Uredba Komisije (ES) št. 2091/2002

z dne 26. novembra 2002

o spremembi Uredbe (ES) št. 2870/2000 o določitvi referenčnih metod Skupnosti za analizo žganih pijač

KOMISIJA EVROPSKIH SKUPNOSTI JE –

ob upoštevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske gospodarske skupnosti,

ob upoštevanju Uredbe Sveta (EGS) št. 1576/89 z dne 29. maja 1989 o določitvi splošnih pravil za opredelitev, opis in predstavitev žganih pijač [1], kakor je bila spremenjena z Aktom o pristopu Avstrije, Finske in Švedske, in zlasti člena 4(8) Uredbe,

ob upoštevanju naslednjega:

(1) Uredba Komisije (ES) št. 2870/2000 z dne 19. decembra 2000 o določitvi referenčnih metod Skupnosti za analizo žganih pijač [2] vsebuje opise teh metod v Prilogi.

(2) Štiri metode analize za določitev trans-anetola v žganih pijačah z janežem, glicirizinske kisline in halkonov v pastisu ter rumenjaka v jajčnem likerju in likerju z dodatkom jajc so potrjene v skladu z mednarodno priznanimi merili v okviru raziskovalnega projekta, ki ga podpira Komisija.

(3) Te štiri metode se lahko priznajo kot referenčne metode Skupnosti in morajo biti dodane Prilogi k Uredbi (ES) št. 2870/2000.

(4) Ukrepi, predvideni s to uredbo, so v skladu z mnenjem Odbora za izvajanje določb o žganih pijačah –

SPREJELA NASLEDNJO UREDBO:

Člen 1

Priloga k Uredbi (ES) št. 2870/2000 se spremeni:

1. V kazalu Priloge se črta navedbe "(p. m.)" v točkah V, VI, VII in IX.

2. Za poglavjem III se dodajo poglavja V, VI, VII in IX iz Priloge k tej uredbi.

Člen 2

Ta uredba začne veljati sedmi dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti.

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.

V Bruslju, 26. novembra 2002

Za Komisijo

Franz Fischler

Član Komisije

[1] UL L 160, 12.6.1989, str. 1.

[2] UL L 333, 29.12.2000, str. 20.

--------------------------------------------------

PRILOGA

V. ANETOL. DOLOČITEV TRANS-ANETOLA V ŽGANIH PIJAČAH S PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1. Področje uporabe

Ta metoda je ob uporabi plinske kromatografije primerna za določitev trans-anetola v žganih pijačah z janežem.

2. Normativne reference

ISO 3696: 1987 Voda za analitično laboratorijsko uporabo – specifikacija in testne metode.

3. Načelo

Vsebnost trans-anetola v žganju določimo s plinsko kromatografijo (GC). Enako količino internega standarda (npr.: 4-alinasola (estragola), kadar estragol ni naravno prisoten v vzorcu) dodamo testnemu vzorcu in referenčni raztopini znane koncentracije in oba raztopimo v 45-odstotni raztopini etanola ter neposredno vbrizgnemo v sistem GC. Pred pripravo vzorca in analizo likerjev, ki vsebujejo velike količine sladkorja, je potrebna ekstrakcija.

4. Reagenti in materiali

Za analizo uporabljamo samo reagente s čistostjo vsaj 98 %. Uporabimo vodo vsaj 3. razreda, kakor je opredeljena v standardu ISO 3696.

Referenčne kemikalije je treba hraniti v hladnem (pri 4 °C) in temnem prostoru v aluminijastih posodah ali v pobarvanih (rumenkastorjavih) steklenicah za reagente. Zamaške je po možnosti treba opremiti z aluminijasto folijo. Trans-anetol je treba pred uporabo "odtaliti" iz njegovega kristaliziranega stanja, vendar v tem primeru njegova temperatura ne bi smela nikoli presegati 35 °C.

4.1 Etanol, 96 vol % (CAS 64-17-5)

4.2 1-metoksi-4-(1-propenil) benzol; (trans-anetol) (CAS 4180-23-8)

4.3 4-alilanisole, (estragol) (CAS 140-67-0), priporočeni interni standard (IS)

4.4 Etanol, 45 vol %.

Dodamo 560 g destilirane vode 378 gramom etanola 96 vol %.

4.5 Priprava standardnih raztopin

Vse standardne raztopine je treba hraniti v temnem prostoru pri sobni temperaturi (15 do 35 °C ) v aluminijastih posodah ali v pobarvanih (rumenkastorjavih) steklenicah za reagente. Zamaške je treba po možnosti opremiti z aluminijasto folijo.

Trans-anetol in 4-alilanisol sta praktično netopljiva v vodi, zato je treba trans-anetol in 4-alilanisol raztopiti v delu 96-odstotnega etanola (4.1), preden dodamo 45-odstotni etanol (4.4).

Osnovne raztopine je treba na novo pripraviti tedensko.

4.5.1 Standardna raztopina A

Osnovne raztopine trans-anetola (koncentracija: 2 g/l)

Stehtamo 40 mg trans-anetola (4.2) v 20-mililitrsko merilno bučko (ali 400-mg v 200- mililitrsko, itn.). Dodamo nekaj 96-odstotnega etanola (4.1) in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.

4.5.2 Interni standard B

Osnovna raztopina internega standarda, npr. estragola (koncentracija: 2 g/l)

Stehtamo 40 mg estragola (4.3) v 20-mililitrsko merilno bučko (ali 400-mg v 200- mililitrsko, itn.). Dodamo nekaj 96-odstotnega etanola (4.1) in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.

