1.1.

Akčná hladina je hladina predmetnej látky, ako sa stanovuje v prílohe k odporúčaniu 2011/516/EÚ, podľa ktorého je, v súlade s druhým odporúčaním uvedeným v danom odporúčaní, potrebné iniciovať prešetrovanie s cieľom identifikovať zdroj uvedenej látky v prípadoch zistenia zvýšených hladín príslušnej látky.

1.2.

Bioanalytické metódy sú metódy na báze použitia biologických princípov, ako sú bunkové testy, receptorové testy alebo imunologické testy. Neposkytujú výsledky na úrovni kongenéru, sú len orientačným údajom (2) hladiny toxických ekvivalentov (TEQ – Toxic Equivalents), vyjadrených v bioanalytických ekvivalentoch (BEQ – Bioanalytical Equivalents), s prihliadnutím na skutočnosť, že nie všetky zložky prítomné vo vzorkovom extrakte vykazujúcom pozitívny výsledok v teste zodpovedajú všetkým požiadavkám princípu TEQ.

1.3.

Biotestová zdanlivá výťažnosť je hladina BEQ vypočítaná z kalibračnej krivky TCDD alebo PCB 126 korigovaná na slepý pokus a následne vydelená hladinou TEQ stanovenou pomocou GC/HRMS. Cieľom je korekcia faktorov, ako sú strata PCDD/PCDF a dioxínom podobných zlúčenín počas extrakcie a procesu čistenia, spoluextrahované zlúčeniny zvyšujúce alebo znižujúce odpoveď (agonistické a antagonistické účinky), kvalita preloženia krivky alebo rozdiely medzi hodnotami TEF a REP. Biotestová zdanlivá výťažnosť sa vypočítava z vhodných referenčných vzoriek s reprezentatívnym kongenérovým profilom v oblasti sledovaných hladín.

1.4.

Semikvantitatívne metódy sú metódy, ktoré poskytujú približný, orientačný údaj o koncentrácii uvažovaného analytu, pričom príslušný číselný výsledok nespĺňa požiadavky kladené na kvantitatívne metódy.

1.5.

Prijatá špecifická medza stanoviteľnosti individuálneho kongenéra je koncentrácia analytu v extrakte vzorky, ktorá poskytuje prístrojovú odozvu pri dvoch rôznych iónoch určených na monitorovanie, pričom pomer signál – šum (S/N) je 3: 1 pre ión s menej citlivým signálom a sú splnené identifikačné kritériá, ako sú opísané napríklad v norme prEN 16215 (Živočíšne krmivá – Stanovenie dioxínov a dioxínom podobných PCB pomocou GC/HRMS a indikátorových PCB pomocou GC/HRMS) a/alebo v metóde EPA 1613, revízia B.

1.6.

Horná medza je koncepcia, ktorá si vyžaduje použitie medze stanoviteľnosti pre príspevok každého nekvantifikovaného kongenéru.

1.7.

Dolná medza je koncepcia, ktorá si vyžaduje použitie nuly pre príspevok každého nekvantifikovaného kongenéru.

1.8.

Stredná medza je koncepcia, ktorá si vyžaduje použitie polovice medze stanoviteľnosti pre výpočet príspevku každého nekvantifikovaného kongenéru.

1.9.

Šarža je identifikovateľné množstvo potraviny doručené naraz, v prípade ktorej je úradne overené, že vykazuje spoločné charakteristiky ako je pôvod, typ, druh balenia, baliareň, odosielateľ alebo značenia. V prípade rýb a produktov rybolovu musí byť aj veľkosť rýb porovnateľná. V prípade, že veľkosť a/alebo hmotnosť rýb nie je v rámci zásielky porovnateľná, zásielka sa môže stále považovať za šaržu, ale musí sa uplatniť osobitný postup odberu vzorky.

1.10.

Podšarža je označená časť veľkej šarže s cieľom uplatniť metódu odberu vzoriek z uvedenej označenej časti. Každá podšarža musí byť fyzicky oddelená a identifikovateľná.

1.11.

Prírastková vzorka je množstvo materiálu odobratého z jedného miesta zo šarže alebo podšarže.

1.12.

Súhrnná vzorka je vzorka získaná zmiešaním všetkých prírastkových vzoriek odobratých zo šarže alebo podšarže.

1.13.

Laboratórna vzorka je reprezentatívna časť/množstvo súhrnnej vzorky, ktoré je určené pre laboratórium.

BEQ

bioanalytické ekvivalenty (Bioanalytical Equivalents)

GC

plynová chromatografia (Gas chromatography)

HRMS

hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením (High resolution mass spectrometry)

LRMS

hmotnostná spektrometria s nízkym rozlíšením (Low resolution mass spectrometry)

PCB

polychlórované bifenyly

PCDD

polychlórované dibenzo-p-dioxíny

PCDF

polychlórované dibenzofurány

QC

kontrola kvality (Quality control)

REP

relatívna účinnosť (Relative potency)

TEF

faktor toxickej ekvivalencie (Toxic Equivalency Factor)

TEQ

toxické ekvivalenty (Toxic Equivalents)

TCDD

tetrachlórdibenzodioxín

U

rozšírená neistota merania (Expanded measurement uncertainty)

—

V prípade, že šarža, z ktorej sa má vykonať odber, obsahuje malé ryby (jednotlivé ryby, ktorých hmotnosť je < cca 1 kg), za prírastkovú vzorku na vytvorenie súhrnnej vzorky sa považuje celá ryba. V prípade, že výsledná súhrnná vzorka váži viac ako 3 kg, prírastkové vzorky môžu obsahovať strednú časť z ryby tvoriacu súhrnnú vzorku vážiacu každá minimálne 100 gramov. Celá časť, na ktorú sa uplatňuje maximálna hladina, sa používa na homogenizáciu vzorky.

