PRÍLOHA

k nariadeniu Komisie z 11. februára 2008, ktorým sa určujú paušálne dovozné hodnoty na určovanie vstupných cien určitých druhov ovocia a zeleniny

(EUR/100 kg)
Kód KN	Kód tretích krajín (1)	Paušálna dovozná hodnota
0702 00 00	IL	143,2
	MA	45,8
	MK	36,8
	TN	111,3
	TR	91,9
	ZZ	85,8
0707 00 05	EG	208,2
	JO	202,1
	MA	175,9
	TR	140,0
	ZZ	181,6
0709 90 70	MA	48,0
	TR	140,3
	ZZ	94,2
0709 90 80	EG	349,4
	ZZ	349,4
0805 10 20	EG	48,2
	IL	55,1
	MA	54,0
	TN	50,2
	TR	70,8
	ZZ	55,7
0805 20 10	IL	106,6
	MA	114,6
	TR	72,2
	ZZ	97,8
0805 20 30 , 0805 20 50 , 0805 20 70 , 0805 20 90	CN	41,9
	EG	83,3
	IL	73,1
	JM	97,3
	MA	131,7
	TR	80,4
	ZZ	84,6
0805 50 10	EG	78,7
	IL	114,8
	MA	77,4
	TR	123,0
	ZZ	98,5
0808 10 80	CA	102,8
	CN	88,7
	MK	40,9
	US	114,4
	ZZ	86,7
0808 20 50	CN	68,2
	US	119,3
	ZA	106,6
	ZZ	98,0

---

(1)  Nomenklatúra krajín podľa nariadenia Komisie (ES) č. 1833/2006 (Ú. v. EÚ L 354, 14.12.2006, s. 19). Kód „ ZZ “ označuje „iné miesto pôvodu“.

PRÍLOHA

ENZYMATICKÁ METÓDA NA STANOVENIE OBSAHU ŠKROBU V PRÍPRAVKOCH POUŽÍVANÝCH AKO KRMIVO PRE ZVIERATÁ POUŽITÍM VYSOKOTLAKOVEJ KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE (HPLC)

1.   Rozsah

Táto metóda opisuje enzymatické stanovenie obsahu škrobu v krmive pre zvieratá. Obsah škrobu sa určí z kvantitatívneho stanovenia glukózy po enzymatickom rozklade prítomného škrobu na glukózu. Predpokladá sa, že celková nameraná glukóza pochádza zo škrobu prítomného vo vzorke.

2.   Vymedzenie pojmov

Touto metódou sa stanovuje obsah škrobu a produktov jeho rozkladu s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktoré sú nerozpustné v 40 % etanole. Obsah škrobu je vyjadrený v % (m/m).

3.   Princíp

Vzorky sa zhomogenizujú mletím. Vzorka sa premýva 40 % etanolom, aby sa odstránili rozpustné cukry a rozpustné produkty rozkladu škrobu.

Do suspenzie sa pridá tepelne stabilný enzým alfa-amyláza. Tento enzým štiepi škrob pri teplote 100 °C na menšie reťazce bez ohľadu na to, či škrob je, alebo nie je úplne rozpustený. Veľké kusy škrobu sa štiepia veľmi pomaly. Preto je potrebné, aby vzorky boli úplne rozpustené alebo aby boli vo forme suspenzie, ktorá obsahuje veľmi malé pevné čiastočky.

Potom sa pridá druhý enzým amyloglukozidáza, ktorým sa pri teplote 60 °C hydrolyzujú rozštiepené glukózové reťazce na glukózu.

Po vyčírení kvapaliny, pomocou ktorej sa prítomné bielkoviny, tuky a zvyšky odfiltrujú, sa získa čistý roztok, ktorý sa môže použiť pre HPLC.

Separácia prítomných cukrov sa vykoná pomocou HPLC.

4.   Činidlá a ďalšie látky

Používajte činidlá s rešpektovanou analytickou čistotou a demineralizovanú vodu.