4.5.3 Raztopine, ki se uporabljajo za preverjanje linearnosti odziva plamensko-ionizacijskega detektorja (FID)

Linearni odziv FID-a se mora preverjati pri analizi, upoštevajoč razpon koncentracij trans-anetola v žganju od 0 g/l do 2,5 g/l. V postopku analize se neznani vzorci žganja 10-krat razredčijo (8.3). Da bi ustvarili analizne pogoje, opisane v metodi, se osnovne raztopine koncentracij 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, in 0,25 g/l trans-anetola pripravijo tako: vzamemo 0,5, 1, 1,5, 2, in 2,5 ml osnovne raztopine A (4.5.1) in jih odpipetiramo v ločene 20-mililitrske merilne bučke; v vsako merilno bučko dodamo 2 ml interne standardne raztopine B (4.5.2) in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.

Kot slepa proba (8.4) se uporablja raztopina koncentracije 0 g/l. (8.4).

4.5.4 Standardna raztopina C

2 ml standardne raztopine A (4.5.1) odpipetiramo v ločeno 20-mililitrsko merilno bučko, dodamo 2 ml internega standarda B (4.5.2) ter dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.

5. Aparature in oprema

5.1 Plinska kromatografija, opremljena s plamensko-ionizacijskim detektorjem (FID) in integratorjem ali drugim sistemom za obdelavo podatkov, ki lahko meri višine ali površine pikov, ter avtomatskim vzorčevalcem ali potrebno opremo za ročno vbrizgavanje vzorcev.

5.2 Injektor tipa split/splitless

5.3 Kapilarna kolona, npr.:

Dolžina: 50 m

Notranji premer: 0,32 mm

Debelina prevleke: 0,2 μm

Stacionarna faza: FFAP – modificiran TPA zamrežen polietilen glikol.

5.4 Laboratorijska oprema: Steklene merilne posode razreda A, analitska tehtnica (natančnost: ± 0,1 mg).

6. Kromatografski pogoji

Tip in dimenzije kolone ter pogoji delovanja plinske kromatografije morajo biti taki, da sta anetol in interni standard ločena eden od drugega ter od drugih motečih snovi. Tipične razmere za kolono, ki je dana kot primer v 5.3, so:

6.1 Nosilni plin: analitski helij

6.2 Pretok: 2 ml/min

6.3 Temperatura injektorja: 250 °C

6.4 Temperatura detektorja: 250 °C

6.5 Temperaturne razmere pečice: izotermne, 180 °C, čas delovanja 10 minut

6.6 Prostornina vbrizga: 1 μl, split 1:40.

7. Vzorci

Vzorce hranimo pri sobni temperaturi v hladnem in temnem prostoru.

8. Postopek

8.1 Preverjanje prisotnosti estragola

Za potrditev odsotnosti estragola v vzorcu je treba opraviti slepo analizo brez dodatka internega standarda. Če je estragol naravno prisoten, moramo uporabiti drug interni standard (na primer mentol).

Odipetiramo 2 ml vzorca v 20-mililitrsko bučko in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.

8.2 Priprava neznanih vzorcev

Odipetiramo 2 ml vzorca v 20-mililitrsko merilno bučko, nato dodamo 2 ml internega standarda B (4.5.2) in dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.

8.3 Slepi poskus

Odipetiramo 2 ml internega standarda B (4.5.2) v 20-mililitrsko merilno bučko in jo dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) ter temeljito premešamo.

8.4 Test linearnosti

Pred začetkom analize je treba preveriti linearnost odziva FID z zaporedno trikratno analizo linearnosti standardnih raztopin (4.5.3).

Na podlagi največjih površin ali višin integratorja izdelamo za vsak vbrizg graf koncentracije izvornih raztopin v g/l proti razmerju R za vsako raztopino.

R = površina ali višina trans-anetola, deljena s površino ali višino estragola.

Dobiti moramo linearno odvisnost.

8.5 Določitev

Vbrizgamo slepi poskus (8.3), nato standardno raztopino C (4.5.4), nato enega od standardov linearnosti (4.5.3), ki delujejo kot kontrolni vzorec kakovosti (tega lahko izberemo s sklicevanjem na verjetno koncentracijo trans-etanola v neznanem vzorcu), nato pet neznanih vzorcev (8.2). Standardni vzorec (kontrolni vzorec) vbrizgamo po petih neznanih vzorcih, da zagotovimo analitično stabilnost.

9. Izračun faktorja odzivnosti

Merimo bodisi površino pika (z uporabo integratorja ali drugega podatkovnega sistema) bodisi višino (ročna integracija) trans-anetola in internega standarda.

9.1 Izračun faktorja odzivnosti (RFi)

Faktor odzivnosti se izračuna:

RFi = (Ci/površina ali višinai)*(površina ali višinais/Cis),

pri čemer je:

Ci koncentracija trans-anetola v standardni raztopini A (4.5.1)

Cis koncentracija internega standarda v standardni raztopini B (4.5.2)

površinai površina (ali višina) trans-anetola

površinais površina (ali višina) internega standarda

RFi se izračuna na podlagi petih vzorcev raztopine C (4.5.4).

9.2 Analiza linearnosti odziva testnih vzorcev

Vbrizgamo testne vzorce linearnosti odziva (4.5.3).

9.3 Analiza vzorca

Vbrizgamo neznane vzorce (8.2).

10. Izračun rezultatov

Formula za izračun koncentracije trans-anetola je:

ci = Cis * (površina ali višinai/površina ali višinais)*RFi,

pri čemer je:

ci neznana koncentracija trans-anetola

Cis koncentracija internega standarda v neznani raztopini (4.5.2)

površina ali višinai površina (ali višina) trans-anetola

površina ali višinais površina (ali višina) internega standarda

RFi odzivnost koeficienta (izracunanega kakor v 9.1)

Koncentracija trans-anetola se izraža v gramih na liter, zaokroženih na eno decimalno mesto.

