|
2.
|
V časti B sa kapitola B.17 nahrádza takto:
„B.17
IN VITRO TESTY NA GÉNOVÉ MUTÁCIE CICAVČÍCH BUNIEK S VYUŽITÍM GÉNOV HPRT A XPRT
ÚVOD
|
1.
|
Táto testovacia metóda (TM) je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 476 (2016). Testovacie metódy sa pravidelne revidujú vzhľadom na vedecký pokrok, zmeny regulačných potrieb a dobré životné podmienky zvierat. Táto súčasná revidovaná verzia TM B.17 zohľadňuje takmer tridsaťročné skúsenosti s týmto testom, ako aj výsledky z vývoja samostatnej novej metódy zameranej na in vitro testy na génové mutácie cicavčích buniek s využitím génu tymidínkinázy. TM B.17 je súčasťou série testovacích metód v oblasti genetickej toxikológie. Bol vypracovaný dokument OECD, ktorý obsahuje stručné informácie o testovaní v oblasti genetickej toxikológie a prehľad posledných zmien, ktoré sa vykonali v usmerneniach OECD na vykonávanie testov v oblasti genetickej toxicity (1).
|
|
2.
|
In vitro test na génové mutácie cicavčích buniek sa používa na zistenie génových mutácií vyvolaných chemikáliami. V bunkových líniách, ktoré sa používajú v týchto testoch, sa merajú priame mutácie v reportérových génoch, konkrétne v endogénnom géne hypoxantín-guanín-fosforibozyltransferázy (Hprt v bunkách hlodavcov, HPRT v ľudských bunkách; v tejto testovacej metóde spoločne označované ako gén Hprt a test HPRT) a prenesenom géne xantín-guanín-fosforibozyltransferázy (gpt) (označovaný ako test XPRT). Testmi mutácií HPRT a XPRT sa zisťuje rôzne spektrum genetických udalostí. Okrem mutačných udalostí zisťovaných testom HPRT (napr. bázové zámeny, posuny čítacieho rámca, malé delécie a včlenenia) možno pomocou autozomálnej lokalizácie preneseného génu gpt zistiť mutácie v dôsledku veľkých delécií a prípadne mitotickej rekombinácie, ktorá sa nezistila prostredníctvom testu HPRT, pretože gén Hprt sa nachádza v X-chromozóme (2) (3) (4) (5) (6) (7). Pokiaľ ide o regulačné účely, test XPRT sa v súčasnosti využíva menej často než test HPRT.
|
|
3.
|
Vymedzenie použitých pojmov sa uvádza v dodatku 1.
|
POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA
|
4.
|
Testy vykonávané in vitro si vo všeobecnosti vyžadujú použitie exogénneho zdroja metabolickej aktivácie. Exogénny systém metabolickej aktivácie nenapodobňuje v plnej miere podmienky in vivo.
|
|
5.
|
Je potrebné dbať na to, aby sa predišlo podmienkam, ktoré by viedli k falošným pozitívnym výsledkom (t. j. možnej interakcii so systémom testovania), ktoré by neboli spôsobené priamou interakciou medzi testovanými chemikáliami a genetickým materiálom bunky, pričom medzi takéto podmienky patria zmeny pH alebo osmolality (8) (9) (10), interakcia so zložkami média (11) (12) alebo nadmerné úrovne cytotoxicity (13). Cytotoxicita, ktorá prekračuje odporúčané horné hranice cytotoxicity uvedené v odseku 19, sa na účely testu HPRT považuje za nadmernú.
|
|
6.
|
Pred použitím tejto testovacej metódy na zmesi s cieľom generovať údaje plánované na regulačné účely by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť adekvátne výsledky na tento účel, a ak áno, tak prečo. Takéto úvahy nie sú nutné, pokiaľ existuje regulatórna požiadavka na testovanie danej zmesi.
|
PRINCÍP TESTU
|
7.
|
Mutantné bunky s nedostatočnou enzymatickou aktivitou Hprt v teste HPRT alebo enzymatickou aktivitou xprt v teste XPRT sú rezistentné voči cytostatickým účinkom purínového analógu 6-tioguanínu (TG). Bunky s dostatkom Hprt (v teste HPRT) alebo gpt (v teste XPRT) sú citlivé na TG, čo spôsobuje inhibíciu bunkového metabolizmu a zastavuje ďalšie delenie buniek. Mutantné bunky sú tak schopné rozširovať sa za prítomnosti TG, zatiaľ čo normálne bunky, ktoré obsahujú Hprt (v teste HPRT) alebo gpt (v teste XPRT), toho schopné nie sú.
|
|
8.
|
Bunky v suspenzii alebo jednovrstvových kultúrach sa vystavia testovanej chemikálii s exogénnym zdrojom metabolickej aktivácie i bez takéhoto zdroja (pozri odsek 14) na primeraný čas (3 – 6 hodín) a následne sa subkultivujú na stanovenie cytotoxicity a na umožnenie fenotypového prejavu pred mutantnou selekciou (14) (15) (16) (17). Cytotoxicita sa určuje na základe relatívneho prežitia (RS), t. j. klonovacej účinnosti meranej bezprostredne po ošetrení pri zohľadnení všetkých strát buniek počas ošetrenia v porovnaní s negatívnou kontrolou (odsek 18 a dodatok 2). Ošetrené kultúry sa dostatočné obdobie, charakteristické pre každý typ buniek, udržiavajú v médiu, čo umožní takmer optimálny fenotypový prejav indukovaných mutácií (zvyčajne minimálne 7 – 9 dní). Po fenotypovom prejave sa frekvencia mutácií stanovuje zasadením známeho počtu buniek do média obsahujúceho selektívne činidlo na zistenie mutantných kolónií a do média bez selektívneho činidla na stanovenie klonovacej účinnosti (životaschopnosti). Po vhodnom inkubačnom čase sa kolónie zrátajú. Frekvencia mutácií sa vypočíta na základe počtu mutantných kolónií s korekciou podľa klonovacej účinnosti v čase mutantnej selekcie.