Stredná časť ryby je miesto, kde sa nachádza ťažisko. Vo väčšine prípadov sa nachádza na chrbtovej plutve (ak má ryba chrbtovú plutvu) alebo v strede medzi žiabrovými otvormi a konečníkom.

—

V prípade, že šarža, z ktorej sa má vykonať odber, obsahuje väčšie ryby (jednotlivé ryby, ktorých hmotnosť je vyššia ako cca 1 kg), prírastková vzorka obsahuje strednú časť ryby. Hmotnosť každej prírastkovej vzorky je najmenej 100 g.

Pri rybách strednej veľkosti (cca 1 – 6 kg) sa na prírastkovú vzorku vykoná odber plátku ryby od chrbtovej kosti k brušnej časti v strednej časti ryby.

V prípade veľmi veľkých rýb (napr. > cca 6 kg) sa odber prírastkovej vzorky uskutoční z pravej strany (čelný pohľad) dorzolaterálnej svaloviny v strednej časti ryby. Ak by odber takéhoto kusu zo strednej časti ryby spôsobil značnú ekonomickú škodu, môže sa uskutočnenie odberu troch prírastkových vzoriek s hmotnosťou najmenej 350 g každá považovať za dostatočné, nezávisle od veľkosti šarže, prípadne je možné uskutočniť odber rovnakej časti svaloviny v blízkosti chvostovej časti a svaloviny v blízkosti hlavovej časti jednej ryby na vytvorenie prírastkovej vzorky, ktorá je reprezentatívna pre hladinu dioxínov v celej rybe.

—

Pokiaľ ide o zloženie vzorky, uplatňujú sa ustanovenia časti III bodu 3.

—

V prípade, že prevažuje určitá trieda/kategória veľkosti/hmotnosti (cca 80 % alebo väčšia časť šarže), vzorka sa odoberie z rýb s prevažujúcou veľkosťou alebo hmotnosťou. Táto vzorka sa považuje za reprezentatívnu pre celú šaržu.

—

V prípade, že neprevažuje žiadna konkrétna trieda/kategória, je nutné zabezpečiť, aby boli ryby vybrané na vzorku reprezentatívne pre celú šaržu. Špecifické pokyny pre takéto prípady sa uvádzajú v Metodike na odber vzoriek z celých rýb rôznej veľkosti a/alebo hmotnosti (2).

—

výpočtom rozšírenej nepresnosti pomocou koeficientu pokrytia v hodnote 2, ktorý zabezpečuje približne 95-percentnú úroveň spoľahlivosti. Šarža alebo podšarža nie je v súlade, ak nameraná hodnota mínus U je nad stanovenou povolenou hladinou,

—

stanovením rozhodovacieho limitu (CCα) podľa ustanovení rozhodnutia Komisie 2002/657/ES (bod 3.1.2.5 prílohy k uvedenému rozhodnutiu – prípad látok so stanovenou povolenou hladinou). Šarža alebo podšarža nie je vyhovujúca, ak sa nameraná hodnota rovná hodnote CCα alebo je vyššia.

—

z výsledku jednej analýzy vykonanej skríningovou metódou s pravdepodobnosťou nepresného merania vykazujúceho dodržanie maximálnych hladín nepresahujúcou 5 % vyplýva, že hladina nepresahuje príslušnú maximálnu hladinu PCDD/F a sumu PCDD/F a PCB podobných dioxínom stanovené v nariadení (ES) č. 1881/2006,

—

výsledok jednej analýzy vykonanej konfirmačnou metódou nepresahuje príslušnú maximálnu hladinu PCDD/F a sumu PCDD/F a dioxínom podobných PCB stanovené v nariadení (ES) č. 1881/2006, s ohľadom na nepresnosť merania.

—

výpočtom rozšírenej nepresnosti pomocou koeficientu pokrytia v hodnote 2, ktorý zabezpečuje približne 95-percentú úroveň spoľahlivosti. Šarža alebo podšarža nie je v súlade, ak nameraná hodnota mínus U je nad stanovenou povolenou hladinou. V prípade oddeleného stanovovania PCDD/F a dioxínom podobných PCB sa musí pre odhadovanú rozšírenú neistotu súčtu PCDD/F a PCB podobných dioxínom použiť súčet odhadovanej rozšírenej neistoty samostatných výsledkov pre PCDD/F a pre PCB podobné dioxínom,

—

stanovením rozhodovacieho limitu (CCα) podľa ustanovení rozhodnutia Komisie 2002/657/ES (bod 3.1.2.5 prílohy I k uvedenému rozhodnutiu – prípad látok so stanovenou povolenou hladinou); šarža alebo podšarža nie je vyhovujúca, ak sa nameraná hodnota rovná hodnote CCα alebo je vyššia.

a)

výber vzoriek s hladinami PCDD/F a dioxínom podobných PCB prekračujúcimi maximálne hladiny alebo akčné hladiny. Tento prístup môže zahŕňať skríningovú metódu umožňujúcu analyzovať vysoký počet vzoriek pri priaznivom pomere efektivity a nákladov, čím sa zvyšuje šanca objaviť nové prípady vysokého vystavenia a zdravotných rizík spotrebiteľa. Skríningové metódy môžu zahŕňať bioanalytické metódy a metódy GC/MS. Ich použitie by malo mať za cieľ predchádzanie výsledkom falošného súladu. Prostredníctvom konfirmačnej metódy je potrebné stanoviť/potvrdiť koncentráciu PCDD/F a sumu PCDD/F a dioxínom podobných PCB vo vzorkách vykazujúcich značné hladiny;

b)

stanovenie hladín PCDD/F a dioxínom podobných PCB vo vzorkách potravín v oblasti nízkych pozaďových hladín. Je to dôležité v záujme sledovania časových trendov, posúdenia vystavenia populácie a budovania databázy na účely možného prehodnotenia opatrení a maximálnych hladín. Tento cieľ sa dosiahne pomocou konfirmačných metód umožňujúcich jednoznačnú identifikáciu PCDD/F a dioxínom podobných PCB a ich stanovenie na požadovanej úrovni. Tieto metódy môžu byť použité na konfirmáciu výsledkov získaných skríningovými metódami a na stanovenie nízkych pozaďových hladín pri monitoringu potravín. Tie sú takisto dôležité na stanovenie kongenérových profilov na účely identifikácie zdroja možnej kontaminácie. V súčasnosti sa pri týchto metódach používa vysokorozlišovacia plynová chromatografia/vysokorozlišovacia hmotnostná spektroskopia (GC/HRMS).

