1.

Coeficientul de partiție (P) se definește ca raportul dintre concentrațiile de echilibru ale unei substanțe dizolvate într-un sistem bifazic constând din doi solvenți aproape nemiscibili. În cazul n-octanol și apă,

coeficientul de partiție fiind raportul dintre două concentrații, el este adimensional și de regulă este exprimat ca logaritm în baza 10.

2.

Pow reprezintă un parametru-cheie în studiile privind evoluția în mediu a substanțelor chimice. S-a dovedit existența unei relații foarte importante între Pow al formei neionizate a substanțelor și bioacumularea lor în pești. S-a dovedit, de asemenea, că Pow reprezintă un parametru util pentru estimarea adsorbției pe sol și sedimente și pentru stabilirea relațiilor structură-activitate cantitative pentru o gamă largă de efecte biologice.

3.

Propunerea inițială privind această metodă de testare a avut la bază un articol scris de C.V. Eadsforth și P. Moser (1). Umweltbundesamt din Republica Federală Germania a coordonat în 1986 (2) dezvoltarea metodei de testare și o comparație interlaboratoare realizată de OCDE.

4.

Valorile log Pow cuprinse între – 2 și 4 (ocazional până la 5 sau mai mult) (1) pot fi determinate în mod experimental prin metoda agitării flaconului (capitolul A.8 din prezenta anexă, Orientarea OCDE privind testarea nr. 107). Metoda HPLC acoperă log Pow de la 0 până la 6 (1)(2)(3)(4)(5). Această metodă ar putea necesita o estimare a Pow pentru a stabili substanțe de referință adecvate și pentru a susține concluziile trase din datele generate de test. Metodele de calcul sunt discutate succint în apendicele la această metodă de testare. Modul de operare HPLC este izocratic.

5.

Valorile Pow depind de condiții de mediu precum temperatura, pH-ul, tăria ionică etc., iar acestea trebuie definite în experiment în vederea interpretării corecte a datelor Pow. Pentru substanțele ionizabile, ar putea deveni disponibilă și ar putea fi utilizată ca metodă alternativă o altă metodă [de exemplu proiectul de orientare OCDE privind metoda pH-metrică pentru substanțele ionizate (6)]. Deși acest proiect de orientare OCDE ar putea fi potrivit pentru determinarea Pow pentru substanțele ionizabile, în anumite cazuri este mai adecvat să se utilizeze metoda HPLC la un nivel al pH-ului relevant din punctul de vedere al mediului (a se vedea punctul 9).

6.

HPLC cu fază inversă se efectuează în coloane analitice umplute cu o fază solidă disponibilă în comerț care conține lanțuri lungi de hidrocarburi (de exemplu C8, C18) legate chimic pe silice.

7.

O substanță chimică injectată într-o astfel de coloană separă faza mobilă cu solvent și faza staționară cu hidrocarburi în timp ce este transportată de-a lungul coloanei de faza mobilă. Substanțele sunt reținute proporțional cu coeficientul lor de partiție hidrocarbură/apă, mai întâi fiind eluate substanțele hidrofile și apoi substanțele lipofile. Timpul de retenție este descris de factorul de capacitate k rezultat din expresia:

în care tR este timpul de retenție al substanței de testare și t0 este timpul mort, adică timpul mediu necesar unei molecule de solvent pentru a trece prin coloană. Nu sunt necesare metode analitice cantitative, ci doar determinarea timpilor de retenție.

8.

Coeficientul de partiție octanol/apă al unei substanțe de testare poate fi calculat prin determinarea în mod experimental a factorului său de capacitate k și apoi introducerea k în următoarea ecuație:

unde:

Ecuația de mai sus poate fi obținută prin regresia liniară a logaritmului coeficienților de partiție octanol/apă ai substanțelor de referință față de logaritmul factorilor de capacitate ai substanțelor de referință.

9.

Metoda HPLC cu fază inversă permite estimarea coeficienților de partiție în intervalul log Pow cuprins între 0 și 6, dar poate fi extinsă pentru a acoperi intervalul log Pow cuprins între 6 și 10 în cazuri excepționale. Aceasta ar putea necesita modificarea fazei mobile (3). Metoda nu este aplicabilă acizilor și bazelor puternice, complecșilor metalici, substanțelor care reacționează cu eluentul sau agenților tensioactivi. Măsurătorile pot fi efectuate asupra substanțelor ionizabile în forma lor neionizată (acid liber sau bază liberă) numai utilizând o soluție tampon adecvată având un pH mai mic decât pKa pentru un acid liber și mai mare decât pKa pentru o bază liberă. În mod alternativ, metoda pH-metrică pentru testarea substanțelor ionizabile (6) ar putea deveni disponibilă și ar putea fi utilizată ca metodă alternativă (6). Dacă valoarea Pow este determinată pentru a fi utilizată în clasificarea pericolelor pentru mediu sau în evaluarea riscurilor asupra mediului, testul ar trebui efectuat în intervalul de pH relevant pentru mediul natural, adică în intervalul de pH 5,0-9.

10.

În unele cazuri, impuritățile pot face dificilă interpretarea rezultatelor din cauza incertitudinii atribuirii picurilor. Pentru amestecurile care au ca rezultat o bandă imprecisă, trebuie raportate limitele superioară și inferioară ale log Pow și % de arie al fiecărui pic al log Pow. Pentru amestecurile care reprezintă un grup de omologi, trebuie precizată și media ponderată a log Pow (7), calculată pe baza valorilor Pow unice și a valorilor % de arie corespunzătoare (8). Toate picurile care contribuie cu o arie de cel puțin 5 % la aria totală a picului trebuie luate în considerare pentru calcul (9):

Media ponderată a log Pow este valabilă numai pentru substanțele sau amestecurile (de exemplu uleiurile de tal) constând în omologi (de exemplu serii de alcani). Se pot obține rezultate relevante din măsurarea amestecurilor, cu condiția ca detectorul analitic utilizat să aibă aceeași sensibilitate față de toate substanțele din amestec și acestea să se poată dizolva în mod adecvat.

11.

Înainte de utilizarea metodei, trebuie să se cunoască constanta de disociere, formula structurală și solubilitatea în faza mobilă. În plus, ar fi utile informații despre hidroliză.

12.

Pentru a crește coeficientul de încredere al măsurătorilor, trebuie să fie făcute determinări duble.

13.

Testul de comparație interlaboratoare a arătat că prin metoda HPLC valorile log Pow pot fi obținute în intervalul de ± 0,5 unități față de valorile obținute prin metoda agitării flaconului (2). Alte comparații pot fi găsite în literatura de specialitate (4)(5)(10)(11)(12). Graficele de corelație bazate pe substanțe de referință înrudite structural oferă cele mai precise rezultate (13).

14.

Pentru a corela factorul de capacitate k măsurat al unei substanțe cu Pow al acesteia, trebuie creat un grafic de calibrare utilizând cel puțin 6 puncte (a se vedea punctul 24). Selectarea substanțelor de referință adecvate este la latitudinea utilizatorului. Substanțele de referință ar trebui să aibă în mod normal valori ale log Pow care să cuprindă valoarea log Pow a substanței de testare, adică cel puțin o substanță de referință ar trebui să aibă valoarea Pow mai mare decât cea a substanței de testare, iar o altă substanță să aibă valoarea Pow mai mică decât cea a substanței de testare. Extrapolarea ar trebui utilizată numai în cazuri excepționale. Este de preferat ca aceste substanțe de referință să fie înrudite structural cu substanța de testare. Valorile log Pow ale substanțelor de referință utilizate pentru calibrare ar trebui să fie bazate pe date experimentale fiabile. Totuși, pentru substanțele cu log Pow ridicat (în mod normal mai mare de 4), pot fi utilizate valorile calculate dacă nu sunt disponibile date experimentale fiabile. Dacă se utilizează valori extrapolate, ar trebui stabilită o valoare-limită.

15.

Sunt disponibile liste lungi de valori log Pow pentru multe grupe de substanțe chimice (14)(15). Dacă nu sunt disponibile date despre coeficienții de partiție ai substanțelor chimice înrudite structural, atunci poate fi folosită o calibrare mai generală, stabilită cu alte substanțe de referință. Substanțele de referință recomandate și valorile Pow ale acestora sunt enumerate în tabelul 1. Pentru substanțele ionizabile, valorile date se aplică formei neionizate. Caracterul plauzibil și calitatea valorilor au fost verificate pe parcursul testului de comparație interlaboratoare.

Tabelul 1

Substanțele de referință recomandate

16.

Dacă est necesar, coeficientul de partiție al substanței de testare poate fi estimat, de preferat, utilizând o metodă de calcul (a se vedea apendicele) sau, dacă este cazul, utilizând raportul de solubilitate al substanței de testare în solvenții puri.

17.

Este necesar un cromatograf în fază lichidă prevăzut cu o pompă cu impulsuri slabe și cu un sistem de detecție potrivit. Pentru marea majoritate a grupelor de substanțe chimice se aplică un detector UV, utilizând o lungime de undă de 210 nm sau un detector RI. Prezența grupelor polare în faza staționară poate afecta serios performanțele coloanei HPLC. Prin urmare, fazele staționare ar trebui să aibă un procentaj minim de grupe polare (16). Pot fi folosite umpluturi de microparticule pentru inversarea fazelor din comerț sau coloane gata umplute. Între sistemul de injecție și coloana analitică poate fi poziționată o coloană de protecție.

18.

Pentru a prepara solventul de eluție se folosește metanol de calitate HPLC și apă distilată sau deionizată, iar solventul este degazat înainte de folosire. Ar trebui utilizată eluție izocratică. Ar trebui utilizate rapoarte metanol/apă cu un conținut minim de apă de 25 %. În general, un amestec metanol-apă 3:1 (v/v) este satisfăcător pentru eluția substanțelor cu log P de 6 într-o oră, la un debit de 1 ml/min. Pentru substanțele cu log P mai mare de 6 poate fi necesar să se scurteze timpul de eluție (și cel al substanțelor de referință) prin reducerea polarității fazei mobile sau a lungimii coloanei.

19.

Substanța de testare și substanțele de referință trebuie să fie solubile în faza mobilă într-o concentrație suficientă pentru a permite detectarea lor. Numai în cazuri excepționale pot fi folosiți aditivi împreună cu amestecul metanol-apă, deoarece aditivii vor schimba proprietățile coloanei. În aceste cazuri trebuie să se confirme că timpul de retenție al substanței de testare și al substanțelor de referință nu este influențat. Dacă amestecul metanol-apă nu este corespunzător, pot fi folosite alte amestecuri solvent organic-apă, de exemplu etanol-apă, acetonitril-apă sau alcool izopropilic (2-propanol)-apă.

20.

PH-ul eluentului este un factor critic pentru substanțele ionizabile. Ar trebui să se încadreze în intervalul de pH operațional al coloanei, care este de obicei cuprins între 2 și 8. Se recomandă utilizarea unei soluții tampon. Trebuie să se acorde o atenție deosebită evitării precipitării sărurilor și deteriorării coloanei care au loc în cazul unor amestecuri fază organică/soluție tampon. Măsurătorile HPLC cu faze staționare pe bază de silice cu un pH mai mare de 8 nu sunt în mod normal recomandabile deoarece folosirea unei faze mobile alcaline poate cauza scăderea rapidă a performanțelor coloanei.

21.

Substanțele de testare și substanțele de referință trebuie să fie suficient de pure pentru a atribui picurile din cromatograme substanțelor corespunzătoare. Dacă este posibil, substanțele care sunt folosite în scopuri de testare sau calibrare se dizolvă în faza mobilă. Dacă se utilizează un alt solvent decât faza mobilă pentru a dizolva substanțele de testare și substanțele de referință, faza mobilă ar trebui utilizată pentru diluarea finală anterioară injecției.

22.

În timpul măsurătorilor, temperatura nu ar trebui să varieze cu mai mult de ± 1 °C.

23.

Timpul mort t0 poate fi măsurat prin folosirea unor substanțe organice nereținute (de exemplu tioureea sau formamida). Un timp mort mai precis poate fi extras din timpii de retenție măsurați sau dintr-un set de aproximativ șapte membri ai unei serii omoloage (de exemplu n-alchil metil cetone) (17). Timpii de retenție tR (nC + 1) sunt reprezentați față de tR (nC), unde nC este numărul de atomi de carbon. Se obține o linie dreaptă, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, unde A, care reprezintă k(nC + 1)/k(nC), este constant. Timpul mort t0 se obține din intersecția dintre (1 – A)t0 și panta A.

24.

Următorul pas este reprezentarea grafică a unei corelații între log k și log P pentru substanțele de referință adecvate cu valori log P apropiate de valoarea așteptată pentru substanța de testare. În practică, se injectează simultan între 6 și 10 substanțe de referință. Timpii de retenție se determină, de preferat, cu un înregistrator conectat la sistemul de detecție. Logaritmii corespunzători ai factorilor de capacitate, log k, se reprezintă grafic ca funcție de log P. Ecuația de regresie se execută la intervale regulate, cel puțin o dată pe zi, astfel încât să se poată ține seama de posibilele schimbări ale performanțelor coloanei.

25.

Substanța de testare se injectează în cele mai mici cantități detectabile. Timpul de retenție se determină în duplicat. Coeficientul de partiție al substanței de testare se obține prin interpolarea factorului de capacitate calculat pe graficul de calibrare. Pentru coeficienții de partiție foarte mici și pentru cei foarte mari este necesară extrapolarea. În special în aceste cazuri trebuie să se acorde atenție limitelor de încredere ale liniei de regresie. Dacă timpul de retenție al eșantionului este în afara intervalului de timpi de retenție obținut pentru etaloane, ar trebui stabilită o valoare-limită.

26.

În raport trebuie incluse următoarele informații:

(1)

C.V. Eadsforth și P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss și H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt și R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OCDE (2000). Guideline for Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). «Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995», Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez și C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke și K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem și K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs și C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky și A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa și E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch și A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity – Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony și J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

1.

Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 201 (2006, anexă corectată în 2011). A fost identificată nevoia extinderii metodei de testare pentru a include specii suplimentare și a actualizării acesteia pentru a îndeplini cerințele privind evaluarea pericolelor și clasificarea substanțelor chimice. Această revizuire a fost efectuată pe baza unei experiențe practice vaste, a progresului științific în domeniul studierii toxicității algelor și a utilizării largi în domeniul reglementării care s-au înregistrat după adoptarea inițială.

2.

Definițiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.

3.

Scopul acestui test constă în determinarea efectelor unei substanțe chimice asupra creșterii microalgelor de apă dulce și/sau a cianobacteriilor. Organismele de testare cu o creștere exponențială se expun substanței chimice de testare sub formă de loturi de cultură în general pentru o perioadă de 72 de ore. În pofida duratei relativ scurte a testului, se pot evalua efectele asupra câtorva generații.

4.

Sistemul răspunde prin reducerea creșterii la o serie de culturi de alge (unități de testare) expuse la diferite concentrații ale unei substanțe chimice de testare. Răspunsul se evaluează ca funcție a concentrației de expunere în comparație cu creșterea medie a culturilor de control duplicate și neexpuse. Pentru exprimarea completă a răspunsului sistemului la efecte toxice (sensibilitate optimă), culturilor le este permisă o creștere exponențială nerestricționată în condiții de hrănire suficientă și lumină continuă, pentru o perioadă de timp suficientă pentru măsurarea reducerii vitezei specifice de creștere.

5.

Creșterea și inhibarea creșterii sunt cuantificate prin măsurări ale biomasei de alge în funcție de timp. Biomasa de alge se definește ca greutate uscată per volum, de exemplu mg alge/litru soluție de testare. Totuși, greutatea uscată este dificil de măsurat și, prin urmare, se folosesc parametri înlocuitori. Dintre acești înlocuitori, numărul celulelor este cel mai des folosit. Alți parametri înlocuitori sunt volumul celulelor, fluorescența, densitatea optică etc. Este necesară cunoașterea unui factor de conversie între parametrul înlocuitor măsurat și biomasă.

6.

Punctul final de testare este inhibarea creșterii, exprimată ca creștere logaritmică a biomasei (viteza medie specifică de creștere) în timpul perioadei de expunere. Concentrația care provoacă o inhibare a vitezei de creștere specificată de x % (de exemplu 50 %) se determină din vitezele medii specifice de creștere înregistrate pentru o serie de soluții de testare și este exprimată ca ErCx (de exemplu ErC50).

7.

O variabilă de răspuns suplimentară folosită în această metodă de testare este randamentul, care poate fi necesar pentru îndeplinirea unor cerințe de reglementare specifice din unele țări. Acesta se definește ca biomasa de la sfârșitul perioadei de expunere minus biomasa de la începutul perioadei de expunere. Concentrația care provoacă o inhibare a randamentului specificată de x % (de exemplu 50 %) se calculează din randamentul înregistrat pentru o serie de soluții de testare și este exprimată ca EyCx (de exemplu EyC50).

8.

În plus, concentrația cea mai scăzută pentru care este observat un efect (LOEC) și concentrația la care nu se observă niciun efect (NOEC) se pot determina prin metode statistice.

9.

Informațiile referitoare la substanța chimică de testare, care pot fi utile pentru stabilirea condițiilor de testare, includ formula structurală, puritatea, stabilitatea la lumină, stabilitatea în condițiile de testare, proprietățile de absorbție a luminii, pKa și rezultatele studiilor de transformare, inclusiv biodegradabilitatea în apă.

10.

Este necesar să se cunoască solubilitatea în apă, coeficientul de partiție octanol/apă (Pow) și presiunea de vapori a substanței chimice de testare și să fie disponibilă o metodă validată de determinare cantitativă a substanței chimice în soluțiile de testare, cu eficiență a recuperării și limită de detecție cunoscute.

11.

Pentru ca testul să fie valabil, trebuie să se îndeplinească următoarele criterii de performanță:

12.

Substanța (substanțele) chimică (chimice) de referință, cum ar fi 3,5-diclorfenolul folosit în ring testul internațional (1), poate (pot) fi testată (testate) ca metodă de verificare a procedurii de testare. Dicromatul de potasiu poate fi folosit, de asemenea, ca substanță chimică de referință pentru algele verzi. Este de preferat ca o substanță chimică de referință să fie testată de cel puțin două ori pe an.

13.

Această metodă de testare se aplică cel mai ușor în cazul substanțelor chimice solubile în apă care, în condițiile testului, sunt susceptibile să rămână în apă. În cazul testării de substanțe chimice volatile, puternic adsorbante, colorate, cu o solubilitate scăzută în apă sau substanțe chimice care pot afecta disponibilitatea nutrienților sau a mineralelor în mediul de testare, pot fi necesare anumite modificări ale procedurii de testare descrise (de exemplu sistem închis, condiționarea vaselor de testare). Orientări privind unele modificări adecvate se găsesc în lucrările (2), (3) și (4).

14.

Vasele de testare și alte echipamente care vor veni în contact cu soluțiile de testare ar trebui să fie în întregime din sticlă sau alt material inert din punct de vedere chimic. Obiectele ar trebui să fie foarte bine spălate pentru prevenirea efectelor contaminanților organici sau anorganici asupra creșterii algelor sau a compoziției soluțiilor de testare.

15.

Vasele de testare vor fi în mod normal flacoane din sticlă de dimensiuni cuprinzând un volum suficient de cultură pentru măsurătorile din cursul testului și permițând un transfer suficient de masă de CO2 din atmosferă (a se vedea punctul 30). Trebuie reținut că volumul de lichid trebuie să fie suficient pentru efectuarea determinărilor analitice (a se vedea punctul 37).

16.

În afară de acestea, pot fi necesare unele sau toate echipamentele următoare:

17.

Se pot folosi câteva specii de microalge și cianobacterii neatașate. S-a demonstrat că sușele enumerate în apendicele 2 sunt adecvate prin folosirea procedurii de testare specificate în această metodă de testare.

18.

Dacă se folosesc alte specii, ar trebui raportate sușa și/sau originea. Trebuie să se confirme că creșterea exponențială a algelor de testare selectate poate fi menținută pe parcursul întregii perioade de testare, în condițiile predominante.

19.

Se recomandă două medii alternative de cultură, mediul OCDE și mediul AAP. Compozițiile acestor medii sunt prezentate în apendicele 3. Trebuie reținut că valoarea inițială a pH-ului și capacitatea de tamponare (care reglează creșterea pH-ului) pentru cele două medii sunt diferite. Prin urmare, rezultatele testelor pot fi diferite, în funcție de mediul folosit, în special în cazul testării de substanțe chimice ionizante.

20.

Modificarea mediilor de cultură poate fi necesară pentru anumite scopuri, cum ar fi situațiile în care se testează metale și agenți de chelare sau la valori diferite ale pH-ului. Folosirea unui mediu modificat ar trebui descrisă în detaliu și justificată (3) (4).

21.

Biomasa inițială din culturile de testare trebuie să fie egală în toate aceste culturi și suficient de scăzută pentru a permite creșterea exponențială pe parcursul întregii perioade de incubație fără riscul de epuizare a nutrienților. Biomasa inițială nu ar trebui să depășească 0,5 mg/l ca greutate uscată. Se recomandă următoarele concentrații celulare inițiale:

22.

Intervalul de concentrație în care pot apărea efecte poate fi stabilit pe baza rezultatelor testelor de stabilire a intervalului. Pentru testul definitiv final ar trebui selectate cel puțin cinci concentrații dispuse în serie geometrică cu un factor care să nu depășească 3,2. Pentru substanțele chimice de testare care prezintă o curbă concentrație-răspuns constantă poate fi justificat un factor mai mare. Seriile de concentrații ar trebui să acopere, de preferat, intervalul care provoacă o inhibare de 5-75 % a vitezei de creștere a algelor.

23.

Proiectul testului ar trebui să includă trei probe duplicat la fiecare concentrație de testare. Dacă determinarea NOEC nu este necesară, proiectul testului poate fi modificat în sensul creșterii numărului de concentrații și reducerea numărului de probe duplicat per concentrație. Numărul de probe de control duplicate trebuie să fie de cel puțin trei, recomandându-se să depășească de două ori numărul probelor duplicat folosite pentru fiecare concentrație de testare.

24.

Pentru determinările analitice ale concentrațiilor substanței chimice de testare se poate pregăti un set separat de soluții de testare (a se vedea punctele 36 și 38).

25.

Dacă se utilizează un solvent pentru solubilizarea substanței chimice de testare, în proiectul testului trebuie incluse probe de control suplimentare conținând solventul în aceeași concentrație cu cea folosită în cazul culturilor de testare.

26.

În scopul adaptării algei testate la condițiile de testare și al asigurării faptului că algele se află în faza de creștere exponențială când sunt folosite pentru inocularea soluțiilor de testare, se pregătește o cultură de inocul în mediul de testare cu 2-4 zile înainte de începerea testului. Biomasa de alge ar trebui ajustată pentru a permite creșterii exponențiale să predomine în cultura de inocul până la începerea testului. Cultura de inocul trebuie incubată în aceleași condiții ca și culturile de testare. Se măsoară creșterea biomasei din cultura de inocul pentru a se verifica dacă creșterea se încadrează în intervalul normal pentru sușa testată în condițiile de cultură. Un exemplu al procedurii pentru cultura algelor este descris în apendicele 4. Pentru a se evita diviziunile celulare sincrone în timpul testului, poate fi necesară o a doua etapă de propagare a culturii de inocul.

27.

Toate soluțiile de testare trebuie să conțină aceleași concentrații de mediu de cultură și de biomasă inițială a algelor testate. Soluțiile de testare ale concentrațiilor alese se pregătesc de obicei prin amestecarea unei soluții stoc a substanței chimice de testare cu mediu de cultură și cultură de inocul. De obicei, soluțiile stoc se pregătesc prin dizolvarea substanței chimice în mediul de testare.

28.

Solvenții, cum ar fi acetona, alcoolul terț-butilic și dimetil-formamida, pot fi folosiți ca soluție vehicul pentru adăugarea în mediul de testare de substanțe chimice cu solubilitate scăzută în apă (2)(3). Concentrația solventului nu trebuie să depășească 100 μl/l, aceeași concentrație de solvent adăugându-se în toate culturile (inclusiv în probele de control) din seria de testare.

29.

Se acoperă vasele de testare cu capace care permit trecerea aerului. Vasele se agită, după care se introduc în echipamentul pentru cultură. Este necesar ca, în timpul testului, algele să fie menținute în suspensie și să se faciliteze transferul de CO2. În acest scop, se vor folosi mișcări de agitare și amestecare constante. Culturile ar trebui menținute la o temperatură cuprinsă între 21 și 24 °C, controlate la ± 2 °C. În cazul altor specii decât cele enumerate în apendicele 2, cum ar fi specii tropicale, pot fi adecvate temperaturi mai ridicate, cu condiția îndeplinirii criteriilor de validitate. Se recomandă ca flacoanele să fie așezate aleatoriu și repoziționate în fiecare zi în incubator.

30.

PH-ul mediului de control nu trebuie să crească cu mai mult de 1,5 unități în timpul testului. În cazul metalelor și substanțelor chimice care se ionizează parțial la un pH aproximativ egal cu pH-ul de testare, poate fi necesară limitarea devierii pH-ului în scopul obținerii de rezultate reproductibile și bine definite. O deviere de < 0,5 unități de pH este posibilă din punct de vedere tehnic și poate fi obținută prin asigurarea unei viteze adecvate de transfer de masă CO2 din aerul înconjurător către soluția de testare, de exemplu prin creșterea vitezei de agitare. O altă posibilitate constă în reducerea necesarului de CO2 prin reducerea biomasei inițiale sau a duratei testului.

31.

Suprafața unde sunt incubate culturile trebuie să primească iluminare fluorescentă continuă și uniformă, de tipul celei «alb-rece» sau «lumina zilei». Sușele de alge și cianobacterii sunt diferite din punctul de vedere al necesarului de lumină. Intensitatea luminii se selectează la un nivel adecvat pentru organismul de testare folosit. În cazul speciilor recomandate de alge verzi, intensitatea luminii la nivelul soluțiilor de testare se selectează în intervalul 60-120 μE · m– 2 s– 1 când se măsoară în intervalul de lungimi de undă eficient din punct de vedere fotosintetic de 400-700 nm, folosindu-se un receptor corespunzător. Unele specii, în special Anabaena flos-aquae, cresc bine la intensități scăzute ale luminii și pot fi afectate negativ la intensități ridicate. În cazul unor astfel de specii se selectează o intensitate luminoasă medie în intervalul 40-60 μE · m– 2 · s– 1. (În cazul instrumentelor de măsurare a luminii calibrate în lux, un interval echivalent de 4 440-8 880 lucși pentru lumină albă rece corespunde aproximativ intensității luminoase recomandate de 60-120 μE · m– 2 · s– 1). Intensitatea luminoasă trebuie menținută la ± 15 % de intensitatea luminoasă medie de deasupra zonei de incubație.

32.

Durata normală a testului este de 72 de ore. Cu toate acestea, pot fi folosite durate mai lungi sau mai scurte ale testului, cu condiția respectării tuturor criteriilor de validitate de la punctul 11.

33.

Biomasa de alge din fiecare flacon se determină cel puțin o dată pe zi în timpul perioadei de testare. Dacă măsurătorile se fac pe volume mici, extrase din soluția de testare cu o pipetă, acestea nu se înlocuiesc.

34.

Măsurarea biomasei are loc prin numărarea manuală a celulelor cu ajutorul unui microscop sau al unui contor electronic de particule (în funcție de numărul de celule și/sau de biovolum). Tehnici alternative, cum ar fi citometria de flux, fluorescența clorofilei in vitro sau in vivo (5) (6) sau densitatea optică, pot fi folosite dacă se demonstrează o corelație satisfăcătoare cu biomasa pentru intervalul de cantități de biomasă prezente în test.

35.

