1.

Porazdelitveni koeficient (P) je opredeljen kot razmerje ravnotežnih koncentracij (c) raztopljene snovi v dvofaznem sistemu, sestavljenem iz dveh topil, ki se v glavnem ne mešata. V primeru n-oktanola in vode:

Porazdelitveni koeficient (P) je količnik dveh koncentracij, je brez enote in se navadno navede v obliki logaritma z osnovo 10.

2.

V študijah usode kemičnih snovi v okolju je Pow ključni parameter. Dokazano je zelo značilno razmerje med koeficientom Pow neionizirane oblike snovi in bioakumulacijo teh oblik snovi v ribah. Dokazano je bilo tudi, da je koeficient Pow uporaben parameter pri napovedovanju adsorpcije v tleh in usedlinah ter pri določitvi kvantitativnih razmerij med strukturo in aktivnostjo za širok nabor bioloških učinkov.

3.

Prvotni predlog za to preskusno metodo je temeljil na članku C. V. Eadsfortha in P. Moserja (1). Razvoj preskusne metode in preskus s primerjavo med laboratoriji OECD je usklajevala Zvezna agencija za okolje Zvezne republike Nemčije v letu 1986 (2).

4.

Vrednosti log Pow v območju od – 2 do 4 (občasno pa do 5 in več) (1) je mogoče določiti s poskusi z metodo stresanja bučke (poglavje A.8 te priloge, Smernica za preskušanje OECD 107). Metoda HPLC zajema vrednost log Pow v območju od 0 do 6 (1)(2)(3)(4)(5). Za določitev primernih referenčnih snovi in v podporo morebitnim zaključkom, ki se izpeljejo iz podatkov, pridobljenih s preskusom, je pri tej metodi morda potrebno ocenjevanje Pow. Računske metode so na kratko obravnavane v Dodatku k tej preskusni metodi. Način delovanja HPLC je izokratski.

5.

Vrednosti Pow so odvisne od okoljskih pogojev, kot so temperatura, pH, ionska moč itd., za pravilno razlago podatkov Pow pa morajo biti ti pogoji v poskusu opredeljeni. Pri snoveh, ki disociirajo na ione, bo morda na voljo druga metoda (npr. osnutek smernice OECD o metodi merjenja pH za ionizirane snovi (6)), ki bi jo bilo mogoče uporabljati kot alternativno. Čeprav je pri snoveh, ki disociirajo na ione, osnutek smernice OECD morda primeren za določanje Pow, je v nekaterih primerih primerneje uporabiti metodo HPLC pri okoljsko ustreznem pH (glej odstavek 9).

6.

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z reverzno fazo se izvaja z analitskimi kolonami, napolnjenimi z na trgu dostopno trdno fazo, ki vsebuje dolge verige ogljikovodikov (npr. C8, C18), vezane na silicijev dioksid.

7.

Kemikalijo, injicirano na tako kolono, po koloni prenaša mobilna faza; med tem prenosom se kemikalija porazdeli med mobilno fazo topila in stacionarno fazo ogljikovodika. Snovi se zadržijo sorazmerno s svojim porazdelitvenim koeficientom ogljikovodik/voda, pri čemer se prve eluirajo hidrofilne snovi, zadnje pa lipofilne. Retencijski čas opisuje faktor kapacitete k, ki je določen z enačbo:

pri čemer je tR retencijski čas preskusne snovi, t0 pa mrtvi čas, tj. povprečni čas, ki ga molekula topila potrebuje, da pride skozi kolono. Kvantitativna analiza ni potrebna, treba je določiti le retencijske čase.

8.

Porazdelitveni koeficient oktanol/voda preskusne snovi je mogoče izračunati z določitvijo njegovega faktorja kapacitete k s poskusi in nato z vnosom faktorja k v naslednjo enačbo:

pri čemer sta:

Zgornjo enačbo je mogoče izračunati z linearno regresijo logaritma porazdelitvenih koeficientov oktanol/voda referenčnih snovi glede na logaritem faktorjev kapacitete referenčnih snovi.

9.

S tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z reverzno fazo je mogoče porazdelitvene koeficiente oceniti v območju vrednosti log Pow med 0 in 6, kar je v izjemnih primerih mogoče razširiti tako, da zajame območje vrednosti log Pow med 6 in 10. Zaradi tega je morda treba prilagoditi mobilno fazo (3). Ta metoda ni uporabna za močne kisline in baze, kovinske komplekse, snovi, ki reagirajo z eluentom, ali površinsko aktivne snovi. Meritve je na neionizirani obliki snovi, ki disociirajo na ione (prosta kislina ali prosta baza), mogoče izvesti le z uporabo ustreznega pufra s pH, ki je pri prosti kislini najmanj eno enoto pod vrednostjo pKa, pri prosti bazi pa najmanj eno enoto nad vrednostjo pKa. Namesto tega bo morda na voljo metoda merjenja pH za preskušanje snovi, ki disociirajo na ione (6); to metodo bi bilo mogoče uporabljati kot alternativno (6). Če je vrednost log Pow določena za uporabo pri razvrščanju nevarnosti za okolje ali ocenjevanju okoljskega tveganja, je treba preskus izvesti v območju pH, ki ustreza naravnemu okolju, tj. v območju pH od 5,0 do 9.

10.

V nekaterih primerih lahko nečistote otežijo razlago rezultatov, ker postanejo določitve vrhov negotove. Za zmesi, ki dajo nedoločen pas, je treba sporočiti zgornjo in spodnjo mejo vrednosti log Pow ter površinski odstotek vsakega vrha vrednosti log Pow. Pri zmeseh, ki so skupina homologov, mora biti navedeno tudi tehtano povprečje vrednosti log Pow (7), izračunano na podlagi posameznih vrednosti koeficienta Pow in ustreznih vrednosti površinskega odstotka (8). Vse vrhove, ki k skupni površini vrhov prispevajo površino 5 % ali več, je treba upoštevati pri izračunu (9):

Tehtano povprečje vrednosti log Pow velja le za snovi ali zmesi (npr. talova olja), ki so sestavljene iz homologov (npr. vrste alkanov). Zmesi je mogoče meriti in pri tem dobiti smiselne rezultate, če ima uporabljeni analitski detektor enako občutljivost na vse snovi v zmesi in jih v zadostni meri razločuje.

11.

Disociacijska konstanta, strukturna formula in topnost v mobilni fazi morajo biti znane pred uporabo metode. Poleg tega bi bile v pomoč informacije o hidrolizi.

12.

Za povečanje zanesljivosti meritve je treba izvesti dve vzporedni določitvi.

13.

Preskus s primerjavo med laboratoriji je dokazal, da je mogoče z metodo HPLC pridobiti vrednosti log Pow do ± 0,5 enote vrednosti, dobljenih z metodo stresanja bučke (2). Druge primerjave je mogoče najti v literaturi (4)(5)(10)(11)(12). Najbolj natančne rezultate dajo korelacijske krivulje, ki temeljijo na strukturno sorodnih referenčnih snoveh (13).

14.

Za določitev soodvisnosti izmerjenega faktorja kapacitete (k) snovi in njenega koeficienta Pow je treba izdelati umeritveno krivuljo z uporabo najmanj 6 referenčnih točk (glej odstavek 24). Uporabnik sam izbere primerne referenčne snovi. Referenčne snovi morajo običajno imeti vrednosti log Pow, ki zajemajo vrednosti log Pow preskusne snovi, tj. mora biti koeficient Pow pri vsaj eni referenčni snovi večji, kot ga ima preskusna snov, pri vsaj eni drugi pa mora biti koeficient Pow manjši, kot ga ima preskusna snov. Ekstrapolacija se uporablja le izjemoma. Zaželeno je, da so te referenčne snovi strukturno sorodne preskusni snovi. Vrednosti log Pow referenčnih snovi, ki se uporabljajo za kalibracijo, morajo temeljiti na zanesljivih preskusnih podatkih. Vendar pa se lahko za snovi z visoko vrednostjo log Pow (običajno večjo od 4) uporabljajo izračunane vrednosti, razen če so na voljo zanesljivi preskusni podatki. Če se uporabljajo ekstrapolirane vrednosti, mora biti navedena mejna vrednost.

15.

Na voljo so izčrpni seznami vrednosti log Pow za številne skupine kemikalij (14)(15). Če ni podatkov o porazdelitvenih koeficientih strukturno sorodnih snovi, se lahko uporabi bolj splošna kalibracija, določena z drugimi referenčnimi snovmi. Priporočene referenčne snovi in njihove vrednosti Pow so navedene v preglednici 1. Za snovi, ki disociirajo na ione, dane vrednosti veljajo za neionizirano obliko. Med preskusom s primerjavo med laboratoriji sta bili preverjeni verodostojnost in kakovost vrednosti.

Preglednica 1

Priporočene referenčne vrednosti

16.

Po potrebi se lahko porazdelitveni koeficient oceni, po možnosti z računsko metodo (glej Dodatek) ali, kadar je primerno, na podlagi razmerja topnosti preskusne snovi v čistih topilih.

17.

Potreben je tekočinski kromatograf, opremljen z nizkozmogljivostno črpalko in primernim detektorjem. Detektor UV z valovno dolžino 210 nm ali detektor RI je mogoče uporabiti pri različnih kemijskih skupinah. Prisotnost polarnih skupin v stacionarni fazi lahko resno zmanjša učinkovitost kolone HPLC. Zato mora imeti stacionarne faze le minimalni odstotek polarnih skupin (16). Lahko se uporabijo na trgu dostopna mikropolnila za kolone za kromatografijo z reverzno fazo ali že pripravljene kolone. Med injektorskim sistemom in analitsko kolono se lahko namesti predkolona.

18.

Topilo za eluiranje se pripravi iz metanola za HPLC in deionizirane vode ter se pred uporabo razplini. Uporabiti je treba izokratsko elucijo. Uporabiti je treba razmerja metanol/voda z deležem vode najmanj 25 %. Običajno je zmes metanol/voda v razmerju 3: 1 (v/v) zadovoljiva za eluiranje snovi z log P = 6 v eni uri pri pretoku 1 ml/min. Pri snoveh, katerih vrednost log P je 6 ali več (in referenčnih snoveh), bo morda treba elucijski čas skrajšati z zmanjšanjem polarnosti mobilne faze ali skrajšanjem kolone.

19.

Preskusne in referenčne snovi morajo biti topne v mobilni fazi v zadostnih koncentracijah, da je omogočena njihova detekcija. Dodatke v zmesi metanol/voda je mogoče uporabiti le izjemoma, saj spremenijo lastnosti kolone. V teh primerih mora biti potrjeno, da ni prišlo do vpliva na retencijski čas preskusnih in referenčnih snovi. Če zmes metanol/voda ni primerna, je mogoče uporabiti druge zmesi topilo/voda, npr. etanol/voda, acetonitril/voda ali izopropil alkohol (2-propanol)/voda.

20.

Pri snoveh, ki disociirajo na ione, je pH eluenta zelo pomemben. Biti mora v delovnem območju pH kolone, ki je običajno med 2 in 8. Priporočeno je dodajanje pufra. Preprečiti je treba obarjanje soli in razpadanje kolone, ki lahko nastaneta pri nekaterih zmeseh organske faze in pufra. Meritve HPLC s stacionarnimi fazami z osnovo iz silicijevega dioksida in pH nad 8 običajno niso priporočljive, saj uporaba alkalne mobilne faze lahko povzroči hitro poslabšanje učinkovitosti kolone.

21.

Za dodeljevanje vrhov v kromatogramih ustreznim snovem morajo biti preskusne in referenčne snovi dovolj čiste. Snovi, ki se bodo uporabile za preskus ali kalibracijo, se po možnosti raztopijo v mobilni fazi. Če je za topljenje preskusnih in referenčnih snovi uporabljeno drugo topilo, ne mobilna faza, mora biti mobilna faza uporabljena pri končnem redčenju pred injiciranjem.

22.

Med merjenjem se temperatura ne sme spreminjati za več kot ± 1 °C.

23.

