▼B

▼M9

---

ANEXA I

METODE DE EȘANTIONARE

1.   SCOP ȘI DOMENIU DE APLICARE

Eșantioanele destinate controlului oficial al furajelor se prelevează în conformitate cu metodele descrise în continuare. Eșantioanele astfel prelevate se consideră reprezentative pentru loturile eșantionate.

Scopul eșantionării reprezentative este de a obține o mică fracțiune dintr-un lot în așa fel încât determinarea oricărei caracteristici speciale a acestei fracțiuni va reprezenta valoarea medie a caracteristicii lotului. Lotul se eșantionează prin prelevarea în mod repetat de eșantioane elementare, la diferite poziții unice din lot. Aceste eșantioane elementare sunt combinate prin amestecare pentru a forma un eșantion agregat pornind de la care sunt pregătite eșantioane finale reprezentative prin divizare reprezentativă.

În cazul în care, printr-o inspecție vizuală sau pe baza altor informații relevante, porțiuni din furajele care urmează să fie eșantionate arată o diferență de calitate față de restul furajelor din același lot, aceste fragmente se separă de restul de furaje și se tratează ca sublot separat. În cazul în care nu este posibilă separarea furajului în subloturi separate, el se eșantionează ca un singur lot. În astfel de cazuri, se menționează acest fapt în raportul de eșantionare.

În cazul în care un furaj eșantionat în conformitate cu dispozițiile prezentului regulament este identificat ca neîndeplinind cerințele UE și face parte dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

Eșantionarea poate include, de asemenea, furajele oferite spre vânzare de către operatorii din sectorul hranei pentru animale prin mijloace de comunicare la distanță în conformitate cu articolul 11 alineatul (3) din Regulamentul (CE) nr. 767/2009 al Parlamentului European și al Consiliului ( 4 ). Eșantionarea furajelor oferite spre vânzare prin mijloace de comunicare la distanță face, în principiu, obiectul punctelor prevăzute în prezenta anexă. Aspectele specifice ale eșantionării în cazul eșantioanelor din vânzare la distanță sunt descrise la punctul 11.

2.   DEFINIȚII

3.   DISPOZIȚII GENERALE

Marcajul sigiliului trebuie să poată fi identificat în mod clar și vizibil.

4.   APARATURA

4.1.   Aparatura de prelevare de eșantioane trebuie să fie realizată din materiale care nu contaminează produsele de eșantionat. Aparatura care este destinată a fi utilizată de mai multe ori trebuie să fie ușor de curățat pentru a evita contaminarea încrucișată.

4.2.    Aparatura recomandată pentru prelevarea eșantioanelor din furaje solide

4.2.1.    Prelevarea manuală

În cazul în care sonda de eșantionare are mai multe orificii, pentru a se asigura faptul că eșantionul este prelevat în diferite locuri de-a lungul sondei, orificiile ar trebui să fie separate prin compartimente sau orificii eșalonate secvențial.

4.2.2.    Prelevarea mecanică

Pentru prelevarea de eșantioane din furajele în mișcare poate fi utilizată aparatură mecanică adecvată. Aparatul mecanic este considerat adecvat dacă cel puțin întreaga secțiune a fluxului este eșantionată.

Prelevarea de eșantioane din furajele în mișcare (la rate de debit ridicat) poate fi efectuată de prelevatoare automate.

4.2.3.    Separator

În cazul în care acest lucru este posibil și oportun, aparatura destinată divizării eșantionului în părți aproximativ egale trebuie să fie utilizată pentru prepararea eșantioanelor reduse în mod reprezentativ.

5.   CERINȚE CANTITATIVE ÎN CEEA CE PRIVEȘTE NUMĂRUL DE EȘANTIOANE ELEMENTARE

5.1.    Cerințe cantitative în ceea ce privește eșantioanele elementare legate de controlul substanțelor sau produselor uniform distribuite în furaje.

5.1.1.    Furaje vrac solide

5.1.2.    Furaje vrac lichide

5.1.3.    Furaje ambalate

Furajele (solide și lichide) pot fi ambalate în pungi, saci, cutii de metal, cuve etc. care sunt menționate în următorul tabel ca unități. Unitățile mari (≥ 500 kg sau litri) trebuie să fie eșantionate în conformitate cu dispozițiile prevăzute pentru furaje vrac (a se vedea punctele 5.1.1 și 5.1.2)

5.1.4.    Blocuri de furaje și brichete minerale

Minimum un bloc sau o brichetă trebuie eșantionat(ă) per lot eșantionat de 25 de unități, până la un maximum de patru blocuri sau brichete.

În cazul blocurilor sau brichetelor care nu cântăresc mai mult de 1 kg fiecare, un eșantion elementar este reprezentat de conținutul unui bloc sau al unei brichete.

5.1.5.    Furaje grosiere/nutreț

5.2.    Cerințe cantitative în ceea ce privește eșantioanele elementare legate de controlul constituenților sau substanțelor care pot fi distribuite neuniform în masa de furaje

Aceste cerințe cantitative în ceea ce privește eșantioanele elementare trebuie utilizate în următoarele situații:

În cazul în care autoritatea de control are serioase suspiciuni privind apariția unei astfel de distribuții neuniforme și în cazul unei contaminări încrucișate printr-un constituent sau printr-o substanță într-un furaj combinat, se pot aplica cerințele cantitative, astfel cum sunt prevăzute în următorul tabel.

5.3.    Cerințe cantitative în ceea ce privește eșantioanele elementare în cazul loturilor de dimensiuni foarte mari

În cazul loturilor mari eșantionate (loturi eșantionate > 500 de tone), numărul de eșantioane elementare care trebuie prelevate = 40 de eșantioane elementare + √ tone în ceea ce privește controlul substanțelor sau produselor distribuite uniform în masa de furaje sau 100 de eșantioane elementare + √ tone în ceea ce privește controlul constituenților sau substanțelor care pot fi distribuite neuniform în furaje.

6.   CERINȚE CANTITATIVE ÎN CEEA CE PRIVEȘTE EȘANTIONUL AGREGAT

Este necesar un singur eșantion agregat per lot eșantionat.

7.   CERINȚE CANTITATIVE ÎN CEEA CE PRIVEȘTE EȘANTIOANELE FINALE

Eșantioane finale

Este necesară analiza a cel puțin un eșantion final. Cantitatea din eșantionul final de analizat nu poate fi mai mică decât cantitățile de mai jos:

8.   METODA DE EȘANTIONARE PENTRU LOTURI FOARTE MARI SAU LOTURI DEPOZITATE SAU TRANSPORTATE ÎNTR-UN MOD CARE NU PERMITE EȘANTIONAREA ÎNTREGULUI LOT

8.1.    Principii generale

În cazul în care modul de transport sau de depozitare a unui lot nu permite prelevarea de eșantioane elementare din întregul lot, eșantionarea unor astfel de loturi trebuie, de preferință, să fie efectuată atunci când lotul se află în flux.

În cazul antrepozitelor mari destinate să stocheze furajele, operatorii trebuie să fie încurajați să instaleze echipamente în antrepozit care să permită eșantionarea (automată) a întregului lot stocat.

