1.1.1.1.

Se toarnă în plăcile ELISA proteina recombinantă VP7 a VPCA de serotip 4 diluată într-un tampon carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se incubează plăcile peste noapte la 4 °C.

1.1.1.2.

Se clătesc plăcile de cinci ori cu apă distilată conținând 0,01 % (V/V) Tween-20 (soluție de spălare). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.

1.1.1.3.

Se blochează plăcile cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) cu pH 7,2 + 5 % (G/V) lapte praf degresat (Nestlé Dry Skim Milk TM), câte 200 μl în fiecare godeu timp de o oră la 37 °C.

1.1.1.4.

Se înlătură soluția de blocare și se scutură ușor plăcile pe un material absorbant.

1.1.2.1.

Eșantioanele de ser de testat și serurile de control pozitiv și negativ se diluează la 1/25 într-o SSTF + 5 % (G/V) lapte degresat + 0,05 % (V/V) Tween-20, 100 μl în fiecare godeu. Se incubează timp de o oră la 37 °C.

Pentru titrare, se efectuează serii de diluție de înjumătățire începând cu 1 la 25 (100 μl/godeu), utilizându-se câte un ser pentru o coloană a plăcii; se procedează la fel cu controalele pozitiv și negativ. Se incubează timp de o oră la 37 °C.

1.1.2.2.

Se clătesc plăcile de cinci ori cu apă distilată conținând 0,01 % (V/V) Tween-20 (soluție de spălare). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.

1.1.3.1.

Se toarnă în fiecare godeu câte 100 μl de gamaglobuline anti-cal conjugate cu peroxidază de hrean diluate într-o SSTF + 5 % lapte + 0,05 % Tween-20 cu pH 7,2. Se incubează timp de o oră la 37 °C.

1.1.3.2.

Se clătesc plăcile de cinci ori cu apă distilată conținând 0,01 % (V/V) Tween-20 (soluție de spălare). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.

1.1.4.1.

Se adaugă 200 μl/godeu de soluție de cromogen/substrat [10 ml de DMAB (dimetilaminobenzaldehidă) 80,6 mM + 10 ml de MBTH (hidroclorură de 3-metil-2-benzotiazolină hidrazonă) 1,56 mM + 5 μl de H2O2].

Se blochează reacția colorimetrică după aproximativ 5-10 minute (înainte să înceapă să se coloreze controlul negativ) prin adăugarea a 50 μl de H2SO4 3N.

Se pot utiliza și alți cromogeni, cum ar fi ABTS [acid 2,2′-azino-bis-(3-etilbenzotiazolină-6-sulfonic)], TMB (tetrametil de benzidină) sau OFD (ortofenildiamină).

1.1.4.2.

Se citesc plăcile la 600 nm (sau 620 nm).

1.2.1.

Se calculează valoarea-prag adăugând 0,06 la valoarea controlului negativ (0,06 este abaterea standard calculată pe baza unui grup de 30 de seruri negative).

1.2.2.

Eșantioanele testate care prezintă valori ale absorbanței inferioare valorii-prag sunt considerate negative.

1.2.3.

Eșantioanele testate care prezintă valori ale absorbanței superioare valorii-prag + 0,15 sunt considerate pozitive.

1.2.4.

Eșantioanele testate care prezintă valori ale absorbanței intermediare sunt neconcludente și trebuie utilizată o a doua tehnică pentru confirmarea rezultatului.

2.1.1.1.

Se toarnă în plăcile ELISA 50-100 ng de proteină recombinantă VP7 a VPCA de serotip 4, diluată într-un tampon carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se incubează peste noapte la 4 °C.

2.1.1.2.

Se spală plăcile de trei ori cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) 0,1x conținând 0,135 M NaCl și 0,05 % (V/V) Tween-20 (SSTFT). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.

2.1.2.1.

Eșantioanele de ser de testat și serurile pozitiv și negativ de control se diluează 1 la 5 într-un diluant care conține 0,35 M NaCl, 0,05 % (V/V) Tween-20 și 0,1 % Kathon, 100 μl în fiecare godeu. Se incubează timp de o oră la 37 °C.

Pentru titrare, se efectuează serii de diluție de înjumătățire a serurilor de testat, începând cu 1 la 10 până la 1 la 280 în 8 godeuri (100 μl/godeu), utilizându-se câte un ser pentru o coloană a plăcii; se procedează la fel cu controalele pozitiv și negativ. Se incubează timp de o oră la 37 °C.

