mogoče, mora biti R2 za najbolj občutljive vrste enak ali večji od 0,7, uporabljene preskusne koncentracije/stopnje pa zajemajo od 20- do 80-odstotne učinke. Če se ocenjuje vrednost NOEC, mora imeti prednost uporaba učinkovitih statističnih preskusov, ki jih je treba izbrati na podlagi porazdelitve podatkov (21)(26).

Poročilo o preskusu

32.

V poročilu o preskusu morajo biti predstavljeni rezultati študij in podroben opis preskusnih pogojev ter temeljita razprava o rezultatih, analiza podatkov in zaključki, izpeljani iz analize. Treba je podati povzetek v preglednici in izvleček rezultatov. Poročilo mora vključevati naslednje:

 

Preskusna kemikalija:

kemijski identifikacijski podatki, relevantne lastnosti preskušane kemikalije (npr. log Pow, topnost v vodi, parni tlak in informacije o usodi in vedenju v okolju, če so na voljo),

podrobnosti o pripravi preskusne raztopine in preverjanju preskusnih koncentracij, kot je navedeno v odstavku 18.

 

Preskusne vrste:

podrobnosti preskusnega organizma: vrsta/sorta, družine rastlin, znanstvena in splošna imena, kar najpodrobneje opisana vir in zgodovina semena (npr. ime dobavitelja, odstotek kalivosti, velikost semena, številka razreda, serije ali skupine, leto ali rastna sezono pobiranja semena, datum ocene kalivosti), viabilnost itd.,

število preskušanih vrst eno- in dvokaličnic,

razlogi za izbiro vrste,

opis shranjevanja, tretiranja in vzdrževanja semena.

 

Preskusni pogoji:

oprema za preskušanje (npr. rastna komora, fitotron in rastlinjak),

opis preskusnega sistema (npr. velikosti in materialov posod ter količine tal),

lastnosti tal (tekstura ali vrsta tal: porazdelitev in razvrstitev delcev tal, fizikalne in kemijske lastnosti, vključno z odstotkom organske snovi, odstotek organskega ogljika in vrednost pH),

priprava tal/substrata (npr. tal, umetnih tal, peska in drugega) pred preskusom,

opis hranilnega gojišča, če je uporabljeno,

nanos kemikalije: opis metode nanosa, opis opreme, stopnje in količine izpostavljenosti, vključno s preverjanjem kemikalije, opis metode umerjanja in opis okoljskih pogojev med nanosom,

rastni pogoji: obsevanost (npr. PAR, fotosintetsko aktivno sevanje), obdobje osvetljenosti, največje/najmanjše temperature, program in metoda zalivanja, gnojenje,

število semen na posodo, število rastlin na odmerek, število ponovitev (posod) na stopnjo izpostavljenosti,

vrsta in število kontrol (negativnih in/ali pozitivnih kontrol, kontrole s topilom, če se uporablja),

trajanje preskusa.

 

Rezultati:

preglednica vseh končnih točk za vsako ponovitev, preskusno koncentracijo/stopnjo in vrsto,

število in odstotek vzniknjenih semen v primerjavi s kontrolami,

meritve biomase (suho težo ali svežo težo poganjkov) rastlin v obliki odstotka kontrol,

višina poganjkov rastlin v obliki odstotka kontrol, če je merjena,

odstotek vidnih poškodb ter kvantitativni in kvalitativni opis vidnih poškodb (kloroza, nekroza, venenje, deformacije listov in stebel, pa tudi morebitna odsotnost učinkov) zaradi preskusne kemikalije v primerjavi s kontrolnimi rastlinami,

opis ocenjevalne lestvice, uporabljene za presojo vidnih poškodb, če obstaja vizualno ocenjevanje,

pri študijah z eno samo stopnjo je treba poročati o odstotku poškodb,

vrednosti ECx ali ERx (npr. EC50, ER50, EC25, ER25) in z njimi povezane meje zaupanja. Če se izvaja regresijska analiza, je treba določiti standardno napako za regresijsko enačbo in standardno napako za ocene posameznih parametrov (npr. naklon, presek),

vrednosti NOEC (in LOEC), če so izračunane,

opis uporabljenih statističnih postopkov in predpostavk,

grafični prikaz teh podatkov in razmerje med odmerkom in odzivom preskušanih vrst.

Odstopanja od postopkov, opisanih v tej preskusni metodi, in morebitne nenavadne dogodke med preskusom.

LITERATURA

(1)

Schrader, G., Metge, K., in Bahadir, M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189–193.

(2)

Mednarodna organizacija za standardizacijo. (1993). ISO 11269-1. Kakovost tal – Določevanje učinka onesnažil na rastlinstvo – 1. del: Metoda merjenja zaviranja rasti korenin.

(3)

Mednarodna organizacija za standardizacijo. (1995). ISO 11269-2. Kakovost tal – Določevanje učinka onesnažil na rastlinstvo – 2. del: Učinki kemikalij na vznik in rast višjih rastlin.

(4)

American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests.

(5)

U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1.

(6)

US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines:

850.4000: Background – Non-target Plant Testing,

850.4025: Target Area Phytotoxicity,

850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence),

850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test,

850.4225: Seedling Emergence, Tier II,

850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test.

(7)

AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines.

(8)

Boutin, C., Freemark, K. E., in Keddy, C. J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series, št. 145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Kanada.

(9)

Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., in Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., št. 48.

(10)

Hale, B., Hall, J. C., Solomon, K., in Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario, Kanada.

(11)

Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) in Soil Sc. Soc. Amer. Ind. 26:305 (1962).

(12)

Audus, L. J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. V: Audus, L. J., ur. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, poglavje 5, str. 163–206.

(13)

Beall, M. L., Jr., in Nash, R. G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571–575.

(14)

Beetsman, G. D., Kenney, D. R., in Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247–250.

(15)

U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 str., FDA, Washington, DC.

(16)

McKelvey, R. A., Wright, J. P., Honegger, J. L., in Warren, L. W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161– 1174.

(17)

Boutin, C.; Elmegaard, N., in Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349–369.

(18)

Boutin, C. in Rogers, C. A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol. 9(4):255–271.

(19)

Boutin, C., in Harper, J. L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155–271.

(20)

Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T. E., Batchelor, S. P., in Maguire, R. J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532–2541.

(21)

OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment, št. 54, Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(22)

Hatzios, K. K., in Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1–63.

(23)

Hamill, P. B., Marriage, P. B., in Friesen, G. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386–389.

(24)

Frans, R. E., in Talbert, R. E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. V: B. Truelove (ur.) Research Methods in Weed Science, 2. izdaja. Southern weed Science Society, Auburn, 15–23.

(25)

Bruce, R. D., in Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485– 1492.

(26)

Poglavje C.33 te priloge: Preskus razmnoževanja deževnikov (Eisenia fetida/Eisenia andrei).

Dodatek 1

Opredelitve pojmov

 

Aktivna sestavina (a.i.) (ali aktivna snov (a.s.)) je snov, zasnovana za doseganje določenega biološkega učinka (npr. nadzora nad insekti, preprečevanje bolezni rastlin, zatiranje plevela na tretiranem območju), ki je znana tudi kot aktivna sestavina oziroma snov na tehnični stopnji.

 

Kemikalija pomeni snov ali zmes.

 

Fitofarmacevtska sredstva (sredstva za zaščito pridelka ali rastlin) ali pesticidi so snovi s posebno biološko aktivnostjo, ki se uporabljajo za zaščito pridelka pred škodljivimi organizmi (npr. glivičnimi boleznimi, insekti in kompetitivnimi rastlinami).

 

ECx – koncentracija z x-odstotnim učinkom ali ERx – stopnja z x-odstotnim učinkom je koncentracija ali stopnja, ki povzroči neželeno menjavo ali spremembo odstotka x v končni točki preskusa, merjeni glede na kontrolo (25- oziroma 50-odstotno zmanjšanje vznika, teže poganjkov, končnega števila prisotnih rastlin ali povečanje vidnih poškodb bi predstavljalo vrednost EC25/ER25 oziroma EC50/ER50).

 

Vznik je pojav koleoptila ali kotiledona nad površino tal.

 

Formulacija je komercialno formulirani produkt, ki vsebuje aktivno snov (aktivno sestavino), znan tudi kot končni pripravek (8) ali značilni končni izdelek (TEP (‚typical end-use product‘)).

 

Vrednost LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) je najnižja koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri je bil opažen učinek. V tem preskusu ima koncentracija, ki ustreza vrednosti LOEC, v danem obdobju izpostavljenosti statistično značilen učinek (p < 0,05) v primerjavi s kontrolo in je višja od vrednosti NOEC.

 

Neciljne rastline: rastline, ki so zunaj ciljnega območja rastlin. Pri fitofarmacevtskih sredstvih to navadno pomeni rastline zunaj tretiranega območja.

 

Vrednost NOEC (No Observed Effect Concentration) je najvišja koncentracija preskusne kemikalije, pri kateri ni bilo opaženega nobenega učinka. V tem preskusu koncentracija, ki ustreza vrednosti NOEC, v danem obdobju izpostavljenosti v primerjavi s kontrolo nima statistično značilnega učinka (p < 0,05).

 

Fitotoksičnost: škodljiva odstopanja (ocenjena z meritvami in vizualno) od normalnega vzorca videza in rasti rastlin kot odziv na dano kemikalijo.

 

Ponovitev je preskusna enota, ki predstavlja kontrolno skupino in/ali tretirano skupino. V teh študijah je posoda opredeljena kot ponovitev.

 

Vizualna ocena: ocena vidnih poškodb na podlagi opazovanja rastlinskega sestoja, vitalnosti, deformacij, kloroze, nekroze in splošnega videza v primerjavi s kontrolo.

 

Preskusna kemikalija: katera koli snov ali zmes, preskušena s to metodo.

Dodatek 2

Seznam vrst, uporabljenih pri preskušanju rastlin v preteklosti

Družina

Vrsta

Splošna imena

DICOTYLEDONAE (DVOKALIČNICE)

Apiaceae (Umbelliferae) (kobulnice)

Daucus carota

korenje

Asteraceae (Compositae) (nebinovke (košarnice))

Helianthus annuus

sončnice

Asteraceae (Compositae) (nebinovke (košarnice))

Lactuca sativa

solata

Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice))

Sinapis alba

bela gorjušica

Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice))

Brassica campestris var. chinensis

kitajski kapus

Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice))

Brassica napus

oljna ogrščica

Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice))

Brassica oleracea var. capitata

zelje

Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice))

Brassica rapa

strniščna repa

Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice))

Lepidium sativum

kreša

Brassicaceae (Cruciferae) (križnice (kapusnice))

Raphanus sativus

redkev

Chenopodiaceae (metlikovke)

Beta vulgaris

sladkorna pesa

Cucurbitaceae (bučevke)

Cucumis sativus

kumara

Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice))

Glycine max (G. soja)

soja

Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice))

Phaseolus aureus

mungo fižol

Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice))

Phaseolus vulgaris

pritlikavi fižol, stročji fižol, vrtni fižol

Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice))

Pisum sativum

grah

Fabaceae (Leguminosae) (metuljnice (stročnice))

Trigonella foenum- graecum

božja rutica

metuljnice (stročnice) (Fabaceae (Leguminosae))

Lotus corniculatus

navadna nokota

metuljnice (stročnice) (Fabaceae (Leguminosae))

Trifolium pratense

črna detelja

metuljnice (stročnice) (Fabaceae (Leguminosae))

Vicia sativa

grašica

Linaceae (lanovke)

Linum usitatissimum

lan

Polygonaceae (dresnovke)

Fagopyrum esculentum

ajda

Solanaceae (razhudnikovke)

Solanum lycopersicon

paradižnik

MONOCOTYLEDONAE (ENOKALIČNICE)

Liliaceae (Amarylladaceae) (lilijevke (narcisovke))

Allium cepa

čebula

Poaceae (Gramineae) (trave)

Avena sativa

oves

Poaceae (Gramineae) (trave)

Hordeum vulgare

ječmen

Poaceae (Gramineae) (trave)

Lolium perenne

trpežna (angleška) ljuljka

Poaceae (Gramineae) (trave)

Oryza sativa

riž

Poaceae (Gramineae) (trave)

Secale cereale

Poaceae (Gramineae) (trave)

Sorghum bicolor

sirek v zrnju, navadni sirek

trave (Poaceae (Gramineae))

Triticum aestivum

pšenica

Poaceae (Gramineae) (trave)

Zea mays

koruza

Dodatek 3

Seznam potencialnih nekmetijskih rastlin

Potencialne rastline za preskušanje strupenosti rastlin OECD.

