PRILOGA I

Metode testiranja za odkrivanje in identifikacijo zadevnega škodljivega organizma iz člena 3(2)

1.   Testiranje s sporami

Za odkrivanje in identifikacijo se uporabljajo poletni sporangiji in počivajoče spore, ki se pridobijo iz presejane zemlje ali neposredno iz rastlinskega materiala.

2.   Metode za odkrivanje

Za ekstrakcijo spor zadevnega škodljivega organizma iz zemlje se uporabi ena od naslednjih metod:

(a)	metoda presejanja zemlje, kot jo je opisal Pratt (1976) (1);

(b)	metoda presejanja zemlje, kot so jo opisali van Leeuwen et al. (2005) (2);

(c)	tehnika conskega centrifugiranja za visokozmogljivo obdelavo vzorcev, kot so jo opisali Wander et al. (2007) (3).

3.   Metode za identifikacijo

Spore zadevnega škodljivega organizma se po ekstrakciji identificirajo z eno od naslednjih metod:

(a)	morfološko identifikacijo pod svetlobnim mikroskopom pri povečavi 100x–400x;

(b)	konvencionalnim PCR z uporabo primerjev na podlagi Lévesque et al. (2001) (4) in van den Boogert et al. (2005) (5);

(c)	PCR v realnem času z uporabo primerjev in sond po van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

(d)	PCR v realnem času z uporabo primerjev in sond po Smith et al. (2014) (7).

4.   Viabilnost počivajočih spor

Viabilnost počivajočih spor se lahko določi z mikroskopskim pregledom ali biološkim testom. Viabilnost sporangijev se lahko določi z mikroskopskim pregledom sporangijev, položenih v laktofenol ali vodo (Przetakiewicz 2015) (8). Sporangiji z zrnato vsebino ali rahlo zaobljeno protoplazmo se lahko štejejo za viabilne. Če so trajno plazmolizirani ali brez vidne vsebine, se štejejo za mrtve.

Kot alternativa ali v primeru dvoma se lahko izvede biološki test, kot je opisan v točki 3 Priloge IV.

5.   Določanje patotipov

Za določanje patotipov je potrebno sveže rakavo tkivo.

Inokulum za test se pridobi z eno od naslednjih metod:

(a)

metodo SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), sestavljeno iz naslednjih dveh korakov: (i) pridobivanje inokuluma Staro (rjavo) rakavo tkivo se razdeli na manjše kose in posuši na zraku pri sobni temperaturi, dokler ne postane trdo. Trdno tkivo se zmelje ročno ali mehansko. Zmleti material se suho preseje, pri čemer se zbere frakcija od 25 do 75 μm, nato pa se ekstrahira s kloroformno metodo po Prattu (1976)1; (ii) pridelava svežega rakavega tkiva Približno 10 mg ekstrahiranih počivajočih spor se razporedi po površini 10 ml sterilne destilirane vode v manjši plastični petrijevki in do kalitve inkubira v temi pri 20 °C. Gomolji krompirja z majhnimi kalčki, dolgimi približno 1 do 2 mm, se položijo v prozorne plastične škatle, obložene z vlažnim vpojnim papirjem, pri čemer so označeni kalčki obrnjeni navzgor. Kalčke se obkroži s stopljenim vazelinom v brizgi Obroč vazelina mora biti neprekinjen in dovolj visok, da brez puščanja zadrži suspenzijo spor. 10 ml počivajočih spor v kali se nadalje razredči na 20 ml s sterilno vodo in s pipeto ali puhalko prenese znotraj obročev, dokler kalček ni popolnoma potopljen v suspenzijo spor. Plastične škatle so prekrite s pokrovi in inkubirane 4 dni pri temperaturi 10 °C, nato pa se škatle odprejo, inokulum in obroči vazelina se odstranijo, škatle pa se prestavijo v vlažen rastlinjak pri temperaturi 15 do 18 °C (16 ur svetlobe);

(b)	metodo po Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

(c)	metodo po Potoček et al. (1991) (10);

(d)	metodo po Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble and Glynne 1970 (13)).

Za določanje vseh patotipov, za katere je znano, da so pomembni za Unijo (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) in 38(Nevşehir), se uporabi diferencialni test okužbe pri različnih sortah zadevne rastline, kot je navedeno v tabeli. Test okužbe se izvede v skladu s protokolom iz točke (d) (metoda Glynne-Lemmerzahl).

