Accept Refuse

EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32016R0266

Nariadenie Komisie (EÚ) 2016/266 zo 7. decembra 2015, ktorým sa na účely prispôsobenia technickému pokroku mení nariadenie (ES) č. 440/2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) (Text s významom pre EHP)

C/2015/8529

OJ L 54, 1.3.2016, p. 1–446 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2016/266/oj

1.3.2016   

SK

Úradný vestník Európskej únie

L 54/1


NARIADENIE KOMISIE (EÚ) 2016/266

zo 7. decembra 2015,

ktorým sa na účely prispôsobenia technickému pokroku mení nariadenie (ES) č. 440/2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH)

(Text s významom pre EHP)

EURÓPSKA KOMISIA,

so zreteľom na Zmluvu o fungovaní Európskej únie,

so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (1), a najmä na jeho článok 13 ods. 2,

keďže:

(1)

Nariadenie Komisie (ES) č. 440/2008 (2) obsahuje testovacie metódy na určovanie fyzikálno-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity chemikálií, ktoré sa majú používať na účely nariadenia (ES) č. 1907/2006.

(2)

Nariadenie (ES) č. 440/2008 je nevyhnutné aktualizovať tak, aby zahŕňalo nové a aktualizované testovacie metódy, ktoré nedávno prijala OECD, a tým sa zohľadnil technický pokrok a zaručilo zníženie počtu zvierat používaných na pokusné účely v súlade so smernicou Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ (3). Tento návrh bol prekonzultovaný so zainteresovanými stranami.

(3)

Prispôsobenie obsahuje 20 testovacích metód: jednu novú metódu na stanovenie fyzikálno-chemickej vlastnosti, 11 nových skúšobných metód a tri aktualizované testovacie metódy na hodnotenie ekotoxicity a päť nových testovacích metód na posúdenie osudu a správania v životnom prostredí.

(4)

Nariadenie (ES) č. 440/2008 by sa preto malo zodpovedajúcim spôsobom zmeniť.

(5)

Opatrenia stanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom výboru zriadeného na základe článku 133 nariadenia (ES) č. 1907/2006,

PRIJALA TOTO NARIADENIE:

Článok 1

Príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa mení v súlade s prílohou k tomuto nariadeniu.

Článok 2

Toto nariadenie nadobúda účinnosť tretím dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch

V Bruseli 7. decembra 2015

Za Komisiu

predseda

Jean-Claude JUNCKER


(1)  Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2)  Nariadenie Komisie (ES) č. 440/2008 z 30. mája 2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH) (Ú. v. EÚ L 142, 31.5.2008, s. 1).

(3)  Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely (Ú. v. EÚ L 276, 20.10.2010, s. 33).


PRÍLOHA

Príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa mení takto:

1.

Na začiatok prílohy sa pred časť A vkladá poznámka:

„Poznámka:

Pred použitím niektorej z týchto testovacích metód na testovanie viaczložkovej látky (MCS), látky neznámeho alebo premenlivého zloženia, produktu komplexnej reakcie alebo biologického materiálu (UVCB), alebo zmesi a v prípade, že sa jej použiteľnosť na testovanie MCS, UVCB alebo zmesí v príslušnej metóde neuvádza, malo by sa zvážiť, či daná metóda spĺňa stanovený regulačný účel.

Ak sa daná testovacia metóda používa na testovanie MCS, UVCB alebo zmesi, mali by byť dostupné čo najpodrobnejšie informácie o jej zložení napr. na základe chemickej identity jej zložiek, ich kvantitatívneho výskytu a príslušných vlastností zložiek.“

2.

Dopĺňa sa kapitola A.24:

A.24.   ROZDEĽOVACIA KONŠTANTA (N-OKTANOL/VODA), METÓDA VYSOKOÚČINNEJ KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE (HPLC)

ÚVOD

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 117 (2004).

1.

Rozdeľovacia konštanta (P) je vymedzená ako pomer rovnovážnych koncentrácií rozpustenej látky v dvojfázovom systéme pozostávajúcom z dvoch do značnej miery nezmiešateľných rozpúšťadiel. V prípade n-oktanolu a vody platí:

Formula

rozdeľovacia konštanta je podielom dvoch koncentrácií; je to bezrozmerná veličina a zvyčajne sa udáva vo forme dekadického logaritmu.

2.

Pow je kľúčovým parametrom v štúdiách osudu chemických látok v životnom prostredí. Bol preukázaný veľmi významný vzťah medzi Pow neionizovanej formy látok a ich bioakumuláciou v rybách. Ukázalo sa tiež, že Pow je užitočným parametrom pri predpovedaní adsorpcie, pokiaľ ide o pôdu a sedimenty a pri stanovovaní kvantitatívnych vzťahov štruktúry a aktivity pre širokú škálu biologických účinkov.

3.

Pôvodný návrh tejto testovacej metódy vychádzal z článku, ktorý napísali C. V. Eadsforth and P. Moser (1). Vývoj testovacej metódy a medzilaboratórneho porovnávacieho testu OECD koordinoval Spolkový úrad pre životné prostredie (Umweltbundesamt) Spolkovej republiky Nemecko v roku 1986 (2).

ÚVODNÉ ÚVAHY

4.

Hodnoty log Pow v rozsahu od – 2 do 4 (príležitostne až 5 a viac) (1) je možné experimentálne stanoviť metódou trepačkovej banky (kapitola A.8 tejto prílohy; usmernenie OECD na vykonávanie testov 107). Metóda vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) sa používa pri hodnotách log Pow v rozsahu od 0 do 6 [odkazy v literatúre (1), (2), (3), (4), (5)]. Táto metóda si môže vyžadovať odhad hodnoty Pow na výber vhodných referenčných látok a na podopretie akýchkoľvek záverov vyvodených z údajov získaných pri teste. Výpočtové metódy sú stručne vysvetlené v dodatku k tejto testovacej metóde. Prevádzkový režim metódy HPLC je izokratický.

5.

Hodnoty Pow závisia od podmienok prostredia, akými sú teplota, pH, iónová sila atď., a tie by sa mali v rámci pokusu definovať, aby bolo možné dosiahnuť správny výklad údajov Pow. Pre ionizovateľné látky môže byť vhodná iná metóda [napr. návrh usmernení OECD o pH-metrickej metóde pre ionizované látky (6)], ktorá by sa mohla použiť ako alternatívna metóda. Hoci tento návrh usmernení OECD môže byť dostatočne vhodný na stanovenie Pow pre spomínané ionizovateľné látky, v niektorých prípadoch je vhodnejšie použiť metódu HPLC pri environmentálne relevantných hodnotách pH (pozri bod 9).

PRINCÍP METÓDY

6.

Metóda HPLC s reverznou fázou sa uskutočňuje na analytických kolónach naplnených komerčne dostupnou tuhou fázou obsahujúcou dlhé uhľovodíkové reťazce (napr. C8, C18), ktoré sú chemicky viazané na kremík.

7.

Chemikália injektovaná na takúto kolónu sa rozdeľuje medzi pohyblivú rozpustnú fázu a uhľovodíkovú nepohyblivú fázu, keďže sa v kolóne transportuje pomocou pohyblivej fázy. Látky sa zadržiavajú proporcionálne k ich rozdeľovacej konštante medzi uhľovodíkom a vodou, pričom najskôr dochádza k elúcii hydrofilných a najneskôr lipofilných látok. Retenčný čas sa vyjadruje pomocou kapacitného faktora k, ktorý je daný vzorcom:

Formula

kde tR je retenčný čas testovanej látky a t0 je mŕtvy čas, t. j. priemerný čas, ktorý molekula rozpúšťadla potrebuje na to, aby prešla kolónou. Kvantitatívne analytické metódy sa nepožadujú a potrebné je iba stanovenie retenčných časov.

8.

Rozdeľovacia konštanta oktanol/voda testovanej látky sa môže vypočítať experimentálnym stanovením jej kapacitného faktora k a dosadením hodnoty k do tejto rovnice:

Formula

kde

a, b sú koeficienty lineárnej regresie.

Uvedenú rovnicu je možné dosiahnuť lineárnou regresiou hodnôt dekadického logaritmu rozdeľovacích konštánt oktanol/voda referenčných látok voči hodnotám dekadického logaritmu kapacitných faktorov referenčných látok.

9.

Metóda HPLC s reverznou fázou umožňuje odhad rozdeľovacích konštánt v rozsahu hodnôt log Pow od 0 do 6, ale vo výnimočných prípadoch sa tento rozsah môže rozšíriť aj na hodnoty log Pow od 6 do 10. To si môže vyžadovať úpravu pohyblivej fázy (3). Metódu nie je možné použiť v prípade silných kyselín a zásad, polymetalických látok, látok, ktoré reagujú s eluentom, alebo povrchovo aktívnych látok. Merania na ionizovateľných látkach v ich neionizovanej forme (voľná kyselina alebo voľná zásada) sa môžu vykonať len s použitím vhodného tlmivého roztoku s hodnotou pH nižšou ako pKa pre voľnú kyselinu alebo vyššou ako pKa pre voľnú zásadu. Ak je dostupná, môže sa ako alternatíva (6) použiť pH-metrická metóda na testovanie ionizovateľných látok (6). Ak sa hodnota log Pow stanovuje na účely klasifikácie nebezpečnosti pre životné prostredie alebo posudzovania environmentálneho rizika, test by sa mal vykonať v rozsahu hodnôt pH relevantnom pre prírodné prostredie, t. j. pre hodnoty pH v rozsahu od 5,0 do 9.

10.

V niektorých prípadoch môžu prímesi skomplikovať interpretáciu výsledkov v dôsledku neistoty vrcholovej špecifikácie. V prípade zmesí, ktoré vykazujú nerozpustené pásmo, je potrebné uviesť horné a dolné hraničné hodnoty log Pow, ako aj percentuálny podiel plochy každého píku log Pow. V prípade zmesí, ktoré predstavujú skupinu homológov, by sa mala uviesť aj vážená priemerná hodnota log Pow (7), vypočítaná na základe jednotlivých hodnôt Pow a zodpovedajúcich percentuálnych podielov plochy (8). Pri výpočte by sa mali vziať do úvahy všetky píky, ktorých podiel na celkovej ploche píku dosahuje hodnotu 5 % alebo viac (9):

Formula

Vážená priemerná hodnota log Pow je platná len pre látky alebo zmesi (napr. talové oleje) pozostávajúce z homológov (napr. série alkánov). V prípade zmesí sa môžu dosiahnuť zmysluplné výsledky merania za predpokladu, že použitý analytický detektor má rovnakú citlivosť na všetky látky v zmesi a tie je možné primerane rozlíšiť.

INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE

11.

Pred použitím danej metódy by mala byť známa disociačná konštanta, štruktúrny vzorec a rozpustnosť v pohyblivej fáze. Užitočné môžu byť aj informácie o hydrolýze.

KRITÉRIÁ KVALITY

12.

S cieľom zvýšiť dôveryhodnosť merania sa hodnoty musia stanoviť dvakrát.

Opakovateľnosť: hodnoty log Pow získané z opakovaných meraní vykonaných za rovnakých podmienok a s použitím rovnakého súboru referenčných látok by mali byť v rozsahu ± 0,1 log jednotiek.

Reprodukovateľnosť: ak sa merania zopakujú s iným súborom referenčných látok, výsledky sa môžu líšiť. Korelačný koeficient R pre vzťah medzi log k a log Pow pre súbor testovaných látok dosahuje spravidla hodnotu približne 0,9, čo zodpovedá rozdeľovacej konštante oktanol/voda log Pow ± 0,5 log jednotiek.

13.

Medzilaboratórny porovnávací test ukázal, že pomocou metódy HPLC je možné získať hodnoty log Pow v rozsahu ± 0,5 jednotiek z hodnôt získaných pomocou metódy trepačkovej banky (2). Ďalšie porovnania je možné nájsť v literatúre pod číslami (4) (5) (10) (11) (12). Najpresnejšie výsledky poskytujú korelačné krivky založené na štrukturálne príbuzných referenčných látkach (13).

REFERENČNÉ LÁTKY

14.

Na účely korelácie nameranej hodnoty kapacitného faktora k látky s jej hodnotou Pow je potrebné vytvoriť kalibračnú krivku pomocou najmenej šiestich bodov (pozri bod 24). Je na používateľovi, aby si zvolil vhodné referenčné látky. Hodnota log Pow testovanej látky by mala byť spravidla v rozsahu hodnôt log Pow referenčných látok, t. j. najmenej jedna referenčná látka by mala mať hodnotu Pow vyššiu než testovaná látka a iná zasa hodnotu Pow nižšiu než testovaná látka. Extrapolácia by sa mala použiť iba vo výnimočných prípadoch. Uprednostňovať by sa mali referenčné látky, ktoré sú štrukturálne príbuzné s testovanou látkou. Hodnoty log Pow referenčných látok, ktoré sa používajú na kalibráciu, by mali byť založené na spoľahlivých experimentálnych údajoch. V prípade látok s vysokou hodnotou log Pow (obyčajne viac ako 4) sa môžu používať vypočítané hodnoty, ak nie sú k dispozícii spoľahlivé experimentálne údaje. Ak sa použijú extrapolované hodnoty, je potrebné uviesť hraničnú hodnotu.

15.

Pre mnohé skupiny chemikálií existujú rozsiahle zoznamy hodnôt log Pow (14) (15). Ak údaje týkajúce sa rozdeľovacích konštánt štrukturálne príbuzných látok nie sú dostupné, je možné použiť všeobecnejšiu kalibráciu vykonanú s inými referenčnými látkami. Odporúčané referenčné látky a ich hodnoty Pow sú uvedené v tabuľke 1. V prípade ionizovateľných látok platia dané hodnoty pre ich neionizovanú formu. Hodnovernosť a kvalita uvedených údajov boli skontrolované v rámci medzilaboratórneho porovnávacieho testu.

Tabuľka 1

Odporúčané referenčné látky

 

Číslo CAS

Referenčná látka

log Pow

pKa

1

78-93-3

2-butanón

(metyletylketón)

0,3

 

2

1122-54-9

4-acetylpyridín

0,5

 

3

62-53-3

anilín

0,9

 

4

103-84-4

acetanilid

1,0

 

5

100-51-6

benzylakohol

1,1

 

6

150-76-5

4-metoxyfenol

1,3

pKa = 10,26

7

122-59-8

kyselina fenoxyoctová

1,4

pKa = 3,12

8

108-95-2

fenol

1,5

pKa = 9,92

9

51-28-5

2,4-dinitrofenol

1,5

pKa = 3,96

10

100-47-0

benzonitril

1,6

 

11

140-29-4

fenylacetonitril

1,6

 

12

589-18-4

4-metylbenzylalkohol

1,6

 

13

98-86-2

acetofenón

1,7

 

14

88-75-5

2-nitrofenol

1,8

pKa = 7,17

15

121-92-6

kyselina 3-nitrobenzoová

1,8

pKa = 3,47

16

106-47-8

4-chlóranilín

1,8

pKa = 4,15

17

98-95-3

nitrobenzén

1,9

 

18

104-54-1

(E)-fenylprop-2-én-1-ol

(škoricový alkohol)

1,9

 

19

65-85-0

kyselina benzoová

1,9

pKa = 4,19

20

106-44-5

p-krezol

1,9

pKa = 10,17

21

140-10-3

(trans)

kyselina škoricová

2,1

pKa = 3,89 (cis)

4,44 (trans)

22

100-66-3

anizol

2,1

 

23

93-58-3

metylbenzoát

2,1

 

24

71-43-2

benzén

2,1

 

25

99-04-7

kyselina 3-metylbenzoová

2,4

pKa = 4,27

26

106-48-9

4-chlórfenol

2,4

pKa = 9,1

27

79-01-6

trichlóretylén

2,4

 

28

1912-24-9

atrazín

2,6

 

29

93-89-0

etyl-benzoát

2,6

 

30

1194-65-6

2,6-dichlórbenzonitril

2,6

 

31

535-80-8

kyselina 3-chlórbenzoová

2,7

pKa = 3,82

32

108-88-3

toluén

2,7

 

33

90-15-3

1-naftol

2,7

pKa = 9,34

34

608-27-5

2,3-dichlóranilín

2,8

 

35

108-90-7

chlórbenzén

2,8

 

36

1746-13-0

alyl(fenyl)éter

2,9

 

37

108-86-1

brómbenzén

3,0

 

38

100-41-4

etylbenzén

3,2

 

39

119-61-9

benzofenón

3,2

 

40

92-69-3

4-fenylfenol

3,2

pKa = 9,54

41

89-83-8

tymol

3,3

 

42

106-46-7

1,4-dichlórbenzén

3,4

 

43

122-39-4

difenylamín

3,4

pKa = 0,79

44

91-20-3

naftalén

3,6

 

45

93-99-2

fenyl-benzoát

3,6

 

46

98-82-8

izopropylbenzén

3,7

 

47

88-06-2

2,4,6-trichlórfenol

3,7

pKa = 6

48

92-52-4

bifenyl

4,0

 

49

120-51-4

benzyl-benzoát

4,0

 

50

88-85-7

2,4-dinitro-6-sek-butylfenol

4,1

 

51

120-82-1

1,2,4-trichlórbenzén

4,2

 

52

143-07-7

kyselina dodekánová

4,2

pKa = 5,3

53

101-84-8

(difenyl)éter

4,2

 

54

85-01-8

fenantrén

4,5

 

55

104-51-8

n-butylbenzén

4,6

 

56

103-29-7

dibenzyl

4,8

 

57

3558-69-8

2,6-difenylpyridín

4,9

 

58

206-44-0

fluorantén

5,1

 

59

603-34-9

trifenylamín

5,7

 

60

50-29-3

DDT

6,5

 

OPIS METÓDY

Predbežný odhad rozdeľovacej konštanty

16.

Uprednostňuje sa odhad rozdeľovacej konštanty použitím výpočtovej metódy (pozri dodatok), alebo kde je to vhodné, na základe pomeru rozpustností testovanej látky v čistých rozpúšťadlách.

Zariadenie

17.

Požaduje sa kvapalinový chromatograf vybavený nízkoimpulzným čerpadlom a vhodným detekčným systémom. Na širokú škálu chemických skupín je možné uplatniť UV detektor, ktorý využíva vlnovú dĺžku 210 nm, alebo refraktometrický (RI) detektor. Prítomnosť polárnych skupín v nepohyblivej fáze môže vážne narušiť fungovanie kolóny vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Preto by mali nepohyblivé fázy obsahovať minimálny podiel polárnych skupín (16). Je možné použiť aj komerčné mikročasticové náplne s reverznou fázou alebo kolóny s hotovou náplňou. Medzi vstrekovací systém a analytickú kolónu sa môže umiestniť ochranná kolóna.

Pohyblivá fáza

18.

Na prípravu eluačného rozpúšťadla, ktoré treba pred použitím odplyniť, sa používa metanol kvalitatívnej triedy HPLC a destilovaná alebo deionizovaná voda. Mala by sa použiť izokratická elúcia. Použiť treba pomery metanolu a vody s minimálnym obsahom vody 25 %. Na elúciu látok s hodnotou log P rovnajúcou sa hodnote 6 v priebehu jednej hodiny pri prietoku 1 ml za minútu spravidla postačí pomer zmesi metanolu a vody 3:1 (objemový zlomok). Pre látky s hodnotou log P vyššou ako 6 môže byť potrebné skrátiť čas elúcie (ako aj časy referenčných látok) znížením polarity pohyblivej fázy alebo skrátením dĺžky kolóny.

19.

Testovaná látka a referenčné látky musia byť rozpustné v pohyblivej fáze v dostatočných koncentráciách, aby sa umožnila ich detekcia. Iba vo výnimočných prípadoch sa môžu so zmesou metanolu a vody použiť aj aditíva, keďže menia vlastnosti kolóny. V týchto prípadoch musí byť potvrdené, že retenčné časy testovanej látky a referenčných látok nie sú ovplyvnené. Ak zmes metanolu a vody nie je vhodná, môžu sa použiť iné zmesi organického rozpúšťadla a vody, napríklad zmes etanolu a vody, acetonitrilu a vody alebo izopropylalkoholu (2-propanolu) a vody.

20.

Hodnota pH eluentu je kritická pre ionizovateľné látky. Táto hodnota by mala byť v prevádzkovom rozsahu pH kolóny, ktorý je spravidla od 2 do 8. Odporúča sa pufrovanie. Treba dbať na to, aby sa zabránilo zrážaniu solí a poškodeniu kolóny, ku ktorým dochádza v prípade použitia niektorých organických zmesí fázy a pufra. Merania metódou HPLC s nepohyblivými fázami na báze kremíka s hodnotami pH nad 8 sa spravidla neodporúčajú, lebo použitie alkalickej pohyblivej fázy môže zapríčiniť rýchle poškodenie funkčnosti kolóny.

Rozpustené látky

21.

Testované a referenčné látky musia byť dostatočne čisté, aby bolo možné priradiť jednotlivé píky v chromatogramoch príslušným látkam. Ak je to možné, mali by byť látky určené na použitie v rámci testu alebo kalibrácie rozpustené v pohyblivej fáze. Ak sa na rozpustenie testovaných a referenčných látok používa iné rozpúšťadlo ako mobilná fáza, mala by sa mobilná fáza použiť na konečné zriedenie pred vstreknutím.

Podmienky testu

22.

Teplota počas merania by sa nemala meniť o viac ako ± 1 °C.

Stanovenie mŕtveho času t0

23.

Mŕtvy čas t0 sa môže merať použitím nezadržaných organických látok (napr. tiomočoviny alebo formamidu). Presnejšie je možné mŕtvy čas odvodiť z nameraných retenčných časov alebo zo súboru približne siedmich členov homologického radu (napr. n-alkylmetylových ketónov) (17) Retenčné časy tR (nC + 1) sú graficky znázornené v diagrame ako funkcia tR (nC), kde nC je počet atómov uhlíka. Vznikne priamka tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, kde hodnota A, ktorá predstavuje vzorec k (nC + 1)/k (nC), je konštantná. Mŕtvy čas t0 sa získa z úseku priamky (1 – A)t0 a sklonu A.

Regresná rovnica

24.

Ďalším krokom postupu je zostrojenie korelačného diagramu hodnôt log k v závislosti od hodnôt log P pre vhodné referenčné látky s hodnotami log P blízkymi očakávanej hodnote log P testovanej látky. V praxi sa súčasne vstrekne 6 až 10 referenčných látok. Stanoví sa retenčný čas, podľa možnosti na záznamovej integračnej jednotke napojenej na detekčný systém. Zodpovedajúce logaritmy kapacitných faktorov log k sa nanesú do diagramu ako funkcia log P. Regresný výpočet sa vykonáva v pravidelných časových intervaloch, najmenej raz denne, aby sa tak dali vziať do úvahy možné zmeny v činnosti kolóny.

STANOVENIE POW TESTOVANEJ LÁTKY

25.

Testovaná látka sa vstrekuje v najmenších zistiteľných množstvách. Retenčný čas sa stanovuje dvakrát. Rozdeľovacia konštanta testovanej látky sa získa interpoláciou vypočítaného kapacitného faktora na kalibračnej krivke. Pre veľmi nízke a veľmi vysoké rozdeľovacie konštanty je potrebná extrapolácia. Najmä v týchto prípadoch sa musí venovať pozornosť hraniciam spoľahlivosti regresnej priamky. Ak je retenčný čas vzorky mimo rozsahu retenčných časov zistených pre normy, mala by sa uviesť hraničná hodnota.

ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV

Protokol o skúške

26.

Protokol musí obsahovať tieto údaje:

odhadnuté hodnoty rozdeľovacej konštanty a použitú metódu, ak sa stanoví predbežný odhad rozdeľovacej konštanty a úplný opis metódy vrátane identifikácie databázy a podrobných informácií o výbere fragmentov, ak sa použije výpočtová metóda,

testované a referenčné látky: čistotu, štrukturálny vzorec a číslo CAS,

opis zariadenia a prevádzkových podmienok: analytická kolóna, ochranná kolóna (predkolóna),

pohyblivú fázu, spôsob detekcie, rozsah teplôt, pH,

elučné profily (chromatogramy),

mŕtvy čas a spôsob, akým sa meral,

retenčné údaje a hodnoty log Pow z odbornej literatúry pre referenčné látky použité v rámci kalibrácie,

podrobnosti o zodpovedajúcej regresnej priamke (hodnoty log k v závislosti od hodnôt log Pow) a korelačný koeficient priamky vrátane intervalov spoľahlivosti,

priemerné retenčné údaje a interpolovanú hodnotu log Pow pre testovanú látku,

v prípade zmesi: chromatogram elučného profilu s uvedenými hraničnými hodnotami,

hodnoty log Pow vzťahujúce sa na percentuálny podiel plochy píku log Pow,

výpočet pomocou regresnej priamky,

v prípade potreby vypočítané vážené priemerné hodnoty log Pow.

LITERATÚRA

1.

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

2.

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

3.

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

4.

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

5.

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

6.

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

7.

OSPAR (1995). ‚Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995‘, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

8.

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

9.

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

10.

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

11.

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

12.

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

13.

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

14.

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

15.

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

16.

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

17.

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

Dodatok

Metódy výpočtu POW

ÚVOD

1.

Tento dodatok obsahuje krátky úvod k výpočtu Pow. Ďalšie informácie sú k dispozícii v príručkách uvedených v literatúre pod číslami (1) (2).

2.

Vypočítané hodnoty Pow sa používajú pri:

rozhodovaní o tom, ktorú experimentálnu metódu použiť: buď metódu trepačkovej banky pre hodnoty log Pow v rozsahu od – 2 do 4, alebo metódu HPLC pre hodnoty log Pow v rozsahu od 0 do 6,

výbere podmienok použitia metódy HPLC (referenčné látky, pomer metanol/voda),

kontrole hodnovernosti hodnôt získaných pomocou experimentálnych metód,

stanovení odhadu, kedy sa nemôžu uplatniť experimentálne metódy.

Princíp výpočtových metód

3.

Všetky výpočtové metódy sú založené na teoretickom trieštení molekuly na vhodné subštruktúry, pre ktoré sú známe spoľahlivé prírastky hodnoty log Pow. Hodnota log Pow sa potom vypočíta ako súčet jej čiastkových hodnôt a korekčných členov pre vnútromolekulové interakcie. Zoznamy fragmentových konštánt a korekčných členov sú k dispozícii v literatúre pod číslami (1) (2) (3) (4) (5) (6). Niektoré z nich sa pravidelne aktualizujú (3).

Spoľahlivosť vypočítaných hodnôt

4.

Spoľahlivosť výpočtovej metódy vo všeobecnosti klesá s narastajúcou komplexnosťou skúmanej látky. V prípade jednoduchých molekúl s nízkou molekulovou hmotnosťou a jednej alebo dvoch funkčných skupín je možné predpokladať odchýlku 0,1 – 0,3 jednotiek log Pow medzi výsledkami rozličných fragmentačných metód a nameranými hodnotami. Hranica chyby bude závisieť od spoľahlivosti použitých fragmentových konštánt, schopnosti rozoznať vnútromolekulové interakcie (napr. vodíkové väzby) a správneho použitia korekčných členov. V prípade ionizujúcich látok je potrebné zohľadniť náboj a stupeň ionizácie (10).