—

bioanalytické metódy so schopnosťou detekcie skúmaných analytov zahŕňajú kalibračnú krivku, poskytujú indikáciu možného prekročenia/neprekročenia predmetnej hladiny a umožňujú vyjadriť výsledok v bioanalytických ekvivalentoch (BEQ), ktoré sú indikátormi hodnoty TEQ vo vzorke,

—

fyzikálno–chemický test (napr. GC-MS/MS alebo GC/LRMS); v prípade tejto metódy charakteristika presnosti merania nespĺňa požiadavky na kvantitatívne testy.

—

Musia byť prijaté opatrenia, ktoré zabránia krížovej kontaminácii v každom stupni odberu vzoriek a procesov analýzy.

—

Vzorky musia byť skladované a prepravované v sklenených, hliníkových, polypropylénových alebo polyetylénových nádobách vhodných na skladovanie a neovplyvňujúcich hladiny PCDD/F a PCB podobných dioxínom vo vzorkách. Z nádoby so vzorkami je nutné odstrániť stopy papierových smietok.

—

Skladovanie a preprava vzoriek sa musí uskutočňovať spôsobom, ktorý zachováva celistvosť potravinovej vzorky.

—

V prípade potreby je potrebné jemne rozomlieť a dôkladne premiešať každú laboratórnu vzorku, a to postupom, ktorý preukázateľne zabezpečí dokonalú homogenizáciu (napr. rozomieľanie do stupňa schopnosti prechodu 1 mm sitom); ak je obsah vlhkosti vo vzorkách príliš vysoký, pred rozomletím sa musia vysušiť.

—

Je dôležité skontrolovať reagenty, sklo a vybavenie na možný vplyv výsledkov na základe TEQ alebo BEQ.

—

Vykonaním celého postupu analýzy bez vzorky sa vykonáva slepá skúška.

—

Pokiaľ ide o bioanalytické metódy, je veľmi dôležité, aby bola v prípade všetkého laboratórneho skla a všetkých rozpúšťadiel používaných pri analýze testom potvrdená neprítomnosť zlúčenín rušiacich detekciu cieľových zlúčenín v pracovnej koncentračnej oblasti. Sklo sa opláchne rozpúšťadlami alebo/a zahreje na teplotu vhodnú na odstránenie stôp PCDD/F, zlúčenín podobných dioxínom a zlúčenín spôsobujúcich interferenciu z jeho povrchu.

—

Na extrakciu sa musí zvoliť také množstvo vzorky, aby sa splnili požiadavky týkajúce sa dostatočne nízkej pracovnej koncentračnej oblasti.

—

Špecifické postupy prípravky vzoriek použité pri skúmaných produktoch spĺňajú medzinárodne prijaté usmernenia.

—

V prípade rýb je nutné odstrániť kožu vzhľadom na to, že maximálna hladina sa vzťahuje na svalovinu bez kože. Je však nevyhnutné, aby bola všetka zvyšná svalovina a tukové tkanivo z vnútornej strany kože dôkladne a kompletne zoškrabané z kože a pridané do vzorky na analýzu.

—

V súlade s ustanoveniami nariadenia (ES) č. 882/2004 akreditáciu laboratórií uskutočňuje uznávaný orgán, ktorý pôsobí v súlade s pokynom ISO 58 s cieľom zaistiť uplatňovanie zabezpečenia analytickej kvality. Akreditácia laboratórií sa uskutočňuje v súlade s normou EN ISO/IEC 17025.

—

Laboratórna spôsobilosť sa dokazuje nepretržitou úspešnou účasťou v medzilaboratórnych štúdiách na stanovenie PCDD/F a dioxínom podobných PCB v príslušných potravinových matriciach a koncentračných oblastiach.

—

Laboratóriá uplatňujúce skríningové metódy na rutinnú kontrolu vzoriek nadväzujú úzku spoluprácu s laboratóriami uplatňujúcimi konfirmačnú metódu tak na účely kontroly kvality, ako aj konfirmácie analytického výsledku podozrivých vzoriek.

—

V prípade PCDD/F sa vzhľadom na mimoriadnu toxicitu niektorých z týchto zlúčenín detekovateľné množstvo musí nachádzať na vyššej femtogramovej (10–15 g) úrovni. Pre väčšinu kongenérov PCB je medza stanoviteľnosti na úrovni nanogramov (10–9 g) už dostatočná. Pri meraní toxickejších dioxínom podobných kongenérov PCB (predovšetkým non-orto substituovaných kongenérov) musí však nižšia hranica pracovného rozpätia dosiahnuť nízke pikogramové (10–12 g) hladiny.

—

Žiada sa rozlíšenie PCDD/F a dioxínom podobných PCB od množstva iných koextrahovaných a potenciálne vzájomne interferujúcich zlúčenín prítomných v koncentráciách až niekoľkorádovo vyšších ako je koncentrácia skúmaných analytov. V prípade metód plynovej chromatografie/hmotnostnej spektrometrie (GC/MS) je potrebné rozlíšenie medzi rôznymi kongenérmi, ako napríklad medzi toxickými (napr. sedemnástimi 2,3,7,8-substituovanými PCDD/F a PCB podobnými dioxínom) a ostatnými kongenérmi.