|
OPIS METÓDY
Príprava
Bunky
|
9.
|
Typy buniek použité na testy HPRT a XPRT majú mať preukázanú citlivosť na chemické mutagény, vysokú klonovaciu účinnosť, stabilný karyotyp a stabilnú frekvenciu spontánnych mutácií. Medzi najčastejšie používané bunky v teste HPRT patria línie CHO, CHL a V79 buniek škrečkov čínskych, lymfómové bunky myší L5178Y a TK6 ľudské lymfoblastoidné bunky (18) (19). Bunky AS52 odvodené od CHO, ktoré obsahujú prenesený gén gpt (a majú deletovaný gén Hprt), sa používajú pre test XPRT (20) (21); test HPRT nemožno uskutočniť na bunkách AS52 v dôsledku delécie génu hprt. Použitie iných bunkových línií má byť opodstatnené a validované.
|
|
10.
|
Bunkové línie by sa mali pravidelne kontrolovať, pokiaľ ide o stabilitu modálneho počtu chromozómov a o vylúčenie kontaminácie mykoplazmou (22) (23), a v prípade kontaminácie alebo zmeny modálneho počtu chromozómov by sa nemali použiť. Mala by sa stanoviť dĺžka bežného bunkového cyklu pri použití v skúšobnom laboratóriu, ktorá by mala byť v súlade s bunkovými charakteristikami uvedenými v literatúre. Je potrebné skontrolovať aj frekvenciu spontánnych mutácií v zásobe materských buniek a nepoužívať zásobu v prípade neprijateľnej frekvencie mutácií.
|
|
11.
|
Pred použitím v tomto teste sa kultúry podľa potreby prečistia od existujúcich mutantných buniek, napr. kultiváciou v médiu HAT pre test HPRT a v médiu MPA pre test XPRT (5) (24) (pozri dodatok 1). Prečistené bunky možno kryogénne zakonzervovať a následne rozmraziť, aby ich bolo možné používať ako pracovné zásoby. Nanovo rozmrazenú pracovnú zásobu možno používať na účely testu, keď sa dosiahnu normálne časy zdvojenia. Pri vykonávaní testu XPRT sa pre rutinnú kultúru buniek AS52 používajú podmienky, ktoré zabezpečujú udržiavanie preneseného génu gpt (20).
|
Médiá a podmienky kultivácie
|
12.
|
Na udržiavanie kultúr by sa malo použiť vhodné kultivačné médium a inkubačné podmienky (kultivačné nádoby, atmosféra s vyššou relatívnou vlhkosťou a 5 % CO2, inkubačná teplota 37 °C). Bunkové kultúry sa majú vždy udržiavať v podmienkach, v ktorých je zabezpečené, že ich rast prebieha v logaritmickej fáze. Osobitne dôležité je zvoliť médium a podmienky kultivácie tak, aby bol zabezpečený optimálny rast buniek počas doby expresie a optimálna klonovacia účinnosť mutantných aj nemutantných buniek.
|
Príprava kultúr
|
13.
|
Bunkové línie sa rozmnožujú zo zásobných kultúr, nasadia sa do kultivačného média v takej hustote, aby pri bunkách v suspenziách alebo v jednovrstvových bunkových kultúrach pokračoval exponenciálny rast počas času ošetrenia a doby expresie (napr. malo by sa zabrániť zhlukovaniu v prípade buniek rastúcich v jednovrstvových bunkových kultúrach).
|
Metabolická aktivácia
|
14.
|
Ak sa použijú bunky s nedostatočnou endogénnou metabolickou kapacitou, mali by sa použiť exogénne systémy metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším systémom, ktorý sa štandardne odporúča, pokiaľ to nie je odôvodnené inak, je kofaktormi obohatená postmitochondriálna frakcia (S9) pripravená z pečene hlodavcov (väčšinou potkanov) ošetrená činidlami na indukciu enzýmov, ako je napríklad Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) alebo kombinácia fenobarbitalu a β-naftoflavónu (29) (30) (31) (32). Použitie uvedenej kombinácie nie je v rozpore so Štokholmským dohovorom o perzistentných organických látkach (33) a preukázalo sa, že táto kombinácia je rovnako účinná pri indukcii oxidáz so zmiešanou funkciou ako Aroclor 1254 (29) (31). Frakcia S9 sa v konečnom testovacom médiu zvyčajne používa v koncentráciách od 1 obj. % do 2 obj. %, môže sa však zvýšiť až na 10 obj. %. Výber typu a koncentrácie použitého exogénneho systému metabolickej aktivácie alebo metabolického induktora môže ovplyvniť trieda testovaných látok (34) (35) (36).
|
Príprava testovanej chemikálie
|
15.
|
Testované chemikálie v tuhom skupenstve by sa podľa potreby mali rozpustiť vo vhodnom rozpúšťadle pred ich aplikáciou na bunky (pozri odsek 16). Kvapalné testované chemikálie možno pridať priamo do testovacieho systému a/alebo pred aplikáciou na testovací systém rozriediť. Plynné alebo prchavé testované chemikálie by sa mali testovať tak, že sa štandardné protokoly vhodne upravia, napríklad sa v nich uskutoční aplikácia v uzavretých kultivačných nádobách (37) (38). Prípravky testovanej chemikálie by sa mali pripraviť bezprostredne pred aplikáciou, pokiaľ údaje o stabilite nepoukazujú na prijateľnosť uskladnenia.
