1.

Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 105 (1995). Táto testovacia metóda je revidovanou verziou pôvodných usmernení TG 105, ktoré boli prijaté v roku 1981. Medzi súčasnou verziou a verziou z roku 1981 nie je žiadny podstatný rozdiel. Zmenil sa najmä formát. Revízia je založená na testovacej metóde EÚ ‚Rozpustnosť vo vode‘ (1).

2.

Rozpustnosť látok vo vode môže byť do značnej miery ovplyvnená prítomnosťou prímesí. Táto testovacia metóda je zameraná na určenie rozpustnosti absolútne čistých látok vo vode, ktoré sú vo vode stabilné a nie sú prchavé. Pred stanovením rozpustnosti vo vode je užitočné získať predbežné informácie o testovanej látke, ako je štruktúrny vzorec, tlak pary, disociačná konštanta a hydrolýza ako funkcia pH.

3.

V rámci tejto testovacej metódy sú opísané dve metódy, metóda vypierania z kolóny, ktorá sa týka rozpustnosti nižšej ako 10–2 g/l, a banková metóda, ktorá sa týka rozpustnosti vyššej ako 10–2 g/l. Takisto je tu opísaný jednoduchý predbežný test. Umožňuje stanovenie približného vhodného množstva vzorky, ktorá sa má použiť v konečnom teste, ako aj čas potrebný na dosiahnutie nasýtenia.

4.

Rozpustnosť látky vo vode je saturačná hmotnostná koncentrácia látky vo vode pri danej teplote.

5.

Rozpustnosť vo vode je vyjadrená ako hmotnosť rozpustenej látky na objem roztoku. Jednotka SI je kg/m3, ale môže sa použiť aj g/l.

6.

Referenčné chemikálie sa pri skúmaní testovanej látky nemusia použiť.

7.

Test podľa možnosti prebieha pri teplote 20 ± 0,5 °C. Zvolená teplota by sa mala udržiavať na konštantnej úrovni vo všetkých relevantných súčastiach skúšobného zariadenia.

8.

V rámci postupu, ktorý pozostáva z niekoľkých krokov, sa pri izbovej teplote pridáva čoraz väčší objem vody približne do 0,1 g vzorky (tuhé testované látky musia byť rozomleté na prach) v 10 ml odmernom valci so sklenou zátkou. Po každom pridaní množstva vody sa zmes trepe počas desiatich minút a vizuálne sa skontroluje, či v nej neostali nerozpustené časti vzorky. Ak sa po pridaní 10 ml vody vzorka alebo jej časti nerozpustia, pokus pokračuje v odmernom valci s objemom 100 ml. Približná rozpustnosť je uvedená v tabuľke 1 pod tým objemom vody, v ktorom dôjde k úplnému rozpusteniu testovanej vzorky. Ak je rozpustnosť nízka, na rozpustenie testovanej látky môže byť potrebný dlhší čas a pokus by mal prebiehať aspoň 24 hodín. Ak ani po 24 hodinách látka nie je rozpustená, malo by sa poskytnúť viac času (až 96 hodín) alebo by sa malo vyskúšať ďalšie riedenie, aby sa získala istota, či by sa nemala použiť metóda vypierania z kolóny alebo banková metóda.

Tabuľka 1

9.

Táto metóda je založená na vypieraní testovanej látky vodou z mikrokolóny, ktorá je naplnená inertným nosným materiálom, ktorý sa predtým pokryl nadbytkom testovanej látky (2). Rozpustnosť vo vode je daná hmotnostnou koncentráciou eluátu, keď dosiahne rovnovážny stav, v závislosti od času.

10.

Vybavenie pozostáva z mikrokolóny (obrázok 1), ktorá sa udržiava pri konštantnej teplote. Je spojené buď s recirkulačným čerpadlom (obrázok 2), alebo s egalizačnou nádobou (obrázok 3). Mikrokolóna obsahuje inertný nosný materiál, ktorý na mieste drží malá zátka zo sklenej vaty, ktorá slúži aj na filtrovanie častíc. Medzi materiál, ktorý je možné použiť ako nosný, patria sklené guľôčky, diatomit alebo iný inertný materiál.

11.

Mikrokolóna znázornená na obrázku 1 je vhodná na zostrojenie vybavenia s recirkulačných čerpadlom. Má uzavretý priestor nad kvapalinou (‚head space‘) poskytujúci päť úložných objemov (vypustených na začiatku pokusu) a objem piatich vzoriek (odobratých na analýzu v priebehu pokusu). Veľkosť je možné prípadne znížiť, ak možno do systému v priebehu pokusu pridať vodu ako náhradu za pôvodných päť úložných objemov vypustených zo systému spolu s prímesami. Kolóna je napojená na rúrku vyrobenú z inertného materiálu, ktorá predstavuje recirkulačné čerpadlo schopné napumpovať približne 25 ml/h. Recirkulačné čerpadlo môže byť napríklad peristaltické alebo membránové čerpadlo. Musí sa dbať na to, aby nedošlo ku kontaminácii a/alebo adsorpcii materiálom, z ktorého sú zhotovené rúrky.

12.

Schematická zostava s využitím egalizačnej nádoby je znázornená na obrázku 3. V tejto zostave je mikrokolóna vybavená jednocestným uzatváracím ventilom. Spojenie s egalizačnou nádobou tvorí zabrúsená sklenená spojka a rúrka vyrobená z inertného materiálu. Prietok z egalizačnej nádoby by mal byť približne 25 ml/h.

Obrázok 1

Rozmery v mm

Obrázok 2

Obrázok 3

13.

Približne 600 mg nosného materiálu sa premiestni do 50 ml banky s guľatým dnom. Vhodné množstvo testovanej látky sa rozpustí v prchavom rozpúšťadle s analytickou kvalitou reagentov a primerané množstvo tohto roztoku sa pridá do nosného materiálu. Rozpúšťadlo sa úplne odparí, napr. pomocou rotačnej odparky, lebo inak sa v priebehu vypierania nedosiahne nasýtenie nosiča vodou z dôvodu rozkladu na povrchu. Nosný materiál s aplikovanou látkou sa nechá máčať približne v 5 ml vody dve hodiny a suspenzia sa vleje do mikrokolóny. Suchý nosný materiál sa prípadne môže vliať do mikrokolóny naplnenej vodou a nechať vyvažovať dve hodiny.

14.

Aplikácia testovanej látky na nosný materiál môže spôsobovať problémy, ktoré budú viesť k chybným výsledkom, napr. ak sa testovaná látka nanáša ako olej. Tieto problémy treba preskúmať a v správe o teste uviesť podrobnosti.

15.

Spustí sa prúdenie cez kolónu. Odporúča sa použiť prietok približne 25 ml/h, ktorý v prípade opísanej kolóny zodpovedá desiatim úložným objemom/h. Najmenej prvých päť úložných objemov sa vypustí s cieľom odstrániť prímesi rozpustné vo vode. Potom sa čerpadlo nechá bežať až dovtedy, kým sa nedosiahne rovnováha vymedzená piatimi za sebou nasledujúcimi vzorkami, ktorých koncentrácie sa nelíšia viac ako ± 30 % v náhodnom slede. Vzorky by mali byť od seba oddelené časovými intervalmi zodpovedajúcimi prietoku najmenej desať úložných objemov. V závislosti od použitej analytickej metódy môže byť vhodnejšie zostrojiť krivku koncentrácia/čas, aby sa ukázalo, že bola dosiahnutá rovnováha.

16.

Za sebou nasledujúce eluátové frakcie by sa potom mali zachytávať a analyzovať podľa zvolenej metódy. Frakcie zo stredného eluátového rozsahu, v ktorých sú koncentrácie konštantné v rozsahu ± 30 % minimálne v piatich následných frakciách, sa použijú na stanovenie rozpustnosti.

17.

Ako eluent sa uprednostňuje dvakrát destilovaná voda. Takisto možno použiť aj deionizovanú vodu s odporom vyšším ako 10 megaohmov/cm a celkovým obsahom organického uhlíka nižším ako 0,01 %.

18.

V prípade oboch postupov sa druhé kolo merania vykonáva pri polovičnej miere prvého prietoku. Ak sú výsledky oboch kôl meraní súhlasné, test bol uskutočnený na uspokojivej úrovni. Ak je nameraná rozpustnosť pri nižšom prietoku vyššia, znižovanie miery prietoku na polovicu musí pokračovať dovtedy, kým dve za sebou nasledujúce kolá meraní nevykážu rovnakú rozpustnosť.

19.

V obidvoch prípadoch by sa frakcie mali kontrolovať z hľadiska prítomnosti koloidného materiálu skúmaním Tyndallovho efektu. Prítomnosť čiastočiek znehodnocuje výsledky a test sa musí zopakovať po zdokonalení postupu filtrácie v kolóne.

20.

Hodnota pH každej vzorky sa musí zmerať podľa možnosti pomocou špeciálnych indikačných pásikov.

21.

Testovaná látka (tuhé látky musia byť rozomleté na prach) sa rozpustí vo vode pri teplote o niečo vyššej, ako je testovacia teplota. Keď sa dosiahne nasýtenie, zmes sa ochladí a udržiava sa pri testovacej teplote. Meranie sa môže alternatívne uskutočniť priamo pri testovacej teplote, ak sa vhodným vzorkovaním zabezpečí, že sa dosiahne nasýtený rovnovážny stav. Následne sa hmotnostná koncentrácia testovanej látky vo vodnom roztoku, ktorý nesmie obsahovať žiadne nerozpustené častice, stanoví vhodnou analytickou metódou (3).

22.

Je potrebný tento materiál:

23.

Množstvo testovanej látky potrebnej na nasýtenie želaného objemu vody sa odhaduje z predbežného testu. Približne päťnásobok stanoveného množstva sa odváži do každej z troch sklených nádob vybavených sklenými zátkami (napr. do odstredivkových skúmaviek, sklených baniek). Do každej nádoby sa pridá objem vody zvolený podľa analytickej metódy a rozsahu rozpustnosti. Potom sa nádoby tesne uzavrú a nechajú sa premiešavať pri teplote 30 °C. Odporúča sa použiť trepačku alebo miešačku schopnú fungovať pri konštantnej teplote, napr. magnetické miešadlo v termostatickom vodnom kúpeli. Po uplynutí jedného dňa sa jedna z nádob ďalších 24 hodín opätovne vyváži pri skúšobnej teplote s občasným pretrepaním. Obsah nádoby sa odstredí pri skúšobnej teplote a pomocou vhodnej analytickej metódy sa stanoví koncentrácia testovanej látky v čírej vodnej fáze. So zvyšnými dvoma bankami sa naloží podobne po počiatočnom vyvážení pri teplote 30 °C počas dvoch dní v prípade jednej a počas troch dní v prípade druhej. Ak sa namerané koncentrácie aspoň v dvoch posledných nádobách nelíšia o viac ako 15 %, test bol uskutočnený na uspokojivej úrovni. Ak výsledky z nádob 1, 2 a 3 prejavia tendenciu narastajúcich hodnôt, celý test sa musí zopakovať pri použití dlhších vyvažovacích časov.

24.

Test sa môže uskutočniť aj bez predchádzajúcej inkubácie pri teplote 30 °C. Na účely odhadu rýchlosti vzniku saturačnej rovnováhy sa vzorky odoberú, až keď už čas miešania neovplyvňuje merané koncentrácie.

25.

Hodnota pH každej vzorky sa musí zmerať podľa možnosti pomocou špeciálnych indikačných pásikov.

26.

Odporúča sa použiť špecifickú metódu pre príslušnú testovanú látku, lebo malé množstvá rozpustných prímesí môžu spôsobiť veľké chyby v nameranej rozpustnosti. Príkladmi takýchto metód sú plynová alebo kvapalinová chromatografia, titrácia, fotometria alebo voltametria.

27.

Pre každé kolo sa musí vypočítať stredná hodnota a smerodajná odchýlka namerané najmenej pri piatich po sebe nasledujúcich vzorkách zo saturačnej úrovne. Stredné hodnoty získané z dvoch testov s rôznym prietokom by sa nemali líšiť o viac ako 30 %.

28.

Jednotlivé výsledky z každej z troch baniek, ktoré sa nesmú líšiť o viac ako 15 %, sa spriemerujú.

29.

Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:

30.

Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:

1.

Smernica Komisie 92/69/EHS z 31. júla 1992, ktorou sa po sedemnástykrát prispôsobuje technickému pokroku smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok (Ú. v. ES L 383, 29.12.1992, s. 113).

2.

NF T 20-045 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.

3.

NF T 20-046 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.“

1.

Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov (TG) 123 (2006). Hodnoty rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda (Pow) až po log Pow 8,2 boli presne stanovené metódou pomalého miešania (1). Ide preto o vhodný experimentálny prístup pre priame stanovenie Pow vysoko hydrofóbnych látok.

2.

Inými metódami na stanovenie rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda (Pow) sú metóda trepačkovej banky (2) a stanovenie Pow z retenčného správania HPLC s reverznou fázou (3). Pri metóde trepačkovej banky sa zvyknú tvoriť vedľajšie produkty z dôvodu prenosu oktanolových mikrokvapôčok do vodnej fázy. S narastajúcimi hodnotami Pow vedie prítomnosť týchto kvapôčok vo vodnej fáze k čoraz vyššiemu nadhodnoteniu koncentrácie testovanej látky vo vode. Preto sa jej použitie obmedzuje na látky s log Pow < 4. Druhá metóda sa opiera o spoľahlivé údaje priamo stanovených hodnôt Pow na kalibráciu vzťahu medzi retenčným správaním HPLC a meranými hodnotami Pow. Na stanovenie rozdeľovacích koeficientov 1-oktanol/voda ionizovateľných látok (4) bolo možné použiť predbežné usmernenia OECD, ktoré sa však už nebudú používať.

3.

Túto testovaciu metódu vyvinuli v Holandsku. Presnosť metód, ktoré sú tu opísané, bola potvrdená a optimalizovaná v rámci hodnotiacej štúdie kruhového testu, na ktorej sa zúčastnilo 15 laboratórií (5).

4.

V prípade inertných organických látok boli zistené veľmi dôležité vzťahy medzi rozdeľovacími koeficientmi 1-oktanol/voda (Pow) a ich bioakumuláciou v rybách. Okrem toho sa preukázala korelácia Pow s toxicitou rýb, ako aj sorpcia chemikálií do tuhých látok, ako je zemina a sedimenty. Rozsiahly prehľad vzťahov sa uvádza v odkaze (6).

5.

Medzi rozdeľovacím koeficientom 1-oktanol/voda a vlastnosťami iných látok bola zistená široká škála vzťahov, ktoré majú význam pre environmentálnu toxikológiu a chémiu. V dôsledku toho sa rozdeľovací koeficient 1-oktanol/voda stal kľúčovým parametrom pri hodnotení environmentálneho rizika chemikálií, ako aj pri predpovedaní osudu chemikálií v životnom prostredí.

6.

Pri pokuse pomalého miešania sa predpokladá nižšia tvorba mikrokvapôčok z kvapiek 1-oktanolu vo vodnej fáze. Následne nedochádza k nadhodnoteniu vodnej koncentrácie v dôsledku molekúl testovanej látky, ktoré súvisí s takýmito kvapôčkami. Metóda pomalého miešania je preto veľmi vhodná na stanovenie Pow látok s predpokladanými hodnotami log Pow rovnajúcimi sa 5 alebo vyššími, v prípade ktorých zvykne metóda trepačkovej banky (2) viesť k chybným výsledkom.

7.

Rozdeľovací koeficient látky medzi vodou a lipofilickým rozpúšťadlom (1-oktanol) charakterizuje rozloženie rovnováhy chemikálie medzi dvoma fázami. Rozdeľovací koeficient medzi vodou a 1-oktanolom (POW) je vymedzený ako pomer rovnovážnych koncentrácií testovanej látky v 1-oktanole nasýtenom vodou (CO) a vo vode nasýtenej 1-oktanolom (CW).

Keďže ide o pomer, je to bezrozmerné číslo. Najčastejšie sa udáva ako logaritmus pri základe 10 (log Pow). Pow závisí od teploty a údaje v správe by mali zahŕňať teplotu merania.

8.

Na účely stanovenia rozdeľovacieho koeficientu sa voda, 1-oktanol a testovaná látka navzájom vyvážia pri konštantnej teplote. Následne sa určia koncentrácie testovanej látky v dvoch fázach.

9.

Problémy pokusu súvisiace s tvorbou mikrokvapôčok počas pokusu s trepaním banky je možné znížiť pri pokuse s pomalým miešaním, ktorý sa v tomto texte navrhuje. V prípade pokusu s pomalým miešaním sa voda, 1-oktanol a testovaná látka vyvážia v termostatickom miešanom reaktore. Výmena medzi fázami sa urýchli miešaním. Miešaním dochádza k malej turbulencii, ktorá napomáha výmene medzi 1-oktanolom a vodou bez vytvárania mikrokvapôčok (1).

10.

Keďže prítomnosť látok iných ako testovaná látka môže ovplyvniť koeficient aktivity testovanej látky, testovaná látka sa musí testovať ako čistá látka. Pri pokuse stanovenia rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda sa použije komerčne dostupná látka najvyššej čistoty.

11.

Uvedená metóda sa vzťahuje na čisté látky, ktoré nedisociujú ani sa nespájajú a ktoré nevykazujú významnú medzipovrchovú aktivitu. Možno ju použiť na stanovenie rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda takýchto látok a zmesí. Ak sa metóda použije v prípade zmesí, stanovené rozdeľovacie koeficienty 1-oktanol/voda sú závislé od chemického zloženia testovanej zmesi a elektrolytického zloženia vo vodnej fáze. Za predpokladu, že sa prijmú dodatočné opatrenia, možno metódu použiť aj na disociujúce alebo spájajúce sa zlúčeniny (odsek 12).

12.