Mrtvi čas t0 je mogoče izračunati z organskimi spojinami, ki se ne zadržijo v koloni (npr. tiosečnino ali formamidom). Natančnejšo vrednost mrtvega časa je mogoče izpeljati iz izmerjenih retencijskih časov ali z nizom približno sedmih spojin homologne vrste (n-alkilmetil-ketoni) (17). Izriše se krivulja dobljenih retencijskih časov tR (nC + 1) v odvisnosti od tR (nC), pri čemer je nC število ogljikovih atomov. Dobljena je ravna črta, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, pri čemer je A, ki predstavlja k(nC + 1)/k(nC), konstanta. Mrtvi čas t0 je dobljen iz presečišča (1 – A)t0 in naklona A.

24.

Naslednji korak je izdelava krivulje vrednosti log k v odvisnosti od log P za ustrezne referenčne snovi, pri čemer morajo biti vrednosti log P blizu pričakovane vrednosti za preskusno snov. V praksi se od 6 do 10 referenčnih snovi injicira hkrati. Določijo se retencijski časi, po možnosti na zapisovalnem integratorju, povezanem z detektorjem. Ustrezni logaritmi faktorjev kapacitete, log k, se izrišejo kot krivulja v odvisnosti od log P. V rednih časovnih razmikih, vsaj enkrat dnevno, se izračunava regresijska enačba, tako da je mogoče upoštevati morebitne spremembe v učinkovitosti kolone.

25.

Preskusna snov se injicira v najmanjših še zaznavnih količinah. Retencijski čas se določa v dvojniku. Porazdelitveni koeficient preskusne snovi je pridobljen z interpolacijo izračunanega faktorja kapacitete na umeritveni krivulji. Pri zelo majhnih in zelo velikih porazdelitvenih koeficientih je potrebna ekstrapolacija. V takih primerih je treba še posebej upoštevati meje zaupanja regresijske premice. Če je retencijski čas vzorca zunaj obsega retencijskih časov, pridobljenih za standarde, je treba navesti mejno vrednost.

26.

Poročilo mora vsebovati naslednje:

(1)

Eadsforth, C. V., in Moser, P. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

Klein, W., Kördel, W., Weiss, M., in Poremski, H. J. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

Eadsforth, C. V. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

Ellgehausen, H., D'Hondt, C., in Fuerer, R. (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

McDuffie, B. (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Osnutek smernice, november 2000.

(7)

OSPAR (1995). ‚Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995‘, Oslo and Pariz Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Priloga 10, Oviedo, od 20. do 24. februarja 1995.

(8)

Thatcher, M., Robinson, M., Henriquez, L. R., in Karman, C. C. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Različica 1.0, 3. avgust.

(9)

Vik, E. A., Bakke, S., in Bansal, K. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, str. 529–537.

(10)

Renberg, L. O., Sundstroem, S. G., in Sundh-Nygård, K. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

Hammers, W. E., Meurs,G. J., in De-Ligny, C. L. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

Haky, J. E., in Young, A. M. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

Fujisawa, S., in Masuhara, E. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

Hansch, C., in Leo, A. J. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

Hansch, C., predsednik; Leo, A. J., dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Na voljo v projektu Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

Rekker, R. F., de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

Berendsen, G. E., Schoenmakers, P. J., de Galan, L., Vigh, G., Varga-Puchony, Z., in Inczédy, J. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 201 (2006; priloga je bila popravljena leta 2011). Ugotovljeno je bilo, da je treba preskusno metodo razširiti, tako da se vanjo vključijo dodatne vrste, in posodobiti, da bo izpolnjevala pogoje za oceno nevarnosti in razvrstitev kemikalij. Te spremembe so bile izvedene na podlagi izčrpnih praktičnih izkušenj, znanstvenega napredka na področju študij strupenosti za alge in ob široki uporabi ustreznih predpisov od njenega prvotnega sprejetja.

2.

Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1.

3.

Namen tega preskusa je določiti učinke kemikalij na rast sladkovodnih mikroalg in/ali cianobakterij. Preskusni organizmi v eksponentni fazi rasti se v šaržnih kulturah izpostavijo preskusni kemikaliji navadno za 72 ur. Kljub relativno kratkemu trajanju preskusa je mogoče oceniti učinke na več generacijah.

4.

Odziv sistema je zmanjšanje rasti pri vrsti kultur alg (preskusnih enot), ki so izpostavljene različnim koncentracijam preskusne kemikalije. Odziv je ocenjen v odvisnosti od koncentracije izpostavljenosti v primerjavi s povprečno rastjo ponovitvenih, neizpostavljenih kontrolnih kultur. Za popolno izražanje odziva sistema na strupene učinke (optimalna občutljivost) se kulturam v zadostnem časovnem obdobju za merjenje zmanjšanja specifične hitrosti rasti omogoči neomejena eksponentna rast pri zadostnih prehranskih pogojih ter stalna svetloba.

5.

Rast in zaviranje rasti sta določena z meritvami biomase alg v odvisnosti od časa. Biomasa alg je opredeljena kot suha teža na prostornino, npr. miligram alg na liter preskusne raztopine. Vendar je suho težo težko meriti, zato se uporabljajo nadomestni parametri. Od teh nadomestkov se najpogosteje uporablja število celic. Drugi nadomestni parametri vključujejo prostornino celic, fluorescenco, optično gostoto itd. Pretvorni faktor med izmerjenim nadomestnim parametrom in biomaso mora biti znan.

6.

Končna točka preskusa je zaviranje rasti, izraženo kot logaritemsko povečanje biomase (povprečne specifične hitrosti rasti) med obdobjem izpostavljenosti. Iz povprečnih specifičnih hitrosti rasti, zabeleženih v nizu preskusnih raztopin, se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje hitrosti rasti (npr. 50-odstotno); ta koncentracija se izrazi kot ErCx (npr. ErC50).

7.

Dodatna spremenljivka odziva, ki se uporablja v tej preskusni metodi, je prirast, ki jo je morda treba določiti, da se izpolnijo specifične zakonske zahteve nekaterih držav. Opredeljena je kot biomasa na koncu obdobja izpostavljenosti, od katere je odšteta biomasa na začetku obdobja izpostavljenosti. Iz prirasti, zabeležene v nizu preskusnih raztopin, se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje prirasti (npr. 50-odstotno), ta koncentracija se izrazi kot EyCx (npr. EyC50).

8.

Poleg navedenega se lahko statistično določita tudi najnižja koncentracija z opaznim učinkom (LOEC) in koncentracija brez opaznega učinka (NOEC).

9.

Podatki o preskusni kemikaliji, ki so lahko uporabni pri vzpostavitvi preskusnih pogojev, vključujejo strukturno formulo, stopnjo čistosti, stabilnost na svetlobi, stabilnost v pogojih preskusa, lastnosti absorpcije svetlobe, pKa in rezultate študij o preoblikovanju, vključno z biološko razgradljivostjo v vodi.

10.

Topnost v vodi, porazdelitveni koeficient oktanol/voda (Pow) in parni tlak preskusne kemikalije morajo biti znani, razpoložljiva pa mora biti tudi validirana metoda za kvantifikacijo kemikalije v preskusnih raztopinah skupaj z navedeno rekuperacijo in mejo zaznavnosti.

11.

Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjena naslednja izvedbena merila:

12.

Referenčne kemikalije, kot je na primer 3,5-diklorofenol, ki se uporablja za mednarodni krožni preskus (1), se lahko preskušajo z namenom preverjanja preskusnega postopka. Kot referenčna kemikalija za zelene alge se prav tako lahko uporabi kalijev dikromat. Referenčno kemikalijo je zaželeno preskusiti vsaj dvakrat letno.

13.

Ta preskusna metoda se najlažje uporabi pri vodotopnih kemikalijah, za katere je verjetno, da bodo v pogojih preskusa ostale v vodi. Za preskušanje kemikalij, ki so hlapne, močno adsorptivne, obarvane in slabo topne v vodi, ali kemikalij, ki lahko vplivajo na razpoložljivost hranilnih snovi ali mineralov v preskusnem mediju, so morda potrebne nekatere prilagoditve opisanega postopka (npr. zaprt sistem ali kondicioniranje preskusnih posod). Navodila za nekaj primernih prilagoditev so navedena v (2), (3) in (4).

14.

Preskusne posode in druge naprave, ki pridejo v stik s preskusnimi raztopinami, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala. Predmete je treba temeljito umiti, da organska ali anorganska onesnaževala ne ovirajo rasti alg ali sestave preskusnih raztopin.

15.

Preskusne posode so navadno steklene bučke z dimenzijami, ki dopuščajo zadostno prostornino kulture za meritve med preskusom in zadosten prenos mase CO2 iz ozračja (glej odstavek 30). Količina tekočine mora biti zadostna za analitsko določanje (glej odstavek 37).

16.

Morda bo potrebna tudi nekatera ali vsa oprema v nadaljevanju:

17.

Uporabi se lahko nekaj vrst nepritrjenih mikroalg in cianobakterij. Sevi, navedeni v Dodatku 2, so se izkazali kot primerni za uporabo preskusnega postopka, določenega v tej preskusni metodi.

18.

Pri uporabi drugih vrst je treba poročati o sevu in/ali izvoru. Treba je potrditi, da se lahko eksponentna rast izbrane preskusne alge ohrani skozi celotno preskusno obdobje pri prevladujočih pogojih.

19.

Priporočata se dve alternativni gojišči; gojišče OECD in gojišče AAP. Sestavi teh gojišč sta prikazani v Dodatku 3. Začetna vrednost pH in kapaciteta pufrov (ki ureja porast pH) sta v teh dveh gojiščih različni. Zato so rezultati preskusov lahko različni, odvisno od uporabljenega gojišča, zlasti pri preskušanju ionizirajočih kemikalij.

20.

Morda bo za nekatere namene, npr. pri preskušanju kovin in kelatnih reagentov ali pri preskušanju pri različnih vrednostih pH, treba prilagoditi gojišče. Uporaba prilagojenega gojišča mora biti podrobno opisana in utemeljena (3)(4).

21.

Začetna biomasa v preskusnih kulturah mora biti enaka v vseh preskusnih kulturah in zadostno nizka, da dopušča eksponentno rast skozi celotno inkubacijsko obdobje brez tveganja izčrpanja hranilnih snovi. Začetna biomasa kot suha teža ne sme prekoračiti 0,5 mg/l. Priporočene so naslednje začetne koncentracije celic:

22.

Razpon koncentracije, v katerem se lahko pojavijo učinki, je lahko določen na osnovi rezultatov iz preskusov za določanje območja delovanja. Za zadnji dokončni preskus naj se izbere najmanj pet koncentracij, razvrščenih v geometrijski vrsti s faktorjem, ki ne presega 3,2. Za preskusno kemikalijo, ki kaže ravno krivuljo odziva na koncentracijo, je lahko določen višji faktor. Serije koncentracij naj po možnosti pokrivajo razpon, ki povzroča 5–75-odstotno zaviranje hitrosti rasti alg.

23.

Načrt preskusa mora vključevati tri ponovitve za vsako preskusno koncentracijo. Če ni zahtevana določitev NOEC, se lahko načrt preskusa prilagodi, da se poveča število koncentracij in zmanjša število ponovitev na koncentracijo. Izvedejo se najmanj tri kontrolne ponovitve, v idealnih razmerah pa naj se uporabi dvakratno število ponovitev za vsako preskusno koncentracijo.

24.

Za analitsko določanje koncentracij preskusne kemikalije se lahko pripravi ločena serija preskusnih raztopin (glej odstavka 36 in 38).

25.

Kadar se za raztapljanje preskusne kemikalije uporabi topilo, morajo biti v načrt preskusa vključene dodatne kontrolne kulture, ki vsebujejo topilo v enaki koncentraciji, kot je bila uporabljena pri preskusnih kulturah.

26.

Kultura inokuluma se pripravi v preskusnem mediju 2–4 dni pred začetkom preskusa zaradi prilagoditve preskusnih alg preskusnim pogojem in zagotovitve, da so alge v fazi eksponentne rasti, ko se uporabijo za inokulacijo preskusnih raztopin. Biomaso alg je treba prilagoditi, da lahko eksponentna rast do začetka preskusa prevlada v kulturi inokuluma. Kultura inokuluma se inkubira pri enakih pogojih kot preskusne kulture. V kulturi inokuluma se meri porast biomase, da se zagotovi rast znotraj normalnega obsega za preskusni sev v pogojih kultiviranja. Primer postopka za kultiviranje alg je opisan v Dodatku 4. Da ne pride do sinhrone delitve celic med preskusom, se lahko zahteva še drugi korak razmnoževanja kulture inokuluma.

