ANEXA I

(Articolul 1)

LISTA METODELOR DE REFERINȚĂ

Index: Min. = minimum, Max. = maximum, Anexă = anexa la regulamentul menționat anterior, SNF = substanțe solide negrase, PV = valoarea peroxidului, A = aspect, F = miros, C = consistență, TBC = număr total de bacterii, Therm = număr de bacterii termofile, MS = stat membru, FIL = Federația Internațională a Laptelui, ISO = Organizația Internațională de Standardizare, IUPAC = Uniunea Internațională de Chimie Pură și Aplicată, ADPI = Institutul American pentru Produse Lactate, SCM = lapte condensat îndulcit, EMC = lapte sau smântână evaporate.

PARTEA A

Regulamentul Comisiei	Produsul	Parametrul	Limita (1)	Metoda de referință	Notă
Regulamentul (CE) nr. 2771/1999 – Depozitare publică	Unt fără sare	Grăsime	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|FIL 194:2003
		Apă	Până la 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|FIL 80-1:2001
		SNF	Până la 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|FIL 80-2:2001
		Acizi grași liberi	1,2 mmol/100 g grăsime	ISO 1740:2004|FIL 6:2004
		PV (max.)	0,3 mechiv. oxigen/1 000 g grăsime	ISO 3976:2006|FIL 74:2006	Nota 1
		Bacterii coliforme	Nedetectabile în 1 g	Anexa X	Nota 3
		Grăsime care nu provine din lapte	Nedetectabilă prin analiza trigliceridelor	Anexa XX
		Marcatori de steroli	Nedetectabili, β-sitosterol ≤ 40 mg/kg	Anexa VIII
		Alți marcatori:
		— vanilină	Nedetectabilă	Anexa VI
		— etil esterul acidului carotenic	≤ 6 mg/kg	Anexa VII
		— trigliceride ale acidului enantic	Nedetectabile	Anexa V
		Caracteristici de sensibilitate	Cel puțin 4 din 5 puncte pentru A, F și C	Anexa IV
		Dispersia apei	Cel puțin 4 puncte	ISO 7586:1985|FIL 112A:1989
Regulamentul (CE) nr. 2771/1999 – Depozitare privată	Unt fără sare	Grăsime	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|FIL 194:2003
		Apă	Până la 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|FIL 80-1:2001
		SNF	Până la 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|FIL 80-2:2001
Regulamentul (CE) nr. 2771/1999 – Depozitare privată	Unt sărat	Grăsime	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|FIL 194:2003
		Apă	Până la 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|FIL 80-1:2001
		SNF (cu excepția sării)	Până la 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|FIL 80-2:2001
		Sare	Până la 2 % m/m	ISO 15648:2004|FIL 179:2004
Regulamentul (CE) nr. 1898/2005 – capitolul II	Unt fără sare	Grăsime	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|FIL 194:2003
		Grăsime care nu provine din lapte		Anexa XX
		Apă	Până la 16 % m/m	ISO 3727-1 2001|FIL 80-1:2001
		SNF	Până la 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|FIL 80-2:2001
		Marcatori:
		— steroli	A se vedea anexa VIII	Anexa VIII
		— vanilină	A se vedea anexa VI	Anexa VI
		— etil esterul acidului carotenic	A se vedea anexa VII	Anexa VII
		— trigliceride ale acidului enantic	A se vedea anexa V	Anexa V
Regulamentul (CE) nr. 1898/2005 – capitolul II	Unt sărat	Grăsime	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|FIL 194:2003
		Grăsime care nu provine din lapte		Anexa XX
		Apă	Până la 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|FIL 80-1:2001
		SNF (cu excepția sării)	Până la 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|FIL 80-2:2001
		Sare	Până la 2 % m/m	ISO 15648:2004|FIL 179:2004
		Marcatori:
		— steroli	A se vedea anexa VIII	Anexa VIII
		— vanilină	A se vedea anexa VI	Anexa VI
		— etil esterul acidului carotenic	A se vedea anexa VII	Anexa VII
		— trigliceride ale acidului enantic	A se vedea anexa V	Anexa V
Regulamentul (CE) nr. 1898/2005 – capitolul II	Unt concentrat	Grăsime	Min. 99,8 % m/m	FIL 24:1964
		Apă și SNF	Până la 0,2 % m/m	ISO 5536:2002|FIL 23:2002 (umiditate) FIL 24:1964 (SNF)
		Acizi grași liberi	1,2 mmol/100 g grăsime	ISO 1740:2004|FIL 6:2004
		PV (max.)	0,5 mechiv. oxigen/1 000 g grăsime	ISO 3976:2006|FIL 74:2006	Nota 1
		Grăsime care nu provine din lapte	Absentă	Anexa XX
		Aromă	Proaspătă
		Miros	Fără mirosuri străine
		Altele	Absența agenților de neutralizare, a antioxidanților și conservanților
		Marcatori:
		— steroli	A se vedea anexa VIII	Anexa VIII
		— vanilină	A se vedea anexa VI	Anexa VI
		— etil esterul acidului carotenic	A se vedea anexa VII	Anexa VII
		— trigliceride ale acidului enantic	A se vedea anexa V	Anexa V
Regulamentul (CE) nr. 1898/2005 – capitolul II	Smântână	Grăsime	Minimum 35 % m/m	ISO 2450:1999|FIL 16 C:1987
		Grăsime care nu provine din lapte		Anexa XX
		Marcatori:
		— steroli	A se vedea anexa VIII		Nota 2
		— vanilină	A se vedea anexa VI	Anexa VI
		— etil esterul acidului carotenic	A se vedea anexa VII		Nota 2
		— trigliceride ale acidului enantic	A se vedea anexa V	Anexa V
Regulamentul (CE) nr. 1898/2005 – capitolul III	Unt concentrat	Grăsime	Min. 96 % m/m		Nota 2
		Grăsime care nu provine din lapte		Anexa XX
		SNF	Până la 2 % m/m		Nota 2
		Marcatori:
		— stigmasterol (95 % m/m)	15 g/100 kg de unt concentrat	Anexa VIII
		— stigmasterol (85 % m/m)	17 g/100 kg de unt concentrat	Anexa VIII
		— trigliceride ale acidului enantic	10,34 kg/100 t de unt concentrat	Anexa V
		— etil ester al acidului butiric și stigmasterol		— etil esterul acidului butiric — stigmasterol: anexa VIII	Nota 2
		— etil esterul acidului butiric și trigliceridele acidului enantic		— etil esterul acidului butiric — trigliceride ale acidului enantic: anexa V	Nota 2
		lecitină (E 322)	Până la 0,5 % m/m		Nota 2
		NaC1	Până la 0,75 % m/m	ISO 15648:2004|FIL 179:2004
		Acizi grași liberi	1,2 mmol/100 g grăsime	ISO 1740:2004|FIL 6:2004
		PV (max.)	Până la 0,5 mechiv. oxigen/1 000 g grăsime	ISO 3976:2006|FIL 74:2006	Nota 1
		Aromă	Proaspătă
		Miros	Fără mirosuri străine
		Altele	Absența agenților de neutralizare, a antioxidanților și a conservanților
Regulamentul (CE) nr. 1898/2005 – capitolul IV	Unt fără sare	Grăsime	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|FIL 194:2003
		Apă	Până la 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|FIL 80-1:2001
		SNF	Până la 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|FIL 80-2:2001
Regulamentul (CE) nr. 1898/2005 – capitolul IV	Unt sărat	Grăsime	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|FIL 194:2003
		Apă	Până la 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|FIL 80-1:2001
		SNF (cu excepția sării)	Până la 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|FIL 80-2:2001
		Sare	Până la 2 % m/m	ISO 15648:2004|FIL 179:2004
Articolul 9 și titlul II din Regulamentul (CE) nr. 1255/1999	Brânză produsă din lapte de oaie și/sau capră	Lapte de vacă	< 1 % m/m	Anexa IX
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90	Anexa I – Cazeină acidă	Apă	Până la 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|FIL 78:2006
		Grăsime	Până la 1,75 % m/m	ISO 5543:2004|FIL 127:2004
		Aciditate liberă	Până la 0,30 ml soluție 0,1 N NaOH/g	ISO 5547:1978|FIL 91:1979
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90	Anexa I – Cazeină cheag	Apă	Până la 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|FIL 78:2006
		Grăsime	Până la 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|FIL 127:2004
		Cenușă	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|FIL 90:1979
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90	Anexa I – Cazeinați	Apă	Până la 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|FIL 78:2006
		Proteine ale laptelui	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|FIL 92:1979
		Grăsime și cenușă	Până la 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|FIL 127:2004
		Cenușă insolubilă		ISO 5544:1978|FIL 89:1979
		Cenușă		ISO 5545:1978|FIL 90:1979
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90	Anexa II – Cazeină acidă	Apă	Până la 10,00 % m/m	ISO 5550:2006|FIL 78:2006
		Grăsime	Până la 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|FIL 127:2004
		Aciditate liberă	Până la 0,20 ml soluție 0,1 N NaOH/g	ISO 5547:1978|FIL 91:1979
		TBC (max.)	30 000/ g	ISO 4833:2003	Nota 3
		Bacterii coliforme	Absente în 0,1 g	Anexa X	Nota 3
		Therm. (max.)	5 000/ g	ISO 4833:2003	Notele 3 și 4
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90	Anexa II – Cazeină cheag	Apă	Până la 8,00 % m/m	ISO 5550:2006|FIL 78:2006
		Grăsime	Până la 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|FIL 127:2004
		Cenușă	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978|FIL 90:1979
		TBC (max.)	30 000/ g	ISO 4833:2003	Nota 3
		Bacterii coliforme	Absente în 0,1 g	Anexa X	Nota 3
		Therm. (max.)	5 000/ g	ISO 4833:2003	Notele 3 și 4
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90	Anexa II – Cazeinați	Apă	Până la 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|FIL 78:2006
		Proteine ale laptelui	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978|FIL 92:1979
		Grăsime și cenușă	Până la 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|FIL 127:2004 ISO 5544:1978|FIL 89:1979 sau ISO 5545:1978|FIL 90:1979
		TBC (max.)	30 000/ g	ISO 4833:2003	Nota 3
		Bacterii coliforme	Absente în 0,1 g	Anexa X	Nota 3
		Therm. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Notele 3 și 4
Regulamentul (CEE) nr. 2921/90	Anexa III – Cazeinați	Apă	Până la 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|FIL 78:2006
		Proteine ale laptelui	Min. 85,00 % m/m	ISO 5549:1978|FIL 92:1979
		Grăsime	Până la 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|FIL 127:2004
		Lactoză	Până la 1,00 % m/m	ISO 5548:2004|FIL 106:2004
		Cenușă	Până la 6,50 % m/m	ISO 5544:1978|FIL 89:1979 sau ISO 5545:1978|FIL 90:1979
		TBC (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Nota 3
		Bacterii coliforme	Absente în 0,1 g	Anexa X	Nota 3
		Therm. (max.)	5 000/ g	ISO 4833:2003	Notele 3 și 4
Regulamentul (CE) nr. 2799/1999	Furaje combinate și lapte praf degresat (SMP) (folosite în furaje)	Apă (zară acidă praf)	Până la 5 % m/m	Anexa XIX
		Proteine	31,4 % m/m (min.) din materia uscată negrasă	ISO 8968-1|2|3:2001|FIL 20-1|2|3:2001
		Apă (SMP)	Până la 5 % m/m	ISO 5537:2004|FIL 26:2004
		Grăsimi (SMP)	Până la 11 % m/m	ISO 1736:2000|FIL 9C:1987
		Zer închegat (SMP)	Absent	Anexa XIII	Nota 6
		Amidon (SMP)	Absent	Anexa XVII
		Apă (amestecuri)	Până la 5 % din materia negrasă	ISO 5537:2004|FIL 26:2004
		Grăsime (amestecuri)		Directiva 84/4/CEE a Comisiei (JO L 15, 18.1.1984, p. 29)
		Zer închegat (amestecuri)	Absent	Anexa XIII
		Conținutul SMP (din produsul final)	Min. 50 % m/m	Anexa XVI
		Grăsime (din produsul final)	Min. 2,5 % m/m sau 5 % m/m	Directiva 84/4/CEE a Comisiei (JO L 15, 18.1.1984, p. 29)	Nota 7
		Amidon (din produsul final)	Min. 2 % m/m	Anexa XVII	Nota 8
		Cupru (din produsul final)	25 ppm	Directiva 78/633/CEE a Comisiei (JO L 206, 26.7.1987, p. 43)
Regulamentul (CE) nr. 214/2001	SPM (spray)	Grăsime	Până la 1,0 % m/m	ISO 1736:2000|FIL 9C:1987
		Proteine	31,4 % (2) m/m (min.) din materia uscată negrasă	ISO 8968-1/2:2001|FIL 20-1/2:2001
		Apă	Până la 3,5 % m/m	ISO 5537:2004|FIL 26:2004
		Aciditate	Până la 19,5 ml, 0,1 N NaOH, 10 g substanțe solide negrase	ISO 6091:1980|FIL 86:1981
		Lactați	Până la 150 mg/100 g substanțe solide negrase	ISO 8069:2005|FIL 69:2005
		Fosfatază	Negativ	ISO 11816-1:2006|FIL 155-1:2006
		Indicele insolubilității	Până la 0,5 ml la 24 °C	ISO 8156:2005|FIL 129:2005
		Particule arse	Disc A sau B (15,0 mg)	ADPI (1990)
		TBC	40 000/ g	ISO 4833:2003	Nota 3
		Bacterii coliforme	Negativ/ 0,1 g	Anexa X	Nota 3
		Zară	Negativ	Anexa XIV
		Zer închegat	Negativ	Anexa XII
		Zer acid	Negativ		Nota 2
		Agenți antimicrobieni		Anexa XV

PARTEA B

Metodele de referință enumerate în partea B pot fi folosite pentru analiza produselor din domeniul reglementat de oricare dintre regulamentele enumerate în coloana 1.

