(1)

În partea A, se adaugă următorul capitol:

„A.25   CONSTANTE DE DISOCIERE ÎN APĂ (METODA DE TITRARE – METODA SPECTROFOTOMETRICĂ – METODA CONDUCTOMETRICĂ)

INTRODUCERE

Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea nr. 112 (1981).

Premise

Informații orientative

Declarații eligibile

Documente standard

Această metodă de testare se bazează pe metode indicate în referințele enumerate în secțiunea „Referințe bibliografice” și în documentul Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA, 18 august 1978.

METODA – INTRODUCERE, SCOP, DOMENIU DE APLICARE, RELEVANȚĂ, APLICARE ȘI LIMITE ALE TESTĂRII

Disocierea unei substanțe în apă este importantă pentru evaluarea impactului acesteia asupra mediului. Aceasta condiționează forma substanței care, la rândul său, determină comportamentul și transportul acesteia. Aceasta poate afecta adsorbția substanței chimice pe soluri și sedimente și absorbția în celule biologice.

Definiții și unități

Disocierea este divizarea reversibilă în două sau mai multe specii chimice care pot fi ionice. Procesul este indicat în general prin

RX ⇌ R ++ X –

iar constanta de echilibru a concentrației care reglementează reacția este

De exemplu, în cazul special în care R este hidrogen (substanța este un acid), constanta este

sau

Substanțe de referință

Următoarele substanțe de referință nu este necesar să fie folosite în toate cazurile în care se studiază o substanță nouă. Acestea sunt furnizate, în principal, pentru a permite calibrarea periodică a metodei și pentru a oferi posibilitatea comparării rezultatelor atunci când se aplică o altă metodă.

Ar fi util să se dispună de o substanță cu mai multe pK astfel cum se indică în secțiunea „Principiul metodei” de mai jos. O astfel de substanță ar putea fi:

Principiul metodei de testare

Procesul chimic descris este în general doar în mică măsură dependent de temperatură, în intervalul de temperatură relevant din punct de vedere al mediului. Determinarea constantei de disociere necesită o măsură a concentrațiilor formelor disociate și nedisociate ale substanței chimice. Pe baza cunoștințelor privind stoichiometria reacției de disociere indicate mai sus în secțiunea „Definiții și unități”, poate fi determinată constanta adecvată. În cazul specific descris în prezenta metodă de testare, substanța se comportă ca un acid sau ca o bază, iar determinarea se efectuează cel mai convenabil prin stabilirea concentrațiilor relative ale formelor ionizate și neionizate ale substanței și a pH-ului soluției. Relația dintre acești termeni este redată în ecuația pentru pKa în secțiunea „Definiții și unități” de mai sus. Unele substanțe prezintă mai mult de o constantă de disociere și ecuații similare pot fi dezvoltate. Unele dintre metodele descrise în prezenta anexă sunt adecvate, de asemenea, pentru disocierea non-acidă/bază.

Criterii de calitate

Repetabilitate

Constanta de disociere se reproduce (cel puțin trei determinări) cu o precizie de ± 0,1 unități logaritmice.

DESCRIEREA PROCEDURILOR DE TESTARE

Există două abordări principale pentru determinarea pKa-ului. Una dintre acestea implică titrarea unei cantități cunoscute de substanță cu un acid sau o bază standard, după caz; cealaltă implică determinarea concentrației relative a formelor ionizate și neionizate și a dependenței acesteia de pH.

Preparate

Metodele bazate pe principiile menționate pot fi clasificate ca proceduri de titrare, spectrofotometrice și conductometrice.

Soluții de testare

Pentru metoda de titrare și metoda conductometrică, substanța chimică se dizolvă în apă distilată. Pentru metoda spectrofotometrică și pentru alte metode, sunt utilizate soluții tampon. Concentrația substanței testate nu trebuie să depășească cea mai mică valoare dintre 0,01 M sau jumătate din concentrația de saturare, iar pentru crearea soluțiilor se utilizează cea mai pură formă disponibilă de substanță. În cazul în care substanța este greu solubilă, aceasta se poate dizolva într-o cantitate mică de solvent miscibil în apă înainte de a se adăuga la concentrațiile indicate mai sus.

Soluțiile se verifică pentru a detecta prezența emulsiilor cu ajutorul unui fascicul Tyndall, în special în cazul în care a fost utilizat un cosolvent pentru a crește solubilitatea. În cazul în care sunt utilizate soluții tampon, concentrația tampon nu trebuie să depășească 0,05 M.

Condițiile de testare

Temperatura

Temperatura se controlează la cel puțin ± 1 °C. Determinarea se efectuează de preferință la 20 °C.

În cazul în care se suspectează o dependență semnificativă de temperatură, determinarea se efectuează la cel puțin două alte temperaturi. În acest caz, intervalele de temperatură trebuie să fie de 10 °C, iar controlul temperaturii, de ± 0,1 °C.

Analize

Metoda va fi determinată de natura substanței testate. Aceasta trebuie să fie suficient de sensibilă pentru a permite determinarea diferitelor tipuri la fiecare concentrație de soluție testată.

Desfășurarea testării

Metoda de titrare

Soluția de testat se determină prin titrare cu o soluție standard bazică sau acidă, după caz, măsurând pH-ul după fiecare adăugare de soluție de titrare. Cel puțin 10 adăugări suplimentare trebuie efectuate până la punctul de echivalență. În cazul în care echilibrul este atins suficient de rapid, se poate utiliza un potențiometru cu înregistrare. Pentru această metodă, atât cantitatea totală de substanță, cât și concentrația acesteia trebuie să fie cunoscute cu exactitate. Trebuie luate măsuri de precauție pentru a exclude dioxidul de carbon. Detaliile procedurii, măsurile de precauție, precum și metodele de calcul sunt prezentate în testări standard, de exemplu referințele bibliografice (1), (2), (3), (4).

Metoda spectrofotometrică

O lungime de undă este constatată în cazul în care formele ionizate și neionizate ale substanței au coeficienți de extincție diferiți în mod considerabil. Spectrul de absorbție UV/VIS se obține din soluții de concentrație constantă într-o condiție de pH în care substanța este în esență neionizată și pe deplin ionizată și la mai multe valori intermediare ale pH-ului. Acest lucru poate fi realizat fie prin adăugarea de acid concentrat (bază) la un volum relativ mare de soluție a substanței într-o soluție tampon cu mai multe componente, inițial cu valoare ridicată (scăzută) a pH-ului (referința 5) sau prin adăugarea de volume egale dintr-o soluție mamă de substanță în, de exemplu, apă, metanol, la volume constante de diferite soluții tampon care acoperă intervalul de pH dorit. Din valorile pH-ului și cele de absorbție la lungimea de undă aleasă, este calculat un număr suficient de valori de pKa utilizând datele pentru minim 5 pH-uri în care substanța este ionizată cel puțin 10 procente și cel mult 90 de procente. Detalii experimentale suplimentare și metoda de calcul sunt prezentate în referința (1).

Metoda conductometrică

Utilizând o celulă cu o constantă celulară mică, cunoscută, se măsoară nivelul de conductivitate al unei soluții de aproximativ 0,1 M de substanță de testat în apă de conductibilitate. De asemenea, se măsoară conductivitățile unei serii de diluții ale acestei soluții efectuate cu acuratețe. Concentrația este redusă la jumătate de fiecare dată, iar seria trebuie să acopere cel puțin un ordin de mărime al concentrației. Conductivitatea limită la diluție infinită se calculează prin efectuarea unui experiment similar cu sarea Na și prin extrapolare. Gradul de disociere poate fi calculat ulterior din conductivitatea fiecărei soluții cu ajutorul ecuației Onsage, prin urmare, utilizând legea diluției lui Ostwald, constanta de disociere poate fi calculată drept K = α2C/(1 – α, unde C este concentrația în moli pe litru și α este gradul de disociere. Trebuie luate măsuri de precauție pentru a exclude CO2. Detalii experimentale suplimentare și metoda de calcul sunt indicate în texte standard și în referințele (1), (6) și (7).

DATE ȘI RAPORTARE

Prelucrarea rezultatelor

Metoda de titrare

PKa se calculează pentru 10 puncte măsurate pe curba de titrare. Se calculează valoarea medie și deviația standard pentru valorile pKa respective. Se include un grafic al pH-ului în funcție de volumul de acid sau de bază standard, împreună cu o prezentare sub formă de tabel.

Metode spectrofotometrice

Valoarea absorbției și pH-ul pentru fiecare spectru sunt indicate în tabel. S unt calculate cel puțin cinci valori pKa pornind de la puncte intermediare de date privind spectrele, iar valoarea medie și deviația standard pentru aceste rezultate sunt calculate, de asemenea.

Metoda conductometrică

Conductivitatea echivalentă Λ se calculează pentru fiecare concentrație de acid și pentru fiecare concentrație a unui amestec cu un echivalent de acid la care se adaugă 0,98 echivalent de hidroxid de sodiu fără carbonați. Acidul este în exces pentru a preveni un exces de OH–datorat hidrolizei. 1/Λ este reprezentată în raport cu Ö_C, iar Λo a sării poate fi determinată prin extrapolare la concentrație zero.

Λo a acidului poate fi calculată utilizând valorile din literatura de specialitate pentru H+ și Na+. PKa poate fi calculată din α = Λi /Λo și Ka = α2C/(1 – α)pentru fiecare concentrație. Valori mai bune pentru Ka pot fi obținute prin efectuarea de corecții pentru mobilitate și activitate. Se calculează valoarea medie și deviația standard ale pKa.

Raport de testare

Toate datele primare și valorile calculate pKa trebuie prezentate împreună cu metoda de calcul (de preferință într-un format tabelar astfel cum se sugerează în referința 1), precum și parametrii statistici descriși mai sus. Pentru metodele de titrare, se prezintă detalii cu privire la standardizarea soluțiilor de titrare.

Pentru metoda spectrofotometrică, se prezintă toate spectrele. Pentru metoda conductometrică, se raportează detalii cu privire la determinarea constantei celulare. Se furnizează informații cu privire la tehnica utilizată, metodele de analiză și natura oricăror soluții tampon utilizate.

Se raportează temperatura (temperaturile) de testare.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

(2)

În partea B, capitolul B.5 se înlocuiește cu următorul text:

„B.5   COROZIUNE/IRITAȚIE OCULARĂ ACUTĂ

INTRODUCERE

Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE (TG) privind testarea nr. 405 (2012). Orientările OCDE privind testarea pentru testarea substanțelor chimice sunt revizuite periodic pentru a se asigura că acestea reflectă cele mai bune cunoștințe științifice disponibile. În revizuirile anterioare ale respectivei orientări privind testarea s-a acordat o atenție deosebită posibilelor îmbunătățiri prin evaluarea tuturor informațiilor existente cu privire la substanța chimică de testat pentru a se evita testarea inutilă pe animale de laborator și, prin urmare, pentru a aborda preocupările privind bunăstarea animală. TG 405 (adoptată în 1981 și actualizată în 1987, 2002 și 2012) include recomandarea ca, înainte de efectuarea testării in vivo descrise pentru coroziune/iritație oculară acută, să fie efectuată o analiză a valorii probante (1) a datelor existente relevante. În cazul în care datele disponibile sunt insuficiente, se recomandă ca acestea să fie dezvoltate prin aplicarea testării secvențiale (2) (3). Strategia de testare include efectuarea unor teste in vitro validate și acceptate și este prezentată ca o completare la această metodă de testare. În sensul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH) (2), o strategie de testare integrată este inclusă, de asemenea, în Orientarea ECHA relevantă (21). Testarea pe animale se efectuează doar în cazul în care se determină necesitatea acesteia, după ce se iau în considerare metodele alternative disponibile și prin utilizarea celor determinate a fi adecvate. La momentul redactării acestei metode de testare actualizate, există cazuri în care utilizarea acestei metode de testare este încă necesară sau impusă în temeiul unor cadre de reglementare.

Ultima actualizare s-a axat în principal pe utilizarea de analgezice și anestezice, fără a avea impact asupra conceptului de bază și asupra structurii orientării privind testarea. ICCVAM (3) și un grup științific independent și internațional de revizuire inter pares au analizat utilitatea și limitele utilizării în mod obișnuit de anestezice topice, analgezice sistemice și puncte finale umane în timpul testării de siguranță in vivo pentru iritația oculară (12). În urma evaluării, s-a constatat că utilizarea de anestezice topice și analgezice sistemice ar putea evita integral sau în mare parte durerea și suferința fără a afecta rezultatul testului și s-a recomandat utilizarea întotdeauna a acestor substanțe. Această metodă de testare ia în considerare revizuirea respectivă. Anestezicele topice, analgezicele sistemice și punctele finale umane sunt utilizate în mod obișnuit în timpul testării in vivo a iritației și coroziunii oculare acute. Excepțiile de la utilizarea acestora trebuie justificate. Îmbunătățirile descrise în prezenta metodă vor reduce în mod substanțial sau vor evita durerea și suferința animalelor în cele mai multe situații de testare în care testarea in vivo pentru siguranță oculară este încă necesară.

Gestionarea echilibrată și preemptivă a durerii trebuie să includă (i) un pretratament de rutină cu anestezic topic (de exemplu, proparacaină sau tetracaină) și un analgezic sistemic (de exemplu, buprenorfină), (ii) schema post-tratament de rutină a analgezicelor sistemice (de exemplu, buprenorfină și meloxicam), (iii) observarea, monitorizarea și înregistrarea planificată a animalelor pentru identificarea semnelor clinice de durere și/sau suferință și (iv) observarea, monitorizarea și înregistrarea planificată a naturii, gravității și evoluției tuturor leziunilor oculare. Mai multe detalii sunt furnizate în versiunea actualizată a procedurilor descrisă mai jos. După administrarea substanței chimice de testat nu se administrează anestezice topice sau analgezice suplimentare, în vederea evitării interferențelor cu studiul. Analgezicele cu acțiune antiinflamatorie (de exemplu, meloxicam) nu se aplică topic, iar dozele utilizate sistemic nu trebuie să interfereze cu efectele oculare.

Definițiile sunt prevăzute în apendicele la metoda de testare.

CONSIDERAȚII INIȚIALE

În interesul acurateței științifice și al bunăstării animalelor, testele in vivo nu trebuie luate în considerare până când toate datele relevante disponibile pentru potențialul de coroziune/iritație oculară al substanței chimice nu au fost evaluate într-o analiză a valorii probante a datelor. Astfel de date includ dovezi din studiile deja efectuate asupra oamenilor și/sau asupra animalelor de laborator, dovezi privind caracterul coroziv/iritant al uneia sau mai multor substanțe chimice înrudite structural sau ale unor amestecuri de astfel de substanțe, date demonstrând o puternică aciditate sau alcalinitate a substanței chimice (4) (5) și rezultatele validate și acceptate ale unor teste in vitro sau ex vivo de coroziune cutanată și de coroziune/iritație oculară (6) (13) (14) (15) (16) (17). Este posibil ca astfel de studii să fi fost efectuate înaintea sau ca urmare a unei analize a valorii probante a datelor.

Pentru anumite substanțe chimice, o astfel de analiză poate indica necesitatea efectuării unor studii in vivo privind potențialul de coroziune/iritație oculară al substanței chimice. În toate aceste cazuri, înainte de a lua în considerare efectuarea testului ocular in vivo, este de preferat să se efectueze mai întâi un studiu in vitro și/sau in vivo asupra efectelor de coroziune cutanată ale substanței chimice, studiu care ar trebui să fie evaluat în conformitate cu strategia de testare secvențială din metoda de testare B.4 (7) sau strategia de testare integrată descrisă în Orientarea ECHA (21).

O strategie de testare secvențială, care include efectuarea de teste validate in vitro sau ex vivo pentru coroziune/iritație oculară, este inclusă drept Supliment la această metodă de testare și, în scopul REACH, în Orientarea ECHA (21). Se recomandă aplicarea acestei strategii de testare înainte de efectuarea testului in vivo. Pentru substanțele chimice noi, se recomandă o abordare de testare graduală pentru obținerea unor date științifice exacte privind caracterul coroziv/iritant al substanței chimice. În cazul substanțelor chimice existente pentru care nu există date suficiente privind coroziunea/iritația cutanată și oculară, strategia poate fi utilizată pentru completarea datelor lipsă. Utilizarea unei strategii sau proceduri diferite de testare sau decizia de a nu utiliza o abordare de testare graduală trebuie justificate.

PRINCIPIUL TESTULUI IN VIVO

În urma unui pretratament cu un analgezic sistemic și după inducția adecvată a anesteziei topice, substanța chimică de testat se aplică, într-o singură doză, pe un ochi al animalului de laborator; celălalt ochi este utilizat drept martor. Nivelul de iritație/coroziune oculară se evaluează prin examinarea leziunilor care afectează conjunctiva, corneea și irisul, la intervale prestabilite. Se descriu, de asemenea, celelalte efecte asupra ochiului sau efecte sistemice adverse, pentru a asigura o evaluare completă a efectelor. Durata studiului trebuie să fie suficientă pentru a evalua reversibilitatea sau ireversibilitatea efectelor.

Animalele care manifestă semne de suferință și/sau dureri profunde în orice etapă a testului sau leziuni de tipul celor întâlnite în punctele finale umane descrise în această metodă de testare (a se vedea punctul 26) sunt eutanasiate, iar substanța chimică este evaluată în consecință. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere în condiții umane a animalelor muribunde sau suferinde fac obiectul unui document de orientare al OCDE (8).

PREGĂTIREA PENTRU TESTUL IN VIVO

Selectarea speciilor

Se utilizează, de preferat, exemplare adulte, tinere, sănătoase de iepure albinos. Utilizarea altor șușe sau specii trebuie justificată.

Pregătirea animalelor

Cu 24 de ore înainte de începerea testului, se examinează ambii ochi ai animalului de experiență selectat provizoriu. Nu se utilizează exemplarele care prezintă iritații sau defecte oculare sau leziuni corneene preexistente.

Condiții de adăpostire și de hrănire

Animalele se adăpostesc individual. În spațiul pentru adăpostirea animalelor de experiență se asigură o temperatură de 20 °C (± 3 °C) pentru iepuri. Cu toate că umiditatea relativă trebuie să fie de cel puțin 30 % și, de preferință, să nu depășească 70 % decât în timpul operațiunilor de curățare a sălii, obiectivul de umiditate este de 50-60 %. Spațiul se iluminează artificial, cu o alternanță de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Se evită intensitatea excesivă a luminii. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantități nelimitate de apă potabilă.

PROCEDURA DE TESTARE

Utilizarea de anestezice topice și analgezice sistemice

Următoarele proceduri sunt recomandate pentru a se evita sau reduce la minimum durerea și suferința în procedurile de testare pentru siguranță oculară. Procedurile alternative, care au fost determinate ca oferind aceeași sau o mai bună evitare sau combatere a durerii și suferinței, pot fi substituite.

Aplicarea substanței chimice de testat

Substanța chimică de testat se aplică în sacul conjunctival al unui ochi al fiecărui animal, după îndepărtarea delicată a pleoapei inferioare de pe globul ocular. Pleoapele se țin apoi lipite pentru circa o secundă, pentru a preveni pierderea materialului. Celălalt ochi, care nu se tratează, se utilizează ca martor.

Irigația

Ochii animalelor testate nu se spală timp de cel puțin 24 de ore de la instilația substanței chimice de testat, cu excepția cazului în care substanța este solidă (a se vedea punctul 18) și a cazului în care apar efecte corozive sau iritante imediate. După 24 de ore, se procedează la o spălare, dacă se consideră necesar.

Nu se recomandă utilizarea unui grup satelit de animale pentru a analiza influența spălării, cu excepția cazului în care acest lucru se justifică științific. În cazul în care este necesar un grup satelit, se folosesc doi iepuri. Se descriu detaliat condițiile de spălare, de exemplu momentul spălării; compoziția și temperatura soluției utilizate; durata, volumul și viteza de aplicare.

Nivelul dozei

(1)   Testarea lichidelor

Pentru testarea lichidelor se utilizează o doză de 0,1 ml. Nu se utilizează pulverizatoare cu pompă pentru instilarea substanței chimice direct în ochi. Se recomandă extragerea lichidului și colectarea acestuia într-un container înainte de instilarea a 0,1 ml în ochi.

(2)   Testarea solidelor

La testarea solidelor, a pastelor și a substanțelor sub formă de particule, cantitatea utilizată are un volum de 0,1 ml sau o greutate de cel mult 100 mg. Substanța chimică de testat se macină într-un praf fin. Volumul materialului solid se măsoară după o compactare delicată, de exemplu, bătând ușor cu palma recipientul de măsură. În cazul în care substanța chimică solidă de testat nu a fost îndepărtată din ochiul animalului de experiență prin mecanisme fiziologice în primul moment prestabilit de observare, și anume la o oră după tratament, ochiul poate fi spălat cu o soluție salină sau cu apă distilată.

(3)   Testarea aerosolilor

Se recomandă colectarea conținutului tuturor pulverizatoarelor cu pompă și aerosolilor înainte de instilarea în ochi. Singura excepție o constituie substanțele chimice în containere sub presiune pentru aerosoli, care nu pot fi colectate din cauza vaporizării. În acest caz, ochiul se ține deschis, iar substanța chimică de testat se administrează în ochi cu un singur jet de circa o secundă, de la o distanță de 10 cm perpendicular pe ochi. Distanța poate varia în funcție de presiunea pulverizatorului și conținutul acestuia. Se evită lezarea ochiului din cauza presiunii pulverizatorului. În unele cazuri, se poate dovedi necesar să se evalueze posibilitatea provocării unor leziuni „mecanice” ochiului prin forța pulverizatorului.

O estimare a dozei dintr-un aerosol poate fi efectuată simulând testul astfel: substanță chimică se pulverizează pe o bucată de hârtie de cântărit, printr-o deschidere de dimensiunea ochiului unui iepure amplasată direct în fața hârtiei. Cantitatea pulverizată în ochi se estimează pe baza creșterii greutății hârtiei. Pentru substanțele chimice volatile, doza poate fi estimată prin cântărirea unui recipient în care este pulverizată substanța, înainte și după îndepărtarea substanței chimice de testat.

Testul inițial (test in vivo de iritație/coroziune oculară pe un animal)

Se recomandă ca testul in vivo să se efectueze inițial pe un singur animal (a se vedea Suplimentul la prezenta metodă de testare: O strategie de testare secvențială pentru iritația și coroziunea oculară). Observațiile trebuie să permită determinarea gravității și a reversibilității înainte de a se trece la un test de confirmare pe un al doilea animal.

În cazul în care rezultatele acestui test indică faptul că substanța chimică este corozivă sau foarte iritantă la nivel ocular utilizându-se procedura descrisă, nu se efectuează teste suplimentare de iritație oculară.

Testul de confirmare (test in vivo de iritație oculară pe animale suplimentare)

În cazul în care nu se observă un efect coroziv sau sever iritant la testul inițial, reacția iritantă sau negativă se confirmă utilizând maximum alte două animale. În cazul în care se observă un efect iritant la testul inițial, se recomandă efectuarea testului de confirmare în mod secvențial, pe câte un animal, și nu prin expunerea simultană a celor două animale suplimentare. În cazul în care la al doilea animal apar efecte corozive sau puternic iritante, testul se întrerupe. În cazul în care rezultatele celui de-al doilea animal sunt suficiente pentru a permite determinarea clasificării pericolelor, nu se efectuează teste suplimentare.

Perioada de observație

Durata perioadei de observație trebuie să fie suficientă pentru evaluarea completă a amplorii și a reversibilității efectelor observate. Cu toate acestea, experimentul se încheie dacă animalul manifestă semne de suferință sau dureri profunde (8). Pentru a determina reversibilitatea efectelor, animalele se observă timp de 21 de zile după administrarea substanței chimice de testat. În cazul în care reversibilitatea intervine înainte de expirarea celor 21 de zile, experimentul se încheie în momentul respectiv.

Observații clinice și punctarea reacțiilor oculare

Ochii se supun unei evaluări cuprinzătoare pentru a stabili prezența sau absența leziunilor oculare la o oră după TCA, urmată de evaluări cel puțin zilnic. Animalele se evaluează de mai multe ori pe zi în primele 3 zile pentru a se asigura că deciziile de eutanasiere sunt luate în timp util. Animalele utilizate în scopuri experimentale se evaluează în mod regulat în timpul perioadei de studiu pentru identificarea semnelor clinice de durere și/sau suferință (de exemplu, lovirea repetată cu piciorul, frecarea repetată a ochiului, clipire excesivă, lacrimare excesivă) (9) (10) (11), cel puțin de două ori pe zi, cu un interval de minim 6 de ore între observații sau mai des, dacă este necesar. Acest lucru este necesar (i) pentru a evalua în mod corespunzător animalele pentru a identifica semne de durere și suferință cu scopul a lua decizii în cunoștință de cauză cu privire la necesitatea de a mări doza de analgezice și (ii) pentru a evalua animalele pentru a identifica criteriile finale umane stabilite cu scopul de a lua decizii în cunoștință de cauză cu privire la adecvarea eutanasierii animalelor și pentru a se asigura că aceste decizii sunt luate în timp util. Colorarea cu fluoresceină se utilizează în mod obișnuit, iar atunci când se consideră necesar, se utilizează un biomicroscop cu lampă cu fantă (de exemplu, pentru evaluarea profunzimii leziunilor atunci când ulcerarea corneană este prezentă) ca adjuvant pentru detectarea și măsurarea leziunilor oculare și pentru a se evalua dacă au fost îndeplinite criteriile finale stabilite pentru eutanasiere în condiții umane. Fotografii digitale ale leziunilor observate pot fi colectate pentru referință și pentru a oferi o înregistrare permanentă a gradului de leziune oculară. Animalele nu se mențin în experiment mai mult decât este necesar pentru obținerea unor informații concludente. Animalele care prezintă semne profunde de durere sau suferință sunt eutanasiate imediat în condiții umane, iar substanța se evaluează în consecință.