Fujitova-Hanschova πmetóda

5.

Hydrofóbna substituenčná konštanta π, ktorú pôvodne zaviedol Fujita a kol. (7) ako:

πX = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)

kde PhX predstavuje aromatický derivát a PhH východiskovú látku.

napr.

πCl

= log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6)

= 2,84 – 2,13

= 0,71

Metóda π (π-metóda) je použiteľná predovšetkým pre aromatické látky. K dispozícii sú hodnoty π pre veľký počet substituentov (4) (5).

Rekkerova metóda

6.

Pomocou Rekkerovej metódy (8) sa hodnota log Pow vypočíta takto:

Formula

kde ai predstavuje počet prípadov výskytu daného fragmentu v molekule a fi prírastok hodnoty log Pow fragmentu. Interakčné členy môžu byť vyjadrené ako integrálny (celý) násobok jednej jedinej konštanty Cm (tzv. ‚magickej konštanty‘). Fragmentové konštanty fi a Cm boli stanovené zo zoznamu 1 054 experimentálnych hodnôt Pow 825 látok použitím zloženej regresnej analýzy (6) (8). Interakčné členy sa určujú podľa stanovených pravidiel (6) (8) (9).

Hanschova-Leova metóda

7.

Pomocou Hanschovej a Leovej metódy (4) sa hodnota log Pow vypočíta takto:

Formula

kde fi predstavuje fragmentovú konštantu, Fj korekčný člen (faktor), ai a bj príslušné frekvencie výskytu. Zoznamy atómových a skupinových fragmentových hodnôt a korekčných členov Fj boli odvodené metódou pokusov a chýb z experimentálnych hodnôt Pow. Korekčné členy boli rozdelené do niekoľkých rozdielnych tried (1) (4). Na zohľadnenie všetkých pravidiel a korekčných členov boli vypracované softvérové balíky (3).

KOMBINOVANÁ METÓDA

8.

Výpočet hodnoty log Pow komplexných molekúl je možné do značnej miery zdokonaliť, ak sa molekula rozdelí na väčšie subštruktúry, pre ktoré sú k dispozícii spoľahlivé hodnoty log Pow, a to buď z tabuliek (3) (4), alebo z existujúcich meraní. Takéto fragmenty (napr. heterocykly, antrachinón, azobenzén) sa potom môžu kombinovať s Hanschovými hodnotami π, prípadne s Rekkerovými alebo Leovými fragmentovými konštantami.

Poznámky

i)

Výpočtové metódy je možné použiť iba pre čiastočne alebo úplne ionizované látky, keď sa zohľadnia potrebné korekčné faktory.

ii)

Ak je možné predpokladať existenciu vnútromolekulových vodíkových väzieb, je potrebné prirátať zodpovedajúce korekčné členy (približne + 0,6 až + 1,0 jednotiek log Pow) (1). Indikácie týkajúce sa prítomnosti takýchto väzieb je možné získať zo stereomodelov alebo zo spektroskopických údajov.

iii)

Ak sú možné viaceré tautomérne formy, za základ výpočtu by sa mala použiť najpravdepodobnejšia forma.

iv)

Je potrebné pozorne sledovať všetky revízie zoznamov fragmentových konštánt.

LITERATÚRA K VÝPOČTOVÝM METÓDAM

1.

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York (1982).

2.

W.J. Dunn, J.H. Block and R.S. Pearlman (ed.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (New York) and Oxford (1986).

3.

Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).

4.

C. Hansch and A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York (1979).

5.

Leo, C. Hansch and D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.

6.

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

7.

Toshio Fujita, Junkichi Iwasa & Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.

8.

R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York (1977).

9.

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

10.

R.A. Scherrer. ACS – Symposium Series 255, p. 225, American Chemical Society, Washington, D.C. (1984).

(3)

Kapitola C.11 sa nahrádza takto:

C.3.   SLADKOVODNÉ RIASY A SINICE, TEST INHIBÍCIE RASTU

ÚVOD

1.

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 201 (2006, príloha upravená v roku 2011). Zistila sa potreba rozšíriť testovaciu metódu tak, aby zahŕňala ďalšie druhy, a aktualizovať ju s cieľom splniť požiadavky týkajúce sa hodnotenia nebezpečnosti a klasifikácie chemikálií. Táto revízia sa uskutočnila na základe rozsiahlych praktických skúseností, vedeckého pokroku v oblasti štúdií toxicity rias a rozsiahleho regulačného využitia, ku ktorému došlo od pôvodného prijatia metódy.

2.

Vymedzenie použitých pojmov je uvedené v dodatku 1.

PRINCÍP TESTU

3.

Účelom tohto testu je stanoviť účinky chemikálie na rast sladkovodných mikrorias a/alebo siníc. Exponenciálne rastúce testované organizmy sú vystavené testovanej chemikálii v jednorazových kultúrach zvyčajne počas 72 hodín. Napriek pomerne krátkej dĺžke testu sa môžu hodnotiť účinky na niekoľkých generáciách.

4.

Reakciou systému je zníženie rastu v sérii kultúr rias (testovacie jednotky) vystavených rôznym koncentráciám testovanej chemikálie. Reakcia sa hodnotí ako funkcia expozičnej koncentrácie v porovnaní s priemerným rastom replikovaných, nevystavených kontrolných kultúr. Na preukázanie úplnej reakcie systému na toxické účinky (optimálna citlivosť) sa kultúram umožní neobmedzený exponenciálny rast v podmienkach s vhodnými živinami a nepretržitým svetlom v čase postačujúcom na meranie zníženia špecifickej rýchlosti rastu.

5.

Rast a inhibícia rastu sa kvantifikujú meraním množstva biomasy rias ako funkcie času. Biomasa rias je vymedzená ako sušina na objem, napríklad mg rias/liter testovacieho roztoku. Suchá hmotnosť sa však zložito meria, a preto sa používajú náhradné parametre. Z týchto náhradných parametrov sa najčastejšie používa počet buniek. Iné náhradné parametre zahŕňajú objem buniek, fluorescenciu, optickú hustotu atď. Je potrebné poznať prepočítavací koeficient medzi meraným náhradným parametrom a množstvom biomasy.

6.

Konečným bodom testu je inhibícia rastu vyjadrená ako logaritmický nárast množstva biomasy (priemerná špecifická rýchlosť rastu) počas expozície. Z priemerných hodnôt špecifickej rýchlosti rastu zaznamenaných v sérii testovacích roztokov sa stanoví koncentrácia, ktorá spôsobuje špecifickú x % inhibíciu rýchlosti rastu (napr. 50 %), a vyjadrí sa ako ErCx (napr. ErC50).

7.

Ďalšou závislou premennou použitou v tejto testovacej metóde je výťažok, ktorý sa v niektorých krajinách môže vyžadovať na splnenie špecifických regulačných požiadaviek. Vymedzený je ako rozdiel množstva biomasy na konci expozície a množstva biomasy na jej začiatku. Z výťažku zaznamenaného v sérii testovacích roztokov sa vypočíta koncentrácia, ktorá spôsobuje špecifickú x % inhibíciu výťažku (napr. 50 %), a vyjadrí sa ako EyCx (napr. EyC50).

8.

Okrem toho je možné štatisticky stanoviť najnižšiu koncentráciu s pozorovaným účinkom (LOEC), ako aj koncentráciu bez pozorovaného účinku (NOEC).

INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII

9.

Informácie o testovanej chemikálii, ktoré môžu byť užitočné pri stanovovaní testovacích podmienok, zahŕňajú štrukturálny vzorec, čistotu, svetelnú stálosť, stabilitu pri podmienkach testu, vlastnosti týkajúce sa absorpcie svetla, pKa a výsledky štúdií transformácie vrátane biodegradovateľnosti vo vode.

10.

Známa by mala byť rozpustnosť vo vode, rozdeľovacia konštanta oktanol/voda (Pow) a tlak pary testovanej chemikálie a k dispozícii by mala byť overená metóda kvantifikácie chemikálie v testovacích roztokoch so zaznamenanou výťažnosťou a detekčným limitom.

PLATNOSŤ TESTU

11.

Test je platný, ak sú splnené tieto kritériá:

Množstvo biomasy v kontrolných kultúrach by sa malo exponenciálne zvýšiť minimálne o faktor 16 počas 72 hodinového testu. To zodpovedá špecifickej rýchlosti rastu 0,92 deň– 1. V prípade najčastejšie používaných druhov je rýchlosť rastu zvyčajne podstatne vyššia (pozri dodatok 2). Toto kritérium sa nemusí splniť, ak sa používajú druhy, ktoré rastú pomalšie než druhy uvedené v dodatku 2. V tomto prípade by sa trvanie testu malo predĺžiť, aby sa dosiahol minimálne 16-násobný rast v kontrolných kultúrach, pričom počas trvania testu musí byť rast exponenciálny. Trvanie testu sa môže skrátiť najmenej na 48 hodín, aby sa zachoval neobmedzený exponenciálny rast počas testu, pokiaľ sa dosiahne minimálny multiplikačný faktor 16.

Priemerný variačný koeficient pre špecifické fázové rýchlosti rastu (0. – 1. deň, 1. – 2. deň a 2. – 3. deň pre 72 hodinové testy) v kontrolných kultúrach (pozri dodatok 1 pod označením ‚variačný koeficient‘) nesmie byť väčší ako 35 % Postup výpočtu špecifickej rýchlosti rastu po častiach je uvedený v bode 49. Toto kritérium platí pre strednú hodnotu variačných koeficientov vypočítanú pre replikáty kontrolných kultúr.

Koeficient odchýlky priemerných špecifických rýchlostí rastu počas celého testu v paralelných kontrolných kultúrach nesmie byť väčší ako 7 % v testoch s druhmi Pseudokirchneriella subcapitata a Desmodesmus subspicatus. Pre iné druhy, zriedkavejšie používané na testovanie, nesmie hodnota presiahnuť 10 %.

REFERENČNÁ CHEMIKÁLIA

12.

Referenčné chemikálie, ako napríklad 3,5-dichlórfenol, používané v medzinárodnej porovnávacej skúške (1) sa môžu testovať ako prostriedok kontroly postupu testu. Pre zelené riasy sa môže použiť ako referenčná chemikália aj dichróman draselný. Referenčnú chemikáliu je potrebné testovať najmenej dvakrát do roka.

POUŽITEĽNOSŤ TESTU

13.

Táto testovacia metóda sa najľahšie používa pre chemikálie rozpustné vo vode, pri ktorých je pravdepodobné, že v podmienkach testu zostanú vo vode. V prípade testovania chemikálií, ktoré sú prchavé, silne sa adsorbujú, sú sfarbené, s nízkou rozpustnosťou vo vode, alebo chemikálií, ktoré môžu ovplyvniť dostupnosť živín alebo minerálnych látok v testovacom médiu, môžu byť potrebné určité modifikácie uvedeného postupu (napr. uzatvorený systém, úprava testovacích nádob). Usmernenia k niektorým vhodným úpravám sú uvedené v literatúre pod číslami (2) (3) a (4).

OPIS TESTOVACEJ METÓDY

Zariadenie

14.

Testovacie nádoby a ostatné zariadenia, ktoré prichádzajú do styku s testovacími roztokmi, by mali byť celé vyrobené zo skla alebo z iného chemicky inertného materiálu. Predmety by sa mali dôkladne umyť, aby sa zabezpečilo, že žiadne organické ani anorganické kontaminanty neovplyvnia rast rias ani zloženie testovacích roztokov.

15.

Testovacími nádobami sú spravidla sklené banky s rozmermi, ktoré umožňujú dostačujúci objem kultúry pre merania počas testu a prenos dostatočného množstva CO2 z atmosféry (pozri bod 30). Treba si uvedomiť, že objem kvapaliny musí byť postačujúci pre analytické stanovenia (pozri bod 37).

16.

Okrem toho môžu byť potrebné niektoré z týchto zariadení alebo všetky tieto zariadenia:

zariadenie na kultiváciu: odporúča sa nádoba alebo komora, v ktorej sa môže udržiavať zvolená inkubačná teplota s presnosťou ± 2 °C,

prístroje na meranie svetla: je dôležité si uvedomiť, že metóda merania svietivosti a najmä typ receptora (kolektora) môže ovplyvniť nameranú hodnotu. Merania by sa mali prednostne vykonávať s použitím guľového (4 π) receptora (ktorý reaguje na priame a odrazené svetlo zo všetkých uhlov nad a pod rovinou merania) alebo 2 π receptora (ktorý reaguje na svetlo zo všetkých uhlov nad rovinou merania).

Zariadenie na stanovenie množstva biomasy rias. Počet buniek, ktorý je najčastejšie používaným náhradným parametrom za biomasu rias, sa môže stanoviť s použitím elektronického počítadla častíc, mikroskopu s počítacou komorou alebo prietokového cytometra. Iné náhradné parametre za biomasu je možné merať použitím prietokového cytometra, fluorimetra, spektrofotometra alebo kolorimetra. Na výpočet je potrebný prepočítavací faktor vzťahujúci sa na počet buniek na sušinu. Na zabezpečenie potrebných meraní pri nízkych koncentráciách biomasy s použitím spektrofotometra môže byť potrebné použiť kyvety s dráhou svetla minimálne 4 cm.

Testované organizmy

17.

Môžu sa použiť viaceré druhy voľne rastúcich mikrorias a siníc. Ukázalo sa, že kmene uvedené v dodatku 2 sú vhodné pre postup testovania uvedený v tejto testovacej metóde.

18.

V prípade použitia iných druhov je potrebné uviesť v skúšobnom protokole kmeň a/alebo pôvod. Treba potvrdiť, že exponenciálny rast zvolenej testovanej riasy sa môže zachovať počas testu za obvyklých podmienok.

Rastové médium

19.

Odporúčajú sa dve alternatívne rastové médiá – médium OECD a AAP. Zloženie týchto médií je uvedené v dodatku 3. Treba si uvedomiť, že počiatočná hodnota pH a tlmivá kapacita (ktorá reguluje zvyšovanie pH) dvoch médií je odlišná. Preto môžu byť výsledky testov rozdielne v závislosti od použitého média, najmä ak sa testujú ionizujúce chemikálie.

20.

Na určité účely môže byť potrebné modifikovať rastové médium, napríklad ak sa testujú kovy a chelatačné činidlá, alebo v prípade testovania pri rôznych hodnotách pH. Použitie modifikovaného média by sa malo podrobne opísať a odôvodniť (3) (4).

Počiatočná koncentrácia biomasy

21.

Počiatočné množstvo biomasy v testovacích kultúrach musí byť rovnaké vo všetkých testovacích kultúrach a dostatočne nízke, aby umožnilo exponenciálny rast počas inkubácie bez rizika vyčerpania živín. Počiatočné množstvo biomasy by nemalo byť vyššie ako 0,5 mg/l, vyjadrené ako sušina. Odporúčajú sa tieto počiatočné koncentrácie buniek:

Pseudokirchneriella subcapitata:

5 × 103 – 104 buniek/ml

Desmodesmus subspicatus

2-5 × 103 buniek/ml

Navicula pelliculosa

104 buniek/ml

Anabaena flos-aquae

104 buniek/ml

Synechococcus leopoliensis

5 × 104 – 105 buniek/ml

Koncentrácie testovanej chemikálie

22.

Rozsah koncentrácií, v ktorých sa môžu účinky prejaviť, je možné stanoviť na základe výsledkov testov na vyhľadávanie rozsahu. Pre konečný definitívny test by sa malo zvoliť minimálne päť koncentrácií usporiadaných v geometrickom rade s faktorom maximálne 3,2. Pre testované chemikálie vykazujúce plochú krivku závislosti veličiny od koncentrácie sa môže zvoliť vyšší faktor. Séria koncentrácií by mala prednostne pokrývať rozsah 5 – 75 % inhibície rýchlosti rastu rias.

Replikáty a kontrolné kultúry

23.

Test by sa mal vykonať s tromi replikátmi pri každej testovacej koncentrácii. Ak sa nevyžaduje stanovenie koncentrácie NOEC, môže sa test pozmeniť zvýšením počtu koncentrácií a znížením počtu replikátov na koncentráciu. Musia existovať minimálne tri kontrolné replikáty a teoreticky by sa mal použiť dvojnásobný počet replikátov pre každú testovaciu koncentráciu.

24.

Pripraviť sa môže osobitný súbor testovacích roztokov na analytické stanovenie koncentrácie testovaných chemikálií (pozri body 36 a 38).

25.

Ak sa na rozpustenie testovanej chemikálie používa rozpúšťadlo, musia sa do koncepcie testu zahrnúť ďalšie kontrolné kultúry obsahujúce rozpúšťadlo v rovnakej koncentrácii, aká sa používa v testovacích kultúrach.

Príprava inokula

26.

Na prispôsobenie testovacích rias podmienkam skúšky, ako aj na zabezpečenie toho, aby sa riasy nachádzali v exponenciálnej fáze rastu v čase ich použitia na inokuláciu testovacích roztokov, sa pripraví inokulum v testovacom médiu 2 až 4 dni pred začiatkom skúšky. Biomasa rias by sa mala upraviť tak, aby sa v inokule umožnil exponenciálny rast do začiatku skúšky. Inokulum sa inkubuje za rovnakých podmienok ako testovacie kultúry. V inokule sa meria nárast množstva biomasy, aby sa zabezpečilo, že rast je v obvyklom rozsahu ako v prípade testovacieho kmeňa za podmienok kultivácie. Príklad postupu kultivácie rias je opísaný v dodatku 4. S cieľom zabrániť synchrónnemu deleniu buniek počas skúšky môže byť potrebný druhý stupeň množenia inokula.

Príprava testovacích roztokov

27.

Všetky testovacie roztoky musia obsahovať rovnaké koncentrácie rastového média a počiatočného množstva biomasy testovanej riasy. Testovacie roztoky zvolených koncentrácií sa zvyčajne pripravujú zmiešaním zásobného roztoku testovanej chemikálie s rastovým médiom a inokulom. Zásobné roztoky sa spravidla pripravujú rozpustením chemikálie v testovacom médiu.

28.

Rozpúšťadlá, napríklad acetón, t-butyl, alkohol a dimetylformamid, sa môžu použiť ako nosiče na pridávanie chemikálií s nízkou rozpustnosťou vo vode do testovacieho média (2) (3). Koncentrácia rozpúšťadla by nemala byť vyššia ako 100 μl/l a rovnaká koncentrácia rozpúšťadla by sa mala pridať do všetkých kultúr (vrátane kontrolných) v testovacej sérii.

Inkubácia

29.

Testovacie nádoby sa uzavrú zátkami prepúšťajúcimi vzduch. Nádoby sa pretrepú a umiestnia do zariadenia na kultiváciu. Počas testu je potrebné ponechať riasy v suspenzii a umožniť prenos CO2. Preto je potrebné nepretržité trepanie alebo miešanie. Kultúry by sa mali udržiavať pri teplote v rozsahu od 21 do 24 °C, s kontrolovanou presnosťou ± 2 °C. Pre iné druhy ako tie, ktoré sú uvedené v dodatku 2, napríklad tropické druhy, môžu byť vhodné vyššie teploty za predpokladu, že je možné splniť kritériá platnosti. Odporúča sa umiestniť banky náhodne a denne ich v inkubátore premiestňovať.

30.

Počas testu by sa hodnota pH kontrolného média nemala zvýšiť o viac ako 1,5 jednotiek. Pre kovy a chemikálie, ktoré sa čiastočne ionizujú pri pH blízkom testovacej hodnote pH, môže byť potrebné limitovať kolísanie pH, aby sa získali reprodukovateľné a jednoznačné výsledky. Odchýlka < 0,5 pH je technicky možná a je možné ju dosiahnuť zabezpečením prísunu dostatočného množstva CO2 z okolitého vzduchu do testovacieho roztoku napr. zvýšením rýchlosti trepania. Ďalšou možnosťou je znížiť spotrebu CO2 znížením počiatočného množstva biomasy alebo skrátením dĺžky testu.

31.

Priestor, kde sa kultúry inkubujú, by mal byť sústavne osvetlený rovnomerným fluorescenčným osvetlením napr. studeným bielym svetlom alebo denným svetlom. Kmene rias a siníc majú odlišné požiadavky na svetlo. Je potrebné zvoliť takú svietivosť, ktorá vyhovuje použitému testovaciemu organizmu. Pre odporúčané druhy zelených rias sa svietivosť zvolí na úrovni testovacích roztokov z rozsahu 60 – 120 · μE m– 2 s– 1 pri meraní vo fotosynteticky účinnom rozsahu vlnovej dĺžky 400 – 700 nm s použitím vhodného receptora. Niektoré druhy, najmä druh Anabaena flos-aquae, rastú dobre pri nižšej svietivosti a pri vysokej sa môžu poškodiť. Pre takéto druhy by sa mala zvoliť priemerná svietivosť v rozsahu od 40 do 60 μE m– 2 s– 1. (V prípade prístrojov na meranie svetla kalibrovaných v luxoch zodpovedá príslušný rozsah 4 440 – 8 880 luxov pre studené biele svetlo približne odporúčanej intenzite svetla 60 – 120 μE m– 2 s– 1.) Svietivosť udržujte v rozsahu ± 15 % priemernej svietivosti v priestore inkubácie.

Dĺžka trvania testu

32.

Test trvá spravidla 72 hodín. Môže sa však skrátiť alebo predĺžiť za predpokladu, že budú splnené všetky kritériá platnosti uvedené v bode 11.

Merania a analytické stanovenia

33.

Počas trvania testu sa v každej banke minimálne jedenkrát za deň stanoví množstvo biomasy rias. Ak sa merania vykonávajú s malými objemami odobratými z testovacieho roztoku pipetou, netreba ich nahradiť.

34.

Meranie množstva biomasy sa vykonáva manuálne počítaním buniek pomocou mikroskopu alebo elektronickým počítadlom častíc (ako počet buniek a/alebo biologický objem). Môžu sa použiť alternatívne techniky napr. prietoková cytometria, chlorofylová fluorescencia in vitro alebo in vivo (5) (6), alebo optická hustota, ak je možné na množstve biomasy vyskytujúcom sa v teste preukázať uspokojivú koreláciu s biomasou.

35.

Meranie pH roztokov sa vykonáva na začiatku a na konci testu.

36.

Ak je k dispozícii analytický postup na stanovenie testovanej chemikálie v použitom rozsahu koncentrácie, testovacie roztoky by sa mali analyzovať, aby sa overili počiatočné koncentrácie a zachovávanie expozičných koncentrácií počas testu.

37.

Analýza koncentrácie testovanej chemikálie na začiatku a na konci testu nízkej a vysokej testovacej koncentrácie a koncentrácie okolo očakávanej hodnoty EC50 môže byť dostatočná, ak je pravdepodobné, že expozičné koncentrácie sa budú odlišovať o menej ako 20 % nominálnych hodnôt počas testu. Analýza všetkých testovacích koncentrácií na začiatku a na konci testu sa odporúča vtedy, al nie je pravdepodobné, že sa koncentrácie udržia v rozsahu od 80 do 120 % nominálnej koncentrácie. Pre prchavé, nestabilné alebo silne adsorbujúce testované chemikálie sa odporúča ďalší odber vzoriek na analýzu v 24 hodinových intervaloch počas expozície, aby sa lepšie stanovil úbytok testovanej chemikálie. Pre tieto chemické látky môžu byť potrebné ďalšie replikáty. Vo všetkých prípadoch je potrebné stanoviť koncentrácie testovanej chemikálie iba v jednej replikovanej nádobe na každú testovaciu koncentráciu (alebo na obsahy nádob rozdelené podľa replikátu).

38.

S testovacím médiom pripraveným osobitne na analýzu expozičných koncentrácií počas testu by sa malo zaobchádzať rovnako ako s tými, ktoré sa používajú na testovanie, t. j. mali by sa inokulovať riasami a inkubovať za rovnakých podmienok. Ak sa vyžaduje analýza koncentrácie rozpustenej testovanej chemikálie, môže byť potrebné oddeliť riasy od média. Na separáciu by sa mala prednostne použiť centrifugácia pri nízkej hodnote g, dostatočnej na usadenie rias.

39.

Ak je dokázané, že koncentrácia chemikálie, ktorá sa testuje, je počas testu v dostatočnej miere udržiavaná v rozsahu ± 20 % nominálnej hodnoty alebo nameranej počiatočnej koncentrácie, analýza výsledkov sa môže zakladať na nominálnych hodnotách alebo nameraných počiatočných hodnotách. Ak je odchýlka od nominálnej alebo nameranej počiatočnej koncentrácie väčšia ako ± 20 %, analýza výsledkov by mala byť založená na geometrickej strednej koncentrácii počas expozície alebo na modeloch opisujúcich pokles koncentrácie testovanej chemikálie (3) (7).

40.

Inhibičný test rastu rias je dynamickejším testovacím systémom ako väčšina iných krátkodobých testov toxicity pre vodné prostredie. V dôsledku toho môže byť zložité stanoviť skutočné expozičné koncentrácie, najmä pre adsorbujúce chemikálie testované pri nízkych koncentráciách. V takýchto prípadoch úbytok testovanej chemikálie z roztoku na základe adsorpcie s narastajúcim množstvom biomasy rias neznamená, že sa látka z testovacieho systému stratila. Pri analýze výsledku testu by sa malo skontrolovať, či zníženie koncentrácie testovanej chemikálie v priebehu testu sprevádza zníženie inhibície rastu. Ak áno, môže sa zvážiť použitie vhodného modelu, ktorý opisuje pokles koncentrácie testovanej látky (7). Ak nie, môže byť vhodné založiť analýzu výsledkov na počiatočných (nominálnych alebo nameraných) koncentráciách.

Ďalšie pozorovania

41.

Na konci testu by sa malo vykonať mikroskopické pozorovanie na overenie normálneho a zdravého vzhľadu inokula a na zistenie akéhokoľvek neobvyklého vzhľadu rias (čo môže byť zapríčinené expozíciou testovanej chemikálie).

Limitný test

42.

V určitých situáciách, napríklad keď z predbežného testu vyplýva, že testovaná chemikália nemá žiadne toxické účinky pri koncentráciách do 100 mg/l alebo do jej limitu rozpustnosti v testovacom médiu (podľa toho, ktorá hodnota je nižšia), sa môže vykonať limitný test umožňujúci porovnanie reakcií v kontrolnej skupine a jednej skupine s aplikovanou chemikáliou (100 mg/l alebo koncentrácia rovná limitu rozpustnosti). Dôrazne sa odporúča, aby sa táto skutočnosť zakladala na analýze expozičnej koncentrácie. Na limitný test sa vzťahujú všetky už uvedené testovacie podmienky a kritériá platnosti s výnimkou, že počet replikátov s aplikovanou chemikáliou by mal byť minimálne šesť. Závislé premenné reakcie v kontrolnej skupine a skupine s aplikovanou chemikáliou sa môžu analyzovať použitím štatistického testu na porovnanie stredných hodnôt, napríklad Studentovho t-testu. Ak variancie v obidvoch skupinách nie sú rovnaké, je potrebné vykonať t-test upravený na nerovnaké rozptyly.

ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV

Vytvorenie rastových kriviek

43.

Množstvo biomasy v testovacích nádobách môže byť vyjadrené v jednotkách náhradného parametra použitého na meranie (napr. počet buniek, fluorescencia).

44.

Na vytvorenie rastových kriviek je potrebné usporiadať do tabuľky odhadnuté koncentrácie biomasy v testovacích kultúrach a kontrolných kultúrach spolu s koncentráciami testovaného materiálu a časmi merania zaznamenanými s rozlíšením minimálne na celé hodiny. V tomto prvom štádiu môžu byť užitočné obidve stupnice, logaritmická aj lineárna, ale logaritmická stupnica je povinná a spravidla lepšie vyjadruje parametre charakterizujúce rast počas trvania testu. Treba si uvedomiť, že exponenciálny rast je vyjadrený priamkou, ak sa vytvorí na logaritmickej stupnici, a že sklon priamky (strmosť) označuje špecifickú rýchlosť rastu.

45.

Grafické znázornenie slúži na kontrolu, či kontrolné kultúry počas testu rastú exponenciálne pri predpokladanej rýchlosti rastu. Je potrebné kriticky preskúmať všetky dátové body a podobu diagramov a skontrolovať prvotné údaje a postupy, aby sa zistili možné chyby. Skontrolovať treba najmä všetky dátové body, ktorých odchýlky sa zdajú byť spôsobené systematickou chybou. Ak je zrejmé, že chyby v postupe je možné zistiť a/alebo sa pokladajú za vysoko pravdepodobné, konkrétny dátový bod sa označí ako extrémna hodnota a nezahrnie sa do následnej štatistickej analýzy. (Nulová koncentrácia rias v jednej z dvoch alebo troch replikovaných nádob môže naznačovať, že nádoba nebola správne inokulovaná alebo nebola riadne vyčistená.) Dôvody na vyradenie dátového bodu ako extrémnej hodnoty je potrebné jasne uviesť v skúšobnom protokole. Prípustným dôvodom sú iba (zriedkavé) chyby v postupe a nie nepresnosť. Štatistické postupy v prípade identifikácie extrémnych hodnôt majú obmedzené použitie pre tento typ problému a nemôžu nahradiť odborné posúdenie. Extrémne hodnoty (takto označené) sa musia prednostne ponechať medzi dátovými bodmi uvedenými v každej ďalšej grafickej alebo tabuľkovej prezentácii údajov.

Premenné hodnoty reakcie

46.

Účelom testu je stanoviť účinky testovanej chemikálie na rast rias. Táto testovacia metóda opisuje dve premenné hodnoty reakcie, keďže rôzne jurisdikcie majú rozdielne preferencie a regulačné požiadavky. Na to, aby boli výsledky testu prijateľné vo všetkých jurisdikciách, by sa účinky mali hodnotiť s použitím obidvoch uvedených závisle premenných reakcie a) a b).

a)    Priemerná špecifická rýchlosť rastu : táto premenná hodnota reakcie sa vypočíta na základe logaritmického nárastu množstva biomasy počas testu vyjadreného za deň.

b)    Výťažok : táto závisle premenná reakcie predstavuje rozdiel množstva biomasy na konci testu a počiatočného množstva biomasy.

47.

Je potrebné si uvedomiť, že hodnoty toxicity vypočítané použitím týchto dvoch závisle premenných veličín reakcie nie sú porovnateľné a tento rozdiel sa musí zohľadniť pri použití výsledkov testu. Pri dodržaní testovacích podmienok tejto testovacej metódy budú hodnoty ECx založené na priemernej špecifickej rýchlosti rastu (ErCx) spravidla vyššie ako výsledky založené na výťažku (EyCx), a to v dôsledku matematického základu príslušných postupov. Nemalo by sa to vysvetľovať ako rozdiel v citlivosti medzi obidvoma závisle premennými veličinami reakcie, ale len tak, že sa hodnoty odlišujú matematicky. Koncepcia priemernej špecifickej rýchlosti rastu sa zakladá na všeobecnom exponenciálnom modeli rastu rias v nelimitovaných kultúrach, kde sa toxicita stanovuje na základe účinkov na rýchlosť rastu, bez závislosti od absolútnej úrovne špecifickej rýchlosti rastu kontrolnej kultúry, od sklonu krivky grafu reakcie a koncentrácie alebo od dĺžky testu. Naopak je to v prípade výsledkov založených na závisle premennej veličine výťažku, ktoré sú závislé od všetkých ďalších premenných. Hodnota EyCx je závislá od špecifickej rýchlosti rastu druhov rias, ktoré sa používajú v každom teste, a od maximálnej špecifickej rýchlosti rastu, ktorá sa môže meniť medzi druhmi a dokonca aj medzi rozdielnymi kmeňmi rias. Táto závisle premenná veličina by sa nemala používať na porovnávanie citlivosti na toxické látky medzi druhmi rias alebo dokonca odlišnými kmeňmi. Zatiaľ čo z vedeckého hľadiska sa na odhady toxicity uprednostňuje použitie priemernej špecifickej rýchlosti rastu, do tejto testovacej metódy bolo zahrnuté aj stanovenie toxicity na základe výťažku, aby sa tak vyhovelo regulačným požiadavkám platným v niektorých krajinách.

Priemerná rýchlosť rastu

48.

Priemerná špecifická rýchlosť rastu pre konkrétny čas sa vypočíta ako logaritmus nárastu množstva biomasy z rovnice pre každú jednotlivú kontrolnú nádobu a nádobu s aplikovanou chemikáliou [1]:

Formula

[1],

kde:

μi-j

je priemerná špecifická rýchlosť rastu od času i do j,

Xi

je množstvo biomasy v čase i,

Xj

je množstvo biomasy v čase j.

Pre každú skupinu s aplikovanou chemikáliou a kontrolnú skupinu sa vypočíta stredná hodnota rýchlosti rastu spolu s odhadmi rozptylu.

49.

Vypočíta sa priemerná špecifická rýchlosť rastu počas celej dĺžky testu (spravidla 0. – 3. deň), a to radšej s použitím nominálne inokulovanej biomasy ako počiatočnej hodnoty, než s použitím nameranej počiatočnej hodnoty, lebo sa tak spravidla dosiahne väčšia presnosť. Ak zariadenie použité na meranie biomasy umožňuje dostatočne presné stanovenie malého množstva inokula biomasy (napr. prietokový cytometer), potom sa môže použiť nameraná počiatočná koncentrácia biomasy. Stanoví sa tiež rýchlosť rastu po častiach výpočtom špecifických rýchlostí rastu pre každý deň počas testu (0. – 1. deň, 1. – 2. deň a 2. – 3. deň) a treba overiť, či je kontrolná rýchlosť rastu naďalej konštantná (pozri kritériá platnosti v bode 11). Výrazne nižšia špecifická rýchlosť rastu v deň 1 ako celková priemerná špecifická rýchlosť rastu môže indikovať lag fázu. Zatiaľ čo v kontrolných kultúrach je možné lag fázu minimalizovať a prakticky eliminovať vhodným namnožením prípravnej kultúry, lag fáza v exponovaných kultúrach môže indikovať regeneráciu po pôvodnom toxickom strese alebo zníženú expozíciu v dôsledku úbytku testovanej chemikálie (vrátane sorpcie na biomasu rias) po počiatočnej expozícii. Môže sa teda stanoviť rýchlosť rastu po častiach na vyhodnotenie účinkov testovanej látky, ktoré sa vyskytnú počas expozície. Zo značných rozdielov medzi fázovou rýchlosťou rastu a priemernou rýchlosťou rastu vyplýva odchýlka od konštantného exponenciálneho rastu, ako aj skutočnosť, že bolo zaručené dôkladné preskúmanie rastových kriviek.

50.

Inhibícia rýchlosti rastu v percentách pre každý replikát s aplikovanou chemikáliou sa vypočíta pomocou rovnice [2]:

Formula

[2],

kde:

% Ir

=

percentuálna hodnota inhibície priemernej špecifickej rýchlosti rastu,

μC

=

stredná hodnota priemernej špecifickej rýchlosti rastu (μ) v kontrolnej skupine,

μT

=

priemerná špecifická rýchlosť rastu pre replikát s aplikovanou chemikáliou.

51.

Ak sa na prípravu testovacích roztokov použijú rozpúšťadlá, vo výpočte percentuálnej inhibície by sa mali použiť skôr kontrolné roztoky s rozpúšťadlom než kontrolné roztoky bez rozpúšťadiel.

Výťažok

52.

Výťažok sa vypočíta ako rozdiel množstva biomasy na konci testu a počiatočného množstva biomasy pre každú jednotlivú kontrolnú nádobu a nádobu s aplikovanou chemikáliou. Pre každú testovanú koncentráciu a kontrolnú vzorku sa vypočíta stredná hodnota výťažku spolu s odhadmi rozptylu. Percentuálna inhibícia výťažku ( % Iy) sa môže vypočítať pre každý replikát s aplikovanou chemikáliou takto:

Formula

[3]

kde:

% Iy

=

percentuálna inhibícia výťažku,

YC

=

stredná hodnota výťažku v kontrolnej skupine,

YT

=

hodnota výťažku pre replikát s aplikovanou chemikáliou.

Vytvorenie krivky reakcie na koncentráciu

53.

Vytvorí sa diagram závislosti percenta inhibície od logaritmu koncentrácie testovanej chemikálie. Diagram je potrebné pozorne skontrolovať a nebrať do úvahy žiadny dátový bod, ktorý bol vylúčený v prvej fáze ako extrémna hodnota. Dátové body sa spoja súvislou čiarou, buď voľne, alebo pomocou počítačovej interpolácie, čím sa získajú prvé poznatky o vzťahu medzi koncentráciou a reakciou, a ďalej sa postupuje presnejšou metódou, prednostne počítačovou štatistickou metódou. V závislosti od plánovaného využitia údajov, kvality (presnosti) a množstva údajov, ako aj dostupnosti nástrojov na analýzu údajov je možné rozhodnúť (niekedy celkom správne) o zastavení analýzy údajov v tomto štádiu a potom jednoducho odčítať kľúčové hodnoty EC50 a EC10 (a/alebo EC20) z voľne zostrojenej krivky (pozri tiež ďalšiu časť o stimulačných účinkoch). Platné dôvody na nepoužitie štatistickej metódy môžu byť takéto:

údaje nie sú vhodné pre počítačové metódy, ktoré by poskytli spoľahlivejšie výsledky, aké je možné získať odborným posúdením – za takýchto okolností niektoré počítačové programy môžu dokonca poskytnúť nesprávne riešenie (iterácie nemusia konvergovať atď.).

Reakcie stimulovaného rastu nie je možné náležite spracovať s použitím dostupných počítačových programov (pozri ďalej).

Štatistické postupy

54.

Cieľom je získať kvantitatívny vzťah medzi koncentráciou a reakciou pomocou regresnej analýzy. Je možné použiť váženú lineárnu regresiu po vykonaní linearizovanej transformácie reakčných údajov – napríklad na probitové alebo logitové, prípadne Weibullove jednotky (8), ale uprednostňujú sa techniky nelineárnej regresie, ktorými sa lepšie spracujú nevyhnutné nepresnosti údajov a odchýlky od hladkých rozdelení. Priblížením buď k nulovej, alebo k úplnej inhibícii sa takéto nepresnosti môžu transformáciou zväčšiť a ovplyvniť analýzu (8). Je potrebné si uvedomiť, že štandardné metódy analýzy s použitím probitovej, logitovej alebo Weibullovej transformácie sú určené na použitie na kvantálne údaje (napr. o mortalite alebo prežití) a musia sa modifikovať, aby sa prispôsobili údajom o raste alebo biomase. Osobitné postupy na stanovenie hodnôt ECx z kontinuálnych údajov je možné nájsť v literatúre pod číslami (9) (10) a (11). Ďalšie podrobnosti o použití nelineárnej regresnej analýzy sú uvedené v dodatku 5.

55.

Pre každú závisle premennú veličinu reakcie, ktorá sa má analyzovať, sa na výpočet bodových odhadov hodnôt ECx použije vzťah medzi koncentráciou a reakciou. Ak je to možné, je potrebné stanoviť 95 % hranice spoľahlivosti pre každý odhad. Vhodnosť reakčných údajov pre regresný model je potrebné vyhodnotiť buď graficky, alebo štatisticky. Regresná analýza sa musí vykonať s použitím reakcií jednotlivých replikátov, nie stredných hodnôt skupiny s aplikovanou chemikáliou. Ak je však zostrojenie nelineárnej krivky zložité alebo nemožné pre príliš veľký rozptyl údajov, problému je možné sa vyhnúť vykonaním regresie na skupinovom základe ako praktický spôsob zníženia vplyvu podozrivých extrémnych hodnôt. Použitie tejto možnosti by sa malo uviesť v protokole o skúške ako odchýlka od obvyklého postupu, keďže krivky zostrojené s jednotlivými replikátmi nepriniesli dobrý výsledok.

56.

Odhady hodnôt EC50 a hranice spoľahlivosti sa môžu získať aj použitím lineárnej interpolácie metódou ‚bootstrap‘ (13), ak sú dostupné regresné modely/metódy nevhodné pre dané údaje.

57.

Pre odhad koncentrácií LOEC aj NOEC v prípade účinkov testovanej chemikálie na rýchlosť rastu je potrebné porovnať stredné hodnoty skupiny s aplikovanou chemikáliou pomocou techník na analýzu rozptylu (ANOVA). Stredná hodnota pre každú koncentráciu sa musí potom porovnať s kontrolnou strednou hodnotou s použitím príslušného viacnásobného porovnania alebo testovacej metódy trendu. Môže sa použiť Dunnettov alebo Williamsov test (12) (14) (15) (16) (17). Je potrebné posúdiť, či je dodržaný predpoklad homogenity rozptylu ANOVA. Toto posúdenie sa môže vykonať graficky alebo formálnym testom (17). Vhodný je Levenov alebo Bartlettov test. Nesplnenie predpokladu homogenity rozptylov je niekedy možné korigovať logaritmickou transformáciou údajov. Ak je heterogenita rozptylu extrémna a nie je možné ju korigovať transformáciou, je potrebné posúdiť analýzu metódami, ako sú napríklad ‚step-down Jonkheere‘ testy trendu. Ďalšie informácie o stanovení hodnoty NOEC je možné nájsť v literatúre pod číslom (11).

58.

Najnovší vývoj vo vede vedie k odporúčaniu upustiť od koncepcie NOEC a nahradiť ju regresiou založenou na bodovom odhade ECx. Príslušná hodnota x pre tento test na riasach nebola stanovená. Vhodný sa zdá byť rozsah 10 – 20 % (v závislosti od zvolenej závisle premennej veličiny reakcie), pričom prednostne by sa mali uvádzať hodnoty EC10 a EC20.

Stimulácia rastu

59.

Niekedy sa pri nízkych koncentráciách pozoruje stimulácia rastu (negatívna inhibícia). Môže to byť dôsledok hormézy (‚toxickej stimulácie‘) alebo pridania stimulujúcich rastových faktorov s testovaným materiálom do použitého minimálneho média. Treba si uvedomiť, že pridanie anorganických živín by nemalo mať žiadny priamy účinok, kedže testovacie médium by si počas celého testu malo zachovávať nadbytok živín. Stimuláciu pri nízkych dávkach je možné pri výpočtoch EC50 zvyčajne ignorovať, pokiaľ nie je extrémna. Ak je však stimulácia extrémna alebo sa má vypočítať hodnota ECx pre nízke x, môžu byť potrebné osobitné postupy. Ak je to možné, malo by sa zabrániť vypusteniu stimulačných reakcií z analýzy údajov, a ak dostupný softvér na vytvorenie krivky nemôže prijať malú stimuláciu, môže sa použiť lineárna interpolácia metódou ‚bootstrap‘. Ak je stimulácia extrémna, môže sa zvážiť model hormézy (18).

Netoxická inhibícia rastu

60.

Testovacie materiály absorbujúce svetlo môžu spôsobiť zníženie rýchlosti rastu, keďže tienenie znižuje množstvo dostupného svetla. Takéto fyzikálne typy účinkov je potrebné oddeliť od toxických účinkov modifikáciou podmienok testu, a to je potrebné osobitne uviesť v skúšobnom protokole. Usmernenie je možné nájsť v literatúre pod číslami (2) a (3).

PROTOKOL O SKÚŠKE

61.

Skúšobný protokol musí obsahovať tieto informácie:

 

Testovaná chemikália:

fyzikálny charakter a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti vrátane limitu rozpustnosti vo vode,

identifikačné údaje chemikálie (napr. číslo CAS) vrátane čistoty (nečistôt).

 

Testovacie druhy:

kmeň, dodávateľ alebo zdroj a použité podmienky kultivácie.

 

Podmienky testu:

dátum začiatku testu a jeho dĺžka,

opis koncepcie testu: testovacie nádoby, objemy kultúr, hustota biomasy na začiatku testu,

zloženie média,

testovacie koncentrácie a replikáty (napr. počet replikátov, počet testovacích koncentrácií a použitý geometrický rad),

opis prípravy testovacích roztokov vrátane použitia rozpúšťadiel atď.,

zariadenie na kultiváciu,

intenzita svetla a kvalita (zdroj, homogenita),

teplota,

testované koncentrácie: nominálne testované koncentrácie a všetky výsledky analýz na stanovenie koncentrácie testovanej chemikálie v testovacích nádobách. V správe sa musí uviesť výťažnosť a kvantifikačný limit v testovacom matrixe,

všetky odchýlky od tejto testovacej metódy,

metóda na stanovenie množstva biomasy a dôkaz korelácie medzi meraným parametrom a sušinou.

 

Výsledky:

hodnoty pH na začiatku a na konci testu pri všetkých aplikáciách chemickej látky,

množstvo biomasy v každej banke v každom meranom bode a metóda merania množstva biomasy,

rastové krivky (diagram závislosti množstva biomasy od času),

vypočítané hodnoty závisle premenných veličín reakcie pre každý replikát s aplikovanou chemikáliou, so strednými hodnotami a s variačným koeficientom pre replikáty,

grafické znázornenie vzťahu koncentrácie a účinku,

odhady toxicity pre závisle premenné veličiny reakcie napr. EC50, EC10, EC20, a príslušné intervaly spoľahlivosti. hodnoty LOEC a NOEC a štatistické metódy použité na ich stanovenie v prípade, že sa vypočítavajú,

ak sa používa technika ANOVA, veľkosť účinku, ktorý je možné detegovať (napr. najmenej významný rozdiel),

každá stimulácia rastu zistená v ľubovoľnej vzorke s aplikovanou chemikáliou,

všetky iné pozorované účinky, napríklad morfologické zmeny rias,

rozbor výsledkov vrátane každého vplyvu na výsledok testu vyplývajúceho z odchýlok od tejto testovacej metódy.

LITERATÚRA

1.

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

2.

International Organisation for Standardisation (1998). ISO DIS 14442. Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

3.

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

4.

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

5.

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

6.

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

7.

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

8.

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

9.

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

10.

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

11.

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

12.

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

13.

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

14.

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

15.

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

16.

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

17.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

18.

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Dodatok 1

Vymedzenia pojmov

Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto pojmy a skratky:

 

Biomasa je suchá hmotnosť živej hmoty nachádzajúcej sa v populácii, vyjadrenej ako daný objem, napríklad mg rias/liter testovacieho roztoku, napr. mg rias/liter testovacieho roztoku. ‚Biomasa‘ je zvyčajne vymedzená ako hmotnosť, ale v tomto teste sa uvedené slovo používa na vyjadrenie hmotnosti na objem. V tomto teste sa bežne merajú aj náhradné parametre biomasy ako napríklad počet buniek, fluorescencia atď., a teda používanie pojmu ‚biomasa‘ sa vzťahuje aj na tieto náhradné parametre.

 

Chemikália je látka alebo zmes.

 

Variačný koeficient (VK) je bezrozmerná hodnota premenlivosti parametra vymedzená ako pomer štandardnej odchýlky k strednej hodnote. Môže byť vyjadrená aj ako percentuálna hodnota. Stredný variačný koeficient priemernej špecifickej rýchlosti rastu sa v repilátoch kontrolných kultúr počíta takto:

1.

pre príslušné replikáty sa vypočíta percentuálna hodnota VK priemernej špecifickej rýchlosti rastu na základe denných/fázových rýchlostí rastu,

2.

vypočíta sa stredná hodnotu zo všetkých hodnôt vypočítaných v bode 1, čím sa získa stredný variačný koeficient špecifickej dennej/fázovej rýchlosti rastu v replikátoch kontrolných kultúr.

 

ECx je koncentrácia testovanej chemikálie rozpustenej v testovacom médiu, ktorej dôsledkom je x % (napr. 50 %) zníženie rastu testovacieho organizmu v rámci stanoveného času expozície (je potrebné výslovne uviesť, ak sa odchyľuje od celkovej alebo bežnej dĺžky testu). Na jednoznačné označenie hodnoty EC odvodenej z rýchlosti rastu alebo výťažku sa používa symbol ‚ErC‘ pre rýchlosť rastu a symbol ‚EyC‘ pre výťažok.

 

Rastové médium je kompletné syntetické kultivačné médium, v ktorom rastie testovaná riasa vystavená pôsobeniu testovanej chemikálie. Testovaná chemikália sa spravidla rozpustí v testovacom médiu.

 

Rýchlosť rastu (priemerná špecifická rýchlosť rastu) je logaritmickým nárastom množstva biomasy počas expozície.

 

Najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC) je najnižšia testovacia koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje, že chemikália má štatisticky významný účinok na zníženie rastu (pri p < 0,05) v porovnaní s kontrolnou kultúrou v rámci daného času expozície. Škodlivý účinok všetkých testovacích koncentrácií nad LOEC však musí byť vždy rovnaký alebo väčší ako účinky pozorované pri LOEC. Ak nie sú splnené tieto dve podmienky, je potrebné poskytnúť úplné vysvetlenie, akým spôsobom sa zvolila koncentrácia LOEC (a teda aj koncentrácia NOEC).

 

Koncentrácia bez pozorovaného účinku (NOEC) je testovacia koncentrácia bezprostredne pod koncentráciou LOEC.

 

Závislé premenná veličina reakcie je premenná na odhad toxicity odvodená z akýchkoľvek meraných parametrov opisujúcich biomasu rôznymi metódami výpočtu. V prípade tejto testovacej metódy sú rýchlosti rastu a výťažok závisle premennými veličinami reakcie odvodenými priamo z merania množstva biomasy alebo uvedených náhradných parametrov.

 

Špecifická rýchlosť rastu je premenná hodnota reakcie vymedzená ako kvocient rozdielu prirodzených logaritmov parametra pozorovania (v rámci tejto testovacej metódy biomasy) a príslušného časového intervalu.

 

Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy.

 

Výťažok je rozdiel hodnoty meranej premennej na konci expozície a hodnoty meranej premennej na jej začiatku, ktorý vyjadruje nárast množstva biomasy počas testu.

Dodatok 2

Kmene, ktoré sa ukázali ako vhodné na účely testu

Zelené riasy

 

Pseudokirchneriella subcapitata (predtým známa ako Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, SAG 61.81

 

Desmodesmus subspicatus (predtým známa ako Scenedesmus subspicatus), SAG 86.81

Rozsievky

Navicula pelliculosa, UTEX 664

Sinice

 

Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A

 

Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1

Zdroje kmeňov

Odporúčané kmene sú dostupné z kultúr s jedným druhom rias z týchto zbierok (v abecednom poradí)

 

ATCC: American Type Culture Collection

10801 University Boulevard

Manassas, Virginia 20110-2209

USA

 

CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa

Institute of Freshwater Ecology,

Windermere Laboratory

Far Sawrey, Amblerside

Cumbria LA22 0LP

VEĽKÁ BRITÁNIA

 

SAG: Collection of Algal Cultures

Inst. Plant Physiology

University of Göttingen

Nikolausberger Weg 18

37073 Göttingen

NEMECKO

 

UTEX Culture Collection of Algae

Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology

School of Biological Sciences

the University of Texas at Austin

Austin, Texas 78712

USA.

Vzhľad a charakteristika odporúčaných druhov

 

P. subcapitata

D. subspicatus

N. pelliculosa

A. flos-aquae

S. leopoliensis

Vzhľad

zakrivené, skrútené samostatné bunky

oválne, väčšinou samostatné bunky

tyčinky

reťazce oválnych buniek

tyčinky

Veľkosť (dĺžka × šírka) μm

8 – 14 × 2 – 3

7 – 15 × 3 – 12

7,1 × 3,7

4,5 × 3

6 × 1

Objem buniek (v μm3 na bunku)

40 – 60 (2)

60 – 80 (2)

40 – 50 (2)

30 – 40 (2)

2,5 (3)

Sušina buniek (v mg na bunku)

2 – 3 × 10– 8

3 – 4 × 10– 8

3 – 4 × 10– 8

1 – 2 × 10– 8

2 – 3 × 10– 9

Rýchlosť rastu (4) (deň– 1)

1,5 – 1,7

1,2 – 1,5

1,4

1,1 – 1,4

2,0 – 2,4

Osobitné odporúčania pre kultiváciu a zaobchádzanie s odporúčanými testovacími druhmi

Pseudokirchneriella subcapitata a Desmodesmus subspicatus

Tieto zelené riasy sa spravidla ľahko uchovávajú v rôznych kultivačných médiách. Informácie týkajúce sa vhodných médií sú dostupné zo zbierok kultúr. Bunky sú spravidla samostatné, bunková hustota sa stanovuje jednoducho s použitím elektronického počítadla častíc alebo mikroskopu.

Anabaena flos-aquae

Na uchovávanie zásobnej kultúry sa môžu použiť rôzne rastové médiá. Je mimoriadne dôležité, aby sa pri obnovovaní zabránilo jednorazovej kultúre prekročiť log fázu rastu, v tomto bode je obnova zložitá.

Anabaena flos-aquae vytvára zhluky spletených reťazcov buniek. Veľkosť týchto zhlukov sa môže meniť podľa podmienok kultivácie. Môže byť potrebné rozdeliť tieto zhluky, ak sa na stanovenie množstva biomasy použije počítanie pomocou mikroskopu alebo elektronického počítadla častíc.

Môže sa použiť sonifikácia čiastkových vzoriek na rozbitie reťazcov, aby sa znížila variabilita počtu buniek. Dlhšia sonifikácia, ako sa vyžaduje na rozbitie reťazcov na kratšie úseky, môže poškodiť bunky. Intenzita sonifikácie a jej trvanie musia byť rovnaké pri každom spracovaní.