Vzhľadom na viacnásobné rovnovážne stavy vo vode a 1-oktanole, ktoré prispievajú k deleniu disociujúcich látok v systéme 1-oktanol/voda, ako sú organické kyseliny a fenoly, organické bázy a organokovové látky, je rozdeľovací koeficient 1-oktanol/voda závislou konštantou, ktorá vo veľkej miere závisí od elektrolytického zloženia (7) (8). Stanovenie rozdeľovacieho koeficientu 1-oktanol/voda preto vyžaduje, aby sa pH a elektrolytické zloženie počas pokusu kontrolovali a zaznamenali v správe. Pri hodnotení týchto rozdeľovacích koeficientov je potrebné opierať sa o odborný posudok. Pomocou hodnoty disociačnej konštanty (disociačných konštánt) je potrebné vybrať vhodné hodnoty pH, aby sa pre každý ionizačný stav stanovil rozdeľovací koeficient. Pri testovaní organokovových zlúčenín (8) sa musia použiť nekomplexujúce tlmivé roztoky. Pri zohľadnení existujúcich znalostí o roztokovej chémii (konštanty stability komplexu, disociačné konštanty) by sa podmienky pokusu mali zvoliť takým spôsobom, aby bolo možné odhadnúť zloženie testovanej látky vo vodnej fáze. Iónová sila by mala byť totožná pri všetkých pokusoch vzhľadom na použitie základného elektrolytu.

13.

Pri teste sa môžu vyskytnúť problémy v prípade testovania látok s nízkou rozpustnosťou vo vode alebo s vysokým Pow, lebo koncentrácie vo vode sú také nízke, že je náročné ich stanoviť s presnosťou. V rámci tejto testovacej metódy sa uvádzajú usmernenia, ako tento problém riešiť.

14.

Chemické reagenty musia mať stupeň čistoty – analyticky čistá alebo musia byť čistejšie. Odporúča sa použitie neoznačkovaných testovacích látok so známym chemickým zložením a podľa možnosti aspoň 99 % čistoty alebo rádiooznačených testovaných látok so známym chemickým zložením a rádiochemickej čistoty. V prípade krátkeho polčasu rozpadu by sa mali aplikovať korekcie na rozpad. V prípade rádiooznačených testovaných látok by sa mala použiť analytická metóda pre konkrétnu chemikáliu, aby sa zabezpečilo, že meraná rádioaktivita priamo súvisí s testovanou látkou.

15.

Odhad log Pow je možné urobiť pomocou komerčne dostupného softvéru na odhadovanie log Pow alebo pomocou pomeru rozpustností v oboch roztokoch.

16.

Pred začatím pokusu s pomalým miešaním na stanovenie Pow musia byť k dispozícii tieto informácie o testovanej látke:

17.

Vyžaduje sa štandardné laboratórne zariadenie, najmä:

18.

Nádoby by mali byť vyrobené z inertného materiálu, aby bola adsorpcia na povrchu nádoby zanedbateľná.

19.

Pow by sa mal stanoviť s využitím 1-oktanolu najvyššej čistoty, ktorý je komerčne dostupný (aspoň + 99 %). Odporúča sa purifikácia 1-oktanolu extrakciou pomocou kyseliny, bázy a vody a následné vysušenie. Okrem toho možno na purifikáciu 1-oktanolu použiť destiláciu. Purifikovaný 1-oktanol sa použije na prípravu štandardných roztokov testovaných látok. Voda, ktorá sa použije na stanovenie Pow, by mala byť destilovaná zo skla alebo kremeňa, alebo získaná zo zariadenia na purifikáciu vody. Takisto je možné použiť vodu HPLC kvality. V prípade destilovanej vody sa vyžaduje filtrácia cez 0,22 μm filter. Mali by sa vykonať aj slepé pokusy na kontrolu, či sa v koncentrovaných extraktoch nenachádzajú žiadne prímesi, ktoré by mohli prísť do styku s testovanou látkou. Ak sa použije filter zo skleného vlákna, musí sa vyčistiť vypálením aspoň počas troch hodín pri teplote 400 °C.

20.

Obe rozpúšťadlá sa pred pokusom navzájom nasýtia vyvažovaním v dostatočnej veľkej nádobe. Rovnováha sa dosiahne pomalým miešaním dvojfázového systému počas dvoch dní.

21.

Zvolí sa vhodná koncentrácia testovanej látky, ktorá sa rozpustí v 1-oktanole (nasýtenom vodou). Rozdeľovací koeficient 1-oktanol/voda sa musí stanoviť v zriedených roztokoch v 1-oktanole a vode. Koncentrácia testovanej látky by preto v žiadnej fáze nemala presiahnuť 70 % svojej rozpustnosti s maximálnou koncentráciou 0,1 M (1). Roztoky 1-oktanolu použité pri pokuse nesmú obsahovať suspendovanú tuhú testovanú látku.

22.

Vhodné množstvo testovanej látky sa rozpustí v 1-oktanole (nasýtenom vodou). Ak je odhad log Pow vyšší ako päť, treba dbať na to, aby roztoky 1-oktanolu použité pri pokuse neobsahovali suspendovanú tuhú testovanú látku. Na tento účel sa v prípade chemikálií s odhadovanou hodnotou log Pow > 5 postupuje takto:

23.

Na skúšku testovanej látky sa použije platná analytická metóda. Výskumníci musia predložiť dôkazy o tom, že koncentrácie v 1-oktanole nasýtenom vodou, ako aj vo fáze vody nasýtenej 1-oktanolom počas pokusu sú vyššie ako kvantifikačný limit metódy použitých analytických postupov. Analytická výťažnosť testovanej látky z vodnej fázy a z 1-oktanolovej fázy sa musí stanoviť pred pokusom v tých prípadoch, v ktorých sú potrebné metódy extrakcie. Analytický signál musí byť korigovaný vzhľadom na slepé pokusy a treba dbať na to, aby nedošlo k prenosu analytu z jednej vzorky do druhej.

24.

Pred analýzou bude pravdepodobne potrebná extrakcia vodnej fázy pomocou organického rozpúšťadla a prekoncentrácia extraktu z dôvodu pomerne nízkych koncentrácií hydrofóbnych testovaných látok vo vodnej fáze. Z toho istého dôvodu je nevyhnutné znížiť koncentrácie pri prípadných slepých pokusoch. Na tento účel treba použiť rozpúšťadlá vysokej čistoty, podľa možnosti rozpúšťadlá na analýzu rezíduí. Takisto práca s vopred dôkladne vyčisteným sklom (napr. umývanie rozpúšťadlom alebo vypaľovanie pri zvýšenej teplote) môže pomôcť zabrániť krížovej kontaminácii.

25.

Odhad log Pow možno získať z programu na odhadovanie alebo z odborného posudku. Ak je hodnota vyššia ako šesť, potom je potrebné dôkladne sledovať korekcie vzhľadom na slepé pokusy a prenos analytu. Podobne ak je odhad log Pow vyšší ako šesť, je potrebné použiť náhradný štandard na korekciu výťažnosti, aby bolo možné dosiahnuť vysoké prekoncentračné faktory. Na odhadovanie log Pow je k dispozícii množstvo komerčne dostupných softvérových programov (1), napr. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) a ACD log P (19). Opisy postupov odhadovania sú uvedené v odkazoch (20 – 22).

26.

Kvantifikačné limity (LOQ) na určenie testovanej látky v 1-oktanole a vo vode sa stanovia pomocou akceptovaných metód. Podľa štandardného pravidla možno kvantifikačný limit metódy stanoviť ako koncentráciu vo vode alebo v 1-oktanole, ktorej pomer signálu k šumu má hodnotu desať. Treba zvoliť vhodné metódy extrakcie a prekoncentrácie a takisto treba špecifikovať analytickú výťažnosť. Po analytickom stanovení sa vyberie vhodný prekoncentračný faktor s cieľom získať signál požadovanej veľkosti.

27.

Na základe parametrov analytickej metódy a predpokladaných koncentrácií sa určí približná veľkosť vzorky potrebná na presné stanovenie koncentrácie zlúčeniny. Treba sa vyhnúť používaniu vzoriek vody, ktoré sú príliš malé na získanie dostatočného analytického signálu. Takisto sa treba vyhnúť používaniu nadmerne veľkých vzoriek vody, lebo inak sa môže stať, že na minimálny požadovaný počet analýz (n = 5) ostane príliš málo vody. V dodatku 1 je minimálny objem vzorky uvedený ako funkcia objemu nádoby, LOD testovanej látky a rozpustnosti testovanej látky.

28.

Kvantifikácia testovanej látky sa vykonáva porovnaním s kalibračnými krivkami príslušnej zlúčeniny. Koncentrácie v analyzovaných vzorkách musia byť ohraničené koncentráciami štandardov.

29.

V prípade testovaných látok s odhadovaným log Pow vyšším ako šesť treba náhradný štandard pridať do vzorky vody pred extrakciou s cieľom zaregistrovať straty, ku ktorým došlo v priebehu extrakcie a prekoncentrácie vzoriek vody. S cieľom zabezpečiť presnú korekciu výťažnosti musia mať náhradné látky vlastnosti, ktoré sú veľmi podobné alebo totožné s vlastnosťami testovanej látky. Na tento účel sa uprednostňuje použitie (stabilných) izotopicky označených analógov k skúmaným látkam (napríklad perdeuterovaných alebo označených uhlíkom 13C). Ak nie je možné použiť označené stabilné izotopy, t. j. 13C alebo 2H, treba na základe spoľahlivých údajov z literatúry preukázať, že fyzikálno-chemické vlastnosti náhradnej látky sú veľmi podobné fyzikálno-chemickým vlastnostiam testovanej látky. V priebehu extrakcie kvapaliny kvapalinou vo vodnej fáze môže dôjsť k tvorbe emulzií. Možno ich redukovať pridaním soli a umožnením, aby sa emulzia počas noci usadila. Metódy používané na extrahovanie a prekoncentráciu vzoriek treba uviesť do správy.

30.

Vzorky získané z 1-oktanolovej fázy možno pred analýzou v prípade potreby zriediť vhodným rozpúšťadlom. Okrem toho sa použitie náhradných štandardov na korekciu výťažnosti odporúča v prípade látok, pri ktorých pokusy s výťažnosťou preukázali vysoký stupeň variácie (relatívna smerodajná odchýlka > 10 %).

31.

Podrobné informácie o analytickej metóde sa musia uviesť v správe. Tieto informácie zahŕňajú metódu extrakcie, prekoncentračné a zrieďovacie faktory, parametre prístrojov, postup kalibrácie, rozsah kalibrácie, analytickú výťažnosť testovanej látky z vody, pridanie náhradných štandardov na korekciu výťažnosti, hodnoty slepých pokusov, detekčné limity a kvantifikačné limity.

32.

Pri voľbe objemov vody a 1-oktanolu by sa mali zohľadniť LOQ v 1-oktanole a vo vode, prekoncentračné faktory použité pri vzorkách vody, objemy vzoriek 1-oktanolu a vody a predpokladané koncentrácie. Z experimentálnych dôvodov by sa mal objem 1-oktanolu v systéme pomalého miešania zvoliť tak, aby vrstva 1-oktanolu bola dostatočne hrubá (> 0,5 cm) a umožňovala odber vzoriek počas 1-oktanolovej fázy bez jej narušenia.

33.

Bežné fázové pomery používané na stanovenie zlúčenín s log Pow rovnajúcim sa 4,5 alebo vyšším sú 20 – 50 ml 1-oktanolu a 950 – 980 ml vody v litrovej nádobe.

34.

V priebehu testu sa reakčná nádoba tepelne stabilizuje, aby teplota nekolísala o viac ako 1 °C. Skúška sa vykonáva pri teplote 25 °C.

35.

Pokusný systém by mal byť chránený pred denným svetlom buď tak, že sa pokus vykoná v tmavej miestnosti, alebo tak, že sa reakčná nádoba prikryje hliníkovou fóliou.

36.

Pokus by sa mal vykonať v bezprašnom prostredí (pokiaľ je to možné).

37.

Systém 1-oktanol-voda sa mieša, až kým sa nedosiahne rovnováha. Pri pilotnom pokuse sa posúdi dĺžka obdobia vyvažovania vykonaním pokusu s pomalým miešaním a pravidelným odberom vzorky vody a 1-oktanolu. Medzi jednotlivými odbermi vzoriek by malo uplynúť minimálne päť hodín.

38.

Pri každom stanovení Pow treba vykonať najmenej tri nezávislé pokusy s pomalým miešaním.

39.

Predpokladá sa, že rovnováha sa dosiahne, keď regresná funkcia pomeru koncentrácie 1-oktanol/voda v závislosti od času v priebehu štyroch časových bodov dosiahne sklon, ktorý sa pri hladine významnosti alfa 0,05 výrazne nelíši od nulového sklonu. Minimálny čas dosiahnutia rovnováhy je jeden deň pred začatím odberov vzoriek. Podľa štandardného pravidla sa môžu vzorky látok s odhadovaným log Pow nižším ako päť odoberať počas druhého a tretieho dňa. Môže sa stať, že vyvažovanie sa bude musieť v prípade hydrofóbnych zlúčenín predĺžiť. V prípade zlúčeniny s log Pow 8,23 (dekachlórbifenyl) stačilo na dosiahnutie rovnováhy 144 hodín. Rovnováha sa posudzuje prostredníctvom opakovaného odberu z jednej nádoby.

40.

Na začiatku pokusu sa reakčná nádoba naplní vodou nasýtenou 1-oktanolom. Na dosiahnutie stálej teploty by mal byť k dispozícii dostatok času.

41.

Do reakčnej nádoby sa opatrne pridá želané množstvo testovanej látky (rozpustené v požadovanom objeme 1-oktanolu nasýtenom vodou). Tento krok je v rámci pokusu veľmi dôležitý, lebo je potrebné vyhnúť sa prudkému miešaniu dvoch fáz. Na tento účel možno 1-oktanolovú fázu pomaly pipetou preniesť na stenu testovacej nádoby blízko hladiny vody. Tá následne stečie po sklenej stene a vytvorí nad vodnou fázou film. Vždy treba zabrániť tomu, aby 1-oktanol stekal priamo do banky. Kvapky 1-oktanolu by nemali padať priamo do vody.

42.

Po začatí miešania sa rýchlosť miešania pomaly zvyšuje. Ak miešacie motory nemožno vhodne nastaviť, treba uvažovať nad použitím transformátora. Rýchlosť miešania sa nastaví tak, aby sa na rozhraní medzi vodou a 1-oktanolom vytvoril vír s hĺbkou od 0,5 cm do maximálne 2,5 cm. Rýchlosť miešania by sa mala znížiť, ak hĺbka víru presiahne 2,5 cm. V opačnom prípade sa z kvapôčok 1-oktanolu vo vodnej fáze môžu vytvoriť mikrokvapôčky, čo bude mať za následok nadhodnotenie koncentrácie testovanej látky vo vode. Maximálna rýchlosť miešania pri hĺbke 2,5 cm je odporúčaná na základe zistení potvrdzujúcej štúdie kruhového testu (5). Ide o kompromis medzi rýchlym dosiahnutím rovnováhy a zamedzením tvorbe 1-oktanolových mikrokvapôčok.

43.

Miešadlo sa pred odobratím vzoriek vypne a počká sa, kým pohyb kvapalín neustane. Po dokončení odberu vzorky sa miešadlo opäť pomaly spustí, ako je opísané vyššie, a následne sa rýchlosť miešania bude postupne zvyšovať.

44.

Pri vodnej fáze sa vzorka odoberie z uzatváracieho kohútika na dne reakčnej nádoby. Vždy je potrebné odstrániť mŕtvy objem vody v kohútikoch (približne 5 ml v prípade nádoby znázornenej v dodatku 2). Voda v kohútikoch sa nemieša, a preto nie je v rovnováhe s hlavným objemom. Zaznamenajte objem vzoriek vody a uistite sa, že množstvo testovanej látky prítomnej v odstránenej vode sa zohľadní pri nastavovaní hmotnostnej bilancie. Straty vznikajúce pri odparovaní by sa mali minimalizovať, a to tak, že sa umožní, aby voda pokojne stiekla do oddeľovacieho lievika, čím sa zabráni narušeniu vrstvy voda/1-oktanol.

45.

Vzorky 1-oktanolu sa získajú odobratím malej alikvotnej časti (cca. 100 μl) z vrstvy 1-oktanolu 100-mikrolitrovou skleneno-kovovou striekačkou. Treba dbať na to, aby sa nenarušila hranica. Objem odobratej vzorky kvapaliny sa zaznamená. Malá alikvotná časť je postačujúca, lebo vzorka 1-oktanolu sa zriedi.

46.

Treba sa vyhnúť zbytočným prenosom vzorky. Na tento účel by sa objem vzorky mal stanoviť gravimetricky. V prípade vzoriek vody to možno dosiahnuť sústredením vzorky vody v oddeľovacom lieviku, ktorý už obsahuje požadovaný objem rozpúšťadla.

47.

Podľa tejto testovacej metódy sa Pow stanoví vykonaním troch pokusov s pomalým miešaním (tri pokusné jednotky) so skúmanou zlúčeninou pri totožných podmienkach. Regresia použitá na preukázanie dosiahnutia rovnováhy by mala vychádzať z výsledkov aspoň štyroch stanovení CO/CW v po sebe nasledujúcich časových bodoch. Tým sa umožní výpočet rozptylu ako ukazovateľa neistoty priemernej hodnoty získanej v prípade každej pokusnej jednotky.

48.

Pow je možné charakterizovať rozptylom údajov získaných pre každú pokusnú jednotku. Tieto informácie sa použijú na výpočet Pow ako váženého priemeru výsledkov jednotlivých pokusných jednotiek. Na tento účel sa ako váha použije inverzná funkcia rozptylu výsledkov získaných z pokusných jednotiek. V dôsledku toho majú údaje s vysokou variáciou (vyjadrenou ako rozptyl), a teda nižšou spoľahlivosťou menší vplyv na výsledok ako údaje s nízkym rozptylom.

49.

Analogicky sa vypočíta vážená smerodajná odchýlka. Tá vyjadruje opakovateľnosť merania Pow. Nízka hodnota váženej smerodajnej odchýlky znamená, že stanovenie Pow malo v rámci jedného laboratória vysokú opakovateľnosť. Formálne štatistické spracovanie údajov je vysvetlené ďalej.

50.