—

Pomocou bioanalytických metód je možná detekcia cieľových zlúčenín ako sumy PCDD/F a/alebo PCB podobných dioxínom. Prečistenie vzorky má za cieľ odstránenie zlúčenín spôsobujúcich falošné výsledky súladu alebo zlúčenín, ktoré môžu znížiť odpoveď, čím spôsobia falošné výsledky súladu.

—

V prípade metód GC/MS stanovenie poskytuje validný odhad skutočnej koncentrácie vo vzorke. Vysoká miera správnosti (správnosť merania: tesnosť súladu medzi výsledkom merania a skutočnou alebo určenou hodnotou meranej veličiny) je potrebná, aby nedošlo k odmietnutiu výsledku analýzy vzorky z dôvodu nízkej spoľahlivosti stanovenej hladiny TEQ. Správnosť sa vyjadruje ako „pravdivosť výsledku merania“ (rozdiel medzi strednou hodnotou meranou pre analyt v certifikovanom materiáli a jej certifikovanou hodnotou, vyjadrený ako percento tejto hodnoty) a „presnosť“ (relatívna štandardná odchýlka RSDR, ktorá sa vypočíta z výsledkov generovaných za podmienok reprodukovateľnosti).

—

V prípade bioanalytických metód sa stanovuje biotestová zdanlivá výťažnosť.

—

Laboratóriá počas validačného postupu a/alebo počas rutinnej analýzy preukazujú výkonnosť metódy v oblasti skúmanej hladiny napr. na úrovni 0,5-násobku, 1-násobku a 2-násobku príslušného prípustného množstva s prijateľným variačným koeficientom pre opakovanú analýzu.

—

Pravidelné slepé kontroly a pokusy na umelo kontaminovaných vzorkách alebo analýza kontrolných vzoriek (ak je to možné, tak najlepšie certifikovaného referenčného materiálu) sa vykonávajú v rámci vnútorných opatrení kontroly kvality. Tabuľky kontroly kvality (QC – quality control) pre slepé kontroly alebo analýzu kontrolných vzoriek sa zaznamenávajú a kontrolujú s cieľom zabezpečiť, aby bolo vykonanie analýzy v súlade s požiadavkami.

—

Pri bioanalytickej skríningovej metóde nie je stanovenie medze stanoviteľnosti (LOQ – limit of quantification) nevyhnutnou požiadavkou, ale pomocou tejto metódy musí byť možné rozlišovať medzi slepou a medznou hodnotou. Pri stanovovaní hladiny BEQ sa stanovuje referenčná hladina pre nakladanie so vzorkami vykazujúcimi odpoveď pod touto hladinou. Musí sa preukázať, že sa príslušná referenčná hladina aspoň trojnásobne odlišuje od slepých vzoriek použitých pri postupe, ktoré vykazujú odpoveď pod pracovnou koncentračnou oblasťou. Vypočítava sa preto zo vzoriek obsahujúcich cieľové zlúčeniny v koncentrácii približujúcej sa požadovanej minimálnej úrovni, a nie na základe pomeru signál-šum (S/N) alebo testu naslepo.

—

Medza stanoviteľnosti (LOQ) pre konfirmačnú metódu musí byť cca 1/5 skúmanej hladiny.

—

V záujme dosiahnutia spoľahlivých výsledkov pomocou konfirmačných alebo skríningových metód je nutné splniť tieto kritériá, pokiaľ ide o hodnotu TEQ a BEQ, či už stanovenú ako celkový TEQ (ako suma PCDD/F a PCB podobných dioxínom), alebo samostatne pre PCDD/F a PCB podobné dioxínom.

—

Pri skríningu je možné využívať GC/MS, ako aj bioanalytické metódy. V prípade metód GC/MS sa musia rešpektovať požiadavky stanovené v bode 7 tejto prílohy. Pre bunkové bioanalytické metódy sú v bode 8 tejto prílohy stanovené osobitné požiadavky.

—

Laboratóriá uplatňujúce skríningové metódy na rutinnú kontrolu vzoriek nadväzujú úzku spoluprácu s laboratóriami uplatňujúcimi konfirmačnú metódu.

—

Overenie výkonnosti skríningovej metódy sa požaduje počas rutinnej analýzy kontrolou kvality analýzy a priebežnou validáciou metódy. Musí fungovať nepretržitý program kontroly výsledkov vykazujúcich súlad.

—

Kontrola možnej supresie bunkovej odpovede a cytotoxicity

20 % vzorkových extraktov sa meria rutinným skríningom bez pridania a s pridaním 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxínu v množstve zodpovedajúcom skúmanej hladine s cieľom zistiť, či môže byť odpoveď potenciálne potlačená z dôvodu interferujúcich látok prítomných v extrakte vzorky. Nameraná koncentrácia vzorky s prídavkom analytu sa porovná so súčtom koncentrácie extraktu bez prídavku a koncentrácie prídavku. Ak je táto nameraná koncentrácia o viac ako 25 % nižšia ako vypočítaná (sčítaná) koncentrácia, je možné, že ide o prípad potlačenia (supresie) signálu a príslušná vzorka sa musí predložiť na konfirmačnú analýzu GC/HRMS. Výsledky sa monitorujú v tabuľkách kontroly kvality.

—

Kontrola kvality vzoriek vykazujúcich súlad (negatívnych vzoriek)

Približne 2 až 10 % negatívnych vzoriek (v závislosti od vzorkovej matrice a laboratórnych skúseností) sa potvrdzuje pomocou GC/HRMS.