Regulamentul Comisiei	Produsul	Codul NC	Parametrul	Limita	Metoda de referință	Notă
Regulamentul (CEE) nr. 2658/87 Regulamentul (CE) nr. 2535/2001 Regulamentul (CE) nr. 1282/2006	Lapte și smântână din lapte, neconcentrate, fără adaos de zahăr sau alți îndulcitori	0401	Grăsime (≤ 6 % m/m)	Limitele sunt cele specificate în descrierea codului NC pentru produsul respectiv, specificate mai apoi, după caz, în Regulamentul (CEE) nr. 3846/87 al Comisiei (JO L 366, 24.12.1987, p. 1), partea 9 din nomenclatura pentru export sau Regulamentul (CE) nr. 2535/2001 (JO L 341, 22.12.2001, p. 29)	ISO 1211:2001|FIL 1D:1996
			Grăsime (> 6 % m/m)		ISO 2450:1999|FIL 16C:1987
	Lapte și smântână din lapte, concentrate sau cu adaos de zahăr sau alți îndulcitori	0402	Grăsime (formă lichidă)		ISO 1737:1999|FIL 13C:1987
			Grăsime (formă solidă)		ISO 1736:2000|FIL 9C:1987
			Proteine		ISO 8968-1|2|3:2001|FIL 20-1|2|3:2001
			Sucroză (conținut normal)		ISO 2911:2004| FIL 35:2004
			Sucroză (conținut scăzut)			Nota 2
			Solide (SCM)		ISO 6734:1989|FIL 15B:1991
			Solide (EMC)		ISO 6731:1989|FIL 21B:1987
			Apă (lapte praf)		ISO 5537:2004|FIL 26:2004
			Apă (smântână praf)		Anexa XVIII
	Lapte acru, lapte sau smântână fermentate sau acrite, concentrate sau neconcentrate, cu adaos de zahăr sau alți îndulcitori	0403	Grăsime		ISO 1211:2001|FIL 1D:1996 ISO 1736:2000|FIL 9C:1987 ISO 2450:1999|FIL 16 C:1987 ISO 7208:1999|FIL 22B:1987 ISO 8262-3:2005|FIL 124-3:2005
			Proteine		ISO 8968-1|2|3:2001|FIL 20-1|2|3:2001
			Sucroză (conținut normal)		ISO 2911:2004|FIL 35:2004
			Sucroză (conținut scăzut)			Nota 2
			Apă (zară acidă praf)		Anexa XIX
			Apă (zară dulce praf)		ISO 5537:2004|FIL 26:2004
			Solide (alte produse)		Metode aprobate de autoritatea competentă
	Zer, chiar concentrat sau cu adaos de zahăr sau de alți îndulcitori; produse obținute din compuși naturali ai laptelui	0404	Grăsime		ISO 1736:2000|FIL 9C:1987 ISO 2450:1999|FIL 16C:1987 ISO 7208:1999|FIL 22B:1987
			Proteine		ISO 8968-1|2|3:2001|FIL 20-1|2|3:2001
			Sucroză (conținut normal)		ISO 2911:2004|FIL 35:2004
			Sucroză (conținut scăzut)			Nota 2
		0404 90	Proteine		ISO 8968 1/2 2001|FIL 20-1/2:2001
			Apă		FIL 21B:1987
			Solide		ISO 6734:1989|FIL 15B:1991
			(Produse concentrate)		ISO 6731:1989|FIL 21B:1987
	Unt și alte grăsimi care provin din lapte; pastă din lapte pentru tartine	0405	Grăsime (în cazul în care ≤ 85 % m/m)		ISO 17189:2003|FIL 194:2003
		Unt	Apă		ISO 3727-1:2001|FIL 80-1:2001
			SNF		ISO 3727-2:2001|FIL 80-2:2001
			NaCl		ISO 15648:2004|FIL 179:2004
			Grăsime (în cazul în care > 99 % m/m)		FIL 24:1964
	Ulei de unt		Apă (în cazul în care grăsimea < 99 % m/m)		ISO 5536:2002|FIL 23:2002
	Brânză și caș	0406	Grăsime		ISO 1735:2004|FIL 5:2004
			Solide		ISO 5534:2004|FIL 4:2004
			Solide (Urdă)		ISO 2920:2004|FIL 58:2004
			NaCl		ISO 5943:2006|FIL 88:2006
			Lactoză		ISO 5765-1/2:2002|FIL 79-1/2:2002
Regulamentul (CEE) nr. 2658/87	Furaje combinate	2309	Lactoză		Anexa XI

Observații la lista metodelor de referință ale Uniunii Europene:

Nota 1: Izolarea grăsimii din lapte conform ISO 1740:1991 (la adăpost de lumină).

Nota 2: Nu s-a stabilit nicio metodă de referință. Metode aprobate de autoritatea competentă.

Nota 3: Proba este preparată conform ISO 8261:2001|FIL 122:2001.

Nota 4: Incubare timp de 48 de ore la temperatură de 55 °C, acordându-se atenție prevenirii uscării mediului de cultură.

Nota 5: % m/m SNF = % m/m solide – % m/m grăsime.

Nota 6: Directiva 84/4/CEE a Comisiei.

Nota 7: Regulamentul (CE) nr. 2799/1999 al Comisiei (JO L 340, 31.12.1999, p. 3-27).

Nota 8: Directiva 78/633/CEE a Comisiei.

---

(1)  Fără a se aduce atingere cerințelor regulamentului în cauză.

(2)  De la 1 septembrie 2009 conținutul minim de proteine va fi de 34 %.

ANEXA II

(Articolul 3)

EVALUAREA CONFORMITĂȚII UNUI LOT CU LIMITA LEGALĂ

1.   PRINCIPIU

În cazurile în care legislația relevantă prevede proceduri detaliate de prelevare a probelor, aceste proceduri trebuie utilizate. În toate celelalte cazuri, se utilizează o probă din cel puțin 3 unități de probă luate la întâmplare din lotul supus controlului. Se poate prepara o probă compozită. Rezultatul obținut este comparat cu limitele legale prin calcularea intervalului de încredere de 95 % pe baza a 2 x deviația standard, unde deviația standard relevantă depinde 1. de validarea metodei în cadrul colaborării internaționale cu valorile pentru σr și σR sau 2. în cazul validării interne, de calcularea reproductibilității interne. Acest interval de încredere este apoi comparat cu incertitudinea de măsurare a rezultatului.

2.   METODA ESTE VALIDATĂ ÎN CADRUL COLABORĂRII INTERNAȚIONALE

În acest caz, deviația standard a repetabilității σr și deviația standard a reproductibilității σR au fost stabilite și laboratorul poate demonstra conformitatea cu caracteristicile de performanță ale metodei validate.

A se calcula media aritmetică din n măsurători repetate.

A se calcula incertitudinea extinsă (k = 2) din pe baza

În cazul în care rezultatul final x al măsurătorii se calculează utilizând o formulă de forma x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 sau x = y 1 / y 2, se respectă procedurile obișnuite de combinare a deviațiilor standard în astfel de cazuri.

Se apreciază că lotul nu respectă limita legală superioară UL în cazul în care

;

în caz contrar, se apreciază că lotul respectă UL.

Se apreciază că lotul nu respectă limita legală inferioară LL în cazul în care

;

în caz contrar, se apreciază că lotul respectă LL.

3.   VALIDAREA INTERNĂ ASOCIATĂ CU CALCULAREA DEVIAȚIEI STANDARD A REPRODUCTIBILITĂȚII INTERNE

În cazurile în care se folosesc metode care nu sunt specificate în prezentul regulament și nu sunt stabilite măsuri de precizie, se realizează o validare internă. Se utilizează deviația standard a repetabilității interne sir și deviația standard a reproductibilității interne siR în locul σr și σ R , respectiv, în formulele de calcul ale incertitudinii extinse U.

Regulile de luare a unei decizii sunt aceleași ca la punctul 1. Cu toate acestea, în cazul în care se consideră că lotul nu respectă limita legală, măsurătorile se repetă folosind metoda specificată în prezentul regulament, decizia urmând să fie luată în conformitate cu punctul 1.

ANEXA III

(Articolul 4)

EVALUAREA EVALUATORILOR ȘI FIABILITATEA REZULTATELOR ÎN ANALIZELE SENZORIALE

În cazul în care se folosesc metode de punctare se aplică următoarele proceduri (Standard FIL 99C:1997).

A.   DETERMINAREA „INDICELUI DE REPETABILITATE”

Cel puțin 10 probe sunt analizate de un evaluator ca duplicat probă martor într-o perioadă de 12 luni. Această procedură se realizează de obicei în câteva ședințe. Rezultatele pentru caracteristicile produsului individual sunt evaluate utilizându-se formula:

unde:

wI	:	indice de repetabilitate;
xi1	:	punctajul pentru prima evaluare a probei xi;
xi2	:	punctajul pentru a doua evaluare a probei xi;
n	:	numărul de probe.

Probele care urmează a fi evaluate trebuie să reflecte o gamă largă de calitate. w1 nu trebuie să depășească 1,5 (pe o scară de 5 puncte).

B.   DETERMINAREA „INDICELUI DE DEVIAȚIE”

Acest indice trebuie utilizat pentru a se verifica în cazul în care un evaluator utilizează aceeași scală pentru evaluarea calitativă ca și un grup de evaluatori experimentați. Punctajul obținut de evaluator este comparat cu media punctajelor obținute de grupul de evaluatori.

Pentru evaluarea rezultatelor se utilizează următoarea formulă:

unde:

xi1; xi2	:	a se vedea punctul A;
;	:	punctajul mediu al grupului de evaluatori pentru prima, respectiv a doua evaluare a probei xi;
n	:	numărul de probe (cel puțin zece per 12 luni).

Probele care urmează a fi evaluate trebuie să reflecte o gamă largă de calitate. DI nu trebuie să depășească 1,5 (pe o scară de 5 puncte).

Statele membre notifică orice dificultăți întâmpinate în aplicarea prezentei proceduri.

În cazul în care se constată că evaluatorii individuali depășesc limita de 1,5 pentru indicii de repetabilitate sau de deviație, expertul (experții) autorității publice trebuie să efectueze una sau mai multe verificări aleatorii de „reevaluare” asupra probelor clasificate de aceștia în următoarele câteva săptămâni sau să efectueze una sau mai multe verificări „în paralel” cu evaluatorii respectivi. Este necesară o monitorizare atentă în vederea luării unei decizii de menținere a serviciilor acestora. Constatările trebuie să fie atestate în mod corespunzător, fiind reținute ca dovadă în acțiunile ulterioare.

C.   COMPARAREA REZULTATELOR OBȚINUTE ÎN REGIUNI DIFERITE ALE STATELOR MEMBRE ȘI ÎN DIFERITE STATE MEMBRE

După caz, se organizează un test cel puțin o dată pe an pentru a compara rezultatele obținute de evaluatorii din diferite regiuni. În cazul în care se constată diferențe semnificative, se iau măsurile necesare pentru a se identifica motivele și pentru a se obține rezultate comparabile.

Statele membre pot organiza teste pentru a compara rezultatele obținute de evaluatorii lor cu cele obținute de evaluatori ai statelor membre învecinate. Diferențele semnificative duc la investigații detaliate în scopul de a obține rezultate comparabile.

Statele membre notifică Comisiei rezultatele acestor comparații.

ANEXA IV

(Articolul 4)

EVALUAREA SENZORIALĂ A UNTULUI

1.   DOMENIUL DE APLICARE

Scopul acestei proceduri de evaluare senzorială a untului este acela de a furniza o metodă uniformă aplicabilă în toate statele membre.

A se consulta actualul standard internațional FIL pentru lapte și produse lactate, FIL 99 – părțile 1, 2, 3 privind Evaluarea senzorială, pentru detalii suplimentare.

2.   DEFINIȚII

„Evaluare senzorială” înseamnă examinarea caracteristicilor unui produs cu ajutorul organelor de simț.

„Panel” înseamnă un grup de evaluatori selectați care, pe perioada evaluării, lucrează independent, fără a comunica între ei și fără a se influența reciproc.

„Evaluatorul” este o persoană aleasă pentru capacitatea sa de a efectua un test senzorial. Acest tip de evaluator poate avea experiență limitată.

„Evaluatorul expert” este o persoană cu un grad înalt de sensibilitate senzorială și cu experiență în metodologia senzorială, care este capabilă să efectueze evaluări coerente și sigure ale unor produse variate. Acest tip de evaluator dispune pe termen lung de o bună memorie senzorială.

„Punctare” înseamnă evaluarea senzorială realizată de un panel, folosindu-se o scală numerică. Trebuie să se folosească un nomenclator al defectelor.

„Clasificare” înseamnă clasificarea calitativă realizată pe baza punctării.

„Documente de control”: documentele folosite pentru înregistrarea punctajelor individuale pentru fiecare caracteristică și a clasificării finale a produsului. (Acest document poate fi folosit și pentru înregistrarea compoziției chimice.)

3.   CAMERĂ DE TESTARE

A se consulta ISO 8589 și ISO/DIS 22935-2 | FIL 99-2 punctul 7, pentru mai multe detalii.

Sunt necesare măsuri de precauție pentru ca evaluatorii dintr-o cameră de testare să nu fie influențați de factori externi.

În camera de testare nu trebuie să existe mirosuri străine și trebuie să fie ușor de curățat. Pereții trebuie să aibă o culoare deschisă și nereflectantă.

Camera de testare și iluminarea acesteia trebuie să fie de așa natură încât să nu afecteze proprietățile produsului care urmează să fie punctat.

Camera trebuie dotată cu un sistem adecvat de control al temperaturii care să permită păstrarea unei temperaturi constante a untului. Untul trebuie să aibă o temperatură de 12 °C (±2 °C) în momentul clasificării.

4.   SELECȚIA EVALUATORILOR

Un evaluator trebuie să fie familiarizat cu produsele din unt și să aibă competența necesară pentru a realiza o gradare a sensibilității senzoriale. Competența evaluatorului este monitorizată de către autoritatea competentă în mod regulat (cel puțin o dată pe an).

4.1.   Se consultă ISO/DIS 22935-1 | FIL 99-1 punctul 4 (recrutarea) și punctul 5.1 pentru detalii privind cerințele generale și testele de selecție care trebuie aplicate înaintea utilizării oficiale a unui nou evaluator.

Este esențial ca formarea profesională să fie continuă, iar ședințele generale trebuie să aibă loc în mod regulat. A se consulta ISO 8586-1 pentru informații privind formarea profesională a panelului.

4.2.   Formarea inițială trebuie să acopere următoarele:

—	teoria generală și importanța practică a evaluării senzoriale;

—	metodele, scalele și descrierea percepțiilor senzoriale;

—	detectarea și recunoașterea caracteristicilor senzoriale și termenilor senzoriali specifici;

—	pregătire de bază în fabricarea untului;

—	referințe și probe validate care să îl ajute pe evaluator în identificarea aromelor specifice și a intensității aromei produsului.

5.   CERINȚE PENTRU PANEL

Numărul evaluatorilor din panel trebuie să fie impar, numărul minim fiind de trei. Majoritatea acestora trebuie să fie angajați ai autorității competente sau persoane autorizate care nu sunt angajate în industria de prelucrare a laptelui.

Conducătorul panelului trebuie să răspundă pentru întreaga procedură și poate participa în panel.

Înainte de evaluare, trebuie avuți în vedere mai mulți factori pentru obținerea unor performanțe optime ale subiecților:

—	subiecții nu trebuie să sufere de boli care le-ar putea afecta performanța. Într-un asemenea caz, evaluatorul în cauză trebuie înlocuit în panel cu un alt evaluator;

—	subiecții trebuie să se prezinte în mod punctual la evaluare și să dispună de suficient timp pentru realizarea evaluării;

—	subiecții nu trebuie să folosească substanțe cu miros puternic cum ar fi parfum, loțiune după ras, deodorant etc. și trebuie să evite consumul de alimente cu arome puternice (de exemplu, foarte condimentate) etc.;

—	subiecții nu au voie să fumeze, să mănânce și să bea altceva decât apă cu o jumătate de oră înainte de evaluare.

6.   PERFORMANȚA

Toți evaluatorii trebuie să participe în mod regulat la panele de evaluare senzorială pentru a-și păstra competențele. Frecvența acestora depinde de volumul și capacitatea de producție a untului și, în măsura în care acest lucru este posibil, trebuie să se organizeze cel puțin un panel pe lună.

Evaluatorii principali trebuie, de asemenea, să participe la un număr de panele în fiecare an și, în măsura în care acest lucru este posibil, cel puțin o dată pe trimestru.

7.   PRELEVAREA ȘI PREPARAREA PROBEI

Este esențial ca identitatea probelor să fie ascunsă în timpul evaluării, astfel încât să se evite orice posibilitate de favorizare. Probele trebuie să fie codate.

Această etapă are loc înaintea evaluării propriu-zise. Se stabilește temperatura untului în timpul transportului către camera de testare (6 °C ± 2 °C).