|
PODMIENKY TESTOVANIA
Rozpúšťadlá
|
16.
|
Rozpúšťadlo by sa malo zvoliť tak, aby sa optimalizovala rozpustnosť testovaných chemikálií bez toho, aby rozpúšťadlo malo negatívny vplyv na vykonávanie testu (napr. zmenou rastu buniek), ovplyvňovalo integritu testovanej chemikálie, reagovalo s kultivačnými nádobami a narušovalo systém metabolickej aktivácie. Odporúča sa, pokiaľ je to možné, najskôr zvážiť použitie vodného rozpúšťadla (alebo kultivačného média). Medzi osvedčené rozpúšťadlá patrí napr. voda a dimetylsulfoxid. Organické rozpúšťadlá by vo všeobecnosti nemali presiahnuť 1 obj. % a vodné rozpúšťadlá (fyziologický roztok alebo voda) by nemali presiahnuť 10 obj. % v konečnom médiu s testovanou chemikáliou. Ak sa použijú iné ako osvedčené rozpúšťadlá (napr. etanol alebo acetón), ich použitie by malo byť podložené údajmi o ich kompatibilite s testovanou chemikáliou a testovacím systémom a o tom, že v použitej koncentrácii nie sú genotoxické. V prípade, že tieto podkladové údaje nie sú k dispozícii, je dôležité do testu doplniť neošetrené kontroly (pozri dodatok 1) s cieľom preukázať, že zvolené rozpúšťadlo nevyvoláva žiadne nepriaznivé ani mutagénne účinky.
|
Meranie cytotoxicity a výber expozičných koncentrácií
|
17.
|
Pri stanovovaní najvyššej koncentrácie testovanej chemikálie by sa malo zabrániť použitiu koncentrácií, ktoré majú schopnosť vyvolať falošné pozitívne reakcie, napr. koncentrácií vyvolávajúcich nadmernú cytotoxicitu (pozri odsek 20), zrážanie kultivačného média (pozri odsek 21) alebo výrazné zmeny pH alebo osmolality (pozri odsek 5). Ak testovaná chemikália v čase, keď sa pridáva, spôsobuje výraznú zmenu pH média, mohlo by sa pH upraviť aplikovaním tlmivého roztoku do konečného média s testovanou chemikáliou tak, aby nedošlo k falošným pozitívnym výsledkom a aby sa zachovali vhodné kultivačné podmienky.
|
|
18.
|
Koncentrácia sa určuje na základe cytotoxicity a iných faktorov (pozri odseky 20 – 22). Aj keď z hľadiska lepšieho definovania koncentrácií, ktoré sa majú použiť v hlavnom experimente, môže byť užitočné hodnotenie cytotoxicity v počiatočnom teste, počiatočný test nie je povinný. Aj keď sa vykoná počiatočné hodnotenie cytotoxicity, vyžaduje sa aj meranie cytotoxicity jednotlivých kultúr v hlavnom experimente. Cytotoxicita sa hodnotí na základe relatívneho prežitia (RS), t. j. klonovacej účinnosti (CE) buniek naočkovaných bezprostredne po ošetrení pri zohľadnení všetkých strát buniek počas ošetrenia, a to na základe počtu buniek v porovnaní s upravenou klonovacou účinnosťou negatívnych kontrol (ktorým je priradená miera prežitia 100 %) (pozri vzorec v dodatku 2).
|
|
19.
|
Mali by sa vyhodnotiť aspoň štyri testovacie koncentrácie (bez rozpúšťadla a pozitívnych kontrol), ktoré spĺňajú kritériá prijateľnosti (vhodná cytotoxicita, počet buniek atď.). Hoci sa odporúča použitie duplicitných kultúr, pri každej testovanej koncentrácii sa môžu použiť buď paralelné kultúry, alebo jednotlivé ošetrené kultúry. Výsledky získané z nezávislých paralelných kultúr pri danej koncentrácii sa majú uvádzať samostatne, možno ich však zlúčiť na účely analýzy údajov (17). V prípade testovaných chemikálií, ktoré vykazujú malú alebo nevykazujú žiadnu cytotoxicitu, budú za bežných okolností vhodné približne dvojnásobné až trojnásobné intervaly koncentrácií. Pri výskyte cytotoxicity by vybrané testované koncentrácie mali pokrývať rozsah od koncentrácie, ktorá vyvoláva cytotoxicitu, po koncentrácie, pri ktorých je cytotoxicita mierna a slabá alebo žiadna. Mnohé testované chemikálie vykazujú strmé krivky závislosti reakcie od koncentrácie a s cieľom pokryť celý rozsah cytotoxicity alebo podrobne preskúmať vzťah medzi koncentráciou a reakciou môže byť nevyhnutné použiť viac koncentrácií s tesným odstupom a viac ako štyri koncentrácie, najmä v situáciách, keď sa vyžaduje opakovať experiment (pozri odsek 43). Použitie viac ako štyroch koncentrácií môže byť obzvlášť dôležité pri použití jednotlivých kultúr.
|
|
20.
|
Ak maximálna koncentrácia vychádza z cytotoxicity, cieľová najvyššia koncentrácia by mala mať hodnotu relatívneho prežitia v rozsahu 20 až 10 %. Pri interpretácii pozitívnych výsledkov, ktoré sa zistili len pri hodnote relatívneho prežitia 10 % alebo nižšej, je potrebné postupovať obozretne (odsek 43).
|
|
21.