27.

Vse preskusne raztopine morajo vsebovati enake koncentracije gojišč in začetno biomaso preskusnih alg. Preskusne raztopine izbranih koncentracij se navadno pripravijo z mešanjem založne raztopine preskusne kemikalije z gojiščem in kulturo inokuluma. Založne raztopine se navadno pripravijo tako, da se kemikalija raztopi v preskusnem mediju.

28.

Topila, npr. aceton, t-butil alkohol in dimetilformamid, je mogoče uporabljati kot nosilce za dodajanje kemikalij z nizko topnostjo v vodi preskusnemu mediju (2)(3). Koncentracija topila naj ne prekorači 100 μl/l in enaka koncentracija topila naj bo dodana vsem kulturam (tudi kontrolnim) v preskusni seriji.

29.

Preskusne posode se zaprejo z zamaški, ki prepuščajo zrak. Posode se pretresejo in postavijo v inkubator za kultiviranje. Med preskusom je treba imeti alge v suspenziji in omogočiti prenos CO2. V ta namen je potrebno nenehno tresenje ali mešanje. Kulture naj se ohranjajo pri temperaturi med 21 in 24 °C, kontrolirani pri ± 2 °C. Za vrste, ki niso naštete v Dodatku 2, npr. tropske, so lahko primerne višje temperature, pod pogojem, da je mogoče izpolniti merila za veljavnost. Priporočeno je, da se bučke v inkubatorju naključno razporedijo in dnevno prestavljajo.

30.

Vrednost pH kontrolnega medija se med preskusom ne bi smela povečati za več kot 1,5 enote. Za kovine in spojine, ki delno ionizirajo pri vrednosti pH, približno enaki preskusni vrednosti pH, je morda treba omejiti premik (drift) pH, da se zagotovijo ponovljivi in natančni rezultati. Premik za < 0,5 enote pH je tehnično izvedljiv in ga je mogoče doseči tako, da se v preskusni raztopini zagotovi primerna stopnja prenosa mase CO2 iz okoliškega zraka, npr. s povečanjem stopnje tresenja. Druga možnost je zmanjšanje potrebe po CO2 z zmanjšanjem začetne biomase ali skrajšanjem trajanja preskusa.

31.

Površina, na kateri so kulture inkubirane, naj prejema stalno, enotno fluorescentno osvetljenost, npr. ‚hladno belo‘ svetlobo ali ‚dnevno svetlobo‘. Sevi alg in cianobakterij se razlikujejo glede svojih zahtev po svetlobi. Izbrana obsevanost naj ustreza uporabljenemu preskusnemu organizmu. Za priporočene vrste zelenih alg izberite obsevanost na stopnji preskusnih raztopin v območju 60–120 μE·m– 2 s– 1, kadar se z uporabo primernega sprejemnika meri v fotosintetično učinkovitem obsegu valovne dolžine 400–700 nm. Nekatere vrste, zlasti Anabaena flos-aquae, dobro rastejo pri nižjih obsevanostih in se pri visokih obsevanostih lahko poškodujejo. Za takšne vrste naj bo izbrana povprečna obsevanost v območju 40–60 μE·m– 2 · s– 1. (Pri merilnikih svetlobe, umerjenih v luksih, enakovredno območje 4 440–8 880 luksov za hladno belo svetlobo približno ustreza priporočeni obsevanosti 60– 120 μE·m– 2 · s– 1). V inkubacijskem območju vzdržujte obsevanost v razponu ± 15 % povprečne obsevanosti.

32.

Preskus navadno traja 72 ur. Lahko traja tudi več ali manj časa, pod pogojem da so izpolnjena vsa merila za veljavnost, navedena v odstavku 11.

33.

Biomasa alg v vsaki bučki se med preskusnim obdobjem določa najmanj enkrat dnevno. Če se merjenje izvaja na majhnih količinah, vzetih iz preskusne raztopine s pipeto, je treba te ohranjati nespremenjene.

34.

Merjenje biomase se izvaja z ročnim štetjem celic s pomočjo mikroskopa ali z elektronskim števcem delcev (s štetjem celic in/ali biovolumnom). Alternativne tehnike, npr. pretočno citometrijo, klorofilno fluorescenco in vitro ali in vivo (5)(6) ali optično gostoto, se lahko uporabijo, če je mogoče v območju biomase v preskusu ugotoviti zadovoljivo povezavo z biomaso.

35.

Vrednost pH raztopin se izmeri na začetku in koncu preskusa.

36.

Če je na voljo analitski postopek za določanje preskusne kemikalije v uporabljenem razponu koncentracije, je treba preskusne raztopine analizirati, da se preverijo začetne koncentracije in vzdrževanje koncentracij izpostavljenosti med preskusom.

37.

Analiza koncentracije preskusne kemikalije na začetku in koncu preskusa nizke in visoke preskusne koncentracije ter koncentracija okrog pričakovane EC50 lahko zadoščata, če je verjetno, da se bodo koncentracije izpostavljenosti med preskusom od nominalnih vrednosti razlikovale za manj kot 20 %. Analiza vseh preskusnih koncentracij na začetku in koncu preskusa je priporočljiva, če je malo verjetno, da bodo koncentracije ostale znotraj območja 80– 120 % nominalne koncentracije. Za hlapne, neobstojne ali močno adsorptivne preskusne kemikalije se med obdobjem izpostavljenosti priporoča dodatno vzorčenje za analizo v 24-urnih intervalih, da se bolje določijo izgube preskusne kemikalije. Za te kemikalije so morda potrebne posebne ponovitve. V vseh primerih je treba izvesti določanje koncentracije preskusne kemikalije samo na eni ponovitveni posodi pri vsaki preskusni koncentraciji (ali vsebinah posod, zbranih s ponovitvijo).

38.

Preskusno gojišče, pripravljeno posebej za analizo koncentracij izpostavljenosti med preskusom, naj se obravnava enako kot tisto, uporabljeno za preskušanje; npr. naj se inokulira z algami in inkubira pri enakih pogojih. Če je zahtevana analiza raztopljene koncentracije preskusne kemikalije, je morda treba ločiti alge od gojišča. Najbolje je, da se ločitev izvede s centrifugiranjem z nizkim pospeškom g, ki zadošča, da se alge usedejo.

39.

Če so na voljo dokazi, da so se koncentracije preskusne kemikalije zadovoljivo vzdrževale v območju ± 20 % nominalne ali izmerjene začetne koncentracije ves čas preskusa, lahko analiza rezultatov temelji na nominalnih ali izmerjenih začetnih vrednostih. Če odklon od nominalne ali izmerjene začetne koncentracije ni v območju ± 20 %, se analiza rezultatov utemelji na geometrijski srednji koncentraciji med izpostavljenostjo ali na modelih, ki opisujejo upad koncentracije preskusne kemikalije (3)(7).

40.

Preskus zaviranja rasti alge je bolj dinamičen preskusni sistem od večine drugih kratkoročnih preskusov strupenosti za vodno okolje. Posledično je morda težko določiti dejanske koncentracije izpostavljenosti, zlasti za adsorptivne kemikalije, preskušane pri nizkih koncentracijah. Izginevanje preskusne kemikalije iz raztopine z adsorpcijo v naraščajočo biomaso alg v takih primerih ne pomeni, da se je kemikalija izgubila iz preskusnega sistema. Ko je rezultat preskusa analiziran, je treba preveriti, ali upadanje koncentracije preskusne kemikalije med preskusom spremlja upadanje v zaviranju rasti. Če je tako, se lahko prouči uporaba primernega modela, ki opisuje upadanje koncentracije preskusne kemikalije (7). Če ne, je morda primerno utemeljiti analizo rezultatov na začetnih (nominalnih ali izmerjenih) koncentracijah.

41.

Izvesti je treba mikroskopsko opazovanje, da se preveri normalna in zdrava navzočnost kulture inokuluma in opazi vsako nenormalno pojavljanje alg (ki ga lahko povzroči izpostavljenost preskusni kemikaliji) na koncu preskusa.

42.

V nekaterih okoliščinah, npr. kadar predhodni preskus pokaže, da preskusna kemikalija nima strupenih učinkov pri koncentracijah do 100 mg/l ali do svoje meje topnosti v preskusnem mediju (kar je nižje), se lahko izvede mejni preskus, ki vključuje primerjavo odzivov v kontrolni skupini in eni tretirani skupini (100 mg/l ali koncentracija, ki je enaka meji topnosti). Zelo se priporoča, da se ta preskus podpre z analizo koncentracije izpostavljenosti. Za mejni preskus se uporabljajo vsi prej opisani preskusni pogoji in merila za veljavnost, razen da je število tretiranih ponovitev najmanj šest. Spremenljivke odziva v kontrolni in tretirani skupini se lahko analizirajo z uporabo statističnega preskusa za primerjavo sredin, npr. s t-preskusom. Če so variance obeh skupin neenake, je treba izvesti t-preskus, prilagojen za neenake variance.

43.

Biomasa v preskusnih posodah je lahko izražena v enotah nadomestnega parametra, uporabljenega za merjenje (npr. število celic, fluorescenca).

44.

V preglednici se predstavi ocenjena koncentracija biomase v preskusnih kulturah in kontrolnih skupinah skupaj s koncentracijami preskusnega materiala in časom meritev, zabeleženim z ločljivostjo vsaj celih ur, da se izdela izris rastnih krivulj. V tej fazi so lahko uporabne tako logaritemske kot linearne lestvice, vendar so logaritemske lestvice obvezne in na splošno podajo boljšo predstavitev variacij rastnega vzorca med preskusnim obdobjem. Eksponentna rast pri izrisu na logaritemski lestvici kaže ravno črto in naklon (nagib) črte prikazuje specifično hitrost rasti.

45.

Z uporabo izrisov se preveri, ali kontrolne kulture skozi celotni preskus rastejo eksponentno in s pričakovano hitrostjo. Zaradi možnih napak se preverijo vse podatkovne točke in videz krivulj ter neobdelani podatki in postopki. Zlasti se preverijo vse podatkovne točke, za katere se zdi, da odstopajo zaradi sistematične napake. Če je mogoče postopkovne napake očitno prepoznati in/ali so zelo verjetne, se specifična podatkovna točka označi kot osamelec in se ne vključi v kasnejšo statistično analizo. (Koncentracija alg nič v eni od dveh ali treh ponovitvenih posod lahko pokaže, da posoda ni bila pravilno inokulirana ali da je bila neprimerno očiščena.) Razlogi za zavrnitev podatkovnih točk kot osamelcev morajo biti jasno navedeni v poročilu o preskusu. Veljavni razlogi so samo (redko) postopkovne napake, ne pa nenatančnost. Statistični postopki za prepoznavanje osamelcev imajo za to vrsto problema omejeno uporabnost in ne morejo nadomestiti strokovne presoje. Osamelci (označeni kot taki) naj se po možnosti ohranijo med podatkovnimi točkami, ki so prikazane v katerikoli grafični ali tabelarni predstavitvi podatkov.

46.

Namen preskusa je določiti učinke preskusne kemikalije na rast alg. Ta preskusna metoda opisuje dve spremenljivki odziva, saj imajo države članice različne preference in zakonske zahteve. Da bi bili rezultati preskusa sprejemljivi v vseh državah članicah, se morajo učinki ovrednotiti z obema spremenljivkama odziva, (a) in (b), ki sta opisani spodaj.

(a)    Povprečna specifična hitrost rasti : ta spremenljivka odziva se izračuna na osnovi logaritemskega naraščanja biomase med preskusnim obdobjem, ki je izraženo dnevno.

(b)    Prirast : ta spremenljivka odziva je biomasa na koncu preskusa, od katere je odšteta začetna biomasa.

47.