Când evaluarea senzorială se realizează într-un antrepozit frigorific, proba este prelevată cu ajutorul unui prelevator de unt. În cazul în care evaluarea senzorială se realizează în alt loc decât în antrepozitul frigorific, se prelevează o probă de cel puțin 500 g. Pe parcursul evaluării, untul trebuie să aibă o temperatură de 12 °C (±2 °C) (referință: în ISO/DIS 22935-2 | FIL 99-2 temperatura de evaluare a untului este 14 °C ± 2 °C). Deviațiile mari trebuie evitate cu orice preț.

8.   EVALUAREA VALORII FIECĂREI CARACTERISTICI

8.1.   Evaluarea senzorială se realizează pentru următoarele trei caracteristici: aspect, consistență și aromă.

„Aspectul” implică următoarele caracteristici: culoare, puritate vizibilă, absența contaminării fizice, absența fungilor și uniformitatea de dispersie a apei. Dispersia apei se testează în conformitate cu standardul FIL 112A/1989.

„Consistența” implică următoarele caracteristici: corp, textură și fermitate. Tartinabilitatea poate fi monitorizată prin utilizarea mijloacelor fizice, în cazul în care un stat membru dorește acest lucru în vederea satisfacerii cerințelor clientului. Comisia poate decide să armonizeze metodologia în viitor.

„Corp” este termenul care se referă la coeziunea produsului în timp ce este consumat. În mod normal este asociat cu fermitatea și tartinabilitatea și trebuie să fie uniform în întregul produs. Se află în strânsă legătură cu textura și reprezintă abilitatea produsului de a-și menține poziția inițială. Este indicat de rezistență la tăiere, putând fi măsurat mecanic și prin evaluare buco-tactilă și tactilă.

„Aroma” este caracteristica percepută în cavitatea bucală, în principal prin intermediul papilelor gustative de la nivelul limbii.

„Mirosul” este caracteristica percepută prin intermediul nasului și al simțului olfactiv.

O deviație semnificativă față de temperatura recomandată împiedică evaluarea sigură a consistenței și a aromei. Temperatura este extrem de importantă.

Clasificarea untului trebuie amânată în cazul în care temperatura se află în afara intervalului recomandat.

8.2.   Fiecare caracteristică trebuie să facă obiectul unei evaluări senzoriale separate. Punctarea se realizează în conformitate cu tabelul 1.

8.3.   Pentru a se obține uniformitate, uneori este de dorit ca, înainte de începerea evaluării, evaluatorii să puncteze împreună una sau mai multe probe de referință, în privința aspectului, a consistenței și a aromei.

8.4.   Punctajul de acceptare este următorul:

A se consulta partea 7 – Nomenclator și descrierea aplicabilă punctelor în momentul punctării.

	Maxim	Necesar
Aspect	5	4
Consistență	5	4
Aromă/miros	5	4

—	În cazurile în care nu se obține punctajul necesar, trebuie să se prezinte o descriere a defectului.

—	Punctajul acordat de fiecare evaluator pentru fiecare caracteristică trebuie înregistrat în documentul de control.

—	Produsul este acceptat sau respins pe baza deciziei majorității.

—	Nu trebuie să se înregistreze în mod frecvent cazuri în care diferențele dintre punctajele individuale acordate pentru fiecare caracteristică să fie mai mari de un punct (nu mai frecvent de un caz la 20 de probe). În caz contrar, competența panelului trebuie verificată de conducătorul panelului.

9.   SUPRAVEGHERE

Conducătorul panelului, care trebuie să fie angajat oficial al autorității competente și care poate fi membru al panelului, trebuie să răspundă în general pentru întreaga procedură. El/ea trebuie să înregistreze în documentul de control punctajele individuale pentru fiecare caracteristică și să certifice dacă produsul este acceptat sau respins.

10.   NOMENCLATOR

A se consulta tabelul 2 anexat.

11.   REFERINȚE

FIL 99C:1997 Evaluarea senzorială a produselor lactate prin punctare – Metoda de referință

ISO/DIS 22935 | FIL 99 Standardul internațional pentru lapte și produse lactate – Evaluarea senzorială – părțile 1-3

ISO 8586-1 Analiza senzorială – Orientări generale pentru selecția, formarea și monitorizarea evaluatorilor – partea 1

ISO 8589 Analiza senzorială – Orientări generale pentru proiectarea camerelor de testare

FIL 112A:1989 Untul – Determinarea valorii dispersiei apei

Tabelul 1

Punctajul pentru unt

Aspect			Consistență			Aromă + miros
Puncte	Nr. (1)	Observații	Puncte (clasă de calitate)	Nr. (1)	Observații	Puncte (clasă de calitate)	Nr. (1)	Observații
5		Foarte bine tipul ideal cea mai bună calitate (substanță uscată egală)	5		Foarte bine tipul ideal cea mai bună calitate (bine tartinabil)	5		Foarte bine tipul ideal cea mai bună calitate (cea mai fină aromă absolut pură)
4		Bine  (2) nu există defecte evidente	4	17 18	Bine  (2) tare moale	4		Bine  (2) nu există defecte evidente
3	1 2 3 4 5 6 7 8	Acceptabil (mici defecte) nelegat (necompact), umed neuniform, în două culori cu dungi pestriț, marmorat cu aspect granulat separare a uleiurilor supracolorat textură slabă, deschisă	3	14 15 16 17 18	Acceptabil (mici defecte) dezemulsionat, friabil, sfărâmicios păstos, de consistența aluatului, gras lipicios tare moale	3	21 22 25 27 33 34 35	Acceptabil (mici defecte) impur arome străine acid aromă de copt, aromă de ars aromă de furaj aspru, amar suprasărat
2	1 3 4 5 6 10 11 12	Slab (defecte evidente) nelegat (necompact), umed cu dungi pestriț, marmorat cu aspect granulat separare a uleiurilor materii străine mucegăit sare nedizolvată	2	14 15 16 17 18	Slab (defecte evidente) dezemulsionat, friabil, sfărâmicios păstos, de consistența aluatului, gras lipicios tare moale	2	21 22 23 25 32 33 34 35 36 38	Slab (defecte evidente) neclar arome străine vechi acid miros oxidat, miros metalic aromă de furaj aspru, amar suprasărat mucegăit miros de substanțe chimice
1	1 3 4 5 6 7 9 10 11 12	Foarte slab (defecte mari) nelegat (necompact), umed cu dungi pestriț, marmorat cu aspect granulat separare a uleiurilor supracolorat granulat materii străine mucegăit sare nedizolvată	1	14 15 16 17 18	Foarte slab (defecte mari) dezemulsionat, friabil, sfărâmicios păstos, de consistența aluatului, gras lipicios tare moale	1	22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38	Foarte slab (defecte mari) arome străine brânzos, miros de brânză lactică acid spumos miros de mucegai rânced uleios, cu gust de pește cu aspect/gust de seu miros oxidat, miros metalic aspru, amar suprasărat mucegăit, putred cu aspect de malț miros de substanțe chimice

Tabelul 2

Tabelul defectelor untului

I. Aspect

1. nelegat (necompact), umed

2. neuniform, în două culori

3. cu dungi

4. pestriț, marmorat

5. cu aspect granulat

6. separare a uleiurilor

7. supracolorat

8. textură slabă, deschisă

9. granulat

10. materii străine

11. mucegăit

12. sare nedizolvată

II. Consistență

14. dezemulsionat, friabil, sfărâmicios

15. păstos, de consistența aluatului, gras

16. lipicios

17. tare

18. moale

III. Miros și aromă

20. fără miros

21. impur (3)

22. arome străine

23. vechi

24. brânzos, miros de brânză lactică

25. acid

26. spumos

27. (a) aromă de copt

(b) aromă de ars

28. mucegăit

29. rânced

30. uleios, cu gust de pește

31. cu aspect/gust de seu

32. (a) miros oxidat

(b) miros metalic

33. aromă de furaj

34. aspru, amar

35. suprasărat

36. mucegăit, putred

37. cu aspect de malț

38. miros de substanțe chimice

---

(1)  Tabelul 2.

(2)  Defectele menționate la „bun” reprezintă numai deviații foarte mici de la tipul ideal.

(3)  Această desemnare trebuie folosită cât mai rar posibil și numai atunci când defectul nu poate fi descris mai exact.

ANEXA V

(Articolul 5)

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE TRIGLICERIDE ALE ACIDULUI ENANTIC ÎN UNT, ULEI DE UNT ȘI SMÂNTÂNĂ PRIN ANALIZA CROMATOGRAFICĂ ÎN FAZĂ GAZOASĂ A TRIGLICERIDELOR

1.   OBIECTUL

Prezenta metodă stabilește o metodă pentru determinarea conținutului de trigliceride ale acidului enantic în unt, ulei de unt și smântână.

2.   TERMENI ȘI DEFINIȚIE

Conținutul de acid enantic: conținutul de trigliceride ale acidului enantic determinat prin procedura specificată în prezenta metodă.

Notă: Conținutul de acid enantic este exprimat în kg/tonă din produs pentru uleiul de unt și unt, iar pentru smântână este exprimat în kg/tonă din grăsimea din lapte.

3.   PRINCIPIU

Grăsimea din lapte este extrasă din diferite produse în conformitate cu ISO 14156 | FIL 172:2001. Determinarea cantitativă a conținutului de trigliceride ale acidului enantic în grăsimea extrasă este realizată prin cromatografie în fază gazoasă în coloană capilară (GC). Rezultatul obținut pentru probă este evaluat prin aplicarea standardului intern privind trigliceridele acidului caproic.

Notă: S-a constatat de asemenea că tributirina este un standard intern satisfăcător.

4.   REACTIVI

A se folosi numai reactivi de calitate analitică recunoscută.

4.1.   n-Hexan

4.2.   Trigliceride etalon ale acidului caproic, cel puțin 99 % puritate

4.3.   Trigliceride etalon ale acidului enantic, cel puțin 99 % puritate

4.4.   Sulfat de sodiu, anhidru (Na2SO4)

5.   APARATURĂ

Aparatură obișnuită de laborator și, în special, următoarele:

5.1.   Balanță analitică echilibrată la 1 mg

5.2.   Baloane cotate cu capacitate de 10 ml și 20 ml

5.3.   Tuburi de centrifugă cu capacitate de 30 ml

5.4.   Evaporator rotativ

5.5.   Cuptor care să poată fi menținut la o temperatură de 50 °C ± 5 °C

5.6.   Hârtie de filtru de porozitate medie cu diametrul de aproximativ 15 cm

Aparatură de cromatografie în fază gazoasă

5.7.1.   Cromatograf în fază gazoasă dotat cu un injector cu sau fără divizare sau „în coloană” și cu un detector cu ionizare în flacără.

Coloană de cromatografie în fază gazoasă cu fază staționară care a fost folosită cu succes în operațiunea de separare a trigliceridelor (100 % dimetilpolisiloxan sau 5 % fenil-95 % metilpolisiloxan). Selectați faza staționară, ajustați lungimea coloanei (între 4 m și 15 m), diametrul intern (între 0,22 mm și 0,50 mm) și grosimea stratului (0,12 μm sau mai mult), ținând cont de experiența laboratorului și de sistemul de injectare aplicat. În orice caz, coloana selectată produce în același timp o separare completă între vârful solventului și trigliceridele acidului caproic și o rezoluție a liniei de bază între vârfurile trigliceridelor acidului caproic și ale acidului enantic. Mai jos sunt enumerate câteva exemple de condiții aplicabile.

5.7.2.1.   Exemplu de condiții aplicabile folosind un injector cu divizare:

—	gaz vector: heliu;

—	presiunea în capul coloanei: 100 KPa;

—	coloană: coloană din sticlă de siliciu de 12 m lungime, 0,5 mm diametru intern, 0,1 μm grosimea stratului;

—	fază staționară: 100 % dimetilpolisiloxan sau 5 % fenil-95 % dimetilpolisiloxan (de exemplu, HT5);

—	temperatura coloanei: temperatură inițială de 130 °C, menținută timp de 1 min, ridicată cu o rată de 20 °C/min. până la 260 °C și apoi ridicată cu o rată de 30 °C/min. până la 360 °C; a se menține 10 min. la 360 °C;

—	temperatura detectorului: 370 °C;

—	temperatura injectorului: 350 °C;

—	raportul de fracționare 1:30;

—	cantitatea din proba injectată: 1 μl.

5.7.2.2.   Exemplu de condiții aplicabile folosind un injector în coloană:

—	gaz vector: hidrogen (sistem de flux constant);

—	presiunea în capul coloanei: 89 kPa;

—	coloană: coloană din sticlă de siliciu de 4 m lungime, 0,32 mm diametru intern, 0,25 μm grosimea stratului;

—	fază staționară: 5 % fenil, 95 % dimetilpolisiloxan;

—	temperatura coloanei: temperatură inițială de 60 °C, menținută timp de 2 min, ridicată cu o rată de 35 °C/min. până la 340 °C, menținută la această temperatura timp de 5 min;

—	temperatura detectorului: 350 °C;

—	cantitatea din proba injectată: 1 μl.

5.8.   Seringă pentru injectare, cu capacitate de 5 μl.

6.   PRELEVAREA PROBELOR

Este important ca laboratorul să primească o probă care să fie cu adevărat reprezentativă și care să nu fi fost deteriorată sau modificată în timpul transportului sau pe durata depozitării.

Prelevarea probelor nu face parte din metoda specificată în actualul standard internațional. În standardul FIL:50C:1995 sau ISO 707-1997 – Lapte și produse lactate – Metode de prelevare a probelor este prezentată metoda recomandată de prelevare a probelor.

7.   PROCEDURĂ

7.1.   Prepararea probei de analiză și a cantității analizate

A se proceda în conformitate cu ISO 14156 | FIL 172:2001.

7.1.1.   Ulei de unt, unt

7.1.1.1.   Se topește între 50 g și 100 g din proba de analiză în cuptor (5.5)

7.1.1.2.   Se pun între 0,5 g și 1 g de sulfat de sodiu anhidru (5.4) într-o hârtie de filtru pliată

7.1.1.3.   Se filtrează grăsimea prin hârtia de filtru care conține sulfat de sodiu anhidru, colectând filtratul într-un pahar de laborator care se păstrează în cuptor (5.5). În timpul decantării, se acordă multă atenție untului topit în hârtia de filtru, pentru a nu se transfera serul

7.1.2.   Smântână

7.1.2.1.   Proba analizată se aduce la o temperatură de 20 °C ± 2 °C

7.1.2.2.   Proba se amestecă sau se agită bine

7.1.2.3.   Se diluează o cantitate adecvată din proba analizată pentru a se obține 100 ml de cantitate analizată cu o fracțiune de masă a grăsimii de aproximativ 4 %

7.1.2.4.   Se procedează ca și în cazul laptelui crud și al laptelui omogenizat (a se vedea ISO 14156 | FIL 172:2001, §8.3) pentru a extrage grăsimea din smântână

7.1.2.5.   Se cântărește, cu o precizie de 1 mg, 1 g din grăsimea extrasă, într-un balon cotat de 10 ml (5.2). Se adaugă 1 ml din soluția 7.2.2. Se completează până la 10 ml cu n-hexan (4.1) și se omogenizează

7.1.2.6.   Se introduce 1 ml din soluția 7.1.1.2 într-un balon cotat de 10 ml (5.2) și se diluează până la 10 ml cu n-hexan (4.1)

7.2.   Prepararea etaloanelor de calibrare

7.2.1.   Se dizolvă 100 mg de trigliceride ale acidului enantic (4.3) în 10 ml de n-hexan (4.1)

7.2.2.   Se dizolvă 100 mg de trigliceride ale acidului caproic (4.2) în 10 ml de n-hexan (4.1)

7.2.3.   Se introduce 1 ml din soluția 7.2.2 într-un balon cotat de 10 ml (5.2). Se completează până la 10 ml cu n-hexan (4.1)

7.2.4.   Se introduce 1 ml din soluția 7.2.1 și 1 ml din soluția 7.2.2 într-un balon cotat de 10 ml (5.2). Se completează până la 10 ml cu n-hexan (4.1)

7.2.5.   Se introduce 1 ml din soluție 7.2.4 într-un balon cotat de 10 ml (5.2) și se completează până la 10 ml cu n-hexan (4.1)

7.3.   Determinarea cromatografică

7.3.1.   Se injectează de două ori 1 μl din soluția etalon 7.2.5

7.3.2.   Se injectează 1 μl din fiecare soluție de probă

Notă: În cazul în care se adoptă sistemul de injectare în coloană, se aplică o diluare mai mare atât soluției etalon, cât și soluției de probă.

