32000L0045

Smernica Komisie 2000/45/ES

zo 6. júla 2000,

ktorou sa ustanovujú analytické metódy spoločenstva na stanovenie vitamínu A, vitamínu E a tryptofánu v krmivách

(Text s významom pre EHP)

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na smernicu Rady č. 70/373/EHS z 20. júla 1970 o zavádzaní metód spoločenstva pre odber vzoriek a analýz na kontrolu krmiva [1], naposledy zmenenou a doplnenou Aktom o pristúpení Rakúska, Fínska a Švédska [2], a najmä článok 2,

keďže:

(1) Smernica 70/373/EHS stanovuje, že úradné kontroly krmív s cieľom overenia zhody s požiadavkami vyplývajúcimi z právneho poriadku, právnych predpisov a správnych predpisov, ktoré určujú ich kvalitu a zloženie, sa musia vykonávať za použitia metód spoločenstva pre odber vzoriek a analýzu.

(2) Smernica Rady 70/524/EHS z 23. novembra 1970, ktorá sa týka prísad v potravinách [3], naposledy zmenená a doplnená nariadením Komisie (ES) č. 2439/1999 zo 17. novembra 1999 [4] stanovuje, že obsah vitamínu A a vitamínu E musí byť v prípade, ak sú pridané do zmesí a krmív, uvedený na označení.

(3) Smernica Rady 79/373/EHS z 2. apríla 1979, ktorá sa týka obchodovania s kombinovanými krmivami [5] naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2000/16/ES [6] smernicou Rady 93/74/EHS z 13. septembra 1993, ktorá sa týka krmív určených na osobitné výživové účely [7], naposledy zmenená a doplnená smernicou 96/25(ES) [8], stanovuje, aby na označení krmív boli uvedené aminokyseliny.

(4) Na kontrolu týchto látok sa musia ustanoviť analytické metódy spoločenstva.

(5) Opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre krmivá,

PRIJALA TÚTO SMERNICU:

Článok 1

Členské štáty zabezpečia, aby sa analýzy vykonané s cieľom úradných kontrol obsahu vitamínu A, vitamínu E a tryptofánu v krmivách a zmesiach vykonávali za použitia metód, ktoré sú uvedené v prílohe k tejto smernici.

Článok 2

Členské štáty najneskôr do 31. augusta 2000 prijmú zákony, iné právne predpisy a administratívne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s ustanoveniami tejto smernice. Bezodkladne budú o tom informovať Komisiu.

Tieto opatrenia sa budú uplatňovať od 1. septembra 2000.

Keď členské štáty prijmú tieto opatrenia, budú obsahovať odkaz na túto smernicu alebo budú doplnené o takýto odkaz v prípade ich oficiálneho uverejnenia. Členské štáty prijmú postupy na uskutočnenie takéhoto odkazu.

Článok 3

Táto smernica nadobudne účinnosť v dvadsiaty deň po uverejnení v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev.

Článok 4

Táto smernica je adresovaná členským štátom.

V Bruseli 6. júla 2000

Za Komisiu

David Byrne

Člen Komisie

[1] Ú. v. ES L 170, 3.8.1970, s. 2.

[2] Ú. v. ES C 241, 29.8.1994, s. 1.

[3] Ú. v. ES L 270, 14.12.1970, p. 1.

[4] Ú. v. ES L 297, 18.11.1999, s. 8.

[5] Ú. v. ES L 86, 6.4.1979, s. 30.

[6] Ú. v. ES L 105, 3.5.2000, s. 36.

[7] Ú. v. ES L 237, 22.9.1993, s. 23.

[8] Ú. v. ES L 125, 23.5.1996, s. 35.

--------------------------------------------------

PRÍLOHA

Časť A STANOVENIE VITAMÍNU A

1. Cieľ a rozsah

Táto metóda je určená na stanovenie vitamínu A (retinol) v krmivách a zmesiach. Vitamín A zahŕňa all-trans-retinyl alkohol a jeho cis-izoméry, ktoré sa stanovujú touto metódou. Obsah vitamínu A sa vyjadruje v medzinárodných jednotkách (IU) na kg. Jedna IU zodpovedá aktivite 0,300 μg all-trans-vitamín A alkoholu alebo 0,344 μg all-trans-vitamín A acetátu alebo 0,550 μg all-trans-vitamín A palmitátu.

Limit stanovenia je 2000 IU vitamínu A/kg.

2. Princíp

Vzorka sa hydrolyzuje etanolovým roztokom hydroxidu draselného a vitamín A sa extrahuje do petroléteru. Rozpúšťadlo sa odstráni odparením a zvyšok sa rozpustí v metanole a, ak je potrebné, zriedi sa na požadovanú koncentráciu. Obsah vitamínu A sa stanoví pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (RP-HPLC) prostredníctvom reverznej fázy za použitia UV detektora alebo fluorescenčného detektora. Parametre chromatografie sa nastavia tak, aby nedošlo k separácii all-trans-vitamín A alkoholu a jeho cis-izomérov.

3. Reagencie

3.1. Etanol, σ = 96 %

3.2. Petroléter, interval varu 40 až 60 °C

3.3. Metanol

3.4. Roztok hydroxidu draselného, β = 50 g/100 ml

3.5. Roztok askorbátu sodného, β = 10 g/100 ml (pozri Poznámky 7.7.)

3.6. Sírnik sodný, Na2S. x H2O (x = 7 – 9)

3.6.1. Roztok sírnika sodného, c = 0,5 mol/l v glycerole, β = 120 g/l (pre x = 9) (pozri Poznámky 7.8.)

3.7. Roztok fenolftaleinu, β = 2 g/100 ml v etanole (3.1.)

3.8. 2-propanol

3.9. Mobilná fáza pre HPLC: zmes metanolu (3.3.) a vody, napr. 980 + 20 (v + v). Presný pomer sa stanoví na základe charakteristík použitej kolóny.

3.10. Dusík bez obsahu kyslíka

3.11. All-trans-vitamín A acetát, najvyššej čistoty s potvrdenou aktivitou, napr. 2,80 x 106 IU/g

3.11.1. Zásobný roztok all-transacetátu vitamínu A (3.11.) do 100 ml kalibrovanej banky. Rozpusťte v 2-propanole (3.8.) a doplňte týmto rozpúšťadlom po značku. Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 1400 IU vitamínu A na ml. Presný obsah sa musí stanoviť podľa 5.6.3.1.

3.12. All-trans-vitamín A palmitát, najvyššej čistoty s potvrdenou aktivitou, napr. 1,80 x 106 IU/g

3.12.1. Zásobný roztok all-trans-vitamín A palmitátu: Navážte 80 mg s presnosťou 0,1 mg palmitátu vitamínu A (3.12.) do 100 ml kalibrovanej banky. Rozpusťte v 2-propanole (3.8.) a doplňte týmto rozpúšťadlom po značku. Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 1400 IU vitamínu A na ml. Presný obsah sa musí stanoviť podľa 5.6.3.2.

3.13. 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (pozri Poznámky 7.5.)