2.1.2.2.

Se spală plăcile de cinci ori cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) 0,1× conținând 0,135 M NaCl și 0,05 % (V/V) Tween-20 (SSTFT). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.

2.1.3.1.

Se depun în fiecare godeu câte 100 μl de Mab anti-VP7 conjugat cu peroxidază de hrean. Înainte de această operațiune, Mab respectiv a fost diluat la 1/5 000-1/15 000 într-o soluție 1/1 de stabilizator StabiliZyme Select® (referința SurModics.: SZ03) în apă distilată. Se incubează timp de 30 de minute la 37 °C.

2.1.3.2.

Se spală plăcile de cinci ori cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) 0,1× conținând 0,135 M NaCl și 0,05 % (V/V) Tween-20 (SSTFT). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.

2.2.1.

Determinarea procentului de blocare (PB) din fiecare eșantion prin aplicarea următoarei formule, unde «Abs» înseamnă anticorpi:

2.2.2.

Eșantioanele care prezintă o valoare a PB mai mare de 50 % ar trebui considerate pozitive pentru anticorpi VPCA.

2.2.3.

Eșantioanele care prezintă o valoare a PB mai mică de 45 % ar trebui considerate negative pentru anticorpi VPCA.

2.2.4.

Eșantioanele care prezintă o valoare a PB cuprinsă între 45 % și 50 % ar trebui considerate neconcludente și trebuie supuse din nou testelor. Dacă rezultatul este tot neconcludent, animalele ar trebui retestate pe baza unor eșantioane prelevate nu mai devreme de două săptămâni de la prelevarea eșantionului considerat neconcludent.

—

extracția cu fenol-cloroform a acizilor nucleici;

—

adsorbția acizilor nucleici într-un sistem de filtrare;

—

adsorbția acizilor nucleici într-un sistem cu bile magnetice.

1.1.

Un eșantion de 1 g de țesut este omogenizat în 1 ml de soluție de denaturare (tiocianat de guanidină 4 M, citrat de sodiu 25 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 M, sarcozil 0,5 %).

1.2.

După centrifugare, la supernatant se adaugă 1 μg de ARN de drojdie, 0,1 ml de acetat de sodiu 2 M cu pH 4, 1 ml de fenol și 0,2 ml de amestec de cloroform/alcool izoamilic (49/1).

1.3.

Suspensia se scutură energic și se răcește pe gheață timp de 15 minute.

1.4.

După centrifugare, ARN-ul prezent în faza apoasă este extras cu fenol, precipitat cu etanol și resuspendat în apă sterilă.

—

Primer sens

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

Primer antisens

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

Probă MGB-TaqMan

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1.

Concentrația soluției de primer este diluată la o concentrație de lucru de 8 μM («soluție de primer de lucru 8 μM»), în timp ce proba este diluată la o concentrație de lucru de 50 μM («soluție de probă de lucru 50 μM»). Trebuie concepută o dispoziție a plăcii de testat, care trebuie încărcată în softul mașinii de PCR în timp real. Utilizând dispoziția ca ghid, se adaugă 2,5 μl din fiecare soluție de primer de lucru 8 μM în fiecare godeu care va conține eșantioane de ARN, controale pozitiv și/sau negativ (concentrația finală a primerului va fi de 1 μM în cei 20 μl de amestec RT-PCR). Placa se ține pe gheață.

2.1.2.

2 μl de ARN izolat (eșantioanele de testat și controlul pozitiv) sau 2 μl de apă fără ARNază în controale de reacție negativă se amestecă cu primeri sens și antisens. Acest amestec este denaturat prin încălzire la 95 °C timp de 5 minute, urmată de o răcire rapidă pe gheață timp de cel puțin 5 minute.

2.1.3.

Se pregătește, conform instrucțiunilor producătorului, un volum adecvat de amestec principal pentru RT-PCR în timp real într-o singură etapă, pentru numărul de eșantioane care trebuie să fie testate. În fiecare godeu care conține eșantioane de ARN se adaugă 0,1 μl de soluție de probă de lucru 50 μM (concentrația finală a probei va fi de 0,25 μM în fiecare godeu care conține eșantioane de ARN). Se distribuie, în fiecare godeu al plăcii PCR care conține ARN-ul și primerii denaturați, 13 μl de amestec principal pentru RT-PCR în timp real într-o singură etapă.