Selektivna občutljivost krompirjevih kultivarjev za določanje patotipov S. endobioticum

Kultivar	Patotipi S. endobioticum
	1(D1)	2(G1)	6(O1)	18(T1)	38(Nevşehir)
Tomensa/evora/deodara	S	S	S	S	S
Irga/producent	R	S	S	S	S
Talent	R	R*	R*	S	S
Saphir	R	S	R	R	S
Ikar/gawin/karolin/belita	R	R	R	R	R
„S“: občutljiv „R“: odporen *: kaže šibko občutljivost sorte za S. endobioticum („navzočnost ne-nekrotičnih polj trosišč brez nastajanja rakavih tkiv“).

---

(1)  Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21–29.

(2)  van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25–31.

(3)  Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165–174.

(4)  Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ in de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200–201.

(5)  van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47–57.

(6)  van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129–133.

(7)  Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH., 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422–432.

(8)  Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92:704–708.

(9)  Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114–115.

(10)  Potoček J., Krajíčková K., Klabzubová S., Krejcar Z., Hnízdil M., Novák F., Perlová V.,1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191–205.

(11)  Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34–60.

(12)  Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288–297.

(13)  Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125–135.

PRILOGA II

Predloga za preiskavo iz člena 3

Predloga za predstavitev rezultatov preiskave o krompirjevem raku pri spravilu krompirja iz leta pred letom poročanja.

To tabelo uporabite samo za rezultate preiskave za krompir, pobran v vaši državi.

Država članica ali območje

Kategorija krompirja

Celotna pridelovalna površina (ha)

Vizualni pregled gomoljev

Laboratorijsko testiranje

Druge informacije

Število vzorcev

Število partij

Velikost vzorca

Obdobje vzorčenja

Št. sumljivih

Število vzorcev

Velikost vzorcev

Vrsta testa

Št. pozitivnih

vzorcev

partij

vzorcev

partij

Krompir za pridelavo gomoljev za saditev

Jedilni in za predelavo

Drugo (1) (navedite)

---

(1)  Za države z izbruhi bolezni bi lahko bilo na primer ustrezno, da se ločeno od splošnih preiskav navede količina vzorcev, uporabljenih za raziskovanje ali sledenje izbruhov.

PRILOGA III

Protokol za ocenjevanje odpornosti sorte iz člena 7(2)

Protokol za ocenjevanje odpornosti sorte vključuje naslednje korake.

(1)	Testira se najmanj 40 gomoljev ali izrezkov očes na sorto zadevne rastline. Razdelijo se v dve skupini (replikati).

(2)	Test običajno traja dve leti. Samo če se izkaže, da je sorta izredno občutljiva za patotip zadevnega škodljivega organizma, se lahko trajanje testa skrajša na eno leto.

(3)	Pred začetkom sezone testiranja se z metodami, opisanimi v Prilogi I, testira čistost inokuluma.

(4)	V test se vedno vključi pozitivna kontrola v obliki sorte zadevne rastline, ki je izredno občutljiva za patotip zadevnega škodljivega organizma, ki se bo testiral.

(5)

Uporabi se ena od naslednjih testnih metod: (i) Glynne-Lemmerzahlova metoda (Glynne 1925, Lemmerzahl 1930, Noble & Glynne 1970); (ii) Spieckermannova metoda (Spieckermann & Kothoff 1924); ali (iii) metoda SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), ki vključuje vse naslednje korake: — pripravo gomoljev: Gomolji se odstranijo iz hladilnice približno 10 dni pred nameravano inokulacijo, nežno sperejo, posušijo in shranijo v temi pri sobni temperaturi, da se sproži kalitev. V vsako inokulacijo se vključi zelo občutljiva sorta („morene“ ali sorta s primerljivo občutljivostjo), ki služi kot pozitivna kontrola; — kalitev počivajočih spor: Pogoji za sprožitev kalitve počivajočih spor se vzpostavijo 21 dni pred inokulacijo. Približno 10 mg ekstrahiranih spor se potrese na površino 10 ml sterilne destilirane vode v majhnih plastičnih petrijevkah in inkubira v temi pri 20 °C do kalitve. Vsebnost vsake petrijevke se razredči z nadaljnjimi 10 ml sterilne destilirane vode za inokulacijo; — inokulacijo in inkubacijo kalčkov: Ko kalčki dosežejo dolžino 1 mm, se obkrožijo s staljenim vazelinom. Obroč vazelina je neprekinjen, da zadrži suspenzijo spor brez puščanja, in je dovolj visok, da suspenzija pokrije kalček. Na vsakem gomolju se obroč naredi okrog enega kalčka ali enega samega skupka kalčkov. Gomolji se položijo v plastične škatle, ki so obložene z vlažnim vpojnim papirjem, pri čemer so kalčki z obroči obrnjeni navzgor. Obroči vazelina se napolnijo s suspenzijo spor s pipeto ali puhalko, dokler kalček ni popolnoma potopljen. Plastične škatle so prekrite s pokrovi in inkubirane 4 dni pri temperaturi 10 °C v temi, nato pa se obroči vazelina odstranijo, odprte škatle pa se prestavijo v rastlinjak pri temperaturi 15–18 °C ob rednem rošenju (trikrat na dan po 30 minut). Kadar je okužba neuspešna, na primer zato, ker je kalček zgnil ali se ni razvil, se gomolj lahko ponovno testira z drugim kalčkom; — oceno: Kalčki se pregledajo za okužbo 28 dni po inokulaciji s stereo mikroskopom s povečavo 10–15x in svetlobnim mikroskopom. Reakcije z oceno 4 ali 5, kot je določeno v tabeli, se ugotovijo pri pozitivni kontroli pri vsaj 80 % gomoljev. Vsaj en gomolj mora imeti oceno 5.