4. Aparatúra

4.1. Vákuová rotačná odparka

4.2. Nádoby z hnedého skla

4.2.1. 500 ml banky z plochým dnom alebo Erlenmeyerove banky so zábrusom

4.2.2. Kalibrované banky so zábrusovými zátkami, s úzkym hrdlom, 10, 25, 100 a 500 ml

4.2.3. Oddeľovacie lieviky, kónické, 1000 ml, so zábrusovými zátkami

4.2.4. Srdcové banky, 250 ml, so zábrusovými zátkami

4.3. Allihnov chladič, dĺžka plášťa 300 mm, so zábrusovým spojom, s prípojkou na prívod plynu

4.4. Skladaný filtračný papier na oddelenie fáz, priemer 185 mm (napr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. HPLC zariadenie so vstrekovacím systémom

4.5.1. Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 250 mm x 4 mm alebo ekvivalent, C18, 5 alebo 10 μm, alebo ekvivalent (kritérium výkonu: iba jediný pík pre všetky izoméry retinolu v podmienkach HPLC)

4.5.2. UV alebo fluorescenčný detektor s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou

4.6. Spektrofotometer s 10 mm kremíkovými kyvetami

4.7. Vodný kúpeľ s magnetickým miešadlom

4.8. Extrakčný prístroj (pozri obrázok 1) pozostávajúci zo:

4.8.1. skleného valca o objeme 1 l, so zábrusovým hrdlom a zátkou

4.8.2. zábrusového nástavca s bočným ramenom a nastaviteľnou rúrkou prechádzajúcou cez stred. Nastaviteľná rúrka má mať spodný koniec v tvare písmena U a dýzu na opačnom konci tak, aby sa vrchná vrstva kvapaliny vo valci dala premiestniť do oddeľovacieho lievika.

5. Postup

Poznámka:

Vitamín A je citlivý na UV svetlo a oxidáciu. Všetky činnosti sa majú prevádzať bez prítomnosti svetla (používať hnedé sklo alebo sklo obalené alumíniovou fóliou) a kyslíka (v prúde dusíka). Počas extrakcie sa má vzduch nad kvapalinou nahradiť dusíkom (zabráňte nadbytočnému tlaku občasným uvoľňovaním zátky).

5.1. Príprava vzorky

Zomeľte opatrne vzorku na takú jemnosť, aby prešla 1 mm otvormi sita, pričom zabráňte vytváraniu tepla. Mletie sa musí uskutočniť tesne pred vážením a zmydelnením, inak môžu nastať straty vitamínu A.

5.2. Zmydelnenie

Na základe obsahu vitamínu A navážte s presnosťou na 0,01 g, 2 až 25 g vzorky do 500 ml banky s plochým dnom alebo Erlenmeyerovej banky (4.2.1.). Postupne pridávajte za miešania 130 ml etanolu (3.1.), približne 100 mg BHT (3.13.), 2 ml roztoku askorbátu sodného (3.5.) a 2 ml roztoku sírnika sodného (3.6.). Pripevnite chladič (4.3.) k banke a ponorte banku do vodného kúpeľa s magnetickým miešadlom (4.7.). Zahrejte až po var a nechajte 5 minút refluxovať. Potom pridajte cez chladič (4.3.) 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4.) a nechajte za miešania a slabého prúdu dusíka refluxovať ďalších 25 min. Potom vypláchnite chladič približne 20 ml vody a ochlaďte obsah banky na teplotu miestnosti.

5.3. Extrakcia

Zmydelňovací roztok dekantáciou kvantitatívne preneste vymytím 250 ml vody do 1000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3.) alebo do extrakčného prístroja (4.8.). Vymyte zmydelňovaciu banku postupne 25 ml etanolu (3.1.) a 100 ml petroléteru (3.2.) a preneste tieto kvapaliny do oddeľovacieho lievika alebo do extrakčného prístroja. Podiel vody a etanolu v roztokoch má byť okolo 2:1. Intenzívne 2 minúty trepte a nechajte ustáť 2 minúty.

5.3.1. Extrakcia na oddeľovacom lieviku (4.2.3.)

Keď sa vrstvy oddelili (pozri poznámky 7.3.), preneste vrstvu petroléteru do ďalšieho oddeľovacieho lievika (4.2.3.). Zopakujte túto extrakciu dvakrát so 100 ml petroléteru (3.2.) a dvakrát s 50 ml petroléteru (3.2.).

Premyte spojené extrakty v oddeľovacom lieviku jemným vírivým pohybom (na zabránenie vytvorenia emulzie) dvakrát po 100 ml vody, a potom opakovaným trepaním s ďalšími 100 ml dávkami vody, až kým po pridaní roztoku fenolftaleínu (3.7.) nebude voda bezfarebná (štvornásobné premytie je obvykle postačujúce). Premytý extrakt prefiltrujte do 500 ml kalibrovanej banky cez suchý skladaný filter na oddeľovanie fáz (4.4.), aby sa odstránila všetka suspendovaná voda (4.2.2.). Oddeľovací lievik a filter vymyte 50 ml petroléteru (3.2.), doplňte petroléterom (3.2.) po značku a dobre zamiešajte.

5.3.2. Extrakcia na extrakčnom prístroji (4.8.)

Po oddelení vrstiev (pozri poznámku 7.3.) vymeňte zátku skleného valca (4.8.1.) za zábrusový nástavec (4.8.2.) a nastavte spodný koniec nastaviteľnej rúrky v tvare písmena U tak, aby bola tesne nad úrovňou rozhrania. Tlakom z prívodu dusíka do bočného ramena preneste vrchnú vrstvu petroléteru do 1000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3.). Pridajte 100 ml petroléteru (3.2.) do skleného valca, zazátkujte a dobre zatraste. Nechajte oddeliť vrstvy a vrchnú vrstvu preneste opäť do oddeľovacieho lievika. Opakujte extrakciu s ďalšími 100 ml petroléteru (3.2.), potom dvakrát po 50 ml petroléteru (3.2.) a vrstvy petroléteru dajte do oddeľovacieho lievika.

Premyte spojené extrakty petroléteru, ako je popísané v 5.3.1. a postupujte podľa uvedeného návodu.

5.4. Príprava roztoku vzorky pre HPLC

Napipetujte alikvotnú časť roztoku petroléteru (z 5.3.1. alebo 5.3.2.) do 250 ml srdcovej banky (4.2.4.). Odparte rozpúšťadlo takmer dosucha na rotačnej odparke (4.1.) za zníženého tlaku pri teplote kúpeľa nepresahujúcej 40 °C. Obnovte atmosferický tlak prídavkom dusíka (3.10.) a odpojte banku z rotačnej odparky. Odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.10.) a zvyšok ihneď rozpusťte v známom objeme (10 – 100 ml) metanolu (3.3.) (koncetrácia vitamínu A má byť v rozmedzí 5 IU/ml až 30 IU/ml).

5.5. Stanovenie na HPLC

Vitamín A sa oddelí na C18 kolóne s reverznou fázou (4.5.1.) a koncentrácia sa meria UV detektorom (325 nm) alebo fluorescenčným detektorom (excitácia: 325 nm, emisia: 475 nm) (4.5.2.).