|
V prípade slabo rozpustných testovaných chemikálií, ktoré nie sú cytotoxické pri koncentráciách nižších, než je najnižšia nerozpustná koncentrácia, by najvyššia analyzovaná koncentrácia mala na konci ošetrenia testovanou chemikáliou vyvolať zakalenie alebo zrazeninu viditeľnú voľným okom alebo pomocou inverzného mikroskopu. Aj keď sa cytotoxicita vyskytne pri koncentrácii vyššej, ako je najnižšia nerozpustná koncentrácia, testovať sa odporúča len pri jednej koncentrácii vyvolávajúcej zakalenie alebo viditeľnú zrazeninu, pretože falošné účinky môžu byť spôsobené zrazeninou. Pri koncentrácii vyvolávajúcej zrazeninu je potrebné zabezpečiť, aby táto zrazenina nenarušovala vykonávanie testu. Môže byť užitočné pred experimentom stanoviť rozpustnosť v kultivačnom médiu.
|
|
22.
|
Ak sa nezistí žiadna zrazenina ani obmedzujúca cytotoxicita, najvyššia testovaná koncentrácia by mala zodpovedať 10 mM, 2 mg/ml alebo 2 μl/ml, podľa toho, ktorá je najnižšia (39) (40). Keď testovaná chemikália nemá určené zloženie, napr. látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály [t. j. chemické látky neznámeho alebo variabilného zloženia (UVCB)] (41), extrakty z prostredia atď., môže byť potrebná vyššia maximálna koncentrácia (napr. 5 mg/mL) v prípade absencie dostatočnej cytotoxicity, aby sa zvýšila koncentrácia jednotlivých zložiek. Je však potrebné poznamenať, že tieto požiadavky sa môžu v prípade humánnych liekov líšiť (42).
|
Kontroly
|
23.
|
Pre všetky experimentálne podmienky by sa mali zahrnúť súbežné negatívne kontroly (pozri odsek 16), ktoré pozostávajú zo samotného rozpúšťadla v médiu s testovanou chemikáliou a s ktorými sa manipuluje rovnakým spôsobom ako s ošetrenými kultúrami.
|
|
24.
|
Súbežné pozitívne kontroly sú potrebné na preukázanie schopnosti laboratória identifikovať mutagény v podmienkach použitého testovacieho protokolu a v prípade potreby aj na preukázanie účinnosti exogénneho systému metabolickej aktivácie. Príklady pozitívnych kontrol sú uvedené v tabuľke 1 ďalej. V odôvodnených prípadoch sa môžu na pozitívnu kontrolu použiť alternatívne látky. Keďže testy na cicavčích bunkách in vitro na zistenie genetickej toxicity sú dostatočne štandardizované, možno testy využívajúce ošetrenia s exogenóznou metabolickou aktiváciou a bez takejto aktivácie uskutočniť len pomocou pozitívnej kontroly vyžadujúcej metabolickú aktiváciu. V tomto prípade reakcia na túto jednu pozitívnu kontrolu preukáže činnosť systému metabolickej aktivácie, ako aj vnímavosť testovacieho systému. Každá pozitívna kontrola sa má použiť pri jednej alebo viacerých koncentráciách, pri ktorých sa očakáva reprodukovateľný a zistiteľný nárast voči pozadiu s cieľom preukázať citlivosť testovacieho systému, pričom reakciu by nemalo narušiť prekročenie limitov cytotoxicity, ktoré sú stanovené pre túto testovaciu metódu (pozri odsek 20).
|
Tabuľka 1
Referenčné látky odporúčané na posúdenie spôsobilosti laboratória a na výber pozitívnych kontrol
|
Stav metabolickej aktivácie
|
Lokus
|
Látka a číslo CAS
|
|
neprítomnosťexogénnej metabolickej aktivácie
|
Hprt
|
etyl-metánsulfonát [č. CAS 62-50-0] N-etyl-N-nitrózomočovina [č. CAS 759-73-9] 4-nitrochinolín-1-oxid [č. CAS 56-57-5]
|
|
|
xprt
|
streptonigrín [č. CAS 3930-19-6] mitomycín C [č. CAS 50-07-7]
|
|
prítomnosť exogénnej metabolickej aktivácie
|
Hprt
|
3-metylcholantrén [č. CAS 56-49-5] 7,12-dimetylbenzantracén [č. CAS 57-97-6] benzo[a]pyrén (č. CAS 50-32-8)
|
|
|
xprt
|
benzo[a]pyrén (č. CAS 50-32-8)
|
POSTUP
Ošetrenie testovanou chemikáliou
|
25.
|
Proliferujúce bunky sa ošetria testovanou chemikáliou za prítomnosti aj za neprítomnosti systému metabolickej aktivácie. Expozícia trvá primeraný čas (primeraný čas je zvyčajne 3 až 6 hodín).
|
|
26.
|
Minimálny počet buniek použitých v každej z testovacích kultúr (kontrolnej aj ošetrenej) v každom štádiu testu je založený na frekvencii spontánnych mutácií. Všeobecným usmernením je ošetriť a subkultivovať dostatočný počet buniek na to, aby sa vo všetkých štádiách testu vo všetkých kultúrach zachovalo 10 spontánnych mutantov (17). Frekvencia spontánnych mutácií je vo všeobecnosti v rozsahu 5 až 20 × 10-6. Na dosiahnutie frekvencie spontánnych mutácií 5 × 10-6 a zachovanie dostatočného počtu spontánnych mutantov (najmenej 10) aj pri kultúrach ošetrených pomocou koncentrácií, ktoré počas ošetrenia spôsobujú 90 % cytotoxicitu (10 % relatívne prežitie), by bolo potrebné ošetriť aspoň 20 × 106 buniek. Okrem toho sa počas doby expresie musí kultivovať a naočkovať na účely mutantnej selekcie dostatočný počet buniek (nikdy nie menej ako 2 milióny) (17).
|
Čas do prejavenia fenotypu a meranie frekvencie mutácií
|
27.