7.3.3.   Operația 8.3.1 se repetă la fiecare 3 probe în vederea încadrării probelor între injectările etalon martor. Rezultatele se bazează pe media coeficienților de răspuns din cromatogramele etalon.

8.   CALCULAREA REZULTATELOR

Pentru fiecare cromatogramă, se integrează suprafața vârfurilor asociate cu trigliceridele acidului enantic și ale acidului caproic.

Se urmează aceste instrucțiuni pentru fiecare ciclu delimitat, respectiv pentru un set de probe delimitate, etalonul injectat de două ori imediat după acestea este STD1, iar etalonul injectat de două ori imediat după acestea este STD2.

8.1.   Calibrare

8.1.1.   Se calculează coeficientul de răspuns pentru fiecare duplicat al STD1, Rf1(a) și Rf1(b).

Rf1 (a) sau (b) = (Suprafața vârfului pentru trigliceridele acidului caproic/Suprafața vârfului pentru trigliceridele acidului enantic) × 100

Se calculează media coeficientului de răspuns, Rf1

Rf1 = [Rf1(a) + Rf1(b)] / 2

8.1.2.   În mod similar, se calculează media coeficientului de răspuns STD2, Rf2

8.1.3.   Se calculează media coeficientului de răspuns, Rf

Rf = (Rf1 + Rf2) /2

8.2.   Probele analizate

Pentru fiecare cromatogramă a probei obținută între STD1 și STD2, se calculează conținutul de acid enantic, C (kg/ton):

C = (Suprafața vârfului pentru trigliceridele acidului enantic × Rf × 100)/(Suprafața vârfului pentru trigliceridele acidului caproic × Wt × 1 000)

unde:

—	Wt = greutatea grăsimii prelevate (g);

—	100 = volumul de diluare pentru probă;

—	1 000 = coeficientul de transformare (pentru μg/g în kg/t).

Pentru probele de unt, se ține cont de conținutul de grăsime al untului și se calculează o valoare a concentrației corectată, Cunt (kg/t de unt)

Cunt = Cgrăsime × F

unde F este conținutul de grăsime al untului.

9.   PRECIZIA

Detaliile referitoare la testul realizat între laboratoare asupra untului, în conformitate cu ISO 5725-1 și ISO 5725-2 privind precizia metodei se află în (12).

Valorile pentru limita de repetabilitate și reproductibilitate sunt exprimate pentru nivelul de probabilitate de 95 %, fiind posibil ca acestea să nu fie aplicabile în cazul altor intervale si matrice de concentrație decât cele prezentate.

9.1.   Repetabilitate

Diferențele absolute dintre două rezultate individuale ale unui singur test, obținute prin aceeași metodă aplicată asupra unor materiale de testare identice, în același laborator, de către același operator, utilizându-se același echipament, la un interval scurt de timp nu vor fi mai mari de 0,35 kg/t, în nu mai mult de 5 % din cazuri.

9.2.   Reproductibilitate

Diferențele absolute dintre două rezultate individuale ale unui singur test, obținute prin aceeași metodă aplicată asupra unor materiale de testare identice, în laboratoare diferite, de către operatori diferiți, utilizându-se echipamente diferite nu vor fi mai mari de 0,66 kg/t, în nu mai mult de 5 % din cazuri.

10.   LIMITELE DE TOLERANȚĂ: LIMITE INFERIOARE (ÎN CAZUL CANTITĂȚILOR INSUFICIENTE)

10.1.   Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.

10.2.   Unt și unt concentrat

10.2.1.   Rata de încorporare este de 11 kg din trigliceridele acidului enantic cu o puritate de cel puțin 95 %, respectiv 10,45 kg/t

10.2.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei și a omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	9,51 kg/t (rată de încorporare minimă de 95 % pentru trigliceridele acidului enantic cu o puritate de 95 %, determinare separată);

—	6,89 kg/t (rată de încorporare minimă de 70 % pentru trigliceridele acidului enantic cu o puritate de 95 %, determinare separată);

—	concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare, respectiv între 9,51 kg/t și 6,89 kg/t.

10.3.   Smântână

10.3.1.   Rata de încorporare este de 10 kg de trigliceride ale acidului enantic, cu o puritate de cel puțin 95 %, pe tona de grăsimi din lapte, respectiv 9,5 kg/t grăsimi din lapte marcate.

10.3.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	8,60 kg/t (rată de încorporare minimă de 95 % pentru trigliceridele acidului enantic cu o puritate de 95 %, determinare separată);

—	6,23 kg/t (rată de încorporare minimă de 70 % pentru trigliceridele acidului enantic cu o puritate de 95 %, determinare separată);

—	concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare, respectiv între 8,60 kg/t și 6,23 kg/t.

11.   LIMITELE DE TOLERANȚĂ: LIMITELE SUPERIOARE (ÎN CAZUL DEPĂȘIRII CANTITĂȚII CU PESTE 20 %)

11.1.   Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.

11.2.   Unt și unt concentrat

11.2.1.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorilor, iar media acestor rezultate se compară cu următoarele limite:

—	Limita superioară este 12,96 kg/t.

11.3.   Smântână

11.3.1.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorilor, iar media acestor rezultate se compară cu următoarele limite:

—	Limita superioară este 11,82 kg/t.

12.   INFORMAȚII SUPLIMENTARE: ANALIZA STATISTICĂ A REZULTATELOR PRIVIND DETERMINAREA TRIENANTATULUI ÎN GRĂSIMEA DIN UNT PRIN ANALIZA TRIGLICERIDELOR

Au fost realizate patru studii de colaborare pentru determinarea conținutului de trienantat din probele de unt urmărite.

La primul test circular au participat nouă laboratoare și nu au fost puse la dispoziție specificații cu privire la metodele analitice care trebuie folosite:

La cel de-al doilea test circular au participat zece laboratoare și au fost aplicate patru metode diferite:

—	determinarea heptonatului de metil utilizând n-nonan sau nonanoatul de metil drept standard intern;

—	determinarea trienantatului utilizând tricaproatul drept standard intern;

—	determinarea heptonatului de metil utilizând o probă de calibrare/amestec;

—	determinarea heptonatului de metil utilizând un amestec de calibrare.

În plus, dacă au fost analizați esterii metilici ai acizilor grași (FAME), au fost folosite două metode diferite de metilare (De Francesco și Christopherson & Glass).

Datorită rezultatelor obținute, pentru realizarea celui de-al treilea test circular au fost alese două metode:

—	determinarea heptonatului de metil utilizând n-nonan sau nonanoatul de metil drept standard intern;

—	determinarea trienantatului utilizând tricaproatul drept standard intern.

Rezultatele obținute de 7 laboratoare au demonstrat că metoda FAME a produs o variabilitate mai mare și, în consecință, s-a decis să se utilizeze doar determinarea trienantatului sub formă de trigliceride, folosindu-se metoda de determinare a trienantatului prin utilizarea tricaproatului drept standard intern. În plus, analizarea trigliceridelor a trebuit să se realizeze cu ajutorul coloanei capilare.

În cel de-al patrulea test circular au fost transmise patru probe (A, B, C, D), nouă laboratoare oferind rezultatele (tabelele 1-2).

Două laboratoare (DE și UE) au analizat probele utilizând metoda FAME.

Din cauza numărului scăzut de laboratoare, calculul statistic a fost efectuat atât pentru setul complet de date, inclusiv rezultatele aplicării metodei FAME (figurile 1-2), cât și asupra datelor obținute din analiza TG.

Teste pentru valorile aberante:

—	proba A. Testele Dixon, Cochran și Grubbs la niveluri de 1 și 5 % au arătat o valoare aberantă în cadrul analizei;

—	proba B. Testul Grubbs la nivel de 5 % a arătat o valoare aberantă în cadrul analizei;

—	proba C. Testele Dixon și Grubbs la niveluri de 1 și 5 % au arătat o valoarea aberantă în cadrul analizei;

—	proba D. Testele Dixon și Grubbs la niveluri de 1 și 5 % au arătat o valoare aberantă în cadrul analizei.

Valoarea aberantă a fost exclusă din calcul.

Trebuie menționat faptul că valorile obținute prin metoda FAME nu au fost niciodată considerate aberante în urma testelor aplicate.

Parametrii de precizie

Tabelele 1 și 2 prezintă rezultatele tuturor laboratoarelor și parametrii de precizie calculați pentru un număr acceptabil (8) de laboratoare, dar, din nefericire, nu toate rezultatele sunt obținute prin aceeași metodă analitică.

Tabelele 3 și 4 prezintă rezultatele care sunt obținute doar prin metoda TG și parametrii de precizie corespunzători. Acceptarea acestor parametri este condiționată de acceptarea numărului scăzut de laboratoare (6).

Figurile 2 și 3 prezintă tendințele pentru Sr și SR calculate pentru cele 4 probe ale celor 2 seturi de date descrise mai sus.

Tabelul 5 prezintă valorile pentru Sr și SR împreună cu valorile colective aferente și parametrii globali r și R.

În final, a fost calculată diferența critică pentru un nivel al probabilității de 95 %.

Tabelul 1

Rezultatele statistice ale metodelor TG + FAME*

Proba A		R1	R2	Medie	Nr. de laboratoare reținute după eliminarea valorilor aberante	8
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Nr. de valori aberante	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Valori aberante	DК
ZPLA	DE*	11,6	11,8	11,7	Valoare medie	11,3
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Valoare reală	11,0
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Deviația standard a repetabilității (Sr)	0,09
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Deviația standard relativă a repetabilității (RSDr %)	0,80
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Repetabilitate r (95 %)	0,26
ISPRA	UE*	11,0	11,0	11,0	Repetabilitatea relativă r %	2,24
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Deviația standard a reproductibilității (SR)	0,23
					Deviația standard relativă a reproductibilității (RSDR %)	2,04
					Reproductibilitate R (95 %)	0,84
					Reproductibilitatea relativă R %	5,71
Proba B		R1	R2	Medie	Nr. de laboratoare reținute după eliminarea valorilor aberante	8
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Nr. de valori aberante	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Valori aberante	DK
ZPLA	DE*	14,0	13,8	13,9	Valoare medie	13,4
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Valoare reală	13,5
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Deviația standard a repetabilității (Sr)	0,14
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Deviația standard relativă a repetabilității (RSDr %)	1,04
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Repetabilitate r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	13,2	13,3	13,3	Repetabilitatea relativă r %	2,91
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Deviația standard a reproductibilității (SR)	0,35
					Deviația standard relativă a reproductibilității (RSDR %)	2,61
					Reproductibilitate R (95 %)	0,99
					Reproductibilitatea relativă R %	7,31

Tabelul 2

Rezultatele statistice ale metodelor TG + FAME*

Proba C		R1	R2	Medie	Nr. de laboratoare reținute după eliminarea valorilor aberante	8
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Nr. de valori aberante	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Valori aberante	DK
ZPLA	DE*	9,2	9,4	9,3	Valoare medie	9,3
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Valoare reală	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Deviația standard a repetabilității (Sr)	0,14
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Deviația standard relativă a repetabilității (RSDr %)	1,50
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Repetabilitate r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	9,4	9,3	9,4	Repetabilitatea relativă r %	4,20
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Deviația standard a reproductibilității (SR)	0,17
					Deviația standard relativă a reproductibilității (RSDR %)	1,82
					Reproductibilitate R (95 %)	0,47
					Reproductibilitatea relativă R %	5,10
Proba D		R1	R2	Medie	Nr. de laboratoare reținute după eliminarea valorilor aberante	8
RENNES	R1	1,6	1,6	1,6	Nr. de valori aberante	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Valori aberante	DK
ZPLA	DE*	2,3	2,3	2,3	Valoare medie	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Valoare reală	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Deviația standard a repetabilității (Sr)	0,08
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Deviația standard relativă a repetabilității (RSDr %)	3,81
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Repetabilitate r (95 %)	0,22
ISPRA	UE*	2,3	2,3	2,3	Repetabilitatea relativă r %	10,67
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Deviația standard a reproductibilității (SR)	0,24
					Deviația standard relativă a reproductibilității (RSDR %)	11,43
					Reproductibilitate R (95 %)	0,67
					Reproductibilitatea relativă R %	32,00

Tabelul 3

Rezultatele statistice ale metodelor TG + FAME*

Proba A		R1	R2	Medie	Nr. de laboratoare reținute după eliminarea valorilor aberante	6
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Nr. de valori aberante	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Valori aberante	DК
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Valoare medie	11,2
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Valoare reală	11,0
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Deviația standard a repetabilității (Sr)	0,09
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Deviația standard relativă a repetabilității (RSDr %)	0,80
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Repetabilitate r (95 %)	0,25
					Repetabilitatea relativă r %	2,24
					Deviația standard a reproductibilității (SR)	0,13
					Deviația standard relativă a reproductibilității (RSDR %)	1,16
					Reproductibilitate R (95 %)	0,36
					Reproductibilitatea relativă R %	3,25
Proba B		R1	R2	Medie	Nr. de laboratoare reținute după eliminarea valorilor aberante	6
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Nr. de valori aberante	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Valori aberante	DК
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Valoare medie	13,3
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Valoare reală	13,5
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Deviația standard a repetabilității (Sr)	0,15
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Deviația standard relativă a repetabilității (RSDr %)	1,13
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Repetabilitate r (95 %)	0,42
					Repetabilitatea relativă r %	3,16
					Deviația standard a reproductibilității (SR)	0,33
					Deviația standard relativă a reproductibilității (RSDR %)	2,48
					Reproductibilitate R (95 %)	0,93
					Reproductibilitatea relativă R %	6,94

Tabelul 4

Rezultatele statistice ale metodei TG

Proba C		R1	R2	Medie	Nr. de laboratoare reținute după eliminarea valorilor aberante	6
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Nr. de valori aberante	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Valori aberante	DК
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Valoare medie	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Valoare reală	9,3
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Deviația standard a repetabilității (Sr)	0,15
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Deviația standard relativă a repetabilității (RSDr %)	1,61
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Repetabilitate r (95 %)	0,42
					Repetabilitatea relativă r %	4,51
					Deviația standard a reproductibilității (SR)	0,19
					Deviația standard relativă a reproductibilității (RSDR %)	2,04
					Reproductibilitate R (95 %)	0,53
					Reproductibilitatea relativă R %	5,71
Proba D		R1	R2	Medie	Nr. de laboratoare reținute după eliminarea valorilor aberante	6
RENNES	FR1	1,6	1,6	1,6	Nr. de valori aberante	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Valori aberante	DK
					Valoare medie	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Valoare reală	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Deviația standard a repetabilității (Sr)	0,09
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Deviația standard relativă a repetabilității (RSDr %)	4,29
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Repetabilitate r (95 %)	0,26
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Repetabilitatea relativă r %	12,01
					Deviația standard a reproductibilității (SR)	0,25
					Deviația standard relativă a reproductibilității (RSDR %)	11,90
					Reproductibilitate R (95 %)	0,69
					Reproductibilitatea relativă R %	33,32

Tabelul 5

Repetabilitate și reproductibilitate (cu FAME)

	Nr. de laboratoare	Valoare maximă excepțională	Repetabilitate Sr (95 %)	Reproductibilitate SR (95 %)
Proba A	8	1	0,09	0,23
Proba B	8	1	0,14	0,35
Proba C	8	1	0,14	0,17
Proba D	8	1	0,08	0,24
Valoare colectivă			0,116	0,256
			R	R
Valoare colectivă* 2,8			0,324	0,716
CrD95 = 0,40 Puritate minimă declarată pentru trienantat = 95 % Limită minimă declarată pentru trienantat în grăsimea din unt = 11 kg/t Luându-se în considerare diferența critică pentru un nivel de probabilitate de 95 %, media celor două rezultate nu este mai mică decât:   10,05 kg/t, în cazul în care se încorporează trienantat cu o puritate de 95 %.