Vstreknite alikvotnú časť (napr. 20 μl) roztoku metanolu pripraveného podľa 5.4. a vymyte mobilnou fázou (3.9.). Vypočítajte priemernú výšku píku (plochu) z niekoľkých vstreknutí toho istého roztoku vzorky a priemernú výšku píkov (plôch) z niekoľkých vstreknutí kalibračných roztokov.

Podmienky HPLC

Na účely usmernenia sa poskytujú nasledovné špecifikácie, iné špecifikácie sa môžu použiť za predpokladu, že poskytnú rovnocenné výsledky.

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.5.1.): | 250 mm x 4 mm, C18, 5 alebo 10 μm balenie alebo ekvivalent |

Mobilná fáza (3.9.): | zmes metanolu (3.3.) a vody, napr. 980 + 20 (v + v) |

Prietoková rýchlosť: | 1 - 2 ml/min |

Detektor (4.5.2.): | UV detector (325 nm) alebo fluroscenčný detektor (excitácia: 325 nm, emisia: 475 nm) |

5.6. Kalibrácia

5.6.1. Príprava pracovných štandardných roztokov

Napipetujte 20 ml zásobného roztoku vitamín A acetátu (3.11.1.) alebo 20 ml zásobného roztoku vitamín A palmitátu (3.12.1) do 500 ml banky s plochým dnom alebo Erlenmeyerovej banky (4.2.1.) a hydrolyzujte, ako je popísané v 5.2., ale nepridávajte BHT. Potom extrahujte petroléterom (3.2.) podľa 5.3. a doplňte petroléterom do 500 ml (3.2.). Odparte 100 ml tohto roztoku na rotačnej odparke (pozri 5.4.) takmer dosucha, odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.10.) a zvyšok opäť rozpusťte v 10,0 ml metanolu (3.3.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 560 IU vitamínu A na ml. Presný obsah sa musí stanoviť podľa 5.6.3.3. Pracovný štandardný roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím.

Napipetujte 2,0 ml tohto pracovného štandardného roztoku do 20 ml kalibrovanej banky, doplňte metanolom po značku (3.3.) a zamiešajte. Nominálna koncentrácia tohto zriedeného pracovného štandardného roztoku je 56 IU vitamínu A na ml.

5.6.2. Príprava kalibračných roztokov a kalibračná krivka

Preneste postupne 1,0, 2,0, 5,0 a 10,0 ml zriedeného pracovného štandardného roztoku do 20 ml kalibrovaných baniek, doplňte metanolom po značku (3.3.) a zamiešajte. Nominálna koncentrácia týchto roztokov je 2,8, 5,6, 14,0 and 28,0 IU vitamínu A na ml.

Vstreknite 20 μl každého kalibračného roztoku niekoľkokrát a stanovte priemernú výšku píkov (plôch). Utvorte kalibračnú krivku za použitia priemerných výšok píkov (plôch) pri zohľadnení výsledkov UV kontroly (5.6.3.3.).

5.6.3. UV kontrola štandardných roztokov

5.6.3.1. Zásobný roztok vitamín A acetátu

Napipetujte 2,0 ml zásobného roztoku vitamín A acetátu (3.11.1.) do 50 ml kalibrovanej banky (4.2.2.), doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 56 IU vitamínu A na ml. Napipetujte 3,0 ml tohto zriedeného roztoku vitamín A acetátu do 25 ml kalibrovanej banky, doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 6,72 IU vitamínu A na ml. V spektrofotometri (4.6.) zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti 2-propanolu (3.8.) v rozmedzí 300 nm a 400 nm. Extinčné maximum musí ležať medzi 325 nm a 327 nm.

Výpočet obsahu vitamínu A:

+++++ TIFF +++++

5.6.3.2. Zásobný roztok vitamín A palmitátu

Napipetujte 2,0 ml zásobného roztoku vitamín A palmitátu (3.12.1.) do 50 ml kalibrovanej banky (4.2.2.), doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 56 IU vitamínu A na ml. Napipetujte 3,0 ml tohto zriedeného roztoku vitamín A palmitátu do 25 ml kalibrovanej banky, doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 6,72 IU vitamínu A na ml. V spektrofotometri (4.6.) zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti 2-propanolu (3.8.) v rozmedzí 300 nm a 400 nm. Extinčné maximum musí ležať medzi 325 nm a 327 nm.

Výpočet obsahu vitamínu A:

+++++ TIFF +++++

5.6.3.3. Vitamín A pracovný štandardný roztok

Napipetujte 5,0 ml tohto roztoku do 25 ml kalibrovanej banky a doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 6,72 IU vitamínu A na ml. V spektrofotometri (4.6.) zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti 2-propanolu (3.8.) v rozmedzí 300 nm a 400 nm. Extinčné maximum musí ležať medzi 325 nm a 327 nm.

Výpočet obsahu vitamínu A:

+++++ TIFF +++++

6. Výpočet výsledkov

Stanovte koncentráciu roztoku vzorky v IU/ml za použitia kalibračnej krivky (5.6.2.) z priemernej výšky (plôch) píkov vitamínu A z roztoku vzorky.

Obsah vitamínu A w v IU/kg vzorky je daný nasledovným vzorcom:

w =

500 . β . V

. 1000

V

. m

kde:

β = koncentrácia vitamínu A v roztoku vzorky (5.4.) v IU/ml

V1 = objem roztoku vzorky (5.4.) v ml

V2 = objem alikvotnej časti z 5.4. v ml

m = hmotnosť testovanej dávky v g

7. Poznámky

7.1. V prípade vzoriek s nízkou koncentráciou vitamínu A môže byť užitočné spojiť extrakty petroléteru z dvoch dávok zmydelnenia (navážené: 25 g) na jeden roztok vzorky pre stanovenie na HPLC.

7.2. Hmotnosť vzorky odobratej na analýzu nesmie obsahovať viac ako 2 g tuku.

7.3. Ak nedôjde k oddeleniu fáz, pridajte približne 10 ml etanolu (3.1.) na odstránenie emulzie.

7.4. V prípade rybieho tuku a iných čistých tukov sa má doba zmydelnenia predĺžiť na 45 – 60 minút.

7.5. Namiesto BHT sa môže sa použiť hydrochinón.

7.6. Separácia izomérov retinolu na bežnej kolóne je možná.

7.7. Namiesto roztoku askorbátu sodného sa môže použiť približne 150 g askorbovej kyseliny.

7.8. Namiesto roztoku sírnika sodného sa môže použiť približne 50 g EDTA.

8. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení uskutočnených na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 15 % vzhľadom k vyššej hodnote.

