„ANEXA 1

CARACTERISTICILE ULEIURILOR DE MĂSLINE

Categorie

Esteri etilici ai acizilor grași (EEAG) mg/kg (*)

Aciditate (%) (*)

Indice de peroxid mEq O2/kg (*)

Ceruri mg/kg (**)

Monopalmitat de 2-gliceril (%)

Stigmastadiene mg/kg (1)

Diferență: ECN42 (HPLC) și ECN42 (2) Calcul teoretic

K232 (*)

K268 sau K270 (*)

Delta-K (*)

Evaluare organoleptică Mediana defectului (Md) (*)

Evaluare organoleptică Mediana atributului fructat (Mf) (*)

1. Ulei de măsline extravirgin:

EEAG ≤ 40 (anul agricol 2013-2014) (3) EEAG ≤ 35 (anul agricol 2014-2015) EEAG ≤ 30 (anii agricoli ulteriori anului 2015)

≤ 0,8

≤ 20

≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,50

≤ 0,22

≤ 0,01

Md = 0

Mf > 0

≤ 1,0 dacă procentul de acid palmitic total > 14 %

2. Ulei de măsline virgin

—

≤ 2,0

≤ 20

≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,60

≤ 0,25

≤ 0,01

Md ≤ 3,5

Mf > 0

≤ 1,0 dacă procentul de acid palmitic total > 14 %

3. Ulei de măsline lampant

—

> 2,0

—

(4)

≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 %

≤ 0,50

≤ |0,3|

—

—

—

Md > 3,5 (5)

—

≤ 1,1 dacă procentul de acid palmitic total > 14 %

4. Ulei de măsline rafinat

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 %

—

≤ |0,3|

—

≤ 1,10

≤ 0,16

—

—

≤ 1,1 dacă procentul de acid palmitic total > 14 %

5. Ulei de măsline compus din uleiuri de măsline rafinate și uleiuri de măsline virgine

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 0,9 dacă procentul de acid palmitic total ≤ 14 %

—

≤ |0,3|

—

≤ 0,90

≤ 0,15

—

—

≤ 1,0 dacă procentul de acid palmitic total > 14 %

6. Resturi de măsline brute

—

—

—

(6)

≤ 1,4

—

≤ |0,6|

—

—

—

—

—

7. Ulei rafinat din resturi de măsline

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 1,4

—

≤ |0,5|

—

≤ 2,00

≤ 0,20

—

—

8. Ulei din resturi de măsline

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 1,2

—

≤ |0,5|

—

≤ 1,70

≤ 0,18

—

—

Categorie

Compoziția de acizi grași (7)

Suma izomerilor trans ai acidului oleic (%)

Suma izomerilor trans ai acidului linoleic și ai acidului linolenic (%)

Conținutul de steroli

Steroli totali (mg/kg)

Eritrodiol și uvaol (%) (**)

Miristic (%)

Linolenic (%)

Arahidic (%)

Eicosenoic (%)

Behenic (%)

Lignoceric (%)

Colesterol (%)

Brasicasterol (%)

Campesterol (8) (%)

Stigmasterol (%)

Sitosterol ap (%) (9)

Delta-7-Stigmastenol (8) (%)

1. Ulei de măsline extravirgin

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

> 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Ulei de măsline virgin

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Ulei de măsline lampant

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (10)

4. Ulei de măsline rafinat

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

> 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Ulei de măsline compus din uleiuri de măsline rafinate și uleiuri de măsline virgine

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Ulei brut din resturi de măsline

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (11)

7. Ulei rafinat din resturi de măsline

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8. Ulei din resturi de măsline

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

Note:

(a)	Rezultatele analizelor trebuie să conțină același număr de zecimale ca cele indicate pentru fiecare caracteristică. Ultima cifră trebuie mărită cu o unitate în cazul în care cifra următoare este mai mare de 4.

(b)	Este de ajuns ca o singură caracteristică să nu fie conformă cu valorile indicate pentru ca uleiul să fie încadrat într-o altă categorie sau să fie declarat neconform din punct de vedere al purității, în sensul prezentului regulament.

(c)

Caracteristicile indicate cu asterisc (*), care fac referire la calitatea uleiului, semnifică următoarele: - pentru uleiul de măsline lampant, limitele aferente pot să nu fie respectate în mod simultan; - pentru uleiurile de măsline virgine, nerespectarea cel puțin a uneia dintre aceste limite implică schimbarea categoriei, cu toate că uleiul rămâne clasificat într-una din categoriile de uleiuri de măsline virgine.

(d)	Caracteristicile marcate cu două asteriscuri (**) implică faptul că, pentru toate uleiurile din resturi de măsline, limitele aferente pot să nu fie respectate în mod simultan.

„Apendice

Arborele decizional

Arborele decizional referitor la campesterol pentru uleiurile de măsline virgine și extravirgine:

4,0 % < Campesterol ≤ 4,5 %

Stigmasterol ≤ 1,4 %

Δ-7-stigmastenol ≤ 0,3 %

Ceilalți parametri respectă limitele stabilite în prezentul regulament.

Arborele decizional referitor la Delta-7-stigmastenol:

—	Uleiuri de măsline extravirgine și virgine 0,5 % < Δ-7-stigmastenol ≤ 0,8 % Campesterol ≤ 3,3 % β-sitosterol ap/ (campest + Δ7stig) ≥ 25 Stigmasterol ≤ 1,4 % Δ ECN42 ≤ |0,1|

Ceilalți parametri respectă limitele stabilite în prezentul regulament.

—	Uleiuri din resturi de măsline (brute și rafinate) 0,5 < Δ -7-stigmastenol ≤ 0,7 Δ ECN42 ≤ |0,40| Stigmasterol ≤ 1,4 % Ceilalți parametri în limitele stabilite

„ANEXA Ia

EȘANTIONAREA ULEIULUI DE MĂSLINE SAU A ULEIULUI DIN RESTURI DE MĂSLINE LIVRAT ÎN AMBALAJE IMEDIATE

Această metodă de eșantionare se aplică loturilor de ulei de măsline sau de ulei din resturi de măsline în ambalaje imediate. Se aplică diferite metode de eșantionare, în funcție de volumul ambalajului imediat (mai mic sau mai mare de 5 litri).

Prin „lot” se înțelege un ansamblu de unități de vânzare produse, fabricate și ambalate astfel încât uleiul conținut în fiecare din aceste unități de vânzare este considerat omogen din punct de vedere al tuturor caracteristicilor analitice. Individualizarea unui lot trebuie să se efectueze în conformitate cu Directiva 2011/91/UE a Parlamentului European și a Consiliului (1).

„Prelevare” înseamnă cantitatea de ulei conținută într-un ambalaj imediat și extrasă dintr-un punct aleatoriu al lotului.

1.   CONȚINUTUL UNEI PROBE PRIMARE

1.1.   Ambalaje imediate care nu depășesc 5 litri

În cazul ambalajelor imediate care nu depășesc 5 litri, „probă primară” înseamnă numărul prelevărilor extrase dintr-un lot și conforme tabelului 1.

Tabelul 1

Dimensiunea minimă a fiecărei probe primare trebuie să fie alcătuită din

În cazul în care ambalajele imediate au o capacitate	Proba primară trebuie să conțină ulei din
(a) mai mare sau egală cu 1 litru	(a) 1 ambalaj imediat;
(b) mai mică de 1 litru	(b) numărul minim de ambalaje cu o capacitate totală de cel puțin 1,0 litru

Numărul de ambalaje menționat în tabelul 1 și care constituie o probă primară poate fi mărit de către fiecare stat membru, în conformitate cu propriile nevoi (de exemplu, evaluarea organoleptică de către un alt laborator decât cel care a efectuat analizele chimice, contraanaliză etc.).

1.2.   Ambalaje imediate care depășesc 5 litri

În cazul ambalajelor imediate care depășesc 5 litri, „probă primară” înseamnă o parte reprezentativă a prelevărilor totale, obținute printr-un proces de reducere și conforme tabelului 2. Probele primare trebuie să fie compuse din diferite specimene.

„Specimen” de probă primară înseamnă fiecare dintre ambalajele care compun proba primară.

Tabelul 2

Numărul minim de prelevări care trebuie selectate

Număr de ambalaje pe lot	Numărul minim de prelevări care trebuie selectate
Până la 10	1
De la … 11 la 150	2
De la … 151 la 500	3
De la … 501 la 1 500	4
De la … 1 501 la 2 500	5
> 2 500 pentru 1 000 de ambalaje	1 prelevare suplimentară

Pentru a reduce volumul de ambalaje imediate la eșantionare, conținutul prelevărilor de eșantionare este omogenizat pentru pregătirea probei primare. Fracțiunile din diferitele prelevări sunt vărsate și amestecate într-un recipient comun în vederea omogenizării, într-un mod care să ofere o protecție optimală împotriva aerului.

Conținutul probei primare trebuie să fie turnat într-o serie de ambalaje cu o capacitate minimă de 1,0 litru, astfel încât fiecare dintre acestea să constituie un specimen din proba primară.

Numărul de probe primare poate fi mărit de către fiecare stat membru, în conformitate cu propriile nevoi (de exemplu, evaluarea organoleptică de către un alt laborator decât cel care a efectuat analizele chimice, contraanaliză etc.).

Fiecare ambalaj trebuie să fie umplut în așa fel încât să se reducă la minimum stratul superior de aer, după care este închis și sigilat în mod corespunzător pentru a se asigura protejarea produsului împotriva falsificării.

Specimenele trebuie să fie etichetate pentru a se garanta identificarea corectă a acestora.

2.   ANALIZE ȘI REZULTATE

2.1.

Fiecare probă primară trebuie să se împartă în probe de laborator, în conformitate cu punctul 2.5 din standardul EN ISO 5555 și trebuie să se analizeze urmându-se ordinea prezentată în programul decizional prevăzut în anexa IB sau în orice altă ordine aleatorie.

2.2.

În cazul în care toate rezultatele analizelor sunt conforme caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat conform. Dacă un singur rezultat al analizelor nu este conform caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat neconform.

3.   VERIFICAREA CATEGORIEI LOTULUI

3.1.