—

Stanovenie frekvencie nepresných meraní vykazujúcich súlad na základe údajov získaných v rámci kontroly kvality

Stanovuje sa frekvencia falošných negatívnych výsledkov pri skríningu vzoriek pod a nad maximálnou hladinou alebo akčnou hladinou. Skutočné chybné negatívne hodnoty musia byť nižšie ako 5 %.

Po získaní aspoň 20 potvrdených výsledkov na matricu/skupinu matríc na základe kontroly kvality negatívnych vzoriek sa na základe tohto súboru údajov vyvodzujú závery o frekvencii chybných meraní vykazujúcich súlad. Výsledky zo vzoriek analyzovaných v kruhových testoch alebo pri prípadoch kontaminácie, ktoré sa nachádzajú v koncentračnom rozpätí až do napr. 2 × maximálna hladina (ML), môžu byť takisto zahrnuté medzi príslušné minimálne množstvo 20 výsledkov pre vyhodnocovanie frekvencie chybných meraní vykazujúcich súlad. Vzorky musia pokryť najčastejšie kongenérové profily a reprezentovať rozličné zdroje.

Hoci skríningové testy majú v prvom rade za cieľ detekciu vzoriek prekračujúcich akčnú hladinu, kritériom pre stanovenie frekvencie nepresných meraní vykazujúcich súlad je maximálna hladina, berúc do úvahy nepresnosť merania konfirmačnej metódy.

—

Potenciálne výsledky vykazujúce nedodržanie stanovených hladín zistené na základe skríningu sa vždy overujú konfirmačnou analytickou metódou (GC/HRMS). Tieto vzorky sa môžu takisto použiť na hodnotenie frekvencie falošných výsledkov nesúladu. V prípade skríningových metód je frekvencia „falošných výsledkov nesúladu“ časť výsledkov, v prípade ktorých konfirmačná analýza pomocou GC/HRMS vykázala súlad (dodržanie stanovených hladín), hoci vzorka bola na základe predchádzajúceho skríningu označená za vzorku, pri ktorej existuje podozrenie na nesúlad (nedodržanie stanovených hladín). Vyhodnotenie výhodnosti skríningovej metódy sa však zakladá na porovnaní vzoriek nesprávne vykazujúcich nesúlad s celkovým počtom odkontrolovaných vzoriek. Tento pomer musí byť dostatočne nízky na to, aby bolo možné považovať nástroj skríningu za výhodný.

—

Bioanalytické metódy poskytujú aspoň pri podmienkach validácie platnú indikáciu hladiny TEQ, vypočítanej a vyjadrenej ako BEQ.

—

Takisto v prípade bioanalytických metód vykonaných za podmienok opakovateľnosti by mala byť vnútrolaboratórna RSDr menšia ako RSDR (reprodukovateľnosť).

—

Rozdiel medzi hornou a dolnou medzou nesmie presiahnuť 20 % v prípade potravín kontaminovaných v miere približne 1 pg WHO-TEQ/g tuku (na základe súčtu PCDD/F a dioxínom podobných PCB). Pri potravinách s nízkym obsahom tuku je nutné uplatňovať tie isté požiadavky týkajúce sa miery kontaminácie (na úrovni približne 1 pg WHO-TEQ/g produktu). Pri nižších hladinách kontaminácie, napr. 0,5 pg WHO-TEQ/g produktu, sa môže rozdiel medzi hornou a dolnou medzou pohybovať v rozsahu 25 – 40 %.

—

Na účely validácie analytického postupu sa musia na úplnom začiatku analytickej metódy, napr. pred extrakciou, pridať 13C-označené 2,3,7,8-chlórsubstituované vnútorné (extrakčné) štandardy PCDD/F a 13C-označené vnútorné štandardy dioxínom podobných PCB. Pre každú tetra- až okta-chlórovanú homológovanú skupinu PCDD/F je nutné pridať aspoň jeden kongenér a aspoň jeden kongenér pre každú homológovú skupinu dioxínom podobných PCB (prípadne aspoň jeden kongenér pre každý sledovaný hmotnostno-spektrometrický ión použitý na monitorovanie PCDD/F a dioxínom podobných PCB). V prípade konfirmačných metód je potrebné použiť všetkých 17 13C-označených 2,3,7,8-substituovaných vnútorných (extrakčných) štandardov PCDD/F a všetkých 12 13C-označených vnútorných dioxínom podobných štandardov PCB.

—

Použitím vhodných kalibračných roztokov sa stanovujú relatívne odozvové faktory aj pre tie kongenéry, pre ktoré nebol pridaný 13C-označený ekvivalent.

—

Pridanie interných štandardov je povinné pred extrakciou pri potravinách rastlinného pôvodu a pri potravinách živočíšneho pôvodu obsahujúcich menej ako 10 % tuku. Pre potraviny živočíšneho pôvodu obsahujúce viac ako 10 % tuku je možné pridať vnútorné štandardy pred alebo po extrakcii tuku. V závislosti od toho, v ktorej fáze sa pridáva vnútorný štandard a či sa výsledky uvádzajú na produkt alebo na tuk, sa vykoná vhodná validácia účinnosti extrakcie.

—

Pred GC/MS analýzou musia byť pridané 1 alebo 2 štandardy na výpočet výťažnosti (dávkovacie štandardy).

—

Kontrola výťažnosti je nevyhnutná. Výťažnosti individuálnych vnútorných štandardov by sa mali v prípade konfirmačnej metódy pohybovať v rozsahu 60 až 120 %. Vyššie alebo nižšie výťažnosti pre individuálne kongenéry, najmä pre niektoré hepta- a okta- chlórované dibenzo-p-dioxíny a dibenzofurány, sú akceptovateľné za podmienky, že ich príspevok k hodnote TEQ neprekročí 10 % z celkovej hodnoty TEQ (vyjadrenej ako súčet PCDD/F a dioxínom podobných PCB). Pri skríningových metódach GC/MS sa musia výťažnosti pohybovať v rozpätí 30 až 140 %.

