PRILOGA I

METODE VZORČENJA

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Vzorci za uradni nadzor krme se jemljejo v skladu s spodaj opisanimi metodami. Tako dobljeni vzorci se obravnavajo kot reprezentativni za vzorčene deleže.

2.   OSEBJE, KI JEMLJE VZORCE

Vzorce jemljejo osebe, ki jih za to pooblastijo države članice.

3.   OPREDELITEV POJMOV

Vzorčeni delež: količina proizvoda, ki predstavlja enoto in ima značilnosti, ki se obravnavajo kot enotne.

Posamični vzorec: količina, ki se vzame iz ene točke vzorčenega deleža.

Skupni vzorec: skupek posamičnih vzorcev, vzetih iz istega vzorčenega deleža.

Zmanjšan skupni vzorec: reprezentativni del skupnega vzorca, dobljen iz slednjega s postopkom redukcije.

Končni vzorec: del zmanjšanega skupnega vzorca ali homogeniziranega skupnega vzorca.

4.   OPREMA

4.1	Oprema za vzorčenje mora biti izdelana iz snovi, ki ne morejo onesnažiti proizvodov, katerih vzorci se jemljejo. Takšno opremo lahko države članice uradno odobrijo.

4.2   Priporočena oprema za vzorčenje trdne krme

4.2.1   Ročno vzorčenje

4.2.1.1

Lopatka z ravnim dnom in navpičnimi stranicami.

4.2.1.2

Sonda za vzorčenje z dolgo režo ali razdelki. Dimenzije sonde za vzorčenje morajo ustrezati značilnostim vzorčenega deleža (globina posode, velikost vreče itd.) in velikosti delcev krme.

4.2.2   Mehansko vzorčenje

Za vzorčenje premikajoče se krme se lahko uporablja odobrena mehanska oprema.

4.2.3   Razdelilnik

Naprava, namenjena za delitev vzorca na približno enake dele, ki se lahko uporablja za jemanje posamičnih vzorcev ter za pripravo zmanjšanih skupnih in končnih vzorcev.

5.   KOLIČINSKE ZAHTEVE

5.A	Pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi.
5.A.1	Vzorčeni delež Velikost vzorčenega deleža mora biti takšna, da se lahko vzorči vsak njegov sestavni del.
5.A.2	Posamični vzorci
5.A.2.1	Razsuta krma:	Najmanjše število posamičnih vzorcev:
5.A.2.1.1	vzorčeni deleži, ki ne presegajo 2,5 tone	7
5.A.2.1.2	vzorčeni deleži, ki presegajo 2,5 tone	√ 20-kratnik teže vzorčenega deleža (1) v tonah, do največ 40 posamičnih vzorcev
5.A.2.2	Pakirana krma:	Najmanjše število paketov za vzorčenje (2):
5.A.2.2.1	Paketi, težji od 1 kg:
5.A.2.2.1.1	vzorčeni deleži iz 1 do 4 paketov	vsi paketi
5.A.2.2.1.2	vzorčeni deleži iz 5 do 16 paketov	4
5.A.2.2.1.3	vzorčeni deleži iz več kot 16 paketov	√ število paketov, ki sestavljajo vzorčeni delež (1), do največ 20 paketov
5.A.2.2.2	Paketi, težki do 1 kg	4
5.A.2.3	Tekoča ali poltekoča krma:	Najmanjše število posod za vzorčenje (2):
5.A.2.3.1	posode s prostornino več kot 1 liter:
5.A.2.3.1.1	vzorčeni deleži iz 1 do 4 posod	vse posode
5.A.2.3.1.2	vzorčeni deleži iz 5 do 16 posod	4
5.A.2.3.1.3	vzorčeni deleži iz več kot 16 posod	√ število posod, ki sestavljajo vzorčeni delež (1), do največ 20 posod
5.A.2.3.2	Posode s prostornino do 1 litra	4
5.A.2.4	Krmni bloki in mineralni lizalni kamni	Najmanjše število blokov ali lizalnih kamnov za vzorčenje (2): 1 blok ali lizalni kamen na vzorčeni delež s 25 enotami, do največ 4 bloki ali lizalni kamni
5.A.3	Skupni vzorec: zahtevan je en skupni vzorec na vzorčeni delež. Skupno število posamičnih vzorcev, ki sestavljajo skupni vzorec, ne sme biti manjše kot:
5.A.3.1	razsuta krma	4 kg
5.A.3.2	pakirana krma:
5.A.3.2.1	paketi, težji od 1 kg	4 kg
5.A.3.2.2	paketi, težki do 1 kg	teža vsebine 4 izvirnih paketov
5.A.3.3	Tekoča ali poltekoča krma:
5.A.3.3.1	posode s prostornino več kot 1 liter	4 litre
5.A.3.3.2	posode s prostornino do 1 litra	količina vsebine 4 izvirnih paketov
5.A.3.4	Krmni bloki ali mineralni lizalni kamni:
5.A.3.4.1	teže več kot 1 kg po kosu	4 kg
5.A.3.4.2	teže do 1 kg po kosu	teža štirih izvirnih blokov ali lizalnih kamnov
5.A.4	Končni vzorci Iz skupnega vzorca se po potrebi po redukciji oblikuje končni vzorec. Zahtevana je analiza vsaj enega končnega vzorca. Količina končnega vzorca za analizo ne sme biti manjša od:
	trdna krma	500 g
	tekoča ali poltekoča krma	500 ml
5.B	Pri nadzoru nezaželenih snovi ali proizvodov, za katere obstaja verjetnost, da bodo neenakomerno porazdeljeni po krmi, kot so aflatoksini, rženi rožički, ricinus in krotalarija v posamičnih krmilih (3)
5.B.1	Vzorčeni delež: glej 5.A.1
5.B.2	Posamični vzorci
5.B.2.1	Razsuta krma: glej 5.A.2.1
5.B.2.2	Pakirana krma:	Najmanjše število paketov za vzorčenje:
5.B.2.2.1	vzorčeni deleži iz 1 do 4 paketov	vsi paketi
5.B.2.2.2	vzorčeni deleži iz 5 do 16 paketov	4
5.B.2.2.3	vzorčeni deleži iz več kot 16 paketov	√ število paketov, ki sestavljajo vzorčeni delež (1), do največ 40 paketov
5.B.3	Skupni vzorci Število skupnih vzorcev je odvisno od velikosti vzorčenega deleža. Najmanjše število skupnih vzorcev na vzorčeni delež je navedeno spodaj. Skupna teža posamičnih vzorcev, ki sestavljajo vsak skupni vzorec, ne sme biti manjša od 4 kg:
5.B.3.1	Razsuta krma
	Teža vzorčenega deleža v tonah:	Najmanjše število skupnih vzorcev na vzorčen delež:
	do vključno 1	1
	več kot 1 in do vključno 10	2
	več kot 10 in do vključno 40	3
	več kot 40	4
5.B.3.2	Pakirana krma
	Število paketov vzorčenega deleža:	Najmanjše število skupnih vzorcev na vzorčen delež:
	1 do 16	1
	17 do 200	2
	201 do 800	3
	več kot 800	4
5.B.4	Končni vzorci Iz vsakega skupnega vzorca se po zmanjšanju oblikuje končni vzorec. Zahteva se analiza vsaj enega končnega vzorca na vzorčeni delež. Teža končnega vzorca za analizo ne sme biti manjša od 500 g.

6.   NAVODILA ZA JEMANJE, PRIPRAVO IN PAKIRANJE VZORCEV

6.1   Splošno

Vzorci se morajo jemati in pripravljati v najkrajšem možnem času, pri tem pa se morajo upoštevati vsi potrebni previdnostni ukrepi za preprečitev spremembe ali onesnaženja proizvoda. Instrumenti ter površine in posode, namenjeni za sprejem vzorcev, morajo biti čisti in suhi.

6.2   Posamični vzorci

6.2.A   Pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi

Posamični vzorci morajo biti vzeti naključno iz celega vzorčenega deleža in morajo biti približno enako veliki.

6.2.A.1   Razsuta krma

Vzorčeni delež se razdeli na približno enake namišljene dele. Število delov, ki ustreza zahtevanemu številu posamičnih vzorcev v skladu s točko 5.A.2, se izbere naključno in iz vsakega od njih se vzame vsaj en vzorec.

Po potrebi se lahko vzorčenje opravi med premikanjem (nakladanjem ali razkladanjem) vzorčenega deleža.

6.2.A.2   Pakirana krma

Po izbiri zahtevanega števila paketov za vzorčenje, kot je navedeno v točki 5.A.2, se del vsebine vsakega paketa odstrani s sondo ali lopatko. Po potrebi se paketi izpraznijo ločeno in šele nato vzamejo vzorci. V vsakem posameznem skupnem vzorcu se kakršne koli grude razbijejo po potrebi z ločevanjem in vrnitvijo v vzorec.

6.2.A.3   Homogenizirana ali za homogeniziranje primerna tekoča ali poltekoča krma

Po izbiri zahtevanega števila posod za vzorčenje iz točke 5.A.2 se vsebina po potrebi homogenizira in iz vsake posode se vzame določena količina.

Posamični vzorci se lahko vzamejo, ko se posoda izprazni.

6.2.A.4   Tekoča ali poltekoča krma, ki ni primerna za homogeniziranje

Po izbiri zahtevanega števila posod za jemanje vzorcev iz točke 5.A.2 se vzorci vzamejo z različnih ravni.

Vzorci se lahko vzamejo tudi, ko se posoda izprazni, vendar se prvi deli zavržejo.

Vsa odvzeta količina v nobenem primeru ne sme biti manjša od 10 litrov.

6.2.A.5   Krmni bloki in mineralni lizalni kamni

Po izbiri zahtevanega števila blokov ali lizalnih kamnov za vzorčenje iz točke 5.A.2 se vzame del vsakega bloka ali lizalnega kamna.

6.2.B   Pri nadzoru nezaželenih snovi ali proizvodov, za katere obstaja verjetnost, da bodo neenakomerno porazdeljeni po krmi, kot so aflatoksini, rženi rožički, ricinus in krotalarija v posamičnih krmilih

Vzorčeni delež se razdeli na približno enake namišljene dele, ki ustrezajo številu skupnih vzorcev iz točke 5.B.3. Če je to število višje od ena, se skupno število posamičnih vzorcev iz točke 5.B.2 približno enakomerno razdeli po različnih delih. Nato se vzamejo približno enako veliki vzorci (4), ki morajo biti takšni, da skupna količina v vzorcih iz vsakega dela ni manjša od najmanj 4 kg, kolikor se zahteva za vsak skupni vzorec. Posamični vzorci, odvzeti iz različnih delov, se ne združijo v skupni vzorec.

6.3   Priprava skupnih vzorcev

6.3.A   Pri nadzoru snovi ali proizvodov, ki so enakomerno porazdeljeni po krmi

Posamični vzorci se zmešajo, da sestavljajo skupni vzorec.

6.3.B   Pri nadzoru nezaželenih snovi ali proizvodov, za katere obstaja verjetnost, da bodo neenakomerno porazdeljeni po krmi, kot so aflatoksini, rženi rožički, ricinus in krotalarija v posamičnih krmilih

Posamični vzorci iz vsakega dela vzorčenega deleža se zmešajo in pripravi se število skupnih vzorcev iz točke 5.B.3, pri čemer je treba zabeležiti izvor vsakega skupnega vzorca.

6.4   Priprava končnih vzorcev

Material v vsakem skupnem vzorcu se previdno zmeša, da nastane homogeniziran vzorec (5). Po potrebi se skupni vzorec najprej zmanjša na najmanj 2 kg ali 2 litra (zmanjšan skupni vzorec), in sicer z uporabo mehanskega ali avtomatskega razdelilnika ali razdelitvijo na četrtine.

Nato se pripravijo vsaj trije končni vzorci, ki so približno enako veliki in ustrezajo količinskim zahtevam iz točke 5.A.4 ali 5.B.4. Vsak vzorec se shrani v ustrezno posodo. Sprejeti je treba vse potrebne previdnostne ukrepe, da se med prevozom ali shranjevanjem prepreči kakršna koli sprememba sestave vzorca, onesnaženje ali mešanje.

6.5   Pakiranje končnih vzorcev

Posode ali paketi se zapečatijo in označijo z etiketami (celotna etiketa mora biti vključena v pečat) tako, da jih ni mogoče odpreti, ne da bi se pri tem poškodoval pečat.

7.   EVIDENTIRANJE VZORČENJA

Vsako vzorčenje je treba evidentirati, tako da se lahko vsak vzorčeni delež nedvoumno prepozna.

8.   POŠILJANJE VZORCEV

Za vsak skupni vzorec se v pooblaščeni laboratorij za analizo v najkrajšem možnem času pošlje najmanj en končni vzorec skupaj z vsemi informacijami, ki jih potrebuje oseba, ki izvaja analizo.

---

(1)  Kadar število ni celo število, se zaokroži navzgor na naslednje celo število.

(2)  Za pakete ali posode, katerih vsebina ne presega 1 kg ali 1 litra, ter za bloke ali lizalne kamne, ki posamično ne tehtajo več kot 1 kg, je vsebina posamičnega vzorca en izvirni paket ali izvirna posoda, en blok ali en kamen.

(3)  Metode iz 5.A se uporabljajo za nadzor aflatoksinov, rženih rožičkov, ricinusa in krotalarije pri popolnih in dopolnilnih krmnih mešanicah.

(4)  Pri pakirani krmi se po ločeni izpraznitvi paketov vsebina paketov za vzorčenje po potrebi odstrani s sondo ali lopatko.

(5)  V vsakem posameznem skupnem vzorcu se kakršne koli grude razbijejo (po potrebi z ločevanjem in vrnitvijo v vzorec).

PRILOGA II

SPLOŠNE DOLOČBE O ANALITSKIH METODAH ZA KRMO

A.   PRIPRAVA VZORCEV ZA ANALIZO

1.   Namen

Spodaj navedeni postopki opisujejo pripravo končnih vzorcev za analizo, ki se pošljejo nadzornim laboratorijem po vzorčenju v skladu z določbami iz Priloge I.

Ti vzorci se morajo pripraviti tako, da so natehtane količine, določene za analitske metode, homogene in reprezentativne za končne vzorce.

2.   Previdnostni ukrepi

Postopek za pripravo vzorca je odvisen od uporabljene analitske metode. Zato je zelo pomembno zagotoviti, da je postopek za pripravo vzorca primeren za uporabljeno analitsko metodo.

Vse potrebne operacije se morajo izvesti tako, da se čim bolj prepreči onesnaženje vzorca in sprememba njegove sestave.

Drobljenje, mešanje in sejanje se izvedejo na najhitrejši možni način, tako da je vzorec čim manj izpostavljen zraku in svetlobi. Mlini in drobilci, ki verjetno znatno segrejejo vzorec, se ne uporabljajo.

Krmo, ki je posebej občutljiva na toploto, je priporočljivo drobiti ročno. Pri delu z opremo se zagotovi, da ni vir onesnaženja z elementi v sledovih.

Če pri pripravi ni možno preprečiti bistvene spremembe vsebnosti vlage v vzorcu, je treba v skladu z metodo iz dela A Priloge III določiti vsebnost vlage pred in po pripravi.

3.   Postopek

Vzorec se z ustreznimi tehnikami delitve, kot sta izmenično odvzemanje vzorca z zajemalko ali odvzemanje vzorca ob stacionarnem ali rotacijskem mešanju, razdeli na ustrezne manjše vzorce za analizo in za referenčne vzorce. Stožčasta delitev vzorca ali delitev vzorca v četrtine nista priporočljivi, ker se lahko pojavijo hude napake v cepitvi podvzorcev. Referenčni vzorec je treba hraniti v primerno čisti in suhi posodi z neprepustnim zamaškom, manjše dele, ki tehtajo vsaj 100 g, pa je treba pripraviti za analizo, kakor je navedeno v nadaljnjem besedilu.

3.1   Krma, ki jo je mogoče drobiti kot tako

Če v analitski metodi ni navedeno drugače, se po drobljenju celoten vzorec po potrebi preseje s sitom s kvadratnimi odprtinami 1 mm (v skladu s priporočilom ISO R565). Izogibati se je treba prekomernemu drobljenju.

Presejani vzorec se premeša in zbere v primerno čisto in suho posodo z neprepustnim zamaškom. Tik preden se natehta količina za analizo, se vzorec še enkrat premeša.

3.2   Krma, ki jo je mogoče drobiti po sušenju

Če v analitski metodi ni navedeno drugače, se vzorec v skladu s postopkom za predhodno sušenje iz točke 4.3 metode za določanje vsebnosti vlage iz dela A Priloge III suši toliko časa, da se vsebnost vlage zniža na 8–12 %. Nato se nadaljuje, kakor je navedeno v oddelku 3.1.

3.3   Tekoča ali poltekoča krma

Vzorec se zbere v primerno čisto in suho posodo z neprepustnim zamaškom. Tik preden se natehta količina za analizo, se vzorec še enkrat dobro premeša.

3.4   Druga krma

Vzorci, ki se ne morejo pripraviti v skladu z enim izmed zgoraj navedenih postopkov, se obdelajo po katerem koli drugem postopku, ki zagotavlja, da bo količina vzorca, natehtana za analizo, homogena in reprezentativna za končne vzorce.

4.   Shranjevanje vzorcev

Vzorci se morajo hraniti pri temperaturi, ki ne bo spremenila njihove sestave. Vzorci, namenjeni za analizo vitaminov ali snovi, ki so posebno občutljive na svetlobo, se hranijo v posodah iz rjavega stekla.

B.   DOLOČBE O REAGENTIH IN OPREMI, KI SE UPORABLJAJO PRI ANALITSKIH METODAH

1.	Če v analitskih metodah ni posebej določeno, morajo biti vsi reagenti za analizo analitsko čisti (a.č.). Pri analiziranju sledov se mora čistost reagentov preveriti s slepim preskusom. Glede na dobljene rezultate je morda potrebno dodatno čiščenje reagentov.

2.

Pri vseh postopkih analitskih metod, ki vključujejo pripravo raztopin, razredčevanje, spiranje ali izpiranje in pri katerih vrsta uporabljenega topila ali razredčila ni navedena, se mora uporabiti voda. Praviloma je voda demineralizirana ali destilirana. V posameznih primerih, ki so posebej navedeni v analitskih metodah, jo je treba prečistiti s posebnimi postopki.

3.	Ob upoštevanju opreme, ki je ponavadi prisotna v kontrolnih laboratorijih, so pri analitskih metodah navedeni le posebni instrumenti in naprave ali tisti, ki zahtevajo posebno uporabo. Biti morajo čisti, zlasti pri določanju zelo nizkih količin snovi.

C.   UPORABA ANALITSKIH METOD IN PRIKAZ REZULTATOV

1.   Postopek ekstrakcije

Pri številnih metodah je določen poseben postopek ekstrakcije. Praviloma se lahko uporabijo postopki ekstrakcije, ki se razlikujejo od postopka iz metode, če je za uporabljeni postopek učinkovitost ekstrakcije za analizirano matrico dokazano enakovredna postopku iz metode.

2.   Postopek čiščenja

Pri številnih metodah je določen poseben postopek čiščenja. Praviloma se lahko uporabijo drugi postopki čiščenja, ki se razlikujejo od postopka iz metode, če je za uporabljeni postopek analitska učinkovitost čiščenja za analizirano matrico dokazano enakovredna postopku iz metode.

3.   Poročanje o uporabljeni analitski metodi

Na splošno je za določanje vsake snovi v krmi določena ena sama metoda. Kadar je določenih več metod, mora kontrolni laboratorij v poročilu o analizi navesti, katero metodo je uporabil.

4.   Število določanj

Rezultat, naveden v poročilu o analizi, je srednja vrednost vsaj dveh določanj z zadovoljivo ponovljivostjo, izvedenih na ločenih vzorčenih deležih.

Vendar pri analizi nezaželenih snovi, če je rezultat prvega določanja bistveno (> 50 %) nižji od specifikacije, ki se nadzira, dodatna določanja niso potrebna, če so bili uporabljeni ustrezni kakovostni postopki.

Pri nadzoru navedene vsebnosti snovi ali sestavine, če rezultat prvega določanja potrdi navedeno vsebnost, tj. rezultat analize je znotraj sprejemljivih meja odstopanja navedene vsebnosti, dodatna določanja niso potrebna, če so bili uporabljeni ustrezni kakovostni postopki.

V nekaterih primerih je ta sprejemljiva meja odstopanja opredeljena v zakonodaji, kot je Direktiva Sveta 79/373/EGS (1).

5.   Poročanje o rezultatih analize

Rezultat analize se prikaže tako, kakor je navedeno v analitski metodi, na primerno število decimalk, in se po potrebi popravi glede na vsebnost vlage v končnem vzorcu pred pripravo.

6.   Nezanesljivost meritve in popravek za izkoristek pri analizi nezaželenih snovi

V zvezi z nezaželenimi snovmi po Direktivi 2002/32/ES, vključno z dioksini in dioksinom podobnimi PCB, se proizvod, namenjen za živalsko krmo, šteje za neskladnega z določeno najvišjo vsebnostjo, če rezultat analize presega najvišjo vsebnost ob upoštevanju razširjene nezanesljivosti meritve in popravka za izkoristek. Za oceno skladnosti se uporabi analizirana koncentracija s popravkom za izkoristek, od katere se odšteje razširjena nezanesljivost meritve. Ta postopek se uporabi le v primerih, kadar analitska metoda omogoča oceno nezanesljivosti meritve in popravka za izkoristek (tj. ni možna na primer v primeru mikroskopske analize).

O rezultatu analize se poroča (če uporabljena analitska metoda omogoča oceno nezanesljivosti meritve in popravka za izkoristek) na naslednji način:

(a)	s popravkom za izkoristek, pri čemer se navede raven popravka. Popravek za izkoristek ni potrebno uporabiti, če je 90–110-odstoten;

(b)	kot „x +/– U“, pri čemer je x rezultat analize in U razširjena nezanesljivost meritve, ob uporabi faktorja za zajetje 2, zaradi katerega je stopnja zanesljivosti približno 95 %.

Vendar če je rezultat analize bistveno (> 50 %) nižji od specifikacije, ki se določa, in je bil uporabljen ustrezni kakovostni postopek ter je namen analize le preverjanje skladnosti z zakonodajnimi določbami, se lahko rezultat analize poroča brez popravka za izkoristek, popravek za izkoristek in nezanesljivost meritve pa se lahko v teh primerih izpustita.

---

(1)  UL L 86, 6.4.1979, str. 30.

PRILOGA III

ANALITSKE METODE ZA NADZOR SESTAVE POSAMIČNIH KRMIL IN KRMNIH MEŠANIC

A.   DOLOČANJE VLAGE

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti vlage v krmi. Kadar krma vsebuje hlapne snovi, kot so organske kisline, je treba upoštevati, da se pri določanju vlage zajame tudi bistvena količina hlapnih snovi.

Ta metoda ne zajema analizo mlečnih izdelkov kot posamičnih krmil, analizo mineralnih snovi, analizo mineralnih mešanic, sestavljenih predvsem iz mineralnih snovi, analizo živalskih in rastlinskih maščob in olj ali analizo oljnih semen in oljnatega sadja.

2.   Načelo

Vzorec se osuši pri določenih pogojih, ki se spreminjajo glede na vrsto krme. Izguba mase se določi s tehtanjem. Pri trdni krmi z visoko vsebnostjo vlage je treba izvesti predhodno sušenje.

3.   Oprema

3.1

Drobilec iz materiala, ki ne absorbira vlage, in se lahko enostavno čisti, omogoča hitro in enakomerno drobljenje brez pregretja, v največji možni meri preprečuje stik z zunanjim zrakom ter ustreza zahtevam iz 4.1.1 in 4.1.2 (npr. udarni ali vodno hlajeni mikrodrobilci, konusni mlini, počasni drobilniki ali drobilniki na zobata kolesa).

3.2	Analitska tehtnica, natančna na 1 mg

3.3	Suhe posode iz nerjaveče kovine ali stekla s pokrovi, ki omogočajo zapiranje, neprepustno za zrak; delovna površina, ki omogoča razprostrtje vzorca na približno 0,3 g/cm2.

3.4	Električno ogrevan izotermičen sušilnik (± 2 oC) s primerno ventilacijo in ki zagotavlja hitro uravnavanje temperature (1).

3.5	Nastavljiv električni vakuumski sušilnik, opremljen z oljno črpalko in mehanizmom za dovajanje suhega vročega zraka ali s sušilnim sredstvom (npr. kalcijevim oksidom).

3.6	Eksikator z debelo kovinsko ali porcelansko perforirano ploščo, ki vsebuje učinkovito sušilno sredstvo.

4.   Postopek

Opomba

:

Postopki, opisani v tem oddelku, se morajo izvajati takoj po odprtju posod z vzorci. Analiza se mora izvesti najmanj v dveh vzporednih določitvah.

4.1   Priprava

4.1.1   Krma, razen tiste iz točk 4.1.2 in 4.1.3

Vzame se najmanj 50 g vzorca. Po potrebi se zdrobi ali razdeli tako, da se prepreči sprememba vsebnosti vlage (glej točko 6).

4.1.2   Žita in drobljenci

Vzame se najmanj 50 g vzorca. Zdrobi se tako, da najmanj 50 % delcev preide skozi sito z odprtinami velikosti 0,5 mm in jih na situ z okroglimi odprtinami velikosti 1 mm ostane največ 10 %.

4.1.3   Tekoča ali kašasta krma in krma, sestavljena predvsem iz olj in maščob

Približno 25 g vzorca se natehta na 10 mg natančno, doda se primerna količina brezvodnega peska, stehtanega na 10 mg natančno, in se meša do nastanka homogene mase.

4.2   Sušenje

4.2.1   Krma, razen tiste iz točk 4.2.2 in 4.2.3

Posoda (3.3) s pokrovom se stehta na 1 mg natančno. V stehtano posodo se natehta 5 g vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v sušilnik, segret na 103 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Sušenje traja štiri ure od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 103 oC. Posoda se pokrije s pokrovom, vzame iz sušilnika, pusti v eksikatorju (3.6) 30 do 45 minut, da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno.

Krma, sestavljena zlasti iz olj in maščob, se suši v sušilniku nadaljnjih 30 minut pri 130 oC. Razlika med obema tehtanjema ne sme presegati 0,1 % vlage.

4.2.2   Žita, moka, drobljenci in zdrob

Posoda (3.3) s pokrovom se stehta na 0,5 mg natančno. V stehtano posodo se natehta približno 5 g zdrobljenega vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v sušilnik, segret na 130 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Sušenje traja 2 uri od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 130 oC. Posoda se pokrije s pokrovom, vzame iz sušilnika, pusti v eksikatorju (3.6) 30 do 45 minut, da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno.

4.2.3

Krmne mešanice, ki vsebujejo več kot 4 % saharoze ali laktoze: posamična krmila, kot so rožiči, hidrolizirani žitni proizvodi, fermentirana semena, posušena mleta pesa, ribe in raztopine sladkorja; krmne mešanice, ki vsebujejo več kot 25 % mineralnih soli, vključno s kristalno vodo. Posoda (3.3) s pokrovom se stehta na 0,5 mg natančno. V stehtano posodo se natehta približno 5 g vzorca na 1 mg natančno, ki se enakomerno porazdeli. Posoda brez pokrova se postavi v vakuumski sušilnik (3.5), segret na 80–85 oC. Posoda se postavi v sušilnik v najkrajšem možnem času, da se prepreči prevelik padec temperature. Počaka se, da tlak naraste do 100 torov in pri tem tlaku sušenje traja štiri ure na vročem suhem zraku ali s sušilnim sredstvom (približno 300 g za 20 vzorcev). V zadnjem primeru se vakuumska črpalka izklopi, ko je želeni tlak dosežen. Čas sušenja se računa od trenutka, ko je temperatura v sušilniku ponovno 80–85 oC. Tlak v sušilniku se previdno izenači z atmosferskim. Sušilnik se odpre, posoda se takoj pokrije s pokrovom in vzame iz peči, pusti se 30 do 45 minut v eksikatorju (3.6), da se ohladi, in stehta na 1 mg natančno. Suši se nadaljnjih 30 minut v vakuumskem sušilniku pri 80–85 oC in ponovno stehta. Razlika med obema tehtanjema ne sme presegati 0,1 % vlage.

4.3   Predhodno sušenje

4.3.1   Krma, razen tiste iz točke 4.3.2

Trdna krma z visoko vsebnostjo vlage, ki jo je težko drobiti, mora biti predhodno sušena na naslednji način:

v primerno posodo (npr. aluminijast krožnik velikosti 20 × 12 cm in z robom 0,5 cm) se natehta 50 g nezdrobljenega vzorca na 10 mg natančno (stisnjeno ali zgoščeno krmo se lahko po potrebi na grobo razdeli). V sušilniku se suši pri 60–70 oC, dokler se vsebnost vlage ne zniža na 8–12 %. Posoda se vzame iz sušilnika in eno uro ohlaja v laboratoriju brez pokrova, nato pa stehta na 10 mg natančno. Krma se takoj zdrobi, kakor je navedeno v točki 4.1.1, in osuši, kakor je navedeno v točki 4.2.1 ali 4.2.3 glede na vrsto krme.

4.3.2   Žita

Zrna z vsebnostjo vlage nad 17 % morajo biti predhodno sušena na naslednji način:

v primerno posodo (npr. aluminijast krožnik velikosti 20 × 12 cm in z robom 0,5 cm) se natehta 50 g nezdrobljenega zrna na 10 mg natančno. Suši se 5 do 7 minut v sušilniku pri 130 oC. Posoda se vzame iz sušilnika in 2 uri ohlaja v laboratoriju brez pokrova ter nato stehta na 10 mg natančno. Krma se takoj zmelje, kakor je navedeno v točki 4.1.2, in osuši, kakor je navedeno v točki 4.2.2.

5.   Izračun rezultatov

Vsebnost vlage (X), izražena kot masni delež vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

5.1   Sušenje brez predhodnega sušenja

pri čemer je:

m	=	začetna masa vzorčenega deleža v gramih;
m0	=	masa suhega vzorčenega deleža v gramih.

5.2   Sušenje s predhodnim sušenjem

pri čemer je:

m	=	začetna masa vzorčenega deleža v gramih;
m1	=	masa vzorčenega deleža po predhodnem sušenju v gramih;
m2	=	masa vzorčenega deleža po drobljenju ali mletju v gramih;
m0	=	masa suhega vzorčenega deleža v gramih.

5.3   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne presega 0,2 % absolutne vrednosti vlage.

6.   Opomba

Če se izkaže, da je potrebno drobljenje, in če se izkaže, da se pri tem spremeni vsebnost vlage v proizvodu, se morajo rezultati analize sestavin krme popraviti glede na vsebnost vlage v vzorcu v prvotnem stanju.

B.   DOLOČANJE VLAGE V MAŠČOBAH IN OLJIH ŽIVALSKEGA IN RASTLINSKEGA IZVORA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti vode in hlapnih snovi v maščobah in oljih živalskega in rastlinskega izvora.

2.   Načelo

Vzorec se posuši do konstantne mase (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 1 mg) pri 103 oC. Izguba mase se določi s tehtanjem.

3.   Oprema

3.1	Posoda z ravnim dnom iz nerjavečega materiala s premerom 8 do 9 cm in višino približno 3 cm

3.2	Termometer z utrjeno bučko in podaljškom na zgornjem delu, s skalo od približno 80 oC do vsaj 110 oC in dolžino približno 10 cm

3.3	Peščena kopel ali električna plošča

3.4	Eksikator, ki vključuje učinkovito sušilo

3.5	Analitska tehtnica

4.   Postopek

Približno 20 g homogeniziranega vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v suho, stehtano posodo (3.1), v kateri je termometer (3.2). Ob nenehnem mešanju s termometrom se segreva na peščeni kopeli ali vroči plošči (3.3) tako, da temperatura doseže 90 oC v približno 7 minutah.

Temperatura se zniža, pri čemer se opazuje pogostost dviganja mehurčkov z dna posode. Temperatura ne sme preseči 105 oC. Nadaljuje se z mešanjem in pri tem se drgne dno posode, dokler mehurčki ne prenehajo izhajati.