2.1.4.

Se pune placa într-un thermocycler în timp real programat pentru transcriere inversă și pentru detectarea ADNc prin fluorescență/amplificare. Condițiile de amplificare constau într-o primă etapă de transcriere inversă la 48 °C timp de 25 de minute, urmată de 10 minute la 95 °C («hot start») și de 40 de cicluri de 15 secunde la 95 °C, de 35 de secunde la 55 °C și de 30 de secunde la 72 °C (sau 40 de cicluri la 97 °C timp de 2 secunde și la 55 °C timp de 30 de secunde dacă se utilizează reactivi și un thermocycler care permit reacții rapide). Datele privind fluorescența sunt obținute la sfârșitul etapei de 55 °C.

2.1.5.

Dacă se obțin curbe de amplificare atipice, testul nu este considerat valabil și trebuie repetat.

Eșantioanele sunt considerate pozitive dacă valoarea Ct (numărul ciclului la care fluorescența generată în cadrul unei reacții depășește pragul de fluorescență) este mai mică sau egală cu pragul Ct definit (35) în decurs de maximum 40 de cicluri PCR (Ct ≤ 35).

Eșantioanele sunt considerate neconcludente dacă valoarea Ct este mai mare decât pragul Ct definit (35) în decurs de maximum 40 de cicluri PCR (Ct > 35).

Eșantioanele sunt considerate negative dacă se obține o curbă de amplificare orizontală care nu traversează linia pragului în decurs de maximum 40 de cicluri PCR.

—

Primer sens

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

Primer antisens

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

Probă MGB-TaqMan

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1.

Soluțiile de amestec de primer și de probă sunt preparate într-o concentrație de 25× la 5 μΜ pentru primerii sens și antisens și la 3 μΜ pentru probă. Trebuie concepută o dispoziție a plăcii de testat, care trebuie încărcată în softul mașinii de PCR în timp real. Utilizând dispoziția ca ghid, în godeurile corespunzătoare de pe placă, conform dispoziției, se adaugă 5 μl de eșantioane de ARN, inclusiv eșantioanele de testat și controalele pozitiv și negativ.

2.2.2.

ARN-ul este denaturat prin încălzire la 95 °C timp de 5 minute, urmată de o răcire rapidă pe gheață timp de cel puțin 3 minute.

2.2.3.

Se pregătește, conform instrucțiunilor producătorului, un volum adecvat de amestec principal pentru RT-PCR în timp real într-o singură etapă, pentru numărul de eșantioane care trebuie să fie testate. În amestecul principal se include 1 μl de 25× soluție de amestec primer probă (de la punctul 2.2.1 de mai sus), pentru a obține în fiecare godeu o concentrație finală de 200 nM pentru fiecare primer și de 120 nM pentru probă. Se distribuie 20 μl de amestec principal în fiecare godeu al plăcii PCR care conține ARN-ul denaturat.

2.2.4.

Se pune placa într-un thermocycler în timp real programat pentru transcriere inversă și pentru detectarea ADNc prin fluorescență/amplificare, conform sugestiilor producătorilor. Condițiile de amplificare constau, de exemplu, într-o primă etapă de transcriere inversă la 48 °C timp de 10 minute, urmată de 10 minute la 95 °C și de 40 de cicluri de 15 secunde la 95 °C și de 45 de secunde la 60 °C.

2.2.5.

Probele sunt considerate pozitive dacă fluorescența normalizată pentru testul RT-PCR privind VPCA depășește un prag de 0,1 în decurs de 36 de cicluri PCR în toate duplicatele unui eșantion.

Probele sunt considerate neconcludente dacă fluorescența normalizată pentru testul RT-PCR privind VPCA depășește un prag de 0,1 în decursul a 36-40 de cicluri PCR în orice duplicat al unui eșantion.

Eșantioanele sunt considerate negative dacă fluorescența normalizată pentru testul RT-PCR privind VPCA nu a depășit un prag de 0,1 în decurs de 40 de cicluri PCR în toate duplicatele unui eșantion și dacă fluorescența normalizată pentru testul de control extern sintetic brevetat a depășit un prag de 0,1 în decurs de 33 de cicluri PCR.”