Je potrebné spočítať dostatočné množstvo políčok na hemocytometri (minimálne 400 buniek) na elimináciu variability. Tým sa zlepší spoľahlivosť mikroskopického stanovenia hustoty.

Elektronické počítadlo častíc sa môže použiť na stanovenie celkového objemu buniek rodu Anabaena po rozbití reťazcov buniek opatrnou sonifikáciou. Je potrebné prispôsobiť silu sonifikácie, aby sa zabránilo rozbitiu buniek.

Použite vortexový mixér alebo podobnú vhodnú metódu na zabezpečenie toho, aby suspenzia rias, ktorá sa použije na inokuláciu testovacích nádob, bola dobre premiešaná a homogénna.

Testovacie nádoby by sa mali umiestniť na orbitálnu trepačku s platformou približne pri 150 otáčkach za minútu. Alternatívne sa môže použiť občasné miešanie na zníženie tvorby zhlukov rodu Anabaena. Ak sa vyskytne zhlukovanie, je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa dosiahli reprezentatívne vzorky na stanovenie množstva biomasy. Môže byť potrebné prudké premiešanie pred odberom vzoriek, aby sa rozbili zhluky rias.

Synechococcus leopoliensis

Na uchovávanie zásobnej kultúry sa môžu použiť rôzne rastové médiá. Informácie týkajúce sa vhodných médií sú dostupné zo zbierok kultúr.

Synechococcus leopoliensis rastie vo forme samostatných tyčinkovitých buniek. Bunky sú veľmi malé, čo sťažuje použitie počítania pomocou mikroskopu pri meraniach množstva biomasy. Užitočné sú elektronické počítadlá častíc vybavené na počítanie menších častíc až veľkosti približne 1 μm. Vhodné sú tiež fluorometrické merania in vitro.

Navicula pelliculosa

Na uchovávanie zásobnej kultúry sa môžu použiť rôzne rastové médiá. Informácie týkajúce sa vhodných médií sú dostupné zo zbierok kultúr. Treba si uvedomiť, že do média je potrebné pridať kremičitan.

Navicula pelliculosa môže v určitých rastových podmienkach vytvárať zhluky. Z dôvodu tvorby lipidov majú bunky rias niekedy tendenciu akumulovať sa vo forme povrchového filmu. Za týchto okolností je potrebné prijať osobitné opatrenia pri odoberaní čiastkových vzoriek na stanovenie množstva biomasy, aby bolo možné získať reprezentatívne vzorky. Môže byť potrebné prudké premiešanie napr. použitím vortexového mixéra.

Dodatok 3

Rastové médiá

Môže sa použiť jedno z týchto rastových médií:

médium OECD: pôvodné médium OECD TG 201, tiež podľa ISO 8692,

US. EPA médium AAP, tiež podľa ASTM.

Pri príprave týchto médií sa musia použiť reagenty alebo chemikálie analytickej kvality a deionizovaná voda.

Zloženie média AAP (U.S. EPA) a média OECD TG 201.

Zložka

AAP

OECD

 

mg/l

mM

mg/l

mM

NaHCO3

15,0

0,179

50,0

0,595

NaNO3

25,5

0,300

 

 

NH4Cl

 

 

15,0

0,280

MgCl2 · 6(H2O)

12,16

0,0598

12,0

0,0590

CaCl2 · 2(H2O)

4,41

0,0300

18,0

0,122

MgSO4 · 7(H2O)

14,6

0,0592

15,0

0,0609

K2HPO4

1,044

0,00599

 

 

KH2PO4

 

 

1,60

0,00919

FeCl3 · 6(H2O)

0,160

0,000591

0,0640

0,000237

Na2EDTA · 2(H2O)

0,300

0,000806

0,100

0,000269*

H3BO3

0,186

0,00300

0,185

0,00299

MnCl2 · 4(H2O)

0,415

0,00201

0,415

0,00210

ZnCl2

0,00327

0,000024

0,00300

0,0000220

CoCl2 · 6(H2O)

0,00143

0,000006

0,00150

0,00000630

Na2MoO4 · 2(H2O)

0,00726

0,000030

0,00700

0,0000289

CuCl2 · 2(H2O)

0,000012

0,00000007

0,00001

0,00000006

pH

7,5

8,1

Molárny pomer EDTA a železa je mierne vyšší ako jeden. Zabraňuje to vyzrážaniu železa a zároveň sa minimalizuje chelácia ťažkých kovov.

V teste s rozsievkou Navicula pelliculosa sa musí k obidvom médiám pridať Na2SiO3 · 9H20, aby sa dosiahla koncentrácia 1,4 mg Si/l.

Príslušná hodnota pH média sa dosiahne rovnováhou medzi uhličitanovým systémom média a parciálnym tlakom CO2 v okolitom vzduchu. Približný vzťah medzi pH pri 25 °C a molárnou koncentráciou hydrogenuhličitanu je:

pHeq = 11,30 + log[HCO3]

pri 15 mg NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (U.S. EPA médium) alebo pri 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (médium OECD).

Zloženie prvkov v testovacom médiu

Prvok

AAP

OECD

 

mg/l

mg/l

C

2,144

7,148

N

4,202

3,927

P

0,186

0,285

K

0,469

0,459

Na

11,044

13,704

Ca

1,202

4,905

Mg

2,909

2,913

Fe

0,033

0,017

Mn

0,115

0,115

Príprava média OECD

Živina

Koncentrácia v zásobnom roztoku

Zásobný roztok 1:

makroživiny

NH4Cl

1,5 g/l

MgCl2 · 6H2O

1,2 g/l

CaCl2 · 2H2O

1,8 g/l

MgSO4 · 7H2O

1,5 g/l

KH2PO4

0,16 g/l

Zásobný roztok 2:

železo

FeCl3 · 6H2O

64 mg/l

Na2EDTA · 2H2O

100 mg/l

Zásobný roztok 3:

stopové prvky

H3BO3

185 mg/l

MnCl2 · 4H2O

415 mg/l

ZnCl2

3 mg/l

CoCl2 · 6H2O

1,5 mg/l

CuCl2 · 2H2O

0,01 mg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7 mg/l

Zásobný roztok 4:

hydrogénuhličitan

NaHCO3

50 g/l

Na2SiO3 · 9H20

 

Zásobné roztoky sa sterilizujú membránovou filtráciou (stredný priemer pórov 0,2 μm) alebo autoklávovaním (120 °C, 15 min). Roztoky sa skladujú v tme pri teplote 4 °C.

Zásobné roztoky 2 a 4 sa neautoklávujú, ale sterilizujú membránovou filtráciou.

Rastové médium sa pripraví pridaním príslušného objemu zásobných roztokov 1 až 4 do vody:

 

do 500 ml sterilizovanej vody sa pridá:

 

10 ml zásobného roztoku 1,

 

1 ml zásobného roztoku 2,

 

1 ml zásobného roztoku 3,

 

1 ml zásobného roztoku 4.

 

Doplní sa sterilizovanou vodou do 1 000 ml.

Je potrebné poskytnúť dostatočný čas na vyrovnanie média s atmosférickým CO2, v prípade potreby niekoľkohodinovým prebublávaním sterilným filtrovaným vzduchom.

Príprava U.S. EPA média AAP

1.

Do približne 900 ml deionizovanej alebo destilovanej vody sa pridá 1 ml každého zásobného roztoku v 2.1 – 2.7 a potom sa zriedi na 1 liter.

2.

Zásobné roztoky makroživín sa pripravujú rozpustením týchto látok v 500 ml deionizovanej alebo destilovanej vody. Reagenty 2.1, 2.2, 2.3 a 2.4 sa môžu spojiť do jedného zásobného roztoku.

2,1

NaNO3

12,750 g.

2,2

MgCl2 · 6H2O

6,082 g.

2,3

CaCl2 · 2H2O

2,205 g.

2,4

Zásobný roztok mikroživín (pozri 3)

2,5

MgSO4 · 7H2O

7,350 g.

2,6

K2HPO4

0,522 g.

2,7

NaHCO3

7,500 g.

2,8

Na2SiO3 · 9H2O

Pozri poznámku 1.

Poznámka 1: Používa sa iba pre testovacie druhy rozsievok. Môže sa pridať priamo (202,4 mg) alebo prostredníctvom zásobného roztoku, aby sa dosiahla konečná koncentrácia Si v médiu 20 mg/l.

3.

Zásobný roztok mikroživín sa pripravuje rozpustením týchto látok v 500 ml deionizovanej alebo destilovanej vody:

3,1

H3BO3

92,760 mg.

3,2

MnCl2 · 4H2O

207,690 mg.

3,3

ZnCl2

1,635 mg.

3,4

FeCl3 · 6H2O

79,880 mg.

3,5

CoCl2 · 6H2O

0,714 mg.

3,6

Na2MoO4 · 2H2O

3,630 mg.

3,7

CuCl2 · 2H2O

0,006 mg.

3,8

Na2EDTA · 2H2O

150,000 mg. [dinátrium (etyléndinitrilo) tetraacetát].

3,9

Na2SeO4 · 5H2O

0,005 mg pozri poznámku 2.

Poznámka 2: Používa sa iba v médiu pre zásobné roztoky kultúry druhov rozsievok.

4.

Hodnota pH sa upraví na 7,5 ± 0,1 pridaním 0,1 N alebo 1,0 N NaOH alebo HCl.

5.

Médium sa prefiltruje do sterilnej nádoby cez 0,22 μm membránový filter, ak sa má používať počítač častíc, alebo cez 0,45 μm filter v prípade, že sa počítač častíc nepoužíva.

6.

Médium sa až do použitia skladuje v tme pri teplote približne 4 °C.

Dodatok 4

Vzor postupu kultivácie rias

Všeobecné pozorovania

Účelom kultivácie podľa tohto postupu je získať kultúry rias na testovanie toxicity.

Musia sa použiť vhodné metódy na zabezpečenie toho, aby kultúry rias neboli infikované baktériami. Axenické kultúry môžu byť vhodné, ale potrebné je vytvoriť a používať kultúry s jedným druhom rias.

Všetky činnosti by sa mali vykonávať v sterilných podmienkach, aby sa zamedzilo kontaminácii baktériami a inými riasami.

Zariadenia a materiály

Pozri v časti Testovacia metóda: Zariadenia.

Postupy na získanie kultúr rias

Príprava živných roztokov (médií):

Všetky živné soli média sa pripravia ako koncentrované zásobné roztoky a skladujú sa v tme a chlade. Tieto roztoky sa sterilizujú filtráciou alebo autoklávovaním.

Médium sa pripraví pridaním správneho množstva zásobného roztoku do sterilnej destilovanej vody, pričom sa dbá na to, aby nedošlo k infekcii. V prípade tuhého média sa pridáva 0,8 % agaru.

Zásobná kultúra:

Zásobné kultúry sú malé kultúry rias, ktoré sa pravidelne prenášajú do čerstvého média, aby sa použili ako počiatočný testovací materiál. Ak sa kultúry nepoužívajú pravidelne, naočkujú sa do skúmaviek na šikmý agar. Potom sa aspoň raz za dva mesiace prenesú do čerstvého média.

Zásobné kultúry sa kultivujú v kónických bankách obsahujúcich vhodné médium (objem okolo 100 ml). Ak sa riasy inkubujú pri teplote 20 °C pri sústavnom osvetlení, je potrebný prenos raz týždenne.

Prenesie sa také množstvo ‚starej‘ kultúry sterilnou pipetou do banky s čerstvým médiom, aby počiatočná koncentrácia rýchlo rastúceho druhu bola asi 100-násobne menšia ako v starej kultúre.

Rýchlosť rastu druhu sa môže stanoviť z rastovej krivky. Ak je táto rýchlosť známa, je možné určiť hustotu, pri ktorej by sa mala kultúra preniesť do nového média. To sa musí vykonať skôr, ako kultúra dosiahne stacionárnu fázu rastu.

Prípravná kultúra:

Prípravná kultúra je určená na to, aby poskytla potrebné množstvo rias na inokuláciu testovacích kultúr. Prípravná kultúra sa inkubuje pri testovacích podmienkach a použije sa, pokiaľ je ešte v exponenciálnom raste, spravidla po inkubačnom čase 2 až 4 dni. Kultúry rias obsahujúce deformované alebo abnormálne bunky sa musia odstrániť.

Dodatok 5

Analýza údajov nelineárnou regresiou

Všeobecné aspekty

Reakcia v testoch na riasach a iných testoch mikrobiálneho rastu – rastu biomasy – je svojím charakterom kontinuálna alebo metrická premenná; ide o rýchlosť procesu, ak sa použije rýchlosť rastu, a jeho časový integrál, ak sa zvolí biomasa. Obidva sa vzťahujú na zodpovedajúcu strednú hodnotu reakcie paralelných neexponovaných kontrolných kultúr, ktoré vykazujú maximálnu reakciu za podmienok, ktorým sú vystavené, pričom svetlo a teplota sú v teste na riasach primárnymi určujúcim faktormi. Systém je distribuovaný alebo homogénny a na biomasu sa môže nahliadať ako na kontinuum, pričom sa nezohľadňujú jednotlivé bunky. Distribúcia rozptylu v prípade reakcie takéhoto systému sa vzťahuje iba na experimentálne faktory (spravidla opísané ako logaritmicko-normálne alebo normálne distribúcie chyby). To je opakom typických reakcií pri biologických testoch s kvantálnymi údajmi, pre ktoré sa tolerancia (typicky binomicky rozdelená) jednotlivých organizmov často pokladá za dominantnú zložku rozptylu. Reakcie kontrolných kultúr tu majú hodnotu nula alebo hodnotu pozadia.

V podmienkach bez výskytu komplikácií normalizovaná alebo relatívna reakcia r monotónne klesá z hodnoty 1 (nulová inhibícia) k hodnote 0 (100 % inhibícia). Treba si uvedomiť, že so všetkými reakciami sa spája chyba a že zjavné negatívne inhibície je možné vypočítať iba ako výsledok náhodnej chyby.

Regresná analýza

Modely

Regresná analýza sa zameriava na kvantitatívny opis krivky reakcie na koncentráciu vo forme matematickej regresnej funkcie Y = f (C) alebo častejšie F (Z), kde Z = log C. Inverzné použitie C = f– 1 (Y) umožňuje výpočet hodnôt ECx vrátane EC50, EC10 a EC20 a ich 95 % hraníc spoľahlivosti. Niektoré jednoduché formy matematických funkcií sú schopné úspešne opísať vzťahy medzi koncentráciou a reakciou získané na základe testov inhibície rastu rias. Funkcie zahŕňajú napríklad logaritmickú rovnicu, nesymetrickú Weibullovu rovnicu a logaritmicko-normálnu funkciu distribúcie, z ktorých všetky tvoria sigmoidné krivky asymptoticky sa približujúce k nule pre C → 0 a jednej pre C → nekonečno.

Použitie kontinuálnych modelov prahových funkcií (napr. Kooijmanov model ‚pre inhibíciu populačného rastu‘, Kooijman a kol., 1996) je najnovším návrhom alebo alternatívou asymptotických modelov. Pri tomto modeli sa nepredpokladajú účinky pri koncentráciách pod určitou prahovou hodnotou, EC0+, ktorá sa odhadne extrapoláciou vzťahu reakcie na koncentráciu, aby preťala os koncentrácie s použitím jednoduchej kontinuálnej funkcie, ktorá v počiatočnom bode nie je diferencovateľná.

Treba si uvedomiť, že analýza môže byť jednoduchou minimalizáciou súčtov reziduálnych štvorcov (za predpokladu konštantného rozptylu) alebo vážených štvorcov, ak je heterogenita rozptylu kompenzovaná.

Postup

Postup je možné opísať takto: zvolí sa príslušná rovnica funkcie Y = f (C) a aproximuje sa na údaje nelineárnou regresiou. Je potrebné uprednostniť využitie meraní z každej jednotlivej banky pred využitím stredných hodnôt replikátov, aby sa z údajov získalo čo najviac informácií. Na druhej strane, z praktických skúseností vyplýva, že ak je rozptyl vysoký, stredné hodnoty replikátov môžu poskytnúť lepší matematický odhad, menej ovplyvnený systematickými chybami v údajoch, ako v prípade každého jednotlivého experimentálneho bodu.

Do diagramu sa zaznamená aproximovaná krivka a namerané údaje, pričom je potrebné skontrolovať, či je preloženie krivky správne. Obzvlášť užitočným nástrojom na tento účel môže byť analýza rezíduí. Ak zvolený funkčný vzťah použitý na reakciu na koncentráciu neopisuje dobre celú krivku alebo niektorú jej dôležitú časť, ako napríklad reakcie pri nízkych koncentráciách, je potrebné zvoliť inú možnosť aproximácie krivky – napríklad nesymetrickú krivku ako Weibullovu funkciu namiesto symetrickej krivky. Negatívne inhibície môžu byť problémom napríklad pre logaritmicko-normálnu funkciu distribúcie, ktorá si takisto vyžaduje alternatívnu regresnú funkciu. Neodporúča sa priradiť nulu ani malú kladnú hodnotu k takýmto záporným hodnotám, lebo to skresľuje distribúciu chýb. Môže byť vhodné vyhotoviť samostatné aproximácie krivky na častiach krivky, ako napríklad časť nízkej inhibície na odhad hodnôt EClow x. Z použitej rovnice sa vypočítajú [‚inverzným odhadom‘, C = f– 1 (Y)] charakteristické bodové odhady ECx a zaznamenajú sa ako minimálne EC50 a jeden alebo dva odhady EClow x. Zo skúseností z praktického testovania vyplýva, že presnosť testu na riasach spravidla umožňuje primerane presný odhad pri 10 % úrovni inhibície, ak je dostatok dátových bodov – pokiaľ sa nevyskytne stimulácia pri nízkych koncentráciách ako faktor spôsobujúci zmätok. Presnosť odhadu EC20 je často podstatne vyššia ako EC10, keďže hodnota EC20 obvykle leží približne na lineárnej časti centrálnej krivky závislosti veličiny od koncentrácie. Niekedy môže byť ťažké interpretovať EC10 v dôsledku stimulácie rastu. Preto sa odporúča, aj keď je možné EC10 spravidla získať s dostatočnou presnosťou, zaznamenať vždy aj hodnotu EC20.

Váhové faktory

Experimentálny rozptyl nie je spravidla konštantný a obvykle zahŕňa proporcionálnu zložku, preto je výhodné bežne vykonávať váženú regresiu. Váhové faktory pre takúto analýzu sa zvyčajne pokladajú za inverzne proporcionálne rozptylu:

Wi = 1/Var(ri)

Mnohé regresné programy povoľujú možnosť analýzy váženou regresiou s váženými faktormi uvedenými v tabuľke. Obvykle by sa mali vážené faktory normalizovať tak, že sa vynásobia hodnotou n/Σ wi (n je počet dátových bodov), aby sa ich súčet rovnal jednej.

Normalizované reakcie

Normalizovanie strednou hodnotou reakcie kontrolnej kultúry skrýva niektoré zásadné problémy a spôsobuje pomerne komplikovanú štruktúru rozptylu. Vydelením reakcií strednou hodnotou reakcie kontrolnej kultúry, aby sa získala percentuálna hodnota inhibície, dochádza k ďalšej chybe zapríčinenej chybou strednej hodnoty. Okrem prípadu, keď je táto chyba zanedbateľne malá, sa musia opraviť váhové faktory v regresii, ako aj hranice spoľahlivosti na kovarianciu s hodnotami pre kontrolnú kultúru (Draper a Smith, 1981). Treba si uvedomiť, že vysoká presnosť odhadovanej strednej hodnoty reakcie kontrolnej kultúry je dôležitá, aby sa minimalizovala celkový rozptyl pre relatívnu reakciu. Uvedený rozptyl je takýto:

(Index i sa vzťahuje na úroveň koncentrácie i a index 0 na kontrolné kultúry)

Yi = relatívna reakcia = ri/r0 = 1 – I = f(Ci)

s rozptylom Var(Y i) = Var ( ri/r0) ≅ (∂Yi / ∂ ri)2 · Var(ri) + (∂ Yi/ ∂ r0)2 · Var(r0)

a keďže (∂ Yi/ ∂ ri) = 1/r0 a (∂ Y i/ ∂ r0) = ri/r0 2

s normálne rozdelenými údajmi a replikátmi mi a m0: Var(ri ) = σ2/mi

celkový rozptyl relatívnej reakcie Yi je teda

Var(Yi) = σ2/(r0 2 · mi) + ri 2 · σ2/r0 4 · m0

Chyba strednej hodnoty kontrolnej kultúry je inverzne proporcionálna k druhej odmocnine počtu spriemerovaných paralelných kontrolných kultúr, pričom niekedy môže byť opodstatnené zahrnúť predchádzajúce údaje, a tým vo veľkej miere znížiť chybu. Alternatívny postup je nenormalizovať údaje a aproximovať absolútne reakcie vrátane údajov o reakcii kontrolnej kultúry, ale zaviesť hodnoty reakcie kontrolnej kultúry ako ďalší parameter na použitie nelineárnou regresiou. Regresný výpočet má obvykle dva parametre, no táto metóda si vyžaduje tri parametre, a preto je potrebných viac dátových bodov ako pri nelineárnej regresii, pokiaľ ide o údaje, ktoré sú normalizované pri použití vopred nastavenej reakcie kontrolnej kultúry.

Intervaly inverznej spoľahlivosti

Výpočet intervalov spoľahlivosti nelineárnej regresie inverzným odhadom je pomerne zložitý a nie je dostupnou štandardnou voľbou v bežných počítačových štatistických programových balíkoch. Približné hranice spoľahlivosti sa môžu získať pomocou štandardných programov nelineárnej regresie s reparametrizáciou (Bruce a Versteeg, 1992), ktorá zahŕňa prepísanie matematickej rovnice požadovanými bodovými odhadmi, napríklad s EC10 a EC50 ako parametrami, ktoré sa majú odhadnúť. [Funkciou nech je I = f (α, β, koncentrácia) a použijú sa definičné vzťahy f (α, β, EC10) = 0,1 a f (α, β, EC50) = 0,5, aby sa nahradila f (α, β, koncentrácia) ekvivalentnou funkciou g (EC10, EC50, koncentrácia).

Priamejší výpočet (Andersen a kol., 1998) sa vykoná ponechaním pôvodnej rovnice a použitím Taylorovej expanzie okolo stredných hodnôt ri a r0.

V poslednom čase sa stala populárnou metóda ‚bootstrap‘. Tieto metódy používajú namerané údaje a generátor náhodných čísel riadeného častého opätovného odberu vzoriek na odhad empirickej distribúcie rozptylu.

LITERATÚRA

Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

Bruce, R.D. and Versteeg,, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.

4.

Kapitola C.11 sa nahrádza takto:

C.11.   AKTIVOVANÝ KAL, TEST RESPIRAČNEJ INHIBÍCIE (OXIDÁCIA UHLÍKA A AMÓNNYCH IÓNOV)

ÚVOD

1.

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 209 (2010). Táto testovacia metóda opisuje metódu stanovenia účinkov chemikálie na mikroorganizmy z aktivovaného kalu (väčšinou baktérie) meraním ich rýchlosti spotreby kyslíka (oxidácie uhlíka a/alebo amónnych iónov) v definovaných podmienkach a v prítomnosti rozličných koncentrácií testovanej chemikálie. Testovacia metóda je založená na teste ETAD (ekologické a toxikologické združenie odvetvia výroby farbív) (1) (2), na predchádzajúcom usmernení OECD TG 209 (3) a na revidovanej norme ISO 8192 (4). Účelom tohto testu je poskytnúť metódu rýchleho skríningu na posúdenie účinkov chemikálií na mikroorganizmy aktivovaného kalu z biologického (aeróbneho) stupňa čistiarní odpadových vôd. Výsledky testu môžu slúžiť aj ako ukazovateľ vhodných neinhibičných koncentrácií testovaných chemikálií použiteľných v testoch biodegradovateľnosti (napr. kapitoly C.4 A – F, C.9, C.10, C.12 a C.29 tejto prílohy, OECD TG 302 C). V tomto prípade sa test môže vykonať ako skríningový test, podobne ako test na vyhľadávanie rozsahu alebo limitný test (pozri bod 39), pričom sa berie do úvahy iba celková respirácia. Tieto informácie by sa však mali posudzovať opatrne v prípade testov ľahkej biodegradovateľnosti (kapitola C.4 A – F a C.29 tejto prílohy), pre ktoré je koncentrácia inokula výrazne nižšia než koncentrácia používaná v tejto testovacej metóde. Nedostatočná inhibícia v tomto respiračnom teste však neznamená automaticky neinhibičné podmienky testu ľahkej biodegradovateľnosti podľa kapitoly C.4 A – F alebo C.29 tejto prílohy.

2.

Celkovo sa zdá, že test respiračnej inhibície sa od prvého publikovania úspešne používa, no v niektorých prípadoch boli zaznamenané nesprávne výsledky, napríklad (2) (4) (5). Respiračné krivky súvisiace s koncentráciou sú niekedy dvojfázové, diagramy vzťahu medzi dávkou a reakciou skreslené a hodnoty EC50 nečakane nízke (5). Prešetrovania ukázali, že takéto výsledky sa dosahujú, ak použitý aktivovaný kal výrazne nitrifikuje a testovaná chemikália má väčší účinok na oxidáciu amónnych iónov ako na všeobecnú heterotrofnú oxidáciu. Preto je možné tieto nesprávne výsledky prekonať vykonaním doplnkových testov použitím špecifického inhibítora nitrifikácie. Na základe merania miery spotreby kyslíka v prítomnosti a v neprítomnosti takého inhibítora, napríklad N-alylthomočoviny (ATU), sa môžu osobitne vypočítať miery celkovej, heterotrofnej a nitrifikačnej spotreby kyslíka (4) (7) (8). Umožní to stanoviť inhibičné účinky testovanej chemikálie na tieto dva procesy a vypočítať hodnoty EC50 tak pre oxidáciu organického uhlíka (heterotrofnú), ako aj amónnych iónov (nitrifikáciu) zvyčajným spôsobom. Je potrebné si uvedomiť, že v niektorých zriedkavých prípadoch môže byť inhibičný účinok N-alyltiomočoviny čiastočne alebo úplne anulovaný v dôsledku vytvárania komplexov s testovanými chemikáliami alebo doplnkami média, napríklad iónmi Cu++ (6). Ióny Cu++ sú nevyhnutné pre baktérie Nitrosomonas, no vo vyššej koncentrácii sú toxické.

3.

Potreba nitrifikácie v aeróbnom čistení odpadových vôd ako nevyhnutný krok v procese odstraňovania zlúčenín dusíka z odpadových vôd denitrifikáciou na plynné produkty, sa stala naliehavou najmä v európskych krajinách. EÚ stanovila dolné limity koncentrácie dusíka vo vyčistených výtokoch vypúšťaných do zberných vôd (5).