Repetabilitate și reproductibilitate (fără FAME)

	Nr. de laboratoare	Valoare maximă excepțională	Repetabilitate Sr (95 %)	Reproductibilitate SR (95 %)
Proba A	6	1	0,09	0,13
Proba B	6	1	0,15	0,33
Proba C	6	1	0,15	0,19
Proba D	6	1	0,09	0,25
Valoare colectivă			0,124	0,237
			r	R
Valoare colectivă* 2,8			0,347	0,663
CrD95 = 0,36 Puritate minimă declarată pentru trienantat = 95 % Limită minimă declarată pentru trienantat în grăsimea din unt = 11 kg/t Luându-se în considerare diferența critică pentru un nivel de probabilitate de 95 %, media celor două rezultate nu este mai mică decât:   10,09 kg/t, în cazul în care se încorporează trienantat cu o puritate de 95 %.

Figura 1 (1)

Rezultate experimentale: Proba A

Rezultate experimentale: Proba B

Rezultate experimentale: Proba C

Rezultate experimentale: Proba D

Figura 2

Deviația standard a repetabilității și a reproductibilității la diferite niveluri (TG + FAME)

Figura 3

Deviația standard a repetabilității și a reproductibilității la diferite niveluri (TG)

Figura 4

Exemplu folosind un injector în coloană

---

(1)  = metoda FAME.

ANEXA VI

(Articolul 5)

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE VANILINĂ ÎN UNTUL CONCENTRAT, UNT SAU SMÂNTÂNĂ PRIN CROMATOGRAFIE LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ

1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Metoda implică o procedură de determinare cantitativă a vanilinei din untul concentrat, unt și smântână.

2.   PRINCIPIU

Extragerea unei cantități cunoscute din probă cu ajutorul unui amestec de izopropanol/etanol/acetonitril (1:1:2). Precipitarea majorității grăsimii prin răcire între –15 °C și –20 °C, urmată de centrifugare.

După diluarea cu apă, determinarea conținutului de vanilină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).

3.   APARATURĂ

Aparatură obișnuită de laborator, în special următoarele:

3.1.   Refrigerator cu funcționare în intervalul de temperatură –15 °C la –20 °C

3.2.   Seringi de unică folosință cu capacitate de 2 ml

3.3.   Membrană filtrantă cu pori de 0,45 μm, rezistentă la o soluție conținând 5 % soluție de extragere (4.4)

3.4.   Sistem de cromatografie lichidă conținând o pompă (cu debit de 1,0 ml/min), un injector (injectare automată sau manuală a 20 μl), un detector UV (acționat la 306 nm, 0,01 Å scală completă), un înregistrator sau integrator și o coloană termostat care funcționează la 25 °C

3.5.   Coloană analitică (aproximativ 250 mm × 4,6 mm diametru interior) umplută cu LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) sau o coloană echivalentă

3.6.   Coloană de control (aproximativ 20 mm × 3 mm diametru interior) umplută cu LiChrospher RP 18 (5-10 μm) sau o coloană echivalentă

3.7.   Centrifugă care operează la 2 000 rpm.

4.   REACTIVI

Toți reactivii utilizați trebuie să fie de calitate analitică recunoscută.

4.1.   Izopropanol

4.2.   Etanol 96 % (v/v)

4.3.   Acetonitril

4.4.   Soluție de extragere

Se amestecă izopropanol (4.1), etanol (4.2) și acetonitril (4.3) în proporție de 1:1:2 (v/v).

Vanilină (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă) ≥ 98 %

4.5.1.   Soluție „stock” de vanilină (= 500 μg/ml)

Se cântăresc, cu o precizie de 0,1 mg, aproximativ 50 mg (CM mg) de vanilină (4.5) într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 25 ml de soluție de extragere (4.4) și se completează cu apă.

4.5.2.   Soluție etalon de vanilină (= 10 μg/ml)

Se pipetează 5 ml de soluție „stock” de vanilină (4.5.1) într-un balon cotat de 250 ml și se completează cu apă.

4.5.3.   Metanol, calitate HPLC

4.5.4.   Acid acetic, glacial

4.5.5.   Apă, calitate HPLC

4.5.6.   Faza mobilă HPLC

Se amestecă 300 ml de metanol (4.5.3) cu aproximativ 500 ml apă (4.5.5) și 20 ml de acid acetic (4.5.4) într-un balon cotat de 1 000 ml și se completează cu apă (4.5.5). Se filtrează printr-un filtru de 0,45 μm (3.3).

5.   PROCEDURĂ

5.1.   Prepararea probei de analiză

5.1.1.   Unt

Se încălzește proba până când începe să se topească. Se evită supraîncălzirea unor porțiuni din probă la peste 30 °C. În orice caz, există posibilitatea ca untul să nu se separe în două faze. Când proba devine suficient de maleabilă, se omogenizează prin scuturare. Untul se amestecă timp de 15 s înainte de prelevarea unei probe. Se cântăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 5 g (SM g) de unt într-un balon cotat de 100 ml.

5.1.2.   Unt concentrat

Imediat după prelevarea probei, recipientul conținând un concentrat se introduce în cuptor la 40-50 °C până când se topește complet. Proba se amestecă prin turbionare sau agitare, evitându-se formarea de bule de aer din cauza amestecării prea puternice. Se cântăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 4 g (SM g) de unt concentrat într-un balon cotat de 100 ml.

5.1.3.   Smântână

Proba se încălzește în baie de apă sau într-un incubator la o temperatură de 35-40 °C. Grăsimea se distribuie omogen prin turbionare și, după caz, prin amestecare. Proba se răcește rapid la 20 ± 2 °C. Proba trebuie să aibă un aspect omogen; în caz contrar, procedura trebuie repetată. Se cântăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 10 g (SM g) de smântână într-un balon cotat de 100 ml.

5.2.   Prepararea soluției de analiză

Se adaugă aproximativ 75 ml de soluție de extragere (4.4) la proba prelevată (5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3), se agită sau se scutură cu putere timp de aproximativ 15 minute și se completează cu soluție de extragere (4.4). Se transferă aproximativ 10 ml din acest extract într-o eprubetă prevăzută cu dop. Eprubeta se introduce în refrigerator (3.1) timp de aproximativ 30 minute. Extractul rece se centrifughează timp de 5 minute la aproximativ 2 000 rpm și se decantează imediat. Soluția decantată se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se pipetează 5 ml din soluția decantată într-un balon cotat de 100 ml și se completează cu apă. Se filtrează o parte alicotă printr-o membrană microfiltrantă (3.3) cu ajutorul unei seringi (3.2). Filtratul este gata pentru determinarea HPLC.

5.3.   Calibrare

Se pipetează 5 ml de soluție etalon de vanilină (4.5.2) într-un balon cotat de 100 ml. Se adaugă 5 ml de soluție de extragere (4.4) și se completează cu apă până la marcaj. Această soluție conține 0,5 μg/ml de vanilină.

5.4.   Determinarea prin HPLC

Se lasă sistemul cromatografic să se stabilizeze timp de aproximativ 30 minute. Se injectează soluția etalon (5.3). Procedura se repetă până când diferența dintre suprafețele vârfurilor sau dintre înălțimile vârfurilor a două injectări succesive este sub 2 %. În condițiile descrise timpul de retenție al vanilinei este de aproximativ 9 minute. Soluția etalon (5.3) se analizează în duplicat prin injectarea a 20 μl. Se injectează 20 μl din soluția de analiză (5.2). Se determină suprafața sau înălțimea vârfului obținut pentru vanilină. Se repetă injectarea soluției etalon (5.3) în duplicat, după 10 injectări ale probelor analizate (5.2).

6.   CALCULAREA REZULTATELOR

Se calculează suprafața (sau înălțimea) medie a vârfurilor (AC) pentru vârfurile vanilinei asociate injectării duplicatelor la începutul și la sfârșitul fiecărui lot de soluție de analiză (în total patru suprafețe sau înălțimi).

Se calculează coeficientul de răspuns (R):

unde CM este masa vanilinei în mg (4.5.1).

Conținutul (mg/kg) de vanilină (C) din probă se calculează cu ajutorul formulei:

unde:

AS	=	suprafața vârfului sau înălțimea pentru vârful vanilinei din proba de analiză
SM	=	masa probei de analiză exprimată în g (5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3).

Notă: La analiza vanilinei din smântână, concentrația marcatorului se exprimă ca mg marcator/kg grăsime din lapte. Pentru aceasta se înmulțește C cu 100/f. f este conținutul de grăsime al smântânii în procente (m/m).

20	=	coeficientul de diluare a probei etalon și a probei de analiză
0,96	=	factorul de corecție pentru conținutul de grăsime la prima diluare a probei de analiză

Notă: În locul suprafeței vârfului se poate folosi înălțimea vârfului (a se vedea 8.3).

7.   PRECIZIA METODEI

7.1.   Repetabilitate (r)

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 16 mg/kg.

7.2.   Reproductibilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 27 mg/kg.

8.   LIMITELE DE TOLERANȚĂ

8.1.   Trebuie să se preleveze trei probe din produsul urmărit pentru a se verifica omogenitatea

Marcator obținut fie din vanilie, fie din vanilină sintetică

8.2.1.   Rata de încorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă este de 250 g pe tonă de unt concentrat sau de unt. Pentru smântâna marcată, rata de încorporare este de 250 g pe tonă de grăsime din lapte.

8.2.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei și a omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	220,8 mg/kg (95 % din rata minimă de încorporare);

—	158,3 mg/kg (70 % din rata minimă de încorporare).

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 220,8 mg/kg și 158,3 mg/kg.

Marcator obținut numai din păstăi de vanilie sau extracte integrale ale acesteia:

8.3.1.   Rata de încorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă est de 100 g pe tonă de unt concentrat sau de unt. Pentru smântâna marcată, rata de încorporare este de 100 g pe tonă de grăsime din lapte.

8.3.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și a omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	78,3 mg/kg (95 % din rata minimă de încorporare);

—	53,3 mg/kg (70 % din rata minimă de încorporare).

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 78,3 mg/kg și 53,3 mg/kg.

9.   NOTE

9.1.   Recuperarea vanilinei adăugate la un nivel de 250 mg/kg ulei de unt variază de la 97,0 la 103,8. Conținutul mediu identificat a fost de 99,9 %, cu o deviație standard de 2,7 %.

9.2.   Soluția etalon conține 5 % soluție de extragere pentru a compensa creșterea suprafeței vârfului provocată de prezența a 5 % soluție de extragere în probă. Astfel, se poate opera o clasificare în funcție de înălțimea vârfului.

9.3.   Analiza se bazează pe o curbă liniară de etalonare, cu intersecție cu punctul zero.

9.4.   Folosindu-se soluții diluate adecvate de soluție etalon (4.5.2), se verifică liniaritatea în momentul realizării primei analize, iar apoi la intervale regulate și după modificări sau reparații la echipamentul HPLC. Vanilina poate fi degradată în acid vanilic, divanilină și alți compuși prin acțiunea enzimelor intrinseci în smântâna nepasteurizată sau produsele obținute din aceasta.

ANEXA VII

(Articolul 5)

DETECTAREA PRIN SPECTOMETRIE A ETIL ESTERULUI ACIDULUI BETA-APO-8'-CAROTENIC ÎN UNTUL CONCENTRAT ȘI ÎN UNT

1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Această metodă descrie o procedură de determinare cantitativă a etil esterului acidului beta-apo-8'-carotenic (ester apo-carotenic) în untul concentrat și în unt. Esterul apo-carotenic este suma tuturor substanțelor prezente într-un extract din probe prelevate în condițiile prevăzute pentru această metodă, care absorb lumină la 440 nm.

2.   PRINCIPIU

Grăsimea din unt se dizolvă în eter de petrol și se măsoară absorbanța la 440 nm. Conținutul de ester apo-carotenic se determină prin raportare la un standard extern.

3.   APARATURĂ

3.1.   Pipete – gradate, cu capacitate de 0,25, 0,50, 0,75 și 1,0 ml

3.2.   Spectrofotometru – adecvat utilizării la 440 nm (și la 447-449 nm) și prevăzut cu celule cu drum optic de 1 cm

3.3.   Baloane cotate, de 20 ml și de 100 ml

3.4.   Balanță analitică cu sensibilitate de 0,1 mg, cu o capacitate de cântărire având o precizie de 1 mg, cu o capacitate de citire de 0,1 mg

3.5.   Cuptor, 45 °C ± 1 °C

3.6.   Filtre fără cenușă cu filtrare rapidă

4.   REACTIVI

Toți reactivii utilizați trebuie să fie de calitate analitică recunoscută.

Suspensie de acid apo-carotenic (aproximativ 20 %)

4.1.1.   Conținutul suspensiei se determină astfel:

Suspensia se încălzește între 45 °C și 50 °C și se omogenizează în recipientul original închis. Se cântăresc aproximativ 400 mg într-un balon cotat (100 ml), se dizolvă în 20 ml cloroform (4.4) și se completează volumul cu ciclohexan (4.5). Se diluează 5,0 ml din această soluție cu 100 ml de ciclohexan (soluția A). Se diluează 5,0 ml de soluție A cu ciclohexan până la 100 ml. Se măsoară absorbanța la 447-449 nm (se măsoară valoarea maximă față de o probă de ciclohexan ca probă martor, folosindu-se celule cu drum optic de 1 cm).

Conținutul de ester apo-carotenic P (%) = (Absmax × 40 000)/(Msusp × 2 550) sau se dezvoltă: (Absmax /2 550) × (100/5) × (100/5) × (100/Msusp)

Absmax	=	absorbanța soluției de măsurare la maximum
Msusp	=	masa suspensiei (g)
2 550	=	valoarea de referință Abs (1 %, 1 cm)
P	=	Puritatea (conținutul) suspensiei (%)

Notă: Suspensia de ester apo-carotenic este sensibilă la aer, căldură și lumină. Se poate păstra la loc rece timp de aproximativ 12 luni, în recipientul original închis (sigilat sub azot). După deschiderea recipientului, conținutul trebuie utilizat cât de repede posibil.

4.1.2.   Soluția etalon de ester apo-carotenic, aproximativ 0,2 mg/ml

Se cântăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 0,100 g de suspensie de ester apo-carotenic (4.1.1.) (W), se dizolvă în ligroină (4.2), se transferă cantitativ într-un balon cotat cu capacitate de 100 ml și se completează până la marcaj cu ligroină.

