Deviata Smernica Komisie

z 31. júla 1981,

ktorá ustanovuje metódy analýzy na úradnú kontrolu krmív v spoločenstve

(81/715/EHS)

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva,

so zreteľom na smernicu Rady 70/373/EHS z 20. júla 1970 o zavedení metód odoberania vzoriek a analýzy na úradnú kontrolu krmív v spoločenstve [1], naposledy zmenenej Aktom o pristúpení Grécka, a najmä jej článok 2,

keďže táto smernica vyžaduje, aby sa úradná kontrola krmív na účel kontroly plnenia požiadaviek stanovených zákonom, iným právnym predpisom alebo administratívnym opatrením v súvislosti s kvalitou a zložením krmív vykonávala použitím metód spoločenstva na odoberanie vzoriek a analýzu;

keďže smernice Komisie 71/250/EHS [2], 71/393/EHS [3], 72/199/EHS [4], 73/46/EHS [5], 74/203/EHS [6], 75/84/EHS [7], 76/372/EHS [8], a 78/633/EHS [9], naposledy zmenené a doplnené smernicou z 30. júla 1981, už ustanovili niekoľko metód spoločenstva na analýzu; keďže pokrok v práci si odvtedy vyžiadal prijatie deviatej série metód;

keďže opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre krmivá,

PRIJALA TÚTO SMERNICU:

Článok 1

Členské štáty musia žiadať, aby sa analýzy na úradné kontroly krmív v súvislosti s ich obsahom avoparcínu a monenzinátu sodného vykonávali v súlade s metódami opísanými v prílohe.

Článok 2

Členské štáty prijmú zákony, iné právne predpisy a administratívne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou 1. decembra 1981 a musia o tom informovať Komisiu.

Článok 3

Táto smernica je adresovaná členským štátom.

V Bruseli 31. júla 1981.

Za Komisiu

Gaston Thorn

predseda

[1] Ú. v. ES L 170, 3.8.1970, s. 2.

[2] Ú. v. ES L 155, 12.7.1971, s. 13.

[3] Ú. v. ES L 279, 20.12.1971, s. 7.

[4] Ú. v. ES L 123, 29.5.1972, s. 6.

[5] Ú. v. ES L 83, 30.3.1973, s. 21.

[6] Ú. v. ES L 108, 22.4.1974, s. 7.

[7] Ú. v. ES L 32, 5.2.1975, s. 26.

[8] Ú. v. ES L 102, 15.4.1976, s. 8.

[9] Ú. v. ES L 206, 29.7.1978, s. 43.

--------------------------------------------------

PRÍLOHA

1. STANOVENIE OBSAHU AVOPARCÍNU DIFÚZIOU V AGAROVOM MÉDIU

1. ÚČEL A OBLASŤ

Metóda slúži na stanovenie obsahu avoparcínu v krmivách a v premixoch. Dolná medza stanoviteľnosti je 2 mg/kg (2 ppm). Prítomnosť polyéterických antibiotík môže pôsobiť rušivo pri stanovovaní.

2. PRINCÍP

Vzorka sa extrahuje zmesou acetónu, vody a kyseliny chlorovodíkovej. Antibiotická aktivita extraktu sa stanoví meraním difúzie avoparcínu v agarovom médiu naočkovanom s Bacilus subtilis. Difúzia sa ukáže tvorbou inhibičných zón mikroorganizmu. Vzťah medzi priemerom týchto zón a logaritmom koncentrácie antibiotika v rozsahu použitých antibiotických koncentrácií sa považuje za priamoúmerný.

3. MIKROORGANIZMUS: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Udržiavanie základnej kultúry

Naočkujte šikmé plochy kultivačného média (4.1) v skúmavkách mikroorganizmom Bacillus subtilis a inkubujte počas noci pri 30 oC. Skladujte kultúru v chladničke pri teplote asi 4 oC. Preočkujte raz do mesiaca.