|
Po období ošetrenia sa vykoná kultivácia buniek, aby sa mohol prejaviť mutantný fenotyp. Najmenej 7 až 9 dní je vo všeobecnosti dostatočných, aby bol možný takmer optimálny fenotypový prejav novoindukovaných mutantov Hprt a xprt (43) (44). Počas tohto času sa bunky pravidelne subkultivujú, aby sa zachoval ich exponenciálny rast. Po fenotypovom prejave sa bunky opätovne naočkujú do média so selektívnym činiteľom aj bez selektívneho činiteľa (6-tioguanín) na stanovenie počtu mutantov, resp. klonovacej účinnosti v čase selekcie. Na toto očkovanie možno použiť Petriho misky na jednovrstvové bunkové kultúry alebo mikrotitračné platničky pre bunky v suspenzii. Na účely mutantnej selekcie sa bunky naočkujú s takou hustotou, aby sa zabezpečila optimálna výťažnosť mutantov (t. j. aby sa predišlo metabolickému spolupôsobeniu) (17). Misky sa inkubujú primeraný čas na zabezpečenie optimálneho rastu kolónie (napr. 7 – 12 dní) a kolónie sa spočítajú. Frekvencia mutácií sa vypočíta na základe počtu mutantných kolónií s korekciou podľa klonovacej účinnosti v čase mutantnej selekcie (pozri vzorce v dodatku 2).
|
Spôsobilosť laboratória
|
28.
|
Na to, aby sa pred vykonaním rutinného testu zistilo, či má laboratórium s danou skúškou dostatočné skúsenosti, malo by mať vykonanú sériu pokusov s referenčnými pozitívnymi látkami pôsobiacimi prostredníctvom rôznych mechanizmov (aspoň jedna látka aktívna s metabolickou aktiváciou a jedna látka aktívna bez metabolickej aktivácie, vybraté z látok uvedených v tabuľke 1) a s rôznymi negatívnymi kontrolami (pri použití rôznych rozpúšťadiel/nosičov). Reakcie týchto pozitívnych a negatívnych kontrol by mali byť v súlade s príslušnou literatúrou. Tento postup sa nepoužije v prípade laboratórií, ktoré majú skúsenosti, t. j. ktoré majú k dispozícii databázu historických údajov, ako sa definuje v odsekoch 30 až 33.
|
|
29.
|
Mal by sa preskúmať výber látok na pozitívnu kontrolu (pozri tabuľku 1 v odseku 25) za neprítomnosti aj za prítomnosti metabolickej aktivácie, aby sa preukázala spôsobilosť zistiť mutagénne chemikálie, stanoviť účinnosť systému metabolickej aktivácie a preukázať vhodnosť podmienok pre rast buniek počas ošetrovania, fenotypového prejavu a mutatnej selekcie, ako aj vhodnosť postupov hodnotenia. Rozsah koncentrácií vybraných látok by sa mal zvoliť tak, aby poskytol opakovateľné zvýšenia súvisiace s jednotlivými koncentráciami v porovnaní s úrovňou pozadia, aby sa tak preukázala citlivosť a dynamické rozpätie testovacieho systému.
|
Údaje o historických kontrolách
|
30.
|
Laboratórium by malo určiť:
|
—
|
rozsah a distribúciu historických pozitívnych kontrol,
|
|
—
|
rozsah a distribúciu historických negatívnych kontrol (neošetrených, s rozpúšťadlom).
|
|
|
31.
|
Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s distribúciou historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými údajmi o kontrolách (22). S pridávaním ďalších experimentálnych údajov k distribúcii kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tejto distribúcie (17) (45) (46).
|
|
32.
|
Databázu historických negatívnych kontrol laboratória by na začiatku malo tvoriť minimálne 10 experimentov, ale podľa možnosti by mala pozostávať aspoň z 20 experimentov vykonaných za porovnateľných experimentálnych podmienok. Laboratóriá by mali použiť metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (47)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov týkajúcich sa pozitívnych a negatívnych kontrol a preukázať, že metodika v danom laboratóriu je „pod kontrolou“ (46). Ďalšie odporúčania k vytváraniu a využívaniu historických údajov (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného experimentu) možno nájsť v literatúre (45).
|
|
33.
|
Údaje o negatívnych kontrolách majú obsahovať frekvencie mutácií z jednej alebo prednostne z paralelných kultúr podľa opisu v odseku 23. Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí distribúcie databázy historických negatívnych kontrol laboratória (17) (45) (46). V prípade, že údaje o súbežných negatívnych kontrolách nepatria do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do distribúcie historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne mimo uvedených medzí a pokiaľ existujú dôkazy o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri vyššie), a dôkazy o tom, že nedošlo k technickému alebo ľudskému zlyhaniu.
|
|
34.
|
Všetky zmeny v skúšobnom protokole by sa mali zvážiť z hľadiska ich súladu s existujúcimi databázami historických kontrol laboratória. Každý výrazný nesúlad by mal viesť k vytvoreniu novej databázy historických kontrol.
|
ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
Prezentovanie výsledkov
|
35.
|
Súčasťou prezentovania výsledkov majú byť všetky údaje potrebné na výpočet cytotoxicity (vyjadrenej ako relatívne prežitie). Tieto údaje, ktoré sa uvádzajú pre ošetrené aj kontrolné kultúry, obsahujú počet buniek na konci ošetrenia, počet buniek naočkovaných bezprostredne po ošetrení a počty kolónií (alebo počet jamiek bez kolónií v prípade mikrotitračnej metódy). Relatívne prežitie jednotlivých kultúr sa vyjadruje ako percentuálna hodnota vzhľadom na súbežnú kontrolu s aplikáciou rozpúšťadla (pozri vymedzenie pojmov v dodatku 1).