În vederea verificării categoriei lotului, autoritatea competentă poate mări numărul de probe primare extrase din diferite puncte ale lotului, în conformitate cu următorul tabel: Tabelul 3 Numărul de probe primare stabilite în funcție de mărimea lotului Mărimea lotului (în litri) Numărul de probe primare mai puțin de 7 500 2 de la 7 500 la mai puțin de 25 000 3 de la 25 000 la mai puțin de 75 000 4 de la 75 000 la mai puțin de 125 000 5 egală cu și mai mare de 125 000 6 + 1 pentru fiecare 50 000 de litri suplimentari Fiecare prelevare care constituie o probă primară trebuie să fie extrasă din același loc al lotului, fiind necesar să se noteze amplasarea fiecărei probe primare, care să fie identificată în mod inechivoc. Alcătuirea fiecărei probe primare trebuie să se efectueze în conformitate cu procedurile menționate punctele 1.1 și 1.2. Fiecare probă primară este apoi supusă analizelor menționate la articolul 2 alineatul (1).

3.2.

În cazul în care unul dintre rezultatele analizelor menționate la articolul 2 alineatul (1) pentru cel puțin o probă primară nu este conform caracteristicilor categoriei de ulei declarate, se declară neconform întregul lot de eșantionare.”

„ANEXA Ib

PROGRAMUL DECIZIONAL PENTRU VERIFICAREA CONFORMITĂȚII UNEI PROBE DE ULEI DE MĂSLINE CU CATEGORIA DECLARATĂ

Tabelul 1

ULEI DE MĂSLINE EXTRAVIRGIN

(criterii de calitate)

Aciditate %

≤ 0,8

> 0,8

Valoare peroxid mEq O2/kg

≤ 20

> 20

Spectrometrie UV

K270 ≤ 0,22

K270 > 0,22

Spectrometrie UV

ΔK ≤ 0,01

ΔK > 0,01

Spectrometrie UV

K232 ≤ 2,50

K232 > 2,50

Evaluare organoleptică

med. fructat > 0

și

med. defecte = 0

med. fructat = 0

med. fructat > 0

și

med. defecte > 0

Esteri etilici*

da

nu

Tip de ulei așa cum s-a declarat conform criteriilor de calitate.

Mergeți la tabelul 3. (criterii de puritate)

Uleiul nu respectă categoria declarată.

(a)

Uleiul nu respectă categoria declarată.

(b)

* ≤ 40 mg/kg în 2013/2014

≤ 35 mg/kg în 2014/2015

≤ 30 mg/kg din anul agricol 2015/2016

Tabelul 2

Uleiuri de măsline virgine

(criterii de calitate)

Aciditate %

≤ 2,0

> 2,0

Valoare peroxid mEq O2/kg

≤ 20

> 20

Spectrometrie UV

K270 ≤ 0,25

K270 > 0,25

Spectrometrie UV

Δ K ≤ 0,01

Δ K > 0,01

Spectrometrie UV

K232 ≤ 2,60

K232 > 2,60

Evaluare organoleptică

Mediană fructat > 0

și

Mediană defecte ≤ 3,5

Mediană fructat = 0

sau

mediană fructat > 0

mediană defecte > 3,5

Valorile parametrilor de mai sus îndeplinesc criteriile calitate ale uleiului de măsline extravirgin?

(Tabelul 1)

NU

DA

Tip de ulei așa cum s-a declarat conform criteriilor de calitate.

Mergeți la tabelul 3. (criterii de puritate)

Uleiul nu respectă categoria declarată.

(a)

Uleiul nu respectă categoria declarată.

(b)

Tabelul 3

Extra virgin and virgin olive oils

(Criterii de puritate)

Criterii de calitate (tabelele 1 și 2)

DA

NU

3,5-Stigmastadiene mg/kg

≤ 0,05

> 0,05

Izomeri trans % ai acizilor grași

tC18:1 ≤ 0,05

t(C18:2 + C18:3) ≤ 0,05

tC18:1 > 0,05

t(C18:2 + C18:3) > 0,05

Conținutul de acizi grași

DA

NU

Δ ECN42

≤ |0,2|

> |0,2|

Conținutul de steroli și sterolii totali

DA

NU

Eritrodiol + uvaol %

≤ 2,0

2,0 > E+U ≤ 4,5

> 4,5

Ceruri1 mg/kg

≤ 150

> 150

Tipul de ulei respectă categoria declarată

Uleiul nu respectă categoria declarată

Uleiul nu respectă categoria declarată

(a)

Uleiul nu respectă categoria declarată

Uleiul nu respectă categoria declarată

(b)

1C42+C44+C46

„Apendicele 1

Tabel de corespondență între anexele la prezentul regulament și analizele menționate în programul decizional

— Aciditate	Anexa II	Determinarea acizilor grași liberi, metoda la rece
— Indicele de peroxid	Anexa III	Determinarea indicelui de peroxid
— Spectrometrie UV	Anexa IX	Analiza spectrofotometrică
— Evaluarea organoleptică	Anexa XII	Evaluarea organoleptică a uleiului de măsline virgin
— Esteri etilici	Anexa XX	Metoda pentru determinarea conținutului de ceruri, esteri metilici ai acizilor grași și esteri etilici ai acizilor grași prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară
— Stigmasta-3,5-diene	Anexa XVII	Metoda determinării stigmastadienelor în uleiurile vegetale
— Izomeri trans ai acizilor grași	Anexa X A și	Analiza prin cromatografie în fază gazoasă a esterilor metilici ai acizilor grași
	Anexa X B	Prepararea esterilor metilici ai acizilor grași
— Conținutul de acizi grași	Anexa X A și	Analiza prin cromatografie în fază gazoasă a esterilor metilici ai acizilor grași
	Anexa X B	Prepararea esterilor metilici ai acizilor grași
— ΔECN42	Anexa XVIII	Determinarea compoziției trigliceridelor cu ECN42 (diferența dintre datele HPLC și conținutul teoretic)
— Compoziția de steroli și steroli totali — Eritrodiol și uvaol	Anexa V	Determinarea compoziției și a conținutului de steroli și de dialcooli triterpenici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară
— Ceruri	Anexa IV	Determinarea conținutului de ceară prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară
— Alcooluri alifatice	Anexa XIX	Determinarea conținutului de alcooli alifatici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară
— Acizi grași saturați în poziția 2	Anexa VII	Determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril

„ANEXA V

DETERMINAREA COMPOZIȚIEI ȘI A CONȚINUTULUI DE STEROLI ȘI DE DIALCOOLI TRITERPENICI PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1.   DOMENIUL DE APLICARE

Metoda descrie procedura de determinare a conținutului de steroli, simpli și totali, și de dialcooli triterpenici în uleiurile de măsline și în uleiurile din resturi de măsline.

2.   PRINCIPIU

Uleiul, la care s-a adăugat α-colestanol ca etalon intern, este saponificat cu hidroxid de potasiu în soluție etanolică, apoi se extrage substanța nesaponificabilă cu eter etilic.

Fracțiunea de steroli și de dialcooli triterpenici se separă de substanța nesaponificabilă prin cromatografie în strat subțire pe placă de silicagel bazic. Fracțiunile recuperate din silicagel se transformă în trimetilsilileteri și apoi se analizează prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3.   APARATURA

Aparatura obișnuită de laborator și, în special, următoarele:

3.1.	Balon de 250 ml echipat cu un condensator cu reflux cu racordurile din sticlă rodată.

3.2.	Pâlnie de separare de 500 ml.

3.3.	Baloane de 250 ml.

3.4.	Echipament complet pentru analiză prin cromatografie în strat subțire cu plăci de sticlă de 20 × 20 cm.

3.5.	Lampă cu lumină ultravioletă cu o lungime de undă de 254 sau 366 nm.

3.6.	Microseringi de 100 μl și de 500 μl.

3.7.	Pâlnie cilindrică de filtrare cu membrană poroasă G 3 (porozitate 15-40 μm) cu un diametru de aproximativ 2 cm și o înălțime de 5 cm, adaptată pentru filtrarea în vid cu un racord tată din sticlă rodată.

3.8.	Balon conic cu vid de 50 ml cu un racord mamă din sticlă rodată, care este adaptabil la pâlnia de filtrare (punctul 3.7).

3.9.	Eprubetă cu fund conic de 10 ml, prevăzută cu dop ermetic din sticlă.

3.10.

Cromatograf cu gaz care poate fi utilizat cu coloană capilară, prevăzut cu un dispozitiv de injectare cu splitare, format din următoarele: 3.10.1. Etuvă cu termostat pentru coloane, care poate menține temperatura dorită cu o precizie de ± 1 °C; 3.10.2. Unitate de injectare termoreglabilă cu element vaporizator din sticlă tratată cu persilan și cu dispozitiv de splitare; 3.10.3. Detector cu ionizare în flacără (FID); 3.10.4. Sistem de culegere a datelor care poate fi utilizat cu detectorul FID (punctul 3.10.3.) și care poate efectua integrare manuală.

3.11.

Coloană capilară de sticlă de siliciu cu o lungime de 20–30 m și un diametru interior de 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu 5 % difenil - 95 % dimetilpolisiloxan (faza staționară SE-52 sau SE-54 sau echivalent), cu o grosime uniformă cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm.

3.12.

Microseringă cu o capacitate de 10 μl, pentru cromatografie în fază gazoasă, cu ac cimentat, adecvată pentru injectarea cu splitare.

3.13.

Exsicator cu diclorură de calciu

4.   REACTIVI

4.1.

Hidroxid de potasiu, titru minim 85 %.

4.2.

Hidroxid de potasiu în soluție etanolică, la aproximativ 2 N. Se dizolvă, prin răcire, 130 g de hidroxid de potasiu (punctul 4.1) în 200 ml de apă distilată, apoi se completează până la un litru cu etanol (punctul 4.10). Soluția se păstrează în vase de sticlă opacă bine închise și se depozitează maximum două zile.

4.3.

Eter etilic, de calitate analitică.

4.4.

Hidroxid de potasiu în soluție etanolică, la aproximativ 0,2 N. Se dizolvă 13 g de hidroxid de potasiu (punctul 4.1) în 20 ml de apă distilată și se completează până la un litru cu etanol (punctul 4.10).

4.5.

Sulfat de sodiu anhidru, de calitate analitică.

4.6.

Plăci de sticlă (20 × 20 cm) acoperite cu silicagel fără indicator de fluorescență, cu o grosime de 0,25 mm (acestea sunt disponibile în comerț gata pentru utilizare).

4.7.

Toluen, de calitate cromatografică.

4.8.

Acetonă, de calitate cromatografică.

4.9.

n-Hexan, de calitate cromatografică.

4.10.

Eter etilic, de calitate cromatografică.

4.11.

Etanol, de calitate analitică.

4.12.

Acetat de etil, de calitate analitică.

4.13.

Soluție de referință pentru cromatografie în strat subțire: colesterol sau fitosteroli și soluție de eritrodiol de 5 % în acetat de etil (punctul 4.11).

4.14.