—

Separácia PCDD/F od interferujúcich chlórovaných zlúčenín, ako sú PCB nepodobné dioxínom a chlórované difenylétery, sa vykonáva vhodnými chromatografickými postupmi (pokiaľ možno na kolóne s florisilom, hliníkom a/alebo aktívnym uhlím).

—

Separácia izomérov plynovou chromatografiou má byť dostatočná (údolie medzi pikmi 1,2,3,4,7,8-HxCDF a 1,2,3,6,7,8-HxCDF má byť < 25 %).

—

Rozsah kalibračnej krivky pokrýva príslušnú oblasť skúmaných hladín.

—

Pri výpočte koncentrácií z kalibračnej krivky TCDD vykážu dolné a horné medzné hodnoty krivky veľkú odchýlku (vysoký variačný koeficient – CV). Pracovná oblasť je oblasť, v ktorej je CV menší ako 15 %. Dolná hranica pracovného rozsahu (medza oznamovania) musí byť signifikantne (najmenej trojnásobne) vyššia ako slepé vzorky. Hornú medzu pracovnej oblasti obvykle predstavuje hodnota EC70 (70 % maximálnej účinnej koncentrácie), ale je nižšia, ak je CV vyšší ako 15 % v tejto oblasti. Pracovná oblasť sa stanovuje pri validácii. Medzné hodnoty (bod 8.3) musia byť jasne v rámci pracovnej oblasti.

—

Štandardné roztoky a vzorkové extrakty sa testujú aspoň dvakrát. Odozva alebo koncentrácia štandardných roztokov alebo kontrolných extraktov pri dvojitom testovaní v 4 až 6 jamkách rozložených na platni by mala mať CV < 15 %.

—

Odhad hladín vo vzorkách sa môže vykonať na základe porovnania reakcie na test s kalibračnou krivkou pre TCDD (alebo PCB 126 alebo štandardnú zmes PCDD/F/PCB podobných dioxínom) s cieľom vypočítať hladinu BEQ v extrakte a následne vo vzorke.

—

Kalibračné krivky obsahujú 8 až 12 koncentrácií (aspoň dvojmo) s dostatočným počtom koncentrácií v nižšej časti krivky (pracovnej oblasti). Špeciálna pozornosť je venovaná kvalite preloženia krivky v pracovnej oblasti. Ako taká má hodnota R2 malú alebo žiadnu hodnotu pre odhad správnosti preloženia pri nelineárnej regresii. Lepšie preloženie krivky sa dosiahne minimalizáciou rozdielu medzi vypočítanými a pozorovanými hladinami v pracovnej oblasti krivky (napr. metódou najmenších štvorcov).

—

Odhad hladiny vo vzorkovom extrakte sa následne upraví o hladinu BEQ vypočítanú pre slepú vzorku matrice/rozpúšťadla (aby sa zohľadnili nečistoty pochádzajúce z použitých rozpúšťadiel a chemikálií) a o zdanlivú výťažnosť (vypočítanú z hladiny BEQ vhodných referenčných vzoriek s reprezentatívnymi kongenérovými profilmi v oblasti sledovaných hladín). Na vykonanie korekcie výťažnosti musí byť zdanlivá výťažnosť vždy v rámci požadovanej oblasti (pozri bod 8.1.4). Referenčné vzorky použité na korekciu výťažnosti musia byť v súlade s požiadavkami uvedenými v bode 8.2.

—

Pri validácii sa kontroluje strata zlúčenín, ku ktorej došlo pri prečisťovaní. Slepá vzorka s prídavkom rozličných kongenérov sa podrobuje prečisteniu (aspoň n = 3) a pomocou analýzy GC/HRMS sa overuje variabilita. Výťažnosť sa nachádza v rozpätí 60 až 120 % predovšetkým v prípade kongenérov prispievajúcich viac než 10 % k hladine TEQ v rozličných zmesiach.

—

Pri uvádzaní hladín BEQ sa medza oznamovania stanovuje z príslušných vzoriek matríc vykazujúcich typické kongenérové profily, nie však zo kalibračnej krivky štandardov vzhľadom na malú presnosť v nižšej oblasti krivky. Zohľadniť sa musia účinky extrakcie a prečistenia. Medza oznamovania musí byť stanovená významne (aspoň trojnásobne) nad slepými vzorkami.

—

Referenčné vzorky predstavujú vzorkovú matricu, kongenérové profily a koncentračné oblasti pre PCDD/F a PCB podobné dioxínom v oblasti sledovaných hladín (maximálnych alebo akčných hladín).

—

V každej testovacej sérii musí byť zahrnutá slepá vzorka, alebo pokiaľ možno slepá matrica, ako aj referenčná vzorka vykazujúca skúmanú hladinu. Tieto vzorky sa musia extrahovať a testovať súčasne a pri identických podmienkach. Referenčná vzorka musí vykázať zreteľne silnejšiu reakciu v porovnaní so slepou vzorkou, čím sa zabezpečí vhodnosť príslušného testu. Tieto vzorky sa musia použiť na korekciu slepých vzoriek a výťažnosti.

—

Referenčné vzorky vybrané na korekciu výťažnosti sú reprezentatívne pre testovacie vzorky, čiže kongenérové profily nevedú k podhodnoteniu hladín.

—

Na preukázanie správnej funkcie testu v skúmanej oblasti sa na kontrolu skúmanej hladiny môžu použiť dodatočné referenčné vzorky vykazujúce napr. 0,5- a 2,00-násobok skúmanej hladiny. Kombinácia týchto vzoriek môže poslúžiť na výpočet hladín BEQ v testovacích vzorkách (bod 8.1.2.2).