PH-ul soluțiilor se măsoară la începutul și la sfârșitul testului.

36.

Dacă este disponibilă o procedură analitică de determinare a substanței chimice de testare în intervalul de concentrație utilizat, soluțiile de testare ar trebui analizate pentru a fi verificate concentrațiile inițiale și menținerea concentrațiilor de expunere în timpul testului.

37.

Analizarea concentrației substanței chimice de testare la începutul și la sfârșitul testului unei concentrații de testare scăzute și înalte, precum și o concentrație în jurul valorii anticipate EC50 pot fi suficiente în cazurile în care este probabil ca variația concentrațiilor de expunere să fie de mai puțin de 20 % față de valorile nominale din timpul testului. Analizarea tuturor concentrațiilor de testare la începutul și la sfârșitul testului este recomandată în cazul concentrațiilor care nu rămân în intervalul de 80-120 % din concentrația nominală. În cazul substanțelor chimice de testare volatile, instabile sau puternic adsorbante, se recomandă recoltarea suplimentară de probe la intervale de 24 de ore în timpul perioadei de expunere în scopul definirii cu mai mare precizie a pierderii de substanță chimică de testare. Pentru aceste substanțe chimice sunt necesare probe duplicat suplimentare. În toate cazurile, determinarea concentrațiilor substanței chimice de testare trebuie efectuată doar în unul dintre vasele conținând probe duplicat la fiecare concentrație de testare (sau în conținutul vaselor grupate în funcție de proba duplicat).

38.

Mediile de testare pregătite special pentru analiza concentrațiilor de expunere în timpul testului ar trebui tratate identic cu cele folosite pentru testare, adică ar trebui să se inoculeze cu alge și să fie incubate în condiții identice. Dacă este necesară analiza concentrației substanței chimice de testare dizolvate, se poate impune separarea algelor de mediu. Este de preferat ca separarea să aibă loc prin centrifugare la o forță gravitațională scăzută, suficientă pentru depunerea algelor.

39.

Dacă se poate dovedi menținerea satisfăcătoare, pe toată durata testului, a concentrației substanței chimice de testare în limita a ± 20 % din cea nominală sau măsurată inițial, atunci analiza rezultatelor poate avea loc pe baza valorilor nominale sau măsurate inițial. Dacă abaterea de la concentrația inițială nominală sau măsurată nu se află în limita a ± 20 %, analiza rezultatelor ar trebui să fie bazată pe media geometrică a concentrației din timpul expunerii sau pe modelele care descriu scăderea concentrației substanței chimice testate (3)(7).

40.

Testul de inhibare a creșterii algelor este un sistem de testare mai dinamic decât majoritatea testelor de toxicitate acvatică pe termen scurt. Prin urmare, concentrațiile de expunere reale se pot dovedi dificil de definit, în special în cazul substanțelor chimice adsorbante testate la concentrații scăzute. În astfel de cazuri, dispariția substanței chimice de testare din soluție prin adsorbție în biomasa de alge în creștere nu înseamnă că aceasta s-a pierdut din sistemul de testare. În cursul analizării rezultatului testului, ar trebui să se verifice dacă o scădere a concentrației substanței chimice de testare în cursul testului este însoțită de o reducere a inhibării creșterii. Dacă acesta este cazul, poate fi luată în considerare aplicarea unui model adecvat de descriere a scăderii concentrației substanței chimice de testare (7). Dacă nu este cazul, analizarea rezultatelor se poate întemeia pe valorile concentrațiilor inițiale (nominale sau măsurate).

41.

Observația microscopică se efectuează în scopul verificării stării normale și sănătoase a culturii de inocul și pentru observarea oricărei stări anormale a algelor (care poate fi provocată de expunerea la substanța chimică de testare) la sfârșitul testului.

42.

În unele condiții, de exemplu atunci când un test preliminar arată că substanța chimică de testare nu are efecte toxice la concentrații de până la 100 mg/l sau până la limita solubilității sale în mediul de testare (oricare dintre ele este mai scăzută), se poate realiza un test la valori-limită, care presupune compararea răspunsurilor unui grup de control și ale unui grup supus tratamentului (100 mg/l sau o concentrație egală cu limita solubilității). Se recomandă ca acest test să fie confirmat prin analiza concentrației de expunere. Unui test la valori-limită i se aplică toate condițiile de testare și criteriile de validitate descrise anterior, cu excepția faptului că numărul de probe duplicat supuse tratamentului ar trebui să fie de cel puțin șase. Variabilele de răspuns din grupul de control și din cel supus tratamentului pot fi analizate folosind un test statistic de comparare a mediilor, cum ar fi un test t (Student). Dacă varianțele acestor două grupuri sunt inegale, ar trebui să se efectueze un test t ajustat pentru varianțe inegale.

43.

Biomasa din vasele de testare poate fi exprimată în unități ale parametrului înlocuitor folosit pentru măsurare (de exemplu numărul de celule, fluorescența).

44.

Concentrația estimată a biomasei din culturile de testare și probele de control se prezintă sub forma unui tabel, împreună cu concentrațiile materialului de testare și perioadele de măsurare, înregistrate cu o rezoluție de cel puțin ore întregi, pentru a produce grafice ale curbelor de creștere. Ambele scări, logaritmică și liniară, pot fi utile în această primă etapă, dar scările logaritmice sunt obligatorii și, în general, prezintă mai bine variațiile modelului de creștere în timpul perioadei de testare. Trebuie reținut că creșterea exponențială este reprezentată ca o linie dreaptă când se face reprezentarea grafică la scară logaritmică, iar înclinația liniei (panta) indică viteza specifică de creștere.

45.

Folosind graficele, se examinează dacă, pe parcursul întregului test, culturile de control cresc exponențial la viteza prevăzută. Se examinează critic toate punctele de date și aspectul graficelor și se verifică datele brute și procedurile pentru identificarea posibilelor erori. Se verifică, în special, orice punct de date care pare să devieze printr-o eroare sistematică. Dacă este evident că pot fi identificate erori de procedură și/sau acestea sunt considerate foarte probabile, punctul de date în cauză se marchează ca valoare excepțională și nu se include în analiza statistică ulterioară. (O concentrație a algelor egală cu zero în unul din două sau trei vase duplicate poate arăta că vasul nu a fost inoculat corect sau nu a fost curățat corespunzător.) Motivele respingerii unui punct de date ca fiind valoare excepțională se indică în mod clar în raportul de testare. Motivele acceptate sunt numai erorile (rare) de procedură, nu simpla imprecizie. Procedurile statistice de identificare a valorilor excepționale au aplicabilitate limitată pentru acest tip de problemă și nu pot înlocui raționamentul calificat. Se preferă ca valorile excepționale (marcate ca atare) să fie reținute între punctele de date ilustrate în orice prezentare grafică sau tabelară ulterioară a datelor.

46.

Scopul testului este de a determina efectele substanței chimice de testare asupra creșterii algelor. Această metodă de testare descrie două variabile de răspuns, deoarece diferitele jurisdicții au preferințe și cerințe de reglementare diferite. Pentru ca rezultatele testului să fie acceptabile în toate jurisdicțiile, efectele se evaluează folosind ambele variabile de răspuns (a) și (b) descrise mai jos.

(a)    Viteza medie specifică de creștere : această variabilă de răspuns se calculează pe baza creșterii logaritmice a biomasei în timpul perioadei de testare, exprimată pe zi.

(b)    Randamentul : această variabilă de răspuns reprezintă biomasa de la sfârșitul testului minus biomasa de la începutul testului.

47.

Trebuie remarcat că valorile de toxicitate calculate prin folosirea acestor două variabile de răspuns nu sunt comparabile, iar această diferență trebuie să fie recunoscută atunci când se folosesc rezultatele testului. Valorile ECx bazate pe viteza medie specifică de creștere (ErCx) vor fi în general mai mari decât rezultatele bazate pe randament (EyCx) în cazul în care condițiile de testare din această metodă de testare sunt respectate, ca urmare a bazei matematice a abordărilor respective. Aceasta nu se va interpreta ca o diferență de sensibilitate între cele două variabile de răspuns, valorile fiind diferite din punct de vedere matematic. Conceptul de viteză medie specifică de creștere se bazează pe modelul general al creșterii exponențiale a algelor în culturi nelimitate, în care toxicitatea se estimează pe baza efectelor asupra vitezei de creștere, fără a fi dependentă de nivelul absolut al vitezei specifice de creștere a probei de control, de panta curbei concentrație-răspuns sau de durata testului. Prin contrast, rezultatele bazate pe variabila de răspuns a randamentului depind de toate aceste variabile. EyCx depinde de viteza specifică de creștere a speciilor de alge folosite pentru fiecare test și de viteza maximă specifică de creștere, care poate varia între specii și chiar între sușe diferite de alge. Această variabilă de răspuns nu ar trebui folosită pentru compararea sensibilității la substanțe toxice între specii de alge sau chiar sușe diferite. În timp ce folosirea vitezei medii specifice de creștere în scopul estimării toxicității este preferată din punct de vedere științific, estimările de toxicitate bazate pe randament sunt de asemenea incluse în această metodă de testare pentru a satisface cerințele de reglementare actuale din unele țări.

48.

Viteza medie specifică de creștere pentru o anumită perioadă se calculează ca fiind creșterea logaritmică a biomasei, pe baza ecuației pentru fiecare vas de probe de control și de probe supuse tratamentului [1]:

unde:

Pentru fiecare grup supus tratamentului și pentru fiecare grup de control, se calculează o valoare medie a vitezei de creștere în paralel cu estimările varianței.

49.

Se calculează viteza medie specifică de creștere pentru întreaga durată a testului (în mod normal, zilele 0-3), folosind biomasa inoculată nominal ca valoare inițială în locul unei valori inițiale măsurate, în acest mod obținându-se de obicei o precizie mai mare. Dacă dispozitivul folosit pentru măsurarea biomasei permite o determinare suficient de precisă a biomasei scăzute de inocul (de exemplu citometru de flux), se poate folosi concentrația măsurată a biomasei inițiale. De asemenea, se evaluează viteza de creștere pe secțiuni, calculată ca viteze specifice de creștere pentru fiecare zi din perioada testului (zilele 0-1, 1-2 și 2-3) și se examinează dacă viteza de creștere a probei de control rămâne constantă (a se vedea criteriile de validitate, punctul 11). O viteză specifică de creștere semnificativ mai scăzută în prima zi decât viteza medie specifică de creștere poate indica o fază de latență. În timp ce o fază de latență poate fi minimizată și, practic, eliminată din culturile de control prin propagarea adecvată a preculturii, o fază de latență la culturile expuse poate indica recuperarea după un stres toxic inițial sau o expunere redusă ca urmare a pierderii de substanță chimică de testare (inclusiv sorbție în biomasa de alge) după expunerea inițială. Prin urmare, viteza de creștere pe secțiuni poate fi estimată în scopul evaluării efectelor substanței chimice de testare care se manifestă în timpul perioadei de expunere. Diferențe substanțiale între viteza de creștere pe secțiuni și viteza medie de creștere indică o deviere de la creșterea exponențială constantă și impun examinarea atentă a curbelor de creștere.

50.

Inhibarea procentuală a vitezei de creștere pentru fiecare probă duplicat supusă tratamentului se calculează pe baza ecuației [2]:

unde:

51.

Când se folosesc solvenți pentru pregătirea soluțiilor de testare, pentru calcularea inhibării procentuale se folosesc probele de control cu solvenți în locul probelor de control fără solvenți.

52.

Randamentul se calculează ca biomasa de la sfârșitul testului minus biomasa de la începutul testului în cazul fiecărui vas de probe de control și probe supuse tratamentului. Pentru fiecare concentrație de testare și probă de control, se calculează o valoare medie a randamentului în paralel cu estimările varianței. Inhibarea procentuală a randamentului ( %Iy) se poate calcula pentru fiecare probă duplicat supusă tratamentului, după cum urmează:

unde:

53.

Se reprezintă grafic procentajul de inhibare în funcție de logaritmul concentrației substanței chimice de testare și se examinează graficul cu atenție, ignorându-se toate punctele de date care au fost indicate ca valori excepționale în prima fază. Punctele de date se unesc printr-o curbă, manual sau prin interpolare computerizată, pentru a se obține o primă impresie asupra relației concentrație-răspuns, apoi se continuă cu o metodă mai detaliată, preferabil o metodă statistică computerizată. În funcție de utilizarea prevăzută a datelor, de calitatea (precizia) și cantitatea de date, precum și de disponibilitatea instrumentelor de analiză a datelor, se poate decide (uneori, bine justificat) oprirea analizei datelor în această etapă și se citesc doar cifrele cheie EC50 și EC10 (și/sau EC20) de pe curba trasată manual (a se vedea și punctul de mai jos despre efectele stimulatorii). Motivele valide de a nu folosi o metodă statistică pot include:

54.

Obiectivul este de a se obține o relație cantitativă concentrație-răspuns prin analiza regresiei. Este posibilă folosirea unei regresii liniare ponderate după ce s-a efectuat o transformare de liniarizare a datelor de răspuns – de exemplu în funcția probit, logit sau unități Weibull (8), dar procedurile de regresie neliniară sunt tehnici preferate, care tratează mai bine inexactitățile inevitabile ale datelor și abaterile de la distribuțiile netede. Când se apropie de zero sau în cazul unei inhibiții totale, aceste inexactități se pot amplifica prin transformare, interferând cu analiza (8). Trebuie remarcat că metodele standard de analiză folosind transformările probit, logit sau Weibull se utilizează în cazul datelor binare (de exemplu date despre mortalitate sau supraviețuire) și trebuie să fie modificate pentru a putea fi aplicate la datele despre creștere sau biomasă. Proceduri specifice de determinare a valorilor ECx pe baza datelor continue se găsesc în lucrările (9), (10) și (11). Utilizarea analizei regresiei neliniare este descrisă mai amănunțit în apendicele 5.

55.

