31999L0027

DIRECTIVA 1999/27/CE A COMISIEI

din 20 aprilie 1999

de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru dozarea de amproliu, diclazuril și carbadox în furaje, de modificare a Directivelor 71/250/CEE, 73/46/CEE și de abrogare a Directivei 74/203/CEE

(Text cu relevanță pentru SEE)

COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,

având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,

având în vedere Directiva 70/373/CEE a Consiliului din 20 iulie 1970 privind introducerea modalităților de prelevare de probe și a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor (1), modificată ultima dată de actul de aderare a Austriei, Finlandei și Suediei, în special articolul 2,

întrucât:

ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:

Articolul 1

Statele membre prevăd ca analizele efectuate pentru controalele oficiale ale conținutului de amproliu, diclazuril și carbadox din hrana pentru animale și preamestecuri să fie realizate în conformitate cu metodele prezentate în anexa la prezenta directivă.

Articolul 2

Directiva 71/250/CEE se modifică astfel:

Articolul 3

Directiva 75/46/CEE se modifică după cum urmează:

Articolul 4

A cincea Directivă 74/203/CEE se abrogă.

Articolul 5

Statele membre pun în aplicare actele cu putere de lege și actele administrative necesare pentru a se conforma prezentei directive până la 31 octombrie 1999. Statele membre informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.

Statele membre aplică dispozițiile în cauză de la 1 noiembrie1999.

Atunci când statele membre adoptă aceste acte, ele conțin o trimitere la prezenta directivă sau sunt însoțite de o asemenea trimitere la data publicării lor oficiale. Statele membre stabilesc modalitatea de efectuare a acestei trimiteri.

Articolul 6

Prezenta directivă intră în vigoare în a douăzecea zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.

Articolul 7

Prezenta directivă se adresează statelor membre.

(1)  JO L 170, 3.8.1970, p. 2.

(2)  JO L 270, 14.12.1970, p. 1.

(3)  JO L 6, 12.1.1999, p. 3.

(4)  JO L 347, 23.12.1988, p. 31.

(5)  JO L 155, 12.7.1971, p. 13.

(6)  JO L 208, 24.7.1998, p. 49.

(7)  JO L 83, 30.3.1973, p. 21.

(8)  JO L 108, 22.4.1974, p. 7.

(9)  JO L 246, 29.8.1981, p. 32.

ANEXĂ

Partea A

DOZAJUL AMPROLIULUI

Clorhidrat de clorură de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidin)metil]-2-picolină

1.   Obiect și domeniu de aplicare

Prezenta metodă permite dozarea amproliului în hrana pentru animale și preamestecuri. Limita de detecție este de 1 mg/kg, limita de dozaj este de 25 mg/kg

2.   Principiu

Proba este supusă unei extrageri printr-un amestec de metanol/apă. După diluarea într-o fază mobilă și filtrarea prin membrană, conținutul de amproliu se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (CLHP) cu schimb de cationi cu ajutorul unui detector UV.

3.   Reactivi

3.1.   Metanol

3.2.   Acetonitril, având calitatea CLHP

3.3.   Apă, având calitatea CLHP

3.4.   Soluție de fosfat monosodic, c = 01 mol/l

Se dizolvă 13,80 g de fosfat monosodic monohidratat în apă (3.3), într-un balon gradat de 1 000 ml, se completează până la semn cu apă (3.3) și se amestecă.

3.5.   Soluție de perclorat de sodiu, c = 1,6 mol/l

Se dizolvă 224,74 g de perclorat de sodiu monohidratat în apă (3.3) într-un balon gradat de 1 000 ml, se completează până la semn cu apă (3.3) și se amestecă.

3.6.   Fază mobilă pentru CLHP (vezi punctul 9.1)

Amestec de acetonitril (3.2), soluție de fosfat monosodic (3.4) și soluție de perclorat de sodiu (3.5), 450 + 450 + 100 (V + V + V). Înainte de utilizare, se trece printr-un filtru cu membrana de 0,22 μm (4.3) și se degazează soluția [de exemplu într-o baie ultrasonică (4.4) timp de cel puțin 15 minute].

Substanță etalon: amproliu pur, clorhidrat de clorură de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidin)metil]-2-picolină, E750 (a se vedea 9.2).

3.7.1.   Soluție-mamă a etalonului de amproliu, 500 μg/ml

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,1 mg, 50 mg de amproliu (3.7) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în 80 ml de metanol (3.1) și se așează balonul timp de 10 min. într-o baie ultrasonică (4.4). După tratamentul ultrasonic, se aduce soluția la temperatura camerei, se completează până la semn cu apă și se amestecă. La o temperatură de ≤ 4 °C, soluția este stabilă timp de o lună.