|
|
36.
|
Súčasťou prezentovania výsledkov majú byť aj všetky údaje potrebné na výpočet frekvencie mutácií. Údaje, ktoré sa uvádzajú pre ošetrené aj kontrolné kultúry, obsahujú: 1. počet buniek naočkovaných so selektívnym činiteľom a bez selektívneho činiteľa (v čase naočkovania buniek na účely mutantnej selekcie) a 2. počet spočítaných kolónií (alebo počet jamiek bez kolónií v prípade mikrotitračnej metódy) z misiek so selektívnym činiteľom a bez selektívneho činiteľa. Frekvencia mutácií sa vypočíta na základe počtu mutantných kolónií (v miskách so selektívnym činiteľom) s korekciou podľa klonovacej účinnosti (z misiek bez selektívneho činiteľa). Frekvencia mutácií sa vyjadruje ako počet mutantných buniek na milión životaschopných buniek (pozri vymedzenie pojmov v dodatku 1).
|
|
37.
|
Mali by sa uvádzať údaje o jednotlivých kultúrach. Všetky údaje sa dodatočne sumarizujú v tabuľkovej forme.
|
Kritériá prijateľnosti
|
38.
|
Prijateľnosť testu je založená na týchto kritériách:
|
—
|
Súbežná negatívna kontrola sa považuje za prijateľnú na doplnenie do databázy historických negatívnych kontrol laboratória, ako je opísané v odseku 33.
|
|
—
|
Súbežné pozitívne kontroly (pozri odsek 24) by mali vyvolať reakcie, ktoré sú zlučiteľné s reakciami generovanými v databáze historických pozitívnych kontrol, a viesť k štatisticky významnému nárastu v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou.
|
|
—
|
Testovali sa dve experimentálne podmienky (t. j. s metabolickou aktiváciou a bez metabolickej aktivácie), pokiaľ jedna z nich neviedla k pozitívnym výsledkom (pozri odsek 25).
|
|
—
|
Analyzovateľný je adekvátny počet buniek a koncentrácií (odseky 25, 26 a 19).
|
|
—
|
Kritériá výberu najvyššej koncentrácie sú v súlade s kritériami opísanými v odsekoch 20, 21 a 22.
|
|
Hodnotenie a interpretácia výsledkov
|
39.
|
Za predpokladu, že všetky kritériá prijateľnosti sú splnené, sa testovaná chemikália pokladá za jednoznačne pozitívnu, ak pre ktorúkoľvek z preskúmaných experimentálnych podmienok platí, že:
|
—
|
aspoň jedna z testovaných koncentrácií vykazuje štatisticky významné zvýšenie v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,
|
|
—
|
ide o nárast, pri ktorom sa pri hodnotení vhodným testovaním trendov potvrdí súvislosť s koncentráciou,
|
|
—
|
niektorý z týchto výsledkov je mimo distribúcie údajov historických negatívnych kontrol (napr. mimo 95 % regulačných medzí Poissonovho rozdelenia, pozri odsek 33).
|
Ak sú splnené všetky tieto kritériá, testovaná chemikália sa považuje za schopnú vyvolať génové mutácie v kultivovaných bunkách cicavcov v tomto testovacom systéme. Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (46) (48).
|
|
40.
|
Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jednoznačne negatívnu, ak pre všetky preskúmané experimentálne podmienky platí, že:
|
—
|
ani jedna z testovaných koncentrácií nevykazuje štatisticky významný nárast v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,
|
|
—
|
hodnotenie pomocou vhodného testovania trendov ukáže, že nedochádza k nárastu v závislosti od koncentrácie,
|
|
—
|
všetky výsledky sa vyskytujú v rámci distribúcie historických údajov negatívnych kontrol (napr. v 95 % regulačných medziach Poissonovho rozdelenia, pozri odsek 33).
|
Testovaná chemikália sa vtedy považuje za neschopnú vyvolať génové mutácie v kultivovaných bunkách cicavcov v tomto testovacom systéme.
|
|
41.
|
Neexistuje požiadavka na potvrdenie jednoznačne pozitívnej alebo negatívnej reakcie.
|
|
42.
|
V prípade, že reakcia nie je jednoznačne negatívna ani jednoznačne pozitívna podľa uvedeného opisu, alebo v prípade, že ide o pomoc pri stanovovaní biologickej relevantnosti výsledku, by sa údaje mali odborne posúdiť a/alebo podrobiť ďalšiemu skúmaniu. Prípadne by mohlo byť užitočné uskutočnenie opakovaného experimentu pomocou zmenených experimentálnych podmienok [napr. odstup medzi koncentráciami, iné podmienky metabolickej aktivácie (t. j. koncentrácia S9 alebo pôvod S9)].
|
|
43.
|
V zriedkavých prípadoch neumožní súbor údajov ani po ďalšom skúmaní vyvodiť záver o pozitívnom alebo negatívnom výsledku. Reakcia na testovanú chemikáliu sa preto uzavrie ako nejednoznačná (interpretovaná ako s rovnakou pravdepodobnosťou pozitívna alebo negatívna).
|
Správa o teste
|
44.
|
Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:
|
|
Testovaná chemikália:
|
—
|
zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii,
|
|
—
|
stabilita testovanej chemikálie, ak je známa,
|
|
—
|
rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle, ak je známa,
|
|
—
|
prípadné meranie pH, osmolality a zrazeniny v kultivačnom médiu, do ktorého bola pridaná testovaná chemikália.
|
|
|
|
Jednozložkové látky:
|
—
|
fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,
|
|
—
|
identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď.
|
|
|
|
Viaczložkové látky, UVCB a zmesi:
|
—
|
charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek.