Logaritmus pomeru koncentrácie testovanej látky v 1-oktanole a vo vode [log (CO/Cw)] sa vypočíta pri každom odbere vzorky. Dosiahnutie chemickej rovnováhy sa preukáže jej grafickým znázornením ako funkcie času. Horná hranica (plató) na tomto znázornení, ktoré je založené aspoň na štyroch po sebe nasledujúcich časových bodoch, ukazuje, že rovnováha bola dosiahnutá a že zlúčenina sa v 1-oktanole naozaj rozpustila. Ak to tak nie je, test musí pokračovať, až kým funkcia v priebehu štyroch po sebe nasledujúcich časových bodov nedosiahne sklon, ktorý sa pri hladine významnosti alfa 0,05 výrazne nelíši od nulového sklonu, čo znamená, že log Co/Cw nie je závislý od času.

51.

Hodnota log Pow pokusnej jednotky sa vypočíta ako vážená priemerná hodnota log Co/Cw tej časti krivky log Co/Cw ako funkcie času, v ktorej sa preukázala rovnováha. Vážený priemer sa vypočíta vážením údajov inverznou funkciou rozptylu, aby bol vplyv údajov na konečný výsledok nepriamo úmerný neistote údajov.

52.

Priemerná hodnota log Pow rôznych pokusných jednotiek sa vypočíta ako priemer výsledkov jednotlivých pokusných jednotiek vážený ich zodpovedajúcim rozptylom.

Výpočet je takýto:

kde

Recipročná hodnota rozptylu log Pow,i sa použije ako wi .

53.

Chyba priemeru log Pow sa odhadne ako opakovateľnosť log Co/Cw stanovená počas fázy rovnováhy pri jednotlivých pokusných jednotkách. Je vyjadrená ako vážená smerodajná odchýlka log Pow,Av (σlog Pow,Av), ktorá je zasa ukazovateľom chyby súvisiacej s log Pow,Av. Váženú smerodajnú odchýlku možno vypočítať z váženého rozptylu (varlog Pow,Av) takto:

Premenná n predstavuje počet pokusných jednotiek.

54.

Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:

1.

De Bruijn, J. H. M., Busser, F., Seinen, W., Hermens, J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring‘ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499 – 512.

2.

Kapitola A.8 tejto prílohy, Rozdeľovací koeficient.

3.

Kapitola A.8 tejto prílohy, Rozdeľovací koeficient.

4.

OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paríž.

5.

Tolls, J. (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.

6.

Boethling, R. S., Mackay, D. (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.

7.

Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.

8.

Arnold, C. G., Widenhaupt, A., David, M. M., Müller, S. R., Haderlein, S. B., Schwarzenbach, R. P. (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2 596 – 2 602.

9.

OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paríž.

10.

Kapitola A.6 tejto prílohy, Rozpustnosť vo vode.

11.

Kapitola C.7 tejto prílohy, Degradácia – Abiotická degradácia: hydrolýza ako funkcia pH.

12.

Kapitola C.4 – časť II – VII (metóda A až F) tejto prílohy, Stanovenie ‚ľahkej‘ biodegradovateľnosti.

13.

Kapitola A.4 tejto prílohy, Tlak pary.

14.

Pinsuwan, S., Li A., a Yalkowsky, S. H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623 – 626.

15.

Lyman, W. J. (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman, W. J., Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H., Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 až 2-52.

16.

Leo, A., Weininger, D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.

17.

Meylan, W. (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.

18.

Compudrug, L. (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapešť.

19.

ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.

20.

Lyman, W. J. (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman, W. J., Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H., eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.

21.

Rekker, R. F., de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479 – 488.

22.

Jübermann, O. (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386 – 390.

1.

Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov TG 403 (2009) (1). Pôvodné Usmernenia na vykonávanie testov akútnej inhalácie 403 (TG 403) boli prijaté v roku 1981. Táto revidovaná testovacia metóda B.2 (ako rovnocenná verzia revidovaných usmernení TG 403) bola vytvorená s cieľom zabezpečiť väčšiu flexibilitu, znížiť využívanie zvierat a vyhovieť regulačným potrebám. Revidovaná testovacia metóda zahŕňa dva druhy štúdií: tradičný protokol LC50 a protokol koncentrácia × čas (C × t). Základnými črtami tejto testovacej metódy sú schopnosť určiť závislosť koncentrácie a reakcie v rozsahu od neletálnych dôsledkov až po smrteľné dôsledky na účely odvodenia strednej smrteľnej koncentrácie (LC50), neletálnej prahovej koncentrácie (napr. LC01) a sklonu a zistenia potenciálnej vnímavosti pohlaví. Protokol C × t by sa mal použiť v prípade, že existuje konkrétna regulačná alebo vedecká potreba, ktorá vyžaduje testovanie na zvieratách v priebehu viacerých časových intervalov, ako napríklad na účely plánovania núdzovej reakcie [napr. odvodenie hodnôt smerodajných úrovní akútnej expozície (AEGL), usmernení pre plánovanie núdzovej reakcie (ERPG) alebo prahových úrovní akútnej expozície (AETL)] alebo na plánovanie využitia krajiny.

2.

Usmernenia k vykonaniu a interpretácii štúdií tejto testovacej metódy sú k dispozícii v usmerňovacom dokumente o testovaní akútnej inhalačnej toxicity (GD 39) (2).

3.

Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené na konci tejto kapitoly a v dokumente GD 39 (2).

4.

Táto testovacia metóda umožňuje charakterizáciu testovanej chemikálie a kvantitatívne posúdenie rizík a umožňuje, aby boli testované chemikálie zoradené a klasifikované podľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 (3). V dokumente GD 39 (2) sa uvádzajú usmernenia k výberu vhodnej metódy testovania akútnej toxicity. Ak sa požadujú iba informácie o klasifikácii a označovaní, vo všeobecnosti sa odporúča riadiť sa kapitolou B.52 tejto prílohy (4) [pozri dokument GD 39 (2)]. Táto testovacia metóda B.2 nie je špecificky určená na testovanie špecializovaných materiálov, ako sú slabo rozpustné izometrické alebo vláknité materiály alebo priemyselne vyrábané nanomateriály.

5.

Pred zvažovaním testovania podľa tejto testovacej metódy by testovacie laboratórium malo zohľadniť všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii vrátane existujúcich štúdií [napr. kapitola B.52 tejto prílohy (4)] obsahujúcich údaje, na základe ktorých sa ďalšie testovanie neodporúča s cieľom minimalizovať využívanie zvierat. Informácie, ktoré môžu pomôcť pri výbere najvhodnejšieho druhu, kmeňa, pohlavia, spôsobu expozície a primeraných testovacích koncentrácií, zahŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie, výsledky všetkých testov toxicity in vitro alebo in vivo, predpokladané použitia a potenciál expozície človeka, dostupné údaje (Q)SAR a toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach [pozri dokument GD 39 (2)].

6.

Testovaniu žieravých a/alebo dráždivých testovacích chemikálií v koncentráciách, ktoré podľa očakávania spôsobia silnú bolesť a/alebo utrpenie by sa malo v čo najväčšej možnej miere vyhnúť. Žieravý/dráždivý potenciál by sa mal posúdiť prostredníctvom odborného posudku s využitím takých dôkazov, ako sú skúseností u ľudí a pri zvieratách (napr. zo štúdií opakovaných dávok uskutočnených pri nežieravých/dráždivých koncentráciách), existujúce údaje in vitro [napr. z kapitol B.40, (5), B.40a (6) tejto prílohy alebo dokumentu OECD TG 435 (7)], hodnoty pH, informácie o podobných látkach alebo akékoľvek iné súvisiace údaje, s cieľom preskúmať, či je možné vyhnúť sa ďalšiemu testovaniu. Na špecifické regulačné účely (napr. na účely núdzového plánovania) možno túto testovaciu metódu použiť na expozíciu zvierat týmto materiálom, lebo to poskytne vedúcemu štúdie alebo vedúcemu výskumnému pracovníkovi kontrolu nad výberom cieľových koncentrácií. Cieľové koncentrácie by však nemali spôsobovať silné dráždivé/žieravé účinky, mali by však byť dostatočné na predĺženie krivky závislosti reakcie od koncentrácie na úroveň, na ktorej sa zabezpečí regulačný a vedecký cieľ testu. Tieto koncentrácie by sa mali vyberať v závislosti od jednotlivých prípadov a výber koncentrácie by sa mal odôvodniť [pozri dokument GD 39 (2)].

7.

Táto revidovaná testovacia metóda B.2 bola vypracovaná s cieľom získať dostatočné informácie o akútnej toxicite testovanej chemikálie, aby bolo možné ju klasifikovať a aby sa získali údaje o letalite (napr. LC50, LC01 a sklon) v prípade jedného alebo oboch pohlaví potrebné na kvantitatívne posúdenie rizík. V rámci tejto testovacej metódy sú k dispozícii dve metódy. Prvou metódou je tradičný protokol, pri ktorom sú skupiny zvierat vystavené limitnej koncentrácii (limitný test) alebo sérii koncentrácií v rámci postupu niekoľkých krokov väčšinou v intervaloch trvajúcich štyri hodiny, ktoré sa určia vopred. Na špecifické regulačné účely možno použiť iné intervaly expozície. Druhou metódou je protokol (C × t), pri ktorom sú skupiny zvierat vystavené jednej koncentrácii (limitná koncentrácia) alebo sérii viacerých koncentrácií v priebehu viacerých intervalov.

8.

Moribundné zvieratá alebo zvieratá so zjavnými bolesťami alebo zvieratá, ktoré vykazujú príznaky silného a trvalého utrpenia, by sa mali humánnym spôsobom usmrtiť, pričom pri interpretácii výsledku testu sa vyhodnocujú rovnako ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá na rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom usmerňovacieho dokumentu OECD č. 19 o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (8).

9.

Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Najvhodnejším zvieraťom je potkan. Použitie iných druhov zvierat je nutné odôvodniť.

10.

Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné. V deň expozície by zvieratá mali byť mladé dospelé jedince vo veku od 8 do 12 týždňov a ich telesná hmotnosť by mala byť v rozmedzí ± 20 % strednej hmotnosti jednotlivých pohlaví všetkých zvierat toho istého veku, ktoré boli exponované skôr. Zvieratá sa vyberajú náhodne a označia sa na účely individuálnej identifikácie. Zvieratá sa umiestnia do klietok najmenej na päť dní pred začatím testu, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky. Zvieratá by sa na krátky čas pred testovaním mali aklimatizovať aj na testovacie zariadenie, lebo sa tak zníži stres spôsobený uvedením do nového prostredia.

11.

Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala byť 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkosť by sa v ideálnom prípade mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, hoci to nemusí byť možné, ak sa ako nosič používa voda. Pred a po expozícii sú zvieratá zvyčajne umiestnené v klietkach v skupinách podľa pohlavia a koncentrácie, ale počet zvierat v jednej klietke by nemal prekážať bezproblémovému pozorovaniu každého zvieraťa, pričom by sa mali minimalizovať straty súvisiace so vzájomným požieraním alebo bojom jedincov. V prípade, že sa použije iba expozícia oblasti nosa, môže byť potrebné, aby sa zvieratá aklimatizovali na skúmavky obmedzujúce pohyb. Skúmavky by nemali zvieratám spôsobovať neprimeraný stres súvisiaci s fyzikálnymi vlastnosťami, teplotou alebo obmedzením pohybu. Obmedzenie môže mať vplyv na fyziologické sledované parametre, ako sú telesná teplota (hypertermia) a/alebo respiračný minútový objem. Ak sú k dispozícii všeobecné údaje, podľa ktorých k takýmto zmenám nedochádza vo veľkej miere, potom nie je potrebné predchádzajúce prispôsobenie obmedzujúcim skúmavkám. Zvieratá vystavené účinkom aerosólu celým telom by sa mali v priebehu expozície umiestniť samostatne, aby sa zabránilo filtrovaniu testovaného aerosólu cez srsť ostatných zvierat v klietke. S výnimkou času trvania expozície sa na kŕmenie môže používať bežné a osvedčené laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou miestnej pitnej vody. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.

12.

Pri výbere inhalačnej komory by sa mal vziať do úvahy charakter testovanej chemikálie a cieľ testu. Uprednostňuje sa expozícia oblasti nosa (pričom tento pojem zahŕňa expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti sa pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly, uprednostňuje expozícia oblasti nosa. Špeciálne ciele štúdie možno lepšie dosiahnuť použitím expozície celého tela, ale tento krok je potrebné v správe o štúdii odôvodniť. Na zabezpečenie stability prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by celkový objem testovaných zvierat nemal presiahnuť 5 % objemu komory. Princípy metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (2).

13.

Expozícia oblasti nosa môže mať pri potkanoch akékoľvek trvanie až do šiestich hodín. Ak sa použije expozícia oblasti nosa pri myšiach, vo všeobecnosti by nemala trvať dlhšie ako štyri hodiny. Ak je potrebné, aby expozícia trvala dlhšie, je nutné uviesť odôvodnenie [pozri dokument GD 39 (2)]. Zvieratá vystavené pôsobeniu aerosólov v komorách na expozíciu celého tela by mali byť umiestnené samostatne, aby sa zabránilo požitiu testovanej chemikálie v dôsledku očisťovania tela ostatnými zvieratami v klietke. Počas trvania expozície by sa zviera nemalo kŕmiť. V priebehu expozície celého tela sa zvieraťu môže podať voda.

14.

Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolenej koncentrácie a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne testované chemikálie by sa mali testovať v podmienkach suchého vzduchu. Treba dbať na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie.

15.

Častice by sa mali rozdeliť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly. Na umožnenie expozície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporúčajú aerosóly so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu od 1 do 4 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru (σg) v rozsahu od 1,5 do 3,0 (2) (9) (10). Hoci by sa malo vynaložiť značné úsilie na dodržanie tejto normy, pokiaľ túto podmienku nie je možné splniť, treba predložiť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov môžu byť častice menšie, ako stanovuje táto norma, a takisto nabité častice, vlákna a hygroskopické materiály (ktoré sa vo vlhkom prostredí dýchacej sústavy zväčšujú) môžu túto normu prekračovať.

16.

Na prípravu vhodnej koncentrácie a veľkosti častíc testovanej chemikálie v ovzduší možno použiť nosič. Spravidla sa uprednostňuje voda. Tuhý materiál môže byť podrobený mechanickým procesom s cieľom dosiahnuť požadovanú distribúciu veľkosti častíc, treba však dbať na to, aby sa testovaná chemikália nerozložila ani nezmenila. V prípadoch, v ktorých sa usudzuje, že sa pôsobením mechanických procesov zmenilo zloženie testovanej chemikálie (napr. extrémne teploty spôsobené nadmerným mletím v dôsledku trenia), by sa zloženie testovanej chemikálie malo analyticky overiť. Treba dať dostatočný pozor, aby sa testovaná chemikália neznečistila. Nie je potrebné testovať nedrobivé granulované materiály, ktoré sa účelovo pripravujú tak, aby nebolo možné ich inhalovať. Na preukázanie, že pri manipulácii s granulovaným materiálom nevznikajú dýchateľné častice, by sa mal vykonať test opotrebovania. Ak pri teste opotrebovania nevzniknú dýchateľné látky, treba uskutočniť test inhalačnej toxicity.

17.

Súbežná negatívna kontrolná skupina (ovzdušia) nie je potrebná. V prípade, že sa na vytvorenie testovacieho ovzdušia použije iný nosič ako voda, sa kontrolná skupina nosiča použije iba vtedy, ak nie sú k dispozícii staršie údaje o inhalačnej toxicite. Ak sa pri štúdii toxicity testovanej chemikálie pripravenej v nosiči nezistí žiadna toxicita, znamená to, že nosič pri testovanej koncentrácii nie je toxický, a teda kontrola nosiča nie je potrebná.

18.

Prúdenie vzduchu cez komoru by sa počas každej expozície malo dôkladne kontrolovať, nepretržite monitorovať a zaznamenávať aspoň raz za hodinu. Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia (alebo stability) je integrálne meranie všetkých dynamických parametrov a poskytuje nepriamy prostriedok kontroly všetkých relevantných dynamických parametrov tvorby ovzdušia. Osobitne treba dbať na to, aby sa zabránilo opätovnému vdýchnutiu v komorách na expozíciu oblasti nosa v prípadoch, v ktorých prúdenie vzduchu cez systém expozície nestačí na zabezpečenie dynamického prúdenia vzduchu s testovanou chemikáliou. Existujú predpísané metodiky, prostredníctvom ktorých možno dokázať, že v zvolených prevádzkových podmienkach nedochádza k opätovnému vdýchnutiu (2) (11). Koncentrácia kyslíka by mala byť minimálne 19 % a koncentrácia oxidu uhličitého by nemala presiahnuť 1 %. Ak existuje dôvod domnievať sa, že tieto normy nie je možné splniť, koncentrácie kyslíka a oxidu uhličitého by sa mali zmerať.

19.

Komora by sa mala udržiavať pri teplote 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkosť v dýchacej zóne zvierat, tak v prípade expozície oblasti nosa, ako aj v prípade expozície celého tela, by sa mala monitorovať a zaznamenávať minimálne trikrát počas expozície v trvaní až štyroch hodín a v prípade kratšej expozície každú hodinu. Relatívna vlhkosť by sa ideálne mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa stať, že táto hodnota bude nedosiahnuteľná (napr. v prípade testovania zmesí na báze vody) alebo nemerateľná z dôvodu interferencie testovanej chemikálie a testovacej metódy.

20.

Vždy, keď je to možné, by sa mala vypočítať a zaznamenať nominálna koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnosť vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, ktorý prešiel systémom komory. Nominálna koncentrácia sa nepoužíva na charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej a skutočnej koncentrácie vypovedá o účinnosti vytvárania testovacieho systému, a teda sa môže použiť na zistenie problémov s tvorbou.

21.

Skutočná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie v dýchacej zóne zvierat v inhalačnej komore. Skutočné koncentrácie možno získať špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, adsorpčnými alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analytickou charakterizáciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravimetrická filtrová analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba v prípade jednozložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín s nízkou prchavosťou, pričom je potrebné túto analýzu podložiť primeranými testovými charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa konkrétnej chemikálie. Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov možno takisto stanoviť prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom prípade sú však potrebné analytické údaje, ktoré dokazujú, že zloženie materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto informácie nie sú dostupné, môže byť potrebná opätovná analýza testovanej chemikálie (ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu vypariť alebo môžu sublimovať, by sa malo preukázať, že všetky fázy sa zhromaždili pomocou zvolenej metódy. V správe o štúdii by sa mali uviesť cieľové, nominálne a skutočné koncentrácie. Na výpočet hodnôt smrteľných koncentrácií sa však v štatistických analýzach použijú iba skutočné koncentrácie.