Da se zagotovi popolna odstranitev vlage, se večkrat segreje na 103 ± 2 oC ob ohlajevanju na 93 oC med zaporednimi segrevanji. Nato se pusti, da se vzorec v eksikatorju (3.4) ohladi na sobno temperaturo, in se stehta. Postopek se ponavlja, dokler izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ni manjša od 2 mg.

Opomba

:

Povečanje mase vzorca po ponovljenem segrevanju kaže na oksidacijo maščobe, v tem primeru je treba upoštevati rezultat tehtanja, izvedenega neposredno pred začetkom povečevanja mase.

5.   Izračun rezultatov

Masni delež vlage (X) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m	=	masa vzorčenega deleža v gramih;
m1	=	masa posode z vsebino pred segrevanjem v gramih;
m2	=	masa posode z vsebino po segrevanju v gramih.

Rezultati, nižji od 0,05 %, se navedejo kot „manj kot 0,05 %“.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 0,05 % absolutne vrednosti.

C.   DOLOČANJE VSEBNOSTI SUROVIH BELJAKOVIN

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti surovih beljakovin v krmi na podlagi vsebnosti dušika, določenega po Kjeldahlovi metodi.

2.   Načelo

Vzorec se razkroji z žveplovo kislino v prisotnosti katalizatorja. Raztopina natrijevega hidroksida se doda kisli raztopini, da postane bazična. Amonijak se destilira in zbere v odmerjeno količino žveplove kisline, katere presežek se titrira s standardno raztopino natrijevega hidroksida.

Sproščeni amonijak se lahko destilira v presežek raztopine borove kisline ter nato titrira z raztopino klorovodikove ali žveplove kisline.

3.   Reagenti

3.1	Kalijev sulfat

3.2	Katalizator: bakrov (II) oksid CuO ali bakrov (II) sulfat pentahidrat, CuSO4 5H2O

3.3	Cink v zrncih

3.4	Žveplova kislina, ρ20 = 1,84 g/ml

3.5	Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6	Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7	Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8	Indikator metil rdeče; 300 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml etanola, σ = 95–96 % (v/v)

3.9	Raztopina natrijevega hidroksida (lahko tehnična) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %)

3.10	Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11	Žveplova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12	Zdrobljen plovec, opran v klorovodikovi kislini in prežaren

3.13	Acetanilid (tališče = 114 oC, N-vsebnost = 10,36 %)

3.14	Saharoza (brez dušika)

3.15	Borova kislina (H3BO3)

3.16	Raztopina indikatorja metil rdeče: 100 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml etanola ali metanola.

3.17	Raztopina bromokrezol zelenega: 100 mg bromokrezol zelenega se raztopi v 100 ml etanola ali metanola.

3.18

Raztopina borove kisline (10–40 g/l glede na uporabljeno opremo) Pri določanju s kolorimetrično ekvivalentno točko se morata raztopinam borove kisline dodati indikatorja metil rdeče in bromokrezol. Pri pripravi 1 litra raztopine borove kisline se pred uravnavanjem volumna doda 7 ml raztopine indikatorja metil rdeče (3.16) in 10 ml raztopine bromokrezol zelenega (3.17). Glede na uporabljeno vodo se lahko pH raztopine borove kisline med serijami razlikuje. Pogosto je za doseganje pozitivnega slepega vzorca treba dodati majhen volumen baze. Opomba : 3 do 4 ml NaOH (3.11) v 1 liter 10 g/l borove kisline ponavadi zadošča. Raztopina se shrani pri sobni temperaturi ter zaščiti pred svetlobo in viri amonijevih hlapov.

3.19	Klorovodikova kislina, standardna volumetrična raztopina, c(HCl) = 0,10 mol/l Opomba : Druge koncentracije volumetričnih raztopin (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 in 3.19) se lahko uporabljajo, če se upoštevajo v izračunih. Koncentracije se vedno izrazijo na štiri decimalke natančno.

4.   Oprema

Naprava, primerna za izvajanje razklopa, destilacije in titracije po Kjeldahlovi metodi.

5.   Postopek

5.1   Razklop

1 g vzorca se natehta na 0,001 g natančno in se prenese v bučko naprave za razklop. Doda se 15 g kalijevega sulfata (3.1), ustrezna količina katalizatorja (3.2) (0,3–0,4 g bakrovega (II) oksida ali 0,9–1,2 g bakrovega (II) sulfat pentahidrata), 25 ml žveplove (VI) kisline (3.4) in po potrebi nekaj zrnc plovca (3.12) ter vse skupaj premeša.

Bučka se najprej zmerno segreva in po potrebi občasno obrne, dokler masa ne zogleni in pena ne izgine; nato se močneje segreva do enakomernega vretja tekočine. Segrevanje je ustrezno, če se vrela kislina kondenzira na stenah bučke. Paziti je treba, da se stene bučke ne pregrejejo in da se organski delci ne sprimejo nanje.

Ko se raztopina zbistri in obarva rahlo zeleno, se pusti vreti še 2 uri, nato pa pusti, da se ohladi.

5.2   Destilacija

Previdno se doda toliko vode, da se sulfati povsem raztopijo. Pusti se, da se ohladi, nato pa se po potrebi doda nekaj zrnc cinka (3.3). Nadaljuje se v skladu s točko 5.2.1 ali 5.2.2.

5.2.1   Destilacija v žveplovo kislino

V zbirno bučko naprave za destilacijo se doda natančno 25 ml žveplove kisline (3.5) ali (3.7) glede na pričakovano vsebnost dušika. Doda se nekaj kapljic indikatorja metil rdeče (3.8).

Bučka za razklop se poveže s kondenzatorjem naprave za destilacijo in konica kondenzatorja se potopi v tekočino v zbirni bučki vsaj do globine 1 cm (glej opombo 8.3). V bučko za razklop se počasi vlije 100 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.9) tako, da ne pride do izgube amonijaka (glej opombo 8.1). Bučka se segreva do popolne destilacije amonijaka.

5.2.2.   Destilacija v borovo kislino

Pri ročni titraciji amonijaka iz destilata se uporablja spodaj navedeni postopek. Kadar je destilacijska enota v celoti avtomatizirana in vključuje titracijo amonijaka iz destilata, se upoštevajo navodila proizvajalca za upravljanje z destilacijsko enoto.

Zbirna bučka s 25–30 ml raztopine borove kisline (3.18) se postavi pod izhodno odprtino kondenzatorja tako, da je dovodna cev pod površino presežka raztopine borove kisline. Destilacijska enota se nastavi tako, da se dovaja 50 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.9). Destilacijska enota se upravlja v skladu z navodili proizvajalca, sproščeni amonijak pa se destilira z raztopino natrijevega hidroksida. Destilat se zbere v raztopino borove kisline. Na količino destilata (čas parne destilacije) vpliva količina dušika v vzorcu. Upoštevati je treba navodila proizvajalca.

Opomba

:

V polavtomatski destilacijski enoti sta dodajanje presežka natrijevega hidroksida in parna destilacija avtomatizirana postopka.

5.3   Titracija

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.1 ali 5.3.2.

5.3.1   Žveplova kislina

Presežek žveplove kisline v zbirni bučki se titrira do ekvivalentne točke z raztopino natrijevega hidroksida (3.10 ali 3.11) glede na koncentracijo uporabljene žveplove kisline.

5.3.2   Borova kislina

Vsebina zbirne bučke se titrira s standardno volumetrično raztopino klorovodikove kisline (3.19) ali standardno volumetrično raztopino žveplove kisline (3.6), pri čemer se uporabi bireta in odčita količina uporabljene titracijske snovi.

Pri določanju s kolorimetrično ekvivalentno točko je ekvivalentna točka dosežena pri prvem znaku rožnatega obarvanja vsebine. Volumen birete se odčita na 0,05 ml natančno. Magnetna mešalna plošča z osvetlitvijo ali fotometrični detektor lahko pripomoreta k določanju ekvivalentne točke.

Parni destilator z avtomatično titracijo lahko to opravi avtomatično.

Upoštevati je treba navodila proizvajalca za upravljanje specifičnega destilatorja ali destilatorja/titratorja.

Opomba

:

Pri avtomatičnem sistemu titriranja se titracija začne takoj po začetku destilacije, uporabi pa se 1-odstotna raztopina borove kisline (3.18). Pri popolnoma avtomatizirani destilacijski enoti se lahko izvaja avtomatična titracija amonijaka, ekvivalentna točka pa se lahko določa s potenciometričnim pH sistemom. V tem primeru se uporablja avtomatični titrator s pH metrom. Ta pH meter se ustrezno umeri med pH 4 in pH 7 z običajnimi laboratorijskimi postopki za umerjanje pH. Ekvivalentna točka pH pri titraciji je dosežena pri pH 4,6, ko je naklon titracijske krivulje največji (točka pregiba).

5.4   Slepi preskus

Slepi preskus (razklop, destilacija in titracija), v katerem se namesto vzorca uporabi 1 g saharoze (3.14), se izvede za potrditev, da reagenti ne vsebujejo dušika.

6.   Izračun rezultatov

Izračuni se izvedejo v skladu s točko 6.1 ali 6.2.

6.1   Izračun za titracijo v skladu s točko 5.3.1

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

Vo	=	volumen (ml) NaOH (3.10 ali 3.11), uporabljen pri slepem preskusu;
V1	=	volumen (ml) NaOH (3.10 ali 3.11), uporabljen pri titraciji vzorca;
c	=	koncentracija (mol/l) natrijevega hidroksida (3.10 ali 3.11);
m	=	masa (g) vzorca.

6.2   Izračun za titracijo v skladu s točko 5.3.2

6.2.1   Titracija s klorovodikovo kislino

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m	=	masa (g) vzorčenega deleža;
c	=	koncentracija (mol/l) standardne volumetrične raztopine klorovodikove kisline (3.19);
V0	=	volumen (ml) klorovodikove kisline, uporabljen pri slepem preskusu;
V1	=	volumen (ml) klorovodikove kisline, uporabljen v vzorčenem deležu.

6.2.2   Titracija s žveplovo kislino

Vsebnost surovih beljakovin, izražena kot masni delež, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m	=	masa (g) vzorčenega deleža;
c	=	koncentracija (mol/l) standardne volumetrične raztopine žveplove kisline (3.6);
V0	=	volumen (ml) žveplove kisline (3.6), uporabljen v slepem preskusu;
V1	=	volumen (ml) žveplove kisline (3.6), uporabljen v vzorčenem deležu.

7.   Preverjanje metode

7.1   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

—	0,2 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin pod 20 %,

—	1,0 % višje vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin 20–40 %,

—	0,4 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih beljakovin nad 40 %.

7.2   Točnost

Za analizo (razklop, destilacija, titracija) se uporabi 1,5 do 2,0 g acetanilida (3.13) ob navzočnosti 1 g saharoze (3.14); za 1 g acetanilida se porabi 14,80 ml žveplove kisline (3.5). Izkoristek mora biti najmanj 99-odstoten.

8.   Opombe

8.1

Naprava je lahko ročna, polavtomatska ali avtomatska. Če je pri napravi med razklopom in destilacijo potreben prenos, se ta prenos mora izvesti brez kakršne koli izgube. Če bučka naprave za destilacijo ni opremljena s kapalnim lijakom, se natrijev hidroksid doda tik pred povezavo bučke s kondenzatorjem, pri čemer se tekočina vliva počasi ob steni bučke.

8.2	Če se vsebina bučke strjuje, se določanje začne znova, vendar z večjo količino žveplove kisline (3.4), kakor je navedeno zgoraj.

8.3	Pri proizvodih z nizko vsebnostjo dušika se lahko volumen žveplove kisline (3.7), ki se doda v zbirno bučko, po potrebi zmanjša na 10 ali 15 ml, bučka pa se dopolni do 25 ml z vodo.

8.4

Pri redni analizi se lahko za določanje surovih beljakovin uporabi nadomestna analitska metoda, vendar je Kjeldahlova metoda, opisana v tem delu C, referenčna metoda. Za vsako matrico posebej je treba dokazati, da so rezultati, pridobljeni z nadomestno metodo (npr. DUMAS), enakovredni rezultatom, pridobljenim z referenčno metodo. V poročilu o analizi je treba navesti analitsko metodo, uporabljeno za določanje surovih beljakovin, saj lahko rezultati, pridobljeni z nadomestno metodo, kljub potrditvi enakovrednosti, odstopajo od rezultatov, pridobljenih z referenčno metodo.

D.   DOLOČANJE SEČNINE

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni sečnine v krmi.

2.   Načelo

Vzorec se suspendira v vodi s snovjo za zbistritev. Suspenzija se filtrira. Doda se 4-dimetilaminobenzaldehid (4-DMAB), nato pa se določi vsebnost sečnine v filtratu z merjenjem optične gostote pri valovni dolžini 420 nm.

3.   Reagenti

3.1	Raztopina 4-dimetilaminobenzaldehida: 1,6 g 4-DMAB se raztopi v 100 ml 96-odstotnega etanola in doda 10 ml klorovodikove kisline (ρ201,19 g/ml). Reagent se lahko hrani največ dva tedna.

3.2	Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3COO)2 2H2O in 3 g ledoceta se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.3	Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4 Fe (CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4	Aktivno oglje, ki ne absorbira sečnine (treba je preveriti).

3.5	Sečnina, 0,1-odstotna raztopina (m/v)

4.   Oprema

4.1	Mešalnik: približno 35 do 40 obr./min.

4.2	Epruvete: 160 × 16 mm z brušenimi zamaški

4.3	Spektrofotometer

5.   Postopek

5.1   Analiza vzorca

2 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in skupaj z 1 g aktivnega oglja (3.4) prenese v 500-mililitrsko merilno bučko. Doda se 400 ml vode in 5 ml raztopine Carrez I (3.2), meša se približno 30 sekund in doda 5 ml raztopine Carrez II (3.3). Meša se 30 minut v mešalniku. Dopolni se z vodo do oznake, pretrese in filtrira.

5 ml prozornega brezbarvnega filtrata se odstrani in prenese v epruvete z brušenimi zamaški, doda se 5 ml raztopine 4-DMAB (3.1) ter premeša. Epruvete se postavijo v kopel z vodo pri 20 oC (+/- 4 oC). Po 15 minutah se izmeri optična gostota raztopine vzorca s spektrofotometrom pri 420 nm. Rezultat se primerja z raztopino reagentov iz slepega preskusa.

5.2   Umeritvena krivulja

V 100-mililitrske merilne bučke se prenese 1, 2, 4, 5 in 10 ml raztopine sečnine (3.5), ki se dopolnijo z vodo do oznake. Od vsake raztopine se odpipetira 5 ml, vsaki se doda 5 ml raztopine 4-DMAB (3.1), homogenizira se in izmeri optična gostota, kakor je opisano zgoraj s primerjavo s kontrolno raztopino, ki vsebuje 5 ml 4-DMAB in 5 ml vode brez sečnine. Pripravi se umeritvena krivulja.

6.   Izračun rezultatov

Količina sečnine v vzorcu se določi iz umeritvene krivulje.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

7.   Opombe

7.1	Če vsebnost sečnine presega 3 %, se vzorec zmanjša na 1 g ali se prvotna raztopina razredči, tako da v 500 ml ni več kot 50 mg sečnine.

7.2	Če je vsebnost sečnine nizka, se vzorec poveča, dokler je filtrat še prozoren in brezbarven.

7.3	Če vzorec vsebuje preproste dušikove spojine, kot so aminokisline, se optična gostota meri pri 435 nm.

E.   DOLOČANJE HLAPNIH DUŠIKOVIH BAZ

I.   Z MIKRODIFUZIJO

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti hlapnih dušikovih baz v krmi, izraženih kot amonijak.

2.   Načelo

Vzorec se ekstrahira z vodo, raztopina pa zbistri in filtrira. Hlapne dušikove baze se ločijo z mikrodifuzijo z uporabo raztopine kalijevega karbonata, zberejo v raztopino borove kisline in titrirajo z žveplovo kislino.

3.   Reagenti

3.1	Trikloroocetna kislina, 20-odstotna raztopina (m/v)

3.2	Indikator: 33 mg bromokrezol zelenega in 65 mg metil rdečega se raztopi v 100 ml 95–96-odstotnega (v/v) etanola.

3.3

Raztopina borove kisline: v litrski merilni bučki se v 200 ml 95–96-odstotnega (v/v) etanola in 700 ml vode raztopi 10 g borove kisline. Doda se 10 ml indikatorja (3.2). Premeša se, po potrebi pa se barva raztopine spremeni v svetlo rdečo z dodajanjem raztopine natrijevega hidroksida. 1 ml te raztopine ustreza največ 300 μg NH3.

3.4	Nasičena raztopina kalijevega karbonata: v 100 ml vrele vode se raztopi 100 g kalijevega karbonata. Pusti se, da se ohladi, ter nato filtrira.

3.5	Žveplova kislina, 0,01 mol/l

4.   Oprema

4.1	Mešalec: približno 35 do 40 obr./min.

4.2	Steklene ali plastične Conwayeve celice (glej diagram)

4.3	Mikrobirete z označenim merilom 1/100 ml

5.   Postopek

10 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in se s 100 ml vode prenese v 200-mililitrsko merilno bučko. V mešalcu se meša ali stresa 30 minut. Doda se 50 ml raztopine trikloroocetne kisline (3.1), dopolni z vodo do oznake, močno pretrese in filtrira skozi nagubani filter.

S pipeto se doda 1 ml raztopine borove kisline (3.3) v srednji del Conwayeve celice in 1 ml filtrata vzorca v zgornji del celice. Delno se pokrije z namaščenim pokrovom. V zgornji del celice se hitro nakapa 1 ml nasičene raztopine kalijevega karbonata (3.4), nato se neprepustno zapre. Celica se pazljivo obrača v vodoravni ravnini, da se reagenta premešata. Pusti se najmanj štiri ure pri sobni temperaturi ali eno uro pri temperaturi 40 oC.

Z mikrobireto (4.3) se hlapne baze v raztopini borove kisline titrirajo z žveplovo kislino (3.5).

Slepi preskus se izvede po istem postopku, vendar brez vzorca, ki se analizira.

6.   Izračun rezultatov

1 ml H2SO40,01 mol/l ustreza 0,34 mg amonijaka.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne presega:

—	10 % relativne vrednosti, če je vsebnost amonijaka nižja od 1,0 %,

—	0,1 % absolutne vrednosti, če je vsebnost amonijaka 1,0 % ali več.

7.   Opomba

Če vsebnost amonijaka v vzorcu presega 0,6 %, se začetni filtrat razredči.

II.   Z DESTILACIJO

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje vsebnosti hlapnih dušikovih baz, izraženih kot amonijak, v ribji moki, ki praktično ne vsebuje sečnine. Uporablja se le za vsebnost amonijaka, ki je nižja od 0,25 %.

2.   Načelo

Vzorec se ekstrahira z vodo, raztopina pa zbistri in filtrira. Hlapne dušikove baze se izločijo pri temperaturi vrelišča z dodatkom magnezijevega oksida in zberejo v določeno količino žveplove kisline, katere presežek se titrira z raztopino natrijevega hidroksida.

3.   Reagenti

3.1	Trikloroocetna kislina, 20-odstotna raztopina (m/v)

3.2	Magnezijev oksid

3.3	Emulzija proti penjenju (npr. silikon)

3.4	Žveplova kislina, 0,05 mol/l

3.5	Raztopina natrijevega hidroksida, 0,1 mol/l

3.6	0,3-odstotna raztopina metil rdečega v 95–96-odstotnem (v/v) etanola

4.   Oprema

4.1	Mešalec: približno 35 do 40 obr./min.

4.2	Naprava za destilacijo po Kjeldahlu

5.   Postopek

10 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in s 100 ml vode prenese v 200-mililitrsko merilno bučko. V mešalcu se meša ali stresa 30 minut. Doda se 50 ml raztopine trikloroocetne kisline (3.1), dopolni z vodo do oznake, močno pretrese in filtrira skozi nagubani filter.

Odpipetira se volumen bistrega filtrata, ki ustreza pričakovani vsebnosti hlapnih dušikovih baz (ponavadi zadošča 100 ml). Razredči se na 200 ml, doda se 2 g magnezijevega oksida (3.2) in nekaj kapljic emulzije proti penjenju (3.3). Raztopina mora biti alkalna pri preskusu z lakmusovim papirjem, če ni, se doda magnezijev oksid (3.2). Nadaljevati je treba v skladu s točkama 5.2 in 5.3 dela C te priloge, tj. Analitske metode za določanje vsebnosti surovih beljakovin.

Slepi preskus se izvede po istem postopku, vendar brez vzorca, ki se analizira.

6.   Izračun rezultatov

1 ml H2SO40,05 mol/l ustreza 1,7 mg amonijaka.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

Ponovljivost

Relativna razlika med rezultatoma dveh vzporednih določitev, izvedenih na istem vzorcu, ne presega 10 % amonijaka.

F.   DOLOČANJE AMINOKISLIN (RAZEN TRIPTOFANA)

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda se uporablja za določanje prostih (sintetičnih in naravnih) in celotnih (vezanih s peptidi in prostih) aminokislin v krmi z uporabo analizatorja aminokislin. Uporablja se za naslednje aminokisline: cist(e)in, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aspartat, glutaminsko kislino, glicin, histidin, izolevcin, levcin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin in valin.

S metodo ni možno ločiti soli aminokislin ter D in L oblik aminokislin. Ne uporablja se za določanje triptofana ali hidroksi-analogov aminokislin.

2.   Načelo

2.1   Proste aminokisline

Proste aminokisline se ekstrahirajo z razredčeno klorovodikovo kislino. Soekstrahirane dušikove makromolekule se oborijo s sulfosalicilno kislino in odstranijo s filtriranjem. pH filtrirane raztopine se uravna na 2,20. Aminokisline se ločijo z ionsko izmenjevalno kromatografijo in določijo z reakcijo z ninhidrinom s fotometrično detekcijo pri 570 nm.

2.2   Celotne aminokisline

Postopek se izbere glede na preiskovane aminokisline. Cist(e)in in metionin se morata pred hidrolizo oksidirati v cisteinsko kislino in metionin-sulfon. Tirozin se mora določiti v hidrolizatih neoksidiranih vzorcev. Vse druge aminokisline, navedene v točki 1, se lahko določajo v oksidiranem ali neoksidiranem vzorcu.

Oksidacija se izvede pri 0 oC z mešanico peroksimravljične kisline in fenola. Presežek oksidacijskega reagenta se razgradi z natrijevim disulfitom. Oksidiran ali neoksidiran vzorec se 23 ur hidrolizira s klorovodikovo kislino (3.20). pH hidrolizata se uravna na 2,20. Aminokisline se ločijo z ionsko izmenjevalno kromatografijo in določijo z reakcijo z ninhidrinom s fotometrično detekcijo pri 570 nm (440 nm za prolin).

3.   Reagenti

Uporabiti je treba dvojno destilirano vodo ali vodo enakovredne kakovosti (prevodnost < 10 μS)

3.1	Vodikov peroksid, m (m/m) = 30 %

3.2	Mravljična kislina, m (m/m) = 98–100 %

3.3

Fenol

3.4	Natrijev disulfit

3.5	Natrijev hidroksid

3.6	5-sulfosalicilat dihidrat

3.7	Klorovodikova kislina, približno 1,18 g/ml

3.8	Tri-natrijev citrat dihidrat

3.9	2,2'-tiodietanol (tiodiglikol)

3.10	Natrijev klorid

3.11

Ninhidrin

3.12	Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.13	Norlevcin ali druga spojina, primerna za uporabo kot notranji standard

3.14	Plinasti dušik (< 10 ppm kisika)

3.15

1-oktanol

3.16	Aminokisline

3.16.1

Standardne snovi iz točke 1. Čiste spojine, ki ne vsebujejo kristalne vode. Pred uporabo se suši 1 teden pod vakuumom s P2O5 ali H2SO4.

3.16.2

Cisteinska kislina

3.16.3

Metionin-sulfon

3.17	Raztopina natrijevega hidroksida, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.18	Raztopina natrijevega hidroksida, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.19	Mravljična kislina – raztopina fenola: 889 g mravljične kisline (3.2) se zmeša s 111 g vode ter se doda 4,73 g fenola (3.3).

3.20	Hidrolizna mešanica, c = 6 mol HCl/l, ki vsebuje 1 g fenola/l: 1 g fenola (3.3) se doda k 492 ml HCl (3.7) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.21	Mešanica ekstrakcije, c = 0,1 mol HCl/l, ki vsebuje 2 % tiodiglikola: 8,2 ml HCl (3.7) se razredči s približno 900 ml vode, doda se 20 ml tiodiglikola (3.9) in dopolni z vodo do 1 litra (3.7 in 3.9 se ne smeta zmešati neposredno).

3.22	5-sulfosalicilna kislina, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalicilne kisline (3.6) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra.

3.23

Oksidacijska mešanica (peroksimravljična kislina – fenol): 0,5 ml vodikovega peroksida (3.1) se zmeša s 4,5 ml raztopine mravljične kisline in fenola (3.19) v majhni čaši. Inkubira se 1 uro pri 20–30 oC, da nastane peroksimravljična kislina, nato se ohladi v ledeni kopeli (15 min), preden se doda vzorcu. Opozorilo: Izogibati se je treba stiku s kožo in nositi je treba zaščitna oblačila.

3.24	Citratni pufer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: v približno 800 ml vode se raztopi 19,61 g natrijevega citrata (3.8), 5 ml tiodiglikola (3.9), 1 g fenola (3.3) in 16,50 ml HCl (3.7). pH se uravna na 2,20. Dopolni se z vodo do 1 litra.

3.25	Pufri za eluiranje, pripravljeni v skladu z navodili za uporabljeni analizator (4.9)

3.26	Reagent ninhidrin, pripravljen v skladu z navodili za uporabljeni analizator (4.9)

3.27	Standardne raztopine aminokislin. Te raztopine se hranijo pri temperaturi do 5 oC.

3.27.1

Osnovna standardna raztopina aminokislin (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml za vsako v klorovodikovi kislini. Lahko se priskrbi iz proste prodaje.

3.27.2

Osnovna standardna raztopina cisteinske kisline in metionin-sulfona, c = 1,25 μmol/ml. V litrski merilni bučki se raztopi 0,2115 g cisteinske kisline (3.16.2) in 0,2265 g metionin-sulfona (3.16.3) v citratnem pufru (3.24) ter dopolni s citratnim pufrom do oznake. Hrani se največ 12 mesecev pri temperaturi do 5 oC. Ta raztopina se ne uporablja, če osnovna standardna raztopina (3.27.1) vsebuje cisteinsko kislino in metionin-sulfon.

3.27.3

Osnovna standardna raztopina notranjega standarda, npr. norlevcina, c = 20 μmol/ml. V merilni bučki se raztopi 0,6560 g norlevcina (3.13) v citratnem pufru (3.24) in dopolni s citratnim pufrom do 250 ml. Hrani se največ 6 mesecev pri temperaturi do 5 oC.

3.27.4

Raztopina za umerjanje standardnih aminokislin, ki se uporablja s hidrolizati, c = 5 nmol/50 μl za cisteinsko kislino in metionin-sulfon ter c = 10 nmol/50 μl za druge aminokisline. V 100-mililitrski čaši se raztopi 2,2 g natrijevega klorida (3.10) s 30 ml citratnega pufra (3.24). Dodajo se 4,00 ml osnovne standardne raztopine aminokisline (3.27.1), 4,00 ml osnovne standardne raztopine cisteinske kisline in metionin-sulfona (3.27.2) ter 0,50 ml osnovne standardne raztopine notranjega standarda (3.27.3), če se uporablja. pH se uravna na 2,20 z natrijevim hidroksidom (3.18). Vsebina se prenese v 50-mililitrsko merilno bučko, dopolni se s citratnim pufrom (3.24) do oznake in premeša. Hrani se največ 3 mesece pri temperaturi do 5 oC. Glej tudi opombo 9.1.

3.27.5

Raztopina za umerjanje standardnih aminokislin, ki se uporablja s hidrolizati, se pripravi v skladu s točko 5.3.3.1, za ekstrakte pa v skladu s točko 5.2. Raztopina za umerjanje se pripravi v skladu s točko 3.27.4, vendar brez natrijevega klorida. Hrani se največ 3 mesece pri temperaturi do 5 oC.

4.   Oprema

4.1	100- ali 250-mililitrska bučka z okroglim dnom in kondenzatorjem povratnega toka

4.2	100-mililitrska borosilikatna steklena posoda z zamaškom z navojem in ovita v gumo/teflon (npr. Duran, Schott) za uporabo v sušilniku

4.3	Sušilnik s prezračevanjem z umetnim dotokom zraka in regulatorjem temperature z natančnostjo, boljšo od ± 2 oC

4.4	pH meter (na tri decimalke)

4.5	Membranski filter (0,22 μm)

4.6	Centrifuga

4.7	Rotacijski vakuumski uparjalnik

4.8	Mehanski stresalnik ali magnetno mešalo

4.9

Aminokislinski analizator ali oprema za HPLC s kolono z ionskim izmenjevalcem, pripravo za ninhidrin, derivatizacijo po koloni in fotometričnim detektorjem Kolona se napolni s smolo sulfoniranega polistirena, ki lahko loči aminokisline med seboj in od drugih materialov, ki vsebujejo ninhidrin. Črpalki s stabilnim tokom ±0,5 % zagotavljata tok v pufrski in ninhidrinski črti pri standardnem umerjanju in analizi vzorca. Za nekatere aminokisline se lahko uporabi hidroliza v analizatorju, pri čemer je koncentracija natrija v hidrolizatu c = 0,8 mol/l in v hidrolizatu je vsa mravljična kislina, ki nastane pri oksidaciji. Druge metode ne zagotavljajo zadovoljive ločitve nekaterih aminokislin, če je v hidrolizatu preveč mravljične kisline in/ali visoka koncentracija natrijevih ionov. V tem primeru se volumen kisline po hidrolizi in pred uravnavanjem pH zmanjša z uparevanjem na približno 5 ml. Uparevanje se izvede pod vakuumom pri največ 40 oC.

5.   Postopek

5.1   Priprava vzorca

Vzorec se zdrobi, tako da preide skozi 0,5 mm sito. Vzorci z visoko vlago se morajo pred drobljenjem osušiti na zraku pri temperaturi, ki ne presega 50 oC, ali osušiti z zmrzovanjem. Vzorci z visoko vsebnostjo maščobe se pred drobljenjem ekstrahirajo s petroletrom (3.12).

5.2   Določanje prostih aminokislin v krmi in premiksih

Primerna količina (1–5 g) pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v erlenmajerico, temu pa se doda 100,0 ml mešanice ekstrakcije (3.21). Z mehanskim stresalnikom ali magnetnim mešalom (4.8) se mešanica stresa 60 minut. Pusti se, da se usedlina usede na dno, in odpipetira 10,0 ml supernatanta v 100-mililitrsko čašo.

Med mešanjem se doda 5,0 ml raztopine sulfosalicilne kisline (3.22) in 5 minut nadaljuje z mešanjem s pomočjo magnetnega mešala. Supernatant se filtrira ali centrifugira, da se odstrani ves precipitat. 10,0 ml te raztopine se prenese v 100-mililitrsko čašo in pH uravnava na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (3.18), s citratnim pufrom (3.24) se prenese v merilno bučko ustreznega volumna in dopolni z raztopino pufra (3.24) do oznake.

Če se uporablja notranji standard, se za vsakih 100 ml končne raztopine doda 1,00 ml notranjega standarda (3.27.3) ter dopolni z raztopino pufra (3.24) do oznake.

Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Če se ekstrakti ne pregledajo isti dan, se morajo hraniti pri temperaturi do 5 oC.

5.3   Določanje celotnih aminokislin

5.3.1   Oksidacija

0,1–1 g pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v:

—	100-mililitrsko bučko z okroglim dnom (4.1) (za odprto hidrolizo 5.3.2.3) ali

—	250-mililitrsko bučko z okroglim dnom (4.1), če je zahtevana nizka koncentracija natrija (5.3.3.1), ali

—	100-mililitrsko steklenico z zamaškom z navojem (4.2) (za zaprto hidrolizo 5.3.2.4).

V natehtanem vzorčenem deležu mora biti vsebnost dušika približno 10 mg, vsebnost vlage pa ne sme preseči 100 mg.