Pentru fiecare variabilă de răspuns de analizat se utilizează relația concentrație-răspuns pentru calcularea estimărilor punctuale ale valorilor ECx. Dacă este posibil, se determină limitele de încredere de 95 % pentru fiecare estimare. Concordanța datelor de răspuns cu modelul de regresie se evaluează în mod grafic sau statistic. Analiza regresiei se efectuează folosind răspunsuri individuale ale probelor duplicat, nu medii ale grupului supuse tratamentului. Dacă totuși interpolarea neliniară este dificilă sau eșuează ca urmare a datelor prea dispersate, problema poate fi ocolită prin efectuarea regresiei pe medii de grup, aceasta fiind o metodă practică de reducere a influenței valorilor excepționale suspectate. Folosirea acestei opțiuni se consemnează în raportul de testare ca abatere de la procedura normală, deoarece regresia curbei pe baza probelor duplicat individuale nu a produs un rezultat corect.

56.

Estimările și limitele de încredere ale EC50 pot fi obținute și folosind interpolarea liniară cu «bootstrap» (13), dacă modelele/metodele de regresie disponibile sunt inadecvate pentru date.

57.

Pentru estimarea LOEC și, prin urmare, a NOEC, pentru efectele substanței chimice de testare asupra vitezei de creștere, este necesară compararea mediilor probelor supuse tratamentului folosind tehnici de analiză a varianței (ANOVA). Media pentru fiecare concentrație trebuie comparată apoi cu media probei de control folosind o metodă de comparare multiplă adecvată sau de testare a tendinței. Testul lui Dunnett sau cel al lui Williams poate fi util în acest sens (12)(14)(15)(16)(17). Este necesar să se evalueze dacă ipoteza ANOVA de omogenitate a varianței se verifică. Această evaluare se poate efectua grafic sau printr-un test formal (17). Teste adecvate sunt cel al lui Levene sau al lui Bartlett. Neîndeplinirea ipotezei de omogenitate a varianțelor poate fi corectată uneori prin transformarea logaritmică a datelor. Dacă eterogenitatea varianței este extremă și nu poate fi corectată prin transformare, se va lua în considerare analiza prin metode precum testele Jonkheere regresive de stabilire a tendinței. Orientări suplimentare privind determinarea NOEC se găsesc în referința (11).

58.

Progresele științifice recente au condus la recomandarea de abandonare a conceptului de NOEC și înlocuirea sa cu estimările punctuale ECx bazate pe regresie. Nu a fost stabilită o valoare adecvată a x pentru acest test cu alge. Un interval cuprins între 10 și 20 % pare a fi adecvat (în funcție de variabila de răspuns aleasă) și se recomandă raportarea atât a EC10, cât și a EC20.

59.

Se observă uneori o stimulare a creșterii (inhibare negativă) la concentrații scăzute. Aceasta poate rezulta fie din hormeză («stimulare toxică»), fie în urma adăugării de factori de creștere stimulatori odată cu materialul de testare în mediul minimal folosit. Trebuie reținut că adăugarea de nutrienți anorganici nu ar trebui să aibă niciun efect direct, deoarece mediul de testare ar trebui să își mențină un surplus de nutrienți pe parcursul întregului test. Stimularea cu doze scăzute poate fi ignorată de obicei în calculele EC50 cu excepția cazurilor când este extremă. Cu toate acestea, dacă este extremă sau trebuie să se calculeze o valoare ECx pentru x scăzut, pot fi necesare proceduri speciale. Ștergerea răspunsurilor stimulatorii din analiza datelor ar trebui să fie evitată dacă este posibil, iar dacă software-ul disponibil de interpolare a curbei nu poate accepta o stimulare minoră, se poate utiliza interpolarea liniară cu «bootstrap». Dacă stimularea este extremă, poate fi luată în considerare folosirea unui model hormetic (18).

60.

Materialele de testare fotoabsorbante pot determina o reducere a vitezei de creștere, deoarece umbra reduce cantitatea de lumină disponibilă. Astfel de tipuri de efecte fizice trebuie să fie separate de efectele toxice prin modificarea condițiilor de testare, iar primele se raportează separat. Orientări în acest sens se găsesc în lucrările (2) și (3).

61.

Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații:

(1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality – Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442. Water quality – Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality – Sampling – Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1.

Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 209 (2010). Această metodă de testare descrie o metodă de determinare a efectelor unei substanțe chimice asupra microorganismelor din nămolul activ (în mare parte bacterii) prin măsurarea vitezei de respirație (oxidarea carbonului și/sau a amoniului) în condiții definite, în prezența a diferite concentrații ale substanței chimice de testare. Metoda de testare se bazează pe testul ETAD – Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing Industry (Asociația ecologică și toxicologică a producătorilor de coloranți) (1) ( 2), pe Orientarea anterioară a OCDE TG nr. 209 (3) și pe standardul ISO 8192 revizuit (4). Obiectivul acestui test este furnizarea unei metode de evaluare rapide a efectelor substanțelor chimice asupra microorganismelor din nămolul activ în etapa biologică (aerobă) a stațiilor de epurare a apelor uzate. Rezultatele testului pot, de asemenea, să indice concentrațiile neinhibitorii ale substanțelor chimice de testare care se utilizează în testele de biodegradabilitate (de exemplu capitolele C.4 A-F, C.9, C.10, C12 și C.29 din prezenta anexă, Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 302C). În acest caz, testul poate fi realizat ca un test de depistare, similar unui test de stabilire a intervalului sau unui test la valori-limită (a se vedea punctul 39), luând în considerare numai respirația totală. Cu toate acestea, aceste informații trebuie luate în considerare cu precauție pentru testele de biodegradabilitate rapidă (capitolele C.4 A-F și C.29 ale prezentei anexe) pentru care concentrația inoculului este semnificativ mai scăzută decât cea utilizată în prezenta metodă de testare. Într-adevăr, absența inhibiției în acest test de respirație nu are ca rezultat automat condițiile neinhibitorii din testele de biodegradabilitate rapidă din capitolul C.4 A-F sau C.29 al prezentei anexe.

2.

În general, testul de inhibare a respirației pare să fi fost aplicat cu succes de la prima sa publicare, însă în câteva cazuri au fost raportate rezultate eronate, de exemplu (2) (4) (5). Curbele de respirație în funcție de concentrație sunt uneori bifazice, graficele doză-răspuns au fost denaturate, iar valorile EC50 au fost neașteptat de scăzute (5). Cercetările au arătat că aceste rezultate apar atunci când nămolul activ utilizat pentru test este puternic nitrificant și când substanța chimică de testare are un efect mai puternic asupra oxidării amoniului decât asupra oxidării heterotrofe generale. Prin urmare, aceste rezultate eronate pot fi evitate prin realizarea unui test suplimentar utilizând un inhibitor specific al nitrificării. Prin măsurarea oxigenului consumat în prezența și în absența unui astfel de inhibitor, de exemplu N-aliltioureea (ATU), poate fi calculat separat consumul de oxigen total, heterotrof și legat de nitrificare (4) (7) (8). Astfel efectele inhibitorii ale unei substanțe chimice de testare asupra celor două procese pot fi determinate și valorile EC50 atât pentru oxidarea carbonului organic (heterotrofă), cât și pentru oxidarea amoniului (nitrificare) pot fi calculate prin metoda clasică. Trebuie avut în vedere că în anumite cazuri rare, efectul inhibitor al N-aliltioureei poate fi anulat parțial sau complet dacă aceasta formează complexe cu substanțele chimice de testare sau cu adjuvanții de mediu, de exemplu ioni Cu++ (6). Ionii Cu++ sunt esențiali pentru Nitrosomonas, dar sunt toxici în concentrații mai mari.

3.

Nevoia de nitrificare pentru epurarea aerobă a apelor uzate, ca etapă necesară a procesului de eliminare a compușilor de azot din apele uzate prin denitrificarea în produse gazoase, a devenit urgentă în special în țările europene; UE a stabilit limite mai scăzute pentru concentrația de azot din efluenții tratați deversați în corpurile de apă receptoare (5).

4.

În general metoda de evaluare doar a efectului asupra proceselor de oxidare a carbonului organic este adecvată. Totuși, în unele cazuri, pentru a interpreta rezultatele și a înțelege efectele este necesară o examinare a efectului doar asupra nitrificării sau a efectului asupra nitrificării și a oxidării carbonului organic separat.

5.

Vitezele de respirație ale probelor de nămol activ alimentate cu apă uzată sintetică sunt măsurate într-o celulă ermetică care conține un electrod de oxigen după o perioadă de contact de 3 ore. În funcție de un scenariu de expunere realist, ar putea fi adecvat un timp de contact mai îndelungat. Dacă substanța chimică de testare se degradează rapid, de exemplu abiotic prin hidroliză, sau este volatilă și concentrația nu poate fi menținută la un nivel adecvat, se poate utiliza suplimentar o perioadă de expunere mai scurtă, de exemplu de 30 de minute. Sensibilitatea fiecărui lot de nămol activ ar trebui verificată cu o substanță chimică de referință adecvată în ziua expunerii. Testul se utilizează în general pentru a determina ECx (de exemplu, EC50) a substanței chimice de testare și/sau a concentrației la care nu se observă niciun efect (NOEC).

6.

Inhibarea consumului de oxigen al microorganismelor care oxidează carbonul organic poate fi exprimată separat de cea a microorganismelor care oxidează amoniul prin măsurarea vitezelor consumului de oxigen în absența și în prezența N-aliltioureei, un inhibitor specific al oxidării amoniului în nitrit de către bacteriile nitrificante din prima etapă. În acest caz, procentajul de inhibare a vitezei consumului de oxigen se calculează prin compararea vitezei consumului de oxigen în prezența unei substanțe chimice de testare cu viteza medie a consumului de oxigen al probelor de control care nu conțin nicio substanță chimică de testare, atât în prezența, cât și în absența inhibitorului specific, N-aliltioureea.

7.

Orice consum de oxigen generat de procese abiotice poate fi detectat prin determinarea vitezei în amestecuri formate din substanța chimică de testare, apă uzată sintetică și apă, omițând nămolul activ.

8.

Pentru o interpretare corectă a rezultatelor ar trebui să se cunoască identitatea (de preferat numărul CAS), numele (IUPAC), puritatea, solubilitatea în apă, presiunea de vapori, volatilitatea și caracteristicile de adsorbție ale substanței chimice de testare. În mod normal, substanțele chimice volatile nu pot fi testate în mod adecvat fără luarea unor măsuri de precauție speciale (a se vedea punctul 21).

9.

Metoda de testare poate fi aplicată substanțelor chimice solubile în apă, puțin solubile și volatile. Cu toate acestea, se poate să nu fie întotdeauna posibilă obținerea valorilor EC50 cu substanțe chimice cu solubilitate limitată, iar cu substanțe chimice volatile pot fi obținute rezultate valide numai cu condiția ca marea parte (de exemplu > 80 %) a substanței chimice de testare să rămână în amestecul de reacție la sfârșitul perioadei (perioadelor) de expunere. Atunci când există incertitudini referitoare la stabilitatea sau volatilitatea substanței chimice de testare, ar trebui prezentate date analitice suplimentare pentru a rafina concentrația ECx.

10.

Substanțele chimice de referință ar trebui testate periodic pentru a se garanta fiabilitatea metodei de testare și a condițiilor de testare și pentru a verifica sensibilitatea fiecărui lot de nămol activ utilizat ca inocul microbian în ziua expunerii. Substanța chimică recomandată ca substanță chimică inhibitoare de referință este 3,5-diclorfenolul (3,5-DCP), întrucât este un cunoscut inhibitor al respirației și este utilizat în multe tipuri de teste de inhibare/toxicitate (4). Sulfatul de cupru (II) pentahidrat poate fi, de asemenea, utilizat ca substanță chimică de referință pentru inhibarea respirației totale (9). N-metilanilina poate fi utilizată ca inhibitor de referință specific al nitrificării (4).

11.

Viteza consumului de oxigen al probelor de control neutre (fără substanță chimică de testare sau de referință) nu ar trebui să fie mai mică de 20 mg de oxigen per gram de nămol activ (greutatea uscată a solidelor în suspensie) pe oră. Dacă viteza este mai mică, testul ar trebui repetat cu nămol activ spălat sau cu nămol din altă sursă. Coeficientul de variație al vitezei consumului de oxigen la probele de control duplicate nu ar trebui să fie mai mare de 30 % la încheierea testului final.

12.

În cadrul unui ring test internațional organizat în 2004 de ISO (4) utilizând nămol activ derivat din apele uzate menajere, s-a constatat că EC50 a 3,5-DCP este cuprinsă între 2 mg/l și 25 mg/l pentru respirația totală, între 5 mg/l și 40 mg/l pentru respirația heterotrofă și între 0,1 mg/l și 10 mg/l pentru respirația legată de nitrificare. Dacă EC50 a 3,5-DCP nu se încadrează în intervalul așteptat, testul ar trebui repetat cu nămol activ din altă sursă. EC50 a sulfatului de cupru (II) pentahidrat ar trebui să se încadreze în intervalul 53-155 mg/l pentru respirația totală (9).

13.

Trebuie utilizate echipamentele obișnuite de laborator și următoarele:

14.

Pe parcursul întregului test se utilizează reactivi de puritate analitică.

15.

Se utilizează apă distilată sau deionizată care să conțină sub 1mg/l de COD, cu excepția cazurilor în care se specifică utilizarea de apă fără clor de la robinet.

16.

Mediul ar trebui preparat astfel încât să conțină următorii constituenți în cantitățile specificate:

17.

PH-ul acestei soluții trebuie să fie de 7,5 ± 0,5. Dacă mediul preparat nu se utilizează imediat, acesta ar trebui depozitat la întuneric la o temperatură cuprinsă între 0 °C și 4 °C timp de cel mult 1 săptămână sau în condiții care nu îi modifică compoziția. Trebuie avut în vedere că această apă uzată sintetică este de 100 de ori mai concentrată decât cea descrisă în raportul tehnic al OCDE «Metodă propusă pentru determinarea biodegradabilității agenților tensioactivi folosiți la detergenții sintetici» din 11 iunie 1976 și conține în plus fosfat acid dipotasic.