Opozoriti je treba, da vrednosti strupenosti, ki se izračunajo iz teh dveh spremenljivk odziva, niso primerljive. To razliko je treba upoštevati pri uporabi rezultatov preskusa. Če se upoštevajo pogoji preskusa iz te preskusne metode, bodo vrednosti ECx, ki temeljijo na povprečni specifični hitrosti rasti (ErCx), navadno višje od rezultatov, ki temeljijo na prirasti (EyCx), zaradi matematične osnove teh dveh pristopov. To se ne sme razlagati kot razlika v občutljivosti obeh spremenljivk odziva. Razlika enostavno izvira iz različne matematične narave vrednosti. Pojem povprečne specifične hitrosti rasti temelji na splošnem vzorcu eksponentne rasti alg v nelimitiranih kulturah, ko se strupenost ocenjuje na osnovi učinkov na hitrost rasti brez odvisnosti od absolutne ravni specifične hitrosti rasti v kontrolnem vzorcu, naklona krivulje koncentracija-odziv ali od trajanja preskusa. Nasprotno pa so rezultati, ki temeljijo na prirasti kot spremenljivki odziva, odvisni od vseh teh drugih spremenljivk. EyCx je odvisna od specifične hitrosti rasti vrst alg, uporabljenih v vsakem preskusu, in od maksimalne specifične hitrosti rasti, ki je lahko različna glede na vrsto in celo glede na seve alg. Ta spremenljivka odziva se ne uporablja za primerjanje občutljivosti na strupene snovi med vrstami alg ali celo različnimi sevi. Z znanstvenega vidika ima uporaba povprečne specifične hitrosti rasti prednost pri ocenjevanju strupenosti, vendar so ocene strupenosti na osnovi prirasti vključene v to preskusno metodo, da se izpolnijo trenutne zakonske zahteve nekaterih držav.

48.

Povprečna specifična hitrost rasti za določeno obdobje se izračuna kot logaritemsko povečanje biomase za vsako posamezno posodo kontrolnih in tretiranih skupin iz enačbe [1]:

pri čemer je:

Srednja vrednost hitrosti rasti skupaj z ocenami razhajanj se izračuna za vsako tretirano in kontrolno skupino.

49.

Povprečna specifična hitrost rasti se izračuna za celotno preskusno obdobje (navadno dnevi 0–3) z uporabo nominalno inokulirane biomase kot začetne vrednosti in ne izmerjene začetne vrednosti, saj je v tem primeru dosežena večja natančnost. Če oprema za merjenje biomase dopušča zadovoljivo natančno določanje nizke biomase inokuluma (npr. pretočni citometer), potem se lahko uporabi začetna izmerjena koncentracija biomase. Prav tako se ocenijo posamične hitrosti rasti, izračunane kot specifične hitrosti rasti za vsak dan med potekom preskusa (dneve 0– 1, 1–2 in 2–3) in pregleda se, ali kontrolna hitrost rasti ostaja konstantna (glej merila za veljavnost, odstavek 11). Od celotne povprečne specifične hitrosti rasti znatno nižja specifična hitrost rasti prvega dne lahko nakazuje lag fazo (fazo prilagajanja). Medtem ko je lahko lag faza v kontrolnih skupinah s pravilnim razmnoževanjem predkultur zmanjšana in praktično izničena, lahko lag faza v izpostavljenih kulturah nakazuje obnovitev po začetnem toksičnem stresu ali zmanjšani izpostavljenosti zaradi izgube preskusne kemikalije (vključno s sorpcijo na biomaso alg) po začetni izpostavljenosti. Zaradi tega se lahko oceni posamična hitrost rasti, da se ocenijo učinki preskusne kemikalije, ki se pojavijo med obdobjem izpostavljenosti. Znatne razlike med presečno hitrostjo rasti in povprečno hitrostjo rasti kažejo odklon od konstantne eksponentne rasti in da je utemeljeno natančno preverjanje rastnih krivulj.

50.

Odstotek zaviranja hitrosti rasti za vsako tretirano ponovitev se izračuna po enačbi [2]:

pri čemer je:

51.

Če se za pripravo preskusnih raztopin uporabijo topila, naj se pri izračunu odstotka zaviranja namesto kontrol brez topil uporabi kontrole s topilom.

52.

Prirast se računa kot biomasa ob koncu preskusa, od katere je odšteta začetna biomasa za vsako posodo kontrolnega in tretiranega vzorca. Za vsako preskusno koncentracijo in kontrolno skupino se izračuna srednja vrednost prirasti in oceni varianca. Odstotek zaviranja prirasti ( % Iy) se lahko izračuna za vsako tretirano ponovitev po enačbi:

pri čemer je:

53.

Izriše se odstotek zaviranja glede na logaritem koncentracije preskusne kemikalije in se natančno pregleda izris, pri čemer se ne upošteva vsaka takšna podatkovna točka, ki je bila kot osamelec izločena v prvi fazi. Skozi podatkovne točke se potegne ravna črta, in sicer ročno ali z računalniško interpolacijo, da se dobi prvi vtis o razmerju koncentracija-odziv, nato pa se nadaljuje z bolj podrobno metodo, po možnosti z računalniško statistično metodo. Odvisno od predvidene uporabe podatkov, kakovosti (natančnosti) in količine podatkov ter razpoložljivosti orodij za analizo podatkov se je mogoče odločiti (in včasih povsem upravičeno), da se ustavi analiza podatkov na tej stopnji in se preprosto preberejo ključne vrednosti EC50 in EC10 (in/ali EC20) iz ročno narisane krivulje (glej tudi spodnji oddelek o spodbujevalnih učinkih). Utemeljeni razlogi za neuporabo statistične metode lahko vključujejo naslednje:

54.

Cilj je količinsko ovrednotiti odziv na koncentracijo z regresijsko analizo. Lahko se uporabi tehtana linearna regresija, po tem ko se izvede linearizacijska pretvorba podatkov o odzivu – na primer v verjetnostnih ali logističnih ali Weibullovih enotah (8), vendar so nelinearni regresijski postopki prednostne metode, ki bolje obravnavajo neizogibne podatkovne nepravilnosti in odklone od enakomerne porazdelitve. Če se te nepravilnosti približujejo ničelnemu ali popolnemu zaviranju, se lahko s pretvorbo povečajo in ovirajo analizo (8). Upoštevati je treba, da so standardne metode za analizo, ki uporabljajo analize probit, analize logit ali Weibullove pretvorbe, namenjene za uporabo na kvantiziranih podatkih (npr. umrljivost ali preživetje) in morajo biti ustrezno prirejene zaradi upoštevanja podatkov o rasti ali o biomasi. Specifični postopki za določevanje vrednosti ECx iz kontinuiranih podatkov so na voljo v (9), (10) in (11). Uporaba nelinearne regresijske analize je podrobneje opisana v Dodatku 5.

55.

Za vsako analizirano spremenljivko odziva se izračuna točkovna ocena vrednosti ECx, pri čemer se uporabi razmerje med odzivom in koncentracijo. Kadar je to mogoče, se za vsako oceno določi 95-odstotne meje zaupanja. Grafično ali statistično je treba določiti ustreznost prileganja podatkov odziva na regresijski model. Regresijska analiza se mora opraviti na odzivih posameznih ponovitev in ne na srednjih vrednostih tretiranih skupin. Če pa je nelinearno prilagajanje krivulj težavno ali zaradi preveč razpršenih podatkov ne uspe, se težavo lahko zaobide z izvedbo regresije na skupinskih srednjih vrednostih kot praktičnim načinom zmanjševanja vpliva pričakovanih osamelcev. Uporaba te možnosti naj se navede v poročilu kot odmik od normalnega postopka, ker ujemanje krivulje s posamičnimi ponovitvami ni dalo dobrih rezultatov.

56.

Ocene EC50 in meje zaupanja se prav tako lahko pridobi z uporabo linearne interpolacije z metodo vezanja (13), če so razpoložljivi regresijski modeli/metode za podatke neustrezni.

57.

Za ocenjevanje LOEC in zato tudi NOEC za učinke preskusne kemikalije na hitrost rasti je treba primerjati srednje vrednosti tretiranih skupin z uporabo tehnik analize variance (ANOVA). Srednja vrednost za vsako koncentracijo se nato primerja s srednjo vrednostjo kontrole z ustrezno metodo večkratne primerjave ali trendnostnega preskusa. Uporabna sta lahko Dunnettov ali Williamsov preskus (12)(14)(15)(16)(17). Treba je ugotoviti, ali velja domneva homogenosti variance v analizi variance. Ta ocena se lahko izvede grafično ali s formalnim preskusom (17). Primerna preskusa sta preskus po Levenu ali preskus po Bartlettu. Če domneva homogenosti variance ni izpolnjena, lahko to odpravimo z logaritemsko pretvorbo podatkov. Če je heterogenost variance skrajna in je ni mogoče odpraviti s pretvorbo, je treba proučiti možnosti analize z metodami, kot so večstopenjski trendnostni preskusi po Jonkheeru. Dodatna navodila o določanju NOEC so navedena v (11).

58.

Nedavni razvoj znanosti je privedel do priporočila o opuščanju koncepta NOEC in njegovi zamenjavi z regresijsko določenimi točkovnimi ocenami ECx. Za ta preskus alg ni bila določena primerna vrednost x. Primerno je območje od 10 do 20 % (odvisno od izbrane spremenljivke odziva) in po možnosti naj se poroča tako o EC10 kot tudi o EC20.

59.

Pri nizkih koncentracijah je včasih opaženo spodbujanje rasti (negativno zaviranje). To je lahko posledica hormeze (‚spodbujevalni učinek strupenosti‘) ali dodajanja spodbujevalnih rastnih faktorjev s preskusnim materialom minimalnemu uporabljenemu gojišču. Upoštevati je treba, da naj dodajanje anorganskih hranil ne bi imelo nobenih neposrednih učinkov, saj naj bi preskusni medij ohranjal presežek hranil skozi celoten preskus. Nizek odmerek spodbujanja se navadno ne upošteva pri računanju EC50, razen če je zelo velik. Če pa je zelo velik ali če se izračuna vrednost ECx za nizek x, so potrebni posebni postopki. Brisanju spodbujevalnih odzivov iz analize podatkov se je treba izogibati, če je mogoče; če razpoložljiva programska oprema za prilagajanje krivulje ne more sprejeti manjših spodbujanj, je mogoče uporabiti linearno interpolacijo z metodo vezanja. Če je spodbujanje zelo veliko, naj se obravnava model hormeze (18).

60.

Preskusni materiali, ki absorbirajo svetlobo, lahko povzročijo zmanjšanje hitrosti rasti, ker senčenje zmanjša količino razpoložljive svetlobe. Takšne fizikalne učinke je treba s prilagoditvijo preskusnih pogojev ločiti od strupenih učinkov in o njih ločeno poročati. Navodila so navedena v (2) in (3).

61.

V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije:

(1)

Mednarodna organizacija za standardizacijo (1993). ISO 8692 Kakovost vode – Preskus zaviranja rasti sladkovodnih alg.

(2)

Mednarodna organizacija za standardizacijo (1998). ISO/DIS 14442. Kakovost vode – Smernice za preskuse zaviranja rasti alg s slabo topnimi materiali, hlapnimi spojinami, kovinami in odpadno vodo.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, št. 23. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(4)

Mednarodna organizacija za standardizacijo (1998). ISO 5667-16 Kakovost vode – Vzorčenje – 16. del: Navodilo za biološke preskuse vzorcev.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R., in Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.

(6)

Slovacey, R. E., in Hanna, P. J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919–925

(7)

Simpson, S. L., Roland, M. G. E., Stauber, J. L., in Batley, G. E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Environ. Chem. 22: 2073–2079.

(8)

Christensen, E. R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713–718.

(9)

Nyholm, N., Sørensen, P. S., Kusk, K. O., in Christensen, E. R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Environ. Chem. 11: 157– 167.

(10)

Bruce, R. D., in Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Environ. Chem. 11: 1485– 1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj, Pariz.

(12)

Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096– 1121.

(13)

Norberg-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05–88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.

(15)

Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103– 117.

(16)

Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531.

(17)

Draper, N. R., in Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, druga izdaja. Wiley, New York.