BEQDL

BEQ zodpovedajúce rozhodovaciemu limitu (DL – decision limit) GC/HRMS, ktorý je súčasne maximálnou hladinou pri zohľadnení možnosti nepresného merania

sy,x

štandardná odchýlka rezíduí

t α,f=m-2

Studentov koeficient (α = 5 %, f = počet stupňov voľnosti, jednostranný)

m

celkový počet kalibračných bodov (index j)

n

počet opakovaní pri každej hladine

xi

koncentrácia vzorky kalibračného bodu i stanovená GC/HRMS (v TEQ)

priemerná hodnota koncentrácií (v TEQ) všetkých kalibračných vzoriek

SDR

štandardná odchýlka výsledkov biotestu BEQDL nameraných za podmienok vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti

—

Keďže pri biologických metódach nie je možné využívať žiadne interné normy, je nutné vykonávať testy opakovateľnosti na získanie informácie o štandardnej odchýlke v rámci jednej testovacej série, ako aj medzi jednotlivými testovacími sériami. Opakovateľnosť musí byť nižšia ako 20 %, intralaboratórna reprodukovateľnosť nižšia ako 25 %. Vychádza sa z vypočítaných hladín v BEQ korigovaných na slepé vzorky a výťažnosť.

—

Súčasťou postupu validácie je preukázanie toho, že testy rozlišujú medzi slepou vzorkou a hladinou na úrovni medznej hodnoty, aby bolo možné identifikovať vzorky s vyššou hladinou, ako je príslušná medzná hodnota (pozri 8.1.2).

—

Je nutné definovať cieľové zlúčeniny, možné interferencie a maximálne prípustné hladiny v slepých vzorkách.

—

Percento štandardnej odchýlky týkajúce sa reakcie alebo koncentrácie vypočítanej na základe reakcie (možné len v pracovnej oblasti) nesmie byť pri trojnásobnom stanovovaní na vzorkovom extrakte vyššie ako 15 %.

—

Nekorigované výsledky referenčnej(-ých) vzorky(-iek) vyjadrené v BEQ (slepý pokus a skúmaná hladina) sa používajú na vyhodnotenie výkonnosti príslušnej bioanalytickej metódy počas neprerušovaného časového obdobia.

—

Tabuľky kontroly kvality (QC – quality control) pre slepé vzorky metódy a každý typ referenčnej vzorky sa zaznamenávajú a kontrolujú s cieľom zabezpečiť, aby bolo vykonanie analýzy v súlade s požiadavkami, predovšetkým pokiaľ ide o slepé vzorky a v súvislosti s nimi o požadovaný minimálny odstup od dolnej medze pracovnej oblasti, ako aj pokiaľ ide o referenčné vzorky a v súvislosti s nimi o vnútralaboratórnu reprodukovateľnosť. Slepé vzorky metódy sa musia dôkladne skontrolovať s cieľom predísť výskytu chybných výsledkov indikujúcich po odpočítaní dodržanie stanovených hladín.

—

Výsledky analýz podozrivých vzoriek a 2 až 10 % vzoriek vykazujúcich súlad (minimálne 20 vzoriek na matricu) pomocou GC/HRMS sa zhromažďujú a používajú na vyhodnotenie výkonnosti skríningovej metódy a vzťahu medzi BEQ a TEQ. Tento súbor údajov sa môže použiť na prehodnotenie medzných hodnôt uplatniteľných na rutinné vzorky v prípade validovaných matríc.

—

Úspešnosť výkonnosti metódy sa môže preukázať takisto účasťou na kruhových testoch. Výsledky zo vzoriek analyzovaných v rámci kruhových testov nachádzajúce sa v koncentračnom rozpätí až do napr. 2 × ML (dvojnásobok maximálnej hladiny) môžu byť takisto zahrnuté do vyhodnocovania frekvencie chybných meraní vykazujúcich súlad, ak je laboratórium schopné preukázať svoju úspešnú výkonnosť. Vzorky musia pokryť najčastejšie kongenérové profily a reprezentovať rozličné zdroje.

—

Pri prípadoch kontaminácie sa môžu medzné hodnoty prehodnotiť tým spôsobom, že sa zohľadní špecifická matrica a kongenérové profily tohto konkrétneho prípadu.

—

Pokiaľ to použitý analytický postup umožňuje, analytické výsledky musia zahŕňať hladiny jednotlivých kongenérov PCDD/F a PCB podobných dioxínom a musia byť uvedené ako dolná, horná a stredná medza, aby sa pri uvádzaní výsledkov zahrnulo čo najviac informácií, a tak umožnilo interpretovať výsledky v súlade s osobitnými požiadavkami.

—

Správa zahŕňa takisto metódu použitú na extrahovanie PCDD/F, PCB podobných dioxínom a lipidov. Obsah lipidov vo vzorke sa stanovuje a uvádza v prípade potravinových vzoriek s maximálnymi alebo akčnými hladinami vyjadrenými vo vzťahu k tuku a s očakávanou koncentráciou tuku v rozmedzí 0 až 2 % (v súlade s existujúcimi právnymi predpismi), pre ostatné vzorky nie je stanovenie obsahu lipidov povinné.

—

Údaje o výťažnostiach jednotlivých vnútorných štandardov sa musia poskytnúť v prípade, že výťažnosti sa pohybujú mimo oblasti uvedenej v bode 7.2, v prípade, že sa prekročí maximálna hladina, ako aj v ostatných prípadoch na požiadanie.

—

Keďže je nutné pri rozhodovaní o súlade vzorky zohľadniť možnú nepresnosť merania, tento parameter musí byť tiež k dispozícii. Preto sa analytické výsledky uvádzajú ako „x +/– U“, pričom x je analytický výsledok a U je rozšírená neistota merania pri použití koeficientu pokrytia v hodnote 2, ktorý zabezpečuje približne 95-percentnú úroveň spoľahlivosti. V prípade oddeleného stanovovania PCDD/F a dioxínom podobných PCB, pre PCDD/F a dioxínom podobné PCB sa musí použiť súčet odhadovanej rozšírenej neistoty samostatných analytických výsledkov pre PCDD/F a dioxínom podobné PCB.