4.1.   40-percentný vodný roztok etanolu

4.2.   Glukóza s čistotou min. 99 %

4.3.   Roztok amyloglukozidázy (α-1,4-D-glykánglukohydroláza) z Aspergillus niger (enzymatická aktivita > 5 000 U/ml). Skladovať pri teplote približne 4 °C.

Prípadne sa môže použiť prášok amyloglukozidázy

4.4.   Tepelne stabilná alfa-amyláza (α-1,4-D-glykánglukohydroláza). Skladovať pri teplote približne 4 °C.

4.5.   Dihydrát octanu zinočnatého, p.a.

4.6.   Hexakyanoželeznatan draselný trihydrát (II) (K4[Fe(CN)]6.3H2O), extra čistý

4.7.   Octan sodný bezvodý, p.a.

4.8.   Ľadová kyselina octová, 100 % (v/v)

4.9.   Tlmivý roztok octanu sodného (0,2 mol/l)

Do sklenenej kadičky odvážte 16,4 gramu octanu sodného (4.7). Rozpustite vo vode a prelejte do 1 000 ml odmernej banky. Zrieďte vodou po značku a upravte pH kyselinou octovou na 4,7 [použitím pH-metra (5.11)]. Tento roztok môže byť používaný maximálne 6 mesiacov, ak sa skladuje pri teplote 4 °C.

4.10.   Roztok amyloglukozidázy (enzymatická aktivita > 250 U/ml)

Pripravte roztok z 5 ml roztoku amyloglukozidázy (4.3) alebo 660 mg prášku amyloglukozidázy v konečnom objeme 100 ml použitím tlmivého roztoku octanu sodného (4.9). Roztok pripravte vždy pred analýzou.

4.11.   Referenčný roztok

Pripravte roztoky glukózy vo vode tak, ako sa zvyčajne používajú pri analýzach HPLC.

4.12.   Číracie činidlá (Carrezovo činidlo I)

V sklenenej kadičke rozpustite 219,5 gramu octanu zinočnatého (4.5) vo vode. Prelejte do 1 000 ml odmernej banky, pridajte 30 ml kyseliny octovej (4.8). Dôkladne premiešajte a doplňte vodou. Tento roztok môže byť používaný maximálne 6 mesiacov, ak sa skladuje pri laboratórnej teplote.

Na čírenie sa môžu použiť ďalšie číriace činidlá, ktoré sú ekvivalentné s Carrezovym roztokom .

4.13.   Číriace činidlá (Carrezovo činidlo II)

V sklenenej kadičke rozpustite vo vode 106,0 gramu hexakyanoželeznatanu tetradraselného trihydrátu (II) (4.6). Prelejte do 1 000 ml odmernej banky. Dôkladne premiešajte a doplňte vodou. Tento roztok môže byť používaný maximálne 6 mesiacov, ak sa skladuje pri laboratórnej teplote.

Na čírenie sa môžu použiť ďalšie číriace činidlá, ktoré sú ekvivalentné s Carrezovým roztokom .

4.14.   Mobilná fáza

Pripravte mobilnú fázu, ktorá sa zvyčajne používa pri analýzach cukrov metódou HPLC. V prípade použitia kolóny aminopropyl silikagél je napr. obvyklou mobilnou fázou zmes vody čistoty HPLC a acetonitrilu.