9. Výsledky kruhového testu [1]

L : počet laboratórií

n : počet jednotlivých hodnôt

sr : štandardná odchýlka opakovateľnosti

sR : štandardná odchýlka reprodukovateľnosti

r : opakovateľnosť

R : reprodukovateľnosť

CVr : koeficient zmeny opakovateľnosti

CVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti

| Zmes | Zmesné krmivo | Minerálny koncentrát | Proteínové krmivo | Krmivo pre prasiatka |

L | 13 | 12 | 13 | 12 | 13 |

n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49 |

priemer [IU/kg] | 17,02 x 106 | 1,21 x 106 | 537100 | 151800 | 18070 |

sr [IU/kg] | 0,51 x 106 | 0,039 x 106 | 22080 | 12280 | 682 |

r [IU/kg] | 1,43 x 106 | 0,109 x 106 | 61824 | 34384 | 1910 |

CVr [IU/kg] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8 |

SR [IU/kg] | 1,36 | 0,069 x 106 | 46300 | 23060 | 3614 |

R [IU/kg] | 3,81 x 106 | 0,193 x 106 | 129640 | 64568 | 10119 |

CVR [IU/kg] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20 |

+++++ TIFF +++++

ČASŤ B STANOVENIE VITAMÍNU E

1. Cieľ a rozsah

Táto metóda je určená na stanovenie vitamínu E v krmivách a zmesiach. Obsah vitamínu E sa vyjadruje ako mg DL-α-tokoferol acetátu na kg. 1 mg DL-α-tokoferol acetátu zodpovedá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamín E).

Limit stanovenia je 2 mg vitamínu E/kg.

2. Princíp

Vzorka sa hydrolyzuje etanolovým roztokom hydroxidu draselného a vitamín E sa extrahuje do petroléteru. Rozpúšťadlo sa odstráni odparením a zvyšok sa rozpustí v metanole a, ak je potrebné, zriedi sa na požadovanú koncentráciu. Obsah vitamínu E sa stanoví pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (RP-HPLC) s reverznou fázou za použitia fluorescenčného detektora alebo UV detektora.

3. Reagencie

3.1. Etanol, σ = 96 %

3.2. Petroléter, interval varu 40 – 60 °C

3.3. Metanol

3.4. Roztok hydroxidu draselného, β = 50 g/100 ml

3.5. Roztok askorbátu sodného, β = 10 g/100 ml (pozri poznámky 7.7.)

3.6. Sírnik sodný, Na2S. x H2O (x = 7 – 9)

3.6.1. Roztok sírnika sodného, c = 0,5 mol/l v glycerole, β = 120 g/l (pre x = 9) (pozri poznámky 7.8.)

3.7. Roztok fenolftaleinu, β = 2 g/100 ml v etanole (3.1.)

3.8. Mobilná fáza pre HPLC: zmes metanolu (3.3.) a vody, napr. 980 + 20 (v + v). Presný pomer sa stanoví na základe charakteristík použitej kolóny.

3.9. Dusík bez obsahu kyslíka

3.10. DL-α-tokoferol acetát najvyššej čistoty s potvrdenou aktivitou

3.10.1. Zásobný roztok DL-α-tokoferol acetátu: Navážte s presnosťou 0,1 mg, 100 mg DL-α-tokoferol acetátu (3.10.) do 100 ml kalibrovanej banky. Rozpusťte v etanole (3.1.) a doplňte týmto rozpúšťadlom po značku. 1 ml tohto roztoku obsahuje 1 mg DL-α-tokoferol acetátu. (UV kontrola pozri 5.6.1.3.; stabilizácia pozri poznámky 7.4.).

3.11. DL-α-tokoferol najvyššej čistoty s potvrdenou aktivitou

3.11.1. Navážte s presnosťou 0,1 mg, 100 mg DL-α-tokoferolu (3.10.) do 100 ml kalibrovanej banky. Rozpusťte v etanole (3.1.) a doplňte týmto rozpúšťadlom po značku. 1 ml tohto roztoku obsahuje 1 mg DL-α-tokoferolu. (UV kontrola pozri 5.6.2.3.; stabilizácia pozri poznámky 7.4.).

3.12. 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (pozri poznámky 7.5.)

4. Aparatúra

4.1. Vákuová rotačná odparka

4.2. Nádoby z hnedého skla

4.2.1. 500 ml banky z plochým dnom alebo Erlenmeyerove banky so zábrusom

4.2.2. Kalibrované banky so zábrusovými zátkami, s úzkym hrdlom, 10, 25, 100 a 500 ml

4.2.3. Oddeľovacie lieviky, kónické, 1000 ml, so zábrusovými zátkami

4.2.4. Srdcové banky, 250 ml, so zábrusovými zátkami

4.3. Allihnov chladič, dĺžka plášťa 300 mm, so zábrusovým spojom, s prípojkou na prívod plynu

4.4. Skladaný filtračný papier na oddelenie fáz, priemer 185 mm (napr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. HPLC zariadenie so vstrekovacím systémom

4.5.1. Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 250 mm x 4 mm, C18, 5 alebo 10 μm balenie alebo ekvivalent

4.5.2. Fluorescenčný alebo UV detektor s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou

4.6. Spektrofotometer s 10 mm kremíkovými kyvetami

4.7. Vodný kúpeľ s magnetickým miešadlom

4.8. Extrakčný prístroj (pozri obrázok 1) pozostávajúci zo:

4.8.1. skleného valca o objeme 1 l, so zábrusovým hrdlom a zátkou

4.8.2. zábrusového nástavca s bočným ramenom a nastaviteľnou rúrkou prechádzajúcou cez stred. Nastaviteľná rúrka má mať spodný koniec v tvare písmena U a dýzu na opačnom konci tak, aby sa vrchná vrstva kvapaliny vo valci dala premiestniť do oddeľovacieho lievika.

5. Postup

Poznámka:

Vitamín E je citlivý na UV svetlo a oxidáciu. Všetky činnosti sa musia vykonávať bez prítomnosti svetla (používať hnedé sklo alebo sklo obalené alumíniovou fóliou) a kyslíka (v prúde dusíka). Počas extrakcie sa vzduch nad kvapalinou má nahradiť dusíkom (zabráňte nadbytočnému tlaku občasným uvoľňovaním zátky).

5.1. Príprava vzorky

Zomeľte opatrne vzorku na takú jemnosť, aby prešla 1 mm otvormi sita, pričom zabráňte vytváraniu tepla. Mletie sa musí uskutočniť tesne pred vážením a zmydelnením, inak môžu nastať straty vitamínu E.

5.2. Zmydelnenie

Na základe na obsahu vitamínu E navážte s presnosťou na 0,01 g, 2 až 25 g vzorky do 500 ml banky s plochým dnom alebo Erlenmeyerovej banky (4.2.1.). Postupne pridávajte za miešania 130 ml etanolu (3.1.), približne 100 mg BHT (3.12.), 2 ml roztoku askorbátu sodného (3.5.) a 2 ml roztoku sírnika sodného (3.6.). Pripevnite chladič (4.3.) k banke a ponorte banku do vodného kúpeľa s magnetickým miešadlom (4.7.). Zahrejte až po var a nechajte 5 minút refluxovať. Potom pridajte cez chladič (4.3.) 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4.) a nechajte za miešania a slabého prúdu dusíka refluxovať ďalších 25 min. Potom vypláchnite chladič približne 20 ml vody a ochlaďte obsah banky na laboratórnu teplotu.