4.

Na väčšinu účelov postačuje samotná metóda posúdenia účinku na procesy oxidácie organického uhlíka. V niektorých prípadoch je však na interpretáciu výsledkov a pochopenie účinkov potrebné preskúmanie účinku na samotnú nitrifikáciu, alebo na nitrifikáciu a oxidáciu organického uhlíka zvlášť.

PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY

5.

Rýchlosť spotreby kyslíka aktivovaného kalu vyživovaného syntetickou odpadovou vodou sa meria v uzavretej komore obsahujúcej kyslíkovú elektródu po kontaktnom čase 3 hodiny. So zreteľom na reálny expozičný scenár by vyhovovali dlhšie kontaktné časy. Ak testovaná chemikália rýchlo degraduje, napríklad abioticky prostredníctvom hydrolýzy, alebo je prchavá a koncentráciu nie je možné primerane udržiavať, je možné použiť kratší čas expozície napr. 30 minút. Citlivosť každej dávky aktivovaného kalu by sa mala v deň expozície overiť pomocou vhodnej referenčnej chemikálie. Test sa spravidla používa na stanovenie koncentrácie ECx (napr. EC50) testovanej chemikálie a/alebo koncentrácie bez pozorovaného účinku (NOEC).

6.

Inhibícia spotreby kyslíka mikroorganizmami oxidujúcimi organický uhlík sa môže osobitne vyjadriť zo spotreby kyslíka mikroorganizmami oxidujúcimi amónne ióny meraním rýchlostí spotreby kyslíka v prítomnosti i neprítomnosti N-alyltiomočoviny – špecifického inhibítora oxidácie amónnych iónov na dusitany primárnymi nitrifikačnými baktériami. V tomto prípade sa percentuálna inhibícia rýchlosti spotreby kyslíka vypočíta porovnaním rýchlosti spotreby kyslíka v prítomnosti testovanej chemikálie so strednou hodnotou spotreby kyslíka zodpovedajúcich kontrolných vzoriek neobsahujúcich testovanú chemikáliu, a to tak v prítomnosti, ako aj v neprítomnosti špecifického inhibítora N-alyltiomočoviny.

7.

Akákoľvek spotreba kyslíka vyplývajúca z abiotických procesov sa môže zistiť stanovením miery spotreby v zmesiach testovanej chemikálie, syntetickej odpadovej vody a vody, bez aktivovaného kalu.

INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII

8.

Na to, aby bolo možné správne interpretovať výsledky, mala by byť známa identifikácia testovanej chemikálie (najlepšie číslo CAS), jej názov (IUPAC), čistota, rozpustnosť vo vode, tlak pary, prchavosť a adsorpčné vlastnosti. Prchavé látky spravidla nie je možné primerane testovať, pokiaľ sa neprijmú osobitné opatrenia (pozri bod 21).

POUŽITEĽNOSŤ TESTOVACEJ METÓDY

9.

Testovacia metóda sa môže použiť na chemikálie rozpustné vo vode, slabo rozpustné a prchavé. Nie vždy je však možné získať hodnoty EC50 v prípade látok s obmedzenou rozpustnosťou a platné výsledky v prípade prchavých látok je možné dosiahnuť len tak, že časť (napr. > 80 %) testovanej chemikálie zostane v reakčnej zmesi na konci expozičného času, resp. časov. Ak existuje akákoľvek neistota týkajúca sa stability testovanej chemikálie alebo jej prchavosti, mali by sa na spresnenie koncentrácie ECx predložiť doplňujúce podporné analytické údaje.

REFERENČNÉ CHEMIKÁLIE

10.

Referenčné chemikálie by sa mali pravidelne testovať s cieľom zabezpečiť, aby boli testovacia metóda a testovacie podmienky spoľahlivé a skontrolovať citlivosť každej dávky aktivovaného kalu, ktorý sa používa ako mikrobiálne inokulum, v deň expozície. Ako referenčná inhibičná látka sa odporúča 3,5-dichlórfenol (3,5-DCP), keďže ide o známy inhibítor respirácie, ktorý sa používa na mnohé typy testov inhibície/toxicity (4). Ako referenčná chemikália pre test inhibície celkovej respirácie sa môže použiť aj pentahydrát síranu meďnatého (9). Ako osobitný referenčný inhibítor nitrifikácie je možné použiť N-metylanilín (4).

KRITÉRIÁ PLATNOSTI A REPRODUKOVATEĽNOSŤ

11.

Rchlosť spotreby kyslíka slepými kontrolnými vzorkami (bez testovanej alebo referenčnej chemikálie) by nemala byť nižšia ako 20 mg kyslíka na gram aktivovaného kalu (sušiny suspendovaných tuhých látok) za hodinu. Ak je táto miera nižšia, test by sa mal zopakovať s premytým aktivovaným kalom alebo s kalom z iného zdroja. Variačný koeficient rýchlosti spotreby kyslíka v kontrolných replikátoch by nemal byť vyšší ako 30 % na konci konečného testu.

12.

V rámci medzinárodnej porovnávacej skúšky, ktorú v roku 2004 zorganizovala Medzinárodná organizácia pre normalizáciu ISO (4) s použitím aktivovaného kalu získaného z odpadových vôd z domácností, sa zistilo, že hodnoty EC50 látky 3,5-DCP sú v rozsahu od 2 do 25 mg/l pre celkovú respiráciu, 5 až 40 mg/l pre heterotrofnú respiráciu a 0,1 až 10 mg/l pre nitrifikačnú respiráciu. Ak hodnota EC50 látky 3,5-DCP neleží v očakávanom rozsahu, test by sa mal zopakovať s aktivovaným kalom z iného zdroja. Hodnota EC50 pentahydrátu síranu meďnatého by mala byť v rozsahu od 53 do 155 mg/l pre celkovú respiráciu (9).

OPIS TESTOVACEJ METÓDY

Testovacie nádoby a zariadenie

13.

Používať by sa malo bežné laboratórne zariadenie a toto vybavenie:

a)

testovacie nádoby – napríklad 1 000 ml kadičky obsahujúce 500 ml reakčnej zmesi (pozri bod 5 na obrázku 1);

b)

komora s príslušenstvom na meranie koncentrácie rozpusteného kyslíka; vhodná kyslíková elektróda; uzavretá komora obsahujúca vzorku, bez voľného priestoru a s registračným prístrojom (napr. body 7, 8, 9 na obrázku 1 v dodatku 2); alternatívne sa môže použiť BOD fľaša s vhodným manžetovým adaptérom na upevnenie kyslíkovej elektródy na hrdlo fľaše (obrázok 2 v dodatku 3). S cieľom zabrániť strate kvapaliny odobratej pri vložení kyslíkovej elektródy je vhodné najskôr vložiť cez manžetu lievik alebo sklenenú trubicu, alebo použiť nádoby so žliabkovou obrubou. V obidvoch prípadoch by sa malo použiť magnetické miešadlo alebo alternatívna metóda miešania, napríklad sonda s automatickým miešaním;

c)

magnetické miešadlá a snímače pokryté inertným materiálom, na použitie v meracej komore a/alebo v testovacích nádobách;

d)

prevzdušňovacie zariadenie: v prípade potreby by sa mal vháňať stlačený vzduch cez vhodný filter na odstránenie prachu a oleja a cez premývacie fľaše s vodou na zvlhčovanie vzduchu. Obsah nádob by sa mal prevzdušňovať Pasteurovými pipetami alebo inými prevzdušňovacími zariadeniami, ktoré neadsorbujú chemikálie. Na zabezpečenie spotreby kyslíka pre kal a prekonanie ťažkostí s chemikáliami, ktoré produkujú nadmerné množstvo peny, sú prchavé, a tým vytvárajú straty, alebo sa ťažko rozptyľujú pri prevzdušňovaní vháňaním vzduchu, sa môže použiť orbitálna trepačka s prevádzkovou rýchlosťou rotácie 150 – 250 ot/min a s bankami s objemom napríklad 2 000 ml. Testovací systém tvoria spravidla viaceré kadičky, ktoré sa sústavne prevzdušňujú a postupne používajú (napr. v intervaloch približne 10 – 15 minút), a potom sa postupne analyzujú. Použiť sa môžu aj schválené zariadenia, ktoré umožňujú súčasné prevdzušňovanie a meranie rýchlosti spotreby kyslíka v zmesiach;

e)

pH-meter;

f)

odstredivka, spravidla stolná odstredivka na kal s odstredivým zrýchlením 10 000 m/s2.

Reagenty

14.

Používať by sa mali výlučne reagenty analytickej čistoty.

Voda

15.

Používať by sa mala destilovaná alebo deionizovaná voda obsahujúca menej ako 1 mg/l rozpusteného organického uhlíka (DOC), s výnimkou prípadov, keď sa vyžaduje voda z vodovodu bez chlóru.

Zdroj syntetickej odpadovej vody

16.

Médium by sa malo pripraviť tak, aby obsahovalo tieto zložky v uvedených množstvách:

peptón

16 g

mäsový extrakt (alebo porovnateľný zeleninový extrakt)

11 g

močovina

3 g

chlorid sodný (NaCl)

0,7 g

dihydrát chloridu vápenatého (CaC12, 2H2O)

0,4 g

heptahydrát síranu horečnatého (MgSO4, 7H2O)

0,2 g

hydrogénfosforečnan didraselný bezvodý (K2HPO4)

2. 8 g

destilovaná alebo deionizovaná voda na 1 liter.

 

17.

Hodnota pH tohto roztoku by mala byť 7,5 ± 0,5. Ak sa pripravené médium nepoužije okamžite, malo by sa skladovať na tmavom mieste pri teplote 0 – 4 °C, nie dlhšie ako jeden týždeň, alebo za podmienok, ktoré nemenia jeho zloženie. Je potrebné si uvedomiť, že táto odpadová voda má stonásobne vyššiu koncentráciu, než je opísané v Technickej správe OECD: ‚Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents‘ (Navrhnuté metódy stanovovania biodegradovateľnosti surfaktantov používaných v syntetických detergentoch, 11. jún 1976) a navyše s pridaným hydrogénfosforečnanom didraselným.

18.

Alternatívne sa zložky média môžu pred uskladnením jednotlivo sterilizovať, prípadne sa peptón a mäsový extrakt môžu pridať krátko pred vykonaním testu. Pred použitím by sa médium malo dôkladne premiešať a jeho pH v prípade potreby upraviť na hodnotu 7,5 ± 0,5.

Testovaná chemikália

19.

Pre testované látky ľahko rozpustné vo vode by sa mal pripraviť zásobný roztok iba do maximálnej rozpustnosti vo vode (zrážania nie sú prípustné). Látky slabo rozpustné vo vode, zmesi so zložkami s rôznou rozpustnosťou vo vode a adsorpčné látky by sa mali odvážiť priamo do testovacích nádob. V týchto prípadoch môže byť alternatívou použitie zásobných roztokov, ak sa analyticky stanovia koncentrácie rozpustených testovaných chemikálií v testovacích nádobách (pred pridaním aktivovaného kalu). Analytické stanovenie koncentrácií rozpustených testovaných chemikálií v testovacích nádobách je dôležité aj v prípade, že sa majú pripraviť vode prispôsobené frakcie (water accommodated fraction – WAF). Vyhnúť sa treba použitiu organických rozpúšťadiel, dispergačných činidiel/emulgátorov na zlepšenie rozpustnosti. Použitie ultrazvuku v prípade zásobných roztokov a suspenzií pred miešaním, napríklad počas noci, je možné vtedy, ak sú k dispozícii primerané informácie týkajúce sa stability testovanej látky za takýchto podmienok.

20.

Testovaná chemikália môže nepriaznivo ovplyvniť pH v testovacom systéme. Hodnota pH zmesí s aplikovanou testovanou chemikáliou by sa mala stanoviť predbežnou skúškou pred začiatkom testu, aby sa zistilo, či bude potrebná úprava pH pred hlavným testom a potom opäť v deň hlavného testu. V prípade potreby by sa mali roztoky/suspenzie testovanej látky vo vode neutralizovať pred pridaním inokula. Keďže však neutralizácia môže zmeniť chemické vlastnosti chemikálie, v závislosti od účelov štúdie je možné vykonať ďalšie testovanie na posúdenie účinku testovanej chemikálie na kal bez úpravy pH.

21.

Toxické účinky prchavých chemikálií, najmä pri testoch, v rámci ktorých sa vzduch nechá prebublávať cez systém, môžu mať premenlivú úroveň, k čomu dochádza v dôsledku strát látky počas expozície. V prípade takýchto látok by sa malo postupovať obozretne a mali by sa vykonávať osobitné analýzy kontrolných zmesí obsahujúcich danú látku a úpravy režimu prevzdušňovania.

Referenčná chemikália

22.

Ak sa ako referenčná chemikália používa 3,5-dichlórfenol, je potrebné pripraviť roztok 1 g 3,5-dichlórfenolu v 1 000 ml vody (15). Na urýchlenie rozpúšťania by sa mala použiť teplá voda a/alebo pôsobenie ultrazvuku a po ochladení na izbovú teplotu sa roztok doplní na príslušný objem. Je však potrebné zabezpečiť, aby sa referenčná látka štrukturálne nezmenila. Hodnota pH roztoku by sa mala prekontrolovať a v prípade potreby upraviť pomocou NaOH alebo H2SO4 na pH 7 – 8.

23.

Ak sa ako referenčná chemikália používa pentahydrát síranu meďnatého, pripravia sa koncentrácie 58 mg/l, 100 mg/l a 180 mg/l (faktor 1,8). Látka sa odváži priamo do testovacích nádob (29 – 50 – 90 mg na 500 ml celkového objemu). Potom sa rozpustí v 234 ml vody z vodovodu ošetrenej v autokláve. Pentahydrát síranu meďnatého je ľahko rozpustný. Na začiatku testu sa pridá 16 ml syntetického odpadovej vody a 250 ml aktivovaného kalu.

Osobitný inhibítor nitrifikácie

24.

Pripraviť by sa mal zásobný roztok 2,32 g/l N-alyltiomočoviny (ATM). Pridaním 2,5 ml tohto zásobného roztoku do inkubačnej zmesi s konečným objemom 500 ml sa dosiahne konečná koncentrácia 11,6 mg ATM/l (10– 4 mol/l), ktorá je preukázateľne dostatočná (4) na to, aby spôsobila 100 % inhibíciu nitrifikácie aktivovaného kalu s obsahom 1,5 g/l suspendovaných tuhých látok.

Abiotické kontrolné vzorky

25.

Za určitých výnimočných podmienok môže testovaná chemikália so silne redukčnými vlastnosťami spôsobiť merateľnú abiotickú spotrebu kyslíka. V takých prípadoch sú potrebné abiotické kontrolné vzorky, aby sa rozlišovalo medzi abiotickou spotrebou kyslíka v prípade testovanej látky a mikrobiálnou respiráciou. Abiotické kontrolné vzorky sa môžu pripraviť vynechaním inokula z testovacej zmesi. Podobne sa môžu abiotické kontrolné vzorky bez inokula použiť na vykonanie podporných analytických meraní na účely stanovenia dosiahnutej koncentrácie počas expozičnej fázy testu napr. pri používaní zásobných roztokov chemikálií zle rozpustných vo vode, ktorých zložky majú rôznu rozpustnosť vo vode. V osobitných prípadoch môže byť potrebné pripraviť abiotickú kontrolnú vzorku so sterilizovaným inokulom (napr. pomocou autoklávu alebo pridaním sterilizujúcich toxických látok). Niektoré chemikálie môžu produkovať alebo spotrebúvať kyslík, len ak je povrchová plocha dostatočne veľká na reakciu, a to aj v prípade, že za normálnych okolností na to potrebujú oveľa vyššie hodnoty teploty a tlaku. Osobitná pozornosť by sa v tejto súvislosti mala venovať látkam peroxidovej skupiny. Sterilizované inokulum poskytuje veľkú povrchovú plochu.

Inokulum

26.

Na všeobecné použitie by sa mal aktivovaný kal odoberať z miesta výstupu prevzdušňovacej nádrže alebo z miesta v blízkosti výstupu nádrže správne pracujúcej čistiarne odpadových vôd, ktorá spracováva prevažne odpadové vody z domácností. V závislosti od účelu testu sa pri vhodnej koncentrácii suspendovaných tuhých látok od 2 do 4 g/l môžu použiť aj iné vhodné druhy alebo zdroje aktivovaného kalu, napríklad kal kultivovaný v laboratóriu. Kaly z rôznych čistiarní odpadových vôd však môžu vykazovať rôzne vlastnosti a rôznu citlivosť.

27.

Kal sa môže používať v stave, v akom sa odoberie, no hrubé častice by sa mali odstrániť krátkodobým usadzovaním, napríklad 5 – 15 minút, a následným odliatím vrchnej vrstvy jemnejších tuhých častíc, alebo preosievaním (napr. sitom s veľkosťou otvorov 1 mm2). Alternatívne sa kal môže homogenizovať v miešadle približne 15 sekúnd alebo dlhšie.Potrebná je však opatrnosť, pokiaľ ide o použitú silu a o zmenu teploty, ktorá by mohla nastať počas dlhého miešania.

28.

Často je potrebné premývanie kalu, napríklad ak je rýchlosť endogénej spotreby kyslíka nízka. Kal by sa mal najskôr odstreďovať v čase potrebnom na vytvorenie čistého supernatantu a pelety tuhých látok z odpadovej vody, napríklad 10 minút pri odstredivom zrýchlení približne 10 000 m/s2. Supernatant by sa mal odstrániť a kal resuspendovať vo vode z vodovodu bez chlóru, pri súčasnom pretrepávaní, pričom premývacia voda by sa mala následne odstrániť opätovným odstreďovaním. Proces premývania a odstreďovania by sa mal v prípade potreby opakovať. Stanoviť by sa mala suchá hmotnosť známeho objemu resuspendovaného kalu a kal by sa mal koncentrovať odstránením kvapaliny alebo ďalej riediť vo vode z vodovodu bez chlóru, aby sa dosiahla požadovaná koncentrácia tuhých látok kalu 3 g/l. Aktivovaný kal by sa mal nepretržite prevzdušňovať (napr. prietokom 2 l/minútu) pri testovacej teplote, a ak je to možné, použiť v deň odberu. Ak to nie je možné, kal by sa mal v priebehu nasledujúcich dvoch dní denne vyživovať zdrojom syntetickej odpadovej vody (50 ml zdroja syntetickej odpadovej vody/liter aktivovaného kalu). Kal sa potom použije na test a výsledky sa považujú za platné za predpokladu, že nenastali žiadne výrazné zmeny v jeho aktivite z hľadiska rýchlosti endogénnej heterotrofnej a nitrifikačnej spotreby kyslíka.

29.

Ťažkosti môžu vzniknúť, ak počas inkubácie dochádza k peneniu do takej miery, že pena a tuhé látky kalu, ktoré sa na nej nesú, sú vytláčané z prevzdušňovacích nádob. Penenie môže byť niekedy spôsobené prítomnosťou syntetickej odpadovej vody, no s penením treba počítať, ak je testovaná chemikália povrchovo aktívnou látkou, alebo povrchovo aktívnu látku obsahuje. Strata tuhých látok v kale z testovaných zmesí povedie k umelo zníženým rýchlostiam spotreby kyslíka, čo by sa mohlo nesprávne vykladať ako výsledok inhibície. Prevzdušňovaním roztoku povrchovo aktívnej látky sa navyše povrchovo aktívna látka koncentruje vo vrstve peny a stratou peny z testovacieho systému sa znížia expozičné koncentrácie. Penenie je možné kontrolovať jednoduchými mechanickými metódami (napr. občasným ručným miešaním pomocou sklenenej tyčinky) alebo pridaním emulzie silikónového protipenového činidla bez obsahu povrchovo aktívnej látky a/alebo použitím metódy prevdzušňovania trepačkovej banky. Ak problém súvisí s prítomnosťou syntetickej odpadovej vody, malo by sa upraviť jej zloženie použitím protipenového činidla v pomere napríklad 50 μl/liter. Ak penenie spôsobuje testovaná chemikália, množstvo potrebné na zníženie tohto účinku by sa malo stanoviť pri najvyššej testovacej koncentrácii. Potom by sa mali rovnako ošetriť všetky jednotlivé prevzdušňovacie nádoby (vrátane tých nádob, napríklad slepých kontrolných a referenčných nádob, v ktorých sa pena netvorí). Ak sa používajú protipenové činidlá, nemalo by dochádzať k žiadnej interakcii s inokulom a/alebo testovanou chemikáliou.

POSTUP SKÚŠKY

30.

Stanoviť sa môže inhibícia troch rôznych druhov spotreby kyslíka, celkovej, iba heterotrofnej a spotreby v dôsledku nitrifikácie. Za normálnych okolností by malo postačovať meranie inhibície celkovej spotreby kyslíka. Účinky oxidácie organického uhlíka a oxidácie amónnych solí na heterotrofnú spotrebu kyslíka sú potrebné v prípade, že existuje osobitná požiadavka na tieto dva samostatné parametre pre konkrétnu chemikáliu, alebo (ako alternatíva) ak je potrebné objasniť atypické krivky závislosti odozvy od dávky na základe inhibície celkovej spotreby kyslíka.

Podmienky testu

31.

Test by sa mal vykonávať pri teplote v rozsahu 20 ± 2 °C.

Testovacie zmesi

32.

Testovacie zmesi (FT ako v tabuľke 1), ktoré obsahujú vodu, syntetickú odpadovú vodu a testovanú chemikáliu, by sa mali pripraviť tak, aby sa dosiahli rôzne nominálne hodnoty koncentrácie testovanej chemikálie (príklad objemov zložiek je uvedený v tabuľke 1). Hodnota pH by sa mala v prípade potreby upraviť na 7,5 ± 0,5. Zmesi by sa mali zriediť vodou a malo by sa pridať inokulum tak, aby sa dosiahol rovnaký konečný objem v nádobách a aby sa začalo prevzdušňovanie.

Referenčné zmesi

33.

Zmesi (FR) by sa mali pripravovať rovnakým spôsobom ako testovacie zmesi, a to s referenčnou chemikáliou, napríklad 3,5-dichlórfenolom, namiesto testovanej chemikálie.

Slepé kontrolné vzorky

34.

Slepé kontrolné vzorky (FB) by sa mali pripravovať na začiatku a na konci expozície v rámci testov, pri ktorých sa testovacie kadičky pripravujú postupne v určitých intervaloch. V testoch vykonaných s použitím vybavenia, ktoré umožňuje súbežné merania spotreby kyslíka, by sa mali do každej série paralelných analýz začleniť najmenej dve slepé kontrolné vzorky. Slepé kontrolné vzorky obsahujú rovnaké množstvo aktivovaného kalu a syntetického média, ale neobsahujú testovanú ani referenčnú chemikáliu. Zriediť by sa mali vodou na rovnaký objem, ako majú testovacie a referenčné zmesi.

Abiotické kontrolné vzorky

35.

V prípade potreby, napríklad ak je známe alebo sa predpokladá, že testovaná chemikália má silne redukčné vlastnosti, by sa na meranie abiotickej spotreby kyslíka mala pripraviť zmes FA. Zmes by mala obsahovať rovnaké množstvo testovanej chemikálie, syntetickej odpadovej vody a mala by mať rovnaký objem ako testovacie zmesi, no nemala by obsahovať aktivovaný kal.

Všeobecný postup a merania

36.

Testovacie zmesi, referenčné zmesi a slepé a abiotické kontrolné vzorky sa inkubujú pri skúšobnej teplote v podmienkach núteného prevzdušňovania (0,5 – 1 l/min), aby sa koncentrácia rozpusteného kyslíka udržiavala nad úrovňou 60 – 70 % saturácie a aby sa v suspenzii udržali vločky kalu. Na to, aby sa v suspenzii vločky kalu udržali, je potrebné aj miešanie kultúr. Za začiatok inkubácie sa považuje počiatočný kontakt inokula aktivovaného kalu s ostatnými zložkami konečnej zmesi. Na konci inkubácie, po stanovenom čase expozície zvyčajne v dĺžke troch hodín, sa odoberú vzorky na meranie miery zníženia koncentrácie rozpusteného kyslíka v komore navrhnutej na tento účel (obrázok 2 v dodatku 3) alebo v úplne plnej fľaši BOD. Spôsob, akým sa inkubácia začne, závisí aj od vlastností zariadenia použitého na meranie rýchlostí spotreby kyslíka. Napríklad, ak je jeho súčasťou jedna kyslíková sonda, merania sa vykonávajú samostatne. V tom prípade by sa mali pripraviť rôzne zmesi potrebné na test v syntetickej odpadovej vode, no vynechať by sa malo inokulum, a do každej nádoby zo série by sa mali pridať príslušné časti kalu. Následne by sa každá inkubácia mala začať vo vhodne načasovaných intervaloch napr. 10 – 15 minút. Alternatívne môžu byť súčasťou meracieho systému viaceré sondy, ktoré uľahčia súbežné vykonávanie viacerých meraní. V tom prípade sa môže inokulum pridať súčasne do príslušných skupín nádob.

37.

Nominálna hodnota koncentrácie aktivovaného kalu vo všetkých testovacích, referenčných a slepých (ale nie abiotických kontrolných) zmesiach je 1,5 g/l suspendovaných tuhých látok. Spotreba kyslíka by sa mala merať po troch hodinách expozície. Podľa potreby by sa mali po 30-minútovej expozícii vykonať doplnkové merania opísané v bode 5.

Nitrifikačný potenciál kalu

38.

Na to, aby bolo možné rozhodnúť, či kal nitrifikuje, a ak áno, do akej miery, by sa mali pripraviť zmesi (FB) ako slepé kontrolné zmesi a doplnkové ‚kontrolné‘ zmesi (FN), ktoré však obsahujú aj N-alyltiomočovinu s koncentráciou 11,6 mg/l. Zmesi by sa mali prevzdušňovať a inkubovať pri teplote 20° ± 2 °C počas troch hodín. Potom by sa mali zmerať rýchlosti spotreby kyslíka a vypočítať rýchlosť spotreby kyslíka spôsobená nitrifikáciou.

Koncepcie testov

Test na vyhľadávanie rozsahu

39.

Predbežná skúška sa v prípade potreby používa na odhadnutie rozsahu koncentrácií testovanej chemikálie potrebných pri konečnom teste na stanovenie inhibície spotreby kyslíka. Ak počas predbežnej skúšky nedochádza k inhibícii spotreby kyslíka testovanou chemikáliou, môže to znamenať, že konečný test nie je potrebný. Mali by sa však vykonať tri opakované merania s najvyššou testovacou koncentráciou v rámci predbežnej skúšky (spravidla 1 000 mg/l, ale závisí to od požadovaných údajov).

Tabuľka 1

Príklady zmesí pre predbežnú skúšku

Reagenty

Pôvodná koncentrácia

Zásobný roztok testovanej chemikálie

10 g/l

Zásobný roztok syntetického média

pozri bod 16

Zásobná suspenzia aktivovaného kalu

3 g/l suspendovaných tuhých látok

Zložky zmesí

Dávkovanie do testovacích nádob (6)

FT1

FT2

FT3-5

FB1-2

FA

Zásobný roztok testovanej chemikálie (ml)

(body 19 až 21)

0,5

5

50

0

50

Zásobný roztok zdroja syntetickej odpadovej vody (ml)

(bod 16)

16

16

16

16

16

Suspenzia aktivovaného kalu (ml)

(body 26 až 29)

250

250

250

250

0

Voda

(bod 15)

233,5

229

184

234

434

Celkový objem zmesí (ml)

500

500

500

500

500

Koncentrácie v zmesi

 

 

 

 

 

Testovacia suspenzia (mg/l)

Aktivovaný kal

10

10

1 000

0

1 000

(suspendované tuhé látky) (mg/l)

1 500

1 500

1 500

1 500

0

40.

Test by sa mal vykonať použitím najmenej troch koncentrácií testovanej chemikálie, napríklad 10 mg/l, 100 mg/l a 1 000 mg/l, so slepou kontrolnou vzorkou a v prípade potreby s najmenej tromi abiotickými kontrolnými vzorkami s najvyššími koncentráciami testovanej chemikálie (pozri príklad v tabuľke 1). V ideálnom prípade by najnižšia koncentrácia nemala mať žiadny účinok na spotrebu kyslíka. V prípade potreby by sa mali vypočítať rýchlosti spotreby kyslíka a rýchlosť nitrifikácie a následne percentuálna hodnota inhibície. V závislosti od účelu testu je tiež možné jednoducho stanoviť toxicitu hraničnej hodnoty koncentrácie, napríklad 1 000 mg/l. Ak sa pri tejto koncentrácii nezistí žiadny štatisticky významný toxický účinok, ďalšie testovanie pri vyšších alebo nižších koncentráciách nie je potrebné. Treba si uvedomiť, že látky slabo rozpustné vo vode, zmesi so zložkami s rôznou rozpustnosťou vo vode a adsorpčné látky by sa mali odvážiť priamo do testovacích nádob. V tomto prípade by sa objem vyhradený pre zásobný roztok testovanej látky mal nahradiť vodou na zriedenie.

Konečný test

Inhibícia celkovej spotreby kyslíka

41.

Test by sa mal vykonať s použitím rôznych koncentrácií stanovených na základe predbežnej skúšky. Na získanie hodnôt koncentrácií NOEC a ECx (napr. EC50) sa vo väčšine prípadov odporúča použiť šesť koncentrácií kontrolných vzoriek a päť koncentrácií vzoriek s aplikovanou chemikáliou, v geometrickom rade s piatimi replikátmi. Merania abiotických kontrolných vzoriek nie je potrebné opakovať, ak počas predbežnej skúšky nedošlo k spotrebe kyslíka. Ak sa však zistí výrazná spotreba kyslíka, abiotické kontrolné vzorky by sa mali použiť pre každú koncentráciu testovanej chemikálie. Citlivosť kalu by sa mala skontrolovať pomocou referenčnej chemikálie 3,5-dichlórfenol. Kontrola citlivosti kalu by sa mala vykonať pre každú testovaciu sériu, keďže je známe, že hodnota citlivosti kolíše. Vo všetkých prípadoch sa vzorky odoberú z testovacích nádob po 3 hodinách a v prípade potreby po ďalších 30 minútach na meranie rýchlosti spotreby kyslíka v komore s kyslíkovou elektródou. Zo získaných údajov sa vypočítajú špecifické hodnoty rýchlosti spotreby kyslíka v prípade kontrolných a testovacích zmesí. Následne sa z rovnice 7 vypočíta percentuálna inhibícia.

Rozlišovanie medzi inhibíciou heterotrofnej respirácie a nitrifikácie

42.

Použitie špecifického inhibítora nitrifikácie – ATM – umožňuje priame posúdenie inhibičných účinkov testovanej chemikálie na heterotrofnú oxidáciu. Účinky na mieru nitrifikácie je možné vypočítať ako rozdiel celkovej spotreby kyslíka (bez prítomnosti ATM) a spotreby kyslíka v prítomnosti ATU. Pripraviť by sa mali dva súbory reakčných zmesí podľa koncepcie testu pre koncentrácie ECx alebo NOEC opísané v bode 41. Okrem toho by sa však mal inhibítor ATM pridať do každej zmesi jedného súboru s konečnou koncentráciou 11,6 mg/l, pri ktorej sa preukázala úplná inhibícia nitrifikácie v kale so suspendovanými tuhými látkami pri koncentráciách do 3 000 mg/l (4). Spotreba kyslíka by sa mala merať po uplynutí času expozície. Tieto priamo získané hodnoty predstavujú iba heterotrofnú respiráciu a rozdiely medzi nimi a zodpovedajúcimi hodnotami celkovej rýchlosti spotreby kyslíka zasa nitrifikáciu. Následne sa vypočítajú rôzne stupne inhibície.

Merania

43.

Po uplynutí expozičného času, resp. časov by sa vzorka z prvej prevzdušňovacej nádoby mala presunúť do komory s kyslíkovou elektródou (obrázok 1 v dodatku 2) a okamžite by sa mala zmerať koncentrácia rozpusteného kyslíka. Ak je k dispozícii systém s viacerými elektródami, merania sa môžu vykonať súbežne. Dôležité je miešanie (pomocou zabudovaného magnetu) rovnakou rýchlosťou ako pri kalibrovaní elektródy, aby sa zabezpečilo, že sonda reaguje na meniace sa koncentrácie kyslíka s minimálnym oneskorením a že sa umožní pravidelné a reprodukovateľné meranie kyslíka v meracej nádobe. Zvyčajne je vhodný systém niektorých kyslíkových elektród so sondou s automatickým miešaním. Komoru je potrebné medzi meraniami vypláchnuť vodou. Vzorka sa môže prípadne použiť na vyplnenie BOD fľaše (obrázok 2 v dodatku 3) vybavenej magnetickým miešadlom. Do hrdla fľaše by sa následne mala vložiť kyslíková sonda s manžetovým adaptérom a zapnúť magnetické miešadlo. V obidvoch prípadoch by sa mala priebežne merať a zaznamenávať koncentrácia rozpusteného kyslíka, zvyčajne 5 – 10 minút, alebo kým koncentrácia kyslíka neklesne pod 2 mg/l. Elektróda by sa potom mala odobrať, zmes vrátiť späť do prevzdušňovacej nádoby, a ak je potrebné meranie po dlhšej expozícii, malo by pokračovať prevzdušňovanie a miešanie.

Overovanie koncentrácie testovanej chemikálie

44.

Na určité účely môže byť potrebné meranie koncentrácie testovanej chemikálie v testovacích nádobách. Treba si uvedomiť, že ak sa používajú zásobné roztoky:

látok slabo rozpustných vo vode,

zmesí so zložkami s rôznou rozpustnosťou vo vode alebo

látok s dobrou rozpustnosťou vo vode, pričom koncentrácia zásobného roztoku sa približuje maximálnej rozpustnosti vo vode,

rozpustená frakcia nie je známa rovnako, ako nie je známa skutočná koncentrácia testovanej chemikálie, ktorá sa presúva do testovacích nádob. Na to, aby bolo možné charakterizovať expozíciu, je potrebné analytické stanovenie koncentrácie testovanej chemikálie v testovacích nádobách. Na zjednodušenie postupu by sa malo analytické stanovenie vykonať pred pridaním inokula. Vzhľadom na skutočnosť, že do testovacích nádob sa presunú len rozpustené frakcie, môžu byť namerané hodnoty koncentrácie veľmi nízke.

45.

S cieľom vyhnúť sa časovo náročným a nákladným analýzam sa odporúča jednoducho odvážiť testovanú chemikáliu priamo do testovacích nádob a na ďalšie výpočty použiť nominálne hodnoty koncentrácie zistené počiatočným vážením. Rozlišovanie medzi rozpustenými, nerozpustenými alebo adsorbovanými frakciami testovanej chemikálie nie je potrebné, lebo v reálnych podmienkach sa všetky tieto frakcie vyskytujú v čistiarni odpadových vôd rovnako, pričom sa môžu líšiť v závislosti od zloženia odpadových vôd. Cieľom tejto testovacej metódy je reálny odhad neinhibičnej koncentrácie, pričom metóda nie je vhodná na podrobné skúmanie, ktoré frakcie prispievajú k inhibícii organizmov aktivovaného kalu. Napokon, aj adsorbčné látky by sa mali odvážiť priamo do testovacích nádob a nádoby by mali byť silanizované, aby sa minimalizovali straty vzniknuté adsorbciou.

ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV

Výpočet rýchlostí spotreby kyslíka

46.

Rýchlosti spotreby kyslíka by sa mali vypočítať z priemeru nameraných hodnôt, napríklad z lineárnej časti grafov závislosti koncentrácie kyslíka od času, pričom výpočet by sa mal obmedziť na koncentrácie kyslíka medzi 2,0 mg/l a 7,0 mg/l, keďže vyššie a nižšie koncentrácie môžu samy osebe ovplyvniť hodnoty miery spotreby. Niekedy je nevyhnutné a potrebné preskúmať aj pásma koncentrácií nižších alebo vyšších než sú uvedené hodnoty, napríklad ak je respirácia výrazne znížená, a preto veľmi pomalá, alebo ak daný aktivovaný kal respiruje veľmi rýchlo. To je prípustné za predpokladu, že rozšírené úseky krivky grafu spotreby sú rovné a ich sklon sa nemení pri prechode hranicami 2,0 mg/l alebo 7,0 mg/l O2. Akýkoľvek zakrivený úsek grafu naznačuje, že merací systém sa stabilizuje alebo že sa spotreba mení, a nemali by sa používať na výpočet rýchlosti spotreby kyslíka. Rýchlosť spotreby kyslíka by sa mala vyjadriť v miligramoch na liter za hodinu (mg/lh) alebo v miligramoch na gram suchého kalu za hodinu (mg/gh). Rýchlosť spotreby kyslíka (R) v mg/lh sa môže vypočítať alebo interpolovať z lineárnej časti grafu zaznamenávajúceho pokles množstva kyslíka, podľa rovnice 1:

R = (Q1 – Q2)/Δt × 60

(1)

kde:

Q1

je koncentrácia kyslíka na začiatku vybratého úseku lineárnej fázy (mg/l),

Q2

je koncentrácia kyslíka na konci vybratého úseku lineárnej fázy (mg/l),

Δt

je časový interval medzi týmito dvomi meraniami (min).

47.

Špecifická rýchlosť spotreby kyslíka (RS) sa vyjadrí ako množstvo spotrebovaného kyslíka na gram suchej hmotnosti kalu za hodinu (mg/gh) podľa rovnice 2:

Rs = R/SS

(2)

kde SS je koncentrácia suspendovaných tuhých látok v testovacej zmesi (g/l).

48.

Kombinovať sa môžu rôzne indexy R:

S

špecifická rýchlosť spotreby kyslíka,

T

celková rýchlosť spotreby kyslíka,

N

rýchlosť ovplyvnená nitrifikačnou respiráciou,

H

rýchlosť ovplyvnená heterotrofnou respiráciou,

A

rýchlosť ovplyvnená abiotickými procesmi,

B

rýchlosť na základe slepých vzoriek (stredná hodnota).

Výpočet rýchlosti spotreby kyslíka ovplyvnenej nitrifikáciou

49.

Vzťah medzi celkovou rýchlosťou (RT), nitrifikačnou respiráciou (RN) a heterotrofnou respiráciou (RH) je daný rovnicou 3:

RN = RT – RH

(3)

kde:

RN

je rýchlosť spotreby kyslíka ovplyvnená nitrifikáciou (mg/lh),

RT

je rýchlosť spotreby kyslíka nameraná pomocou slepej kontrolnej vzorky bez ATM, FB) (mg/lh),

RH

je rýchlosť spotreby kyslíka nameraná pomocou slepej kontrolnej vzorky s pridaním ATM (FN) (mg/lh).

50.

Tento vzťah platí pre hodnoty získané pomocou slepých vzoriek (RNB, RTB, RHB), abiotických kontrolných vzoriek (RNA, RTA, RHA) a vzoriek s testovanými chemikáliami (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Konkrétne rýchlosti spotreby kyslíka sa vypočítajú z týchto vzťahov:

RNS = RN/SS

(4)

RTS = RT/SS

(5)

RHS = RH/SS

(6)

51.

Ak je v rámci predbežnej skúšky hodnota RN zanedbateľná (napr. < 5 % hodnoty RT v slepých kontrolných vzorkách), je možné predpokladať, že heterotrofná spotreba kyslíka sa rovná celkovej spotrebe a že nedochádza k žiadnej nitrifikácii. Ak by sa na základe testov mali posudzovať vplyvy na heterotrofné a nitrifikačné mikroorganizmy, bol by potrebný alternatívny zdroj aktivovaného kalu. Konečný test sa vykoná, ak existuje dôkaz o zníženej spotrebe kyslíka pri rôznych koncentráciách testovanej chemikálie.

Výpočet percenta inhibície

52.

Percentuálna inhibícia celkovej spotreby kyslíka (IT) pri každej koncentrácii testovanej chemikálie sa vypočíta podľa rovnice 7:

IT = [1 – (RT – RTA)/RTB] × 100 %

(7)

53.

Podobne sa vypočíta percentuálna inhibícia heterotrofnej spotreby kyslíka (IH) pri každej koncentrácii testovanej chemikálie podľa rovnice 8:

IH = [1 – (RH – RHA)/RHB] / 100 %

(8)

54.

A napokon inhibícia spotreby kyslíka ovplyvnenej nitrifikáciou (IN) sa pri každej koncentrácii vypočíta podľa rovnice 9:

IN = [1 – (RT – RH)/(RTB – RHB)] × 100 %

(9)

55.

Mal by sa zostrojiť diagram závislosti percentuálnej inhibície spotreby kyslíka od logaritmu koncentrácie testovanej chemikálie (inhibičná krivka, pozri obrázok 3 v dodatku 4). Inhibičné krivky sa zostroja pre každé prevzdušňovanie v trvaní 3 hodín alebo po ďalších 30 minútach. Koncentrácia testovanej chemikálie, ktorá vyvolá inhibíciu spotreby kyslíka o 50 % (EC50), by sa mala vypočítať alebo interpolovať z grafu. Ak sú k dispozícii vhodné údaje, môžu sa vypočítať alebo interpolovať 95 % hranice spoľahlivosti pre koncentráciu EC50, sklon krivky a vhodné hodnoty na označenie začiatku inhibície (napr. EC10 alebo EC20) a konca rozsahu inhibície (napr. EC80 alebo EC90).

56.

Je potrebné si uvedomiť, že vzhľadom na premenlivosť často pozorovanú vo výsledkoch môže v mnohých prípadoch postačovať vyjadrenie výsledkov v rozsahu hodnôt, napríklad:

EC50

< 1 mg/l

EC50

1 mg/l až 10 mg/l

EC50

10 mg/l až 100 mg/l

EC50

> 100mg/l

Interpretácia výsledkov

ECx

57.

Hodnoty ECx vrátane ich príslušných horných a dolných 95 % hraníc spoľahlivosti pre daný parameter sa vypočítajú pomocou vhodných štatistických metód [napr. probitová analýza, logistická alebo Weibullova funkcia, upravená Spearman-Karberova metóda alebo jednoduchá interpolácia (11)]. Koncentrácia ECx sa získa zadaním hodnoty, ktorá zodpovedá x % strednej hodnoty nameranej v kontrolnej vzorke, do príslušnej rovnice. Pri výpočte EC50 alebo akejkoľvek inej hodnoty ECx by sa mali stredné hodnoty pre každú vzorku s aplikovanou chemikáliou (x) podrobiť regresnej analýze.

Odhad koncentrácie NOEC

58.

Ak je cieľom štatistickej analýzy stanovenie koncentrácie NOEC, potrebné sú štatistické údaje pre každú nádobu (jednotlivé nádoby sa považujú za replikáty). Používať by sa mali vhodné štatistické metódy (podľa dokumentu OECD o súčasných prístupoch v štatistickej analýze údajov o ekotoxicite: návod na uplatňovanie (11). Vo všeobecnosti sa nepriaznivé účinky testovanej chemikálie v porovnaní s kontrolnými vzorkami skúmajú pomocou jednostranného (obmedzeného) testovania hypotéz pri hodnote p ≤ 0,05.

Protokol o skúške

59.

Protokol o skúške by mal obsahovať tieto informácie:

 

Testovaná chemikália

bežný názov, chemický názov, číslo CAS, čistota,

fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej chemikálie [napr. log Kow, rozpustnosť vo vode, tlak pár, Henryho konštanta (H) a prípadné informácie o osude testovanej chemikálie, napríklad o adsorpcii na aktivovanom kale].

 

Testovací systém

zdroj, podmienky prevádzky čistiarne odpadových vôd a jej prítoku, koncentrácia, predúprava a údržba aktivovaného kalu.

 

Podmienky testu

testovacia teplota, pH počas testu a trvanie expozičnej fázy, resp. fáz.

 

Výsledky

konkrétna spotreba kyslíka v kontrolných vzorkách (mg O2/g kalu × h),

všetky namerané údaje, inhibičná krivka, resp. krivky a metóda výpočtu EC50,

hodnota EC50, a ak je to možné, 95 % hranice spoľahlivosti, prípadne hodnoty EC20, EC80; ak nie je možné stanoviť hodnotu EC50, tak aj hodnotu NOEC a použité štatistické metódy,

výsledky celkovej inhibície, a ak je to vhodné, heterotrofnej a nitrifikačnej inhibície,

abiotická spotreba kyslíka vo fyzikálno-chemickej kontrolnej vzorke (ak sa používa),

názov referenčnej chemikálie a výsledky dosiahnuté s touto chemikáliou,

všetky pozorovania a odchýlky od štandardného postupu, ktoré by mohli ovplyvniť výsledky.

LITERATÚRA

1.

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

2.

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

3.

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

4.

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

5.

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

6.

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

7.

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

8.

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

9.

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

10.

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

11.

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

Dodatok 1

Vymedzenie pojmov

Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto pojmy.

 

Chemikália je látka alebo zmes.

 

ECx (účinná koncentrácia x %) je koncentrácia, ktorá v rámci stanoveného času expozície vyvolá účinok x % na testované organizmy v porovnaní s kontrolnou vzorkou. Napríklad EC50 je koncentrácia, pri ktorej sa odhaduje, že v stanovenom čase expozície vyvolá účinok na výsledok testu pri 50 % exponovanej populácie.

 

NOEC (koncentrácia bez pozorovaného účinku) je koncentrácia testovanej chemikálie, pri ktorej sa nepozoruje žiadny účinok. V tomto teste koncentrácia zodpovedajúca hodnote NOEC nemá žiadny štatisticky významný účinok (p < 0,05) v rámci daného času expozície v porovnaní s kontrolnou vzorkou.

 

Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy.

Dodatok 2

Obrázok 1:   Príklad meracej jednotky

Image

Legenda

1

aktivovaný kal

2

syntetické médium

3

testovaná chemikália

4

vzduch

5

zmiešavacia nádoba

6

magnetické miešadlo

7

komora na meranie koncentrácie kyslíka

8

kyslíková elektróda

9

prístroj na meranie koncentrácie kyslíka

10

registračný prístroj

Dodatok 3

Obrázok 2:   Príklad meracej jednotky s použitím BOD fľaše

Image

Legenda

1

testovacia nádoba

2

kyslíková elektróda

3

prístroj na meranie koncentrácie kyslíka

Dodatok 4

Obrázok 3:   Príklad inhibičných kriviek

Image

Legenda

X

koncentrácia 3,5-dichlórfenolu (mg/l)

Y

inhibícia ( %)

Image

inhibícia heterotrofnej respirácie pomocou nitrifikačného kalu

Image

inhibícia nitrifikácie pomocou nitrifikačného kalu

5.

Kapitola C.26 sa nahrádza takto:

C.26   DRUHY RODU LEMNA, TEST INHIBÍCIE RASTU

ÚVOD

1.

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 221 (2006). Určená je na hodnotenie toxicity chemikálií pre sladkovodné rastliny rodu Lemna (žaburinka). Založená je na existujúcich metódach uvedených v literatúre pod číslami (1) (2) (3) (4) (5) (6), obsahuje však modifikácie týchto metód zohľadňujúce najnovší výskum a konzultácie týkajúce sa niekoľkých kľúčových aspektov. Táto testovacia metóda bola validovaná medzinárodnou porovnávacou skúškou (7).

2.

Táto testovacia metóda opisuje testovanie toxicity pri použití druhov Lemna gibba a Lemna minor, ktoré sú podrobené rozsiahlym študiám a podliehajú uvedeným normám. Taxonómia rodu Lemna je zložitá, komplikuje ju výskyt veľkého množstva fenotypov. Aj keď sa v prípade rodu Lemna môže vyskytnúť genetická variabilita pri reakcii na toxické látky, v súčasnosti neexistujú dostatočné údaje o tomto zdroji variability tak, aby sa mohol odporučiť konkrétny klon na použitie v rámci tejto testovacej metódy. Je potrebné si uvedomiť, že test sa nevykonáva axenicky, ale jednotlivé kroky počas postupu testu sa vykonávajú v etapách, aby sa minimalizovala kontaminácia inými organizmami.

3.

Uvádzajú sa informácie o testovaní pri obnove (semistatické a prietokové) a bez obnovy (statické) testovacieho roztoku. V závislosti od cieľov testu a od regulačných požiadaviek sa odporúča zvážiť použitie semistatických a prietokových metód, napríklad pre chemikálie, ktoré z roztoku rýchlo unikajú v dôsledku odparovania, fotodegradácie, precipitácie alebo biodegradácie. Ďalšie informácie sú uvedené v literatúre pod číslom (8).

4.

Vymedzenie použitých pojmov je uvedené v dodatku 1.

PRINCÍP TESTU

5.

Umožní sa exponenciálny rast rastlinných kultúr rodu Lemna vo forme monokultúr v odlišných koncentráciách testovanej chemikálie počas siedmich dní. Cieľom testu je kvantifikovať účinky chemikálie na vegetatívny rast v uvedenom čase na základe hodnotenia zvolených meraných premenných. Najdôležitejšou meranou premennou je počet lístkov. Meria sa ešte aspoň jedna ďalšia premenná (celková plocha lístkov, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave), keďže niektoré chemikálie môžu oveľa viac ovplyvniť iné merané premenné ako počet lístkov. Na kvantifikovanie účinkov chemikálie sa rast v testovacích roztokoch porovnáva s rastom v kontrolných vzorkách a stanoví sa koncentrácia spôsobujúca špecifickú x % inhibíciu rastu (napr. 50 %) a vyjadrí sa ako ECx (napr. EC50).

6.

Konečným bodom testu je inhibícia rastu vyjadrená ako logaritmický nárast meranej premennej (priemerná špecifická rýchlosť rastu) počas expozície. Z priemerných hodnôt špecifickej rýchlosti rastu zaznamenaných v sérii testovacích roztokov sa stanoví koncentrácia, ktorá spôsobuje špecifickú x % inhibíciu rýchlosti rastu (napr. 50 %), a vyjadrí sa ako ErCx (napr. ErC50).

7.

Ďalšou premennou hodnotou reakcie použitou v tejto testovacej metóde je výťažok, ktorý sa v niektorých krajinách môže vyžadovať na splnenie špecifických regulačných požiadaviek. Vymedzený je ako rozdiel hodnoty meraných premenných na konci expozície a hodnoty meraných premenných na jej začiatku. Z výťažku zaznamenaného v sérii testovacích roztokov sa vypočíta koncentrácia, ktorá spôsobuje špecifickú x % inhibíciu výťažku (napr. 50 %), a vyjadrí sa ako EyCx (napr. EyC50).

8.

Okrem toho je možné štatisticky stanoviť najnižšiu koncentráciu s pozorovaným účinkom (LOEC), ako aj koncentráciu bez pozorovaného účinku (NOEC).

INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII

9.

Na kvantifikáciu chemikálie v testovacom médiu by mala byť k dispozícii analytická metóda s vhodnou citlivosťou.

10.

Informácie o testovanej chemikálii, ktoré môžu byť užitočné pri stanovovaní testovacích podmienok, zahŕňajú štrukturálny vzorec, čistotu, rozpustnosť vo vode, stabilitu vo vode a svetle, pKa, Kow, tlak pary a biodegradovateľnosť. Rozpustnosť vo vode a tlak pary je možné použiť na výpočet Henryho konštanty, ktorá bude indikovať, či môže dôjsť k značným úbytkom testovanej chemikálie počas testu. To pomôže pri indikácii, či je potrebné prijať konkrétne kroky na kontrolu takýchto úbytkov. Ak sú informácie o rozpustnosti a stabilite testovanej chemikálie neurčité, odporúča sa, aby sa tieto informácie hodnotili za podmienok testu, t. j. s rastovým médiom, teplotou, režimom osvetľovania používanými v teste.

11.

Ak je kontrola pH testovacieho média obzvlášť dôležitá, napríklad pri testovaní kovov alebo chemikálií, ktoré sú hydrolyticky nestabilné, odporúča sa pridať do rastového média tlmivý roztok (pozri bod 21). Ďalšie informácie týkajúce sa testovaných chemikálií s fyzikálno-chemickými vlastnosťami, ktoré sťažujú ich testovanie, sú uvedené v literatúre pod číslom (8).

PLATNOSŤ TESTU

12.

Tento test je platný, iba ak čas zdvojnásobenia počtu lístkov v kontrolnej vzorke je menej ako 2,5 dňa (60 hod.), čo zodpovedá približne sedemnásobnému zvýšeniu za sedem dní a priemernej špecifickej rýchlosti rastu 0,275 deň– 1. Pri použití média a za podmienok testu uvedených v tejto testovacej metóde sa toto kritérium môže splniť, ak sa použije statický test (5). Rovnako sa predpokladá, že toto kritérium bude možné dosiahnuť aj za podmienok semistatického a prietokového testu. Výpočet času zdvojenia je uvedený v bode 49.

REFERENČNÁ CHEMIKÁLIA

13.

Referenčné chemikália, resp. chemikálie, ako napríklad 3,5-dichlórfenol, používané v medzinárodnej porovnávacej skúške (7) sa môžu testovať ako prostriedok kontroly postupu testu. Odporúča sa testovať referenčnú chemikáliu najmenej dvakrát do roka, alebo ak sa testovanie vykonáva zriedkavejšie, súbežne so stanovením toxicity testovanej chemikálie.

OPIS METÓDY

Zariadenie

14.

Všetky zariadenia, ktoré prichádzajú do styku s testovacím médiom, by mali byť vyrobené zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu. Sklené nádoby používané na kultiváciu a na testovanie by sa mali vyčistiť od chemických kontaminantov, ktoré by sa mohli rozpúšťať v testovacom médiu, a mali by byť sterilné. Testovacie nádoby by mali byť dostatočne široké, aby lístky rôznych kolónií v kontrolných nádobách mohli rásť bez toho, aby sa na konci testu prekrývali. Neprekáža, ak sa korienky dotýkajú dna testovacích nádob, ale odporúča sa minimálna hĺbka 20 mm a minimálny objem 100 ml v každej testovacej nádobe. Výber testovacích nádob nie je rozhodujúci, pokiaľ sa tieto požiadavky dodržia. Vhodné sú všetky druhy sklených kadičiek, kryštalizačných misiek alebo sklených Petriho misiek primeraných rozmerov. Testovacie nádoby musia byť zakryté, aby sa minimalizovalo vyparovanie a náhodná kontaminácia, pričom sa musí umožniť potrebná výmena vzduchu. Vhodné testovacie nádoby, a predovšetkým veká, nesmú spôsobovať tienenie alebo zmeny spektrálnych charakteristík svetla.

15.

Kultúry a testovacie nádoby by sa nemali uchovávať spoločne. To je možné najlepšie dosiahnuť použitím oddelených environmentálnych rastových komôr, inkubátorov alebo miestností. Osvetlenie a teplota musia byť nastavovateľné a udržiavané na konštantnej úrovni (pozri body 35 a 36).

Testované organizmy

16.

Organizmus používaný pre tento test je buď Lemna gibba, alebo Lemna minor. Krátka charakteristika druhov žaburinky, ktoré sa používajú na testovanie toxicity, je uvedená v dodatku 2. Rastlinný materiál je možné získať zo zbierky kultúr, z iného laboratória alebo z terénu. Ak je získaný z terénu, je potrebné minimálne osem týždňov pred použitím uchovávať rastliny v kultúre v rovnakom médiu, aké sa používa na testovanie. Miesta v teréne použité na zbieranie počiatočných kultúr musia byť bez zrejmých zdrojov kontaminácie. Ak sa materiál získa z iného laboratória alebo zo zbierky kultúr, mal by sa takisto uchovávať minimálne tri týždne. Vždy je potrebné uviesť v správe zdroj rastlinného materiálu a druh a klon (ak je známy) použitý na testovanie.

17.

Používať by sa mali monokultúry, ktoré sú viditeľne bez kontaminácie inými organizmami, ako sú napríklad riasy a prvoky. dravé rastliny L. minor sa skladajú z kolónií obsahujúcich dva až päť lístkov, kým zdravé kolónie L. gibba môžu obsahovať až sedem lístkov.

18.

Kvalita a uniformita rastlín, ktoré sa používajú na test, budú mať značný vplyv na výsledok testu, a preto by sa mali starostlivo vyberať. Použiť by sa mali mladé, rýchlo rastúce rastliny bez viditeľných lézií alebo úbytku farby (chloróza). Kvalitné kultúry sa prejavujú vysokým výskytom kolónií, ktoré pozostávajú najmenej z dvoch lístkov. Veľký počet jediných lístkov značí environmentálny stres, napríklad obmedzený prísun živín, preto by sa rastlinný materiál z takýchto kultúr nemal použiť na testovanie.

Kultivácia

19.

Na zníženie frekvencie uchovávania kultúr (napr. v čase, keď sa neplánujú žiadne testy s rodom Lemna) sa kultúry môžu uchovávať pri zníženom osvetlení a teplote (4 – 10 °C). Informácie o kultivovaní sú uvedené v dodatku 3. Zrejmé znaky kontaminácie riasami alebo inými organizmami si môžu vyžadovať povrchovú sterilizáciu čiastočnej vzorky lístkov rastlín rodu Lemna, ktorá sa potom prenesie do čerstvého média (pozri dodatok 3). V tomto prípade by sa zvyšná kontaminovaná kultúra mala vyradiť.

20.

Najmenej sedem dní pred vykonaním testu sa dostatočný počet kolónií prenesie sterilne do čerstvého sterilného média a kultivuje 7 – 10 dní za podmienok testu.

Testovacie médium

21.

Pre druhy Lemna minor a Lemna gibba sa odporúčajú rôzne médiá, ako je uvedené nižšie. Je potrebné starostlivo posúdiť pridanie pH tlmivého roztoku do testovacieho média [MOPS (kyselina 4-morfolinopropánsulfónová, číslo CAS: 1132–61–2) v médiu pre L. minor a NaHCO3 v médiu pre L. gibba], ak sa očakáva, že by mohol reagovať s testovanou chemikáliou a ovplyvniť vyjadrenie jej toxicity. Steinbergovo médium (9) je tiež prijateľné, pokiaľ sú splnené kritériá platnosti.

22.

Na kultiváciu a testovanie druhu L. minor sa odporúča modifikácia švédskej normy (SIS) rastového média pre rod Lemna. Zloženie tohto média je uvedené v dodatku 4.

23.

Na kultiváciu a testovanie druhu L. gibba sa odporúča rastové médium 20X – AAP, ako je uvedené v dodatku 4.

24.

Steinbergovo médium, ako je uvedené v dodatku 4, je takisto vhodné pre druh L. minor, no môže sa použiť aj pre druh L. gibba, pokiaľ sú splnené kritériá platnosti.

Testovacie roztoky

25.

Testovacie roztoky sa pripravujú obvykle zriedením zásobného roztoku. Zásobné roztoky testovanej chemikálie sa spravidla pripravujú rozpustením látky v rastovom médiu.

26.

Najvyššia testovacia koncentrácia testovanej chemikálie by spravidla nemala byť vyššia ako rozpustnosť látky vo vode za podmienok testu. Je však potrebné si uvedomiť, že rastliny rodu Lemna plávajú na povrchu a môžu byť vystavené chemikáliám, ktoré sa zhromažďujú na rozhraní voda – vzduch (napr. látky, ktoré sú vo vode zle rozpustné, hydrofóbne látky alebo povrchovo aktívne látky). Za takýchto podmienok bude expozícia pochádzať z iného materiálu, než sa nachádza v roztoku, a testovacie koncentrácie môžu byť v závislosti od vlastností testovanej chemikálie vyššie ako rozpustnosť vo vode. Pre testované chemikálie s nízkou rozpustnosťou vo vode môže byť potrebné pripraviť koncentrovaný zásobný roztok alebo disperziu chemikálie s použitím organického rozpúšťadla alebo disperzantu, aby sa umožnilo pridanie presných množstiev testovanej chemikálie do testovacieho média a napomohlo jej rozptýlenie a rozpustenie. Treba vyvinúť maximálne úsilie na to, aby sa zabránilo použitiu takýchto materiálov. Nemala by sa vyskytovať žiadna fytotoxicita v dôsledku použitia pomocných rozpúšťadiel alebo disperzantov. Napríklad k bežne používaným rozpúšťadlám, ktoré nespôsobujú fytotoxicitu pri koncentráciách do 100 μl/l, patrí acetón a dimetylformamid. Ak sa používa rozpúšťadlo alebo disperzant, jeho konečná koncentrácia by sa mala zaznamenať a udržiavať na minime (≤ 100 μl/l) a všetky vzorky s aplikovanou chemikáliou a kontrolné vzorky by mali obsahovať rovnakú koncentráciu rozpúšťadla alebo disperzantu. Ďalšie informácie o použití disperzantov sú uvedené v literatúre pod číslom (8).

Testovacie a kontrolné skupiny

27.

Predchádzajúce poznatky o toxicite testovanej chemikálie pre rod Lemna, napríklad z testov na vyhľadávanie rozsahu, pomôžu pri voľbe vhodných testovaných koncentrácií. V konečnom teste toxicity by spravidla malo byť najmenej päť testovaných koncentrácií zoradených v geometrických radoch. Rozdeľovacia konštanta medzi testovanými koncentráciami by prednostne nemala byť viac ako 3,2, no môže sa použiť aj vyššia hodnota, ak je krivka závislosti veličiny od koncentrácie plochá. Je potrebné uviesť zdôvodnenie, ak sa použije menej ako päť koncentrácií. Na každú testovanú koncentráciu by sa mali použiť najmenej tri replikáty.

28.

Pri stanovení rozsahu testovaných koncentrácií (v prípade testu na vyhľadávanie rozsahu a/alebo konečného testu toxicity) je potrebné zvážiť tieto okolnosti:

Na stanovenie koncentrácie ECx musia testované koncentrácie podopierať hodnotu ECx tak, aby sa zabezpečila primeraná úroveň spoľahlivosti. Napríklad ak sa odhaduje koncentrácia EC50, najvyššia testovaná koncentrácia musí byť vyššia ako hodnota EC50. Ak je hodnota EC50 mimo rozsahu testovaných koncentrácií, príslušné intervaly spoľahlivosti budú veľké a môže sa stať, že nebude možné správne posúdiť vhodnosť modelu pre štatistické spracovanie.

Ak je cieľom odhad koncentrácií LOEC/NOEC, najnižšia testovaná koncentrácia by mala byť dostatočne nízka na to, aby rast nebol významne nižší než v kontrolnej vzorke. Okrem toho najvyššia testovaná koncentrácia by mala byť dostatočne vysoká na to, aby bol rast významne nižší než v kontrolnej vzorke. Ak to tak nie je, test sa bude musieť opakovať s použitím iného koncentračného rozsahu (pokiaľ najvyššia koncentrácia nie je medzou rozpustnosti alebo najvyššou povolenou limitnou hodnotou koncentrácie, napríklad 100 mg/l).

29.

Každý test by mal zahŕňať kontrolné vzorky pozostávajúce z rovnakého média obsahujúceho živiny, počtu lístkov a kolónií, environmentálnych podmienok a postupov ako v prípade testovacích nádob, ale bez testovanej chemikálie. Ak sa používa pomocné rozpúšťadlo alebo disperzant, musí sa zahrnúť ďalšia kontrola s rozpúšťadlom/disperzantom v rovnakej koncentrácii, aká sa nachádza v nádobách s testovanou chemikáliou. Počet paralelných kontrolných nádob (a v prípade potreby nádob s rozpúšťadlom) by mal byť minimálne rovnaký alebo v ideálnom prípade dvojnásobný ako počet nádob použitý pre každú testovanú koncentráciu.

30.

Ak sa nevyžaduje stanovenie koncentrácie NOEC, môže sa test pozmeniť: zvýšiť počet koncentrácií a znížiť počet replikátov na koncentráciu. Musia však existovať minimálne tri kontrolné replikáty.

Expozícia

31.

Kolónie pozostávajúce z 2 až 4 viditeľných lístkov sa prenesú do kultúry inokula a náhodne sa rozdelia do testovacích nádob za sterilných podmienok. Každá testovacia nádoba by mala obsahovať celkove 9 až 12 lístkov. Počet lístkov a kolónií by mal byť rovnaký v každej testovacej nádobe. Zo skúseností pri použití tejto metódy a údajov z medzilaboratórneho porovnania vyplýva, že na detekciu rozdielov v raste približne v rozsahu 4 – 7 % inhibície vypočítanej na základe rýchlosti rastu (10 – 15 % vypočítanej podľa výťažku) medzi aplikáciami chemikálie stačia tri replikáty na jednu aplikáciu chemikálie, pričom každý replikát obsahuje na začiatku 9 až 12 lístkov (7).

32.

Je potrebné, aby sa testovacie nádoby v inkubátore umiestňovali náhodne, čím sa minimalizuje vplyv priestorových rozdielov v intenzite svetla alebo teplote. Takisto je potrebné blokové usporiadanie alebo náhodné premiestňovanie nádob pri vykonávaní pozorovaní (alebo častejšie premiestňovanie).

33.

Ak z predbežnej skúšky stability vyplýva, že nie je možné zachovať koncentráciu testovanej chemikálie (t. j. meraná koncentrácia klesne pod 80 % nameranej počiatočnej koncentrácie) počas trvania testu (7 dní), odporúča sa vykonať semistatický test. V tom prípade by mali byť kolónie vystavené čerstvo pripraveným testovacím a kontrolným roztokom najmenej dvakrát počas testu (napr. na 3. a 5. deň). Frekvencia expozície čerstvému médiu bude závisieť od stability testovanej chemikálie. Môže byť potrebná vyššia frekvencia na zachovanie približne konštantných koncentrácií veľmi nestabilných alebo prchavých látok. V niektorých prípadoch môže byť potrebné použiť prietokový postup (8) (10).

34.

Expozičný scenár aplikácie na listy (sprejom) sa v tejto testovacej metóde nenachádza, preto pozri odkaz v literatúre pod číslom (11).

Podmienky inkubácie

35.

Použije sa kontinuálne teplé alebo studené biele fluorescenčné osvetlenie na zabezpečenie zvolenej intenzity svetla v rozsahu 85 – 135 μE · m– 2 s– 1 pri meraní vo fotosynteticky aktívnom žiarení (400 – 700 nm) v bodoch, ktoré sú v rovnakej vzdialenosti od zdroja svetla ako lístky rastliny rodu Lemna (v rozsahu od 6 500 do 10 000 lux). Žiadna odchýlka od zvolenej intenzity svetla nad plochou, kde sa uskutočňuje test, nesmie presiahnuť hodnotu ± 15 %. Metóda detekcie a merania svetla, najmä typ senzora, ovplyvní meranú hodnotu. Guľové senzory (ktoré reagujú na svetlo zo všetkých uhlov nad a pod rovinou merania) a ‚kosínusové‘ senzory (ktoré reagujú na svetlo zo všetkých uhlov nad rovinou merania) sa uprednostňujú pred jednosmernými senzormi a poskytujú presnejšie snímanie v prípade viacbodového svetelného zdroja takého typu, aký sa uvádza v tejto metóde.

36.

Teplota v testovacích nádobách by mala byť 24 °C ± 2 °C. Hodnota pH kontrolného média by sa nemala zvýšiť počas testu o viac ako 1,5 jednotky. Odchýlka o viac ako 1,5 jednotky by však nespôsobila neplatnosť testu, ak sa preukáže, že sú splnené kritériá platnosti. V určitých prípadoch je potrebné venovať zvýšenú pozornosť kolísaniu pH napr. pri testovaní nestabilných chemikálií alebo kovov. Ďalšie informácie sú uvedené v literatúre pod číslom (8).

Trvanie

37.

Test sa ukončí 7 dní po premiestnení rastlín do testovacích nádob.

Merania a analytické stanovenia

38.

Na začiatku testu sa spočíta a zaznamená počet lístkov v testovacích nádobách, pričom je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa spočítali vystupujúce, zreteľne viditeľné lístky. Počet lístkov, ktoré majú normálny alebo abnormálny vzhľad, je potrebné stanoviť na začiatku testu, minimálne každé 3 dni počas expozície (t. j. najmenej dvakrát počas 7 dní) a po ukončení testu. Je potrebné si všimnúť zmeny vo vývoji rastliny, napríklad vo veľkosti lístkov, vzhľade, známky nekrózy, chlorózy alebo gibozity, rozpad kolónií alebo stratu schopnosti plávať na hladine či v dĺžke a vzhľade korienkov. Je potrebné si všimnúť aj významné znaky testovacieho média (napr. prítomnosť nerozpusteného materiálu, rast rias v testovacej nádobe).

39.

Okrem stanovenia počtu lístkov počas testu sa posudzujú aj účinky testovanej chemikálie na jednu (alebo viac) z týchto meraných premenných:

i)

celková plocha lístkov;

ii)

sušina;

iii)

hmotnosť v čerstvom stave.

40.

Celková plocha lístkov je výhodná, pretože sa dá stanoviť pre každý test a kontrolnú nádobu na začiatku, počas a na konci testu. Sušinu alebo hmotnosť v čerstvom stave je potrebné stanoviť na začiatku testu zo vzorky kultúry inokula, ktorá predstavuje kultúru použitú na začiatku testu a na konci testu, s rastlinným materiálom z každého testu a kontrolnej nádoby. Ak sa plocha lístkov nemeria, uprednostňuje sa sušina pred hmotnosťou v čerstvom stave.

41.

Celková listová plocha, sušina a hmotnosť v čerstvom stave sa môžu stanoviť takto:

i)

celková listová plocha: celková listová plocha všetkých kolónií sa môže stanoviť obrazovou analýzou. Siluetu testovacej nádoby a rastlín je možné zachytiť prostredníctvom videokamery (t. j. umiestnením nádoby na svetelný box) a výsledný obraz sa digitalizuje. Kalibráciou plochých tvarov známej plochy sa potom môže stanoviť celková listová plocha v testovacej nádobe. Je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa vylúčila interferencia spôsobená okrajom testovacej nádoby. Alternatívnym, ale prácnejším prístupom je urobiť fotokópiu testovacej nádoby a rastlín, vystrihnúť výslednú siluetu kolónií a stanoviť ich plochu s použitím analyzátora plochy lístkov alebo milimetrového papiera. Vhodné môžu byť aj iné techniky (napr. pomer hmotnosti papiera medzi plochou siluety kolónii a jednotkou plochy).

ii)

sušina: všetky kolónie sa zozbierajú z každej testovacej nádoby a opláchnu sa destilovanou alebo deionizovanou vodou. Osušia sa, aby sa odstránila nadbytočná voda, a potom sa sušia pri 60 °C na konštantnú hmotnosť. Musia obsahovať všetky úlomky korienkov. Sušina sa musí vyjadriť s presnosťou minimálne 0,1 mg.

iii)

hmotnosť v čerstvom stave: všetky kolónie sa prenesú do predvážených polystyrénových skúmaviek (alebo z iného inertného materiálu) s malými (1 mm) otvormi v zaoblených dnách. Skúmavky sa potom 10 minút centrifugujú pri rýchlosti 3 000 ot/min a pri izbovej teplote. Skúmavky obsahujúce už vysušené kolónie sa opätovne prevážia a hmotnosť v čerstvom stave sa vypočíta odpočítaním hmotnosti prázdnej skúmavky.

Frekvencia meraní a analytické stanovenia

42.

Ak sa použije statický test, na začiatku a na konci testu by sa mala zmerať hodnota pH každej vzorky s aplikovanou chemikáliou. Ak sa použije semistatický test, hodnota pH by sa mala zmerať v každej dávke ‚čerstvého‘ testovacieho roztoku pred každým obnovením a aj v zodpovedajúcich ‚spotrebovaných‘ roztokoch.

43.

Svietivosť by sa mala merať v rastovej komore, inkubátore alebo miestnosti v bodoch v rovnakej vzdialenosti od zdroja svetla ako lístky rastliny rodu Lemna. Merania by sa mali vykonať minimálne jedenkrát počas testu. Teplota média v náhradnej nádobe udržiavanej v rovnakých podmienkach v rastovej komore, inkubátore alebo miestnosti by sa mala zaznamenať minimálne jedenkrát za deň.

44.

Počas testu sa v príslušných intervaloch stanovia koncentrácie testovanej látky. V rámci statických testov je potrebné stanoviť koncentrácie minimálne na začiatku a na konci testu.

45.

V rámci semistatických testov, kde sa očakáva, že hodnoty koncentrácie testovanej chemikálie nebudú v rozsahu ± 20 % nominálnej koncentrácie, je potrebné analyzovať všetky čerstvo pripravené testovacie roztoky a rovnaké roztoky pri každom obnovení (pozri bod 33). V prípade testov, kde nameraná hodnota počiatočnej koncentrácie testovanej chemikálie neleží v rozsahu ± 20 % nominálnej hodnoty, ale kde je možné poskytnúť dostačujúce dôkazy na preukázanie, že počiatočné koncentrácie sú opakovateľné a stabilné (t. j. v rozsahu od 80 do 120 % počiatočnej koncentrácie), sa však chemické stanovenia môžu vykonať iba s najvyššími a najnižšími testovanými koncentráciami. Vo všetkých prípadoch je potrebné stanoviť koncentrácie testovanej chemikálie pred obnovením iba v jednej paralelnej nádobe na každú testovaciu koncentráciu (alebo obsahy nádob rozdelených do replikátov).

46.

Ak sa použije prietokový test, je vhodný podobný systém odberu vzoriek, ako je uvedený pre semistatické testy, vrátane analýzy na začiatku, v polovici a na konci testu, pričom meranie ‚spotrebovaných‘ roztokov v tomto prípade nie je vhodné. Pri tomto type testu sa musí denne kontrolovať prietoková rýchlosť riedidla a testovanej chemikálie alebo zásobného roztoku testovanej chemikálie.

47.

Ak je dokázané, že koncentrácia chemikálie, ktorá sa testuje, je počas testu v dostatočnej miere udržiavaná v rozsahu ± 20 % nominálnej hodnoty alebo nameranej počiatočnej koncentrácie, analýza výsledkov sa môže zakladať na nominálnych alebo nameraných počiatočných hodnotách. Ak je odchýlka od nominálnej alebo nameranej počiatočnej koncentrácie väčšia ako ± 20 %, analýza výsledkov by sa mala zakladať na geometrickej strednej koncentrácii počas expozície alebo na modeloch opisujúcich pokles koncentrácie testovanej chemikálie (8).

Limitný test

48.

V určitých situáciách, napríklad keď z predbežného testu vyplýva, že testovaná chemikália nemá žiadne toxické účinky pri koncentráciách do 100 mg/l alebo do jej limitu rozpustnosti v testovacom médiu (podľa toho, ktorá hodnota je nižšia), sa môže vykonať limitný test umožňujúci porovnanie reakcií v kontrolnej skupine a jednej skupine s aplikovanou chemikáliou (100 mg/l alebo koncentrácia rovná limitu rozpustnosti). Dôrazne sa odporúča, aby sa táto skutočnosť zakladala na analýze expozičnej koncentrácie. Na limitný test sa vzťahujú všetky už uvedené testovacie podmienky a kritériá platnosti s výnimkou, že počet replikátov s aplikovanou chemikáliou by mal byť dvojnásobný. Rast v kontrolnej skupine a skupine s aplikovanou chemikáliou sa môže analyzovať použitím štatistického testu na porovnanie stredných hodnôt napr. Studentovho t-testu.

ÚDAJE A PODÁVANIE SPRÁV

Čas zdvojnásobenia

49.

Na stanovenie času zdvojnásobenia (Td ) počtu lístkov a pri dodržaní tohto kritéria platnosti podľa štúdie (bod 12) sa použije tento vzorec s údajmi, ktoré sa získali z kontrolných nádob:

Td = ln 2/μ,

kde μ je priemerná špecifická rýchlosť rastu stanovená postupom opísaným v bodoch 54 a 55.

Premenné hodnoty reakcie

50.

Účelom testu je stanoviť účinky testovanej chemikálie na vegetatívny rast rastlín rodu Lemna. Táto testovacia metóda opisuje dve závisle premenné veličiny reakcie, keďže rôzne jurisdikcie majú rozdielne preferencie a regulačné požiadavky. Na to, aby boli výsledky testu prijateľné vo všetkých jurisdikciách, by sa účinky mali hodnotiť s použitím obidvoch uvedených závisle premenných reakcie a) a b).

a)

Priemerná špecifická rýchlosť rastu: táto závisle premenná veličina reakcie sa vypočíta na základe zmien logaritmu počtu lístkov a navyše na základe zmien logaritmu iného parametra merania (celková listová plocha, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave) v čase (vyjadrené za deň) v kontrolných skupinách a v každej skupine s aplikovanou chemikáliou. Niekedy sa uvádza ako relatívna rýchlosť rastu (12).

b)

Výťažok: táto závisle premenná veličina reakcie sa vypočíta na základe zmien počtu lístkov a navyše na základe zmien iného parametra merania (celková listová plocha, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave) v kontrolných skupinách a v každej skupine s aplikovanou chemikáliou až do ukončenia testu.

51.

Je potrebné si uvedomiť, že hodnoty toxicity vypočítané použitím týchto dvoch závisle premenných veličín reakcie nie sú porovnateľné a tento rozdiel sa musí zohľadniť pri použití výsledkov testu. Pri dodržaní testovacích podmienok tejto testovacej metódy budú hodnoty ECx založené na priemernej špecifickej rýchlosti rastu (ErCx) spravidla vyššie ako výsledky založené na výťažku (EyCx), a to v dôsledku matematického základu príslušných postupov. Nemalo by sa to vysvetľovať ako rozdiel v citlivosti medzi obidvoma závisle premennými veličinami reakcie, ale len tak, že sa hodnoty odlišujú matematicky. Koncepcia priemernej špecifickej rýchlosti rastu sa zakladá na všeobecnom exponenciálnom modeli rastu žaburiniek v nelimitovaných kultúrach, kde sa toxicita stanovuje na základe účinkov na rýchlosť rastu, bez závislosti od absolútnej úrovne špecifickej rýchlosti rastu kontrolnej kultúry, od sklonu krivky závislosti veličiny koncentrácie alebo od dĺžky testu. Naopak je to v prípade výsledkov založených na závisle premennej veličine výťažku, ktoré sú závislé od všetkých ďalších premenných. Hodnota EyCx je závislá od špecifickej rýchlosti rastu žaburiniek, ktoré sa používajú v každom teste, a od maximálnej špecifickej rýchlosti rastu, ktorá sa môže meniť medzi druhmi a dokonca aj medzi odlišnými klonmi. Táto závisle premenná veličina by sa nemala používať na porovnávanie citlivosti na toxické látky medzi druhmi žaburinky alebo dokonca medzi odlišnými klonmi. Zatiaľ čo z vedeckého hľadiska sa na odhady toxicity uprednostňuje použitie priemernej špecifickej rýchlosti rastu, do tejto testovacej metódy bolo zahrnuté aj stanovenie toxicity na základe výťažku, aby sa tak vyhovelo regulačným požiadavkám platným v rámci niektorých jurisdikcií.

52.

Odhady toxicity by sa mali zakladať na počte lístkov a na jednej ďalšej meranej premennej (celková listová plocha, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave), keďže niektoré chemikálie môžu oveľa viac ovplyvniť iné merané premenné ako počet lístkov. Tento účinok by sa nemal stanovovať iba na základe počítania počtu lístkov.

53.

Počet lístkov, ako aj každá iná zaznamenaná meraná premenná, t. j. celková listová plocha, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave, sa pri každom meraní zapíše do tabuľky spolu s koncentráciami testovanej chemikálie. Následná analýza údajov, napríklad odhad koncentrácií LOEC, NOEC alebo ECx, by sa mala zakladať na hodnotách pre jednotlivé replikáty a nie na vypočítaných stredných hodnotách pre každú skupinu s aplikovanou chemikáliou.

Priemerná špecifická rýchlosť rastu

54.

Priemerná špecifická rýchlosť rastu za konkrétny čas sa vypočíta ako logaritmus nárastu premenných rastu – počtu lístkov a jednej ďalšej meranej premennej (celková listová plocha, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave) – použitím uvedeného vzorca pre každý replikát kontrolných vzoriek a vzoriek s aplikovanou chemikáliou:

Formula

kde:

:

μi-j

:

priemerná špecifická rýchlosť rastu od času i do j,

:

Ni

:

meraná premenná v testovacej alebo kontrolnej nádobe v čase i,

:

Nj

:

meraná premenná v testovacej alebo kontrolnej nádobe v čase j,

:

t

:

čas medzi i a j.

Pre každú skupinu s aplikovanou chemikáliou a kontrolnú skupinu sa vypočíta stredná hodnota rýchlosti rastu spolu s odhadmi rozptylu.

55.

Priemerná špecifická rýchlosť rastu by sa mala vypočítať pre celý čas testu (čas ‚i‘ v uvedenom vzorci je začiatok testu a čas ‚j‘ je koniec testu). Pre každú testovanú koncentráciu a kontrolnú vzorku sa vypočíta stredná hodnota priemernej špecifickej rýchlosti rastu spolu s odhadmi rozptylu. Okrem toho by sa mala posúdiť fázová rýchlosť rastu, aby sa vyhodnotili účinky testovanej chemikálie, ktoré sa vyskytnú počas expozície (napr. skontrolovaním logaritmicky transformovaných rastových kriviek). Zo značných rozdielov medzi fázovou rýchlosťou rastu a priemernou rýchlosťou rastu vyplýva odchýlka od konštantného exponenciálneho rastu, ako aj skutočnosť, že bolo zaručené dôkladné preskúmanie rastových kriviek. V tomto prípade by bolo konzervatívnym prístupom porovnávanie špecifických rýchlostí rastu kultúr s aplikovanou chemikáliou počas maximálnej inhibície so špecifickými rýchlosťami rastu kontrolných kultúr v tom istom čase.

56.

Percentuálna inhibícia rýchlosti rastu (Ir) sa môže potom vypočítať pre každú testovaciu koncentráciu (skupinu s aplikovanou chemikáliou) podľa tohto vzorca:

Formula

kde:

:

% Ir

:

percentuálna inhibícia priemernej špecifickej rýchlosti rastu,

:

μC

:

stredná hodnota μ v kontrolnej skupine,

:

μT

:

stredná hodnota pre μ v skupine s aplikovanou chemikáliou.

Výťažok

57.

Účinky na výťažok sa stanovia na základe dvoch meraných premenných, počtu lístkov a jednej ďalšej meranej premennej (celková listová plocha, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave) nachádzajúcej sa v každej testovacej nádobe na začiatku a na konci testu. Pre sušinu alebo hmotnosť v čerstvom stave sa počiatočné množstvo biomasy stanoví na základe vzorky lístkov odobratých z rovnakej dávky použitej na inokuláciu testovacích nádob (pozri bod 20). Pre každú testovanú koncentráciu a kontrolnú vzorku sa vypočíta stredná hodnota výťažku spolu s odhadmi rozptylu. Percentuálna inhibícia výťažku ( % Iy) sa môže vypočítať pre každý replikát s aplikovanou chemikáliou takto:

Formula

kde:

:

% Iy

:

percentuálna hodnota zníženia výťažku,

:

bC

:

rozdiel konečného množstva biomasy a počiatočného množstva biomasy pre kontrolnú skupinu,

:

bT

:

rozdiel konečného množstva biomasy a počiatočného množstva biomasy v skupine s aplikovanou chemikáliou.

Zostrojenie kriviek závislosti veličiny od koncentrácie

58.

Je potrebné zostrojiť krivky závislosti veličiny od koncentrácie vzťahujúce sa na strednú hodnotu percentuálnej inhibície závisle premennej veličiny reakcie (Ir alebo Iy vypočítané podľa bodov 56 alebo 57), ako aj logaritmus koncentrácie testovanej chemikálie.

Odhad koncentrácie ECx

59.

Odhady koncentrácie ECx (napr. EC50) by sa mali zakladať na priemernej špecifickej rýchlosti rastu (ErCx) a na výťažku (EyCx), pričom každý z týchto parametrov sa musí zasa zakladať na počte lístkov a jednej ďalšej meranej premennej (celková listová plocha, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave). Dôvodom je, že existujú testované chemikálie, ktoré rozdielne vplývajú na počet lístkov a na iné merané premenné. Požadovanými parametrami toxicity sú preto štyri hodnoty koncentrácie ECx pre každú vypočítanú úroveň inhibície x: ErCx (počet lístkov), ErCx (celková listová plocha, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave), EyCx (počet lístkov), a EyCx (celková listová plocha, sušina alebo hmotnosť v čerstvom stave).

Štatistické postupy

60.

Cieľom je získať kvantitatívny vzťah medzi koncentráciou a reakciou pomocou regresnej analýzy. Je možné použiť váženú lineárnu regresiu po vykonaní linearizovanej transformácie reakčných údajov – napríklad na probitové alebo logitové, prípadne Weibullove jednotky (13), ale uprednostňujú sa techniky nelineárnej regresie, ktorými sa lepšie spracujú nevyhnutné nepresnosti údajov a odchýlky od hladkých rozdelení. Priblížením buď k nulovej, alebo k úplnej inhibícii sa takéto nepresnosti môžu transformáciou zväčšiť a ovplyvniť analýzu (13). Je potrebné si uvedomiť, že štandardné metódy analýzy s použitím probitovej, logitovej alebo Weibullovej transformácie sú určené na použitie na kvantálne údaje (napr. o mortalite alebo prežití) a musia sa modifikovať, aby sa prispôsobili údajom o rýchlosti rastu alebo výťažku. Osobitné postupy na stanovenie hodnôt ECx z kontinuálnych údajov je možné nájsť v literatúre pod číslami (14) (15) a (16).

61.

Pre každú závisle premennú veličinu reakcie, ktorá sa má analyzovať, sa na výpočet bodových odhadov hodnôt ECx použije vzťah medzi koncentráciou a reakciou. Ak je to možné, je potrebné stanoviť 95 % hranice spoľahlivosti pre každý odhad. Vhodnosť reakčných údajov pre regresný model je potrebné vyhodnotiť buď graficky, alebo štatisticky. Regresná analýza sa musí vykonať s použitím reakcií jednotlivých replikátov, nie stredných hodnôt skupiny s aplikovanou chemikáliou.

62.

Odhady hodnôt EC50 a hranice spoľahlivosti sa môžu získať aj použitím lineárnej interpolácie metódou ‚bootstrap‘ (17), ak sú dostupné regresné modely/metódy nevhodné pre dané údaje.

63.

Pre odhad koncentrácií LOEC aj NOEC je potrebné porovnať stredné hodnoty skupiny s aplikovanou chemikáliou pomocou techník pre analýzu rozptylu (ANOVA). Stredná hodnota pre každú koncentráciu sa musí potom porovnať s kontrolnou strednou hodnotou s použitím príslušného viacnásobného porovnania alebo testovacej metódy trendu. Môže sa použiť Dunnettov alebo Williamsov test (18) (19) (20) (21). Je potrebné posúdiť, či je dodržaný predpoklad homogenity rozptylu ANOVA. Toto posúdenie sa môže vykonať graficky alebo formálnym testom (22). Vhodný je Levenov alebo Bartlettov test. Nesplnenie predpokladu homogenity rozptylov je niekedy možné korigovať logaritmickou transformáciou údajov. Ak je heterogenita rozptylu extrémna a nie je možné ju korigovať transformáciou, je potrebné posúdiť analýzu metódami, ako sú napríklad ‚step-down Jonkheere‘ testy trendu. Ďalšie informácie o stanovení hodnoty NOEC je možné nájsť v literatúre pod číslom (16).

64.

Najnovší vývoj vo vede vedie k odporúčaniu upustiť od koncepcie NOEC a nahradiť ju regresiou založenou na bodovom odhade ECx. Príslušná hodnota x pre tento test na rastlinách rodu Lemna nebola stanovená. Vhodný sa však zdá byť rozsah 10 – 20 % (v závislosti od zvolenej závisle premennej veličiny reakcie), pričom prednostne by sa mali uvádzať hodnoty EC10 a EC20.

Predkladanie správ

65.

Skúšobný protokol musí obsahovať tieto informácie:

 

Testovaná chemikália:

fyzikálny charakter a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti vrátane limitu rozpustnosti vo vode,

identifikačné údaje chemikálie (napr. číslo CAS) vrátane čistoty (nečistôt).

 

Testovacie druhy:

vedecký názov, klon (ak je známy) a zdroj.

 

Podmienky testu:

použitý postup testovania (statický, semistatický alebo prietokový),

dátum začiatku testu a jeho dĺžka,

testovacie médium,

opis priebehu experimentu: testovacie nádoby a veká, objemy roztokov, počet kolónií a lístkov na testovaciu nádobu na začiatku testu,

testovacie koncentrácie (nominálne a merané podľa potreby) a počet replikátov na koncentráciu,

metódy prípravy zásobných a testovacích roztokov vrátane použitia všetkých rozpúšťadiel alebo disperzantov,

teplota počas testu,

zdroj svetla, svietivosť a homogenita svetla,

hodnoty pH testovacieho a kontrolného média,

koncentrácie testovaných chemikálií a metóda analýzy s príslušným posúdením kvality údajov (validačné štúdie, štandardné odchýlky alebo hranice spoľahlivosti analýzy),

metódy stanovenia počtu lístkov a iných meraných premenných, napríklad sušiny, hmotnosti v čerstvom stave alebo listovej plochy,

všetky odchýlky od tejto testovacej metódy,

 

Výsledky:

nespracované údaje: počet lístkov a iné merané premenné v každej testovacej a kontrolnej nádobe pri každom pozorovaní a analýze,

stredné hodnoty a štandardné odchýlky pre každú meranú premennú,

rastové krivky pre každú koncentráciu (odporúčané s logaritmicky transformovanou meranou premennou, pozri bod 55),

čas zdvojnásobenia/rýchlosť rastu v kontrolných vzorkách na základe počtu lístkov,

vypočítané hodnoty závisle premenných veličín reakcie pre každý replikát s aplikovanou chemikáliou, so strednými hodnotami a variačným koeficientom pre replikáty,

grafické znázornenie vzťahu koncentrácie a účinku,

odhady toxicity pre závisle premenné veličiny reakcie napr. EC50, EC10, EC20, a príslušné intervaly spoľahlivosti; ak sa vypočítavajú, hodnoty LOEC a/alebo NOEC a štatistické metódy použité na ich stanovenie,

ak sa používa technika ANOVA, veľkosť účinku, ktorý je možné detegovať (napr. najmenej významný rozdiel),

každá stimulácia rastu zistená v ľubovoľnej vzorke s aplikovanou chemikáliou,

všetky viditeľné znaky fytotoxicity, ako aj pozorovania testovacích roztokov,

rozbor výsledkov vrátane každého vplyvu na výsledok testu vyplývajúceho z odchýlok od tejto testovacej metódy.

LITERATÚRA

1.

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

2.

US EPA – United States Environmental Protection Agency. (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft‘. EPA 712-C-96-156. 8pp.

3.

AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

4.

SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (vo švédštine).

5.

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37 – 120 pp.

6.

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

7.

Sims I., Whitehouse P. and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.

8.

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

9.

International Organisation for Standardisation. ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) – Duckweed Growth Inhibition Test.

10.

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.

11.

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353 – 359.

12.

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

13.

Christensen, E.R.,, Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.

14.

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

15.

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

16.

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

17.

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

18.

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

19.

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.

20.

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.

21.

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.

22.

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Dodatok 1

Vymedzenia pojmov

Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto pojmy a skratky:

 

Biomasa je sušina živej hmoty nachádzajúcej sa v populácii. V tomto teste biomasu nahrádza napríklad počet lístkov alebo plocha lístkov, ktoré sa bežne merajú, a používanie pojmu ‚biomasa‘ sa teda vzťahuje aj na tieto náhradné kritériá.

 

Chemikália je látka alebo zmes.

 

Chloróza je žltnutie tkaniva lístkov.

 

Klon je organizmus alebo bunka, ktorá vznikla z jedného jedinca nepohlavným rozmnožovaním. Jedince z rovnakého klonu sú preto geneticky identické.

 

Kolónia znamená zhluk navzájom spojených materských a dcérskych lístkov (obvykle 2 až 4). Niekedy sa uvádza ako rastlina.

 

ECx je koncentrácia testovanej chemikálie rozpustenej v testovacom médiu, ktorej dôsledkom je x % (napr. 50 %) zníženie rastu rastlín rodu Lemna v rámci stanoveného času expozície (je potrebné výslovne uviesť, ak sa odchyľuje od celkovej alebo obvyklej dĺžky testu). Na jednoznačné označenie hodnoty EC odvodenej z rýchlosti rastu alebo výťažku sa používa symbol ‚ErC‘ pre rýchlosť rastu a symbol ‚EyC‘ pre výťažok, potom nasleduje použitá meraná premenná napr. ‚ErC‘ (počet lístkov).

 

Prietokový test je test, v ktorom sa testovacie roztoky kontinuálne nahrádzajú.

 

Lístok je individuálna/samostatná ‚lístkovitá‘ štruktúra žaburinky. Je to najmenšia jednotka, resp. jedinec schopný rozmnožovania.

 

Gibozita je stav, keď lístky rastliny majú vypuklý alebo napuchnutý vzhľad.

 

Rast je nárast meranej premennej, napríklad počtu lístkov, sušiny, hmotnosti vo vlhkom stave alebo plochy lístkov, počas testu.

 

Rýchlosť rastu (priemerná špecifická rýchlosť rastu) je logaritmickým nárastom množstva biomasy počas expozície.

 

Najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC) je najnižšia testovacia koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje, že chemikália má štatisticky významný účinok na zníženie rastu (pri p < 0,05) v porovnaní s kontrolnou kultúrou v rámci daného času expozície. Škodlivý účinok všetkých testovacích koncentrácií nad LOEC však musí byť vždy rovnaký alebo väčší ako účinky pozorované pri LOEC. Ak nie sú splnené tieto dve podmienky, je potrebné poskytnúť úplné vysvetlenie, akým spôsobom sa zvolila koncentrácia LOEC (a teda aj koncentrácia NOEC).

 

Merané premenné sú všetky typy premenných, ktoré sa merajú na vyjadrenie konečného parametra testu použitím jednej alebo viacerých závisle premenných veličín reakcie. V rámci tejto metódy sú meranými premennými počet lístkov, listová plocha, hmotnosť v čerstvom stave a sušina.

 

Monokultúra je kultúra s jedným druhom rastliny.

 

Nekróza je odumreté (t. j. biele alebo rozmočené) tkanivo lístkov.

 

Koncentrácia bez pozorovaného účinku (NOEC) je testovacia koncentrácia bezprostredne pod koncentráciou LOEC.

 

Fenotyp je viditeľná charakteristika organizmu určená interakciou jeho génov s jeho prostredím.

 

Závisle premenná veličina reakcie je premenná na odhad toxicity odvodená zo všetkých meraných premenných opisujúcich biomasu rôznymi metódami výpočtu. V prípade tejto testovacej metódy sú závislými premennými rýchlosti rastu a výťažok, ktoré sú odvodené od meraných premenných, ako je počet lístkov, listová plocha, hmotnosť v čerstvom stave alebo sušina.

 

Semistatický (obnovovací) test je test, v ktorom sa testovací roztok počas testu pravidelne nahrádza v stanovených intervaloch.

 

Statický test je testovacia metóda bez obnovy testovacieho roztoku počas testu.

 

Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy.

 

Konečný parameter testu znamená všeobecný faktor, ktorý sa testovanou chemikáliou v porovnaní s kontrolnou vzorkou zmení ako cieľ testu. V prípade tejto testovacej metódy je konečným parametrom inhibícia rastu, ktorá sa dá vyjadriť rôznymi závisle premennými veličinami reakcie založenými na jednej alebo viacerých meraných premenných.

 

Testovacie médium je kompletné syntetické rastové médium, v ktorom rastú testovacie rastliny vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie. Testovaná chemikália sa spravidla rozpustí v testovacom médiu.

 

Výťažok je rozdiel hodnoty meranej premennej, ktorá vyjadruje množstvo biomasy, na konci expozície a hodnoty meranej premennej na jej začiatku.

Dodatok 2

Opis rodu Lemna

Vodná rastlina bežne nazývaná žaburinka (Lemna spp.) patrí do čeľade Lemnaceae, ktorá má množstvo druhov rozšírených po celom svete v štyroch rodoch. Ich odlišný vzhľad a taxonómia sú dôkladne opísané v literatúre pod číslami (1) (2). Lemna gibba a Lemna minor sú druhy zastúpené v miernych pásmach a bežne sa používajú na testy toxicity. Obidva druhy majú plávajúcu alebo ponorenú byľ v tvare disku (lístok) a veľmi tenký koreň vychádzajúci zo stredu spodnej plochy každého lístka. Rastliny rodu Lemna zriedkavo vytvárajú kvety a rozmnožujú sa vegetatívne vytváraním nových lístkov (3). Mladšie rastliny v porovnaní so staršími bývajú bledšie, majú kratšie korene a skladajú sa z dvoch až troch lístkov rôznych veľkostí. Malá veľkosť rastliny Lemna, jej jednoduchá štruktúra, nepohlavné rozmnožovanie a krátky čas vývoja umožňujú, že rastliny tohto rodu sú veľmi vhodné na laboratórne testovanie (4) (5).

Vzhľadom na pravdepodobné medzidruhové rozdiely v citlivosti sú platné iba porovnania citlivosti v rámci jedného druhu.

Príklady druhov Lemna, ktoré sa používajú na testovanie: literatúra k jednotlivým druhom

 

Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

 

Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

 

Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft‘. EPA 712-C-96-156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).

 

Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., ‚Public draft‘. EPA 712-C-96-156. 8pp.

 

Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

 

Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

 

Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481- 483.

 

Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Zdroje druhov Lemna

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria

Department of Botany, University of Toronto

Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2

Tel: +1-416-978-3641

Fax:+1-416-978-5878

e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca

North Carolina State University

Forestry Dept

Duckweed Culture Collection

Campus Box 8002

Raleigh, NC 27695-8002

USA

phone 001 (919) 515-7572

astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University

SE-106 91

STOCKHOLM

ŠVÉDSKO

Tel: +46 8 674 7240

Fax +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA)

FG III 3.4

Schichauweg 58

12307 Berlin

NEMECKO

e-mail: lemna@uba.de

LITERATÚRA

1.

Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

2.

Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

3.

Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

4.

Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.

5.

Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.

Dodatok 3

Uchovávanie zásobnej kultúry

Zásobné kultúry sa môžu dlhší čas uchovávať pri nižších teplotách (4 – 10 oC) bez toho, aby ich bolo potrebné opätovne pripraviť. Rastové médium pre rastliny rodu Lemna môže byť rovnaké, ako sa používa na testovanie, ale pre zásobné kultúry sa môžu použiť iné médiá bohaté na živiny.

Pravidelne sa pomocou sterilných nástrojov premiestni množstvo mladých svetlozelených rastlín do nových kultivačných nádob obsahujúcich čerstvé médium. Pri nižšej teplote navrhnutej v tomto materiáli sa môže čiastočná kultivácia vykonávať až v trojmesačných intervaloch.

Mali by sa používať chemicky čisté (umyté v kyseline) a sterilné sklenené kultivačné nádoby a sterilné postupy. V prípade kontaminácie zásobnej kultúry, napríklad riasami alebo plesňami, je potrebné prijať opatrenia na odstránenie kontaminujúcich organizmov. V prípade rias a väčšiny iných kontaminujúcich organizmov je to možné docieliť povrchovou sterilizáciou. Odoberie sa vzorka kontaminovaného rastlinného materiálu a korienky sa odstrihnú. Následne sa materiál prudko pretrepe v čistej vode, následne sa ponorí do 0,5 % (v/v) roztoku chlórnanu sodného na 30 sekúnd až 5 minút. Rastlinný materiál sa potom opláchne sterilnou vodou a prenesie v niekoľkých dávkach do kultivačných nádob obsahujúcich čerstvé rastové médium. V dôsledku tohto postupu veľa lístkov uhynie, najmä ak sa použijú dlhšie expozičné časy, ale tie, ktoré prežijú, sú obvykle nekontaminované. Tieto sa môžu potom použiť na opätovné naočkovanie nových kultúr.

Dodatok 4

Médiá

Odporúčajú sa rôzne rastové médiá pre druhy L. minor a L. gibba. Pre L. minor sa odporúča modifikované médium podľa švédskej normy (SIS), zatiaľ čo pre L. gibba sa odporúča médium 20X AAP. Zloženia obidvoch médií sú uvedené nižšie. Pri príprave týchto médií sa musia použiť reagenty alebo chemikálie analytickej kvality a deionizovaná voda.

Rastové médium podľa švédskej normy (SIS) pre rastliny rodu Lemna

Zásobné roztoky I – V sa sterilizujú v autokláve (120 °C, 15 minút) alebo membránovou filtráciou (veľkosť pórov približne 0,2 μm).

Zásobný roztok VI (a voliteľne VII) sa sterilizuje iba membránovou filtráciou, nie je potrebné ho autoklávovať.

Sterilné zásobné roztoky by sa mali skladovať v chlade a tme. Zásobné roztoky I – V by sa mali vyradiť po šiestich mesiacoch, zatiaľ čo zásobný roztok VI (a voliteľne VII) má čas použiteľnosti jeden mesiac.

Číslo zásobného roztoku:

Látka

Koncentrácia v zásobnom roztoku

(g/l)

Koncentrácia v pripravenom médiu

(mg/ߦl)

Pripravené médium

 

 

 

 

Prvok

Koncentrácia

(mg/ߦl)

I

NaNO3

8,50

85

Na; N

32; 14

KH2PO4

1,34

13,4

K; P

6,0; 2,4

II

MgSO4 · 7H2O

15

75

Mg; S

7,4; 9,8

III

CaCl2 · 2H2O

7,2

36

Ca; Cl

9,8; 17,5

IV

Na2CO3

4,0

20

C

2,3

V

H3BO3

1,0

1,00

B

0,17

MnCl2 · 4H2O

0,20

0,20

Mn

0,056

Na2MoO4 · 2H2O

0,010

0,010

Mo

0,0040

ZnSO4 · 7H2O

0,050

0,050

Zn

0,011

CuSO4 · 5H2O

0,0050

0,0050

Cu

0,0013

Co(NO3)2 · 6H2O

0,010

0,010

Co

0,0020

VI

FeCl3 · 6H2O

0,17

0,84

Fe

0,17

Na2-EDTA 2H2O

0,28

1,4

VII

MOPS (tlmiaci roztok)

490

490

Na prípravu jedného litra média SIS sa do 900 ml deionizovanej vody pridá:

10 ml zásobného roztoku I,

5 ml zásobného roztoku II,

5 ml zásobného roztoku III,

5 ml zásobného roztoku IV,

1 ml zásobného roztoku V,

5 ml zásobného roztoku VI,

1 ml zásobného roztoku VII (voliteľné).

Poznámka: Ďalší zásobný roztok VII (tlmivý roztok MOPS) môže byť potrebný pre určité testované chemikálie (pozri bod 11).

Hodnota pH sa nastaví na 6,5 ± 0,2 pridaním 0,1 alebo 1 mol HCl alebo NaOH a objem sa doplní do jedného litra deionizovanou vodou.

Rastové médium 20X AAP

Zásobné roztoky sa pripravia v sterilnej destilovanej alebo deionizovanej vode.

Sterilné zásobné roztoky by sa mali skladovať v chlade a tme. V týchto podmienkach budú mať zásobné roztoky čas použiteľnosti minimálne 6 až 8 týždňov.

Pre médium 20X – AAP sa pripraví päť živných zásobných roztokov (A1, A2, A3, B a C) a použijú sa chemikálie reagenčnej kvality. Na prípravu rastového média sa pridá 20 ml každého živného zásobného roztoku do približne 850 ml deionizovanej vody. Hodnota pH sa nastaví na 7,5 ± 0,1 pridaním 0,1 alebo 1 mol HCl alebo NaOH a objem sa doplní do jedného litra deionizovanou vodou. Médium sa potom prefiltruje do sterilnej nádoby cez 0,2 μm (približne) membránový filter.

Rastové médium určené na testovanie by sa malo pripraviť jeden až dva dni pred použitím, aby sa stabilizovala hodnota pH. Pred použitím sa skontroluje pH rastového média a v prípade potreby sa znovu upraví pridaním 0,1 alebo 1 mol NaOH alebo HCl, ako sa uvádza vyššie.

Číslo zásobného roztoku:

Látka

Koncentrácia v zásobnom roztoku

(g/ߦl) (7)

Koncentrácia v pripravenom médiu

(mg/ߦl) (7)

Pripravené médium

 

 

 

 

Prvok

Koncentrácia

(mg/ߦl) (7)

A1

NaNO3

26

510

Na;N

190; 84

MgCl2 · 6H2O

12

240

Mg

58,08

CaCl2 · 2H2O

4,4

90

Ca

24,04

A2

MgSO4 · 7H2O

15

290

S

38,22

A3

K2HPO4 · 3H2.O

1,4

30

K;P

9,4; 3,7

B

H3BO3

0,19

3,7

B

0,65

MnCl2 · 4H2O

0,42

8,3

Mn

2,3

FeCl3 · 6H2O

0,16

3,2

Fe

0,66

Na2EDTA.2H2O

0,30

6,0

ZnCl2

3,3 mg/l

66 μg/l

Zn

31 μg/l

CoCl2 · 6H2O

1,4 mg/l

29 μg/l

Co

7,1 μg/l

Na2MoO4 · 2H2O

7,3 mg/l

145 μg/l

Mo

58 μg/l

CuCl2 · 2H2O

0,012 mg/l

0,24 μg/l

Cu

0,080 μg/l

C

NaHCO3

15

300

Na; C

220; 43

STEINBERGOVO médium (podľa normy ISO 20079)

Koncentrácie a zásobné roztoky

Modifikované Steinbergovo médium sa používa v rámci normy ISO 20079 len pre druh Lemna minor (lebo iba druh Lemna minor je v tomto prípade povolený), ale z testov vyplýva, že dobré výsledky je možné dosiahnuť aj s druhom Lemna gibba.

Pri príprave média by sa mali použiť chemikálie reagenčnej alebo analytickej kvality a deionizovaná voda.

Pripraví sa médium obsahujúce živiny zo zásobných roztokov alebo desaťnásobne koncentrované médium, ktoré umožňuje maximálnu koncentráciu média bez vyzrážania.

Tabuľka 1

STEINBERGOVO médium so stabilizovanou hodnotou pH (modifikované podľa Altenburgera)

Zložka

Médium obsahujúce živiny

makroprvky

molárna hmotnosť

mg/l

mmol/l

KNO3

101,12

350,00

3,46

Ca(NO3)2 · 4H2O

236,15

295,00

1,25

KH2PO4

136,09

90,00

0,66

K2HPO4

174,18

12,60

0,072

MgSO4 · 7H2O

246,37

100,00

0,41

mikroprvky

molárna hmotnosť

μg/l

μmol/l

H3BO3

61,83

120,00

1,94

ZnSO4 · 7H2O