—

Ak sa nepresnosť merania zohľadní uplatnením CCα (ako je uvedené v časti IV bode 2 prílohy II ), je nutné uviesť aj tento parameter.

—

Výsledky sa vyjadrujú v identických jednotkách a s (najmenej) rovnakým počtom podstatných hodnôt, ako sú maximálne hladiny stanovené v nariadení (ES) č. 1881/2006.

—

Výsledok skríningu sa vyjadruje ako „v súlade“ alebo „podozrenie na nesúlad“ („podozrenie“).

—

Okrem toho sa môže uvádzať výsledok pre PCDD/F a/alebo PCB vyjadrený v bioanalytických ekvivalentoch (BEQ) (nie TEQ) (pozri bod 2 prílohy III).

—

Ak sa uvedie neistota merania, pokiaľ ide o vypočítanú hladinu v BEQ, napr. ako štandardná odchýlka, musí sa vychádzať z aspoň trojnásobnej analýzy vzorky (vrátane extrakcie, prečistenia a stanovenia reakcie na test).

—

Vzorky vykazujúce reakciu pod medzou oznamovania sa musia označiť ako vzorky pod medzou oznamovania.

—

Pre každý typ matrice sa uvádza skúmaná hladina (maximálna hladina, akčná hladina), z ktorej vychádza hodnotenie.

—

Uvádza sa druh použitého testu, základná testovacia zásada a druh kalibrácie.

—

Správa zahŕňa takisto metódu použitú na extrahovanie PCDD/F, PCB podobných dioxínom a lipidov. Obsah lipidov vo vzorke sa stanovuje a uvádza v prípade potravinových vzoriek s maximálnymi alebo akčnými hladinami vyjadrenými vo vzťahu k tuku a s očakávanou koncentráciou tuku v rozmedzí 0 až 2 % (v súlade s existujúcimi právnymi predpismi), pre ostatné vzorky nie je stanovenie obsahu lipidov povinné.

—

Relatívny retenčný čas vo vzťahu k interným štandardom alebo referenčným štandardom (prijateľná odchýlka +/– 0,25 %).

—

Separácia všetkých šiestich indikátorových PCB (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 and PCB 180) od interferujúcich látok, osobitne koeluovaných PCB, najmä ak sú hladiny vzoriek v oblasti zákonom stanovených medzí a nesúlad sa musí potvrdzovať.

Pounámka: Kongenéry, v prípade ktorých je často zaznamenaná koeluácia, sú napr. PCB 28/31, PCB 52/69 a PCB 138/163/164. V prípade GC/MS je takisto nevyhnutné uvažovať o možných interferenciách fragmentov vyšších chlórovaných kongenérov.

—

Pri technikách GC/MS:

—

Pri GC/ECD:

Potvrdenie výsledkov prekračujúcich toleranciu na dvoch kolónach GC so stacionárnymi fázami rozličnej polarity.

—

Používanie vhodných vnútorných štandardov s fyzikálno–chemickými vlastnosťami porovnateľnými so skúmanými analytmi.

—

Pridávanie vnútorných štandardov:

—

Požiadavky na metódy používajúce všetkých šesť izotopom označených indikátorových kongenérov PCB:

—

Požiadavky na metódy využívajúce nie všetkých šesť izotopom označených vnútorných štandardov alebo iné vnútorné štandardy:

—

Výťažnosti neoznačených kongenérov sa overujú umelo nakontaminovanými vzorkami alebo vzorkami kontroly kvality s koncentráciami v oblasti skúmanej hladiny. Prijateľné výťažnosti pre tieto kongenéry sú medzi 70 a 120 %.

—

Pokiaľ to použitý analytický postup umožňuje, analytické výsledky musia zahŕňať hladiny jednotlivých kongenérov PCB a musia byť uvedené ako dolná, horná a stredná medza, aby sa pri uvádzaní výsledkov zahrnulo čo najviac informácií, a tak umožnilo interpretovať výsledky v súlade s osobitnými požiadavkami.

—

Správa zahŕňa takisto metódu použitú na extrahovanie PCB a lipidov. Obsah lipidov vo vzorke sa stanovuje a uvádza v prípade potravinových vzoriek s maximálnymi hladinami vyjadrenými vo vzťahu k tuku a s očakávanou koncentráciou tuku v rozmedzí 0 až 2 % (v súlade s existujúcimi právnymi predpismi), pre ostatné vzorky nie je stanovenie obsahu lipidov povinné.

—

Údaje o výťažnostiach jednotlivých vnútorných štandardov sa musia poskytnúť v prípade, že výťažnosti sa pohybujú mimo oblasti uvedenej v bode 6, v prípade, že sa prekročí maximálna hladina, ako aj v ostatných prípadoch na požiadanie.

—

Keďže je nutné pri rozhodovaní o súlade vzorky zohľadniť nepresnosť merania, tento parameter musí byť tiež k dispozícii. Preto sa analytické výsledky uvádzajú ako „x +/– U“, pričom x je analytický výsledok a U je rozšírená neistota merania pri použití koeficientu pokrytia v hodnote 2, ktorý zabezpečuje približne 95-percentnú úroveň spoľahlivosti.

—

Ak sa možnosť nepresnosti merania zohľadní uplatnením CCα (ako je uvedené v časti IV bode 1 prílohy II), je nutné uviesť aj tento parameter.

—

Výsledky sa vyjadrujú v identických jednotkách a s (najmenej) rovnakým počtom podstatných hodnôt, ako sú maximálne hladiny stanovené v nariadení (ES) č. 1881/2006.