5.3. Extrakcia

Zmydelňovací roztok dekantáciou kvantitatívne preneste vymytím 250 ml vody do 1000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3.) alebo do extrakčného prístroja (4.8.). Vymyte zmydelňovaciu banku postupne 25 ml etanolu (3.1.) a 100 ml petroléteru (3.2.) a preneste tieto kvapaliny do oddeľovacieho lievika alebo do extrakčného prístroja. Podiel vody a etanolu v roztokoch má byť okolo 2:1. Intenzívne 2 minúty trepte a nechajte stáť 2 minúty.

5.3.1. Extrakcia na oddeľovacom lieviku (4.2.3.)

Keď sa vrstvy oddelili (pozri poznámky 7.3.), preneste vrstvu petroléteru do ďalšieho oddeľovacieho lievika (4.2.3.). Zopakujte túto extrakciu dvakrát so 100 ml petroléteru (3.2.) a dvakrát s 50 ml petroléteru (3.2.).

Premytý extrakt prefiltrujte do 500 ml kalibrovanej banky cez suchý skladaný filter na oddeľovanie fáz (4.4.), aby sa odstránila všetka suspendovaná voda (4.2.2.). Oddeľovací lievik a filter vymyte 50 ml petroléteru (3.2.), doplňte petroléterom (3.2.) po značku a dobre zamiešajte.

5.3.2. Extrakcia na extrakčnom prístroji (4.8.)

Po oddelení vrstiev (pozri poznámku 7.3.) vymeňte zátku skleného valca (4.8.1.) za zábrusový nástavec (4.8.2.) a nastavte spodný koniec nastaviteľnej rúrky v tvare písmena U tak, aby bola tesne nad úrovňou rozhrania. Tlakom z prívodu dusíka do bočného ramena preneste vrchnú vrstvu petroléteru do 1000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3.). Pridajte 100 ml petroléteru (3.2.) do skleného valca, zazátkujte a dobre zatraste. Nechajte oddeliť vrstvy a vrchnú vrstvu preneste opäť do oddeľovacieho lievika. Opakujte extrakciu s ďalšími 100 ml petroléteru (3.2.), potom dvakrát po 50 ml petroléteru (3.2.) a vrstvy petroléteru dajte do oddeľovacieho lievika.

Premyte spojené extrakty petroléteru, ako je popísané v 5.3.1. a postupujte podľa uvedeného návodu.

5.4. Príprava roztoku vzorky pre HPLC

Napipetujte alikvotnú časť roztoku petroléteru (z 5.3.1. alebo 5.3.2.) do 250 ml srdcovej banky (4.2.4.). Odparte rozpúšťadlo takmer dosucha na rotačnej odparke (4.1.) za zníženého tlaku pri teplote kúpeľa nepresahujúcej 40 °C. Obnovte atmosferický tlak prídavkom dusíka (3.9.) a odpojte banku z rotačnej odparky. Odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.9.) a zvyšok ihneď rozpusťte v známom objeme (10 – 100 ml) metanolu (3.3.) (koncentrácia DL-α-tokoferolu má byť v rozmedzí 5 μg/ml až 30 μg/ml).

5.5. Stanovenie na HPLC

Vitamín E sa oddelí na C18 kolóne s reverznou fázou (4.5.1.) a koncentrácia sa meria fluorescenčným detektorom (excitácia: 295 nm, emisia: 330 nm) alebo UV detektorom (292 nm) (4.5.2.).

Vstreknite alikvotnú časť (napr. 20 μl) roztoku metanolu pripraveného podľa 5.4. a vymyte mobilnou fázou (3.8.). Vypočítajte priemernú výšku píkov (plôch) z niekoľkých vstreknutí toho istého roztoku vzorky a priemernú výšku píkov (plôch) z niekoľkých vstreknutí kalibračných roztokov.

Podmienky HPLC

Na účely usmernenia sa poskytujú nasledovné špecifikácie, iné špecifikácie sa môžu použiť za predpokladu, že poskytnú rovnocenné výsledky.

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.5.1.): | 250 mm x 4 mm, C18, 5 alebo 10 μm balenie alebo ekvivalent |

Mobilná fáza (3.8.): | zmes metanolu (3.3.) a vody, napr. 980 + 20 (v + v) |

Prietoková rýchlosť: | 1 – 2 ml/min |

Detektor (4.5.2.). | Fluorescenčný detektor (excitácia: 295 nm, emisia: 330 nm) alebo UV detektor (292 nm) |

5.6. Kalibrácia (DL-α-tokoferol acetát alebo DL-α-tokoferol)

5.6.1. Štandard DL-α-tokoferol acetátu

5.6.1.1. Príprava pracovného štandardného roztoku

Napipetujte 25 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1.) do 500 ml banky s plochým dnom alebo Erlenmeyerovej banky (4.2.1.) a hydrolyzujte, ako je uvedené v 5.2. Potom extrahujte petroléterom (3.2.) podľa 5.3. a doplňte petroléterom do 500 ml. Odparte 25 ml tohto roztoku na rotačnej odparke (pozri 5.4.) takmer dosucha, odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.9.) a zvyšok opäť rozpusťte v 25,0 ml metanolu (3.3.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 45,5 μg DL-α-tokoferolu na ml, ekvivalent k 50 μg DL-α-tokoferolu acetátu na ml. Pracovný kalibračný roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím.

5.6.1.2. Príprava kalibračných roztokov a kalibračná krivka

ml kalibrovaných baniek, doplňte po značku metanolom (3.3.) a zamiešajte. Nominálna koncentrácia týchto roztokov je 2,5, 5,0, 10,0 and 25,0 μg/ml, t. j. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml and 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.

Vstreknite 20 μl každého kalibračného roztoku niekoľkokrát a stanovte priemernú výšku píkov (plôch). Zostavte kalibračnú krivku použitím priemerných výšok píkov (plôch).

5.6.1.3 UV kontrola zásobného roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1.)

Zrieďte etanolom 5,0 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1.) na 25,0 ml a zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti etanolu (3.1.) v spektrofotometri (4.6.) v rozmedzí 250 nm a 320 nm.

Absorpčné maximum má byť pri 284 nm:

+++++ TIFF +++++

Pri tomto zriedení sa má dosiahnuť extinčná hodnota 0,84 až 0,88.

5.6.2. Štandard DL-α-tokoferolu

5.6.2.1. Príprava pracovného štandardného roztoku

Napipetujte 2,0 ml zásobného roztoku DL-α-tocopherolu (3.11.1.) do 50 ml kalibrovanej banky, rozpusťte v metanole (3.3.) a doplňte po značku metanolom. Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 40 μg DL-α-tokoferolu na ml, ekvivalent k 44,0 μg DL-α-tokoferolu acetátu na ml. Pracovný kalibračný roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím.

5.6.2.2. Príprava kalibračných roztokov a kalibračná krivka

ml kalibrovaných baniek, doplňte po značku metanolom (3.3.) a zamiešajte. Nominálna koncentrácia týchto roztokov je 2,0, 4,0, 8,0 and 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, t. j. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml a 22,0 μg/ml DL-α-tokoferolu acetátu.