18.

În mod alternativ, componentele mediului pot fi sterilizate individual înainte de depozitare sau peptona și extractul de carne pot fi adăugate puțin înainte de efectuarea testului. Înainte de utilizare, mediul trebuie bine amestecat, iar pH-ul trebuie ajustat la 7,5 ± 0,5, dacă este cazul.

19.

Trebuie pregătită o soluție stoc pentru substanțele de testare ușor solubile în apă numai până la solubilitatea maximă în apă (precipitatele nu sunt acceptate). Substanțele puțin solubile în apă, amestecurile ale căror componente au solubilități diferite în apă și substanțele adsorbante trebuie cântărite direct în vasele de testare. În aceste cazuri, utilizarea soluțiilor stoc poate fi o alternativă dacă concentrațiile dizolvate ale substanțelor chimice de testare sunt determinate analitic în vasele de testare (înainte de adăugarea nămolului activ). Dacă se prepară fracțiuni adaptate la apă (WAF), este esențială și determinarea analitică a concentrațiilor dizolvate ale substanțelor chimice de testare în vasele de testare. Trebuie evitată utilizarea de solvenți organici, agenți de dispersie/emulgatori pentru îmbunătățirea solubilității. Ultrasonicarea soluțiilor stoc și agitarea prealabilă a suspensiilor, de exemplu peste noapte, sunt posibile atunci când sunt disponibile informații adecvate privind stabilitatea substanței chimice de testare în astfel de condiții.

20.

Substanța chimică de testare poate afecta pH-ul din sistemul de testare. pH-ul amestecurilor tratate cu substanța chimică de testare ar trebui determinat înainte de efectuarea testului, în cadrul unui test preliminar, pentru a stabili dacă va fi necesară ajustarea pH-ului înainte de testul principal și din nou în ziua efectuării testului principal. Soluțiile/suspensiile apoase ale substanței chimice de testare trebuie neutralizate înainte de adăugarea inoculului, dacă este necesar. Cu toate acestea, având în vedere că neutralizarea poate modifica proprietățile chimice ale substanței chimice, pot fi efectuate, în funcție de scop, teste suplimentare pentru evaluarea efectului substanței chimice de testare asupra nămolului fără ajustarea pH-ului.

21.

Efectele toxice ale substanțelor chimice volatile, în special în testele în care aerul este barbotat în sistem, pot avea intensități diferite din cauza pierderilor de substanță de pe parcursul perioadei de expunere. În cazul acestor substanțe sunt necesare măsuri de precauție precum efectuarea unei analize specifice ale substanțelor din amestecurile de control care conțin substanța și modificarea regimului de aerare.

22.

Dacă substanța chimică de referință utilizată este 3,5-diclorfenolul, se prepară o soluție de 1,00 g de 3,5-diclorfenol în 1 000 ml de apă (15). Pentru accelerarea dizolvării trebuie utilizată apă caldă/ultrasonicarea, soluția ajungând la volumul său final numai după răcirea la temperatura camerei. Trebuie asigurat totuși faptul că structura substanței chimice de referință nu este modificată. PH-ul soluției trebuie verificat și ajustat, dacă este necesar, cu NaOH sau H2SO4 până la un pH de 7-8.

23.

Dacă substanța chimică de referință utilizată este sulfatul de cupru (II) pentahidrat, se utilizează concentrații de 58 mg/l, 100 mg/l și 180 mg/l (factor de 1,8). Substanța se cântărește direct în vasele de testare (29, 50 și 90 mg pentru un volum total de 500 ml). Apoi se dizolvă în 234 ml de apă de la robinet sterilizată în autoclavă. Sulfatul de cupru (II) pentahidrat este ușor solubil. Când se începe testul, se adaugă 16 ml de apă uzată sintetică și 250 ml de nămol activ.

24.

Se prepară o soluție stoc de N-aliltiouree (ATU) cu o concentrație de 2,32 g/l. Adăugarea a 2,5 ml din această soluție stoc într-un amestec de incubare cu volum final de 500 ml are ca rezultat o concentrație de ATU de 11,6 mg/l (10– 4mol/l), despre care se știe că este suficientă (4) pentru a inhiba 100 % nitrificarea dintr-un nămol activ nitrificant care conține 1,5 g/l de solide în suspensie.

25.

În unele condiții rare, o substanță chimică de testare puternic reductoare poate antrena un consum de oxigen abiotic măsurabil. În aceste cazuri sunt necesare probe de control abiotice pentru a face distincția între consumul de oxigen abiotic al substanței chimice de testare și respirația microbiană. Probele de control abiotice pot fi preparate prin eliminarea inoculului din amestecurile de testare. În mod similar, atunci când se realizează măsurători analitice de sprijin, pot fi incluse probe de control abiotice pentru a determina concentrația obținută pe parcursul etapei de expunere a testului, de exemplu, atunci când se utilizează soluții stoc de substanțe chimice puțin solubile în apă cu componente având solubilitate diferită în apă. În cazuri specifice, poate fi necesară prepararea unei probe de control abiotice cu inocul sterilizat (de exemplu prin autoclavare sau prin adăugarea de agenți toxici sterilizanți). Anumite substanțe chimice pot produce sau consuma oxigen numai dacă suprafața este destul de mare pentru reacție, chiar dacă pentru acest lucru au în mod obișnuit nevoie de o temperatură sau o presiune mult mai ridicată. În această privință, trebuie acordată o atenție specială substanțelor peroxidice. Un inocul sterilizat prezintă o suprafață mare.

26.

Pentru utilizare generală, nămolul activ se colectează la ieșirea sau aproape de ieșirea bazinului de aerare al unei stații de epurare a apelor uzate bine exploatate care este alimentată predominant cu ape uzate menajere. În funcție de scopul testului, pot fi utilizate și alte tipuri sau surse adecvate de nămol activ, de exemplu, nămolul crescut în laborator la concentrații adecvate de solide în suspensie cuprinse între 2 g/l și 4 g/l. Cu toate acestea, nămolurile provenind de la stații de epurare diferite pot prezenta caracteristici și sensibilități diferite.

27.

Nămolul poate fi utilizat ca atare, însă particulele mari trebuie eliminate prin limpezire pentru o perioadă scurtă, 5-15 minute, și prin decantarea stratului superior de solide fine sau strecurare (de exemplu, sită de 1 mm2 ). O altă variantă ar fi omogenizarea nămolului într-un blender timp de cca 15 secunde sau mai mult, însă trebuie acordată atenție forțelor de forfecare și modificărilor temperaturii care pot apărea în cazul perioadelor lungi de amestecare.

28.

Spălarea nămolului este adesea necesară, de exemplu, dacă viteza de respirație endogenă este scăzută. Nămolul trebuie să fie mai întâi centrifugat pentru o anumită perioadă pentru a produce un lichid supernatant limpede și granule de solide din apa uzată, de exemplu 10 minute la cca 10 000 m/s2. Lichidul supernatant se elimină, iar nămolul este repus în suspensie prin agitare în apă de la robinet fără clor. Această apă de spălare trebuie apoi eliminată prin recentrifugare. Procesul de spălare și centrifugare se repetă, dacă este necesar. Trebuie determinată masa uscată a unui volum cunoscut de nămol repus în suspensie, iar nămolul trebuie concentrat prin eliminarea lichidului sau diluat în apă de la robinet fără clor pentru a obține concentrația de solide necesară a nămolului, adică 3 g/l. Nămolul activ trebuie aerat în mod constant (de exemplu, 2 l/minut) la temperatura de testare și, dacă este posibil, trebuie utilizat în ziua colectării. Dacă acest lucru nu este posibil, nămolul trebuie alimentat zilnic cu apă uzată sintetică (50 ml de apă uzată sintetică/l de nămol activ) timp de încă două zile. Apoi nămolul este utilizat pentru test și rezultatele sunt acceptate ca fiind valabile, cu condiția să nu fi avut loc nicio modificare semnificativă a activității sale, evaluată prin intermediul vitezei de respirație heterotrofă endogenă și a vitezei de respirație legată de nitrificare.

29.

În cazul în care pe parcursul incubației se produce spumă, pot apărea dificultăți în sensul că spuma și solidele din nămol pe care le conține se pot revărsa din vasele de aerare. Ocazional, formarea spumei poate fi cauzată pur și simplu de prezența apei uzate sintetice, însă, în cazul în care substanța chimică de testare conține un agent tensioactiv, acest fenomen trebuie anticipat. Pierderea solidelor din nămolul din amestecurile de testare va avea ca rezultat viteze de respirație reduse artificial care ar putea fi interpretate greșit ca rezultat al inhibării. În plus, aerarea soluției de agenți tensioactivi concentrează acești agenți în stratul de spumă; pierderea spumei din sistemul de testare va reduce concentrațiile de expunere. Formarea spumei poate fi ținută sub control prin metode mecanice simple (de exemplu, agitarea manuală ocazională cu ajutorul unei tije de sticlă) sau prin adăugarea unui agent antispumant pe bază de emulsie siliconată fără agenți tensioactivi și/sau utilizarea metodei de aerare prin agitarea flaconului. Dacă problema este legată de prezența apei uzate sintetice, compoziția apei uzate trebuie modificată prin adăugarea unui reactiv antispumant într-o proporție de 50 μl/l, de exemplu. Dacă formarea spumei este cauzată de substanța chimică de testare, trebuie determinată cantitatea necesară pentru topirea spumei la concentrația maximă de testare, după care fiecare dintre vasele de aerare trebuie tratate în mod identic (inclusiv cele în care nu există spumă, cum ar fi probele de control neutre și vasele de referință). Dacă se utilizează agenți antispumanți, nu trebuie să existe nicio reacție cu inoculul și/sau cu substanța chimică de testare.

30.

Poate fi determinată inhibarea a trei tipuri de consum de oxigen: total, exclusiv heterotrof și legat de nitrificare. În mod normal, este adecvată măsurarea inhibării consumului total de oxigen. Efectele asupra consumului heterotrof de oxigen din oxidarea carbonului organic și din oxidarea amoniului sunt necesare atunci când există o cerință specifică privind calcularea acestor două efecte distincte pentru o anumită substanță chimică sau (opțional) pentru a explica curbele doză-răspuns atipice rezultate din inhibarea consumului total de oxigen.

31.

Testul ar trebui efectuat la o temperatură de 20 ± 2 °C.

32.

Amestecurile de testare (FT ca în tabelul 1) conținând apă, apă uzată sintetică și substanța chimică de testare se prepară astfel încât să se obțină diferite concentrații nominale ale substanței chimice de testare (a se vedea tabelul 1 pentru exemple de volum al constituenților). Dacă este necesar, pH-ul trebuie ajustat la 7,5 ± 0,5; se diluează amestecurile cu apă și se adaugă inoculul pentru a obține volume finale egale în vase și pentru a începe aerarea.

33.

Amestecurile (FR) trebuie preparate cu substanța chimică de referință, de exemplu 3,5-diclorfenol, în locul substanței chimice de testare, în același mod ca amestecurile de testare.

34.

Probele de control neutre (FB) ar trebui preparate la începutul și la sfârșitul perioadei de expunere pentru testele în care paharele de testare sunt pregătite secvențial la intervale regulate. În testele care utilizează echipamente care permit efectuarea de măsurători simultane ale consumului de oxigen, trebuie incluse cel puțin două probe de control neutre în fiecare lot de analiză simultană. Probele de control neutre conțin un volum egal de nămol activ și de mediu sintetic, însă nu conțin substanță chimică de testare sau de referință. Acestea trebuie diluate cu apă în același volum ca amestecurile de testare și de referință.

35.

Dacă este necesar, de exemplu, dacă se știe sau se suspectează că o substanță chimică de testare are proprietăți reductoare puternice, trebuie preparat un amestec FA pentru a măsura consumul abiotic de oxigen. Amestecul trebuie să conțină aceleași cantități de substanță chimică de testare și de apă uzată sintetică și același volum ca amestecurile de testare, însă fără nămol activ.

36.

Amestecurile de testare, amestecurile de referință și probele de control neutre și abiotice se incubează la temperatura de testare în condiții de aerare forțată (0,5-1 l/min) pentru a păstra concentrația de oxigen dizolvat la o saturație de peste 60-70 % și pentru a menține flocoanele de nămol în suspensie. Agitarea culturilor este, de asemenea, necesară pentru a menține flocoanele de nămol în suspensie. Se consideră că incubarea începe odată cu contactul inițial dintre inoculul din nămolul activ și ceilalți constituenți ai amestecului final. La finalul incubării, după timpii de expunere specificați, în general de 3 ore, se extrag eșantioane pentru a măsura viteza de descreștere a concentrației de oxigen dizolvat în celula destinată acestui scop (fig. 2 din apendicele 3) sau în vasul CBO umplut complet. Modul în care încep incubările depinde și de capacitatea echipamentelor utilizate de a măsura viteza consumului de oxigen. De exemplu, dacă echipamentul cuprinde o singură sondă de oxigen, măsurătorile se realizează individual. În acest caz, se prepară diferitele amestecuri necesare pentru testarea în apă uzată sintetică însă fără a adăuga inoculul, iar cantitățile de nămol necesare se adaugă în fiecare vas din serie. Incubările se încep pe rând la intervale de timp adecvate de 10-15 minute, de exemplu. În mod alternativ, sistemul de măsurare poate cuprinde mai multe sonde care facilitează măsurătorile simultane multiple; în acest caz, inoculul poate fi adăugat în același timp în grupurile de vase adecvate.

37.

Concentrația nominală de nămol activ din toate amestecurile de testare, de referință și neutre (dar nu și din probele de control abiotice) este de 1,5 g/l de solide în suspensie. Consumul de oxigen se măsoară după 3 ore de expunere. Dacă este cazul, se realizează măsurători după 30 de minute de expunere suplimentară, conform descrierii de la punctul 5 de mai sus.

38.