22.

Ak je to možné, mala by sa použiť jedna dávka testovanej chemikálie, pričom testovaná vzorka by sa mala uskladniť za podmienok, za ktorých sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred začatím štúdie by mala byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej čistoty a, ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných kontaminantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukázať napríklad týmito údajmi: retenčný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnosť získaná pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium nenesie zodpovednosť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspoň čiastočne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávateľom (napr. farbu, fyzikálne skupenstvo atď.).

23.

Prostredie expozície by malo byť čo najstálejšie a malo by sa nepretržite a/alebo občasne monitorovať v závislosti od metódy analýzy. Ak sa použije občasný odber vzoriek, vzorky ovzdušia komory by sa mali v priebehu štvorhodinovej štúdie odobrať najmenej dvakrát. Ak to pre nízky prietok vzduchu alebo nízke koncentrácie nie je možné, môže sa v priebehu celého intervalu expozície odobrať jedna vzorka. Ak sa medzi jednotlivými vzorkami vyskytnú výrazné výkyvy, pri ďalších testovaných koncentráciách by sa mali použiť štyri vzorky z každej expozície. Jednotlivé vzorky koncentrácie komory by sa nemali odchýliť od strednej koncentrácie o viac ako ± 10 % v prípade plynov a pár alebo o ± 20 % v prípade kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy v komore (t95) by sa mal vypočítať a zaznamenať. Interval expozície zahŕňa čas, keď sa testovaná chemikália tvorí, pričom sa zohľadňujú aj časy potrebné na dosiahnutie t95. Usmernenia k odhadovaniu t95 sú uvedené v dokumente GD 39 (2).

24.

V prípade veľmi komplexných zmesí tvorených plynmi/parami a aerosólov (napr. spaľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií poháňaných účelovými výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhalačnej komore môže každá fáza správať inak, takže by sa mala vybrať aspoň jedna látka slúžiaca ako ukazovateľ (analyt), najčastejšie hlavná aktívna látka v zmesi, každej fázy (plyn/para a aerosól). Ak je testovaná chemikália zmes, v správe by sa mala uviesť analytická koncentrácia zmesi, nielen aktívnej látky alebo zložky (analytu). Ďalšie informácie týkajúce sa skutočných koncentrácií sú uvedené v dokumente GD 39 (2).

25.

Rozdelenie veľkosti častíc aerosólov by sa malo stanoviť aspoň dvakrát v priebehu každej expozície v trvaní štyroch hodín, a to pomocou kaskádového impaktora alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc. Ak možno preukázať rovnocennosť výsledkov získaných pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alternatívny prístroj môže používať počas celej štúdie. Druhé zariadenie, ako je gravimetrický filter alebo impinger/premývačka, by sa malo použiť súbežne s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej účinnosti hlavného prístroja. Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou veľkosti častíc by mala byť v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (2)]. Ak možno preukázať rovnocennosť v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonávať ďalšie potvrdzujúce merania. V záujme zabezpečenia dobrých životných podmienok pre zvieratá by sa mali prijať opatrenia na minimalizáciu nejednoznačných údajov, ktoré môžu viesť k potrebe opakovať expozíciu. Rozdelenie veľkosti častíc by sa malo vykonať v prípade pár, ak existuje možnosť, že kondenzácia pary môže mať za následok tvorbu aerosólu, alebo ak sa v ovzduší pár zistia častice s potenciálom zmiešaných fáz (pozri odsek 15).

26.

Ďalej v texte sú opísané dva druhy štúdií: tradičný protokol a protokol C × t. Obidva protokoly môžu zahŕňať predbežnú štúdiu, základnú štúdiu a/alebo limitný test (tradičný protokol) alebo testovanie pri limitnej koncentrácii (C × t). Ak je známe, že jedno pohlavie je vnímavejšie, vedúci štúdie môže rozhodnúť, že sa na tieto štúdie použije iba vnímavejšie pohlavie. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobiť s cieľom minimalizovať druhovo špecifické utrpenie. Pred začatím by sa mali zvážiť všetky dostupné údaje, aby sa minimalizovalo využívanie zvierat. Napríklad údaje získané s využitím kapitoly B.52 tejto prílohy (4) môžu eliminovať potrebu predbežnej štúdie a môžu takisto preukázať, či je jedno pohlavie vnímavejšie [pozri dokument GD 39 (2)].

27.

Pri tradičnej štúdii sú skupiny zvierat vystavené účinkom testovanej chemikálie počas pevne stanoveného obdobia (vo všeobecnosti štyri hodiny) buď v komore na expozíciu oblasti nosa, alebo v komore na expozíciu celého tela. Zvieratá sú exponované limitnej koncentrácii (limitný test) alebo v prípade postupu zahŕňajúceho viac krokov najmenej trom koncentráciám (základná štúdia). Základnej štúdii môže predchádzať predbežná štúdia, pokiaľ neexistujú informácie o testovanej látke, ako je napríklad štúdia B.52 uskutočnená skôr [pozri GD 39 (2)].

28.

Predbežná štúdia sa používa na odhad potencie testovanej chemikálie, identifikáciu rozdielov medzi pohlaviami, pokiaľ ide o vnímavosť, a pomoc pri výbere úrovní koncentrácie pri expozícii pre základnú štúdiu alebo pre limitný test. Pri výbere úrovní koncentrácie na účely predbežnej štúdie by sa mali použiť všetky dostupné informácie vrátane údajov (Q)SAR a údajov o podobných chemikáliách. Pri každej koncentrácii by sa nemali exponovať viac ako tri samce a tri samice (na stanovenie rozdielov medzi pohlaviami môžu byť potrebné tri zvieratá z každého pohlavia). Predbežná štúdia sa môže vykonávať s využitím jednej koncentrácie, ale v prípade potreby je možné testovať aj viac koncentrácií. V rámci predbežnej štúdie by sa nemal testovať taký počet zvierat a koncentrácií, ktorý by pripomínal základnú štúdiu. Namiesto predbežnej štúdie sa môže použiť štúdia B.52 (4) uskutočnená skôr [pozri dokument GD 39 (2)].

29.

Limitný test sa používa, ak je známe alebo sa predpokladá, že testovaná chemikália je v podstate netoxická, t. j. vyvoláva toxickú reakciu iba pri koncentrácii vyššej, ako je regulačná limitná koncentrácia. Pri limitnom teste sa jedna skupina troch samcov a troch samíc exponuje testovanej chemikálii pri limitnej koncentrácii. Informácie o toxicite testovanej chemikálie možno získať z poznatkov o podobných testovaných chemikáliách pri zohľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V situáciách, keď existuje málo informácií alebo neexistujú žiadne informácie o jej toxicite, alebo ak sa očakáva, že testovaná chemikália bude toxická, je potrebné vykonať základný test.

30.

Výber limitných koncentrácií zvyčajne závisí od regulačných požiadaviek. Ak sa použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade plynov je 20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l (alebo maximálna dosiahnuteľná koncentrácia) (3). V prípade niektorých testovaných chemikálií, najmä vo forme pár a aerosólov, môže byť technicky náročné pripraviť limitné koncentrácie. Pri testovaní aerosólov by hlavným cieľom malo byť dosiahnutie dýchateľnej veľkosti častíc (MMAD 1 – 4 μm). V prípade väčšiny testovaných chemikálií je túto veľkosť možné dosiahnuť pri koncentrácii 2 mg/l. O testovanie aerosólov pri koncentrácii vyššej ako 2 mg/l sa možno pokúšať, iba ak je možné získať dýchateľnú veľkosť častíc [pozri dokument GD 39 (2)]. V nariadení (ES) č. 1272/2008 sa z dôvodu starostlivosti o zvieratá neodporúča testovanie pri koncentrácii vyššej, ako je limitná koncentrácia (3). Limitná koncentrácia by sa mala zvažovať iba vtedy, ak existuje vysoká pravdepodobnosť, že výsledky takéhoto testu by mali priamy význam pre ochranu ľudského zdravia (3), pričom do správy o štúdii treba uviesť odôvodnenie. V prípade potenciálne výbušných testovaných chemikálií treba dbať na to, aby nenastali podmienky, ktoré by mohli viesť k výbuchu. S cieľom zabrániť zbytočnému využívaniu zvierat by sa malo pred limitným testom vykonať testovacie kolo bez zvierat, aby sa zabezpečilo, že v komore je možné dosiahnuť podmienky na účely limitného testu.

31.

Ak sa pri limitnej koncentrácii pozoruje mortalita alebo moribundita, výsledky limitného testu môžu slúžiť ako predbežná štúdia pre ďalšie testovanie pri iných koncentráciách (pozri základnú štúdiu). Ak fyzikálne alebo chemické vlastnosti testovanej chemikálie znemožňujú dosiahnutie limitnej koncentrácie, mala by sa testovať maximálna dosiahnuteľná koncentrácia. Ak sa pri maximálnej dosiahnuteľnej koncentrácii vyskytne letalita nižšia ako 50 %, ďalšie testovanie nie je potrebné. Ak nebolo možné dosiahnuť limitnú koncentráciu, v správe o štúdii treba uviesť vysvetlenie a podložiť ho údajmi. Ak maximálna dosiahnuteľná koncentrácia pary nevyvoláva toxicitu, môže byť potrebné pripraviť testovanú chemikáliu ako kvapalný aerosól.

32.

Základná štúdia sa zvyčajne vykonáva s využitím piatich samcov a piatich samíc (alebo päť zvierat vnímavejšieho pohlavia, ak je známe) pri jednej úrovni koncentrácie, pričom sa testujú najmenej tri úrovne koncentrácie. Na zabezpečenie dôkladnej štatistickej analýzy by sa mali použiť dostatočné úrovne koncentrácie. Časový interval medzi skupinami expozícií je určený nástupom, trvaním a závažnosťou príznakov toxicity. Expozícia zvierat pri ďalšej úrovni koncentrácie by sa mala odložiť, kým sa nenadobudne dostatočná dôvera, že zvieratá, ktoré boli testované, prežijú. To umožní vedúcemu štúdie, aby prispôsobil cieľovú koncentráciu pre ďalšiu expozičnú skupinu. Z dôvodu závislosti od sofistikovaných technológií to v prípade inhalačných štúdií nemusí byť vždy možné, takže expozícia zvierat pri ďalšej úrovni koncentrácie by mala vychádzať z predchádzajúcich skúseností a vedeckého posudku. Pri testovaní zmesí si treba preštudovať dokument GD 39 (2).

33.

O štúdii C × t pozostávajúcej z viacerých krokov možno pri hodnotení inhalačnej toxicity uvažovať ako o alternatíve k tradičnému protokolu (12) (13) (14). Tento prístup umožňuje, aby boli zvieratá exponované testovanej chemikálii pri viacerých úrovniach koncentrácie a počas niekoľkých časových intervalov. Celé testovanie prebieha v komore na expozíciu oblasti nosa (v prípade tohto protokolu nie je možné použiť komory na expozíciu celého tela). Tento protokol je znázornený v tokovom diagrame v dodatku 1. Zo simulačnej analýzy vyplynulo, že v prípade tradičného protokolu, ako aj v prípade protokolu C × t možno získať spoľahlivé hodnoty LC50, ale protokol C × t je všeobecne lepší na získanie spoľahlivých hodnôt LC01 a LC10 (15).

34.

Simulačná analýza preukázala, že využívanie dvoch zvierat pre jeden interval C × t (jedno zviera z každého pohlavia pri použití oboch pohlaví alebo dve zvieratá vnímavejšieho pohlavia) môže byť vo všeobecnosti v prípade základnej štúdie vhodné pri testovaní štyroch koncentrácií a piatich intervalov expozície. Za určitých okolností sa vedúci štúdie môže rozhodnúť pre použitie dvoch potkanov z každého pohlavia pre jeden interval C × t (15). Použitie dvoch zvierat z každého pohlavia na jednu koncentráciu a časový bod môže znížiť chybu a variabilitu odhadov, zvýšiť úspešnosť odhadu a zvýšiť istotu, pokiaľ ide o rozsah intervalov. V prípade nedostatočne presnej zhody s údajmi pre odhad (pri použití jedného zvieraťa z každého pohlavia alebo dvoch zvierat vnímavejšieho pohlavia) môže postačovať aj piata expozičná koncentrácia. Ďalšie usmernenia týkajúce sa počtu zvierat a koncentrácií, ktoré sa majú použiť v prípade štúdie C × t, sú uvedené v dokumente GD 39 (2).

35.

Predbežná štúdia sa používa na odhad potencie testovanej chemikálie a na pomoc pri výbere úrovní expozičných koncentrácií pre základnú štúdiu. Pri predbežnej štúdii, pri ktorej sa využívajú až tri zvieratá z každého pohlavia na koncentráciu [podrobnejšie informácie sú uvedené v dodatku III dokumentu GD 39 (2)], môže byť potrebné vybrať vhodnú počiatočnú koncentráciu pre základnú štúdiu a minimalizovať počet použitých zvierat. Na zistenie rozdielov medzi pohlaviami môže byť nevyhnutné použiť tri zvieratá z každého pohlavia. Tieto zvieratá by sa mali jednorazovo exponovať zvyčajne počas 240 minút. Otázka, či je možné vytvoriť vhodné testovacie ovzdušie, by sa mala posúdiť v priebehu predbežných technických testov bez zvierat. Vo všeobecnosti nie je potrebné vykonávať predbežnú štúdiu, ak sú k dispozícii údaje o mortalite zo štúdie B.52 (4). Pri výbere počiatočnej cieľovej koncentrácie v štúdii B.2 by mal vedúci štúdie zohľadniť štruktúru mortality pozorovanú pri všetkých dostupných štúdiách B.52 (4) pri oboch pohlaviach a pri všetkých testovaných koncentráciách [pozri dokument GD 39 (2)].

36.

Počiatočná koncentrácia (expozičné kolo I) (dodatok 1) bude buď limitná koncentrácia, alebo koncentrácia, ktorú vyberie vedúci štúdie na základe predbežnej štúdie. Skupiny po jednom zvierati z každého pohlavia sú exponované tejto koncentrácii počas niekoľkých intervalov (napr. 15, 30, 60, 120 alebo 240 minút), čo vedie k celkovému počtu desiatich zvierat (tzv. expozičné kolo I) (dodatok 1).

37.

Výber limitných koncentrácií zvyčajne závisí od regulačných požiadaviek. Ak sa použije nariadenie (ES) č. 1272/2008, limitná koncentrácia v prípade plynov je 20 000 ppm, v prípade pár 20 mg/l a v prípade aerosólov 5 mg/l (alebo maximálna dosiahnuteľná koncentrácia) (3). V prípade niektorých testovaných chemikálií, najmä vo forme pár a aerosólov, môže byť technicky náročné pripraviť limitné koncentrácie. Pri testovaní aerosólov by malo byť cieľom dosiahnutie dýchateľnej veľkosti častíc (t. j. MMAD 1 – 4 μm) pri limitnej koncentrácii 2 mg/l. Túto veľkosť je možné dosiahnuť v prípade väčšiny testovaných chemikálií. O testovanie aerosólov pri koncentrácii vyššej ako 2 mg/l sa možno pokúšať, iba ak je možné získať dýchateľnú veľkosť častíc [pozri dokument GD 39 (2)]. V nariadení (ES) č. 1272/2008 sa z dôvodu starostlivosti o zvieratá neodporúča testovanie pri koncentrácii vyššej, ako je limitná koncentrácia (3). Testovanie pri limitnej koncentrácii by sa malo zvažovať iba vtedy, ak existuje vysoká pravdepodobnosť, že výsledky takéhoto testu by mali priamy význam pre ochranu ľudského zdravia (3), pričom do správy o štúdii treba uviesť odôvodnenie. V prípade potenciálne výbušných testovaných chemikálií treba dbať na to, aby nenastali podmienky, ktoré by mohli viesť k výbuchu. S cieľom zabrániť zbytočnému využívaniu zvierat by sa malo pred testovaním pri počiatočnej koncentrácii vykonať testovacie kolo bez zvierat, aby sa zaistilo, že v komore je možné zabezpečiť podmienky na dosiahnutie tejto koncentrácie.

38.

Ak sa pri počiatočnej koncentrácii pozoruje mortalita alebo moribundita, výsledky pri tejto koncentrácii môžu slúžiť ako východisko na ďalšie testovanie pri iných koncentráciách (pozri základnú štúdiu). Ak fyzikálne alebo chemické vlastnosti testovanej chemikálie znemožňujú dosiahnutie limitnej koncentrácie, mala by sa testovať maximálna dosiahnuteľná koncentrácia. Ak sa pri maximálnej dosiahnuteľnej koncentrácii vyskytne letalita nižšia ako 50 %, ďalšie testovanie nie je potrebné. Ak nebolo možné dosiahnuť limitnú koncentráciu, v správe o štúdii treba uviesť vysvetlenie a podložiť ho údajmi. Ak maximálna dosiahnuteľná koncentrácia pary nevyvoláva toxicitu, môže byť potrebné pripraviť testovanú chemikáliu ako kvapalný aerosól.

39.

Počiatočná koncentrácia (expozičné kolo I) (dodatok 1) testovaná v rámci základnej štúdie bude buď limitná koncentrácia, alebo koncentrácia, ktorú vyberie vedúci štúdie na základe predbežnej štúdie. Ak sa v priebehu alebo po kole expozície I pozoruje mortalita, minimálna expozícia (C × t), ktorá má za následok mortalitu, sa použije ako smerodajný údaj na stanovenie koncentrácie a intervalov expozície pre kolo expozície II. Každé následné kolo expozície bude závisieť od predchádzajúceho kola (pozri dodatok 1).

40.