2′,7′ Diclorfluoresceină, soluție etanolică de 0,2 %. Aceasta este făcută ușor bazică prin adăugarea câtorva picături de soluție alcoolică de hidroxid de potasiu la 2 N (punctul 4.2).

4.15.

Piridină anhidră, de calitate cromatografică (a se vedea nota 5).

4.16.

Hexametil-disilazan, de calitate analitică.

4.17.

Trimetilclorosilan, de calitate analitică.

4.18.

Soluție de probă de trimetilsilileter de steroli. Se prepară în momentul folosirii din steroli și eritrodiol extrași din uleiurile care le conțin.

4.19.

α-colestanol, cu puritate de peste 99 % (puritatea trebuie să fie controlată prin analiză GC).

4.20.

Soluție etalon intern de α-colestanol, soluție de 0,2 % (m/V) în acetat de etil (punctul 4.11).

4.21.

Soluție de fenolftaleină, 10 g/l în etanol (punctul 4.10).

4.22.

Gaz purtător: hidrogen sau heliu pur, puritate pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.23.

Gaze auxiliare: hidrogen, heliu, azot și aer, puritate pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.24.

n-Hexan (punctul 4.9)/eter etilic (punctul 4.10) amestec de 65:35 (V/V).

4.25.

Reactiv de sililare, constituit dintr-un amestec de 9:3:1 (V/V/V) de piridină/hexametil-disilazan/trimetilclorosilan.

5.   PROCEDURA

5.1.   Prepararea substanței nesaponificabile

5.1.1.   În balonul de 250 ml (punctul 3.1) se introduce, cu ajutorul microseringii de 500 μl (punctul 3.6), un volum de soluție etalon intern de α-colestanol (punctul 4.20) care conține o cantitate de colestanol corespunzătoare pentru aproximativ 10 % din conținutul de steroli ai probei. De exemplu, pentru 5 g de probă de ulei de măsline trebuie să se adauge 500 μg de soluție de α-colestanol (punctul 4.20) și 1 500 μl în cazul uleiului din resturi de măsline. Se evaporă până la uscare cu un curent ușor de azot într-o baie caldă de aburi; după răcirea balonului se cântăresc 5 ± 0,01 g de probă uscată și filtrată în același balon.

Nota 1:

În cazul uleiurilor și grăsimilor animale sau vegetale care conțin cantități considerabile de colesterol, poate fi prezentă o valoare de vârf cu un timp de retenție apropiat de cel al colestanolului. În astfel de cazuri, trebuie să se analizeze fracțiunea de steroli în duplicat, cu și fără etalon intern.

5.1.2.   Se adaugă 50 ml de soluție etanolică de hidroxid de potasiu la 2 N (punctul 4.2) și câteva granule de piatră ponce, se pune în funcțiune condensatorul cu reflux și se încălzește până la o ușoară fierbere până când se produce saponificarea (soluția devine limpede). Se continuă încălzirea timp de 20 minute, apoi se adaugă 50 ml de apă distilată provenită din partea de sus a condensatorului, se deconectează condensatorul și se răcește balonul la aproximativ 30 °C.

5.1.3.   Se transvazează cantitativ conținutul balonului într-o pâlnie de separare de 500 ml (punctul 3.2), adăugând apă distilată de mai multe ori (50 ml). Se adaugă aproximativ 80 ml de eter etilic (punctul 4.10), se agită energic timp de aproximativ 60 de secunde și se eliberează presiunea periodic, prin inversarea pâlniei de separare și deschiderea robinetului. Se lasă în repaus până la separarea completă a celor două faze (nota 2).

Apoi se extrage soluția de săpun cât mai complet posibil într-o a doua pâlnie de separare. Se fac încă două extracții pe fază de apă-alcool, în același mod, utilizând 60-70 ml de eter etilic (punctul 4.10).

Nota 2: Eventualele emulsii pot fi eliminate adăugând cantități mici de etanol (punctul 4.11).

5.1.4.   Se combină cele trei extracte eterice într-o pâlnie de separare care conține 50 ml de apă. Se continuă spălarea cu apă (50 ml) până când apa de spălare nu mai prezintă o culoare roz la adăugarea unei picături de soluție de fenolftaleină (punctul 4.21).

După ce s-a eliminat apa de spălare, se filtrează pe sulfat de sodiu anhidru (punctul 4.5) într-un balon de 250 ml cântărit în prealabil, spălând pâlnia și filtrul cu mici cantități de eter etilic (punctul 4.10).

5.1.5.   Se evaporă solventul prin distilare sub vid pe un evaporator rotativ la 30 °C. Se adaugă 5 ml de acetonă și se elimină complet solventul volatil într-un curent ușor de aer. Se usucă reziduul în cuptor la 103 ± 2 °C timp de 15 minute. Se răcește în exsicator și se cântărește cu o precizie de 0,1 mg.

5.2.   Separarea fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici (eritrodiol + uvaol)

5.2.1.   Pregătirea plăcilor bazice pentru cromatografia în strat subțire. Se scufundă plăcile de silicagel (punctul 4.6) la aproximativ 4 cm în soluția etanolică de hidroxid de potasiu la 0,2 N (punctul 4.5) timp de 10 secunde, se lasă apoi să acționeze închise, sub hotă, timp de două ore și se pun, în final, în etuvă la 100 °C timp de o oră.

Se scot din etuvă și se păstrează într-un exsicator cu clorură de calciu (punctul 3.13) până în momentul folosirii (plăcile astfel tratate trebuie să fie folosite în termen de 15 zile).

Nota 3:

Folosirea plăcilor bazice de silicagel pentru separarea fracțiunii de steroli elimină necesitatea tratării fracțiunii nesaponificabile cu alumină. În acest mod, toți compușii de natură acidă (acizi grași și alții) sunt reținuți pe linia de depunere, iar banda de steroli este separată net de banda de alcooli alifatici și triterpenici.

5.2.2.   Se introduce în cuva de developare amestecul de hexan/etil (punctul 4.24) (Nota 4) până la o adâncime de aproximativ 1 cm. Se închide cuva folosind un capac corespunzător și se lasă astfel timp de cel puțin o jumătate de oră, la rece, în așa fel încât echilibrul lichid/vapori să se stabilizeze. Pe suprafețele interioare ale cuvei se pot fixa benzi de hârtie de filtru care se cufundă în eluant. Astfel se reduce cu aproximativ o treime timpul de developare și se obține o eluare mai uniformă a componentelor.

Nota 4:

Amestecul de developare trebuie să fie schimbat la fiecare test, pentru a obține condiții de eluare perfect reproductibile. Se poate utiliza un solvent alternativ de n-hexan/eter etilic 50:50 (V/V).

5.2.3.   Se prepară o soluție de aproximativ 5 % de nesaponificabile (punctul 5.1.5) în acetat de etil (punctul 4.12) și se depun, utilizând microseringa de 100 μl, 0,3 ml de soluție într-o linie fină și uniformă pe capătul inferior (2 cm) al plăcii cromatografice (punctul 5.2.1). În paralel cu linia de depozit, se depun, la una dintre extremitățile plăcii, 2–3 μl de soluție de referință (punctul 4.13), în scopul identificării sterolilor și a alcoolilor triterpenici după developare.

5.2.4.   Se pune placa în cuva de developare pregătită conform indicațiilor de la punctul 5.2.2. Temperatura ambiantă trebuie să fie menținută între 15 și 20 °C (nota 5). Se închide imediat cu capacul și se eluează până când nivelul solventului ajunge la aproximativ 1 cm de marginea superioară a plăcii. Se scoate placa din cuva de developare și se trece la evaporarea solventului într-un curent de aer cald sau prin menținerea plăcii scurt timp sub hotă.

Nota 5: Temperatura mai mare ar putea afecta separarea.

5.2.5.   Se vaporizează placa ușor și uniform cu soluție de 2′,7′ diclorfluoresceină (punctul 4.14) și apoi se lasă să se usuce. Atunci când placa se observă la lumină ultravioletă, se poate identifica banda de steroli și de dialcooli triterpenici prin alinierea cu petele obținute cu soluția de referință (punctul 4.13). Se delimitează benzile cu un creion negru de-a lungul marginilor de fluorescență (a se vedea placa de cromatografie în strat subțire, figura 3).

5.2.6.   Cu o spatulă metalică, se curăță silicagelul din zona delimitată. Materialul extras, sfărâmat fin, se introduce în pâlnia de filtrare (punctul 3.7). Se adaugă 10 ml de acetat de etil cald (punctul 4.12), se amestecă cu grijă cu o spatulă metalică și se filtrează cu ajutorul vidului, apoi se colectează filtratul în balonul conic (punctul 3.8) conectat la pâlnia de filtrare.

Se spală reziduul din balon de trei ori cu eter etilic (punctul 4.3) (aproximativ 10 ml de fiecare dată) și se colectează filtratul în același balon conectat la pâlnia de filtrare, se evaporă filtratul până la obținerea unui volum de 4-5 ml, se transvazează soluția reziduală în eprubeta de 10 ml (punctul 3.9) cântărită în prealabil, se usucă încălzind-o ușor într-un ușor curent de azot, se continuă cu câteva picături de acetonă (punctul 4.8), uscând-o din nou.

Reziduul din eprubetă trebuie să fie alcătuit din fracțiunile de steroli și de dialcooli triterpenici.

5.3.   Prepararea trimetilsilileterilor

5.3.1.   Se adaugă, în eprubeta care conține fracțiunile de steroli și de dialcooli triterpenici, reactivul de sililare (punctul 4.25) (nota 6) într-o proporție de 50 μl pe miligram de steroli și de dialcooli triterpenici, evitând toate absorbțiile de umiditate (nota 7).

Nota 6:

Soluțiile utilizabile ca atare sunt disponibile în comerț. De asemenea, sunt disponibili și alți reactivi de sililare, cum ar fi, de exemplu, bitrimetilsililtrifluoracetamida + 1 % trimetilclorosilan care trebuie să se dilueze cu un volum egal de piridină anhidră.

Piridina poate fi înlocuită cu aceeași cantitate de acetonitril.

5.3.2.   Se închide eprubeta, se agită cu grijă (fără a o răsturna) până la solubilizarea completă a compușilor. Se lasă în repaus minimum 15 minute la temperatura ambiantă, apoi se centrifughează timp de câteva minute. Soluția limpede este gata pentru analiza prin cromatografie în faza gazoasă.

Nota 7:

Eventuala formare a unei opalescențe ușoare este normală și nu provoacă nicio anomalie. Formarea unei floculații albe sau apariția unei colorații roz indică prezența umidității sau alterarea reactivului. În acest caz, trebuie să se repete testul (numai dacă se utilizează hexametildisilazan/trimetilclorosilan).