Animalele care după instilare prezintă următoarele leziuni oculare sunt eutanasiate în condiții umane (a se vedea tabelul 1 pentru o descriere a punctării leziunilor): perforare corneană sau ulcerare corneană semnificativă, inclusiv stafilom; sânge în camera anterioară a ochiului; opacitate corneană de gradul 4; absența reflexului fotomotor (reacție a irisului de gradul 2) care persistă timp de 72 de ore; ulcerare a membranei conjunctivale; necroză a conjunctivelor și a membranei nictitante; sau desprinderea țesutului necrozat. Eutanasierea se justifică deoarece astfel de leziuni sunt, în general, ireversibile. În plus, se recomandă ca următoarele leziuni oculare să fie utilizate ca puncte finale umane pentru a încheia studiile planificate înainte de sfârșitul perioadei de observație de 21 de zile. Aceste leziuni sunt considerate predictive de leziuni iritante și corozive grave și leziuni care nu se preconizează a fi complet reversibile până la sfârșitul perioadei de observație de 21 de zile: profunzime gravă a leziunii (de exemplu, ulcerare corneană care se extinde dincolo de straturile stromale superficiale), distrugere a limbului în proporție de peste 50 % (după cum reiese din albirea țesutului conjunctival) și infecția oculară gravă (scurgere purulentă). O combinație de: vascularizare a suprafeței corneene (de exemplu, panus); suprafața colorării cu fluoresceină care nu se micșorează în timp, pe baza evaluărilor zilnice; și/sau lipsa de reepitelizare 5 zile după aplicarea substanței chimice de testat ar putea fi considerată, de asemenea, drept criterii posibil utile pentru a influența decizia clinică de a încheia prematur un studiu. Cu toate acestea, astfel de constatări, luate în considerare individual, sunt insuficiente pentru a justifica încheierea prematură a studiului. Odată ce au fost identificate efecte oculare severe, se consultă un medic veterinar curant sau calificat, specializat pe animale de laborator, sau personalul instruit pentru a identifica leziunile clinice pentru a efectua un examen clinic cu scopul de a determina dacă o combinație a acestor efecte justifică încheierea prematură a studiului. Nivelurile reacției oculare (conjunctivă, cornee și iris) se obțin și se înregistrează la 1, 24, 48 și 72 de ore de la aplicarea substanței chimice de testat (tabelul 1). Animalele care nu prezintă leziuni oculare pot fi eutanasiate după cel puțin 3 zile de la instilare. Animale cu leziuni oculare care nu sunt atât de grave sunt supuse observației până la dispariția leziunilor sau timp de 21 de zile, moment în care studiul se încheie. Observațiile se efectuează și se înregistrează la un minim de 1 oră, 24 de ore, 48 de ore, 72 de ore, 7 zile, 14 zile și 21 de zile pentru a determina starea și reversibilitatea sau ireversibilitatea leziunilor. Observații mai frecvente se efectuează, dacă este necesar, pentru a stabili dacă animalul testat se eutanasiază din considerente umane sau este eliminat din studiu din cauza rezultatelor negative.

Nivelurile leziunilor oculare (tabelul 1) se înregistrează la fiecare examinare. Se înregistrează, de asemenea, orice altă leziune oculară (de exemplu, panus, colorare, modificări în camera anterioară) sau efecte sistemice adverse.

Pentru a facilita examinarea reacțiilor, se poate utiliza o lupă binoculară, o lampă portabilă cu fantă, un biomicroscop sau un alt dispozitiv adecvat. După înregistrarea observațiilor la 24 de ore, ochii pot fi examinați în continuare cu ajutorul fluoresceinei.

Punctarea reacțiilor oculare este, în mod evident, subiectivă. Pentru a promova armonizarea punctării reacțiilor oculare și pentru a veni în sprijinul laboratoarelor de testare și al persoanelor implicate în efectuarea și interpretarea observațiilor, personalul care efectuează observațiile trebuie să fie instruit corespunzător cu privire la sistemul de examinare utilizat.

DATE ȘI RAPORTARE

Evaluarea rezultatelor

Punctajele iritației oculare se evaluează în legătură cu natura și gravitatea leziunilor, precum și cu reversibilitatea sau ireversibilitatea acestora. Punctajele individuale nu reprezintă un standard absolut pentru proprietățile iritante ale unei substanțe chimice, întrucât se evaluează și alte efecte ale substanței chimice de testat. În schimb, punctajele individuale trebuie privite ca valori de referință și sunt semnificative doar dacă sunt însoțite de o descriere și o evaluare completă a tuturor observațiilor.

Raport de testare

Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații:

Interpretarea rezultatelor

Extrapolarea rezultatelor studiilor de iritație oculară asupra animalelor la oameni este valabilă doar într-o măsură restrânsă. În multe cazuri, iepurele albinos este mai sensibil decât oamenii la substanțe cu proprietăți iritante sau corozive la nivel ocular.

La interpretarea datelor se acordă o atenție deosebită excluderii iritației generate de infecții secundare.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

Tabelul 1

Punctarea leziunilor oculare

SUPLIMENT LA METODA DE TESTARE B.5  (4)

O STRATEGIE DE TESTARE SECVENȚIALĂ PENTRU IRITAȚIA ȘI COROZIUNEA OCULARĂ

Considerente generale

În interesul acurateței științifice și al bunăstării animalelor, este important să se evite utilizarea inutilă a animalelor de experiență și să se reducă la minimum testările care pot produce reacții grave la animale. Este necesar să se evalueze toate informațiile privind o substanță chimică care sunt relevante pentru potențialul caracter coroziv /iritant la nivel ocular al acesteia înainte de a lua în considerare testarea in vivo. Este posibil să existe deja date suficiente pentru clasificarea unei substanțe chimice de testat în ceea ce privește potențialul său coroziv sau iritant la nivel ocular, fără a mai fi necesar să se efectueze teste pe animale de laborator. Prin urmare, prin utilizarea unei analize a valorii probante a datelor și a unei strategii de testare secvențiale se reduce la minimum necesitatea de a efectua teste in vivo, în special dacă substanța chimică are potențialul de a produce reacții grave.

Se recomandă utilizarea unei analize a valorii probante a datelor pentru a evalua informațiile existente privind potențialul iritant și coroziv la nivel ocular al substanțelor chimice și pentru a se stabili dacă este necesară efectuarea unor studii suplimentare, altele decât studii oculare in vivo, pentru caracterizarea acestui potențial. Dacă sunt necesare studii suplimentare, se recomandă aplicarea strategiei de testare secvențiale pentru obținerea datelor experimentale relevante. Pentru substanțele care nu au fost testate anterior, se recomandă aplicarea strategiei de testare secvențiale pentru obținerea datelor necesare pentru evaluarea potențialului său coroziv/iritant la nivel ocular. Inițial, strategia de testare descrisă în prezentul supliment a fost dezvoltată în cadrul unui atelier de lucru OCDE (1). Ulterior, aceasta a fost susținută și extinsă în cadrul Sistemului armonizat integrat de clasificare a riscurilor substanțelor chimice pentru sănătatea oamenilor și mediu, adoptat la cea de a 28-a reuniune comună a Comitetului pentru substanțe chimice și a Grupului de lucru pentru substanțe chimice, în noiembrie 1998 (2), și actualizat de un grup de experți OCDE în anul 2011.

Cu toate că această strategie de testare nu face parte integrantă din metoda de testare B.5, aceasta reprezintă abordarea recomandată pentru determinarea caracteristicilor iritante/corozive la nivel ocular. Această abordare reprezintă atât cea mai bună practică, cât și un reper etic pentru testarea in vivo pentru iritație/coroziune oculară. Metoda de testare oferă indicații pentru efectuarea testului in vivo și rezumă factorii care trebuie evaluați înainte de un astfel de test. Strategia de testare secvențială oferă o abordare a valorii probante pentru evaluarea datelor existente privind proprietățile iritante/corozive la nivel ocular ale substanțelor chimice și o abordare graduală pentru generarea datelor relevante pentru substanțele chimice pentru care sunt necesare studii suplimentare sau care nu au făcut încă obiectul unor studii. Strategia include, într-o primă etapă, efectuarea unor teste in vitro sau ex vivo validate și acceptate, iar apoi aplicarea metodei de testare MT B.4 în condiții specifice (3) (4).

Descrierea strategiei de testare secvențiale

Înainte de efectuarea testelor incluse în strategia de testare secvențială (figură), se evaluează toate informațiile disponibile pentru a stabili dacă este necesară testarea oculară in vivo. Cu toate că se pot obține informații semnificative din evaluarea unor parametri specifici (de exemplu, o valoare extremă a pH-ului), se iau în considerare toate informațiile existente. Se evaluează toate datele relevante privind efectele substanței chimice în cauză și a analogilor săi pentru adoptarea unei decizii prin analiza valorii probante și se prezintă motivele care stau la baza deciziei. Se acordă o atenție specială datelor privind efectele substanței chimice asupra oamenilor și animalelor, urmate de rezultatele testelor in vitro sau ex vivo. Se evită, ori de câte ori este posibil, efectuarea unor studii in vivo pentru substanțele chimice corozive. Factorii luați în considerare în strategia de testare includ:

STRATEGIE DE TESTARE ȘI EVALUARE A IRITAȚIEI/COROZIUNII OCULARE

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

(3)

În partea B, capitolul B.10 se înlocuiește cu următorul text:

„B. 10.   Testul in vitro de aberație cromozomială pe celule de mamifere

INTRODUCERE

Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea nr. 473 a OCDE (2016). Acesta face parte dintr-o serie de metode de testare privind toxicologia genetică. A fost elaborat un document al OCDE care oferă informații succinte privind testarea pentru toxicologia genetică (1) și care trece în revistă modificările efectuate recent asupra orientărilor respective.

Scopul testului in vitro de aberație cromozomială este de a identifica substanțele chimice care provoacă aberații cromozomiale structurale în celulele de mamifere în cultură (2) (3) (4). Aberațiile structurale pot fi de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. Poliploidia (inclusiv endoreduplicarea) ar putea apărea în testele in vitro de aberație cromozomială. În timp ce substanțele aneugene pot determina poliploidie, poliploidia singură nu indică potențial aneugenic și poate indica pur și simplu perturbația ciclului celular sau citotoxicitate (5). Acest test nu este conceput pentru a măsura aneuploidia. Un test in vitro de micronucleu (6) ar fi recomandat pentru detectarea aneuploidiei.

Testul in vitro de aberație cromozomială poate să utilizeze culturi de linii celulare stabilite sau culturi de celule primare de origine umană sau de la rozătoare. Celulele utilizate se selectează în funcție de potențialul de dezvoltare în cultură, stabilitatea cariotipului (inclusiv numărul de cromozomi) și frecvența spontană a aberațiilor cromozomiale (7). În prezent, datele disponibile nu permit efectuarea de recomandări ferme, dar sugerează faptul că este important, atunci când se evaluează riscurile chimice, să se ia în considerare statutul p53, stabilitatea genetică (a cariotipului), capacitatea de regenerare a ADN-ului și originea celulelor (rozătoare versus umane) alese pentru testare. Utilizatorii acestei metode de testare sunt încurajați, prin urmare, să ia în considerare influența acestor și altor caracteristici ale celulelor privind performanța unei linii celulare în detectarea inducției de aberații cromozomiale, întrucât cunoștințele evoluează în acest domeniu.

Definițiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.

CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI LIMITĂRI

Testele efectuate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică, cu excepția cazului în care celulele sunt competente din punct de vedere metabolic în ceea ce privește substanțele chimice de testat. Sistemul exogen de activare metabolică nu reproduce integral condițiile in vivo. Trebuie acordată atenție pentru a evita condiții care ar putea conduce la rezultate pozitive date de artefacte, și anume, daune cromozomiale care nu sunt cauzate de interacțiunea directă dintre substanțele chimice de testat și cromozomi; astfel de condiții includ modificările de pH sau de osmolalitate (8) (9) (10), interacțiunea cu componenții din mediu (11) (12) sau valori excesive ale citotoxicității (13) (14) (15) (16).

Această testare este utilizată pentru a detecta aberațiile cromozomiale care pot rezulta din evenimente clastogene. Analiza inducției de aberații cromozomiale se realizează prin utilizarea de celule în metafază. Prin urmare, este esențial ca celulele să ajungă în mitoză atât în culturile tratate, cât și în cele netratate. În cazul nanomaterialelor fabricate, pot fi necesare adaptări specifice ale acestei metode de testare, dar care nu sunt descrise în prezentul document.

Înainte de utilizarea metodei de testare pe un amestec pentru a genera date pentru un obiectiv de reglementare specific, trebuie să se examineze dacă, iar în caz afirmativ, din ce cauză, aceasta poate oferi rezultate adecvate în acest scop. Astfel de considerații nu sunt necesare în cazul în care există o cerință normativă pentru testarea amestecului.

PRINCIPIUL TESTULUI

Culturile de celule umane sau de altă origine mamiferă sunt expuse la substanța chimică de testat în prezența și în absența unei surse exogene de activare metabolică, cu excepția cazului în care sunt utilizate celule cu capacitate metabolică adecvată (a se vedea punctul 13). După începutul expunerii culturilor de celule la substanța chimică de testat, acestea se tratează, la intervale de timp prestabilite și adecvate, cu o substanță chimică de inhibare a metafazei (de exemplu, colcemid sau colchicină), se recoltează, se colorează și celulele în metafază sunt analizate la microscop pentru detectarea aberațiilor de tip cromatidic și de tip cromozomial.

DESCRIEREA METODEI

Preparate

Celule

Se pot utiliza diferite linii celulare [de exemplu, celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), celule pulmonare de hamster chinezesc V79, celule pulmonare de hamster chinezesc (CHL)/IU, TK6) sau culturi de celule primare, inclusiv limfocite din sângele periferic uman sau al altor mamifere] (7). Alegerea liniilor celulare trebuie justificată din punct de vedere științific. În cazul în care se utilizează celule primare, din motive de bunăstare a animalelor, se ia în considerare utilizarea de celule primare de origine umană atunci când este posibil și de la care s-au prelevat probe în conformitate cu principiile și reglementările etice umane. Limfocitele din sângele periferic uman se obțin de la indivizi tineri (aproximativ 18-35 de ani), nefumători, fără vreo boală cunoscută sau expuneri recente la agenți genotoxici (de exemplu, substanțe chimice, radiații ionizante) la niveluri care ar conduce la creșterea incidenței generale a aberațiilor cromozomiale. Acest lucru ar garanta incidența generală redusă și consecventă a aberațiilor cromozomiale. Incidența de bază a aberațiilor cromozomiale crește odată cu vârsta, iar această tendință este mai pronunțată la femei decât la bărbați (17) (18). În cazul în care celulele provenite de la mai mulți donatori sunt puse în comun în vederea utilizării, se precizează numărul de donatori. Este necesar să se demonstreze că celulele s-au divizat de la începutul tratării cu substanța chimică de testat în celule prelevate. Culturile de celule sunt menținute într-o fază de creștere exponențială a celulelor (linii celulare) sau sunt stimulate să se împartă (culturi primare de limfocite) pentru a expune celulele în stadii diferite ale ciclului celular, având în vedere faptul că sensibilitatea stadiilor celulelor la substanțele chimice de testat poate să nu fie cunoscută. Celule primare care trebuie să fie stimulate cu agenți mitogenici pentru a se divide nu mai sunt sincronizate, în general, în timpul expunerii la substanța chimică de testat (de exemplu, limfocitele umane după 48 de ore de la stimularea mitogenică). Utilizarea celulelor sincronizate în timpul tratamentului nu este recomandată, dar poate fi acceptabilă dacă este justificată.

Medii și condiții de cultură

Se recomandă utilizarea mediilor de cultură și a condițiilor de incubare corespunzătoare (vasele de cultură, umiditate atmosferică de 5 % CO2, după caz, temperatura de incubare de 37 °C) pentru dezvoltarea culturilor. Liniile celulare trebuie controlate în mod regulat pentru verificarea stabilității numărului modal de cromozomi și a absenței contaminării cu micoplasmă (7) (19), iar, în cazul în care se constată contaminarea sau în cazul în care numărul modal de cromozomi s-a modificat, celulele nu se mai utilizează. Durata normală a ciclului celular al liniilor celulare sau al culturilor primare utilizate în laboratorul de testare trebuie să fie stabilită și să corespundă cu caracteristicilor celulare publicate (20).

Pregătirea culturilor

Linii celulare: celulele se prepară plecând de la culturile de rezervă, se însămânțează în mediul de cultură la o anumită densitate astfel încât celulele în suspensie ori în culturile monostrat vor continua să crească exponențial până la recoltarea acestora (de exemplu, se evită confluența celulelor care cresc în monostrat).

Limfocite: sânge integral tratat cu un anticoagulant (de exemplu, heparină) sau limfocite separate sunt plasate în cultură (de exemplu, pentru 48 de ore pentru limfocite umane) în prezența unui mitogen [de exemplu, fitohemaglutinină (PHA) pentru limfocite umane] pentru a determina diviziunea celulară anterior expunerii la substanța chimică de testat.

Activare metabolică

Recurgerea la un sistem endogen de activare metabolică este necesară în cazul utilizării de celule dotate cu o capacitate endogenă metabolică inadecvată. Sistemul utilizat cel mai frecvent și care este recomandat implicit, cu excepția cazului în care se justifică altfel, constă într-o fracție postmitocondrială îmbogățită cu un cofactor (S9) preparată din ficat provenit de la rozătoare (în general, șobolani) tratat cu agenți de inducție enzimatică, de exemplu Aroclor 1254 (21) (22) (23) sau un amestec de fenobarbital și β-naftoflavonă (24) (25) (26) (27) (28) (29). Utilizarea acestui amestec nu este contrară prevederilor Convenției de la Stockholm privind poluanții organici persistenți (30) și s-a dovedit a fi la fel de eficientă ca Aroclor 1254 pentru inducția de oxidaze cu funcție mixtă (24) (25) (26) (28). Fracția S9 este utilizată în general cu o concentrație cuprinsă între 1-2 % (v/v), dar poate fi majorată la 10 % (v/v) în mediul de test final. Utilizarea de produse care reduc indexul mitotic, în special produsele de complexare cu calciu (31) se evită în timpul tratamentului. Alegerea tipului și a concentrației de sistem exogen de activare metabolică sau a inductorului metabolic utilizat poate fi influențată de clasa de substanțe chimice testate.

Prepararea substanței chimice de testat

Substanțele chimice de testat în stare solidă sunt preparate în solvenți adecvați și sunt diluate, dacă este cazul, anterior tratamentului aplicat celulelor (a se vedea punctul 23). Substanțele chimice de testat în stare lichidă pot fi adăugate direct în sistemul de testare și/sau diluate anterior tratamentului sistemului de testare. Gazele sau substanțele chimice de testat volatile necesită o modificare adecvată a protocoalelor standard, de exemplu utilizarea de vase de cultură închise ermetic (32) (33) (34). Pregătirea de preparate de substanța chimică de testat se efectuează anterior tratamentului, cu excepția cazului în care există date care demonstrează stabilitatea acestora în condiții de stocare.

Condiții de testare

Solvenți

Solventul trebuie ales pentru a optimiza solubilitatea substanțelor chimice de testat fără a afecta desfășurarea testului, de exemplu, modificarea creșterii celulare, afectarea integrității substanței chimice de testat, reacția cu vasele de cultură, afectarea sistemului de activare metabolică. Se recomandă ca, în măsura în care este posibil, să se ia în considerare în primă instanță utilizarea unui solvent apos (sau un mediu de cultură). Solvenții bine stabiliți sunt, de exemplu, apa sau dimetilsulfoxidul. În general, solvenții organici nu trebuie să depășească 1 % (v/v) și solvenții apoși ( soluție salină sau apă) nu trebuie să depășească 10 % (v/v) în mediul final de tratament. În cazul în care nu se utilizează solvenți bine stabiliți (de exemplu, etanol sau acetonă), utilizarea acestora trebuie justificată prin date care să indice compatibilitatea acestora cu substanțele chimice de testat, cu sistemul de testatare, precum și absența genotoxicității la concentrația utilizată. În lipsa unor astfel de date justificative, este important să se includă martori netratați (a se vedea apendicele 1) pentru a demonstra că solventul ales nu induce efecte vătămătoare sau clastogene.

Măsurarea proliferării celulare și a citotoxicității și alegerea concentrațiilor de tratament

În momentul determinării celei mai mari concentrații a substanței chimice de testat, se evită concentrațiile susceptibile să producă răspunsuri pozitive date de artefacte, cum ar fi cele care produc citotoxicitate excesivă (a se vedea punctul 22), precipitate în mediul de cultură (a se vedea punctul 23) sau modificări importante de pH sau osmolalitate (a se vedea punctul 5). În cazul în care substanța chimică de testat provoacă o modificare importantă a pH-ului mediului în timpul adăugării sale, pH-ul ar putea fi ajustat prin tamponarea mediului final de tratament astfel încât să se evite rezultate pozitive date de artefacte și să se mențină condiții de cultură corespunzătoare.

Măsurătorile proliferării celulare se efectuează pentru a se asigura că un număr suficient de celulele tratate au ajuns la mitoză în timpul testului și că tratamentele sunt realizate la niveluri adecvate de citotoxicitate (a se vedea punctele 18 și 22). Citotoxicitatea se determină cu și fără activare metabolică în experimentul principal, utilizând un indicator corespunzător de moarte și creștere celulară. În timp ce evaluarea citotoxicității într-un test inițial poate fi utilă pentru o mai bună definire a concentrațiilor care urmează să fie utilizate în experimentul principal, un test inițial nu este obligatoriu. În cazul în care este efectuat, acesta nu trebuie să înlocuiască măsurarea citotoxicității în experimentul principal.

Dublarea relativă a populației (RPD) sau creșterea relativă a numărului de celule (RICC) reprezintă metode adecvate pentru evaluarea citotoxicității în teste citogenetice (13) (15) (35) (36) (55) (a se vedea formulele din apendicele 2). În cazul tratamentului pe termen lung și în cazul prelevării de probe după inițierea tratamentului, la intervale de timp mai mari cu de 1,5 ori durata ciclul celular normal (și anume, mai mult de 3 cicluri celulare în total), RPD ar putea subestima citotoxicitatea (37). În astfel de circumstanțe, RICC ar putea fi o măsură mai potrivită sau evaluarea citotoxicității după o perioadă de 1,5 ori durata ciclului celular normal ar fi o estimare utilă pe baza RPD.

În cazul limfocitelor din culturi primare, în timp ce indicele mitotic (MI) este o măsură a efectelor citotoxice/citostatice, acesta este influențat de timpul după tratament când se efectuează măsurătoarea, de mitogenul utilizat și de posibile perturbări ale ciclului celular. Cu toate acestea, MI este acceptabil deoarece alte măsurători de citotoxicitate pot fi dificile și nepractice și este posibil ca acestea să nu se poată aplica la populația țintă de limfocite care cresc ca răspuns la stimularea cu PHA.

În timp ce RICC și RPD reprezintă parametrii de citotoxicitate recomandați pentru liniile celulare și MI pentru cultura primară a limfocitelor, alți indicatori (de exemplu, integritatea celulară, apoptoza, necroza, ciclul celular) ar putea furniza informații suplimentare utile.

Se evaluează cel puțin trei concentrații de testat (fără a include martorii solvent și pozitivi) care îndeplinesc criteriile de acceptabilitate (citotoxicitate adecvată, număr de celule etc.). Indiferent de tipurile de celule (linii celulare sau culturi primare de limfocite), fiecare concentrație se poate testa fie pe culturi duplicat tratate, fie pe culturi unice tratate. În timp ce utilizarea a două culturi tratate este recomandată, culturile unice sunt acceptabile, de asemenea, cu condiția ca același număr total de celule să fie examinat atât pentru culturi unice, cât și pentru culturi duplicat. Utilizarea de culturi unice este deosebit de relevantă atunci când sunt evaluate mai mult de 3 concentrații (a se vedea punctul 31). Rezultatele obținute în culturile independente duplicat pentru o anumită concentrație pot fi grupate pentru analiza datelor (38). În cazul substanțelor chimice de testat fără citotoxicitate sau cu citotoxicitate ușoară, sunt adecvate, de regulă, intervale de concentrație de aproximativ 2 până la 3 ori mai mari. În prezența citotoxicității, concentrațiile de testat selectate trebuie să acopere un interval de la cea care produce citotoxicitate astfel cum este descris la punctul 22 și să includă concentrații la care există citotoxicitate moderată și ușoară sau fără citotoxicitate. Multe substanțe chimice de testat prezintă curbe concentrație-răspuns cu pante puternice, iar pentru a obține date la un nivel scăzut și moderat de citotoxicitate sau pentru a studia în detaliu relația doză-răspuns va fi necesară utilizarea concentrațiilor cu spațiu de separare redus și/sau mai mult de trei concentrații (culturi unice sau duplicat), în special în situațiile în care este necesară repetarea experimentului (a se vedea punctul 47).

În cazul în care concentrația maximă se bazează pe citotoxicitate, cea mai mare concentrație trebuie să vizeze atingerea unui nivel de citotoxicitate de 55 ± 5 % utilizând parametrii de citotoxicitate recomandați (și anume, reducerea RICC și RPD pentru linii celulare și reducerea de MI pentru culturile primare de limfocite la 45 ± 5 % a martorului negativ testat în paralel). Se acordă atenție deosebită interpretării rezultatelor pozitive care se găsesc numai în limita superioară a acestui interval de toxicitate de 55 ± 5 % (13).

În cazul substanțelor chimice de testat cu solubilitate redusă care nu sunt citotoxice la concentrații mai mici decât concentrația minimă de insolubilitate, cea mai mare concentrație analizată produce o turbiditate sau un precipitat vizibil cu ochiul liber sau cu ajutorul unui microscop inversat la sfârșitul tratamentului cu substanța chimică de testat. Chiar dacă se manifestă citototoxicitate la un nivel sub concentrația minimă de insolubilitate, se recomandă testarea la o singură concentrație care produce turbiditate sau cu un precipitat vizibil deoarece efecte date de artefacte pot rezulta din precipitat. La concentrația care produce un precipitat, se acordă atenție deosebită pentru a se asigura că precipitatul nu interferează cu desfășurarea testului (de exemplu, colorare sau examinare). Determinarea solubilității în mediul de cultură înainte de experiment poate fi utilă.

În cazul în care nu se constată citotoxicitate sau precipitat, concentrația maximă de testare trebuie să corespundă cu 10 mM, 2 mg/ml or 2 μl/ml, fiind reținută cea mai mică valoare (39) (40) (41). În cazul în care substanța chimică de testat nu are o compoziție definită, de exemplu, o substanță cu compoziție necunoscută sau variabilă, produse de reacție complexă sau materii biologice (UVCB) (42), extract de mediu etc., concentrația maximă ar trebui să fie mai mare (de exemplu, 5 mg/ml) în absența citotoxicității suficiente, pentru a crește concentrația fiecărei componente. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că aceste cerințe pot fi diferite de cele pentru produsele farmaceutice umane (43).

Martori

Martori negativi testați în paralel (a se vedea punctul 15), constituiți dintr-un solvent singur în mediul de tratare și tratați în același condiții precum culturile de tratare, trebui incluși la fiecare moment de recoltare.

Martorii pozitivi testați în paralel sunt necesari pentru a demonstra abilitatea laboratorului de identificare a substanțelor clastogene în condițiile prevăzute în protocolul de testare utilizat și eficacitatea sistemului exogen de activare metabolică, după caz. Tabelul 1 de mai jos prezintă exemple de martori pozitivi. În mod alternativ, pot fi utilizate alte substanțe chimice martor pozitive, dacă acest lucru este justificat. Întrucât testele in vitro de genotoxicitate pe celule de mamifere sunt suficient de standardizate, utilizarea de martori pozitivi poate fi limitată la un clastogen care necesită activare metabolică. Acest rezultat unic al martorului pozitiv va demonstra atât activitatea sistemului de activare metabolică, cât și reactivitatea sistemului de testare, cu condiția ca acesta să fie efectuat concomitent cu testul neactivat utilizând aceeași durată de tratament. Cu toate acestea, tratamentul de lungă durată (fără S9) necesită propriul martor pozitiv deoarece durata tratamentului va fi diferită față de testul care utilizează activare metabolică. Fiecare martor pozitiv se utilizează în una sau mai multe concentrații susceptibile să determine creșteri reproductibile și detectabile ale frecvenței de fond pentru a demonstra sensibilitatea sistemului de testare (și anume, efectele sunt clare, dar nu dezvăluie imediat identitatea lamelor codate celui care le interpretează) și rezultatul nu trebuie să fie compromis de citotoxicitatea care depășește limitele specificate în metoda de testare.

Tabelul 1.

Substanțe chimice de referință recomandate pentru evaluarea competenței de laborator și pentru selectarea de martori pozitivi.

PROCEDURĂ

Tratamentul cu substanța chimică de testat

Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanța de testat atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică.

Momentul recoltării culturilor

Pentru o evaluare aprofundată, necesară pentru a încheia un rezultat negativ, toate cele trei condiții experimentale următoare se efectuează cu ajutorul unui tratament de scurtă durată cu și fără activare metabolică, precum și al unui tratament pe termen lung fără activare metabolică (a se vedea punctele 43, 44 și 45):

În cazul în care oricare dintre condițiile experimentale de mai sus conduc la un rezultat pozitiv, se poate să nu fie necesar să se investigheze vreun alt regim de tratament dintre celelalte.

Prepararea cromozomilor

Culturile celulare se tratează cu colcemid sau colchicină, de regulă timp de una până la trei ore înainte de recoltare. Fiecare cultură celulară se recoltează și se prelucrează separat pentru prepararea cromozomilor. Prepararea cromozomilor include tratamentul hipotonic al celulelor, precum și fixarea și colorarea acestora. În culturile monostrat pot fi prezente celule mitotice (recunoscute după forma rotundă a acestora și după faptul că se detașează de pe suprafață) la sfârșitul perioadei de tratament de 3-6 ore. Deoarece celulele mitotice se detașează ușor, acestea pot fi pierdute în momentul înlăturării mediului care conține substanța chimică de testat. În cazul în care există dovezi privind o creștere substanțială a numărului de celule mitotice în comparație cu martorii, indicând probabil inhibarea fazei mitotice, celulele se colectează prin centrifugare și se adaugă înapoi la culturi pentru a evita pierderea de celule în mitoză și a celor amenințate de aberația cromozomială la momentul recoltării.

Analiză

Toate lamele, inclusiv cele cu martori pozitivi și negativi, trebuie codificate individual înaintea analizei microscopice pentru aberație cromozomială. Deoarece metodele de preparare a lamelor conduc adesea la o proporție de celule în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele examinate trebuie, prin urmare, să conțină un număr de centromeri egal cu numărul modal +/- 2.

Pentru fiecare concentrație și fiecare martor se examinează cel puțin 300 de celule în metafază bine etalate în vederea stabilirii unei substanțe chimice de testat ca fiind cât mai clar negativă (a se vedea punctul 45). Cele 300 celule se împart în mod egal între culturile duplicat, atunci când sunt utilizate astfel de culturi. În cazul în care se utilizează culturi unice pentru fiecare concentrație (a se vedea punctul 21), cel puțin 300 de celule în metafază bine etalate trebuie examinate pentru această cultură unică. Examinarea a 300 de celule prezintă avantajul creșterii puterii statistice a testului și, în plus, valorile nule vor fi rar constatate (se preconizează a fi doar 5 %) (44). Numărul de celule în metafază examinat poate fi redus în cazul în care se constată un număr ridicat de celule cu aberații cromozomiale, iar substanța chimică de testat este considerată cât mai clar pozitivă.

Se examinează celulele cu aberație (aberații) cromozomială (cromozomiale) structurală (structurale), incluzând și excluzând lacunele. Rupturile și lacunele sunt definite în apendicele 1 în conformitate cu punctele 45 și 46. Aberațiile de tip cromatidian și cromozomial se înregistrează în mod separat și se clasifică în funcție de subtipuri (rupturi, schimburi). Procedurile utilizate în laborator trebuie să asigure că analiza de aberație cromozomială este efectuată de către un personal bine instruit și este supusă unei evaluări inter pares, dacă este cazul.

Cu toate că scopul testului este detectarea aberațiilor cromozomiale structurale, este important să se semnaleze cazurile de poliploidie și endoreduplicare, dacă se constată apariția acestora. (A se vedea punctul 2).

Competența laboratorului

Pentru a stabili o experiență suficientă în materie de testare înainte de utilizarea acesteia pentru efectuarea testelor de rutină, laboratorul trebuie să fi efectuat o serie de experiențe cu substanțele chimice de referință pozitive acționând prin diferite mecanisme și diferiți martori negativi (utilizând diferiți solvenți/vehicul). Aceste răspunsuri ale martorilor pozitivi și negativi trebuie să fie în concordanță cu referințele bibliografice. Acest lucru nu se aplică laboratoarelor care au experiență, și anume, cele care au o bază de date anterioară disponibilă, astfel cum este definit la punctul 37.

O serie de substanțe chimice martor pozitive (a se vedea tabelul 1 de la punctul 26) se investighează cu tratamente de scurtă și lungă durată, fără activare metabolică, precum și cu tratament de scurtă durată în prezența activării metabolice, pentru a demonstra competența de a detecta substanțele chimice clastogene și de a determina eficacitatea sistemului de activare metabolică. Un interval de concentrații ale substanțelor chimice selectate se alege astfel încât să se obțină creșteri reproductibile și legate de concentrație peste nivelul de fond pentru a demonstra sensibilitatea și gama dinamică a sistemului de testare.

Date privind martorii testați anterior

Laboratorul trebuie să stabilească:

La obținerea primelor date pentru o distribuție a martorilor negativi testați anterior, martorii negativi testați în paralel trebuie să fie în concordanță cu datele publicate referitoare la martori, în cazul în care acestea există. Pe măsură ce tot mai multe date experimentale se adaugă la distribuția martorilor, martorii negativi testați în paralel trebuie să fie, în mod ideal, de până la 95 % din limitele de control ale respectivei distribuții (44) (47). Baza de date privind martori negativi testați anterior a laboratorului trebuie să fie construită inițial cu cel puțin 10 experimente, dar ar fi de preferat să conțină cel puțin 20 de experimente efectuate în conformitate cu condiții experimentale comparabile. Laboratoarele trebuie să utilizeze metode de control al calității precum grafice de control [de exemplu, diagrame C și X-bar (48)] pentru a identifica gradul de variabilitate al datelor privind martorii negativi și pozitivi ale acestora și pentru a dovedi faptul că metodologia se află „sub control” în cadrul respectivului laborator (44). Referințele bibliografice prezintă recomandări suplimentare privind modalitatea în care se pot construi și utiliza datele istorice (și anume, criteriile de includere și excludere a datelor în datele istorice și criteriile de acceptabilitate pentru un anumit experiment) (47).

Orice modificare la protocolul experimental se ia în considerare în ceea ce privește coerența acesteia cu bazele de date privind martorii testați anterior existente ale laboratorului. Orice inconsecvență majoră trebuie să conducă la stabilirea unei noi baze de date privind martorii testați anterior.

Datele privind martorii negativi trebuie să cuprindă incidența celulelor cu aberații cromozomiale de la o cultură unică sau suma dintre culturile duplicat, astfel cum este descris la punctul 21. Martorii negativi testați în paralel trebuie să fie, în mod ideal, de până la limitele de control de 95 % ale distribuției bazelor de date privind martorii negativi testați anterior ale laboratorului (44) (47). În cazul în care datele privind martorii negativi testați în paralel se situează în afara limitelor de control de 95 %, acestea pot fi acceptabile pentru a fi incluse în distribuția martorilor testați anterior, în măsura în care datele respective nu reprezintă valori aberante extreme și există dovezi că sistemul de testare se află „sub control” (a se vedea punctul 37) și că nu s-au înregistrat defecțiuni tehnice sau umane.

DATE ȘI RAPORTARE

Prezentarea rezultatelor

Se evaluează procentul de celule cu aberație (aberații) cromozomială (cromozomiale) structurală (structurale). Se întocmește separat o listă cu aberațiile de tip cromatidian și cromozomial clasificate în funcție de subtipuri (rupturi, schimburi), specificând numărul și frecvența acestora pentru culturile experimentale și cele martor. Lacunele se înregistrează și se prezintă în mod separat, dar nu se includ în frecvența totală a aberațiilor. Procentajul de poliploidie și/sau endoreduplicare celulară este prezentat în cazul în care acestea sunt observate.

Se înregistrează rezultatele determinărilor concomitente de citotoxicitate realizate pentru toate culturile tratate și pentru cele martor negative și pozitive în principalul (principalele) experiment(e) de aberație.

Datele se indică individual pentru fiecare cultură. În plus, toate datele sunt sintetizate sub formă de tabele.

Criterii de acceptabilitate

Acceptarea unui test se bazează pe următoarele criterii:

Evaluarea și interpretarea rezultatelor

Cu condiția ca toate criteriile de acceptabilitate să fie îndeplinite, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar pozitivă în cazul în care, în oricare dintre condițiile experimentale examinate (a se vedea punctul 28):

La îndeplinirea tuturor acestor criterii, se consideră că substanța chimică de testat poate produce aberații cromozomiale în celulele de mamifere în cultură în cadrul acestui sistem de testare. Referințele bibliografice prezintă recomandări pentru cele mai adecvate metode statistice (49) (50) (51).

Cu condiția ca toate criteriile de acceptabilitate să fie îndeplinite, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar negativă în cazul în care, în toate condițiile experimentale examinate (a se vedea punctul 28):

Prin urmare, substanța chimică de testat este considerată incapabilă să provoace aberații cromozomiale în celulele de mamifere în cultură în cadrul acestui sistem de testare.

Nu există nicio cerință referitoare la verificarea unui răspuns clar pozitiv sau negativ.

În cazul în care răspunsul nu este nici în mod clar negativ, nici în mod clar pozitiv astfel cum este descris mai sus sau pentru a asista la stabilirea relevanței biologice a unui rezultat, datele se evaluează de către experți și/sau prin intermediul unor investigații suplimentare. Examinarea de celule suplimentare (dacă este cazul) sau repetarea experimentului folosind posibile condiții experimentale modificate [de exemplu, intervale dintre concentrații, alte condiții de activare metabolică (și anume, concentrație S9 sau origine S9)] ar putea fi utile.

În cazuri rare, chiar și după efectuarea de investigații suplimentare, setul de date va exclude posibilitatea unei concluzii de rezultate pozitive sau negative și, prin urmare, răspunsul substanței chimice de testat va fi stabilit ca fiind echivoc.

O creștere a numărului de celule poliploide poate să indice faptul că substanțele chimice de testat au potențialul să inhibe procesele mitotice și să producă aberații cromozomiale numerice (52). O creștere a numărului de celule cu cromozomi endoreduplicați poate să indice faptul că substanțele chimice de testat au potențialul de a inhiba progresul ciclului celular (53) (54) (a se vedea punctul 2). Prin urmare, incidența celulelor poliploide și a celulelor cu cromozomi endoreduplicați se înregistrează separat.

Raport de testare

Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații:

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

Apendicele 2

FORMULE PENTRU EVALUAREA CITOTOXICITĂȚI

Indice mitotic (MI):

Se recomandă creștere relativă a numărului de celule (RICC) sau dublarea relativă a populației (RPD), întrucât ambele iau în considerare proporția de celule care au efectuat o diviziune celulară.

unde:

Dublarea populației = [log (numărul de celule post-tratament ÷ numărul inițial de celule)] ÷ log 2

De exemplu, o RICC sau o RPD de 53 % indică 47 % citotoxicitate/citostază și 55 % citotoxicitate/citostază măsurată prin MI, însemnând că MI este 45 % din martor.

În orice caz, se măsoară numărul de celule înainte de tratament, iar același lucru se efectuează atât pentru culturile tratate, cât și pentru cele martor negative.

În timp ce RICC (și anume, numărul de celule în culturile tratate/numărul de celule în culturile martor) a fost utilizată ca parametru de citotoxicitate în trecut, aceasta nu mai este recomandată deoarece poate subestima citotoxicitatea.

În culturile martor negative, dublarea populației trebuie să fie compatibilă cu cerința prelevării de probe a celulelor după tratament la un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal și indicele mitotic trebuie să fie destul de crescut pentru a obține un număr suficient de celule în mitoză și pentru a calcula într-un mod fiabil o reducere de 50 %.

(4)

În partea B, capitolul B.11 se înlocuiește cu următorul text:

„B.11   Test de aberație cromozomială în măduva osoasă de mamifere

INTRODUCERE

Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea nr. 475 a OCDE (2016). Acesta face parte dintr-o serie de metode de testare privind toxicologia genetică. A fost elaborat un document al OCDE care oferă informații succinte privind testarea pentru toxicologia genetică (1) și care trece în revistă modificările efectuate recent asupra orientărilor respective.

Testul in vivo de aberație cromozomială pe măduva osoasă de mamifere este relevant în special pentru evaluarea genotoxicității deoarece, în pofida faptului că pot varia între specii, factorii de metabolism in vivo, farmacocinetica și procesele de regenerare de ADN sunt active și contribuie la răspunsuri. Un test in vivo este util, de asemenea, pentru investigarea suplimentară a genotoxicității detectate de un sistem in vitro.

Testul in vivo de aberație cromozomială la mamifere este utilizat pentru detectarea aberațiilor cromozomiale provocate de substanțele chimice de testat în structura celulelor din măduva osoasă a mamiferelor, de regulă, rozătoare (2) (3) (4) (5). Aberații cromozomiale structurale pot fi de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. În timp ce majoritatea aberațiilor induse prin substanța chimică sunt de tip cromatidic, se produc, de asemenea aberații de tip cromozomial. Leziunile cromozomiale și fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane și există dovezi substanțiale că, atunci când aceste leziuni și fenomene conexe provoacă modificări ale oncogenelor și ale genelor supresoare de tumori, acestea sunt implicate în inducerea cancerului la oameni și în sistemele experimentale. Poliploidia (inclusiv endoreduplicarea) ar putea apărea în testele in vivo de aberație cromozomială. Cu toate acestea, o creștere a numărului de celule poliploide în sine nu indică potențial aneugenic și poate indica pur și simplu perturbarea ciclului celular sau citotoxicitate. Acest test nu este conceput pentru a măsura aneuploidia. Un test in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere (capitolul B.12 din prezenta anexă) sau testul in vitro de micronucleu pe celule de mamifere (capitolul B.49 din prezenta anexă) ar fi testele in vivo și, respectiv, in vitro recomandate pentru detectarea aneuploidiei.

Definiții ale terminologiei utilizate sunt prevăzute în apendicele 1.

CONSIDERAȚII INIȚIALE

Rozătoarele sunt utilizate în mod obișnuit în acest test, dar utilizarea altor specii poate fi adecvată în unele cazuri, dacă este justificată din punct de vedere științific. Țesutul-țintă în acest test este măduva osoasă, întrucât este un țesut puternic și conține o populație de celule cu ciclu rapid care se pot izola și prelucra ușor. Justificarea din punct de vedere științific a utilizării altor specii decât șobolanii și șoarecii se indică în raport. În cazul în care sunt utilizate alte specii decât rozătoare, se recomandă ca măsurarea aberației cromozomiale în măduva osoasă să fie integrată în alt test de toxicitate corespunzător.

În cazul în care există dovezi că substanța (substanțele) chimică(e) de testat sau metabolitul (metaboliții) acesteia nu vor ajunge la țesutul țintă, este posibil ca utilizarea acestui test să nu fie potrivită.

Înainte de utilizarea metodei de testare pe un amestec pentru a genera date pentru un obiectiv de reglementare specific, se examinează dacă și, în caz afirmativ, din ce cauză aceasta poate oferi rezultate adecvate pentru respectivul scop. Astfel de considerații nu sunt necesare în cazul în care există o cerință normativă pentru testarea amestecului.

PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Animalele sunt expuse la substanța chimică de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare și sunt eutanasiate în condiții umane la momentul corespunzător după tratament. Înainte de eutanasiere, animalele se supun tratamentului cu un agent de inhibare a metafazei (de exemplu, colchicină sau colcemid). Ulterior, din celulele de măduvă osoasă se realizează preparate cromozomiale care se colorează și celulele în metafază se examinează pentru a pune în evidență aberațiile cromozomiale.

VERIFICAREA COMPETENȚEI LABORATORULUI

Verificări de competență

Pentru a stabili experiența suficientă în efectuarea testului înainte de a-l utiliza pentru testele de rutină, laboratorul trebuie să fi demonstrat capacitatea de a reproduce rezultatele așteptate în urma informațiilor publicate [de exemplu, (6)] pentru frecvențe de aberații cromozomiale cu un minim de două substanțe chimice martor pozitive (inclusiv răspunsurile slabe cauzate de doze scăzute de martori pozitivi) precum cele enumerate în tabelul 1 și cu martori vehicul/solvent compatibili (a se vedea punctul 22). Aceste experimente utilizează doze care produc creșteri reproductibile și legate de doză și demonstrează sensibilitatea și gama dinamică a sistemului de testare în țesutul de interes (măduva osoasă) utilizând metoda de examinare care urmează să fie utilizată în cadrul laboratorului. Această cerință nu se aplică laboratoarelor care au experiență, și anume, cele care dețin o bază de date anterioare disponibilă astfel cum este definit la punctele 10-14.

Date privind martorii testați anterior

Pe parcursul verificărilor de competență, laboratorul trebuie să stabilească:

La obținerea primelor date pentru o distribuție a martorilor negativi testați anterior, martorii negativi testați în paralel trebuie să fie în concordanță cu datele publicate referitoare la martori, în cazul în care acestea există. Pe măsură ce tot mai multe date experimentale se adaugă la distribuția martorilor testați anterior, martorii negativi testați în paralel trebuie să fie, în mod ideal, de până la 95 % din limitele de control ale respectivei distribuții. Baza de date privind martorii negativi testați anterior trebuie să fie solidă din punct de vedere statistic pentru a asigura capacitatea laboratorului de a evalua distribuția datelor sale privind martorii negativi. Referințele bibliografice sugerează că poate fi necesar un minim de 10 experimente, dar ar trebui, de preferință, ca baza de date să fie constituită din cel puțin 20 experimente efectuate în conformitate cu condiții experimentale comparabile. Laboratoarele trebuie să utilizeze metode de control al calității, cum ar fi grafice de control [de exemplu, diagrame C sau X-bar (7)], pentru a identifica gradul de variabilitate al datelor lor și pentru a dovedi faptul că metodologia se află „sub control” în respectivul laborator. Referințele bibliografice prezintă recomandări suplimentare privind modalitatea în care se pot construi și utiliza datele anterioare (și anume, criteriile de includere și de excludere a datelor în datele istorice și criteriile de acceptabilitate pentru un anumit experiment) (8).

În cazul în care laboratorul nu completează un număr suficient de experimente pentru a stabili o distribuție a martorilor negativi solidă din punct de vedere statistic (a se vedea punctul 11) în timpul verificărilor de competență (descrise la punctul 9), se acceptă posibilitatea elaborării distribuției în timpul primelor teste de rutină. Această abordare trebuie să respecte recomandările stabilite în referințele bibliografice (8), iar rezultatele martorilor negativi obținute în aceste experimente trebuie să rămână în conformitate cu datele publicate cu privire la martorii negativi.

Orice modificare la protocolul experimental se ia în considerare în ceea ce privește impactul acesteia asupra datelor rezultate, care trebuie să fie în conformitate cu baza de date existentă privind martorii testați anterior a laboratorului. Doar inconsecvențele majore conduc la stabilirea unei noi baze de date privind martorii testați anterior, în cazul în care opiniile experților stabilesc faptul că acestea diferă față de distribuția anterioară (a se vedea punctul 11). În timpul procesului de restabilire, o bază completă de date cu privire la martorii negativi nu este neapărat necesară pentru a permite efectuarea unui test propriu-zis, cu condiția ca laboratorul să poată demonstra că valorile martor negative ale acestuia rămân consecvente fie cu bazele de date anterioare aferente, fie cu datele publicate corespunzătoare.

Datele cu privire la martorii negativi trebuie să cuprindă incidența aberațiilor cromozomiale structurale (cu excepția lacunelor) pentru fiecare animal. Martorii negativi testați în paralel trebuie să fie, în mod ideal, de până la 95 % din limitele de control ale distribuției bazei de date privind martorii negativi testați în paralel a laboratorului. În cazul în care datele privind martorii negativi testați în paralel se situează în afara limitelor de control de 95 %, acestea pot fi acceptabile pentru a fi incluse în distribuția de martori testați anterior în măsura în care datele respective nu reprezintă valori aberante extreme și există dovezi că sistemul de testare se află „sub control” (a se vedea punctul 11) și că nu s-au înregistrat defecțiuni tehnice sau umane.

DESCRIEREA METODEI

Preparate

Selectarea speciilor de animale

Se utilizează șușe utilizate în mod curent în laborator, alegându-se animale adulte, tinere, sănătoase. Se utilizează, de regulă, șobolani, cu toate că se pot utiliza și șoareci. Orice altă specie adecvată de mamifere poate fi utilizată, în cazul în care se furnizează justificarea științifică în raport.

Condiții de adăpostire și de hrănire a animalelor

În cazul rozătoarelor, temperatura sălii în care se află animalele trebuie să fie de 22 °C (± 3 °C). Cu toate că umiditatea relativă este, în mod ideal, de 50-60 %, aceasta trebuie să fie de cel puțin 40 % și să nu depășească, de preferință, 70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul. Spațiul se iluminează artificial, cu o alternanță de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Alegerea regimului alimentar poate fi influențată de necesitatea de a asigura o proporție adecvată a substanței chimice de testat în cazul administrării prin această metodă. Rozătoarele se adăpostesc în grupuri mici (cel mult cinci pentru fiecare cușcă) de același sex și grup supus tratamentului, în cazul în care nu se preconizează niciun comportament agresiv, de preferință în cuști cu pardoseală solidă cu îmbogățire adecvată a mediului de viață. Animalele pot fi adăpostite individual în cazul în care acest lucru este justificat din punct de vedere științific.

Pregătirea animalelor

Se utilizează în mod normal animale adulte, tinere, sănătoase (pentru rozătoare, de preferință, de 6-10 săptămâni la începutul tratamentului, deși animale puțin mai în vârstă sunt, de asemenea, acceptabile), care sunt distribuite în mod aleatoriu în grupe martor și grupe de tratament. Animalele sunt identificate individual prin utilizarea unei metode umane, foarte puțin invazive (de exemplu, prin marcare cu inele, crotaliere, microcipare sau identificare biometrică, dar nu prin secționarea urechii sau a degetului) și sunt aclimatizate la condițiile de laborator timp de minimum cinci zile. Cuștile se dispun astfel încât posibilele efecte datorate amplasării în cușcă să fie reduse la minim. Se evită contaminarea încrucișată dintre martorul pozitiv și substanța chimică de testat. La începutul studiului, greutatea animalelor trebuie să prezinte o variație minimă și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.