5.   Prístroje

5.1.   Bežné laboratórne sklo

5.2.   Odstredivka pre 1 000 g alebo viac (výpočet v strede skúmavky)

5.3.   Sklené odstredivkové skúmavky s objemom 100 ml

5.4.   Magnetický miešadlo

5.5.   Magnetické tyčinky

5.6.   Skladané filtre, napríklad 185 mm

5.7.   Injekčné filtre, 0,45 μm, vhodné pre vodné roztoky

5.8.   Vzorkovacie ampulky vhodné pre HPLC automatický vzorkovač

5.9.   100 ml odmerné banky

5.10.   5 a 10 ml plastové injekčné striekačky

5.11.   pH-meter

5.12.   Vodný kúpeľ s termostatom s nastaviteľnou teplotou na 60 °C a 100 °C

5.13.   Výhrevné dosky s magnetickými miešadlami

5.14.   Prístroj HPLC

5.14.1.   Pumpa vhodná pre nulovú pulzáciu

5.14.2.   Automatický vzorkovač

5.14.3.   Kolóna a predkolóna, ktoré sú vhodné na analýzu cukrov

5.14.4.   Ohrievač kolóny s teplotným rozsahom od laboratórnej teploty do 40 °C

5.14.5.   Detektor vhodný na analýzy cukrov, napríklad refraktometer

5.14.6.   Integračný systém

6.   Postup

6.1.   Všeobecne

Vzorky sa analyzujú jednotlivo.

6.2.   Príprava vzoriek na niekoľko typov produktov

Produkt sa homogenizuje mletím.

6.3.   Dávka vzorky

Obsah škrobu sa odhadne pomocou údajov o prísadách. Množstvo vzorky (vážené s presnosťou na 0,1 mg) sa môže vypočítať podľa:

6.4.   Slepý pokus

Slepý pokus, bez pridania vzorky, sa vykoná kompletnou analýzou (uvedenou v 6.5). Výsledok slepého pokusu sa použije pri výpočte obsahu škrobu (7.1).

6.5.   Analýza

6.5.1.   Príprava vzoriek

Vzorku premiešajte trepaním alebo miešaním. Vybranú analyzovanú dávku (6.3) odvážte do odstredivkovej skúmavky (5.3) a pridajte 50 ml 40 % etanolu (4.1). Pri laboratórnej teplote miešajte v magnetickom miešadle po dobu 20 minút. Magnetickú tyčinku nechajte v skúmavke a odstreďujte po dobu 5 minút. Opatrne odsajte a odstráňte kvapalnú fázu (napríklad Pasteurovou pipetou). Tento extrakčný postup opakujte dvakrát s 25 ml etanolu (4.1). Zvyšok preneste do 100 ml odmernej banky (5.9) s približne 70 ml vody.

Po rozpustení alebo vytvorení suspenzie pridajte 100 mikrolitrov tepelne stabilnej alfa-amylázy (4.4) a po dobu jednej hodiny zahrievajte pri teplote 100 °C, napríklad vo vodnom kúpeli (5.12). Ochlaďte na teplotu 60 °C vo vodnom kúpeli a pridajte 5 ml roztoku amyloglukozidázy (4.10). Banku ponorte na 30 minút do vodného kúpeľa s teplotou 60 °C. Ochlaďte na laboratórnu teplotu, vzorku vyčírte pridaním 1 ml Carrezovho činidla I (4.12), pretrepte a potom pridajte 1 ml Carrezovho činidla II (4.13). Carrezove činidlá I a II môžu byť pridané pred alebo po ochladení. Zrieďte vodou po značku, zhomogenizujte a roztok prefiltrujte cez skladaný filter (5.6). Odoberte extrakt vzorky.

6.5.2.   Spracovanie extraktov vzoriek

Pomocou striekačky (5.10) prefiltrujte extrakty cez diskový filter (5.7), ktorý bol prepláchnutý extraktom. Oboberte filtráty do ampuliek (5.8).

Poznámka: Diskový filter sa môže použiť niekoľkokrát. Filter by sa mal prepláchnuť nasledujúcim extraktom, aby sa predišlo kontaminácii s predchádzajúcim extraktom.

6.6.   Chromatografia

HPLC sa vykonáva spôsobom obvyklým pri analýze cukrov. Nakoľko vzorky sú extrahované etanolom/vodou, glukóza je hlavný cukor, ktorý sa analyzuje. Ak analýzy HPLC vykazujú stopy maltózy, môže to indikovať neúplnú premenu škrobu.