(6)	Ocenijo se vsi gomolji, pri čemer se jim dodeli ocena odpornosti od 1 do 5, kot je določeno v tabeli.

(7)

Vsaka testirana sorta se uvrsti v skupino odpornosti („zelo odporna“, „odporna“, „rahlo občutljiva“ ali „izredno občutljiva“) glede na razpon ocen, ugotovljenih v zadevni populaciji posameznih gomoljev ali izrezkov očes, ki so bili testirani: (i) sorta se šteje za „zelo odporno“, če je ocena vseh gomoljev v vseh replikatih 1; (ii) sorta se šteje za „odporno“, če je ocena vseh gomoljev v vseh replikatih med 1 in 3; (iii) sorta se šteje za „rahlo občutljivo“, če ima eden ali več gomoljev oceno 4 (če samo en gomolj doseže oceno 4, se test lahko ponovi, da se izključi nečistoča v partiji sort); (iv) sorta se šteje za „izredno občutljivo“, če vsaj en gomolj v enem replikatu doseže oceno 5. Standardne ocene za testne populacije krompirja Standardna ocena Skupina odpornosti Opis odpornosti Opis 1 R1 Izredna odpornost Zgodnja obrambna nekroza; ni vidnega nastajanja trosišča. 2 R1 Odpornost Pozna obrambna nekroza; nastanek trosišča delno viden, trosišča nezrela ali nekrotična pred zrelostjo. 3 R2 Šibka odpornost Zelo pozna obrambna nekroza; razvito enojno zrelo trosišče ali polja trosišč, ki pa so popolnoma obdana z nekrozo; dovoljeno je do pet ne-nekrotičnih poletnih trosišč, očitna nekroza v drugih predelih istega kosa gomolja. Ni tvorb rakavega tkiva ali počivajočih spor. Za odločitev med skupinama 3 in 4 bo morda treba pripraviti tanke rezine okuženega tkiva: če ni počivajočih spor, je ocena 3. 4 S1 Rahla občutljivost Razpršene okužbe; trosišče ali polja trosišč so ne-nekrotična, maloštevilna; pozna nekroza je lahko prisotna na drugih mestih okužbe na kalčku; kalček je lahko rahlo deformiran (odebeljen). Prisotni so počivajoči (zimski) sporangiji. Za odločitev med skupinama 3 in 4 bo morda treba pripraviti tanke rezine okuženega tkiva: če so prisotne počivajoče spore, je ocena 4. 5 S2 Izredna občutljivost Gosta okužena polja, številna zrela ne-nekrotična trosišča ali polja trosišč, polja z gostimi ne-nekrotičnimi območji okužbe, prevladujoče nastajanje rakavega tkiva.

PRILOGA IV

Pogoji za preklic ukrepov, navedenih v členu 9

1.   Pogoji za preklic ukrepov

1.1

Po najmanj 50 letih od zadnjega odkritja zadevnega škodljivega organizma, če obstaja neprekinjena evidenca posevka na okuženem območju, ki dokazuje, da so bile določbe člena 6(2) in (3) ves čas izpolnjene in da okuženo območje ni bilo uporabljeno kot trajno travinje.