Pregătirea dozelor

Substanțele de testat în stare solidă se dizolvă sau se pun în suspensii în solvenți sau vehicule corespunzătoare sau se amestecă în alimente sau în apa de băut înainte de a fi administrate animalelor. Substanțele chimice de testat în stare lichidă se pot administra direct sau se pot dilua înainte de administrare. Pentru expunerile prin inhalare, substanțele chimice de testat pot fi administrate sub formă de gaz, vapori sau aerosol solid/lichid, în funcție de proprietățile fizico-chimice ale acestora. Se utilizează preparate proaspete de substanță chimică de testat, cu excepția cazului în care datele de stabilitate demonstrează caracterul acceptabil al stocării și definesc condițiile de stocare corespunzătoare.

Solvent/vehicul

Solventul/vehiculul nu trebuie să producă efecte toxice la volumele de doză utilizate și nu trebuie să existe suspiciunea reacției chimice a acestuia cu substanțele chimice de testat. În cazul în care se utilizează alți solvenți/vehicule decât cei recunoscuți, includerea acestora trebuie să fie justificată cu date de referință care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare mai întâi utilizarea unui solvent/vehicul apos. Exemple de solvenți/vehicule compatibili utilizați în mod obișnuit includ apa, soluția fiziologică salină, soluția de metilceluloză, soluția de carboximetilceluloză sare de sodiu, uleiul de măsline și uleiul de porumb. În absența unor date anterioare sau publicate cu privire la martori care să ateste faptul că nicio aberație cromozomială de structură sau alte efecte vătămătore nu sunt induse de un anumit solvent/vehicul atipic, se efectuează un studiu inițial pentru a stabili acceptabilitatea martorului tratat cu solvent/vehicul.

Martori

Martori pozitivi

Pentru fiecare test se include, în mod normal, un grup de animale tratate cu o substanță chimică martor pozitivă. Acest lucru poate fi eliminat în cazul în care laboratorul de testare a demonstrată competență în efectuarea testului și a stabilit un interval de martori pozitivi anteriori. În cazul în care nu este inclus un grup de martori pozitivi testați în paralel, în fiecare experiment se includ martori examinați (lame fixate și necolorate). Aceștia pot fi obținuți prin includerea în sistemul de examinare a studiului de probe de referință adecvate care au fost obținute și păstrate în urma unui experiment separat cu martori pozitivi efectuat periodic (de exemplu, la fiecare 6-18 luni) în cadrul laboratorului în care se efectuează testul, de exemplu, în timpul testărilor de competență și ulterior în mod regulat, dacă este necesar.

Substanțele chimice martor pozitive trebuie să producă în mod fiabil o creștere detectabilă în ceea ce privește frecvența celulelor cu aberații cromozomiale structurale față de nivelul spontan. Dozele de martor pozitiv se aleg astfel încât să se obțină efecte clare, dar fără a releva imediat examinatorului identitatea probelor codate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită față de cea utilizată în cazul substanței chimice de testat, folosind o schemă de tratament diferită și o singură prelevare de probe. În plus, utilizarea de martori pozitivi din aceeași clasă de substanțe chimice poate fi luată în considerare, după caz. Tabelul 1 include exemple de substanțe chimice martor pozitive.

Tabelul 1.

Exemple de substanțe chimice martor pozitive

Martori negativi

Animalele din grupul martor negativ se iau în considerare la fiecare prelevare de probe și se manipulează de altfel în aceeași modalitate ca grupurile tratate, cu excepția faptului că nu beneficiază de tratamentul cu substanța chimică de testat. În cazul în care un solvent/vehicul este utilizat pentru administrarea substanței chimice de testat, acesta se administrează grupului martor. Cu toate acestea, în cazul în care coerența variabilității inter-animale și frecvențele celulelor cu aberații structurale sunt demonstrate de datele privind martorii negativi testați anterior la fiecare prelevare de probe efectuată de laboratorul de testare, ar putea fi necesară o singură prelevare de probe pentru martorul negativ. În cazul în care se utilizează o singură prelevare de probe pentru martorii negativi, aceasta trebuie să fie prima prelevare de probe utilizată în cadrul studiului.

PROCEDURĂ

Numărul și sexul animalelor

În general, reacția de micronucleu este similară între masculi și femele (9) și se preconizează că acest lucru va fi valabil, de asemenea, pentru aberațiile cromozomiale structurale; prin urmare, majoritate studiilor pot fi efectuate pe oricare dintre sexe. Date care demonstrează diferențe relevante între masculi și femele (de exemplu, diferențele în materie de toxicitate sistemică, metabolism, biodisponibilitate, toxicitate în măduva osoasă, etc., inclusiv, de exemplu, un studiu de stabilire a dozelor) ar încuraja utilizarea ambelor sexe. În acest caz, ar fi adecvat să se efectueze un studiu în cazul ambelor sexe, de exemplu, ca parte a unui studiu de toxicitate cu doză repetată. Utilizarea modelului factorial poate fi adecvată în cazul în care sunt utilizate ambele sexe. Apendicele 2 prezintă detalii cu privire la modul de analiză a datelor care utilizează acest model.

Dimensiunea grupurilor la începerea studiului se stabilește cu scopul de a furniza pentru fiecare grup cel puțin 5 animale analizabile de același sex sau din fiecare sex, în cazul în care sunt utilizate ambele sexe. În cazul în care expunerea umană la substanțe chimice este specifică unui anumit sex, cum ar fi, de exemplu, în cazul unor produse farmaceutice, testul se efectuează utilizând sexul corespunzător. Ca o orientare pentru cerințe maxime tipice animalelor, un studiu pe măduva osoasă din două prelevări de probe cu trei grupuri de dozaj și un grup martor negativ testat în paralel, la care se adaugă un grup martor pozitiv (fiecare grup alcătuit din cinci animale de același sex) ar necesita 45 de animale.

Doze

În cazul în care se efectuează un studiu preliminar de stabilire a dozelor deoarece nu există date adecvate disponibile pentru a contribui la selectarea dozei, acesta se realizează în același laborator, utilizând aceeași specie, șușă, sex și regim de tratament precum cele care urmează să fie utilizate în studiul principal (10). Studiul are ca obiectiv identificarea dozei maxime tolerate (DMT), definită drept doza cea mai ridicată care va fi tolerată fără dovezi de toxicitate care să limiteze studiul, în funcție de durata perioadei de studiu [de exemplu, prin reducerea greutății corporale sau a citotoxicității sistemului hematopoietic, dar nu deces sau semne de durere, suferință sau stres care să necesite eutanasiere în condiții umane (11)].

Doza maximă mai poate fi definită ca doza care produce unele semne de toxicitate în măduva osoasă.

Substanțele chimice care prezintă saturație a proprietăților toxicocinetice sau provoacă procese de detoxifiere care pot conduce la o diminuare a expunerii după un tratament pe termen lung pot reprezenta excepții de la criteriile de stabilire a dozelor și se evaluează de la caz la caz.

Pentru a obține informații privind relația doză-răspuns, un studiu complet trebuie să includă un grup martor negativ și un minim de trei niveluri de doze separate, în general, de un factor de 2, dar nu mai mult de 4. În cazul în care substanța chimică de testat nu produce toxicitate într-un studiu de stabilire a dozelor sau pe baza datelor existente, doza maximă pentru o singură administrare este de 2 000 mg/kg greutate corporală. Cu toate acestea, în cazul în care substanța chimică de testat provoacă toxicitate, DMT trebuie să fie cea mai mare doză administrată, iar dozele utilizate trebuie, de preferat, să acopere un interval de toxicitate de la doza maximă până la o doză care provoacă toxicitate minimă sau nu provoacă toxicitate. În cazul în care se observă toxicitate în țesutul țintă (măduva osoasă) la toate dozele testate, se recomandă efectuarea unui studiu suplimentar la doze netoxice. Studiile care au ca scop caracterizarea pe deplin a informațiilor cantitative doză-răspuns pot solicita grupuri suplimentare de dozare. Pentru anumite tipuri de substanțe chimice de testat (de exemplu, produsele farmaceutice umane) reglementate prin cerințe specifice, aceste limite pot varia.

Test limită

În cazul în care experimentele pentru stabilirea intervalului sau datele existente legate de șușele de animale indică faptul că un regim de tratament de cel puțin doza limită (descrisă mai jos) nu produce efecte toxice detectabile, (inclusiv nicio diminuare a proliferării măduvei osoase sau alte semne de citotoxicitate în țesutul țintă) și în cazul în care genotoxicitatea este improbabilă pe baza studiilor in vitro de genotoxicitate sau a datelor provenite de la substanțele chimice cu o structura apropriată, atunci este posibil ca un studiu integral cu trei doze de niveluri diferite să nu fie considerat necesar dacă s-a demonstrat că substanța (substanțele) chimică(e) de testat ajung(e) la țesutul țintă (măduva osoasă). În astfel de cazuri, un singur nivel de doză, la doza limită, poate fi suficient. Pentru o perioadă de administrare > 14 zile, doza limită este de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi. Pentru perioadele de administrare de 14 zile sau mai puțin, doza limită este de 2 000 mg/kg greutate corporală/zi.

Administrarea dozelor

La elaborarea unui test se ia în considerare calea anticipată de expunere umană. Prin urmare, căile de expunere precum alimentația, apa potabilă, expunerea locală, subcutanată, intravenoasă, calea orală (prin gavaj), inhalarea, expunerea intratraheală sau implantarea pot fi alese după caz. În orice caz, calea trebuie aleasă pentru a asigura expunerea adecvată a țesutului (țesuturilor) țintă. Injectarea peritoneală nu este recomandată, în general, deoarece nu este o cale destinată expunerii umane și se utilizează doar cu anumite justificări științifice. În cazul în care substanța chimică de testat este administrată în amestec cu hrana sau apa potabilă, în special în cazul administrării unice, se acordă atenție deosebită intervalului dintre consumul de hrană și apă și prelevarea de probe, care trebuie să fie suficient pentru a permite identificarea efectelor (a se vedea punctele 33-34). Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică sau prin injecție într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul nu trebuie să depășească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală, exceptând cazul soluțiilor apoase, când se poate administra un maxim de 2 ml/100 g. Utilizarea unor volume mai mari decât cele menționate se justifică. Exceptând substanțele chimice de testat iritante sau corozive, care vor prezenta, în mod normal, efecte exacerbate la concentrații mai mari, variația volumului testat se reduce la minim prin ajustarea concentrației, astfel încât să se asigure administrarea unui volum constant în raport cu greutatea corporală pentru toate dozele.

Schema de tratament

Substanțele chimice de testat se administrează, în mod normal, o singură dată, dar se pot administra, de asemenea, în doză fracționată (și anume, două sau mai multe tratamente în aceeași zi la distanță de doar 2-3 ore) pentru a facilita administrarea unui volum mare. În aceste circumstanțe sau atunci când substanța chimică de testat este administrată prin inhalare, momentul de prelevare de probe trebuie programat în funcție de ultima administrare a dozei sau de sfârșitul expunerii.

Există puține date disponibile cu privire la gradul de adecvare al unui protocol cu doză repetată pentru efectuarea acestui test. Cu toate acestea, în cazurile în care se dorește integrarea acestui test cu un test de toxicitate la doze repetate, se acordă atenție deosebită pentru a evita pierderea de celule mitotice cu leziuni cromozomiale astfel cum se întâmplă cu doze toxice. O astfel de integrare este acceptabilă în cazul în care doza maximă este mai mare sau egală cu doza limită (a se vedea punctul 29) și la un grup de dozare se administrează doza limită pe durata perioadei de tratament. Testul pe micronucleu (metoda de testare B.12) se consideră testul in vivo agreat pentru aberații cromozomiale în cazul în care se dorește integrarea cu alte studii.

Se efectuează prelevarea de probe de măduva osoasă în două momente diferite în urma tratamentelor unice. Pentru rozătoare, primul interval de prelevare de probe trebuie să fie perioada necesară pentru a completa de 1,5 ori durata ciclului celular normal (acesta din urmă fiind în mod normal de 12-18 ore după perioada de tratament). Având în vedere faptul că timpul necesar pentru absorbția și metabolizarea substanței (substanțelor) chimice de testat, precum și acțiunea acesteia (acestora) asupra cineticii ciclului celular poate avea efecte asupra timpului optim pentru detectarea aberației cromozomiale, se recomand să se procedeze la o altă prelevare de probe la 24 de ore după prima prelevare. După prima prelevare de probe, se tratează toate grupurile de dozare și se colectează probele pentru analiză; cu toate acestea, la ultima (ultimele) prelevare (prelevări) de probe se administrează doar dozele maxime. În cazul în care sunt utilizate regimuri de dozare de mai mult de o zi pe baza unor justificări științifice, se procedează la o prelevare de probe la un interval de timp de până la de 1,5 ori durata ciclului celular normal după tratamentul final.

După tratament și înainte de colectarea probelor, animalele se injectează intraperitoneal cu o doză corespunzătoare de agent de inhibare a metafazei (de exemplu, colcemid sau colchicină ), iar probele sunt colectate ulterior la un interval corespunzător. Intervalul respectiv este de aproximativ 3-5 ore înaintea colectării în cazul șoarecilor și de 2-5 ore pentru șobolani. Celulele se recoltează din măduva osoasă, se umflă, se fixează se colorează și se analizează pentru aberații cromozomiale (12).

Observații

Se recomandă efectuarea de observații clinice generale asupra animalelor de experiență și înregistrarea semnelor clinice cel puțin o dată pe zi, de preferat la aceeași (aceleași) oră (ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrarea dozei. În perioada de administrare a dozei, toate animalele se examinează cel puțin de două ori pe zi pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea. Toate animalele se cântăresc la începutul studiului, cel puțin o dată pe săptămână în timpul studiilor cu doză repetată și la eutanasiere. În cadrul studiilor cu o durată de cel puțin o săptămână, consumul de hrană se măsoară cel puțin săptămânal. În cazul în care substanța chimică de testat este administrată prin apa de băut, consumul de apă se măsoară la fiecare schimbare de apă și cel puțin o dată pe săptămână. Animalele care prezintă indicatori neletali de toxicitate excesivă se eutanasiază în condiții umane înainte de încheierea perioadei de testare (11).

Expunerea țesutului țintă

Se prelevează o probă de sânge la momentul (momentele) adecvat(e) pentru de a permite investigarea nivelurilor plasmatice ale substanțelor chimice de testat cu scopul a demonstra faptul că măduva osoasă a fost expusă, acolo unde este cazul și unde nu există alte date de expunere (a se vedea punctul 44).

Măduva osoasă și preparatele cromozomiale

Imediat după eutanasierea în condiții umane, celule de măduvă osoasă se extrag din femurul sau tibia animalelor, se expun la o soluție hipotonică și se fixează. Celulele în metafază se întind apoi pe lame și se colorează prin metodele stabilite (a se vedea punctele 3-12).

Analiză

Toate lamele, inclusiv cele de la martorii pozitivi și negativi, sunt codificate independent înainte de analiză și sunt randomizate astfel încât examinatorul să nu cunoască condiția de tratament.

Se determină indicele mitotic ca o măsură a citotoxicității, pe cel puțin 1000 de celule pe animal pentru toate animalele tratate (inclusiv martorii pozitivi), netratate sau animalele martori negativi tratate cu un vehicul/solvent.

Pentru fiecare animal se analizează cel puțin 200 de celule în metafază pentru a evidenția aberații cromozomiale structurale, incluzând și excluzând lacunele (6). Cu toate acestea, în cazul în care baza de date privind martorii negativi testați anterior indică faptul că valoarea medie a frecvenței aberațiilor cromozomiale structurale de fond este < 1 % în laboratorul de testare, se ia în considerare examinarea de celule suplimentare. Aberațiile de tip cromatidian și cromozomial se înregistrează separat și se clasifică în funcție de subtipuri (rupturi, schimburi). Procedurile utilizate în laborator trebuie să asigure că analiza aberațiilor cromozomiale este efectuată de un personal bine instruit și este supusă unei evaluări inter pares, dacă este cazul. Recunoscând faptul că metodele de preparare a lamelor conduc adesea la scindarea unei fracții de celule în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele examinate trebuie, prin urmare, să conțină un număr de centromeri nu mai mic de 2n±2, unde n este numărul haploid de cromozomi pentru specia respectivă.

DATE ȘI RAPORTARE

Prelucrarea rezultatelor

Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Pentru fiecare animal, se evaluează indicele mitotic, numărul de celule în metafază examinate, numărul de aberații pentru fiecare celulă în metafază și procentul de celule cu aberație (aberații) cromozomială (cromozomiale) structurală (structurale). Diferitele tipuri de aberații cromozomiale structurale se enumeră împreună cu numărul și frecvența acestora pentru grupurile tratate și pentru cele martor. Se înregistrează separat lacunele, precum și celulele poliploide și celulele cu cromozomi endoreduplicați. Se raportează frecvența lacunelor, dar, în general, aceasta nu se include în analiza frecvenței totale a aberațiilor structurale. În cazul în care nu există dovezi privind diferența de răspunsuri între sexe, datele se pot combina pentru analiza statistică. Datele cu privire la toxicitatea animală și semnele clinice trebuie, de asemenea, să fie raportate.

Criterii de acceptabilitate

Următoarele criterii determină acceptabilitatea testului:

Evaluarea și interpretarea rezultatelor

Cu condiția îndeplinirii tuturor criteriilor de acceptabilitate, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar pozitivă în cazul în care:

În cazul în care se analizează doar doza maximă la un anumit moment de prelevare de probe, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar pozitivă în cazul în care există o creștere semnificativă din punct de vedere statistic, comparativ cu martorul negativ testat în paralel, iar rezultatele se situează în afara distribuției de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limite de control 95 % pe baza distribuției Poisson). Referințele bibliografice prezintă recomandări privind metode statistice adecvate (13). La efectuarea unei analize a relației doză-răspuns, se analizează cel puțin trei grupuri tratate de dozare. Testele statistice utilizează animalul ca unitate experimentală. Rezultatele pozitive ale unui test de aberație cromozomială indică faptul că substanța chimică de testat induce aberații cromozomiale structurale în măduva osoasă a speciei testate.

Cu condiția ca toate criteriile de acceptabilitate să fie îndeplinite, o substanță chimică de testat este considerată în mod clar negativă în cazul în care, în toate condițiile experimentale examinate:

Referințele bibliografice prezintă recomandări privind cele mai adecvate metode statistice (13). Dovezi ale expunerii măduvei osoase la o substanță chimică de testat pot include o diminuare a indicelui mitotic sau măsurarea concentrațiilor plasmatice sau sangvine din substanța (substanțele) chimică(e) de testat. În cazul administrării intravenoase, nu sunt necesare dovezi de expunere. În mod alternativ, datele ADME, obținute în cadrul unui studiu independent utilizând aceeași cale și aceeași specie, pot fi utilizate pentru a demonstra expunerea măduvei osoase. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile de testare, substanța chimică de testat nu provoacă aberații cromozomiale structurale în măduva osoasă a speciei testate.

În cazul unui răspuns clar pozitiv sau clar negativ, nu există nicio cerință referitoare la verificare.

În cazul în care răspunsul nu este în mod clar negativ sau pozitiv și pentru contribui la stabilirea relevanței biologice a rezultatului (de exemplu, o creștere slabă sau de limită), datele se evaluează de către experți și/sau prin investigații suplimentare realizate pe experimentele existente. În unele cazuri, analizarea mai multor celule sau repetarea experimentului utilizând condiții de testare modificate ar putea fi utile.

În cazuri rare, chiar și după efectuarea de investigații suplimentare, datele vor exclude posibilitatea unui rezultat pozitiv sau negativ al substanței chimice de testat și, prin urmare, se va concluziona că studiul este echivoc.

Frecvența celulelor poliploide și enderoduplicate în metafază în cadrul numărului total de celule în metafază se înregistrează separat. O creștere a numărului de celule poliploide/enderoduplicate poate să indice faptul că substanța chimică de testat este capabilă să inhibe procesele mitotice sau avansarea ciclului celular (a se vedea punctul 3).

Raport de testare

Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații:

Rezumat

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

(5)

În partea B, capitolul B.12 se înlocuiește cu următorul text:

„B. 12.   Testul de micronucleu pe eritrocite de mamifere

INTRODUCERE

Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea nr. 474 a OCDE (2016). Aceasta face parte dintr-o serie de metode de testare privind toxicologia genetică. A fost elaborat un document al OCDE care oferă informații succinte privind testarea pentru toxicologia genetică (1) și care trece în revistă modificările efectuate recent asupra orientărilor respective.

Testul in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere este relevant în special pentru evaluarea genotoxicității deoarece, în pofida faptului că pot să varieze între specii, factorii de metabolism in vivo, farmacocinetica și procesele de regenerare a ADN sunt active și contribuie la răspunsuri. Un test in vivo este util, de asemenea, pentru investigarea suplimentară a genotoxicității detectate de un sistem in vitro.

Testul in vivo de micronucleu pe celule de mamifere se utilizează pentru detectarea leziunilor induse de substanța chimică de testat asupra cromozomilor sau asupra aparatului mitotic al eritroblaștilor. Testul evaluează formarea de micronuclee în eritrocitele prelevate fie din măduva osoasă, fie din celulele sângelui periferic ale animalelor, de regulă, rozătoare.

Scopul testului de micronucleu este identificarea substanțelor chimice care produc leziuni citogenetice care determină formarea de micronuclee conținând fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi întârziați.

Atunci când un eritroblast din măduva osoasă evoluează într-un eritrocit imatur (denumit uneori și eritrocit policromatic sau reticulocit), nucleul principal este expulzat; orice nucleu care se formează poate să rămână în citoplasmă. Micronucleele se vizualizează sau se detectează mai ușor în aceste celule deoarece le lipsește nucleul principal. O creștere a frecvenței eritrocitelor imature micronucleate la animalele tratate indică producerea unei aberații cromozomiale de natură structurală sau numerică.

Eritrocite micronucleate nou-formate sunt identificate și numărate prin colorare, fiind evaluate apoi fie prin examinarea vizuală, utilizând un microscop, fie prin analiză automată. Numărarea de suficiente eritrocite imature din sângele periferic sau măduva osoasă a animalelor adulte este facilitată în mare măsură de utilizarea unei platforme automate de examinare. Astfel de platforme reprezintă alternative acceptabile ale evaluării manuale (2). Studiile comparative au arătat că astfel de metode, utilizând standarde de calibrare adecvate, pot oferi o sensibilitate și reproductibilitate intra- și inter-laboratore mai bună decât examinarea microscopică manuală (3) (4). Sisteme automate care pot măsura frecvențele de eritrocite micronucleate includ, dar nu se limitează la, citometre de flux (5), platforme de analiză a imaginilor (6) (7) și citometre cu scanare laser (8).

Deși acest lucru nu este efectuat în mod normal ca parte a testului, fragmentele de cromozomi se pot distinge de cromozomii întregi printr-o serie de criterii. Unul dintre acestea este identificarea prezenței sau absenței unui kinetocor sau ADN centromeric, ambii fiind caracteristici cromozomilor întregi. Absența unui kinetocor sau ADN centromeric indică faptul că micronucleul conține doar fragmente de cromozomi, în timp ce prezența indică pierderea de cromozomi.

Definiții ale terminologiei utilizate sunt prevăzute în apendicele 1.

CONSIDERAȚII INIȚIALE

Măduva osoasă de la rozătoare adulte tinere este țesutul țintă pentru leziuni genetice în cadrul acestui test, având în vedere faptul că eritrocitele sunt produse în acest țesut. Măsurarea micronucleelor în eritrocitele imature în sângele periferic este acceptabilă la alte specii de mamifere a căror sensibilitate specifică pentru detectarea substanțelor chimice care produc aberații cromozomiale de natură structurală sau numerică a fost demonstrată (prin inducție de micronuclee în eritrocitele imature), pe baza unei justificări stiințifice. Frecvența eritrocitelor imature micronucleate reprezintă criteriul principal. Frecvența eritrocitelor mature care conțin micronuclee în sângele periferic poate fi utilizată, de asemenea, drept criteriu la speciile fără o selecție splenică puternică împotriva celulelor micronucleate și în cazul în care animalele sunt tratate în mod continuu pentru o perioadă care depășește durata de viață a eritrocitelor la speciile utilizate (de exemplu, 4 săptămâni sau mai mult la șoareci).

În cazul în care există dovezi că substanța (substanțele) chimică(e) de testat sau metabolitul (metaboliții) specific(i) nu va (vor) ajunge la țesutul țintă, utilizarea acestui test ar putea să nu fie potrivită.

Înainte de utilizarea metodei de testare pe un amestec pentru a genera datele în scopul unui obiectiv de reglementare specific, trebuie să se examineze dacă și, în caz afirmativ, din ce cauză, aceasta poate oferi rezultate adecvate în respectivul scop. Astfel de considerații nu sunt necesare în cazul în care există o cerință normativă pentru testarea amestecului.

PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Se expun animalele la substanța de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare. În cazul în care se utilizează măduvă osoasă, animalele sunt eutanasiate în condiții umane la un moment adecvat după tratament, se extrage măduva osoasă, se prepară și se colorează lamele (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Atunci când se utilizează sânge periferic, acesta se colectează la un moment(e) adecvat(e) după tratament, se prepară și se colorează lamele (12) (16) (17) (18). Atunci când tratamentul este administrat acut, este important să se selecteze momente de recoltare a măduvei osoase sau a sângelui în care inducția eritrocitelor imature micronucleate provocată de tratament poate fi detectată. În cazul prelevării de probe din sângele periferic, o perioadă suficientă de timp trebuie, de asemenea, să treacă pentru ca aceste evenimente să apară în sângele în circulație. Lamele preparate se examinează pentru a depista prezența micronucleelor, fie prin vizualizare utilizând un microscop, prin analizarea imaginii, prin citometria în flux sau citometria cu scanare laser.

VERIFICAREA COMPETENȚEI LABORATORULUI

Verificările de competență

Pentru a stabili o experiență suficientă în efectuarea testului înainte de a-l utiliza pentru testele de rutină, laboratorul trebuie să fi demonstrat capacitatea de a reproduce rezultatele așteptate în urma datelor publicate (17) (19) (20) (21) (22) pentru frecvența micronucleelor cu minimum două substanțe chimice martor pozitive (inclusiv răspunsurile slabe cauzate de doze scăzute de martori pozitivi), cum ar fi cele enumerate în tabelul 1 și cu martori vehicul/solvent compatibili (a se vedea punctul 26). Aceste experimente utilizează doze care produc creșteri reproductibile și legate de doză și demonstrează sensibilitatea și gama dinamică a sistemului de testare în țesutul de interes (măduva osoasă sau sânge periferic), utilizând metoda de examinare care urmează să fie utilizată în cadrul laboratorului. Această cerință nu se aplică laboratoarelor care au experiență, și anume, care dețin o bază de date anterioare disponibilă astfel cum este definit la punctele 14-18.

Date privind martorii testați anterior

Pe parcursul verificărilor de competență, laboratorul trebuie să stabilească:

La obținerea primelor date pentru o distribuție a martorilor negativi testați anterior, martorii negativi testați în paralel trebuie să fie în concordanță cu datele publicate referitoare la martori, în cazul în care acestea există. Pe măsură ce tot mai multe date experimentale sunt adăugate la distribuția martorilor testați anterior, martorii negativi testați în paralel trebuie să fie, în mod ideal, de până la 95 % din limitele de control ale respectivei distribuții. Baza de date privind martorii negativi testați anterior trebuie să fie solidă din punct de vedere statistic pentru a asigura capacitatea laboratorului de a evalua distribuția datelor sale privind martorii negativi. Referințele bibliografice sugerează că poate fi necesar un minim de 10 de experimente, dar ar trebui, de preferință, ca baza de date să fie constituită din cel puțin 20 experimente efectuate în conformitate cu condiții experimentale comparabile. Laboratoarele trebuie să utilizeze metode de control al calității precum grafice de control [de exemplu, diagrame C sau X-bar (23)], pentru a identifica gradul de variabilitate al datelor lor și pentru a dovedi faptul că metodologia se află „sub control” în respectivul laborator. Referințele bibliografice prezintă recomandări suplimentare privind modalitatea în care se pot constitui și utiliza datele anterioare (și anume, criteriile de includere și de excludere a datelor în datele istorice și criteriile de acceptabilitate pentru un anumit experiment) (24).

În cazul în care laboratorul nu completează un număr suficient de experimente pentru a stabili o distribuție a martorilor negativi solidă din punct de vedere statistic (a se vedea punctul 15) în timpul verificărilor de competență (descrise la punctul 13), se acceptă posibilitatea elaborării distribuției în timpul primelor teste de rutină. Această abordare trebuie să respecte recomandările stabilite în referințele bibliografice (24) și rezultatele martorilor negativi obținute în aceste experimente trebuie să rămână în conformitate cu datele publicate cu privire la martorii negativi.

Orice modificare la protocolul experimental se ia în considerare în ceea ce privește impactul acesteia asupra datelor rezultate, care trebuie să fie în conformitate cu baza de date existentă privind martorii testați anterior a laboratorului. Doar inconsecvențele majore conduc la stabilirea unei noi baze de date privind martorii testați anterior, în cazul în care opiniile experților stabilesc faptul că acestea diferă față de distribuția anterioară (a se vedea punctul 15). În timpul procesului de restabilire, o bază completă de date cu privire la martorii negativi nu este neapărat necesară pentru a permite efectuarea unui test propriu-zis, cu condiția ca laboratorul să poată demonstra că valorile martor negative ale acestuia rămân consecvente fie cu bazele de date anterioare aferente, fie cu datele publicate corespunzătoare.

Datele cu privire la martorii negativi trebuie să cuprindă incidența eritrocitelor micronucleate imature pentru fiecare animal. Martorii negativi testați în paralel trebuie să fie, în mod ideal, de până la 95 % din limitele de control ale distribuției bazei de date privind martorii negativi testați în paralel a laboratorului. În cazul în care datele privind martorii negativi testați în paralel se situează în afara limitelor de control de 95 %, acestea pot fi acceptabile pentru a fi incluse în distribuția de martori testați anterior în măsura în care datele respective nu reprezintă valori aberante extreme și există dovezi că sistemul de testare se află „sub control” (a se vedea punctul 15) și nu există nicio dovadă de defecțiuni tehnice sau umane.

DESCRIEREA METODEI

Preparate

Selectarea speciilor de animale

Se utilizează șușe de laborator utilizate în mod curent, alegându-se animale adulte, tinere, sănătoase. Se pot utiliza șoareci, șobolani sau la o altă specie de mamifere adecvată. Atunci când se utilizează sânge periferic, trebuie stabilit faptul că îndepărtarea splenică a celulelor micronucleate din circulație nu compromite detectarea micronucleelor induse la speciile selectate. Acest lucru a fost demonstrat în mod clar în cazul sângelui periferic de șoarece și șobolan (2). Justificarea științifică pentru utilizării altor specii decât șobolani și șoareci trebuie furnizată în raport. În cazul în care se utilizează alte specii decât rozătoare, se recomandă ca măsurarea micronucleelor induse să se integreze în alt test de toxicitate corespunzător.

Condiții de adăpostire și de hrănire a animalelor

În cazul rozătoarelor, temperatura sălii în care se află animalele trebuie să fie de 22 °C (± 3 °C). Cu toate că umiditatea relativă este, în mod ideal, de 50-60 %, aceasta trebuie să fie de cel puțin 40 % și să nu depășească, de preferință,70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul. Spațiul se iluminează artificial, cu o alternanță de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Alegerea regimului alimentar poate fi influențată de necesitatea de a asigura o proporție adecvată a unei substanțe chimice de testat în cazul administrării prin această metodă. Rozătoarele se adăpostesc în grupuri mici (cel mult cinci pentru fiecare cușcă), de același sex și grup supus tratamentului, în cazul în care nu se preconizează niciun comportament agresiv, de preferință în cuști cu pardoseală solidă cu îmbogățire adecvată a mediului de viață. Animalele pot fi adăpostite individual în cazul în care acest lucru este justificat din punct de vedere științific.

Pregătirea animalelor

Se utilizează în mod normal animale adulte, tinere, sănătoase (pentru rozătoare, de preferință, de 6-10 săptămâni la începutul tratamentului, cu toate că animale puțin mai în vârstă sunt, de asemenea, acceptabile), care sunt distribuite în mod aleatoriu în grupe martor și grupe de tratament. Animalele se identifică în mod individual prin utilizarea unei metode umane, foarte puțin invazive (de exemplu, prin aplicarea de inele, crotaliere, microcipare sau identificare biometrică, dar nu prin secționarea urechii sau a degetului) și se aclimatizează la condițiile de laborator timp de minimum cinci zile. Cuștile trebuie dispuse astfel încât posibilele efecte datorate amplasării în cușcă să fie reduse la minim. Se evită contaminarea încrucișată dintre martorul pozitiv și substanța chimică de testat. La începutul studiului, greutatea animalelor trebuie să prezinte o variație minimă și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.

Pregătirea dozelor

Substanțele de testat în stare solidă se dizolvă sau se pun în suspensii în solvenți sau vehicule corespunzătore sau se amestecă în alimente sau în apa de băut înainte de a fi administrate animalelor. Substanțele chimice de testat în stare lichidă se pot administra direct sau se pot dilua înainte de administrare. Pentru expunerile prin inhalare, substanțele chimice de testat pot fi administrate sub formă de gaz, vapori sau aerosol solid/lichid, în funcție de proprietățile fizico-chimice ale acestora. Se utilizează preparate proaspete de substanță chimică de testat, cu excepția cazului în care datele de stabilitate demonstrează caracterul acceptabil al stocării și definesc condiții de stocare corespunzătoare.

Condiții de testare

Solvent/vehicul

Solventul/vehiculul nu trebuie să producă efecte toxice la volumele de doză utilizate și nu trebuie să reacționeze chimic cu substanțele chimice de testat. În cazul în care se utilizează alți solvenți/vehicule decât cei recunoscuți, includerea acestora trebuie să fie justificată cu date de referință care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare mai întâi utilizarea unui solvent/vehicul apos. Exemple de solvenți/vehicule compatibili utilizați în mod obișnuit includ apa, soluția fiziologică salină, soluția de metilceluloză, soluția de carboximetilceluloză sare de sodiu, uleiul de măsline și uleiul de porumb. În absența unor date anterioare sau publicate cu privire la martori, care să ateste că niciun micronucleu sau efect vătămător nu este indus de către un anumit solvent/vehicul atipic, se efectuează un studiu inițial pentru a stabili acceptabilitatea martorului tratat cu solvent/vehicul.

Controale

Martorii pozitivi

Pentru fiecare test se include, în mod normal, un grup de animale tratate cu o substanță chimică martor pozitivă. Acest lucru poate fi eliminat în cazul în care laboratorul de testare a demonstrat competență în efectuarea testului și a stabilit un interval de martori pozitivi testați anterior. În cazul în care un grup de martori pozitivi testați în paralel nu este inclus, în fiecare experiment se includ martori examinați (lame fixate și necolorate sau probe de suspensie celulară, în funcție de metoda de examinare). Acestea pot fi obținute prin includerea în sistemul de examinare a studiului de probe de referință adecvate care au fost obținute și păstrate în urma unui experiment separat cu martori pozitivi efectuat periodic (de exemplu, la fiecare 6-18 luni), de exemplu, în timpul testărilor de competență și ulterior în mod regulat, dacă este necesar.

Substanțele chimice martor pozitive trebuie să producă în mod fiabil o creștere detectabilă în ceea ce privește frecvența micronucleelor față de nivelul spontan. Atunci când se utilizează examinarea manuală prin microscopie, dozele de martor pozitiv se aleg astfel încât să se obțină efecte clare, dar fără a releva imediat examinatorului identitatea probelor codate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită față de cea utilizată în cazul substanței chimice de testat, folosind o schemă de tratament diferită și o singură prelevare de probe. În plus, utilizarea de martori pozitivi din aceeași clasă de substanțe chimice poate fi luate în considerare, după caz. Tabelul 1 include exemple de substanțe chimice martor pozitive.

Tabelul 1

Exemple de substanțe chimice martor pozitive.

Substanțe chimice și Nr. CAS

Metansulfonat de etil [NR. CAS 62-50-0]

Metansulfonat de metil [NR. CAS 66-27-3]

Etil nitrozouree [NR. CAS 759-73-9]

Mitomicină C [NR. CAS 50-07-7]

Ciclofosfamidă (monohidrat) [NR. CAS 50-18-0 (NR. CAS 6055-19-2)]

Trietilenmelamină [NR. CAS 51-18-3]

Colchicină [NR. CAS 64-86-8] sau vinblastină [NR. CAS 865-21-4] – ca aneugeni

Martorii negativi

Animalele din grupul martor negativ se iau în considerare la fiecare prelevare de probe și se manipulează de altfel în același mod precum grupurile tratate, cu excepția faptului că nu beneficiază de tratamentul cu substanța chimică de testat. În cazul în care un solvent/vehicul este utilizat pentru administrarea substanței chimice de testat, acesta se administrează grupului martor. Cu toate acestea, în cazul în care coerența variabilității inter-animale și frecvențele celulelor cu micronuclee sunt demonstrate de datele privind martorii negativi testați anterior la fiecare prelevare de probe efectuată de către laboratorul de testare, ar putea fi necesară o singură prelevare de probe pentru martorul negativ. În cazul în care se utilizează o singură prelevare de probe pentru martorii negativi, aceasta trebuie să fie prima prelevare de probe utilizată în cadrul studiului.

În cazul în care se utilizează sânge periferic, se acceptă o probă prelevată înainte de tratament în locul unui martor negativ testat în paralel pentru studiile pe termen scurt, atunci când datele rezultate sunt coerente cu baza de date privind martorii testați anterior a laboratorului de testare. În cazul șobolanilor, s-a demonstrat că prelevarea de probe de volume mici (de exemplu, sub 100 μl/zi) înainte de tratament are un impact minim asupra frecvenței de fond a micronucleelor (25).

PROCEDURĂ

Numărul și sexul animalelor

În general, reacția de micronucleu este similară între masculi și femele, prin urmare, majoritatea studiilor ar putea fi efectuate pe oricare dintre sexe (26). Datele care demonstrează diferențe relevante între masculi și femele (de exemplu, diferențele în materie de toxicitate sistemică, metabolism, biodisponibilitate, toxicitate în măduva osoasă, etc., inclusiv, de exemplu, într-un studiu de stabilire a dozelor) ar încuraja utilizarea ambelor sexe. În acest caz, ar fi adecvat să se efectueze un studiu în cazul ambelor sexe, de exemplu, ca parte a unui studiu de toxicitate cu doză repetată. Utilizarea modelului factorial poate fi adecvată în cazul în care sunt utilizate ambele sexe. Apendicele 2 prezintă detalii cu privire la modalitatea de analiză a datelor care utilizează acest model.

Dimensiunea grupurilor la începutul studiului se stabilește cu scopul de a furniza pentru fiecare grup cel puțin 5 animale analizabile de același sex sau din fiecare sex în cazul în care ambele sexe sunt utilizate. În cazul în care expunerea umană la substanțe chimice este specifică unui anumit sex, cum ar fi, de exemplu, în cazul unor produse farmaceutice, testul se efectuează pe sexul corespunzător. Ca o orientare pentru cerințe maxime tipice animalelor, un studiu pe măduva osoasă efectuat în conformitate cu parametrii stabiliți la punctul 37, cu trei grupuri de dozare și martori negativi și pozitivi testați în paralel (fiecare grup alcătuit din cinci animale de același sex) ar necesita între 25 și 35 de animale.

Doze

În cazul în care se efectuează un studiu preliminar de stabilire a dozelor deoarece nu există date adecvate disponibile pentru a contribui la selectarea dozei, acesta se realizează în același laborator, utilizând aceeași specie, șușă, sex și regim de tratament precum cele care urmează să fie utilizate în studiul principal (27). Studiul are ca obiectiv identificarea dozei maxime tolerate (DMT), definită drept doza cea mai ridicată care va fi tolerată fără dovezi de toxicitate care să limiteze studiul, în funcție de durata perioadei de studiu [de exemplu, cu reducerea greutății corporale sau a citotoxicității sistemului hematopoietic, dar nu deces sau semne de durere, suferință sau stres care să necesite eutanasiere în condiții umane (28)].

Doza maximă poate fi definită, de asemenea, ca doza care produce toxicitate în măduva osoasă (de exemplu, o reducere a proporției de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite din măduva osoasă sau din sângele periferic de mai mult de 50 %, dar nu mai puțin de 20 % din valoarea probei martor). Cu toate acestea, atunci când sunt analizate celulele CD71 pozitiv în circulația periferică a sângelui (și anume, prin citometria de flux), această fracție foarte tânără de eritrocite imature răspunde mai repede provocărilor toxice decât cohorta mai mare de eritrocite imature cu ARN pozitiv. Prin urmare, toxicitatea aparent mai mare ar putea fi evidentă prin modelele de expunere acută care examinează fracția CD71 pozitivă de eritrocite imature în raport cu cele care identifică eritrocite imature pe baza conținutului de ARN. Din acest motiv, atunci când se utilizează experimente de cinci sau mai puține zile de tratament, doza cea mai ridicată pentru substanțele chimice de testat care provoacă toxicitate poate fi definită ca doza care provoacă o reducere semnificativă din punct de vedere statistic a proporției de eritrocite imature CD71 pozitiv în raport cu numărul total de eritrocite, dar nu la mai puțin de 5 % din valoarea probei martor (29).

Substanțele chimice care prezintă saturație a proprietăților toxicocinetice sau provoacă procese de detoxifiere care pot conduce la o diminuare a expunerii după un tratament pe termen lung pot reprezenta excepții de la criteriile de stabilire a dozelor și se evaluează de la caz la caz.

Pentru a obține informații privind relația doză-răspuns, un studiu complet trebuie să includă un grup martor negativ și un minim de trei niveluri de doze separate, în general, de un factor de 2, dar nu mai mult de 4. În cazul în care substanța chimică de testat nu produce toxicitate într-un studiu de stabilire a dozelor sau pe baza datelor existente, doza maximă pentru o perioadă de administrare de 14 zile sau mai mult este de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi sau pentru perioade de administrare mai mici de 14 zile, 2 000 mg/kg greutate corporală/zi. Cu toate acestea, în cazul în care substanța chimică de testat provoacă toxicitate, DMT trebuie să fie cea mai mare doză administrată, iar dozele utilizate trebuie, de preferat, să acopere un interval de toxicitate de la doza maximă până la o doză care provoacă toxicitate minimă sau nu provoacă toxicitate. În cazul în care se observă toxicitate în țesutul țintă (măduva osoasă) la toate dozele testate, se recomandă efectuarea unui studiu suplimentar la doze netoxice. Studiile care au ca scop caracterizarea pe deplin a informațiilor cantitative doză-răspuns pot necesita grupuri suplimentare de dozare. Pentru anumite tipuri de substanțe chimice de testat (de exemplu, produsele farmaceutice umane) reglementate prin cerințe specifice, aceste limite pot varia.

Test-limită

În cazul în care experimentele pentru stabilirea intervalului sau datele existente legate de șușele de animale indică faptul că un regim de tratament de cel puțin o doza limită (descrisă mai jos) nu produce efecte toxice detectabile (inclusiv nicio diminuare a proliferării măduvei osoase sau alte semne de citotoxicitate în țesutul țintă) și în cazul în care o genotoxicitate este improbabilă pe baza studiilor in vitro de genotoxicitate sau datelor provenite de la substanțele chimice cu o structura apropriată, este posibil ca un studiu integral cu trei niveluri de doze diferite să nu fie considerat necesar dacă s-a demonstrat că substanța (substanțele) chimică(e) de testat ajunge (ajung) la țesutul țintă (măduva osoasă). În astfel de cazuri, un singur nivel de doză, la doza limită, poate fi suficient. În cazul în care administrarea se realizează timp de 14 zile sau mai mult, doza limită este de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi. Pentru administrarea cu o durată mai mică de 14 zile, doza limită este de 2 000 mg/kg greutate corporală/zi.

Administrarea dozelor

La elaborarea unui test se ia în considerare calea anticipată de expunere umană. Prin urmare, căile de expunere precum alimentația, apa potabilă, expunerea locală, subcutanată, intravenoasă, calea orală (prin gavaj), inhalarea, expunerea intratraheală sau implantarea pot fi alese, după caz. În orice caz, calea se alege pentru a asigura expunerea adecvată a țesutului (țesuturilor) țintă. Injecția intraperitoneală nu se recomandă, în general, deoarece nu este o cale destinată expunerii umane și se utilizează doar cu justificări științifice specifice. În cazul în care substanța chimică de testat este administrată în amestec cu hrana sau apa potabilă, în special în cazul administrării unice, se acordă atenție deosebită intervalului dintre consumul de hrană și apă și prelevarea de probe, care trebuie să fie suficient pentru a permite identificarea efectelor (a se vedea punctul 37). Volumul maxim de lichid care se poate administra prin gavaj sau prin injecție într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul nu trebuie să depășească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală, exceptând cazul soluțiilor apoase, când se poate administra un maxim de 2 ml/100 g. Utilizarea unor volume mai mari decât cele menționate trebuie să fie justificată. Exceptând substanțele chimice de testat iritante sau corozive, care vor prezenta, în mod normal, efecte exacerbate la concentrații mai mari, variația volumului testat se reduce la minim prin ajustarea concentrației, astfel încât să se asigure administrarea unui volum constant în raport cu greutatea corporală pentru toate dozele.

Schema de tratament

De preferință, se efectuează 2 sau mai multe tratamente, administrate la intervale de 24 de ore, în special la integrarea acestui test în alte studii de toxicitate. Cu titlu subsidiar, pot fi administrate tratamente unice, dacă se justifică științific (de exemplu, substanțe chimice de testat despre care se știe că blochează ciclul celular). Substanțele chimice de testat se pot administra, de asemenea, în doză fracționată, și anume, două sau mai multe tratamente în aceeași zi, la distanță de nu mai mult de 2-3 ore, pentru a facilita administrarea unui volum mare. În aceste circumstanțe sau atunci când substanța chimică de testat este administrată prin inhalare, momentul pentru prelevarea de probe trebuie programat în funcție de ultima administrare a dozei sau de sfârșitul expunerii.

Testul poate fi efectuat la șoareci sau șobolani prin una dintre următoarele trei metode:

Alte regime de dozare sau de prelevare pot fi utilizate atunci când este relevant și se justifică din punct de vedere științific, precum și pentru a facilita integrarea cu alte teste de toxicitate.

Observații

Se recomandă efectuarea de observații clinice generale asupra animalelor de experiență și înregistrarea semnelor clinice cel puțin o dată pe zi, de preferat la aceeași (aceleași) oră (ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrarea dozei. În perioada de administrare a dozei, se examinează toate animalele cel puțin de două ori pe zi pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea. Se cântăresc toate animalele la începutul studiului, cel puțin o dată pe săptămână în timpul studiilor cu doze repetate și la eutanasiere. În cadrul studiilor cu o durată de cel puțin o săptămână, se măsoară consumul de hrană cel puțin săptămânal. În cazul în care substanța chimică de testat este administrată prin apa de băut, se măsoară consumul de apă la fiecare schimbare de apă și cel puțin o dată pe săptămână. Animalele care prezintă indicatori neletali de toxicitate excesivă se eutanasiază înaintea de încheierea perioadei de testare (28). În anumite circumstanțe, temperatura corpului animalelor ar putea fi monitorizată, având în vedere faptul că hipertermia și hipotermia provocată de tratament au fost implicate în producerea de rezultate false (32) (33) (34).

Expunere țesutului țintă

Se prelevează o probă de sânge la momentul (momentele) adecvat(e) pentru a permite investigarea nivelurilor plasmatice ale substanțelor chimice de testat cu scopul de a demonstra faptul că măduva osoasă a fost expusă, acolo unde este cazul și unde nu există alte date de expunere (a se vedea punctul 48).

Prepararea măduvei osoase/a sângelui

Celule de măduvă osoasă se obțin în mod obișnuit din femurul sau tibia animalelor imediat după eutanasierea în condiții umane. De regulă, celulele se extrag, se depun pe lame și se colorează prin metodele stabilite. Cantități mici de sânge periferic pot fi obținute în conformitate cu standardele de bunăstare animală adecvate, folosind fie o metodă care să permită supraviețuirea animalelor de experiență precum sângerarea din vena caudală sau alte vase de sânge corespunzătoare, fie prin puncție cardiacă sau prelevarea de probe de la un vas mare la eutanasierea animalului. Atât pentru eritrocitele derivate din măduva osoasă, cât și pentru cele derivate din sânge periferic, în funcție de metoda de analiză, celulele pot fi colorate imediat supravital (16) (17) (18), pot fi întinse pe lame și apoi colorate pentru microscopie sau pot fi fixate și colorate în mod adecvat pentru citometria de flux. Utilizarea unui colorant specific pentru ADN [de exemplu, oranj de acridină (35) sau Hoechst 33258 plus pironină-Y (36)] poate să elimine unele dintre artefactele asociate utilizării unui colorant nespecific pentru ADN. Avantajul menționat nu exclude utilizarea coloranților convenționali (de exemplu, Giemsa pentru analiza microscopică). Se pot utiliza și alte sisteme [de exemplu, coloane de celuloză pentru eliminarea celulelor nucleate (37) (38)], cu condiția ca sistemele respective să se fi dovedit compatibile cu pregătirea probelor în laborator.

În cazul în care aceste metode sunt aplicabile (39), anticorpii antikinetocori, metoda FISH cu sonde ADN pancentromerice (40) sau marcarea in situ cu ajutorul amorselor pancentrometrice, împreună cu un colorant de contrast al ADN adecvat (41) pot fi utilizați pentru a identifica natura micronucleelor (cromozomi/fragmente cromozomiale) pentru a stabili dacă mecanismul inducției de micronuclee se datorează activității clastogene și/sau aneugene. Alte metode de diferențiere a efectelor clastogene și aneugene pot fi utilizate, cu condiția ca eficacitatea acestora să fi fost demonstrată.

Analiză (manuală și automată)

Toate lamele sau probele pentru analiză, inclusiv cele cu martori pozitivi și negativi, se codifică în mod independent înainte de orice tip de analiză și se randomizează astfel încât examinatorul să nu cunoască condiția de tratament; o astfel de codificare nu este necesară atunci când se utilizează sisteme automate de examinare care nu se bazează pe inspecție vizuală și nu pot fi afectate de subiectivitatea operatorului. Pentru fiecare animal se determină proporția de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite (imature + mature) prin examinarea a cel puțin 500 de eritrocite pentru măduva osoasă și 2 000 de eritrocite pentru sângele periferic (42). Cel puțin 4 000 de eritrocite imature se analizează per animal pentru a determina incidența eritrocitelor imature micronucleate (43). În cazul în care datele cu privire la martorii negativi testați anterior indică faptul că valoarea medie a frecvenței de fond de eritrocite imature micronucleate este < 0,1 % în laboratorul de testare, se ia în considerare examinarea de celule suplimentare. Atunci când se analizează probe, proporția de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite de la animalele tratate nu trebuie să fie mai mică de 20 % din proporția martorului tratat cu vehicul/solvent la examinarea prin microscopie și mai mică decât aproximativ 5 % din proporția martorului tratat cu vehicul/solvent la examinarea de eritrocite imature CD71+ prin metode citometrice (a se vedea punctul 31) (29).De exemplu, pentru un test de măduvă osoasă examinat prin microscopie, în cazul în care proporția de probă martor de eritrocite imature în măduva osoasă este de 50 %, limita superioară de toxicitate ar fi de 10 % eritrocite imature.

Deoarece splina de șobolan sechestrează și distruge eritrocitele micronucleate, pentru a menține un nivel ridicat de sensibilitate a testului atunci când se analizează sânge periferic de șobolan, este preferabil să se limiteze analiza eritrocitelor imature micronucleate la cea mai tânără fracție. Atunci când se utilizează metode de analiză automată, aceste eritrocite imature pot fi identificate pe baza conținutului lor ridicat de ARN sau pe baza nivelului ridicat de receptori de transferină (CD71+) exprimat pe suprafața acestora (31). Cu toate acestea, comparația directă a diferitelor metode de colorare a arătat că se pot obține rezultate satisfăcătoare prin diferite metode, inclusiv colorarea convențională cu oranj de acridină (3) (4).

DATE ȘI RAPORTARE

Prelucrarea rezultatelor

Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Pentru fiecare animal, se consemnează în mod separat numărul de eritrocite imature examinate, numărul de eritrocite imature micronucleate și numărul de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite. Atunci când șoarecii se tratează în mod continuu timp de 4 săptămâni sau mai mult, se prezintă, de asemenea, datele privind numărul și proporția de eritrocite mature micronucleate, dacă au fost colectate. Datele cu privire la toxicitatea animală și semnele clinice trebuie, de asemenea, să fie raportate.

Criterii de acceptabilitate

Următoarele criterii determină acceptabilitatea testului:

Evaluarea și interpretarea rezultatelor

Cu condiția îndeplinirii tuturor criteriilor de acceptabilitate, o substanță chimică de testat este considerată în mod clar pozitivă în cazul în care:

În cazul în care se analizează doar doza maximă la un anumit moment de prelevare de probe, o substanță chimică de testat este considerată în mod clar pozitivă în cazul în care există o creștere semnificativă din punct de vedere statistic, comparativ cu martorul negativ testat în paralel, iar rezultatele se situează în afara distribuției de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limite de control 95 % pe baza distribuției Poisson). Referințele bibliografice prezintă recomandări pentru cele mai adecvate metode statistice (44) (45) (46) (47). La efectuarea unei analize a relației doză-răspuns, se analizează cel puțin trei grupuri tratate de dozare. Testele statistice utilizează animalul ca unitate experimentală. Rezultatele pozitive ale testului de micronucleu indică faptul că substanța chimică de testat determină formarea de micronuclee ca urmare a leziunilor cromozomiale sau leziunilor aparatului mitotic din eritroblaștii speciei testate. În cazul în care s-a efectuat un test pentru depistarea centromerelor în micronuclee, o substanță chimică de testat ce produce micronuclee care conțin centromer ( ADN centromeric sau kinetocor, indicând pierdere de cromozomi întregi) reprezintă dovada că substanța chimică de testat este un aneugen.

Cu condiția ca toate criteriile de acceptabilitate să fie îndeplinite, o substanță chimică de testat este considerată în mod clar negativ dacă, în toate condițiile experimentale examinate:

Referințele bibliografice prezintă recomandări pentru cele mai adecvate metode statistice (44) (45) (46) (47). Dovezi ale expunerii măduvei osoase la o substanță chimică de testat pot include o diminuare a raportului dintre eritrocitele imature față de eritrocitele mature sau măsurarea concentrațiilor plasmatice sau sangvine din substanța chimică de testat. În cazul administrării intravenoase, nu sunt necesare dovezi de expunere. În mod alternativ, datele ADME, obținute în cadrul unui studiu independent utilizând aceeași cale și aceeași specie, pot fi utilizate pentru a demonstra expunerea măduvei osoase. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile de testare, substanța chimică de testat nu produce micronuclee în eritrocitele imature ale speciei de testat.

În cazul unui răspuns clar pozitiv sau clar negativ, nu există nicio cerință referitoare la verificare.

În cazul în care răspunsul nu este în mod clar negativ sau pozitiv și pentru a acorda asistență în stabilirea relevanței biologice a rezultatului (de exemplu, o creștere slabă sau de limită), datele se evaluează de către experți și/sau prin investigații suplimentare realizate pe experimentele existente. În unele cazuri, analizarea mai multor celule sau repetarea experimentului utilizând condițiile experimentale modificate ar putea fi utile.

În cazuri rare, inclusiv după efectuarea de investigații suplimentare, datele vor exclude posibilitatea unui rezultat pozitiv sau negativ al substanței chimice de testat și, prin urmare, studiul va fi concluzionat ca fiind echivoc.

Raport de testare

Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații:

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

(6)

În partea B, capitolul B.15. se elimină.

(7)

În partea B, capitolul B.16. se elimină.

(8)

În partea B, capitolul B.18. se elimină.

(9)

În partea B, capitolul B.19. se elimină.

(10)

În partea B, capitolul B.20. se elimină.

(11)

În partea B, capitolul B.24. se elimină.

(12)

În partea B, capitolul B.47. se înlocuiește cu următorul text:

„B.47   Metoda de testare a opacității și permeabilității corneene la bovine pentru identificarea i) substanțelor chimice care produc lezarea oculară gravă și a ii) substanțelor chimice care nu necesită clasificare pentru iritația oculară sau lezarea oculară gravă

INTRODUCERE

Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 437 (2013). Metoda de testare a opacității și permeabilității corneene la bovine (BCOP) a fost evaluată de Comitetul de coordonare la nivel de agenții privind validarea metodelor alternative (ICCVAM), în colaborare cu Centrul european pentru validarea metodelor alternative (ECVAM) și Centrul Japonez pentru validarea metodelor alternative (JaCVAM) în anii 2006 și 2010 (1) (2). În cadrul primei evaluări, metoda de testare BCOP a fost evaluată pentru utilitatea acesteia la identificarea substanțelor chimice (substanțe și amestecuri) care provoacă leziuni oculare grave (1). În cadrul celei de a doua evaluări, metoda de testare BCOP a fost evaluată pentru utilitatea acesteia la identificarea substanțelor chimice (substanțe și amestecuri) care nu sunt clasificate în ceea ce privește iritarea oculară sau lezarea oculară gravă (2). Baza de date de validare BCOP a fost constituită din 113 substanțe și 100 de amestecuri în total (2) (3). În urma acestor evaluări și a revizuirii lor inter pares s-a concluzionat faptul că metoda de testare poate identifica în mod corect substanțele chimice (atât substanțe, cât și amestecuri) care provoacă lezarea oculară gravă (categoria 1), precum și substanțele care nu necesită clasificare pentru iritația oculară sau lezarea oculară gravă, astfel cum este definit de Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice (GHS) al Organizației Națiunilor Unite (ONU) (4) și de Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 privind clasificarea, etichetarea și ambalarea substanțelor și a amestecurilor (CLP) (7) și, prin urmare, a fost declarată valabilă din punct de vedere științific pentru ambele scopuri. Lezarea oculară gravă reprezintă producerea de leziuni tisulare la ochi sau deteriorarea fizică gravă a vederii, în urma aplicării unei substanțe chimice de testat pe suprafața anterioară a ochiului, care nu este complet reversibilă într-un interval de 21 de zile de la aplicare. Substanțele chimice de testat care provoacă leziuni oculare grave sunt clasificate în categoria 1 din GHS al ONU. Substanțele chimice care nu sunt clasificate în ceea ce privește iritația oculară sau lezarea oculară gravă sunt definite ca fiind cele care nu îndeplinesc cerințele pentru clasificarea în categoria 1 sau 2 (2A sau 2B) din GHS al ONU, și anume, cele menționate în „nicio categorie” din GHS al ONU. Prezenta metodă de testare include utilizarea și limitele recomandate pentru metoda de testare BCOP pe baza evaluărilor acesteia. Principalele diferențe dintre versiunea originală din anul 2009 și versiunea actualizată din anul 2013 ale Orientării OCDE privind testarea includ, dar nu sunt limitate la: utilizarea metodei de testare BCOP pentru a identifica substanțele chimice care nu necesită clasificare conform GHS al ONU (punctele 2 și 7); clasificările aplicabilității metodei de testare BCOP la testarea alcoolilor, cetonelor și substanțelor solide (punctele 6 și 7) și a substanțelor și a amestecurilor (punctul 8); clasificări ale modalităților de testare a substanțelor tensioactive sau a amestecurilor care conțin surfactanți (punctul 28); actualizări și clarificări cu privire la martorii pozitivi (punctele 39 și 40); o actualizare a criteriilor de decizie ale metodei de testare BCOP (punctul 47); o actualizare a criteriilor de acceptare a studiului (punctul 48); o actualizare a elementelor raportului de testare (punctul 49); o actualizarea a apendicelui 1 cu privire la definiții; adăugarea apendicelui 2 pentru capacitatea predictivă a metodei de testare BCOP în diferite sisteme de clasificare; o actualizarea a apendicelui 3 cu privire la lista substanțelor chimice de verificare; și o actualizare a apendicelui 4 cu privire la suportul cornean BCOP (punctul 1) și opacimetru (punctele 2 și 3).

În prezent, este general acceptat faptul că, în viitorul apropiat, niciun test in vitro de iritație oculară nu va putea înlocui testul ocular in vivo Draize pentru efectuarea de predicții în cadrul întregii game de iritații pentru diferite clase de substanțe chimice. Cu toate acestea, combinații strategice de mai multe metode de testare alternative în cadrul unei strategii de testare (secvențiale) ar putea înlocui testul ocular Draize (5). Abordarea descendentă (5) este concepută pentru a fi utilizată în cazul în care, pe baza informațiilor existente, se preconizează că o substanță chimică are potențial iritant ridicat, în timp ce abordarea ascendentă (5) este concepută pentru a fi utilizată în cazul în care, pe baza informațiilor existente, se preconizează că o substanță chimică nu cauzează iritație oculară suficientă pentru a necesita o clasificare. Metoda de testare BCOP este o metodă de testare in vitro care poate fi utilizată, în anumite circumstanțe și cu limitări specifice, pentru clasificarea pericolelor la nivel ocular și pentru etichetarea substanțelor chimice. Cu toate că nu este considerată valabilă ca metodă de testare de sine stătătoare de substituire a testului in vivo pe ochi de iepure, metoda de testare BCOP este recomandată ca o etapă inițială în cadrul unei strategii de testare precum abordarea descendentă propusă de către Scott et al.(5) pentru a identifica substanțele chimice care provoacă lezarea oculară gravă, și anume substanțele chimice care urmează să fie clasificate în categoria 1 din GHS al ONU fără testare suplimentară (4). Metoda de testare BCOP este recomandată, de asemenea, pentru a identifica substanțele chimice care nu necesită clasificare în ceea ce privește iritația oculară sau lezarea oculară gravă, astfel cum este definit de GHS al ONU („nicio categorie” din GHS al ONU) (4) în cadrul unei strategii de testare precum abordarea ascendentă (5). Cu toate acestea, o substanță chimică care nu se preconizează să cauzeze lezare oculară gravă sau care nu este clasificată pentru iritație oculară/lezare oculară gravă prin metoda de testare BCOP ar necesita teste suplimentare (in vitro și/sau in vivo) pentru a se stabili o clasificare definitivă.

Scopul acestei metode de testare este de a descrie procedurile utilizate pentru a evalua potențialul pericolelor la nivel ocular al unei substanțe chimice de testat, măsurat prin capacitatea acesteia de a provoca opacitate sau permeabilitate crescută a unei cornee izolate de bovină. Efectele toxice la nivelul corneei sunt măsurate prin: (i) scăderea transmisiei luminii (opacitate) și (ii) creșterea pătrunderii colorantului fluoresceină sodică (permeabilitate). Evaluarea opacității și permeabilității corneei după expunerea la o substanță chimică de testat se combină pentru a deduce un scor privind iritarea in vitro (IVIS) care se utilizează pentru clasificarea nivelului de iritabilitate a substanței chimice de testat.

Definițiile sunt prevăzute în apendicele 1.

CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI LIMITĂRI

Această metodă de testare are la bază protocolul metodei de testare BCOP al ICCVAM (6) (7) care a fost dezvoltat inițial din informații obținute din protocolul Institutului pentru științe in vitro- IIVS) și Protocolul 124 al INVITTOX (8). Acestea din urmă reprezintă protocolul utilizat pentru studiul de prevalidare sponsorizat de Comunitatea Europeană și efectuat în perioada 1997-1998. Cele două protocoale se bazează pe metoda de testare BCOP raportată pentru prima dată de către Gautheron et al.(9).

Metoda de testare BCOP poate fi utilizată pentru a identifica substanțele chimice care provoca leziuni oculare grave, astfel cum sunt definite de GHS al ONU, și anume substanțele chimice clasificate în categoria 1 din GHS al ONU (4). Atunci când este utilizată în acest scop, metoda de testare BCOP are o precizie generală de 79 % (150/191), o rată de rezultate fals pozitive de 25 % (32/126) și o rată de rezultate fals negative de 14 % (9/65) în comparație cu datele privind metoda de testare in vivo pe ochi de iepure clasificate conform sistemului de clasificare GHS al ONU (3) (a se vedea apendicele 2 tabelul 1). Atunci când substanțele chimice de testat din cadrul anumitor clase de substanțe chimice (și anume, alcooli, cetone) sau fizice (și anume, substanțe solide) sunt excluse din baza de date, metoda de testare BCOP are o precizie generală de 85 % (111/131), o rată de rezultate fals pozitive de 20 % (16/81) și o rată de rezultate fals negative de 8 % (4/50) în ceea ce privește sistemul de clasificare GHS al ONU (3). Eventualele deficiențe ale metodei de testare BCOP atunci când este utilizată pentru a identifica substanțe chimice care provoca leziuni oculare grave (categoria 1 din GHS al ONU) se datorează ratei ridicate de rezultate fals pozitive pentru alcooli și cetone și ratei ridicate de rezultate fals negative pentru substanțele solide observate în baza de date de validare (1) (2) (3). Cu toate acestea, având în vedere faptul că nu toți alcoolii și cetonele sunt supraestimați prin metoda de testare BCOP și unii sunt corect preconizați drept categoria 1 din GHS al ONU, aceste două grupe funcționale organice nu sunt considerate a fi în afara domeniului de aplicabilitate a metodei de testare. Revine utilizatorului acestei metode de testare să decidă dacă o posibilă supraestimare a unui alcool sau a unei cetone poate fi acceptată sau este necesară efectuarea de teste suplimentare într-o abordare pe baza forței probante. În ceea ce privește ratele de rezultate fals negative pentru substanțele solide, se remarcă faptul că substanțele solide pot conduce la condiții de expunere variabile și extreme în testul Draize de iritație oculară in vivo, care pot rezulta în predicții irelevante ale adevăratului lor potențial iritant (10). De asemenea, se remarcă faptul că niciunul dintre rezultatele fals negative identificate în baza de date de validare ICCVAM (2) (3), în contextul identificării substanțelor chimice care provoacă lezarea oculară gravă (categoria 1 din GHS al ONU), nu au condus la o valoare a IVIS ≤ 3, care este criteriul utilizat pentru a identifica o substanță chimică de testat ca încadrându-se în „nicio categorie” din GHS al ONU. În plus, rezultatele fals negative ale BCOP nu sunt critice în acest context, având în vedere faptul că toate substanțele chimice care produc o valoare 3< IVIS≤ 55 ar fi testate ulterior în cadrul altor teste in vitro validate în mod corespunzător sau, ca o ultimă opțiune, la iepuri, în funcție de cerințele de reglementare, cu ajutorul unei strategii de testare secvențiale cu o abordare pe baza forței probante. Având în vedere faptul că unele substanțe chimice solide sunt corect estimate prin metoda de testare BCOP în categoria 1 din GHS al ONU, această stare fizică nu este considerată, de asemenea, a fi încadrată în afara domeniului de aplicabilitate a metodei de testare. Inspectorii ar putea avea în vedere utilizarea acestei metode de testare pentru toate tipurile de substanțe chimice, prin care o valoare a IVIS ≥ 55 se acceptă ca indicator al unui răspuns care provocă lezarea oculară gravă ce trebuie clasificată în categoria 1 din GHS al ONU fără testări suplimentare. Cu toate acestea, astfel cum s-a menționat deja, rezultatele pozitive obținute cu ajutorul alcoolilor sau cetonelor se interpretează cu prudență având în vedere potențialul de supraestimare.

Metoda de testare BCOP pot fi utilizată, de asemenea, pentru a identifica substanțe chimice care nu necesită clasificare pentru iritația oculară sau lezarea oculară gravă în temeiul sistemului de clasificare GHS al ONU (4). Atunci când este utilizată în acest scop, metoda de testare BCOP are o precizie generală de 69 % (135/196), o rată de rezultate fals pozitive de 69 % (61/89) și o rată de rezultate fals negative de 0 % (0/107) în comparație cu datele privind metoda de testare in vivo pe ochi de iepure clasificate conform sistemului de clasificare GHS al ONU (3) (a se vedea apendicele 2 tabelul 2). Rata de rezultate fals pozitive obținută [substanțele chimice din „nicio categorie” a GHS al ONU care produc o valoare a IVIS >3 in vivo, a se vedea punctul 47) este în mod considerabil ridicată, dar nu critică în acest context, având în vedere faptul că toate substanțele chimice care produc o valoare 3< IVIS≤ 55 ar fi testate ulterior în cadrul altor teste in vitro validate în mod corespunzător sau ca o ultimă opțiune, pe iepuri, în funcție de cerințele de reglementare, cu ajutorul unei strategii de testare secvențiale cu o abordare pe baza forței probante a datelor. Metoda de testare nu prezintă deficiențe specifice în ceea ce privește testarea alcoolilor, cetonelor și substanțelor solide atunci când scopul este identificarea substanțelor chimice care nu necesită clasificare pentru iritația oculară sau lezarea oculară gravă („nicio categorie” a GHS al ONU) (3). Inspectorii ar putea avea în vedere utilizarea acestei metode de testare pentru toate tipurile de substanțe chimice, prin care un rezultat negativ (IVIS ≤ 3) se acceptă drept indicator al faptului că nu este necesară clasificarea („nicio categorie” a GHS al ONU). Întrucât metoda de testare BCOP nu poate identifica în mod corect decât 31 % din substanțele chimice care nu necesită clasificare pentru iritația oculară sau lezarea oculară gravă, această metodă de testare nu trebuie să fie considerată prima opțiune pentru a iniția o abordare ascendentă (5) în cazul în care sunt disponibile alte metode in vitro validate și acceptate cu același grad ridicat de sensibilitate, dar un grad mai ridicat de specificitate.

Baza de date de validare BCOP a fost constituită din 113 substanțe și 100 de amestecuri în total (2) (3). Metoda de testare BCOP este considerată, prin urmare, ca fiind aplicabilă pentru testarea atât a substanțelor, cât și a amestecurilor.

Metoda de testare BCOP nu este recomandată pentru identificarea substanțelor chimice de testat care sunt clasificate drept iritante la nivel ocular (categoria 2 din GHS al ONU sau categoria 2A) sau substanțele chimice de testat care sunt clasificate drept ușor iritante la nivel ocular (categoria 2B din GHS al ONU), având în vedere numărul considerabil de substanțe chimice din categoria 1 din GHS al ONU clasificate insuficient drept categoria 2, 2A sau 2B și substanțe chimice din categoria „nicio categorie” din GHS al ONU clasificate excesiv drept categoria 2, 2A sau 2B din GHS al ONU (2) (3). În acest scop, ar putea fi necesare teste suplimentare utilizând o altă metodă adecvată.

Toate procedurile care utilizează ochi și cornee de bovine trebuie să respecte reglementările și procedurile aplicabile ale instalației de testare cu privire la manipularea materialelor de origine animală, care includ țesuturile și fluidele tisulare, fără a se limita la acestea. Se recomandă măsurile de precauție universale aplicabile în laboratoare (11).

Cu toate că metoda de testare BCOP nu ia în considerare leziunile conjunctivale și iridiane, aceasta abordează efectele asupra corneei, care sunt principalul motor de clasificare in vivo atunci când se ia în considerare clasificarea GHS al ONU. Reversibilitatea leziunilor corneene nu poate fi evaluată în mod separat prin metoda de testare BCOP. Pe baza studiilor pe ochi de iepure, s-a propus posibila utilizare a unei evaluări a adâncimii inițiale a leziunii corneene pentru a identifica unele tipuri de efecte ireversibile (12). Cu toate acestea, sunt necesare cunoștințe științifice suplimentare pentru a înțelege modul în care se produc efectele ireversibile care nu sunt legate de leziunea inițială de nivel ridicat. În sfârșit, metoda de testare BCOP nu permite evaluarea toxicității sistemice potențiale asociate expunerii oculare.

Această metodă de testare va fi actualizată periodic, pe măsură ce se iau în considerare noi informații și date. De exemplu, histopatologia ar putea fi utilă atunci când este necesară o caracterizare mai cuprinzătoare a leziunilor corneene. Astfel cum este subliniat în documentul de orientare nr. 160 al OCDE (13), utilizatorii sunt încurajați să păstreze corneele și să pregătească specimenele histopatologice care pot fi utilizate pentru a dezvolta o bază de date și criterii de decizie care pot îmbunătăți în continuare acuratețea acestei metode de testare.

Orice laborator care utilizează pentru prima dată această metodă de testare trebuie să utilizeze substanțele chimice de verificare prevăzute în apendicele 3. Un laborator poate utiliza respectivele substanțe chimice pentru a-și demonstra performanțele tehnice în ceea ce privește aplicarea metodei de testare BCOP, înainte de trimiterea datelor metodei de testare BCOP în scopul clasificării reglementare a pericolelor.

PRINCIPIUL TESTULUI

Metoda de testare BCOP este un model organotipic care permite menținerea pe termen scurt a funcțiilor fiziologice și biochimice normale ale corneei bovine in vitro. În cadrul acestei metode de testare, leziunea provocată de substanța chimică de testat este evaluată prin măsurătorile cantitative ale modificărilor opacității și permeabilității corneene cu ajutorul unui opacimetru și, respectiv, al unui spectrofotometru în lumină vizibilă. Ambele măsurători sunt utilizate pentru a calcula un IVIS, care este utilizat pentru a desemna o categorie de clasificare a pericolelor in vitro pentru anticiparea potențialului iritant la nivel ocular in vivo al unei substanțe chimice de testat (a se vedea criteriile de decizie la punctul 48).

Metoda de testare BCOP utilizează cornee izolate de la ochii bovinelor proaspăt sacrificate. Opacitatea corneană este determinată cantitativ prin măsurarea transmisiei luminii prin cornee. Permeabilitatea este determinată cantitativ prin măsurarea cantității de colorant fluoresceină sodică care străbate întreaga grosime a corneei, detectat în centrul camerei posterioare. Substanțele chimice de test sunt aplicate la nivelul suprafeței epiteliale a corneei prin adăugare în camera anterioară a suportului cornean. Apendicele 4 prezintă o descriere și o diagramă a unui suport cornean utilizat în metoda de testare BCOP. Suporturile corneene pot fi obținute comercial, din diferite surse sau pot fi confecționate.

Sursa și vârsta ochilor bovini și selectarea speciilor de animale

Bovinele trimise la abator sunt sacrificate în mod obișnuit pentru consumul uman sau în alte scopuri comerciale. Numai animalele sănătoase, considerate corespunzătoare pentru alimentația umană, sunt utilizate ca sursă de cornee pentru metoda de testare BCOP. Deoarece bovinele au o greutate care variază în limite largi în funcție de rasă, vârstă și sex, nu există o greutate recomandată pentru animale în momentul sacrificării.

Utilizarea ochilor de la animale de vârste diferite poate conduce la variații ale dimensiunilor corneene. Corneele cu un diametru orizontal > 30,5 mm și valori ale grosimii corneene centrale (CCT) ≥1100 μm sunt obținute, în general, de la bovine cu vârsta de peste opt ani, în timp ce corneele cu diametrul orizontal < 28,5 mm și CCT < 900 μm sunt obținute, în general, de la bovine cu vârsta sub cinci ani (14). Din această cauză, nu se utilizează de regulă ochi de la animale cu vârsta de peste 60 de luni. În mod obișnuit, nu au fost utilizați ochi de la bovine cu vârsta sub 12 luni deoarece acestea sunt în creștere, iar grosimea și diametrul corneei sunt în mod considerabil mai mici decât cele raportate pentru ochii proveniți de la bovine mature. Cu toate acestea, utilizarea corneelor de la animale tinere (și anume, cele cu vârsta cuprinsă între 6 și 12 luni) este permisă deoarece aceasta prezintă o serie de avantaje precum disponibilitatea sporită, un interval de vârstă mai limitat și riscuri diminuate în ceea ce privește expunerea potențială a lucrătorilor la encefalopatia bovină spongiformă (15). Având în vedere faptul că evaluarea suplimentară a efectului dimensiunii sau grosimii corneei asupra sensibilității la substanțe chimice corozive sau iritante ar fi utilă, utilizatorii sunt încurajați să raporteze vârsta estimativă și/sau greutatea animalelor de la care provin corneele utilizate într-un studiu.

Colectarea și transportul ochilor la laborator

Ochii se colectează de către angajații abatorului. Pentru a reduce la minim lezarea mecanică sau de altă natură a ochilor, aceștia se enuclează cât mai curând posibil după sacrificare și se păstrează la rece imediat după enucleere și în timpul transportului. Pentru a preveni expunerea ochilor la substanțe chimice cu potențial iritant, angajații abatorului nu trebuie să utilizeze detergenți la spălarea capului animalului.

Ochii se imersează complet în soluție salină echilibrată Hanks rece (HBSS), într-un recipient cu dimensiuni adecvate și se transportă la laborator într-un mod care să reducă la minim deteriorarea și/sau contaminarea bacteriană. Întrucât ochii sunt colectați în timpul procesului de sacrificare, aceștia ar putea fi expuși la sânge sau la alte substanțe biologice, inclusiv bacterii și alte microorganisme. Prin urmare, este important să se asigure reducerea la minim a riscului de contaminare [de exemplu, prin păstrarea în gheață a recipientului care conține ochii și prin adăugarea de antibiotice la HBSS utilizată la păstrarea ochilor în timpul transportului (de exemplu, penicilină în concentrație de 100 UI/ml și streptomicină, 100 μg/ml)].

Perioada de timp dintre colectarea ochilor și utilizarea corneelor în metoda de testare BCOP se reduce la minim (în mod normal, acestea se colectează și se utilizează în aceeași zi) și trebuie să se demonstreze că aceasta nu compromite rezultatele testării. Rezultatele au la bază criteriile de selecție a ochilor, precum și răspunsurile probelor martor pozitive și negative. Toți ochii utilizați pentru testare trebuie să provină din același grup de ochi colectați într-o anumită zi.

Criteriile de selecție a ochilor utilizați în metoda de testare BCOP

Ochii, odată ajunși la laborator, se examinează cu atenție pentru defecte, inclusiv opacitate crescută, zgârieturi și neovascularizare. Numai corneele care provin de la ochi lipsiți de asemenea defecte urmează să fie utilizate.

De asemenea, calitatea fiecărei cornee este evaluată în etape ulterioare ale analizei. Corneele care au o capacitate mai mare de șapte unități de opacitate sau echivalentă pentru opacimetru și suporturile corneene, utilizate după o perioadă de echilibrare inițială de o oră, se îndepărtează (NOTĂ: opacimetrul se calibrează cu standarde de opacitate care sunt utilizate pentru stabilirea unităților de opacitate, a se vedea apendicele 4).

Fiecare grup de tratament (substanță chimic de testat, martori pozitivi și negativi testați în paralel) constă în minim trei ochi. În metoda de testare BCOP se utilizează trei cornee în calitate de cornee martor negativ. Având în vedere faptul că toate corneele se excizează din globul integral și se montează în camerele corneene, există posibilitatea producerii de artefacte din cauza manipulării în ceea ce privește valorile opacității corneene individuale și ale permeabilității (inclusiv martorul negativ). În plus, valorile opacității și permeabilității pentru corneele martor negative sunt utilizate pentru a corecta valorile permeabilității și opacității corneene ale substanței chimice de testat tratate și cele ale martorului pozitiv tratat în calculele IVIS.

PROCEDURĂ

Pregătirea ochilor

Corneele fără defecte sunt disecate cu menținerea unei margini de 2 până la 3 mm de sclerotică pentru a contribui la manipularea ulterioară, luându-se precauții pentru a preveni lezarea epiteliului și a endoteliului corneei. Corneele izolate sunt montate în suporturi corneene special proiectate care sunt compuse din compartimente anterioare și posterioare strâns legate de partea epitelială și, respectiv, de partea endotelială a corneei. Ambele camere sunt umplute cu un exces de mediu Eagle esențial minimal (EMEM) fără roșu fenol, preîncălzit (mai întâi camera posterioară), asigurându-se că nu se formează bule. Dispozitivul este apoi echilibrat la 32 ± 1 °C timp de cel puțin o oră, pentru a permite corneelor să se echilibreze cu mediul și, în măsura în care este posibil, să desfășoare o activitate metabolică normală (temperatura aproximativă a suprafeței corneene in vivo este de 32 °C).

După perioada de echilibrare, în ambele camere se adaugă EMEM fără roșu fenol proaspăt preîncălzit și se efectuează citirile nivelului de bază pentru opacitatea fiecărei cornee. Toate corneele care prezintă leziuni tisulare macroscopice (de exemplu, zgârieturi, pigmentare, neovascularizare) sau o opacitate mai mare decât șapte unități de opacitate sau echivalentă pentru opacimetru și suporturile cornene se îndepărtează. Se selectează cel puțin trei cornee drept cornee martor negativ (sau solvent). Corneele rămase sunt distribuite apoi în grupuri de tratament și grupuri martor pozitiv.

Deoarece căldura specifică a apei este mai mare decât cea a aerului, apa asigură condiții de temperatură pentru incubație mai stabile. Prin urmare, se recomandă utilizarea unei băi de apă pentru menținerea suportului cornean și a conținutului acestuia la temperatura de 32 ± 1 °C. Cu toate acestea, se pot utiliza, de asemenea, incubatoare cu aer, dacă se iau precauții pentru menținerea stabilității temperaturii (de exemplu, prin preîncălzirea suporturilor și a mediilor).

Aplicarea substanței chimice de testat

Se utilizează două protocoale de tratament diferite, unul pentru substanțele lichide și surfactanți (solizi sau lichizi) și altul pentru substanțe solide nesurfactante.

Substanțele lichide sunt testate în stare nediluată. În mod normal, substanțele semisolide, cremele și cerurile sunt testate în același mod ca și substanțele lichide. Substanțele surfactante pure sunt testate la o concentrație de 10 % g/v într-o soluție de 0,9 % clorură de sodiu, în apă distilată sau într-un alt solvent pentru care există dovezi că este lipsit de efecte adverse asupra sistemului testat. Pentru utilizarea de concentrații de diluție alternative este necesară furnizarea unei justificări adecvate. Amestecurile care conțin surfactanți se pot testa nediluate sau diluate la o concentrație corespunzătoare, în funcție de scenariul de expunere in vivo corespunzător. Pentru concentrația testată este necesară o justificare adecvată. Corneele se expun la substanțele lichide și la surfactanți timp de 10 minute. Utilizarea altor durate de expunere trebuie însoțită de o justificare științifică adecvată. A se vedea apendicele 1 pentru o definiție a surfactantului și a amestecului care conține surfactant.

În mod normal, substanțele solide nesurfactante sunt testate sub formă de soluții sau suspensii cu o concentrație de 20 % g/v într-o soluție de 0,9 % clorură de sodiu, în apă distilată sau într-un alt solvent pentru care există dovezi că este lipsit de efecte adverse asupra sistemului testat. În anumite circumstanțe și cu o justificare științifică adecvată, substanțele solide pot fi testate, de asemenea, în stare pură prin aplicarea directă pe suprafața corneană, utilizând metoda camerei deschise (a se vedea punctul 32). Corneele sunt expuse la substanțele solide timp de patru ore, dar, la fel precum în cazul lichidelor sau al surfactanților, se pot utiliza durate de expunere alternative, cu o argumentare științifică corespunzătoare.

În funcție de natura fizică și de caracteristicile chimice (de exemplu, substanțe solide, lichide, vâscoase, comparativ cu lichide nevâscoase) ale substanței chimice de testat, se pot utiliza diferite metode de tratament. Factorul critic este să se asigure că substanța chimică de testat acoperă în mod adecvat suprafața epitelială și că aceasta este îndepărtată în mod corespunzător în timpul etapelor de spălare. În mod normal, pentru substanțele chimice de testat în stare lichidă nevâscoase sau ușor vâscoase se utilizează o metodă cu camera închisă, iar pentru substanțele chimice de testat în stare lichidă semivâscoase și vâscoase, precum și pentru substanțele solide pure se utilizează o metodă cu camera deschisă.

În cazul metodei cu camera închisă, prin orificiile de dozare de pe suprafața superioară a camerei se introduce în camera anterioară suficientă substanță chimică de testat (750 μl) pentru a acoperi porțiunea epitelială a corneei, iar orificiile sunt sigilate ulterior cu ajutorul dopurilor camerei în timpul expunerii. Este important să se asigure expunerea fiecărei cornee la o substanță chimică de testat pentru o perioadă de timp adecvată.

În cazul metodei cu camera deschisă, inelul de fixare a ferestrei și fereastra de sticlă din camera anterioară sunt îndepărtate înainte de tratament. Substanța martor sau substanța chimică de testat (750 μl sau substanță de testat în cantitate suficientă pentru a acoperi complet corneea) se aplică direct pe suprafața epitelială a corneei cu ajutorul unei micropipete. În cazul în care o substanță chimică de testat este dificil de pipetat, aceasta poate fi încărcată sub presiune într-o pipetă care funcționează pe principiul dezlocuirii pozitive pentru a asista dozarea. Vârful unei astfel de pipete este introdus în vârful de distribuire al seringii astfel încât materialul să poată fi încărcat sub presiune în vârful de dezlocuire. În mod simultan, pistonul seringii este eliberat pe măsură ce este tras în sus. În cazul în care la nivelul vârfului pipetei apar bule de aer, substanța chimică de testat este îndepărtată (expulzată) și procesul se repetă până când vârful se umple fără a exista bule de aer. Dacă este necesar, se poate utiliza o seringă normală (fără ac), întrucât aceasta permite măsurarea unui volum precis de substanță chimică de testat și o aplicare mai ușoară la nivelul suprafeței epiteliale a corneei. După dozare, fereastra de sticlă este înlocuită la nivelul camerei anterioare pentru a recrea un sistem închis.

Incubarea post-expunere

După perioada de expunere, se îndepărtează din camera anterioară substanța chimică de testat, substanța chimică martor negativ sau substanța chimică martor pozitiv, iar epiteliul se spală de cel puțin trei ori (sau până când nu se mai constată vizual prezența substanței chimice de testat) cu EMEM (care conține roșu fenol). Pentru spălare se utilizează un mediu care conține roșu fenol deoarece schimbarea de culoare a acestui indicator poate fi monitorizată pentru determinarea eficienței spălării substanțelor de testare acide sau alcaline. Corneele se spală de mai mult de trei ori dacă roșul fenol este în continuare decolorat (galben sau purpuriu) sau dacă substanța chimică de testat este în continuare vizibilă. După ce mediul nu mai conține substanță chimică de testat, corneele se spală pentru ultima dată cu EMEM (fără roșu fenol). EMEM (fără roșu fenol) se utilizează pentru spălarea finală pentru a se asigura îndepărtarea substanței roșu fenol din camera anterioară înainte de măsurarea opacității. Camera anterioară se reumple apoi cu EMEM fără roșu fenol.

În cazul lichidelor sau al surfactanților, după spălare, corneele se incubează pentru o perioadă suplimentară de două ore la 32 ± 1 °C. Un interval post-expunere mai lung poate fi util în anumite circumstanțe și necesitatea acestuia va fi examinată de la caz la caz. Corneele tratate cu substanțe solide se spală amănunțit după o perioadă de expunere de patru ore, fără a fi necesară o incubație suplimentară.

Opacitatea și permeabilitatea fiecărei cornee se înregistrează la sfârșitul perioadei de incubare post-expunere, în cazul substanțelor lichide și al surfactanților și la sfârșitul unei perioade de expunere de patru ore în cazul substanțelor solide nesurfactante. De asemenea, fiecare cornee se examinează vizual, înregistrându-se observațiile pertinente (de exemplu, exfolierea țesuturilor, reziduuri de substanță chimică de testat, tipare de opacifiere neuniformă). Observațiile respective pot fi importante deoarece acestea se pot reflecta în variații ale citirilor opacimetrului.

Substanțe chimice martor

În fiecare experiment se includ martori negativi sau grupuri martor solvent/vehicul și martori pozitivi testați în paralel.

Atunci când se testează o substanță lichidă cu puritate de 100 %, în metoda de testare BCOP se include un martor negativ testat în paralel (de exemplu, soluție de clorură de sodiu 0,9 % sau apă distilată) pentru a putea detecta modificările nespecifice din sistemul testat și pentru a furniza un nivel de bază pentru criteriile finale ale testării. În plus, această metodă garantează faptul că nu va apărea o reacție de iritație din cauza condițiilor de analiză neadecvate.

Atunci când se testează o substanță lichidă diluată, un surfactant, sau o substanță solidă, în metoda de testare BCOP se include un grup martor solvent/vehicul pentru a putea detecta modificările nespecifice din sistemul testat și pentru a furniza un nivel de bază pentru punctele finale ale analizei. Se poate utiliza numai un solvent/vehicul pentru care nu există dovezi că are efecte adverse asupra sistemului testat.

O substanță chimică cunoscută pentru faptul că provoacă o reacție pozitivă se introduce în fiecare experiment ca martor pozitiv testat în paralel cu scopul de a verifica integritatea sistemului de testare și pentru desfășurarea corespunzătoare a acestuia. Cu toate acestea, pentru a garanta faptul că există posibilitatea evaluării variabilității în timp a reacției la martorul pozitiv, amploarea reacției iritante nu trebuie să fie excesivă.

Exemple de martori pozitivi pentru substanțele chimice de testat sunt etanol 100 % sau dimetilformamidă 100 %. Soluția de imidazol 20 % g/v într-o soluție de clorură de sodiu 0,9 % reprezintă un exemplu de martor pozitiv pentru substanțele chimice de testat în stare solidă.

Substanțele chimice etalon sunt utile pentru evaluarea potențialului iritant la nivel ocular al substanțelor chimice necunoscute din cadrul unei anumite clase de substanțe sau de produse sau pentru evaluarea potențialului iritant relativ al unei substanțe iritante la nivel ocular într-un interval specific de reacții iritante.

Caracteristici măsurate

Opacitatea se determină prin măsurarea luminii transmise prin cornee. Opacitatea corneană este măsurată cantitativ cu ajutorul unui opacimetru, conducând la valori ale opacității măsurate pe o scară continuă.

Permeabilitatea este determinată prin măsurarea cantitativă a colorantului cu fluoresceină sodică care străbate toate straturile celulare corneene (și anume, epiteliul de pe suprafața exterioară a corneei prin endoteliul de pe suprafața interioară a corneei). Un ml de soluție de fluoresceină sodică (4 sau 5 mg/ml atunci când se testează substanțe lichide și surfactanți sau substanțe nesurfactante) se adaugă în camera anterioară a suportului cornean, care interferează cu porțiunea epitelială a corneei, iar camera posterioară, care interferează cu porțiunea endotelială a corneei, este umplută cu EMEM proaspăt. Suportul este apoi incubat în poziție orizontală timp de 90 ± 5 min la 32 ± 1 °C. Cantitatea de fluoresceină sodică care pătrunde în camera posterioară este măsurată cantitativ cu ajutorul unui spectrofotometru UV/VIS. Măsurătorile spectrofotometrice efectuate la 490 nm sunt înregistrate sub formă de valori ale densității optice (DO490) sau ale absorbanței, care sunt măsurate pe o scară continuă. Valorile permeabilității fluoresceinei sunt determinate prin utilizarea valorilor DO490 înregistrate de un spectrofotometru cu lumină vizibilă care folosește valoarea standard de 1 cm a lungimii traiectoriei.

Ca o variantă alternativă, se poate utiliza un cititor de plăci de microtitrare cu 96 de godeuri, cu condiția: (i) să se poată stabili domeniul linear al cititorului de plăci pentru determinarea valorilor DO490 a fluoresceinei; și (ii) să se utilizeze volumul corect de mostre de fluoresceină în placa cu 96 de godeuri pentru a se obține valori ale DO490 echivalente cu valoarea standard de 1 cm a lungimii traiectoriei [acest aspect ar putea necesita un godeu umplut complet (în mod obișnuit 360 μl)].

DATE ȘI RAPORTARE

Evaluarea datelor

După corectarea valorilor opacității și ale permeabilității medii (DO490) pentru valorile opacității de fundal și ale permeabilității martorului negativ DO490, valorile medii ale opacității și ale permeabilității DO490 pentru fiecare grup de tratament trebuie combinate într-o formulă dedusă în mod empiric pentru a calcula un scor privind iritarea in vitro (IVIS) pentru fiecare grup de tratament după cum urmează:

IVIS = valoarea opacității medii + (15 x valoarea permeabilității medii DO490)

Sina et al. (16) au raportat că această formulă a fost dedusă în urma unor studii interne și între laboratoare. Datele generate pentru o serie de 36 de compuși într-un studiu realizat între laboratoare au fost supuse unei analize multivariante pentru a determina ecuația cea mai potrivită pentru datele in vivo și cele in vitro. Această analiză a fost efectuată de cercetători de la două companii diferite, care au obținut ecuații aproape identice.

Valorile opacității și ale ermeabilității se evaluează, de asemenea, în mod independent pentru a determina, prin utilizarea doar a uneia dintre cele două caracteristici (a se vedea criteriile de decizie) dacă o substanță chimică de testat a provocat coroziune sau iritație severă.

Criterii de decizie

Valorile limită IVIS pentru identificarea substanțelor chimice de testat care provoacă lezarea oculară gravă (categoria 1 din GHS al ONU) și substanțele chimice de testat care nu necesită clasificare pentru iritația oculară sau lezarea oculară gravă („nicio categorie” din GHS al ONU) sunt prezentate în continuare:

Criterii de acceptare a studiului

Un test este considerat acceptabil în cazul în care pentru martorul pozitiv se obține o valoare IVIS cuprinsă în intervalul reprezentat de două deviații standard ale valorii medii actuale a martorilor testați anterior, care trebuie actualizată la fiecare trei luni sau de fiecare dată când un test care poate fi acceptat este efectuat în laboratoare în care testele sunt realizate rar (și anume, mai puțin de o dată pe lună). Reacțiile martorilor negativi sau cele ale grupului martor solvent/vehicul trebuie să conducă la valori ale opacității și permeabilității care sunt mai mici decât limitele superioare stabilite pentru valorile opacității și ale ermeabilității fundalului pentru corneele de bovine tratate cu martorii negativi sau cu grupurile martor solvent/vehicul respective. O singură serie de testare compusă din cel puțin trei cornee este suficientă pentru o substanță chimică de testat atunci când clasificarea este fără echivoc. Cu toate acestea, în cazul rezultatelor limită în prima serie de testare, se ia în considerare (dar nu este neapărat necesară) o a doua serie de testare, precum și o a treia serie în cazul unor rezultate IVIS medii discordante între primele două serii de testare. În acest context, un rezultat în prima serie de testare este considerat limită în cazul în care previziunile pe baza celor 3 cornee au fost neconcordante, astfel încât:

Raport de testare

Raportul de testare trebuie să conțină următoarele informații, dacă acestea prezintă relevanță pentru desfășurarea studiului:

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

Apendicele 4

SUPORTUL CORNEAN BCOP

Suporturile corneene BCOP sunt confecționate dintr-un material inert (de exemplu, polipropilenă). Suporturile sunt formate din două jumătăți (o cameră anterioară și una posterioară) și au două camere cilindrice interne similare. Fiecare cameră are un volum de 5 ml și conține la capăt un geam din sticlă, prin care se observă și se înregistrează opacitatea. Camerele interne au un diametru de 1,7 cm și o adâncime de 2,2 cm (11). Eventualele scurgeri sunt prevenite cu ajutorul unei garnituri amplasate în camera posterioară. Corneele se plasează cu partea endotelială pe garnitura camerei posterioare, iar camerele interioare se plasează pe partea epitelială a corneelor. Camerele sunt fixate cu trei șuruburi din oțel inoxidabil aflate pe muchiile exterioare ale camerei. La capătul fiecărei camere se află un geam de sticlă amovibil, care permite accesul facil la cornee. De asemenea, se plasează o garnitură între geamul de sticlă și cameră pentru prevenirea scurgerilor. Două orificii situate în partea superioară a fiecăreia dintre cele două camere permit introducerea și îndepărtarea mediului și a substanțelor chimice de testare. Aceste orificii sunt închise cu capace de cauciuc pe perioadele de tratament și de incubație. Transmisia luminii prin suporturile corneene se poate schimba deoarece efectele uzurii fizice sau ale acumulării de reziduuri chimice specifice în orificiile camerei interioare sau pe geamul de sticlă pot afecta dispersia sau reflexia luminii. Drept consecință, transmisia luminii de bază ar putea înregistra creșteri sau scăderi (și în opoziție cu citirile de bază ale opacității) prin suportul corneean și ar putea fi evidențiate drept modificări semnificative ale măsurătorilor inițiale de bază preconizate pentru opacitatea coorneană în camerele individuale (și anume, valorile inițiale de opacitate corneeană în suporturi corneene individuale specifice pot diferi în mod obișnuit cu mai mult de 2 sau 3 unități de opacitate față de valorile de bază preconizate). Fiecare laborator trebuie să ia în considerare crearea unui program pentru evaluarea modificărilor transmisiei luminii prin suporturile corneene, în funcție de natura substanțelor chimice testate și frecvența utilizării camerelor. Pentru a stabili valorile de bază, suporturile corneene pot fi verificate înainte de utilizarea sistematică prin măsurarea nivelului de bază al valorilor opacității (sau ale transmisiei luminii) a camerelor umplute cu mediu complet, fără cornee. Suporturile corneene sunt verificate apoi periodic pentru a se ține cont de modificările aduse transmisiei luminii în timpul perioadelor de utilizare. Fiecare laborator poate stabili frecvența de verificare a suporturilor corneene, în funcție de substanțele chimice utilizate, frecvența de utilizare și observațiile modificărilor valorilor de bază ale opacității corneene. În cazul în care se observă modificări semnificative în transmisia luminii prin suporturile corneene, se ia în considerare efectuarea de proceduri corespunzătoare de curățare și/sau lustruire a suprafaței interioare a suporturilor corneene sau de înlocuire a acestora.

Suport cornean: diagramă descompusă

orificiu de umplere

disc de sticlă

garnitură PTFE

cârlig

capac

disc de sticlă

șaibă

garnitură

compartiment posterior

compartiment anterior

șaibă

șuruburi de fixare

(13)

În partea B, capitolul B.48 se înlocuiește cu următorul text:

„B.48   Metoda de testare a ochiului izolat de pui pentru identificarea i) substanțelor chimice care provoacă lezarea oculară gravă și a ii) substanțelor chimice care nu necesită clasificare pentru iritația oculară sau lezarea oculară gravă

INTRODUCERE

Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 438 (2013). Metoda de testare a ochiului izolat de pui (ICE) a fost evaluată de către Comitetul de coordonare la nivel de agenții privind validarea metodelor alternative (ICCVAM), în coroborare cu Centrul European pentru validarea metodelor alternative (ECVAM) și Centrul Japonez pentru validarea metodelor alternative (JaCVAM) în anul 2006 și 2010 (1) (2) (3). În cadrul primei evaluări, ICE a fost aprobată ca o metodă de testare valabilă din punct de vedere științific pentru a fi utilizată ca test pentru a identifica substanțele chimice (substanțe și amestecuri) care provoacă lezarea oculară gravă (categoria 1), astfel cum sunt definite în sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice (GHS) al Organizației Națiunilor Unite (ONU) (1) (2) (4) și Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 privind clasificarea, etichetarea și ambalarea substanțelor și a amestecurilor (CLP) (12). În cadrul celei de a doua evaluări, metoda de testare ICE a fost evaluată în vederea utilizării ca test de screening pentru a identifica substanțele chimice neclasificate în ceea ce privește iritația oculară și lezarea oculară gravă, astfel cum sunt definite în GHS al ONU (3) (4). Rezultatele din studiul de validare și recomandările grupului de revizuire inter pares au menținut recomandarea inițială de utilizare a ICE pentru clasificarea substanțelor chimice care provoacă lezarea oculară gravă (categoria 1 din GHS al ONU), având în vedere faptul că baza de date disponibilă a rămas neschimbată de la validarea inițială a ICCVAM. În stadiul respectiv, nu au fost sugerate recomandări suplimentare pentru extinderea domeniului de aplicabilitate a ICE pentru a include, de asemenea, alte categorii. O reevaluare a setului de date in vitro și in vivo utilizat în studiul de validare a fost efectuată cu scopul de a evalua utilitatea ICE pentru identificarea substanțelor chimice care nu necesită clasificare pentru iritația oculară sau lezarea oculară gravă (5). Reevaluarea a ajuns la concluzia că metoda de testare ICE poate fi utilizată, de asemenea, pentru a identifica substanțe chimice care nu necesită clasificare în ceea ce privește iritația oculară și lezarea oculară gravă, astfel cum sunt definite în GHS al ONU (4) (5). Această metodă de testare include utilizările și limitările recomandate ale metodei de testare ICE pe baza evaluărilor respective. Principalele diferențe între versiunea inițială din anul 2009 și versiunea actualizată din anul 2013 a orientării OCDE privind testarea includ, dar nu se limitează la utilizarea metodei de testare ICE la identificarea substanțelor chimice care nu necesită clasificare în conformitate cu GHS al ONU, o actualizare a elementelor raportului de testare, o actualizare a apendicelui 1 privind definițiile și o actualizare a apendicelui 2 privind substanțele chimice de verificare.

În prezent, este general acceptat faptul că în viitorul apropiat niciun test in vitro de iritație oculară nu va putea înlocui testul ocular in vivo Draize pentru a efectua estimări în cadrul întregii game de iritații pentru diferite clase de substanțe chimice. Cu toate acestea, combinații strategice de mai multe metode de testare alternative în cadrul unei strategii de testare (secvențiale) ar putea înlocui testul ocular Draize (6). Abordarea descendentă (7) este proiectată pentru a fi utilizată în cazul în care, pe baza informațiilor existente, se preconizează că o substanță chimică are potențial iritant ridicat, în timp ce abordarea ascendentă (7) este proiectată pentru a fi utilizată în cazul în care, pe baza informațiilor existente, se preconizează că o substanță chimică nu cauzează iritație oculară suficientă pentru a necesita o clasificare. Metoda de testare ICE este o metodă de testare in vitro care poate fi utilizată, în anumite cazuri și cu limite specifice, astfel cum sunt descrise la punctele 8-10, pentru clasificarea riscurilor la nivel ocular și etichetarea substanțelor chimice. Cu toate că nu este considerată validă ca metodă de testare de sine stătătoare de substituire a testului in vivo pe ochi de iepure, metoda de testare ICE este recomandată ca o etapă inițială în cadrul unei strategii de testare precum abordarea descendentă propusă de către Scott et al.(7) pentru a identifica substanțele chimice care provoacă lezarea oculară gravă, și anume, substanțele chimice care urmează să fie încadrate în categoria 1 din GHS al ONU fără testare suplimentară (4). Metoda de testare ICE este recomandată, de asemenea, pentru a identifica substanțele chimice care să nu necesită clasificare în ceea ce privește iritația oculară și lezarea oculară gravă, astfel cum sunt definite în GHS al ONU („nicio categorie”, NC) (4), și, prin urmare, poate fi utilizată ca o etapă inițială în cadrul unei strategii de testare ascendente (7). Cu toate acestea, o substanță chimică care nu se preconizează să cauzeze lezare oculară gravă sau care nu este clasificată pentru iritația oculară/lezare oculară gravă prin metoda de testare ICE ar necesita teste suplimentare (in vitro și/sau in vivo) pentru a se stabili o clasificare definitivă. În plus, este necesară consultarea autorităților de reglementare competente înainte de a utilizarea ICE în cadrul unei abordări ascendente în conformitate cu alte scheme de clasificare decât cele GHS al ONU.

Scopul acestei metode de testare este de a descrie procedurile utilizate pentru a evalua potențialul riscurilor la nivel ocular al unei substanțe chimice de testat, măsurat prin capacitatea acesteia de a provoca sau nu toxicitate într-un ochi enucleat de pui. Efectele toxice la nivelul corneei sunt măsurate prin (i) o evaluare calitativă a opacității, (ii) o evaluare calitativă a leziunilor epiteliului pe baza aplicării de fluoresceină în ochi (retenție de fluoresceină), (iii) o măsurare cantitativă a creșterii grosimii (inflamare) și (iv) o evaluare calitativă a leziunilor morfologice macroscopice ale suprafeței. Opacitatea corneană, inflamarea și evaluările leziunilor după expunerea la o substanță chimică de testat se stabilesc în mod individual, apoi rezultatele se combină pentru a se obține o clasificare a iritației oculare.

Definițiile sunt prevăzute în apendicele 1.

CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI LIMITĂRI

Această metodă de testare are la bază protocolul propus în documentul de orientare nr. 160 al OCDE (8), care a fost elaborat în urma studiului internațional de validare ICCVAM (1) (3) (9), cu contribuții din partea Centrului european pentru validarea metodelor alternative, a Centrului japonez pentru validarea metodelor alternative și a Departamentului TNO pentru calitatea vieții, toxicologie și farmacologie aplicată (Țările de Jos). Protocolul a fost întocmit pe baza informațiilor conținute în protocoalele publicate și în protocolul utilizat în prezent de către TNO (10) (11) (12) (13) (14).

O gamă largă de substanțe chimice a fost testată în cadrul procesului de validare care sta la baza acestei metode de testare, iar baza de date empirice a studiului de validare a cuprins 152 de substanțe chimice, incluzând 72 de substanțe chimice și 80 de amestecuri (5). Metoda de testare este aplicabilă substanțelor solide, lichide, emulsiilor și gelurilor. Substanțele lichide pot fi apoase sau neapoase; substanțele solide pot fi solubile sau insolubile în apă. Gazele și aerosolii nu au fost încă evaluați în cadrul unui studiu de validare.

Metoda de testare ICE poate fi utilizată pentru a identifica substanțele chimice care provoacă lezarea oculară gravă, și anume, substanțele chimice care urmează să fie clasificate în categoria 1 din GHS al ONU (4). Atunci când sunt utilizate în acest scop, limitele de aplicare identificate pentru metoda de testare ICE se bazează pe rata ridicată de rezultate fals pozitive pentru alcoolii și ratele ridicate de rezultate fals negative pentru substanțele solide și surfactanți (1) (3) (9). Cu toate acestea, în acest context (categoria 1 din GHS al ONU identificată ca nefiind categoria 1 din GHS al ONU), ratele de rezultate fals negative nu sunt critice având în vedere faptul că toate substanțele chimice care conduc la rezultate negative ar fi testate ulterior utilizând un test(e) in vitro validat(e) în mod corespunzător sau, ca ultimă opțiune, la iepuri, în funcție de cerințele de reglementare, utilizând o strategie de testare secvențială cu o abordare pe baza forței probante. Se remarcă faptul că substanțele solide pot conduce la condiții de expunere extreme și variabile în testul Draize de iritație oculară in vivo, care pot avea ca rezultat estimări irelevante în ceea ce privește potențialul lor iritant real (15). Inspectorii ar putea avea în vedere utilizarea acestei metode de testare pentru toate tipurile de substanțe chimice, prin care un rezultat pozitiv se acceptă drept indicator al lezării oculare grave, și anume încadrarea în categoria 1 din GHS al ONU fără testări suplimentare. Cu toate acestea, rezultatele pozitive obținute cu ajutorul alcoolilor se interpretează cu prudență, având în vedere riscul de producere a unor supraestimări.

Atunci când este utilizată pentru a identifica substanțele chimice care provoacă lezarea oculară gravă (categoria 1 din GHS al ONU), metoda de testare ICE are o precizie generală de 86 % (120/140), o rată de rezultate fals pozitive de 6 % (7/113) și o rată de rezultate fals negative de 48 % (13/27) în comparație cu datele privind metoda de testare in vivo pe ochi de iepure clasificate în conformitate cu sistemul de clasificare GHS al ONU (4) (5).

Metoda de testare ICE poate fi utilizată, de asemenea, pentru a identifica substanțele chimice care nu necesită clasificare pentru iritația oculară sau lezarea oculară gravă în temeiul sistemului de clasificare GHS al ONU (4). Este necesară consultarea autorităților de reglementare competente înainte de a utiliza ICE în cadrul unei abordări ascendente în conformitate cu alte scheme de clasificare. Această metodă de testare poate fi utilizată pentru toate tipurile de substanțe chimice, prin care un rezultat negativ ar putea fi acceptat pentru neclasificarea unei substanțe chimice pentru iritația oculară și lezarea oculară gravă. Cu toate acestea, pe baza un singur rezultat din baza de date de validare, vopsele antivegetative organice care conțin solvent pot prezenta subestimări (5).

Atunci când este utilizată pentru a identifica substanțele chimice care nu necesită clasificare pentru iritația oculară și lezarea oculară gravă, metoda de testare ICE are o precizie generală de 82 % (125/152), o rată de rezultate fals pozitive de 33 % (26/79) și o rată de rezultate fals negative de 1 % (1/73) în comparație cu datele privind metoda de testare in vivo pe ochi de iepure clasificate în conformitate cu sistemul de clasificare GHS al ONU (4) (5). În cazul în care substanțele chimice din cadrul anumitor categorii (și anume, vopsele antivegetative organice care conțin solvent) sunt eliminate din baza de date, precizia metodei de testare ICE este de 83 % (123/149), rata de rezultate fals pozitive este de 33 % (26/78), iar rata de rezultate fals negative este de 0 % (0/71) în ceea ce privește sistemul de clasificare GHS al ONU (4) (5).

Metoda de testare ICE nu este recomandată pentru identificarea substanțelor chimice de testat care sunt clasificate drept iritante la nivel ocular (și anume, categoria 2 sau categoria 2A din GHS al ONU) sau substanțele chimice de testat care sunt clasificate drept ușor iritante la nivel ocular (categoria 2B din GHS al ONU) având în vedere numărul considerabil de substanțe chimice din categoria 1 din GHS al ONU clasificate greșit drept categoria 2, 2A sau 2B din GHS al ONU și de substanțe chimice din categoria „nicio categorie” din UN GHS al ONU clasificate excesiv drept categoria 2, 2A sau 2B din GHS al ONU. În acest scop, ar putea fi necesare teste suplimentare utilizând o altă metodă adecvată.

Toate procedurile efectuate pe ochi de pui trebuie să respecte regulamentele și normele de manipulare a materialelor de origine umană sau animală, precum țesuturi și lichide tisulare, fără a se limita la acestea. Sunt recomandate măsurile de precauție universale aplicabile în laboratoare (16).

Cu toate că metoda de testare ICE nu ia în considerare leziunile conjunctivale și iridiane ca fiind evaluate în metoda de testare a iritării ochiului de iepure, acesta abordează efectele corneei, care sunt principalul motor de clasificare in vivo atunci când se ia în considerare clasificarea GHS al ONU. De asemenea, deși reversibilitatea leziunilor corneene nu poate fi evaluată în mod separat prin metoda de testare ICE, s-a propus, pe baza studiilor pe ochi de iepure, utilizarea unei evaluări a adâncimii inițiale a leziunii corneene pentru a identifica anumite tipuri de efecte ireversibile (17). În special, sunt necesare cunoștințe științifice suplimentare pentru a înțelege modul în care se produc efectele ireversibile care nu au legătură cu leziunea inițială de nivel ridicat. În sfârșit, metoda de testare ICE nu permite evaluarea toxicității sistemice potențiale asociate expunerii oculare.

Această metodă de testare va fi actualizată periodic, pe măsură ce se iau în considerare noi informații și date. De exemplu, histopatologia ar putea fi utilă atunci când este necesară o caracterizare mai cuprinzătoare a leziunilor corneene. Pentru a evalua această posibilitate, utilizatorii sunt încurajați să păstreze ochii și să pregătească exemplarele histopatologice care pot fi utilizate pentru a dezvolta o bază de date și criterii de decizie care pot îmbunătăți în continuare acuratețea acestei metode de testare. OCDE a elaborat un document de orientare privind utilizarea metodelor de testare in vitro a toxicității oculare care include proceduri detaliate privind colectarea de specimene histopatologice și informații cu privire la locul de prezentare a specimenelor și/sau a datelor cu privire la histopatologie (8).

Toate laboratoarele care utilizează pentru prima dată această testare trebuie să utilizeze substanțele chimice de verificare menționate în apendicele 2. Un laborator poate utiliza substanțele chimice respective pentru a-și demonstra competența tehnică în ceea ce privește aplicarea metodei de testare ICE înainte de a transmite datele analizei ICE în scopul clasificării reglementare a pericolelor.

PRINCIPIUL TESTULUI

Metoda de testare ICE este un model organotipic care permite menținerea pe termen scurt a ochiului de pui in vitro. În cadrul acestei metode de testare, leziunile provocate de substanța chimică de testat sunt evaluate în funcție de inflamarea corneană, opacitate și retenția de fluoresceină. În timp ce ultimii doi parametri presupun o evaluare calitativă, analiza inflamării corneene asigură o evaluare cantitativă. Fiecare măsurare este transformată într-un scor cantitativ utilizat pentru a se calcula un indice general de iritare sau primește un indice calitativ utilizat pentru a desemna o clasificare a riscurilor in vitro la nivel ocular, fie drept categoria 1 din GHS al ONU, fie drept neclasificat conform GHS al ONU. Oricare dintre cele două rezultate poate fi utilizat ulterior pentru a estima potențialul de lezare oculară in vivo sau nicio cerință pentru clasificarea riscurilor la nivel ocular prezentate de o substanță chimică de testat (a se vedea criteriile de decizie). Cu toate acestea, substanțele chimice pentru care nu se preconizează faptul că provoacă leziuni oculare grave sau care nu sunt clasificate prin metoda de testare ICE nu pot fi clasificate (a se vedea punctul 11).

Sursa și vârsta ochilor de pui

Până în prezent, pentru această evaluare au fost utilizați ochi colectați de la pui sacrificați în abatoare pentru consumul uman, nefiind necesare animale de laborator. Sunt utilizați exclusiv ochi proveniți de la animale considerate adecvate pentru consumul uman.

Cu toate că nu a fost efectuat un studiu controlat de evaluare a vârstei optime a puilor, vârsta și greutatea puilor utilizați până în prezent pentru această metodă de testare sunt cele ale puilor de primăvară procesați în mod normal de un abator (și anume, de aproximativ 7 săptămâni, 1,5– 2,5 kg).

Colectarea și transportul ochilor la laborator

Capetele se îndepărtează imediat după sedarea puilor, de regulă prin șoc electric și incizie la nivelul gâtului pentru scurgerea sângelui. Se recomandă identificarea unei ferme de pui aflate în apropierea laboratorului, astfel încât capetele să fie transferate de la abator către laborator într-un timp suficient de scurt pentru a reduce riscul de deteriorare și/sau contaminare bacteriană. Perioada de timp dintre colectarea capetelor și plasarea în camera de suprafuziune după enucleere trebuie să fie redusă la minim (în mod normal, în două ore) pentru a se asigura îndeplinirea criteriilor de acceptare ale testului. Toți ochii utilizați pentru testare trebuie să provin din același grup de ochi și să fie colectați în aceeași zi.

Deoarece ochii sunt disecați în laborator, capetele se transportă intacte de la abator, la temperatură ambiantă (de regulă între 18 °C și 25 °C), în cutii de plastic și se mențin umede cu prosoape înmuiate în soluție salină izotonică.

Criterii de selecție și numărul de ochi utilizați în metoda ICE

Se resping ochii care, după enucleare, prezintă un nivel de bază ridicat al colorării cu fluoresceină și anume, > 0,5) sau opacitate corneană (și anume, > 0,5).

Fiecare grup de testare și martorul pozitiv testat în paralel este format din cel puțin trei ochi. Grupul martor negativ sau martorul solvent (în cazul în care se utilizează un solvent diferit de soluția salină) este constituit din cel puțin un ochi.

În cazul materialelor solide care conduc la un rezultat NC conform GHS, se recomandă o a doua determinare a trei ochi pentru a confirma sau a elimina rezultatele negative.

PROCEDURĂ

Pregătirea ochilor

Pleoapele sunt excizate cu atenție, astfel încât să nu se lezeze corneea. Integritatea corneană este evaluată rapid cu ajutorul unei picături de soluție de fluoresceină sodică 2 % (g/v) aplicată pe suprafața corneană timp de câteva secunde, care apoi se clătește cu soluție salină izotonică. Ochii tratați cu fluoresceină sunt apoi examinați cu un microscop cu lampă cu fantă, urmărindu-se eventualele leziuni ale corneei (și anume, valori ale retenției de fluoresceină și opacității corneene ≤0,5).

În cazul în care nu prezintă leziuni, ochiul este îndepărtat din orbită cu atenție, astfel încât corneea să nu fie lezată. Globul ocular este scos din orbită prin fixarea membranei nictitante cu ajutorul unui forceps chirurgical, apoi mușchii oculari se taie cu un foarfece îndoit, cu vârf bont. Este important să se evite lezarea corneei ca urmare a unei presări excesive (și anume, leziuni de compresie).

Atunci când ochiul este îndepărtat din orbită, se păstrează atașată o porțiune vizibilă a nervului optic. După îndepărtarea din orbită, ochiul este plasat pe o suprafață absorbantă, iar membrana nictitantă și alte țesuturi conjunctive sunt eliminate.

Ochiul enucleat este prins cu o clemă din oțel inoxidabil, cu corneea poziționată vertical. Clema este introdusă ulterior într-o cameră a aparatului de suprafuziune (18). Clemele sunt introduse în aparatul de suprafuziune astfel încât corneea să fie complet irigată cu soluție izotonică (3-4 picături pe minut sau 0,1-0,15 ml/min). Temperatura camerelor aparatului de superfuziune se menține la 32 ± 1,5 °C. În apendicele 3 este prezentată o diagramă a aparatului tipic de suprafuziune și a clemelor pentru ochi, care pot achiziționate din comerț sau confecționate. Aparatul poate fi modificat pentru a respecta cerințele din anumite laboratoare (de exemplu, pentru un număr diferit de ochi).

După ce au fost introduși în aparatul de suprafuziune, ochii sunt examinați din nou cu un microscop oftalmologic pentru eventuale leziuni apărute în timpul procedurii de disecție. În acest moment, se măsoară de asemenea, grosimea corneei în vârful său, cu ajutorul dispozitivului de măsurare a adâncimii atașat microscopului cu lampă cu fantă. Se înlocuiesc ochii care prezintă: (i) un coeficient al retenției de fluoresceină > 0,5; (ii) opacitate corneană >0,5; sau (iii) orice semne suplimentare de leziuni. În cazul ochilor care nu sunt respinși pe baza acestor criterii, se exclud ochii cu o grosime a corneei care deviază cu peste 10 % de la valoarea medie a tuturor ochilor. Utilizatorii trebuie să cunoască faptul că microscoapele cu lampă cu fantă pot produce rezultate diferite ale grosimii corneei dacă lărgimea fantei microscopului este diferită. Această lățime se stabilește la 0,095 mm.

După examinarea și acceptarea ochilor, aceștia sunt incubați timp de aproximativ 45-60 de minute pentru a fi echilibrați cu sistemul de testare înaintea dozării. După perioada de echilibrare, se înregistrează o valoare de referință 0 a grosimii și opacității corneei, care va fi utilizată ca valoare de bază (și anume, momentul de timp egal cu 0). Cantitatea de fluoresceină determinată în momentul disecției este utilizată ca valoare de referință măsurată pentru acea caracteristică.

Aplicarea substanței chimice de testat

Imediat după măsurarea valorii de referință zero, ochiul (aflat în suportul său) este extras din aparatul de suprafuziune și plasat într-o poziție orizontală, iar substanța chimică de testat se aplică pe cornee.

De regulă, substanțele chimice de testat lichide se testează nediluate, dar pot fi diluate dacă se consideră necesar (de exemplu, în cadrul elaborării testelor). Solventul utilizat de preferință pentru substanțele chimice de testat diluate este serul fiziologic. Cu toate acestea, solvenți alternativi pot fi utilizați în condiții controlate, cu condiția ca adecvarea solvenților diferiți de serul fiziologic să fie demonstrată.

Substanțele chimice de testat lichide se aplică pe cornee astfel încât întreaga suprafață a acesteia să fie acoperită uniform cu substanța chimică de testat; volumul standard este de 0,03 ml.

Dacă este posibil, substanțele chimice de testat solide se macină cât mai fin posibil cu ajutorul unui mojar cu pistil sau al unui instrument de măcinat comparabil. Pulberea se aplică pe cornee astfel încât suprafața să fie acoperită uniform cu substanța chimică de testat; cantitatea standard este de 0,03 g.

Substanța chimică de testat (lichidă sau solidă) se aplică timp de 10 secunde, după care ochiul se clătește cu soluție salină izotonică (aproximativ 20 ml) la temperatura camerei. După aceasta, ochiul (în suportul său) este reintrodus în aparatul de suprafuziune, în poziția verticală inițială. Dacă este necesar, clătirea suplimentară poate fi utilizată după aplicarea de 10 secunde și la intervale de timp ulterioare (de exemplu, la descoperirea de reziduuri de substanță chimică de testat pe cornee). În general, cantitatea de soluție salină utilizată pentru clătire nu este critică, dar observarea aderenței substanței chimice la cornee este importantă.

Substanțele chimice martor

În fiecare experiment se introduc martori negativi testați în paralel sau martori solvent/vehicul și martori pozitivi.

Atunci când se testează substanțe lichide 100 % sau substanțe solide prin metoda de testare ICE, se utilizează ser fiziologic ca martor negativ pentru a se detecta modificări nespecifice ale sistemului de testare și a se preveni un efect iritant în urma condițiilor de testare.

Atunci când sunt testate substanțe lichide diluate, metoda de testare prevede un grup de martori solvent/vehicul testat în paralel pentru a se detecta modificările nespecifice ale sistemului de testare și a se preveni un efect iritant în urma condițiilor de testare. Conform punctului 31, se poate utiliza doar un solvent/vehicul care nu afectează în mod negativ sistemul de testare.

În fiecare experiment se introduce un martor pozitiv testat în paralel constând într-un iritant ocular pentru a verifica dacă se obține un răspuns adecvat. Având în vedere faptul că testul ICE este utilizat în această metodă de testare pentru a identifica corozivi sau iritanții severi, martorul pozitiv trebuie să fie o substanță chimică de referință care provoacă un răspuns sever în cadrul acestei metode de testare. Cu toate acestea, pentru a se asigura evaluarea variabilității răspunsului martorului pozitiv în timp, dimensiunea răspunsului sever nu trebuie să fie excesiv de mare. Este necesară generarea de suficiente date in vitro pentru martorul pozitiv, astfel încât să poată fi calculat un interval statistic acceptabil pentru acesta. În cazul în care nu sunt disponibile date adecvate precedente privind metoda de testare ICE pentru un anumit martor pozitiv, poate fi necesară efectuarea de studii pentru a furniza aceste informații.

Exemple de martori pozitivi pentru substanțele chimice de testat lichide sunt acidul acetic 10 % sau clorura de benzalconiu 5 %, în timp ce exemple de martori pozitivi pentru substanțe chimice de testat solide sunt hidroxidul de sodiu sau imidazolul.

Substanțele chimice etalon sunt utile pentru evaluarea potențialului iritant la nivel ocular al substanțelor chimice necunoscute din cadrul unei anumite clase de substanțe sau de produse sau pentru evaluarea potențialului iritant relativ al unei substanțe iritante la nivel ocular într-un interval specific de reacții iritante.

Caracteristici măsurate

Corneele tratate sunt evaluate înainte tratamentului și la 30, 75, 120, 180 și 240 minute (± 5 minute) după spălarea post-tratament. Aceste momente de observare permit un număr adecvat de măsurători pe parcursul celor patru ore de tratament, lăsând un interval suficient între măsurători pentru efectuarea observațiilor necesare la nivelul tuturor ochilor.

Caracteristicile evaluate sunt opacitatea corneană, inflamarea, retenția de fluoresceină și efectele morfologice (de exemplu, corodarea sau detașarea epiteliului). Cu excepția retenției de fluoresceină (determinată numai înainte de tratament și la 30 de minute după expunerea la substanța chimică de testat), toate caracteristicile se determină în fiecare dintre momentele de observare menționate mai sus.

Se recomandă realizarea de fotografii pentru documentarea opacității corneene, a retenției de fluoresceină, a efectelor morfologice și, dacă s-au efectuat, a studiilor histopatologice.

După examinarea finală la un interval de patru ore, utilizatorii sunt încurajați să păstreze ochii într-un fixator adecvat (de exemplu, formol neutru tamponat) pentru un potențial examen histopatologic [a se vedea punctul 14 și referința bibliografică (8) pentru detalii].

Inflamarea corneană se determină prin măsurarea grosimii corneene efectuată cu ajutorul unui pahimetru cornean, atașat unui microscop cu lampă cu fantă. Aceasta se exprimă sub formă procentuală și se calculează pe baza măsurătorilor grosimii corneene conform formulei următoare:

Valoarea procentuală medie a inflamării corneene pentru toți ochii testați se calculează pentru toate momentele de observare. Pe baza punctajului maxim mediu al inflamării corneene, obținut în oricare dintre momentele de observare, se furnizează apoi punctajul general al categoriei pentru fiecare substanță chimică de testat (a se vedea punctul 51).

Opacitatea corneană este evaluată prin utilizarea pentru înregistrare a suprafeței corneei care este cea mai opacifiată, astfel cum se arată în tabelul 1. Valoarea medie a opacității corneene pentru toți ochii testați se calculează pentru toate momentele de observare. Pe baza punctajului mediu maxim al opacității corneene obținut în oricare dintre momentele de observare, se furnizează apoi un punctaj general al categoriei pentru fiecare substanță chimică de testat (a se vedea punctul 51).

Tabelul 1.

Punctajele opacității corneene

Retenția de fluoresceină este evaluată numai pentru momentul de observare după 30 de minute, astfel cum se arată în tabelul 2. Valoarea medie a retenției de fluoresceină pentru toți ochii testați se calculează în consecință pentru momentul de observare după 30 de minute și este utilizată pentru punctajul general al categoriei furnizat pentru fiecare substanță chimică de testat (a se vedea punctul 51).

Tabelul 2.

Punctajele de retenție de fluoresceină.

Efectele morfologice includ „corodarea” celulelor epiteliale corneene, „detașarea” epiteliului, „formarea de asperități” la nivelul suprafeței corneene și „aderarea” de cornee a substanței chimice de testat. Aceste rezultate pot varia în gravitate și se pot produce în mod simultan. Clasificarea rezultatelor este subiectivă în funcție de interpretarea formulată de cercetător.

DATE ȘI RAPORTARE

Evaluarea datelor

Rezultatele pentru opacitatea corneană, inflamarea corneei și reținerea de fluoresceină se evaluează separat pentru a genera o clasă ICE pentru fiecare caracteristică. Clasele ICE pentru fiecare caracteristică sunt combinate ulterior pentru a genera o clasificare a iritației oculare pentru fiecare substanță chimică de testat.

Criterii de decizie

După evaluarea fiecărei caracteristici, se pot desemna clasele ICE în funcție de un interval predeterminat. Interpretarea inflamării corneene (tabelul 3), a opacității (tabelul 4) și a retenției de fluoresceină (tabelul 5) utilizând patru clase ICE se realizează în conformitate cu scalele prezentate mai jos. Este important să se remarce faptul că punctajele pentru inflamarea corneană prezentate în tabelul 3 sunt aplicabile numai în cazul în care grosimea se măsoară cu un microscop cu lampă cu fantă (de exemplu, Haag-Streit BP900) cu dispozitivul de măsurare a adâncimii nr. 1 și cu lărgimea fantei setată la 9

Tabelul 3

Criteriile de clasificare a ICE pentru inflamarea corneeană.

Tabelul 4

Criteriile de clasificare a ICE pentru opacitate.