11. Zagotovitev kakovosti in nadzora

Kromatogrami morajo biti taki, da sta anetol in interni standard ločena drug od drugega ter od katere koli moteče snovi. Vrednost RFi se izračuna na podlagi rezultatov petih vbrizgov raztopine C (4.5.4). Če je koeficient variacije (CV % = (standardni odmik/srednja vrednost)*100)) v intervalu plus ali minus 1 %, je srednja vrednost RFi sprejemljiva.

Zgornji izračun uporabimo za koncentracijo trans-anetola v vzorcu, izbranem za nadzor kakovosti na podlagi linearnosti kontrolnih raztopin (4.5.3).

Če je srednja vrednost rezultatov izračunana na podlagi vzorcev linearnosti, izbrana za interni kontrolni vzorec kakovosti (IQC), v intervalu plus ali minus 2,5 % od teoretične vrednosti, so rezultati za neznani vzorec sprejemljivi.

12. Ravnanje z vzorci žganih pijač z veliko vsebnostjo sladkorja in vzorci likerjev pred analizo s plinsko kromatografijo

Ekstrakcija alkohola iz žgane pijače z veliko vsebnostjo sladkorja, zato da bi se omogočila določitev koncentracije trans-anetola, uporabljajoč plinsko kromatografijo (GC).

12.1 Načelo

Vzamemo alikvot vzorca likerja in mu dodamo interni standard v podobni koncentraciji kakor analitu (trans-anetola) v likerju. Nato dodamo natrijev fosfat dodekahidrat in brezvodni amonijev sulfat. Mešanico dobro pretresemo in ohladimo, razvijeta se dve plasti, nato odstranimo zgornjo plast alkohola. Vzamemo alikvot te plasti alkohola in razredčimo s 45-odstotno raztopino etanola (4.4) (Opomba: v tej fazi se ne dodaja noben interni standard, ker je že dodan). Pridobljeno raztopino analiziramo s plinsko kromatografijo.

12.2 Reagenti in materiali

Med ekstrakcijo uporabimo samo reagente čistosti 99 % in več.

12.2.1 Amonijev sulfat, brezvodni (CAS 7783-20-2).

12.2.2 Natrijev fosfat dodekahidrat, dvobazni (CAS 10039-32-4).

12.3 Aparature in oprema

Erlenmajerice, liji ločniki, hladilnik.

12.4 Postopek

12.4.1 Preverjanje prisotnosti estragola

Za preverjanje odsotnosti estragola Č v vzorcu, je treba izvesti slepo ekstrakcijo (12.6.2) in analizo brez dodajanja internega standarda. Če je estragol naravno prisoten, uporabimo drug interni standard.

12.4.2 Ekstrakcija

Od Pipetiramo 5 ml 96-odstotnega etanola (4.1) v erlenmajerico in vanjo stehtamo 50 mg internega standarda (4.3) ter dodamo 50 ml vzorca. Dodamo 12 g brezvodnega amonijevega sulfata(12.2.1) in 8.6 g dvobaznega natrijevega fosfatadodekahidrata (12.2.2). Zamašimo erlenmajerico.

Erlenmajerico stresamo vsaj 30 minut. Lahko uporabimo mehanski stresalnik, vendar ne magnetnega mešala, prevlečenega s teflonom, ker bi teflon absorbiral nekaj analita. Upoštevamo, da se dodane soli ne bodo raztopile v celoti.

Zamašeno erlenmajerico damo v hladilnik (T < 5 C) za vsaj dve uri.

Medtem se morajo ustvariti dve ločeni plasti in trdni ostanek. Plast alkohola mora biti čista, če ni, damo erlenmajerico ponovno v hladilnik, dokler ne dosežemo jasne ločitve.

Ko je plast alkohola čista, previdno odvzamemo alikvot (npr. 10 ml) brez dotikanja vodne plasti, damo v temno stekleničko in trdno zapremo.

12.4.3 Priprava ekstrahiranega vzorca

Pustimo, da ekstrakt (12.4.2) doseže sobno temperaturo.

Vzamemo 2 ml alkoholne plasti vzorca pri sobni temperaturi in ga odpipetiramo v 20-mililitrsko merilno bučko, dopolnimo s 45-odstotnim etanolom (4.4) in temeljito premešamo.

12.5 Določitev

Sledimo postopku, kakor je opisan v 8.5.

12.6 Izračun rezultatov

Uporabimo naslednjo formulo za izračun rezultatov:

Ci = (mis/V)* (površinai/površina is) *RFi,

pri čemer je:

mis masa internega standarda (4.3), ki je uporabljen (12.4.2) (v miligramih),

V prostornina neznanega vzorca (50 ml)

RFi faktor odzivnosti (9.1)

površinai površina trans-anetola

površinais površina internega standarda

Rezultate izrazimo v gramih na liter, zaokroženih na eno decimalno mesto.

12.7 Nadzor in zagotovitev kakovosti

Sledimo postopku, kakor je opisan v 11 zgoraj.

13. Značilnosti rezultatov metode (natančnost)

Statistični rezultati medlaboratorijskega poskusa:

naslednje tabele vsebujejo vrednosti za anetol.

Naslednji podatki so pridobljeni na podlagi mednarodnega medlaboratorijskega preskusa, ki je opravljen v skladu z mednarodno priznanimi postopki.