3.7.2.   Soluție etalon intermediară de amprolium, 50 μg/ml

Se introduc cu pipeta 5,0 ml din soluția-mamă a etalonului (3.7.1) într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu solvent de extracție (3.8) și se amestecă. La o temperatură de ≤ 4 °C, soluția este stabilă timp de o lună.

3.7.3.   Soluții de etalonare

Se transferă 0,5, 1,0, și 2,0 ml din soluția etalon intermediară (3.7.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se completează până la semn cu faza mobilă (3.6) și se amestecă. Aceste soluții corespund la 0,5, 1,0 și respectiv 2,0 μg de amproliu pe ml. Ele trebuie reînnoite la fiecare întrebuințare.

3.8.   Solvent de extracție

Amestec de metanol (3.1) – apă 2 + 1 (V + V).

4.   Aparatura

Echipament CLHP cu sistem de injecție care permite injectarea unor volume de 100 μl.

4.1.1.   Coloana pentru cromatografie lichidă de 125 mm x 4 mm cu schimb de cationi, umplută cu Nucleosil 10 SA de 10 μm sau echivalent.

4.1.2.   Detector UV cu lungime de undă variabila sau detector de diode cu linii transversale.

4.2.   Filtru cu membrană, material PTFE, de 0,45 μm.

4.3.   Filtru cu membrană de 0,22 μm.

4.4.   Baie ultrasonică.

4.5.   Agitator mecanic sau amestecător magnetic.

5.   Mod de operare

5.1.   Generalități

5.1.1.   Aliment probă martor

Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2), se analizează un aliment probă pentru a verifica absența amproliului sau a unor substanțe interferente. Alimentul probă trebuie să fie de același tip cu eșantionul; nu trebuie să se detecteze nici amproliu nici substanțe interferente.

5.1.2.   Test de recuperare

Se efectuează un test de recuperare prin analiza alimentului probă la care s-a adăugat o cantitate de amproliu similară celei prezente în eșantion. Pentru a obține o concentrație de 100 mg/kg, se transferă 10,0 ml din soluția de bază etalon (3.7.1) într-un balon conic de 250 ml și se concentrează soluția prin evaporare la aproximativ 0,5 ml. Se adaugă 50 g din alimentul probă, se amestecă cu grijă și se lasă să stea 10 minute, amestecându-se din nou de mai multe ori înainte de a trece la extracție (5.2).

În mod alternativ, în lipsa unui aliment probă de același tip cu eșantionul (a se vedea 5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat conform acestei metode prin adăugarea etalonului. În acest caz, eșantionul de analizat este suplimentat cu o cantitate de amproliu similară cu cea deja prezentă în eșantion. Acesta este analizat cu eșantionul care nu a fost suplimentat și recuperarea poate fi calculată prin diferență.

5.2.   Extracția

5.2.1.   Preamestecuri (conținut < 1 % amproliu) și hrană pentru animale

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,01 g, 5–40 g din eșantion, în funcție de conținutul său de amproliu, într-un balon conic de 500 ml și se adaugă 200 ml de solvent de extracție (3.8). Se așează balonul timp de 15 minute în baia ultrasonică (4.4). Se scoate balonul din baia ultrasonică și se agită cu ajutorul agitatorului mecanic sau magnetic (4.5) timp de 1 oră. Se diluează o parte alicotă din extract cu faza mobilă (3.6), pentru a se obține un conținut de amprolium de 0,5–2μg/ml și se amestecă (a se vedea observația 9.3). Se filtrează 5–10 ml din această soluție diluată cu un filtru cu membrană (4.2). Se efectuează dozajul prin CLHP (5.3).

5.2.2.   Preamestecuri (conținut ≤ 1 % amproliu)

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,001 g, 1–4 g de preamestec în funcție de conținutul său de amproliu într-un balon conic de 500 ml și se adaugă 200 ml solvent de extracție (3.8). Se așează balonul timp de 15 minute în baia ultrasonică (4.4). Se scoate balonul din baia ultrasonică și se agită cu ajutorul agitatorului mecanic sau magnetic (4.5) timp de 1 oră. Se diluează o parte alicotă de extract cu faza mobilă (3.6) pentru a obține un conținut de amproliu de 0,5–2 μg/ml și se amestecă. Se filtrează 5–10 ml din această soluție diluată cu un filtru cu membrană (4.2). Se efectuează dozajul prin CLHP (5.3).

5.3.   Dozaj CLHP

5.3.1.   Parametri

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu indicativ; se pot aplica și alte condiții dacă dau rezultate echivalente.

Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic injectându-se de mai multe ori soluția de etalonare (3.7.3) care conține 1,0 μg/ml până când se obțin înălțimi ale semnalului și timpi de reținere constanți.