(18)

Brain, P., in Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 209 (2010). Opisana preskusna metoda ocenjuje učinek kemikalije na mikroorganizme iz aktivnega blata (večinoma bakterije) z merjenjem hitrosti dihanja (oksidacije ogljika in/ali amonija) v določenih pogojih pri različnih koncentracijah preskusne kemikalije. Ta metoda temelji na preskusu ETAD (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing Industry – Združenja za ekologijo in toksikologijo industrije proizvodnje barvil) (1)(2), na prejšnji smernici OECD TG 209 (3) in na revidiranem standardu ISO 8192 (4). Namen tega preskusa je omogočiti hitro presejalno metodo, s katero je mogoče oceniti vplive kemikalij na mikroorganizme aktivnega blata v biološki (aerobni) fazi čistilnih naprav za odpadne vode. Rezultati tega preskusa lahko služijo tudi kot kazalnik ustreznih koncentracij preskusnih kemikalij, ki niso zaviralne, za uporabo v preskusih biološke razgradljivosti (na primer poglavja C.4 A–F, C.9, C.10, C.12 in C.29 te priloge, OECD TG 302C). V tem primeru se preskus lahko izvede kot presejalni, podobno kot preskus za določanje območja delovanja ali mejni preskus (glej odstavek 39), pri čemer se upošteva samo celotno dihanje. Vendar je treba te informacije pri preskusih lahke biološke razgradljivosti (poglavji C.4 A–F in C.29 te priloge), za katere je koncentracija inokuluma znatno nižja od koncentracije, uporabljene pri tej preskusni metodi, vzeti z rezervo. Vsekakor odsotnost zaviranja pri tem preskusu dihanja ne pomeni samodejno, da bodo pogoji pri preskusu lahke biološke razgradljivosti iz poglavja C.4 A–F ali C.29 te priloge nezaviralni.

2.

V splošnem se zdi, da je bil preskus zaviranja dihanja, odkar je bil prvič objavljen, uspešno uporabljen, v nekaterih primerih pa je bilo poročano o lažnih rezultatih (2)(4)(5). Od koncentracije odvisne krivulje dihanja so včasih dvofazne, krivulje odmerek-odziv se popačijo in vrednosti EC50 so nepričakovano nizke (5). Preiskave so pokazale, da do takih rezultatov pride, če aktivno blato v preskusih znatno nitrira in če ima preskusna kemikalija na oksidacijo amonija večji vpliv kot na splošno heterotrofno oksidacijo. Te lažne rezultate je zato mogoče preseči z dodatnim preskušanjem, pri katerem se uporabi ustrezen zaviralec nitrifikacije. Z merjenjem hitrosti privzema kisika v prisotnosti in odsotnosti takšnega zaviralca, npr. n-aliltiouree (ATU), je mogoče ločeno izračunati skupno, heterotrofno in nitrifikacijsko hitrost privzema kisika (4)(7)(8). Tako je mogoče določiti zaviralne učinke preskusne kemikalije na dveh procesih in na običajen način izračunati vrednosti EC50 za oksidacijo organskega ogljika (heterotrofno) in oksidacijo amonija (nitrifikacijo). Opozoriti je treba, da je v nekaterih redkih primerih zaviralni učinek n-aliltiouree delno ali popolnoma izničen zaradi kompleksacije s preskusnimi kemikalijami ali dodatki gojišču, npr. z ioni Cu++ (6). Ioni Cu++ so bistveni za bakterije vrste Nitrosomonas, vendar so v višjih koncentracijah strupeni.

3.

Potreba po nitrifikaciji pri aerobnem čiščenju odpadnih voda kot nujni korak pri odstranjevanju dušikovih spojin iz odpadnih voda z denitrifikacijo plinastih produktov je postala nuja, še posebej v evropskih državah; Evropska unija je zdaj za koncentracijo dušika v prečiščenih iztokih, odvajanih v sprejemne vode, določila nižje meje (5).

4.

Za večino namenov zadošča že samo metoda ocenjevanja vpliva na procese oksidacije organskega ogljika. Vendar pa je v nekaterih primerih za razlago rezultatov in razumevanje vplivov potrebna preiskava vpliva samo na nitrifikacijo ali pa na oboje, nitrifikacijo in oksidacijo organskega ogljika, pri čemer se to izvede ločeno.

5.

Hitrost dihanja vzorcev aktivnega blata, hranjenega s hranili iz sintetičnih odplak, se meri po treh urah stika v zaprti celici, ki vsebuje kisikovo elektrodo. Ob upoštevanju realističnega scenarija izpostavljenosti so lahko primerni daljši časi stika. Če se preskusna kemikalija hitro razkraja, npr. abiotsko s hidrolizo, ali če je hlapna in koncentracije ni mogoče zadovoljivo vzdrževati, je čas izpostavljenosti lahko krajši, npr. 30 minut. Občutljivost vsake šarže aktivnega blata je treba na dan izpostavljenosti preveriti s primerno referenčno kemikalijo. Preskus se običajno uporablja za določanje ECx (npr. EC50) preskusne kemikalije in/ali koncentracije brez opaznega učinka (NOEC).

6.

Zaviranje privzema kisika z mikroorganizmi, ki oksidirajo organski ogljik, je mogoče izraziti ločeno od tistega z mikroorganizmi, ki oksidirajo amonij, in sicer z merjenjem hitrosti privzema kisika v prisotnosti in odsotnosti n-aliltiouree, posebnega zaviralca oksidacije amonija v nitrit, ki na prvi stopnji poteka z nitrifikacijskimi bakterijami. V tem primeru se odstotek zaviranja hitrosti privzema kisika izračuna s primerjavo hitrosti privzema kisika v prisotnosti preskusne kemikalije s srednjo vrednostjo hitrosti privzema kisika ustreznih kontrol, ki ne vsebujejo preskusne kemikalije, v prisotnosti in odsotnosti specifičnega zaviralca, n-aliltiouree.

7.

Z določanjem hitrosti v zmeseh preskusne kemikalije, gojišča iz sintetičnih odplak in vode, pri čemer se zanemari aktivno blato, je mogoče zaznati kakršen koli privzem kisika, ki izvira iz abiotskih procesov.

8.

Za pravilno razlago rezultatov morajo biti znani identifikacija (po možnosti številka CAS), poimenovanje (IUPAC), čistost, topnost v vodi, parni tlak, hlapnost in adsorpcijske lastnosti preskusne kemikalije. Hlapnih kemikalij običajno ni mogoče zadovoljivo preskusiti, če niso upoštevani posebni varnostni ukrepi (glej odstavek 21).

9.

Preskusno metodo je mogoče uporabiti pri vodotopnih, slabo topnih in hlapnih kemikalijah. Vendar pa pri kemikalijah z omejeno topnostjo ni vedno mogoče pridobiti vrednosti EC50, veljavne rezultate pri hlapnih kemikalijah pa je mogoče pridobiti le, če večina (recimo > 80 %) preskusne kemikalije ob koncu obdobij izpostavljenosti ostane v reakcijski zmesi. Če obstaja kakršna koli negotovost glede stabilnosti preskusne kemikalije ali njene hlapnosti, je treba za natančnejšo določitev koncentracije ECx predložiti dodatne analitske podporne podatke.

10.

Za zagotovitev zanesljivosti preskusne metode in preskusnih pogojev ter za preverjanje občutljivosti vsake šarže aktivnega blata, ki se na dan izpostavljenosti uporablja kot mikrobni inokulum, je treba referenčne kemikalije redno preskušati. Kot referenčna zaviralna kemikalija se priporoča 3,5-diklorofenol (3,5-DCP), saj je znan zaviralec dihanja in se uporablja pri mnogih vrstah preskusov zaviranja/strupenosti (4). Kot referenčno kemikalijo pri zaviranju celotnega dihanja (9) je mogoče uporabiti tudi bakrov (II) sulfat pentahidrat. Kot specifični referenčni zaviralec nitrifikacije se lahko uporabi N-metilanilin (4).

11.

Hitrost privzema kisika slepe kontrole (brez preskusne ali referenčne kemikalije) ne sme biti manjša od 20 mg kisika na gram aktivnega blata (suhe teže suspendiranih trdnih snovi) v eni uri. Če je hitrost nižja, je treba preskus ponoviti s spranim aktivnim blatom ali blatom iz drugega vira. Koeficient variacije hitrosti privzema kisika pri kontrolnih ponovitvah na koncu dokončnega preskusa ne sme biti večji od 30 %.

12.

V mednarodnem krožnem preskusu, ki ga je leta 2004 organizirala Mednarodna organizacija za standardizacijo ISO (4) in v kateri je bilo uporabljeno aktivno blato iz gospodinjskih odplak, je bilo ugotovljeno, da se vrednost EC50 kemikalije 3,5-DCP pri celotnem dihanju giblje med 2 mg/l in 25 mg/l, pri heterotrofnem dihanju med 5 mg/l in 40 mg/l in pri nitrifikacijskem dihanju med 0,1 mg/l in 10 mg/l. Če vrednost EC50 kemikalije 3,5-DCP ni v pričakovanem območju, je treba preskus ponoviti z aktivnim blatom iz drugega vira. Vrednost EC50 bakrovega (II) sulfata pentahidrata mora biti za celotno dihanje v območju med 53 mg/l in 155 mg/l (9).

13.

Uporabljena mora biti običajna laboratorijska oprema in naslednje:

14.

Vseskozi je treba uporabljati analitsko čiste reagente.

15.

Uporabljati je treba destilirano ali deionizirano vodo, ki vsebuje manj kot 1 mg/l raztopljenega organskega ogljika (DOC), razen če je navedeno, naj se uporablja neklorirana vodovodna voda.

16.

Gojišče mora biti pripravljeno tako, da vsebuje naslednje sestavine v navedenih količinah:

17.

Vrednost pH te raztopine mora biti 7,5 ± 0,5. Če se pripravljeno gojišče ne uporabi takoj, ga je treba najdlje en teden hraniti v temi pri temperaturi od 0 °C do 4 °C ali v pogojih, ki ne povzročajo nikakršnih sprememb v njegovi sestavi. Opozoriti je treba, da so te sintetične odplake 100-kratni koncentrat odplak, opisanih v Tehničnem poročilu OECD z naslovom ‚Predlagana metoda za določitev biološke razgradljivosti površinsko aktivnih snovi, uporabljenih v sintetičnih detergentih‘ z dne 11. junija 1976, tudi z dodatkom dikalijevega hidrogen fosfata.

18.

Druga možnost je, da se sestavine gojišča pred shranitvijo sterilizirajo posamezno ali pa se tik pred izvajanjem preskusa dodata pepton in mesni ekstrakt. Pred uporabo je treba gojišče dobro premešati, vrednost pH pa po potrebi prilagoditi na 7,5 ± 0,5.

19.

Založna raztopina mora biti pripravljena za preskusne snovi, ki so brez težav topne v vodi, samo do največje topnosti v vodi (oborine niso sprejemljive). Snovi, ki so slabo topne v vodi, zmesi, katerih sestavine imajo različno topnost v vodi, in adsorptivne snovi je treba odtehtati neposredno v preskusne posode. V teh primerih je druga možnost lahko uporaba založnih raztopin, če so raztopljene koncentracije preskusnih kemikalij analitsko določene v preskusnih posodah (pred dodajanjem aktivnega blata). Če so pripravljeni pripravki Water Accommodated Fraction (WAF), je nujna tudi analitska določitev raztopljenih koncentracij preskusnih kemikalij v preskusnih posodah. Pri uporabi organskih topil se je treba izogibati disperzijskim sredstvom/emulgatorjem. Obdelava založnih raztopin z ultrazvokom in predhodno mešanje suspenzij, npr. čez noč, sta možna, če je na voljo dovolj informacij o stabilnosti preskusne kemikalije v takšnih pogojih.

20.

Preskusna kemikalija lahko škodljivo vpliva na vrednost pH v preskusnem sistemu. Vrednost pH zmesi, obdelanih s preskusno kemikalijo, je treba določiti pred pripravo preskusa, v predhodnem preskusu, da se določi, ali je vrednost pH pred glavnim preskusom in še enkrat na dan glavnega preskusa treba prilagoditi. Raztopine/suspenzije preskusne kemikalije v vodi morajo biti pred dodajanjem inokuluma po potrebi nevtralizirane. Ker pa lahko nevtralizacija spremeni kemijske lastnosti kemikalije, se lahko, odvisno od namena študije, izvede dodatno preskušanje, s katerim se oceni učinek preskusne kemikalije na blato brez prilagoditve vrednosti pH.

21.

Strupeni učinki hlapnih kemikalij lahko zaradi izgub snovi v obdobju izpostavljenosti povzročijo, da so ravni učinkov različne, še posebej pri preskusih, pri katerih zrak skozi sistem steče v obliki mehurčkov. Pri takšnih snoveh je potrebna previdnost; pri kontrolnih zmeseh, ki vsebujejo snov, je treba izvesti specifično analizo za snov in spremeniti režim prezračevanja.

22.

Če se kot referenčna kemikalija uporablja 3,5-diklorofenol, je treba pripraviti raztopino 1,00 g 3,5-diklorofenola v 1 000 ml vode (15). Za pospešitev raztapljanja in dopolnitev raztopine do volumna, ko se raztopina ohladi na sobno temperaturo, je treba uporabiti toplo vodo in/ali obdelavo z ultrazvokom. Vendar je treba poskrbeti, da se struktura referenčne kemikalije ne spremeni. Treba je preveriti vrednost pH raztopine in jo po potrebi prilagoditi z NaOH ali H2SO4 tako, da vrednost pH znaša 7–8.

23.

Če se kot referenčna kemikalija uporablja bakrov (II) sulfat pentahidrat, se uporabijo koncentracije 58 mg/l, 100 mg/l in 180 mg/l (faktor 1,8). Snov se tehta neposredno v preskusnih posodah (29–50–90 mg za celoten volumen 500 ml). Nato se raztopi z 234 ml avtoklavirane vodovodne vode. Bakrov (II) sulfat pentahidrat je zlahka topen. Ob začetku preskusa je dodanih 16 ml sintetičnih odplak in 250 ml aktivnega blata.

24.

Pripraviti je treba založno raztopino 2,32 g n-aliltiouree (ATU) na liter. Z dodajanjem 2,5 ml te založne raztopine zmesi za inkubacijo s končno prostornino 500 ml znaša končna koncentracija 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l); znano je, da to zadošča (4) za 100-odstotno zaviranje nitrifikacije v nitrifikacijskem aktivnem blatu, ki vsebuje 1,5 g/l suspendiranih trdnih snovi.

25.

Pri nekaterih pogojih, ki se sicer redko pojavijo, lahko preskusna kemikalija z močno izraženimi redukcijskimi lastnostmi povzroči merljiv abiotski privzem kisika. V takih primerih so za razlikovanje med abiotsko porabo kisika preskusne kemikalije in mikrobnim dihanjem potrebne abiotske kontrole. Abiotske kontrole je mogoče pripraviti z izpustitvijo inokuluma iz preskusnih zmesi. Podobno je abiotske kontrole brez inokuluma mogoče vključiti pri izvajanju podpornih analitskih meritev za določanje dosežene koncentracije med preskusnim obdobjem izpostavljenosti, npr. pri uporabi založnih raztopin kemikalij, ki so slabo topne v vodi, skupaj s sestavinami, ki imajo drugačno topnost v vodi. V posebnih primerih je morda treba pripraviti abiotsko kontrolo s steriliziranim inokulumom (npr. z avtoklaviranjem ali dodajanjem sterilizirajočih strupenih snovi). Nekatere kemikalije lahko proizvajajo ali porabljajo kisik le, če je površina dovolj velika za reakcijo, tudi če zanjo običajno potrebujejo precej višjo temperaturo ali tlak. V tem pogledu je treba posebno pozornost nameniti snovem s peroksidno vezjo. Sterilizirani inokulum zagotavlja veliko površino.

26.

Za splošno uporabo je treba aktivno blato zbrati na izhodu ali v bližini izhoda prezračevalnega bazena dobro delujoče čistilne naprave za odpadne vode, ki v glavnem sprejema gospodinjske odplake. Glede na namen preskusa je mogoče pri primernih koncentracijah suspendiranih trdnih snovi, ki znašajo od 2 g/l do 4 g/l, uporabiti tudi druge primerne vrste virov aktivnega blata, npr. blato, vzgojeno v laboratoriju. Vendar pa bodo vrste blata iz drugih čistilnih naprav najverjetneje imele drugačne lastnosti in občutljivost.

27.

Blato je mogoče uporabiti tako, kot je bilo zbrano, vendar je treba odstraniti grobe delce s kratkotrajnim usedanjem, ki traja npr. od 5 do 15 minut, poleg tega pa je treba tudi odliti ali presejati (npr. z mrežo, katere odprtine merijo 1 mm2) zgornje plasti drobnejših trdih delcev. Druga možnost je homogeniziranje blata v mešalu pribl. 15 sekund ali dlje, vendar je pri tem potrebna previdnost v zvezi s strižnimi silami in spremembami temperature, do katerih lahko pride pri daljšem mešanju.

28.

Blato je pogosto treba oprati, npr. če je hitrost endogenega dihanja nizka. Blato je treba najprej nekaj časa, npr. 10 minut, centrifugirati pri pribl. 10 000 m/s2, da nastaneta čist supernatant in pelet trdnih snovi iz odplak. Tekočino supernatanta je treba zavreči, blato pa z mešanjem ponovno suspendirati v neklorirani vodovodni vodi; vodo za pranje je nato s ponovnim centrifugiranjem treba odstraniti in jo ponovno zavreči. Po potrebi je treba postopek pranja in centrifugiranja ponoviti. Določiti je treba suho maso znanega volumna ponovno suspendiranega blata, blato pa je treba koncentrirati z odstranitvijo bistre raztopine nad usedlino ali pa ga dodatno razredčiti v neklorirani vodovodni vodi, tako da bo koncentracija trdnih snovi v blatu dosegla zahtevano vrednost 3 g/l. Aktivno blato je treba pri preskusni temperaturi nenehno prezračevati (npr. s hitrostjo 2 l/minuto) in ga, kadar je le mogoče, uporabiti na dan zbiranja. Če to ni mogoče, je treba blatu dva dodatna dneva vsak dan dovajati hranila iz sintetičnih odplak (50 ml hranila iz sintetičnih odplak/liter aktivnega blata). Blato se nato uporabi za preskus, rezultati pa so sprejeti kot veljavni, če ni prišlo do nobenih pomembnih sprememb v njegovi aktivnosti, ki se ocenijo prek hitrosti endogenega heterotrofnega in nitrifikacijskega dihanja.

29.

Če se med inkubacijo pojavi penjenje v takšni meri, da so pena in trdne snovi v blatu, ki jih pena nosi, iztisnjene iz prezračevalnih posod, lahko pride do težav. Občasno se penjenje pojavi samo zato, ker so prisotne sintetične odplake, če pa je preskusna kemikalija površinsko aktivna snov ali če preskusna kemikalija vsebuje površinsko aktivno snov, je penjenje treba pričakovati. Zaradi izgube trdnih snovi v blatu iz preskusnih zmesi pride do umetno znižane hitrosti dihanja, kar se lahko napačno razlaga kot rezultat zaviranja. Poleg tega prezračevanje raztopine površinsko aktivne snovi skoncentrira površinsko aktivno snov v plasti pene; zaradi izgube pene iz preskusnega sistema se bodo koncentracije izpostavljenosti znižale. Penjenje je mogoče nadzorovati s preprostimi mehanskimi metodami (npr. z občasnim ročnim mešanjem s stekleno paličico) ali pa z dodajanjem antipenilca iz silikonske emulzije brez površinsko aktivne snovi in/ali z metodo prezračevanja s stresanjem bučke. Če je težava povezana s prisotnostjo sintetičnih odplak, je treba sestavo odplak spremeniti z dodajanjem antipenilca v razmerju npr. 50 μl/l. Če penjenje povzroča preskusna kemikalija, je treba količino, potrebno za zmanjšanje penjenja, določiti pri maksimalni preskusni koncentraciji, nato pa morajo biti vse posamezne prezračevalne posode enako obdelane (vključno s tistimi, ki npr. vsebujejo slepe kontrole, in referenčnimi posodami, v katerih ni pene). Če se uporabljajo antipenilci, ne sme priti do interakcije z inokulumom in/ali preskusno kemikalijo.

30.

Določiti je mogoče zaviranje pri treh različnih privzemih kisika: pri celotni porabi, samo pri heterotrofni porabi in pri porabi, do katere pride zaradi nitrifikacije. Običajno zadošča merjenje zaviranja celotnega privzema kisika. Treba je poznati učinke na heterotrofni privzem kisika, ki nastanejo zaradi oksidacije organskega ogljika in oksidacije amonija, če za določeno kemikalijo obstaja posebna zahteva za dve takšni ločeni končni točki ali (neobvezno) za razlago atipičnih krivulj ‚odmerek-odziv‘ zaradi zaviranja celotnega privzema kisika.

31.

Preskus je treba izvesti pri temperaturi v območju 20 ± 2 °C.

32.

Za pridobitev različnih nominalnih koncentracij preskusne kemikalije (za primere prostornin sestavin glej preglednico 1) je treba pripraviti preskusne zmesi (FT, kot je navedeno v preglednici 1), ki vsebujejo vodo, hranila iz sintetičnih odplak in preskusno kemikalijo. Vrednost pH mora biti po potrebi spremenjena na 7,5 ± 0,5; da bodo končne prostornine v posodah enake in da bo mogoče začeti prezračevanje, je treba zmesi razredčiti z vodo in dodati inokulum.

33.

Zmesi (FR) morajo biti z referenčno kemikalijo, npr. s 3,5-diklorofenolom, ki nadomešča preskusno kemikalijo, pripravljene na enak način kot preskusne zmesi.

34.

Slepe kontrole (FB) morajo biti v preskusih, pri katerih so preskusne čaše v časovnih razmikih pripravljene zaporedno, pripravljene na začetku in na koncu obdobja izpostavljenosti. Pri preskusih, izvajanih z opremo, ki omogoča sočasne meritve porabe kisika, je treba v vsako serijo sočasne analize vključiti vsaj dve slepi kontroli. Slepe kontrole vsebujejo enako količino aktivnega blata in sintetičnega gojišča, ne pa preskusne ali referenčne kemikalije. Treba jih je razredčiti z vodo do enake prostornine, kot jo imajo preskusne in referenčne zmesi.

35.

Če je znano ali če se domneva, da ima preskusna kemikalija močno izražene redukcijske lastnosti, je treba za merjenje abiotske porabe kisika po potrebi pripraviti zmes FA. Zmes mora imeti enake količine preskusne kemikalije in hranil iz sintetičnih odplak ter enako prostornino kot preskusne zmesi, vendar brez aktivnega blata.

36.

Preskusne zmesi, referenčne zmesi ter slepe in abiotske kontrole se inkubirajo pri preskusni temperaturi v pogojih prisiljenega prezračevanja (od 0,5 do 1 l/min), da se koncentracija raztopljenega kisika ohranja nad 60–70-odstotno nasičenostjo in da kosmi blata ostajajo v suspenziji. Za to, da kosmi blata ostajajo v suspenziji, je treba kulture tudi mešati. Velja, da se inkubacija začne z začetnim stikom inokuluma aktivnega blata z drugimi sestavinami končne zmesi. Ob koncu inkubacije, po določenem času izpostavljenosti, ki navadno znaša 3 ure, se odvzamejo vzorci za merjenje hitrosti upadanja koncentracije raztopljenega kisika v celici, zasnovani za ta namen (slika 2 v Dodatku 3), ali v do konca napolnjeni BPK-steklenici. Način, na katerega se inkubacije začnejo, je odvisen tudi od zmogljivosti opreme, uporabljene pri merjenju hitrosti porabe kisika. Če jo na primer sestavlja ena sama kisikova sonda, se meritve izvajajo posamezno. V tem primeru morajo biti pripravljene različne zmesi, potrebne za preskus v sintetičnih odplakah, inokulum pa je treba zadržati in v vsako posodo serije je treba dodati zahtevane odmerke blata. Inkubacije se morajo začenjati po vrsti, v ustrezno določenih časovnih razmikih, ki znašajo npr. od 10 do 15 minut. Namesto tega lahko sistem za merjenje sestavlja več sond, ki omogočajo več sočasnih meritev; v tem primeru je mogoče inokulum v ustrezne skupine posod dodati hkrati.

37.

Koncentracija aktivnega blata v vseh preskusnih, referenčnih in slepih zmeseh (ne pa v abiotskih kontrolah) nominalno znaša 1,5 g/l suspendiranih trdnih snovi. Porabo kisika je treba izmeriti po 3 urah izpostavljenosti. Izvesti je treba dodatne, 30-minutne meritve izpostavljenosti, kot je ustrezno in opisano zgoraj v odstavku 5.

38.

Za ugotavljanje, ali blato nitrificira in če da, s kakšno hitrostjo, je treba pripraviti zmesi (FB) kot v slepi kontroli in dodatne ‚kontrolne‘ zmesi (FN), ki pa vsebujejo tudi n-aliltioureo v koncentraciji 11,6 mg/l. Zmesi je treba 3 ure zračiti in inkubirati pri 20 ± 2 °C. Nato je treba izmeriti hitrosti privzema kisika in izračunati hitrost privzema kisika zaradi nitrifikacije.

39.

Predhodni preskus se po potrebi uporablja za ocenjevanje območja koncentracij preskusne kemikalije, potrebne pri dokončnem preskusu za ugotavljanje zaviranja porabe kisika. Druga možnost je, da odsotnost zaviranja porabe kisika preskusne kemikalije v predhodnem preskusu lahko kaže na nepotrebnost dokončnega preskusa, vendar je treba vključiti tri ponovitve pri najvišji preskušani koncentraciji predhodnega preskusa (običajno 1 000 mg/l, odvisno pa je od zahteve po podatkih).

Preglednica 1

Primeri zmesi za predhodni preskus

40.

Preskus je treba izvesti z vsaj tremi koncentracijami preskusne kemikalije, na primer 10 mg/l, 100 mg/l in 1 000 mg/l, s slepo kontrolo in po potrebi z vsaj tremi abiotskimi kontrolami z najvišjimi koncentracijami preskusne kemikalije (kot primer glej preglednico 1). V idealnem primeru najnižja koncentracija ne bi smela imeti nikakršnega učinka na privzem kisika. Izračunati je treba hitrosti porabe kisika in hitrost nitrifikacije, če je to smiselno; nato je treba izračunati odstotek zaviranja. Odvisno od namena preskusa je mogoče tudi samo določiti strupenost mejne koncentracije, npr. 1 000 mg/l. Če pri tej koncentraciji ni nobenega statistično značilnega strupenega učinka, nadaljnje preskušanje pri višjih ali nižjih koncentracijah ni potrebno. Velja pripomniti, da je treba snovi, ki so slabo topne v vodi, zmesi, katerih sestavine imajo različno topnost v vodi, in adsorptivne snovi odtehtati neposredno v preskusne posode. V tem primeru je treba količino, rezervirano za založno raztopino preskusne snovi, nadomestiti z vodo za redčenje.

41.

Preskus je treba izvesti s serijo koncentracij, izpeljanih iz predhodnega preskusa. Za pridobitev vrednosti NOEC in ECx (npr. EC50) se v večini primerov priporoča šest kontrolnih koncentracij in pet koncentracij tretiranih vzorcev v geometrijski vrsti s petimi ponovitvami. Abiotske kontrole ni treba ponavljati, če v predhodnem preskusu ni bilo privzema kisika, če pa pride do znatnega privzema, je treba vključiti abiotske kontrole za vsako koncentracijo preskusne kemikalije. Občutljivost blata je treba preveriti z referenčno kemikalijo 3,5-diklorofenol. Občutljivost blata je treba preveriti za vsako preskusno serijo, saj je znano, da se spreminja. V vseh primerih se za merjenje hitrosti privzema kisika v celici s kisikovo elektrodo vzorci iz preskusnih posod odvzamejo po 3 urah in, po potrebi, dodatnih 30 minutah. Iz zbranih podatkov se izračunajo specifične hitrosti dihanja kontrolnih in preskusnih zmesi; odstotek zaviranja se nato izračuna na podlagi spodnje enačbe 7.

42.

Z uporabo posebnega zaviralca nitrifikacije, ATU, je mogoča neposredna ocena zaviralnih učinkov preskusnih kemikalij na heterotrofno oksidacijo, z odštetjem hitrosti privzema kisika v prisotnosti ATU od celotne hitrosti privzema (brez prisotnosti ATU) pa je mogoče izračunati učinke na hitrost nitrifikacije. Treba je pripraviti dve seriji reakcijskih zmesi v skladu z načrti preskusov za vrednost ECx ali NOEC, opisano v odstavku 41, dodatno pa mora biti vsaki zmesi ene serije pri končni koncentraciji 11,6 mg/l dodana ATU, ki dokazano popolnoma zavira nitrifikacijo v blatu s koncentracijami suspendiranih trdnih snovi do 3 000 mg/l (4). Po obdobju izpostavljenosti je treba izmeriti hitrosti privzema kisika; te neposredne vrednosti predstavljajo le heterotrofno dihanje, razlika med njimi in ustreznimi hitrostmi celotnega dihanja pa predstavlja nitrifikacijo. Nato se izračunajo različne stopnje zaviranja.

43.

Po obdobju(-ih) izpostavljenosti je treba vzorec iz prve prezračevalne posode prenesti v celico s kisikovo elektrodo (slika 1 v Dodatku 2) in takoj izmeriti koncentracijo raztopljenega kisika. Če je na voljo sistem z več elektrodami, je mogoče meritve izvesti sočasno. Mešanje (s prekritim magnetom) je nujno pri isti hitrosti kot takrat, ko se elektroda umerja; s tem se zagotovi, da se sonda na spreminjajoče se koncentracije kisika odziva z minimalno zamudo in da so omogočene redne in ponovljive meritve kisika v merilni posodi. Navadno zadošča sistem s samodejno mešalno sondo, ki ga imajo nekatere kisikove elektrode. Med meritvami je treba celico splakniti z vodo. Namesto tega se za polnjenje BPK-steklenice (slika 2 v Dodatku 3), opremljene z magnetnim mešalom, lahko uporabi vzorec. Nato je treba v vrat steklenice vstaviti kisikovo sondo s prilagoditvijo v obliki obojke in zagnati magnetno mešalo. V obeh primerih je treba nenehno meriti koncentracijo raztopljenega kisika in jo določeno obdobje, običajno 5– 10 minut ali dokler koncentracija kisika ne pade pod 2 mg/l, beležiti. Elektrodo je treba odstraniti, zmes vrniti v prezračevalno posodo, če pa so nujne meritve po daljšem obdobju izpostavljenosti, je treba nadaljevati s prezračevanjem in mešanjem.

44.

Pri nekaterih namenih je morda nujno merjenje koncentracije preskusne kemikalije v preskusnih posodah. Če se uporabljajo založne raztopine:

je treba opozoriti, da raztopljeni del ni znan in da tudi ni znana prava koncentracija preskusne kemikalije, ki je prenesena v preskusne posode. Za opis izpostavljenosti je nujna analitična ocena koncentracij preskusne kemikalije v preskusnih posodah. Zaradi poenostavitve je treba analitično oceno izvesti pred dodajanjem inokuluma. Ker bodo v preskusne posode preneseni le raztopljeni deli, bodo izmerjene koncentracije morda zelo nizke.

45.

Da se izognemo časovno potratnim in dragim analizam, je preskusno kemikalijo priporočljivo samo odtehtati neposredno v preskusne posode in se za poznejše izračune zanesti na prvotno tehtano nominalno koncentracijo. Razlikovanje med raztopljenimi, neraztopljenimi in adsorbiranimi deli preskusne kemikalije ni potrebno, ker se vsi ti deli prav tako pojavljajo v resničnih pogojih v čistilni napravi za odpadne vode in se lahko spreminjajo glede na sestavo odplak. Cilj te metode je realistična ocena neinhibitorne koncentracije in ni primerna za podrobno raziskovanje tega, kateri deli prispevajo k zaviranju organizmov v aktivnem blatu. Na koncu je treba neposredno v preskusnih posodah tehtati tudi adsorptivne snovi, posode pa je treba silanizirati, da so izgube, ki nastanejo zaradi adsorpcije, kar najmanjše.

46.

Hitrosti privzema kisika je treba izračunati iz srednje vrednosti izmerjenih vrednosti, npr. iz linearnega dela krivulj koncentracije kisika v odvisnosti od časa, s čimer se omeji izračune na koncentracije kisika med 2,0 mg/l in 7,0 mg/l, saj lahko višje in nižje koncentracije vplivajo na hitrosti porabe. Odklonu v razpone koncentracije pod ali nad temi vrednostmi se občasno ni mogoče izogniti in je nujen, na primer, kadar je dihanje močno zadušeno in zato zelo počasno ali pa, če določeno aktivno blato diha zelo hitro. To je sprejemljivo, če so podaljšani deli krivulje privzema ravni in se njihovi nakloni ob prehodu meje 2,0 mg/l ali 7,0 mg/l O2 ne spreminjajo. Vsi ukrivljeni deli krivulje kažejo, da se sistem za merjenje stabilizira ali pa, da se hitrost privzema spreminja in se je ne sme uporabiti pri izračunu hitrosti dihanja. Hitrost privzema kisika mora biti izražena v miligramih na liter na uro (mg/lh) ali v miligramih na gram suhega blata na uro (mg/gh). Hitrost porabe kisika, R, v mg/lh je mogoče izračunati ali interpolirati iz linearnega dela krivulje zabeleženega upada kisika v skladu z enačbo 1:

pri čemer je:

47.

Specifična hitrost dihanja (Rs) je izražena kot količina kisika, porabljenega na gram suhe teže blata na uro (mg/gh) v skladu z enačbo 2:

pri čemer je SS koncentracija suspendiranih trdnih snovi v preskusni zmesi (g/l).

48.

Različni kazalniki R, ki jih je mogoče kombinirati, so:

49.

Razmerje med celotnim dihanjem (RT), nitrifikacijskim dihanjem (RN) in heterotrofnim dihanjem (RH) je podano z enačbo 3:

pri čemer je:

50.

To razmerje velja za vrednosti slepih kontrol (RNB, RTB, RHB), abiotskih kontrol (RNA, RTA, RHA) in preskusov s preskusnimi kemikalijami (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Specifične hitrosti dihanja se izračunajo iz enačb:

51.

Če je vrednost RN v predhodnem preskusu zanemarljiva (npr. < 5 % RT v slepih kontrolah), je mogoče predpostaviti, da je heterotrofni privzem kisika enak celotnemu privzemu in da ni prišlo do nitrifikacije. Če bi morali preskusi upoštevati učinke na heterotrofne in nitrifikacijske mikroorganizme, bi bil potreben alternativni vir aktivnega blata. Dokončni preskus se izvede, če so na voljo dokazi o zadušenih hitrostih privzema kisika pri drugih koncentracijah preskusne kemikalije.

52.

Odstotek zaviranja, IT, celotne porabe kisika pri vsaki koncentraciji preskusne kemikalije je podan z enačbo 7:

53.

Podobno je odstotek zaviranja heterotrofnega privzema kisika, IH, pri vsaki koncentraciji preskusne kemikalije podan z enačbo 8:

54.

Zaviranje privzema kisika zaradi nitrifikacije, IN, je pri vsaki koncentraciji podano z enačbo 9:

55.

Odstotek zaviranja privzema kisika je treba izrisati v odvisnosti od logaritma koncentracije preskusne kemikalije (krivulja zaviranja, glej sliko 3 v Dodatku 4). Krivulje zaviranja se izrišejo za vsako 3-urno obdobje prezračevanja ali dodatno po 30 minutah. Koncentracijo preskusne kemikalije, ki zavira privzem kisika za 50 % (EC50), je treba iz krivulje izračunati ali pridobiti z interpolacijo. Če so na voljo primerni podatki, je mogoče izračunati ali z interpolacijo pridobiti 95-odstotne meje zaupanja vrednosti EC50, naklon krivulje in primerne vrednosti, ki označujejo začetek območja zaviranja (na primer, EC10 ali EC20) in konec območja zaviranja (na primer, EC80 ali EC90).

56.

Treba je opozoriti, da je z vidika variabilnosti, ki jo je mogoče pogosto opaziti pri rezultatih, v mnogih primerih dovolj dodatno izraziti rezultate po velikosti:

57.

Vrednosti ECx, vključno z njihovimi pripadajočimi zgornjimi in spodnjimi 95-odstotnimi mejami zaupanja za parameter, se izračunajo z ustreznimi statističnimi metodami (npr. z analizo probit, logistično ali Weibullovo funkcijo, prilagojeno metodo Spearman-Karber ali enostavno interpolacijo (11)). Vrednost ECx je pridobljena tako, da je v navedeno enačbo vstavljena vrednost, ki ustreza x % srednje vrednosti kontrole. Za izračun vrednosti EC50 ali katere koli druge vrednosti ECx je treba srednjo vrednost glede na tretirano skupino (x) analizirati z regresijsko analizo.

58.