3.2. Príprava suspenzie spór [1]

Zozbierajte produkt z čerstvo pripravenej šikmej plochy agaru (3.1) pomocou 2 až 3 ml sterilnej vody. Použite túto suspenziu na naočkovanie 300 ml kultivačného média (4.1) v Rouxovej banke a inkubujte 3 až 5 dní pri teplote 30 oC. Zozbierajte produkt do 15 ml etylalkoholu (4.2) po skontrolovaní sporulácie pod mikroskopom a dobre zmiešajte. Túto suspenziu možno skladovať aspoň päť mesiacov pri teplote asi 4 oC.

4. KULTIVAČNÉ MÉDIÁ A ČINIDLÁ

4.1 Kultivačné médium [2]

Mäsový bujón | 6,0 g |

Tryptónový bujón | 4,0 g |

Kvasinkový extrakt | 3,0 g |

Mäsový extrakt | 1,5 g |

Glukóza | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizácii). | |

4.2. Etylalkohol 20 % (v/v): zrieďte 200 ml etylalkoholu s 800 ml vody.

4.3. Kyselina chlorovodíková, d: 1,18 do 1,19

4.4. Hydroxid sodný, 2 M roztok.

4.5. Fosfátový pufer, 0,1 M:

Dihydrogén fosforečnan draselný, KH2PO4: 13,6 g

Voda do 1000 ml.

Upravte pH na 4,5.

4.6. Zmes acetónu, vody, kyseliny chlorovodíkovej (4.3): 65/32,5/2,5 (v/v/v).

4.7. Štandardná látka: avoparcín sulfát so známou aktivitou.

5. ŠTANDARDNÉ ROZTOKY

Rozpustite presne odvážené množstvo asi 10 mg štandardnej látky (4.7) vo fosfátovom pufri a rozrieďte týmto pufrom tak, aby ste dostali základný roztok obsahujúci 100 μg avoparcínu na mililiter. Ak sa tento roztok skladuje v uzatvorenej banke pri 4 oC, udrží si stabilitu sedem dní.

5.1. Pre premixy

Z tohto základného roztoku pripravte ďalším riedením použitím pufru (4.5) nasledujúce roztoky:

S8 | 4,0 μg/ml |

S4 | 2,0 μg/ml |

S2 | 1,0 μg/ml |

S1 | 0,5 μg/ml |

5.2. Pre krmivá

Z tohto základného roztoku pripravte ďalším riedením použitím pufra (4.5) nasledujúce roztoky:

S8 | 2,0 μg/ml |

S4 | 1,0 μg/ml |

S2 | 0,5 μg/ml |

S1 | 0,25 μg/ml |

6. PRÍPRAVA EXTRAKTU A SKÚŠOBNÝCH ROZTOKOV

6.1. Premixy

Odvážte dostatočne veľkú vzorku s presnosťou na 10 mg, ktorá obsahuje od 10 do 100 mg avoparcínu. Preneste do 100 ml odmernej banky so 60 ml zmesi (4.6) a trepte 15 minút v mechanickej trepačke. Odmerajte pH a upravte v prípade potreby na pH 2 kyselinou chlorovodíkovou (4.3). Doplňte do objemu zmesou (4.6) a dobre zmiešajte. Prefiltrujte časť cez vhodný filtračný papier (napríklad Whatman č. 1) a prvých 5 ml filtrátu odstráňte. Zoberte alikvotnú časť a upravte pH na 4,5 roztokom hydroxidu sodného (4.4). Zrieďte tento roztok pufrom (4.5), aby ste dostali očakávanú koncentráciu avoparcínu 4 μg/ml (= U8).

Z tohto roztoku pripravte roztoky U4 (očakávaný obsah: 2 μg/ml), U2 (očakávaný obsah: 1 μg/ml) a U1 (očakávaný obsah: 0,5 μg/ml) postupným riedením (1 + 1) pufrom (4.5).

6.2. Krmivá

Odvážte množstvo vzorky 50 g a trepte 100 ml zmesi (4.6) 30 minút v mechanickej trepačke. Vyčírte extrakt odstredením (použitím uzatvorených odstreďovacích skúmaviek), zoberte alikvotnú časť vyčíreného extraktu (pozri tabuľku nižšie) a upravte pH na 4.5 roztokom hydroxidu sodného (4.4). Zrieďte túto alikvotnú časť pufrom (4.5) na U8 (pozri tabuľku nižšie).

Z tohto roztoku pripravte roztoky U4 (očakávaný obsah: 1μg/ml), U2 (očakávaný obsah: 0,5 μg/ml) a U1 (očakávaný obsah: 0,25 μg/ml) postupným riedením (1 + 1) pufrom (4.5).

Predpokladaný obsah avoparcínu (mg/kg) | 5 | 7,5 | 10 | 15 | 20 | 40 |

Hmotnosť vzorky (g (± 0, 1 g)) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |

Objem zmesi (4.6) (ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Objem vyčíreného extraktu (ml) | 20 | 15 | 20 | 15 | 20 | 10 |

Konečný objem (ml): U8 | 25 | 25 | 50 | 50 | 100 | 100 |

Očakávaná koncentrácia U8 (μg/ml) | 2 | asi 2 | 2 | asi 2 | 2 | 2 |

7. POSTUP SKÚŠKY

7.1. Očkovanie skúšobného média

Naočkujte skúšobné médium (4.1) suspenziou spór (3.2) pri teplote od 50 do 60 oC. Predbežným testovaním na platniach so skúšobným médiom (4.1) stanovte množstvo suspenzie spór potrebnej na získanie najväčších a najjasnejších inhibičných zón s rôznymi koncentráciami avoparcínu.

7.2. Príprava platní

Difúzia v agare sa uskutoční na platniach so štyrmi koncentráciami štandardného roztoku (S8, S4, S2, S1) a štyrmi koncentráciami skúšobného roztoku (U8, U4, U2, U1). Tieto štyri koncentrácie extraktu a štandardu sa musia umiestniť na každú platňu. Na to je potrebné vybrať dostatočne veľké platne, aby bolo možné urobiť do agaru aspoň osem jamiek s priemerom od 10 do 13 mm a aspoň s 30 mm odstupom medzi ich stredmi. Test sa môže urobiť na sklenených platniach s hliníkovým alebo umelohmotným prstencom o priemere 200 mm a výške 20 mm pripevneným na nich.

Nalejte na platne médium (4.1) naočkované podľa 7.1 v takom množstve, aby ste získali asi 2 mm hrubú vrstvu (60 ml na platňu s priemerom 200 mm). Nechajte stuhnúť vo vodorovnej polohe, urobte jamky a umiestnite do nich presne odmerané objemy skúšobného a štandardného roztoku (podľa priemeru medzi 0,10 a 0,15 ml na každú jamku). Aplikujte každú koncentráciu aspoň štyrikrát tak, aby predmetom každého stanovenia bolo hodnotenie 32 inhibičných zón.

7.3. Inkubácia

Inkubujte platne od 16 do 18 hodín pri teplote 30 oC.

8. HODNOTENIE

Odmerajte priemer inhibičných zón s presnosťou na 0,1 mm. Zaznamenajte priemerné merania každej koncentrácie na semilogaritmický grafický papier tak, aby sa ukázal logaritmus koncentrácii vo vzťahu k priemerom inhibičných zón. Vyneste optimálnu rastovú krivku štandardného roztoku a extraktu ako v príklade uvedenom nižšie.

Určite optimálny rastový bod pre najnižšiu koncentráciu štandardu (SL) podľa vzorca:

SL =

10

Stanovte optimálny rastový bod pre najvyššiu koncentráciu štandardu (SH) podľa vzorca:

SH =

10

Podobne vypočítajte optimálne rastové body pre najnižšiu koncentráciu extraktu (UL) a najvyššiu koncentráciu extraktu (UH) nahradením U1, U2, U4 a U8 za S1, S2, S4 a S8 vo vyššie uvedenom vzorci.

Zaznamenajte vypočítané hodnoty SL a SH na ten istý grafický papier a spojte ich, aby ste dostali "optimálnu rastovú" krivku pre štandardný roztok. Podobne zaznamenajte UL a UH a spojte ich, aby ste dostali "optimálnu rastovú" krivku pre extrakt.

Pri neprítomnosti interferencií majú byť krivky rovnobežné. Z praktických dôvodov sa krivky môžu považovať za rovnobežné, ak sa hodnoty (SH — SL) a (UH — UL) nelíšia viac ako o 10 % od ich priemernej hodnoty.

Ak nie sú krivky rovnobežné, môžeme vynechať buď U1 a S1, alebo U8 a S8 a vypočítať SL, SH, UL a UH použitím alternatívneho vzorca, ktorý nám dá iné krivky "optimálneho rastu":

(a ′ )SL =5S1 + 2S2 – S46 | alebo | 5S2 + 2S4 – S86 |

(b ′ )SH =5S4 + 2S2 – S16 | alebo | 5S8 + 2S4 – S26 |

a podobne aj UL a UH. Alternatívne krivky "optimálneho rastu" majú spĺňať obdobné kritériá rovnobežnosti. Skutočnosť, že výsledok sa vypočítal z troch koncentrácií, sa musí uviesť v záverečnej správe.

Keď sa krivky považujú za rovnobežné, vypočítajte logaritmus relatívnej aktivity (log A) pomocou jedného z nasledujúcich vzorcov:

Pre štyri koncentrácie:

log A =

U

+ U

+ U

+ U

– S

– S

– S

– S

8 × 0,602 U4 + U8 + S4 + S8 – U1 – U2 – S1 – S2

Pre tri koncentrácie:

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

4 × 0,401 U4 + S4 – U1 – S1

alebo

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

8 × 0,401 U8 + S8 – U2 – S2

Reálna aktivita = predpokladaná aktivita x relatívna aktivita

Ak je relatívna aktivita mimo rozpätia 0,5 až 2,0, opakujte skúšku a urobte vhodné úpravy koncentrácií extraktu alebo, ak to nie je možné, štandardných roztokov. Ak nie je možné dosiahnuť, aby mala relatívna aktivita požadované rozpätie, každý dosiahnutý výsledok sa musí považovať za približný a táto skutočnosť sa musí uviesť v záverečnej správe.

Ak krivky nie sú považované za rovnobežné, opakujte stanovenie. Ak ani potom nedosiahnete rovnobežnosť, musí sa stanovenie považovať za neuspokojivé.

9. OPAKOVATEĽNOSŤ

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke tým istým laborantom/analytikom nesmie presiahnuť:

- 2 mg/kg v absolútnej hodnote pre obsah avoparcínu od 2 do 10mg/kg.

- 20 % relatívnych z najvyššej hodnoty pre obsahy od 10 do 25 mg/kg

- 5 mg/kg v absolútnej hodnote pre obsah od 25 do 50 mg/kg

- 10 % relatívnych z najvyššej hodnoty pre obsahy nad 50 mg/kg.

2. STANOVENIE MONENZINÁTU SODNÉHO DIFÚZIOU V AGAROVOM MÉDIU

1. ÚČEL A OBLASŤ

Metóda slúži na stanovenie obsahu monenzinátu sodného v krmivách a v premixoch. Dolná medza stanoviteľnosti je 10 mg/kg (10 ppm) [3].

2. PRINCÍP

Vzorka sa extrahuje 90 % metylalkoholom. Extrakt sa podrobí vhodnému postupu podľa obsahu monenzinátu sodného vo vzorke. Jeho antibiotická aktivita sa stanoví meraním difúzie monenzinátu sodného v agarovom médiu naočkovanom s Bacilus subtilis. Difúzia sa ukáže tvorbou inhibičných zón mikroorganizmu. Vzťah medzi priemerom týchto zón a logaritmom koncentrácie antibiotika v rozsahu použitých antibiotických koncentrácií sa považuje za priamo úmerný. Citlivosť tejto metodiky skúšky sa znižuje v prítomnosti iónov sodíka.

3. MIKROORGANIZMUS: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Udržiavanie základnej kultúry

Naočkujte šikmé plochy kultivačného média (4.1) v skúmavkách mikroorganizmom Bacillus subtilis a inkubujte počas noci pri 30 oC. Skladujte kultúru v chladničke pri teplote asi 4 oC. Preočkujte raz do mesiaca.

3.2. Príprava suspenzie spór [4]

Zozbierajte produkt z čerstvo pripravenej šikmej plochy agaru (3.1) pomocou 2 až 3 ml sterilizovanej vody. Použite túto suspenziu na naočkovanie 300 ml kultivačného média (4.1) v Rouxovej banke a inkubujte tri až päť dní pri 30 oC. Zozbierajte produkt do 15 ml 20 % etylalkoholu (4.3) a po skontrolovaní sporulácie pod mikroskopom dobre zmiešajte. Túto suspenziu možno skladovať aspoň päť mesiacov pri teplote asi 4 oC.

4. KULTIVAČNÉ MÉDIÁ A ČINIDLÁ

4.1. Kultivačné médium [5]

Tryptónový bujón | 10,0 g |

Kvasinkový extrakt | 3,0 g |

Mäsový extrakt | 1,5 g |

Glukóza | 1,0 g |

Agar (podľa kvality) | 10,0 až 20,0 g |

Voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizácii). | |

4.2. Skúšobné médium

Glukóza | 10,0 g |

Kvasinkový extrakt | 2,5 g |

Hydrofosforečnan dvojdraselný K2HPO4 | 0,69 g |

Dihydrofosforečnan draselný KH2PO4 | 0,45 g |

Agar (podľa kvality) | 10,0 až 20,0 g |

Voda | 1000 ml |

pH 6 (po sterilizácii) | |

4.3. Etylalkohol 20 % (v/v): zrieďte 200 ml etylalkoholu s 800 ml vody.

4.4. Bezvodý metylalkohol.

4.5. Metylalkohol 90 % (v/v) zrieďte 900 ml metylalkoholu (4.4) so 100 ml vody.

4.6. Metylalkohol 50 % (v/v) zrieďte 500 ml metylalkoholu (4.4) s 500 ml vody.

4.7. Granulovaný kysličník hlinitý (alcoa F, meš 20; aktivovaný kysličník hlinitý UGI: F. Lancaster and Co. alebo ekvivalentný).

4.8. Štandardné látky: monenzinát sodný známej aktivity (napríklad z International Laboratory for Biological Standards, Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK-Surrey KT15 3NB).

5. PRÍSTROJE

5.1. Rotačná vákuová odparka s 250 ml bankou s guľatým dnom.

5.2. Sklenená kolónka na chromatografiu, vnútorný priemer: 25 mm, dĺžka: 400 mm s otvoreným koncom o priemere 2 mm.

5.3. Sklenená kolónka na chromatografiu, vnútorný priemer: 11 mm, dĺžka: asi 300 mm s otvoreným koncom o priemere 2 mm.

6. ŠTANDARDNÉ ROZTOKY

Rozpustite presne odvážené množstvo štandardnej látky (4.8) v metylalkohole (4.4) a zrieďte tak, aby ste dostali základný roztok obsahujúci 800 μg monenzinátu sodného v jednom mililitri. Ak sa tento roztok skladuje v uzatvorenej banke pri 4 oC, udrží si stabilitu do dvoch týždňov.

Pripravte z tohto základného roztoku postupným riedením 50 % metylalkoholom (4.6) nasledujúce roztoky:

S8 | 8,0 μg/ml |

S4 | 4,0 μg/ml |

S2 | 2,0 μg/ml |

S1 | 1,0 μg/ml |

7. PRÍPRAVA EXTRAKTU

7.1. Extrakcia

7.1.1. Premixy

Odvážte vzorku o množstve 2 g, pridajte 100 ml 90 % metylalkoholu (4.5), zhomogenizujte a odstreďte počas niekoľkých minút. Zrieďte odstredený roztok 50 % metylalkoholom (4.6) tak, aby ste získali očakávaný obsah monenzinátu sodného 8 μg/ml (= U8).

7.1.2 Krmivá s obsahom monenzinátu sodného 50 ppm a viac

Odvážte množstvo vzorky od 10 do 22 g, pridajte 100 ml 90 % metylalkoholu (4.5), homogenizujte 15 minút a nechajte usadiť.

Vložte zátku z bavlnenej vaty do užšieho konca sklenenej kolónky (5.2) a vložte kysličník hlinitý (4.7), jemne poklepkávajte, kým stĺpec dosiahne výšku 75 až 80 mm.

Naneste extrakt na stĺpec kysličníka hlinitého a filtrát zachytávajte. Zrieďte 30 ml filtrátu vodou na 50 ml. Ďalej rieďte 50 % metylalkoholom (4.6) tak, aby ste získali očakávaný obsah monenzinátu sodného 8 μg/ml (= U8).

7.1.3. Krmivá s obsahom monenzinátu sodného nižším ako 50 ppm (až do hraničnej hodnoty 10 ppm)

Odvážte vzorku o množstve od 10 do 20 g, pridajte 100 ml 90 % metylalkoholu (4.5), homogenizujte 15 minút. Odstreďte, kým sa roztok vyčíri.

Pre vzorku obsahujúcu 20 ppm monenzinátu sodného použite 40 ml odstredenej tekutiny. Pre vzorku obsahujúcu 10 ppm použite 80 ml a odparte do sucha vo vákuovej rotačnej odparke (5.1) pri teplote do 40 oC., Odparok rozpustite v 10 ml 90 % metylalkoholu (4.5).

Vložte zátku z bavlnenej vaty do užšieho konca sklenenej kolónky (5.3) a vložte kysličník hlinitý (4.7) i jemným poklepávaním, kým stĺpec dosiahne výšku 75 až 80 mm.

Naneste metylalkoholový roztok odparku na stĺpec kysličníka hlinitého a zachytávajte filtrát. Premyte stĺpec 10 ml 90 % metylalkoholom (4. 5) a spojte premývaciu tekutinu s filtrátom.

Odparte roztok do sucha vo vákuu v rotačnej odparke (5.1) pri teplote nižšej ako 40 oC. Odparok rozpusťte v 10 ml bezvodého metylalkoholu (4.4) a doplňte vodou do 20 ml. Odstreďte roztok pri otáčkach najmenej 4000 za minútu najmenej po dobu päť minút. Ďalej rieďte 50 % metylalkoholom (4.6) tak, aby ste získali očakávaný obsah monenzinátu sodného 8 μg/ml (= U8).

7.2 Skúšobné roztoky

Z roztoku U8 pripravte roztoky U4 (očakávaný obsah: 4 μg/ml), U2 (očakávaný obsah: 2 μg/ml) a U1 (očakávaný obsah: 1 μg/ml) postupným riedením (1 + 1) s 50 % metylalkoholom (4.6).

8. POSTUP SKÚŠKY

8.1. Očkovanie skúšobného média

Naočkujte do skúšobného média (4.2) suspenziu spór (3.2) pri teplote od 50 do 60oC. Predbežným testovaním na platniach so skúšobným médiom (4.2) stanovte množstvo suspenzie spór potrebnej na získanie najväčších a najjasnejších inhibičných zón s rôznymi koncentráciami monenzinátu sodného.

8.2. Príprava platní

Difúzia v agare sa uskutoční na platniach so štyrmi koncentráciami štandardného roztoku (S8, S4, S2, S1) a štyrmi koncentráciami skúšobného roztoku (U8, U4, U2, U1). Tieto štyri koncentrácie extraktu a štandardu sa musia umiestniť na každú platňu. Nato je potrebné vybrať dostatočne veľké platne, aby bolo možné urobiť do agaru aspoň osem jamiek s priemerom od 10 do 13 mm a aspoň s 30 mm odstupom medzi ich stredmi. Test sa musí urobiť na sklenených platniach s hliníkovým alebo umelohmotným prstencom s priemerom 200 mm a výškou 20 mm pripevneným na nich.

Nalejte na platne médium (4.2) naočkované podľa 8.1 v takom množstve, aby ste získali asi 2 mm hrubú vrstvu (60 ml na platňu o priemere 200 mm). Nechajte stuhnúť vo vodorovnej polohe, urobte jamky a umiestnite do nich presne odmerané objemy skúšobného a štandardného roztoku (podľa priemeru medzi 0,10 a 0,15 ml na každú jamku). Aplikujte každú koncentráciu aspoň štyrikrát tak, aby bolo každé stanovenie predmetom hodnotenia 32 inhibičných zón.

8.3. Inkubácia

Inkubujte platne asi 18 hodín pri teplote od 35 do 37 oC.

9. HODNOTENIE

Odmerajte priemer inhibičných zón s presnosťou 0.1 mm. Zaznamenajte priemerné merania každej koncentrácie na semilogaritmický grafický papier tak, aby sa ukázal logaritmus koncentrácii vo vzťahu k priemerom inhibičných zón. Vyneste optimálnu rastovú krivku štandardného roztoku a extraktu ako v príklade uvedenom nižšie.

Určite optimálny rastový bod pre najnižšiu koncentráciu štandardu (SL) podľa vzorca:

SL =

10

Stanovte optimálny rastový bod pre najvyššiu koncentráciu štandardu (SH) podľa vzorca:

SH =

10

Podobne vypočítajte optimálne rastové body pre najnižšiu koncentráciu extraktu (UL) a najvyššiu koncentráciu extraktu (UH) nahradením U1, U2, U4 a U8 za S1, S2, S4 a S8 vo vyššie uvedenom vzorci.

Zaznamenajte vypočítané hodnoty SL a SH na ten istý grafický papier a spojte ich, aby ste dostali "optimálnu rastovú" krivku pre štandardný roztok. Podobne zaznamenajte UL a UH a spojte ich, aby ste dostali "optimálnu rastovú" krivku pre extrakt.

Pri neprítomnosti interferencií majú byť krivky rovnobežné. Z praktických dôvodov sa krivky môžu považovať za rovnobežné, ak sa hodnoty (SH — SL) a (UH — UL) nelíšia viac ako o 10 % od ich priemernej hodnoty.

Ak nie sú krivky rovnobežné, môžete vynechať buď U1 a S1, alebo U8 a S8 a vypočítať SL, SH, UL a UH použitím alternatívneho vzorca, ktorý vám dá iné krivky optimálneho rastu:

(a ′ )SL =5S1 + 2S2 – S46 | alebo | 5S2 + 2S4 – S86 |

(b ′ )SH =5S4 + 2S2 – S16 | alebo | 5S8 + 2S4 – S26 |

a podobne aj UL a UH. Alternatívne krivky "optimálneho rastu" majú spĺňať obdobné kritériá rovnobežnosti. Skutočnosť, že výsledok sa vypočítal z troch koncentrácii, sa musí uviesť v záverečnej správe.

Keď sa krivky považujú za rovnobežné, vypočítajte logaritmus relatívnej aktivity (log A) pomocou jedného z nasledujúcich vzorcov:

Pre štyri koncentrácie:

log A =

U

+ U

+ U

+ U

– S

– S

– S

– S

8 × 0,602 U4 + U8 + S4 + S8 – U1 – U2 – S1 – S2

Pre tri koncentrácie:

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

4 × 0,401 U4 + S4 – U1 – S1

alebo

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

8 × 0,401 U8 + S8 – U2 – S2

Reálna aktivita = predpokladaná aktivita x relatívna aktivita

Ak je relatívna aktivita mimo rozpätia 0,5 až 2,0, opakujte skúšku a urobte vhodné úpravy koncentrácií extraktu alebo, ak to nie je možné, štandardných roztokov. Ak nie je možné dosiahnuť, aby mala relatívna aktivita požadované rozpätie, každý dosiahnutý výsledok sa musí považovať za približný a táto skutočnosť sa musí uviesť v záverečnej správe.

Ak sú krivky považované za nerovnobežné, opakujte stanovenie. Ak ani potom nedosiahnete rovnobežnosť, musí sa stanovenie považovať za neuspokojivé.

10. OPAKOVATEĽNOSŤ

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke tým istým laborantom/analytikom nesmie presiahnuť:

- 20 % relatívnych z najvyššej hodnoty pre obsahy monenzinátu sodného od 10 do 25 mg/kg,

- 5 mg/kg v absolútnej hodnote pre obsahy od 25 do 50 mg/kg,

- 10 % relatívnych z najvyššej hodnoty pre obsahy nad 50 mg/kg.

[1] Je možné použiť iné metódy za predpokladu, že dávajú rovnaké suspenzie spór.

[2] Je možné použiť akékoľvek komerčné kultivačné médium podobného zloženia s rovnakými výsledkami.

[3] 1 mg monenzinátu sodného sa rovná 1000 jednotiek UK.

[4] Je možné použiť iné metódy za predpokladu, že dávajú rovnaké suspenzie spór.

[5] Je možné použiť akékoľvek komerčné kultivačné médium s podobným zložením s rovnakými výsledkami.

--------------------------------------------------