7.   Výpočet a vyjadrenie výsledkov

7.1.   Výpočet výsledkov HPLC

Z výsledkov analýz HPLC sa vypočíta obsah glukózy (%, m/m).

Enzymatický roztok amyloglukozidázy (4.3) sa stabilizuje glukózou. Okrem toho, tepelne stabilná alfa-amyláza (4.4) sa stabilizuje sacharózou, ktorá môže byť čiastočne premenená na glukózu invertáznou aktivitou amyloglukozidázy. Preto nameraná koncentrácia glukózy (%, m/v) by sa mala upraviť o koncentráciu glukózy stanovenú v slepom pokuse (%, m/v). Obsah glukózy (%, m/m) upravený o slepý pokus sa potom vypočíta z prepočítanej koncentrácie glukózy, hmotnosti vzorky a kalibrácie s referenčnými roztokmi (4.11).

7.2.   Výpočet obsahu škrobu

Obsah škrobu (%, m/m) sa vypočíta z obsahu glukózy (%, m/m) po korekcii slepým pokusom.

Obsah škrobu = 0,9 * glukóza po korekcii

8.   Presnosť

8.1.   Medzilaboratórny test

Podrobnosti medzilaboratórneho testu týkajúce sa presnosti metódy sú zhrnuté v bode 8.4.

8.2.   Opakovateľnosť

Absolútna hodnota rozdielu medzi výsledkami dvoch nezávislých individuálnych testov získaných použitím tej istej metódy na rovnakých testovacích materiáloch v tom istom laboratóriu tým istým pracovníkom pri použití toho istého zariadenia počas krátkeho časového obdobia nebude vo viac ako 5 % prípadov väčšia ako limit opakovateľnosti 1,1 % (m/m). Limit opakovateľnosti bol odvodený zo súhrnných výsledkov medzilaboratórneho testu (pozri bod 8.4).

8.3.   Reprodukovateľnosť

Absolútna hodnota rozdielu medzi výsledkami dvoch individuálnych testov získaných použitím tej istej metódy na rovnakých testovacích materiáloch v rôznych laboratóriách rôznymi pracovníkmi pri použití rôznych zariadení nebude vo viac ako 5 % prípadov väčšia ako limit reprodukovateľnosti 3,7 % (m/m). Limit reprodukovateľnosti bol odvodený zo súhrnných výsledkov medzilaboratórneho testu (pozri bod 8.4).

8.4.   Výsledky medzilaboratórneho testu

Európske colné laboratóriá vykonali medzilaboratórny test v rokoch 2005 a 2006. Tento test bol vykonaný v súlade s normou ISO 5725 a protokolom IUPAC (W. Horwitz, Pure and Applied Chemistry, vol. 67, 1995, p. 331-343). Údaje o presnosti sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

Štatistické výsledky medzilaboratórnej štúdie

	Vzorka
	1	2	3	4	5
Počet laboratórií po vylúčení odľahlých výsledkov	25	26	26	25	24
Počet uznaných výsledkov	50	52	52	50	48
Priemerný obsah škrobu (%, m/m)	31,2	14,4	25,1	12,9	27,8
Štandardná odchýlka opakovateľnosti sr (%, m/m)	0,4	0,3	0,6	0,2	0,3
Limit opakovateľnosti r (%, m/m)	1,1	0,8	1,7	0,7	0,9
Štandardná odchýlka reprodukovateľnosti SR (%, m/m)	1,7	0,8	1,7	0,9	1,3
Limit reprodukovateľnosti R (%, m/m)	4,8	2,2	4,7	2,5	3,7
Vzorky 1 : suché krmivo pre psov 2 : suché krmivo pre mačky 3 : suché krmivo pre mačky (vzorka 2) s prídavkom škrobu 4 : suché krmivo pre mačky (vzorka 2) s prídavkom repných rezkov 5 : obchodné krmivo pre domáce zvieratá