Leto medlaboratorijskega poskusa | 1998 |

Število laboratorijev | 16 |

Število vzorcev | 10 |

Analit | anetol |

Pastis:

Vzorci | A | B | C | D | E | F |

Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 15 | 15 | 15 | 13 | 16 | 16 |

Število izločenih (laboratorijev) | 1 | 1 | 1 | 3 | — | — |

Število sprejetih rezultatov | 30 | 30 | 30 | 26 | 16 | 16 |

Srednja vrednost g/l | 1,477 | 1,955 | 1,940 | 1,833 | 1,741 | 1,754 |

Standardni odklon ponovljivosti (Sr) g/l | 0,022 | 0,033 | 0,034 | 0,017 | — | — |

Relativni standarni odklon ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,7 | 1,8 | 0,9 | — | — |

Meja ponovljivosti (r) g/l | 0,062 | 0,093 | 0,096 | 0,047 | — | — |

Standardni odklon obnovljivosti (SR) g/l | 0,034 | 0,045 | 0,063 | 0,037 | 0,058 | 0,042 |

Relativni standardni odklon obnovljivosti (RSDR) ( %) | 2,3 | 2,3 | 3,2 | 2,0 | 3,3 | 2,4 |

Meja obnovljivosti (R) g/l | 0,094 | 0,125 | 0,176 | 0,103 | 0,163 | 0,119 |

Vrste vzorcev:

A pastis, slepi, duplikati

B pastis, slepi, duplikati

C pastis, slepi, duplikati

D pastis, slepi, duplikati

E pastis, posamezni, duplikati

F pastis, posamezni, duplikati

Druge žgane pijače z janežem:

Vzorci | G | H | I | J |

Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 16 | 14 | 14 | 14 |

Število izločenih (laboratorijev) | — | 2 | 1 | 1 |

Število sprejetih rezultatov | 32 | 28 | 28 | 28 |

Srednja vrednost g/l | 0,7780,530 (*) | 1,742 | 0,351 | 0,599 |

Standardni odklon ponovljivosti (Sr) g/l | 0,020 | 0,012 | 0,013 | 0,014 |

Relativni standardni odklon ponovljivosti (RSDr) (%) | 3,1 | 0,7 | 3,8 | 2,3 |

Meja ponovljivosti (r) g/l | 0,056 | 0,033 | 0,038 | 0,038 |

Standardni odklon obnovljivosti (SR) g/l | 0,031 | 0,029 | 0,021 | 0,030 |

Relativni standardni odklon obonovljivosti (RSDR) (%) | 4,8 | 1,6 | 5,9 | 5,0 |

Meja obnovljivosti (R) g/l | 0,088 | 0,080 | 0,058 | 0,084 |

Vrste vzorcev:

G ouzo, split (*)

H jane, slepi duplikati

I liker z janežem, duplikati

J liker z janežem, duplikati

VI. GLICIRIZINSKA KISLINA. DOLOČITEV GLICIRIZINSKE KISLINE Z UPORABO TEKOČINSKE KROMATOGRAFIJE VISOKE LOČLJIVOSTI

1. Področje uporabe

Ta metoda je primerna za določitev glicirizinske kisline v žganih pijačah z janežem z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC). Uredba (EGS) št. 1576/89 določa, da mora žgana pijača "pastis" vsebovati med 0,05 in 0,5 g glicirizinske kisline na liter.

2. Normativne reference

ISO 3696: 1987 Voda za analitično laboratorijsko uporabo – specifikacija in testne metode.

3. Načelo

Koncentracijo glicirizinske kisline določimo z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) z UV-detektorjem. Standardno raztopino in testni vzorec filtriramo in ju ločeno vbrizgamo neposredno v sistem tekočinske kromatografije.

4. Reagenti in materiali

Za analizo uporabljamo le reagente, ki ustrezajo zahtevam tekočinske kromatografije, absolutni etanol in vodo 3. razreda, kakor je definirana s standardom ISO 3696.

4.1 Etanol, 96 vol % (CAS 64-17-5).

4.2 Amonijev glicirizinat, C42H62O16.NH3 (amonijeva sol glicirizinske kisline)

(Mol. Wt.: 839,98)(CAS 53956-04-0): vsaj 90-odstotna čistost

(Mol. Wt.: glicirizinska kislina 822,94).

4.3 Ocetna kislina (ledocet), CH3COOH, (CAS 64-19-7).

4.4 Metanol, CH3OH (CAS 67-56-1).

4.5 Etanol, 50 vol %.

Za 1000 ml pri 20 °C:

- etanol, 96 vol. % (4.1): 521 ml

- voda (2.0): 511 ml.

4.6 Priprava elucijskih raztopin za visoko učinkovito tekoče izpiranje

4.6.1 Mobilna faza (topilo) A (primer)

80 delov (prostornina) vode (2.0)

20 delov (prostornina) ocetne kisline (4.3).

Razplinjujemo topilo pet minut.

Opomba:

Če uporabljena voda ni mikrofiltrirana, je priporočljivo filtrirati pripravljeno topilo skozi filter za organska topila z velikostjo lukenj 0,45 μm ali manj.

4.6.2 Mobilna faza (topilo) B (primer)

Metanol (4.4).

4.7 Priprava standardnih raztopin

Vse standardne raztopine moramo sveže pripraviti po dveh mesecih.

4.7.1 Referenčna raztopina C

Z natančnostjo na 0,1 mg stehtamo 25 mg amonijevega glicirizinata (4.2) v 100-mililitrsko merilno bučko. Dodamo nekaj 50 –odstotnega etanola (4.5) in raztopimo amonijev glicirizinat. Ko se raztopi, dopolnimo do oznake s 50-odstotnim etanolom. (4.5).

Filtriramo skozi filter za organska topila.

4.7.2 Standardne raztopine, ki se uporabljajo za preverjanje linearnosti odziva instrumentov

Osnovno raztopino 1,0 g/l pripravimo s tehtanjem, z natančnostjo na 0,1 mg. 100 mg amonijevega glicirizinata stehtamo v 100-mililitrsko merilno bučko. Dodamo nekaj 50-odstotnega etanola (4.5) in raztopimo amonijev glicirizinat. Ko se raztopi, dopolnimo do oznake s 50 –odstotnim etanolom (4.5).

Pripravimo vsaj štiri druge raztopine, ki ustrezajo koncentracijam amonijevega glicirizinata 0,05, 0,1, 0,25 in 0,5 g/l, s posamičnim pipetiranjem 5 ml, 10 ml, 25 ml in 50 ml osnovne raztopine s koncentracijo 1,0 g/l v ločene 100-mililitrske merilne bučke. Nato do oznake dopolnimo s 50-odstotnim etanolom (4.5) in temeljito premešamo.

Filtriramo vse raztopine skozi filter za organska topila.

5. Aparature in oprema

5.1 Separacijski sistem

5.1.1 Tekoča kromatografija visoke ločljivosti

5.1.2 Črpalni sistem, ki nam omogoča doseganje in ohranjanje stalnega programiranega pretoka z veliko natančnostjo.

5.1.3 UV-spektrofotometrični detekcijski sistem: nastavimo na 254 nm.

5.1.4 Sistem za razplinjanje topil.

5.2 Računalniški integrator ali registrator združljiv z drugim sistemom.

5.3 Kolona (primer):

Material: nerjaveče jeklo ali steklo

Notranji premer: 4 do 5 mm

Dolžina: 100 do 250 mm

Stacionarna faza: silika, oplaščena z oktadecilno skupino (C18), velikost delca: 5 μm.

5.4 Laboratorijska oprema

5.4.1 Analitska tehtnica z natančnostjo 0,1 mg

5.4.2 Merilna posoda razreda A

5.4.3 Priprave za filtriranje za mikromembransko filtracijo majhnih prostornin

6. Kromatografski pogoji

6.1 Elucijske značilnosti: (primer)

- pretok: 1 ml/minuto,

- topilo A = 30 %,

- topilo B = 70 %,

6.2 Detekcija:

- UV = 254 nm

7. Postopek

7.1 Priprava vzorca žgane pijače

Po potrebi filtriramo skozi filter za organska topila (premer lukenj: 0,45 μm).

7.2 Določitev

Ko se ustalijo kromatografski pogoji,

- vbrizgamo 20 μl referenčne raztopine C (4.7.1),

- vbrizgamo 20 μl vzorčne raztopine,

- primerjamo oba kromatograma. Identificiramo pike glicirizinske kisline na podlagi njihovega retenzijskega časa. Izmerimo njihove površine (ali višine) in izračunamo koncentracijo v g/l, zaokroženo na dve decimalni mesti natančno, z naslednjo enačbo:

c =

c × h × P × 823H × 100 × 840

pri čemer je:

c koncentracija v gramih na liter glicirizinske kisline v žgani pijači, ki jo analiziramo

C koncentracija v gramih na liter amonijevega glicirizinata v referenčni raztopini

h površina (ali višina) glicirizinske kisline v žgani pijači, ki jo analiziramo

H površina (ali višina) glicirizinske kisline v referenčni raztopini

P čistost referencnega amonijevega glicirizinata (v %)

823 masa enega mola glicirizinske kisline

840 masa enega mola amonijevega glicirizinata.

8. Značilnosti rezultatov metode (natančnost)

Statistični rezultati medlaboratorijskega preskusa:

naslednja tabela vsebuje vrednosti glicirizinske kisline.

Naslednji podatki so pridobljeni na podlagi mednarodnega medlaboratorijskega poskusa, opravljenega v skladu z mednarodno priznanimi postopki.

Leto medlaboratorijskega poskusa | 1998 |

Število laboratorijev | 16 |

Število vzorcev | 5 |

Analit | glicirizinska kislina |

Vzorci | A | B | C | D | E |

Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 13 | 14 | 15 | 16 | 16 |

Število izločenih (laboratorijev) | 3 | 2 | 1 | — | — |

Število sprejetih rezultatov | 26 | 28 | 30 | 32 | 32 |

Srednja vrednost g/l | 0,046 | 0,092(*) 0,099 | 0,089 | 0,249 | 0,493 |

Standardni odklon ponovljivosti (Sr) g/l | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,003 |

Relativni standardni odklon ponovljivosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,3 | 0,7 | 1,0 | 0,6 |

Meja ponovljivosti (r) g/l | 0,002 | 0,004 | 0,002 | 0,007 | 0,009 |

Standardni odklon obnovljivosti(SR) g/l | 0,004 | 0,007 | 0,004 | 0,006 | 0,013 |

Relativni standardni odklon obnovljivosti (RSDR) (%) | 8,6 | 7,2 | 4,0 | 2,5 | 2,7 |

Meja obnovljivosi (R) g/l | 0,011 | 0,019 | 0,010 | 0,018 | 0,037 |

Vrste vzorcev:

A pastis, slepi, duplikati

B pastis, split (*)

C pastis, slepi, duplikati

D pastis, slepi, duplikati

E pastis, slepi, duplikati

VII. HALKONI. METODA TEKOČINSKE KROMATOGRAFIJE VISOKE LOČLJIVOSTI ZA PREVERJANJE PRISOTNOSTI HALKONOV V PASTISU

1. Področje uporabe

Ta metoda je primerna za določitev prisotnosti halkonov v pijačah z janežem. Halkoni so naravna barvila iz družine flavonoidov, ki jih najdemo v koreninah sladkega golostebelnega korena (Glycyrrhiza glabra).

Žgana pijača z imenom "pastis" mora vsebovati halkone (Uredba (EGS) št. 1576/89).

2. Normativne reference

ISO 3696: 1987 Voda za analitsko laboratorijsko uporabo – specifikacija in testne metode.

3. Načelo

Pripravimo referenčno raztopino ekstraktov iz sladkega golostebelnega korena. Prisotnost ali odsotnost halkonov določimo z uporabo tekoče kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) z UV-detektorjem.

4. Reagenti in materiali

Za analizo uporabimo le reagente, ki ustrezajo zahtevam tekočinske kromatografije. Etanol mora biti vsaj 96-odstoten. Uporablja se voda 3. razreda, kakor je definirana v standardu ISO 3696.

4.1 Etanol, 96 vol % (CAS 64-17-5)

4.2 Acetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8)

4.3 Referenčna snov: Glycyrrhiza glabra: sladki golostebelni koren

Grobo zmlete korenine sladkega golostebelnega korena (Glycyrrhiza glabra). Povprečne dimenzije delcev: dolžina: 10 do 15 mm, debelina: 1 do 3 mm.

4.4 Natrijev acetat, CH3COONa, (CAS 127-09-3)

4.5 Ocetna kislina (ledocet), CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.6 Priprava raztopin

4.6.1 Etanol, 50 vol %

Za 1000 ml pri 20 °C:

- etanol, 96 vol. % (4.1): 521 ml,

- voda (2.0): 511 ml.

4.6.2 Topilo A: acetonitril

Acetonitril (4.2) z analitično čistostjo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti.

Razplinimo.

4.6.3 Topilo B: 0,1 M pufer raztopina natrijevega acetata, pH 4,66.

V merilno bučko stehtamo 8,203 g natrijevega acetata (4.4), dodamo 6,005 g ocetne kisline (ledocet) (4.5) in z vodo dopolnimo do 1000 ml (2).

5. Priprava referenčnih ekstraktov iz Glycyrrhiza glabra (4.3)

5.1 Stehtamo 10 g zmletih korenin sladkega golostebelnega korena (Glycyrrhiza glabra) (4.3) in damo v destilacijsko bučko z okroglim dnom

- dodamo 100 ml etanola z vsebnostjo 50 vol. % (4.6.1),

- vremo eno uro ob povratnem toku (refluksu),

- filtriramo,

- shranimo filtrat za kasnejšo uporabo.

5.2 Vzamemo ekstrakt korena iz filtra

- damo v destilacijsko bučko z okroglim dnom

- dodamo 100 ml 50-odstotnega etanola, (4.6.1),

- vremo eno uro ob povratnem toku (refluksu),

- filtriramo. Shranimo filtrat za kasnejšo uporabo.

5.3 Ekstrakcija korenine sladkega golostebelnega korena se opravi trikrat zaporedoma.

5.4 Združimo vse tri filtrate.

5.5 Pustimo, da topilna faza (iz 5.4) izhlapi na rotacijskem evaporatorju.

5.6 Preostali ekstrakt (iz 5.5) dopolnimo s 100 ml 50-odstotnega etanola. (4.6.1).

6. Aparature in oprema

6.1 Separacijski sistem.

6.1.1 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

6.1.2 Črpalni sistem, ki lahko doseže in ohrani stalno ali programirano hitrost pretoka pri visokem pritisku.

6.1.3 UV/vidni spektrofotometrični detektor, ki se lahko nastavi na 254 in 370 nm.

6.1.4 Sistem za razplinjanje topil:

6.1.5 Termostat kolone, ki se lahko nastavi na temperaturo 40 ± 0,1 °C.

6.2 Računalniški integrator ali registrator združljiv z drugim separacijskim sistemom.

6.3 Kolona

Material: nerjaveče jeklo ali steklo

Notranji premer: 4 do 5 mm

Stacionarna faza: silika, oplaščena z oktadecilno skupino (C 18), velikost delca: 5 μm.

6.4 Običajna laboratorijska oprema:

6.4.1 analitska tehtnica (natančnost: ± 0,1 mg)

6.4.2 destilacijska aparatura s kondenzatorjem povratnega toka (refluksa), vključujoč npr.:

- 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom s standardiziranim obrusom iz brušenega stekla,

- 30 cm dolgi kondenzator povratnega toka in

- vir toplote (z uporabo ustrezne priprave moramo preprečiti vsako pirogeno reakcijo nepredestilirane snovi).

6.4.3 Rotacijski evaporator.

6.4.4 Filtracijski sistem (tj. Buchnerjevega lija).

6.5 Kromatografski pogoji (primer).

6.5.1 Elucijske značilnosti topil A (4.6.2) in B (4.6.3):

- gradient iz 20/80 (v/v) na 50/50 (v/v) v 15 minutah,

- gradient iz 50/50 (v/v) na 75/25 (v/v) v petih minutah,

- izenačimo 75/25 (v/v) za pet minut,

- stabilizacija kolone med vbrizgi,

- izenačimo 20/80 (v/v) za pet minut,

6.5.2 Pretok: 1 ml/minuto.

6.5.3 Nastavitve UV-detektorja:

Detektor mora biti nastavljen na 370 nm za detekcijo halkonov in potem na 254 nm za detekcijo glicirizinske kisline.

Opomba:

sprememba valovne dolžine (z 370 nm na 254 nm) mora biti opravljena 30 sekund prej, preden elucija glicirizinske kisline začne dosegati največje vrednosti.

7. Postopek

7.1 Priprava vzorca žgane pijače

Filtriramo skozi filter za organska topila (premer lukenj: 0,45 μm).

7.2 Priprava ekstrakta iz sladkega golostebelnega korena (5.6)

Naredimo raztopino ena proti deset s 50-odstotnim etanolom (4.6.1)

7.3 Določitev

7.3.1 Vbrizgamo 20 μl pripravljenega ekstrakta (7.2). Analizo izvedemo pri kromatografskih pogojih, ki so opisani zgoraj (6.5).

7.3.2 Vbrizgamo 20 μl vzorca (7.1) (vzorec žgane pijače z janežem). Analizo izvedemo pri kromatografskih pogojih, ki so opisani zgoraj (6.5).

7.3.3 Primerjamo oba kromatograma. Podobnost med dvema kromatografoma mora biti velika v območju halkona (med ugotavljanjem pri 370 nm pri zgoraj opisanih pogojih analize.) (Glej Diagram 1)

8. Značilni kromatogram za pastis

+++++ TIFF +++++

9. Značilnosti rezultatov metode (natančnost)

Rezultati medilaboratorijskega poskusa:

Naslednja tabela opisuje rezultate ugotavljanja halkona v pastisu in žganih pijačah z aromo janeža.

Naslednji podatki so pridobljeni na podlagi mednarodnega medlaboratorijskega poskusa, ki je opravljen v skladu z mednarodno sprejetimi postopki.

Leto medlaboratorijskega poskusa | 1998 |

Število laboratorijev | 14 |

Število vzorcev | 11 |

Analit | halkoni |

Vzorci | A | B | C | D | E | F |

Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 13 |

Število izločenih (laboratorijev) | — | — | — | — | — | 1 [1] |

Število sprejetih rezultatov | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | 26 |

Število rezultatov, ki kažejo na prisotnost halkona | 28 | 14 | 14 | 0 | 28 | 0 |

Število rezultatov, ki kažejo na odsotnost halkonov | 0 | 0 | 0 | 28 | 0 | 26 |

Odstotek pravilnih rezultatov ( %) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Vzorci | G | H | I | J | K |

Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 |

Število izločenih (laboratorijev) | — | — | — | — | — |

Število sprejetih rezultatov | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |

Število rezultatov, ki kažejo prisotnost halkonov | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |

Število rezultatov, ki kažejo na odsotnost halkonov | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |

Odstotek pravilnih rezultatov (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Vrste vzorcev:

A pastis, slepi, duplikati

B pastis, posamezni vzorci

C pastis, posamezni vzorci

D "pastis" (brez vsebnosti halkonov), slepi, duplikati

E "pastis" (brez vsebnosti halkonov), slepi, duplikati

F liker z janežem (brez vsebnosti halkonov), slepi, duplikat

G liker z janežem (brez vsebnosti halkonov), slepi, duplikat

H ouzo (brez vsebnosti halkonov), posamezni vzorec

I ouzo (brez vsebnosti halkonov), posamezni vzorec

J jane (brez vsebnosti halkonov), slepi duplikati

K "pastis" (brez vsebnosti halkonov, slepi duplikati.

IX. RUMENJAK. DOLOČITEV KONCENTRACIJE RUMENJAKA V ŽGANIH PIJAČAH – FOTOMETRIČNA METODA

1. Področje uporabe

Ta metoda je primerna za določitev koncentracije rumenjaka v razponu med 40 in 250 g/l v jajčnem likerju in likerju z jajci.

2. Normativne reference

ISO 3696:1897 Voda za analitično laboratorijsko uporabo – specifikacija in testne metode.

3. Načelo

Fosforne spojine, topne v etanolu, in jih najdemo v jajcu, se ekstrahirajo in ovrednotijo fotometrično kot fosfomolibdenski kompleks.

4. Reagenti in materiali

4.1 Dvakrat destilirana voda

4.2 Diatomejska zemlja

4.3 Etanol, 96 vol % (CAS 64-17-5)

4.4 15 % raztopina magnezijevega acetatata (CAS 16674-78-5)

4.5 10 % žveplena kislina (CAS 7664-93-9)

4.6 1 N žveplena kislina

4.7 0,16 g/l raztopine kalijevega dihidrogen fosfata (CAS 778-77-0), KH2PO4

4.8 Reagenti za določitev fosfata:

20 g amonijevega molibdata (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24.4H2O raztopimo v 400 ml vode pri 50 °C;

v drugi posodi raztopimo 1 g amonijevega vanadata (CAS 7803-55-6) NH4VO3 v 300 ml vroče vode, pustimo, da se ohladi, in dodamo 140 ml koncentrirane dušikove kisline (CAS 7697-37-2). Združimo ohlajene raztopine v 1000-mililitrski merilni bučki in dopolnimo do oznake.

5. Aparature in oprema

5.1 1100-mililitrska erlenmajerica

5.2 Ultrazvočna kopel (ali magnetno mešalo)

5.3 3100-mililitrska merilna bučka

5.4 Vodna kopel pri 25 °C

5.5 Filter (whatman št. 4 ali enakovreden)

5.6 Porcelanski (ali platinasti) lonček

5.7 Vodna kopel

5.8 Plošča za izparevanje

5.9 Talilna peč

5.10 50-mililitrska merilna bučka

5.11 20-mililitrska merilna bučka

5.12 Spektrofotometer, nastavljen na 420 nm.

5.13 1-centimetrska kiveta.

6. Vzorci

Vzorci se pred analizo hranijo na sobni temperaturi.

7. Postopek

7.1 Priprava vzorca

7.1.1 Stehtamo 10 g vzorca v 100-mililitrsko erlenmajerico (5.1).

7.1.2 Postopno dodajamo 70 ml etanola (4.3) v majhnih količinah, obračamo erlenmajerico ob vsakem dodatku, nato damo v ultrazvočno kopel (5.2) za 15 minut (ali mešamo z magnetnim mešalom (5.2) 10 minut na sobni temperaturi).

7.1.3 Vsebino erlenmajerice prenesemo v 100-mililitrsko merilno bučko (5.3) ob splakovanju z etanolom (4.3). Do oznake dopolnimo z etanolom (4.3) in damo bučko v vodno kopel pri 20 °C (5.4). Dopolnimo do oznake pri 20 °C.

7.1.4 Dodamo majhno količino diatomejske zemlje (4.2), filtriramo (5.5) in zavržemo prvih 20 ml.

7.1.5 Prenesemo 25 ml filtrata v porcelanasti (ali platinasti) lonček (5.6). Nato filtrat koncentriramo z izhlapevanjem v vreli vodni kopeli (5.7) ob dodatku 5 ml 15-odstotne raztopine magnezijevega acetata (4.4).

7.1.6 Lonček postavimo na ploščo za izparevanje (5.8) in segrevamo do izsušitve.

7.1.7 Preostanek sežgemo pri 600 °C v peči (5.9), dokler pepel ne pobeli. Postopek naj traja najmanj eno uro in pol, vendar lahko pustimo čez noč.

7.1.8 Pepel prelijemo z 10 ml 10-odstotne žveplene kisline in ga prenesemo ob spiranju z destilirano vodo (4.1) v 50-mililitrsko merilno bučko (5.10) in jo napolnimo do oznake pri sobni temperaturi z destilirano vodo (4.1). 5-milimetrski alikvot te raztopine pepela se uporabi za pripravo vzorčne raztopine za fotometrični preskus.

7.2 Fotometrični preskus

7.2.1 Primerjalne raztopine

7.2.1.1 10 ml 10-odstotne žveplene kisline (4.5) nalijemo v 50-mililitrsko merilno bučko (5.10) in napolnimo do oznake z destilirano vodo (4.1).

7.2.1.2 5 mililitrom alikvota raztopine (7.2.1.1) v 20-mililitrski merilni bučki (5.11) dodamo 1 ml 1N žveplene kisline (4.6) in 2 ml fosfatovega reagenta (4.8) ter dopolnimo do oznake z destilirano vodo (4.1).

7.2.1.3 Zamašimo z rahlo vstavljenim zamaškom, pretresemo in segrevamo v vreli vodni kopeli (5.7) 10 minut, nato hladimo 20 minut v vodni kopeli pri 20 °C (5.4).

7.2.1.4 Napolnimo 1-centimetrsko kiveto (5.13) s to primerjalno raztopino.

7.2.2 Raztopina vzorca

7.2.2.1 5 mililitrom alikvota raztopine pepela (7.1.8) v 20-mililitrski merilni bučki (5.11) dodamo 1 ml 1 N žveplene kisline (4.6) in 2 ml fosfatovega reagenta (4.8) in dopolnimo do oznake z destilirano vodo (4.1).

7.2.2.2 Zamašimo z rahlo vstavljenim zamaškom, pretresemo in segrevamo v vreli vodni kopeli (5.7) 10 minut, nato hladimo v vodni kopeli 20 minut pri 20 °C (5.4).

7.2.2.3 Rumeno raztopino, ki se razvije, nemudoma analiziramo s spektrofotometrično (5.12) v 1-centimetrski kiveti (5.13) pri 420 nm glede na primerjalne raztopine (7.2.1.4).

7.2.3 Umeritvena krivulja

7.2.3.1 Za izdelavo umeritvene krivulje dodamo 2 ml alikvota fosfatovega reagenta (4.8) v 20-mililitrske merilne bučke (5.11), od katerih vsaka vsebuje 1 ml 1 N žveplene kisline (4.6) in 0, 2, 4, 6, 8, ter 10 ml raztopine kalijevega dihidrogenega fosfata (4.7). Dopolnimo do oznake z destilirano vodo (4.1).

7.2.3.2 Zamašimo z rahlo vstavljenim zamaškom, pretresemo in segrevamo na vreli vodni kopeli (5.7) 10 minut, nato hladimo v vodni kopeli pri 20 °C (5.4) 20 minut ter analiziramo s spektrofotometrom (5.12) v 1-centimetrski kiveti (5.13) pri 420 nm glede na primerjalno raztopino (7.2.1.4).

7.2.3.3 Izdelava kalibracijske krivulje

raztopina dihidrogenega fosfata (ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

P2O5 (mg) | 0 | 0,167 | 0,334 | 0,501 | 0,668 | 0,835 |

8. Navajanje rezultatov

Vsebnost rumenjaka v g/l se izračuna z naslednjo formulo:

g/l rumenjak = mg P

O

×

110 × gostotaE/40

pri čemer je:

110 faktor pretvorbe za celotni P2O5 v gramih v 100 g rumenjaka

mg P2O5 na osnovi umeritvene krivulje ugotovljena vrednost

gostota masa na enoto prostornine (g/ml) likerja na osnovi rumenjaka pri 20 °C

E masa likerja na osnovi jajc v gramih

40 faktor razredčitve za 5 ml alikvota raztopine pepela.

9. Značilnosti rezultatov metode (natančnost)

Statistični rezultati medlaboratorijskega poskusa:

naslednja tabela vsebuje vrednosti za rumenjak.

Naslednji podatki so pridobljeni na podlagi mednarodnega medlaboratorijskega poskusa, ki je opravljen v skladu z mednarodno sprejetimi postopki.

Leto interlaboratorijskega testa: | 1998 |

Število laboratorijev: | 24 |

Število vzorcev: | 5 |

Analit: | rumenjak |

Vzorci | A | B | C | D | E |

Število preostalih laboratorijev po izločitvi | 19 | 20 | 22 | 20 | 22 |

Število izločenih (laboratorijev) | 3 | 4 | 2 | 4 | 2 |

Število sprejetih rezultatov | 38 | 40 | 44 | 40 | 44 |

Srednja vrednost | 147,3 | 241,1 | 227,4 | 51,9 (*)72,8 (*) | 191,1 |

Standardni odklon ponovljivosti (Sr) g/l | 2,44 | 4,24 | 3,93 | 1,83 | 3,25 |

Relativni standardni odklon ponovljivosti (RSDR) (%) | 1,7 | 1,8 | 1,8 | 2,9 | 1,7 |

Meja ponovljivosti (r) g/l | 6,8 | 11,9 | 11,0 | 5,1 | 9,1 |

Standardni odklon obnovljivosti (SR) g/l | 5,01 | 6,06 | 6,66 | 3,42 | 6,87 |

Relativni standardni odklon obnovljivosti(RSDR) (%) | 3,4 | 2,5 | 2,9 | 5,5 | 3,6 |

Meja obnovljivosti (R) g/l | 14,0 | 17,0 | 18,7 | 9,6 | 19,2 |

Vrste vzorcev

A Advocaat, slepi duplikati

B Advocaat, slepi duplikati

C Advocaat, slepi duplikati

D Advocaat (razredčen), vrednosti split (*)

E Advocaat, slepi duplikati

[1] Neskladni rezultati med dvema duplikatoma, ki so pripisani napaki vzorčenja.

--------------------------------------------------