Această soluție conține (W × P)/10 mg/ml de ester apo-carotenic.

Notă: Soluția trebuie păstrată la rece și la adăpost de lumină. Soluția nefolosită se aruncă după o lună.

4.2.   Ligroină (40-60 °C)

4.3.   Sulfat de sodiu anhidru, granulat, deshidratat în prealabil la 102 °C timp de 2 ore

4.4.   Cloroform

4.5.   Ciclohexan

5.   PROCEDURĂ

5.1.   Prepararea probei de analiză

5.1.1.   Unt concentrat

Proba se topește în cuptor la aproximativ 45 °C.

5.1.2.   Unt

Proba se topește în cuptor la aproximativ 45 °C și se filtrează o parte reprezentativă printr-un filtru care conține aproximativ 10 g de sulfat de sodiu anhidru (4.3) într-un mediu protejat de lumina naturală sau artificială puternică și se păstrează la 45 °C. Se colectează o cantitate adecvată de grăsime din unt.

5.2.   Determinare

Se cântărește, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 1 g de unt concentrat [sau grăsime extrasă din unt (5.1.2)], (M). Se transferă cantitativ într-un balon cotat de 20 ml (V), folosindu-se ligroină (4.2), se completează până la marcaj și se amestecă bine.

Se transferă o parte alicotă într-o celulă de 1 cm și se măsoară absorbanța la 440 nm, față de o probă martor de ligroină. Concentrația de ester apo-carotenic în soluție se determină conform curbei de etalonare (C μg/ml).

5.3.   Calibrare

Se pipetează 0, 0,25, 0,5, 0,75 și 1,0 ml de soluție etalon de ester apo-carotenic (4.1.2) în cinci baloane cotate de 100 ml. Se diluează la volum cu ligroină (4.2) și se amestecă.

Concentrațiile aproximative ale soluției variază între 0 și 2 μg/ml și se calculează cu precizie prin referire la concentrația soluției etalon (4.1.2) (W × P)/10 mg/ml. Se măsoară absorbanța la 440 nm față de o probă martor de ligroină (4.2).

Valorile absorbanței se reprezintă pe axa y, iar pe axa x se reprezintă concentrația esterului apo-carotenic. Se calculează ecuația curbei de etalonare.

6.   CALCULAREA REZULTATELOR

6.1.   Conținutul de ester apo-carotenic, exprimat în mg/kg de produs, se calculează după cum urmează:

Unt concentrat: (C × V)/M

Unt: 0,82 (C × V)M

unde:

C	=	conținutul de ester apo-carotenic, în μg/ml, citit de pe curba de etalonare (5.3);
V	=	volumul (ml) soluției de analiză (5.2);
M	=	masa (g) cantității analizate (5.2);
0,82	=	factorul de corecție pentru conținutul de grăsime al untului.

7.   PRECIZIA METODEI

7.1.   Repetabilitate

7.1.1.   Analiza untului

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 1,4 mg/kg.

7.1.2.   Analiza untului concentrat

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 1,6 mg/kg.

7.2.   Reproductibilitate

7.2.1.   Analiza untului

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 4,7 mg/kg.

7.3.   Analiza untului concentrat

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 5,3 mg/kg.

7.4.   Sursa datelor de precizie

Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1995, în cadrul căruia au participat 11 laboratoare și s-au folosit 12 probe urmărite (șase duplicate probă martor) pentru unt și 12 probe urmărite (șase duplicate probă martor) pentru unt concentrat.

8.   LIMITELE DE TOLERANȚĂ

8.1.   Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.

8.2.   Unt

8.2.1.   Rata de încorporare pentru unt, având în vedere absorbanța de fond, este de 22 mg/kg.

8.2.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei și a omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	17,7 mg/kg (95 % din rata minimă de încorporare);

—	12,2 mg/kg (70 % din rata minimă de încorporare).

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 17,7 mg/kg și 12,2 mg/kg.

8.3.   Unt concentrat

8.3.1.   Rata de încorporare pentru untul concentrat, având în vedere absorbanța de fond, este de 24 mg/kg.

Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei și a omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	19,2 mg/kg (95 % din rata minimă de încorporare);

—	13,2 mg/kg (70 % din rata minimă de încorporare).

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 19,2 mg/kg și 13,2 mg/kg.

ANEXA VIII

(Articolul 5)

DETERMINAREA SITOSTEROLULUI SAU A STIGMASTEROLULUI DIN UNT ȘI UNT CONCENTRAT PRIN CROMATOGRAFIA ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Metoda implică o procedură care permite determinarea cantitativă a sitosterolului și a stigmasterolului din unt și din untul concentrat. Conținutul de sitosterol reprezintă suma cantităților de β-sitosterol și de 22-dihidro-β-sitosterol, ceilalți sitosteroli fiind considerați nesemnificativi.

2.   PRINCIPIU

Untul sau untul concentrat este saponificat cu hidroxid de potasiu într-o soluție de etanol, iar substanțele nesaponificabile sunt extrase cu ajutorul dietil eterului.

Sterolii se transformă în trimetil-silil-eteri și sunt analizați prin cromatografie în fază de gaz cu coloană capilară prin raportare la un etalon intern/betulina.

3.   APARATURA

3.1.   Balon de saponificare de 150 ml, dotat cu un refrigerator cu reflux cu capete rodate

3.2.   Conducte de decantare de 500 ml

3.3.   Baloane de 250 ml

3.4.   Conducte de egalizare a presiunii, de 250 ml sau cu o capacitate similară, pentru a colecta dietil eterul rezidual

3.5.   Coloană de sticlă de 350 mm × 20 mm, prevăzută cu un racord cu frită

3.6.   Baie de apă sau izotermă

3.7.   Eprubete de reacție de 2 ml

Cromatograf cu gaz care poate fi utilizat cu coloană capilară, prevăzut cu un dispozitiv de scindare format din următoarele:

3.8.1.   etuvă cu termostat pentru coloane, care poate menține temperatura dorită cu o precizie de ±1 °C;

3.8.2.   injector termoreglabil;

3.8.3.   detector cu ionizare în flacără și convertor-amplificator;

3.8.4.   integrator-înregistrator care poate fi utilizat împreunăc cu convertorul-amplificator (3.8.3).

3.9.   Coloană capilară din sticlă de siliciu acoperită în întregime de BP1 sau de o substanță echivalentă (sau orice altă coloană cu rezoluție cel puțin egală) în strat uniform cu grosimea de 0,25 µm; coloana trebuie să poată reduce derivații trimetil-silil ai lanosterolului și ai sitosterolului. Este recomandabil să se utilizeze o coloană cu lungimea de 12 m și diametrul intern de 0,2 mm.

3.10.   Microseringă cu ac din oțel inoxidabil de 1 µl pentru cromatografie cu gaz.

4.   REACTIVI

Toți reactivii utilizați trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă.

4.1.   Etanol, cu o puritate de cel puțin 95 %

4.2.   Hidroxid de potasiu, soluție 60 %, prin dizolvarea a 600 g de hidroxid de potasiu (minimum 85 %) în apă, la care se adaugă apă până la 1 l

Betulină cu o puritate de cel puțin 99 %

Soluții de betulină în eter dietilic (4.4)

4.3.1.1.   Concentrația soluției de betulină utilizată pentru determinarea sitosterolului trebuie să fie de 1,0 mg/ml.

4.3.1.2.   Concentrația soluției de betulină utilizată pentru determinarea stigmasterolului trebuie să fie de 0,4 mg/ml.

4.4.   Eter dietilic de puritate analitică (fără peroxizi sau reziduuri).

4.5.   Sulfat de sodiu anhidru, granulat, deshidratat în prealabil la 102 °C timp de 2 ore.

4.6.   Reactiv de sililare, de exemplu, TRI-SIL (poate fi procurat de la Pierce Chemical Co., Categoria nr. 49001) sau un reactiv echivalent (Important: TRI-SIL este inflamabil și toxic, coroziv și are un posibil potențial cancerigen. Personalul de laborator trebuie să cunoască normele de siguranță aplicabile în cazul utilizării TRI-SIL și trebuie să ia toate măsurile de precauție care se impun).

4.7.   Lanosterol

Sitosterol, cu puritate cunoscută, mai mare sau egală cu 90 % (P)

Nota 1: Puritatea materialelor etalon utilizate pentru calibrare trebuie determinată prin metoda de normalizare. Se presupune că toți sterolii din probă sunt reprezentați în cromatogramă, că suprafața totală a vârfurilor reprezintă 100 % din compușii sterolilor și că sterolii dau aceeași reacție la detector. Liniaritatea sistemului trebuie validată pentru nivelurile de concentrație luate în calcul.

4.8.1.   Soluție etalon de sitosterol: se prepară o soluție cu o precizie de 0,001 mg/ml, conținând aproximativ 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) în eter dietilic (4.4)

Stigmasterol, cu puritate cunoscută, mai mare sau egală cu 90 % (P)

4.9.1.   Soluție etalon de stigmasterol: se prepară o soluție cu o precizie de 0,001 mg/ml, conținând aproximativ 0,2 mg/ml (W1) de stigmasterol (4.9) în eter dietilic (4.4)

4.10.   Amestec pentru testul de rezoluție. Se prepară o soluție conținând 0,05 mg/ml de lanosterol (4.7) și 0,5 mg/ml de sitosterol (4.8) în eter dietilic (4.4)

5.   METODĂ

5.1.   Prepararea soluțiilor etalon pentru cromatografie

Se adaugă soluția etalon intern (4.3.1) la soluția etalon de sterol adecvată și, simultan, la proba saponificată (a se vedea 5.2.2).

5.1.1.   Soluția cromatografică etalon de sitosterol: se transferă 1 ml de soluție etalon de sitosterol (4.8.1) în fiecare dintre cele două eprubete de reacție (3.7) și se elimină dietil eterul sub flux de azot. Se adaugă 1 ml de soluție etalon intern (4.3.1.1) și se elimină dietil eterul sub flux de azot.

5.1.2.   Soluția cromatografică etalon de stigmasterol: se transferă 1 ml de soluție etalon de stigmasterol (4.9.1) în fiecare dintre cele două eprubete de reacție (3.7) și se elimină dietil eterul sub flux de azot. Se adaugă 1 ml de soluție etalon intern (4.3.1.2) și se elimină dietil eterul sub flux de azot.

5.2.   Prepararea substanțelor nesaponificabile

5.2.1.   Se topește proba de unt la o temperatură de maximum 35 °C; se amestecă cu grijă.

Se cântărește, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 1 g de unt (W2) sau de unt concentrat (W2) într-un balon de 150 ml (3.1). Se adaugă 50 ml de etanol (4.1) și 10 ml de soluție de hidroxid de potasiu (4.2). Se adaptează refrigeratorul cu reflux și se aduce la aproximativ 75 °C timp de 30 de minute. Se deconectează refrigeratorul și se lasă balonul să se răcească la temperatura camerei.

5.2.2.   Se adaugă 1,0 ml de soluție etalon intern în balon (4.3.1.1), în cazul în care se determină sitosterolul, sau (4.3.1.2), în cazul în care se determină stigmasterolul. Se amestecă bine. Se transferă cantitativ conținutul balonului într-o conductă de decantare de 500 ml (3.2), se spală balonul cu 50 ml de apă, apoi cu 250 ml de eter dietilic (4.4). Se agită puternic conducta de decantare timp de 2 minute și se lasă fazele să se separe. Se elimină faza apoasă inferioară și se spală faza eterică agitându-se 4 părți alicote succesive de 100 ml apă.

Nota 2: Pentru a evita formarea unei emulsii, este neapărat necesar ca primele două spălări cu apă să se efectueze ușor (10 rotații). Pentru a treia spălare, se poate agita mai puternic timp de 30 de secunde. În cazul în care se formează o emulsie, aceasta poate fi eliminată prin adăugarea a 5 până la 10 ml de etanol. În cazul în care se adaugă etanol, este absolut necesar să se efectueze încă două spălări puternice cu apă.

5.2.3.   Se trece faza eterică limpede și desaponificată pe o coloană de sticlă (3.5) care conține 30 g de sulfat de sodiu anhidru (4.5). Se colectează eterul într-un balon de 250 ml (3.3). Se adaugă bile antiproiecție și se evaporă până la uscare aproape completă într-o baie de apă sau într-o izotermă, colectându-se solvenții care trebuie eliminați.

Nota 3: În cazul în care anumite părți din probă se evaporă în uscat la o temperatură prea ridicată, este posibil să se piardă cantități de sterol.

5.3.   Prepararea trimetil-silil-eterilor

5.3.1.   Se transferă soluția de eter rămasă în balon într-o eprubetă de reacție de 2 ml (3.7) cu ajutorul a 2 ml de dietil eter și se elimină eterul sub flux de azot. Se spală balonul cu două părți alicote suplimentare de 2 ml de eter dietilic, transferându-se conținutul în eprubetă și eliminându-se eterul de fiecare dată sub flux de azot.

5.3.2.   Se sililează proba prin adăugarea a 1 ml de TRI-SIL (4.6). Se astupă eprubeta și se agită puternic pentru a produce dizolvarea. În cazul în care proba nu s-a dizolvat complet, se aduce la temperatura de 65-70 °C. Se lasă să stea cel puțin 5 minute înainte de a se injecta în cromatograful cu gaz. Se sililează etaloanele în același mod ca și probele. Se sililează amestecul pentru testul de rezoluție (4.10) în același mod ca și probele.

Nota 4: Sililarea trebuie efectuată într-un mediu anhidru. Sililarea incompletă a betulinei se recunoaște prin obținerea unui al doilea vârf apropiat de cel al betulinei.

Prezența etanolului în timpul sililării va interfera cu procesul de sililare. Acest fapt poate fi consecința unei spălări insuficiente în momentul extragerii. În cazul în care această problemă persistă, în etapa de extragere se va include o a cincea spălare, cu agitare puternică timp de 30 de secunde.

5.4.   Analiza prin cromatografie cu gaz

5.4.1.   Alegerea condițiilor pentru procedură

Se instalează cromatograful cu gaz conform instrucțiunilor producătorului.

Condițiile indicate pentru procedură sunt următoarele:

—	temperatura coloanei: 265 °C;

—	temperatura injectorului: 265 °C;

—	temperatura detectorului: 300 °C;

—	debitul gazului vector: 0,6 ml/min;

—	presiunea hidrogenului: 84 kPa;

—	presiunea aerului: 155 kPa;

—

fracționarea probei: de la 10:1 la 50:1; raportul de fracționare trebuie optimizat în funcție de instrucțiunile producătorului și de liniaritatea răspunsului detectorului și validat ulterior în funcție de intervalele de concentrații luate în considerare. Nota 5: Curățarea regulată a camerei de vaporizare este deosebit de importantă.

—	cantitatea de substanță injectată: 1 µl de soluție TMSE.

Se lasă sistemul să se echilibreze și se obține un răspuns suficient de stabil înainte de a se efectua vreo analiză.

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului cu gaz, pentru a se obține cromatograme care să îndeplinească condițiile următoare:

—	vârful sitosterolului trebuie să prezinte o rezoluție suficientă față de lanosterol. Figura 1 prezintă o cromatogramă tipică, cea care trebuie obținută pentru un amestec sililat prin testul de rezoluție (4.10);

—	timpii relativi de retenție ai sterolilor de mai jos trebuie să fie de aproximativ: — colesterol: 1,0; — stigmasterol: 1,3; — sitosterol: 1,5; — betulină: 2,5;

—	timpul de retenție al betulinei trebuie să fie de aproximativ 24 minute.

5.4.2.   Protocolul de analiză

Se injectează 1 µl de soluție etalon sililată (stigmasterol sau sitosterol) și se ajustează parametrii de calibrare ai integratorului.

Se injectează din nou 1 µl de soluție etalon sililată pentru a se determina coeficientul de răspuns față de betulină.

Se injectează 1 µl de soluție de probă sililată și se măsoară suprafața vârfurilor. Fiecare serie de probe trebuie precedată și urmată de o injectare de soluție etalon.

În general, injectarea soluției de probă se poate efectua după o serie de șase probe.

Nota 6: Integrarea vârfului stigmasterolului trebuie să prezinte curbele indicate la punctele 1, 2 și 3 din figura 2b.

Integrarea vârfului sitosterolului trebuie să înglobeze suprafața vârfului 22-dihidro-β-sitosterolului (stigmastanol) care apare imediat după sitosterol (a se vedea figura 3b) în momentul evaluării sitosterolului total.

6.   CALCULAREA REZULTATELOR

6.1.   Se determină suprafața vârfurilor sterolului și a vârfurilor betulinei în cele două etaloane, la începutul și la finalul fiecărei serii, și se calculează R1:

R1 = (suprafața medie a vârfului sterolului în etalon)/(suprafața medie a vârfului betulinei în etalon)

Se determină suprafața vârfului de sterol (stigmasterol sau sitosterol) și a vârfului betulinei în probă și se calculează R2:

R2 = (suprafața vârfului sterolului în probă)/(suprafața vârfului betulinei în probă)

W1	=	conținutul de sterol al etalonului (mg) din 1 ml de soluție etalon (4.8.1 sau 4.9.1)
W2	=	masa probei (g) (5.2.1)
P	=	puritatea sterolului etalon (4.8 sau 4.9)

Conținutul de sterol din probă (mg/kg) = [(R 2)/(R 1)] × [(W 1)/(W 2)] × P × 10.

7.   PRECIZIA METODEI

7.1.   Unt

7.1.1.   Repetabilitate

7.1.1.1.   Stigmasterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 19,3 mg/kg.

7.1.1.2.   Sitosterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 23,0 mg/kg.

7.1.2.   Reproductibilitate

7.1.2.1.   Stigmasterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 31,9 mg/kg.

7.1.2.2.   Sitosterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 8,7 % din valoarea medie a acestor determinări.

7.1.3.   Sursa datelor de precizie

Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1992 în care au fost implicate opt laboratoare și șase probe (trei duplicate probă martor) pentru stigmasterol și șase probe (trei duplicate probă martor) pentru sitosterol.

7.2.   Unt concentrat

7.2.1.   Repetabilitate

7.2.1.1.   Stigmasterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 10,2 mg/kg.

7.2.1.2.   Sitosterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeași aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 3,6 % din valoarea medie a acestor determinări.

7.2.2.   Reproductibilitate

7.2.2.1.   Stigmasterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 25,3 mg/kg.

7.2.2.2.   Sitosterol

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depășească 8,9 % din valoarea medie a acestor determinări.

7.2.3.   Sursa datelor de precizie

Datele de precizie au fost determinate printr-un experiment realizat în 1991 în care au fost implicate opt laboratoare și șase probe (trei duplicate probă martor) pentru stigmasterol și șase probe (trei duplicate probă martor) pentru sitosterol.

8.   LIMITE DE TOLERANȚĂ

8.1.   Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.

8.2.   Unt

8.2.1.   Stigmasterol

8.2.1.1.   Rata de încorporare pentru stigmasterol este de 150 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puțin 95 %, pe o tonă de unt, respectiv 142,5 mg/kg, sau de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puțin 85 %, pe o tonă de unt, respectiv 144,5 mg/kg.

8.2.1.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei și a omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	115,8 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95 % pentru stigmasterol cu o puritate de 95 %);

—	117,7 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95 % pentru stigmasterol cu o puritate de 85 %);

—	80,1 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70 % pentru stigmasterol cu o puritate de 95 %);

—	81,5 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70 % pentru stigmasterol cu o puritate de 85 %).

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 115,8 mg/kg și 80,1 mg/kg sau între 117,7 mg/kg și 81,5 mg/kg.

8.2.2.   Sitosterol

8.2.2.1.   Rata de încorporare pentru sitosterol este de 600 g de sitosterol, cu o puritate de cel puțin 90 %, pe o tonă de unt, respectiv 540 mg/kg.

8.2.2.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei și omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	482,6 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95 % pentru sitosterol cu o puritate de 90 %);

—	347,6 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70 % pentru sitosterol cu o puritate de 90 %).

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 482,6 mg/kg și 347,6 mg/kg.

8.3.   Unt concentrat

8.3.1.   Stigmasterol

8.3.1.1.   Rata de încorporare pentru stigmasterol este de 150 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puțin 95 %, pe o tonă de unt concentrat, respectiv 142,5 mg/kg; sau de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puțin 85 %, pe o tonă de unt concentrat, respectiv 144,5 mg/kg.

8.3.1.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei și a omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	118,5 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95 % pentru stigmasterol cu o puritate de 95 %);

—	120,4 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95 % pentru stigmasterol cu o puritate de 85 %);

—	82,9 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70 % pentru stigmasterol cu o puritate de 95 %);

—	84,3 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70 % pentru stigmasterol cu o puritate de 85 %).

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 118,5 mg/kg și 82,9 mg/kg sau între 120,4 mg/kg și 84,3 mg/kg.

8.3.2.   Sitosterol

8.3.2.1.   Rata de încorporare pentru sitosterol este de 600 g de sitosterol, cu o puritate de cel puțin 90 %, pe o tonă de unt concentrat, respectiv 540 mg/kg.

8.3.2.2.   Rezultatele pentru cele trei probe obținute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei și a omogenității de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

—	480,9 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95 % pentru sitosterol cu o puritate de 90 %);

—	345,9 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70 % pentru sitosterol cu o puritate de 90 %).

Concentrația marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 480,9 mg/kg și 345,9 mg/kg.

Figura 1

Cromatograma amestecului pentru testul de rezoluție

Se preferă rezoluția completă, respectiv vârful lanesterolului trebuie să revină la linia de bază, înainte de a se îndrepta către vârful sitosterolului, deși este tolerată și o rezoluție incompletă.

Figura 2a	Figura 2b
Etalon stigmasterol	Probă de unt denaturat cu stigmasterol
Notă: Integrarea vârfului stigmasterolului trebuie să includă toate traseele cuprinse între punctele 1, 2 și 3.

aFigura 3a	Figura 3b
Etalon sitosterol	Probă de unt denaturat cu ß-sitosterol
Notă: β-sitosterolul conține frecvent o impuritate (stigmastanol) care apare imediat după β-sitosterol. Suprafețele celor două vârfuri trebuie însumate la evaluarea cantității totale de β-sitosterol existente.

ANEXA IX

(Articolul 6)

METODĂ DE REFERINȚĂ PENTRU DETECTAREA LAPTELUI DE VACĂ ȘI A CAZEINATULUI ÎN BRÂNZETURILE PRODUSE DIN LAPTE DE OAIE, LAPTE DE CAPRĂ SAU LAPTE DE BIVOLIȚĂ SAU DIN AMESTECURI DE LAPTE DE OAIE, CAPRĂ ȘI BIVOLIȚĂ

1.   OBIECTUL

Detectarea laptelui de vacă și a cazeinei în brânzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliță sau din amestecuri de lapte de oaie, capră și bivoliță prin focalizarea izoelectrică a γ-cazeinelor după plasminoliză.

2.   DOMENIUL DE APLICARE

Această metodă poate fi folosită pentru detectarea sensibilă și specifică a laptelui de vacă natural și tratat termic și a cazeinatului în brânzeturile proaspete și maturate produse din lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliță sau din amestecuri de lapte de oaie, capră și bivoliță. Nu poate fi folosită pentru detectarea falsificării laptelui și a brânzei cu concentrate de proteine de zer de bovine tratate termic.

3.   PRINCIPIUL METODEI

3.1.   Izolarea cazeinei din brânză și din probele de referință

3.2.   Dizolvarea cazeinelor izolate și tratarea acestora prin clivare plasminică (EC.3.4.21.7)

3.3.   Focalizarea izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină în prezența ureii și colorarea proteinelor

3.4.   Evaluarea benzilor colorate de γ2- și γ3-cazeină (dovezi ale prezenței laptelui de vacă) prin compararea benzilor obținute din probă cu benzile obținute pe același gel din probele de referință conținând 0 % și 1 % lapte de vacă

4.   REACTIVI

În afara cazurilor în care se precizează altceva, produsele chimice utilizate trebuie să fie de puritate analitică. Apa folosită trebuie să fie dublu-distilată sau de o puritate echivalentă.

Notă: Următoarele detalii se aplică gelurilor de poliacrilamide cu conținut de uree preparate în laborator, cu dimensiunile de 265 × 125 × 0,25 mm. În cazul în care se folosesc geluri de alte dimensiuni sau tipuri, poate fi necesară modificarea condițiilor de separare.

Focalizarea izoelectrică

4.1.   Reactivi pentru producerea gelurilor de poliacrilamide cu conținut de uree

4.1.1.   Soluție „stock” de gel

Se dizolvă în apă:

4,85 g acrilamidă

0,15 g N, N'-metilen-bis-acrilamidă (BIS)

48,05 g uree

15,00 g glicerol (87 % m/m)

și se completează cu apă până la 100 ml, apoi se păstrează produsul obținut în refrigerator, într-un recipient de sticlă de culoare maro.

Notă: În locul cantităților fixe de acrilamide neurotoxice menționate mai sus se poate folosi o soluție de acrilamidă/BIS prefabricată disponibilă în comerț. În cazul în care o asemenea soluție conține 30 % m/v acrilamidă și 0,8 % m/v BIS, cantitățile de acrilamidă și BIS din preparatul de mai sus se înlocuiesc cu 16,2 ml de soluție. Termenul de valabilitate a soluției „stock” este de maximum 10 zile; în cazul în care conductibilitatea acesteia este mai mare de 5 μS, se deionizează substanța prin agitare cu 2 g Amberlite MB-3 timp de 30 minute, ulterior se filtrează printr-o membrană de 0,45 μm.

4.1.2.   Soluția de gel

Se prepară o soluție de gel amestecând aditivii și amfoliții cu soluția „stock” de gel (a se vedea 4.1.1).

9,0 ml soluție „stock”

24 mg β-alanină

500 μl amfolit pH 3,5-9,5 (1)

250 μl amfolit pH 5-7 (1)

250 μl amfolit pH 6-8 (1).

Se amestecă soluția de gel și se degazeifică timp de două sau trei minute într-o baie ultrasonică sau sub vid.

Notă: Soluția de gel se prepară imediat înainte de a o turna (a se vedea 6.2).

4.1.3.   Soluții catalizator

4.1.3.1.   N, N, N' N' – tetrametiletilendiamină (Temed)

4.1.3.2.   40 % m/v persulfat de amoniu (PER):

Se dizolvă 800 mg PER în apă și se completează cu apă până la 2 ml.

Notă: A se folosi întotdeauna soluție PER proaspăt preparată.

4.2.   Fluid de contact

Kerosen sau parafină lichidă

4.3.   Soluție anodică

Se dizolvă în apă 5,77 g acid fosforic (85 % m/m) și se diluează până la 100 ml.

4.4.   Soluție catodică

Se dizolvă în apă 2,00 g hidroxid de sodiu și se diluează până la 100 ml.

Prepararea probei

4.5.   Reactivi pentru izolarea proteinelor

4.5.1.   Se diluează acid acetic (25,0 ml acid acetic cristalizabil completat cu apă până la 100 ml)

4.5.2.   Diclorometan

4.5.3.   Acetonă

4.6.   Soluție tampon de dizolvare a proteinelor

Se dizolvă în apă

5,75 g glicerol (87 % m/m)

24,03 g uree

250 mg ditiotreitol

și se completează cu apă până la 50 ml.

Notă: Se păstrează substanța în refrigerator, termen de valabilitate: maximum o săptămână.

4.7.   Reactivi pentru clivarea plasminică a cazeinelor

4.7.1.   Soluție tampon de carbonat de amoniu

Se titrează până la pH 8 o soluție de hidrogencarbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml apă) conținând acid etilendiaminotetraacetic 0,05 mol/l (EDTA, 1,46 g/100 ml) cu o soluție de carbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml apă) conținând 0,05 mol/l EDTA.

4.7.2.   Plasmină bovină (EC. 3.4.21.7), cu activitate de minimum 5 U/ml

4.7.3.   Soluție de acid ε-aminocaproic pentru inhibarea enzimelor

Se dizolvă 2,624 g acid ε-aminocaproic (acid 6-amino-n-hexanoic) în 100 ml de etanol 40 % (v/v).

4.8.   Standarde

4.8.1.   De la Institutul pentru Materiale și Măsurători de Referință al Comisiei, B-2440 Geel, Belgia pot fi obținute probe de referință certificate obținute din amestecuri de lapte închegat de oaie și capră conținând 0 %, respectiv 1 % lapte de vacă.

4.8.2.   Prepararea probelor de referință provizorii de laborator din lapte de bivoliță închegat conținând 0 % și 1 % lapte de vacă

Laptele degresat se prepară prin centrifugarea laptelui crud de bivoliță sau de vacă în vrac la 37 °C (2 500 g, timp de 20 minute). După răcirea rapidă a tubului și a conținutului la 6-8 °C, stratul superior de grăsime se îndepărtează în totalitate. Pentru prepararea probei etalon 1 % se adaugă 5,00 ml de lapte de vacă degresat la 495 ml lapte de bivoliță degresat într-un vas de 1 l, se ajustează pH-ul la 6,4 prin adăugarea de acid lactic diluat (10 % m/v). Se ajustează temperatura la 35 °C și se adaugă 100 μl de cheag de vițel (activitatea reninică 1: 10 000, c. 3 000 U/ml), se amestecă timp de 1 minut, apoi se acoperă vasul cu o folie de aluminiu și se lasă la 35 °C timp de 1 oră pentru a se putea forma coagulul. După formarea acestuia, laptele închegat este liofilizat în întregime fără omogenizare prealabilă și fără a se extrage zerul. După liofilizare, produsul se zdrobește până se obține o pulbere fină omogenă. Pentru prepararea probei etalon 0 %, se urmează aceeași procedură folosind lapte degresat de bivoliță veritabil. Probele trebuie păstrate la –20 °C.

Notă: Înaintea preparării probelor etalon, se recomandă verificarea purității laptelui de bivoliță prin focalizarea izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină.

Reactivi pentru colorarea proteinelor

4.9.   Fixativ

Se dizolvă în apă 150 g acid tricloroacetic și se completează cu apă până la 1 000 ml.

4.10.   Soluție pentru decolorare

Se diluează în apă distilată până la 2 000 ml 500 ml metanol și 200 ml acid acetic cristalizabil.

Notă: Se prepară zilnic o soluție proaspătă de decolorare; soluția poate fi preparată prin amestecarea de volume egale de soluții „stock” metanol 50 % (v/v) și acid acetic cristalizabil 20 % (v/v).

4.11.   Soluții pentru colorare

4.11.1.   Soluție pentru colorare (soluție „stock” 1)

Se dizolvă 3,0 g Albastru Briliant de Coomassie G-250 (C.I. 42655) în 1 000 ml metanol 90 % (v/v) folosind un agitator magnetic (timp de aproximativ 45 minute), apoi se filtrează prin două filtre pliate de viteză medie.

4.11.2.   Soluție pentru colorare (soluție „stock” 2)

Se dizolvă 5,0 g sulfat de cupru pentahidrat în 1 000 ml acid acetic 20 % (v/v).

4.11.3.   Soluție pentru colorare (soluție de lucru)

Se amestecă 125 ml din fiecare soluție „stock” (4.11.1, 4.11.2) imediat înainte de colorare.

Notă: Se recomandă prepararea soluției de colorare în ziua folosirii acesteia.

5.   APARATURĂ

5.1.   Plăci de sticlă (265 × 125 × 4 mm); rolă de cauciuc (lățime 15 cm); masă reglabilă

5.2.   Foaie susținătoare de gel (265 × 125 mm)

5.3.   Foaie de acoperire (280 × 125 mm). Se lipește o bucată de bandă adezivă (280 × 6 ×0,25 mm) pe fiecare latură lungă (a se vedea figura 1)

5.4.   Cuvă de electrofocalizare cu placă de răcire (de exemplu 265 × 125 mm) cu unitate de alimentare electrică adecvată (≥ 2,5 kV) sau cu aparat automat de electroforeză

5.5.   Criostat de circulație controlat termostatic la 12 ± 0,5 °C

5.6.   Centrifugă ajustabilă la 3 000 g

5.7.   Benzi de electrozi (lungime ≥ 265 mm)

5.8.   Sticle picurătoare de plastic pentru soluțiile anodice și catodice

5.9.   Aplicatoare de probe (10 × 5 mm, vâscoză sau hârtie de filtru cu absorbție redusă a proteinelor)

5.10.   Foarfeci, scalpele și pensete din oțel inoxidabil

5.11.   Cuve din oțel inoxidabil pentru colorare și decolorare (de exemplu, tăvi de 280 × 150 mm)

5.12.   Omogenizator ajustabil cu tijă (diametrul tijei 10 mm), viteză de rotație 8 000-20 000 rpm

5.13.   Agitator magnetic

5.14.   Baie ultrasonică

5.15.   Aparat de sudură a foliilor

5.16.   Micropipete de 25 μl

5.17.   Concentrator sub vid sau liofilizator

5.18.   Baie de apă cu agitator, controlată termostatic și ajustabilă la 35 și 40 ± 1 °C

5.19.   Echipament de densitometrie cu citire la λ = 634 nm

6.   PROCEDURĂ

6.1.   Prepararea probei

6.1.1.   Izolarea cazeinelor

Se cântărește într-un tub de centrifugă de 100 ml echivalentul a 5 g materie uscată de brânză sau probă de referință, se adaugă 60 ml apă distilată și se omogenizează cu un omogenizator cu tijă (8 000-10 000 rpm). Se ajustează la un pH de 4,6 cu o soluție de acid acetic diluat (4.5.1) și se pune în centrifugă (5 minute, 3 000 g). Se decantează grăsimea și zerul, se omogenizează reziduul la 20 000 rpm în 40 ml apă distilată ajustată la un pH de 4,5 cu soluție de acid acetic diluat (4.5.1), se adaugă 20 ml diclorometan (4.5.2), se omogenizează din nou și se pune în centrifugă (5 minute, 3 000 g). Se îndepărtează cu o spatulă stratul de cazeină care se află între faza apoasă și cea organică (a se vedea figura 2) și se elimină ambele faze. Se reomogenizează cazeina în 40 ml apă distilată (a se vedea mai sus) și în 20 ml diclorometan (4.5.2), apoi se pune în centrifugă. Se repetă procedura până când ambele faze extrase sunt incolore (de două sau trei ori). Se omogenizează reziduul de proteină cu 50 ml acetonă (4.5.3) și se filtrează printr-o hârtie de filtru pliată de viteză medie. Se spală de fiecare dată reziduul de pe filtru cu câte două porții separate de 25 ml acetonă și se lasă să se usuce în aer sau sub jet de azot, apoi se transformă în pulbere într-un mojar.

Notă: Cazeina izolată uscată trebuie păstrată la –20 °C.

6.1.2.   Clivarea plasminică al ß-cazeinelor pentru intensificarea γ-cazeinelor

Se prepară o suspensie de 25 mg cazeine izolate (6.1.1) în 0,5 ml soluție tampon de carbonat de amoniu (4.7.1) și se omogenizează timp de 20 minute folosind, de exemplu, tratamentul ultrasonic. Se încălzește la 40 °C și se adaugă 10 μl plasmină (4.7.2), apoi se amestecă și se incubează timp de o oră la 40 °C, agitând continuu. Pentru a inhiba enzimele se adaugă 20 μl soluție de acid ε-aminocaproic (4.7.3), apoi se adaugă 200 mg uree solidă și 2 mg ditiotreitol.

Notă: Pentru a obține o simetrie mai mare a benzilor cazeinice focalizate se recomandă liofilizarea soluției după adăugarea acidului ε-aminocaproic și dizolvarea reziduurilor în 0,5 ml soluție tampon pentru dizolvarea proteinelor (4.6).

6.2.   Prepararea gelurilor poliacrilamide care conțin uree

Cu ajutorul câtorva picături de apă se întinde foaia susținătoare de gel (5.2) pe o placă de sticlă (5.1), îndepărtându-se surplusul de apă cu un șervețel. Se întinde în mod similar foaia de acoperire (5.3) cu spațiatoare (0,25 mm) pe o altă placă de sticlă. Se așază placa orizontal pe masa reglabilă.

Se adaugă 10 μl Temed (4.1.3.1) la soluția de gel degazeificată pregătită (4.1.2), se amestecă și se adaugă 10 μl soluție PER (4.1.3.2), se amestecă bine și se toarnă imediat amestecul într-un strat egal pe centrul foii de acoperire. Se pune o margine a plăcii susținătoare de gel (cu fața foii îndreptată în jos) pe placa de acoperire și se coboară încet, astfel încât între foi să se formeze un strat subțire de gel care să se întindă uniform și fără bule (figura 3). Se coboară cu grijă până la capăt placa susținătoare de gel, folosind o spatulă subțire, apoi se așază încă trei plăci de sticlă deasupra, pentru a acționa ca greutate. După încheierea polimerizării (aproximativ 60 minute), se transferă gelul polimerizat împreună cu foaia de acoperire pe foaia susținătoare de gel, înclinând plăcile de sticlă. Se curăță cu grijă spatele foii susținătoare de gel pentru a elimina reziduurile de gel și de uree. Se sudează marginile „sandvișului” de gel, astfel încât să se obțină un tub și se păstrează în refrigerator (timp de maximum șase săptămâni).

Notă: Foaia de acoperire și spațiatoarele pot fi refolosite. Gelul de poliacrilamidă poate fi tăiat la dimensiuni mai mici, acțiune care este recomandată în cazul în care există puține probe sau în cazul în care se folosește un aparat automat de electroforeză (două geluri format 4,5 × 5 cm).

6.3.   Focalizarea izoelectrică

Se reglează termostatul de răcire la 12 °C. Se șterge cu kerosen spatele foii susținătoare de gel, apoi se picură câteva picături de kerosen (4.2) pe centrul blocului de răcire. Se rulează apoi pe el „sandvișul” de gel, cu partea susținătoare de gel îndreptată în jos, având grijă să se evite formarea bulelor. Se șterge excesul de kerosen și se îndepărtează foaia de acoperire. Se îmbibă benzile de electrozi în soluțiile electrolitice (4.3, 4.4), se taie după lungimea gelului și se plasează în poziția prevăzută (distanța dintre electrozi de 9,5 cm).

Condiții pentru focalizarea izoelectrică:

6.3.1.   Dimensiunile gelului 265 × 125 × 0,25 mm

Etapă	Timp (min)	Tensiune (V)	Intensitate (mA)	Putere (W)	Volți oră (Vh)
1. Prefocalizare	30	maximum 2 500	maximum 15	constant 4	c. 300
2. Focalizarea probei (2)	60	maximum 2 500	maximum 15	constant 4	c. 1 000
3. Focalizarea finală	60	maximum 2 500	maximum 5	maximum 20	c. 3 000
	40	maximum 2 500	maximum 6	maximum 20	c. 3 000
	30	maximum 2 500	maximum 7	maximum 25	c. 3 000

Notă: În cazul în care se modifică grosimea sau lățimea gelurilor, atunci intensitatea și puterea curentului trebuie ajustate în consecință (de exemplu, în cazul în care se folosește un gel de 265 × 125 × 0,5 mm se dublează valorile pentru intensitatea și puterea curentului electric).

6.3.2.   Exemplu de program de tensiune pentru un aparat automat de electroforeză (2 geluri de 5,0 × 4,5 cm), cu electrozi fără benzi și aplicați direct pe gel

Etapă	Tensiune	Intensitate	Putere	Temp.	Volți oră
1. Prefocalizare	1 000 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	85 Vh
2. Focalizarea probei	250 V	5,0 mA	2,5 W	8 °C	30 Vh
3. Focalizare	1 200 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	80 Vh
4. Focalizare	1 500 V	5,0 mA	7,0 W	8 °C	570 Vh

Se plasează aplicatorul probei la pasul 2 la 0 Vh.

Se îndepărtează aplicatorul probei la pasul 2 la 30 Vh.

6.4.   Colorarea proteinelor

6.4.1.   Fixarea proteinelor

Se îndepărtează benzile de electrozi imediat după stingerea aparatului și se plasează imediat gelul într-o cuvă de colorare/decolorare umplută cu 200 ml fixativ (4.9); se lasă acolo timp de 15 minute, agitând în continuu.

6.4.2.   Spălarea și colorarea plăcii de gel

Se scurge cu grijă fixativul și se spală placa de gel de două ori, timp de câte 30 de secunde, cu 100 ml soluție decolorantă (4.10). Se decantează soluția decolorantă și se umple cuva cu 250 ml soluție colorantă (4.11.3); se lasă 45 minute să se coloreze, agitându-se ușor cuva.

6.4.3.   Decolorarea plăcii de gel

Se decantează soluția colorantă, se spală placa de gel de două ori, cu câte 100 ml soluție decolorantă (4.10), apoi se agită timp de 15 minute cu 200 ml soluție decolorantă și se repetă pasul de decolorare de cel puțin două-trei ori, până când fundul vasului este curățat și incolor. Se clătește apoi cu apă distilată placa de gel (2 × 2 minute) și se usucă la aer (2-3 ore) sau cu un uscător de păr (10-15 minute).

Nota 1: Fixarea, spălarea, colorarea și decolorarea se efectuează la 20 °C. A nu se folosi temperaturi ridicate.

Nota 2: În cazul în care se preferă colorarea mai sensibilă cu argint (de exemplu, Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, cod nr. 17-1150-01), probele de cazeină tratate cu plasmină trebuie diluate la 5 mg/ml.

7.   EVALUARE

Evaluarea este efectuată prin compararea benzilor de proteine ale probei necunoscute cu probele de referință efectuate pe același gel. Detectarea laptelui de vacă în brânzeturile din lapte de oaie, lapte de capră și lapte de bivoliță și în amestecurile de lapte de oaie, capră și bivoliță se face prin intermediul γ3- și γ2-cazeinelor, ale căror puncte izoelectrice se află în intervalul pH 6,5-pH 7,5 (figurile 4 a și 4 b, figura 5). Limita de detecție este mai mică de 0,5 %.

7.1.   Estimare vizuală

Pentru evaluarea vizuală a cantității de lapte de vacă se recomandă ajustarea concentrațiilor probelor și a probelor etalon pentru a obține același nivel de intensitate a γ2- și γ3-cazeinelor din laptele de ovine, caprine și/sau bivolițe (a se vedea „γ2 E, G, B” și „γ3 E, G, B” din figurile 4 a și 4 b și din figura 5). După aceasta, nivelul de lapte de vacă (mai mic decât, egal cu sau mai mare de 1 %) din proba necunoscută poate fi estimat direct, prin compararea intensității γ3- și γ2-cazeinelor din laptele de vacă (a se vedea „γ3 C” și „γ2 C” din figurile 4 a și 4 b și din figura 5) cu cea a probelor de referință de 0 % și 1 % (oaie, capră) sau cu standardele provizorii de laborator (bivoliță).

7.2.   Estimare densitometrică

În cazul în care este disponibilă, se aplică densitometria (5.19) pentru determinarea raportului dintre suprafața vârfurilor γ2- și γ3-cazeinelor din laptele de vacă, respectiv din laptele de oaie, capră și/sau bivoliță (a se vedea figura 5). Această valoare se compară cu raportul dintre suprafața vârfurilor γ2- și γ3-cazeinelor pentru proba de referință 1 % (oaie, capră) sau pentru standardul provizoriu de laborator (bivoliță), analizate pe același gel.

Notă: Metoda funcționează corespunzător în cazul în care se obține un semnal pozitiv clar pentru ambele cazeine bovine γ2- și γ3- din proba de referință 1 %, dar nu și din proba de referință 0 %. Dacă nu, procedura trebuie îmbunătățită respectându-se cu exactitate detaliile metodei.

O probă este considerată pozitivă în cazul în care ambele cazeine bovine γ2- și γ3- sau raportul suprafeței vârfurilor corespunzător sunt mai mari sau egale cu nivelul din proba de referință 1 %.

8.   REFERINȚE

1.	Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2.	Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3.

Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4.	Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5.	Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Figura 1

Schița foii de acoperire

Figura 2

Strat de cazeină plutind după centrifugare între faza apoasă și faza organică

Figura 3

Tehnică de pliere pentru obținerea straturilor foarte fine de geluri poliacrilamide

a = bandă adezivă pentru spațiere (0,25 mm); b = foaie de acoperire (5.3); c, e = plăci de sticlă (5.1); d = soluție de gel (4.1.2); f = foaie susținătoare de gel (5.2)

Figura 4 a

Focalizare izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină din brânză din lapte de oaie și de capră care conține diferite cantități de lapte de vacă

% CM = procentaj lapte de vacă; C = vacă; E = oaie; G = capră.

Este ilustrată jumătatea de sus a gelului IEF.

Figura 4 b

Focalizare izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină din brânză din amestec de lapte de oaie, capră și bivoliță care conține diferite cantități de lapte de vacă

% CM = procentaj lapte de vacă; 1 + = probă conținând 1 % lapte de vacă și dopat cu cazeină pură de lapte de vacă la mijlocul traiectului gelului. C = vacă; E = oaie; G = capră; B = bivoliță.

Este ilustrată distanța separatoare totală a gelului IEF.

Figura 5

Suprapunerea densitogramelor probelor etalon (STD) și a probelor de brânză preparate din amestec de lapte de oaie și de capră după focalizarea izoelectrică

a, b = probe etalon conținând 0, respectiv 1 % lapte de vacă; c-g = probe de brânză conținând 0, 1, 2, 3 și 7 % lapte de vacă. C = vacă; E = oaie; G = capră.

Jumătatea superioară a gelului IEF a fost scanată la λ = 634 nm.

---

(1)  Produsele Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) și Resolyte® pH 5-7 și pH 6-8 (BDH, Merck) s-au dovedit deosebit de adecvate pentru obținerea gradului necesar de separare a γ-cazeinelor.

(2)  Aplicarea probei: După prefocalizare (etapa 1), se picură 18 μl din proba și din soluțiile standard pe aplicatorii probei (10 × 5 mm), se plasează aplicatorii pe gel la distanță de 1 mm unul de celălalt și la 5 mm longitudinal față de anod și se apasă ușor. Procedura de focalizare se finalizează în condițiile specificate mai sus, îndepărtând cu grijă aplicatorii probei după 60 minute de focalizare a probei.