Opomba: V naslednji preglednici so informacije o 52 nekmetijskih vrstah (viri so za vsak vnos navedeni v oklepajih). Navedene hitrosti vznika so vzete iz objavljene literature in služijo le kot splošno vodilo. Posamezne izkušnje se lahko razlikujejo glede na vir semena in druge dejavnike.

Botanično ime DRUŽINE vrste

(slovensko splošno ime)

Življenjska doba (9) in habitat

Teža semena

(mg)

Obdobje osvetljenosti za kalivost ali rast (10)

Globina sejanja

(mm) (11)

Čas do kalitve

(dni) (12)

Posebna tretiranja (13)

Preskus strupenosti (14)

Dobavitelji semen (15)

Druge reference (16)

APIACEAE (KOBULNICE)

Torilis japónica

(japonska oklobnica)

E, D; prizadeta območja, žive meje, pašniki (16, 19)

1,7–1,9 (14, 19)

S = T (14)

0

(1, 19)

5 (50 %) (19)

hladna stratifikacija (7, 14, 18, 19), morda je potrebno zorenje (19), tema zavira kalivost (1, 19), brez posebnih tretiranj (5)

NAKNADNO (5)

 

 

ASTERACEAE (NEBINOVKE)

Bellis perennis

(navadna marjetica)

T

travišča, orna zemljišča, trate (16, 19)

0,09–0,17 (4, 19)

S = T (14)

0

(4)

3 (50 %) (19)

11 (100 %) (18)

obsevanost ne vpliva na kalivost (18, 19), brez posebnih tretiranj (4, 14)

NAKNADNO (4)

A, D, F

7

Centaurea cyanus

(plavica)

E

polja, obcestne površine, odprti habitati (16)

4,1–4,9 (4, 14)

S = T (14)

0–3 (2, 4, 14)

14–21 (100 %) (14)

brez posebnih tretiranj (2, 4)

NAKNADNO (2,4)

A, D, E, F

7

Centaurea nigra

(črni glavinec)

T

polja, obcestne površine, odprti habitati (16, 19)

2,4–2,6 (14, 19)

S = T (14)

0 (19)

3 (50 %) (19)

4 (97 %) (18)

morda je potrebno zorenje (18, 19), tema zavira kalivost (19), brez posebnih tretiranj (5, 14, 26)

NAKNADNO (5, 22, 26)

A

 

Inula helenium

veliki oman

T

vlažna, prizadeta mesta

(16)

1–1,3 (4, 14, 29)

 

0

(4, 29)

 

brez posebnih tretiranj (4)

NAKNADNO (4)

A, F

 

Leontodon hispidus

(navadni otavčič)

T

polja, obcestne površine, prizadeta območja (16, 19)

0,85–1,2 (14, 19)

S = T (14)

0 (19)

4 (50 %) (19)

7 (80 %) (18)

tema zavira kalivost (17, 18, 19) brez posebnih tretiranj (5, 23)

NAKNADNO (5, 22, 23)

 

 

Rudbeckia hirta

(srhkodlakava rudbekija)

D, T prizadeta območja

(16)

0,3 (4, 14)

S = T (14)

0

(4, 33)

< 10 (100 %) (33)

brez posebnih tretiranj

(4, 14, 33)

NAKNADNO (4, 33)

C, D, E, F

 

Solidago canadensis

kanadska zlata rozga

T

pašniki, odprta območja (16)

0,06–0,08 (4, 14)

S = T (11)

0

(4)

14–21

(11)

zmešajte z enakim delom peska in 24 ur namakajte v 500 ppm GA (11), brez posebnih tretiranj (4)

NAKNADNO (4)

E, F

 

Xanthium pensylvanicum

(pensilvanski bodič)

E

polja, odprti habitati (16)

25–61 (14, 29)

 

0(1)

5(29)

 

tema lahko zavira kalivost (1), namakajte 12 ur v topli vodi (29)

PREDHODNO IN NAKNADNO (31)

A

 

Xanthium spinosum

(trnati bodič)

E

odprti habitati (16)