Pentru a stabili dacă nămolul nitrifică și, în caz afirmativ, cu ce viteză, trebuie preparate amestecuri (FB) similare amestecurilor de control neutre și amestecuri «de control» suplimentare (FN), dar care conțin și N-aliltiouree în concentrație de 11,6 mg/l. Amestecurile trebuie aerate și incubate la 20 °C ± 2 °C timp de 3 ore. Apoi trebuie măsurată viteza consumului de oxigen și trebuie calculată viteza consumului de oxigen legat de nitrificare.

39.

Atunci când este necesar, se utilizează un test preliminar pentru a estima intervalul concentrațiilor substanței chimice de testare necesare pentru un test final de determinare a inhibării consumului de oxigen. Alternativ, absența inhibării consumului de oxigen de către substanța chimică de testare într-un test preliminar poate demonstra inutilitatea unui test final, însă trebuie incluse triplicate la cea mai mare concentrație testată în testul preliminar (în general 1 000 mg/l, însă depinde de cerințele de date).

Tabelul 1

Exemple de amestecuri pentru testul preliminar

40.

Testul trebuie efectuat utilizând cel puțin trei concentrații ale substanței chimice de testare, de exemplu, 10 mg/l, 100 mg/l și 1 000 mg/l cu o probă de control neutră și, dacă este necesar, cel puțin trei probe de control abiotice cu cea mai mare concentrație a substanței chimice de testare (a se vedea drept exemplu tabelul 1). În mod ideal, concentrația cea mai scăzută nu ar trebui să aibă niciun efect asupra consumului de oxigen. Trebuie calculate vitezele de consum al oxigenului și viteza de nitrificare, dacă este relevantă; apoi se calculează procentajul de inhibare. În funcție de scopul testului, este de asemenea posibil să se determine doar toxicitatea unei concentrații-limită, de exemplu 1 000 mg/l. Dacă la această concentrație nu se produce niciun efect toxic semnificativ din punct de vedere statistic, nu mai sunt necesare alte teste la concentrații mai mari sau mai mici. Trebuie avut în vedere că substanțele puțin solubile în apă, amestecurile ale căror componente au solubilități diferite în apă și substanțele adsorbante trebuie cântărite direct în vasele de testare. În acest caz, volumul rezervat pentru soluția stoc de substanță de testare trebuie înlocuit cu apă de diluție.

41.

Testul trebuie realizat utilizând un interval de concentrații dedus din testul preliminar. Pentru a obține atât o NOEC, cât și o ECx (de exemplu EC50), se recomandă, în cele mai multe cazuri, șase probe de control și cinci concentrații de tratare într-o serie geometrică având cinci probe duplicat. Proba de control abiotică nu trebuie repetată dacă în testul preliminar nu a existat consum de oxigen, însă, în cazul în care are loc un consum semnificativ, trebuie incluse probe de control abiotice pentru fiecare concentrație a substanței chimice de testare. Sensibilitatea nămolului se verifică utilizând substanța chimică de referință 3,5-diclorfenol. Sensibilitatea nămolului se verifică pentru fiecare serie de testare, deoarece se știe că sensibilitatea fluctuează. În toate cazurile, se extrag eșantioane din vasele de testare după 3 ore sau după 3 ore și 30 de minute, dacă este necesar, pentru a măsura viteza consumului de oxigen din celula cu electrod de oxigen. Din datele colectate, se calculează vitezele de respirație specifice ale amestecurilor de control și de testare; ulterior se calculează procentajul de inhibare utilizând ecuația 7 de mai jos.

42.

Utilizarea inhibitorului specific al nitrificării, ATU, permite evaluarea directă a efectelor inhibitorii ale substanțelor chimice de testare asupra oxidării heterotrofe, iar prin scăderea vitezei consumului de oxigen în prezența ATU din viteza de consum totală (fără ATU) pot fi calculate efectele asupra vitezei de nitrificare. Se prepară două seturi de amestecuri de reacție, conform protocoalelor de test pentru ECx sau NOEC descrise la punctul 41, dar se adaugă ATU în fiecare amestec dintr-un set, la o concentrație finală de 11,6 mg/l, care s-a demonstrat că inhibă complet nitrificarea în nămolul cu concentrații de solide în suspensie de până la 3 000 mg/l (4). Vitezele consumului de oxigen trebuie măsurate după perioada de expunere; aceste valori directe reprezintă doar respirația heterotrofă, iar diferențele dintre acestea și vitezele de respirație totale corespunzătoare reprezintă nitrificarea. Se calculează apoi diferitele grade de inhibare.

43.

După perioada (perioadele) de expunere, un eșantion din primul vas de aerare trebuie transferat în celula cu electrod de oxigen (fig. 1 din apendicele 2), iar concentrația oxigenului dizolvat trebuie măsurată imediat. Dacă este disponibil un sistem cu mai mulți electrozi, măsurătorile se pot efectua simultan. Este esențială agitarea (cu ajutorul unui magnet acoperit) la aceeași viteză utilizată pentru calibrarea electrodului pentru a asigura faptul că sonda răspunde cu întârziere minimă la variațiile de concentrație a oxigenului și pentru a garanta regularitatea și reproductibilitatea măsurătorilor în vasul de măsurare. În general este adecvat sistemul cu sondă autoagitatoare format din câțiva electrozi de oxigen. Între măsurători, celula trebuie clătită cu apă. Alternativ, eșantionul poate fi folosit pentru umplerea unui vas CBO (fig. 2 din apendicele 3) prevăzut cu un agitator magnetic. Apoi trebuie introdusă o sondă de oxigen cu adaptor de tip manșon în gâtul vasului și trebui pornit agitatorul magnetic. În ambele cazuri, concentrația de oxigen dizolvat trebuie măsurată în mod continuu și înregistrată pentru o anumită perioadă, de obicei 5-10 minute, sau până când concentrația de oxigen scade sub 2 mg/l. Electrodul trebuie scos, amestecul trebuie turnat înapoi în vasul de aerare, continuând aerarea și agitarea, în cazul în care este necesară măsurarea după o perioadă mai lungă de expunere.

44.

Pentru anumite scopuri, poate fi necesară măsurarea concentrației substanței chimice de testare în vasele de testare. Trebuie avut în vedere că dacă se utilizează soluții stoc de:

fracțiunea dizolvată nu se cunoaște, iar concentrația reală a substanței chimice de testare transferate în vasele de testare rămâne necunoscută. Pentru a caracteriza expunerea, este necesară o estimare analitică a concentrațiilor substanței chimice de testare în vasele de testare. Pentru a simplifica lucrurile, estimarea analitică trebuie făcută înainte de a adăuga inoculul. Din cauza faptului că numai fracțiunile dizolvate vor fi transferate în vasele de testare, concentrațiile măsurate pot fi foarte scăzute.

45.

Pentru a evita analizele îndelungate și costisitoare, se recomandă simpla cântărire a substanței chimice de testare direct în vasele de testare și utilizarea concentrației nominale inițiale corespunzătoare acestei mase ca referință pentru calculele ulterioare. Nu este necesară o distincție între fracțiunile dizolvată, nedizolvată sau adsorbită ale substanței chimice, deoarece toate aceste fracțiuni apar și în condiții normale în stația de epurare a apelor uzate și pot varia în funcție de compoziția apelor uzate. Obiectivul acestei metode de testare este de a obține o estimare realistă a concentrației neinhibitoare și nu este adecvată pentru a studia în detaliu fracțiunile care contribuie la inhibarea organismelor din nămolul activ. În final, ar trebui cântărite direct în vasele de testare și substanțele adsorbante, iar vasele trebuie silanizate pentru a reduce la minimum pierderile prin adsorbție.

46.

Vitezele consumului de oxigen se calculează pornind de la media valorilor măsurate, de exemplu, pornind de la partea liniară a graficelor concentrației oxigenului în funcție de timp, limitând calculele la concentrațiile oxigenului cuprinse între 2,0 mg/l și 7,0 mg/l, întrucât concentrațiile mai mari și mai mici pot influența vitezele de consum. Incursiunea în benzile de concentrație superioare sau inferioare acestor valori este uneori inevitabilă și necesară, de exemplu, atunci când respirația este puternic inhibată și prin urmare foarte lentă sau dacă un anumit nămol activ respiră foarte repede. Acest demers este acceptabil cu condiția ca secțiunile extinse ale graficului de viteză să fie drepte, iar gradienții să nu se modifice atât timp cât traversează limitele de 2,0 mg/l sau 7,0 mg/l O2. Orice secțiune curbată a graficului indică faptul că sistemul de măsurare se stabilizează sau că viteza de consum se modifică și nu ar trebui utilizate pentru calcularea vitezelor de respirație. Viteza consumului de oxigen trebuie exprimată în miligrame per litru pe oră (mg/lh) sau în miligrame per gram de nămol uscat pe oră (mg/gh). Viteza consumului de oxigen, R, în mg/lh, poate fi calculată sau interpolată plecând de la partea liniară a graficului de descreștere a cantității de oxigen în conformitate cu ecuația 1:

unde:

47.

Viteza de respirație specifică (Rs) este exprimată ca fiind cantitatea de oxigen consumată per g de masă uscată de nămol pe oră (mg/gh) în conformitate cu ecuația 2:

unde SS este concentrația de solide în suspensie din amestecul de testare (g/l).

48.

Diferiții indici ai R care pot fi combinați sunt:

49.

Relația dintre respirația totală (RT), respirația legată de nitrificare (RN) și respirația heterotrofă (RH) se obține din ecuația 3:

unde:

50.

Această relație este valabilă pentru valorile probelor de control neutre (RNB, RTB, RHB), probele de control abiotice (RNA, RTA, RHA) și determinările cu substanțele chimice de testare (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Vitezele de respirație specifice se calculează pornind de la:

51.

Dacă RN este nesemnificativă (de exemplu < 5 % din RT a probelor de control neutre) într-un test preliminar, se poate presupune că consumul de oxigen heterotrof este egal cu consumul total și că nu se produce nitrificare. Dacă testele trebuie să țină cont de efectele asupra microorganismelor heterotrofe și nitrificante, este necesară o altă sursă de nămol activ. Dacă există dovezi ale unor viteze ale consumului de oxigen inhibate cu diferite concentrații ale substanței chimice de testare, se realizează un test final.

52.

Procentajul de inhibare, IT, a consumului total de oxigen la fiecare concentrație a substanței chimice de testare se obține din ecuația 7:

53.

În mod similar, procentajul de inhibare a consumului heterotrof de oxigen, IH, la fiecare concentrație a substanței chimice de testare se obține din ecuația 8:

54.

În final, inhibarea consumului de oxigen legat de nitrificare, IN, la fiecare concentrație se obține din ecuația 9:

55.

Procentajul de inhibare a consumului de oxigen se reprezintă grafic în funcție de logaritmul concentrației substanței chimice de testare (curba inhibării, a se vedea fig. 3 din apendicele 4). Curbele inhibării se reprezintă grafic pentru fiecare perioadă de aerare de 3 ore sau de 3 ore și 30 de minute. Concentrația substanței chimice de testare care inhibă consumul de oxigen cu 50 % (EC50) trebuie calculată sau interpolată din grafic. Dacă sunt disponibile date adecvate, se pot calcula sau interpola limitele de încredere de 95 % ale EC50, panta curbei și valorile adecvate pentru a reprezenta începutul inhibării (de exemplu, EC10 sau EC20) și finalul intervalului de inhibare (de exemplu, EC80 sau EC90).

56.

Trebuie avut în vedere că din cauza variabilității rezultatelor observate adesea, în multe cazuri poate fi suficientă exprimarea suplimentată a rezultatelor în ordinul de mărime, de exemplu:

57.

Valorile ECx, inclusiv limitele de încredere de 95 % inferioare și superioare corespunzătoare parametrului se calculează utilizând metodele statistice adecvate [de exemplu, analiza probit, funcția logistică sau Weibull, metoda simplificată Spearman-Karber sau simpla interpolare (11)]. O valoare ECx se obține prin inserarea unei valori corespunzătoare cu x % din media etaloanelor în ecuația respectivă. Pentru calcularea valorii EC50 sau a unei alte valori ECx, mediile per tratament (x) trebuie supuse unei analize de regresie.

58.

În cazul în care se intenționează determinarea valorii NOEC prin analiză statistică, sunt necesare statistici pentru fiecare vas (fiecare vas este considerat duplicat). Trebuie utilizate metode statistice adecvate conform Documentului OCDE intitulat «Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application» (11). În general, efectele adverse ale substanței chimice de testare în raport cu proba de control sunt analizate cu ajutorul unei testări a ipotezei unilaterale (inferioare) la p ≤ 0,05.

59.

Raportul de testare trebuie să conțină următoarele informații:

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. și Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. și Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test – acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1.

Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 221 (2006). Aceasta a fost concepută pentru a evalua toxicitatea substanțelor chimice asupra plantelor acvatice de apă dulce din genul Lemna (lintiță). Se bazează pe metodele (1)(2)(3)(4)(5)(6) existente, dar include modificări ale acestor metode pentru a reflecta cercetările și consultările recente asupra unei serii de aspecte-cheie. Prezenta metodă de testare a fost validată printr-un ring test internațional (7).

2.

Prezenta metodă de testare descrie testarea toxicității prin folosirea Lemna gibba și Lemna minor, care au fost ambele studiate pe larg și fac obiectul standardelor menționate mai sus. Taxonomia speciilor de Lemna este dificilă, fiind complicată de existența unei game largi de fenotipuri. Deși în cazul Lemna se poate manifesta o variabilitate genetică în ceea ce privește răspunsul față de substanțele toxice, în prezent nu există date suficiente despre această sursă de variabilitate pentru a se recomanda folosirea unei anumite clone pentru această metodă de testare. Trebuie reținut că testul nu se desfășoară în condiții axenice, dar sunt luate măsuri de reducere la minimum a contaminării cu alte organisme în timpul procedurii de testare.

3.

Sunt descrise detaliile privind testarea cu reînnoire (semistatică și în regim dinamic) și fără reînnoire (statică) a soluției de testare. În funcție de obiectivele testului și de cerințele de reglementare, se recomandă aplicarea metodei semistatice și a metodei dinamice, de exemplu pentru substanțe chimice care se pierd cu rapiditate din soluție ca urmare a volatilizării, fotodegradării, precipitării sau biodegradării. Alte orientări sunt disponibile în referința (8).