V prípade mnohých testovaných chemikálií budú výsledky získané pri počiatočnej koncentrácii spolu s tromi ďalšími kolami expozície s využitím hustejšej súradnicovej siete (t. j. geometrického rozloženia intervalov expozície určeného faktorom medzi intervalmi, ktoré nasledujú po sebe, zvyčajne s hodnotou √2) na stanovenie závislosti mortality v rámci štúdie C × t postačujúce (15). Použitie piatej expozičnej koncentrácie však môže mať isté výhody [pozri dodatok 1 a dokument GD 39 (2)]. Matematická úprava výsledkov protokolu C × t je uvedená v dodatku 1.

41.

Zvieratá by sa mali v priebehu trvania expozície pravidelne klinicky pozorovať. Po expozícii by sa mali klinické pozorovania vykonať najmenej dvakrát v deň expozície alebo častejšie, ak to indikuje reakcia zvierat na testovanie, a následne najmenej raz denne počas 14 dní. Dĺžka pozorovania nie je presne určená, ale mala by sa stanoviť podľa charakteru a času nástupu klinických príznakov a dĺžky obdobia zotavenia. Časy, keď sa objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia príznakov toxicity. Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam. Moribundné zvieratá a zvieratá, ktoré majú očividne silné bolesti a/alebo vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom utratiť. Pri vyšetrovaní klinických príznakov toxicity treba dávať pozor, aby sa počiatočný nepatrný nález a krátkodobé zmeny dýchania, ktoré sú dôsledkom expozície, nezamieňali za toxicitu súvisiacu s testovanou chemikáliou, ktorá by vyžadovala predčasné utratenie zvierat. Zohľadnia sa zásady a kritériá zosumarizované v usmerňujúcom dokumente o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (GD 19) (7). Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.

42.

Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože, srsti, očí, slizníc, dýchania, krvného obehu, autonómneho a centrálneho nervového systému, ako aj somatomotoriky a správania. Ak je to možné, zaznamená sa každý rozdiel medzi lokálnymi a systémovými účinkami. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Meraním rektálnej teploty možno získať dôkazy svedčiace o reflexnej bradypney alebo hypo/hypertermii, ktoré súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu.

43.

Individuálne hmotnosti zvierat by sa mali zaznamenať raz počas obdobia aklimatizácie, v deň expozície pred expozíciou (deň 0), minimálne v dňoch 1, 3 a 7 (a následne raz za týždeň) a v čase uhynutia alebo utratenia, pokiaľ k nemu dôjde po dni 1. Telesná hmotnosť sa považuje za kritický ukazovateľ toxicity, takže zvieratá, pri ktorých nastane trvalý úbytok hmotnosti ≥ 20 % v porovnaní s hodnotami pred štúdiou, by sa mali pozorne sledovať. Zvieratá, ktoré prežijú, sa na konci obdobia po expozícii odvážia a humánne usmrtia.

44.

Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú počas testu alebo sa utratia a vylúčia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú autopsii. Ak nie je možné vykonať autopsiu ihneď po objavení uhynutého zvieraťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostatočne nízku teplotu, aby sa minimalizovala autolýza. Autopsie by sa mali vykonať čo najskôr, zvyčajne v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati sa zaznamenajú všetky makroskopické patologické zmeny, pričom osobitná pozornosť sa venuje akýmkoľvek zmenám v dýchacej sústave.

45.

Na účely zvýšenia výpovednej hodnoty štúdie možno zvážiť ďalšie vyšetrenia a priori zahrnuté od začiatku, ako je meranie hmotnosti pľúc potkanov, ktoré prežili, a/alebo poskytnutie dôkazov o podráždení prostredníctvom mikroskopického vyšetrenia dýchacej sústavy. Medzi skúmané orgány môžu patriť aj orgány, ktoré svedčia o makroskopickej patológii pri zvieratách, ktoré prežili 24 alebo viac hodín, a orgány, o ktorých je známe alebo pri ktorých sa predpokladá, že boli zasiahnuté. Mikroskopické vyšetrenie celej dýchacej sústavy môže poskytnúť užitočné informácie o testovaných chemikáliách, ktoré reagujú s vodou, ako sú kyseliny a hygroskopické testované chemikálie.

46.

Treba uviesť údaje o telesnej hmotnosti a pitevných nálezoch jednotlivých zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, opis a časový priebeh toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy.

47.

Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:

1.

OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].

2.

OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].

3.

Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).

4.

Kapitola B.52 tejto prílohy, Akútna inhalačná toxicita – metóda akútnej toxickej triedy (ATC).

5.

Kapitola B.40 tejto prílohy, Poleptanie kože in vitro: test pomocou transkutánneho elektrického odporu (TER).

6.

Kapitola B.40a tejto prílohy, Poleptanie kože in vitro: test pomocou modelu ľudskej kože.

7.

OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].

8.

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].

9.

SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321 – 327.

10.

Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (druhé vydanie) Informa Healthcare, New York.

11.

Pauluhn, J., a Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160 – 167.

12.

Zwart, J. H. E., Arts, J. M., ten Berge, W. F., Appelman, L. M. (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278 – 290.

13.

Zwart, J. H. E., Arts, J. M., Klokman-Houweling, E. D., Schoen, E. D. (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105 – 117.

14.

Ten Berge, W. F., a Zwart, A. (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65 – 71.

15.

OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paríž. K dispozícii na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].

16.

Finney, D. J. (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, Londýn/New York.

1.

Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov TG 407 (2008). Pôvodné Usmernenia na vykonávanie testov 407 boli prijaté v roku 1981. V roku 1995 bola prijatá revidovaná verzia s cieľom získať ďalšie informácie pomocou zvierat použitých v štúdii, najmä informácie o neurotoxicite and imunotoxicite.

2.

Organizácia OECD v roku 1998 iniciovala aktivitu s vysokou prioritou s cieľom zrevidovať existujúce usmernenia k testovaniu a vypracovať nové usmernenia k testovaniu potenciálnych endokrinných disruptorov (8). Jednou zložkou tejto aktivity bolo aktualizovať existujúce usmernenia OECD pre ‚28-dňovú štúdiu orálnej toxicity pri hlodavcoch/test v opakovaných dávkach‘ (TG 407) podľa parametrov vhodných na zistenie endokrinného pôsobenia testovaných chemikálií. Tento postup bol podrobený rozsiahlemu medzinárodnému programu, ktorého účelom bolo otestovať význam a vykonateľnosť ďalších parametrov, výkonnosť týchto parametrov pri chemikáliách s (anti)estrogénnym, (anti)androgénnym a (anti)tyreoidným pôsobením, intralaboratórnu a interlaboratórnu reprodukovateľnosť a vzájomnú interferenciu nových parametrov s parametrami požadovanými v predchádzajúcom usmerňovacom dokumente TG 407. Týmto spôsobom sa zozbieralo veľké množstvo údajov, ktoré sa podrobne zhodnotili v súhrnnej správe OECD (9). Táto aktualizovaná testovacia metóda B.7 (rovnocenná s TG 407) bola vypracovaná na základe skúseností a výsledkov získaných počas medzinárodného programu testovania. Táto testovacia metóda umožňuje skúmanie súvislostí medzi určitými endokrinnými účinkami a inými toxikologickými účinkami.

3.

Pri posudzovaní a vyhodnocovaní toxických charakteristík chemikálie možno po získaní prvotných informácií o toxicite prostredníctvom testovania akútnej toxicity pomocou opakovaných dávok stanoviť orálnu toxicitu. Táto testovacia metóda je zameraná na preskúmanie účinkov na veľmi širokej škále potenciálnych cieľov toxicity. Poskytuje informácie o možnej nebezpečnosti pre zdravie, ktorá sa pravdepodobne vyskytne pri opakovanej expozícii v priebehu pomerne krátkeho časového obdobia, vrátane účinkov na nervový, imunitný a endokrinný systém. Pokiaľ ide o tieto konkrétne sledované parametre, mali by sa pomocou nej identifikovať chemikálie s neurotoxickým potenciálom, čo môže viesť k ďalšiemu dôkladnému skúmaniu tohto aspektu, a chemikálie, ktoré majú vplyv na tyreoidnú fyziológiu. Takisto pomocou nej možno získať údaje o chemikáliách, ktoré majú vplyv na samčie a/alebo samičie rozmnožovacie orgány pri mladých dospelých zvieratách, a možno pomocou nej zistiť imunologické účinky.

4.

Výsledky tejto testovacej metódy B.7 sa použijú na identifikáciu nebezpečnosti a na hodnotenie rizík. Výsledky získané pomocou parametrov súvisiacich s endokrinným systémom by sa mali posudzovať v kontexte Koncepčného rámca OECD na testovanie a hodnotenie chemikálií poškodzujúcich endokrinný systém (11). Metóda zahŕňa základnú štúdiu toxicity pri opakovaných dávkach, ktorú možno použiť v prípade chemikálií, pri ktorých nemožno zaručiť 90-dňovú štúdiu (napr. keď objem produkcie neprekračuje určité limity), alebo ako predbežnú štúdiu k dlhodobej štúdii. Interval expozície trvá 28 dní.

5.

Medzinárodný program uskutočnený na overenie parametrov vhodných na potenciálne odhalenie endokrinného pôsobenia testovanej chemikálie, ukázal, že kvalita údajov získaných touto testovacou metódou B.7 bude vo veľkej miere závisieť od skúseností testovacieho laboratória. Súvisí to najmä s histopatologickým stanovením cyklických zmien pri samičích rozmnožovacích orgánoch a so stanovením hmotnosti malých hormonálnych orgánov, ktorých pitva je náročná. Boli vypracované usmernenia k histopatológii (19), ktoré sú k dispozícii na verejnej webovej stránke OECD o usmerneniach k testovaniu. Ich cieľom je pomôcť patológom pri ich skúmaní a pomôcť zvýšiť citlivosť skúšky. Pri množstve parametrov sa zistilo, že indikujú endokrinnú toxicitu, na základe čoho boli začlenené do testovacej metódy. Parametre, pre ktoré nie sú k dispozícii dostatočné údaje na preukázanie ich užitočnosti alebo pri ktorých bol v rámci programu overovania preukázaný iba slabý prínos pri zisťovaní endokrinných disruptorov, sú navrhnuté ako nepovinné parametre (pozri dodatok 2).

6.

Vzhľadom na údaje získané v rámci procesu overovania treba zdôrazniť, že táto štúdia nie je dostatočne citlivá na identifikáciu všetkých látok s (anti)androgénnymi alebo (anti)estrogénnymi účinkami (9). Testovacia metóda sa nevykonáva v životnej fáze, v ktorej je endokrinný systém najcitlivejší na poškodenie. Pomocou testovacej metódy sa však v priebehu procesu overovania identifikovali látky slabo alebo silno ovplyvňujúce funkciu štítnej žľazy a látky so silným a stredne silným účinkom na endokrinný systém, ktoré pôsobia na estrogénové alebo androgénové receptory. Na druhej strane vo väčšine prípadov nebolo možné identifikovať látky s účinkami na endokrinný systém, ktorých pôsobenie na estrogénové alebo androgénové receptory je slabé. Testovaciu metódu preto nemožno charakterizovať ako skríningový test endokrinného pôsobenia.

7.

Neexistenciu účinkov súvisiacich s týmito druhmi pôsobenia následne nemožno brať ako dôkaz neexistencie účinkov na endokrinný systém. Pokiaľ ide o endokrinné účinky, charakterizácia látok by preto nemala byť založená iba na výsledkoch tejto testovacej metódy, ale mala by sa použiť v rámci prístupu váhy dôkazov, ktorý zohľadňuje všetky existujúce údaje o chemikálii na účely charakterizácie potenciálneho endokrinného pôsobenia. Z tohto dôvodu by regulačné rozhodovanie o endokrinnom pôsobení (charakterizácia látky) malo byť postavené na širokom základe a nemalo by sa opierať iba o výsledky aplikácie tejto testovacej metódy.

8.

Uznáva sa, že všetky postupy využívajúce zvieratá musia byť v súlade s miestnymi normami starostlivosti o zvieratá. Opisy starostlivosti a zaobchádzania uvedené ďalej predstavujú minimálne normy pre vykonávanie postupov a v prípade, že miestne predpisy sú prísnejšie, budú mať miestne predpisy prednosť. Ďalšie usmernenia k humánnemu zaobchádzaniu so zvieratami uvádza organizácia OECD (14).

9.

Vymedzenie pojmov je uvedené v dodatku 1.

10.

Niekoľkým skupinám experimentálnych zvierat sa denne orálne podáva testovaná chemikália v odstupňovaných dávkach spôsobom, pri ktorom sa každej skupine podáva jedna dávka počas 28-dňovej periódy. Počas periódy podávania sa zvieratá pozorne pozorujú, pričom sa denne kontroluje prítomnosť znakov toxického účinku. Zvieratá, ktoré počas testu uhynú alebo sa utratia, sú následne pitvané a takisto zvieratá, ktoré prežijú, sú na záver testu utratené a podrobené pitve. 28-dňová štúdia poskytuje informácie o účinkoch orálnej expozície v opakovaných dávkach a môže poukázať na potrebu ďalších dlhodobejších štúdií. Takisto môže poskytnúť informácie o výbere koncentrácií na účely dlhodobejších štúdií. Údaje získané pomocou tejto testovacej metódy by mali umožniť charakterizáciu toxicity testovanej chemikálie na zistenie závislosti medzi dávkou a reakciou a na stanovenie hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL).

11.

Uprednostňovanými hlodavcami sú potkany, aj keď sa môžu použiť aj iné hlodavce. Ak sa parametre uvedené v rámci tejto testovacej metódy B.7 skúmajú pri inom druhu hlodavcov, je potrebné uviesť podrobné odôvodnenie. Hoci z biologického hľadiska je hodnoverné, že iné druhy by reagovali na toxikanty podobným spôsobom ako potkany, použitie menších druhov môže mať za následok väčšiu variabilitu z dôvodu technických problémov pri pitve menších orgánov. V rámci medzinárodného programu overovania na zistenie endokrinných disruptorov sa použili iba potkany. Používajú sa mladé zdravé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné. Dávkovanie sa musí začať čo najskôr po odstavení mláďat a skôr než zvieratá dovŕšia deväť týždňov. Na začiatku štúdie sú váhové odchýlky pri zvieratách minimálne a neprevyšujú ± 20 % priemernej váhy oboch pohlaví. Ak je štúdia opakovanej orálnej dávky predbežnou štúdiou dlhodobej štúdie, uprednostňuje sa používanie zvierat toho istého kmeňa a z toho istého zdroja v oboch štúdiách.

12.

Všetky postupy musia byť v súlade s miestnymi normami starostlivosti o laboratórne zvieratá. Teplota pokusnej miestnosti, kde sú zvieratá umiestnené, by mala byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď by relatívna vlhkosť mala byť aspoň 30 %, a pokiaľ možno by nemala prevyšovať 70 % okrem obdobia počas čistenia miestnosti, cieľom je, aby relatívna vlhkosť dosahovala 50 – 60 %. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. Zvieratá by mali byť umiestnené spolu v malých skupinách rovnakého pohlavia. Zvieratá možno umiestniť samostatne, ak je to vedecky opodstatnené. Pokiaľ ide o umiestnenie skupín do klietok, v jednej klietke by nemalo byť viac ako päť zvierat.

13.

Krmivo treba pravidelne analyzovať, aby sa zistilo, či neobsahuje kontaminanty. Vzorka krmiva by sa mala zachovať až do dokončenia správy.

14.

Zdravé, mladé, dospelé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy vzhľadom na ich umiestnenie. Zvieratá sa jednotlivo označia. Zvieratá sa v klietkach aklimatizujú na laboratórne podmienky najmenej päť dní pred začatím testovacej štúdie.

15.

Testovaná chemikália sa podáva cez sondu priamo do žalúdka alebo v potrave alebo v pitnej vode. Metóda orálneho podávania závisí od účelu štúdie a fyzikálnych, chemických a toxikokinetických vlastností testovanej chemikálie.

16.

Ak je to potrebné, testovaná chemikália sa rozpustí alebo suspenduje vo vhodnom nosiči. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/suspenzie v oleji (napr. kukuričnom oleji) a nakoniec prípadného roztoku v iných nosičoch. Charakteristiky toxicity nosičov iných ako voda musia byť známe. Určí sa stabilita testovanej chemikálie v nosiči.

17.

Na každej hladine dávkovania sa použije prinajmenšom desať zvierat (päť samíc a päť samcov). Ak je v pláne utratiť nejaké zvieratá aj počas testu, počet by mal byť zvýšený o plánovaný počet zvierat, ktoré majú byť utratené pred ukončením štúdie. Treba zvážiť použitie ďalšej satelitnej skupiny desiatich zvierat (päť z každého pohlavia) ku kontrolnej skupine a ku skupine vystavenej najvyššej dávke na účely pozorovaní reverzibility, perzistencie alebo oneskorenia toxických účinkov, a to najmenej počas 14 dní po testovaní.

18.

Zvyčajne sa používajú najmenej tri testovacie skupiny a jedna kontrolná skupina, ale v prípade, že sa na základe hodnotenia ostatných údajov nepredpokladajú účinky pri dávke 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň, môže sa vykonať limitný test. Ak nie sú k dispozícii vhodné údaje, môže sa vykonať štúdia na zistenie rozsahu (zvieratá toho istého kmeňa a z toho istého zdroja), aby sa ľahšie stanovili dávky, ktoré sa použijú. So zvieratami v kontrolnej skupine sa musí zaobchádzať takisto ako so zvieratami v testovaných skupinách, s výnimkou aplikovania testovanej chemikálie. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie používa nosič, kontrolná skupina dostane nosič v najvyššom používanom objeme.

19.

Pri výbere hladín dávok sa berú do úvahy existujúce údaje o toxicite a (toxiko-)kinetike testovanej chemikálie a príbuzných chemikálií. Najvyššia dávka sa vyberá tak, aby indukovala toxické účinky, ale nespôsobovala uhynutie zvierat alebo vážne utrpenie. Podľa toho sa vyberá aj znižujúca sa postupnosť hladín dávok s cieľom určiť závislosť reakcie od dávky a stanoviť hodnotu NOAEL pri najnižšej hladine dávky. Intervaly dávkovania s faktorom dva až štyri sú často optimálne na stanovenie klesajúceho dávkovania a pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie veľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) medzi dávkami.

20.