5.3.2.   Curba de etalonare

Se injectează fiecare soluție de etalonare (3.7.3) de mai multe ori și se determină înălțimea (suprafața) medie a vârfurilor pentru fiecare concentrație. Se stabilește o curbă de etalonare utilizându-se înălțimile (suprafețele) medii ale vârfurilor soluțiilor de etalonare ca ordonate și concentrațiile corespunzătoare în μg/ml ca abscise.

5.3.3.   Soluția eșantionului

Se injectează extractul din probă (5.2) de mai multe ori utilizându-se același volum ca și cel reținut pentru soluțiile de etalonare și se determină înălțimea (suprafața) medie a vârfurilor de amproliu.

6.   Exprimarea rezultatelor

Plecând de înălțimea (suprafața) medie a vârfurilor de amproliu din soluția probei, se determină conținutul soluției probei în μg/ml în raport cu curba de etalonare (5.3.2.).

Conținutul w de amproliu, exprimat în mg/kg din probă, este dat de următoarea formulă:

formulă în care:

V= volumul solventului de extracție (3.8) în ml conform 5.2 (adică 200 ml).

δ= conținutul de amproliu al extractului din eșantion (5.2) în μg/ml.

f= factorul de diluare conform 5.2.

m= masa porției de probă în g.

7.   Validarea rezultatelor

7.1.   Identitate

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau cu ajutorul unui detector cu linii transversale de diode care permite compararea spectrelor extractului din eșantion (5.2) și al soluției de etalonare (3.7.3) care conține 2,0 μg/ml.

7.1.1.   Co-cromatografie

Unui extract din probă (5.2) i se adaugă o cantitate adecvată din soluția de etalonare (3.7.3). Cantitatea de amproliu adăugată trebuie să fie similară cantității de amproliu constatată în extractul din eșantion.

Numai înălțimea vârfului de amproliu trebuie să fie mărită, ținând cont de cantitatea adăugată și de diluția extractului. Lățimea vârfului la jumătatea înălțimii trebuie să se situeze la ± 10 % din lățimea inițială a vârfului de amproliu din extractul din probă care nu a fost suplimentată.

7.1.2.   Detectarea prin linii transversale de diode

Se evaluează rezultatele după următoarele criterii:

Dacă unul dintre aceste criterii nu este îndeplinit, prezența analitului nu este confirmată.

7.2.   Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două dozaje paralele efectuate pe aceeași probă nu trebuie să depășească:

7.3.   Recuperare

Pentru o probă suplimentată, randamentul trebuie să fie de cel puțin 90 %.

8.   Rezultatele unui studiu între laboratoare

S-a organizat un studiu între laboratoare, în cursul căruia au fost analizate trei tipuri de hrană pentru păsări de curte (probele 1–3), un furaj mineral (proba 4) și un preamestec (proba 5). Rezultatele studiului figurează mai jos:

9.   Observații

9.1.   În cazul în care proba conține tiamină, vârful tiaminei în cromatogramă apare puțin înaintea vârfului amproliumului. Conform acestei metode, amproliul și tiamina trebuie să fie separate. În cazul în care amproliul și tiamina nu sunt separate prin coloana (4.1.1) utilizată în această metodă, se înlocuiește până la 50 % din porția de acetonitril din faza mobilă (3.6) cu metanol.

9.2.   Conform Farmacopeei Britanice, spectrul soluției de amproliu (c = 0,02 mol/l) în acid clorhidric (c = 0,1 mol/l) prezintă valori maxime la 246 nm și 262 nm. Absorbanța va fi de 0,84 la 246 nm și de 0,80 la 262 nm.

9.3.   Extractul trebuie întotdeauna să fie diluat cu faza mobilă, altfel timpul de reținere al vârfului de amproliu se poate schimba în mod semnificativ din cauza variațiilor forței ionice.

PARTEA B

DOZAJUL DICLAZURILULUI

2,6 cloro-alfa-(4-clorofenil)-4-[4,5-dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)-il]benzen-acetonitril

1.   Obiect și domeniu de aplicare

Prezenta metodă permite dozarea diclazurilului în furaje și preamestecuri. Limita de detecție este de 0,1 mg/kg; limita de dozaj este de 0,5 mg/kg.

2.   Principiu

După adăugarea unei probe interne, proba este extrasă cu ajutorul metanolului acidifiat. În cazul hranei pentru animale, o parte alicotă din extract se purifică într-un cartuș C18 pentru extracția în faza solidă. Se eluează diclazurilul din cartuș cu ajutorul unui amestec de metanol acidifiat și apă. După evaporare, reziduul se dizolvă în amestec DMF/apă. Pentru preamestecuri, extractul se evaporă și reziduul se dizolvă într-un amestec DMF/apă. Conținutul de diclazuril se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (CLHP) la gradiente ternare și în fază inversată, cu ajutorul unui detector UV.

3.   Reactivi

3.1.   Apă de calitatea CLHP.

3.2.   Acetat de amoniu.

3.3.   Sulfat acid de tetrabutilamoniu (TBHS).

3.4.   Acetonitril, de calitatea CLHP.

3.5.   Metanol, de calitatea CLHP.

3.6.   N,N–dimetilformamidă (DMF).

3.7.   Acid clorhidric, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8.   Substanță etalon: diclazuril II-24: 2,6 cloro-alfa-(4-clorofenil)-4-[4,5-dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)-il]benzen-acetonitril, garantat pur, E771.

3.8.1.   Soluția-mamă a etalonului de diclazuril, 500 μg/ml.

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,1 mg, 25 mg de substanță etalon de diclazuril (3.8) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF (3.6), se completează până la semn cu DMF (3.6) și se amestecă. Se învelește balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un balon opac și se introduce în frigider. La o temperatură de ≤4 °C, soluția este stabilă o lună.

3.8.2.   Soluția etalon de diclazuril, 50 μg/ml.

Se transferă 5,00 ml din soluția-mamă a etalonului (3.8.1) într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu DMF (3.6) și se amestecă. Se învelește balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un balon opac și se introduce în frigider. La o temperatură de ≤ 4 °C, soluția este stabilă o lună.

3.9.   Etalon intern: 2,6 dicloro-alfa-(4-clorofenil)-4-[4,5-dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)-il]alfa-metilbenzen-acetonitril.

3.9.1.   Soluția-mamă a etalonului intern, 500 μg/ml.

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,1 mg, 25 mg de substanță etalon intern (3.9) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF (3.6), se completează până la semn cu DMF (3.6) și se amestecă. Se învelește balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un balon opac și se introduce în frigider. La o temperatură de ≤ 4 °C, soluția este stabilă o lună.

3.9.2.   Soluția etalonului intern, 50 μg/ml

Se transferă 5,00 ml din soluția-mamă a etalonului intern (3.9.1) într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu DMF (3.6) și se amestecă. Se învelește balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un balon opac și se introduce în frigider. La o temperatură de ≤4 °C, soluția este stabilă o lună.

3.9.3.   Soluția etalonului intern pentru preamestecuri, p/1 000 mg/ml (p = conținutul nominal de diclazuril al preamestecului în mg/kg)

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,1 mg, p/10 mg de etalon intern într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în DMF (3.6) într-o baie ultrasonică (4.6), se completează până la semn cu DMF și se amestecă. Se învelește balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un balon opac și se introduce în frigider. La o temperatură de ≤ 4 °C, soluția este stabilă o lună.

3.10.   Soluția de etalonare, 2 μg/ml

Se toarnă cu pipeta 2,00 ml din soluția etalon de diclazuril (3.8.2) și 2,00 ml din soluția etalon intern (3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 16 ml de DMF (3.6), se completează până la semn cu apă și se amestecă. Această soluție trebuie preparată de fiecare dată când este folosită.

3.11.   Cartușul C 18 pentru extracție în fază solidă, de exemplu Bond Elut, mărimea: 1 cc, masa de sorbție 100 ml.

3.12.   Solvent de extracție: metanol acidifiat.

Se toarnă cu pipeta 5,0 ml de acid clorhidric (3.7) în 1 000 ml metanol (3.5) și se amestecă.

3.13.   Faza mobilă pentru CLHP.

Eluant A: acetat de amoniu – soluție de sulfat acid de tetrabutilamoniu.

3.13.1.   Se dizolvă 5 g de acetat de amoniu (3.2) și 3,4 g de TBHS (3.3) în 1 000 ml apă (3.1) și se amestecă.

3.13.2.   Eluant B. acetonitril (3.4).

3.13.3.   Eluant C: metanol (3.5).

4.   Aparatura

4.1.   Agitator mecanic.

Echipament pentru CLHP cu gradiente ternare.

4.2.1.   Coloană pentru cromatografie lichidă, umplută cu Hypersil ODS de 3 μm, 100 mm × 4,6 mm, sau echivalent.

4.2.2.   Detector UV cu lungime de undă variabilă sau detector cu linii transversale de diode.

4.3.   Evaporator rotativ sub vid.

4.4.   Filtru cu membrană de 0,45 μm.

4.5.   Distribuitor la vid.

4.6.   Baie ultrasonică.

5.   Mod de operare

5.1.   Generalități

5.1.1.   Aliment probă martor

Se analizează un aliment probă pentru a verifica lipsa diclazurilului sau a substanțelor interferente. Alimentul probă trebuie să fie de același tip cu eșantionul; nu trebuie să se detecteze nici diclazuril, nici substanțe interferente.

5.1.2.   Test de recuperare

Se efectuează un test de recuperare prin analiza alimentului probă la care s-a adăugat o cantitate de diclazuril similară cu cea prezentă în eșantion. Pentru a obține o concentrație de 1 mg/kg, se adaugă 0,1 ml din soluția-mamă a etalonului (3.8.1) la 50 g din alimentul probă, se amestecă cu grijă și se lasă să stea 10 minute, se amestecă din nou de mai multe ori înainte de a se trece la extracție (5.2).

În mod alternativ, în lipsa unui aliment probă de același tip ca eșantionul (a se vedea 5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat conform metodei, adăugându-se etalonul. În acest caz, eșantionul de analizat se suplimentează cu o cantitate de diclazuril asemănătoare celei deja prezente în eșantion. Acesta este analizat cu eșantionul care nu a fost suplimentat și recuperarea poate fi calculată prin diferență.

5.2.   Extracția

5.2.1.   Hrana pentru animale

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,01 g, aproximativ 50 g de eșantion. Se transferă într-un balon conic de 500 ml, se adaugă 1,00 ml din soluția etalon intern (3.9.2), 200 ml din solventul de extracție (3.12) și se astupă balonul. Se agită amestecul pe agitator (4.1) timp de o noapte. Se lasă să se așeze 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 20 ml din supernatant într-un recipient de sticlă adecvat și se diluează în 20 ml apă. Se transferă această soluție într-un cartuș de extracție (3.11) și se filtrează sub vid (4.5). Se spală cartușul cu ajutorul a 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracție (3.12) și de apă, 65 + 35 (V + V). Se elimină fracțiile colectate și se eluează compușii cu ajutorul a 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracție (3.12) și apă, 80 + 20 (V + V). Se evaporă această fracție până când începe să se usuce cu ajutorul unui evaporator rotativ (4.3) la 60 °C. Se dizolvă reziduul în 1,0 ml de DMF (3.6), se adaugă 1,5 ml apă (3.1) și se amestecă. Se filtrează cu un filtru cu membrană (4.4). Se efectuează dozajul prin CLHP (5.3).

5.2.2.   Preamestecuri

Se cântărește, cu o marjă de eroare de 0,001 g, aproximativ 1 g de eșantion. Se transferă într-un balon conic de 500 ml, se adaugă 1,00 ml din soluția etalon intern (3.9.3) și 200 ml din solventul de extracție (3.12) și se astupă balonul. Se agită amestecul pe agitator (4.1) timp de o noapte. Se lasă să se așeze 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 10 000/p ml (p = conținutul nominal al preamestecului de diclazuril în mg/kg) din supernatant într-un balon cu fund rotund de dimensiuni adecvate. Se evaporă acest amestec până începe să se usuce, la presiune scăzută și la 60 °C, cu ajutorul unui evaporator rotativ (4.3). Se dizolvă din nou reziduul în 10,0 ml de DMF (3.6), se adaugă 15,0 ml apă (3.1) și se amestecă. Se efectuează dozajul prin CLHP (5.3).

5.3.   Dozaj CLHP

5.3.1.   Parametri

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu indicativ; se pot aplica și alte condiții dacă dau rezultate echivalente.

Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic injectându-se de mai multe ori soluția de etalonare (3.10) care conține 2 μg/ml, până se obțin înălțimi de vârf și timpi de reținere constanți.

5.3.2.   Soluția de etalonare

Se injectează 20 μl din soluția de etalonare (3.10) de mai multe ori și se determină înălțimea (suprafața) medie a vârfurilor de diclazuril și de etalon intern.

5.3.3.   Soluția probei

Se injectează 20 μl din soluția probei (5.2.1 sau 5.2.2) de mai multe ori și se determină înălțimea (suprafața) medie a vârfurilor de diclazuril și de etalon intern.

6.   Exprimarea rezultatelor

6.1.   Furaje

Conținutul de diclazuril w (în mg/kg) al eșantionului este dat de următoarea formulă:

[mg/kg]

formulă în care:

6.2.   Preamestecuri

Conținutul de diclazuril w (mg/kg) al eșantionului este dat de următoarea formulă:

[mg/kg]

formulă în care:

7.   Validarea rezultatelor

7.1.   Identitate

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau cu ajutorul unui detector cu linii transversale de diode care permite compararea spectrelor extractului din probă (5.2.1 sau 5.2.2) și al soluției de etalonare (3.10).

7.1.1.   Co-cromatografie

La un extract din probă (5.2.1 sau 5.2.2) se adaugă o cantitate adecvată din soluția de etalonare (3.10). Cantitatea de diclazuril adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea de diclazuril constatată în extractul din probă.

Numai înălțimea vârfului de diclazuril și a vârfului etalonului intern trebuie să fie mărită ținându-se cont atât de cantitatea adăugată, cât și de diluția extractului. Lățimea vârfului la jumătatea înălțimii trebuie să se situeze la ± 10 % din lățimea inițială a vârfului de diclazuril sau a vârfului etalonului intern al extractului din proba care nu a fost suplimentată.

7.1.2.   Detectarea prin liniile transversale de diode

Se evaluează rezultatele după următoarele criterii:

7.2.   Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două dozaje paralele efectuate pe aceeași probă nu trebuie să depășească:

7.3.   Recuperare

Pentru o probă suplimentară, recuperarea trebuie să fie de cel puțin 80 %.

8.   Rezultatele unui studiu între laboratoare

S-a realizat un studiu între laboratoare, în cursul căruia au fost analizate cinci probe de către 11 laboratoare. Aceste probe erau formate din două preamestecuri: unul era amestecat cu o matrice organică (O 100), iar celălalt cu o matrice anorganică (A 100). Conținutul teoretic este de 100 mg de diclazuril pe kg. Cele trei tipuri de hrană pentru păsări de curte erau fabricate de trei producători diferiți (NL) (L1/Z1/K1). Conținutul teoretic este de 1 mg de diclazuril pe kg. Laboratoarele primiseră instrucțiuni să analizeze fiecare probă o singură dată sau în duplicat. (Informații detaliate privind acest studiu între laboratoare figurează în Journal of AOAC, vol. 77, nr. 6, 1994, p. 1359 – 1361). Rezultatele studiului sunt prezentate în cele ce urmează:

9.   Observații

Trebuie să se demonstreze în prealabil că reacția diclazurilului este liniară pentru toată gama de conținuturi măsurate.

PARTEA C

DOZAJUL CARBADOXULUI

Metil 3-(2-quinoxalinilmetilen)carbazat N1, N4-dioxid

1.   Obiect și domeniu de aplicare

Prezenta metodă permite dozarea carbadoxului din furaje, preamestecuri și preparate. Limita de detecție este de 1mg/kg; limita de dozare este de 10 mg/kg.

2.   Principiu

Proba este echilibrată cu apă și supusă unei extracții cu un amestec metanol/acetonitril. În cazul furajelor, o parte alicotă din extractul filtrat se curăță pe o coloană de oxid de aluminiu. Pentru preamestecuri și preparate, o parte alicotă din extractul filtrat se diluează la o concentrație adecvată cu apă, metanol și acetonitril. Conținutul de carbadox se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (CLHP) în fază inversată cu ajutorul unui detector UV.

3.   Reactivi

3.1.   Metanol.

3.2.   Acetonitril, de calitate CLHP.

3.3.   Acid acetic, w = 100 %.

3.4.   Oxid de aluminiu: neutru, grad de activitate I.

3.5.   Metanol-acetonitril 1 + 1 (V + V).

Se amestecă 500 ml de metanol (3.1) cu 500 ml de acetonitril (3.2).

3.6.   Acid acetic, σ = 10 %

Se diluează 10 ml de acid acetic (3.3) în 100 ml apă.

3.7.   Acetat de sodiu, CH3COONa.

3.8.   Apă de calitate CLHP

3.9.   Soluție tampon de acetat, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0

Se dizolvă 0,82 g acetat de sodiu (3,7) în 700 ml apă (3.8) și se reglează pH-ul la 6,0 cu acid acetic (3.6). Se transferă într-un balon gradat de 1 000 ml, se completează până la semn cu apă (3.8) și se amestecă.

3.10.   Fază mobilă pentru CLHP

Se amestecă 825 ml de soluție tampon de acetat (3.9) cu 175 ml de acetonitril (3.2). Se trece compoziția printr-un filtru de 0,22 μm (4.5) și se degazează soluția (de exemplu prin tratarea cu ultrasunete timp de 10 minute).

3.11.   Substanță etalon.

Carbadox pur: metil 3-(2-quinoxalinilmetilen)carbazat N1, N4-dioxid, E 850.

3.11.1.   Soluția-mamă a etalonului de carbadox, 100 μg/ml (vezi punctul 5 Mod de operare)

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,1 mg, 25 mg de substanță etalon de carbadox (3.11) într-un balon gradat de 250 ml. Se dizolvă într-un amestec de metanol-acetonitril (3.5) prin tratare cu ultrasunete (4.7). După tratamentul ultrasonic, se aduce soluția la temperatura ambiantă, se completează până la semn cu metanol-acetonitril (3.5) și se amestecă. Se înfășoară balonul într-o folie de aluminiu sau se utilizează un recipient din sticlă opacă și se pune la frigider. La o temperatură de ≤4 °C soluția este stabilă timp de o lună.

3.11.2.   Soluții de etalonare

Se transferă 2,0, 5,0, 10,0 și 20,0 ml din soluția-mamă a etalonului (3.11.1) într-o serie de baloane gradate de 100 ml. Se adaugă 30 ml apă, se completează până la semn cu metanol-acetonitril (3.5) și se amestecă. Se înfășoară baloanele în folii de aluminiu. Aceste soluții corespund la 2,0, 5,0, 10,0, și respectiv 20,0 μg/ml de carbadox. Ele trebuie să fie reînnoite pentru fiecare folosire.

Notă: Pentru dozarea carbadoxului în hrana care conține mai puțin de 10 mg/kg, trebuie pregătite soluții de etalonare cu concentrații mai mici de 2,0 μg/ml.

3.12.   Amestec apă-[metanol-acetonitril] (3.5), 300 + 700 (V + V)

Se amestecă 300 ml de apă cu 700 ml de amestec de metanol-acetonitril (3.5).

4.   Aparatură

4.1.   Agitator de laborator sau amestecător magnetic.

4.2.   Hârtie filtru din fibră de sticlă (Whatman GF/A sau echivalent).

4.3.   Coloană de sticlă (lungime 300–400 mm, diametru intern aproximativ 10 mm), cu perete din sticlă sinterizată și valvă de evacuare

Notă: Este posibil, de asemenea, să se utilizeze o coloană de sticlă dotată cu un robinet sau o coloană de sticlă cu extremitatea îngustată; în acest caz, se inserează un tampon mic din vată de sticlă în extremitatea inferioară și se împinge cu ajutorul unei baghete de sticlă.

4.4.   Echipament CLHP cu sistem de injecție, care permite injectarea de volume de 20 μl.

4.5.   Filtru cu membrană de 0,22 μm.

4.6.   Filtru cu membrană de 0,45 μm.

4.7.   Baie ultrasonică.

5.   Mod de operare

Notă: Carbadoxul este fotosensibil. Se operează totdeauna la lumină filtrată, sau se utilizează recipiente din sticlă opacă sau înfășurate în folie de aluminiu.

5.1.   Generalități

5.1.1.   Aliment probă

Pentru a efectua testul de recuperare (5.1.2), se analizează un aliment probă pentru a se verifica lipsa carbadoxului sau a substanțelor interferente. Alimentul probă trebuie să fie de același tip ca eșantionul; nu trebuie să se detecteze nici carbadox, nici substanțe interferente.

5.1.2.   Test de recuperare

Se efectuează un test de recuperare prin analizarea alimentului probă (5.1.1) la care a fost adăugată o cantitate de carbadox similară celei prezente în proba prelevată. Pentru obținerea unei concentrații de 50 mg/kg, se transferă 5,0 ml din soluția-mamă a etalonului (3.11.1) într-un balon conic de 200 ml. Se concentrează soluția prin evaporare la aproximativ 0,5 ml într-un curent de azot. Se adaugă 10 g din alimentul probă, se amestecă și se lasă 10 minute înainte de a trece la extracție (5.2).

Alternativ, în lipsa unui aliment probă de același tip ca cel al probei (vezi 5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat conform metodei prin adăugarea etalonului. În acest caz, proba de analizat este suplimentată cu o cantitate de carbadox asemănătoare celei deja prezente în probă. Aceasta este analizată împreună cu proba care nu a fost suplimentată și recuperarea poate fi calculată prin diferență.

5.2.   Extracția

5.2.1.   Furaje

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,01 g, aproximativ 10 g de probă și se transferă într-un balon conic de 200 ml. Se adaugă 15,0 ml apă, se amestecă și se echilibrează timp de 5 minute. Se adaugă 35,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupă și se supune timp de 30 minute unei agitări mecanice sau magnetice (4.1). Se trece soluția prin hârtie de filtru din fibră de sticlă (4.2). Se conservă această soluție pentru faza de purificare (5.3).

5.2.2.   Preamestecuri (0,1-2,0 %)

Se cântărește, cu o marjă de eroare de 0,001 g, aproximativ 1 g de probă neconcasată și se transferă într-un balon conic de 200 ml. Se adaugă 15,0 ml apă, se amestecă și se echilibrează timp de 5 minute. Se adaugă 35,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupă și se supune 30 de minute unei agitări mecanice sau magnetice (4.1). Se trece soluția prin hârtie de filtru din fibră de sticlă (4.2). Se toarnă cu pipeta o parte alicotă din filtrat într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 15,0 ml apă, se completează până la semn cu metanol-acetonitril (3.5) și se amestecă. Conținutul de carbadox al soluției finale trebuie să fie de aproximativ 10 μg/ml. O parte alicotă se trece printr-un filtru de 0,45 μm (4.6). Se trece la dozarea CLHP (5.4).

5.2.3.   Preparate (> 2 %)

Se cântăresc, cu o marjă de eroare de 0,001 g, aproximativ 0,2 g de probă neconcasată și se transferă într-un balon conic de 250 ml. Se adaugă 45,0 ml apă, se amestecă și se echilibrează timp de 5 minute. Se adaugă 105,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupă și se omogenizează. Se supune proba ultrasunetelor (4.7) timp de 15 minute, apoi unei agitări mecanice sau magnetice timp de 15 minute (4.1). Se trece soluția printr-o hârtie de filtru din fibră de sticlă (4.2). Se diluează o parte alicotă din filtrat cu amestecul apă-metanol-acetonitril (3.12) până la o concentrație finală de carbadox de 10–15 μg/ml (pentru un preparat 10 %, factorul de diluție este 10). O parte alicotă se trece printr-un filtru de 0,45 μm (4.6). Se trece la dozarea CLHP (5.4).

5.3.   Purificare

5.3.1.   Prepararea coloanei de oxid de aluminiu.

Se cântăresc 4 g de oxid de aluminiu (3.4) și se transferă în coloana de sticlă (4.3).

5.3.2.   Purificarea eșantionului

Se trec 15 ml din extractul filtrat (5.2.1) în coloana de oxid de aluminiu și se elimină primii doi ml de eluat. Se colectează următorii 5 ml și se trece o parte alicotă printr-un filtru de 0,45 μm (4.6). Se trece la dozarea CLHP (5.4).

5.4.   Dozare CLHP

5.4.1.   Parametri

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu indicativ; se pot aplica și alte condiții dacă dau rezultate echivalente.

Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic injectându-se de mai multe ori soluția de etalonare (3.11.2) care conține 5,0 μg/ml, până se obțin înălțimi (suprafețe) ale vârfurilor și timpi de retenție constanți.

5.4.2.   Curba de etalonare

Se injectează fiecare soluție de etalonare (3.11.2) de mai multe ori și se determină înălțimile (suprafețele) vârfurilor pentru fiecare concentrație. Se stabilește o curbă de etalonare utilizând înălțimile sau suprafețele medii ale vârfurilor soluțiilor de etalonare ca ordonate și concentrațiile coresponzătoare în μg/l ca abscise.

5.4.3.   Soluția probei

Se injectează extractul din probă [(5.3.2) pentru furaje, (5.2.2) pentru preamestecuri și (5.2.3) pentru preparate] de mai multe ori și se determină înălțimea (suprafața) medie a vârfurilor de carbadox.

6.   Exprimarea rezultatelor

Plecând de la înălțimea (suprafața) medie a vârfurilor de carbadox ale soluției eșantionului, se determină conținutul soluției probei în μg/l prin referire la curba de etalonare (5.4.2).

6.1.   Hrana pentru animale

Conținutul w de carbadox, exprimat în mg/kg, al probei este dat de formula următoare:

[mg/kg]

formulă în care:

6.2.   Preamestecuri și preparate

Conținutul w de carbadox, exprimat în mg/kg, al probei este dat de formula următoare:

[mg/kg]

formulă în care:

7.   Validarea rezultatelor

7.1.   Identitate

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau cu ajutorul unui detector cu linii transversale de diode care permite compararea spectrelor extractului din probă și soluției de etalonare (3.11.2) conținând 10,0 μg/ml.

7.1.1.   Co-cromatografie

La un extract din probă se adaugă o cantitate adecvată din soluția de etalonare (3.11.2). Cantitatea de carbadox adăugată trebuie să fie similară cu cea evaluată în extractul din probă.

Numai înălțimea vârfului de carbadox trebuie să fie mărită, ținând cont în același timp de cantitatea adăugată și de diluția extractului. Lățimea vârfului la jumătatea înălțimii trebuie să se situeze la ± 10 % din lățimea inițială.

7.1.2.   Detectarea prin liniile transversale de diode

Se evaluează rezultatele după următoarele criterii:

7.2.   Repetabilitate

Pentru conținuturile de 10 mg/kg și mai mult, diferența dintre rezultatele a două dozaje paralele efectuate pe aceeași probă nu trebuie să depășească 15 % din rezultatul superior.

7.3.   Recuperare

Pentru o probă suplimentară, recuperarea trebuie să fie de cel puțin 90 %.

8.   Rezultatele unui studiu între laboratoare

S-a organizat un studiu între laboratoare, în cursul căruia au fost analizate șase tipuri de furaje, patru preamestecuri și trei preparate, în opt laboratoare. Pentru fiecare probă, analizele au fost efectuate în dublu. (Informații detaliate privind acest studiu între laboratoare figurează în

Rezultatele studiului (cu excepția valorilor aberante) sunt prezentate în cele ce urmează:

Tabelul 1.   Rezultatele studiului între laboratoare efectuat pe furaje

Tabelul 2.   Rezultatele studiului între laboratoare efectuat pe preamestecuri și preparate