5.4.   Analiza prin cromatografie în faza gazoasă.

5.4.1.   Operațiuni preliminare, condiționarea coloanei capilare

5.4.1.1.

Se instalează coloana (punctul 3.11) în cromatograful în fază gazoasă, legând extremitatea de intrare la injectorul cu splitare și extremitatea de ieșire la detector. Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în fază gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului, eficacitatea sistemului de splitare și a sistemului de înregistrare etc.).

5.4.1.2.

În cazul în care se utilizează coloana pentru prima dată, se recomandă să se efectueze condiționarea sa: se trece un ușor flux de gaz de-a lungul acesteia, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă și se începe o încălzire treptată până când se atinge o temperatură cu cel puțin 20 °C mai mare decât cea de funcționare (nota 8). Se menține această temperatură timp de minimum 2 ore, apoi se asigură condițiile de funcționare pentru complex (reglarea fluxului gazos și a splitării, aprinderea flăcării, conectarea la sistemul de culegere a datelor, reglarea temperaturii coloanei, a detectorului și a injectorului etc.) și se înregistrează semnalul la o sensibilitate de cel puțin două ori mai mare decât cea prevăzută pentru executarea analizelor. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf de orice natură și nu trebuie să prezinte abateri. O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei, o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei. Nota 8: Temperatura de condiționare trebuie să fie totdeauna cu cel puțin cu 20 °C mai mică decât temperatura maximă prevăzută pentru faza staționară folosită.

5.4.2.   Alegerea condițiilor de funcționare.

5.4.2.1.

Condițiile de funcționare sunt următoarele: — Temperatura coloanei: 260 ± 5 °C; — Temperatura injectorului: 280-300 °C; — Temperatura detectorului: 280-300 °C; — Viteza liniară a gazului purtător: heliu 20 - 35 cm/s; hidrogen 30 - 50 cm/s; — Raportul de splitare: de la 1:50 la 1:100; — Sensibilitatea instrumentelor: de la 4 la 16 ori atenuarea minimă, — Sensibilitatea de înregistrare: 1 - 2 mV scară totală; — Cantitatea de substanță injectată: 0,5 - 1 μl de soluție de TMSE. Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, pentru a se obține cromatograme care îndeplinesc următoarele cerințe: — Timpul de retenție pentru valoarea de vârf a ß-sitosterolului trebuie să fie de 20 ± 5 minute; — valoarea de vârf pentru campesterol trebuie să se situeze în cazul uleiului de măsline (conținut mediu 3 %) la 20 ± 5 % din scara totală, iar în cazul uleiului de soia (conținut mediu 20 %) la 80 ± 10 % din scara totală; — Toți sterolii prezenți trebuie să fie separați. Valorile de vârf separate să fie, de asemenea, complet rezolvate, ceea ce înseamnă că traseul valorii de vârf trebuie să se unească cu linia de bază înaintea de ieșirea pentru valoarea de vârf următoare. Cu toate acestea, o rezolvare incompletă este tolerată cu condiția ca valoarea de vârf la RRT 1,02 (sitostanol) să fie cuantificabilă folosind perpendiculara.

5.4.3.   Protocolul de analiză

5.4.3.1.

Se prelevează, cu microseringa de 10 μl, 1 μl de hexan, se aspiră 0,5 μl de aer și apoi 0,5 - 1 μl din soluția de probă. Se trage pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul prin membrana injectorului și, după 1–2 secunde, se injectează rapid și apoi se extrage lent acul, după aproximativ 5 secunde. Se poate utiliza și un injector automat.

5.4.3.2.

Se efectuează înregistrează până la eluarea completă a TMSE dialcoolilor triterpenici prezenți. Linia de bază trebuie să îndeplinească întotdeauna condițiile specificate(punctul 5.4.1.2).

5.4.4.   Identificarea vârfurilor

Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu TMSE al amestecului de steroli și de dialcooli triterpenici, analizați în aceleași condiții (a se vedea apendicele).

Sterolii și dialcoolii triterpenici sunt supuși procesului de eluare în următoarea ordine: colesterol, brasicasterol, ergosterol, 24-metilen-colesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-stigmastadienol, clerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol și uvaol.

În tabelul 1 sunt prezentați timpii de retenție pentru ß-sitosterol, pentru coloanele SE-52 și SE-54.

Figurile 1și 2 prezintă cromatogramele tipice ale unor uleiuri.

5.4.5.   Evaluarea cantitativă

5.4.5.1.

Cu ajutorul sistemului de culegere a datelor, se procedează la calculul ariilor valorilor de vârf pentru α-colestanol și steroli și dialcoolii triterpenici. Nu se iau în considerare valorile de vârf eventuale ale compușilor care nu sunt incluși (ergosterolul nu trebuie calculat) printre cei enumerați în tabelul 1. Coeficientul de răspuns pentru α-colestanol se consideră a fi egal cu 1.

5.4.5.2.

Se calculează concentrația pentru fiecare sterol, în mg/kg de materie grasă, după cum urmează: unde: Ax = aria de vârf a sterolului x, în unități ale sistemului de culegere a datelor; As = aria valorii de vârf a α-colestanolului, în unități ale sistemului de culegere a datelor; ms = masa α-colestanol adăugat, în miligrame; m = masa probei utilizate pentru determinare, în grame.

6.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

6.1.

Se raportează concentrația fiecărui sterol în mg/kg de substanță grasă și suma lor ca „steroli totali”. Compoziția pentru fiecare sterol și eritrodiol și uvaol se exprimă cu o zecimală. Compoziția de steroli totali trebuie să fie exprimată fără zecimale.

6.2.

Se calculează procentul fiecărui sterol pornind de la raportul dintre aria valorii de vârf corespondente și suma ariilor valorilor de vârf pentru steroli și eritrodiol și uvaol: unde: Ax = aria valorii de vârf pentru x; ΣA = suma ariilor valorilor de vârf pentru steroli;

6.3.

β-Sitosterol aparent: Δ5-23-stigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4.

Se calculează procentul de eritrodiol și uvaol: unde ΣA = suma ariei pentru sterol, în unități ale sistemului de culegere a datelor; ER = aria pentru eritrodiol, în unități ale sistemului de culegere a datelor; Uv = aria pentru uvaol, în unități ale sistemului de culegere a datelor.

„Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat în condiții de operare normale, se injectează 1–3 μl de metan (sau propan) și se cronometrează timpul în care gazul parcurge coloana, între momentul de injecție și cel al ieșirii valorii de vârf (tM).

Viteza liniară în cm/s este dată de L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri și tM este timpul cronometrat în secunde.

Tabelul 1

Timpii de retenție relativi ai sterolilor

Vârf	Identificare		Timpi de retenție relativi
			SE 54 coloană	SE 52 coloană
1	Colesterol	Δ-5-cholesten-3ß-ol	0,67	0,63
2	Colestanol	5α-colestan-3ß-ol	0,68	0,64
3	Brasicasterol	[24S]-24-metil-Δ-5,22-colestadien-3ß-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S] 24 meti Δ5-7-22 colestatrien 3β-ol	0,78	0,76
4	24-metilen-colesterol	24-metilen-Δ-5,24-colestadien-3ß-o1	0,82	0,80
5	Campesterol	(24R)-24-metil-Δ-5-colesten-3ß-ol	0,83	0,81
6	Campestanol	(24R)-24-metil-colestan-3ß-ol	0,85	0,82
7	Stigmasterol	(24S)-24-etill-Δ-5,22-colestadien-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-campesterol	(24R)-24-metil-Δ-7-colesten-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,23-coIestadien-3ß-ol	0,95	0,95
10	Clerosterol	(24S)-24-etil-Δ-5,25-colestadien-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-sitosterol	(24R)-24-etil-Δ-5-colesten-3ß-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-etil-colestan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-colesten-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ-5-24-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,24-colestadien-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmastenol	(24R,S)-24-etil-Δ-7-colesten-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-7-colesten-3ß-ol	1,16	1,16
17	Eritrodiol	5α olean-12en-3β28 diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-ursen-3β28 diol	1,52	1,52

Figura 1

Cromatograma în fază gazoasă a fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici a unui ulei de măsline lampant (eluat cu etalon intern)

Figura 2

Cromatograma în fază gazoasă a fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici a unui ulei de măsline rafinat (eluat cu etalon intern)

Figura 3

Placa de cromatografie în strat subțire pentru uleiul din resturi de măsline, cu zona care trebuie să fie curățată pentru determinarea sterolilor și a dialcoolilor triterpenici

1 –

Scualen

2 –	Alcooli triterpenici și alifatici

3 –	Steroli și dialcooli triterpenici

4 –	Acizi grași inițiali și acizi grași liberi

„ANEXA XII

METODA CONSILIULUI OLEICOL INTERNAȚIONAL PENTRU EVALUAREA ORGANOLEPTICĂ A ULEIURILOR DE MĂSLINE VIRGINE

1.   SCOPUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Această metodă internațională vizează stabilirea procedurii pentru evaluarea caracteristicilor organoleptice ale uleiurilor de măsline virgine în sensul punctului 1 din anexa XVI la Regulamentul (CE) nr. 1234/2007 și determinarea metodei de clasare a uleiurilor pe baza acestor caracteristici. Metoda conține și indicații pentru etichetarea opțională.

Metoda prezentată nu se aplică decât uleiurilor de măsline virgine și clasificării sau etichetării acestora în funcție de intensitatea defectelor percepute și a gustului fructat, determinate de un grup de degustători selecționați, formați și monitorizați, constituiți într-o comisie.

Metoda conține și indicații pentru etichetarea opțională.

Standardele IOC menționate în prezenta anexă se utilizează în ultima versiune disponibilă.

2.   VOCABULARUL GENERAL DE BAZĂ AL ANALIZEI SENZORIALE

A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 4 „Analiza senzorială: Vocabular general de bază”

3.   VOCABULAR SPECIFIC

3.1.   Atribute negative

Stătut/de drojdie: aromă caracteristică uleiului extras din măsline strânse sau depozitate în condiții de natură să determine un stadiu avansat de fermentare anaerobă sau uleiului rămas în contact cu depunerile rezultate în urma decantării, care au suferit, de asemenea, un proces de fermentare anaerobă în containere și cuve.

Mucegăit/umed/de pământ: Aromă caracteristică uleiului de măsline obținut din fructe atacate de mucegaiuri și de drojdii, ca rezultat al depozitării acestora timp de mai multe zile în condiții de umiditate sau uleiului obținut din măsline care au fost culese cu pământ sau acoperite cu noroi și care nu au fost spălate.