4.

Definițiile utilizate sunt prezentate în apendicele 1.

5.

Culturile de plante cu creștere exponențială din genul Lemna se lasă să crească în monoculturi, cu diferite concentrații ale substanței chimice de testare, timp de șapte zile. Obiectivul testului este de a cuantifica efectele substanței chimice asupra creșterii vegetative în această perioadă, pe baza evaluărilor variabilelor de măsurare selectate. Numărul de fronde este variabila de măsurare principală. Se mai măsoară cel puțin încă o variabilă de măsurare (suprafața totală a frondelor, greutatea uscată sau greutatea în stare proaspătă), deoarece unele substanțe chimice pot afecta alte variabile de măsurare considerabil mai mult decât numărul de fronde. Pentru cuantificarea efectelor substanței chimice, creșterea în soluțiile de testare se compară cu cea a probelor de control, fiind determinată concentrația care provoacă o inhibare specificată de x % a creșterii (de exemplu 50 %) și exprimată ca ECx (de exemplu EC50).

6.

Punctul final de testare este inhibarea creșterii, exprimată ca creștere logaritmică a variabilei de măsurare (viteza medie specifică de creștere) în timpul perioadei de expunere. Concentrația care provoacă o inhibare a vitezei de creștere specificată de x % (de exemplu 50 %) se determină din vitezele medii specifice de creștere înregistrate pentru o serie de soluții de testare și este exprimată ca ErCx (de exemplu ErC50).

7.

O variabilă de răspuns suplimentară folosită în prezenta metodă de testare este randamentul, care poate fi necesar pentru îndeplinirea unor cerințe de reglementare specifice din unele țări. Acesta se definește ca variabilele de măsurare la sfârșitul perioadei de expunere minus variabilele de măsurare la începutul perioadei de expunere. Concentrația care provoacă o inhibare a randamentului specificată de x % (de exemplu 50 %) se calculează din randamentul înregistrat pentru o serie de soluții de testare și este exprimată ca EyCx (de exemplu EyC50).

8.

În plus, concentrația cea mai scăzută pentru care este observat un efect (LOEC) și concentrația la care nu se observă niciun efect (NOEC) se pot determina statistic.

9.

Este necesară o metodă analitică cu sensibilitate specifică pentru cuantificarea substanței chimice în mediul de testare.

10.

Informațiile referitoare la substanța chimică de testare, care pot fi utile pentru stabilirea condițiilor de testare, includ formula structurală, puritatea, solubilitatea în apă, stabilitatea în apă și la lumină, pKa, Kow, presiunea de vapori și biodegradabilitatea. Solubilitatea în apă și presiunea de vapori pot fi folosite pentru a calcula constanta legii lui Henry, care va arăta dacă sunt probabile pierderi semnificative ale substanței chimice de testare în perioada de testare. Aceasta va indica dacă este necesară adoptarea anumitor măsuri pentru limitarea unor astfel de pierderi. Dacă informațiile privind solubilitatea și stabilitatea substanței chimice de testare sunt incerte, se recomandă ca acestea să fie evaluate în condițiile testului, cum ar fi mediul de cultură, temperatura sau condițiile de iluminare din test.

11.

Când controlarea pH-ului mediului de testare are o importanță specială, de exemplu în cursul testării unor metale sau substanțe chimice instabile din punct de vedere hidrolitic, se recomandă adăugarea unui tampon în mediul de cultură (a se vedea punctul 21). Orientări suplimentare privind testarea substanțelor chimice cu proprietăți fizico-chimice care le fac dificil de testat sunt prezentate în referința (8).

12.

Pentru ca testul să fie valabil, perioada de dublare a numărului de fronde în proba de control trebuie să fie mai mică de 2,5 zile (60 de ore), corespunzând unei creșteri de aproximativ șapte ori într-o perioadă de șapte zile și unei viteze medii specifice de creștere de 0,275 zi– 1. Folosind mediul și condițiile de testare descrise în prezenta metodă de testare, acest criteriu poate fi îndeplinit prin folosirea unui test static (5). Se consideră că acest criteriu poate fi îndeplinit și în condiții de testare semistatică și dinamică. Calculul perioadei de dublare este prezentat la punctul 49.

13.

Substanța (substanțele) chimică (chimice) de referință, cum ar fi 3,5-diclorfenol, folosită (folosite) în ring testul internațional (7), poate (pot) fi testată (testate) ca mijloc de verificare a procedurii de testare. Este recomandabil ca o substanță chimică de referință să fie testată cel puțin de două ori pe an sau, dacă testarea se desfășoară mai puțin frecvent, în paralel cu determinarea toxicității unei substanțe chimice de testare.

14.

Toate echipamentele care intră în contact cu mediile de testare trebuie să fie confecționate din sticlă sau alt material chimic inert. Recipientele de sticlă folosite pentru cultură și testare trebuie să fie sterile și curățate de contaminanții chimici care se pot infiltra în mediul de testare. Vasele de testare trebuie să fie suficient de largi pentru ca frondele din diferitele colonii aflate în vasele de control să crească fără a se suprapune la sfârșitul testului. Nu este important dacă rădăcinile ating baza vaselor de testare, dar se recomandă o adâncime minimă de 20 mm și un volum minim de 100 ml în fiecare vas de testare. Tipul de vase de testare nu influențează desfășurarea testului atât timp cât se respectă aceste cerințe. Pot fi folosite pahare de laborator, vase de cristalizare sau plăci Petri din sticlă de dimensiuni corespunzătoare. Vasele de testare trebuie să fie acoperite pentru a se reduce la minimum evaporarea și contaminarea accidentală, permițând în același timp trecerea aerului. Vasele de testare corespunzătoare, în special capacele, trebuie să prevină formarea umbrei sau modificarea caracteristicilor spectrale ale luminii.

15.

Culturile și vasele de testare nu se păstrează în același loc. Această condiție poate fi îndeplinită prin folosirea unor încăperi, incubatoare sau camere de creștere care reproduc condițiile de mediu. Iluminarea și temperatura trebuie să fie controlabile și menținute la un nivel constant (a se vedea punctele 35-36).

16.

Organismul folosit pentru acest test este Lemna gibba sau Lemna minor. Scurte descrieri ale speciilor de lintiță care au fost folosite pentru testarea toxicității sunt prezentate în apendicele 2. Plantele pot fi obținute dintr-o colecție de culturi, de la un alt laborator sau de pe teren. Dacă sunt colectate de pe teren, plantele se mențin în cultură într-un mediu identic cu cel folosit pentru testare timp de cel puțin opt săptămâni înainte de utilizare. Terenurile de pe care s-au colectat culturile inițiale trebuie să fie lipsite de surse evidente de contaminare. Dacă au fost obținute de la un alt laborator sau dintr-o colecție de culturi, se vor menține în condiții similare timp de cel puțin trei săptămâni. Sursa plantelor, a speciilor și a clonei (dacă se cunoaște) folosite pentru testare se raportează întotdeauna.

17.

Se vor folosi monoculturi care sunt vizibil necontaminate cu alte organisme, cum ar fi alge sau protozoare. Plantele sănătoase de L. minor vor consta în colonii cuprinzând între două și cinci fronde, în timp ce coloniile sănătoase de L. gibba pot conține până la șapte fronde.

18.

Calitatea și uniformitatea plantelor folosite pentru testare vor avea o influență semnificativă asupra rezultatului testului și, prin urmare, se vor selecta cu atenție. Se vor folosi plante tinere, cu creștere rapidă, fără leziuni sau decolorări vizibile (cloroză). Culturile de bună calitate sunt indicate de numărul mare de colonii cuprinzând cel puțin două fronde. Un număr mare de fronde unice indică stres ambiental, cum ar fi o cantitate redusă de nutrienți, iar plantele din astfel de culturi nu se folosesc pentru testare.

19.

În scopul reducerii frecvenței de întreținere a culturii (de exemplu în situațiile în care nu sunt prevăzute teste cu Lemna pentru o anumită perioadă), culturile pot fi menținute în condiții de iluminare și temperatură scăzută (4-10 °C). Detalii privind culturile sunt prezentate în apendicele 3. Semnele vizibile de contaminare cu alge sau alte organisme pot necesita sterilizarea la suprafață a unui subeșantion de fronde de Lemna, urmată de transferul către un mediu proaspăt (a se vedea apendicele 3). În această situație, restul culturii contaminate se elimină.

20.

Cu cel puțin șapte zile înainte de testare, se transferă un număr suficient de colonii în condiții aseptice într-un mediu steril proaspăt și se cultivă timp de 7-10 zile în condițiile de testare.

21.

Pentru Lemna minor și Lemna gibba se recomandă medii diferite, conform descrierii de mai jos. Se va examina cu atenție includerea unui tampon de pH în mediul de testare [MOPS (acid 4-morfolinpropansulfonic, nr. CAS: 1132-61-2) în mediul L. minor și de NaHCO3 în mediul L. gibba] când se suspectează că va reacționa cu substanța chimică de testare și va influența exprimarea toxicității acesteia. Mediul Steinberg (9) este de asemenea acceptabil dacă se îndeplinesc criteriile de validitate.

22.

Pentru cultura și testarea cu L. minor se recomandă o modificare a mediului de cultură a Lemna prevăzut de standardul suedez (SIS). Compoziția acestui mediu este prezentată în apendicele 4.

23.

Mediul de cultură 20X-AAP, descris în apendicele 4, este recomandat pentru cultivarea și testarea cu L. gibba.

24.

Mediul Steinberg descris în apendicele 4 este, de asemenea, adecvat pentru L. minor, dar poate fi folosit și pentru L. gibba dacă se îndeplinesc criteriile de validitate.

25.

Soluțiile de testare se prepară de obicei prin diluarea unei soluții stoc. Soluțiile stoc ale substanțelor chimice de testat se prepară în general prin dizolvarea substanței chimice în mediul de cultură.

26.

Concentrația cea mai mare testată a substanței chimice de testare nu trebuie să depășească de preferință limita de solubilitate în apă a substanței chimice în condițiile de testare. Cu toate acestea, trebuie remarcat că speciile de Lemna plutesc la suprafață și pot fi expuse la substanțe chimice care se acumulează la interfața apă-aer (de exemplu substanțe chimice cu solubilitate scăzută în apă, hidrofobe sau tensioactive). În astfel de circumstanțe, expunerea va rezulta de la alte materiale decât cele din soluție, iar concentrațiile de testare pot depăși nivelul de solubilitate în apă, în funcție de caracteristicile substanței chimice de testare. În cazul substanțelor chimice de testare cu solubilitate scăzută în apă, poate fi necesară prepararea unei soluții stoc concentrate sau dispersia substanței chimice folosind un solvent sau agent de dispersie organic, pentru a facilita adăugarea de cantități exacte de substanță chimică de testare în mediul de testare și a favoriza dispersia și dizolvarea sa. Se vor depune toate eforturile pentru evitarea folosirii unor astfel de materiale. Nu se vor folosi solvenți sau agenți de dispersie suplimentari în urma cărora să rezulte fitotoxicitate. De exemplu, printre solvenții obișnuiți care nu provoacă fitotoxicitate la concentrații de până la 100 μl/l se numără acetona și dimetilformamida. Dacă se folosește un solvent sau agent de dispersie, concentrația sa finală se raportează și se menține la minimum (≤ 100 μl/l), iar toate tratamentele și probele de control trebuie să conțină aceeași concentrație de solvent sau agent de dispersie. Orientări suplimentare privind folosirea agenților de dispersie sunt prezentate în referința (8).

27.

Cunoașterea prealabilă a toxicității substanței chimice de testare față de Lemna, de exemplu în urma unui test de stabilire a intervalului, va permite alegerea concentrațiilor potrivite de testare. În testul final de stabilire a toxicității trebuie să existe în mod normal cel puțin cinci concentrații de testare dispuse în serie geometrică. Se preferă ca factorul de separare între concentrațiile de testare să nu depășească 3,2, dar se poate folosi o valoare mai mare în cazul în care curba concentrație-răspuns este plată. Utilizarea a mai puțin de cinci concentrații trebuie justificată. Pentru fiecare concentrație de testare se folosesc cel puțin trei probe duplicat.

28.

La stabilirea intervalului de concentrații de testare (pentru testul de stabilire a intervalului și/sau testul final de stabilire a toxicității), trebuie să se rețină următoarele:

29.

Fiecare test trebuie să includă probe de control constând în mediu nutritiv, număr de fronde și colonii, condiții de mediu și proceduri identice celor din vasele de testare, dar fără substanța chimică de testare. Dacă se folosește un solvent sau agent de dispersie suplimentar, se va include o tratare suplimentară a probei de control cu acest solvent/agent de dispersie, prezent în aceeași concentrație cu cea din vasele cu substanța chimică de testare. Numărul vaselor de control duplicate (și vasele cu solvenți, dacă este cazul) trebuie să fie cel puțin egal cu numărul de vase folosite pentru fiecare concentrație de testare; în mod ideal acest număr va fi de două ori mai mare.

30.

Dacă determinarea NOEC nu este necesară, testul poate fi modificat în sensul creșterii numărului de concentrații și al reducerii numărului de probe duplicat per concentrație. Cu toate acestea, numărul de probe duplicat de control trebuie să fie de cel puțin trei.

31.

Coloniile constând în 2-4 fronde vizibile se transferă din cultura de inocul și se distribuie aleatoriu în vasele de testare în condiții aseptice. Fiecare vas de testare va conține un total de 9-12 fronde. Numărul de fronde și colonii va fi același în fiecare vas de testare. Experiența dobândită în urma aplicării acestei metode și a ring testului a indicat că folosirea a trei probe duplicat per tratament, fiecare probă duplicat conținând inițial 9-12 fronde, este suficientă pentru a detecta diferențe de creștere de aproximativ 4-7 % inhibare calculată în funcție de viteza de creștere (10-15 % calculată în funcție de randament) între tratamente (7).