Vstreknite 20 μl každého kalibračného roztoku niekoľkokrát a stanovte priemernú výšku píkov (plôch). Zostavte kalibračnú krivku použitím priemerných výšok píkov (plôch).

5.6.2.3. UV kontrola zásobného roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1.)

Zrieďte etanolom 2,0 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1.) na 25,0 ml a zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti etanolu (3.1.) v spektrofotometri (4.6.) v rozmedzí 250 nm a 320 nm. Absorpčné maximum má byť pri 292 nm:

+++++ TIFF +++++

Pri tomto zriedení sa má dosiahnuť extinčná hodnota 0,6.

6. Výpočet výsledkov

Stanovte koncentráciu roztoku vzorky v μg/ml (vypočítané ako α-tokoferol acetát) za použitia kalibračnej krivky (5.6.1.2 alebo 5.6.2.2) z priemernej výšky píku (plochy) vitamínu E z roztoku vzorky.

Obsah vitamínu E w v mg/kg vzorky je daný nasledovným vzorcom:

+++++ TIFF +++++

kde:

β = koncentrácia vitamínu E v roztoku vzorky (5.4.) v μg/ml

V1 = objem roztoku vzorky (5.4.) v ml

V2 = objem alikvotnej časti z 5.4. v ml

m = hmotnosť testovanej dávky v g

7. Poznámky

7.1. V prípade vzoriek s nízkou koncentráciou vitamínu E môže byť užitočné spojiť extrakty petroléteru z dvoch dávok zmydelnenia (navážené: 25 g) na jeden roztok vzorky pre stanovenie na HPLC.

7.2. Hmotnosť vzorky odobratej na analýzu nesmie obsahovať viac ako 2 g tuku.

7.3. Ak nedôjde oddeleniu fáz, pridajte približne 10 ml etanolu (3.1.) na odstránenie emulzie.

7.4. Po spektrofotometrickom meraní DL-α-tokoferol acetátu alebo roztoku DL-α-tokoferolu podľa 5.6.1.3. alebo 5.6.2.3 pridajte približne 10 mg BHT (3.12.) do roztoku (3.10.1. alebo 3.10.2.) a udržujte roztok v chladničke (doba uskladnenia je maximálne štyri týždne).

7.5. Namiesto BHT sa môže sa použiť hydrochinón.

7.6. Separácia α-, β-, χ-, δ- tokoferolu na bežnej kolóne je možná.

7.7. Namiesto roztoku askorbátu sodného sa môže použiť približne 150 g kyseliny askorbovej.

7.8. Namiesto roztoku sírnika sodného sa môže použiť približne 50 mg EDTA.

8. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 15 % vzhľadom k vyššej hodnote.

9. Výsledky kruhového testu [2]

L : počet laboratórií

n : počet jednotlivých hodnôt

sr : štandardná odchýlka opakovateľnosti

sR : štandardná odchýlka reprodukovateľnosti

r : opakovateľnosť

R : reprodukovateľnosť

CVr : koeficient zmeny opakovateľnosti

CVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti

| Zmes | Zmesné krmivo | Minerálny koncentrát | Proteínové krmivo | Krmivo pre prasiatka |

L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |

n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48 |

priemer [mg/kg] | 17380 | 1187 | 926 | 315 | 61,3 |

sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3 |

r [mg/kg] | 1075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4 |

CVr [%] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8 |

sR [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8 |

R [mg/kg] | 2324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8 |

CVR [%] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7 |

+++++ TIFF +++++

Časť C STANOVENIE TRYPTOFÁNU

1. Cieľ a rozsah

Táto metóda je určená na stanovenie celkového a voľného tryptofánu v krmivách. Nerozlišuje D- a L- formy.

2. Princíp

Na účely stanovenia celkového tryptofánu sa vzorka hydrolyzuje v alkalickom prostredí saturovaným roztokom hydroxidu barnatého a pri 110 °C sa vypaľuje 20 hodín. Po hydrolýze sa pridá interný štandard.

Na účely stanovenia voľného tryptofánu sa vzorka extrahuje v mierne kyslom prostredí za prítomnosti interného štandardu.

Tryptofán a interný štandard v hydrolyzáte alebo extrakte sa stanovia fluorescenčnou detekciou za použitia HPLC.

3. Reagencie

3.1. Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (konduktivita < 10 μS/cm)

3.2. Štandard: tryptofán (čistota/obsah 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným

3.3. Interný štandard: α-methyl-tryptofán (čistota/obsah 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným

3.4. Oktahydrát hydroxidu barnatého (Ba(OH)2 · 8H2O sa nesmie nechať dlho na vzduchu, aby sa nevytváral BaCO3, ktorý môže pôsobiť rušivo pri stanovení (pozri poznámky 9.3.).

3.5. Hydroxid sodný

3.6. Kyselina orto-fosforečná, w = 85 %

3.7. Kyselina chlorovodíková, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8. Metanol, HPLC kvalita

3.9. Petroléter, interval varu 40 – 60 °C

3.10. Roztok hydroxidu, c = 1 mol/l:

Rozpusťte 40,0 g NaOH (3.5.) vo vode a doplňte do 1 l (3.1.).

3.11. Kyselina chlorovodíková, c = 6 mol/l:

492 ml HCl (3.7.) doplňte do 1 l vodou.

3.12. Kyselina chlorovodíková, c = 1 mol/l:

82 ml HCl (3.7.) doplňte do 1 l vodou.

3.13. Kyselina chlorovodíková, c = 0,1 mol/l:

8,2 ml HCl (3.7.) doplňte do 1 l vodou.

3.14. Kyselina orto-fosforečná, c = 0,5 mol/l:

34 ml orto-fosforečnej kyseliny (3.6.) doplňte do 1 l vodou (3.1.)

3.15. Koncentrovaný roztok tryptofánu (3.2.), c = 2,50 μmol/ml:

V 500 ml odmernej banke rozpusťte 0,2553 g tryprofánu (3.2.) v kyseline chlorovodíkovej (3.13.) a doplňte po značku kyselinou chlorovodíkovou (3.13.). Skladujte pri – 18 °C maximálne štyri týždne.

3.16. Koncentrovaný roztok interného štandardu, c = 2,50 μmol/ml:

Skladujte pri - 18 °C maximálne štyri týždne.

3.17. Kalibračný štandardný roztok tryptofánu a interného štandardu:

Vezmite 2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15.) a 2,00 ml koncentrátu roztoku interného štandardu (α-metyl-tryptofán) (3.16.). Zrieďte vodou (3.1.) a metanolom (3.8.) na približne rovnaký objem a rovnakú koncentráciu metanolu (10 – 30 %), ako má konečný hydrolyzát.

Tento roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím.

Počas prípravy chráňte pred priamym slnečným svetlom.

3.18. Kyselina octová

3.19. 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanol

3.20. Etanolamín > 98 %

3.21. Roztok 1 g 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19.) v 100 ml metanolu (3.8.)

3.22. Mobilná fáza pre HPLC: Roztok 3,00 g octovej kyseliny (3.18.) + 900 ml vody (3.1.) + 50,0 ml roztoku (3.21.) 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19.) v metanole (3.8.) (1 g/100 ml). Etanolamínom (3.20.) upravte pH na 5,00. Doplňte do 1000 ml vodou (3.1.).

4. Aparatúra

4.1. HPLC zariadenie so spektrofluorimetrickým detektorom

4.2. Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 125 mm x 4 mm, C18, 3 μm balenie alebo ekvivalent

4.3. pH-meter

4.4. Polypropylénová banka, objem 125 ml so širokým hrdlom a závitovým uzáverom

4.5. Membránový filter, 0,45 μm

4.6. Autokláv, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar

4.7. Mechanická trepačka alebo magnetické miešadlo

4.8. Vortexové miešadlo

5. Postup

5.1. Príprava vzoriek

Vzorka sa zomelie na takú veľkosť, aby prešla 0,5 mm otvormi v site. Vlhké vzorky sa musia buď vysušiť pri teplote nepresahujúcej 50 °C alebo pred zomletím lyofilizovať. Vzorky obsahujúce vysoký obsah tuku sa majú pred zomletím extrahovať petroléterom (3.9.).

5.2. Stanovenie voľného tryptofánu (extrakt)

Navážte do 250 ml Erlenmeyerovej banky s presnosťou 1 mg príslušné množstvo (1 - 5 g) pripravenej vzorky (5.1.). Pridajte 100,0 ml kyseliny chlorovodíkovej, c = 0,1 mol/l (3.13.) a 5,00 ml roztoku koncentrovaného interného štandardu (3.16.). Trepte alebo miešajte 60 min. na mechanickej trepačke alebo magnetickom miešadle (4.7.). Nechajte usadiť a napipetujte do kadičky 10,0 ml roztoku supernatantu. Pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej, c = 0,5 mol/l (3.14.). Upravte na pH 3,0 hydroxidom sodným, c = 1,0 mol/l (3.10.). Pridajte dostatočné množstvo metanolu (3.8.) na dosiahnutie koncentrácie v rozmedzí 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky príslušný objem a zrieďte vodou na objem potrebný pre chromatografiu (približne rovnaký objem, ako má kalibračný štandardný roztok (3.17.).

Pred vstreknutím do HPLC kolóny prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5.). Postupujte po chromatografické stanovenie podľa odseku 5.4.

Chráňte štandardný roztok a extrakty pred priamym slnečným svetlom. Nie je možné analyzovať extrakty v ten istý deň, extrakty sa môžu skladovať pri 5 °C maximálne tri dni.

5.3. Stanovenie celkového tryptofánu (hydrolyzát)

Navážte do polypropylénovej banky (4.4.) s presnosťou 0,2 mg od 0,1 do 1 g pripravenej vzorky (5.1.). Navážená dávka vzorky má mať obsah dusíka okolo 10 mg. Pridajte 8,4 g oktahydrátu hydroxidu barnatého (3.4.) a 10 ml vody. Zamiešajte na vortexovom miešadle (4.8.) alebo magnetickom miešadle (4.7.). Ponechajte teflónový magnet v zmesi. Zmyte steny nádoby 4 ml vody. Nasaďte závitový uzáver a voľne uzavrite banku. Preneste do autoklávu (4.6.) s horúcou vodou a parou na 30 – 60 minút. Zatvorte autokláv a autoklávujte 20 hodín pri 110 (± 2) °C.

Pred otvorením autoklávy znížte teplotu tesne pod 100 °C. Pridajte teplú zmes 30 ml vody, ktorá má teplotou miestnosti, aby ste zabránili kryštalizácii Ba(OH)2 · 8 H2O. Jemne zatraste alebo zamiešajte. Pridajte 2,00 ml koncentrovaného interného roztoku štandardu (α-methyl-tryptofán) (3.16.). Ochlaďte nádoby v kúpeli voda/ľad na 15 minút.

Potom pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej, c = 0,5 mol/l (3.14.). Ponechajte nádobu v chladiacom kúpeli a neutralizujte HCl, c = 6 mol/l (3.11.) za miešania a upravte pH na 3,0 pomocou HCl, c = 1 mol/l (3.12.). Pridajte dostatočné množstvo metanolu na dosiahnutie koncentrácie v rozmedzí 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky príslušný objem a zrieďte vodou na objem potrebný pre chromatografiu (napr. 100 ml). Prídavok metanolu by nemal spôsobiť precipitáciu.

Pred vstreknutím do HPLC kolóny prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5.). Postupujte po chromatografické stanovenie podľa odseku 5.4.

Chráňte štandardný roztok a hydrolyzáty pred priamym slnečným svetlom. Hydrolyzáty nie je možné analyzovať v ten istý deň, môžu sa skladovať pri 5 °C maximálne tri dni.

5.4. Stanovenie za použitia HPLC

Na účely usmernenia sa poskytujú nasledovné špecifikácie pre izokratickú elúciu, iné špecifikácie sa môžu použiť za predpokladu, že poskytnú rovnocenné výsledky (pozri poznámky 9.1. a 9.2.):

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.2.): | 125 mm x 4 mm, C18, 3 μm balenie alebo ekvivalent |

Teplota kolóny: | Teplota miestnosti |

Mobilná fáza (3.22.): | Roztok 3,00 g kyseliny octovej (3.18.) + 900 ml vody (3.1.) + 50,0 ml roztoku (3.21.) 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19.) v metanole (3.8.) (1 g/100 ml). Etanolamínom (3.20.) upravte pH na 5,00. Doplňte do 1000 ml vodou (3.1.). |

Prietoková rýchlosť: | 1 ml/min |

Celková doba priebehu: | približne 34 min |

Vlnová dĺžka detektora: | excitácia: 280 nm, emisia: 356 nm |

Vstrekovaný objem: | 20 μl |

6. Výpočet výsledkov

+++++ TIFF +++++

A = plocha píku interného štandardu, kalibračný štandardný roztok (3.17.)

B = plocha píku tryptofánu, extrakt (5.2.) alebo hydrolyzát (5.3.)

C = kalibračnému roztoku (3.17.)

D = koncentrácia v μmol/ml (= 2,50) koncentrovaného tryptofánového roztoku (3.15.) pridaného ku kalibračnému roztoku (3.17.)

E = extrakcii (5.2.) (= 5,00 ml) alebo k hydrolyzátu (5.3.) (= 2,00 ml)

F = plocha píku interného štandardu, extrakt (5.2.) alebo hydrolyzát (5.3.)

G = plocha píku tryptofánu, kalibračný štandardný roztok (3.17.)

H = objem v ml (= 2,00 ml) koncentrovaného interného štandardného roztoku (3.16.) pridaného ku kalibračnému roztoku (3.17.)

W = hmotnosť vzorky v g (prepočítaná na pôvodnú hmotnosť, ak bola vysušená alebo zbavená tuku.

MW = molekulárna hmotnosť tryptofánu (= 204,23)

7. Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % vzhľadom k najvyššej hodnote.

8. Výsledky kruhového testu

Pri kruhovom teste spoločenstva (štvrtý porovnávací test) až 12 laboratórií analyzovalo tri vzorky s cieľom potvrdenia hydrolyzačnej metódy. Každá vzorka sa analyzovala viackrát (5). Výsledky sú uvedené v nasledovnej tabuľke:

L : počet laboratórií poskytujúcich výsledky

n : počet jednotlivých výsledkov získaný elimináciou extrémnych hodnôt (získané Cochranovým a Dixonovým testom pre extrémne hodnoty)

sr : štandardná odchýlka opakovateľnosti

sR : štandardná odchýlka reprodukovateľnosti

r : opakovateľnosť

R : reprodukovateľnosť

CVr : koeficient zmeny opakovateľnosti, %

CVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti, %

| Vzorka 1 Krmivo pre ošípané | Vzorka 2 Krmivo pre ošípané s L - tryptofánom | Vzorka 3 Koncentrát krmiva pre ošípané |

L | 12 | 12 | 12 |

n | 50 | 55 | 50 |

priemer [g/kg] | 2,42 | 3,40 | 4,22 |

sr [g/kg] | 0,05 | 0,05 | 0,08 |

r [g/kg] | 0,14 | 0,14 | 0,22 |

CVr [%] | 1,9 | 1,6 | 1,9 |

sR [g/kg] | 0,15 | 0,20 | 0,09 |

R [g/kg] | 0,42 | 0,56 | 0,25 |

CVR [%] | 6,3 | 6,0 | 2,2 |

Pri kruhovom teste spoločenstva (tretí porovnávací test) až 13 laboratórií analyzovalo dve vzorky s cieľom potvrdenia metódy na extrakciu voľného tryptofánu. Každá vzorka sa analyzovala viackrát (5x). Výsledky sú uvedené v nasledovnej tabuľke:

L : počet laboratórií poskytujúcich výsledky

n : počet jednotlivých výsledkov získaných elimináciou extrémnych hodnôt (získané Cochranovým a Dixonovým testom pre extrémne hodnoty)

sr : štandardná odchýlka opakovateľnosti

sR : štandardná odchýlka reprodukovateľnosti

r : opakovateľnosť

R : reprodukovateľnosť

CVr : koeficient zmeny opakovateľnosti, %

CVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti, %

| Vzorka 1 Zmes pšenice a sóje | Vzorka 2 Zmes pšenice a sóje (vzorka 4) s prídavkom tryptofánu (0,457 g/kg) |

L | 12 | 12 |

n | 55 | 60 |

priemer [g/kg] | 0,391 | 0,931 |

sr [g/kg] | 0,005 | 0,012 |

r [g/kg] | 0,014 | 0,034 |

CVr [%] | 1,34 | 1,34 |

sR [g/kg] | 0,018 | 0,048 |

R [g/kg] | 0,050 | 0,134 |

CVR [%] | 4,71 | 5,11 |

Vykonal sa ďalší porovnávací test, kde až 7 laboratórií analyzovalo štyri vzorky s cieľom potvrdenia metódy hydrolýzu tryptofánu. Výsledky sú uvedené nižšie. Každá vzorka sa analyzovala päťkrát.

L : počet laboratórií poskytujúcich výsledky

n : počet jednotlivých výsledkov získaných elimináciou extrémnych hodnôt (získané Cochranovým a Dixonovým testom pre extrémne hodnoty

sr : štandardná odchýlka opakovateľnosti

sR : štandardná odchýlka reprodukovateľnosti

r : opakovateľnosť

R : reprodukovateľnosť

CVr : koeficient zmeny opakovateľnosti, %

CVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti, %

| Vzorka 1 (Zmiešané krmivo pre ošípané) (CRM 117) | Vzorka 2 Rybia múčka s nízkym obsahom tuku (CRM 118) | Vzorka 3 Sójová múčka (CRM 119) | Vzorka 4 Sušené odstredené mlieko (CRM 120) |

L | 7 | 7 | 7 | 7 |

n | 25 | 30 | 30 | 30 |

priemer [g/kg] | 2,064 | 8,801 | 6,882 | 5,236 |

sr [g/kg] | 0,021 | 0,101 | 0,089 | 0,040 |

r [g/kg] | 0,059 | 0,283 | 0,249 | 0,112 |

CVr [%] | 1,04 | 1,15 | 1,30 | 0,76 |

sR [g/kg] | 0,031 | 0,413 | 0,283 | 0,221 |

R [g/kg] | 0,087 | 1,156 | 0,792 | 0,619 |

CVR [%] | 1,48 | 4,69 | 4,11 | 4,22 |

9. Poznámky

9.1. Nasledovné špeciálne chromatografické podmienky môžu poskytnúť lepšiu separáciu tryptofánu a α-methyl-tryptofánu.

Izokratická elúcia nasleduje po prečistení kolóny gradientom:

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu: | 125 mm x 4 mm, C18, 5 μm balenie alebo ekvivalent |

Teplota kolóny: | 32 °C |

Mobilná fáza: | A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V + V) B: Metanol |

Zostava gradientu: | 0 min | 100 % A | 0 % B |

15 min | 100 % A | 0 % B |

17 min | 60 % A | 40 % B |

19 min | 60 % A | 40 % B |

21 min | 100 % A | 0 % B |

33 min | 100 % A | 0 % B |

Prietoková rýchlosť: | 1,2 ml/min |

Celková doba priebehu: | približne 33 min |

9.2. Chromatografia sa môže odlišovať v závislosti na type HPLC a použitého balenia kolóny. Vybratý systém musí mať schopnosť poskytnúť základnú líniu separácie medzi tryptofánom a interným štandardom. Ďalej je dôležité, aby degradačné produkty boli dobre oddelené od tryptofánu a interného štandardu. Hydrolyzáty bez interného štandardu sa majú analyzovať, aby sa analyzovala základná línia na nečistoty pod internými štandardami. Je dôležité, aby bola doba priebehu dostatočne dlhá na elúciu všetkých degradačných produktov, v opačnom prípade môžu elučné píky interferovať s následnými chromatografickými priebehmi.

V rozsahu svojej činnosti má chromatografický systém poskytovať lineárnu odozvu. Lineárna odozva sa má merať konštantnou (bežnou) koncentráciu interného štandardu a meniacimi sa koncentráciami tryptofánu. Je dôležité, aby veľkosť píkov tryptofánu a interného štandardu boli v rámci lineárneho rozsahu HPLC/fluorescenčného systému. Ak je (sú) píky tryptofánu a/alebo interného štandardu príliš malé alebo vysoké, analýza sa má opakovať pri inej veľkosti vzorky a/alebo zmenenom konečnom objeme.

9.3. Hydroxid barnatý

Čím je hydroxid barnatý starší, tým sa ťažšie rozpúšťa. Toto môže viesť k tomu, že stanovenie na HPLC môže poskytnúť nízke hodnoty tryptofánu.

[1] Uskutočnené pracovnou skupinou pre potraviny Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

[2] Uskutočnené pracovnou skupinou pre potraviny Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

--------------------------------------------------