|
|
|
|
Rozpúšťadlo:
|
—
|
zdôvodnenie výberu rozpúšťadla,
|
|
—
|
percentuálny podiel rozpúšťadla v konečnom kultivačnom médiu.
|
|
|
|
Pre hlavné laboratórne kultúry:
|
—
|
typ, zdroj bunkových línií,
|
|
—
|
počet pasáží, ak je dostupný, a história laboratória,
|
|
—
|
vlastnosti karyotypu a/alebo modálny počet chromozómov,
|
|
—
|
metódy udržiavania bunkových kultúr,
|
|
—
|
neprítomnosť mykoplazmy,
|
|
|
|
Podmienky testovania:
|
—
|
zdôvodnenie výberu koncentrácií a počtu kultúr vrátane napríklad údajov o cytotoxicite a obmedzení rozpustnosti,
|
|
—
|
skladba média, koncentrácia CO2, úroveň vlhkosti,
|
|
—
|
koncentrácia testovanej chemikálie vyjadrená ako konečná koncentrácia v kultivačnom médiu (napr. μg alebo mg/ml alebo mM kultivačného média),
|
|
—
|
koncentrácia (a/alebo objem) rozpúšťadla a testovanej chemikálie pridaných do kultivačného média,
|
|
—
|
hustota buniek počas ošetrenia,
|
|
—
|
typ a zloženie systému metabolickej aktivácie (zdroj S9, metóda prípravy zmesi S9, koncentrácia alebo objem zmesi S9 a S9 v konečnom kultivačnom médiu, kontroly kvality S9),
|
|
—
|
látky na pozitívnu a negatívnu kontrolu, konečné koncentrácie pre každú z podmienok ošetrenia;
|
|
—
|
dĺžka doby expresie (vrátane počtu vysadených buniek, subkultúr a harmonogramov kŕmenia, ak je to vhodné),
|
|
—
|
identita selektívneho činiteľa a jeho koncentrácia,
|
|
—
|
kritériá prijateľnosti testov,
|
|
—
|
metódy použité na stanovenie počtu životaschopných a mutantných buniek,
|
|
—
|
metódy použité na meranie cytotoxicity,
|
|
—
|
akékoľvek doplňujúce informácie týkajúce sa cytotoxicity a použitej metódy,
|
|
—
|
dĺžka inkubačného času po očkovaní,
|
|
—
|
kritériá na považovanie štúdií za pozitívne, negatívne alebo nejednoznačné,
|
|
—
|
metódy použité na určenie pH, osmolality a zrážania.
|
|
|
|
Výsledky:
|
—
|
počet ošetrených buniek a počet subkultivovaných buniek pre jednotlivé kultúry,
|
|
—
|
merania cytotoxicity a prípadné iné pozorovania,
|
|
—
|
známky zrážania a čas ich stanovenia,
|
|
—
|
počet buniek naočkovaných v selektívnom a neselektívnom médiu,
|
|
—
|
počet kolónií v neselektívnom médiu a počet rezistentných kolónií v selektívnom médiu a súvisiace frekvencie mutácií,
|
|
—
|
ak je to možné, závislosť medzi koncentráciou a reakciou,
|
|
—
|
údaje o súbežných negatívnych (rozpúšťadlo) a pozitívnych kontrolách (koncentrácie a rozpúšťadlá),
|
|
—
|
historické údaje o negatívnych (rozpúšťadlo) a pozitívnych kontrolách obsahujúce rozsahy, stredné hodnoty, štandardné odchýlky a interval spoľahlivosti (napr. 95 %), ako aj počet údajov,
|
|
—
|
štatistické analýzy (pre jednotlivé kultúry a spojené paralelné kultúry v odôvodnených prípadoch) a hodnoty p, ak existujú.
|
|
|
LITERATÚRA
|
(1)
|
OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.
|
|
(2)
|
Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.
|
|
(3)
|
Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306–1312.
|
|
(4)
|
Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394–403.
|
|
(5)
|
Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121–128.
|
|
(6)
|
Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235–239.
|
|
(7)
|
Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. Mutation Res., 196, 17–36.
|
|
(8)
|
Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147–204.
|
|
(9)
|
Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297–305.
|
|
(10)
|
Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789–886.
|
|
(11)
|
Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439–452.
|
|
(12)
|
Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177–183.
|
|
(13)
|
Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 584, 1–256.
|
|
(14)
|
Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O’Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135–141.
|
|
(15)
|
Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9–17.
|
|
(16)
|
Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133–147.
|
|
(17)
|
Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, s. 66–101.
|
|
(18)
|
Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193–214.
|
|
(19)
|
Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165–175.
|
|
(20)
|
Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411–1415.
|
|
(21)
|
Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.
|
|
(22)
|
Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in preparation).
|
|
(23)
|
Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261–287.
|
|
(24)
|
Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299–305.
|
|
(25)
|
Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83–90.
|
|
(26)
|
Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365–373.
|
|
(27)
|
Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347–364.
|
|
(28)
|
Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.
|
|
(29)
|
Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175–177.
|
|
(30)
|
Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, s. 85–88.
|
|
(31)
|
Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55–65.
|
|
(32)
|
Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.
|
|
(33)
|
UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). K dispozícii na adrese: [http://www.pops.int.html].
|
|
(34)
|
Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.
|
|
(35)
|
O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.
|
|
(36)
|
Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.
|
|
(37)
|
Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91-103.
|
|
(38)
|
Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.
|
|
(39)
|
OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Available upon request from the Organisation for Economic Cooperation and Development.
|
|
(40)
|
Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.
|
|
(41)
|
EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,
|
|
(42)
|
USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. K dispozícii na adrese: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].
|
|
(43)
|
O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.
|
|
(44)
|
Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.
|
|
(45)
|
Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.
|
|
(46)
|
OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
|
|
(47)
|
Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141-154.
|
|
(48)
|
Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.
|
Dodatok 1
VYMEDZENIE POJMOV
Substitučné mutagény bázového páru: chemikálie, ktoré spôsobujú substitúciu bázových párov v DNA.