32.

Vasele de testare vor fi poziționate aleatoriu în incubator pentru a se minimiza influența diferențelor spațiale de intensitate a luminii sau de temperatură. Este nevoie, de asemenea, de o dispunere fixă sau aleatorie a vaselor (sau o repoziționare mai frecventă) atunci când se fac observații.

33.

Dacă un test preliminar de stabilitate arată că nu poate fi menținută concentrația substanței chimice de testat (concentrația măsurată scade sub 80 % din concentrația măsurată inițial) pe durata perioadei de testare (7 zile), se recomandă un test semistatic. În acest caz, coloniile se expun unor soluții proaspăt preparate de testare și de control de cel puțin două ori în timpul testului (de exemplu ziua 3 și ziua 5). Frecvența expunerii la un mediu proaspăt va depinde de stabilitatea substanței chimice de testare; pentru menținerea concentrațiilor cât mai aproape de nivelul constant în cazul substanțelor chimice foarte instabile sau volatile, poate fi necesară o frecvență mai mare. În unele situații poate fi necesară o procedură dinamică (8)(10).

34.

Scenariul de expunere prin aplicare foliară (pulverizare) nu este inclus în prezenta metodă de testare. Pentru aceasta, a se vedea referința (11).

35.

Se va utiliza o lumină fluorescentă albă, caldă sau rece, continuă pentru a asigura o intensitate luminoasă cuprinsă în intervalul 85-135 μE · m– 2s– 1 atunci când este măsurată în radiație activă fotosintetică (400-700 nm) în puncte aflate la distanțe egale de sursa de lumină cu distanțele la care se află frondele de Lemna (echivalent cu 6 500-10 000 lucși). Diferențele față de intensitatea luminoasă selectată în zona de testare nu trebuie să depășească ± 15 %. Metoda de detectare și măsurare a luminii, în special tipul de senzor, va influența valoarea măsurată. Senzorii sferici (care răspund la lumina din toate unghiurile de deasupra și dedesubtul planului de măsurare) și senzorii «cosinusf» (care răspund la lumina din toate unghiurile de deasupra planului de măsurare) sunt preferabili senzorilor unidirecționali și vor da valori mai mari pentru o sursă de lumină multipunct de tipul celei descrise aici.

36.

Temperatura din vasele de testare trebuie să fie de 24 ± 2 °C. pH-ul mediului de control nu trebuie să aibă o creștere mai mare de 1,5 unități în timpul testului. O deviație de peste 1,5 unități nu va invalida totuși testul dacă se poate demonstra întrunirea criteriilor de validitate. Se va acorda o atenție sporită devierii pH-ului în cazuri speciale, cum ar fi în timpul testării de substanțe chimice sau metale instabile. Pentru orientări suplimentare, a se vedea referința (8).

37.

Testul se încheie după 7 zile de la transferul plantelor în vasele de testare.

38.

Numărul de fronde din vasele de testare se determină și se consemnează la începutul testului, acordându-se atenție înregistrării frondelor proeminente și distincte. Numărul de fronde cu aspect normal sau anormal se stabilește la începutul testului, cel puțin o dată la fiecare trei zile în timpul perioadei de expunere (adică cel puțin de două ori în timpul perioadei de 7 zile), precum și la încheierea testului. Se înregistrează modificările în dezvoltarea plantei, cum ar fi dimensiunea frondei, aspectul, indicațiile de necroză, cloroză sau gibozitate, separarea coloniilor sau pierderea de flotabilitate, precum și cele privind lungimea și aspectul rădăcinii. Se înregistrează, de asemenea, caracteristici semnificative ale mediului de testare (de exemplu prezența de material nedizolvat, creșterea de alge în vasul de testare).

39.

Pe lângă determinările numărului de fronde în timpul testului, se evaluează și efectele substanței chimice de testare asupra uneia (sau mai multora) dintre următoarele variabile de măsurare:

40.

Suprafața totală a frondelor are avantajul de a putea fi determinată pentru fiecare vas de testare și de control la începutul, în timpul și la sfârșitul testului. Greutatea uscată sau în stare proaspătă se determină la începutul testului, pe baza unui eșantion al culturii de inocul reprezentativ pentru substanța folosită la începutul testului și la sfârșitul testului, pe baza materialului din fiecare vas de testare și de control. Dacă suprafața frondelor nu se măsoară, se preferă greutatea uscată în locul greutății în stare proaspătă.

41.

Suprafața totală a frondelor, greutatea uscată și greutatea în stare proaspătă se determină după cum urmează:

42.

Dacă se folosește un test static, pH-ul fiecărui tratament se măsoară la începutul și la sfârșitul testului. Dacă se folosește un test semistatic, pH-ul se măsoară în fiecare lot de soluție de testare «proaspătă» înainte de fiecare reînnoire, precum și în soluțiile «uzate» corespunzătoare.

43.

Intensitatea luminoasă se măsoară în încăperea, incubatorul sau camera de creștere în puncte aflate la distanțe de sursa de lumină identice cu cele ale frondelor de Lemna. Măsurătorile se fac cel puțin o dată în timpul testului. Temperatura mediului dintr-un vas înlocuitor menținut în condiții identice în încăperea, incubatorul sau camera de creștere se măsoară cel puțin o dată pe zi.

44.

Concentrațiile substanței chimice de testat se determină la intervale corespunzătoare în timpul testului. În testele statice, cerința minimă este de a determina concentrațiile la începutul și la sfârșitul testului.

45.

Pentru testele semistatice în care nu se estimează menținerea concentrației substanței chimice de testare în limita a ± 20 % din cea nominală, este necesară analizarea tuturor soluțiilor de testare proaspăt preparate și aceleași soluții la fiecare reînnoire (a se vedea punctul 33). Cu toate acestea, pentru testele în care concentrația inițială măsurată a substanței chimice de testare nu se situează în limita a ± 20 % din cea nominală, dar se pot aduce dovezi suficiente care să indice repetabilitatea și stabilitatea concentrațiilor inițiale (adică în intervalul de 80-120 % din concentrațiile inițiale), determinările chimice se vor efectua doar la concentrațiile de testare cele mai mari și cele mai scăzute. În toate cazurile, determinarea concentrațiilor substanței chimice de testare înainte de reînnoire trebuie efectuată doar la un vas duplicat la fiecare concentrație de testare (sau la conținutul vaselor combinate în funcție de proba duplicat).

46.

Dacă se folosește un test în regim dinamic, se recomandă un regim de recoltare a eșantioanelor similar cu cel descris pentru testele semistatice, inclusiv analiza la începutul, mijlocul și sfârșitul testului, dar măsurarea soluțiilor «uzate» nu este adecvată în acest caz. La aceste tip de test, trebuie verificat zilnic debitul diluantului și al substanței chimice de testare sau al soluției stoc a substanței chimice de testare.

47.

Dacă se poate dovedi menținerea satisfăcătoare, pe toată durata testului, a concentrației substanței chimice de testare în limita a ± 20 % din cea nominală sau cea măsurată inițial, atunci analiza rezultatelor poate avea loc pe baza valorilor nominale sau măsurate inițial. Dacă abaterea de la concentrația nominală sau cea măsurată inițial nu se află în limita a ± 20 %, este necesar ca rezultatele să se exprime în funcție de media geometrică a concentrației în timpul expunerii sau de modelele care descriu declinul concentrației substanței chimice de testare (8).

48.

În unele condiții, de exemplu atunci când un test preliminar arată că substanța chimică de testare nu are efecte toxice la concentrații de până la 100 mg/l sau până la limita solubilității sale în mediul de testare (oricare dintre ele este mai scăzută), se poate realiza un test la valori-limită, care presupune compararea răspunsurilor unui grup de control și ale unui grup supus tratamentului (100 mg/l sau o concentrație egală cu limita solubilității). Se recomandă ca acest test să fie confirmat prin analizarea concentrației de expunere. Unui test la valori-limită i se aplică toate condițiile de testare și criteriile de validitate descrise anterior, cu excepția faptului că numărul de probe duplicat supuse tratamentului trebuie să fie dublu. Creșterea în grupul de control și în cel supus tratamentului poate fi analizată folosind un test statistic de comparare a mediilor, cum ar fi un test-t (Student).

49.

Pentru determinarea timpului de duplicare (Td) a numărului de fronde și asigurarea respectării de către studiu a acestui criteriu de validitate (punctul 12), se utilizează următoarea formulă cu datele obținute de la vasele de control:

Td = ln 2/μ

unde μ este viteza medie specifică de creștere determinată conform descrierii de la punctele 54-55.

50.

Scopul testului este de a determina efectele substanței chimice de testat asupra creșterii vegetative a Lemna. Prezenta metodă de testare descrie două variabile de răspuns, deoarece diferitele jurisdicții au preferințe și cerințe de reglementare diferite. Pentru ca rezultatele testului să fie acceptabile în toate jurisdicțiile, efectele se evaluează folosind ambele variabile de răspuns (a) și (b) descrise mai jos.

51.

Trebuie remarcat că valorile de toxicitate calculate prin folosirea acestor două variabile de răspuns nu sunt comparabile, iar această diferență trebuie să fie recunoscută când se folosesc rezultatele testului. Valorile ECx bazate pe viteza medie specifică de creștere (ErCx) vor fi în general mai mari decât rezultatele bazate pe randament (EyCx) în cazul în care condițiile de testare din prezenta metodă de testare sunt respectate, ca urmare a bazei matematice a abordărilor respective. Aceasta nu se va interpreta ca o diferență de sensibilitate între cele două variabile de răspuns, valorile fiind diferite din punct de vedere matematic. Conceptul de viteză medie specifică de creștere se bazează pe modelul general al creșterii exponențiale a lintiței în culturi nelimitate, în care toxicitatea se estimează pe baza efectelor asupra vitezei de creștere, fără a fi dependentă de nivelul absolut al vitezei specifice de creștere a probei de control, de panta curbei concentrație-răspuns sau de durata testului. Prin contrast, rezultatele bazate pe variabila de răspuns privind randamentul depind de toate aceste alte variabile. EyCx depinde de viteza specifică de creștere a speciilor de lintiță folosite pentru fiecare test și de viteza maximă specifică de creștere, care poate varia între specii și chiar între clone diferite. Această variabilă de răspuns nu se folosește pentru compararea sensibilității la substanțe toxice între speciile de lintiță și chiar clone diferite. În timp ce folosirea vitezei medii specifice de creștere în scopul estimării toxicității este preferată din punct de vedere științific, estimările de toxicitate bazate pe randament sunt, de asemenea, incluse în prezenta metodă de testare pentru a satisface cerințele de reglementare actuale din unele jurisdicții.

52.

Estimările toxicității trebuie să se bazeze pe numărul de fronde și pe o variabilă de măsurare suplimentară (suprafața totală a frondelor, greutatea uscată sau greutatea în stare proaspătă), deoarece unele substanțe chimice pot afecta alte variabile de măsurare în proporție considerabil mai mare decât o poate face numărul de fronde. Acest efect nu va putea fi detectat exclusiv în urma calculării numărului de fronde.

53.

Numărul de fronde, precum și orice altă variabilă de măsurare înregistrată, cum ar fi suprafața totală a frondelor, greutatea uscată sau greutatea în stare proaspătă, sunt introduse într-un tabel împreună cu concentrațiile substanței chimice de testare cu ocazia fiecărei măsurări. Analiza ulterioară a datelor, de exemplu pentru estimarea LOEC, NOEC sau a ECx trebuie să se bazeze pe valorile probelor duplicat individuale, și nu pe mediile calculate pentru fiecare grup supus tratamentului.

54.

Viteza medie specifică de creștere pentru o anumită perioadă se calculează ca fiind creșterea logaritmică a variabilelor de creștere – numărul de fronde și încă o variabilă de măsurare (suprafața totală a frondelor, greutatea uscată sau greutatea în stare proaspătă) – pe baza formulei de mai jos pentru fiecare probă duplicat a probelor de control și a probelor supuse tratamentului:

unde:

Pentru fiecare grup supus tratamentului și pentru fiecare grup de control, se calculează o valoare medie a vitezei de creștere în paralel cu estimările varianței.

55.

Viteza medie specifică de creștere se calculează pentru întreaga durată a testului (momentul «i» în formula de mai sus este începutul testului, iar momentul «j» este sfârșitul testului). Pentru fiecare concentrație de testare și probă de control se calculează o valoare medie pentru viteza medie specifică de creștere în paralel cu estimările varianței. În plus, viteza de creștere pe secțiuni se evaluează în scopul evaluării efectelor substanței chimice de testare care se produc în timpul perioadei de expunere (de exemplu prin verificarea curbelor de creștere transformate logaritmic). Diferențe substanțiale între viteza de creștere pe secțiuni și viteza medie de creștere indică o deviere de la creșterea exponențială constantă și impun verificarea atentă a curbelor de creștere. În acest caz, o abordare conservativă constă în compararea vitezelor specifice de creștere ale culturilor tratate în timpul perioadei de timp de inhibare maximă cu cele ale probelor de control, în aceeași perioadă.

56.

Astfel, procentajul de inhibare a vitezei de creștere (Ir) se poate calcula pentru fiecare concentrație de testare (grup supus tratamentului) conform următoarei formule:

unde:

57.

Efectele asupra randamentului se determină pe baza a două variabile de măsurare, numărul de fronde și încă o variabilă de măsurare (suprafața totală a frondelor, greutatea uscată sau greutatea în stare proaspătă) prezentă în fiecare vas de testare la începutul și la sfârșitul testului. În cazul greutății uscate sau al greutății în stare proaspătă, biomasa inițială se determină pe baza unui eșantion de fronde recoltat din același lot folosit pentru inocularea vaselor de testare (a se vedea punctul 20). Pentru fiecare concentrație de testare și probă de control, se calculează o valoare medie a randamentului în paralel cu estimările varianței. Procentajul mediu de inhibare a randamentului (% Iy) se poate calcula pentru fiecare grup supus tratamentului după cum urmează:

unde: