ANEXA II
ANEXA XX
Metoda pentru determinarea conținutului de ceruri, esteri metilici ai acizilor grași și esteri etilici ai acizilor grași prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară
1. SCOP
Această metodă se utilizează pentru determinarea conținutului de ceruri, esteri metilici ai acizilor grași și esteri etilici ai acizilor grași în uleiurile de măsline. Cerurile și esterii alchilici se separă în funcție de numărul atomilor de carbon. Metoda se recomandă ca instrument pentru a face distincția între uleiul de măsline și uleiul din turte de măsline, precum și ca parametru de calitate pentru uleiurile de măsline extravirgine, permițând detectarea amestecurilor frauduloase de uleiuri de măsline extravirgine cu uleiuri de calitate inferioară, indiferent dacă este vorba despre uleiuri de măsline virgine, lampante sau unele uleiuri deodorizate.
2. PRINCIPIU
Adăugarea unor standarde interne adecvate pentru ulei, apoi fracționarea prin cromatografie pe o coloană cu silicagel hidratat. Recuperarea fracției eluate în condițiile de testare (cu o polaritate mai mică decât cea a triacilglicerolilor), apoi analiza directă prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.
3. APARATURĂ
3.1. Pahar Erlenmayer, 25 ml.
3.2. Coloană de sticlă pentru cromatografie în fază lichidă, diametru interior 15 mm, înălțime 30-40 cm, echipată cu un robinet adecvat.
3.3. Cromatograf în fază gazoasă adecvat pentru funcționarea cu coloană capilară, echipat cu un sistem de introducere directă în coloană, alcătuit din:
3.3.1. Cuptor cu control prin termostat cu temperatură programabilă.
3.3.2. Injector la rece pentru introducere directă în coloană
3.3.3. Detector cu ionizare în flacără și convertor-amplificator.
3.3.4. Aparat de înregistrare-integrator (nota 1) adaptat la funcționarea cu un convertor-amplificator (punctul 3.3.3) cu timp de răspuns de cel mult o secundă și cu viteză a hârtiei variabilă.
|
Nota 1: |
Se pot utiliza de asemenea sisteme computerizate dacă datele pentru cromatografia în fază gazoasă se introduc printr-un PC. |
3.3.5. Coloană capilară din silice topită (pentru analiza cerurilor și a esterilor metilici și etilici), lungime 8-12 m, diametru interior 0,25-0,32 mm, acoperiră în interior cu fază lichidă (nota 2) într-un strat de grosime uniformă cuprinsă între 0,10-0,30 μm.
|
Nota 2: |
Există în comerț faze lichide care pot fi folosite în acest scop, de exemplu SE52, SE54 etc. |
3.4. Microseringă, 10 μl, cu ac călit, pentru injecție directă pe coloană.
3.5. Agitator electric.
3.6. Evaporator rotativ.
3.7. Cuptor cu muflă.
3.8. Balanță analitică pentru cântărirea cu o acuratețe de ± 0,1 mg.
3.9. Sticlărie de laborator obișnuită.
4. REACTIVI
4.1. Silicagel, 60-200 μm. Silicagelul se păstrează în cuptorul cu muflă la 500 °C timp de cel puțin patru ore. Se lasă să se răcească, apoi se adaugă 2% apă în raport cu cantitatea de silicagel utilizată. Se agită bine pentru omogenizarea suspensiei și se păstrează în desicator timp de cel puțin 12 ore înainte de utilizare.
4.2. n-hexan, pentru cromatografie sau analiza reziduurilor (puritatea trebuie verificată).
AVERTISMENT – Gazele de evacuare se pot aprinde. A se ține la distanță de surse de căldură, scântei sau flăcări deschise. A se verifica întotdeauna etanșeitatea recipientelor. A se asigura ventilarea corespunzătoare în timpul utilizării. A se evita acumularea gazelor de evacuare și a se lua măsuri de eliminarea a oricăror surse de incendiu, precum radiatoarele sau aparatele electrice care nu sunt fabricate din materiale neinflamabile. Toxic la inhalare, poate cauza deteriorarea celulelor sistemului nervos. A se evita inspirarea gazelor de evacuare. A se utiliza, dacă este necesar, un aparat de respirat adecvat. A se evita contactul cu ochii și cu pielea.
4.3. Eter etilic, pentru cromatografie.
AVERTISMENT – Foarte inflamabil și cu toxicitate moderată. Irită pielea. Toxic la inhalare. Poate provoca leziuni ale ochilor. Efectele pot apărea cu întârziere. Poate da naștere unor peroxizi explozivi. Gazele de evacuare se pot aprinde. A se ține la distanță de surse de căldură, scântei sau flăcări deschise. A se verifica întotdeauna etanșeitatea recipientelor. A se asigura ventilarea corespunzătoare în timpul utilizării. A se evita acumularea gazelor de evacuare și a se lua măsuri de eliminarea a oricăror surse de incendiu, precum radiatoarele sau aparatele electrice care nu sunt fabricate din materiale neinflamabile. A nu se evapora până la desicare totală sau cvasitotală. Adăugarea de apă sau alt agent reducător adecvat poate diminua formarea de peroxizi. A nu se ingera. A se evita inspirarea gazelor de evacuare A se evita contactul prelungit sau repetat cu pielea.
4.4. n-heptan, pentru cromatografie, sau izooctan.
AVERTISMENT – Inflamabil. Toxic la inhalare. A se ține la distanță de surse de căldură, scântei sau flăcări deschise. A se verifica întotdeauna etanșeitatea recipientelor. A se asigura ventilarea corespunzătoare în timpul utilizării. A se evita inspirarea gazelor de evacuare A se evita contactul prelungit sau repetat cu pielea.
4.5. Soluție standard de lauril arahidat (nota 3), la 0,05 % (m/V) în heptan (standard intern pentru ceruri).
|
Nota 3: |
Se poate utiliza, de asemenea, palmitat de palmitil, stearat de miristil sau laureat de arahidil. |
4.6. Soluție standard de metil heptadecanoat, la 0,02 % (m/V) în heptan (standard intern pentru esteri metilici și etilici).
4.7. Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol).
4.8. Gaz transportor: hidrogen sau heliu, pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.
AVERTISMENT
Hidrogen. Foarte inflamabil, sub presiune. A se ține la distanță de surse de căldură, scântei, flăcări deschise sau aparate electrice care nu sunt fabricate din materiale neinflamabile. A se verifica dacă supapa buteliei este bine închisă atunci când aceasta nu este utilizată. A se utiliza întotdeauna cu reductor de presiune. A se slăbi resortul reductorului înainte de a deschide supapa buteliei. Nu stați în fața punctului de ieșire a gazului din butelie la deschiderea supapei. A se asigura ventilarea corespunzătoare în timpul utilizării. A nu se transfera hidrogen dintr-o butelie în alta. A nu se amesteca gazul din butelie. Asigurați-vă că buteliile nu pot fi răsturnate. A se păstra la adăpost de lumina soarelui și de surse de căldură. A nu se depozita în mediu corosiv. A nu se utiliza butelii deteriorate sau neetichetate.
Heliu. Gaz comprimat sub presiune ridicată. Reduce cantitatea de oxigen disponibilă pentru respirație. A se păstra recipientul închis. A se asigura ventilarea corespunzătoare în timpul utilizării. A nu se intra în spațiile de depozitare dacă nu sunt ventilate adecvat. A se utiliza întotdeauna cu reductor de presiune. A se slăbi resortul reductorului înainte de a deschide supapa buteliei. A nu se transfera gaz dintr-o butelie în alta. Asigurați-vă că buteliile nu pot fi răsturnate. Nu stați în fața punctului de ieșire a gazului din butelie la deschiderea supapei. A se păstra la adăpost de lumina soarelui și de surse de căldură. A nu se depozita în mediu corosiv. A nu se utiliza butelii deteriorate sau neetichetate. A nu se inhala. A se utiliza exclusiv pentru aplicații tehnice.
4.9. Gaze auxiliare:
|
— |
hidrogen, pur, pentru cromatografie în fază gazoasă. |
|
— |
aer, pur, pentru cromatografie în fază gazoasă. |
AVERTISMENT
Aer. Gaz comprimat sub presiune ridicată. A se utiliza cu atenție în prezența substanțelor combustibile, deoarece temperatura de autoaprindere pentru majoritatea compușilor organici în aer se reduce substanțial la presiune mare. A se verifica dacă supapa buteliei este bine închisă atunci când aceasta nu este utilizată. A se utiliza întotdeauna un reductor de presiune. A se slăbi resortul reductorului înainte de a deschide supapa buteliei. Nu stați în fața punctului de ieșire a gazului din butelie la deschiderea supapei. A nu se transfera gaz dintr-o butelie în alta. A nu se amesteca gazul din butelie. Asigurați-vă că buteliile nu pot fi răsturnate. A se păstra la adăpost de lumina soarelui și de surse de căldură. A nu se depozita în mediu corosiv. A nu se utiliza butelii deteriorate sau neetichetate. Aerul destinat utilizării în aplicații tehnice nu trebuie inhalat sau utilizat pentru aparatele de respirat.
5. PROCEDURA
5.1. Pregătirea coloanei cromatografice
Se prepară o suspensie de 15 g de silicagel (punctul 4.1) în n-hexan (punctul 4.2) și se introduce pe coloană (punctul 3.2). Se lasă să se clarifice spontan. Se definitivează clarificarea cu ajutorul unui agitator electric pentru a face banda de cromatografie mai omogenă. Se percolează 30 ml de n-hexan pentru a înlătura orice impurități. Cu ajutorul balanței analitice (punctul 3.8), se cântăresc exact 500 mg de probă într-o fiolă de 25 ml (punctul 3.1) și se adaugă o cantitate adecvată de soluție standard intern (punctul 4.5), în funcție de conținutul de ceară estimat, de exemplu se adaugă 0,1 mg de lauril arahidat în cazul uleiului de măsline, 0,25-0,50 mg în cazul uleiului din turte de măsline și 0,05 mg de metil heptadecanoat în cazul uleiurilor de măsline (punctul 4.6).
Se transferă proba preparată în coloana cromatografică cu ajutorul dozelor de 2 ml de n-hexan (punctul 4.2).
Se lasă solventul să curgă până la 1 mm deasupra nivelului superior al absorbantului. Se percolează un amestec de n-hexan/eter etilic (99:1) și se colectează 220 ml la un debit de aproximativ 15 picături la fiecare 10 secunde. (Această fracțiune conține esterii metilici, esterii etilici și cerurile). (Nota 4) (Nota 5).
|
Nota 4: |
Amestecul de n-hexan/eter etilic (99:1) trebuie să fie proaspăt pregătit în fiecare zi. |
|
Nota 5: |
Pentru a verifica vizual eluția corectă a cerurilor, se poate adăuga la soluția probei 100 μl de colorant Sudan I diluat la 1 % în amestecul de eluție. Colorantul are un timp de retenție cuprins între cel al cerurilor și cel al triacilglicerolilor. Prin urmare, atunci când colorantul atinge fundul coloanei cromatografice, eluția trebuie suspendată deoarece toate cerurile au fost eluate. |
Se evaporă fracțiunile rezultate într-un evaporator rotativ până când aproape tot solventul este eliminat. Se elimină ultimii 2 ml de solvent cu ajutorul unui curent slab de azot. Se colectează fracțiunea care conține esterii metilici și etilici, diluată cu 2-4 ml de n-heptan sau izooctan.
5.2. Analiza prin cromatografie în fază gazoasă
5.2.1. Procedura preliminară
Se instalează coloana în cromatograful în fază gazoasă (punctul 3.3), conectând extremitatea de intrare la sistemul coloanei și extremitatea de ieșire la detector. Se verifică aparatura pentru cromatografia în fază gazoasă (funcționarea buclelor cu gaz, eficiența detectorului și a aparatului înregistrator etc.).
În cazul în care coloana este folosită pentru prima dată, se recomandă condiționarea sa. Se trece un debit slab de gaz prin coloană, apoi se deschide aparatul de cromatografie în fază gazoasă. Se încălzește treptat până la atingerea unei temperaturi de 350 °C, după aproximativ patru ore.
Se menține această temperatură timp de cel puțin două ore, apoi se reglează aparatul la condițiile de funcționare [se reglează debitul de gaz, se aprinde flacăra, se conectează la aparatul înregistrator electronic (punctul 3.3.4), se reglează temperatura cuptorului pentru coloană, detectorul etc.]. Se înregistrează semnalul la o sensibilitate cel puțin de două ori mai mare decât cea necesară pentru analiză. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf, de orice natură, și să nu prezinte abateri.
O abatere negativă în linie dreaptă indică faptul că nu sunt efectuate corect conexiunile coloanei, iar o abatere pozitivă indică faptul că nu a fost condiționată corect coloana.
5.2.2. Alegerea condițiilor de funcționare pentru ceruri, esteri metilici și esteri etilici (Nota 6)
Condițiile de funcționare care trebuie respectate sunt, în general, următoarele:
— Temperatura coloanei: 20 °C/min 5 °C/min
80 °C inițial (1′) 
140 °C 
335 °C (20)
— Temperatura detectorului: 350 °C.
— Cantitatea injectată: 1 μl de soluție (2-4 ml) de n-heptan.
— Gaz transportor: heliu sau hidrogen cu viteză lineară optimă pentru gazul ales (a se vedea apendicele A).
— Sensibilitatea instrumentelor: adecvată pentru îndeplinirea condițiilor de mai sus.
|
Nota 6: |
Datorită temperaturii finale ridicate, este permisă o abatere pozitivă care să nu depășească însă 10 % din valoarea maximă admisibilă la citire. |
Aceste condiții se pot modifica pentru a se adapta caracteristicilor coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, în scopul separării tuturor cerurilor și esterilor metilici și etilici ai acizilor grași, precum și în scopul obținerii unei separări a vârfurilor satisfăcătoare (a se vedea figurile 2, 3 și 4) și a unui timp de retenție de 18 ± 3 minute pentru standardul intern de lauril arahidat. Vârful cel mai reprezentativ al cerurilor trebuie să fie peste 60 % din valoarea maximă admisibilă la citire, în timp ce standardul intern de metil heptadecanoat pentru esterii metilici și etilici trebuie să atingă valoarea maximă admisibilă la citire.
Se determină parametrii de integrare a vârfurilor în așa fel încât să se obțină o evaluare corectă a suprafeței vârfurilor luate în considerare.
5.3. Realizarea analizei
Se iau 10 μl de soluție cu ajutorul unei microseringi de 10 μl, retrăgând pistonul până când acul este gol. Se introduce acul în sistemul de injecție și se injectează repede, după una sau două secunde. După aproximativ 5 secunde, acul se scoate ușor.
Se înregistrează până la eluarea completă a cerurilor sau a stigmastadienelor, în funcție de fracțiunea analizată.
Linia de bază trebuie să corespundă întotdeauna condițiilor impuse.
5.4. Identificarea vârfurilor
Se identifică vârfurile timpilor de retenție, comparându-le cu amestecuri de ceruri cu timpi de retenție cunoscuți, analizate în aceleași condiții. Esterii alchilici se identifică din amestecuri de esteri metilici și etilici din principalii acizi grași conținuți în uleiurile de măsline (palmitic și oleic).
Figura 1 prezintă cromatograma cerurilor pentru un ulei de măsline virgin. Figurile 2 și 3 prezintă cromatogramele a două uleiuri de măsline extravirgine din comerț, unul cu esteri metilici și etilici, iar celălalt fără. Figura 4 prezintă cromatograma unui ulei de măsline extravirgin de bună calitate și cea a aceluiași ulei conținând în proporție de 20 % un ulei deodorizat.
5.5. Analiza cantitativă a cerurilor
Se determină suprafața vârfurilor corespunzătoare standardului intern de lauril arahidat și esterilor alifatici de la C40 la C46 cu ajutorul integratorului.
Se determină conținutul total de ceruri adunând fiecare tip de ceară, în mg/kg de grăsime, după cum urmează:
unde:
|
Ax |
= |
aria corespunzătoare vârfului pentru fiecare ester, calculată sub formă numerică |
|
As |
= |
aria corespunzătoare vârfului pentru standardul intern de lauril arahidat, calculată sub formă numerică |
|
ms |
= |
masa de standard intern de lauril arahidat adăugat, în miligrame; |
|
m |
= |
masa probei prelevate pentru determinare, în grame. |
5.5.1. Analiza cantitativă a esterilor metilici și etilici
Cu ajutorul integratorului, se determină ariile vârfurilor corespunzătoare standardului intern de metil heptadecanoat, esterilor metilici ai acizilor grași C16 și C18, precum și esterilor etilici ai acizilor grași C16 și C18.
Se determină conținutul pentru fiecare ester alchilic, în mg/kg de grăsime, după cum urmează:
unde:
|
Ax |
= |
aria corespunzătoare vârfului pentru fiecare ester C16 și C18, calculată sub formă numerică |
|
As |
= |
aria corespunzătoare vârfului pentru standardul intern de metil heptadecanoat, calculată sub formă numerică |
|
ms |
= |
masa de standard intern de metil heptadecanoat adăugat, în miligrame; |
|
m |
= |
masa probei prelevate pentru determinare, în grame. |
6. EXPRIMAREA REZULTATELOR
Se indică suma de ceruri conținute de la C40 la C46 (Nota 7) în miligrame per kilogram de grăsime.
Se indică suma esterilor metilici și a esterilor etilici conținuți de la C16 la C18 și totalul celor două.
Rezultatele se aproximează la cea mai apropiată valoare în mg/kg.
|
Nota 7: |
Componentele de cuantificat se referă la vârfurile esterilor C40 - C46 cu un număr par de atomi de carbon, conform cromatogramei cerurilor din uleiul de măsline reproduse în figura atașată. În scopul identificării, dacă esterul C46 este scindat, se recomandă să se analizeze fracțiunea de ceruri a unui ulei din turte de măsline, unde vârful pentru C46 se poate distinge, deoarece acesta este clar predominant. |
Se indică raportul dintre esterii etilici și esterii metilici.
Figura 1
Exemplu de cromatogramă în fază gazoasă a fracțiunii cerurilor dintr-un ulei de măsline (1)
Figura 2
Esteri metilici, esteri etilici și ceruri într-un ulei de măsline virgin
Figura 3
Esteri metilici, esteri etilici și ceruri într-un ulei de măsline extravirgin
Figura 4
Cromatograma parțială a unui ulei de măsline extravirgin și cea a aceluiași ulei conținând un ulei deodorizat
Apendicele A
Determinarea vitezei liniare a gazului
Se injectează 1:3 μl de metan (sau propan) în cromatograful în fază gazoasă, după ce acesta a fost în prealabil reglat la condițiile normale de funcționare. Se măsoară timpul în care gazul trece prin coloană, din momentul în care a fost injectat până când apare vârful (tM).
Viteza liniară în cm/s se obține prin formula L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri, iar tM este timpul măsurat în secunde.
(1) După eluarea esterilor steroli, traseul cromatografic nu trebuie să prezinte vârfuri semnificative (triacilgliceroli).