De vin/oțetit/acid/acru: aromă caracteristică a anumitor uleiuri care amintește de vin sau de oțet. Această aromă se datorează în principal unui proces de fermentare aerobă a măslinelor sau a resturilor de pastă de măsline de pe rogojini care nu au fost probabil spălate corespunzător, ceea ce a condus la formarea de acid acetic, de acetat de etil și de etanol.

Rânced: aromă a uleiurilor care au fost supuse unui proces intens de oxidare.

Măsline înghețate (lemn umed): aromă caracteristică uleiurilor extrase din măsline care au suferit de pe urma înghețului în copaci.

3.2.   Alte atribute negative

Încălzit sau aromă caracteristică a uleiurilor, care provine din încălzirea excesivă și/sau prelungită

Ars: în cursul obținerii acestora și, în special, în timpul malaxării termice a pastei, dacă aceasta se realizează în condiții termice necorespunzătoare.

De fân-lemnos: aromă caracteristică anumitor uleiuri care provin de la măsline uscate.

Grosier: senzație bucotactilă densă și păstoasă produsă de anumite uleiuri vechi.

De lubrifianți: aromă a uleiului care amintește de motorină, de grăsime sau de uleiul mineral.

De ape de vegetație: aromă dobândită de ulei în urma unui contact prelungit cu apele de vegetație care au suferit procese de fermentare.

De saramură: aroma uleiului obținut din măsline conservate în saramură.

Metalică aromă care amintește de cea a metalelor. Aceasta este caracteristică uleiului care a rămas în contact îndelungat cu suprafețe metalice, pe durata procesului de măcinare, de malaxare, de presare sau de stocare.

Rogoz: aromă caracteristică uleiului obținut din măsline presate între rogojini împletite din rogoz nou. Aceasta poate fi diferită în funcție de materialul folosit la fabricarea rogojinilor, și anume rogoz verde sau rogoz uscat.

Mâncat de viermi: aroma uleiului provenit din măsline care au fost supuse unui atac puternic al larvelor muștei măslinului (Bactrocera Oleae).

Castravete aromă care apare ca urmare a condiționării ermetice a uleiului, prelungite în mod excesiv, în special în recipiente de tinichea, și care este atribuită formării de 2-6 nonadienal.

3.3.   Atribute pozitive

Fructat: ansamblul senzațiilor olfactive caracteristice ale uleiului, în funcție de soiul măslinelor, provenind de la fructe sănătoase și proaspete, verzi sau coapte. Senzațiile sunt percepute direct și/sau retronazal.

Amar: gust elementar caracteristic al uleiului obținut din măsline verzi sau în stadiul de coacere. Este perceput de papilele caliciforme care formează „V”-ul lingual.

Picant: senzație tactilă de pișcătură, caracteristică uleiurilor produse la începutul sezonului, în principal pe bază de măsline încă verzi. Senzația poate fi percepută în toată cavitatea bucală, în special în gât.

3.4.   Terminologie opțională în scopul etichetării

La cerere, președintele comisiei poate atesta faptul că uleiurile evaluate respectă definițiile și intervalele corespunzătoare expresiilor și adjectivelor următoare în funcție de intensitatea și de percepția atributelor.

Atributele pozitive (fructat, amar și picant): În funcție de intensitatea percepției: Intens, atunci când mediana atributului este mai mare de 6; Mediu, atunci când mediana atributului este cuprinsă între 3 și 6; Ușor, atunci când mediana atributului este mai mică de 3;

Fructat: ansamblul senzațiilor olfactive caracteristice ale uleiului, în funcție de soiul măslinelor, provenind de la fructe sănătoase și proaspete, în care nu predomină nici gustul fructat verde și nici gustul fructat copt. Senzațiile sunt percepute direct și/sau retronazal.

Fructat verde: set de senzații olfactive caracteristice uleiului, care amintesc pe cele ale fructelor verzi, în funcție de soiul măslinelor, provenind de la fructe verzi, sănătoase și proaspete. Senzațiile sunt percepute direct și/sau retronazal.

Fructat copt: set de senzații olfactive caracteristice uleiului, care amintesc pe cele ale fructelor coapte, în funcție de soiul măslinelor, provenind de la fructe sănătoase și proaspete. Senzațiile sunt percepute direct și/sau retronazal.

Echilibrat: ulei care nu este dezechilibrat. Prin „dezechilibrat” se înțelege senzația olfactivă, gustativă și tactilă a uleiului în cazul căruia mediana atributului amar și/sau cea a atributului picant este mai mare cu două puncte decât mediana atributului fructat.

Ulei dulce: un ulei în cazul căruia mediana atributului amar și cea a atributului picant sunt mai mici sau egale cu 2.

4.   PAHAR PENTRU DEGUSTAREA ULEIURILOR

A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 5, „Pahar pentru degustarea uleiurilor”.

5.   SALA DE DEGUSTARE

A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 6, „Ghid pentru instalarea unei săli de degustare”.

6.   ACCESORII

Fiecare cabină trebuie să fie dotată cu următoarele accesorii, care să se afle la îndemâna degustătorului pentru a-i permite să-și îndeplinească sarcina în mod corespunzător:

—	pahare (standardizate) care conțin probele, identificate cu un număr de cod, acoperite cu o sticlă de ceas și păstrate la 28 °C ± 2 °C;

—	foaia de profil (a se vedea figura 1), pe suport de hârtie sau în format electronic, care îndeplinește condițiile privind foaia de profil, împreună cu instrucțiunile pentru utilizarea sa în cazul în care este necesar;

—	pix sau cerneală indelebilă;

—	tăvi cu felii de mere și/sau apă, apă gazoasă și/sau pesmeți;

—	un pahar cu apă la temperatura ambiantă;

—	o foaie care reamintește normele generale enumerate la punctele 8.4 și 9.1.1;

—	scuipători.

7.   PREȘEDINTELE COMISIEI ȘI DEGUSTĂTORII

7.1.   Președintele comisiei

Președintele comisiei trebuie să aibă o pregătire corespunzătoare și să fie un expert în toate tipurile de uleiuri pe care le va degusta în timpul testării. El este personalitatea de bază din comisie și are responsabilitatea organizării și funcționării acesteia.

Activitățile președintelui comisiei necesită ca acesta să aibă o formare de bază în ceea ce privește instrumentele de analiză senzorială, aptitudini senzoriale, meticulozitate la pregătirea, organizarea și desfășurarea testelor, precum și capacitățile și răbdarea necesare pentru a planifica și efectua testele în mod științific.

El este singura persoană responsabilă cu selectarea, formarea și monitorizarea degustătorilor, pentru a garanta nivelul lor de aptitudini. El este, prin urmare, responsabil cu evaluarea degustătorilor, care trebuie întotdeauna să fie obiectivă și pentru care trebuie să dezvolte proceduri specifice bazate pe teste și pe criterii solide de acceptare și de respingere. A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 14, „Ghid pentru selectarea, formarea și monitorizarea degustătorilor calificați de ulei de măsline virgin”.

Președintele comisiei este responsabil de performanța comisiei și, prin urmare, de evaluarea sa, în legătură cu care trebuie să furnizeze dovezi fiabile și obiective. În orice caz, trebuie să dovedească, în orice moment, că metoda și degustătorii fac obiectul unor controale. Se recomandă calibrarea periodică a comisiei (IOC/T.20/Doc. nr. 14, punctul 5).

El deține responsabilitatea finală pentru ținerea evidențelor comisiei. Evidențele trebuie să fie întotdeauna trasabile, să respecte cerințele de certitudine și de calitate stabilite în standardele internaționale privind analiza senzorială și să asigure întotdeauna anonimitatea probelor.

El este responsabil cu inventarierea aparaturii și a echipamentelor și trebuie să se asigure că acestea, care sunt necesare pentru a respecta specificațiile prezentei metode, sunt curățate și întreținute în mod corespunzător, păstrând dovezi scrise în această privință. De asemenea, el este responsabil cu respectarea condițiilor de testare.

El are responsabilitatea recepționării și depozitării probelor în momentul în care ajung la laborator, precum și pe cea a depozitării lor după testare. În acest context, el se asigură în permanență că probele rămân anonime și că sunt depozitate corespunzător, iar în acest scop trebuie să elaboreze proceduri scrise pentru a garanta că întregul proces este trasabil și sigur.

În plus, este responsabil cu pregătirea, alocarea unui cod și prezentarea probelor către degustători în conformitate cu un protocol experimental corespunzător care respectă protocoalele prestabilite și, de asemenea, răspunde de colectarea și prelucrarea statistică a datelor obținute de degustători.

El este responsabil cu elaborarea și redactarea oricăror alte proceduri care ar putea fi necesare pentru a completa prezentul standard și pentru a garanta funcționarea corespunzătoare a comisiei.

El trebuie să caute modalități de comparare a rezultatelor comisiei cu cele obținute de alte comisii care efectuează analiza uleiului de măsline virgin, pentru a stabili dacă comisia funcționează în mod corespunzător.

Președintele comisiei are datoria de a-i motiva pe membrii comisiei de degustători prin promovarea interesului, a curiozității și a spiritului competitiv în rândurile acestora. În acest sens, li se recomandă să asigure un bun flux bidirecțional de informații cu membrii comisiei, care trebuie să fie informați în privința tuturor sarcinilor pe care le efectuează, precum și a rezultatelor obținute. În plus, el nu trebuie să-și facă publică opinia și va evita situația în care eventualii lideri își impun propriile criterii celorlalți degustători.

El îi convoacă din timp pe degustători și răspunde întrebărilor acestora cu privire la desfășurarea testelor, dar nu le sugerează opinii referitoare la probă.

7.2.   Degustătorii

Persoanele care au calitatea de degustători în testarea organoleptică a uleiurilor de măsline trebuie să facă acest lucru în mod voluntar, cu toate consecințele rezultate din acest voluntariat în ceea ce privește obligațiile și absența unei recompense financiare. Prin urmare, se recomandă depunerea unei cereri scrise de către candidați. Candidații sunt selecționați, formați și monitorizați de către președintele comisiei, în conformitate cu capacitatea lor de a face distincția între probe similare, ținând cont de faptul că precizia lor se va îmbunătăți ca urmare a formării.

Degustătorii trebuie să se comporte ca adevărați observatori senzoriali, lăsându-și deoparte gusturile personale și raportând exclusiv senzațiile pe care le percep. În acest sens, ei trebuie să-și desfășoare întotdeauna activitatea în tăcere, într-un mod relaxat și lipsit de grabă, acordând o atenție senzorială maximă probei pe care o degustă.