1.2

Po najmanj 20 letih od zadnjega odkritja zadevnega škodljivega organizma, če obstaja neprekinjena evidenca posevka, ki dokazuje, da so bile določbe člena 6(2) in (3) ves čas izpolnjene in da okuženo območje ni bilo uporabljeno kot trajno travinje, in — pri dveh bioloških testih (kot je opisano v točki 3) z občutljivimi krompirjevimi kultivarji niso bili odkriti nobeni znaki okužbe z zadevnim škodljivim organizmom ali — pri enem biološkem testu (kot je opisan v točki 3) z občutljivimi krompirjevimi kultivarji niso bili odkriti nobeni znaki okužbe z zadevnim škodljivim organizmom, pri neposrednem pregledu zemlje z okuženega območja z mikroskopom po ekstrakciji spor z eno od metod iz točke 2 Priloge I pa niso bile ugotovljene nobene viabilne počivajoče spore. Shema, ki se uporablja za pridobivanje zemlje za testiranje, vključuje vse naslednje korake: — okuženo območje se razdeli na enote po 0,33 ha; — iz vsake enote se odvzame 60 podvzorcev do globine 20 cm, enakomerno porazdeljenih po celotnem območju ali združenih glede na znana okužena žarišča; — podvzorci se temeljito premešajo, tako da se pridobijo trije vzorci na hektar.

2.   Delni preklic ukrepov

Po najmanj desetih letih od zadnjega odkritja zadevnega škodljivega organizma na predelih okuženega območja se lahko za ta območja predvidi delni preklic ukrepov iz člena 6, če obstaja neprekinjena evidenca posevka, ki dokazuje, da so bile določbe člena 6(2) in (3) ves čas izpolnjene in da okuženo območje ni bilo uporabljeno kot trajno travinje, ter:

(a)	pri dveh bioloških testih, kot je opisano v točki 3, z občutljivimi krompirjevimi kultivarji niso odkriti nobeni znaki okužbe z zadevnim škodljivim organizmom ali

(b)

pri enem biološkem testu, kot je opisan v točki 3, z občutljivimi krompirjevimi kultivarji niso bili odkriti nobeni znaki okužbe z zadevnim škodljivim organizmom, pri neposrednem pregledu zemlje z okuženega območja z mikroskopom po ekstrakciji spor z eno od metod iz točke 2 Priloge I pa je bilo ugotovljenih manj kot pet viabilnih počivajočih spor na gram zemlje.

Shema, ki se uporablja za pridobivanje zemlje za testiranje, vključuje vse naslednje korake:

—	okuženo območje se razdeli na enote po 0,33 ha;

—	iz vsake enote se odvzame 60 podvzorcev do globine 20 cm, enakomerno porazdeljenih po celotnem območju ali združenih glede na znana okužena žarišča;

—	podvzorci se temeljito premešajo, tako da se pridobijo trije vzorci na hektar.

Če ti pogoji niso izpolnjeni, se lahko možnost delnega preklica ukrepov preuči ponovno po čakalni dobi najmanj dveh letih. Države članice pri določanju dolžine te čakalne dobe upoštevajo stopnjo okužbe in/ali število odkritih viabilnih spor.

3.   Biološki testi, namenjeni za preklic ukrepov

Več gomoljev zadevnih rastlin se inkubira v lončkih skupaj z najmanj 5 l zemlje v pogojih temperature, vlage in svetlobe, ki so ugodni za rast krompirja. Uporablja se kultivar, ki je zelo občutljiv za vse patotipe (kot so deodara, evora, morene, tomensa, maritiema, arran chief).

Rastoče krompirjeve rastline se odrežejo, ko dosežejo višino približno 60 cm. Po približno 100 dneh se na novo oblikovani gomolji pregledajo za rakava tkiva.

V test je treba vedno vključiti negativne kontrole zemlje, proste zadevnega škodljivega organizma, in pozitivne kontrole okuženih tal. Test se šteje za veljavnega, če rakava tkiva nastanejo v gomoljih pozitivne kontrole, v gomoljih negativne kontrole pa ne. Zabeležijo se pogoji temperature in vlage v rastlinjaku. Rakava tkiva, nastala v testnih vzorcih, se mikroskopsko pregledajo glede prisotnosti poletnih sporangijev in/ali počivajočih spor.

Celoten test se izvede pod pogoji, ki preprečujejo nadaljnje širjenje zadevnega škodljivega organizma.