Ak sa pozoruje všeobecná toxicita (napr. zníženie telesnej hmotnosti, účinky na pečeň, srdce, pľúca alebo obličky atď.) alebo iné zmeny, ktoré nemusia byť toxickou reakciou (napr. nižší príjem potravy, zväčšenie pečene), pozorované účinky na imunitné, neurologické alebo endokrinné citlivé parametre by sa mali interpretovať opatrne.

21.

Ak sa zistí, že test pri jednej hladine najmenej 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti za deň, alebo rovnocenné množstvo v percentách v strave alebo v pitnej vode (založené na určení telesnej hmotnosti) nespôsobil pri testovaných zvieratách žiadne toxické príznaky, a ak sa toxické účinky neočakávajú ani na základe údajov štruktúrne príbuzných chemikálií, potom sa nepovažuje za nevyhnutné uskutočniť celú štúdiu s použitím troch hladín. Výnimkou je prípad, keď expozícia človeka indikuje potrebu skúmania na vyššej hladine, a vtedy sa používa limitný test.

22.

Zvieratám sa podá dávka testovanej chemikálie každý deň sedem dní v týždni počas 28 dní. Ak je testovaná chemikália podávaná cez sondu, musí sa to realizovať v jednej dávke pre zviera za použitia žalúdočnej trubice alebo vhodnej intubačnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorazovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem nemá byť vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, okrem vodných roztokov, keď sa môže použiť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. S výnimkou dráždivých alebo žieravých chemikálií, ktoré zvyčajne pri vyšších koncentráciách spôsobia zhoršenie účinkov, variabilita v aplikovanom objeme sa minimalizuje tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vo všetkých dávkach.

23.

V prípade chemikálií podávaných v potrave alebo pitnej vode je dôležité zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej chemikálie neinterferovali s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. Ak je testovaná chemikália podávaná v potrave, môže sa použiť buď konštantná stravná koncentrácia (ppm) alebo konštantná úroveň dávkovania s ohľadom na telesnú hmotnosť zvierat; alternatívne používanie je potrebné špecifikovať. V prípade, keď sa chemikália podáva sondou, dávka sa podáva približne v rovnaký čas každý deň a prispôsobí sa podľa potreby, aby sa zachovala stála hladina dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť. Ak sa uskutoční predbežná štúdia pri opakovaných dávkach pred uskutočnením dlhodobej štúdie, je potrebné v oboch štúdiách použiť podobnú potravu.

24.

Pozorovanie trvá 28 dní. Zvieratá v satelitnej skupine, ktoré sa plánujú použiť pri ďalšom sledovaní, sa držia najmenej 14 dní bez akéhokoľvek podávania, aby bolo možné zistiť oneskorené toxické účinky alebo ich perzistenciu, alebo zotavenie sa po nich.

25.

Najmenej raz denne je nutné uskutočniť všeobecné klinické pozorovania, najlepšie vždy v tom istom čase s ohľadom na časový vrchol očakávaných účinkov po podaní. Zaznamenáva sa zdravotný stav zvierat. Najmenej dvakrát denne si treba všímať chorobnosť a úmrtnosť zvierat.

26.

Raz pred prvou expozíciou (je dovolené porovnanie jednotlivých zvierat medzi sebou) a potom najmenej raz týždenne sa uskutočňujú pri všetkých zvieratách podrobné klinické pozorovania. Uskutočňujú sa mimo domovských klietok v štandardnom priestore, pokiaľ možno, vždy v tom istom dennom čase. Musia byť pozorne zaznamenané, s použitím hodnotiaceho systému explicitne vymedzeného testovacím laboratóriom. Je potrebné zaistiť čo najmenšie zmeny testovacích podmienok a výhodné je, ak pozorovania vedie pozorovateľ, ktorý nepozná postup testovania. Medzi príznaky, ktoré je potrebné si všímať, patria zmeny na koži, srsti, očiach, sliznici, výskyt sekrécie, exkrécie a vegetatívnej aktivity (slzenie, piloerekcia, veľkosť zreničiek, nezvyčajné dýchanie), ale uvedené príznaky nie sú vyčerpávajúce. Zmeny v chôdzi, držaní tela a reakcii na zaobchádzanie, ako aj prítomnosť klonických alebo napätých pohybov, stereotypov (napr. opakované točenie sa), prílišné ošetrovanie sa alebo zvláštne správanie (napr. chôdza dozadu, sebaznetvorenie), sa takisto musia zaznamenať (2).

27.

Vo štvrtom týždni expozície sa uskutočňuje určenie zmyslovej reaktivity podnecovanej odlišnými spôsobmi (2) (napríklad zvukovými, zrakovými a proprioceptívnymi podnetmi) (3) (4) (5), určenie sily zovretia (6) a určenie motorickej aktivity (7). Ďalšie podrobnosti o postupoch, ktoré môžu nasledovať, sú uvedené v príslušných odkazoch. Možno však použiť aj iné alternatívne postupy k postupom, ktoré tu boli opísané.

28.

Funkčné pozorovania v štvrtom týždni expozície sa nemusia uskutočniť, ak je štúdia uskutočňovaná ako predbežná štúdia subchronickej štúdie (90 dní). V tomto prípade sa funkčné pozorovania uskutočnia v nasledujúcej štúdii. Na druhej strane, dostupnosť údajov o funkčných pozorovaniach zo štúdie opakovanej dávky zvyšujú možnosť výberu úrovní dávkovaných v nasledujúcej subchronickej štúdii.

29.

Výnimočne sa nemusia uskutočniť funkčné pozorovania ani pri skupinách, v ktorých sa inak preukážu toxické príznaky v takom rozsahu, že by mohli významne interferovať s uskutočnením funkčných testov.

30.

Pri pitve možno stanoviť estrálny cyklus všetkých samíc (nepovinné) odobratím vaginálnych sterov. Tieto pozorovania poskytnú informácie o fáze estrálneho cyklu v čase utratenia a pomôžu pri histologickom hodnotení tkanív citlivých na estrogény [pozri usmernenia o histopatológii (19)].

31.

Všetky zvieratá sa musia vážiť najmenej raz za týždeň. Meranie spotreby potravy sa robí najmenej raz za týždeň. Ak sa testovaná chemikália podáva vo vode na pitie, spotrebu vody je takisto potrebné merať aspoň raz za týždeň.

32.

Na konci testovacieho obdobia sa uskutočňujú tieto hematologické testy: hematokrit, koncentrácia hemoglobínu, počet erytrocytov, retikulocyty, celkový a diferenciálny počet leukocytov, počet trombocytov a meranie času/potenciálu zrážanlivosti krvi. Medzi ďalšie stanovenia, ktoré sa uskutočňujú, ak testovaná chemikália alebo jej predpokladané metabolity majú oxidačné vlastnosti alebo ak existuje podozrenie, že majú oxidačné vlastnosti, patrí koncentrácia methemoglobínu a Heinzove telieska.

33.

Vzorky krvi sa odoberajú zo stanoveného miesta tesne pred alebo počas postupu utratenia zvierat a uchovávajú sa za vhodných podmienok. Zvieratá sa noc pred utratením nekŕmia (7).

34.

Klinická biochémia skúma hlavné toxické účinky v tkanivách a najmä účinky na obličky a pečeň. Vyšetrenie sa uskutočňuje zo vzoriek krvi, ktoré sa odoberajú všetkým zvieratám tesne pred alebo počas postupu utratenia zvierat (okrem zvierat uhynutých a/alebo utratených pred dokončením štúdie). Vyšetrenie plazmy alebo séra zahŕňa sodík, draslík, glukózu, celkový cholesterol, močovinu, kreatinín, celkové proteíny a albumín, najmenej dva enzýmy indukujúce hepatocelulárne účinky (ako alanín-aminotransferáza, aspartát-aminotransferáza, alkalická fosfatáza, γ-glutamyl transpeptidáza a glutamát-dehydrogenáza) a žlčové kyseliny. Meranie ďalších enzýmov (hepatálneho alebo iného pôvodu) a bilirubínu môže za určitých okolností poskytnúť užitočné informácie.

35.

Nepovinne sa nasledujúce zistenia v analýzach moču môžu vykonať počas posledného týždňa štúdie a použije sa časový zber objemu moču: vzhľad, objem, osmolalita alebo špecifická váha, pH, bielkoviny, glukóza a krv/krvné bunky.

36.

Okrem toho by sa mali brať do úvahy aj štúdie na vyšetrovanie plazmových alebo sérových markerov v základných poškodených tkanivách. Ostatné zisťovanie je možné uskutočniť, ak poznáme vlastnosti testovanej chemikálie, ktoré môžu vplývať, alebo sa o nich predpokladá, že vplývajú na príbuzné metabolické profily zahrňujúce vápnik, fosfáty, triglyceridy, špecifické hormóny a cholínesterázu. Je ich potrebné identifikovať pre chemické látky v určitých skupinách alebo posúdiť prípad po prípade.

37.

Hoci v medzinárodnom hodnotení sledovaných parametrov súvisiacich s endokrinným systémom nebolo možné jednoznačne preukázať jednoznačnú výhodu určenia hormónov štítnej žľazy (T3, T4) a TSH, je vhodné zachovať vzorky plazmy alebo séra na meranie T3, T4 a TSH (nepovinné), ak je indikovaný účinok na os hypofýza – štítna žľaza. Tieto vzorky možno na účely skladovania zmraziť na teplotu – 20 °C. Variabilitu a absolútne koncentrácie hormonálnych ukazovateľov môžu ovplyvniť tieto faktory:

Definitívna identifikácia chemikálií s tyreoidnými účinkami je spoľahlivejšia na základe histopatologickej analýzy ako na základe hladín hormónov.

38.

Vzorky plazmy špecificky určené na stanovenie hladiny hormónov sa odoberú počas porovnateľných denných časov. Odporúča sa, aby sa zohľadnilo stanovenie hladín T3, T4 a TSH ovplyvnených na základe zmien tyreoidnej histopatológie. Číselné hodnoty získané analýzou koncentrácií hormónov sa v prípade použitia rozličných komerčných testovacích súprav líšia. Následne nemusí byť možné zabezpečiť výkonnostné kritériá založené na jednotných historických údajoch. Laboratóriá by sa namiesto toho mali usilovať, aby boli kontrolné variačné koeficienty nižšie ako 25 v prípade T3 a T4 a nižšie ako 35 v prípade TSH. Všetky koncentrácie sa zaznamenajú v ng/ml.

39.

Ak sú historické bazálne hodnoty nevhodné, zváži sa stanovenie premenných v oblasti hematológie a klinickej biochémie pred začatím dávkovania alebo podľa možnosti na skupine zvierat, ktoré neboli zaradené do pokusných skupín.

40.

Všetky zvieratá v štúdii budú predmetom úplnej detailnej všeobecnej pitvy, ktorá zahŕňa pozorné vyšetrenie vonkajšieho povrchu tela, všetkých telesných otvorov a lebečnej, hrudnej, brušnej dutiny a ich obsahu. Pečeň, obličky, nadobličky, semenníky, nadsemenníky, prostata + semenné mechúriky s koagulačnými žľazami ako celok, týmus, slezina, mozog a srdce zo všetkých zvierat (okrem tých, ktoré chradnú, a/alebo zvierat, ktoré boli utratené pred ukončením štúdie) by sa mali pitvať na priľnavej tkanine a je potrebné čo najrýchlejšie zistiť ich mokrú hmotnosť skôr, ako pri pitve vyschnú. Orgány prostaty je nutné pitvať veľmi opatrne, aby sa zabránilo prepichnutiu semenných mechúrikov naplnených tekutinou. Semenné mechúriky a prostata sa prípadne môžu pitvať a vážiť aj po fixácii.

41.

Okrem toho sa nepovinne môžu čo najskôr, aby sa zabránilo vyschnutiu, odvážiť ďalšie dve tkanivá: párové vaječníky (mokrá váha) a maternica vrátane krčka maternice [usmernenie o odstránení a príprave maternicových tkanív na meranie hmotnosti sa uvádza v dokumente OECD TG 440 (18)].

42.

Hmotnosť štítnej žľazy (nepovinné) sa môže určiť po fixácii. Úpravu je potrebné vykonať veľmi opatrne a až po fixácii, aby sa predišlo poškodeniu tkaniva. Poškodenie tkaniva by mohlo ohroziť histopatologickú analýzu.

43.

Tieto tkanivá by sa mali uchovávať v čo najvhodnejšom fixačnom médiu na obidva typy tkanív a na neskoršie histopatologické vyšetrenie (pozri odsek 47): všetky makroskopické poškodenia, mozog (reprezentatívne oblasti vrátane veľkého mozgu, mozočka a mosta), miecha, oko, žalúdok, tenké a hrubé črevo (vrátane Peyerových plakov), pečeň, obličky, nadobličky, slezina, srdce, týmus, štítna žľaza, priedušnica a pľúca (uskladnené nafúknutím s fixačným prostriedkom a potom ponorením), gonády (semenníky a vaječníky), vedľajšie pohlavné orgány (maternica a krčok maternice, nadsemenníky, prostata + semenné mechúriky s koagulačnými žľazami), vagína, močový mechúr, lymfatické uzliny [okrem najbližšej odvodňovacej uzliny by sa mala odobrať ešte jedna lymfatická uzlina podľa praxe laboratória (15)], periférny nerv (sedací alebo tibiálny) podľa možnosti čo najbližšie k svalu, kostrový sval a kosť, s kostnou dreňou (prierez alebo čerstvo odobratá vzorka kostnej drene). Odporúča sa fixovať semenníky ponorením do Bouinovho alebo modifikovaného Davidsonovho fixačného prostriedku (16) (17). Obal tunica albuginea je potrebné opatrne a plytko prepichnúť ihlou na oboch stranách orgánu, aby sa umožnilo rýchle napustenie fixačným prostriedkom. Z klinických a iných nálezov môže vyplynúť potreba vyšetrenia ďalších následných tkanív. Takisto by sa mali zachovať všetky orgány, ktoré vzhľadom na známe vlastnosti testovanej chemikálie možno považovať za cieľové orgány.

44.

Tieto tkanivá môžu poskytnúť cenné údaje o účinkoch na endokrinný systém: gonády (vaječníky a semenníky), vedľajšie pohlavné orgány (maternica vrátane krčka maternice, nadsemenníky, semenné mechúriky s koagulačnými žľazami, dorzolaterálna a ventrálna prostata), vagína, hypofýza, samčia prsná žľaza, štítna žľaza a nadoblička. Zmeny na samčích prsných žľazách nie sú dostatočne zdokumentované, ale tento parameter môže byť veľmi citlivý na látky s estrogénovým pôsobením. Pozorovanie orgánov/tkanív, ktoré nie sú vymenované v odseku 43, je nepovinné (pozri dodatok 2).

45.

V Usmernení o histopatológii (19) sa uvádzajú ďalšie podrobnosti o pitvaní, fixácii, vykonávaní rezov a histopatológii endokrinných tkanív.

46.

V rámci medzinárodného testovacieho programu boli získané dôkazy o tom, že nepatrné endokrinné účinky chemikálií s nízkou potenciou účinku na homeostázu pohlavných hormónov je možné určiť skôr na základe narušenia synchronizácie estrálneho cyklu v rôznych tkanivách a menej na základe zrejmých histopatologických zmien na samičích pohlavných orgánoch. Aj keď sa nezískal žiadny konečný dôkaz o takýchto účinkoch, pri interpretácii histopatológie vaječníkov (folikulárnych, tekálnych a granulóznych buniek), maternice, krčka maternice a vagíny sa odporúča brať do úvahy znaky možnej asynchrónnosti estrálneho cyklu. Ak sa hodnotí štádium cyklu podľa vaginálnych sterov, takisto ho možno zahrnúť do tohto porovnania.

47.

Úplná histopatológia sa uskutoční na uskladnených orgánoch a tkanivách všetkých zvierat v kontrolnej skupine a v skupinách s vysokými dávkami. Tieto skúšky sa rozšíria o zvieratá zo všetkých skupín s odlišným dávkovaním, ak boli zistené zmeny v skupine s vysokými dávkami.

48.

Preskúmajú sa všetky závažné poškodenia.

49.

Ak boli použité satelitné skupiny, histopatológia sa vykoná na tkanivách a orgánoch, pri ktorých boli v testovaných skupinách zistené účinky.

50.

Je potrebné uviesť jednotlivé údaje. Navyše všetky údaje sa musia zhrnúť v tabuľkovej forme, pričom ukazujú pre každú testovanú skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat uhynutých počas testu alebo utratených z humánnych dôvodov, čas uhynutia alebo utratenia jednotlivých zvierat, počet zvierat, pri ktorých sa prejavili príznaky toxicity, opis pozorovaných príznakov toxicity vrátane nástupu, trvania a závažnosti toxických účinkov, počet zvierat vykazujúcich poškodenie, typy poškodení, ich závažnosť a percentuálne množstvo zvierat, pri ktorých sa prejavil daný typ poškodenia.

51.

Ak je to možné, číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne akceptovateľnou štatistickou metódou. Porovnávanie účinkov podľa rozsahu dávkovania má zamedziť používaniu opakovaných t-testov. Štatistické metódy by sa mali vybrať počas prípravnej fázy štúdie.

52.

Na účely kontroly kvality sa navrhuje, aby sa zozbierali historické kontrolné údaje a aby sa vypočítali variačné koeficienty pre číselné údaje, najmä pre parametre spojené s detekciou endokrinného disruptora. Tieto údaje sa môžu použiť pre porovnanie, keď sa vyhodnocujú jednotlivé štúdie.

53.

Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:

1.

OECD (Paríž, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.

2.

IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.

3.

Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: s. 999 – 1003.

4.

Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: s. 691 – 704.

5.

Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: s. 267 – 283.

6.

Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: s. 233 – 236.

7.

Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: s. 599 – 609.

8.

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10. – 11. marca 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

9.

OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No. 59, ENV/JM/MONO(2006)26.

10.

OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.

11.

OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html.

12.

OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.

13.

OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.

14.

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

15.

Haley, P., Perry, R., Ennulat, D., Frame, S., Johnson, C., Lapointe, J.-M., Nyska, A., Snyder, P. W., Walker, D., Walter, G. (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: s. 404 – 407.

16.

Hess, R. A., Moore, B. J. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, s. 52 – 85.

17.

Latendresse, J. R., Warbrittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. (2002). Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, s. 524 – 533.

18.

OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.

19.

OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.

1.

Táto testovacia metóda je rovnocenná s Usmerneniami OECD na vykonávanie testov TG 412 (2009). Pôvodné usmernenia na vykonávanie testov subakútnej inhalačnej toxicity 412 (TG 412) boli prijaté v roku 1981 (1). Táto testovacia metóda B.8 (ako rovnocenná verzia revidovaných usmernení TG 412) bola aktualizovaná, aby odrážala stav vedy a spĺňala súčasné a budúce regulačné potreby.

2.

Táto metóda umožňuje opísať nepriaznivé účinky po opakovanej dennej inhalačnej expozícii testovanej chemikálii počas 28 dní. Údaje odvodené z 28-dňových štúdií subakútnej inhalačnej toxicity sa môžu použiť pri kvantitatívnom hodnotení rizík [ak nenasleduje 90-dňová štúdia subchronickej inhalačnej toxicity (kapitola B.29 tejto prílohy)]. Údaje môžu takisto poskytnúť informácie o výbere koncentrácií pre dlhodobejšie štúdie, ako je napríklad 90-dňová štúdia subchronickej inhalačnej toxicity. Táto testovacia metóda nie je špecificky určená na testovanie nanomateriálov. Vymedzenie pojmov použitých v súvislosti s touto testovacou metódou je uvedené na konci tejto kapitoly a v usmerňovacom dokumente 39 (2).

3.

Pred samotným vykonaním štúdie testovacie laboratórium zváži všetky dostupné informácie o testovanej chemikálii s cieľom zlepšiť kvalitu štúdie a minimalizovať využívanie zvierat. Informácie, ktoré môžu pomôcť pri výbere vhodných testovacích koncentrácií, zahŕňajú identitu, chemickú štruktúru a fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie; výsledky všetkých testov toxicity in vitro alebo in vivo; predpokladané použitie (použitia) a potenciál pre expozíciu ľudí; dostupné údaje (Q)SAR, toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach a údaje odvodené z testov akútnej inhalačnej toxicity. Ak sa očakávajú alebo ak sa v priebehu štúdie objavia príznaky neurotoxicity, vedúci štúdie môže rozhodnúť o zahrnutí vhodných hodnotení, ako je napríklad funkčná pozorovacia batéria (FOB) a meranie motorickej aktivity. Aj keď je pri určitých testoch rozhodujúce načasovanie expozícií, tieto dodatočné činnosti nesmú narušiť základný plán štúdie.

4.

Riedenie žieravých alebo dráždivých testovaných chemikálií sa môže testovať pri koncentráciách, ktoré budú vykazovať želanú mieru toxicity [pozri dokument GD 39 (2)]. Pri vystavovaní zvierat pôsobeniu týchto materiálov musia byť cieľové koncentrácie dostatočne nízke, aby nespôsobovali výraznú bolesť ani utrpenie, a zároveň dostatočné na predĺženie krivky závislosti reakcie od koncentrácie na úroveň, na ktorej sa zabezpečí regulačný a vedecký cieľ testu. Tieto koncentrácie by sa mali vybrať v závislosti od jednotlivých prípadov, pokiaľ možno podľa vhodne navrhnutej štúdie na zistenie rozsahu, ktorá poskytuje informácie o kritickom parametri, každom prahu dráždivosti a čase nástupu príznakov (pozri odseky 11 – 13). Je potrebné zdôvodniť výber koncentrácie.

5.

Moribundné zvieratá alebo zvieratá, ktoré majú očividne silné bolesti alebo vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, by sa mali humánnym spôsobom usmrtiť. Moribundné zvieratá sa posudzujú rovnako ako zvieratá, ktoré uhynú počas testovania. Kritériá na rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom usmerňovacieho dokumentu OECD o humánnych parametroch (Humane Endpoints Guidance Document) (3).

6.

Používajú sa zdravé mladé dospelé hlodavce bežne používaných laboratórnych kmeňov. Preferovaným druhom je potkan. Použitie iných druhov je potrebné zdôvodniť.

7.

Používajú sa samice, ktoré nikdy nevrhli mláďatá a sú negravidné. V deň randomizácie majú byť zvieratá mladé dospelé jedince vo veku sedem až deväť týždňov. Telesná hmotnosť má byť v rozsahu ± 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia. Zvieratá sú náhodne vybraté, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia, a držia sa v klietkach aspoň päť dní pred začiatkom testu, aby sa im umožnila aklimatizácia na laboratórne podmienky.

8.

Zvieratá musia byť jednotlivo identifikované, najlepšie pomocou podkožných transpondérov, aby sa zjednodušilo pozorovanie a zamedzilo zámenám. Teplota miestnosti, kde sa pokusné zviera chová, by mala byť 22 ± 3 °C. Relatívna vlhkosť by sa v ideálnom prípade mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, hoci to nemusí byť možné, ak sa ako nosič používa voda. Pred a po expozícii sú zvieratá zvyčajne umiestnené v klietkach v skupinách podľa pohlavia a koncentrácie, ale počet zvierat v jednej klietke by nemal prekážať bezproblémovému pozorovaniu každého zvieraťa, pričom by sa mali minimalizovať straty súvisiace so vzájomným požieraním alebo bojom jedincov. V prípade, že sa použije iba expozícia oblasti nosa, môže byť potrebné, aby sa zvieratá aklimatizovali na skúmavky obmedzujúce pohyb. Obmedzujúce skúmavky by nemali zvieratám spôsobovať neprimeraný stres súvisiaci s fyzikálnymi vlastnosťami, teplotou alebo obmedzením pohybu. Obmedzenie môže mať vplyv na fyziologické sledované parametre, ako sú telesná teplota (hypertermia) a/alebo respiračný minútový objem. Ak sú k dispozícii všeobecné údaje, podľa ktorých k takýmto zmenám nedochádza vo veľkej miere, potom obmedzujúce skúmavky nie je potrebné vopred upraviť. Zvieratá vystavené účinkom aerosólu celým telom by sa mali v priebehu expozície umiestniť samostatne, aby sa zabránilo filtrovaniu testovaného aerosólu cez srsť ostatných zvierat v klietke. S výnimkou času trvania expozície sa na kŕmenie môže používať bežné a osvedčené laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou miestnej pitnej vody. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.

9.

Pri výbere inhalačnej komory by sa mal vziať do úvahy charakter testovanej chemikálie a predmet testu. Uprednostňuje sa expozícia oblasti nosa (pričom tento pojem zahŕňa iba expozíciu hlavy, nosa alebo pysku). Vo všeobecnosti sa pri štúdiách kvapalných alebo tuhých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly, uprednostňuje expozícia oblasti nosa. Špeciálne ciele štúdie možno lepšie dosiahnuť použitím expozície celého tela, ale tento krok je potrebné v správe o štúdii odôvodniť. Na zabezpečenie stability prostredia pri používaní komory na expozíciu celého tela by celkový objem testovaných zvierat nemal presiahnuť 5 % objemu komory. Princípy metód expozície celého tela a oblasti nosa a ich konkrétne výhody a nevýhody sú opísané v dokumente GD 39 (2).

10.

Na rozdiel od štúdií akútnej toxicity nie sú pre 28-dňové štúdie subakútnej inhalačnej toxicity stanovené žiadne limitné koncentrácie. Pri maximálnej testovanej koncentrácii je potrebné zvážiť: 1. maximálnu dosiahnuteľnú koncentráciu; 2. najhorší možný prípad úrovne expozície ľudí; 3. potrebu zachovať primeraný prísun kyslíka a/alebo 4. otázky týkajúce sa dobrých životných podmienok zvierat. V prípade chýbajúcich limitov založených na údajoch sa môžu použiť akútne limity podľa nariadenia (ES) č. 1272/2008 (13) (t. j. až do maximálnej koncentrácie 5 mg/l v prípade aerosólov, 20 mg/l v prípade pár a 20 000 ppm v prípade plynov); pozri dokument GD 39 (2). Ak je nutné prekročiť tieto limity pri testovaní plynov alebo vysokoprchavých testovaných chemikálií (napr. chladiace látky), je potrebné uviesť odôvodnenie. Z limitnej koncentrácie by sa mala vyvodiť jednoznačná toxicita bez toho, aby sa zvieratám spôsoboval neprimeraný stres alebo aby bola ovplyvnená dĺžka ich života (3).

11.

Pred začiatkom základnej štúdie môže byť potrebné vykonať štúdiu na zistenie rozsahu. Štúdia na zistenie rozsahu je komplexnejšia ako predbežná štúdia, lebo sa neobmedzuje na výber koncentrácie. Poznatky získané zo štúdie na zistenie rozsahu môžu viesť k úspešnej základnej štúdii. Štúdia na zistenie rozsahu môže napríklad poskytnúť technické informácie o analytických metódach, rozdelení veľkosti častíc, odhalení toxických mechanizmov, klinickej patológii a histopatologických údajoch a odhadoch koncentrácií NOAEL a MTC v základnej štúdii. Vedúci štúdie sa môže rozhodnúť pre štúdiu na zistenie rozsahu s cieľom identifikovať prah dráždivosti dýchacích ciest (napr. histopatológiou dýchacích ciest, testovaním fungovania pľúc alebo bronchoalveolárnou lavážou), hornú koncentráciu tolerovanú bez toho, aby spôsobovala zvieratám neprimeraný stres, a parametre, ktoré najlepšie charakterizujú toxicitu testovanej chemikálie.

12.

Štúdia na zistenie rozsahu môže pozostávať z jednej alebo viacerých úrovní koncentrácie. Každej úrovni koncentrácie by mali byť vystavené nie viac ako tri samce a tri samice. Štúdia na zistenie rozsahu by mala trvať minimálne päť dní a zvyčajne nie viac ako 14 dní. V správe o štúdii sa uvedú dôvody výberu koncentrácií pre základnú štúdiu. Cieľom základnej štúdie je preukázať vzťah koncentrácie a reakcie založený na parametri, ktorý je podľa očakávaní najcitlivejší. Nízka koncentrácia by mala ideálne predstavovať koncentráciu bez pozorovaného účinku, zatiaľ čo z vysokej koncentrácie by sa mala vyvodiť jednoznačná toxicita bez toho, aby sa zvieratám spôsoboval neprimeraný stres alebo aby bola ovplyvnená dĺžka ich života (3).

13.

Pri výbere úrovní koncentrácie pre štúdiu na zistenie rozsahu je potrebné zvážiť všetky dostupné informácie vrátane vzťahov štruktúry a aktivity a údajov o podobných látkach (pozri odsek 3). Štúdia na zistenie rozsahu môže potvrdiť/vyvrátiť parametre, ktoré sa považujú za najcitlivejšie mechanisticky založené parametre, napr. cholínesterázna inhibícia prostredníctvom organofosfátov, tvorba methemoglobínu prostredníctvom erytrocytotoxických činiteľov, hormóny štítnej žľazy (T3, T4) v prípade látok toxických pre štítnu žľazu, proteín, LDH alebo neutrofily pri bronchoalveolárnej laváži v prípade neškodných slabo rozpustných častíc alebo aerosólov dráždivých pre pľúca.

14.

Základná štúdia subakútnej toxicity vo všeobecnosti pozostáva z troch úrovní koncentrácie a podľa potreby aj zo súbežných negatívnych (vzduchových) kontrol a/alebo kontrol nosiča (pozri odsek 17). Pri výbere vhodných úrovní expozície je potrebné použiť všetky dostupné údaje vrátane výsledkov štúdií systémovej toxicity, metabolizmu a kinetiky (osobitne treba dbať na to, aby sa nepoužívali vysoké úrovne koncentrácie, ktoré nasycujú kinetické procesy). Každá testovacia skupina je zložená aspoň z desiatich hlodavcov (piatich samcov a piatich samíc), ktoré sú exponované testovanej chemikálii šesť hodín denne päť dní v týždni počas štyroch týždňov (celkové trvanie štúdie 28 dní). Zvieratá môžu byť pôsobeniu chemikálie vystavené aj sedem dní v týždni (napr. pri testovaní inhalovaných liekov). Ak je o jednom z pohlaví známe, že je voči danej testovanej chemikálii vnímavejšie, môžu byť pohlavia vystavené rôznym úrovniam koncentrácie, aby sa optimalizovala reakcia na koncentráciu podľa opisu v odseku 15. Ak sa v prípade iných hlodavcov ako potkanov použije expozícia oblasti nosa, maximálne trvanie expozície je možné prispôsobiť s cieľom minimalizovať druhovo špecifické utrpenie. Pri použití intervalu expozície v trvaní menej ako šesť hodín denne, alebo ak je potrebné vykonať štúdiu expozície celého tela s dlhým intervalom (napr. 22 hodín denne), treba uviesť odôvodnenie [pozri dokument GD 39 (2)]. Počas trvania expozície by sa zviera nemalo kŕmiť, ak expozícia nepresiahne šesť hodín. V priebehu celej expozície celého tela sa zvieraťu môže podať voda.

15.

Pomocou vybratých cieľových koncentrácií by sa mal identifikovať cieľový orgán (orgány) a preukázať zrejmá reakcia na koncentráciu:

16.

Satelitná štúdia (štúdia reverzibility) sa môže použiť na pozorovanie reverzibility, pretrvávania alebo oneskoreného výskytu toxicity počas primerane dlhého obdobia po skončení testovania, najmenej však počas 14 dní. Satelitné skupiny (reverzibility) pozostávajú z piatich samcov a piatich samíc, ktoré sú exponované súbežne s pokusnými zvieratami v základnej štúdii. Skupiny satelitnej štúdie (reverzibility) sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie pri najvyššej úrovni koncentrácie a súbežne sa podľa potreby vykonávajú vzduchové kontroly a/alebo kontroly nosiča (pozri odsek 17).

17.

S kontrolnými zvieratami súbežných negatívnych (vzduchových) kontrol sa zaobchádza rovnako ako so zvieratami testovacej skupiny s tou výnimkou, že sú vystavené filtrovanému vzduchu a nie testovanej chemikálii. Ak sa pri vytváraní testovacieho ovzdušia používa voda alebo iná látka, do štúdie je potrebné namiesto negatívnej (vzduchovej) kontrolnej skupiny zahrnúť kontrolnú skupinu nosiča. Vždy, keď je to možné, sa ako nosič použije voda. Ak sa ako nosič použije voda, kontrolné zvieratá by mali byť exponované vzduchu s rovnakou relatívnou vlhkosťou ako exponované skupiny exponované testovanej chemikálii. Výber vhodného nosiča by mal byť založený na primerane vykonanej predbežnej štúdii alebo na historických údajoch. Ak nie je toxicita nosiča dostatočne známa, vedúci štúdie sa môže rozhodnúť použiť negatívnu (vzduchovú) kontrolu aj kontrolu nosiča, ale tento postup sa vyslovene neodporúča. Ak z historických údajov vyplýva, že nosič nie je toxický, negatívna (vzduchová) kontrolná skupina nie je potrebná a mala by sa použiť iba kontrola nosiča. Ak sa pri predbežnej štúdii testovanej chemikálie pripravenej v nosiči nezistí žiadna toxicita, znamená to, že nosič pri testovanej koncentrácii nie je toxický a táto kontrola nosiča by sa mala použiť.

18.

Zvieratá sú vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie vo forme plynu, pary, aerosólu alebo ich kombinácie. Fyzikálne skupenstvo, ktoré sa testuje, závisí od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie, zvolenej koncentrácie a/alebo najpravdepodobnejšej fyzikálnej formy pri manipulácii a používaní testovanej chemikálie. Hygroskopické a chemicky reaktívne testované chemikálie by sa mali testovať v podmienkach suchého vzduchu. Treba dbať na to, aby sa nevytvorili výbušné koncentrácie. Tuhé materiály môžu byť podrobené mechanickým procesom na zmenšenie veľkosti častíc. Ďalšie usmernenia sa nachádzajú v dokumente GD 39 (2).

19.

Častice my sa mali rozdeliť podľa veľkosti v prípade všetkých aerosólov a pár, ktoré môžu kondenzovať a vytvárať aerosóly. Na umožnenie expozície všetkých relevantných oblastí dýchacej sústavy sa odporúčajú aerosóly so stredným aerodynamickým hmotnostným priemerom (MMAD) v rozsahu od 1 do 3 μm so štandardnou odchýlkou geometrického priemeru (σg) v rozsahu od 1,5 do 3,0 (4). Hoci by sa malo vynaložiť primerané úsilie na dodržanie tejto normy, pokiaľ túto podmienku nie je možné splniť, treba predložiť odborný posudok. Napríklad v prípade kovových dymov môžu byť častice menšie, ako stanovuje táto norma, a nabité častice a vlákna môžu túto normu prekračovať.

20.

V ideálnom prípade sa testovaná chemikália testuje bez nosiča. Ak je nevyhnutné použiť nosič, aby sa dosiahla vhodná koncentrácia a veľkosť častíc testovanej chemikálie, uprednostňuje sa voda. Vždy, keď je testovaná chemikália rozpustená v nosiči, je potrebné preukázať jej stabilitu.

21.

Prúdenie vzduchu cez expozičnú komoru by sa počas každej expozície malo dôkladne kontrolovať, nepretržite monitorovať a zaznamenávať aspoň raz za hodinu. Monitorovanie koncentrácie testovacieho ovzdušia v reálnom čase (alebo dočasnej stability) je integrálne meranie všetkých dynamických parametrov a poskytuje nepriamy prostriedok kontroly všetkých relevantných dynamických inhalačných parametrov. Ak sa koncentrácia monitoruje v reálnom čase, frekvencia meraní prúdenia vzduchu sa môže obmedziť na jedno meranie na expozíciu za deň. Je potrebné venovať osobitnú pozornosť tomu, aby v komorách na expozíciu oblasti nosa nedochádzalo k opätovnému vdychovaniu. Koncentrácia kyslíka by mala byť minimálne 19 % a koncentrácia oxidu uhličitého by nemala presiahnuť 1 %. Ak existuje dôvod domnievať sa, že túto normu nie je možné splniť, koncentrácie kyslíka a oxidu uhličitého by sa mali zmerať. Ak merania v prvý deň expozície preukážu, že úrovne týchto plynov sú správne, ďalšie merania nie sú nutné.

22.