Bučka/steklenica se postavi v ledeno kopel in ohladi na 0 oC, doda se 5 ml oksidacijske mešanice (3.23) in meša s stekleno lopatico z ukrivljeno konico. Bučka/steklenica z lopatico se nepredušno zapre s filmom, ledena kopel, ki vsebuje nepredušno zaprto posodo, pa se postavi v hladilnik s temperaturo 0 oC in pusti 16 ur. Po 16 urah se posoda vzame iz hladilnika, presežni oksidacijski reagent pa se razgradi z dodatkom 0,84 g natrijevega disulfita (3.4).

Nadaljuje se s točko 5.3.2.1.

5.3.2   Hidroliza

5.3.2.1    Hidroliza oksidiranih vzorcev

Oksidiranemu vzorcu, pripravljenemu v skladu s točko 5.3.1, se doda 25 ml hidrolizne mešanice (3.20), pri čemer je treba pazljivo sprati kakršne koli ostanke vzorca s stene posode in lopatice.

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4 odvisno od uporabljenega postopka hidrolize.

5.3.2.2    Hidroliza neoksidiranih vzorcev

V 100- ali 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom (4.1) ali 100-mililitrsko steklenico z zamaškom z navojem (4.2) se natehta 0,1–1 g pripravljenega vzorca (5.1) na 0,2 mg natančno. V natehtanem vzorčenem deležu mora biti vsebnost dušika približno 10 mg. Pazljivo se doda 25 ml hidrolizne mešanice (3.20) in zmeša z vzorcem. Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4.

5.3.2.3    Odprta hidroliza

Mešanici v bučki (pripravljeni v skladu s točko 5.3.2.1 ali 5.3.2.2) se dodajo 3 steklene kroglice, nato se pusti vreti z neprestanim mehurčenjem pri povratnem toku 23 ur. Po zaključku hidrolize se kondenzator spere s 5 ml citratnega pufra (3.24). Bučka se odstrani in ohladi v ledeni kopeli.

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.3.

5.3.2.4    Zaprta hidroliza

Steklenica, ki vsebuje mešanico, pripravljeno v skladu s točko 5.3.2.1 ali 5.3.2.2, se postavi v sušilnik (4.3) pri 110 oC. V prvi uri se za preprečitev povečanja tlaka (zaradi nastanka plinastih snovi) in eksplozije zamašek z navojem postavi čez vrh steklenice. Steklenica se ne sme zapreti z zamaškom. Po eni uri se steklenica zapre z zamaškom in pusti v sušilniku (4.3) 23 ur. Po zaključku hidrolize se steklenica odstrani iz sušilnika, zamašek steklenice se pazljivo odpre, steklenica pa položi v ledeno kopel. Pusti se, da se ohladi.

Odvisno od postopka za uravnavanje pH (5.3.3) se vsebina steklenice z uporabo citratnega pufra (3.24) prenese v 250-mililitrsko čašo ali 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom.

Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.3.

5.3.3   Uravnavanje pH

Glede na odstopanje analizatorja aminokislin (4.9) za natrij se za uravnavanje pH nadaljuje v skladu točko 5.3.3.1 ali 5.3.3.2.

5.3.3.1    Kromatografski sistemi (4.9), pri katerih je zahtevana nizka koncentracija natrija

Ko se uporabljajo analizatorji aminokislin, pri katerih je zahtevana nizka koncentracija natrija (ko je treba zmanjšati volumen kisline), je priporočljivo uporabiti raztopino notranjega osnovnega standarda (3.27.3).

V tem primeru se hidrolizatu pred uparevanjem dodata 2,00 ml raztopine notranjega osnovnega standarda (3.27.3).

Hidrolizatu, pridobljenemu v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4, se dodata 2 kaplji 1-oktanola (3.15).

Z rotacijskim uparilnikom (4.7) se pod vakuumom pri 40 oC volumen zmanjša na 5–10 ml. Če se volumen nenamerno zmanjša na manj kot 5 ml, se mora hidrolizat izločiti in analiza začeti znova.

pH se uravna na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (3.18), nato pa se nadaljuje v skladu s točko 5.3.4.

5.3.3.2    Za vse druge analizatorje aminokislin (4.9)

Hidrolizati, pridobljeni v skladu s točko 5.3.2.3 ali 5.3.2.4, se delno nevtralizirajo, tako da se med mešanjem pazljivo doda 17 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.17), pri čemer se mora ohranjati temperatura pod 40 oC.

Pri sobni temperaturi se pH uravna na 2,20 z raztopino natrijevega hidroksida (3.17) in nato raztopino natrijevega hidroksida (3.18). Nadaljuje se v skladu s točko 5.3.4.

5.3.4   Raztopina vzorca za kromatografijo

Hidrolizat (5.3.3.1 ali 5.3.3.2), uravnan na pH, se s citratnim pufrom (3.24) prenese v 200-mililitrsko merilno bučko in dopolni s pufrom (3.24) do oznake.

Če notranji standard še ni bil uporabljen, se dodata 2,00 ml notranjega standarda (3.27.3), nato pa se dopolni s citratnim pufrom (3.24) do oznake. Temeljito se premeša.

Nadaljuje se s kromatografijo (5.4).

Če se raztopine vzorca ne pregledajo še isti dan, se morajo shraniti pri temperaturi pod 5 oC.

5.4   Kromatografija

Pred kromatografijo mora biti temperatura ekstrakta (5.2) ali hidrolizata (5.3.4) enaka sobni temperaturi. Mešanica se stresa, primerna količina pa se filtrira skozi membranski filter 0,22 μm (4.5). S to bistro raztopino se opravi ionska izmenjevalna kromatografija z analizatorjem aminokislin (4.9).

Vbrizgavanje je lahko ročno ali avtomatično. Pomembno je, da se ista količina raztopine (±0,5 %) doda koloni za analizo standardov in vzorcev, razen ko se uporablja notranji standard, ter da je razmerje med natrijem in aminokislino v raztopinah standarda in vzorca takšno, kot se uporablja ponavadi.

Na splošno je pogostost umerjanja odvisna od stabilnosti reagenta ninhidrina in analitskega sistema. Standard ali vzorec se razredči s citratnim pufrom (3.24), da se doseže površina vrha standarda, ki je 30–200 % površine vrha aminokislin v vzorcu.

Kromatografija aminokislin se nekoliko razlikuje glede na vrsto uporabljenega analizatorja in smole. Izbrani sistem mora imeti možnost ločitve aminokisline med seboj in od materialov, ki vsebujejo ninhidrin. V delovnem območju se mora kromatografski sistem odzivati linearno na spremembe količin aminokislin, dodanih koloni.

Pri kromatografiji se uporabljajo spodaj navedena razmerja med najnižjimi in najvišjimi vrednostmi, ko se analizira istomolarna raztopina (aminokislin, ki se določajo). Istomolarna raztopina mora vsebovati vsaj 30 % največje vsebnosti vsake aminokisline, ki se lahko natančno izmeri s sistemom za analizo aminokislin (4.9).

Za ločevanje treonina od serina razmerje med najnižjo in najvišjo vrednostjo za aminokislino z nižjo vrednostjo izmed dveh prekrivajočih se aminokislin ne sme presegati 2:10. (Če se določajo le cistein, metionin, treonin in lizin, bo neustrezna ločitev od sosednjih vrhov negativno vplivala na določanje.) Za vse druge aminokisline mora biti ločevanje boljše od 1:10.

Sistem mora zagotavljati, da se lizin loči od „lizinskih artefaktov“ in ornitina.

6.   Izračun rezultatov

Za vsako posamezno aminokislino se izračuna površina vzorca in najvišje vrednosti standarda ter količina (X), izražena v g aminokislin na kg vzorca.

Če se uporablja notranji standard, se pomnoži z:

A	=	površina vrha hidrolizata ali ekstrakta;
B	=	površina vrha standardne raztopine za umerjanje;
C	=	površina vrha hidrolizata ali ekstrakta kot notranjega standarda;
D	=	površina vrha standardne raztopine za umerjanje kot notranjega standarda;
M	=	molska masa aminokisline, ki se določa;
c	=	koncentracija standarda v μmol/ml;
m	=	masa vzorca v gramih (popravljena na prvotno maso, če je vzorec posušen ali razmaščen);
V	=	ml celotnega hidrolizata (5.3.4) ali izračunani celotni volumen razredčitve ekstrakta (6.1) v ml.

Cistin in cistein se določata kot cisteinska kislina v hidrolizatih oksidiranega vzorca, vendar se izračunata kot cistin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) z uporabo molske mase 120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol).

Metionin se določa kot metionin-sulfon v hidrolizatih oksidiranega vzorca, vendar se izračuna kot metionin, pri čemer se uporabi molska masa metionina: 149,21 g/mol.

Dodani prosti metionin se določa po ekstrakciji kot metionin, za izračun pa se uporabi ista molska masa.

6.1	Celotni volumen razredčitve ekstraktov (F) za določanje prostih aminokislin (5.2) se izračuna po naslednji formuli: V = volumen končnega ekstrakta.

7.   Ocena metode

Metoda je bila preskušena v mednarodni medlaboratorijski primerjavi, ki je bila izvedena leta 1990 s štirimi različnimi vrstami krme (mešana prašičja krma, mešanica za pitovne piščance, beljakovinski koncentrat, premiks). Rezultati, brez izjem, s srednjimi vrednostmi in standardnimi odmiki so prikazani v preglednici v tej točki:

Srednje vrednosti v g/kg

Referenčni material	Aminokislina
	Treonin	Cist(e)in	Metionin	Lizin
Mešana prašičja krma	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Mešanica za pitovne piščance	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Beljakovinski koncentrat	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Premiks	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = število sodelujočih laboratorijev.

7.1   Ponovljivost

Ponovljivost zgoraj navedene primerjave, izražena kot „standardni odmik v laboratoriju“, je prikazana v spodnji preglednici:

Standardni odmik (Sr) v laboratoriju, izražen v g/kg

Referenčni material	Aminokislina
	Treonin	Cist(e)in	Metionin	Lizin
Mešana prašičja krma	0,13 n = 15	0,10 n = 17	0,11 n = 17	0,26 n = 13
Mešanica za pitovne piščance	0,20 n = 16	0,11 n = 18	0,16 n = 18	0,28 n = 16
Beljakovinski koncentrat	0,48 n = 16	0,13 n = 17	0,27 n = 17	0,99 n = 15
Premiks	1,30 n = 16	—	2,19 n = 16	2,06 n = 16
n = število sodelujočih laboratorijev.

Koeficient variacije (%) standardnega odmika (Sr) v laboratoriju

Referenčni material	Aminokislina
	Treonin	Cist(e)in	Metionin	Lizin
Mešana prašičja krma	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Mešanica za pitovne piščance	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Beljakovinski koncentrat	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Premiks	2,2 n= 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = število sodelujočih laboratorijev.

7.2   Obnovljivost

Rezultati zgoraj navedene primerjave, izraženi kot standardni odmik med laboratoriji, so prikazani v spodnji preglednici:

Standardni odmik (SR) med laboratoriji, izražen v g/kg

Referenčni material	Aminokislina
	Treonin	Cist(e)in	Metionin	Lizin
Mešana prašičja krma	0,28 n = 15	0,30 n = 17	0,23 n = 17	0,30 n = 13
Mešanica za pitovne piščance	0,48 n = 16	0,34 n = 18	0,55 n = 18	0,75 n = 16
Beljakovinski koncentrat	0,85 n = 16	0,62 n = 17	1,57 n = 17	1,24 n = 15
Premiks	2,49 n = 16	—	6,20 n = 16	6,62 n = 16
n = število sodelujočih laboratorijev.

Koeficient variacije (%) standardnega odmika (SR) med laboratoriji

Referečni material	Amino Acid
	Treonin	Cist(e)in	Metionin	Lizin
Mešana prašičja krma	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Mešanica za pitovne piščance	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Beljakovinski koncentrat	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Premiks	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = število sodelujočih laboratorijev.

8.   Uporaba referenčnih materialov

Pravilna uporaba metode se preveri s ponovljenimi merjenji na potrjenih referenčnih materialih, kadar so na voljo. Priporočeno je umerjanje s potrjeno raztopino za umerjanje aminokislin.

9.   Opombe

9.1

Zaradi razlik med analizatorji aminokislin se kot smernica obravnavajo končne koncentracije raztopin standardnih aminokislin za umerjanje (glej 3.27.4 in 3.27.5) in hidrolizata (glej 5.3.4). Za vse aminokisline je treba preveriti območje naprave, v katerem je odziv linearen. Standardna raztopina se razredči s citratnim pufrom, da je površina vrha na sredini tega območja.

9.2	Kadar se za analizo hidrolizatov uporablja oprema za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, se morajo eksperimentalni pogoji optimizirati v skladu s priporočili proizvajalca.

9.3	Pri uporabi metode za krmo, ki vsebuje več kot 1 % klorida (koncentrat, mineralna krma, nadomestna krma), se lahko pojavi prenizka vrednost vsebnosti metionina in je zato potrebna posebna obdelava.

G.   DOLOČANJE TRIPTOFANA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje celotnega in prostega triptofana v krmi. Ne omogoča pa ločevanja med oblikama D in L.

2.   Načelo

Za določanje celotnega triptofana se vzorec hidrolizira pri bazičnih pogojih z nasičeno raztopino barijevega hidroksida in 20 ur segreva do 110 oC. Po hidrolizi se doda notranji standard.

Za določanje prostega triptofana se vzorec ekstrahira pri rahlo kislih pogojih v prisotnosti notranjega standarda.

Triptofan in notranji standard v hidrolizatu ali ekstraktu se določata s HPLC s fluorescenčno detekcijo.

3.   Reagenti

3.1	Uporabljati je treba dvakrat destilirano vodo ali vodo enake kakovosti (prevodnost < 10 μS/cm).

3.2	Standardna snov: triptofan (čistoča/vsebnost ≥ 99 %), osušen pod vakuumom nad fosforjevim pentoksidom

3.3	Snov, ki je notranji standard: α-metil-triptofan (čistoča/vsebnost ≥ 99 %), osušen pod vakuumom nad fosforjevim pentoksidom.

3.4	Barijev hidroksid oktahidrat (paziti je treba, da Ba(OH)2 .8 H2O ni pretirano izpostavljen zraku, da se ne bi tvoril BaCO3, ki lahko moti določanje) (glej opombo 9.3).

3.5	Natrijev hidroksid

3.6	Ortofosforna kislina, m (m/m) = 85 %

3.7	Klorovodikova kislina, ρ201,19 g/ml

3.8	Metanol, za HPLC

3.9	Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.10	Raztopina natrijevega hidroksida, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) se raztopi v vodi in dopolni z vodo do 1 litra (3.1).

3.11	Klorovodikova kislina, c = 6 mol/l: 492 ml HCl (3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.12	Klorovodikova kislina, c = 1 mol/l: 82 ml HCl (3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.13	Klorovodikova kislina, c = 0,1 mol/l: 8,2 ml HCl (3.7) se dopolni z vodo do 1 litra.

3.14	Ortofosforna kislina, c = 0,5 mol/l: 34 ml ortofosforne kisline (3.6) se dopolni z vodo (3.1) do 1 litra.

3.15	Koncentrirana raztopina triptofana (3.2), c = 2,50 μmol/ml: v 500-mililitrski merilni bučki se raztopi 0,2553 g triptofana (3.2) v klorovodikovi kislini (3.13) in dopolni s klorovodikovo kislino (3.13) do oznake. Hrani se največ 4 tedne pri –18 oC.

3.16	Koncentrirana raztopina notranjega standarda, c = 2,50 μmol/ml: v 500-mililitrski merilni bučki se raztopi 0,2728 g α-metil-triptofana (3.3) v klorovodikovi kislini (3.13) in dopolni se s klorovodikovo kislino (3.13) do oznake. Pri –18 oC se shrani največ 4 tedne.

3.17

Standardna raztopina triptofana in notranjega standarda za umerjanje: pripravi se 2,00 ml koncentrirane raztopine triptofana (3.15) in 2,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (α-metil-triptofan) (3.16). Razredči se z vodo (3.1) in metanolom (3.8) na približno enak volumen in približno enako koncentracijo metanola (10–30 %) kot pri končnem hidrolizatu. Ta raztopina se mora pripraviti sveža pred uporabo. Med pripravo jo je treba zaščititi pred neposredno sončno svetlobo.

3.18	Ocetna kislina

3.19	1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol

3.20	Etanolamin, m (m/m) > 98 %

3.21	1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) se raztopi v 100 ml metanola (3.8).

3.22	Mobilna faza za HPLC: 3,00 g ocetne kisline (3.18) + 900 ml vode (3.1) +50,0 ml raztopine (3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) v metanolu (3.8) (1 g/100 ml). pH se uravna na 5,00 z etanolaminom (3.20). Dopolni se z vodo do 1 000 ml (3.1).

4.   Oprema

4.1	Oprema HPLC s spektrofluorometričnim detektorjem

4.2	Kolona za tekočinsko kromatografijo, 125 mm x 4 mm C18, polnitev 3 μm ali enakovredna

4.3

pH meter

4.4	Bučka iz polipropilena, volumna 125 ml, s širokim vratom in zamaškom z navojem

4.5	Membranski filter, 0,45 μm

4.6	Avtoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar

4.7	Mehanski stresalnik ali magnetno mešalo

4.8	Vorteks mešalnik

5.   Postopek

5.1   Priprava vzorcev

Vzorec se zdrobi, tako da preide skozi 0,5 mm sito. Vzorce z visoko vsebnostjo vlage je treba pred drobljenjem osušiti na zraku pri temperaturi do 50 oC ali pa osušiti z zmrzovanjem. Vzorci z visoko vsebnostjo maščobe se pred drobljenjem ekstrahirajo s petroletrom (3.9).

5.2   Določanje prostega triptofana (ekstrakt)

Primerna količina (1–5 g) pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 1 mg natančno in prenese v erlenmajerico. Doda se 100,0 ml klorovodikove kisline (3.13) in 5,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16). Z mehanskim stresalnikom ali magnetnim mešalom (4.7) se stresa ali meša 60 minut. Pusti se, da se usedlina usede na dno, nato pa se odpipetira 10,0 ml supernatanta v čašo. Doda se 5 ml ortofosforne kisline (3.14). pH raztopine se z natrijevim hidroksidom (3.10) uravna na 3. Doda se dovolj metanola (3.8), da je v končnem volumnu koncentracija metanola 10–30 %. Prenese se v merilno bučko primernega volumna in razredči z vodo na volumen, potreben za kromatografijo (približno enak volumen kot pri standardni raztopini za umerjanje (3.17)).

Pred vbrizganjem na HPLC kolono se nekaj ml raztopine prefiltrira skozi 0,45 μm membranski filter (4.5). Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Standardna raztopina in ekstrakti se zaščitijo pred neposredno sončno svetlobo. Če ni možno analizirati ekstraktov istega dne, se lahko hranijo največ 3 dni pri 5 oC.

5.3   Določanje celotnega triptofana (hidrolizat)

0,1–1 g pripravljenega vzorca (5.1) se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v bučko iz polipropilena (4.4). Vsebnost dušika v natehtanem delu vzorca je približno 10 mg. Doda se 8,4 mg barijevega hidroksid oktahidrata (3.4) in 10 ml vode. Meša se na vorteks mešalniku (4.8) ali z magnetnim mešalom (4.7). S teflonom prevlečeni magnet se pusti v mešanici. Stene posode se sperejo s 4 ml vode. Zapre se z zamaškom z navojem, bučka pa se rahlo zapre. Prenese se v avtoklav (4.6), kjer je vrela voda, in pusti v pari 30–60 minut. Zapre se avtoklav in 20 ur avtoklavira pri 110 (± 2) oC.

Preden se avtoklav odpre, se temperatura zmanjša nekoliko pod 100 oC. Da se prepreči kristalizacija Ba(OH)2 ×8 H2O, se topli mešanici doda 30 ml vode sobne temperature. Rahlo se pretresa ali meša. Doda se 2,00 ml koncentrirane raztopine notranjega standarda (α-metil-triptofana) (3.16). Posode se 15 minut hladijo na vodni/ledeni kopeli.

Nato se doda 5 ml ortofosforne kisline (3.14). Posoda se zadrži v hladilni kopeli, med mešanjem nevtralizira s HCl (3.11), pH pa se s HCl (3.12) uravna na 3,0. Doda se dovolj metanola, da je koncentracija metanola v končnem volumnu 10–30 %. Prenese se v merilno bučko primernega volumna in razredči z vodo do volumna, potrebnega za kromatografijo (na primer 100 ml). Dodatek metanola ne povzroči obarjanja.

Pred vbrizganjem na HPLC kolono se nekaj ml raztopine prefiltrira skozi 0,45 μm membranski filter (4.5). Nadaljuje se s kromatografijo v skladu s točko 5.4.

Standardna raztopina in hidrolizati se zaščitijo pred neposredno sončno svetlobo. Če ni možno analizirati ekstraktov istega dne, se lahko hranijo največ 3 dni pri 5 oC.

5.4   Določanje s HPLC

Za izokratsko eluiranje se lahko kot smernica uporabljajo naslednji pogoji; lahko se uporabljajo tudi drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate (glej tudi opombi 9.1 in 9.2).

Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.2):	125 mm × 4 mm, C18, polnitev 3 μm ali enakovredna
Temperatura kolone:	sobna temperatura
Mobilna faza (3.22):	3,00 g ocetne kisline (3.18) + 900 ml vode (3.1) +50,0 ml raztopine (3.21) 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanola (3.19) v metanolu (3.8) (1 g/100 ml). pH raztopine se z etanolaminom (3.20) uravna na 5,00. Dopolni se z vodo (3.1) do 1 000 ml.
Hitrost pretoka:	1 ml/min
Skupni čas izvedbe:	približno 34 min
Detekcijska valovna dolžina:	ekscitacija: 280 nm, emisija: 356 nm.
Volumen, ki se vbrizga:	20 μl

6.   Izračun rezultatov

Količina triptofana (X), izražena v g na 100 g vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

A	=	površina vrha notranjega standarda, standardne raztopina za umerjanje (3.17);
B	=	površina vrha triptofana, ekstrakta (5.2) ali hidrolizata (5.3);
V1	=	volumen, v ml (2 ml), koncentrirane raztopine triptofana (3.15), dodane raztopini za umerjanje (3.17);
c	=	koncentracija, v μmol/ml (= 2,50), koncentrirane raztopine triptofana (3.15), dodane raztopini za umerjanje (3.17);
V2	=	volumen, v ml, koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16), dodane pri ekstrakciji (5.2) (= 5,00 ml) ali hidrolizatu (5.3) (= 2,00 ml);
C	=	površina vrha notranjega standarda, ekstrakta (5.2) ali hidrolizata (5.3);
D	=	površina vrha triptofana, standardne raztopine za umerjanje (3.17);
V3	=	volumen, v ml (= 2,00 ml), koncentrirane raztopine notranjega standarda (3.16), dodane standardni raztopini za umerjanje (3.17);
m	=	masa vzorca v g (popravljena na prvotno maso, če je vzorec posušen in/ali razmaščen);
M	=	molska masa triptofana (= 204,23 g/mol).

7.   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 10 % najvišjega rezultata.

8.   Rezultati medlaboratorijske študije

Organizirana je bila medlaboratorijska študija ES (četrta medlaboratorijska primerjava), pri kateri je 12 laboratorijev analiziralo 3 vzorce, da se potrdi metoda za hidrolizo. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat. Rezultati so prikazani v spodnji preglednici:

	Vzorec 1 Prašičja krma	Vzorec 2 Prašičja krma z dodanim L-triptofanom	Vzorec 3 Koncentrat prašičje krme
L	12	12	12
n	50	55	50
Srednja vrednost [g/kg]	2,42	3,40	4,22
Sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [ %]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [ %]	6,3	6,0	2,2

L	=	število laboratorijev, ki so predložili rezultate;
n	=	število uporabljenih posameznih rezultatov, razen izjem (identificiranih s testom za izjeme po Cochranu in Dixonu);
Sr	=	standardni odmik ponovljivosti;
SR	=	standardni odmik obnovljivosti;
r	=	ponovljivost;
R	=	obnovljivost;
CVr	=	koeficient variacije ponovljivosti v %;
CVR	=	koeficient variacije obnovljivosti v %.

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija ES (tretja medlaboratorijska primerjava), v kateri je 13 laboratorijev analiziralo 2 vzorca, da se potrdi metoda za ekstrakcijo prostega triptofana. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat. Rezultati so prikazani v spodnji preglednici:

	Vzorec 4 Mešanica pšenice in soje	Vzorec 5 Mešanica pšenice in soje (= vzorec 4) z dodanim triptofanom (0,457 g/kg1)
L	12	12
n	55	60
Srednja vrednost [g/kg]	0,391	0,931
Sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [ %]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [ %]	4,71	5,11

L	=	število laboratorijev, ki so predložili rezultate;
n	=	število uporabljenih posameznih rezultatov, razen izjem (identificiranih s testom za izjeme po Cochranu in Dixonu);
Sr	=	standardni odmik ponovljivosti;
SR	=	standardni odmik obnovljivosti;
r	=	ponovljivost;
R	=	obnovljivost;
CVr	=	koeficient variacije ponovljivosti v %;
CVR	=	koeficient variacije obnovljivosti v %.

Organizirana je bila še ena medlaboratorijska študija ES, v kateri je do 7 laboratorijev analiziralo 4 vzorce, da se potrdi metoda za hidrolizo triptofana. Rezultati so prikazani spodaj. Vsak vzorec je bil analiziran petkrat.

	Vzorec 1 Mešana prašičja krma (CRM 117)	Vzorec 2 Ribja moka z nizko vsebnostjo maščob (CRM 118)	Vzorec 3 Sojina moka (CRM 119)	Vzorec 4 Posneto mleko v prahu (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Srednja vrednost [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
Sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [ %]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [ %]	1,48	4,69	4,11	4,22

L	=	število laboratorijev, ki so predložili rezultate;
n	=	število uporabljenih posameznih rezultatov, po izločitvi izjem (identificiranih s testom za izjeme po Cochranu in Dixonu);
Sr	=	standardni odmik ponovljivosti;
SR	=	standardni odmik obnovljivosti;
r	=	ponovljivost;
R	=	obnovljivost;
CVr	=	koeficient variacije ponovljivosti v %;
CVR	=	koeficient variacije obnovljivosti v %.

9.   Opombe

9.1

Ločevanje triptofana in α-metil-triptofana lahko izboljšajo naslednji posebni kromatografski pogoji. Izokratsko eluiranje, ki mu sledi gradientno čiščenje kolone: Kolona za tekočinsko kromatografijo: 125 mm x 4 mm, C18, polnitev 5 μm ali enakovredna Temperatura kolone: 32 oC Mobilna faza: A. 0,01 mol/l KH2PO4/Metanol, 95+5 (V+V). B: Metanol Gradientni program: 0 min 100 % A 0 % B   15 min 100 % A 0 % B   17 min 60 % A 40 % B   19 min 60 % A 40 % B   21 min 100 % A 0 % B   33 min 100 % A 0 % B Hitrost pretoka: 1,2 ml/min Skupni čas izvedbe: približno 33 min

9.2

Kromatografija se spreminja glede na vrsto HPLC in uporabljeni material za polnitev kolone. Izbrani sistem mora zagotavljati ločevanje bazne linije triptofana in notranjega standarda. Poleg tega je pomembno, da se produkti razgradnje dobro ločijo od triptofana in notranjega standarda. Izvede se postopek s hidrolizatom brez notranjega standarda, da se preveri bazna linija notranjega standarda za nečistoče. Pomembno je, da je čas izvedbe dovolj dolg, da se eluirajo vsi produkti razgradnje, sicer lahko zapozneli vrhovi eluiranja motijo nadaljnje kromatografiranje. Kromatografski sistem se v delovnem območju odziva linearno. Linearni odziv se izmeri s konstantno (običajno) koncentracijo notranjega standarda in različnimi koncentracijami triptofana. Zelo pomembno je, da so velikosti vrhov triptofana in notranjega standarda v linearnem območju HPLC/fluorescenčnega sistema. Če so vrhovi triptofana in/ali notranjega standarda prenizki ali previsoki, se analiza ponovi z drugačno količino vzorca in/ali drugačnim končnim volumnom.

9.3	Barijev hidroksid Topnost barijevega hidroksida se s staranjem zmanjša. Posledica tega je motna raztopina za določitev HPLC, kar lahko povzroči nizke rezultate za triptofan.

H.   DOLOČANJE SUROVIH OLJ IN MAŠČOB

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti surovih olj in maščob v krmi. Ne omogoča analize oljnih semen in oljnatega sadja.

Vrsta in sestava krme ter namena izvajanja analize vplivata na uporabo spodaj opisanih postopkov.

1.1   Postopek A – Surova olja in maščobe, ki se ekstrahirajo neposredno

Ta metoda se uporablja za krmo rastlinskega izvora, razen tiste, ki je zajeta v področju uporabe postopka B.

1.2   Postopek B – Celotna surova olja in maščobe

Ta metoda se uporablja za krmo živalskega izvora in za vse krmne mešanice. Uporablja se za vso krmo, iz katere ni mogoče povsem ekstrahirati olj in maščob brez predhodne hidrolize (npr. gluteni, kvas, krompirjeve beljakovine in izdelki, pri katerih se izvaja izrivanje, kosmičenje in segrevanje).

1.3   Razlaga rezultatov

Vedno kadar je rezultat pri postopku B višji od rezultata pri postopku A, se kot prava vrednost sprejme rezultat, dobljen pri postopku B.

2.   Načelo

2.1   Postopek A

Vzorec se ekstrahira s petroletrom. Topilo se oddestilira, ostanek pa osuši in stehta.

2.2   Postopek B

Vzorec se med segrevanjem obdela s klorovodikovo kislino. Mešanica se ohladi in filtrira. Ostanek se spere in osuši, nato pa se izvede določanje v skladu s postopkom A.

3.   Reagenti

3.1	Petroleter, vrelišče 40–60 oC. Bromno število mora biti nižje od 1 in ostanek pri uparevanju nižji od 2 mg/100 ml.

3.2	Natrijev sulfat, brezvodni

3.3	Klorovodikova kislina, c = 3 mol/l

3.4	Filtracijsko sredstvo, npr. Kieselguhr, Hyflo-supercel

4.   Oprema

4.1	Naprava za ekstrakcijo. Če je opremljena s sifonom (naprava Soxhlet), je hitrost povratnega toka približno 10 ciklov na uro; če ni opremljena s sifonom, je hitrost povratnega toka približno 10 ml na minuto.

4.2	Kartuše za ekstrakcijo, ki ne vsebujejo materialov, topnih v petroletru, in s poroznostjo, ki je v skladu z zahtevami iz točke 4.1.

4.3	Sušilnik, vakuumski, nastavljen na 75 oC ± 3 oC, ali zračni, nastavljen na 100 oC ± 3 oC.

5.   Postopek

5.1   Postopek A (glej točko 8.1)

5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno, prenese v kartušo za ekstrakcijo (4.2) in pokrije s čepkom iz vate, ki ne vsebuje maščobe.

Kartuša se postavi v ekstraktor (4.1) in šest ur ekstrahira s petroletrom (3.1). Ekstrakt petroletra se zbere v suho stehtano bučko, v kateri so delci plovca (2).

Topilo se oddestilira. Ostanek se osuši tako, da se bučka za uro in pol postavi v sušilnik (4.3). Pusti se, da se ohladi v eksikatorju, in stehta. Ponovno se suši 30 minut, da se zagotovi ohranitev konstantne mase olj in maščob (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 1 mg).

5.2   Postopek B

2,5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno (glej točko 8.2), prenese v 400-mililitrsko čašo ali 300-mililitrsko erlenmajerico in ter doda 100 ml klorovodikove kisline (3.3) in delci plovca. Čaša se pokrije z urnim steklom ali pa se erlenmajerica spoji s kondenzatorjem povratnega toka. Pri nizkem plamenu ali na električnem kuhalniku se mešanica počasi zavre in se pusti rahlo vreti eno uro. Paziti je treba, da se vzorec ne oprijema sten posode.

Ohladi se in doda toliko filtracijskega sredstva (3.4), da med filtracijo ne pride do izgub olja in maščob. Filtrira se skozi navlažen, dvojni filtrirni papir, ki ne vsebuje maščob. Ostanek se spere s hladno vodo, dokler filtrat ni nevtralen. Prepričati se je treba, da filtrat ne vsebuje nobenih olj ali maščob. Njihova prisotnost pomeni, da se mora vzorec pred hidrolizo ekstrahirati s petroletrom po postopku A.

Dvojni filtrirni papir, na katerem je ostanek, se prenese na urno steklo in se uro in pol suši v sušilniku (4.3) pri 100 oC ± 3 oC.

Dvojni filtrirni papir s suhim ostankom se prenese v kartušo za ekstrahiranje (4.2) in pokrije s čepkom iz vate, ki ne vsebuje maščob. Kartuša se postavi v ekstraktor (4.1), nato pa se nadaljuje, kakor je navedeno v drugem in tretjem odstavku točke 5.1.

6.   Prikaz rezultatov

Masa ostanka se izrazi kot masni delež vzorca.

7.   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne presega:

—	0,2 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih olj in maščobe, nižje od 5 %,

—	4,0 % višjega rezultata za vsebnosti 5–10 %,

—	0,4 % absolutne vrednosti za vsebnosti nad 10 %.

8.   Opombe

8.1

Pri proizvodih z visoko vsebnostjo olj in maščob, ki jih je težko zdrobiti ali so neprimerni za pripravo homogenega zmanjšanega skupnega preskusnega vzorca, se uporabi naslednji postopek. 20 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in zmeša z 10 g ali več brezvodnega natrijevega sulfata (3.2). Ekstrahira se s petroletrom (3.1), kakor je navedeno v točki 5.1. Ekstrakt se dopolni s petroletrom do 500 ml (3.1) in premeša. 50 ml raztopine se prenese v majhno suho stehtano bučko, v kateri so delci plovca. Oddestilira se topilo, se osuši, nato pa se nadaljuje, kakor je določeno v zadnjem odstavku točke 5.1. Iz ostanka po ekstrakciji v kartuši se odstrani topilo, ostanek se zdrobi do velikosti delcev 1 mm, vrne v kartušo za ekstrakcijo (natrijev sulfat se ne doda), nato pa se nadaljuje, kakor je določeno v drugem in tretjem odstavku točke 5.1. Vsebnost olj in maščob kot masni delež vzorca se izračuna po naslednji formuli: (10m1 + m2) × 5 pri čemer je: m1 = masa ostanka po prvi ekstrakciji (alikvot ekstrakta) v gramih; m2 = masa ostanka po drugi ekstrakciji v gramih.

8.2	Pri proizvodih z nizko vsebnostjo olj in maščob se lahko preskusni vzorec poveča na 5 g.

8.3	Hrano za hišne živali, ki vsebuje veliko vode, je treba včasih pred hidrolizo in ekstrakcijo po postopku B zmešati z brezvodnim natrijevim sulfatom.

8.4	Pri točki 5.2 je za spiranje ostanka po filtraciji morda učinkoviteje uporabiti vročo vodo namesto hladne.

8.5	Pri nekateri krmi je morda treba podaljšati čas sušenja na več kot uro in pol. Odvečnemu sušenju se izogiba, saj lahko povzroči nizke rezultate. Uporabi se lahko tudi mikrovalovna pečica.

8.6	Če je vsebnost surovih olj/maščob višja od 15 %, se pred hidrolizo po postopku A priporoča predhodna ekstrakcija, pri postopku B pa ponovna ekstrakcija. Do določene mere je to odvisno od vrste krme ter vrste olj in maščob v krmi.

I.   DOLOČANJE SUROVIH VLAKEN

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje nemastnih organskih snovi v krmi, ki so netopne v kislih in baznih medijih ter so ponavadi poimenovane surova vlakna.

2.   Načelo

Vzorec se po potrebi razmasti in zaporedno obdela s specificiranimi koncentracijami vrelih raztopin žveplove kisline in kalijevega hidroksida. Ostanek se loči s filtracijo skozi filter iz sintranega stekla, spere, posuši, stehta in upepeli pri 475–500 oC. Izguba teže pri upepeljevanju ustreza vsebnosti surovih vlaken v preskusnem vzorcu.

3.   Reagenti

3.1	Žveplova kislina, c = 0,13 mol/l

3.2	Sredstvo proti penjenju (npr. n-oktanol)

3.3	Filtrirno sredstvo (Celite 545 ali enakovredno), segreto na 500 oC za štiri ure (8.6)

3.4

Aceton

3.5	Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.6	Klorovodikova kislina, c = 0,5 mol/l

3.7	Raztopina kalijevega hidroksida, c = 0,23 mol/l

4.   Oprema

4.1

Enota za segrevanje za razklop z žveplovo kislino in raztopino kalijevega hidroksida, opremljena z dodatkom za filtrirni lonček (4.2) in odtočno cevjo, ki je preko zamaška priklopljena na tekočino in vakuum, po možnosti s stisnjenim zrakom. Pred vsako uporabo se enota pet minut segreva z vrelo vodo.

4.2	Stekleni filtrirni lonček z nameščeno filtrirno ploščo iz sintranega stekla in velikosti por 40–90 μm. Pred prvo uporabo ga je treba za nekaj minut segreti na 500 oC in ohladiti (8.6).

4.3	Valj, volumna vsaj 270 ml, s kondenzatorjem povratnega toka, primernim za vretje

4.4	Sušilnik s termostatom

4.5	Žarilna peč s termostatom

4.6	Enota za ekstrakcijo, sestavljena iz podporne plošče za filtrirni lonček (4.2) in odtočne cevi, ki je preko zamaška priklopljena na vakuum in tekočino.

4.7	Obročki, ki povežejo enoto za segrevanje (4.1), lonček (4.2) in valj (4.3) ter enoto za hladno ekstrakcijo (4.6) in lonček.

5.   Postopek

1 g pripravljenega vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v lonček (4.2) (glej opombe 8.1, 8.2 in 8.3), čemur se doda 1 g filtrirnega sredstva (3.3).

Najprej se povežeta enota za segrevanje (4.1) in filtrirni lonček (4.2), nato pa valj (4.3) in lonček. V povezana valj in lonček se nalije 150 ml vrele žveplove kisline (3.1) in po potrebi nekaj kapljic sredstva proti penjenju (3.2).

Tekočina se zavre v 5 ± 2 minutah ter pusti močno vreti natančno 30 minut.

Odpre se zamašek na odtočni cevi (4.1), žveplova kislina se pod vakuumom filtrira skozi filtrirni lonček, ostanek pa se trikrat spere s po 30 ml vrele vode, da je filtrirni ostanek po vsakem spiranju suh.

Odtočni zamašek se zapre, v povezana valj in lonček se nalije 150 ml vrele raztopine kalijevega hidroksida (3.7), nato pa se doda nekaj kapljic sredstva proti penjenju (3.2). Tekočina se zavre v 5 ± 2 minutah ter pusti močno vreti natančno 30 minut. To se filtrira, postopek spiranja pa se ponovi, kakor je bil uporabljen za žveplovo kislino.

Po končnem spiranju in sušenju se lonček z vsebino odklopi in priklopi na enoto za hladno ekstrakcijo (4.6). Ostanek v lončku se pod vakuumom trikrat spere s po 25 ml acetona (3.4), da je filtrirni ostanek po vsakem spiranju suh.

Lonček se suši v sušilniku pri 130 oC do konstantne teže. Po vsakem sušenju se ohladi v eksikatorju in hitro stehta. Lonček se postavi v žarilno peč in pri 475–500 oC žari najmanj 30 minut do konstantne teže (izguba teže med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 2 mg).

Po vsakem segrevanju in pred merjenjem se lonček najprej ohladi v peči, nato pa še v eksikatorju.

Slepi preskus se izvede brez vzorca. Izguba teže pri žarjenju ne sme presegati 4 mg.

6.   Izračun rezultatov

Vsebnost surovih vlaken, izražena kot masni delež vzorca, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

m	=	masa vzorca v gramih;
m0	=	izguba mase po žarjenju pri določanju v gramih;
m1	=	izguba mase po žarjenju pri slepem preskusu v gramih.

7.   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

—	0,6 % absolutne vrednosti za vsebnosti surovih vlaken, manjše od 10 %,

—	6 % višje vrednosti za vsebnosti surovih vlaken 10 % ali več.

8.   Opombe

8.1

Krmo, ki vsebuje več kakor 10 % surovih maščob, je treba pred analizo razmastiti s petroletrom (3.5). Filtrirni lonček (4.2) z vsebino se poveže z enoto za hladno ekstrakcijo (4.6), ostanek pa se pod vakuumom trikrat spere s po 30 ml petroletra, da je ostanek suh. Lonček z vsebino se poveže z enoto za segrevanje (4.1), nadaljuje pa se v skladu s točko 5.

8.2

Krmo, ki vsebuje maščobe, ki se ne morejo neposredno ekstrahirati s petroletrom (3.5), je treba razmastiti, kakor je navedeno v točki 8.1, in ponovno razmastiti po vretju s kislino. Po vretju s kislino in nadaljnjim spiranjem se lonček z vsebino poveže z enoto za hladno ekstrakcijo (4.6) ter trikrat spere s po 30 ml acetona in trikrat s po 30 ml petroletra. Filtrira se pod vakuumom do suhega stanja, nadaljuje pa se, kakor je navedeno v točki 5, pri čemer se začne z dodajanjem kalijevega hidroksida.

8.3

Če krma vsebuje več kot 5 % karbonatov, izraženih kot kalcijev karbonat, se lonček (4.2) z natehtanim vzorcem poveže z enoto za segrevanje (4.1). Vzorec se trikrat spere s po 30 ml klorovodikove kisline (3.6). Po vsakem dodajanju je treba vzorec pustiti stati približno eno minuto, preden se filtrira. Ponovno se spere s 30 ml vode, nato pa se nadaljuje, kakor je navedeno v točki 5.

8.4	Če se uporablja naprava v obliki stojala (številni lončki, povezani na isto enoto za segrevanje), se v isti seriji ne smeta opraviti posamezni določanji na istem vzorcu za analizo.

8.5	Če je po vretju težko filtrirati kisle in bazične raztopine, se uporabi stisnjen zrak skozi odtočno cev enote za segrevanje in se nato nadaljuje s filtriranjem.

8.6	Temperatura žarjenja ne presega 500 oC, da se podaljša obstojnost steklenih filtrirnih lončkov. Potrebna je previdnost, da se preprečijo odvečni toplotni šoki med segrevanjem ali hlajenjem.

J.   DOLOČANJE SLADKORJA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje količine reducirajočih sladkorjev in celotnih sladkorjev po inverziji, izraženih kot glukoza ali, kadar je to primerno, saharoza s faktorjem preračunavanja 0,95. Uporablja se za krmne mešanice. Za drugo krmo se uporabljajo posebne metode. Kadar je primerno, se laktoza izmeri ločeno in upošteva pri izračunu rezultata.

2.   Načelo

Sladkorji se ekstrahirajo z razredčenim etanolom in raztopina se zbistri z raztopinama Carrez I in II. Po odstranitvi etanola se določijo količine pred inverzijo in po njej po Luff-Schoorlovi metodi.

3.   Reagenti

3.1	Etanol, 40-odstotna raztopina (v/v), gostota: 0,948 g/ml pri 20 oC, nevtraliziran proti fenolftaleinu

3.2	Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn (CH3COO)2 × 2H2O in 3 g ledoceta se raztopijo v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.3	Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4 Fe (CN)6 × 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4	Metiloranž 0,1-odstotna raztopina (m/v)

3.5	Klorovodikova kislina, 4 mol/l

3.6	Klorovodikova kislina, 0,1 mol/l

3.7	Raztopina natrijevega hidroksida, 0,1 mol/l

3.8

Luff-Schoorlov reagent: Med previdnim mešanjem se v raztopimo natrijevega karbonata (3.8.3) vlije raztopina citronske kisline (3.8.2). Doda se raztopina bakrovega sulfata (3.8.1), nato pa se dopolni z vodo do 1 litra. Pusti se čez noč in nato filtrira. Preveri se koncentracija tako dobljenega reagenta (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l), glej zadnji odstavek točke 5.4. pH raztopine je približno 9,4.

3.8.1

Raztopina bakrovega sulfata: v 100 ml vode se raztopi 25 g bakrovega sulfata (Cu SO4 5H2O), ki ne vsebuje železa.

3.8.2

Raztopina citronske kisline: v 50 ml vode se raztopi 50 g citronske kisline (C6H8O7.H2O).

3.8.3

Raztopina natrijevega karbonata: v približno 300 ml tople vode se raztopi 143,8 g brezvodnega natrijevega karbonata. Pusti se, da se ohladi.

3.9	Raztopina natrijevega tiosulfata, 0,1 mol/l.

3.10	Raztopina škroba: v liter vrele vode se doda suspenzija 5 g topnega škroba v 30 ml vode. Pusti se vreti 3 minute, nato se ohladi in po potrebi doda 10 mg živosrebrovega jodida kot konzervansa.

3.11	Žveplova kislina, 3 mol/l

3.12	Kalijev jodid, 30-odstotna raztopina (m/v)

3.13	Zdrobljen plovec, prevret v klorovodikovi kislini, opran z vodo in osušen

3.14	3-metilbutan-l-ol

4.   Oprema

Mešalnik: približno 35 do 40 obr./min.

5.   Postopek

5.1   Ekstrakcija vzorca

2,5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v 250-mililitrsko merilno bučko. Doda se 200 ml etanola (3.1) in v mešalniku meša 1 uro. Doda se 5 ml raztopine Carrez I (3.2) in meša približno 30 sekund. Doda se 5 ml raztopine Carrez II (3.3) in ponovno meša 1 minuto. Dopolni se z etanolom (3.1) do oznake, homogenizira in filtrira. Odstrani se 200 ml filtrata in upari približno do polovice, da se odstrani skoraj ves etanol. Ostanek po uparevanju se s toplo vodo prenese v 200-mililitrsko merilno bučko, ohladi se, dopolni z vodo do oznake, homogenizira in po potrebi filtrira. Ta raztopina se uporabi za določanje količine reducirajočih sladkorjev, po inverziji pa celotnih sladkorjev.

5.2   Določanje reducirajočih sladkorjev

Odpipetira se največ 25 ml raztopine, ki vsebuje manj kot 60 mg reducirajočih sladkorjev, izraženih kot glukoza. Po potrebi se dopolni z destilirano vodo do 25 ml in določi vsebnost reducirajočih sladkorjev po Luff-Schoorlovi metodi. Rezultat se izrazi kot masni delež glukoze v vzorcu.

5.3   Določanje celotnih sladkorjev po inverziji

50 ml raztopine se odpipetira v 100-mililitrsko merilno bučko. Doda se nekaj kapljic raztopine metiloranža (3.4), nato pa se previdno in ob neprestanem mešanju doda klorovodikova kislina (3.5), dokler tekočina na postane močno rdeča. Doda se 15 ml klorovodikove kisline (3.6), bučka se potopi v skoraj vrelo vodno kopel in v njej pusti 30 minut. Hitro se ohladi na približno 20 oC, nato pa se doda 15 ml raztopine natrijevega hidroksida (3.7). Dopolni se z vodo do 100 ml in homogenizira. Odpipetira se največ 25 ml raztopine, ki vsebuje manj kot 60 mg reducirajočih sladkorjev, izraženih kot glukoza. Po potrebi se dopolni z destilirano vodo do 25 ml in določi vsebnost reducirajočih sladkorjev po Luff-Schoorlovi metodi. Rezultat se izrazi kot masni delež glukoze ali, kadar je to primerno, saharoze tako, da se pomnoži s faktorjem 0,95.

5.4   Titracija po Luff-Schoorlovi metodi

25 ml Luff-Schoorlovega reagenta (3.8) se odpipetira v 300-mililitrsko erlenmajerico; doda se natančno 25 ml zbistrene raztopine sladkorja. Dodata se 2 zrni plovca (3.13) in med ročnim mešanjem se segreva nad prostim plamenom srednje višine tako, da raztopina zavre v približno dveh minutah. Erlenmajerica se takoj postavi na žično mrežico, prevlečeno z azbestom, ki ima odprtino s premerom 6 cm, pod katero je prižgan plamen. Plamen se naravna tako, da se segreva le dno erlenmajerice. Na erlenmajerico se namesti kondenzator povratnega toka. Pusti se vreti natančno 10 minut. Takoj se ohladi v mrzli vodi in čez približno pet minut titrira na naslednji način:

doda se 10 ml raztopine kalijevega jodida (3.12) in takoj nato (previdno zaradi možnosti močnega penjenja) 25 ml žveplove kisline (3.11). Z raztopino natrijevega tiosulfata (3.9) se titrira do svetlorumene barve, doda se indikator škrob (3.10), nato pa se titracija zaključi.

Enaka titracija se izvede brez vretja z natančno izmerjeno mešanico 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta (3.8) in 25 ml vode, potem ko se ji doda 10 ml raztopine kalijevega jodida (3.12) in 25 ml žveplove kisline (3.11).

6.   Izračun rezultatov

S pomočjo preglednice se določi količina glukoze v mg, ki ustreza razliki med vrednostma obeh titracij, izraženi v mg natrijevega tiosulfata 0,1 mol/l. Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

7.   Posebni postopki

7.1

Pri krmi, ki vsebuje veliko melase, in drugi krmi, ki ni zelo homogena, se natehta 20 g vzorca in s 500 ml vode prenese v litrsko merilno bučko. V mešalniku se meša 1 uro. Raztopina se zbistri z uporabo reagentov Carrez I (3.2) in II (3.3), kakor je opisano v točki 5.1, vendar se uporabi štirikratna količina vsakega reagenta. Bučka se dopolni z 80-odstotnim etanolom (v/v) do oznake. Homogenizira se in filtrira. Etanol se odstrani, kakor je opisano v točki 5.1. Če ni dekstriniranega škroba, se dopolni do oznake z destilirano vodo.

7.2

V primeru melas in posamične krme, ki vsebujejo veliko sladkorja in so skoraj brez škroba (rožiči, posušene rezine pese itd.), se natehta 5 g in prenese v 250-mililitrsko merilno bučko, doda se 200 ml destilirane vode in eno uro ali po potrebi več meša v mešalniku. Raztopina se zbistri z uporabo reagentov Carrez I (3.2) in II (3.3), kakor je opisano v točki 5.1. Dopolni se z mrzlo vodo do oznake, homogenizira in filtrira. Za določanje količine celotnih sladkorjev se nadaljuje, kakor je opisano v točki 5.3.

8.   Opombe

8.1	Za preprečevanje penjenja je priporočljivo, da se pred vretjem z Luff-Schoorlovim reagentom doda (ne glede na volumen) približno 1 ml 3-metilbutan-l-ola (3.14).

8.2	Razlika med vsebnostjo celotnih sladkorjev po inverziji, izraženih kot glukoza, in vsebnostjo reducirajočih sladkorjev, izraženih kot glukoza, pomnoženo z 0,95, je masni deleži saharoze.

8.3	Za določanje vsebnosti reducirajočih sladkorjev, razen laktoze, se lahko uporabljata dve metodi:

8.3.1

za približen izračun se vsebnost laktoze, določena z drugo analitsko metodo, pomnoži z 0,675, dobljeni rezultat pa se odšteje od vsebnosti reducirajočih sladkorjev;

8.3.2

za natančen izračun reducirajočih sladkorjev, razen laktoze, je treba za končno določitev uporabiti isti vzorec. Ena od analiz se izvede na delu raztopine, ki nastane pri postopku iz točke 5.1, druga pa na delu raztopine, ki nastane pri določanju laktoze z metodo, določeno za navedeni namen (po fermentiranju drugih vrst sladkorja in zbistritve). V obeh primerih se količina sladkorja določi z Luff-Schoorlovo metodo in izračuna v mg glukoze. Ena vrednost se odšteje od druge in razlika se izrazi kot masni delež vzorca. Primer: Za vsako določanje oba uporabljena volumna ustrezata 250 mg vzorca. V prvem primeru se porabi 17 ml raztopine natrijevega tiosulfata 0,1 mol/l, kar ustreza 44,2 mg glukoze, v drugem pa 11 ml, kar ustreza 27,6 mg glukoze. Razlika je 16,6 mg glukoze. Vsebnost reducirajočih sladkorjev (razen laktoze), izračunana kot glukoza, je zato:

Preglednica vrednosti za 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta

ml Na2 S2 O30,1 mol/l, 2 minuti segrevanja, 10 minut vretja

Na2S2O3 0,1 mol/l	Glukoza, fruktoza, sladkorji po inveriziji C6H12O6		Laktoza C12H22O11		Maltoza C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	razlika	mg	razlika	mg	razlika	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   DOLOČANJE LAKTOZE

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni laktoze v krmi, ki vsebuje več kot 0,5 % laktoze.

2.   Načelo

Sladkorji se raztopijo v vodi. Raztopina se fermentira s kvasovkami vrste Saccharomyces cerevisiae, ki ne spreminjajo laktoze. Po zbistritvi in filtriranju se vsebnost laktoze v filtratu določi po Luff-Schoorlovi metodi.

3.   Reagenti

3.1	Suspenzija kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae: 25 g svežih kvasovk se raztopi v 100 ml vode. Suspenzija je ob hranjenju v hladilniku uporabna največ en teden.

3.2	Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn (CH3 COO)2 2H2O in 3 g ledoceta se raztopijo v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.3	Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4 Fe (CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4

Luff-Schoorlov reagent: med previdnim mešanjem se v raztopino natrijevega karbonata (3.4.3) vlije raztopina citronske kisline (3.4.2). Doda se raztopina bakrovega sulfata (3.4.1), nato pa se dopolni z vodo do 1 litra. Pusti se čez noč in nato filtrira. Preveri se koncentracija tako dobljenega reagenta (Cu 0,05 mol/l, Na2 CO3 1 mol/l). pH raztopine je približno 9,4.

3.4.1

Raztopina bakrovega sulfata: v 100 ml vode se raztopi 25 g bakrovega sulfata (Cu SO4 × 5H2O), ki ne vsebuje železa.

3.4.2

Raztopina citronske kisline: v 50 ml vode se raztopi 50 g citronske kisline (C6H8O7×H2O).

3.4.3

Raztopina natrijevega karbonata: v približno 300 ml tople vode se raztopi 143,8 g brezvodnega natrijevega karbonata. Pusti se, da se ohladi.

3.5	Zdrobljen plovec, prevret v klorovodikovi kislini, opran z vodo in osušen

3.6	Kalijev jodid, 30-odstotna raztopina (m/v)

3.7	Žveplova kislina, 3 mol/l

3.8	Raztopina natrijevega tiosulfata, 0,1 mol/l

3.9	Raztopina škroba: v liter vrele vode se doda suspenzija 5 g topnega škroba v 30 ml vode. Pusti se vreti 3 minute, nato pa se ohladi in po potrebi doda 10 mg živosrebrovega jodida kot konzervansa.

4.   Oprema

Vodna kopel s termostatom, nastavljenim na 38–40 oC

5.   Postopek

1 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko. Doda se 25–30 ml vode. Bučka se za 30 minut postavi v vrelo vodno kopel, nato ohladi na približno 35 oC. Doda se 5 ml suspenzije kvasovk (3.1) in homogenizira. Bučka se pusti 2 uri v vodni kopeli pri temperaturi 38–40 oC. Ohladi se na približno 20 oC.

Doda se 2,5 ml raztopine Carrez I (3.2) in meša 30 sekund, nato se doda 2,5 ml raztopine Carrez II (3.3) in ponovno meša 30 sekund. Dopolni se z vodo do 100 ml, premeša in filtrira. Del filtrata, ki ne presega 25 ml in ki priporočljivo vsebuje 40 do 80 mg laktoze, se odpipetira in prenese v 300-mililitrsko erlenmajerico. Po potrebi se dopolni z vodo do 25 ml.

Slepi preskus s 5 ml suspenzije kvasovk (3.1) se izvede pri enakih pogojih. Vsebnost laktoze se določi po Luff-Schoorlovi metodi na naslednji način: doda se natančno 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta (3.4) in 2 zrni plovca (3.5). Med ročnim mešanjem se segreva nad prostim plamenom srednje jakosti tako, da tekočina zavre v približno 2 minutah. Erlenmajerica se takoj postavi na žično mrežico, prevlečeno z azbestom, ki ima odprtino s premerom 6 cm, pod katero je prižgan plamen. Plamen se naravna tako, da se segreva le dno erlenmajerice. Na erlenmajerico se namesti kondenzator povratnega toka. Pusti se vreti natančno 10 minut. Takoj se ohladi v mrzli vodi in čez približno 5 minut titrira na naslednji način:

doda se 10 ml raztopine kalijevega jodida (3.6) in takoj nato (previdno zaradi možnosti močnega penjenja) 25 ml žveplove kisline (3.7). Z raztopino natrijevega tiosulfata (3.8) se titrira do svetlorumene barve, doda se indikator škrob (3.9), nato pa se titracija zaključi.

Enaka titracija se izvede brez vretja z natančno izmerjeno mešanico 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta (3.4) in 25 ml vode, potem ko se ji doda 10 ml raztopine kalijevega jodida (3.6) in 25 ml žveplove kisline (3.7).

6.   Izračun rezultatov

S pomočjo priložene preglednice se določi količina laktoze v mg, ki ustreza razliki med rezultatoma dveh titracij, izraženih v ml natrijevega tiosulfata 0,1 mol/l.

Rezultat se izrazi kot masni delež brezvodne laktoze v vzorcu.

7.   Opomba

Pri proizvodih, ki vsebujejo več kot 40 % fermentiranega sladkorja, se uporabi več kot 5 ml suspenzije kvasovk (3.1).

Preglednica vrednosti za 25 ml Luff-Schoorlovega reagenta

ml Na2 S2 O30,1 mol/l, 2 minuti segrevanja, 10 minut vretja

Na2S2O3 0,1 mol/l	Glukoza, fruktoza, sladkorji po inveriziji C6H12O6		Laktoza C12H22O11		Maltoza C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/l
ml	mg	razlika	mg	razlika	mg	razlike	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

L.   DOLOČANJE ŠKROBA

POLARIMETRIČNA METODA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni škroba in visokomolekularnih produktov razgradnje škroba v krmi za preverjanje skladnosti z označeno energijsko vrednostjo (določbe iz Priloge VII) in Direktivo Sveta 96/25/ES (3).

2.   Načelo

Metoda vključuje dve določanji. Pri prvi se vzorec obdela z razredčeno klorovodikovo kislino. Po zbistritvi in filtriranju se izmeri optična rotacija raztopine s polarimetrijo.

Pri drugi se vzorec ekstrahira s 40-odstotnim etanolom. Po nakisanju filtrata s klorovodikovo kislino ter zbistritvi in filtriranju se izmeri optična rotacija tako kot pri prvem določanju.

Razlika med dvema meritvama, pomnožena z znanim faktorjem, je vsebnost škroba v vzorcu.

3.   Reagenti

3.1	Klorovodikova kislina, 25-odstotna raztopina (m/v), gostota: 1,126 g/ml

3.2	Trikloroocetna kislina, 1,13-raztopina raztopina (m/v) Koncentracija se mora preveriti s titracijo z 0,1 mol/l raztopino natrijevega hidroksida v prisotnosti 0,1-odstotnega (m/v) metil rdečega v 94-odstotnem (v/v) etanolu. Za nevtralizacijo 10 ml je potrebno 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

3.3	Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn(CH3COO)2 2H2O in 3 g ledoceta se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.4	Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4(Fe(CN)6 3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.5	Etanol, 40-odstotna raztopina (v/v), gostota: 0,948 g/ml pri 20 oC

4.   Oprema

4.1	250-mililitrska erlenmajerica s standardnim brušenim vratom in kondenzatorjem povratnega toka

4.2	Polarimeter ali saharometer

5.   Postopek

5.1   Priprava vzorca

Vzorec se zdrobi tako, da vsi delci preidejo skozi sito z okroglimi luknjicami premera 0,5 mm.

5.2   Določanje celotne optične rotacije (P ali S) (glej opombo 7.1)

2,5 g zdrobljenega vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko. Doda se 25 ml klorovodikove kisline (3.2), pretrese se, da nastane enakomerna porazdelitev preskusnega vzorca, nato pa se doda nadaljnjih 25 ml klorovodikove kisline (3.2). Bučka se potopi v vrelo vodno kopel in prve 3 minute močno in enakomerno stresa, da se prepreči nastanek aglomeratov. V vodni kopeli mora biti toliko vode, da kopel ostane na točki vrelišča, ko se vanjo potopi bučka. Bučke se med stresanjem ne sme odstraniti iz kopeli. Po natanko 15 minutah se bučka odstrani iz kopeli, doda se 30 ml hladne vode, nato pa se takoj ohladi na 20 oC.

Doda se 5 ml Raztopine Carrez I (3.3) in stresa približno 30 sekund. Nato se doda 5 ml raztopine Carrez II (3.4) in ponovno stresa 30 sekund. Dopolni se z vodo do oznake, premeša in filtrira. Če filtrat ni popolnoma bister (kar je redko), se ponovi določanje z uporabo večje količine raztopin Carrez I in II, na primer 10 ml.

Optična rotacija raztopine v 200-milimetrski epruveti se izmeri s polarimetrom ali saharimetrom.

5.3   Določanje optične rotacije (P' ali S') snovi, ki so topne v 40-odstotnem etanolu

5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno, prenese v 100-mililitrsko merilno bučko in doda se približno 80 ml etanola (3.5) (glej opombo 7.2). Bučka se pusti stati 1 uro na sobni temperaturi; v tem času se šestkrat močno pretrese, da se preskusni vzorec temeljito premeša z etanolom. Dopolni se z etanolom (3.5) do oznake, premeša in filtrira.

50 ml filtrata (kar ustreza 2,5 g vzorca) se odpipetira v 250-mililitrsko erlenmajerico, doda se 2,1 ml klorovodikove kisline (3.1) in močno pretrese. Erlenmajerica se spoji s kondenzatorjem povratnega toka in potopi v vrelo vodno kopel. Po natanko 15 minutah se erlenmajerica odstrani iz kopeli, vsebina se prenese v 100-mililitrsko merilno bučko, spere se z malo hladne vode in ohladi na 20 oC.

Za zbistritev se uporabita raztopini Carrez I (3.3.) in II (3.4), dopolni se z vodo do oznake, premeša in filtrira, nato pa se izmeri optična rotacija, kakor je navedeno v drugem in tretjem odstavku točke 5.2.

6.   Izračun rezultatov

Vsebnost škroba (%) se izračuna na naslednji način:

6.1   meritve s polarimetrom

P	=	celotna optična rotacija v kotnih stopinjah;
P'	=	optična rotacija snovi, ki so topne v 40-odstotnem (V/V) etanolu, v kotnih stopinjah;
	=	specifična optična rotacija čistega škroba. Vrednosti, D ki se ponavadi uporabljajo za ta faktor, so: + 185,9o: rižev škrob; + 185,7o: krompirjev škrob; + 184,6o: koruzni škrob; + 182,7o: pšenični škrob; + 181,5o: ječmeni škrob; + 181,3o: ovseni škrob; + 184,0o: druge vrste škroba in škrobnih mešanic v krmnih mešanicah.

6.2   meritve s saharimetrom

S	=	celotna optična rotacija v stopinjah saharimetra;
S'	=	optična rotacija snovi, ki so topne v 40-odstotnem (v/v) etanolu, v stopinjah saharimetra;
N	=	masa (g) saharoze v 100 ml vode, pri kateri je optična rotacija 100 saharimetrskih stopinj, kadar se meri z uporabo 200-milimetrske epruvete; 16,29 g za francoske saharimetre; 26,00 g za nemške saharimetre; 20,00 g za mešane saharimetre;
	=	specifična optična rotacija čistega škroba (glej 6.1).

6.3   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 0,4 absolutne vrednosti za vsebnost škroba, ki je nižja od 40 %, in 1 % relativne vrednosti za vsebnost škroba, ki je enaka ali višja od 40 %.

7.   Opombe

7.1	Če vzorec vsebuje več kot 6 % karbonatov, izračunanih v obliki kalcijevega karbonata, se jih mora pred določanjem celotne optične rotacije razkrojiti z obdelavo z natančno primerno količino razredčene žveplove kisline.

7.2

V primeru proizvodov, ki imajo visoko vsebnost laktoze, kot je serum mleka v prahu ali posneto mleko v prahu, se po dodatku 80 ml etanola (3.5) izvaja naslednje: bučka se spoji s kondenzatorjem povratnega toka in se za 30 minut potopi v vodno kopel pri 50 oC. Pusti se, da se ohladi, in nadaljuje z analizo, kakor je navedeno v točki 5.3.

7.3

Naslednja posamična krmila, kadar so prisotna v znatni količini v krmi, povzročajo motnje pri določanju vsebnosti škroba s polarimetrično metodo, zaradi česar so lahko rezultati nepravilni: — proizvodi iz (sladkorne) pese, kot so pulpa (sladkorne) pese, melasa (sladkorne) pese, melasirana pulpa (sladkorne) pese, usedlina pri destilaciji (sladkorne) pese, (pesni) sladkor, — pulpa agrumov, — laneno seme; laneno seme z nižjo vsebnostjo maščobe; ekstrahirano laneno seme, — seme oljne ogrščice; oljna ogrščica z nižjo vsebnostjo maščobe; ekstrakt oljne ogrščice; luščine oljne ogrščice, — sončnično seme; ekstrahirano sončnično seme; sončnično seme, delno oluščeno, ekstrahirano, — kopra z nižjo vrednostjo maščobe; ekstrakt kopre, — krompirjeva pulpa, — suhi kvas, — proizvodi z visoko vsebnostjo inulina (npr. koščki in moka topinamburja), — ocvirki.

M.   DOLOČANJE SUROVEGA PEPELA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje vsebnosti surovega pepela v krmi.

2.   Načelo

Vzorec se upepeli pri 550 oC; ostanek se stehta.

3.   Reagenti

Amonijev nitrat, 20-odstotna raztopina (m/v)

4.   Oprema

4.1	Grelna plošča

4.2	Električna žarilna peč s termostatom

4.3	Žarilni lončki za upepeljevanje iz kremena, porcelana ali platine, pravokotni (približno 60 × 40 × 25 mm) ali okrogli (premer: 60 do 75 mm, višina: 20 do 40 mm)

5.   Postopek

Približno 5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno (2,5 g pri proizvodih, ki lahko nabreknejo) in prenese v žarilni lonček za upepelitev, ki se predhodno segreje na 550 oC, ohladi in tarira. Lonček se postavi na grelno ploščo in postopoma segreva, da snov zogleni. Upepeli se v skladu s točko 5.1 ali 5.2.

5.1	Lonček se postavi v žarilno peč, segreto na 550 oC. Pri tej temperaturi se pusti, dokler ne nastane bel, svetlosiv ali rdečkast pepel, ki je videti, da ne vsebuje ogljikovih delcev. Lonček se postavi v eksikator, pusti se, da se ohladi, in takoj stehta.

5.2

Lonček se postavi v žarilno peč, segreto na 550 oC. V peči se pusti 3 ure. Lonček se postavi v eksikator, pusti se, da se ohladi, in takoj stehta. Ponovno se postavi v žarilno peč za 30 minut, pri čemer mora biti masa pepela konstantna (izguba mase med dvema zaporednima tehtanjema ne sme presegati 1 mg).

6.   Izračun rezultatov

Masa ostanka se izračuna tako, da se odšteje tara.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

7.   Opombe

7.1

Snovi, ki se težko upepelijo, je treba najprej najmanj tri ure upepeljevati, nato ohladiti in jim dodati nekaj kapljic 20-odstotne raztopine amonijevega nitrata ali vode (pazljivo, da se pepel ne razprši ali da ne nastanejo grude). Po sušenju v sušilniku se nadaljuje z žarjenjem. Postopek se po potrebi ponovi, dokler upepelitev ni popolna.

7.2

Pri snoveh, ki so odporne na obdelavo iz točke 7.1, se nadaljuje na naslednji način: po triurni upepelitvi se pepel prenese v vročo vodo in filtrira skozi majhen filter brez pepela. Filter in njegova vsebina se upepelita v istem lončku. Filtrat se prenese v ohlajen lonček, upari do suhega, upepeli in stehta.

7.3	Pri oljih in maščobah se 25 g vzorca natančno natehta v lonček primerne velikosti. Upepeli se tako, da se snov zažge s trakom iz filtrirnega papirja brez pepela. Po sežigu se navlaži s čim manj vode. Osuši in upepeli se, kakor je opisano v točki 5.

N.   DOLOČANJE PEPELA, NETOPNEGA V KLOROVODIKOVI KISLINI

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni mineralnih snovi v krmi, netopnih v klorovodikovi kislini. Glede na naravo vzorca se lahko uporabljata dve metodi.

1.1	Metoda A: uporablja se za organska posamična krmila in za večino krmnih mešanic;

1.2	Metoda B: uporablja se za mineralne krmne mešanice in krmne mešanice, ki vsebujejo več kot 1 % snovi, netopnih v klorovodikovi kislini in določenih po metodi A.

2.   Načelo

2.1	Metoda A: vzorec se upepeli, pepel se raztopi v vreli klorovodikovi kislini, netopni ostanek pa filtrira in stehta.

2.2	Metoda B: vzorec se obdela s klorovodikovo kislino. Raztopina se filtrira, ostanek se upepeli, tako dobljeni pepel pa se obdela v skladu z metodo A.

3.   Reagenti

3.1	Klorovodikova kislina, 3 mol/l

3.2	Trikloroocetna kislina, 20-odstotna raztopina (m/v)

3.3	Trikloroocetna kislina, 1-odstotna raztopina (m/v)

4.   Oprema

4.1	Grelna plošča

4.2	Električna žarilna peč s termostatom

4.3	Žarilni lončki za upepeljevanje iz kremena, porcelana ali platine, pravokotni (približno 60 × 40 × 25 mm) ali okrogli (premer: 60 do 75 mm, višina: 20 do 40 mm)

5.   Postopek

5.1   Metoda A

Vzorec se upepeli po metodi za določanje surovega pepela. Lahko se uporabi pepel, dobljen pri navedeni analizi.

Pepel se prenese v 250- do 400-mililitrsko čašo s 75 ml klorovodikove kisline (3.1). Počasi se segreje do vretja in pusti rahlo vreti petnajst minut. Topla raztopina se filtrira skozi filtrirni papir brez pepela, ostanek pa se spira s toplo vodo, dokler kisla reakcija ne preneha. Filter z ostankom in pepelom se posuši v tariranem žarilnem lončku pri 550–700 oC. Ohladi se v eksikatorju in stehta.

5.2   Metoda B

5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in prenese v 250- do 400-mililitrsko čašo. Doda se 25 ml vode in nato 25 ml klorovodikove kisline (3.1), premeša se, nato pa se počaka, da se reakcija umiri. Doda se še 50 ml klorovodikove kisline (3.1). Počaka se, da se preneha izločati plin, nato pa se čaša postavi v vrelo vodno kopel za 30 minut ali po potrebi dlje, da se popolnoma hidrolizira kakršen koli škrob, ki je lahko prisoten. Vsebina, ki je še topla, se filtrira skozi filter brez pepela, filter pa se spere s 50 ml tople vode (glej opombo 7). Filter, ki vsebuje ostanek, se prenese v žarilni lonček, posuši in upepeli pri 550–700 oC. Pepel se prenese v 250- do 400-mililitrsko čašo s 75 ml klorovodikove kisline (3.1); nadaljuje se, kakor je opisano v drugem pododstavku točke 5.1.

6.   Izračun rezultatov

Masa ostanka se izračuna tako, da se odšteje tara. Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

7.   Opomba

Če pri filtriranju nastopijo težave, se analiza ponovi, pri čemer se 50 ml klorovodikove kisline (3.1) nadomesti s 50 ml 20-odstotne trikloroocetne kisline (3.2), filter pa se spere s toplo raztopino 1-odstotne trikloroocetne kisline (3.3).

O.   DOLOČANJE KARBONATOV

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje količine karbonatov v večini krme, ponavadi izraženih kot kalcijev karbonat.

Vendar je treba v nekaterih primerih (na primer pri železovem karbonatu) uporabiti posebna metoda.

2.   Načelo

Karbonati se razkrojijo s klorovodikovo kislino; sproščeni ogljikov dioksid se zbere v bireto, nastala prostornina pa se primerja s prostornino, ki se pod istimi pogoji sprosti iz znane količine kalcijevega karbonata.

3.   Reagenti

3.1	Klorovodikova kislina, gostota 1,10 g/ml

3.2	Kalcijev karbonat

3.3	Žveplova kislina, približno 0,05 mol/l, obarvana z metil rdečim

4.   Oprema

Scheibler-Dietrichova naprava (glej sliko) ali ustrezna druga naprava

5.   Postopek

Glede na vsebnost karbonata v vzorcu se natehta del vzorca, kakor je navedeno spodaj:

—	0,5 g pri proizvodih, ki vsebujejo 50–100 % karbonatov, izraženih kot kalcijev karbonat,

—	1 g pri proizvodih, ki vsebujejo 40–50 % karbonatov, izraženih kot kalcijev karbonat,

—	2 do 3 g za druge proizvode.

Natehtani del vzorca se prenese v posebno bučko (4) naprave, povezano z majhno epruveto iz nezdrobljivega materiala, ki vsebuje 10 ml klorovodikove kisline (3.1), bučka pa se poveže z napravo. Trojni petelinček (5) se obrne tako, da je bireta (1) odprta navzven. S pomočjo pomične cevi (2), napolnjene z obarvano žveplovo kislino (3.3) in povezane z bireto (1), se nivo tekočine uravna na oznako nič. Petelinček (5) se obrne tako, da se bireta (1) in cev (3) povežeta, nato pa se preveri, ali je raven na oznaki nič.

Z nagibanjem bučke (4) se klorovodikova kislina (3.1) počasi spušča prek vzorca. Tlaka se izenačita tako, da se cev (2) spušča. Bučka (4) se stresa, dokler se ogljikov dioksid popolnoma ne preneha izločati.

Tlaka se izenačita tako, da se izenačita ravni tekočin v bireti (1) in cevi (2). Rezultat se odčita po nekaj minutah, ko se volumen plina ustali.

Pod enakimi pogoji se izvede kontrolni preskus z 0,5 g kalcijevega karbonata (3.2).

6.   Izračun rezultatov

Vsebnost karbonatov, izraženih kot kalcijev karbonat, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

X	=	% (m/m) karbonatov v vzorcu, izraženih kot kalcijev karbonat;
V	=	ml sproščenega CO2 iz dela vzorca;
V1	=	ml sproščenega CO2 iz 0,5 g CaCO3;
m	=	masa dela vzorca v gramih.

7.   Opombe

7.1	Ko je masa dela vzorca večja od 2 g, se najprej v bučko (4) nalije 15 ml destilirane vode in se pred začetkom preskusa premeša. Enaka količina vode se uporabi za kontrolni preskus.

7.2	Če se volumen naprave, ki se uporablja, razlikuje od volumna Scheibler-Dietrichove naprave, je treba ustrezno prilagoditi količino dela vzorca in kontrolne snovi ter izračun rezultata.

P.   DOLOČANJE CELOTNEGA FOSFORJA

FOTOMETRIČNA METODA

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje celotne vsebnosti fosforja v krmi. Zlasti primerna je za analizo proizvodov z nizko vsebnostjo fosforja. V nekaterih primerih (pri proizvodih, ki vsebujejo veliko fosforja) se lahko uporabi gravimetrična metoda.

2.   Načelo

Vzorec se mineralizira s suhim sežigom (pri organski krmi) ali z raztapljanjem s kislino (pri mineralnih mešanicah in tekoči krmi) ter prenese v kislo raztopino. Raztopini se doda molibdovanadatni reagent. Optična gostota rumene raztopine, ki pri tem nastane, se meri s spektrofotometrom pri 430 nm.

3.   Reagenti

3.1	Kalcijev karbonat

3.2	Klorovodikova kislina, ρ20 = 1,10 g/ml (približno 6 mol/l)

3.3	Dušikova kislina, ρ20 = 1,045 g/ml

3.4	Dušikova kislina, ρ20 = 1,38 do 1,42 g/ml

3.5	Žveplova kislina, ρ20 = 1,84 g/ml

3.6	Molibdovanadatni reagent: v litrski merilni bučki se zmeša 200 ml raztopine amonijevega heptamolibdata (3.6.1), 200 ml raztopine amonijevega monovanadata (3.6.2) in 134 ml dušikove kisline (3.4). Dopolni se z vodo do oznake.

3.6.1

Raztopina amonijevega heptamolibdata: v vroči vodi se raztopi 100 g amonijevega heptamolibdata ((NH4) 6Mo7O24×4H2O). Doda se 10 ml amonijaka (gostota 0,91 g/ml) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.6.2

Raztopina amonijevega monovanadata: v 400 ml vroče vode se raztopi 2,35 g amonijevega monovanadata (NH4VO3). Med neprestanim mešanjem se počasi doda 20 ml razredčene dušikove kisline (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.7	Standardna raztopina 1 mg fosforja na ml: v vodi se raztopi 4,387 g kalijevega dihidrogen fosfata (KH2PO4). Dopolni se z vodo do 1 litra.

4.   Oprema

4.1	Žarilni lončki iz kremena, porcelana ali platine

4.2	Električna žarilna peč s termostatom, nastavljenim na 550 oC

4.3	250-mililitrska Kjeldahlova bučka

4.4	Merilne bučke in precizijske pipete

4.5	Spektrofotometer

4.6	Epruvete premera približno 16 mm, z brušenimi zamaški premera 14,5 mm, volumna 25–30 ml

5.   Postopek

5.1   Priprava raztopine

Glede na naravo vzorca se raztopina pripravi, kakor je navedeno v točki 5.1.1 ali 5.1.2.

5.1.1   Standardni postopek

1 g vzorca ali več se natehta na 1 mg natančno. Vzorec se prenese v Kjeldahlovo bučko, doda se 20 ml žveplove kisline (3.5), pretrese se, da se vzorec popolnoma prepoji s kislino in da se ne sprijema sten bučke, nato se segreje in pusti vreti 10 minut. Pusti se, da se nekoliko ohladi, dodata se 2 ml dušikove kisline (3.4), zmerno se segreje, pusti se, da se nekoliko ohladi, doda se še nekaj dušikove kisline (3.4) in ponovno segreje do vretja. Postopek se ponavlja do nastanka brezbarvne raztopine. Ohladi se, doda nekaj vode, tekočina se prelije v 500-mililitrsko merilno bučko, Kjeldahlova bučka pa se spere z vročo vodo. Pusti se, da se ohladi, dopolni se z vodo do oznake, homogenizira in filtrira.

5.1.2   Vzorci, ki vsebujejo organske snovi in ne vsebujejo kalcijevih in magnezijevih dihidrogen fosfatov

V žarilni lonček se natehta približno 2,5 g vzorca na 1 mg natančno. Doda se 1 g kalcijevega karbonata (3.1) in meša, da se snovi popolnoma premešata. Žari se v pečici pri 550 oC, da nastane bel ali siv pepel (majhna količina oglja ni problematična). Pepel se prenese v 250-mililitrsko čašo. Doda se 20 ml vode, nato pa se dodaja klorovodikova kislina (3.2), dokler ne prenehajo izhajati mehurčki. Doda se nadaljnjih 10 ml klorovodikove kisline (3.2). Čaša se postavi na peščeno kopel in pusti uparevati do suhega, da kremen postane netopen. Ostanek se raztopi v 10 ml dušikove kisline (3.3) in se na peščeni kopeli ali vroči plošči pusti vreti 5 minut, raztopina pa ne sme upariti v celoti. Tekočina se prelije v 500-mililitrsko merilno bučko, čaša pa se večkrat spere z vročo vodo. Pusti se, da se ohladi, dopolni se z vodo do oznake, homogenizira in filtrira.

5.2   Nastanek barve in merjenje optične gostote

Alikvot filtrata iz točke 5.1.1 ali 5.1.2 se razredči do koncentracije fosforja največ 40 μg/ml. 10 ml te raztopine se prenese v epruveto (4.6) in doda 10 ml molibdovanadatnega reagenta (3.6). Homogenizira se in pusti stati najmanj 10 minut pri 20 oC. Izmeri se optična gostota s spektrofotometrom pri 430 nm raztopine, ki se dobi z dodajanjem 10 ml molibdovanadatnega reagenta (3.6) v 10 ml vode.

5.3   Umeritvena krivulja

Iz standardne raztopine (3.7) se pripravijo raztopine, ki vsebujejo 5, 10, 20, 30 in 40 μg fosforja na ml. V 10 ml vsake izmed teh raztopin se doda 10 ml molibdovanadatnega reagenta (3.6). Homogenizira se in pusti stati najmanj 10 minut pri 20 oC. Izmeri se optična gostota, kakor je navedeno v točki 5.2. Umeritvena krivulja se pripravi tako, da se v diagram vnesejo izmerjene optične gostote ustreznih količin fosforja. Za koncentracije 0–40 μg/ml bo krivulja linearna.

6.   Izračun rezultatov

Količina fosforja v preskusnem vzorcu se določi iz umeritvene krivulje.

Rezultat se izrazi kot masni delež vzorca.

Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne presega:

—	3 % višjega rezultata, če je vsebnost fosforja nižja od 5 %,

—	0,15 % absolutne vrednosti, če je vsebnost fosforja 5 % ali več.

Q.   DOLOČANJE KLORA IZ KLORIDOV

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanja količine klora v kloridih, topnih v vodi, ki so ponavadi izraženi kot natrijev klorid. Uporablja se za vso krmo.

2.   Načelo

Kloridi se raztopijo v vodi. Če proizvod vsebuje organske snovi, se zbistri. Raztopina se rahlo nakisa z dušikovo kislino in kloridi se oborijo v obliki srebrovega klorida z raztopino srebrovega nitrata. Presežek srebrovega nitrata se titrira z raztopino amonijevega tiocianata po Volhardovi metodi.

3.   Reagenti

3.1	Raztopina amonijevega tiocianata, 0,1 mol/liter

3.2	Raztopina srebrovega nitrata, 0,1 mol/l

3.3	Nasičena raztopina amonij-železovega sulfata (NH4)Fe(SO4)2

3.4	Dušikova kislina, gostota: 1,38 g/ml

3.5	Dietileter

3.6

Aceton

3.7	Raztopina Carrez I: 21,9 g cinkovega acetata Zn (CH3COO)2·2H2O in 3 g ledoceta se raztopijo v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.8	Raztopina Carrez II: 10,6 g kalijevega ferocianida K4Fe(CN)6·3H2O se raztopi v vodi. Dopolni se z vodo do 100 ml.

3.9	Aktivno oglje, ki ne vsebuje kloridov in jih ne absorbira.

4.   Oprema

Mešalnik: približno 35 do 40 obr./min.

5.   Postopek

5.1   Priprava raztopine

Glede na naravo vzorca se raztopina pripravi, kakor je navedeno v točki 5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3.

Hkrati se opravi slepi preskus brez vzorca, ki se analizira.

5.1.1   Vzorci brez organskih snovi

Največ 10 g vzorca, ki vsebuje največ 3 g klora v obliki kloridov, se natehta na 1 mg natančno. S 400 ml vode se prenese v 500-mililitrsko merilno bučko pri približno 20 oC. V mešalniku se meša 30 minut, dopolni do oznake, homogenizira in filtrira.

5.1.2   Vzorci, ki vsebujejo organske snovi, razen proizvodov iz točke 5.1.3

Približno 5 g vzorca se natehta na 1 mg natančno in se skupaj z 1 g aktivnega oglja prenese v 500-mililitrsko merilno bučko. Doda se 400 ml vode s temperaturo približno 20 oC in 5 ml raztopine Carrez I (3.7), meša se 30 sekund in nato doda 5 ml raztopine Carrez II (3.8). V mešalniku se meša 30 minut, dopolni do oznake, homogenizira in filtrira.

5.1.3   Kuhana krma, lanove pogače in moka, proizvodi, ki vsebujejo veliko lanene moke, in drugi proizvodi, ki vsebujejo veliko lepila ali koloidnih snovi (na primer dekstriniran škrob)

Raztopina se pripravi, kakor je opisano v točki 5.1.2, vendar se ne filtrira. Dekantira se (po potrebi centrifugira), 100 ml supernatanta pa se odstrani in prenese v 200-mililitrsko merilno bučko. Zmeša se z acetonom (3.6) in z njim dopolni do oznake, homogenizira in filtrira.

5.2   Titracija

S pipeto se v erlenmajerico prenese 25–100 ml filtrata (glede na pričakovano vsebnost klora), ki nastane pri postopku iz točke 5.1.1, 5.1.2 ali 5.1.3. Alikvot ne sme vsebovati več kot 150 mg klora (Cl). Po potrebi se z vodo razredči na najmanj 50 ml, doda se 5 ml dušikove kisline (3.4), 20 ml nasičene raztopine amonij-železovega sulfata (3.3) in 2 kapljici raztopine amonijevega tiocianata (3.1), ki se doda iz birete, napolnjene do oznake nič. Z bireto se doda raztopina srebrovega nitrata (3.2), tako da nastane 5 ml presežka. Doda se 5 ml dietiletra (3.5) in dobro se pretrese, da oborina koagulira. Presežek srebrovega nitrata se titrira z raztopino amonijevega tiocianata (3.1), dokler ne nastane rdečkastorjavi odtenek, ki je obstojen 1 minuto.

6.   Izračun rezultatov

Količina klora (X), izražena kot masni delež natrijevega klorida, se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

V1	=	ml dodane raztopine srebrovega nitrata 0,1 mol/l;
V2	=	ml za titracijo uporabljene raztopine amonijevega tiocianata 0,1 mol/l;
m	=	masa vzorca.

Če je pri slepem preskusu uporabljen srebrov nitrat 0,1 mol/l, se ta vrednost odšteje od volumna (V1 – V2).

7.   Opombe

7.1	Titracija se lahko izvede tudi s potenciometrom.

7.2	Proizvodi, ki vsebujejo veliko olj in maščob, se najprej razmastijo z dietiletrom ali petroletrom.

7.3	Pri ribji moki se titracija lahko izvede z Mohrovo metodo.

---

(1)  Za sušenje žita, moke, drobljencev in zdroba mora imeti sušilnik takšno toplotno kapaciteto, da se bo, ko je predhodno nastavljen na 131 oC, vrnil na to temperaturo v manj kot 45 minutah, potem ko je bilo vanj za sušenje hkrati postavljeno največje možno število vzorcev. Ventilacija mora biti takšna, da se, ko se v sušilniku dve uri suši največje možno število vzorcev pšenice, rezultati razlikujejo za manj kot 0,15 % od tistih, ki so bili sušeni 4 ure.

(2)  Kadar je treba kakovost olja ali maščob naknadno še preskušati, se delci plovca zamenjajo s steklenimi kroglicami.

(3)  UL L 125, 23.5.1996, str. 35.

PRILOGA IV

ANALITSKE METODE ZA NADZOR RAVNI DOVOLJENIH KRMNIH DODATKOV

A.   DOLOČANJE VITAMINA A

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni vitamina A (retinola) v krmi in premiksih. Vitamin A vključuje celoten trans-retinil alkohol in njegove cis izomere, ki se določajo s to metodo. Vsebnost vitamina A se izrazi v mednarodnih enotah (IU) na kg. Ena IU ustreza aktivnosti 0,300 μg celotnega trans-vitamin A alkohola ali 0,344 μg acetata celotnega trans-vitamina A ali 0,550 μg palmitata celotnega trans-vitamina A.

Meja kvantifikacije je 2 000 IU vitamina A/kg.

2.   Načelo

Vzorec se hidrolizira z raztopino etanolnega kalijevega hidroksida, vitamin A pa se ekstrahira v petroleter. Topilo se odstrani z uparevanjem, ostanek pa raztopi v metanolu in po potrebi razredči do zahtevane koncentracije. Vsebnost vitamina A se določi s plinsko kromatografijo visoke ločljivosti z reverzno fazo (RP–HPLC) z uporabo UV- ali fluorescenčnega detektorja. Kromatografski parametri se izberejo tako, da se celoten trans-vitamin A alkohol in njegovi cis izomeri ne ločijo.

3.   Reagenti

3.1	Etanol, σ = 96 %

3.2	Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.3

Metanol

3.4	Raztopina kalijevega hidroksida, c = 50 g/100 ml

3.5	Raztopina natrijevega askorbata, c = 10 g/100 ml (glej opombo 7.7)

3.6	Natrijev sulfid, Na2S· x H2O (x = 7–9)

3.6.1

Raztopina natrijevega sulfida, c = 0,5 mol/l v glicerolu, ß = 120 g/l (za x = 9) (glej opombo 7.8)

3.7	Raztopina fenolftaleina, c = 2 g/100 ml v etanolu (3.1)

3.8	2-propanol

3.9	Mobilna faza za HPLC: mešanica metanola (3,3) in vode, npr. 980 + 20 (v + v). Točno razmerje bo določeno glede na značilnosti uporabljene kolone.

3.10	Dušik, brez kisika

3.11	Acetat celotnega trans-vitamina A, posebne čistosti, certificirane aktivnosti, npr. 2,80 × 106 IU/g

3.11.1

Osnovna raztopina acetata celotnega trans-vitamina A: 50 mg acetata vitamina A (3.11) se natehta na 0,1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko. Raztopi se v 2-propanolu (3.8) in dopolni do oznake z istim topilom. Nominalna koncentracija te raztopine je 1 400 IU vitamina A na ml. Točno vsebnost je treba določiti v skladu s točko 5.6.3.1.

3.12	Palmitat celotnega trans-vitamina A, posebne čistosti, certificirane aktivnosti, npr. 1,80 × 106 IU/g

3.12.1

Osnovna raztopina palmitata celotnega trans-vitamina A: 80 mg palmitata vitamina A (3.12) se natehta na 0,1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko. Raztopi se v 2-propanolu (3.8) in dopolni do oznake z istim topilom. Nominalna koncentracija te raztopine je 1 400 IU vitamina A na ml. Točno vsebnost je treba določiti v skladu s točko 5.6.3.2.

3.13	2,6-Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (glej opombo 7.5)

4.   Oprema

4.1	Rotacijski vakuumski uparjalnik

4.2	Temna steklovina

4.2.1

Bučke z ravnim dnom ali erlenmajerice, 500-mililitrske, z brušenim vratom

4.2.2

Merilne bučke z zamaški iz brušenega stekla, z ozkim vratom, 10, 25, 100 in 500-mililitrske

4.2.3

Liji ločniki, konusni, 1 000-mililitrski, z zamaški iz brušenega stekla

4.2.4

Hruškaste bučke, 250-mililitrske, z zamaški iz brušenega stekla

4.3	Allihnov kondenzator, z dolžino obroča 300 mm s spojem iz brušenega stekla in z nastavkom za dovodno cev plina

4.4	Naguban filtrirni papir za ločevanje faz, premera 185 mm (npr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5	Oprema HPLC s sistemom vbrizgavanja

4.5.1

Kolona za tekočinsko kromatografijo, 250 mm x 4 mm, C18, polnitev 5 ali 10 μm ali enakovredna (kriterij za zmogljivost: samo en vrh za vse izomere retinola pod pogoji kromatografije HPLC)

4.5.2

UV- ali fluorescenčni detektor s spremenljivo nastavitvijo valovne dolžine

4.6	Spektrofotometer z 10 mm kvarcnimi kivetami

4.7	Vodna kopel z magnetnim mešalnikom

4.8	Naprava za ekstrakcijo (glej sliko 1), sestavljena iz:

4.8.1

steklenega valja z volumnom l litra, vratom iz brušenega stekla in zamaškom;

4.8.2

vložka iz brušenega stekla s stransko ročico in nastavljivo cevjo, ki gre skozi središče. Nastavljiva cev ima spodnji del v obliki črke U in vbrizg na nasprotnem koncu, tako da vrhnja plast tekočine v valju lahko preide v lij ločnik.

5.   Postopek

Opomba

:

Vitamin A je občutljiv na (UV) svetlobo in oksidacijo. Vsi postopki se izvajajo brez svetlobe (z uporabo temne steklovine ali steklene posode, zaščitene v aluminijasto folijo) in kisika (spiranje z dušikom). Med ekstrakcijo se zrak nad tekočino zamenja z dušikom (previsokemu tlaku se izogne z občasnim popuščanjem zamaška).

5.1   Priprava vzorca

Vzorec se zdrobi tako, da preide skozi 1 mm sito, pri čemer se je treba izogibati nastanku toplote. Drobljenje se mora izvesti neposredno pred tehtanjem in umiljenjem, drugače lahko pride do izgube vitamina A.

5.2   Umiljenje

Glede na vsebnost vitamina A se natehta 2–25 g vzorca na 1 mg natančno in prenese v 500-mililitrsko bučko z ravnim dnom ali erlenmajerico (4.2.1). Med obračanjem se postopoma dodajo 130 ml etanola (3.1), približno 100 mg BHT (3.13), 2 ml raztopine natrijevega askorbata (3.5) in 2 ml raztopine natrijevega sulfida (3.6). Na bučko se namesti kondenzator (4.3), bučka pa se potopi v vodno kopel z magnetnim mešalnikom (4.7). Segreje se do vretja in 5 minut pusti pod kondenzatorjem povratnega toka. Nato se skozi kondenzator doda 25 ml raztopine kalijevega hidroksida (3.4) in pusti pod kondenzatorjem (4.3) povratnega toka nadaljnjih 25 minut, z mešanjem pod rahlim pretokom dušika. Nato se kondenzator spere s približno 20 ml vode, vsebina bučke pa ohladi na sobno temperaturo.

5.3   Ekstrakcija

Z dekantiranjem se raztopina za umiljenje kvantitativno prenese v 1 000-mililitrski lij ločnik (4.2.3) ali napravo za ekstrakcijo (4.8), tako da se spere s skupno 250 ml vode. Nato se bučka za umiljenje spere s 25 ml etanola (3.1) in 100 ml petroletra (3.2), raztopine za spiranje pa se prenesejo v lij ločnik ali napravo za ekstrakcijo. Razmerje vode in etanola v združenih raztopinah mora biti približno 2:1. 2 minuti se močno stresa in nato 2 minuti pusti, da se umiri.

5.3.1   Ekstrakcija z lijem ločnikom (4.2.3)

Ko so plasti ločene (glej opombo 7.3), se plast petroletra prenese v drug lij ločnik (4.2.3). Ekstrakcija se ponovi dvakrat s 100 ml petroletra (3.2) in dvakrat s 50 ml petroletra (3.2).

Združene ekstrakte v liju ločniku se med rahlim pretresanjem (da se prepreči nastanek emulzij) dvakrat spere s po 100 ml vode in nato s ponavljajočim se stresanjem ponovno s po 100 ml vode, dokler voda pri dodajanju raztopine fenolftaleina (3.7) ne ostane brezbarvna (navadno zadošča štirikratno spiranje). Sprani ekstrakt se filtrira skozi suh naguban filter za ločevanje faz (4.4) v 500-mililitrsko merilno bučko (4.2.2), da se odstrani suspendirana voda. Lij ločnik in filter se spereta s 50 ml petroletra (3.2), dopolni se do oznake s petroletrom (3.2) in dobro premeša.

5.3.2   Ekstrakcija z uporabo naprave za ekstrakcijo (4.8)

Ko se plasti ločijo (glej opombo 7.3), se zamašek steklenega valja (4.8.1) zamenja z vložkom iz brušenega stekla (4.8.2), spodnji del nastavljive cevi pa se namesti v obliki črke U tik nad raven vmesnika. S tlakom, ki ga tvori dušik v stranski ročici, se zgornja plast petroletra prenese v 1 000-mililitrski lij ločnik (4.2.3). V stekleni valj se doda 100 ml petroletra (3.2), zamaši in dobro pretrese. Počaka se, da se plasti ločijo, zgornja plast pa se prenese v lij ločnik tako kot prej. Postopek ekstrakcije se ponovi s 100 ml petroletra (3.2), nato dvakrat s po 50 ml petroletra (3.2), plasti petroletra pa se dodajo v lij ločnik.

Združeni ekstrakti petroletra se sperejo, kakor je opisano v točki 5.3.1, nato pa se nadaljuje, kakor je navedeno v navedeni točki.

5.4   Priprava raztopine vzorca za HPLC

Alikvot raztopine petroletra (iz 5.3.1 ali 5.3.2) se odpipetira v 250-mililitrsko hruškasto bučko (4.2.4). Topilo se upari skoraj do suhega v rotacijskem uparjalniku (4.1) pri znižanem tlaku in temperaturi kopeli do 40 oC. Atmosferski tlak se vzpostavi z dovajanjem dušika (3.10), bučka pa se odstrani iz rotacijskega uparjalnika. Preostalo topilo se odstrani v toku dušika (3.10), ostanek pa se takoj raztopi v znanem volumnu (10–100 ml) metanola (3.3) (koncentracija vitamina A mora biti 5–30 IU/ml).

5.5   Določanje s HPLC

Vitamin A se loči na koloni C18 z reverzno fazo (4.5.1), koncentracija pa se izmeri z UV-detektorjem (325 nm) ali fluorescenčnim detektorjem (ekscitacija: 325 nm, emisija: 475 nm) (4.5.2).

Vbrizga se alikvot (npr. 20 μl) raztopine metanola, ki nastane pri točki 5.4, in eluira z mobilno fazo (3.9). Izračuna se srednja vrednost višine (površine) vrhov za več vbrizgov iste raztopine vzorca in srednje vrednosti višin (površin) vrhov za več vbrizgov raztopin za umerjanje (5.6.2).

Pogoji za HPLC

Naslednji pogoji se lahko uporabljajo kot smernica; lahko se uporabljajo tudi drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate.

Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, polnitev 5 ali 10 μm ali enakovredna
Mobilna faza (3.9):	Mešanica metanol (3.3) in vode, npr. 980 + 20 (v + v)
Hitrost pretoka:	1–2 ml/min
Detektor (4.5.2):	UV-detektor (325 nm) ali fluorescenčni detektor (ekscitacija: 325 nm/emisija: 475 nm)

5.6   Umerjanje

5.6.1   Priprava delovnih standardnih raztopin

20 ml osnovne raztopine acetata vitamina A (3.11.1) ali 20 ml osnovne raztopine palmitata vitamina A (3.12.1) se odpipetira v 500-mililitrsko bučko z ravnim dnom ali erlenmajerico (4.2.1) ter hidrolizira, kakor je navedeno v točki 5.2, vendar brez dodatka BHT. Nato se ekstrahira s petroletrom (3.2) v skladu s točko 5.3 in dopolni do 500 ml s petroletrom (3.2). 100 ml tega ekstrakta se upari v rotacijskem uparjalniku (glej 5.4) skoraj do suhega, odstrani se preostalo topilo s tokom dušika (3.10), ostanek pa se ponovno raztopi v 10,0 ml metanola (3.3). Nominalna koncentracija te raztopine je 560 IU vitamina A na ml. Točno vsebnost je treba določiti v skladu s točko 5.6.3.3. Delovno standardno raztopino je treba sveže pripraviti pred uporabo.

2,0 ml te delovne standardne raztopine se odpipetira v 20-mililitrsko merilno bučko, dopolni se z metanolom (3.3) do oznake in premeša. Nominalna koncentracija te razredčene delovne standardne raztopine je 56 IU vitamina A na ml.

5.6.2   Priprava raztopin za umerjanje in umeritvena krivulja

1,0, 2,0, 5,0 in 10,0 ml razredčene delovne standardne raztopine se prenese v serijo 20-mililitrskih merilnih bučk, dopolni se z metanolom (3.3) do oznake in premeša. Nominalne koncentracije teh raztopin so 2,8, 5,6, 14,0 in 28,0 IU vitamina A na ml.

Večkrat se vbrizga 20 μl vsake od raztopin za umerjanje in določijo se srednje vrednosti višin (površin) vrhov. Iz srednjih vrednosti višin (površin) vrhov se pripravi umeritvena krivulja ob upoštevanju rezultatov UV-kontrole (5.6.3.3).

5.6.3   UV-standardizacija standardnih raztopin

5.6.3.1   Osnovna raztopina acetata vitamina A

2,0 ml osnovne raztopine acetata vitamina A (3.11.1) se odpipetira v 50 ml merilno bučko (4.2.2) in dopolni z 2-propanolom (3.8) do oznake. Nominalna koncentracija te raztopine je 56 IU vitamina A na ml. 3,0 ml te razredčene raztopine acetata vitamina A se odpipetira v 25-mililitrsko merilno bučko in dopolni z 2-propanolom (3.8) do oznake. Nominalna koncentracija te raztopine je 6,72 IU vitamina A na ml. Izmeri se UV-spekter te raztopine proti 2-propanolu (3.8) v spektrofotometru (4.6) med 300 in 400 nm. Maksimalna ekstinkcija mora biti med 325 in 327 nm.

Izračun vsebnosti vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

( za acetat vitamina A = 1 530 pri 326 nm v 2-propanolu)

5.6.3.2   Osnovna raztopina palmitata vitamina A

2,0 ml osnovne raztopine palmitata vitamina A (3.12.1) se odpipetira v 50-mililitrsko merilno bučko (4.2.2) in dopolni z 2-propanolom (3.8) do oznake . Nominalna koncentracija te raztopine je 56 IU vitamina A na ml. 3,0 ml te razredčene raztopine palmitata vitamina A se odpipetira v 25-mililitrsko merilno bučko in dopolni z 2-propanolom (3.8) do oznake. Nominalna koncentracija te raztopine je 6,72 IU vitamina A na ml. Izmeri se UV-spekter te raztopine proti 2-propanolu (3.8) v spektrofotometru (4.6) med 300 in 400 nm. Maksimalna ekstinkcija mora biti med 325 in 327 nm.

Izračun vsebnosti vitamina A:

IU vitamina A/ml = E326 × 19,0

( za palmitat vitamina A = 957 pri 326 nm v 2-propanolu)

5.6.3.3   Delovna standardna raztopina vitamina A

3,0 ml nerazredčene delovne standardne raztopine vitamina A, pripravljene v skladu s točko 5.6.1, se odpipetira v 50-mililitrsko merilno bučko (4.2.2) in dopolni z 2-propanolom (3.8) do oznake. 5,0 ml te raztopine se odpipetira v 25-mililitrsko merilno bučko in dopolni z 2-propanolom (3.8) do oznake . Nominalna koncentracija te raztopine je 6,72 IU vitamina A na ml. Izmeri se UV-spekter te raztopine proti 2-propanolu (3.8) v spektrofotometru (4.6) med 300 in 400 nm. Maksimalna ekstinkcija mora biti med 325 in 327 nm.

Izračun vsebnosti vitamina A:

IU vitamina A/ml = E325 × 18,3

( za vitamin A alkohol = 1 821 pri 325 nm v 2-propanolu)

6.   Izračun rezultatov

Iz srednje vrednosti višin (površin) vrhov vitamina A iz raztopine vzorca se s pomočjo umeritvene krivulje (5.6.2) določi koncentracija raztopine vzorca v IU/ml.

Vsebnost vitamina A (w) v vzorcu, izražena v IU/kg, se izračuna po naslednji formuli:

[IU/kg]

pri čemer je:

c	=	koncentracija vitamina A (5.4) v IU/ml v raztopini vzorca;
V1	=	volumen raztopine vzorca (5.4) v ml;
V2	=	volumen alikvota, uporabljenega pri točki 5.4, v ml;
m	=	masa preskusnega vzorca v gramih.

7.   Opombe

7.1	Pri vzorcih z nizko koncentracijo vitamina A se ekstrakte petroletra iz dveh umilitvenih šarž (natehtana količina: 25 g) lahko združi v eno raztopino vzorca za določanje s HPLC.

7.2	Masa vzorca za analizo ne vsebuje več kot 2 g maščobe.

7.3	Če se fazi ne ločita, se doda približno 10 ml etanola (3.1) za razbitje emulzije.

7.4	Pri ribjem olju in drugih čistih maščobah se čas umiljenja podaljša na 45–60 minut.

7.5	Namesto BHT se lahko uporablja hidrokinon.

7.6	Z običajno fazno kolono je možno ločiti izomere retinola. Vendar je pri tem treba za izračune zabeležiti vse višine (površine) vrhov vseh cis in trans izomerov.

7.7	Namesto raztopine natrijevega askorbata se lahko uporabi približno 150 mg askorbinske kisline.

7.8	Namesto raztopine natrijevega sulfida se lahko uporabi približno 50 mg EDTA.

7.9

Pri analizi vitamina A v mlečnih nadomestkih je treba paziti: — pri umiljenju (5.2): zaradi količine maščobe v vzorcu je lahko potrebna večja količina raztopine kalijevega hidroksida (3.4), — pri ekstrakciji (5.3): zaradi prisotnosti emulzij je morda potrebna sprememba razmerja voda/etanol 2:1. Da se preveri, ali uporabljena analitska metoda zagotavlja zanesljive rezultate glede te specifične matrice (mlečni nadomestek), je treba na dodatnem preskusnem vzorcu izvesti preskus izkoristka. Če je izkoristek nižji od 80 %, se pri analitskem rezultatu uporabi popravek za izkoristek.

8.   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 15 % najvišjega rezultata.

9.   Rezultati medlaboratorijske študije  (1)

	Premiks	Krma in premiksi	Mineralni koncentrat	Beljakovinska krma	Krma za prašiče
L	13	12	13	12	13
n	48	45	47	46	49
Srednja vrednost [IU/kg]	17,02 x 106	1,21 x 106	537 100	151 800	18 070
Sr [IU/kg]	0,51 x 106	0,039 x 106	22 080	12 280	682
r [IU/kg]	1,43 x 106	0,109 x 106	61 824	34 384	1 910
CVr [ %]	3,0	3,5	4,1	8,1	3,8
SR [IU/kg]	1,36 x 106	0,069 x 106	46 300	23 060	3 614
R [IU/kg]	3,81 x 106	0,193 x 106	129 640	64 568	10 119
CVR [ %]	8,0	6,2	8,6	15	20

L	:	število laboratorijev;
n	:	število posameznih vrednosti;
Sr	:	standardni odmik ponovljivosti;
SR	:	standardni odmik obnovljivosti;
r	:	ponovljivost;
R	:	obnovljivost;
CVr	:	koeficient variacije ponovljivosti;
CVR	:	koeficient variacije obnovljivosti;

B.   DOLOČANJE VITAMINA E

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni vitamina E v krmi in premiksih. Vsebnost vitamina E se izrazi v mg acetata DL-α-tokoferola na kg. 1 mg acetata DL-α-tokoferola ustreza 0,91 mg DL-α-tokoferola (vitamina E).

Meja kvantifikacije je 2 mg vitamina E/kg. Ta meja kvantifikacije se lahko doseže le s fluorescenčnim detektorjem. Meja kvantifikacije za UV-detektor je 10 mg/kg.

2.   Načelo

Vzorec se hidrolizira z raztopino etanolnega kalijevega hidroksida, vitamin E pa se ekstrahira v petroleter. Topilo se odstrani z uparevanjem, ostanek pa raztopi v metanolu in po potrebi razredči do zahtevane koncentracije. Vsebnost vitamina E se določi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z reverzno fazo (RP–HPLC) z uporabo UV- ali fluorescenčnega detektorja.

3.   Reagenti

3.1	Etanol, σ = 96 %

3.2	Petroleter, vrelišče 40–60 oC

3.3

Metanol

3.4	Raztopina kalijevega hidroksida, c = 50 g/100 ml

3.5	Raztopina natrijevega askorbata, c = 10 g/100 ml (glej opombo 7.7)

3.6	Natrijev sulfid, Na2S· x H2O (x = 7–9)

3.6.1

Raztopina natrijevega sulfida, c = 0,5 mol/l v glicerolu, β = 120 g/l (za x = 9) (glej opombo 7.8)

3.7	Raztopina fenolftaleina, c = 2 g/100 ml v etanolu (3.1)

3.8	Mobilna faza za HPLC: mešanica metanola (3.3) in vode, npr. 980 + 20 (v + v). Točno razmerje bo določeno glede na značilnosti uporabljene kolone.

3.9	Dušik, brez kisika

3.10	Acetat DL-α-tokoferola, posebne čistosti, certificirane aktivnosti

3.10.1

Osnovna raztopina acetata DL-α-tokoferola: 100 mg acetata DL-α-tokoferola (3.10) se natehta na 0,1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko. Raztopi se v etanolu (3.1) in dopolni z istim topilom do oznake. 1 ml te raztopine vsebuje 1 mg acetata DL-α-tokoferola. (Za UV-kontrolo glej točko 5.6.1.3, za stabilizacijo pa opombo 7.4.)

3.11	DL-α-tokoferol, posebne čistosti, certificirane aktivnosti

3.11.1

Osnovna raztopina acetata DL-α-tokoferola: 100 mg DL-α-tokoferola (3.10) se natehta na 0,1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko. Raztopi se v etanolu (3.1) in dopolni z istim topilom do oznake. 1 ml te raztopine vsebuje 1 mg DL-α-tokoferola. (Za UV-kontrolo glej točko 5.6.2.3, za stabilizacijo pa opombo 7.4.)

3.12	2,6-Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (glej opombo 7.5)

4.   Oprema

4.1	Rotacijski uparjalnik

4.2	Temna steklovina

4.2.1

Bučke z ravnim dnom ali erlenmajerice, 500-mililitrske, z brušenim vratom

4.2.2

Merilne bučke z zamaški iz brušenega stekla, z ozkim vratom, 10-, 25-, 100- in 500-mililitrske

4.2.3

Liji ločniki, konusni, 1 000-mililitrski, z zamaški iz brušenega stekla

4.2.4

Hruškaste bučke, 250-mililitrske, z zamaški iz brušenega stekla

4.3	Allihnov kondenzator, dolžina obroča 300 mm, s spojem iz brušenega stekla in nastavkom za dovodno cev plina

4.4	Naguban filtrirni papir za ločevanje faz, premera 185 mm (npr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5	Oprema za kromatografijo HPLC s sistemom vbrizgavanja

4.5.1

Kolona za tekočinsko kromatografijo, 250 mm x 4 mm C18, polnitev 5 ali 10 μm ali enakovredna

4.5.2

Fluorescenčni ali UV-detektor, s spremenljivo nastavitvijo valovne dolžine

4.6	Spektrofotometer z 10 mm kvarcnimi kivetami

4.7	Vodna kopel z magnetnim mešalnikom

4.8	Naprava za ekstrakcijo (glej sliko 1), sestavljena iz:

4.8.1

steklenega valja z volumnom l litra, vratom iz brušenega stekla in zamaškom;

4.8.2

vložka iz brušenega stekla s stransko ročico in nastavljivo cevjo, ki gre skozi središče. Nastavljiva cev ima spodnji del v obliki črke U in vbrizg na nasprotnem koncu, tako da vrhnja plast tekočine v valju lahko preide v lij ločnik.

5.   Postopek

Opomba

:

Vitamin E je občutljiv na (UV) svetlobo in oksidacijo. Vsi postopki se izvajajo brez svetlobe (z uporabo temne steklovine ali steklene posode, zaščitene v aluminijasto folijo) in kisika (spiranje z dušikom). Med ekstrakcijo se zrak nad tekočino zamenja z dušikom (previsokemu tlaku se izogne z občasnim rahljanjem zamaška).

5.1   Priprava vzorca

Vzorec se zdrobi tako, da preide skozi 1 mm sito, pri čemer se je treba izogibati nastanku toplote. Drobljenje se mora izvesti neposredno pred tehtanjem in umiljenjem, drugače lahko pride do izgube vitamina E.

5.2   Umiljenje

Glede na vsebnost vitamina E se natehta 2–25 g vzorca na 0,01 g natančno in prenese v 500-mililitrsko bučko z ravnim dnom ali erlenmajerico (4.2.1). Med obračanjem se postopoma dodajo 130 ml etanola (3.1), približno 100 mg BHT (3.12), 2 ml raztopine natrijevega askorbata (3.5) in 2 ml raztopine natrijevega sulfida (3.6). Na bučko se namesti kondenzator (4.3), bučka pa se potopi v vodno kopel z magnetnim mešalnikom (4.7). Segreje se do vretja in 5 minut pusti pod kondenzatorjem povratnega toka. Nato se skozi kondenzator (4.3) doda 25 ml raztopine kalijevega hidroksida (3.4) in z mešanjem pod rahlim pretokom dušika pusti pod kondenzatorjem povratnega toka nadaljnjih 25 minut. Nato se kondenzator spere s približno 20 ml vode, vsebina bučke pa ohladi na sobno temperaturo.

5.3   Ekstrakcija

Z dekantiranjem se raztopina za umiljenje kvantitativno prenese v 1 000-mililitrski lij ločnik (4.2.3) ali napravo za ekstrakcijo (4.8), tako da se spere s skupno 250 ml vode. Nato se bučka za umiljenje spere s 25 ml etanola (3.1) in 100 ml petroletra (3.2), raztopine za spiranje pa se prenesejo v lij ločnik ali napravo za ekstrakcijo. Razmerje vode in etanola v združenih raztopinah mora biti približno 2:1. 2 minuti se močno stresa in nato 2 minuti pusti, da se umiri.

5.3.1   Ekstrakcija z lijem ločnikom (4.2.3)

Ko so plasti ločene (glej opombo 7.3), se plast petroletra prenese v drug lij ločnik (4.2.3). Ekstrakcija se ponovi dvakrat s 100 ml petroletra (3.2) in dvakrat s 50 ml petroletra (3.2).

Združene ekstrakte v liju ločniku se med rahlim pretresanjem (da se prepreči nastanek emulzij) dvakrat spere s po 100 ml vode in nato s ponavljajočim se stresanjem ponovno s po 100 ml vode, dokler voda pri dodajanju raztopine fenolftaleina (3.7) ne ostane brezbarvna (navadno zadošča štirikratno spiranje). Sprani ekstrakt se filtrira skozi suh naguban filter za ločevanje faz (4.4) v 500-mililitrsko merilno bučko (4.2.2), da se odstrani suspendirana voda. Lij ločnik in filter se spereta s 50 ml petroletra (3.2), dopolni se do oznake s petroletrom (3.2) in dobro premeša.

5.3.2    Ekstrakcija z uporabo naprave za ekstrakcijo (4.8)

Ko se plasti ločijo (glej opombo 7.3), se zamašek steklenega valja (4.8.1) zamenja z vložkom iz brušenega stekla (4.8.2), spodnji del nastavljive cevi pa se namesti v obliki črke U tik nad raven vmesnika. S tlakom, ki ga tvori dušik v stranski ročici, se zgornja plast petroletra prenese v 1 000-mililitrski lij ločnik (4.2.3). V stekleni valj se doda 100 ml petroletra (3.2), zamaši se in dobro pretrese. Počaka se, da se plasti ločijo, zgornja plast pa se prenese v lij ločnik tako kot prej. Postopek ekstrakcije se ponovi s 100 ml petroletra (3.2), nato dvakrat s po 50 ml petroletra (3.2), plasti petroletra pa se dodajo v lij ločnik.

Združeni ekstrakti petroletra se sperejo, kakor je opisano v točki 5.3.1, nato pa se nadaljuje, kakor je navedeno v navedeni točki.

5.4   Priprava raztopine vzorca za HPLC

Alikvot raztopine petroletra (iz točke 5.3.1 ali 5.3.2) se odpipetira v 250-mililitrsko hruškasto bučko (4.2.4). Topilo se upari skoraj do suhega v rotacijskem uparjalniku (4.1) pri znižanem tlaku in temperaturi kopeli do 40 oC. Atmosferski tlak se vzpostavi z dovajanjem dušika (3.9), bučka pa se odstrani iz rotacijskega uparjalnika. Preostalo topilo se odstrani v toku dušika (3.9), ostanek pa se takoj raztopi v znanem volumnu (10–100 ml) metanola (3.3) (koncentracija DL-α-tokoferola mora biti 5–30 μg/ml).

5.5   Določanje s HPLC

Vitamin E se loči na koloni C18 z reverzno fazo (4.5.1), koncentracija pa se izmeri s fluorescenčnim detektorjem (ekscitacija: 295 nm, emisija: 330 nm) ali UV-detektorjem (292 nm) (4.5.2).

Vbrizga se alikvot (npr. 20 μl) raztopine metanola, ki nastane pri točki 5.4, in eluira se z mobilno fazo (3.8). Izračunajo se srednje vrednosti višin (površin) vrhov za več vbrizgov iste raztopine vzorca in srednje vrednosti višin (površin) vrhov za več vbrizgov raztopin za umerjanje (5.6.2).

Pogoji za HPLC

Naslednji pogoji se lahko uporabljajo kot smernica; lahko se uporabljajo tudi drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate.

Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, polnitev 5 ali 10 μm ali enakovredna
Mobilna faza (3.8):	Mešanica metanola (3.3) in vode, npr. 980 + 20 (v + v).
Hitrost pretoka:	1–2 ml/min
Detektor (4.5.2):	Fluorescečni detektor: (ekscitacija: 295 nm/emisija: 330 nm) ali UV-detektor (292 nm)

5.6   Umerjanje (acetat DL-α-tokoferola ali DL-α-tokoferol)

5.6.1   Standardni acetat DL-α-tokoferola

5.6.1.1   Priprava delovne standardne raztopine

25 ml osnovne raztopine acetata DL-α-tokoferola (3.10.1) se odpipetira v 500-mililitrsko bučko z ravnim dnom ali erlenmajerico (4.2.1) in hidrolizira, kakor je opisano v točki 5.2. Nato se ekstrahira s petroletrom (3.2) v skladu s točko 5.3 in dopolni do 500 ml s petroletrom. 25 ml tega ekstrakta se upari v rotacijskem uparjalniku (glej 5.4) skoraj do suhega, odstrani se preostalo topilo s tokom dušika (3.9), ostanek pa se ponovno raztopi v 25,0 ml metanola (3.3). Nominalna koncentracija te raztopine je 45,5 μg DL-α-tokoferola na ml, kar je enakovredno 50 μg acetata DL-α-tokoferola na ml. Delovno standardno raztopino je treba pripraviti svežo pred uporabo.

5.6.1.2   Priprava raztopin za umerjanje in umeritvena krivulja

1,0, 2,0, 4,0 in 10,0 ml delovne standardne raztopine se prenese v serijo 20-mililitrskih merilnih bučk, dopolni se z metanolom (3.3) do oznake in premeša. Nominalne koncentracije teh raztopin so 2,5, 5,0, 10,0 in 25,0 μg/ml acetata DL-α-tokoferola, tj. 2,28, 4,55, 9,10 in 22,8 μg/ml DL-α-tokoferola.

Večkrat se vbrizga 20 μl vsake raztopine za umerjanje, nato pa se določijo srednje vrednosti višin (površin) vrhov. Iz srednjih vrednosti višin (površin) vrhov se pripravi umeritvena krivulja.

5.6.1.3   UV-standardizacija osnovne raztopine acetata DL-α-tokoferola (3.10.1)

5,0 ml osnovne raztopine acetata DL-α-tokoferola (3.10.1) se razredči na 25,0 ml z etanolom, UV-spekter te raztopine pa se izmeri proti etanolu (3.1) v spektrofotometru (4.6) med 250 in 320 nm.

Maksimalna absorpcija je pri 284 nm:

= 43,6 pri 284 nm v etanolu

Pri tem razredčenju mora biti vrednost ekstinkcije 0,84 do 0,88.

5.6.2   DL-α-tokoferol standard

5.6.2.1   Priprava delovne standardne raztopine

2 ml osnovne raztopine DL-α-tokoferola (3.11.1) se odpipetira v 50-mililitrsko merilno bučko, raztopi v metanolu (3.3) in dopolni z metanolom do oznake. Nominalna koncentracija te raztopine je 40 μg DL-α-tokoferola na ml, kar je enakovredno 44,0 μg acetata DL-α-tokoferola na ml. Delovno standardno raztopino je treba pripraviti svežo pred uporabo.

5.6.2.2   Priprava raztopin za umerjanje in umeritvena krivulja

1,0, 2,0, 4,0 in 10,0 ml delovne standardne raztopine se prenese v serijo 20-mililitrskih merilnih bučk, dopolni se do oznake z metanolom (3.3) in premeša. Nominalne koncentracije teh raztopin so 2,0, 4,0, 8,0 in 20,0 μg/ml DL-α-tokoferola, tj. 2,20, 4,40, 8,79 in 22,0 μg/ml acetata DL-α-tokoferola.

Večkrat se vbrizga 20 μl vsake raztopine za umerjanje, nato pa se določijo srednje vrednosti višin (površin) vrhov. Iz srednjih vrednosti višin (površin) vrhov se pripravi umeritvena krivulja.

5.6.2.3   UV-standardizacija osnovne raztopine DL-α-tokoferola (3.11.1)

2,0 ml osnovne raztopine DL-α-tokoferola (3.11.1) se razredči na 25,0 ml z etanolom, UV-spekter te raztopine pa se izmeri proti etanolu (3.1) v spektrofotometru (4.6) med 250 in 320 nm. Maksimalna absorpcija je pri 292 nm:

 = 75,8 pri 292 nm v etanolu

Pri tem razredčenju mora biti vrednost ekstinkcije 0,6.

6.   Izračun rezultatov

Iz srednje vrednosti višine (površine) vrhov vitamina E iz raztopine vzorca se s pomočjo umeritvene krivulje (5.6.1.2 ali 5.6.2.2) določi koncentracija raztopine vzorca v μg/ml (izračunana kot acetat DL-α-tokoferola).

Vsebnost vitamina E (w) v mg/kg v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

[mg/kg]

pri čemer je:

c	=	koncentracija vitamina E (kot acetata α-tokoferola) v raztopini vzorca (5.4) v μg/ml;
V1	=	volumen raztopine vzorca (5.4) v ml;
V2	=	volumen alikvota, uporabljenega pri točki 5.4, v ml;
m	=	masa preskusnega vzorca v gramih.

7.   Opombe

7.1	Pri vzorcih z nizko koncentracijo vitamina E se ekstrakti petroletra iz dveh umilitvenih šarž (natehtana množina: 25 g) združijo v eno raztopino vzorca za določanje s HPLC.

7.2	Masa vzorca za analizo ne vsebuje več kot 2 g maščobe.

7.3	Če se fazi ne ločita, se doda približno 10 ml etanola (3.1) za razbitje emulzije.

7.4	Po spektrofotometrični meritvi raztopine acetata DL-α-tokoferola ali raztopine DL-α-tokoferola v skladu s točko 5.6.1.3 ali pa 5.6.2.3 se doda približno 10 mg BHT (3.12) v raztopino (3.10.1 ali 3.10.2), raztopina pa se hrani v hladilniku (hrani se lahko največ 4 tedne).

7.5	Namesto BHT se lahko uporablja hidrokinon.

7.6	Z običajno fazno kolono je možno ločiti α-, β-, γ- in δ-tokoferol.

7.7	Namesto raztopine natrijevega askorbata se lahko uporabi približno 150 mg askorbinske kisline.

7.8	Namesto raztopine natrijevega sulfida se lahko uporabi približno 50 mg EDTA.

7.9

Acetat vitamina E se v bazičnih pogojih hidrolizira zelo hitro, zato je zelo občutljiv na oksidacijo, zlasti v navzočnosti elementov v sledovih, kot sta železo in baker. Če raven vitamina E v premiksih presega 5 000 mg/kg, se vitamin E pri določanju lahko razgradi. Zato je za potrditev priporočena metoda HPLC z encimsko razgradnjo strukture vitamina E brez bazičnega umiljenja.

8.   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 15 % najvišjega rezultata.

9.   Rezultati medlaboratorijske študije  (2)

	Premiks	Krma in premiksi	Mineralni koncentrat	Beljakovinska krma	Krma za prašiče
L	12	12	12	12	12
n	48	48	48	48	48
Srednja vrednost [mg/kg]	17 380	1 187	926	315	61,3
Sr [mg/kg]	384	45,3	25,2	13,0	2,3
r [mg/kg]	1 075	126,8	70,6	36,4	6,4
CVr [ %]	2,2	3,8	2,7	4,1	3,8
SR mg/kg]	830	65,0	55,5	18,9	7,8
R [mg/kg]	2 324	182,0	155,4	52,9	21,8
CVR [ %]	4,8	5,5	6,0	6,0	12,7

L	:	število laboratorijev;
n	:	število posameznih vrednosti;
Sr	:	standardni odmik ponovljivosti;
SR	:	standardni odmik obnovljivosti;
r	:	ponovljivost;
R	:	obnovljivost;
CVr	:	koeficient variacije ponovljivosti;
CVR	:	koeficient variacije obnovljivosti.

C.   DOLOČANJE ŽELEZA, BAKRA, MANGANA IN CINKA V SLEDOVIH

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje železa, bakra, mangana in cinka v sledovih v krmi. Meje za določanje so:

—	železo (Fe): 20 mg/kg,

—	baker (Cu): 10 mg/kg,

—	mangan (Mn): 20 mg/kg,

—	cink (Zn): 20 mg/kg.

2.   Načelo

Po razkroju morebitnih organskih snovi se vzorec raztopi v klorovodikovi kislini. Po primernem razredčenju se z atomsko absorpcijsko spektrometrijo določijo železo, baker, mangan in cink.

3.   Reagenti

Uvodne opombe

Za pripravo reagentov in raztopin za analizo se uporabi voda brez kationov, ki jih je treba določiti, ki se pripravi z dvojnim destiliranjem vode v destilatorju iz borosilikatnega ali kremenovega stekla ali z dvojno ionsko izmenjavo.

Reagenti morajo biti najmanj analitske čistoče. Odsotnost elementa, ki se določa, se preveri s slepim preskusom. Po potrebi se morajo reagenti dodatno prečistiti.

Namesto spodaj navedenih standardnih raztopin se lahko uporabijo komercialne standardne raztopine, če imajo jamstvo in so bile pred uporabo preverjene.

3.1	Klorovodikova kislina (g: 1,19 g/ml)

3.2	Klorovodikova kislina (6 mol/l)

3.3	Klorovodikova kislina (0,5 mol/l)

3.4	38–40-odstotna (v/v) klorovodikova kislina z vsebnostjo železa (Fe) manj kot 1 mg/l in z manj kot 10 mg/l ostanka (v obliki sulfata) po uparevanju

3.5	Žveplova kislina (g: 1,84 g/ml)

3.6	Vodikov peroksid a.č. (približno 100 volumnov kisika (30 % po masi))

3.7	Standardna raztopina železa (1 000 μg Fe/ml), pripravljena na naslednji način, ali enakovredna komercialno dostopna raztopina: 1 g železne žice se raztopi v 200 ml klorovodikove kisline 6 mol/l (3.2), doda se 16 ml vodikovega peroksida (3.6) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.7.1

Standardna delovna raztopina železa (100 μg Fe/ml), pripravljena z redčenjem 1 dela standardne raztopine (3.7) z 9 deli vode.

3.8	Standardna raztopina bakra (1 000 μg Cu/ml), pripravljena na naslednji način, ali enakovredna komercialno dostopna raztopina: — 1 g bakra v prahu se raztopi v 25 ml klorovodikove kisline 6 mol/l (3.2), doda se 5 ml vodikovega peroksida (3.6) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.8.1

Standardna delovna raztopina bakra (10 μg Cu/ml), pripravljena z redčenjem 1 dela standardne raztopine (3.8) z 9 deli vode, nato pa z redčenjem 1 dela te raztopine z 9 deli vode.

3.9	Standardna raztopina mangana (1 000 μg Mn/ml), pripravljena na naslednji način, ali enakovredna komercialno dostopna raztopina: — 1 g mangana v prahu se raztopi v 25 ml klorovodikove kisline 6 mol/l (3.2) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.9.1

Standardna delovna raztopina mangana (10 μg Mn/ml), pripravljena z redčenjem 1 dela standardne raztopine (3.9) z 9 deli vode, nato pa z redčenjem 1 dela te raztopine z 9 deli vode.

3.10	Standardna raztopina cinka (1 000 μg Zn/ml), pripravljena na naslednji način, ali enakovredna komercialno dostopna raztopina: — 1 g cinka v foliji ali granulah se raztopi v 25 ml klorovodikove kisline 6 mol/l (3.2) in dopolni z vodo do 1 litra.

3.10.1

Standardna delovna raztopina cinka (10 μg Zn/ml), pripravljena z redčenjem 1 dela standardne raztopine (3.10) z 9 deli vode, nato pa z redčenjem 1 dela te raztopine z 9 deli vode.

3.11	Raztopina lantanovega klorida: 12 g lantanovega klorida se raztopi v 150 ml vode, doda se 100 ml klorovodikove kisline 6 mol/l (3.2) in dopolni z vodo do 1 litra.

4.   Oprema

4.1	Žarilna peč z regulacijo temperature in po možnosti rekorderjem

4.2	Stekleni deli morajo biti iz odpornega borosilikata, priporočljiva pa je uporaba opreme, ki je namenjena izključno določanju elementov v sledovih.

4.3	Atomski absorpcijski spektrofotometer, ki ustreza zahtevam metode glede občutljivosti in natančnosti zahtevanega območja.

5.   Postopek  (3)

5.1   Vzorci, ki vsebujejo organske snovi

5.1.1    Upepeljevanje in priprava raztopine za analizo  (4)

5.1.1.1

5–10 g vzorca se natehta na 0,2 mg natančno in prenese v žarilni lonček iz kvarca ali platine (glej opombo (b)), osuši v sušilniku pri 105 oC in postavi v hladno žarilno peč (4.1). Peč se zapre (glej opombo (c)), temperatura pa se približno 90 minut postopoma viša na 450–475 oC. Ta temperatura se ohranja 4–16 ur (npr. čez noč), da se odstranijo zoglenele snovi, nato pa se peč odpre in ohladi (glej opombo (d)). Pepel se navlaži z vodo in prenese v 250-mililitrsko čašo. Lonček se spere s skupaj približno 5 ml klorovodikove kisline (3.1), vsebina pa se počasi in previdno prenese v čašo (lahko pride do burne reakcije zaradi nastanka CO2). Po kapljicah se dodaja klorovodikova kislina (3.1), meša pa se, dokler penjenje ne poneha. Upareva se do suhega, pri čemer se občasno premeša s stekleno palčko. Nato se ostanku doda 15 ml klorovodikove kisline 6 mol/l (3.2) in približno 120 ml vode. Premeša se s stekleno paličico, ki se pusti v čaši, čaša pa se pokrije z urnim steklom. Počasi se segreva do vretja in pusti vreti do popolne raztopitve pepela. Skozi filter, ki ne vsebuje pepela, se filtrira v 250-mililitrsko merilno bučko. Čaša in filter se spereta s 5 ml vroče klorovodikove kisline 6 mol/l (3.2) in dvakrat z vrelo vodo. Merilna bučka se napolni z vodo do oznake (koncentracija HCl približno 0,5 mol/l).

5.1.1.2

Če je ostanek na filtru videti črn (ogljik), se ponovno postavi v peč in upepeli pri 450–475 oC. Ta upepelitev, ki zahteva le nekaj ur (približno 3–5 ur), je končana, ko je pepel videti bel ali skoraj bel. Ostanek se raztopi s približno 2 ml klorovodikove kisline (3.1), upari do suhega in doda 5 ml klorovodikove kisline 6 mol/l (3.2). Segreje se, raztopina se filtrira v merilno bučko in dopolni z vodo do oznake (koncentracija HCl približno 0,5 mol/l). Opombe: (a) Pri določanju elementov v sledovih je pomembno paziti zaradi tveganja onesnaženja, predvsem s cinkom, bakrom in železom. Zato oprema, ki se uporablja pri pripravi vzorcev, ne sme vsebovati teh kovin. Za zmanjšanje splošnega tveganja onesnaženja je treba delati v brezprašnem prostoru s popolnoma čisto opremo in dobro pomitimi steklenimi posodami. Določanje cinka je posebej občutljivo na več vrst onesnaženja, npr. s stekleno posodo, reagenti, prahom itd. (b) Masa vzorca, ki se upepeli, se izračuna iz približne vsebnosti elementov v sledovih v krmi glede na občutljivost uporabljenega spektrofotometra. Pri nekateri krmi z nizko vsebnostjo elementov v sledovih je morda potrebno začeti z 10–20 g vzorca ter končno raztopino dopolniti do samo 100 ml. (c) Upepeljevanje se mora izvajati v zaprti peči brez dovajanja zraka ali kisika. (d) Temperatura na pirometru ne sme preseči 475 oC.

5.1.2   Določanje s spektrofotometrijo

5.1.2.1   Priprava raztopin za umerjanje

Za vsak element, ki se določa, se iz standardnih delovnih raztopin iz točk 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 in 3.10.1 pripravi serija raztopin za umerjanje, pri čemer je koncentracija HCl v vsaki približno 0,5 mol/l (in (pri železu, manganu in cinku) koncentracija lantanovega klorida, ki ustreza 0,1 % La (m/v)).

Izbrane koncentracije elementov v sledovih morajo ustrezati območju občutljivosti uporabljenega spektrofotometra. V spodnjih preglednicah so kot primer navedena tipična območja raztopin za umerjanje glede na vrsto in občutljivost uporabljenega spektrofotometra, zato je morda treba izbrati drugačne koncentracije.

Železo

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml delovne standardne raztopine (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in dopolniti z vodo do 100 ml

Baker

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml delovne standardne raztopine (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Mangan

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml delovne standardne raztopine (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in dopolniti z vodo do 100 ml

Cink

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml delovne standardne raztopine (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in dopolniti z vodo do 100 ml

5.1.2.2   Priprava raztopine za analizo

Za določanje bakra se lahko raztopina, pripravljena v skladu s točko 5.1.1, ponavadi uporabi neposredno. Če je treba koncentracijo prilagoditi območju umeritve, se ustrezen alikvot odpipetira v 100-mililitrsko merilno bučko in dopolni s klorovodikovo kislino 0,5 mol/l (3.3) do oznake.

Za določanje železa, mangana in cinka se odpipetira ustrezen alikvot raztopine, pripravljene v skladu s točko 5.1.1, v 100-mililitrsko merilno bučko, doda se 10 ml raztopine lantanovega klorida (3.11) in dopolni do oznake s klorovodikovo kislino 0,5 mol/l (3.3) (glej tudi točko 8 „Opomba“).

5.1.2.3   Slepi preskus

Slepi preskus mora vključevati vse predpisane korake postopka, le da se izpusti vzorec. Raztopina za umerjanje „0“ se ne sme uporabljati kot slepa raztopina.

5.1.2.4   Merjenje atomske absorpcije

Atomska absorpcija raztopin za umerjanje in raztopine, ki se analizira, se izmeri z uporabo oksidnega plamena zrak-acetilen pri naslednjih valovnih dolžinah:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Vsako merjenje se izvede štirikrat.

5.2   Mineralna krma

Če vzorec ne vsebuje organskih snovi, predhodno upepeljevanje ni potrebno. Nadaljuje se v skladu z drugim odstavkom točke 5.1.1.1. Uparevanje s klorovodikovo kislino se lahko izpusti.

6.   Izračun rezultatov

Koncentracija elementa v sledovih v raztopini, ki se analizira, se izračuna s pomočjo umeritvene krivulje, rezultat pa se izrazi v miligramih elementa v sledovih na kilogram vzorca (ppm).

7.   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, ki jih na istem vzorcu izvaja isti analitik, ne presega:

—	5 mg/kg absolutne vrednosti za vsebnosti zadevnega elementa v sledovih do 50 mg/kg,

—	10 % višjega rezultata za vsebnosti zadevnega elementa v sledovih 50–100 mg/kg,

—	10 mg/kg absolutne vrednosti za vsebnosti zadevnega elementa v sledovih 100–200 mg/kg,

—	5 % višjega rezultata za vsebnosti zadevnega elementa v sledovih nad 200 mg/kg.

8.   Opomba

Če je količina prisotnih fosfatov visoka, lahko moti določanje železa, mangana in cinka. To se mora popraviti z dodajanjem raztopine lantanovega klorida (3.11). Če pa je masno razmerju v vzorcu (Ca + Mg/P)  > 2, se lahko izpusti dodajanje raztopine lantanovega klorida (3.11) raztopini za analizo in raztopinam za umerjanje.

D.   DOLOČANJE HALOFUGINONA

DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-kvinazolin-4-(3H)-ena hidrobromid

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni halofuginona v krmi. Meja kvantifikacije je 1 mg/kg.

2.   Načelo

Po obdelavi z vročo vodo se halofuginon ekstrahira v obliki proste baze v etilni acetat in se nato kot hidroklorid loči v vodno raztopino kisline. Ekstrakt se prečisti z ionsko izmenjevalno kromatografijo. Vsebnost halofuginona se določi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z reverzno fazo in z UV-detektorjem.

3.   Reagenti

3.1	Acetonitril, za HPLC

3.2	Izmenjevalec Amberlite XAD-2

3.3	Amonijev acetat

3.4	Etilni acetat

3.5	Ledocetna kislina

3.6	Standardna snov halofuginon (DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-kvinazolin-4-(3H)-ena hidrobromid, E 764)

3.6.1

Osnovna standardna raztopina halofuginona, 100 μg/ml 50 mg halofuginona (3.6) se natehta na 0,1 mg natančno in prenese v 500-mililitrsko merilno bučko ter raztopi v pufrski raztopini amonijevega acetata (3.18), dopolni se s pufrsko raztopino do oznake in premeša. Ta raztopina je stabilna tri tedne pri 5 oC, če se hrani na temnem.

3.6.2

Raztopine za umerjanje V serijo 100-mililitrskih merilnih bučk se prenese 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 in 6,0 ml osnovne standardne raztopine (3.6.1). Dopolni se z mobilno fazo (3.21) do oznake in premeša. V teh raztopinah je koncentracija halofuginona 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 in 6,0 μg/ml. Te raztopine je treba pripraviti sveže pred uporabo.

3.7	Klorovodikova kislina, (ρ20 približno 1,16 g/ml)

3.8

Metanol

3.9	Srebrov nitrat

3.10	Natrijev askorbat

3.11	Natrijev karbonat

3.12	Natrijev klorid

3.13	EDTA (etilendiamintetraocetna kislina, dinatrijeva sol)

3.14	Voda, za HPLC

3.15	Raztopina natrijevega karbonata, c = 10 g/100 ml

3.16	Raztopina natrijevega klorida in nasičenega natrijevega karbonata, c = 5 g/100 ml 50 g natrijevega karbonata (3.11) se raztopi v vodi, razredči do 1 litra, nato pa se doda natrijev klorid (3.12), dokler raztopina ni nasičena.

3.17	Klorovodikova kislina, približno 0,1 mol/l 10 ml HCl (3.7) se razredči z vodo do 1 litra.

3.18	Pufrska raztopina amonijevega acetata, približno 0,25 mol/l 19,3 g amonijevega acetata (3.3) in 30 ml ocetne kisline (3.5) se raztopi v vodi (3.14) ter razredči do 1 litra.

3.19

Priprava izmenjevalca Amberlite XAD-2 Ustrezna količina Amberlita (3.2) se spira z vodo, dokler niso odstranjeni vsi kloridni ioni, kar dokazuje preskus s srebrovim nitratom (3.20) v zavrženi vodni fazi. Nato se izmenjevalec spere s 50 ml metanola (3.8), metanol se zavrže, izmenjevalec pa hrani v svežem metanolu.

3.20	Raztopina srebrovega nitrata, približno 0,1 mol/l 0,17 g srebrovega nitrata (3.9) se raztopi v 10 ml vode.

3.21

Mobilna faza HPLC 500 ml acetonitrila (3.1) se zmeša s 300 ml pufrske raztopine amonijevega acetata (3.18) in 1 200 ml vode (3.14). pH se uravna na 4,3 z ocetno kislino (3.5). Filtrira se skozi filter 0,22 μm (4.8) in raztopina se razplini (npr. 10 minut v ultrazvočni kopeli). Ta raztopina je stabilna en mesec, če se hrani na temnem v zaprti posodi.

4.   Oprema

4.1	Ultrazvočna kopel

4.2	Rotacijski uparjalnik

4.3	Centrifuga

4.4	HPLC-oprema z ultravijoličnim detektorjem z nastavljivo valovno dolžino ali detektorjem s serijo diod

4.4.1

Kolona za tekočinsko kromatografijo, 300 mm × 4 mm, C18, polnitev 10 μm ali enakovredna kolona

4.5	Steklena kolona (300 mm × 10 mm) s filtrom iz sintranega stekla in petelinčkom

4.6	Filtri iz steklenih vlaken, premera 150 mm

4.7	Membranski filtri, 0,45 μm

4.8	Membranski filtri, 0,22 μm

5.   Postopek

Opomba

:

Halofuginon kot prosta baza je nestabilen v bazičnih in etilacetatnih raztopinah. V etilacetatu se ne pusti več kot 30 minut.

5.1   Splošno

5.1.1

Z analizo slepe krme se preveri, da niso prisotni niti halofuginon niti moteče snovi.

5.1.2

Preskus izkoristka se izvede z analizo slepe krme, ki se ji doda količina halofuginona, podobna količini v vzorcu. Za koncentracijo 3 mg/kg se k 10 g slepe krme doda 300 μl osnovne standardne raztopine (3.6.1), premeša se in počaka 10 minut, preden se začne postopek ekstrakcije (5.2). Opomba : Pri tej metodi je vrsta slepe krme podobna vrsti vzorca, pri analizi pa se dokaže odsotnost halofuginona.

5.2   Ekstrakcija

10 g pripravljenega vzorca se natehta na 0,1 g natančno in prenese v 200-mililitrsko centrifugirno epruveto, doda se 0,5 g natrijevega askorbata (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) in 20 ml vode ter premeša. Epruveta se postavi za 5 min v vodno kopel (80 oC). Po ohladitvi na sobno temperaturo se doda 20 ml raztopine natrijevega karbonata (3.15) in premeša. Takoj se doda 100 ml etilacetata (3.4) in 15 sekund ročno močno stresa. Nato se epruveta postavi za 3 minute v ultrazvočno kopel (4.1), zamašek pa zrahlja. Centrifugira se 2 minuti, faza etilacetata pa se oddekantira skozi filter iz steklenih vlaken (4.6) v 500-mililitrski lij ločnik. Ekstrakcija vzorca se ponovi z nadaljnjimi 100 ml etilacetata. Sestavljeni ekstrakti se spirajo 1 minuto s 50 ml raztopine nasičenega natrijevega klorida-natrijevega karbonata (3.16), vodna plast pa se zavrže.

Organska plast se ekstrahira 1 minuto s 50 ml klorovodikove kisline (3.17). Spodnja kislinska plast se prenese v 250-mililitrski lij ločnik. Organska plast se ponovno ekstrahira 1,5 minute z nadaljnjimi 50 ml klorovodikove kisline, ekstrakt pa se združi s prvim ekstraktom. Združena ekstrakta se približno 10 sekund spirata z 10 ml etilacetata (3.4) z vrtenjem.

Vodna plast se prenese v 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom, organska faza pa se zavrže. Ves preostali etilacetat iz kisle raztopine se upari v rotacijskem uparjalniku (4.2). Temperatura vodne kopeli ne sme preseči 40 oC. Ves preostali etilacetat se odstrani v 5 minutah v vakuumu pri približno 25 milibarih in 38 oC.

5.3   Čiščenje

5.3.1   Priprava kolone z Amberlitom

Kolona XAD-2 se pripravi za vsak ekstrakt vzorca. 10 g pripravljenega Amberlita (3.19) se z metanolom (3.8) prenese v stekleno kolono (4.5). Na vrh posteljice izmenjevalca se položi majhen zamašek iz steklene volne. Metanol se izpusti iz kolone, izmenjevalec pa se spere s 100 ml vode tako, da se tok vode ustavi, ko vrh posteljice doseže izmenjevalec. Pred uporabo se pusti 10 minut, da se kolona uravnoteži. Kolona se ne sme nikoli izsušiti.

5.3.2   Čiščenje vzorca

Ekstrakt (5.2) se prenese na vrh pripravljene kolone z Amberlitom (5.3.1) in eluira, eluat pa se zavrže. Hitrost eluiranja ne sme biti večja od 20 ml/min. Bučka z okroglim dnom se spere z 20 ml klorovodikove kisline (3.17) in vsebina se uporabi za spiranje izmenjalne kolone. Kakršna koli preostala raztopina kisline se prepiha z zrakom. Ostanek po izpiranju se zavrže. V kolono se doda 100 ml metanola (3.8), 5–10 ml se eluira, eluat pa se zbere v 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom. Preostali metanol se pusti 10 minut, da se uravnoteži z izmenjevalcem, eluiranje se nadaljuje s hitrostjo, ki ne presega 20 ml/min, eluat pa se zbira v isto bučko z okroglim dnom. Metanol se upari na rotacijskem uparjalniku (4.2), pri čemer temperatura vodne kopeli ne sme preseči 40 oC. Ostanek se z mobilno fazo (3.21) prenese v 10-mililitrsko merilno bučko. Dopolni se z mobilno fazo do oznake in premeša. Alikvot se prefiltrira skozi membranski filter (4.7). Raztopina se shrani za določanje s HPLC (5.4).

5.4   Določanje s HPLC

5.4.1   Parametri

Naslednji pogoji se lahko uporabljajo kot smernice, lahko pa se uporabljajo drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate.

Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.4.1)

Mobilna faza HPLC (3.21)

Hitrost pretoka: 1,5–2 ml/min

Detekcijska valovna dolžina: 243 nm

Volumen, ki se vbrizga: 40 do 100 μl

Stabilnost kromatografskega sistema se preveri z večkratnim vbrizgavanjem raztopine za umerjanje s koncentracijo 3,0 μg/ml (3.6.2), dokler niso dosežene konstantne višine (ali površine) vrhov in konstantni retencijski časi.

5.4.2   Umeritvena krivulja

Vsaka raztopina za umerjanje (3.6.2) se vbrizga večkrat, za vsako koncentracijo pa se izmerijo srednje vrednosti višin (površin) vrhov. Umeritvena krivulja se pripravi tako, da se na ordinato nanesejo srednje vrednosti višin ali površin vrhov raztopin za umerjanje, na absciso pa ustrezne koncentracije v μg/ml.

5.4.3   Raztopina vzorca

Ekstrakt vzorca (5.3.2) se vbrizga večkrat, pri čemer se uporabijo enaki volumni kot za raztopino za umerjanje, nato pa se določi srednja vrednost višin (površin) vrhov halofuginona.

6.   Izračun rezultatov

Koncentracija raztopine v μg/ml se določi iz srednjih vrednosti višin (površin) vrhov halofuginona v raztopini vzorca iz umeritvene krivulje (5.4.2).

Vsebnost halofuginona (w) (mg/kg) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

c	:	koncentracija halofuginona v raztopini vzorca v μg/ml;
m	:	masa preskušanega vzorca v gramih.

7.   Potrditev rezultatov

7.1   Identiteta

Identiteta analita se lahko potrdi z dodatno kromatografijo ali z detektorjem s serijo diod, s katerim se primerjata spekter ekstrakta vzorca in spekter raztopine za umerjanje (3.6.2) s koncentracijo 6,0 μg/ml.

7.1.1   Dodatna kromatografija

Ekstraktu vzorca se doda ustrezna količina raztopine za umerjanje (3.6.2). Količina dodanega halofuginona mora biti podobna ocenjeni količini halofuginona v ekstraktu vzorca.

Povišan je le vrh halofuginona ob upoštevanju dodane količine in razredčitve ekstrakta. Širina vrha na polovici maksimalne višine mora biti znotraj ± 10 % prvotne širine.

7.1.2   Detekcija s serijo diod

Rezultati se ocenijo glede na naslednja merila:

(a)	valovni dolžini maksimalne absorpcije spektra vzorca in spektra standarda, zabeleženi na najvišji točki vrha kromatograma, morata biti isti znotraj meja, določenih z ločljivostjo sistema za detekcijo. Za detekcijo s serijo diodo je to ponavadi znotraj ± 2 nm;

(b)

med 225 in 300 nm se spekter vzorca in spekter standarda, zabeležena na najvišji točki kromatografskega vrha, za navedene dele spektra ne smeta razlikovati znotraj območja 10–100 % relativne absorbance. To merilo je izpolnjeno, ko so prisotne iste najvišje vrednosti in ko odmik med dvema spektroma na nobeni opazovani točki ne preseže 15 % absorbance standardnega analita;

(c)

med 225 in 300 nm se spektri naraščanja, najvišje točke vrha in padanja vrha, pridobljeni iz ekstrakta vzorca, za navedene dele spektra ne smejo razlikovati znotraj območja 10–100 % relativne absorbance. To merilo je izpolnjeno, ko so prisotne iste najvišje točke in ko odmik med spektri na nobeni od opazovanih točk ne preseže 15 % absorbance spektra najvišje točke.

Če eno od teh meril ni izpolnjeno, prisotnost analita ni potrjena.

7.2   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 0,5 mg/kg za vsebnost halofuginona do 3 mg/kg.

7.3   Izkoristek

Za slepi vzorec z dodatkom je izkoristek najmanj 80 %.

8.   Rezultati medlaboratorijske študije

Organizirana je bila medlaboratorijska študija (5), v kateri je osem laboratorijev analiziralo tri vzorce.

Rezultati

	Vzorec A (slepi) ob prejemu	Vzorec B (v prahu)		Vzorec C (v briketih)
		ob prejemu	po 2 mesecih	ob prejemu	po 2 mesecih
Srednja vrednost [mg/kg]	ND	2,80	2,42	2,89	2,45
SR [mg/kg]	—	0,45	0,43	0,40	0,42
CVR [ %]	—	16	18	14	17
Rec. [ %]		86	74	88	75

ND	=	ni zaznano;
SR	=	standardni odmik obnovljivosti;
CVR	=	koeficient variacije obnovljivosti (%);
Rec.	=	izkoristek (%).

E.   DOLOČANJE ROBENIDINA

1,3-bis [(4-klorobenziliden)amino]gvanidin – hidroklorid

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni robenidina v krmi. Meja kvantifikacije je 5 mg/kg.

2.   Načelo

Vzorec se ekstrahira z nakisanim metanolom. Ekstrakt se osuši in alikvot se prečisti na koloni iz aluminijevega oksida. Robenidin se eluira s kolone z metanolom, koncentrira in dopolni z mobilno fazo do ustreznega volumna. Vsebnost robenidina se določi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z reverzno fazo in UV-detektorjem.

3.   Reagenti

3.1

Metanol

3.2	Nakisani metanol 4,0 ml klorovodikove kisline (ρ20 = 1,18 g/ml) se prenese v 500-mililitrsko merilno bučko, dopolni se do oznake z metanolom (3.1) in premeša. Ta raztopina se pred vsako uporabo sveže pripravi.

3.3	Acetonitril, za HPLC

3.4	Molekularno sito Tip 3A, kroglice 8 do 12 meš (kroglice, premera 1,6 – 2,5 mm, kristalinični aluminijev silikat, premer por 0,3 mm)

3.5	Stopnja kislinske aktivnosti I aluminijevega oksida, za kolonsko kromatografijo V primerno posodo se prenese 100 g aluminijevega oksida in doda 2,0 ml vode. Zamaši se in stresa približno 20 minut. Hrani se v dobro zaprti posodi.

3.6	Raztopina kalijevega dihidrogenfosfata, c = 0,025 mol/l 3,40 g kalijevega dihidrogenfosfata se raztopi v vodi (za HPLC) v 1 000-mililitrski merilni bučki, dopolni se do oznake in premeša.

3.7	Raztopina dinatrijevega hidrogenfosfata, c = 0,025 mol/l 3,55 g brezvodnega dinatrijevega hidrogenfosfata (ali 4,45 g dihidrata ali 8,95 g dodekahidrata) se raztopi v vodi (za HPLC) v 1 000-mililitrski merilni bučki, dopolni se do oznake in premeša.

3.8

HPLC-mobilna faza Zmešajo se naslednji reagenti:   650 ml acetonitrila (3.3),   250 ml vode (za HPLC),   50 ml raztopine kalijevega dihidrogenfosfata (3.6),   50 ml raztopine dinatrijevega hidrogenfosfata (3.7). Filtrira se skozi filter 0,22 μm (4,6), raztopina pa se nato razplini (npr. 10 minut v ultrazvočni kopeli).

3.9	Standardna snov Čisti robenidin: 1,3-bis[4-klorobenziliden)amino] gvanidin hidroklorid

3.9.1

Osnovna standardna raztopina robenidina: 300 μg/ml 30 mg standardnega robenidina (3.9) se natehta na 0,1 mg natančno. Raztopi se v nakisanem metanolu (3.2) v 100-mililitrski merilni bučki, dopolni se z istim topilom do oznake in premeša. Bučka se ovije v aluminijasto folijo in hrani v temi.

3.9.2

Vmesna standardna raztopina robenidina: 12 μg/ml 10,0 ml osnovne standardne raztopine robenidina (3.9.1) se prenese v 250-mililitrsko merilno bučko, dopolni se z mobilno fazo (3.8) do oznake in premeša. Bučka se ovije v aluminijasto folijo in hrani v temi.

3.9.3

Raztopine za umerjanje V serijo 50-mililitrskih merilnih bučk se prenese 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 in 25,0 ml vmesne standardne raztopine (3.9.2). Dopolni se z mobilno fazo (3.8) do oznake in premeša. Te raztopine ustrezajo koncentracijam robenidina 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 in 6,0 μg/ml. Te raztopine je treba pripraviti sveže pred uporabo.

3.10	Voda za HPLC

4.   Oprema

4.1	Steklena kolona Iz temnega stekla, s petelinčkom in rezervoarjem z volumnom približno 150 ml, notranjega premera 10–15 mm, dolžine 250 mm

4.2	Mehanski stresalnik ali magnetno mešalo

4.3	Rotacijski uparjalnik

4.4	Oprema za HPLC z ultravijoličnim detektorjem ali detektorjem s serijo diod, z nastavljivo valovno dolžino v območju 250–400 nm.

4.4.1

Kolona za tekočinsko kromatografijo: 300 mm × 4 mm, C18, polnitev 10 μm ali enakovredna

4.5	Filtrski papir iz steklenih vlaken (Whatman GF/A ali enakovreden)

4.6	Membranski filtri, 0,22 μm

4.7	Membranski filtri, 0,45 μm

5.   Postopek

Opomba

:

Robenidin je občutljiv na svetlobo. Pri vseh postopkih se uporablja temna steklovina.

5.1   Splošno

5.1.1

Z analizo slepe krme se zagotovi, da niso prisotni niti robenidin niti moteče snovi.

5.1.2

Preskus izkoristka se izvede z analizo slepe krme (5.1.1), ki se ji doda količina amproliuma, podobna količini v vzorcu. Za koncentracijo 60 mg/kg se 3,0 ml osnovne standardne raztopine (3.9.1) prenese v 250-mililitrsko erlenmajerico. Raztopina se upari v toku dušika do približno 0,5 ml. Doda se 15 g slepe krme, premeša, pusti 10 minut in nadaljuje z ekstrakcijo (5.2). Opomba : Pri tej metodi je vrsta slepe krme podobna vrsti vzorca in pri analizi se dokaže odsotnost robenidina.

5.2   Ekstrakcija

Približno 15 g vzorca se natehta na 0,01 g natančno. Prenese se v 250-mililitrsko erlenmajerico, doda se 100,0 ml nakisanega metanola (3.2), zamaši se in stresa eno uro v stresalniku (4.2). Raztopina se filtrira skozi filtrirni papir iz steklenih vlaken (4.5) v 150-mililitrsko erlenmajerico. Doda se 7,5 g molekularnega sita (3.4), zamaši se in stresa pet minut. Takoj se filtrira skozi filtrirni papir iz steklenih vlaken. Ta raztopina se shrani za fazo čiščenja (5.3).

5.3   Čiščenje

5.3.1   Priprava kolone z aluminijevim oksidom

V spodnji del steklene kolone se vstavi majhen zamašek iz steklene volne (4.1), ki se potlači s stekleno palčko. 11,0 g pripravljenega aluminijevega oksida (3.5) se natehta in prenese v kolono. Pazi se, da je pri tem postopku izpostavljenost zraku čim manjša. Rahlo se udarja po spodnjem delu polne kolone, da se aluminijev oksid sesede.

5.3.2   Čiščenje vzorca

Na kolono se s pipeto prenese 5,0 ml ekstrakta vzorca, pripravljenega v (5.2). Pipeta se nasloni na steno kolone, nato pa se pusti, da se raztopina absorbira na aluminijev oksid. Robenidin se eluira iz kolone s 100 ml metanola (3.1) s hitrostjo pretoka 2–3 ml/min, eluat pa se zbere v 250-mililitrsko bučko z okroglim dnom. Raztopina metanola se upari do suhega pri znižanem tlaku in pri 40 oC v rotacijskem uparjalniku (4.3). Ostanek se raztopi v 3–4 ml mobilne faze (3.8) in prenese v 10-mililitrsko merilno bučko. Bučka se nekajkrat spere z 1–2 ml mobilne faze, izpirki pa se prenesejo v merilno bučko. Dopolni se do oznake z istim topilom in premeša. Alikvot se prefiltrira skozi membranski filter 0,45 μm (4.7). Ta raztopina se shrani za določanje s HPLC (5.4).

5.4   Določanje s HPLC

5.4.1   Parametri

Naslednji pogoji se lahko uporabljajo kot smernice, lahko pa se uporabljajo drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate:

kolona za tekočinsko kromatografijo (4.4.1),

mobilna faza HPLC (3.8),

hitrost pretoka: 1,5–2 ml/min,

valovna dolžina detekcije: 317 nm,

volumen, ki se vbrizga: 20–50 μl.

Stabilnost kromatografskega sistema se preveri z večkratnim vbrizgavanjem raztopine za umerjanje (3.9.3) s koncentracijo 3,6 μg/ml, dokler se ne dosežejo konstantne višine vrhov in konstantni retencijski časi.

5.4.2   Umeritvena krivulja

Vsaka raztopina za umerjanje (3.9.3) se večkrat vbrizga, za vsako koncentracijo pa se izmerijo višine (površine) vrhov. Umeritvena krivulja se pripravi tako, da se na ordinato nanesejo srednje vrednosti višin ali površin vrhov raztopin za umerjanje, na absciso pa ustrezne koncentracije v μg/ml.

5.4.3   Raztopina vzorca

Večkrat se vbrizga ekstrakt vzorca (5.3.2) z enakimi volumni, kakor se uporabljajo pri raztopini za umerjanje, nato pa se določijo srednje vrednosti višin (površin) vrhov robenidina.

6.   Izračun rezultatov

Koncentracija raztopine vzorca v μg/ml se določi iz srednje vrednosti višin (površin) vrhov robenidina iz umeritvene krivulje (5.4.2).

Vsebnost robenidina (w) (mg/kg) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

pri čemer je:

c	=	koncentracija robenidina v raztopini vzorca v μg/ml;
m	=	masa preskušanega vzorca v gramih.

7.   Potrditev rezultatov

7.1   Identiteta

Identiteta analita se lahko potrdi z dodatno kromatografijo ali z detektorjem s serijo diod, s katerim se primerjata spekter ekstrakta vzorca in spekter raztopine za umerjanje (3.9.3) s koncentracijo 6,0 μg/ml.

7.1.1   Dodatna kromatografija

Ekstraktu vzorca se doda primerna količina raztopine za umerjanje (3.9.3). Količina dodanega robenidina mora biti podobna ocenjeni količini robenidina v ekstraktu vzorca.

Povišan je le vrh robenidina ob upoštevanju dodane količine in razredčitve ekstrakta. Širina vrha na polovici njegove največje višine mora biti v mejah približno 10 % prvotne širine.

7.1.2   Detekcija s serijo diod

Rezultati se ocenijo glede na naslednja merila:

(a)	valovni dolžini maksimalne absorpcije spektra vzorca in spektra standarda, zabeleženi na najvišji točki vrha kromatograma, morata biti isti znotraj meja, določenih z ločljivostjo sistema za detekcijo. Za detekcijo s serijo diod je to ponavadi v območju približno 2 nm;

(b)

med 250 in 400 nm se spekter vzorca in spekter standarda na najvišji točki kromatografskega vrha za navedene dele spektra ne smeta razlikovati znotraj območja 10–100 % relativne absorbance. To merilo je izpolnjeno, ko so prisotne iste najvišje vrednosti in ko odmik med dvema spektroma na nobeni opazovani točki ne preseže 15 % absorbance standardnega analita;

(c)

med 250 in 400 nm se spektri naraščanja, najvišje točke vrha in padanja vrha, pridobljeni iz ekstrakta vzorca, za navedene dele spektra ne smejo razlikovati znotraj območja 10–100 % relativne absorbance. To merilo je izpolnjeno, ko so prisotne iste najvišje točke in ko odmik med spektri na nobeni od opazovanih točk ne preseže 15 % absorbance spektra najvišje točke.

Če eno od teh meril ni izpolnjeno, prisotnost analita ni potrjena.

7.2   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati 10 % višjega rezultata za vsebnost robenidina nad 15 mg/kg.

7.3   Izkoristek

Za slepi vzorec z dodatkom je izkoristek najmanj 85 %.

8.   Rezultati medlaboratorijske študije

ES je organizirala medlaboratorijsko študijo, pri kateri je 12 laboratorijev analiziralo štiri vzorce perutninske in kunčje krme v prahu in briketih. Vsak vzorec je bil analiziran dvakrat. Rezultati so zbrani v spodnji preglednici:

	Perutninska krma		Kunčja krma
	v prahu	v briketih	v prahu	v briketih
Srednja vrednost [mg/kg]	27,00	27,99	43,6	40,1
Sr [mg/kg]	1,46	1,26	1,44	1,66
CVr [ %]	5,4	4,5	3,3	4,1
SR [mg/kg]	4,36	3,36	4,61	3,91
CVR [ %]	16,1	12,0	10,6	9,7
Recovery [ %]	90,0	93,3	87,2	80,2

Sr	=	standardni odmik ponovljivosti;
CVr	=	koeficient variacije ponovljivosti v %;
SR	=	standardni odmik obnovljivosti;
CVR	=	koeficient variacije obnovljivosti v %.

F.   DOLOČANJE DIKLAZURILA

(+)-4-klorfenil [2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-diokso-1,2,4-triazin-2-il) fenil] acetonitril

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni diklazurila v krmi in premiksih. Meja določanja je 0,1 mg/kg, meja kvantifikacije pa 0,5 mg/kg.

2.   Načelo

Po dodatku notranjega standarda se vzorec ekstrahira z nakisanim metanolom. Pri krmi se alikvot ekstrakta prečisti na kartuši C18 za ekstrakcijo v trdni fazi. Diklazuril se eluira iz kartuše z mešanico nakisanega metanola in vode. Po uparevanju se ostanek raztopi v raztopini DMF in vode. Pri premiksih se ekstrakt upari in nato se ostanek raztopi v raztopini DMF in vode. Vsebnost diklazurila se določi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z reverzno fazo s ternarnim gradientom, z uporabo UV-detektorja.

3.   Reagenti

3.1	Voda, za HPLC

3.2	Amonijev acetat

3.3	Tetrabutilamonijev hidrogen sulfat (TBHS)

3.4	Acetonitril, za HPLC

3.5	Metanol, za HPLC

3.6	N, N-dimetilformamid (DMF)

3.7	Klorovodikova kislina, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8	Standardna snov: diklazuril II-24: (+)-4-klorfenil [2,6-diklor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-diokso-1,2,4-triazin-2-il) fenil] acetonitril, zajamčene čistosti, E771.

3.8.1

Osnovna standardna raztopina diklazurila, 500 μg/ml 25 mg standardne snovi diklazurila (3.8) se natehta na 0,1 mg natančno in prenese v 50-mililitrsko merilno bučko. Raztopi se v DMF (3.6), bučka se dopolni z DMF (3.6) do oznake in premeša. Bučka se ovije v aluminijasto folijo ali pa se uporabi rjava bučka ter shrani v hladilniku. Pri temperaturi ≤ 4 oC je raztopina stabilna 1 mesec.

3.8.2

Standardna raztopina diklazurila, 50 μg/ml 5,00 ml osnovne standardne raztopine (3.8.1) se prenese v 50-mililitrsko merilno bučko, dopolni se z DMF (3.6) do oznake in premeša. Bučka se ovije v aluminijasto folijo ali pa se uporabi rjava bučka ter shrani v hladilniku. Pri temperaturi ≤ 4 oC je raztopina stabilna 1 mesec.

3.9	Snov, ki je notranji standard: 2,6 dikloro-α-(4-klorofenil)-4-(4,5 dihidro-3,5-diokso-1,2,4-triazin-2 (3H) – il) α-metilbenzen-acetonitril.

3.9.1

Osnovna raztopina notranjega standarda, 500 μg/ml 25 mg notranjega standarda (3.9) se natehta na 0,1 mg natančno in prenese v 50-mililitrsko merilno bučko. Raztopi se v DMF (3.6), bučka se dopolni z DMF (3.6) do oznake in premeša. Bučka se ovije v aluminijasto folijo ali se pa uporabi rjava bučka ter shrani v hladilniku. Pri temperaturi ≤ 4 oC je raztopina stabilna 1 mesec.

3.9.2

Raztopina notranjega standarda, 50 μg/ml 5,00 ml osnovne raztopine notranjega standarda (3.9.1) se prenese v 50-mililitrsko merilno bučko, dopolni se z DMF (3.6) do oznake in premeša. Bučka se ovije v aluminijasto folijo ali pa se uporabi rjava bučka ter shrani v hladilniku. Pri temperaturi ≤ 4 oC je raztopina stabilna 1 mesec.

3.9.3

Raztopina notranjega standarda za premikse, p/1 000 mg/ml (p = nominalna vsebnost diklazurila v mg/kg v premiksu) p/10 mg notranjega standarda se natehta na 0,1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko, raztopi se v DMF (3.6) v ultrazvočni kopeli (4.6), dopolni se z DMF do oznake in premeša. Bučka se ovije v aluminijasto folijo ali pa se uporabi rjava bučka ter shrani v hladilniku. Pri temperaturi ≤ 4 oC je raztopina stabilna 1 mesec.

3.10

Raztopina za umerjanje, 2 μg/ml 2,00 ml standardne raztopine diklazurila (3.8.2) in 2,00 ml raztopine notranjega standarda (3.9.2) se odpipetira v 50-mililitrsko merilno bučko. Doda se 16 ml DMF (3.6), bučka se dopolni z vodo do oznake in premeša. To raztopino je treba pripraviti svežo pred uporabo.

3.11	Ekstrakcijska kartuša za trdno fazo C18, npr. Bond Elut, velikost: 1 cc, masa absorbenta: 100 mg

3.12	Ekstrakcijsko topilo: nakisani metanol 5,0 ml klorovodikove kisline (3.7) se odpipetira v 1 000 ml metanola (3.5) in premeša.

3.13	Mobilna faza za HPLC

3.13.1

Eluent A: raztopina amonijevega acetata in tetrabutilamonijevega hidrogen sulfata 5 g amonijevega acetata (3.2) in 3,4 g TBHS (3.3) se raztopi v 1 000 ml vode (3.1) ter premeša.

3.13.2

Eluent B: acetonitril (3.4)

3.13.3

Eluent C: metanol (3.5)

4.   Oprema

4.1	Mehanski stresalnik

4.2	Oprema za HPLC s terciarnim gradientom

4.2.1

Kolona za tekočinsko kromatografsko kolono, Hypersil ODS, polnitev 3 μm, 100 mm x 4,6 mm ali enakovredna

4.2.2

UV-detektor z nastavljivo valovno dolžino ali detektor s serijo diod.

4.3	Rotacijski uparjalnik

4.4	Membranski filter, 0,45 μm

4.5	Vakuumski ventil

4.6	Ultrazvočna kopel

5.   Postopek

5.1   Splošno

5.1.1   Slepa krma

Z analizo slepe krme se zagotovi, da niso prisotni niti diklazuril niti moteče snovi. Vrsta slepe krme je podobna vrsti vzorca in z analizo se dokaže odsotnost diklazurila ali motečih substanc.

5.1.2   Preskus izkoristka

Preskus izkoristka se izvede tako, da se analizira slepa krma, ki se ji doda toliko diklazurila, kolikor ga je v vzorcu. Za koncentracijo l mg/kg se doda 0,1 ml osnovne standardne raztopine (3.8.1) v 50 g slepe krme, dobro se premeša in pusti 10 minut, pred nadaljevanjem (5.2) pa se večkrat ponovno premeša.

Če pa vrsta slepe krme, podobna vrsti vzorca, ni na voljo (glej 5.1.1), se lahko preskus izkoristka izvede po metodi standardnega dodatka. V tem primeru se vzorcu za analizo doda količina diklazurila, podobna tisti v vzorcu. Ta vzorec se analizira skupaj z vzorcem brez dodanega diklazurila, izkoristek pa se izračuna z odštevanjem.

5.2   Ekstrakcija

5.2.1   Krma

Približno 50 g vzorca se natehta na 0,01 g natančno. Prenese se v 500-mililitrsko erlenmajerico, doda se 1,00 ml raztopine notranjega standarda (3.9.2) in 200 ml ekstrakcijskega topila (3.12), nato pa se erlenmajerica zamaši. Mešanica se prek noči stresa v stresalniku (4.1). Pusti se 10 minut, da se usede. 20-mililitrski alikvot supernatanta se prenese v primerno stekleno posodo in razredči z 20 ml vode. Ta raztopina se prenese na ekstrakcijsko kartušo (3.11), skoznjo pa se spusti z vakuumom (4.5). Kartuša se spere s 25 ml mešanice ekstrakcijskega topila (3.12) in vode, 65 + 35 (V + V). Zbrane frakcije se zavržejo, spojine pa se eluirajo s 25 ml mešanice ekstrakcijskega topila (3.12) in vode, 80 + 20 (V + V). Ta frakcija se upari v rotacijskem uparjalniku (4.3) pri 60 oC do prve sušine. Ostanek se raztopi v 1,0 ml DMF (3.6), doda se 1,5 ml vode (3.1) in premeša. Filtrira se skozi membranski filter (4.4). Nadaljuje se z določanjem s HPLC (5.3).

5.2.2   Premiksi

Približno 1 g vzorca se natehta na 0,001 g natančno. Prenese se v 500-mililitrsko erlenmajerico, doda se 1,00 ml raztopine notranjega standarda (3.9.3) in 200 ml ekstrakcijskega topila (3.12), nato pa se erlenmajerica zamaši. Mešanica se prek noči stresa v stresalniku (4.1). Pusti se 10 minut, da se usede. Alikvot (10 000/p ml, p = nominalna vsebnost diklazurila v mg/kg v premiksu) supernatanta se prenese v primerno veliko bučko z okroglim dnom. Do prve sušine se upari pri znižanem tlaku in 60 oC v rotacijskem uparjalniku (4.3). Ostanek se ponovno raztopi v 10,0 ml DMF (3.6), doda se 15,0 ml vode (3.1) in premeša. Nadaljuje se z določanjem s HPLC (5.3).

5.3   Določanje s HPLC

5.3.1   Parametri

Naslednji pogoji se lahko uporabljajo kot smernice, lahko pa se uporabljajo drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate.

Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.2.1):	100 mm × 4,6 mm, Hypersil ODS, polnitev 3 μm ali enakovredna
Mobilna faza:	Eluent A (3.13.1):	vodna raztopina amonijevega acetata in tetrabutil amonijevega hidrogen sulfata
	Eluent B (3.13.2):	acetonitril
	Eluent C (3.13.3):	metanol
Način eluiranja:	— linearni gradient — začetni pogoji: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V) — po 10 minutah se elucijski gradient v 30 minutah spremeni na: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V). V 10 minutah se spere z B.
Hitrost pretoka:	1,5–2 ml/min
Volumen, ki se vbrizga:	20 μl
Valovna dolžina detekcije:	280 nm

Stabilnost kromatografskega sistema se preveri z večkratnim vbrizgavanjem raztopine za umerjanje s koncentracijo 2 μg/ml (3.10), dokler se ne dosežejo konstantne višine vrhov in konstantni retencijski časi.

5.3.2   Raztopina za umerjanje

Večkrat se vbrizga 20 μl raztopine za umerjanje (3.10) ter določi srednja vrednost višine (površine) vrhov diklazurila in vrhov raztopine notranjega standarda.

5.3.3   Raztopina vzorca

Večkrat se vbrizga 20 μl raztopine vzorca (5.2.1 ali 5.2.2) ter določi srednja vrednost višine (površine) vrha diklazurila in raztopine notranjega standarda.

6.   Izračun rezultatov

6.1   Krma

Vsebnost diklazurila (w) (mg/kg) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

[mg/kg]

pri čemer je:

hd, s	=	višina (površina) vrha diklazurila v raztopini vzorca (5.2.1);
hi, s	=	višina (površina) vrha notranjega standarda v raztopini vzorca (5.2.1);
hd, c	=	višina (površina) vrha diklazurila v raztopini za umerjanje (3.10);
hi, c	=	višina (površina) vrha notranjega standarda v raztopini za umerjanje (3.10);
cd, c	=	koncentracija diklazurila v raztopini za umerjanje v μg/ml (3.10);
m	=	masa preskusnega vzorca v gramih;
V	=	volumen ekstrakta vzorca v skladu s točko 5.2.1 (tj. 2,5 ml).

6.2   Premiksi

Vsebnost diklazurila (w) (mg/kg) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

[mg/kg]

pri čemer je:

hd, c	=	višina (površina) vrha diklazurila v raztopini za umerjanje (3.10);
hi, c	=	višina (površina) vrha notranjega standarda v raztopini za umerjanje (3.10);
hd, s	=	višina (površina) vrha diklazurila v raztopini vzorca (5.2.2);
hi, s	=	višina (površina) vrha notranjega standarda v raztopini vzorca (5.2.2);
cd, c	=	koncentracija diklazurila v raztopini za umerjanje v μg/ml (3.10);
m	=	masa preskusnega vzorca v gramih;
V	=	volumen ekstrakta vzorca v skladu s točko 5.2.2 (tj. 25 ml);
p	=	nominalna vsebnost diklazurila v mg/kg v premiksu.

7.   Potrditev rezultatov

7.1   Identiteta

Identiteta analita se lahko potrdi z dodatno kromatografijo ali z detektorjem s serijo diod, s katerim se primerjata spekter ekstrakta vzorca (5.2.1 ali 5.2.2) in spekter raztopine za umerjanje (3.10).

7.1.1   Dodatna kromatografija

Ekstraktu vzorca (5.2.1 ali 5.2.2) se doda primerna količina raztopine za umerjanje (3.10). Količina dodanega diklazurila mora biti podobna količini diklazurila v ekstraktu vzorca.

Povišana sta le vrh diklazurila in vrh notranjega standarda ob upoštevanju dodane količine in razredčitve ekstrakta. Širina vrha na polovici višine mora biti znotraj ± 10 % prvotne širine vrha diklazurila ali notranjega standardnega vrha v vzorcu, ki mu diklazuril ni bil dodan.

7.1.2   Detekcija s serijo diod

Rezultati se ocenijo glede na naslednja merila:

(a)	valovni dolžini maksimalne absorpcije spektra vzorca in spektra standarda, zabeleženi na najvišji točki vrha na kromatogramu, morata biti isti znotraj meja, določenih z ločljivostjo sistema za detekcijo. Pri detekciji s serijo diod je to ponavadi ± 2 nm;

(b)

med 230 in 320 nm se spekter vzorca in spekter standarda, zabeležena na najvišji točki vrha na kromatogramu, za navedene dele spektra ne smeta razlikovati v območju 10–100 % relativne absorbance. To merilo je izpolnjeno, ko so prisotne iste najvišje vrednosti in ko odmik med dvema spektroma na nobeni opazovani točki ne preseže 15 % absorbance standardnega analita;

(c)

med 230 in 320 nm se spektri naraščanja, najvišje točke vrha in padanja vrha, pridobljeni iz ekstrakta vzorca, za navedene dele spektra ne smejo razlikovati v območju 10–100 % relativne absorbance. To merilo je izpolnjeno, ko so prisotne iste najvišje točke in ko odmik med spektri na nobeni od opazovanih točk ne preseže 15 % absorbance spektra najvišje točke.

Če eno od teh meril ni izpolnjeno, prisotnost analita ni potrjena.

7.2   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

—	30 % višje vrednosti za vsebnosti diklazurila 0,5–2,5 mg/kg,

—	0,75 mg/kg za vsebnosti diklazurila 2,5–5 mg/kg,

—	15 % višje vrednosti za vsebnosti diklazurila nad 5 mg/kg.

7.3   Izkoristek

Pri vzorcu z dodatkom (slepem vzorcu) je izkoristek najmanj 80 %.

8.   Rezultati medlaboratorijske študije

Organizirana je bila medlaboratorijska študija, pri kateri je 11 laboratorijev analiziralo 5 vzorcev. Te vzorce sta sestavljala dva premiksa; eden je bil mešan z organsko matrico (O 100), drug pa z anorgansko matrico (A 100). Teoretična vsebnost je 100 mg diklazurila na kg. Trije različni proizvajalci (NL) (L1/Z1/K1) so proizvedli 3 mešane perutninske krme. Teoretična vsebnost je 1 mg diklazurila na kg. Laboratorijem je bilo naročeno, naj vsak vzorec analizirajo enkrat ali dvakrat. (Podrobnejše informacije o navedeni medlaboratorijski študiji so v Journal of AOAC International, knjiga 77, št. 6, 1994, str. 1359–1361). Rezultati so navedeni v spodnji preglednici.

	Vzorec 1 A 100	Vzorec 2 O 100	Vzorec 3 L1	Vzorec 4 Z1	Vzorec 5 K1
L	11	11	11	11	6
n	19	18	19	19	12
Srednja vrednost	100,8	103,5	0,89	1,15	0,89
Sr (mg/kg)	5,88	7,64	0,15	0,02	0,03
CVr (%)	5,83	7,38	17,32	1,92	3,34
SR (mg/kg)	7,59	7,64	0,17	0,11	0,12
CVR (%)	7,53	7,38	18,61	9,67	13,65
Nominalna vsebnost (mg/kg)	100	100	1	1	1

L	=	število laboratorijev;
n	=	število posameznih vrednosti;
Sr	=	standardni odmik ponovljivosti;
CVr	=	koeficient variacije ponovljivosti;
SR	=	standardni odmik obnovljivosti;
CVR	=	koeficient variacije obnovljivosti.

9.   Opomba

Predhodno je treba dokazati, da je odziv diklazurila linearen v območju koncentracij, ki se merijo.

G.   DOLOČANJE LASALOCID NATRIJA

Natrijeva sol polieter monokarboksilne kisline, proizvedena s Streptomyces lasaliensis

1.   Namen in področje uporabe

Ta metoda omogoča določanje ravni lasalocid natrija v krmi in premiksih. Meja določanja je 5 mg/kg, meja kvantifikacije pa 10 mg/kg.

2.   Načelo

Lasalocid natrij se ekstrahira iz vzorca v nakisani metanol in določi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z reverzno fazo z uporabo spektrofluorimetričnega detektorja.

3.   Reagenti

3.1	Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4)

3.2	Ortofosforna kislina, m (m/m) = 85 %

3.3	Raztopina ortofosforne kisline, c = 20 % 23,5 ml ortofosforne kisline (3.2) se razredči s 100 ml vode.

3.4	6-metil-2-heptilamin (1,5-dimetilheksilamin), m (m/m) = 99 %

3.5	Metanol, za HPLC

3.6	Klorovodikova kislina, gostota = 1,19 g/ml

3.7	Raztopina fosfatnega pufra, c = 0,01 mol/l 1,36 g KH2PO4 (3.1) se raztopi v 500 ml vode (3.11), doda se 3,5 ml ortofosforne kisline (3.2) in 10,0 ml 6-metil-2-heptilamina (3.4). pH se uravna na 4,0 z raztopino ortofosforne kisline (3.3) in razredči z vodo (3.11) do 1 000 ml.

3.8	Nakisani metanol 5,0 ml klorovodikove kisline (3.6) se prenese v litrsko merilno bučko, dopolni se z metanolom (3.5) do oznake in premeša. To raztopino je treba pripraviti svežo pred uporabo.

3.9	Mobilna faza za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC), raztopina fosfatnega pufra in metanola 5 + 95 (V + V) 5 ml raztopine fosfatnega pufra (3.7) se zmeša s 95 ml metanola (3.5).

3.10	Lasalocid natrij standardna snov, zajamčene čistosti, C34H53O8Na (natrijeva sol polieter monokarboksilne kisline, proizvedena s Streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1

Osnovna standardna raztopina lasalocid natrija, 500 μg/ml 50 mg lasalocid natrija (3.10) se natehta na 0,1 mg natančno in prenese v 100-mililitrsko merilno bučko, raztopi se v nakisanem metanolu (3.8) ter z istim topilom dopolni do oznake in premeša. To raztopino je treba pripraviti svežo pred uporabo.

3.10.2

Vmesna standardna raztopina lasalocid natrija, 50 μg/ml 10,0 ml osnovne standardne raztopine (3.10.1) se odpipetira v 100-mililitrsko merilno bučko, z nakisanim metanolom (3.8) se dopolni do oznake in premeša. Ta raztopina se mora pripraviti sveža pred uporabo.

3.10.3

Raztopine za umerjanje V serijo 50-mililitrskih merilnih bučk se prenese 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 in 10,0 ml vmesne standardne raztopine (3.10.2). Z nakisanim metanolom se dopolni do oznake (3.8) in premeša. Te raztopine ustrezajo 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 in 10,0 μg lasalocid natrija na ml. Te raztopine se morajo pripraviti sveže pred uporabo.

3.11	Voda, za HPLC

4.   Oprema

4.1	Ultrazvočna kopel (ali stresalna vodna kopel) z nadzorom temperature

4.2	Membranski filtri, 0,45 μm

4.3	Oprema za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) s sistemom za vbrizgavanje, primernim za vbrizgavanje volumnov 20 μl

4.3.1

Kolona za tekočinsko kromatografijo 125 mm x 4 mm, reverzna faza C18, polnitev 5 μm ali enakovredna

4.3.2

Spektrofluorimeter s spremenljivo nastavitvijo valovnih dolžin ekscitacije in emisije

5.   Postopek

5.1   Splošno

5.1.1   Slepa krma

Za učinkovitost preskusa izkoristka (5.1.2) se z analizo slepe krme zagotovi, da niso prisotni niti lasalocid natrij niti moteče snovi. Slepa krma je podobne vrste kot vzorec in dokaže se odsotnost lasalocid natrija ali motečih snovi.

5.1.2   Preskus izkoristka

Preskus izkoristka se izvede z analiziranjem slepe krme, ki se ji doda količina lasalocid natrija, podobna količini v vzorcu. Za koncentracijo 100 mg/kg se 10,0 ml osnovnega standarda (3.10.1) prenese v 250-mililitrsko erlenmajerico, raztopina pa se upari do približno 0,5 ml. Doda se 50 g slepe krme, dobro se premeša in pusti 10 minut, preden se nadaljuje s postopkom ekstrakcije (5.2) pa se nekajkrat ponovno premeša.

Če pa vrsta slepe krme, podobna vrsti vzorca, ni na voljo (glej točko 5.1.1), se lahko preskus izkoristka izvede po metodi standardnega dodatka. V tem primeru se vzorcu za analizo doda količina lasalocid natrija, podobna tisti v vzorcu. Ta vzorec se analizira skupaj z vzorcem brez dodanega lasalocid natrija, izkoristek pa se izračuna z odštevanjem.

5.2   Ekstrakcija

5.2.1   Krma

5–10 g vzorca se natehta na 0,01 g natančno in prenese v 250-mililitrsko erlenmajerico z zamaškom. S pipeto se doda 100,0 ml nakisanega metanola (3.8). Zamašek se rahlo zapre, erlenmajerica pa se zavrti, da se delci razpršijo. Erlenmajerica se postavi v ultrazvočno kopel (4.1) pri približno 40 oC za 20 minut, nato se odstrani iz kopeli in ohladi na sobno temperaturo. Pusti se stati približno 1 uro, dokler se suspenzija ne usede, nato pa se alikvot filtrira skozi 0,45 μm membranski filter (4.2) v primerno posodo. Nadaljuje se z določanjem s HPLC (5.3).

5.2.2   Premiksi

Približno 2 g nezmletega premiksa se natehta na 0,001 g natančno in prenese v 250-mililitrsko merilno bučko. Doda se 100,0 ml nakisanega metanola (3.8) in bučka se zavrti, da se delci razbijejo. Erlenmajerica z vsebino se postavi v ultrazvočno kopel (4.1) pri približno 40 oC za 20 minut, nato se odstrani iz kopeli in ohladi na sobno temperaturo. Z nakisanim metanolom (3.8) se razredči do oznake in dobro premeša. Pusti se stati 1 uro, dokler se suspenzija ne obori, nato se alikvot filtrira skozi 0,45 μm membranski filter (4.2). Primeren volumen čistega filtrata se razredči z nakisanim metanolom (3.8), da nastane končna preskusna raztopina s koncentracijo približno 4 μg/ml lasalocid natrija. Nadaljuje se z določanjem s HPLC (5.3).

5.3   Določanje s HPLC

5.3.1   Parametri

Naslednji pogoji se lahko uporabljajo kot smernice; lahko se uporabljajo tudi drugi pogoji, če zagotavljajo enakovredne rezultate:

Kolona za tekočinsko kromatografijo (4.3.1):	125 mm × 4 mm, reverzna faza C18, polnitev 5 μm ali enakovredna
Mobilna faza (3.9):	Mešanica raztopine fosfatnega pufra (3.7) in metanola (3.5), 5+95 (V+V)
Hitrost pretoka:	1,2 ml/min
Detekcijska valovna dolžina:
ekscitacija:	310 nm
emisija	419 nm
Volumen, ki se vbrizga:	20 μl

Stabilnost kromatografskega sistema se preveri z večkratnim vbrizgavanjem raztopine za umerjanja s koncentracijo 4,0 μg/ml (3.10.3), dokler niso dosežene konstantne višine (ali površine) vrhov in konstantni retencijski časi.

5.3.2   Umeritvena krivulja

Vsaka raztopina za umerjanje (3.10.3) se večkrat vbrizga in za vsako koncentracijo se določijo srednje vrednosti višin (površin) vrhov. Umeritvena krivulja se pripravi tako, da se na ordinato nanesejo srednje vrednosti višin (površin) vrhov, na absciso pa ustrezne koncentracije v μg/ml.

5.3.3   Raztopina vzorca

Večkrat se vbrizgajo ekstrakti vzorca, ki nastanejo pri točki 5.2.1 ali 5.2.2, pri čemer se uporabijo enaki volumni kot pri raztopinah za umerjanje ter določijo srednje vrednosti višin (površin) vrhov lasalocid natrija.

6.   Izračun rezultatov

Iz srednjih vrednosti višin (površin) vrhov, ki so nastali z vbrizganjem raztopine vzorca (5.3.3), se določi koncentracija lasalocid natrija (μg/ml) iz umeritvene krivulje.

6.1   Krma

Vsebnost lasalocid natrija (w) (mg/kg) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

[mg/kg]

pri čemer je:

c	=	koncentracija lasalocid natrija v raztopini vzorca (5.2.1) v μg/ml;
V1	=	volumen ekstrakta vzorca v skladu s točko 5.2.1 v ml (tj. 100);
m	=	masa preskusnega vzorca v gramih.

6.2   Premiksi

Vsebnost lasalocid natrija (w) (mg/kg) v vzorcu se izračuna po naslednji formuli:

[mg/kg]

pri čemer je:

c	=	koncentracija lasalocid natrija v raztopini vzorca (5.2.2) v μg/ml;
V2	=	volumen ekstrakta vzorca v skladu s točko 5.2.2 v ml (tj. 250);
f	=	faktor razredčitve v skladu s 5.2.2;
m	=	masa preskusnega vzorca v gramih.

7.   Potrditev rezultatov

7.1   Identiteta

Metode, ki temeljijo na spektrofluorometriji, so manj izpostavljene motnjam kot metode, pri katerih se uporablja UV-detekcija. Identiteta analita se lahko potrdi z dodatno kromatografijo.

7.1.1   Dodatna kromatografija

Ekstraktu vzorca (5.2.1 ali 5.2.2) se doda ustrezna količina raztopine za umerjanje (3.10.3). Količina dodanega lasalocid natrija mora biti podobna količini lasalocid natrija v ekstraktu vzorca. Le vrh lasalocid natrija je povišan ob upoštevanju količine dodanega lasalocid natrija in razredčitve ekstrakta. Širina vrha na polovici višine mora biti znotraj ± 10 % prvotne širine vrha, ki nastane pri ekstraktu vzorca brez dodanega lasalocid natrija.

7.2   Ponovljivost

Razlika med rezultatoma dveh vzporednih določanj, izvedenih na istem vzorcu, ne sme presegati:

—	15 % višje vrednosti za vsebnosti lasalocid natrija 30–100 mg/kg,

—	15 mg/kg za vsebnosti lasalocid natrija 100–200 mg/kg,

—	7,5 % višje vrednosti za vsebnosti lasalocid natrija več kot 200 mg/kg.

7.3   Izkoristek

Za krmo z dodatkom (slepo krmo) je izkoristek najmanj 80 %. Za vzorce premiksov z dodatkom je izkoristek najmanj 90 %.

8.   Rezultati medlaboratorijske študije

Organizirana je bila medlaboratorijska študija (6), v kateri je 12 laboratorijev analiziralo 2 premiksa (vzorca 1 in 2) in 5 vzorcev krme (vzorci 3–7). Vsak vzorec je bil analiziran dvakrat. Rezultati so navedeni v spodnji preglednici:

	Vzorec 1 Premiks za piščance	Vzorec 2 Premiks za purane	Vzorec 3 Briketi za purane	Vzorec 4 Drobtine za piščance	Vzorec 5 Krma za purane	Vzorec 6 Krma za perutnino A	Vzorec 7 Krma za perutnino B
L	12	12	12	12	12	12	12
n	23	23	23	23	23	23	23
Srednja vrednost [mg/kg]	5 050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
Sr [mg/kg]	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
CVr [ %]	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
SR [mg/kg]	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR [ %]	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Nominalna vsebnosti [mg/kg]	5 000 (7)	16 000 (7)	80 (7)	105 (7)	120 (7)	50 (8)	35 (8)

L	=	število laboratorijev;
n	=	število posameznih vrednosti;
Sr	=	standardni odmik ponovljivosti;
SR	=	standardni odmik obnovljivosti;
CVr	=	koeficient variacije ponovljivosti v %;
CVR	=	koeficient variacije obnovljivosti v %;

---

(1)  Izvedla delovna skupina za krmo Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2)  Izvedla delovna skupina za krmo Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(3)  Lahko se uporabljajo druge metode za razklop, če dokazano zagotavljajo podobne rezultate (kot je npr. mikrovalovni razklop).

(4)  V zeleni krmi (sveži ali posušeni) je lahko velika količina kremena rastlinskega izvora, v katerem so lahko elementi v sledovih in ga je treba odstraniti. Pri vzorcih takšne krme je treba izvajati naslednji spremenjeni postopek. Postopki iz točke 5.1.1.1 se izvedejo do filtracije. Filtrirni papir, ki vsebuje netopen ostanek, se dvakrat spere z vrelo vodo in prenese v žarilni lonček iz kvarca ali platine. Prežari se v žarilni peči (4.1) pri temperaturi pod 550 oC, dokler ves zogleneli material popolnoma ne izgine. Pusti se ohladiti, doda se nekaj kapljic vode in 10–15 ml klorovodikove kisline (3.4), nato pa se upari do suhega pri približno 150 oC. Če v ostanku ostane kremen, se ponovno raztopi v nekaj mililitrih klorovodikove kisline (3.4) in upari do suhega. Doda se pet kapljic žveplove kisline (3.5) in segreva do prenehanja izhajanja belih hlapov. Po dodatku 5 ml klorovodikove kisline 6 mol/l (3.2) in približno 30 ml vode se segreva, raztopina se filtrira v 250-mililitrsko merilno bučko ter dopolni z vodo do oznake (koncentracija HCl približno 0,5 mol/l). Nadaljuje se z določanjem v skladu s točko 5.1.2.

(5)  The Analyst 108, 1983, str. 1252–1256.

(6)  Analyst, 1995, 120, 2175-2180;

(7)  Vsebnost, ki jo navede proizvajalec;

(8)  Krma, pripravljena v laboratoriju.