Chemikália: látka alebo zmes.
Klonovacia účinnosť: percentuálny podiel buniek naočkovaných s nízkou hustotou, ktoré sú rastom schopné vytvoriť kolóniu, ktorú možno spočítať.
Koncentrácie: sú konečné koncentrácie testovanej chemikálie v kultivačnom médiu.
Cytotoxicita: v prípade skúšok v rámci tejto testovacej metódy znamená cytotoxicita pokles relatívneho prežitia ošetrených buniek v porovnaní s negatívnou kontrolou (pozri príslušný odsek).
Priama mutácia: génová mutácia z rodičovského typu na mutantnú formu, ktorá spôsobuje zmenu alebo stratu enzymatickej aktivity alebo funkcie kódovaného proteínu.
Konštrukčné mutagény: chemikálie, ktoré v molekule DNA spôsobujú pridanie alebo deléciu jedného alebo viacerých bázových párov.
Genotoxický: všeobecný výraz, ktorý zahŕňa všetky typy poškodenia DNA alebo chromozómov vrátane zlomov DNA, aduktov, zmien usporiadania, mutácií, chromozómových aberácií a aneuploidie. Nie všetky typy genotoxických účinkov majú za následok mutácie alebo trvalé poškodenie chromozómov.
Médium HAT: médium, ktoré obsahuje hypoxantín, aminopterín a tymidín a slúži na odstránenie mutantov HPRT.
Mitotická rekombinácia: rekombinácia medzi homológnymi chromatidmi počas mitózy, ktorá môže potenciálne indukovať zlom dvojvláknového reťazca DNA alebo stratu heterozygozity.
Médium MPA: médium, ktoré obsahuje xantín, adenín, tymidín, aminopterín a kyselinu mykofenolovú a slúži na odstránenie mutantov XPRT.
Mutagénny: produkujúci dedičnú zmenu sekvencie(-í) párov báz DNA v génoch alebo štruktúry chromozómov (chromozómové aberácie).
Frekvencia mutácií (MF): podiel počtu zistených mutantných kolónií a počtu buniek naočkovaných v selektívnom médiu, ktorý sa upraví na základe klonovacej účinnosti (alebo životaschopnosti) v čase selekcie.
Čas do prejavenia fenotypu: Čas po ošetrení, počas ktorého prebieha genetická zmena v rámci genómu a už existujúce génové produkty sa vyčerpajú až do bodu, keď dôjde k zmene fenotypovej charakteristiky.
Relatívne prežitie (RS): na základe relatívneho prežitia sa meria cytotoxicita súvisiaca s ošetrením. Relatívne prežitie predstavuje klonovaciu účinnosť (CE) buniek naočkovaných bezprostredne po ošetrení pri zohľadnení všetkých strát buniek počas ošetrenia v porovnaní s klonovacou účinnosťou negatívnych kontrol (ktorým je priradená miera prežitia 100 %).
Frakcie pečene S9: supernatant pečeňového homogenátu po odstredení pri 9 000 g, t. j. surový pečeňový extrakt.
Zmes S9: zmes frakcie pečene S9 a kofaktorov potrebných pre aktivitu metabolických enzýmov.
Kontrola s aplikáciou rozpúšťadla: všeobecný termín na vymedzenie kontrolných kultúr, ku ktorým sa pridáva len rozpúšťadlo používané na rozpúšťanie testovanej chemikálie.
Testovaná chemikália: každá látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
Neošetrená kontrola: kultúry, ktoré sa neošetrujú (t. j. testovanou chemikáliou ani rozpúšťadlom), ale sa spracovávajú súbežne a rovnakým spôsobom ako kultúry, ku ktorým sa pridáva testovaná chemikália.
UVCB: chemické látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály.
Dodatok 2
VZORCE NA POSÚDENIE CYTOTOXICITY A FREKVENCIE MUTÁCIÍ
Cytotoxicita sa hodnotí na základe relatívneho prežitia, t. j. klonovacej účinnosti (CE) buniek naočkovaných bezprostredne po ošetrení pri zohľadnení všetkých strát buniek počas ošetrenia v porovnaní s upravenou klonovacou účinnosťou negatívnych kontrol (ktorým je priradená miera prežitia 100 %) (pozri vzorec relatívneho prežitia ďalej).
Upravená klonovacia účinnosť pre kultúru ošetrenú pomocou testovanej chemikálie sa vypočíta ako:
Relatívne prežitie (RS) pre kultúru ošetrenú pomocou testovanej chemikálie sa vypočíta ako:
Frekvencia mutácií predstavuje podiel klonovacej účinnosti mutantných kolónií v selektívnom médiu a klonovacej účinnosti v neselektívnom médiu, ktorá sa meria pre tú istú kultúru v čase selekcie.
Keď sa na účely klonovacej účinnosti používajú Petriho misky:
|
Klonovacia účinnosť = počet kolónií/počet naočkovaných buniek.
|
Keď sa na účely klonovacej účinnosti používajú mikrotitračné platničky:
|
Počet kolónií na jamku mikrotitračnej platničky zodpovedá Poissonovmu rozdeleniu.
|
|
Klonovacia účinnosť = –LnP(0)/počet naočkovaných buniek na jednu jamku
|
|
Keď –LnP(0) je pravdepodobný počet prázdnych jamiek spomedzi nasadených jamiek a opisuje ho tento vzorec:
|
|
LnP(0) = –Ln (počet prázdnych jamiek/počet naočkovaných jamiek).
|
“ |
In force