Teplotu v komore je potrebné udržiavať na úrovni 22 ± 3 °C. Relatívnu vlhkosť v dýchacej zóne zvierat pri expozícii oblasti nosa aj pri expozícii celého tela je potrebné počas každej expozície nepretržite monitorovať a podľa možnosti raz za hodinu zaznamenávať. Relatívna vlhkosť by sa podľa možnosti mala udržiavať v rozsahu od 30 do 70 %, ale môže sa stať, že táto hodnota bude nedosiahnuteľná (napr. v prípade testovania zmesí na báze vody) alebo nemerateľná z dôvodu interferencie testovanej chemikálie a testovacej metódy.

23.

Vždy, keď je to možné, by sa mala vypočítať a zaznamenať nominálna koncentrácia expozície v komore. Nominálna koncentrácia je hmotnosť vytvorenej testovanej chemikálie vydelená celkovým objemom vzduchu, ktorý prešiel systémom inhalačnej komory. Nominálna koncentrácia sa nepoužíva na charakterizáciu expozície zvierat, ale porovnanie nominálnej a skutočnej koncentrácie vypovedá o účinnosti vytvárania testovacieho systému, a teda sa môže použiť na zistenie problémov s tvorbou.

24.

Skutočná koncentrácia je koncentrácia testovanej chemikálie odobratej z dýchacej zóny zvierat v inhalačnej komore. Skutočné koncentrácie možno získať špecifickými metódami (napr. priamym odberom vzorky, adsorpčnými alebo chemicky reaktívnymi metódami a následnou analytickou charakterizáciou) alebo nešpecifickými metódami, ako je gravimetrická filtrová analýza. Použitie gravimetrickej analýzy je prípustné iba v prípade jednozložkových práškových aerosólov alebo aerosólov kvapalín s nízkou prchavosťou, pričom je potrebné túto analýzu podložiť primeranými testovými charakterizáciami predbežných štúdií týkajúcich sa konkrétnej chemikálie. Koncentráciu viaczložkových práškových aerosólov takisto možno stanoviť prostredníctvom gravimetrickej analýzy. V tom prípade sú však potrebné analytické údaje, ktoré dokazujú, že zloženie materiálu vo vzduchu je podobné ako zloženie východiskového materiálu. Ak tieto informácie nie sú dostupné, môže byť potrebná opätovná analýza testovanej chemikálie (ideálne v jej skupenstve v ovzduší) v pravidelných intervaloch v priebehu štúdie. V prípade aerosólových látok, ktoré sa môžu vypariť alebo môžu sublimovať, by sa malo preukázať, že všetky fázy sa zhromaždili pomocou zvolenej metódy.

25.

Ak je to možné, počas celej štúdie by sa mala použiť jedna dávka testovanej chemikálie, pričom testovaná vzorka by sa mala uskladniť za podmienok, za ktorých sa zachová jej čistota, homogenita a stabilita. Pred začatím štúdie by mala byť k dispozícii charakterizácia testovanej chemikálie vrátane jej čistoty a, ak je to technicky možné, identity a množstiev identifikovaných kontaminantov a prímesí. Charakterizáciu možno preukázať napríklad týmito údajmi: retenčný čas a relatívna plocha píku, molekulová hmotnosť získaná pomocou analýzy hmotnostnej spektrometrie alebo plynovej chromatografie alebo iné odhady. Hoci za identitu testovanej vzorky testovacie laboratórium nenesie zodpovednosť, je vhodné, aby testovacie laboratórium aspoň čiastočne potvrdilo charakterizáciu poskytnutú dodávateľom (napr. farbu, fyzikálne skupenstvo atď.).

26.

Podľa možnosti je potrebné udržiavať ovzdušie pri expozícii konštantné. Na preukázanie stability podmienok expozície sa môže použiť zariadenie na monitorovanie v reálnom čase, ako napríklad aerosólový fotometer pre aerosóly alebo komplexný uhľovodíkový analyzátor pre pary. Skutočná koncentrácia v komore by sa mala merať aspoň tri razy v každý deň expozície a pri každej úrovni expozície. Ak to pre nízky prietok vzduchu alebo nízke koncentrácie nie je možné, je prijateľný jeden odber vzorky počas intervalu expozície. V takom prípade by sa mala táto vzorka podľa možnosti odoberať za celé trvanie expozície. Jednotlivé vzorky koncentrácie v komore by sa nemali od strednej koncentrácie v komore odchýliť o viac ako ± 10 % v prípade plynov a pár a o viac ako ± 20 % v prípade kvapalných alebo tuhých aerosólov. Čas na dosiahnutie rovnováhy v komore (t95) by sa mal vypočítať a mala by o ňom podať správa. Interval expozície zahŕňa čas, keď sa testovaná chemikália tvorí. Zohľadňuje sa pri tom čas potrebný na dosiahnutie rovnováhy v komore (t95) a čas rozpadu. Usmernenia k odhadovaniu t95 sú uvedené v dokumente GD 39 (2).

27.

V prípade veľmi komplexných zmesí tvorených plynmi/parami a aerosólov (napr. spaľovacieho ovzdušia a testovaných chemikálií poháňaných účelovými výrobkami/zariadeniami koncového použitia) sa v inhalačnej komore môže každá fáza správať inak. Preto by sa pre každú fázu (plyn/para a aerosól) mala vybrať aspoň jedna látka slúžiaca ako ukazovateľ (analyt), obyčajne hlavná aktívna látka v zmesi. Ak je testovaná chemikália zmes, v správe by sa mala uviesť analytická koncentrácia celej zmesi, nielen aktívnej látky alebo látky slúžiacej ako ukazovateľ (analyt). Ďalšie informácie týkajúce sa skutočných koncentrácií sú uvedené v dokumente GD 39 (2).

28.

Rozdelenie veľkosti častíc aerosólov by sa pri každej úrovni koncentrácie malo stanoviť aspoň raz za týždeň, a to pomocou kaskádového impaktora alebo alternatívneho prístroja, ako je napríklad aerodynamický spektrometer častíc (APS). Ak možno preukázať rovnocennosť výsledkov získaných pomocou kaskádového impaktora a alternatívneho prístroja, potom sa alternatívny prístroj môže používať počas celej štúdie.

29.

Druhé zariadenie, ako je gravimetrický filter alebo impinger/premývačka, by sa malo použiť súbežne s hlavným prístrojom na potvrdenie zachytávacej účinnosti hlavného prístroja. Hmotnostná koncentrácia získaná analýzou veľkosti častíc by mala byť v rozsahu primeraných limitov hmotnostnej koncentrácie získanej filtrovou analýzou [pozri dokument GD 39 (2)]. Ak možno preukázať rovnocennosť pri všetkých koncentráciách testovaných v počiatočnej fáze štúdie, nie je potrebné vykonávať ďalšie potvrdzujúce merania. V záujme zabezpečenia dobrých životných podmienok pre zvieratá by sa mali prijať opatrenia na minimalizáciu nejednoznačných údajov, ktoré môžu viesť k potrebe opakovať štúdiu.

30.

Rozdelenie veľkosti častíc by sa malo vykonať v prípade pár, ak existuje možnosť, že kondenzácia pary môže mať za následok tvorbu aerosólu, alebo ak sa v ovzduší pár zistia častice s potenciálom zmiešaných fáz.

31.

Zvieratá by sa mali pred, počas a po skončení expozície klinicky pozorovať. V závislosti od reakcie zvierat počas expozície môžu byť potrebné častejšie pozorovania. Ak pozorovaniu zvierat bráni používanie skúmaviek obmedzujúcich pohyb zvierat, slabo osvetlených komôr na expozíciu celého tela alebo nepriehľadné ovzdušie, zvieratá by sa mali dôkladne preskúmať po skončení expozície. Na základe pozorovaní pred expozíciou v nasledujúcom dni možno zhodnotiť akúkoľvek reverzibilitu alebo zhoršenie toxických účinkov.

32.

Všetky pozorovania sa zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam. Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.

33.

Pozorovania v klietkach sa zameriavajú na zmeny kože a srsti, očí, slizníc, dýchania a krvného obehu, zmeny nervového systému, somatomotoriky a správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Meraním rektálnej teploty možno získať dôkazy svedčiace o reflexnej bradypney alebo hypo/hypertermii, ktoré súvisia s testovaním alebo s obmedzením pohybu. Protokol o štúdii môže zahŕňať ďalšie hodnotenia, ako je napríklad kinetika, biomonitorovanie, funkcia pľúc, zadržiavanie slabo rozpustných materiálov, ktoré sa hromadia v pľúcnom tkanive, a zmeny správania.

34.

Hmotnosť jednotlivých zvierat je potrebné zaznamenať krátko pred prvou expozíciou (deň 0), potom dvakrát týždenne (napríklad: piatky a pondelky, aby sa preukázalo zotavenie po víkende bez expozícií, alebo v časovom intervale, ktorý umožňuje hodnotenie systémovej toxicity) a v čase uhynutia alebo utratenia. Ak sa v prvých dvoch týždňoch neobjavia žiadne účinky, po zvyšok štúdie sa môže telesná hmotnosť merať raz za týždeň. Satelitné zvieratá (na štúdiu reverzibility, ak sa použijú) sa naďalej vážia raz za týždeň počas celého obdobia zotavovania. Na konci štúdie by sa všetky zvieratá mali krátko pred utratením odvážiť, aby sa získali neskreslené vypočítané pomery hmotnosti orgánov k telu.

35.

Spotreba potravy by sa mala merať raz za týždeň. Môže sa merať aj spotreba vody.

36.

Hodnotenia klinickej patológie sa po utratení vykonávajú pri všetkých zvieratách vrátane kontrolných a satelitných zvierat. Je potrebné zaznamenať časový interval medzi skončením expozície a odberom krvi, najmä ak je rekonštitúcia sledovaného parametra rýchla. Odber vzoriek po skončení expozície je indikovaný pri tých parametroch, ktoré majú krátky biologický polčas v plazme (napr. COHb, CHE a MetHb).

37.

V tabuľke 1 sa uvádza zoznam parametrov klinickej patológie, ktoré sa vo všeobecnosti požadujú pri všetkých toxikologických štúdiách. Rozbor moču sa bežne nevyžaduje, ale môže sa vykonať, ak sa na základe očakávanej alebo pozorovanej toxicity predpokladá, že bude užitočný. Vedúci štúdie sa môže rozhodnúť hodnotiť ďalšie parametre s cieľom lepšie charakterizovať toxicitu testovanej chemikálie (napr. cholínesteráza, lipidy, hormóny, acidobázická rovnováha, methemoglobín alebo Heinzove telieska, kreatinkináza, pomer myelocytov a erytrocytov, troponíny, plyny v arteriálnej krvi, laktát-dehydrogenáza, sorbitol-dehydrogenáza, glutamát-dehydrogenáza a gama-glutamyl transpeptidáza).

Tabuľka 1

Štandardné parametre klinickej patológie

38.

Ak existuje dôkaz, že hlavným miestom usadzovania a zachytávania sú dolné dýchacie cesty (t. j. alveoly), ako metóda kvantitatívnej analýzy hypotetických parametrov účinnosti dávky zameranej na hypersenzitívnu pneumonitídu, zápal pľúc a fosfolipidózu sa môže zvoliť bronchoalveolárna laváž (BAL). Tá umožňuje primerane preskúmať priebežné zmeny alveolárneho poškodenia súvisiace so závislosťou reakcie od dávky. Z tekutiny bronchoalveolárnej laváže sa môže analyzovať celkový a diferenciálny počet leukocytov, celkový obsah bielkovín a laktát-dehydrogenáza. Ďalej sa môžu zvážiť parametre indikujúce lyzozomálne poškodenie, fosfolipidózu, fibrózu a dráždivé alebo alergické zápaly, ktoré môžu zahŕňať stanovenie zápalových cytokínov/chemokínov. Merania BAL vo všeobecnosti dopĺňajú výsledky histopatologických testov, nemôžu ich však nahradiť. Usmernenia o postupe pľúcnej laváže sú uvedené v dokumente GD 39 (2).

39.

Všetky testované zvieratá vrátane tých, ktoré uhynú počas testu alebo sa vylúčia zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá, sa podrobujú úplnému vykrveniu (ak je uskutočniteľné) a makroskopickej autopsii. Pri každom zvierati sa zaznamená čas medzi skončením poslednej expozície a utratením. Ak nie je možné vykonať autopsiu ihneď po objavení uhynutého zvieraťa, zviera sa schladí (nie zmrazí) na dostatočne nízku teplotu, aby sa minimalizovala autolýza. Autopsie by sa mali vykonať čo najskôr, zvyčajne v priebehu jedného alebo dvoch dní. Pri každom zvierati sa zaznamenajú všetky makroskopické patologické zmeny, pričom osobitná pozornosť sa venuje akýmkoľvek zmenách v dýchacej sústave.

40.

V tabuľke 2 sa uvádza zoznam orgánov a tkanív, ktoré je počas makroskopickej pitvy potrebné zachovať vo vhodnom médiu na účely histopatologického vyšetrenia. O uchovaní orgánov a tkanív [v zátvorke] a všetkých ostatných orgánov a tkanív rozhodne vedúci štúdie. Orgány vyznačené tučným písmom by sa mali čo najskôr po disekcii upraviť a odvážiť v mokrom stave, aby sa zabránilo ich vyschnutiu. Štítna žľaza a nadsemenníky by sa mali vážiť iba v prípade potreby, lebo úprava artefaktov môže brániť histopatologickému hodnoteniu. Tkanivá a všetky orgány sa fixujú v 10 % formalínovom tlmivom roztoku alebo v inom vhodnom fixačnom prostriedku ihneď po vykonaní autopsie a nie skôr ako 24 – 48 hodín pred úpravou v závislosti od použitého fixačného prostriedku.

Tabuľka 2

Orgány a tkanivá zachované počas makroskopickej pitvy

Nadobličky

Kostná dreň (a/alebo čerstvý aspirát)

Mozog (vrátane častí predného mozgu, mozočka a predĺženej miechy/mosta)

[Oči (sietnica, očný nerv) a očné viečka]

Srdce

Obličky

Hrtan (tri úrovne, jedna úroveň má zahŕňať základňu epiglotis)

Pečeň

Pľúca (všetky laloky na jednej úrovni vrátane hlavných priedušiek)

Lymfatické uzliny z hilovej oblasti pľúc najmä v prípade tuhých testovaných chemikálií so slabou rozpustnosťou. Pri detailnejších testoch a/alebo štúdiách s imunologickým zameraním sa môžu zvážiť ďalšie lymfatické uzliny, napr. z mediastinálnych, cervikálnych/submandibulárnych a/alebo aurikulárnych oblastí.

Nosohltanové tkanivá [aspoň štyri úrovne; jedna úroveň zahŕňa nosohltanovú trubicu a nosové lymfoidné tkanivo (NALT)]

Pažerák

[Čuchový bulbus]

Vaječníky

Semenné mechúriky

Miecha (krčná, hrudná a lumbálna)

Slezina

Žalúdok

Semenníky

Týmus

Štítna žľaza

Priedušnica (aspoň dve úrovne vrátane jedného pozdĺžneho rezu cez karinu a jedného priečneho rezu)

[Močový mechúr]

Maternica

Všetky makroskopické poškodenia

41.

Pľúca by sa mali odňať neporušené, odvážiť a napustiť vhodným fixačným prostriedkom pri tlaku 20 – 30 cm vody, aby sa zachovala ich štruktúra (5). Je potrebné odobrať rezy všetkých lalokov na jednej úrovni vrátane hlavných priedušiek, ale ak sa robí pľúcna laváž, mali by sa vykonať rezy nelavážovaného laloku na troch úrovniach (nie sériové rezy).

42.

Preskúmajú sa najmenej štyri úrovne nosohltanových tkanív, z ktorých jedna by mala obsahovať nosohltanovú trubicu (5, 6, 7, 8, 9), aby sa umožnilo vhodné preskúmanie dlaždicového, prechodného (neriasinkového dýchacieho), dýchacieho (riasinkového dýchacieho) a čuchového epitelu a odvodného lymfatického tkaniva (NALT; 10, 11). Preskúmajú sa tri úrovne hrtana, pričom jedna z týchto úrovní by mala obsahovať základňu epiglotis (12). Je potrebné preskúmať aspoň dve úrovne priedušnice vrátane jedného pozdĺžneho rezu cez karinu bifurkácie extrapulmonárnych priedušiek a jedného priečneho rezu.

43.

Pri kontrolných skupinách a skupinách s vysokými koncentráciami a pri všetkých zvieratách, ktoré uhynú alebo sú utratené počas štúdie, sa vykoná histopatológia všetkých orgánov a tkanív vymenovaných v tabuľke 2. Osobitná pozornosť by sa mala venovať dýchacím cestám, cieľovým orgánom a makroskopickým poškodeniam. Orgány a tkanivá, ktoré majú poškodenia v skupine s vysokými koncentráciami, sa preskúmajú pri všetkých skupinách. Vedúci štúdie sa môže rozhodnúť pre vykonanie histopatologických hodnotení pri ďalších skupinách s cieľom preukázať jednoznačnú reakciu na koncentráciu. Ak boli použité satelitné skupiny (reverzibilita), histopatologické hodnotenie sa vykoná v prípade všetkých tkanív a orgánov, pri ktorých boli v testovaných skupinách zistené účinky. Ak v skupine s vysokou expozíciou došlo k nadmernému predčasnému úhynu alebo iným problémom, ktoré spochybňujú významnosť údajov, je potrebné histopatologicky preskúmať najbližšiu nižšiu koncentráciu. Sledovanie nálezov pitvy by malo korelovať s mikroskopickými nálezmi.

44.

Je potrebné uviesť údaje o telesnej hmotnosti, spotrebe potravy, klinickej patológii, makroskopickej patológii, orgánových hmotnostiach a histopatológii jednotlivých zvierat. Údaje z klinických pozorovaní sa zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich špecifické príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu alebo ich usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, opis a časový priebeh toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy. Všetky výsledky, kvantitatívne aj náhodné, sa vyhodnotia primeranou štatistickou metódou. Možno použiť akúkoľvek všeobecne akceptovanú štatistickú metódu, pričom štatistické metódy je potrebné vybrať počas plánovania štúdie.

45.

Správa o teste by mala podľa potreby obsahovať tieto informácie: