1991R2568 — SL — 04.08.2016 — 029.001

To besedilo je zgolj informativne narave in nima pravnega učinka. Institucije Unije za njegovo vsebino ne prevzemajo nobene odgovornosti. Verodostojne različice zadevnih aktov, vključno z uvodnimi izjavami, so objavljene v Uradnem listu Evropske unije. Na voljo so na portalu EUR-Lex. Uradna besedila so neposredno dostopna prek povezav v tem dokumentu

spremenjena z:

popravljena z:

▼B

UREDBA KOMISIJE (EGS) št. 2568/91

z dne 11. julija 1991

o značilnostih oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin ter o ustreznih analiznih metodah

▼M20

Člen 1

1.  Olja, katerih značilnosti so skladne z značilnostmi iz točk 1 in 2 Priloge I k tej uredbi, se štejejo za deviška oljčna olja v smislu točke 1(a) in (b) Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

2.  Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 3 Priloge I k tej uredbi, se šteje za lampante oljčno olje v smislu točke 1(c) Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

3.  Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 4 Priloge I k tej uredbi, se šteje za rafinirano oljčno olje v smislu točke 2 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

4.  Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 5 Priloge I k tej uredbi, se šteje za oljčno olje, sestavljeno iz rafiniranih oljčnih olj in deviških oljčnih olj v smislu točke 3 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

5.  Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 6 Priloge I k tej uredbi, se šteje za surovo olje iz oljčnih tropin v smislu točke 4 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

6.  Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 7 Priloge I k tej uredbi, se šteje za rafinirano olje iz oljčnih tropin v smislu točke 5 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

7.  Olje, katerega značilnosti so skladne z značilnostmi iz točke 8 Priloge I k tej uredbi, se šteje za olje iz oljčnih tropin v smislu točke 6 Priloge k Uredbi št. 136/66/EGS.

▼M26

Člen 2

1.  Značilnosti olj, določenih v Prilogi I, se določijo v skladu z naslednjimi analiznimi metodami:

▼M28

▼M26

▼M28

▼M26

▼M28 —————

▼M26

2.  Preverjanje organoleptičnih značilnosti deviških olj izvajajo nacionalni organi ali njihovi zastopniki v okviru ocenjevalnih komisij, ki jih odobrijo države članice.

Organoleptične značilnosti olja, kot so navedene v prvem pododstavku, se štejejo za skladne z deklarirano kategorijo, če ocenjevalna komisija, ki jo odobri država članica, potrdi razvrstitev.

Če ocenjevalna komisija ne potrdi deklarirane kategorije v zvezi z organoleptičnimi značilnostmi, nacionalni organi ali njihovi zastopniki na zahtevo zainteresirane strani nemudoma opravijo dve ponovljeni oceni, pri čemer ju izvedejo druge odobrene ocenjevalne komisije, vsaj eno oceno pa opravi ocenjevalna komisija, ki jo odobri zadevna država članica proizvajalka. Zadevne značilnosti se štejejo za skladne z deklariranimi značilnostmi, če vsaj dve ponovljeni oceni potrdita deklarirano razvrstitev. V nasprotnem primeru stroške ponovljenih ocen krije zainteresirana stran.

3.  Ko nacionalni organi ali njihovi zastopniki preverijo značilnosti olja, kot je določeno v odstavku 1, se vzamejo vzorci v skladu z mednarodnima standardoma EN ISO 661 za pripravo preskusnih vzorcev in EN ISO 5555 za vzorčenje. Vendar pa se ne glede na točko 6.8 standarda EN ISO 5555 v primeru serij takih olj v izvirnem pakiranju vzorec vzame v skladu s Prilogo Ia k tej uredbi. V primeru nepakiranih olj, ki jih ni mogoče vzorčiti v skladu s standardom EN ISO 5555, se vzorčenje opravi v skladu z navodili pristojnega organa države članice.

Brez poseganja v standard EN ISO 5555 in poglavje 6 standarda EN ISO 661 se vzeti vzorci nemudoma spravijo v temen prostor, v katerem temperatura ni previsoka, in pošljejo v laboratorij za analizo najpozneje v petih delovnih dneh po tem, ko so bili vzeti, pri čemer se hranijo tako, da med prevozom ali hrambo ne propadejo ali se poškodujejo, preden se pošljejo v laboratorij.

4.  Za preverjanje iz odstavka 3 se v primeru pakiranih proizvodov analize, navedene v prilogah II, III, IX, XII in XX, ter, kjer je primerno, vse ponovljene analize, ki jih zahteva nacionalna zakonodaja, izvedejo pred iztekom minimalnega roka trajanja. V primeru vzorčenja nepakiranih olj se navedene analize izvedejo najpozneje šest mesecev po mesecu, v katerem je bil vzorec vzet.

Za druge analize iz te uredbe ne veljajo nobeni roki.

Če se rezultati analiz ne ujemajo z značilnostmi deklarirane kategorije oljčnega olja ali olja iz oljčnih tropin, se zadevna stran o tem uradno obvesti najpozneje en mesec pred koncem obdobja iz prvega pododstavka, razen če je bil vzorec vzet manj kot dva meseca pred minimalnim rokom trajanja.

5.  Za ugotavljanje značilnosti oljčnih olj z metodami, določenimi v prvem pododstavku odstavka 1, se rezultati analize neposredno primerjajo z mejnimi vrednostmi iz te uredbe.

▼M25

Člen 2a

1.  Za namene tega člena „oljčno olje, dano na trg“ pomeni skupno količino oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin posamezne države članice, ki se porabi v navedeni državi članici ali se iz nje izvozi.

2.  Države članice zagotovijo, da se na podlagi analize tveganja selektivno in dovolj pogosto opravijo preverjanja skladnosti, in tako zagotovijo, da je oljčno olje, dano na trg, skladno z deklarirano kategorijo.

3.  Merila za ocenjevanje tveganja lahko vključujejo:

4.  Države članice vnaprej določijo:

Vsako leto je treba izvesti vsaj eno preverjanje skladnosti na tisoč ton oljčnega olja, danega na trg v državi članici.

5.  Države članice preverjajo skladnost:

▼M19 —————

▼M25

Člen 3

Kadar se ugotovi, da olje ne ustreza opisu svoje kategorije, mora zadevna država članica, brez poseganja v kakršne koli druge kazni, uporabiti učinkovite, sorazmerne in odvračilne kazni, ki se določijo glede na resnost odkrite nepravilnosti.

Če se pri pregledih odkrijejo večje nepravilnosti, države članice opravljajo pogostejše preglede v zvezi s fazo trženja, kategorijo olja, poreklom ali drugimi merili.

▼M5

Člen 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Če države članice naletijo na težave pri ustanavljanju skupin ocenjevalcev na svojem ozemlju, se lahko obrnejo na skupino ocenjevalcev, potrjeno v drugi državi članici.

3.  Vsaka država članica sestavi seznam skupin ocenjevalcev, ki so jih ustanovile strokovne ali medpanožne organizacije v skladu s pogoji, določenimi v odstavku 1, in zagotovi, da so ti pogoji izpolnjeni.

▼M19 —————

▼B

Člen 6

1.  Vsebnost olja v oljni pogači in drugi ostanki, ki nastanejo pri pridobivanju oljčnega olja (oznaki KN 2306 90 11 in 2306 90 19 ) se določijo z uporabo metode, predpisane v Prilogi XV.

2.  Vsebnost olja, navedenega v odstavku 1, je izražena v masnem odstotnem deležu olja na maso suhe snovi.

▼M20

Člen 7

Uporabljajo se določbe Skupnosti o prisotnosti onesnaževalcev.

Kar zadeva halogenirana topila so mejne vrednosti za vse kategorije oljčnih olj naslednje:

▼M25

Člen 7a

Fizične ali pravne osebe in skupine oseb, ki imajo v lasti oljčno olje in olje iz oljčnih tropin od faze pridobivanja olja v oljarni do ustekleničenja, v kakršne koli poslovne ali komercialne namene, morajo za vsako kategorijo teh olj voditi evidence dobav in izdanih količin.

Države članice zagotovijo, da je obveznost iz prvega odstavka ustrezno izpolnjena.

▼M25

Člen 8

1.  Države članice morajo obvestiti Komisijo o ukrepih, sprejetih za izvajanje te uredbe. Komisijo obvestijo o kakršnih koli naknadnih spremembah.

2.  Države članice Komisiji vsako leto najpozneje 31. maja predložijo poročilo o izvajanju te uredbe v preteklem koledarskem letu. Poročilo vsebuje vsaj rezultate opravljenih preverjanj skladnosti oljčnega olja v skladu s predlogami iz Priloge XXI.

3.  Obvestila iz te uredbe se predložijo v skladu z Uredbo Komisije (ES) št. 792/2009 ( 1 ).

▼B

Člen 9

Uredba (EGS) št. 1058/77 se s tem razveljavi.

Člen 10

1.  Ta uredba začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropskih skupnosti.

Vendar se metoda, predpisana v Prilogi XII, uporablja od ►M1  1. november 1992 ◄ , razen če ne zadeva postopka sistema intervencij.

▼M5

Ta metoda se ne uporablja za deviško olje, ki je bilo pripravljeno za trg pred 1. novembrom 1992.

▼B

2.  Ta uredba se ne uporablja za oljčno olje in oljčne tropine, predpakirane pred začetkom veljavnosti te uredbe in so v prometu do 31. oktobra 1992.

Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah.

PRILOGE

Vsebina

▼M27

PRILOGA I

ZNAČILNOSTI OLJČNEGA OLJA

Opombe:

Dodatek

DREVO ODLOČANJA

Drevo odločanja za vsebnost kampesterola v deviških in ekstra deviških oljčnih oljih:

Drugi parametri so skladni z mejnimi vrednostmi, določenimi v tej uredbi.

Drevo odločanja za vsebnost delta-7-stigmastenola v:

Drugi parametri so skladni z mejnimi vrednostmi, določenimi v tej uredbi.

▼M26

PRILOGA Ia

VZORČENJE OLJČNEGA OLJA ALI OLJA IZ OLJČNIH TROPIN, DOSTAVLJENEGA V IZVIRNEM PAKIRANJU

Ta metoda vzorčenja se uporablja za serije oljčnega olja ali olja iz oljčnih tropin v izvirnem pakiranju. Uporabljajo se različne metode vzorčenja, odvisno od tega, ali izvirno pakiranje presega 5 litrov ali ne.

„Serija“ pomeni skupek prodajnih enot, ki se proizvajajo, izdelujejo in pakirajo v takih okoliščinah, da se olje, ki ga vsebuje vsaka prodajna enota, šteje za homogeno v smislu vseh analitičnih značilnosti. Posamezne serije se določijo v skladu z Direktivo 2011/91/EU Evropskega parlamenta in Sveta ( 2 )

„Posamični vzorec“ pomeni količino olja v izvirnem pakiranju, ki je vzeta iz naključnega dela serije.

1.   VSEBINA PRIMARNEGA VZORCA

1.1    Izvirno pakiranje, ki ne presega 5 litrov

„Primarni vzorec“ za izvirno pakiranje, ki ne presega 5 litrov, pomeni število posamičnih vzorcev, vzetih iz serije, v skladu s tabelo 1.

Število pakiranj iz tabele 1, ki predstavljajo primarni vzorec, lahko vsaka država članica po lastnih potrebah poveča (na primer zaradi organoleptičnega ocenjevanja v drugem laboratoriju, kot je tisti, ki je izvedel kemijske analize, ponovljeno analizo itd.).

1.2    Izvirno pakiranje, ki presega 5 litrov

„Primarni vzorec“ za izvirno pakiranje, ki presega 5 litrov, pomeni reprezentativen del vseh posamičnih vzorcev, pridobljen z zmanjšanjem, v skladu s tabelo 2. Primarni vzorec mora biti sestavljen iz različnih primerov.

„Primer“ primarnega vzorca pomeni vsako od pakiranj, ki sestavljajo primarni vzorec.

Da bi se zmanjšala prostornina vzorčenih izvirnih pakiranj, se vsebina vzorčenih posamičnih vzorcev homogenizira za pripravo primarnega vzorca. Odmerki različnih posamičnih vzorcev se prelijejo v skupno posodo za homogenizacijo z mešanjem, kar zagotavlja najboljšo zaščito pred zrakom.

Vsebino primarnega vzorca je treba preliti v več pakiranj z najmanjšo prostornino 1,0 litra, pri čemer vsako pakiranje predstavlja primer primarnega vzorca.

Število primarnih vzorcev lahko vsaka država članica po lastnih potrebah poveča (na primer zaradi organoleptičnega ocenjevanja v drugem laboratoriju, kot je tisti, ki je izvedel kemijske analize, ponovljeno analizo itd.).

Vsako pakiranje je treba napolniti tako, da je zračna plast na vrhu čim manjša, nato pa ustrezno zapreti in zatesniti, tako da je proizvod zaščiten pred nedovoljenimi posegi.

Te primere je treba zaradi pravilne identifikacije označiti.

2.   ANALIZE IN REZULTATI

3.   PREVERJANJE KATEGORIJE SERIJE

PRILOGA Ib

DREVO ODLOČANJA ZA PREVERJANJE, ALI JE VZOREC OLJČNEGA OLJA SKLADEN Z DEKLARIRANO KATEGORIJO

Tabela 1

Tabela 2

Tabela 3

Dodatek 1

▼M29

PRILOGA II

DOLOČANJE PROSTIH MAŠČOBNIH KISLIN, METODA V HLADNEM

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Ta metoda opisuje določanje prostih maščobnih kislin v oljčnih oljih in oljih iz oljčnih tropin. Vsebnost prostih maščobnih kislin je izražena kot kislost, izračunana v deležu oleinske kisline.

2.   PRINCIP

Vzorec se raztopi v mešanici topil in prisotne proste maščobne kisline se titrirajo z uporabo raztopine kalijevega hidroksida ali natrijevega hidroksida.

3.   REAGENTI

Vsi reagenti naj bodo priznane analitske kakovosti in uporabljena voda naj bo destilirana ali enakovredne čistoče.

4.   APARATURA

Običajna laboratorijska oprema, vključno z:

5.   POSTOPEK

5.1    Priprava vzorca

Ko je vzorec moten, ga je treba filtrirati.

5.2    Testni vzorec

Odvisno od predvidene kislosti natehtamo vzorec po naslednji tabeli:

Vzorec tehtamo v erlenmajerici (4.2).

5.3    Določanje

Raztopimo vzorec (5.2) v 50 do 100 ml predhodno nevtralizirane mešanice dietilnega etra in etanola (3.1).

Med mešanjem titriramo z raztopino 0,1 mol/l kalijevega hidroksida (ali natrijevega hidroksida) (3.2) (glej opombo 4) do preskoka barve indikatorja (barva obarvanega indikatorja je obstojna najmanj 10 sekund).

Vsebnost določamo drugič le, če je prvi rezultat višji od omejitve, navedene za kategorijo olja.

6.   IZRAŽANJE REZULTATOV

Kislost kot odstotek oleinske kisline je enaka:

pri čemer:

Oleinska kislina se zapiše, kot sledi:

▼B

PRILOGA III

DOLOČANJE PEROKSIDNEGA ŠTEVILA

1.   NAMEN

Ta standard opisuje metodo za določanje peroksidnega števila olj in masti.

2.   PODROČJE UPORABE

Ta standard se uporablja za olja in masti živalskega in rastlinskega izvora.

3.   DEFINICIJA POJMOV

Peroksidno število je količina tistih snovi v vzorcu, izražena v miliekvivalentih aktivnega kisika na kilogram, ki oksidira kalijev jodid v opisanih delovnih pogojih.

4.   PRINCIP

Reakcija preskusnega deleža vzorca v raztopini ocetne kisline in kloroforma, z raztopino kalijevega jodida. Titracija sproščenega joda s standardizirano raztopino natrijevega tiosulfata.

5.   OPREMA

Vsa uporabljena oprema je brez reducirajočih ali oksidirajočih snovi.

Opomba: Brušenih površin ne namažite.

6.   REAGENTI

7.   VZOREC

Pazimo, da vzorec jemljemo in skladiščimo v temnem, hranimo na hladnem v popolnoma zaprtih steklenih posodah. Posode so hermetično zatesnjene z zamaški z obrusom ali iz plute.

8.   POSTOPEK

Preskus se izvede pri difuzni dnevni svetlobi ali pri umetni svetlobi. V skladu s pričakovanim peroksidnim številom, natehtamo na stekleni ladjici (5.1) ali,če vam to ne uspe, v bučki (5.2) s točnostjo 1 mg.

V bučko prenesemo stekleno ladjico z vzorcem. Dodamo 10 ml kloroforma (6.1). Vzorec hitro raztopimo z mešanjem. Dodamo 15 ml ocetne kisline (6.2), nato 1 ml raztopine kalijevega jodida (6.3). Hitro zamašimo z zamaškom, stresamo eno minuto in pustimo točno pet minut, v temnem prostoru na temperaturi od 15 do 25 °C.

Dodamo približno 75 ml destilirane vode. Titriramo sproščeni jod z raztopino natrijevega tiosulfata (6.4) (za pričakovana peroksidna števila, nižja od 12 titriramo z 0,002 mol/L raztopino in z 0,01 mol/L raztopino za pričakovana števila, nad 12), močno tresemo, uporabimo škrobovico (6.5) kot indikator.

Na istem preskusnem vzorcu opravimo dve določitvi.

Istočasno izvedemo slepi preskus. Če rezultat presega 0,05 ml 0,01 mol/L raztopine natrijevega tiosulfata (6.4), zamenjamo reagente s čistejšimi.

9.   IZRAŽANJE REZULTATOV

Peroksidno število (PV), izraženo v miliekvivalentih aktivnega kisika na kilogram, se izrazi s formulo:

kjer je:

Za rezultat se vzame aritmetično povprečje dveh določitev.

▼M21

PRILOGA IV

DOLOČEVANJE VSEBNOSTI VOSKOV S KAPILARNO PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   NAMEN

Ta metoda opisuje postopek za določitev vsebnosti voskov v oljčnem olju. Voski se ločijo glede na število ogljikovih atomov. Metodo lahko uporabimo zlasti za razlikovanje med oljčnim oljem, pridobljenim s stiskanjem, in oljčnim oljem, pridobljenim z ekstrakcijo (olje iz oljčnih tropin).

2.   PRINCIP

Maščobo, ki smo ji dodali ustrezen interni standard, na z vodo omočenem silikagelu frakcioniramo s kolonsko kromatografijo; eluirano frakcijo najprej ujamemo pri pogojih preskušanja (katere polarnost je manjša kot pri trigliceridih), nato jo neposredno analiziramo s kapilarno plinsko kromatografijo.

3.   OPREMA

4.   REAGENTI

5.   POSTOPEK

5.1   Priprava kromatografske kolone

V n-heksanu (4.2) suspendiramo 15 g silikagela (4.1) in napolnimo kolono (3.2). Počakamo, da se posede. Homogenost posedanja, ki poveča homogenost kromatografskih pasov, lahko dosežemo z električnim vibratorjem (3.5). Spiramo s 30 ml n-heksana, da odstranimo vse morebitne nečistoče. S tehtnico (3.8) v erlenmajerico prostornine 25 ml (3.1) natehtamo natanko 500 mg vzorca in dodamo ustrezno količino internega standarda (4.5), ki je odvisna od pričakovane vsebnosti voskov. Na primer, pri oljčnem olju dodamo 0,1 mg, pri olju iz oljčnih tropin pa 0,25 do 0,5 mg lauril arahidata. Tako pripravljen vzorec prenesemo v kromatografsko kolono, in sicer z dvema 2-ml odmerkoma n-heksana (4.2).

Topilo izpuščamo iz kolone tako dolgo, da doseže 1 mm nad zgornjim robom absorbenta, zatem spiramo z dodatnimi 70 ml n-heksana, da odstranimo morebitne naravno prisotne n-alkane. Nato začnemo kromatografsko eluiranje, in sicer zberemo 180 ml mešanice n-heksan/etilni eter v razmerju 99:1 in pri pretoku približno 15 kapljic na 10 sekund. Eluiranje vzorca mora potekati pri sobni temperaturi 22 ± 4 °C.

Opombe:

Iz tako dobljene frakcije na rotavaporju (3.6) odparimo skoraj vse topilo. Preostala 2 ml topila odstranimo z uporabo blagega toka dušika, nato dodamo 2-4 ml n-heptana.

5.2   Plinsko-kromatografska analiza

5.2.1   Predpriprava

Kolono pritrdimo na plinski kromatograf (3.3), in sicer vstopni del na injektor, izhodnega pa na detektor. Izvedemo splošno preverjanje plinskega kromatografa (tesnjenje plinskih povezav, pravilno delovanje detektorja in rekorderja itd.).

Če kolono uporabljamo prvič, je priporočljivo, da jo kondicioniramo. Pri majhnem pretoku plina skozi kolono vključimo plinski kromatograf. Postopoma segrevamo, tako da po približno 4 urah dosežemo temperaturo 350 °C. Pri tej temperaturi kolono kondicioniramo vsaj dve uri, nato naravnamo instrument v skladu s pogoji delovanja (naravnamo pretok, prižgemo plamen, povežemo z elektronskim rekorderjem (3.3.4), naravnamo delovno temperaturo peči za kolono, naravnamo detektor itd.). Pri občutljivosti, ki je vsaj dvakrat večja od delovne, posnamemo bazno linijo. Le-ta mora biti linearna, brez kakršnih koli vrhov in odklonov.

Negativen premočrtni odklon kaže na slabo tesnjenje med kolono in instrumentom, pozitiven odklon pa na slabo kondicionirano kolono.

5.2.2   Izbira delovnih pogojev

Splošni delovni pogoji, ki jih je treba upoštevati, so naslednji:

Te pogoje lahko spremenimo glede na značilnosti kolone in plinskega kromografa, da bi dosegli ločevanje vseh voskov, zadostno resolucijo vrhov (glej sliko) in retencijski čas internega standarda C32, ki mora biti 18 ± 3 minute. Najznačilnejši vrh voskov mora biti izmerjen najmanj 60 % od spodnjega dela skale.

Integracijske parametre moramo določiti tako, da dobimo pravilno vrednotenje površin vrhov.

Opomba:Glede na visoko končno temperaturo je dovoljen pozitivni odklon, ki pa ne sme biti večji od 10 % od spodnjega dela skale.

5.3   Izvedba analize

Z 10-μl mikrobrizgalko odvzamemo 1 μl raztopine; bat izvlečemo, da se igla izprazni. Iglo vbodemo v injektor in po eni ali dveh sekundah hitro vbrizgnemo. Po približno petih sekundah iglo pazljivo izvlečemo.

Kromatogram snemamo, dokler ne eluirajo vsi voski.

Bazna linija mora ves čas izpolnjevati zahtevane pogoje.

5.4   Identifikacija vrhov

Različne vrhove identificiramo na podlagi retencijskih časov in s primerjavo med mešanicami voskov z znanimi retencijskimi časi, ki so bile analizirane pri enakih pogojih.

Slika prikazuje kromatogram voskov deviškega oljčnega olja.

5.5   Kvantitativna analiza

Z integratorjem izračunamo površine vrhov alifatskih estrov od C40 do C46 in površino vrha internega standarda.

Na podlagi naslednje formule izračunamo vsebnost voskov posameznega estra v mg/kg maščobe:

Kjer je:

6.   PODAJANJE REZULTATOV

Navedemo vsoto vsebnosti posameznih sestavin različnih voskov od C40 do C46, v mg/kg maščobe (ppm).

Opomba:Spojine, ki jih je treba količinsko določiti, se nanašajo na vrhove s sodim številom ogljikovih atomov med estri C40 do C46, tako kot je to prikazano na kromatograma voskov oljčnega olja. Če sta za ester C46 dva vrhova, je za njegovo identifikacijo priporočljiva analiza frakcije voskov olja iz oljčnih tropin, kjer je vrh C46 dobro viden, ker je razločno večji.

Rezultate je treba izraziti na eno decimalno mesto natančno.

Slika

Kromatogram voskov v oljčnem olju ( 3 )

Legenda:

DODATEK

Določanje linearne hitrosti plina

V plinski kromatograf, naravnan na običajne delovne pogoje, injiciramo 1 do 3 μl metana (ali propana). Merimo čas, ki ga plin potrebuje za pot skozi kolono od trenutka vbrizga do trenutka, ko se pojavi vrh (tM).

Linearna hitrost v cm/s je izražena s formulo L/tM, kjer je L dolžina kolone v cm, tM pa izmerjeni čas v sekundah.

▼M26

PRILOGA V

DOLOČANJE SESTAVE IN VSEBNOSTI STEROLOV IN TRITERPENSKIH DIALKOHOLOV S KAPILARNO PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   PODROČJE UPORABE

Metoda opisuje postopek za določanje posamezne in skupne vsebnosti sterolov in triterpenskih dialkoholov v oljčnih oljih in oljih iz oljčnih tropin.

2.   PRINCIP

Olje z dodanim α-holestanolom kot internim standardom se umili s kalijevim hidroksidom in etanolno raztopino, neumiljive snovi pa se nato ekstrahirajo z etilnim etrom.

Sterolni in triterpenski dialkoholni frakciji se ločita od neumiljivih snovi s tankoplastno kromatografijo na z lugom obdelani silikagelni plošči. Frakcije, dobljene iz silikagela, se pretvorijo v trimetilsililne etre in se nato analizirajo s kapilarno plinsko kromatografijo.

3.   OPREMA

Običajna laboratorijska oprema in zlasti:

4.   REAGENTI

5.   POSTOPEK

6.   IZRAŽANJE REZULTATOV

▼M28

▼M26

Dodatek

Določanje linearne hitrosti plina

Pri nastavitvi plinskega kromatografa na normalne delovne pogoje vbrizgajte 1 do 3 μl metana (ali propana) in izmerite čas, ki ga plin potrebuje za pot skozi kolono, od trenutka vbrizganja do trenutka, ko se pojavi vrh (tM).

Linearna hitrost v cm/s je podana z L/tM, pri čemer je L dolžina kolone v centimetrih in tM izmerjeni čas v sekundah.

Slika 1

Plinski kromatogram sterolnih in triterpenskih dialkoholnih frakcij lampante oljčnega olja (z dodanim notranjim standardom)

Slika 2

Plinski kromatogram sterolnih in triterpenskih dialkoholnih frakcij rafiniranega oljčnega olja (z dodanim notranjim standardom)

Slika 3

Tankoplastna kromatografija olja iz oljčnih tropin s površino, s katere je treba odstraniti silikagel za določitev sterolov in triterpenskih dialkoholov

▼M26 —————

▼M21

PRILOGA VII

DOLOČANJE ODSTOTNEGA DELEŽA 2-GLICERIL MONOPALMITATA

1.   PREDMET UREJANJA IN PODROČJE UPORABE

S to metodo je opisan analitski postopek za določevanje odstotnega deleža palmitinske kisline na položaju 2 v trigliceridih z ovrednotenjem 2-gliceril monopalmitata.

To metodo uporabljamo za rastlinska olja, tekoča pri sobni temperaturi (20 °C).

2.   PRINCIP

Po pripravi pustimo, da na vzorec olja učinkuje pankreatična lipaza: poteče delna hidroliza, specifična za položaja 1 in 3 v molekuli triglicerida, ki povzroči nastanek 2-monoacilglicerolov. Odstotni delež 2-gliceril monopalmitata v monoacilglicerolni frakciji se po sililiranju določi s kapilarno plinsko kromatografijo.

3.   APARATURE IN OBIČAJNA LABORATORIJSKA OPREMA

4.   REAGENTI

5.   POSTOPEK

5.1   Priprava vzorca

5.2   Hidroliza s pankreatično lipazo

5.3   Priprava silaniziranih derivatov in plinska kromatografija

5.4   Plinska kromatografija

Pogoji za postopek so naslednji:

5.4.1   Identifikacija vrhov

Posamezne monoacilglicerole identificiramo na podlagi dobljenih retencijskih časov in glede na čase, dobljene za standardne mešanice monogliceridov, analizirane pri enakih pogojih.

5.4.2   Kvantitativna analiza

Površina vsakega vrha se izračuna z elektronskim integratorjem.

6.   PODAJANJE REZULTATOV

Odstotek gliceril monopalmitata izračunamo iz razmerja med ustrezno površino vrha in vsoto površin vrhov vseh monoacilglicerolov (glej Sliko 2), in sicer na podlagi formule:

gliceril monopalmitat (%):

kjer je:

Rezultat je treba podati na eno decimalko natančno.

7.   POROČILO O ANALIZI

V poročilu o analizi je treba podrobno navesti:

Slika 1

Kromatogram proizvodov reakcije silaniziranja, dobljenih z delovanjem lipaze na rafiniranem oljčnem olju, ki mu je dodanih 20 % 100 % zaestrenega olja

Legenda: Acides gras libres = proste maščobne kisline Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = rafinirano oljčno olje + 20 % zaestrenega olja 1-2 monopalmitate = 1-2 monopalmitat 1-2 monopalmitoléine = 1-2 monopalmitolein 1-2 mono C18 insat. = 1-2 mono C18 nenasič. squalène = skvalen.

Slika 2

Kromatogram

(A)

nezaestrenega oljčnega olja po delovanju lipaze, in silaniziranega; pri teh pogojih (kapilarna kolona 8–12 m) frakcija voskov eluira hkrati s frakcijo diacilglicerolov ali malo zatem. Vsebnost triacilglicerolov po lipazi ne sme preseči 15 %. Legenda: 1 = Proste maščobne kisline 2 = Monoacilgliceroli 3 = Diacilgliceroli 4 = Tracilgliceroli (*) = 2-monopalmitin (**) = Triacilglicerol C54

Kromatogram:

(B)

zaestrenega olja po delovanju lipaze; po silaniziranju; pri teh pogojih (kapilarna kolona 8–12 m) frakcija voskov eluira hkrati s frakcijo diglicerida ali malo zatem. Vsebnost trigliceridov po lipazi ne sme preseči 15 % Legenda: 1 = Proste maščobne kisline 2 = Monogliceridi 3 = Digliceridi 4 = Trigliceridi (*) = 2-monopalmitin (**) = Triglicerid C54

8.   OPOMBE

PRIPRAVA LIPAZE

Lipaze z zadostno aktivnostjo so komercialno dostopne. Lahko jih pripravimo tudi v laboratoriju, in sicer na naslednji način:

5 kg sveže prašičje trebušne slinavke ohladimo na 0 °C. Odstranimo okoliško trdo maščevje in vezno tkivo ter jo zmeljemo v mlinčku z rezili, da dobimo kašasto tekočino. To tekočino 4 do 6 ur mešamo z 2,5 litra brezvodnega acetona in nato centrifugiramo. Izvleček naredimo še trikrat z enako količino acetona, nato dvakrat z mešanico acetona/dietilnega etra (1/1) (V/V) in dvakrat z dietilnim etrom.

Preostanek 48 ur sušimo v vakuumu, da dobimo stabilen prah, ki ga je treba dolgo časa hraniti v hladilniku in pred vlago.

PREVERJANJE AKTIVNOSTI LIPAZE

Oljno emulzijo pripravimo na naslednji način:

V mešalniku 10 minut mešamo mešanico 165 ml raztopine gumarabikuma (100 g/l), 15 g zdrobljenega ledu in 20 ml predhodno nevtraliziranega oljčnega olja.

V čašo prostornine 50 ml zaporedoma damo 10 ml te emulzije, nato 0,3 ml raztopine natrijevega holata (0,2 g/ml) in 20 ml destilirane vode.

Čašo damo v termostat, naravnan na 37 °C; namestimo elektrode pH metra in spiralni mešalnik.

Z bireto po kapljicah dodajamo raztopino natrijevega hidroksida 0,1 N, dokler ne dobimo pH vrednosti 8,3.

Dodamo ustrezno količino v vodi raztopljene lipaze v prahu (0,1 g/ml lipaze). Takoj ko pH meter pokaže pH 8,3, sprožimo štoparico in po kapljah dodajamo raztopino natrijevega hidroksida, in sicer s tako hitrostjo, da ohranimo pH vrednost 8,3. Vsako minuto odčitamo volumen porabljene raztopine.

Podatke zabeležimo v sistem koordinatnih osi, in sicer odčitke časa navedemo kot absciso, kot ordinato pa ml alkalne raztopine 0,1 N, ki smo jih porabili za ohranitev konstantnega pH. Dobiti moramo linearen graf.

Aktivnost lipaze, izmerjena v lipaznih enotah na mg, je izražena z naslednjo formulo:

kjer je:

Lipazna enota je opredeljena kot količina encima, ki sprosti 10 mikro-ekvivalentov kisline na minuto.

▼M20 —————

▼M28

PRILOGA IX

SPEKTROFOTOMETRIČNO MERJENJE NA UV-OBMOČJU

PREDGOVOR

Spektrofotometrično merjenje na UV-območju lahko daje informacije o kakovosti maščobe, njenem stanju ohranitve in spremembah, ki so jih v njej povzročili tehnološki procesi. Absorpcijo valovnih dolžin, določenih v postopku, povzroči prisotnost konjugiranih dienov in trienov, ki so posledica oksidacije in/ali rafinacije. Te absorpcije so izražene kot specifične ekstinkcije

(ekstinkcija 1-odstotne w/v raztopine maščobe v specificiranem topilu, v 10-milimetrski kiveti), konvencionalno označene s K (imenuje se tudi „ekstinkcijski koeficient“).

1.   NAMEN

Ta priloga opisuje postopek za izvajanje spektrofotometričnega merjenja oljčnega olja na UV-območju.

2.   PRINCIP METODE

Vzorec se raztopi v zahtevanem topilu in absorbanca raztopine se izmeri pri specifični valovni dolžini glede na čisto topilo.

Specifične ekstinkcije pri 232 nm in 268 nm v izooktanu ali 232 nm in 270 nm v cikloheksanu se izračunajo za koncentracijo 1 % w/v v 10-milimetrski kiveti.

3.   OPREMA

4.   REAGENTI

Če ni določeno drugače, pri analizi uporabite le reagente priznane čistoče za analizo in destilirano ali demineralizirano vodo ali vodo enakovredne čistoče.

Topilo: izooktan (2,2,4-trimetilpentan) za merjenje pri 232 nm in 268 nm ter cikloheksan za merjenje pri 232 nm in 270 nm z absorbanco, manjšo od 0,12 pri 232 nm in manjšo od 0,05 pri 270 nm, proti destilirani vodi, izmerjeno v 10-milimetrski kiveti.

5.   POSTOPEK

6.   IZRAŽANJE REZULTATOV

PRILOGA X

DOLOČANJE METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN S PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   NAMEN

V tej prilogi so navodila za določanje prostih in vezanih maščobnih kislin v masti in oljih rastlinskega izvora s plinsko kromatografijo po njihovi pretvorbi v metil estre maščobnih kislin (FAME).

Vezane maščobne kisline triacilglicerolov (TAG) in glede na metodo esterifikacije proste maščobne kisline (FFA) se pretvorijo v metil estre maščobnih kislin (FAME), ki se določijo s kapilarno plinsko kromatografijo.

Metoda iz te priloge omogoča določitev FAME od C12 do C24, vključno z nasičenimi, cis in trans mononenasičenimi ter cis in trans polinenasičenimi metil estri maščobnih kislin.

2.   PRINCIP

Plinska kromatografija se uporablja za kvantitativno analizo FAME. FAME se pripravijo v skladu z delom A. Potem se vbrizgajo v injektor in v njem uparijo. Ločevanje FAME se izvaja z analitskimi kolonami s specifično polarnostjo in dolžino. Za ugotavljanje prisotnosti FAME se uporablja plamensko-ionizacijski detektor. Pogoji analize so določeni v delu B.

Kot nosilni plin (mobilna faza) v plinski kromatografiji FAME s plamensko-ionizacijskim detektorjem se lahko uporabi vodik ali helij. Vodik pospeši ločevanje in zagotovi ostrejše vrhove. Stacionarna faza je mikroskopska plast tankega tekočega filma na inertni trdni podlagi iz zlitega silicijevega dioksida.

Pri prehodu skozi kapilarno kolono hlapne spojine, ki se analizirajo, reagirajo s stacionarno fazo, ki je nanesena na notranji površini kolone. Zaradi različnih reakcij različnih spojin je čas eluiranja teh spojin različen, tj. retenzijski čas spojine za določen sklop analiznih parametrov. Primerjava retenzijskih časov se uporablja za določanje različnih spojin.

DEL A

PRIPRAVA METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN IZ OLJČNEGA OLJA IN OLJA IZ OLJČNIH TROPIN

1.   NAMEN

Ta del določa pripravo metilnih estrov maščobnih kislin. Vključuje metodi za pripravo metilnih estrov maščobnih kislin iz oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin.

2.   PODROČJE UPORABE

Priprava metilnih estrov maščobnih kislin iz oljčnega olja in olja iz oljčnih tropin se izvaja s transesterifikacijo z metanolno raztopino kalijevega hidroksida pri sobni temperaturi. Potreba po čiščenju vzorca pred transesterifikacijo je odvisna od vsebnosti prostih maščobnih kislin v vzorcu in analitskega parametra, ki se lahko določi glede na naslednjo preglednico:

3.   METODOLOGIJA

3.1    Transesterifikacija z metanolno raztopino kalijevega hidroksida pri sobni temperaturi

3.1.1    Princip

Metilni estri se pripravijo s transesterifikacijo z metanolno raztopino kalijevega hidroksida kot vmesna stopnja pred izvedbo umiljenja.

3.1.2    Reagenti

3.1.3    Oprema

3.1.4    Čiščenje vzorcev olj

Vzorci se po potrebi očistijo, pri čemer se olje spusti skozi silikagelno kartušo za ekstrakcijo v trdni fazi. Silikagelna kartuša (3.1.2.8) se vstavi v vakuumsko napravo za eluiranje in izpere s 6 ml heksana (3.1.2.2); izpiranje se izvede brez vakuuma. Potem se v kolono vnese raztopina olja (približno 0,12 g) v 0,5 ml heksana (3.1.2.2). Raztopina gre skozi kolono in nato eluira z 10 ml heksana/dietil etra (87:13 v/v) (3.1.2.6). Združena eluata se homogenizirata in ločita na dva enaka dela. Alikvot se odpari do suhega v rotacijskem izparilniku pod znižanim pritiskom in pri sobni temperaturi. Ostanek se raztopi v 1 ml heptana in raztopina je pripravljena na analizo maščobnih kislin s plinsko kromatografijo. Drugi alikvot se odpari in ostanek se raztopi v 1 ml acetona za analizo trigliceridov s HPLC, če je to potrebno.

3.1.5    Postopek

V epruveti z navojnim zamaškom in prostornino 5 ml (3.1.3.1) natehtajte približno 0,1 g vzorca olja. Dodajte 2 ml heptana (3.1.2.2) in pretresite. Dodajte 0,2 ml metanolne raztopine kalijevega hidroksida (3.1.2.7), zaprite epruveto z zamaškom, opremljenim s priključkom iz politetrafluoroetilena, in ga čvrsto zamašite ter močno tresite 30 sekund. Pustite, da se razsloji, dokler zgornja raztopina ne postane bistra. Z dekantiranjem ločite zgornjo plast, ki vsebuje metilne estre. Raztopina heptana je pripravljena za vbrizganje v plinski kromatograf. Priporočljivo je, da se raztopina do analize s plinsko kromatografijo hrani v hladilniku. Hramba raztopine več kot 12 ur ni priporočljiva.

DEL B

ANALIZA METILNIH ESTROV MAŠČOBNIH KISLIN S PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   NAMEN

Ta del vključuje splošne smernice za uporabo plinske kromatografije s kapilarnimi kolonami za določanje kvalitativne in kvantitativne sestave mešanice metilnih estrov maščobnih kislin, dobljenih v skladu z metodo iz dela A.

Ta del se ne uporablja za polimerizirane maščobne kisline.

2.   REAGENTI

2.1    Nosilni plin

Inertni plin (helij ali vodik), popolnoma posušen in z vsebnostjo kisika, nižjo od 10 mg/kg.

2.2    Pomožni plini

2.3    Referenčni standard

Mešanica metilnih estrov čistih maščobnih kislin ali metilnih estrov maščobe poznane sestave, po možnosti podobne maščobi, ki jo je treba analizirati. Cis in trans izomeri oktadecenojskih, oktadekadienojskih in oktadekatrienojskih metilnih estrov so uporabni za določanje trans izomerov nenasičenih kislin.

Treba je paziti, da se prepreči oksidacija polinenasičenih maščobnih kislin.

3.   OPREMA

Navedena navodila se nanašajo na običajno opremo, ki se uporablja za plinsko kromatografijo, z uporabo kapilarnih kolon in plamensko ionizacijskega detektorja.

3.1    Plinski kromatograf

Plinski kromatograf vključuje naslednje elemente:

3.1.1    Sistem za vbrizgavanje

Uporabite sistem za vbrizgavanje s kapilarnimi kolonami, pri čemer mora biti sistem za vbrizgavanje posebej izdelan za uporabo s takšnimi kolonami. Lahko je tip sistema z deljenjem vzorca ali brez deljenja vzorca v koloni.

3.1.2    Peč

Peč je takšna, da lahko segreje kapilarno kolono na temperaturo najmanj 260 °C in ohranja želeno temperaturo do ± 0,1 °C natančno. Zadnja zahteva je zlasti pomembna, kadar se uporablja kapilarna kolona.

Uporaba programiranega temperaturnega gretja se priporoča v vseh primerih in zlasti za maščobne kisline z manj kot 16 ogljikovimi atomi.

3.1.3    Kapilarna kolona

3.1.4    Plamensko ionizacijski detektor in konverter-ojačevalec

3.2    Brizgalka

Brizgalka je maksimalne kapacitete 10 μl z razdelki na 0,1 μl.

3.3    Sistem za pridobivanje podatkov

Sistem za pridobivanje podatkov je prek spleta povezan z detektorji in se uporablja s programsko opremo, primerno za integracijo in normalizacijo vrhov.

4.   POSTOPEK

Postopki, opisani v 4.1 do 4.3, se nanašajo na uporabo plamensko ionizacijskega detektorja.

4.1    Preskusni pogoji

4.1.1    Izbor optimalnih delovnih pogojev za kapilarne kolone

Zaradi učinkovitosti in prepustnosti kapilarnih kolon sta ločevanje sestavin in trajanje analize v veliki meri odvisna od pretoka nosilnega plina v koloni. Zato bo treba optimizirati delovne pogoje s prilagoditvijo tega parametra (ali preprosto izgube glave kolone), odvisno od tega, ali je cilj izboljšati ločevanje ali pospešiti analizo.

Naslednji pogoji so se izkazali za primerne za ločevanje FAME (C4 do C26). Primeri kromatogramov so navedeni v Dodatku B:

4.1.2    Določanje resolucije (glej Dodatek A)

Izračunajte resolucijo R dveh sosednjih vrhov I in II na podlagi naslednje formule:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) ali R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (Farmakopeja Združenih držav Amerike)

ali

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) (JP (Japonska farmakopeja), EP (Evropska farmakopeja), BP (Britanska farmakopeja))

pri čemer je:

Če velja ω(I) ≈ ω(II), izračunajte R na podlagi naslednje formule:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

pri čemer je:

Če je razdalja dr med dvema vrhovoma d r(II) – d r(I) enaka 4σ, je faktor ločljivosti R = 1.

Če vrhova nista popolnoma ločena, se tangenti na prevojnih točkah sekata na točki C. Da bi bila vrha popolnoma ločena, mora biti razdalja med njima enaka:

d r(II) – d r(I) = 6 σ, pri čemer je R = 1,5 (glej sliko 3 v Dodatku A).

5.   IZRAŽANJE REZULTATOV

5.1    Kvalitativna analiza

Identificirajte vrhove metilnih estrov v vzorcu iz kromatograma iz slike 1 v Dodatku B, po potrebi z interpolacijo ali primerjavo z referenčnimi mešanicami za vrhove metilnih estrov (kot je navedeno v točki 2.3).

5.2    Kvantitativna analiza

5.2.1    Določanje sestave

Izračunajte masni delež w i posameznih metilnih estrov maščobnih kislin, izražen kot masni odstotni delež metilnih estrov, na naslednji način:

5.2.2    Metoda izračuna

5.2.2.1   Splošni primer

Izračunajte vsebnost dane komponente i, izražene kot masni odstotni delež metilnih estrov, tako da določite površinski delež zadevnega vrha glede na vsoto površin vseh vrhov, na podlagi naslednje formule:

wi = (Ai/ΣA) × 100

pri čemer je:

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.

5.2.2.2   Uporaba korekcijskih faktorjev

V določenih primerih, na primer ob prisotnosti maščobnih kislin z manj kot osmimi ogljikovimi atomi ali kislinami s sekundarnimi skupinami, se površine popravijo s specifičnimi korekcijskimi faktorji (Fci). Ti faktorji se določijo za vsak instrument. V ta namen se uporabi primeren referenčni material s certificirano sestavo maščobnih kislin v ustreznem razponu.

Za to referenčno mešanico je masni odstotni delež FAME i podan s formulo:

wi = (mi /Σm) × 100

pri čemer:

Iz kromatograma referenčne mešanice izračunajte odstotni delež površine FAME i, kot sledi:

wi = (Ai/ΣA) × 100

pri čemer:

Korekcijski faktor Fc se izračuna:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

V vzorcu se masni odstotni delež posameznega FAME i izračuna:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.

5.2.2.3   Uporaba internega standarda

Pri nekaterih analizah (na primer, kadar vse maščobne kisline niso kvantificirane, kot v prisotnosti kislin s štirimi ali šestimi ogljiki ob kislinah s 16 ali 18 ogljikovimi atomi ali kadar je treba določiti absolutno količino maščobne kisline v vzorcu) je treba uporabiti interni standard. Pogosto se uporabljajo maščobne kisline s 5, 15 ali 17 ogljikovimi atomi. Treba je določiti (morebitni) korekcijski faktor za interni standard.

Masni odstotni delež sestavine i, izražen kot metilni estri, je potem podan s formulo:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

pri čemer:

Rezultati se izrazijo na dve decimalni mesti natančno.

6.   POROČILO O PRESKUSU

V poročilu o preskusu se navedejo metode, uporabljene za pripravo metilnih estrov in za analizo s plinsko kromatografijo. Navedejo se tudi vse delovne podrobnosti, ki v tej standardni metodi niso določene ali veljajo za neobvezne, skupaj s podrobnostmi kakršnega koli dogodka, ki bi lahko vplival na rezultate.

Poročilo o preskusu vključuje vse informacije, potrebne za popolno identifikacijo vzorca.

7.   TOČNOST

7.1    Rezultati medlaboratorijskega preskusa

Podrobnosti medlaboratorijskega preskusa glede točnosti metode so določene v Prilogi C k standardu IOC/T.20/Dok. št. 33. Vrednosti, ki izhajajo iz tega medlaboratorijskega preskusa, mogoče ne bodo ustrezale razponom koncentracij in matricam, ki se od danih razlikujejo.

7.2    Ponovljivost

Absolutna razlika med rezultatoma dveh neodvisnih posameznih preskusov, ki ju v kratkem časovnem presledku po enaki metodi na enakem preskusnem materialu v istem laboratoriju izvede isti izvajalec z uporabo iste opreme, ne sme biti v več kot 5 % primerov večja od vrednosti r iz preglednic 1 do 14 iz Priloge C k standardu IOC/T.20/Dok. št. 33.

7.3    Obnovljivost

Absolutna razlika med rezultatoma dveh posameznih preskusov, ki sta bila pridobljena po enaki metodi na enakem preskusnem materialu v različnih laboratorijih pri različnih izvajalcih, ki so uporabljali različno opremo, bo v največ 5 % primerov večja od vrednosti R iz preglednic 1 do 14 iz Priloge C k standardu IOC/T.20/Dok. št. 33.

Dodatek A

Slika 1

S širino ω0,5 na polovici višine trikotnika (ABC) in širino b na polovici višine trikotnika (NPM).

Dodatek B

Slika 1

Plinsko-kromatografski profil, pridobljen z metodo hladnega metiliranja iz olja iz oljčnih tropin

Kromatografski vrhi ustrezajo metilnim in etilnim estrom, razen če je navedeno drugače.

▼B

PRILOGA XI

DOLOČANJE HLAPNIH HALOGENIRANIH TOPIL V OLJČNEM OLJU

1.   METODA

Analiza s plinsko kromatografijo z uporabo tehnike „head space“.

2.   OPREMA

3.   REAGENTI

Standard: halogenirana topila, plinsko-kromatografske čistoče.

4.   POSTOPEK

▼M26

PRILOGA XII

METODA MEDNARODNEGA SVETA ZA OLJKE ZA ORGANOLEPTIČNO OCENJEVANJE DEVIŠKEGA OLJČNEGA OLJA

▼M28

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Namen mednarodne metode iz te priloge je določiti postopek za ocenjevanje organoleptičnih značilnosti deviškega oljčnega olja v smislu točke 1 dela VIII Priloge VII k Uredbi (EU) št. 1308/2013 Evropskega parlamenta in Sveta ( 4 ) ter na podlagi teh značilnosti določiti način za razvrščanje olj. Metoda vsebuje tudi navedbe za neobvezno etiketiranje.

Opisana metoda se uporablja samo za deviška oljčna olja ter razvrščanje ali etiketiranje teh olj glede na intenzivnost odkritih napak in sadežnosti, kot jo določi skupina izbranih, usposobljenih in preverjenih pokuševalcev, ki sestavljajo ocenjevalno komisijo.

Uporabljajo se najnovejše razpoložljive različice standardov Mednarodnega sveta za oljke, ki so navedeni v tej prilogi.

▼M26

2.   OSNOVNI SPLOŠNI BESEDNJAK ZA ORGANOLEPTIČNO ANALIZO

Glej standard IOC/T.20/Dok. št. 4 „Organoleptična analiza: osnovni splošni besednjak“

3.   POSEBNI BESEDNJAK

3.1    Negativne lastnosti

▼M28

3.1.1    Druge negativne lastnosti

3.2    Pozitivne lastnosti

▼M29

3.3    Neobvezna terminologija za etiketiranje

Vodja ocenjevalne komisije lahko na zahtevo potrdi, da so ocenjena olja skladna z opredelitvami in razponi, ki glede intenzivnosti in zaznavanja lastnosti ustrezajo izrazom v nadaljevanju.

Pozitivne lastnosti (sadežno, grenko in pikantno): glede na intenzivnost zaznavanja:

Seznam izrazov glede na intenzivnost zaznavanja:

▼M26

4.   KOZARCI ZA DEGUSTACIJO OLJA

Glej standard IOC/T.20/Dok. št. 5 „Kozarci za degustacijo olja“.

5.   PROSTOR ZA OCENJEVANJE

Glej standard IOC/T.20/Dok. št. 6 „Navodila za ureditev prostora za ocenjevanje“.

6.   DODATKI

Da bi lahko pokuševalci pravilno opravili svojo nalogo, morajo biti v vsaki kabini zagotovljeni in zlahka dostopni naslednji dodatki:

7.   VODJA OCENJEVALNE KOMISIJE IN POKUŠEVALCI

7.1    Vodja ocenjevalne komisije

Vodja ocenjevalne komisije mora biti ustrezno usposobljen in imeti strokovno znanje o vrstah olj, s katerimi se bo med delom srečeval. Ima ključno vlogo v ocenjevalni komisiji ter je odgovoren za njeno organizacijo in delovanje.

Vodja ocenjevalne komisije mora imeti osnovno znanje o delu z orodji za organoleptično analizo, organoleptične izkušnje, mora biti natančen pri pripravi, organizaciji in izvedbi pokušenj ter mora znati te pokušnje potrpežljivo in znanstveno načrtovati in izvesti.

Vodja ocenjevalne komisije ima izključno odgovornost za izbiro, usposabljanje in preverjanje pokuševalcev za določitev ravni njihovih sposobnosti. To pomeni, da je odgovoren za oceno pokuševalcev, ki mora biti vedno objektivna ter za katero mora vodja oblikovati posebne postopke na podlagi pokušenj in zanesljivih meril za sprejem ali zavrnitev. Glej standard IOC/T.20/Dok. št. 14 „Navodila za izbiro, usposabljanje in preverjanje kvalificiranih pokuševalcev deviških oljčnih olj“.

Vodja ocenjevalne komisije je odgovoren za uspešnost komisije in posledično za njeno oceno, za katero mora zagotoviti zanesljiva in objektivna dokazila. V vsakem primeru mora biti vedno zmožen dokazati, da so metoda in pokuševalci pod nadzorom. Priporočljivo je redno usposabljanje ocenjevalne komisije (IOC/T.20/Dok. št. 14, točka 5).

Vodja ocenjevalne komisije ima končno odgovornost za vodenje njenih evidenc. Slednje morajo biti vedno sledljive. Poleg tega mora vodja izpolnjevati zahteve glede zagotavljanja kakovosti, ki so določene v mednarodnih standardih za organoleptično analizo, in zagotoviti, da so vzorci ves čas anonimni.

Vodja ocenjevalne komisije je odgovoren za inventuro opreme, potrebne za izpolnitev specifikacij te metode, pri tem pa mora zagotoviti, da je ta oprema ustrezno očiščena in vzdrževana, o čemer mora imeti pisna dokazila, vključno z dokazilom o izpolnjevanju pogojev za pokušanje.

Vodja ocenjevalne komisije je odgovoren za sprejem in shranjevanje vzorcev, ko prispejo v laboratorij, ter njihovo shranjevanje po pokušanju. Pri tem mora zagotoviti, da so vzorci ves čas anonimni in ustrezno shranjeni, za kar mora oblikovati pisne postopke za zagotovitev sledljivosti in zanesljivosti celotnega procesa.

Poleg tega je vodja ocenjevalne komisije odgovoren za pripravo, kodiranje in predstavitev vzorcev pokuševalcem v skladu z ustreznim načrtom pokušanja in predhodno določenimi protokoli ter za zbiranje in statistično obdelavo podatkov, ki jih pridobijo pokuševalci.

Vodja ocenjevalne komisije je odgovoren za razvoj in oblikovanje kakršnih koli drugih postopkov, ki so morda potrebni za izpolnitev tega standarda in zagotovitev pravilnega delovanja komisije.

Vodja ocenjevalne komisije mora poiskati načine, kako primerjati rezultate komisije z rezultati drugih komisij, ki so analizirale deviško oljčno olje, da bi ugotovil, ali komisija deluje pravilno.

Vodja ocenjevalne komisije mora spodbujati člane komisije, tako da spodbuja njihovo zanimanje in radovednost ter konkurenco med njimi. V ta namen se zelo priporoča, da vodja zagotavlja neovirano izmenjavo informacij s člani komisije, tako da jih obvešča o vseh opravljenih nalogah in dobljenih rezultatih. Poleg tega vodja zagotavlja, da njegovo mnenje ostane anonimno, in ne dovoli drugim vodjem, da bi vsiljevali svoja merila drugim pokuševalcem.

Vodja ocenjevalne komisije pravočasno povabi pokuševalce in odgovori na kakršna koli poizvedovanja glede izvedbe pokušenj, vendar pri tem ne razkrije nobenega mnenja o vzorcu.

▼M28

7.1.1    Namestnik vodje ocenjevalne komisije

Vodjo ocenjevalne komisije lahko na podlagi utemeljenih razlogov nadomesti namestnik vodje ocenjevalne komisije, ki lahko namesto njega opravlja naloge v zvezi z izvedbo pokušenj. Ta namestnik mora imeti vse potrebne spretnosti, ki se zahtevajo za vodjo ocenjevalne komisije.

▼M28

7.2    Pokuševalci

Osebe, ki imajo vlogo pokuševalcev pri organoleptičnih pokušnjah oljčnih olj, to počnejo prostovoljno. Zato je priporočljivo, da kandidati vložijo pisno vlogo. Vodja ocenjevalne komisije izbere, usposablja in preverja kandidate glede na njihove sposobnosti razlikovanja med podobnimi vzorci, pri čemer je treba upoštevati, da se bo njihova natančnost med usposabljanjem povečala.

Pokuševalci morajo ravnati kot pravi degustatorji, pri čemer ne smejo upoštevati svojih osebnih okusov, temveč poročati le o občutkih, ki jih zaznavajo. Zato morajo vedno delati v tišini ter sproščeno in brez hitenja, tako da se lahko čim bolj osredotočijo na vzorec, ki ga pokušajo.

Za vsako pokušnjo je potrebnih 8 do 12 pokuševalcev, vendar je priporočljivo, da so na voljo dodatni pokuševalci, ki lahko nadomestijo morebitne odsotne pokuševalce.

▼M26

8.   POGOJI ZA OCENJEVANJE

8.1    Predstavitev vzorca

Vzorec olja za analizo je predstavljen v standardiziranih kozarcih za degustacijo, ki izpolnjujejo standard IOC/T.20/Dok. št. 5 „Kozarci za degustacijo olja“.

Kozarec vsebuje 14–16 ml olja (ali 12,8–14,6 g, če se vzorci tehtajo) in je pokrit z urnim steklom.

Vsak kozarec je označen s kodo, sestavljeno iz naključno izbranih številk ali kombinacije črk in številk. Koda ne sme imeti nobenega vonja.

8.2    Temperatura prostora za ocenjevanje in vzorca

Vzorci olja, namenjeni pokušanju, se skozi celotno pokušnjo hranijo v kozarcih pri temperaturi 28± 2 °C. Ta temperatura je bila izbrana zato, ker omogoča lažje opazovanje organoleptičnih razlik kot pri sobni temperaturi in ker pri nižjih temperaturah aromatične spojine, značilne za ta olja, slabo izhlapevajo, medtem ko pri višjih temperaturah nastajajo hlapne spojine, značilne za segreta olja. Za metodo, ki jo je treba uporabiti za segrevanje vzorcev v kozarcu, glej standard IOC/T.20/Dok. št. 5 „Kozarci za degustacijo olja“.

Temperatura prostora za ocenjevanje mora biti med 20 in 25 °C (glej IOC/T.20/Dok. št. 6).

8.3    Čas za ocenjevanje

Jutro je najboljši čas za pokušanje olj. Dokazano je, da obstajajo določeni časi v dnevu, ki so optimalni za zaznavanje okusa in vonja. Pred obroki se občutljivost za zaznavanje vonjev in okusov poveča, medtem ko je po obrokih ta občutljivost manjša.

Vendar tega merila ni treba upoštevati do skrajnosti, saj lahko lakota zamoti pokuševalce in zmanjša njihovo sposobnost razlikovanja. Zato se priporoča, da pokušnje potekajo med 10. in 12. uro.

8.4    Pokuševalci: splošna pravila ravnanja

Priporočila v nadaljevanju veljajo za ravnanje pokuševalcev med delom.

Pokuševalci se na vabilo vodje ocenjevalne komisije udeležijo organoleptične pokušnje ob predhodno določenem času in upoštevajo naslednje:

9.   POSTOPEK ZA ORGANOLEPTIČNO OCENJEVANJE IN RAZVRŠČANJE DEVIŠKEGA OLJČNEGA OLJA

9.1    Tehnika pokušanja

▼M29

▼M26

9.2    Uporaba ocenjevalnega lista s strani pokuševalcev

Ocenjevalni list, ki ga morajo uporabiti pokuševalci, je podrobneje prikazan na sliki 1 v tej prilogi.

Vsak pokuševalec v ocenjevalni komisiji povoha in pokusi ( 5 ) olje, ki se ocenjuje. Nato na 10-centimetrski lestvici na ocenjevalnem listu navede intenzivnost zaznave vsake od negativnih in pozitivnih lastnosti.

Če pokuševalci zaznajo negativne lastnosti, ki niso navedene v oddelku 4, jih zabeležijo v rubriko „Drugo“, pri čemer uporabijo izraz ali izraze, ki te lastnosti najbolj natančno opisujejo.

▼M28

9.3    Uporaba podatkov s strani vodij ocenjevalnih komisij

Vodja ocenjevalne komisije zbere ocenjevalne liste, ki jih je izpolnil vsak pokuševalec, in preveri intenzivnost posameznih lastnosti. Če ugotovi nepravilnost, od pokuševalca zahteva, da ponovno pregleda svoj ocenjevalni list in po potrebi ponovi pokušnjo.

Vodja ocenjevalne komisije vnese podatke o ocenjevanju, ki jih zagotovi vsak član ocenjevalne komisije, v računalniški program, kot je določen s standardom IOC/T.20/Dok. št. 15, da se na podlagi izračunane mediane statistično izračunajo rezultati analize. Glej točko 9.4 in Dodatek k tej prilogi. Podatki za določen vzorec se vnesejo z uporabo matrike, sestavljene iz 9 stolpcev, ki predstavljajo 9 organoleptičnih lastnosti, in n vrstic, ki predstavljajo n uporabljenih članov ocenjevalne komisije.

Če je ugotovljeno napako v rubriko „Drugo“ vneslo vsaj 50 % ocenjevalne komisije, vodja ocenjevalne komisije izračuna mediano napake in določi ustrezno razvrstitev.

Vrednost grobega koeficienta variacije, ki določa razvrstitev (napaka z največjo intenzivnostjo in lastnostjo sadežno), mora biti enaka ali nižja od 20 %.

V nasprotnem primeru mora vodja ocenjevalne komisije ponoviti oceno določenega vzorca v drugi pokušnji.

Če se to pogosto pojavlja, se priporoča, da vodja ocenjevalne komisije zagotovi pokuševalcem posebno dodatno usposabljanje (IOC/T.20/Dok. št. 14, točka 5) ter na podlagi indeksa ponovljivosti in indeksa odstopanja preveri uspešnost pokuševalca (IOC/T.20/Dok. št. 14, točka 6).

▼M29

9.4    Razvrstitev olja

Olje se razvrsti v skladu s spodaj navedenimi opisi na podlagi mediane napak in mediane lastnosti sadežno. Mediana napak je mediana napake, ki se zazna z največjo intenzivnostjo. Mediana napak in mediana lastnosti sadežno sta izraženi na eno decimalno mesto natančno.

Razvrstitev olja se izvede s primerjavo vrednosti mediane napak in mediane lastnosti sadežno z referenčnimi razponi, navedenimi spodaj. Ker so bile meje razponov določene ob upoštevanju napak metode, veljajo za absolutne. Programska oprema omogoča prikaz razvrstitve v obliki tabele s statističnimi podatki ali grafa.

▼M29

9.5    Merila za sprejem ali zavrnitev dvojnikov

Normirana napaka, kot je opredeljena spodaj, se uporabi za določitev, ali so oboji rezultati dvakratne analize homogeni ali statistično sprejemljivi:

pri čemer sta Me1 in Me2 mediani dvakratne analize (prva oziroma druga analiza), U1 in U2 pa sta povečani merilni negotovosti za obe vrednosti, izračunani kot sledi in je opredeljeno v Dodatku:

U 1 = c × s * and

za povečano merilno negotovost, c = 1,96; zato

U1 = 0,0196 × CVr × Me1

pri čemer je CVr grobi koeficient variacije.

Za določitev, da vrednosti nista statistično različni, mora biti vrednost En enaka ali manjša kot 1,0.

▼M26

Dodatek

Metoda izračuna mediane in intervalov zaupanja

Mediana

Mediana je realno število Xm, za katerega je značilno, da je verjetnost (p), da so vrednosti distribucije (X) nižje od tega števila (Xm), enaka ali manjša od 0,5 in da je hkrati verjetnost (p), da so vrednosti distribucije (X) enake ali nižje od Xm, enaka ali višja od 0,5. Bolj praktična opredelitev je, da je mediana 50. percentil distribucije števil, urejenih po naraščajočem vrstnem redu. Povedano enostavneje, je mediana vrednost na sredini lihega števila urejenih vrednosti v nizu ali povprečje dveh vrednosti na sredini sodega števila urejenih vrednosti v nizu.

Grobi standardni odklon

Za zanesljivo oceno variabilnosti povprečja je treba upoštevati grobi standardni odklon po Stuartu in Kendallu (4). Formula izraža asimptotičen grobi standardni odklon, tj. grobo oceno variabilnosti upoštevanih podatkov, pri čemer sta N število opažanj in IQR interkvartilni interval, ki zajema točno 50 % primerov določene distribucije verjetnosti.

Interkvartilni interval se izračuna tako, da se izračuna velikost razpona med 75. in 25. percentilom.

Percentil je vrednost Xpc, za katero je značilno, da je verjetnost (p), da so vrednosti distribucije nižje od Xpc, enaka ali manjša od določene stotine in da je hkrati verjetnost (p), da so vrednosti distribucije nižje ali enake Xpc, enaka ali višja od navedene določene stotine. Stotina označuje izbrani delež distribucije. V primeru mediane je ta enak 50/100.

V praksi je percentil vrednost distribucije, ki ustreza določenemu območju, zarisanemu od krivulje distribucije ali gostote. Tako, na primer, 25. percentil predstavlja vrednost distribucije, ki ustreza območju 0,25 ali 25/100.

Pri tej metodi se percentili izračunajo na podlagi dejanskih vrednosti v podatkovni matriki (postopek za izračun percentilov).

Grobi koeficient variacije (%)

CVr% predstavlja čisto število, ki označuje delež variabilnosti analiziranega niza števil. Zato je ta koeficient zelo koristen za preverjanje zanesljivosti članov ocenjevalne komisije.

95-odstotni intervali zaupanja pri mediani

95-odstotni intervali zaupanja (vrednost napake prve vrste je enaka 0,05 ali 5 %) predstavljajo interval, v katerem bi se vrednost mediane lahko spremenila, če bi bilo mogoče preskus ponoviti neštetokrat. V praksi ta interval označuje interval variabilnosti pokušnje pod izbranimi delovnimi pogoji ob predpostavki, da se pokušnja lahko ponovi večkrat. Tako kot pri CVr% ta interval pomaga oceniti zanesljivost pokušnje.

pri čemer je C v primeru 95-odstotnega intervala zaupanja enak 1,96.

Primer izračuna je predstavljen v Prilogi I k standardu IOC/T.20/Dok. št. 15.

Viri

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

PRILOGA XV

1.   VSEBNOST OLJA V OLJČNIH TROPINAH

1.1   Oprema

1.2   Reagenti

Normalni heksan, v katerem po popolnem sušenje suhi ostanek ne sme biti višji od 0,002 g v 100 ml.

2.   POSTOPEK

2.1   Priprava vzorca

Če je potrebno, s predhodno dobro očiščenim mehanskim mlinom zmeljemo laboratorijski vzorec do velikosti delcev, ki v celoti preidejo skozi sito.

S približno dvanajstino vzorca očistimo mlin, zmleti material zavržemo, zmeljemo preostali del vzorca in ga takoj analiziramo.

2.2   Vzorec za pokušanje

Takoj po končanem mletju natehtamo približno 10 g vzorca s točnostjo 0,01 g.

2.3   Priprava kartuše

Natehtani vzorec prenesemo v kartušo, ki jo pokrijemo z vato. Pri uporabi filtrirnega papirja vzorec v papir zavijemo.

2.4   Predhodno sušenje

Če so oljčne tropine zelo vlažne (to je, če je vsebnost hlapnih snovi višja od 10 %), izvedemo predhodno sušenje tako, da napolnjeno kartušo (ali filtrirni papir) postavimo v sušilnik, v katerem temperatura ni višja od 80 °C, da vsebnost vlage in hlapnih snovi znižamo na manj od 10 %.

2.5   Priprava bučke z okroglim dnom

S točnostjo 1 mg stehtamo bučko, v kateri se nahaja en do dva koščka plovca, ki smo ga predhodno sušili pri 103 ± 2 °C in v eksikatorju hladili eno uro.

2.6   Začetna ekstrakcija

V aparaturo za ekstrakcijo vstavimo kartušo (ali filtrirni papir) z vzorcem. V bučko vlijemo zahtevano količino heksana. Bučko spojimo z aparaturo za ekstrakcijo in jo postavimo na električno greto kopel. Hitrost gretja nastavimo tako, da je hitrost refluksa najmanj tri kaplje na sekundo (srednje, ne burno vretje). Po štirih urah ohladimo. Kartušo vzamemo iz aparature za ekstrakcijo in s tokom zraka odstranimo večji del topila.

2.7   Druga ekstrakcija

Vsebino iz kartuše prenesemo v mikro drobilec in jo čim bolje zdrobimo. Zdrobljeno mešanico kvantitativno vrnemo v kartušo, ki jo ponovno vstavimo v aparaturo za ekstrakcijo.

Nadaljujemo z ekstrakcijo nadaljnji dve uri ob uporabi iste bučke z okroglim dnom, v kateri se nahaja ekstrakt iz začetne ekstrakcije.

Dobljena raztopina v ekstrakcijski bučki mora biti bistra. Če ni, jo filtriramo skozi filtrirni papir in originalno bučko ter filtrirni papir nekolikokrat speremo s heksanom. Filtrat in raztopino za izpiranje lovimo v drugo predhodno osušeno bučko, stehtano s točnostjo 1 mg.

2.8   Odstranjevanje topila in tehtanje ekstrakta

Večino topila odstranimo z destilacijo na električno greti kopeli. Zadnje ostanke topila odstranimo s segrevanjem bučke v sušilniku pri 103 ± 2 °C 20 minut. Odstranjevanje topila lahko pospešimo s prepihovanjem z zrakom ali, še bolje, z inertnim plinom v časovnih presledkih ali pri znižanem tlaku.

Bučko hladimo v eksikatorju najmanj eno uro in jo nato stehtamo s točnostjo 1 mg.

Pod enakimi pogoji ponovno grejemo 10 minut, ohladimo v eksikatorju in ponovno tehtamo.

Razlika med obema tehtanjema ne sme biti večja od 10 mg. Če je večja, ponovno grejemo 10 minut, ohladimo in stehtamo ter postopek ponavljamo, dokler razlika med dvema tehtanjema ni manjša od 10 mg. Zabeležimo zadnjo maso bučke.

Izvedemo dve vzporedni določitvi.

3.   IZRAŽANJE REZULTATOV

3.1   Metoda izračuna in formula

3.2   Ponovljivost

Razlika med dvema vzporednima določitvama, ki jih izvede isti analitik istočasno ali v kratkem časovnem intervalu, ne sme biti večja od 0,2 g heksanskega ekstrakta v 100 g vzorca.

Če ta pogoj ni izpolnjen, analizo ponovimo z dvema drugima deloma vzorca. Če je tudi v tem primeru razlika večja od 0,2 g, je rezultat srednja vrednost štirih določitev.

Priloga XVI

DOLOČANJE JODNEGA ŠTEVILA

1.   NAMEN

V tem mednarodnem standardu je opisana metoda za določanje jodnega števila v maščobah in oljih živalskega in rastlinskega izvora, v nadaljevanju maščobah.

2.   DEFINICIJA

Za namene tega mednarodnega standarda se uporablja naslednja opredelitev:

3.   PRINCIP

Vzorec raztopimo v topilu ob dodatku Wijs-ovega regenta. Po določenem času dodamo raztopino kalijevega jodida v vodi in sproščeni jod titriramo z raztopino natrijevega tiosulfata.

4.   REAGENTI

Vsi reagenti morajo biti priznane čistoče za analizo.

5.   OPREMA

Običajna laboratorijska oprema, posebno:

6.   PRIPRAVA VZORCA ZA ANALIZO

Homogeniziran vzorec osušimo nad natrijevim sulfatom in filtriramo.

7.   POSTOPEK

8.   IZRAŽANJE REZULTATOV

Jodno število podaja izraz

kjer je:

Rezultat je aritmetična sredina dveh določitev, pod pogojem, da so izpolnjeni pogoji ponovljivosti (9.2).

▼M11

PRILOGA XVII

METODA ZA DOLOČANJE STIGMASTADIENOV V RASTLINSKIH OLJIH

1.   NAMEN

Določitev stigmastadienov v rastlinskih oljih z nizko vsebnostjo teh ogljikovodikov, predvsem v deviškem oljčnem olju in v surovem olju iz oljčnih tropin.

2.   PODROČJE

Metodo lahko uporabljamo za vsa rastlinska olja, čeprav so določitve zanesljive le v primerih, ko je vsebnost teh ogljikovodikov med 0,01 in 4,0 mg/kg. Metoda je še posebej primerna za ugotavljanje prisotnosti rafiniranih rastlinskih olj (oljčnih, oljčnih tropin, sončničnih, palmovih itd.) v deviških oljčnih oljih, kajti rafinirana olja vsebujejo stigmastadiene, deviška olja pa ne.

3.   PRINCIP

Izolacija neumiljivih snovi. Ločitev steroidne ogljikovodične frakcije s kolonsko kromatografijo na silikagelu ter analiza s kapilarno plinsko kromatografijo.

4.   OPREMA

5.   REAGENTI

Vsi reagenti morajo biti analizne čistoče, razen če ni drugače določeno. Voda, ki se uporabi, mora biti destilirana ali vsaj enakovredne čistoče.

6.   POSTOPEK

6.1   Priprava neumiljivih snovi

6.2   Ločitev steroidne ogljikovodične frakcije

6.3   Plinska kromatografija

Slika 1

Plinski kromatogrami vzorcev oljčnega olja, analizirani na kapilarni koloni (z notranjim premerom 0,25 mm, dolžine 25 m) z notranjim nanosom 5 % -fenilmetilsilikonske faze v debelini 0,25 μm).

Slika 2

Plinski kromatogram, pridobljen iz vzorca rafiniranega oljčnega olja, analiziranega na DB-5 koloni, kaže izomer 3,5-stigmastadiena.

▼M25

PRILOGA XVIII

DOLOČANJE RAZLIKE MED DEJANSKO IN TEORETIČNO VSEBNOSTJO TRIACILGLICEROLOV Z EKVIVALENTNIM OGLJIKOVIM ŠTEVILOM (ECN) 42

1.   NAMEN

Določanje absolutne razlike med eksperimentalnimi vrednostmi triacilglicerolov (TAG) z ekvivalentnim ogljikovim številom 42 (ECN42HPLC) v olju, dobljenimi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, in teoretično vrednostjo triacilglicerolov z ekvivalentnim ogljikovim številom 42 (ECN 42teoretično), izračunano na podlagi sestave maščobnih kislin.

2.   PODROČJE UPORABE

Standard se uporablja za oljčna olja. Metoda se uporablja za odkrivanje prisotnosti majhnih količin semenskih olj (bogatih z linolno kislino) v vsaki posamezni kategoriji oljčnih olj.

3.   PRINCIP

Vsebnost triacilglicerolov z ECN 42, določena z analizo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC), in teoretična vsebnost triacilglicerolov z ECN 42 (izračunana na podlagi določitve sestave maščobnih kislin s plinsko-tekočinsko kromatografijo) sta v okviru določene mejne vrednosti za pristna oljčna olja. Če je razlika večja od vrednosti, sprejetih za posamezno vrsto olja, to pomeni, da olje vsebuje semenska olja.

4.   METODA

Metoda za izračun teoretične vsebnosti triacilglicerolov z ECN 42 in razlike glede na podatke tekočinske kromatografije visoke ločljivosti se v bistvu izvaja z uskladitvijo analitičnih podatkov, dobljenih z drugimi metodami. Razlikovati je mogoče med tremi fazami: določanjem sestave maščobnih kislin s kapilarno plinsko kromatografijo, izračunom teoretične sestave triacilglicerolov z ECN 42 in določanjem triacilglicerolov z ECN 42 s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti.

4.1    Oprema

4.2    Reagenti

Reagenti morajo biti analitsko čisti. Elucijska topila morajo biti razplinjena in se jih lahko večkrat reciklira brez vpliva na ločevanje.

4.3    Priprava vzorcev

Ker lahko zaradi številnih motečih snovi dobimo lažno pozitivne rezultate, je treba vzorec vedno očistiti po metodi IUPAC št. 2507, ki se uporablja za določanje polarnih spojin v maščobah za cvrtje.

4.3.1    Priprava kromatografske kolone

V kolono (4.1.3) vlijemo približno 30 ml elucijskega topila (4.2.3), nato v kolono vstavimo nekaj steklene volne (4.2.5) in jo s stekleno paličico potisnemo na dno (4.1.5).

V 100-mililitrski čaši raztopimo 25 g silikagela (4.2.4) v 80 ml elucijske mešanice (4.2.3.), nato jo skozi stekleni lij prenesemo v kolono (4.1.6).

Da zagotovimo popoln prenos silikagela v kolono, speremo čašo z elucijsko mešanico in tudi to tekočino prenesemo v kolono.

Odpremo petelinček in pustimo, da topilo eluira iz kolone, dokler ne sega približno 1 cm nad silikagel.

4.3.2    Kolonska kromatografija

Z natančnostjo 0,001 g natehtamo 2,5 ± 0,1 g olja, po potrebi predhodno prefiltriranega, homogeniziranega in dehidriranega, v 50-mililitrsko merilno bučko (4.1.7).

Raztopimo ga v približno 20 ml elucijskega topila (4.2.3). Po potrebi nekoliko segrejemo, da pospešimo raztapljanje. Ohladimo pri sobni temperaturi in volumen prilagodimo z elucijskim topilom.

Z merilno pipeto vnesemo 20 ml raztopine v kolono, pripravljeno v skladu s točko 4.3.1, odpremo petelinček in pustimo, da topilo eluira do višine plasti silikagela.

Nato eluiramo s 150 ml elucijskega topila (4.2.3.), pri čemer hitrost pretoka topila prilagodimo na približno 2 ml/min (150 ml bo šlo skozi kolono v približno 60–70 minutah).

Eluat se zbira v 250-mililitrski bučki z okroglim dnom (4.1.1), ki je bila predhodno tarirana v peči in natančno stehtana. Topilo odstranimo pri znižanem tlaku v rotacijskem izparilniku (4.1.9) in stehtamo ostanek, ki se bo uporabil za pripravo raztopine za analizo HPLC in pripravek metil estra.

Izkoristek vzorca iz kolone mora biti najmanj 90-odstoten za kategorije oljčnega olja ekstra deviško, deviško, navadno in rafinirano, ter najmanj 80-odstoten za lampante oljčno olje in olje iz oljčnih tropin.

4.3.3    Čiščenje z ekstrakcijo v trdni fazi

Kolona s silikagelom za ekstrakcijo v trdni fazi se aktivira s 6 ml heksana (4.2.3) v vakuumu, pri čemer je treba preprečiti izsušitev.

Z natančnostjo 0,001 g natehtamo 0,12 g v 2-mililitrsko vialo (4.1.15) in razredčimo z 0,5 ml heksana (4.2.3).

Raztopino vnesemo v kolono za ekstrakcijo v trdni fazi in eluiramo z 10 ml heksana/dietil etra (87: 13 v/v) (4.2.3) v vakuumu.

Zbrana frakcija se v rotacijskem izparilniku (4.1.9) odpari do suhega pod znižanim tlakom pri sobni temperaturi. Ostanek se raztopi v 2 ml acetona (4.2.6) za analizo triacilglicerolov (TAG).

4.4    Analiza HPLC

4.4.1    Priprava vzorcev za kromatografsko analizo

5-odstotno raztopino vzorca za analizo pripravimo tako, da v 10-mililitrsko merilno bučko natehtamo 0,5 ± 0,001 g vzorca in dolijemo topilo do oznake 10 ml (4.2.9).

4.4.2    Postopek

Pripravimo kromatografski sistem. Elucijsko topilo (4.2.8) črpamo s hitrostjo 1,5 ml/min, da očistimo celotni sistem. Počakamo, da dobimo stabilno bazno linijo.

Vbrizgamo 10 μl vzorca, pripravljenega v skladu s točko 4.3.

4.4.3    Izračun in izražanje rezultatov

Uporabimo metodo normalizacije površine, tj. predpostavimo, da je vsota površin vrhov, ki ustreza triacilglicerolom z ekvivalentnim ogljikovim številom od ECN 42 do ECN 52, enaka 100 %.

Izračunamo relativni odstotni delež posameznega triglicerida z uporabo enačbe:

.

Rezultate je treba podati na vsaj dve decimalni mesti natančno.

Glej opombe od 1 do 4.

4.5    Izračun sestave triacilglicerolov (mol %) na podlagi podatkov o sestavi maščobnih kislin (površinski %)

4.5.1    Določanje sestave maščobnih kislin

Sestava maščobnih kislin se določi na podlagi standarda ISO 5508 s kapilarno kolono. Metil estri se pripravijo v skladu z dokumentom Mednarodnega sveta za oljčno olje COI/T.20/Dok. št. 24.

4.5.2    Maščobne kisline za izračun

Gliceridi se razvrstijo glede na ekvivalentno ogljikovo število (ECN), pri čemer se upoštevajo naslednje ekvivalence med ECN in maščobnimi kislinami. Upoštevane so bile samo maščobne kisline s 16 in 18 ogljikovimi atomi, ker so samo te pomembne za oljčno olje. Maščobne kisline je treba normalizirati do 100 %.

4.5.3    Pretvorba površinskega % v mole za vse maščobne kisline (1)

4.5.4    Normalizacija maščobnih kislin do 100 % (2)

Rezultat pomeni odstotni delež posamezne maščobne kisline v mol % na vseh (1, 2, 3) položajih triacilglicerolov.

Nato so izračunata vsoti nasičenih maščobnih kislin P in S (NMK) ter nenasičenih maščobnih kislin Po, O, L in Ln (NEMK)(3):

4.5.5    Izračun sestave maščobnih kislin na položajih 2 ter 1 in 3 triacilglicerolov

Maščobne kisline so razdeljene na naslednje tri skupine: ena za položaj 2 in dve enaki za položaja 1 in 3, z različnimi koeficienti za nasičene (P in S) in nenasičene kisline (Po, O, L in Ln).

4.5.5.1   Nasičene maščobne kisline na položaju 2 [P(2) in S(2)] (4)

4.5.5.2   Nenasičene maščobne kisline na položaju 2 [Po(2), O(2), L(2) in Ln(2)] (5):

4.5.5.3   Maščobne kisline na položajih 1 in 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) in Ln(1,3)] (6):

4.5.6    Izračun triacilglicerolov

4.5.6.1   TAG s samo eno maščobno kislino (AAA, tukaj LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2   TAG z dvema maščobnima kislinama (AAB, tukaj PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3   TAG s tremi različnimi maščobnimi kislinami (ABC, tukaj OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4   Triacilgliceroli z ekvivalentnim ogljikovim številom (ECN 42)

Triacilgliceroli z ECN 42 se izračunajo po enačbah 7, 8 in 9, nato pa se navedejo v vrstnem redu pričakovane elucije v HPLC (običajno samo trije vrhovi).

Triacilglicerole z ECN 42 dobimo z vsoto devetih triacilglicerolov, vključno z njihovimi položajnimi izomeri. Rezultate je treba podati na vsaj dve decimalni mesti natančno.

5.   VREDNOTENJE REZULTATOV

Primerjata se izračunana teoretična vsebnost in vsebnost, določena z analizo HPLC. Če je absolutna razlika, ki jo dobimo, ko od podatkov HPLC odštejemo teoretične podatke, večja od vrednosti, navedenih za ustrezno kategorijo olja v standardu, vzorec vsebuje semensko olje.

Rezultati so podani na dve decimalni mesti natančno.

6.   PRIMER (ŠTEVILKE SE NANAŠAJO NA ODDELKE V BESEDILU METODE)

— 4.5.1    Izračun mol % maščobnih kislin na podlagi podatkov plinsko-tekočinske kromatografije (normaliziran površinski %)

Glede sestave maščobnih kislin s plinsko-tekočinsko kromatografijo dobimo naslednje podatke:

— 4.5.3    Pretvorba površinskega % v mole za vse maščobne kisline (glej enačbo 1)

— 4.5.4    Normalizacija molov maščobnih kislin do 100 % (glej enačbo 2)