Če je statistična analiza namenjena določanju vrednosti NOEC, je potrebna statistika glede na posodo (posamezne posode se štejejo za ponovitve). Uporabljene morajo biti ustrezne statistične metode glede na dokument OECD z naslovom ‚Sodobni pristopi pri statistični analizi podatkov o ekotoksičnosti: smernice za uporabo‘ (11). V splošnem se s pomočjo enostransko zastavljenega (manj obsežnega) preskušanja domnev pri p ≤ 0,05 proučijo škodljivi učinki preskusne kemikalije v primerjavi s kontrolo.

59.

Poročilo o preskusu mora vključevati naslednje informacije:

(1)

Brown, D., Hitz, H. R., in Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245–261.

(2)

King, E. F., in Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27–39.

(3)

OECD (1984). Aktivno blato, preskus zaviranja dihanja. Smernica za preskušanje št. 209, Smernice za preskušanje kemikalij, OECD, Pariz.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Kakovost vode – Preskus inhibicije porabe kisika z aktivnim blatom za oksidacijo ogljika in amonija. Mednarodna organizacija za standardizacijo.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Dokument ISO/TC147/WGI/N.183. Mednarodna organizacija za standardizacijo.

(6)

Painter, H. A, Jones, K. (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471–483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515–524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig, S., in Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13, št. 12b: 1556–1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v vodi slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove biorazgradljivosti v vodi. Mednarodna organizacija za standardizacijo.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment, št. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Pariz.

1.

Ta preskusna metoda je enakovredna Smernici za preskušanje OECD (TG) 221 (2006). Zasnovana je za določanje strupenosti kemikalij za sladkovodne rastline iz rodu Lemna (vodolečevke). Temelji na obstoječih metodah (1)(2)(3)(4)(5)(6), vendar zaradi upoštevanja nedavnih raziskav in posvetovanj o številnih ključnih vprašanjih vključuje spremembe navedenih metod. Ta preskusna metoda je bila validirana v mednarodnem krožnem preskusu (7).

2.

Ta preskusna metoda opisuje preskušanje strupenosti z organizmoma Lemna gibba in Lemna minor. Oba organizma sta bila obsežno proučena in sta predmet zgoraj navedenih standardov. Taksonomija vrst Lemna je težavna zaradi prisotnosti velike množice fenotipov. Čeprav lahko pride do genetske variabilnosti kot odziv na strupene snovi, trenutno ni dovolj podatkov o tej vrsti variabilnosti, na podlagi katerih bi bilo za to preskusno metodo mogoče priporočiti uporabo specifičnega klona. Opozoriti je treba, da se preskus ne opravlja aksenično, temveč se med preskusom uporabljajo ukrepi za čim manjšo kontaminacijo z drugimi organizmi.

3.

Podrobno je opisano preskušanje z obnavljanjem preskusne raztopine (polstatično ali pretočno) ali brez obnavljanja le-te (statično). Glede na cilje preskusa in zakonske zahteve je priporočljivo proučiti možnosti uporabe polstatičnih ali pretočnih metod, npr. za kemikalije, ki hitro izginjajo iz raztopine zaradi izhlapevanja, svetlobne razgradnje, obarjanja ali biorazgradnje. Več smernic je na voljo v (8).

4.

Uporabljene opredelitve so navedene v Dodatku 1.

5.

Kulturam rastlin iz rodu Lemna v eksponentni fazi rasti se omogoči, da sedem dni rastejo kot monokulture v prisotnosti različnih koncentracij preskusne snovi. Cilj preskusa je količinsko opredeliti učinke kemikalije na vegetativno rast v tem obdobju na osnovi izbranih merjenih spremenljivk. Primarna merjena spremenljivka je število listov. Poleg nje se meri vsaj še ena merjena spremenljivka (skupna površina listov, suha ali sveža teža), saj lahko nekatere kemikalije bolj vplivajo na druge merjene spremenljivke kot na število listov. Učinki, ki so odvisni od kemikalije, se količinsko opredelijo tako, da se rast v preskusni raztopini primerja z rastjo kontrol, nato pa se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje rasti (npr. 50-odstotno). Ta koncentracija se izrazi kot ECx (npr. EC50).

6.

Končna točka preskusa je zaviranje rasti, ki je izraženo kot logaritemsko povečanje merjene spremenljivke (povprečne specifične hitrosti rasti) v obdobju izpostavljanja. Iz povprečnih specifičnih hitrosti rasti, zabeleženih v nizu preskusnih raztopin, se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje hitrosti rasti (npr. 50-odstotno); ta koncentracija se izrazi kot ErCx (npr. ErC50).

7.

Dodatna spremenljivka odziva, ki se uporablja v tej preskusni metodi, je prirast, ki jo je morda treba določiti, da se izpolnijo specifične zakonske zahteve nekaterih držav. Določi se kot vrednost merjenih spremenljivk na koncu obdobja izpostavljanja, od česar se odšteje vrednost merjenih spremenljivk na začetku obdobja izpostavljanja. Iz prirasti, zabeležene v nizu preskusnih raztopin, se določi koncentracija, ki je povzročila navedeno x-odstotno zaviranje prirasti (npr. 50-odstotno); ta koncentracija se izrazi kot EyCx (npr. EyC50).

8.

Poleg navedenega se lahko statistično določita tudi najnižja koncentracija z opaznim učinkom (LOEC) in koncentracija brez opaznega učinka (NOEC).

9.

Na voljo mora biti analitska metoda z zadostno občutljivostjo za kvantifikacijo kemikalije v preskusnem mediju.

10.

Podatki o preskusni kemikaliji, ki so morda uporabni za določitev preskusnih pogojev, so med drugim strukturna formula, čistost, topnost v vodi, obstojnost v vodi in na svetlobi, pKa, Kow, parni tlak in biorazgradljivost. Topnost v vodi in parni tlak se lahko uporabita za izračun Henryjeve konstante, ki pokaže, ali so v časovnem obdobju preskusa verjetne bistvene izgube preskusne kemikalije. To pripomore k odločitvi o uvedbi posameznih postopkov za nadzorovanje takšnih izgub. Če so podatki o topnosti in obstojnosti preskusne kemikalije negotovi, je priporočljivo, da se te vrednosti določijo v pogojih preskusa, tj. v gojišču, pri temperaturi in režimu osvetljevanja, ki se uporabijo v preskusu.

11.

Kadar je zlasti pomembno nadzorovanje vrednosti pH preskusnega medija, npr. pri preskušanju kovin ali kemikalij, ki so hidrolitično neobstojne, je priporočljivo dodajanje pufra v gojišče (glej odstavek 21). Več smernic za preskusne kemikalije s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskušanje oteženo, je navedenih v (8).

12.

Za veljavnost preskusa mora biti podvojitveni čas števila listov v kontrolnem vzorcu krajši od 2,5 dni (60 ur), kar ustreza približno sedemkratnemu povečanju v sedmih dneh in povprečni specifični hitrosti rasti 0,275 dan– 1. Ta kriterij je mogoče doseči z mediji in preskusnimi pogoji, ki so opisani v tej preskusni metodi, ter statičnim preskusnim režimom (5). Pričakovati je, da bo ta kriterij dosegljiv tudi v polstatičnih in pretočnih pogojih preskusa. Izračun podvojitvenega časa je prikazan v odstavku 49.

13.

Referenčne kemikalije, kot je na primer 3,5-diklorofenol, ki se uporablja za mednarodni krožni preskus (7), se lahko preskušajo z namenom preverjanja preskusnega postopka. Referenčno kemikalijo je priporočljivo preskusiti najmanj dvakrat letno oz. vzporedno z določanjem strupenosti preskusne snovi, kadar se preskušanja opravljajo redkeje.

14.

Vsa oprema v stiku s preskusnimi mediji mora biti izdelana iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala. Steklovino za gojenje in preskušanje je treba očistiti kemijskih onesnaževal, ki bi se lahko sprala v preskusni medij; steklovina mora biti sterilna. Preskusne posode morajo biti dovolj široke, da listi posameznih kolonij v posodah kontrol rastejo brez prekrivanja do konca preskusa. Ni pomembno, ali se korenine dotikajo dna preskusnih posod, vendar je najmanjša priporočljiva globina vsake preskusne posode 20 mm, najmanjša priporočljiva prostornina vsake preskusne posode pa 100 ml. Če so te zahteve izpolnjene, izbira preskusnih posod ni ključna. Kot primerne so se izkazale steklene čaše, kristalizacijske posodice in steklene petrijevke ustreznih mer. Preskusne posode morajo biti pokrite, da se čim bolj zmanjšata izhlapevanje in nenamerna kontaminacija, hkrati pa se omogoči potrebna izmenjava zraka. Primerne preskusne posode in zlasti pokrovi ne smejo senčiti ali spremeniti spektralnih lastnosti svetlobe.

15.

Kulture in preskusne posode se ne smejo hraniti skupaj. To je najbolje doseči z ločenimi okoljskimi gojitvenimi komorami, inkubatorji ali prostori. Omogočeno mora biti nadzorovanje osvetljenosti in temperature ter ohranjanje teh parametrov na konstantni ravni (glej odstavka 35 in 36).

16.

V tem preskusu se uporabi Lemna gibba ali Lemna minor. Kratki opisi vrst vodne leče, ki so bile uporabljene pri preskušanju strupenosti, so navedeni v Dodatku 2. Rastlinski material je možno dobiti iz zbirke kultur, drugega laboratorija ali na terenu. Če se rastlinski material odvzame na terenu, je treba rastline najmanj osem tednov pred uporabo ohranjati v kulturi v istem mediju, v kakršnem se uporablja za preskus. Terenska mesta, kjer se jemljejo začetne kulture, morajo biti brez očitnih virov kontaminacije. Če se kulture pridobijo iz drugega laboratorija ali zbirke kultur, jih je treba na podoben način ohranjati najmanj tri tedne. V poročilu je treba vedno navesti v preskusu uporabljen vir rastlinskega materiala ter vrsto in klon (če sta znana).

17.

Uporabiti je treba monokulture, za katere se s prostim očesom oceni, da niso kontaminirane z drugimi organizmi, npr. algami in praživalmi. Zdrave rastline vrste L. minor bodo sestavljale kolonije, ki imajo od dva do pet listov. Zdrave kolonije vrste L. gibba pa lahko imajo do sedem listov.

18.

Kakovost in enakomernost rastlin, ki se uporabijo v preskusu, bosta pomembno vplivali na izid preskusa, zato je treba rastline natančno izbrati. Uporabiti je treba mlade, hitrorastoče rastline brez vidnih lezij ali sprememb barve (kloroze). Kulture dobre kakovosti nakazuje visoka pojavnost kolonij, ki imajo najmanj dva lista. Veliko število posameznih listov kaže na okoljski stres, npr. omejitev hranil, in rastlinski material, katerega kulture se ne smejo uporabiti za preskušanje.

19.

Kulture se lahko hranijo pri zmanjšani osvetljenosti in znižani temperaturi (4–10 °C), da se zmanjša pogostnost vzdrževanja kultur (npr. kadar se za neko obdobje ne načrtuje preskusov z vrsto Lemna). Podrobnosti gojenja so navedene v Dodatku 3. Kadar se pojavijo očitni znaki kontaminacije z algami ali drugimi organizmi, je morda treba podvzorec listov vodne leče površinsko sterilizirati ter nato prenesti v svež medij (glej Dodatek 3). V tem primeru je treba preostalo kontaminirano kulturo zavreči.

20.

Najmanj sedem dni pred preskušanjem je treba zadostno število kolonij aseptično prenesti v svež sterilni medij in gojiti 7–10 dni v pogojih preskusa.

21.

Kot je opisano spodaj, so za Lemna minor in Lemna gibba priporočeni različni mediji. Natančno je treba proučiti vključitev pufra v preskusni medij (MOPS (4-morfolinpropan sulfonska kislina, št. CAS: 1132-61-2) v medij za L. minor in NaHCO3 v medij za L. gibba), kadar sumimo, da bi lahko reagiral s preskusno kemikalijo in vplival na izražanje njene strupenosti. Če so izpolnjena merila za veljavnost, je sprejemljiv tudi medij po Steinbergu (9).

22.

Za gojenje L. minor in preskušanje z L. minor je priporočljiva modifikacija gojišča za vodno lečo iz švedskega standarda (SIS). Sestava tega medija je navedena v Dodatku 4.