Pentru fiecare test sunt necesari între opt și doisprezece degustători, dar trebuie să se prevadă câțiva degustători suplimentari care să poate fi folosiți în cazul unei eventuale absențe.

8.   CONDIȚIILE DE TESTARE

8.1.   Prezentarea probei

Proba de ulei pentru analiză este prezentată în pahare de testare standardizate care respectă standardul IOC/T.20/Doc. nr. 5, „Pahar pentru degustarea uleiurilor”.

Paharul conține 14-16 ml de ulei, sau între 12,8 și 14,6 g dacă probele sunt cântărite, și se acoperă cu o sticlă de ceas.

Fiecare pahar trebuie să fie marcat cu un cod format din cifre sau o combinație de litere și de cifre alese la întâmplare. Marcarea codului se face cu ajutorul unui sistem nemirositor.

8.2.   Temperatura de testare și cea a probelor

Probele de ulei destinate degustării trebuie să fie menținute în pahare la 28 °C ± 2 °C pe toată durata testării. Această temperatură a fost reținută pentru că ușurează observarea diferențelor organoleptice prin comparație cu temperatura ambiantă și pentru că la temperaturi mai scăzute compușii aromatici caracteristici acestor uleiuri sunt slab volatili, în timp ce temperaturile mai ridicate duc la formarea de compuși volatili caracteristici uleiurilor încălzite. A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 5 „Pahar pentru degustarea uleiurilor” pentru metoda care trebuie utilizată pentru încălzirea probelor aflate în pahar.

Sala de degustare trebuie să aibă o temperatură de 20 ° - 25 ° C (a se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 6).

8.3.   Orarul de degustare

Pentru degustarea uleiurilor, orele optime de lucru sunt cele de dimineață: s-a dovedit că există perioade optime de percepție a gustului și a mirosului în timpul zilei. Înainte de mese sensibilitatea gustativ-olfactivă crește, în timp ce după mese percepția gustativ-olfactivă scade.

Cu toate acestea, criteriul menționat nu trebuie absolutizat în cazul în care foamea poate să distragă atenția degustătorilor, ceea ce diminuează capacitatea lor de departajare, prin urmare se recomandă ca degustarea să aibă loc dimineața între orele 10 și 12.

8.4.   Degustători: norme generale de conduită

Următoarele recomandări se referă la comportamentul degustătorilor în timpul degustării.

Atunci când sunt chemați de către președintele comisiei să participe la testul organoleptic, degustătorii trebuie să respecte orarul stabilit, precum și următoarele reguli:

—	Să se abțină de la fumat și să nu bea cafea cu cel puțin 30 minute înainte de ora stabilită pentru test.

—	Trebuie să nu folosească parfumuri, produse cosmetice sau un săpunuri al căror miros ar putea să persiste în momentul testului. Trebuie să-și spele mâinile cu un săpun fără miros, apoi să le clătească și să le usuce ori de câte ori este necesar pentru a elimina orice miros.

—	Să nu mănânce nimic cu cel puțin o oră înaintea degustării.

—	În cazul unui disconfort fizic, în special dacă le este afectat simțul mirosului sau al gustului sau dacă se află sub efectul unui impact psihologic care îi poate împiedica să se concentreze, degustătorii îl informează pe președintele comisiei pentru ca acesta să îi retragă din testare.

—	După îndeplinirea celor menționate, degustătorii își ocupă locul în cabina care le-a fost atribuită, într-un mod ordonat și silențios.

—

Ei trebuie să citească atent instrucțiunile care figurează pe foaia de profil și să înceapă examinarea probei numai după ce sunt pe deplin pregătiți pentru sarcina de îndeplinit (în mod relaxat și lipsit de grabă). În cazul unor nelămuriri, trebuie să se consulte în particular cu președintele comisiei.

—	Atunci când își îndeplinesc sarcinile, degustătorii păstrează tăcerea.

—	Telefoanele lor mobile trebuie să fie oprite pe toată durata degustării, pentru a nu afecta concentrația și activitatea colegilor.

9.   PROCEDURA PENTRU EVALUAREA ORGANOLEPTICĂ ȘI CLASAREA ULEIULUI DE MĂSLINE VIRGIN

9.1.   Tehnica de degustare

9.1.1.

Degustătorii iau paharul, ținându-l acoperit cu sticla de ceas, apoi îl înclină încet, și în această poziție îl răsucesc pentru a umezi interiorul acestuia pe o suprafață cât mai mare. După această operațiune, scot sticla de ceas și miros proba inspirând lent și profund, pentru a evalua uleiul. Perioada olfactivă nu trebuie să depășească 30 de secunde. Dacă în acest timp degustătorii nu au ajuns la nici o concluzie, fac o scurtă pauză înainte de a trece la o nouă testare. După efectuarea testului olfactiv, degustătorii evaluează senzațiile bucale (senzații retronazale globale și olfactive, gustative și tactile). În acest scop, se ia în gură o mică cantitate de ulei, de aproximativ 3 ml. Este foarte importantă distribuirea uleiului în toată cavitatea bucală, de la partea anterioară a gurii și limbii, trecând prin părțile laterale și partea posterioară, până la vălul palatului și gât, fiind bine cunoscut că gustul și senzațiile tactile sunt percepute cu o intensitate variabilă în funcție de diferitele zone ale limbii, ale palatului și ale gâtului. Trebuie să se insiste asupra necesității de a răspândi uleiul în cantități suficiente și foarte lent în partea posterioară a limbii până la vălul palatului și gât, atenția degustătorului fiind dirijată spre ordinea apariției stimulilor amar și picant. Dacă nu se procedează astfel, la anumite uleiuri cei doi stimuli pot trece neobservați sau stimulul amar poate fi mascat de stimulul picant. Inspirațiile scurte și succesive, care lasă aerul să pătrundă prin gură, permit nu numai buna răspândire a probei în toată cavitatea bucală, dar și perceperea pe cale retronazală a compușilor aromatici volatili, prin utilizarea forțată a acestui canal. Senzația tactilă de picant trebuie luată în considerare. În acest scop, se recomandă ingerarea uleiului.

9.1.2.

Când se efectuează evaluarea organoleptică a uleiului de măsline virgin, se recomandă evaluarea a maximum patru probe în fiecare sesiune, având cel mult trei sesiuni pe zi, pentru a evita efectul de contrast care ar putea apărea prin degustarea imediată a altor probe. Având în vedere că degustările succesive sunt afectate de oboseală sau de pierderea acuității, cauzate de degustările precedente, trebuie să se utilizeze un produs capabil să elimine din gură resturile de ulei de la degustarea tocmai efectuată. Se recomandă utilizarea unei bucățele de măr care, după mestecare, poate fi aruncată în scuipătoare. În continuare, se clătește gura cu puțină apă la temperatura ambiantă. Se lasă să treacă cel puțin 15 minute între sfârșitul unei sesiuni și începutul următoarei.

9.2.   Utilizarea foii de profil de către degustători

Foaia de profil care trebuie utilizată de către degustători este reprodusă în figura 1 din prezenta anexă.

Fiecare degustător din comisie miroase și pe urmă gustă (1) uleiul în cauză. Pe urmă, introduce intensitatea cu care percepe fiecare dintre atributele negative și pozitive pe scara de 10 cm de pe foaia de profil pe care o are la dispoziție.

În cazul în care degustătorii percep atribute negative neindicate în secțiunea 4, acestea se înregistrează la rubrica „altele”, folosindu-se termenul sau termenii care descriu cel mai precis atributele respective.

9.3.   Utilizarea datelor de către președintele comisiei

Președintele comisiei strânge foile de profil completate de fiecare degustător și trece în revistă intensitățile consemnate pentru diferitele atribute. Dacă identifică vreo anomalie, invită degustătorul să își revizuiască fișa de profil și, dacă este necesar, să repete testul.

Președintele comisiei introduce datele referitoare la evaluarea fiecărui membru al comisiei într-un program informatic de tipul celor prevăzute de standardul IOC/T.20/Doc. nr. 15) în vederea calculării din punct de vedere statistic a rezultatelor analizei, bazate pe calcularea medianei acestora. A se vedea punctul 9.4 și apendicele la prezenta anexă. Datele pentru o anumită probă se introduc cu ajutorul unei matrice care conține 9 coloane, reprezentând cele 9 atributele senzoriale, și n linii corespunzătoare celor n membri care fac parte din comisie.

Atunci când se percepe un defect care se înregistrează la rubrica „altele” de către cel puțin 50 % din comisie, președintele comisiei calculează mediana defectului și obține clasarea corespunzătoare.

Valoarea coeficientului de variație robust care definește clasarea (defectul cu cea mai mare intensitate și atributul fructat) trebuie să nu fie mai mare de 20 %.

În caz contrar, președintele comisiei trebuie să repete evaluarea probei respective într-o altă sesiune de degustare.

Dacă această situație este frecventă, se recomandă ca președintele comisiei să ofere degustătorilor o formare specifică suplimentară (IOC/T.20/Doc. nr. 14, punctul 5) și să utilizeze indicele de repetabilitate și indicele de deviație pentru a verifica performanțele comisiei (IOC/T.20/Doc. nr. 14, punctul 6).

9.4.   Clasarea uleiului

Uleiul se clasează în categoriile de mai jos, în funcție de mediana defectelor și de mediana atributului fructat. Mediana defectelor se definește ca mediana defectului perceput cu cea mai mare intensitate. Mediana defectelor și mediana atributului fructat sunt exprimate cu o precizie de o zecimală.

Clasarea uleiului se efectuează prin compararea valorilor medianei defectelor și a medianei atributului fructat cu intervalele de referință prezentate în cele ce urmează. Întrucât limitele acestor intervale s-au stabilit ținându-se cont de eroarea metodei, acestea sunt considerate drept absolute. Programele software permit să se afișeze clasarea într-un tabel de date statistice sau ca grafic.

(a)	În cazul uleiului de măsline extravirgin, mediana defectelor este egală cu 0, iar mediana atributului fructat este mai mare de 0;

(b)	în cazul uleiului de măsline virgin, mediana defectelor este mai mare de 0 și mai mică sau egală cu 3,5, iar mediana atributului fructat este mai mare de 0;

(c)	în cazul uleiului de măsline lampant, mediana defectului depășește 3,5 sau mediana defectului este mai mică sau egală cu 3,5 și mediana atributului fructat este egală cu 0.

Nota 1:

Atunci când mediana atributului amar și/sau a atributului picant depășește 5,0, președintele comisiei trebuie să declare acest lucru pe certificatul de test.

Figura 1

FOAIA DE PROFIL PENTRU ULEIUL DE MĂSLINE VIRGIN

Intensitatea perceperii defectelor
Stătut/de drojdie (*1)
Mucegăit/umed/de pământ (*1)
De vin/oțetit acid/acru (*1)
Măsline înghețate (lemn umed)
Rânced
Alte atribute negative
Descriptor:	Metalic  De fân  Mâncat de viermi  Grosier  De saramură  Încălzit sau ars  De ape de vegetație  Rogoz  Castravete  De lubrifianți 
Intensitatea perceperii atributelor pozitive
Fructat
	Verde 	Copt 
Amar
Picant
Numele degustătorului:			Codul degustătorului:
Codul probei:	Semnătura:

„Apendice

Metoda de calcul al medianei și al intervalelor de încredere

Mediana

Mediana se definește ca numărul real Xm caracterizat de faptul că probabilitatea (p) ca valorile distribuției (X) să fie inferioare acestui număr (Xm) este mai mică sau egală cu 0,5 și că, simultan, probabilitatea (p) ca valorile distribuției (X) să fie inferioare sau egale cu Xm este mai mare sau egală cu 0,5. O definiție mai practică consideră mediana ca fiind a 50-a percentilă a unei distribuții de numere ordonate în ordine crescătoare. În termeni mai simpli, mediana este punctul de mijloc al unui ansamblu ordonat de numere impare, sau media a două puncte de mijloc ale unui ansamblu ordonat de numere pare.

Deviația standard robustă

Pentru a se obține o estimare fiabilă a variabilității în jurul mediei, este necesar să se țină cont de deviația standard robustă, astfel cum a fost estimată conform Stuart și Kendall (4). Formula oferă deviația standard asimptotică robustă, adică estimarea robustă a variabilității datelor luate în considerare, în care N este numărul de observații și IQR este intervalul interquartil, care înglobează exact 50% din cazurile unei anumite distribuții de probabilitate:

Calculul intervalului interquartil se efectuează calculând magnitudinea diferenței dintre a 75-a și a 25-a percentilă.

unde percentila este valoarea Xpc caracterizată de faptul că probabilitatea (p) ca valorile distribuției să fie inferioare Xpc este mai mică sau egală cu o sutime specifică și că, simultan, probabilitatea (p) ca valorile distribuției să fie mai mici sau egale cu Xpc este mai mare sau egală cu acea sutime specifică. Sutimea indică cuantila de distribuție reținută. În cazul medianei, aceasta este egală cu 50/100.

În scopuri practice, percentila este valoarea de distribuție care corespunde unei arii specifice trasate dintr-o curbă de distribuție sau de densitate. De exemplu, a 25-a percentilă reprezintă valoarea de distribuție care corespunde unei arii egale cu 0,25 sau 25/100.

În prezenta metodă, percentilele sunt calculate pe baza valorilor reale care apar în datele din matrice (procedura de calculare a percentilelor).

Coeficientul de variație robust (%)

CVr% reprezintă un număr pur care indică procentajul de variabilitate al seriei de numere analizate. Din acest motiv, coeficientul este foarte util pentru verificarea fiabilității evaluatorilor comisiei.

Intervalele de încredere pentru mediană la 95 %

Intervalele de încredere la 95 % (valoarea erorii de tip I egale cu 0,05 sau 5 %) reprezintă intervalul în care valoarea medianei ar putea varia în ipoteza în care ar fi posibilă repetarea experienței de un număr infinit de ori. În practică, acesta indică intervalul de variabilitate al testului în condițiile de operare reținute, dacă se pleacă de la ipoteza că s-ar putea repeta de mai multe ori. Intervalul ajută la evaluarea fiabilității testului, ca și în cazul CVr%.

unde C = 1,96 pentru intervalul de încredere la nivelul de 95 %.

Un exemplu al fișei de calcul este prezentat în anexa I la standardul IOC/T 20/Doc. nr. 15.

Bibliografie

(1)	Wilkinson, L. 1990. Systat: The system for statistics. Evanston, IL.SYSTAT Inc.

(2)	Cicchitelli, G. 1984. Probabilità e Statistica. Maggioli Editore, Rimini.

(3)	Massart, D.L.; Vandeginste, B.G.M.; Deming, Y.; Michotte, L. 1988. Chemometrics. A textbook. Elsevier. Amsterdam.

(4)	Kendall, M.G.; Stuart, A. 1967. The advanced theory of statistics. Vol. 1. Hafner Publishing Co.

(5)	McGill, R.; Tukey, J.W.; Larsen, W.A. 1978. Variation of Box Plots. The American Statistician, 32, (2), 12-16.

(6)	IOC/T.28/Doc. nr. 1 septembrie 2007, Orientări pentru acreditarea laboratoarelor de teste senzoriale cu referire specială la uleiul de măsline virgin în conformitate cu standardul ISO/IEC 17025:2005.

(7)	IOC/T.20/Doc. nr. 14.

(8)	IOC/T.20/Doc. nr. 15.

(9)	ISO/IEC 17025:05.

„ANEXA XXa

METODĂ PENTRU DETECTAREA PREZENȚEI ÎN ULEIURILE DE MĂSLINE A ULEIURILOR STRĂINE

1.   DOMENIUL DE APLICARE

Această metodă este utilizată pentru a detecta prezența în uleiurile de măsline a uleiurilor vegetale străine. Se pot detecta în uleiurile de măsline uleiurile vegetale cu conținut ridicat de acid linoleic (de soia, de rapiță, de floarea-soarelui etc.) și anumite uleiuri vegetale cu conținut ridicat de acid oleic (cum ar fi uleiurile de alune, de floarea-soarelui cu conținut ridicat de acid oleic și de resturi de măsline). Nivelul detectat depinde de tipul de ulei străin și de soiul măslinelor. În cazul uleiului de alune, este curent un nivel de detecție între 5 și 15 %. Metoda nu este în măsură să identifice tipul de ulei străin detectat, indicând doar dacă uleiul de măsline este autentic sau contrafăcut.

2.   PRINCIPIU

Uleiul se purifică prin extracție în fază solidă (SPE) pe cartușe de silicagel. Compoziția de triacilglicerol (TAG) se determină prin cromatografie lichidă de înaltă rezoluție în fază inversă utilizând un detector de indice de refracție și propionitril ca fază mobilă. Esterii metilici ai acizilor grași (EMAG) sunt preparați din ulei purificat prin metilare cu o soluție rece de KOH în metanol (anexa X B), după care esterii sunt analizați prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară care utilizează coloane cu polaritate mare (anexa X A). Conținutul teoretic de triacilglicerol se calculează pe baza conținutului de acizi grași, de către un program informatic care face ipoteza unei distribuții aleatorii în poziția 1,3 sau 2 a acizilor grași în triacilglicerol, cu restricții pentru acizii grași saturați în poziția 2. Metoda de calcul reprezintă o modificare a procedurii descrise în anexa XVIII. Mai mulți algoritmi matematici sunt calculați pe baza conținutului teoretic și experimental de triacilglicerol (HPLC), iar valorile rezultate sunt comparate cu cele dintr-o bază de date constituită plecând de la uleiuri de măsline autentice.

3.   MATERIAL ȘI REACTIVI

3.1.   Purificarea uleiului

3.1.1.

Vase conice de 25 ml.

3.1.2.

Eprubete din sticlă de 5 ml cu filet superior și dopuri cu îmbinări din PTFE

3.1.3.

Cartușe de silicagel, 1 g (6 ml), pentru extracția în fază solidă (de exemplu Waters, Massachusetts, SUA).

3.1.4.

n-hexan, de calitate analitică.

3.1.5.

Amestec solvent de n-hexan/eter dietilic (87:13, v/v).

3.1.6.

N-heptan, de calitate analitică.

3.1.7.

Acetonă, de calitate analitică.

3.2.   Analiza HPLC a triacilglicerolilor

3.2.1.

Microseringi (50 μl) și ace pentru injectarea HPLC.

3.2.2.

Propionitril, puritate superioară sau calitate HPLC (de exemplu ROMIL, Cambridge, Regatul Unit), utilizat ca fază mobilă.

3.2.3.

Coloană HPLC (25 cm x 4 mm diametru interior), umplută cu faza RP-18 (dimensiunea particulelor de 4 μm).

3.3.   Pregătirea esterilor metilici ai acizilor grași

(a se vedea anexa X B)

3.3.1.

Metanol care conține maximum 0,5 % apă.

3.3.2.

Heptan, de calitate analitică.

3.3.3.

Soluție de hidroxid de potasiu în metanol la 2N. Se dizolvă 1,1 g de hidroxid de potasiu în 10 ml de metanol.

3.3.4.

Eprubete din sticlă de 5 ml cu filet superior și dopuri prevăzute cu îmbinări din PTFE

3.4.   Analiza GC a EMAG

(A se vedea metoda pentru determinarea acizilor grași nesaturați trans prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară descrisă în anexa X A).

3.4.1

Microseringi (5 μl) și ace pentru injectarea GC.

3.4.2

Hidrogen sau heliu ca gaz purtător.

3.4.3

Hidrogen și oxigen pentru detectorul FID.

3.4.4

Azot sau heliu ca gaz purtător auxiliar.

3.4.5.

Coloană capilară de sticlă de siliciu (50-60 m x 0,25 – 0,30 mm diametru interior) acoperită în interior cu o fază de cianopropilpolisiloxan sau cianopropilfenilsiloxan (SP-2380 sau similară) cu o grosime a peliculei de 0,20-0,25 μm.

4.   APARATURA

4.1.

Pompă de vid pentru extracție în fază solidă.

4.2.

Evaporator rotativ.

4.3.

Echipament pentru HPLC format din: 4.3.1. Degazor pentru faza mobilă. 4.3.2. Valvă de injectare Rheodyne cu o buclă de 10 μl. 4.3.3. Instalație de pompare de înaltă presiune. 4.3.4. Etuvă cu termostat pentru coloana HPLC, care poate menține temperaturi mai mici decât temperatura ambiantă (15-20 °C), (de exemplu, de tip Peltier). 4.3.5. Detector de indice de refracție. 4.3.6. Sistem informatizat de culegere a datelor, prevăzut cu un program de integrare.

4.4

Echipamentul pentru cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară descris în anexa X A, care include: 4.4.1. Injector cu splitare. 4.4.2. Detector cu ionizare în flacără (FID). 4.4.3. Etuvă cu temperatură programabilă. 4.4.4. Sistem informatizat de culegere a datelor, prevăzut cu un program de integrare.

4.5.

Calculator care are instalat programul Microsoft Excel.

5.   PROCEDURA ANALITICĂ

5.1.   Purificarea uleiului

În aparatul de eluare de vid se introduce un cartuș de silicagel pentru extracție în fază solidă și se spală sub vid cu 6 ml de hexan. Pentru a preîntâmpina uscarea coloanei, nu se menține vidul. Se așează un balon conic sub cartuș. În coloană se introduce o soluție de ulei (aproximativ 0,12 g) în 0,5 ml de hexan, care se deplasează prin aceasta și care apoi este eluată sub vid cu 10 ml din amestecul solvent (3.1.5) de hexan - eter dietilic (87:13 v/v). Solventul eluat este omogenizat, apoi se toarnă aproximativ jumătate din volum într-un alt balon conic. Ambele soluții se evaporă separat până la uscare într-un evaporator rotativ, la presiune redusă și la temperatura camerei. Pentru analiza triacilglicerolului, se dizolvă reziduurile provenite din prima soluție în 1 ml de acetonă (a se vedea primul paragraf de la punctul 5.2) și se toarnă într-o eprubetă din sticlă de 5 ml cu filet superior. Reziduurile provenite din a doua soluție se dizolvă în 1 ml de n-heptan și se toarnă într-a altă eprubetă din sticlă de 5 ml cu filet superior pentru pregătirea esterilor metilici ai acizilor grași.

Notă: Purificarea uleiului se poate efectua utilizând o coloană de silicagel, după cum se specifică în metoda IUPAC 2.507.

5.2.   Analiza HPLC a triacilglicerolilor

Se pune în funcțiune sistemul HPLC, menținând temperatura coloanei la 20 °C și utilizând propionitril ca fază mobilă la un debit de 0,6 ml/min. Atunci când linia de bază este stabilă, se injectează un solvent, dacă linia de bază pare instabilă în zona de la 12 la 25 min, se utilizează pentru dizolvarea probei un alt tip de acetonă sau un amestec de propionitril/acetonă (25:75).

Notă: Unele tipuri de acetonă produc instabilitatea liniei de bază în zona menționată mai sus.

Se injectează 10μl de parte alicotă din soluția de ulei purificat în acetonă (5 %). Deplasarea durează aproximativ 60 min. Trebuie să se ajusteze temperatura etuvei și/sau debitul, pentru a se obține o cromatogramă similară celei ilustrate în figura 1, în care trilinoleina (vârful 1) eluează la 15,5 min și în care există bune rezoluții între perechile LLL/OLLn (vârfurile 1 și 2) și OLL/OOLn (vârfurile 4 și 5).

Înălțimea vârfului 2 (OLLn+PoLL) trebuie să atingă cel puțin 3 % din scara totală.

5.3.   Pregătirea esterilor metilici ai acizilor grași

Se adaugă 0,1 ml de soluție de hidroxid de potasiu în metanol la 2N la soluția de ulei purificat în 1 ml de n-heptan. Se închide eprubeta, strângând bine dopul filetat. Se agită eprubeta energic timp de 15 secunde și se lasă să se facă separarea până când stratul superior devine limpede (5 minute). Soluția de n-heptan este gata pentru injectarea în cromatograful în fază gazoasă. Soluția poate fi lăsată la temperatura camerei timp de maximum 12 ore.

5.4.   Analiza GC a esterilor metilici ai acizilor grași

Trebuie să se utilizeze procedura descrisă în metoda pentru determinarea acizilor grași nesaturați trans (a se vedea anexa X A).

Se pune în funcțiune sistemul GC la o temperatură a etuvei de 165 °C. Se recomandată o temperatură izotermă a etuvei la 165 °C timp de 10 minute, după care temperatura crește cu 1,5 °C/min până la 200 °C. Se recomandată o temperatură a injectorului de 220 °C - 250 °C, pentru a se reduce la minimum formarea de acizi grași trans (a se vedea anexa X A). Temperatura detectorului: 250 °C. Hidrogenul sau heliul trebuie să fie folosit ca gaz purtător la o presiune în capul coloanei de aproximativ 130 kPa. Volum de injectare de 1μl în modul de injectare cu splitare.

Trebuie să se obțină un profil de GC similar celui indicat în figura 2. Trebuie să se acorde o atenție deosebită rezoluției între C18:3 și C20:1 (vârful C18:3 trebuie să apară înainte de C20:1). Pentru a îndeplini aceste cerințe, trebuie să se optimizeze temperatura inițială și/sau presiunea în capul coloanei. Se ajustează parametrii injectorului (temperatura, raportul de splitare și volumul de injectare), pentru a reduce la minimum separarea acidului palmitic și palmitoleic.

Înălțimea vârfului C20:0 trebuie să fie de aproximativ 20 % din scara totală pentru a cuantifica izomerii trans. Dacă vârful C18:0 pare deformat, se reduce volumul probei.

6.   INTEGRAREA VÂRFURILOR CROMATOGRAFICE

6.1.   Cromatograma HPLC

Figura 1 prezintă o cromatogramă HPLC tipică a triacilglicerolilor pentru un ulei de măsline purificat. Pentru integrarea vârfurilor, trebuie să fie trasate trei linii de bază: prima între începutul vârfului 1 și sfârșitul vârfului 3, a doua între începutul vârfului 4 și valea dinaintea vârfului 8, iar a treia între valea dinaintea vârfului 8 și sfârșitul vârfului 18.

Aria totală este suma ariilor tuturor vârfurilor (identificate și neidentificate), de la vârful 1 până la vârful 18. Procentul fiecărui vârf se calculează după cum urmează:

Procentajele trebuie să fie exprimate cu o precizie de două zecimale.

6.2.   Cromatograma GC

Figura 2 prezintă o cromatogramă GC a esterilor alchilici ai acizilor grași obținuți dintr-un ulei de măsline purificat. Trebuie să se calculeze următoarele procente de acizi grași:

Palmitic;	P (C16:0)	=	ester metilic + ester etilic
Stearic;	S (C18:0)	=	ester metilic
Palmitoleic;	Po (C16:1)	=	suma esterilor metilici ai celor doi izomeri cis
Oleic;	O (C18:1)	=	suma esterilor metilici ai celor doi izomeri cis + ester etilic + izomeri trans
Linoleic;	L (C18:2)	=	ester metilic+ ester etilic + izomeri trans
Linolenic;	Ln (C18:3)	=	ester metilic + izomeri trans
Arahidic;	A (C20:0)	=	ester metilic
Eicosenoic (gondoic);	G (C20:1)	=	ester metilic

Esterii etilici și izomerii trans pot lipsi din cromatograma GC.

Suprafața totală (AT) este suma tuturor valorilor de vârf care figurează în cromatogramă de la C14:0 la C24:0, cu excepția celor care corespund scualenului. Procentul fiecărei valori de vârf se calculează după cum urmează:

Rezultatele trebuie să fie exprimate cu o precizie de două zecimale.

Pentru calculele din programele informatice, nu este necesar să se normalizeze la 100, deoarece acest lucru se face automat.

Figura 1

Cromatograma pentru TAG a unui ulei de măsline virgin „Chamlali”. Componentele principale ale valorilor de vârf cromatografice

(1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; (4) OLL; (5) OOLn+PoOL;

(6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; (8) OOL+LnPP; (9) PoOO;

(10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP;

(13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; (17) SOO;

(18) POS+SLS.

Tabelul 1

Datele privind repetabilitatea la determinarea TAG pentru uleiul de măsline virgin, utilizând HPLC la o temperatură a coloanei de 20 °C și propionitril ca fază mobilă

ECN	Valori de vârf ale HPLC	TAG	Proba 1		Proba 2		Proba 3		Proba 4		Proba 5
			Media (%)	DSRr (%)	Media (%)	DSRr (%)	Media (%)	DSRr (%)	Media (%)	DSRr (%)	Media (%)	DSRr (%)
42	1	LLL	0,020	7,23	0,066	5,18	0,095	4,10	0,113	0,95	0,34	1,05
	2	OLLn+ PoLL	0,085	7,44	0,24	1,78	0,26	2,25	0,35	2,02	0,50	2,83
	3	PLLn	0,023	15,74	0,039	5,51	0,057	5,62	0,082	4,35	0,12	6,15
44	4	OLL	0,47	1,52	1,53	0,42	2,62	0,98	3,35	1,05	4,37	1,13
	5	OOLn+ PoOL	1,07	2,01	1,54	0,46	1,61	0,71	1,72	1,07	1,77	2,40
	6	PLL+ PoPoO	0,11	12,86	0,24	4,37	0,65	1,32	1,35	0,73	2,28	1,24
	7	POLn+ PpoPo+ PpoL	0,42	5,11	0,49	2,89	0,55	2,01	0,85	1,83	1,09	1,96
46	8	OOL+ LnPP	6,72	0,63	8,79	0,31	11,21	0,42	13,25	0,33	15,24	0,23
	9	PoOO	1,24	2,86	1,49	0,95	1,63	0,85	2,12	0,45	2,52	0,56
	10	SLL+ PLO	2,70	0,65	4,05	0,70	6,02	0,65	9,86	0,53	11,53	0,31
	11	PoOP+ SpoL+ SOLn+ SpoPo	0,64	4,42	0,69	3,02	0,79	1,23	1,53	0,89	1,70	1,66
48	12+13	OOO+ PLP+ PoPP	49,60	0,07	48,15	0,06	42,93	0,06	33,25	0,10	24,16	0,06
	14	SOL	0,82	1,72	0,92	1,56	1,05	1,32	1,25	1,05	1,60	1,77
	15	POO	22,75	0,25	21,80	0,20	21,05	0,30	20,36	0,35	20,17	0,14
50	16	POP	3,05	0,46	4,56	0,42	4,98	0,52	5,26	0,41	5,57	0,38
	17	SOO	6,87	0,21	5,56	0,33	4,86	0,43	4,12	0,72	3,09	0,69
	18	POS + SLS	1,73	1,23	1,65	1,10	1,54	0,99	1,49	1,10	1,41	1,00
n = 3 iterări DSRr = Deviație standard relativă a repetabilității

Figura 2

Cromatograma GC a esterilor alchilici ai acizilor grași obținuți dintr-un ulei din resturi de măsline, prin transesterificarea cu o soluție rece de KOH în metanol

7.   DETECTAREA PREZENȚEI ÎN ULEIURILE DE MĂSLINE A ULEIURILOR STRĂINE

Metoda de calcul pentru detectarea prezenței în uleiurile de măsline a uleiurilor străine prin intermediul unei comparații a algoritmilor matematici cu o bază de date constituită plecând de la uleiuri de măsline autentice este stabilită în anexa I la standardul IOC/T.20/Doc. nr. 25.”