În cazul aplicării procedurilor de eșantionare prevăzute la prezentul punct, operatorul din sectorul hranei pentru animale sau reprezentantul său este informat cu privire la procedura de eșantionare. În cazul în care procedura de eșantionare este pusă sub semnul întrebării de către operatorul din sectorul hranei pentru animale sau de către reprezentantul acestuia, operatorul din sectorul hranei pentru animale sau reprezentantul acestuia va permite autorității competente să preleveze eșantioane din întregul lot pe cheltuiala sa.

8.2.    Loturile mari transportate pe cale navală

8.2.1.    Eșantionarea dinamică a loturilor mari transportate pe cale navală

Eșantionarea loturilor mari în nave se efectuează de preferință în timp ce produsul este în flux (eșantionare dinamică).

Eșantionarea se face per stivă (entitate care poate fi separată fizic). Stivele sunt, totuși, golite parțial una după alta, astfel încât separarea fizică inițială nu mai există după transferul în instalațiile de depozitare. Prin urmare, eșantionarea poate fi efectuată în funcție de separarea fizică inițială sau în funcție de separarea după transferul în instalațiile de depozitare.

Descărcarea unei nave poate dura câteva zile. În mod normal, eșantionarea trebuie să fie efectuată la intervale de timp regulate pe întreaga durată a descărcării. Cu toate acestea, nu este întotdeauna posibil sau adecvat pentru un inspector oficial să fie prezent pentru eșantionare pe parcursul întregii operațiuni de descărcare. Prin urmare, se permite eșantionarea unei părți (lot eșantionat) din întregul lot. Numărul de eșantioane elementare este stabilit luând în considerare dimensiunea lotului eșantionat.

În cazul eșantionării unei părți dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

Chiar dacă eșantionul oficial este prelevat automat, prezența unui inspector este necesară. Cu toate acestea, în cazul în care se efectuează o prelevare automată cu parametri prestabiliți care nu pot fi schimbați în cursul eșantionării și eșantioanele elementare sunt colectate într-un recipient închis, împiedicând orice posibilă fraudă, prezența unui inspector este necesară numai la începutul eșantionării, de fiecare dată când recipientul în care se află eșantioanele trebuie să fie schimbat și la sfârșitul eșantionării.

8.2.2.    Eșantionarea loturilor transportate pe cale navală prin eșantionare statică

În cazul în care eșantionarea se efectuează în mod static, trebuie aplicată aceeași procedură ca și cea prevăzută pentru spațiile de depozitare (silozuri) accesibile din partea de sus (a se vedea punctul 8.4.1).

Eșantionarea trebuie să se efectueze pe partea accesibilă (de sus) din lot/stivă. Numărul de eșantioane elementare este stabilit luând în considerare dimensiunea lotului eșantionat. În cazul eșantionării unei părți dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

8.3.    Eșantionarea loturilor mari depozitate în antrepozite

Eșantionarea trebuie să se efectueze pe partea accesibilă a lotului. Numărul de eșantioane elementare este stabilit luând în considerare dimensiunea lotului eșantionat. În cazul eșantionării unei părți dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

8.4.    Prelevarea de eșantioane din spații de depozitare (silozuri)

8.4.1.    Prelevarea de eșantioane din silozuri (ușor) accesibile din partea de sus

Eșantionarea trebuie să se efectueze pe partea accesibilă a lotului. Numărul de eșantioane elementare este stabilit luând în considerare dimensiunea lotului eșantionat. În cazul eșantionării unei părți dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

8.4.2.    Prelevarea de eșantioane din silozuri care nu sunt accesibile din partea de sus (silozuri închise)

8.4.2.1.    Silozuri care nu sunt accesibile din partea de sus (silozuri închise) cu dimensiunea > 100 de tone

Furajele depozitate în astfel de silozuri nu pot fi eșantionate în mod static. Prin urmare, în cazul în care furajele din siloz trebuie să fie eșantionate și nu există nicio posibilitate de a deplasa lotul, trebuie să se ajungă la un acord cu operatorul conform căruia acesta trebuie să informeze inspectorul cu privire la momentul în care silozul va fi descărcat pentru a permite eșantionarea atunci când furajul este în flux.

8.4.2.2.    Silozuri care nu sunt accesibile din partea de sus (silozuri închise) cu dimensiunea < 100 de tone

Procedura de eșantionare implică introducerea într-un recipient a unei cantități de 50-100 kg și prelevarea eșantionului din aceasta. Dimensiunea eșantionului agregat corespunde cu întregul lot, iar numărul de eșantioane elementare este legat de cantitatea din siloz introdusă într-un recipient pentru eșantionare. În cazul eșantionării unei părți dintr-un lot de furaje din aceeași clasă sau având aceeași descriere și în cazul în care acea parte a lotului este identificată ca nesatisfăcând cerințele UE, se presupune că rezultatele sunt valabile pentru toate furajele din acel lot, cu excepția cazului în care, în urma unei evaluări detaliate, nu există nicio dovadă că restul lotului nu satisface cerințele UE.

8.5.    Eșantionarea furajelor vrac în recipiente mari închise

Adesea, astfel de loturi pot fi eșantionate numai atunci când sunt descărcate. În anumite cazuri nu este posibil să se descarce loturile la punctul de import sau de control și, prin urmare, eșantionarea ar trebui să aibă loc atunci când aceste recipiente sunt descărcate.

9.   INSTRUCȚIUNI PENTRU PRELEVAREA, PREPARAREA ȘI AMBALAREA EȘANTIOANELOR

9.1.    Generalități

Eșantioanele trebuie prelevate și preparate fără întârzieri inutile, luând în considerare precauțiile necesare pentru a garanta că produsul nu este nici modificat, nici contaminat. Instrumentele, suprafețele de lucru și recipientele destinate colectării de eșantioane trebuie să fie curate și uscate.

9.2.    Eșantioane elementare

Eșantioanele elementare trebuie prelevate în mod aleatoriu și distribuite uniform din întregul lot eșantionat, iar dimensiunile lor trebuie să fie aproximativ egale.

Dimensiunea eșantionului elementar este de cel puțin 100 de grame sau 25 de grame în cazul furajelor grosiere sau al nutrețului cu o densitate specifică redusă.

În cazul în care, în conformitate cu normele pentru procedura de eșantionare stabilite la punctul 8, trebuie prelevate mai puțin de 40 de eșantioane elementare, dimensiunea eșantioanelor elementare se determină în funcție de dimensiunea necesară a eșantionului agregat (a se vedea punctul 6).

În cazul eșantionării loturilor de dimensiuni reduse de furaje ambalate în cazul cărora, conform cerințelor cantitative, trebuie prelevat un număr limitat de eșantioane elementare, un eșantion elementar este reprezentat de conținutul unei unități originale al cărei conținut nu depășește 1 kg sau un litru.

În cazul eșantionării furajelor ambalate compuse din unități mici (de exemplu, < 250 g), dimensiunea eșantionului elementar depinde de dimensiunea unității.

În cazul eșantioanelor din vânzările la distanță, dimensiunea eșantionului elementar depinde de dimensiunea unității și poate conține, de asemenea, mai puțin de 100 g sau 100 ml în cazuri individuale.

9.2.1.    Furaje vrac

După caz, eșantionarea poate fi efectuată atunci când lotul eșantionat este în flux (încărcare sau descărcare).

9.2.2.    Furaje ambalate

După selectarea numărului necesar de unități pentru eșantionare, conform indicațiilor de la punctul 5, o parte a conținutului fiecărei unități se îndepărtează folosind o sondă sau o lopată. Dacă este necesar, eșantioanele se prelevează după ce unitățile au fost golite separat.

9.2.3.    Furaje lichide sau semilichide, omogene sau omogenizabile

După selectarea pentru eșantionare a numărului necesar de unități, în conformitate cu indicațiile de la punctul 5, conținutul se omogenizează, dacă este necesar, și se prelevează o cantitate din fiecare unitate.

Eșantioanele elementare pot fi prelevate la descărcarea conținutului.

9.2.4.    Furaje lichide sau semilichide, neomogenizabile

După selectarea pentru eșantionare a numărului necesar de unități, în conformitate cu indicațiile de la punctul 5, se prelevează eșantioane de la diferite niveluri.

Eșantioanele se pot preleva și în timpul descărcării conținutului, dar primele fracțiuni se îndepărtează.

În oricare dintre cazuri, volumul total prelevat nu trebuie să fie mai mic de 10 litri.

9.2.5.    Blocuri de furaje și brichete minerale

După selectarea pentru eșantionare a numărului necesar de blocuri sau brichete, conform indicațiilor de la punctul 5, se prelevează o parte din fiecare bloc sau brichetă. În cazul în care există suspiciuni legate de un bloc sau de o brichetă neomogen(ă), întregul bloc sau întreaga brichetă poate fi considerat(ă) ca eșantion.

În cazul blocurilor sau brichetelor care nu cântăresc mai mult de 1 kg fiecare, un eșantion elementar este reprezentat de conținutul unui bloc sau al unei brichete.

9.3.    Prepararea eșantioanelor agregat

Eșantioanele elementare se amestecă pentru a forma un singur eșantion agregat.

9.4.    Prepararea eșantioanelor finale

Materialul din eșantionul agregat se amestecă cu grijă ( 5 ).

Fiecare eșantion este introdus într-un recipient corespunzător. Se iau toate precauțiile necesare pentru evitarea oricărei modificări de compoziție a eșantionului, a contaminării sau a falsificării, care ar putea avea loc în timpul transportării sau depozitării.

9.4.1.    Substanțe distribuite uniform

În cazul controlului constituenților sau substanțelor uniform distribuite în întregul furaj, eșantionul agregat poate fi redus în mod reprezentativ la cel puțin 2,0 kg sau 2,0 l (eșantion redus) ( 6 ), de preferință prin utilizarea fie a unui separator mecanic, fie a unui separator automat. Pentru controlul prezenței de reziduuri de pesticide în leguminoase, boabe de cereale și fructe nucifere, dimensiunea minimă a eșantionului redus este de 3 kg. În cazul în care natura furajului nu permite utilizarea unui separator sau separatorul nu este disponibil, eșantionul poate fi redus prin metoda sferturilor.

Din eșantionul agregat sau din eșantioanele reduse se prelevează eșantioanele finale (pentru control, apărare și, eventual, referință) de o dimensiune aproximativ egală, în conformitate cu cerințele cantitative de la punctul 7.

9.4.2.    Substanțe distribuite neuniform

În cazul controlului constituenților, inclusiv materialul modificat genetic sau substanțele care ar putea fi distribuite neuniform în furaje, eșantionul agregat trebuie să fie:

Din eșantionul redus se prelevează eșantioanele finale de o dimensiune aproximativ egală, în conformitate cu cerințele cantitative de la punctul 7.

9.5.    Ambalarea eșantioanelor

Recipientele sau ambalajele se sigilează și se etichetează astfel încât să nu poată fi deschise fără a deteriora sigiliul. Eticheta completă se încorporează în sigiliu. În mod alternativ, eșantionul poate fi pus într-un recipient care poate fi închis astfel încât să nu poată fi deschis fără a deteriora în mod ireversibil recipientul, evitând reutilizarea recipientului.

9.6.    Expedierea eșantioanelor către laborator

Eșantionul trebuie să fie trimis fără întârzieri inutile la laboratorul analitic desemnat, împreună cu informațiile necesare laborantului.

10.   PROCESUL-VERBAL DE EȘANTIONARE

Pentru fiecare eșantion se întocmește un proces-verbal, care permite identificarea fără ambiguități a lotului eșantionat și a dimensiunii acestuia.

Procesul-verbal trebuie să menționeze, de asemenea, orice abatere de la procedura de eșantionare, astfel cum se prevede în prezentul regulament.

Procesul-verbal trebuie pus atât la dispoziția laboratorului de control oficial, cât și la dispoziția operatorului din sectorul hranei pentru animale și/sau a laboratorului desemnat de operatorul din sectorul hranei pentru animale.

11.   EȘANTION DIN VÂNZARE LA DISTANȚĂ

---

ANEXA II

DISPOZIȚII GENERALE PRIVIND METODELE DE ANALIZĂ A FURAJELOR

A.   PREPARAREA EȘANTIOANELOR PENTRU ANALIZĂ

1.    Obiectiv

Procedurile descrise în prezenta anexă se referă la prepararea pentru analiză a eșantioanelor trimise laboratoarelor de control după eșantionare conform dispozițiilor prevăzute în anexa I.

Eșantioanele de laborator trebuie pregătite astfel încât cantitățile prelevate, astfel cum se prevede în metodele de analiză, să fie omogene și reprezentative pentru eșantioanele finale.

În plus față de procedurile descrise în prezenta anexă, trebuie respectate orientările pentru prepararea eșantioanelor prevăzute în EN ISO 6498.

2.    Măsuri de precauție

Procedura de preparare a eșantioanelor care trebuie urmată este în funcție de metodele de analiză care trebuie utilizate și de constituenții sau substanțele care trebuie controlate. De aceea, este extrem de important ca procedura de preparare a eșantioanelor urmată să fie adecvată pentru metoda de analiză utilizată și pentru constituenții sau substanțele care trebuie controlate.

Toate operațiunile necesare trebuie să se efectueze astfel încât să se evite, pe cât posibil, contaminarea eșantionului și modificarea compoziției acestuia.

Măcinarea, amestecarea și cernerea se efectuează fără întârziere în condițiile unei expuneri minime a eșantionului la aer și la lumină. Nu se utilizează râșnițe sau aparate de măcinat care ar putea cauza încălzirea semnificativă a eșantionului.

Se recomandă ca furajele foarte sensibile la căldură să fie măcinate manual. Trebuie, de asemenea, să se asigure că aparatul în sine nu constituie o sursă de contaminare.

Omogenizarea eșantionului prin prepararea unei suspensii prin amestecare cu apă cu ajutorul unui mixer cu forfecare înaltă s-a dovedit a furniza, în anumite cazuri, subeșantioane mai omogene decât omogenizarea/măcinarea uscată, în special în cazul substanțelor chimice distribuite eterogen. Cu toate acestea, omogenizarea printr-o măcinare uscată suficientă ar putea oferi subeșantioane omogene.

În anumite cazuri, cum ar fi pentru determinarea cornului secarei, a impurităților botanice nocive etc., omogenizarea eșantionului nu poate fi realizată prin măcinare, ci prin amestecarea suficientă a eșantionului.

Dacă prepararea nu poate fi efectuată fără modificări semnificative ale conținutului de umiditate al eșantionului, se determină conținutul de umiditate înainte și după preparare, în conformitate cu metoda menționată în partea A din anexa III.

3.    Procedura

3.1.    Procedura generală

Alicota de test este prelevată din eșantionul final omogenizat. Formarea unui con și selectarea de sferturi nu sunt recomandate deoarece ar putea să se formeze alicote de test care să dea naștere la erori de separare mari.

3.1.1.    Furaje care pot fi măcinate ca atare

3.1.2.    Furaje care pot fi măcinate după uscare

3.1.3.    Furaje lichide sau semilichide

3.1.4.    Alte furaje

3.2.    Proceduri specifice în cazul examinării prin inspecție vizuală sau la microscop sau în cazurile în care întregul eșantion agregat se omogenizează

4.    Depozitarea eșantioanelor

Eșantioanele trebuie păstrate la o temperatură care să nu le altereze compoziția. Eșantioanele destinate analizării prezenței vitaminelor sau substanțelor foarte sensibile la lumină se păstrează în condiții care să garanteze că eșantionul nu este afectat în mod negativ de lumină.

B.   DISPOZIȚII PRIVIND REACTIVII ȘI APARATURA UTILIZATE ÎN METODELE DE ANALIZĂ

C.   APLICAREA METODELOR DE ANALIZĂ ȘI PREZENTAREA REZULTATELOR

1.    Procedura de extracție

O serie de metode determină o procedură de extracție specifică. Ca regulă generală, se pot aplica alte proceduri de extracție decât cea la care se face referire în metodă dacă s-a dovedit că procedura de extracție utilizată are, pentru matricea analizată, o eficiență de extracție echivalentă cu procedura menționată în metodă.

2.    Procedura de purificare

O serie de metode determină o procedură de purificare specifică. Ca regulă generală, se pot aplica alte proceduri de purificare decât cea la care se face referire în metodă dacă s-a dovedit că procedura de purificare utilizată determină, pentru matricea analizată, rezultate analitice echivalente cu procedura menționată în metodă.

3.    Numărul de determinări

În cazul analizelor de detectare a substanțelor indezirabile, dacă rezultatul primei determinări este semnificativ (> 50 %) mai mic decât specificația de control, nu sunt necesare alte determinări, cu condiția să fie aplicate procedurile calitative adecvate. În alte cazuri, o analiză duplicat (a doua determinare) este necesară pentru a exclude posibilitatea contaminării încrucișate interne sau a încurcării accidentale a eșantioanelor. Media celor două determinări este utilizată pentru o evaluare suplimentară.

În cazul controlului nivelurilor minime sau maxime de aditivi furajeri, dacă rezultatul primei determinări este peste nivelul minim sau sub nivelul maxim, nu sunt necesare alte determinări, cu condiția să fie aplicate procedurile calitative adecvate. În alte cazuri, o analiză duplicat (a doua determinare) este necesară pentru a exclude posibilitatea contaminării încrucișate interne sau a încurcării accidentale a eșantioanelor. Media celor două determinări este utilizată pentru o evaluare suplimentară.

În cazul controlului privind conținutul declarat pentru o anumită substanță sau un anumit ingredient, dacă rezultatul primei determinări confirmă conținutul declarat, adică rezultatul analizei se situează în interiorul intervalului de variație acceptat, nu sunt necesare alte determinări, cu condiția să fie aplicate procedurile calitative adecvate. În alte cazuri, o analiză duplicat (a doua determinare) este necesară pentru a exclude posibilitatea contaminării încrucișate interne sau a încurcării accidentale a eșantioanelor. Media celor două determinări este utilizată pentru o evaluare suplimentară (rezultatul analitic mediu se încadrează sau nu în intervalul acceptabil de variație a conținutului declarat).

În unele cazuri, acest interval acceptabil de variație este definit în legislație, cum ar fi Regulamentul (CE) nr. 767/2009 și Regulamentul (UE) 2019/4 al Parlamentului European și al Consiliului ( 9 ).

4.    Raportarea metodei de analiză utilizate

Raportul de analiză menționează metoda de analiză utilizată.

5.    Raportarea rezultatului analitic

Rezultatul analitic se exprimă în maniera indicată în metoda de analiză, cu un număr adecvat de zecimale și se ajustează, dacă este cazul, la conținutul de umiditate al eșantionului final înainte de preparare.

Majoritatea nivelurilor reglementate (de exemplu, nivelul maxim, nivelul minim) din legislația UE privind hrana pentru animale sunt stabilite în raport cu un furaj cu un conținut de umiditate de 12 %. Prin urmare, în aceste cazuri, pentru a evalua rezultatul analitic măsurat pe eșantion în raport cu nivelul de reglementare, rezultatul analitic trebuie mai întâi împărțit la conținutul de substanță uscată al eșantionului (în %) înmulțit cu 88, astfel cum se indică în următoarea formulă:

unde:

Mc

:

conținutul de umiditate al eșantionului (în %). 100 – Mc reprezintă, prin urmare, conținutul de substanță uscată al eșantionului (în %).

Rana

:

rezultatul analitic măsurat pe eșantion

R12 %

:

rezultat pentru un furaj cu un conținut de umiditate de 12 %; a se evalua în raport cu nivelul de reglementare.

În plus, dacă sunt îndeplinite următoarele condiții:

În cazul în care rezultatul analitic este ajustat pentru conținutul de umiditate, incertitudinea de măsurare corespunzătoare trebuie, de asemenea, să fie ajustată în cadrul aceleiași proceduri.

În cazul determinării cornului secarei sau a impurităților botanice nocive prin examinare vizuală/microscopică, nu este necesară ajustarea conținutului de umiditate.

6.    Incertitudinea de măsurare analitică și rata de recuperare în cazul analizelor de detectare a substanțelor indezirabile

În ce privește substanțele indezirabile, în sensul Directivei 2002/32/CE, un produs destinat utilizării în furaje se consideră neconform cu conținutul maxim stabilit dacă rezultatul analitic calculat ca media a două determinări independente, referitor la un furaj cu un conținut de umiditate de 12 %, este considerat ca depășind conținutul maxim, ținând cont de incertitudinea de măsurare analitică extinsă folosind un factor de acoperire 2 care conferă un nivel de încredere de aproximativ 95 % și de ajustarea pentru recuperare. Aceasta înseamnă că, pentru a evalua conformitatea, concentrația analizată se utilizează după ce a fost ajustată pentru recuperare și după ce s-a dedus incertitudinea de măsurare analitică extinsă. Această procedură se aplică numai în cazurile în care metoda de analiză permite estimarea incertitudinii de măsurare analitică extinse și a ajustării pentru recuperare. (de exemplu, nu este necesar în cazul examinării vizuale/microscopice).

În cazul în care rezultatul analitic al eșantionului prelevat pentru apărare depășește conținutul maxim (fără a lua în considerare incertitudinea de măsurare analitică extinsă), acest lucru confirmă neconformitatea constatată cu eșantionul de control, în absența unor norme naționale specifice în acest sens.

Rezultatul analitic se raportează în modul următor (în măsura în care metoda de analiză utilizată permite estimarea incertitudinii de măsurare analitică extinse):

Totuși, dacă rezultatul analizei este semnificativ (> 50 %) mai mic decât specificația de control și cu condiția ca procedurile calitative corespunzătoare să fie aplicate și ca analiza să servească doar verificării conformității cu prevederile legale, raportarea ratei de recuperare și a incertitudinii de măsurare analitică extinse ar putea fi omisă (de exemplu, în cazul în care nu există nicio specificație sau nivel de reglementare), cu excepția cazului în care incertitudinea de măsurare este necesară pentru interpretare.

7.    Incertitudinea de măsurare analitică și rata de recuperare în cazul analizei conținutului de aditivi furajeri

Pentru a verifica conformitatea cu conținutul minim și maxim autorizat de aditivi furajeri, prezența unui aditiv furajer este considerată neconformă cu conținutul minim și maxim stabilit dacă rezultatul analitic, calculat ca media două determinări independente, în raport cu un furaj cu un conținut de umiditate de 12 %, este considerat:

În cazul în care rezultatul analitic al eșantionului prelevat pentru apărare depășește conținutul maxim (fără a lua în considerare incertitudinea de măsurare analitică extinsă), acest lucru confirmă neconformitatea constatată cu eșantionul de control, în absența unor norme naționale specifice în acest sens.

Rezultatul analitic se raportează în modul următor (în măsura în care metoda de analiză utilizată permite estimarea incertitudinii de măsurare analitică extinse):

---

ANEXA III

METODE DE ANALIZĂ DE CONTROL AL COMPOZIȚIEI MATERIILOR PRIME FURAJERE ȘI AL FURAJELOR COMBINATE

A.   DETERMINAREA UMIDITĂȚII

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conținutului de umiditate al furajelor. În cazul furajelor care conțin substanțe volatile, cum sunt acizii organici, este de notat că o dată cu determinarea conținutului de umiditate se determină și un număr semnificativ de substanțe volatile.

Metoda nu se aplică în cazul analizei produselor lactate utilizate ca materii prime furajere și al furajelor combinate care constau în principal din produse lactate, analizei grăsimilor și uleiurilor de origine animală și vegetală sau analizei semințelor și a fructelor oleaginoase.

Determinarea conținutului de umiditate din semințele oleaginoase se determină prin metoda prevăzută în EN ISO 665 „Determinarea conținutului de umiditate și de materii volatile”, cu mențiunea că boabele de soia trebuie să fie măcinate înainte de determinarea conținutului de umiditate.

2.    Principiu

Eșantionul se deshidratează în condiții specificate, care variază în funcție de natura furajelor. Pierderea de greutate se determină prin cântărire. Este necesar să se efectueze o uscare prealabilă atunci când se analizează furaje solide cu conținut ridicat de umiditate.

3.    Aparatură

4.    Procedura

4.1.    Preparare

4.1.1.    Furaje care nu sunt menționate la punctele 4.1.2 și 4.1.3

Se prelevează cel puțin 50 g de eșantion. Dacă este necesar, se zdrobește sau se divizează astfel încât să se evite orice variație a conținutului de umiditate (a se vedea punctul 6).

4.1.2.    Cereale și tărâțe

Se prelevează cel puțin 50 g de eșantion. Se macină în particule din care cel puțin 50 % trec printr-o sită cu orificii de 0,5 mm și care nu determină un reziduu mai mare de 10 % în cazul folosirii unei site cu orificii rotunde cu diametru de 1 mm.

4.1.3.    Furaje lichide sau păstoase, furaje constituite în mod predominant din uleiuri și grăsimi

Se prelevează aproximativ 25 g din eșantion, se cântărește cu o abatere de 10 mg, se adaugă o cantitate adecvată de nisip anhidru cântărită cu o abatere de 10 mg și se amestecă până la obținerea unui produs omogen.

4.2.    Uscare

Se usucă un recipient (punctul 3.3) împreună cu capacul său în cuptorul reglat la 103 °C timp de 30 de minute +/– 1 min. Se scoate din cuptor și se lasă să se răcească la temperatura ambiantă în desicator (punctul 3.6).

4.2.1.    Furaje care nu sunt menționate la punctele 4.2.2 și 4.2.3

Se cântărește recipientul împreună cu capacul său, cu o abatere de 1 mg. În recipientul respectiv se cântărește, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eșantion și se împrăștie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul preîncălzit la 103 °C. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cât mai rapid posibil. Se lasă la uscat timp de patru ore, calculate din momentul în care temperatura din cuptor revine la 103 °C. Se deschide cuptorul, se așază imediat capacul pe recipient, se scoate acesta din urmă din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator (punctul 3.6) și se cântărește cu o abatere de 1 mg.

În cazul furajelor constituite în mod predominant (> 50 %) din uleiuri și grăsimi de origine animală și vegetală, uscarea în cuptor se prelungește cu 30 de minute, la 103 °C. Diferența între cele două cântăriri nu trebuie să depășească 0,1 % în umiditate.

4.2.2.    Cereale, făină fină, tărâțe și făină grunjoasă

Se cântărește recipientul împreună cu capacul său, cu o abatere de 0,5 mg. În recipientul respectiv se cântărește, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eșantion măcinat și se împrăștie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul preîncălzit la 130 °C. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cât mai rapid posibil. Se lasă la uscat timp de două ore, considerate din momentul în care temperatura din cuptor revine la 130 °C. Se deschide cuptorul, se așază imediat capacul pe recipient, se scoate acesta din urmă din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator (punctul 3.6) și se cântărește cu o abatere de 1 mg.

4.2.3.    Furaje combinate conținând peste 4 % zaharoză sau lactoză: materii prime furajere precum semințele de roșcove, produsele cerealiere hidrolizate, semințele de malț, bucăți de sfeclă uscată, solubilizate de pește și zaharuri

Se cântărește recipientul împreună cu capacul său, cu o abatere de 0,5 mg. În recipientul respectiv se cântărește, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eșantion și se împrăștie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul vidat (punctul 3.5) preîncălzit la o temperatură cuprinsă între 80 °C și 85 °C. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cât mai rapid posibil.

Se aduce presiunea la 100 Torr și se lasă la uscat, la această presiune, timp de patru ore, fie într-un curent de aer uscat și cald, fie cu ajutorul unui agent de desicare (aproximativ 300 g pentru 20 de eșantioane). În al doilea caz, pompa de vid se deconectează după ce se obține presiunea recomandată. Durata de uscare se calculează din momentul în care temperatura în cuptor revine la o valoare cuprinsă între 80 °C și 85 °C. Presiunea cuptorului se readuce cu grijă până la nivelul presiunii atmosferice. Se deschide cuptorul, se așază imediat capacul pe recipient, se scoate recipientul din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator (punctul 3.6) și se cântărește cu o abatere de 1 mg. Uscarea în cuptorul vidat se prelungește cu încă 30 de minute la o temperatură cuprinsă între 80 °C și 85 °C și se recântărește. Diferența între cele două cântăriri nu trebuie să depășească 0,1 % în umiditate.

4.3.    Uscarea prealabilă (parțială)

Este necesară uscarea parțială a furajelor „umede” cu o fracțiune masică mai mică de 85 % substanță uscată (de exemplu, nutreț, rații totale amestecate, furaje nelichide) înainte de măcinarea fină, pentru a analiza substanțele stabile ale acestora; pentru substanțele instabile, uscarea parțială nu este posibilă.

Uscarea parțială se poate efectua cu un cuptor cu aer forțat, cu un cuptor cu microunde sau prin liofilizare. Cu excepția uscării parțiale prin liofilizare, scopul este uscarea furajului menținând în același timp temperatura eșantionului sub 60 °C, astfel încât compoziția chimică să fie minim afectată. Uscarea la temperaturi mai mari de 60 °C provoacă modificări chimice în furaje (de exemplu, degradarea proteinelor). Furajul uscat se echilibrează la temperatura camerei timp de aproximativ 15 minute înainte de măsurarea materiei uscate parțiale, astfel încât să se reducă la minimum modificarea potențială a umidității care poate apărea în timpul măcinării și depozitării. Uscarea la temperaturi mai mici de 60 °C nu îndepărtează toată apa din furaj; prin urmare, uscarea parțială (inițială) nu reprezintă substanța uscată totală a furajului. După uscare, subeșantionul este măcinat și analizat pentru a se stabili conținutul de substanță uscată (finală) al eșantionului parțial uscat (restul de umiditate între 3 % și 15 %) atunci când se determină alți constituenți chimici.

Prin urmare, se recomandă o procedură în două etape pentru determinarea substanței uscate. Se determină mai întâi conținutul parțial de substanță uscată (în cazul în care acesta este mai mic de 85 %), apoi se determină conținutul de substanță uscată rămasă pe un eșantion de testat măcinat și se înmulțește substanța uscată parțială cu substanța uscată rămasă pentru a determina conținutul total de substanță uscată.

5.    Calculul rezultatelor

Conținutul de umiditate (X) al eșantionului, în procente, se calculează prin utilizarea formulelor următoare:

5.1.    Uscare fără uscare prealabilă

unde:

m

=

greutatea inițială, în grame, a eșantionului de testat,

m0

=

greutatea, în grame, a eșantionului de testat uscat.

5.2.    Uscare cu uscare prealabilă ( 13 )

unde:

m

=

greutatea inițială, în grame, a eșantionului de testat,

m1

=

greutatea, în grame, a eșantionului de testat după uscare prealabilă,

m2

=

greutatea, în grame, a eșantionului de testat după zdrobire sau măcinare,

m0

=

greutatea, în grame, a eșantionului de testat uscat.

5.3.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele obținute în două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu depășește 0,2 % din valoarea absolută pentru umiditate, cu excepția hranei umede pentru animale de companie și a produselor de ros pentru câini, în cazul cărora diferența nu depășește 0,5 % din valoarea absolută pentru umiditate.

6.    Observație

Dacă zdrobirea se dovedește a fi necesară și dacă această acțiune poate modifica conținutul de umiditate al produsului, rezultatele analizei referitoare la componentele furajelor trebuie ajustate în funcție de conținutul de umiditate al eșantionului în starea lui inițială.

B.   DETERMINAREA UMIDITĂȚII DIN GRĂSIMILE ȘI ULEIURILE ANIMALE ȘI VEGETALE

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conținutului în apă și substanțe volatile din grăsimile și uleiurile animale și vegetale.

2.    Principiu

Eșantionul se usucă până la atingerea greutății constante (pierderea de greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 1 mg) la 103 °C. Pierderea de greutate se determină prin cântărire.

3.    Aparatură

4.    Procedura

Se cântăresc, cu o abatere de 1 mg, aproximativ 20 g din eșantionul omogenizat, în recipientul uscat și cântărit (punctul 3.1), conținând termometrul (punctul 3.2). Se încălzește pe cuva cu nisip sau pe plită (punctul 3.3), amestecând continuu cu termometrul, astfel încât temperatura să ajungă la 90 °C în aproximativ 7 minute.

Se reduce intensitatea căldurii, urmărind frecvența cu care bulele se ridică de pe fundul vasului. Temperatura nu trebuie să depășească 105 °C. Se continuă amestecarea, răzuind fundul vasului, până când bulele încetează să se mai formeze.

Pentru a asigura eliminarea completă a umidității, se reîncălzește de câteva ori la 103 ± 2 °C, răcind la 93 °C între încălziri succesive. În continuare se lasă să se răcească la temperatura camerei în desicator (punctul 3.4) și se cântărește. Se repetă această operație până când pierderea de greutate dintre două încălziri succesive nu depășește 2 mg.

5.    Calculul rezultatelor

Conținutul de umiditate (X), ca procentaj din eșantion, este dat de următoarea formulă:

unde:

m

=

greutatea, în grame, a eșantionului de testat;

m1

=

greutatea, în grame, a vasului împreună cu conținutul său înainte de încălzire;

m2

=

greutatea, în grame, a vasului împreună cu conținutul său după încălzire.

Rezultatele mai mici de 0,05 % se înregistrează ca fiind „sub 0,05 %”.

Repetabilitate

Diferența de umiditate dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească 0,1 %, în valoare absolută.

C.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE AZOT ȘI CALCULAREA CONȚINUTULUI DE PROTEINE BRUTE

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Prezenta metodă permite determinarea conținutului de proteine brute din furaje pe baza conținutului de azot, determinat conform metodei Kjeldahl ( 14 ).

2.    Principiu

Eșantionul se dizolvă cu acid sulfuric în prezența unui catalizator. Soluția acidă se alcalinizează cu soluție de hidroxid de sodiu. Amoniacul se distilează și se colectează într-o cantitate măsurată de acid sulfuric, al cărei exces se titrează cu o soluție etalon de hidroxid de sodiu.

Ca alternativă, amoniacul eliberat se distilează într-o soluție de acid boric în exces, urmat de titrare cu o soluție de acid clorhidric sau acid sulfuric.

3.    Reactivi

Când se aplică detectarea prin colorimetrie a punctului final, indicatorii roșu de metil și bromocrezol trebuie adăugați la soluțiile de acid boric. Dacă se prepară 1 litru de soluție de acid boric, înainte de ajustarea de volum, se adaugă 7 ml de soluție de indicator roșu de metil (punctul 3.16) și 10 ml de soluție verde de bromocrezol (punctul 3.17).

În funcție de apa utilizată, pH-ul soluției de acid boric poate diferi de la lot la lot. pH-ul soluției de acid boric trebuie să fie între 4,3 și 4,7. Adesea este necesară o ajustare cu ajutorul unui mic volum de substanță alcalină pentru a obține un martor pozitiv.

4.    Aparatură

Aparatură adecvată pentru efectuarea dizolvării, distilării și titrării conform procedurii Kjeldahl.

5.    Procedura

5.1.    Dizolvarea

Se cântărește 1 g de eșantion cu o abatere de 0,001 g și se transferă eșantionul în vasul aparatului de dizolvare. Se adaugă 15 g de sulfat de potasiu (punctul 3.1), o cantitate adecvată de catalizator (punctul 3.2) [0,3-0,4 g oxid de cupru (II) sau 0,9-1,2 g sulfat de cupru (II) pentahidrat], 25 ml de acid sulfuric (punctul 3.4) și, dacă este necesar, câteva granule de piatră ponce (punctul 3.12), apoi se amestecă.

Se încălzește vasul, la început moderat, agitând circular din când, dacă este cazul, până când materia s-a carbonizat și spuma a dispărut; apoi se încălzește mai intens, până când lichidul fierbe constant. Încălzirea este adecvată dacă acidul aflat în fierbere se condensează pe peretele vasului. Se previne supraîncălzirea marginilor și lipirea particulelor organice de acestea.

Când soluția devine limpede și de culoare verde deschis, se continuă fierberea timp de încă două ore, apoi se lasă să se răcească.

5.2.    Distilarea

Se adaugă cu atenție apă suficientă pentru a asigura dizolvarea completă a sulfaților. Se lasă la răcit și apoi se adaugă, dacă este cazul, câteva granule de zinc (punctul 3.3). Se procedează ca la punctul 5.2.1 sau 5.2.2.

5.2.1.    Distilarea în acid sulfuric

În vasul de colectare al aparatului de distilare se introduce o cantitate de 25 ml de acid sulfuric (punctul 3.5) sau (punctul 3.7), măsurată cu exactitate, în funcție de conținutul estimat de azot. Se adăugă câteva picături de indicator roșu de metil (punctul 3.8).

Se conectează vasul de dizolvare la condensatorul aparatului de distilare și se scufundă capătul condensatorului în lichidul din vasul de colectare până la o adâncime de cel puțin 1 cm (a se vedea observația 8.3). Se toarnă încet 100 ml de soluție de hidroxid de sodiu (punctul 3.9) în vasul de dizolvare, fără pierderi de amoniac (a se vedea observația 8.1). Se încălzește vasul până la distilarea completă a amoniacului.

5.2.2.    Distilarea în acid boric

În cazul în care titrarea amoniacului conținut în distilat se face manual, se aplică procedura de mai jos. În cazul în care unitatea de distilare este complet automatizată, inclusiv titrarea amoniacului conținut în distilat, se urmează instrucțiunile de operare a unității de distilare puse la dispoziție de fabricant.

Sub orificiul de evacuare al condensatorului se așază un vas de colectare conținând 25-30 ml de soluție de acid boric (punctul 3.18), astfel încât tubul de evacuare se află sub nivelul suprafeței soluției de acid boric în exces. Se reglează unitatea de distilare astfel încât să elibereze 50 ml de soluție de hidroxid de sodiu (punctul 3.9). Unitatea de distilare se operează în conformitate cu instrucțiunile fabricantului, distilându-se complet amoniacul eliberat prin adăugarea de soluție de hidroxid de sodiu. Distilatul se colectează în soluția de acid boric receptoare. Cantitatea de distilat (timpul de distilare în vapori) depinde de cantitatea de azot din eșantion. Se urmează instrucțiunile fabricantului.

5.3.    Titrarea

Se procedează ca la punctul 5.3.1 sau 5.3.2.

5.3.1.    Acid sulfuric

Se titrează excesul de acid sulfuric în vasul de colectare cu soluție de hidroxid de sodiu (punctul 3.10 sau 3.11), în funcție de concentrația acidului sulfuric utilizat, până se atinge punctul final.

5.3.2.    Acid boric

Cu ajutorul unei biurete se titrează conținutul vasului de colectare cu soluție volumetrică standard de acid clorhidric (punctul 3.19) sau cu soluție volumetrică standard de acid sulfuric (punctul 3.6) și se citește cantitatea de soluție de titrare utilizată.

Când se aplică detectarea colorimetrică a punctului final, acesta este atins la prima apariție în conținut a culorii roz. Citirea biuretei se estimează cu o abatere de 0,05 ml. Vizualizarea punctului final poate fi facilitată de o placă de agitator magnetic iluminat sau de un detector fotometric.

Aceasta poate fi efectuată automat prin utilizarea unui aparat de distilare cu vapori cu titrare automată.

Operarea specifică a aparatului de distilare sau a celui de distilare/titrare se face conform instrucțiunilor fabricantului.

În cazul care se utilizează o unitate de distilare complet automată, titrarea automată a amoniacului poate fi efectuată, de asemenea, prin detectarea punctului final cu ajutorul unui sistem pH potențiometric.

În acest caz, se utilizează un aparat de titrare automat, cu pH-metru. pH-metrul se calibrează în mod corespunzător în intervalul de pH 4-7, folosindu-se proceduri de laborator normale de calibrare a pH-ului.

Punctul final al titrării exprimat în pH este atins la valoarea de 4,6, reprezentând punctul cel mai de jos al curbei de titrare (punctul de inflexiune).

5.4.    Testul martor

Pentru a confirma faptul că reactivii nu conțin azot, se efectuează un test martor (dizolvare, distilare și titrare), folosind 1 g de zaharoză (punctul 3.14) în locul eșantionului.

6.    Calculul rezultatelor

Calcularea se efectuează în conformitate cu punctul 6.1 sau 6.2.

6.1.    Calcularea titrării în conformitate cu punctul 5.3.1

Conținutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:

unde:

V0

=

volumul (ml) de NaOH (punctul 3.10 sau 3.11) folosit în testul martor;

V1

=

volumul (ml) de NaOH (punctul 3.10 sau 3.11) folosit în titrarea eșantionului;

c

=

concentrația (mol/l) a hidroxidului de sodiu (punctul 3.10 sau 3.11);

m

=

greutatea (g) a eșantionului.

6.2.    Calcularea titrării în conformitate cu punctul 5.3.2

6.2.1.    Titrare cu acid clorhidric

Conținutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:

unde:

m

=

greutatea (g) a părții de testat;

c

=

concentrația (mol/l) a soluției volumetrice standard de acid clorhidric (punctul 3.19);

V0

=

volumul (în ml) de acid clorhidric utilizat în testul martor;

V1

=

volumul (în ml) de acid clorhidric utilizat în partea de testat.

6.2.2.    Titrare cu acid sulfuric

Conținutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:

unde:

m

=

greutatea (g) a părții de testat;

c

=

concentrația (mol/l) a soluției volumetrice standard de acid sulfuric (punctul 3.6);

V0

=

volumul (în ml) de acid sulfuric (punctul 3.6) utilizat în testul martor;

V1

=

volumul (în ml) de acid sulfuric (punctul 3.6) utilizat în partea de testat.

7.    Verificarea metodei

7.1.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească:

7.2.    Reproductibilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate pe același eșantion în laboratoare diferite nu trebuie să depășească:

7.3.    Acuratețea

Analiza (dizolvare, distilare și titrare) se efectuează pe o cantitate adecvată de acetanilidă (punctul 3.13) (de exemplu, 0,2-0,3 g), în prezența a 1 g zaharoză (punctul 3.14); 1 g de acetanilidă consumă 14,80 ml de acid sulfuric (punctul 3.5). Recuperarea trebuie să fie de cel puțin 99 %.

8.    Observații

D.   DETERMINAREA UREEI

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conținutului de uree utilizată ca aditiv furajer în furajele pentru rumegătoare.

2.    Principiu

Eșantionul este pus în suspensie în apă, în care s-a adăugat un produs de limpezire. Suspensia se filtrează. Conținutul în uree al filtratului este determinat după adăugarea de 4-dimetilaminobenzaldehidă (4-DMAB), prin măsurarea densității optice la o lungime de undă de 420 nm.

3.    Reactivi

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Analiza eșantionului

Se cântăresc 2 g de eșantion cu abatere de 1 mg și se introduc împreună cu 1 g de cărbune activ (punctul 3.4) într-un balon gradat de 500 ml. Se adaugă 400 ml de apă și 5 ml de soluție Carrez I (punctul 3.2), se amestecă timp de aproximativ 30 de secunde și se adaugă 5 ml de soluție Carrez II (punctul 3.3). Se amestecă timp de 30 de minute în agitator. Se completează volumul cu apă, se agită și se filtrează.

Se îndepărtează 5 ml de filtrat transparent și incolor, se introduc în eprubete cu dop de sticlă șlefuită, se adaugă 5 ml de soluție de 4-DMAB (punctul 3.1) și se amestecă. Se introduc eprubetele într-o baie de apă la 20 °C (+/– 4 °C). După 15 minute se măsoară densitatea optică a soluției de eșantion cu spectrofotometrul la 420 nm. Se compară cu soluția de reactivi pentru testul martor.

5.2.    Curba de calibrare

Se îndepărtează volume de 1, 2, 4, 5 și 10 ml din soluția de uree (punctul 3.5), se introduc în baloanele gradate de 100 ml și se completează volumul cu apă. Se îndepărtează 5 ml din fiecare soluție, se adaugă în fiecare 5 ml de soluție 4-DMAB (punctul 3.1), se omogenizează și se măsoară densitatea optică conform indicațiilor de mai sus cu o soluție martor care conține 5 ml de 4-DMAB și 5 ml de apă în care nu există uree. Se trasează curba de calibrare.

6.    Calculul rezultatelor

Se determină cantitatea de uree din eșantion cu ajutorul curbei de calibrare.

Rezultatul se exprimă în mg de uree per kg eșantion.

7.    Evaluarea metodei

7.1.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate pe același eșantion în același laborator și de către același laborant nu trebuie să depășească:

7.2.    Reproductibilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate pe același eșantion în laboratoare diferite și/sau efectuate de laboranți diferiți nu trebuie să depășească:

8.    Rezultatele unui studiu colaborativ

A fost organizat un exercițiu de comparare interlaboratoare la nivelul UE, la care au participat 18 laboratoare. Au fost analizate cinci eșantioane pozitive de furaje combinate pentru rumegătoare (în tabelele 1 și 2, denumite MAT) (1 analiză) în duplicate oarbe, în timp ce un furaj combinat de rumegătoare martor a fost analizat o singură dată.

Calculele pentru limitele de repetabilitate (r) și reproductibilitate (R), astfel cum sunt definite în orientările internaționale, au fost efectuate după eliminarea valorilor excepționale utilizând analiza varianței valorilor valabile.

Cifrele privind performanța calculată a metodei (repetabilitate, reproductibilitate) sunt prezentate în tabelele următoare. Pentru toate eșantioanele testate, inclusiv materialul martor, nu au fost găsite rezultate fals pozitive sau fals negative.

9.    Observații

E.   DETERMINAREA AMINOACIZILOR (CU EXCEPȚIA TRIPTOFANULUI)

Metodele de analiză utilizate pentru determinarea aminoacizilor (cu excepția triptofanului) sunt:

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea aminoacizilor liberi (sintetici și naturali) și totali (legați în peptide și liberi) din materii prime furajere, furaje combinate și preamestecuri care conțin mai puțin de 10 % ( 16 ) din fiecare aminoacid, folosind un analizator de aminoacizi. Ea este aplicabilă următorilor aminoacizi: cist(e)ină, metionină, lizină, treonină, alanină, arginină, acid aspartic, acid glutamic, glicină, histidină, izoleucină, leucină, fenilalanină, prolină, serină, tirozină și valină.

Metoda nu deosebește diferite săruri ale aminoacizilor și nu permite diferențierea între formele D și L ale aminoacizilor. Ea nu este valabilă pentru determinarea triptofanului sau a analogilor hidroxilați ai aminoacizilor.

2.    Principiu

2.1.    Aminoacizi liberi

Aminoacizii liberi se extrag cu acid clorhidric diluat. Macromoleculele azotate coextrase se precipită cu acid sulfosalicilic și se îndepărtează prin filtrare. Soluția filtrată se ajustează la pH-ul de 2,20. Aminoacizii se separă prin cromatografie cu schimb de ioni și se determină prin reacție cu ninhidrină cu detecție fotometrică la 570 nm.

2.2.    Aminoacizi totali

Procedura aleasă depinde de aminoacizii care sunt analizați. Cist(e)ina și metionina trebuie oxidate la acid cisteic și, respectiv, metionin sulfonă înainte de hidroliză. Tirozina trebuie determinată în hidrolizate de eșantioane neoxidate. Toți ceilalți aminoacizi enumerați la punctul 1 (Obiectiv și domeniu de aplicare) se pot determina fie în eșantionul oxidat, fie în eșantionul neoxidat.

Oxidarea se realizează la 0 °C cu ajutorul unui amestec de acid performic și fenol. Reactivul de oxidare în exces se descompune cu disulfit de sodiu. Eșantionul oxidat sau neoxidat se hidrolizează cu acid clorhidric (punctul 3.20) timp de 23 de ore. Hidrolizatul se ajustează la pH-ul de 2,20. Aminoacizii se separă prin cromatografie cu schimb de ioni și se determină prin reacție cu ninhidrină folosind detecția fotometrică la 570 nm (440 nm pentru prolină).

3.    Reactivi

Trebuie utilizată apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS).

Se dizolvă 300 g de NaOH (punctul 3.5) în apă și se completează până la 1 litru.

Se dizolvă 40 g de NaOH (punctul 3.5) în apă și se completează până la 1 litru.

Se amestecă 889 g de acid formic (punctul 3.2) cu 111 g de apă și se adaugă 4,73 g de fenol (punctul 3.3).

Se adaugă 1 g de fenol (punctul 3.3) la 492 ml de HCl (punctul 3.7) și se completează cu apă până la 1 litru.

Se dizolvă 60 g de acid 5-sulfosalicilic (punctul 3.6) în apă și se completează cu apă până la 1 litru.

Se amestecă 0,5 ml de peroxid de hidrogen (punctul 3.1) cu 4,5 ml soluție de acid formic-fenol (punctul 3.19) într-un mic pahar de laborator. Se incubează la 20-30 °C timp de 1 oră pentru a se forma acid performic, apoi se răcește în baie de apă cu gheață (15 min) înainte de a se adăuga la eșantion.

Atenție: a se evita contactul cu pielea și a se purta îmbrăcăminte protectoare.

Se dizolvă 19,61 g de citrat de sodiu (punctul 3.8), 5 ml de tiodiglicol (punctul 3.9), 1 g de fenol (punctul 3.3) și 16,50 ml de HCl (punctul 3.7) în aproximativ 800 ml de apă. Se ajustează pH-ul la 2,20. Se completează cu apă până la 1 litru.

c = 2,5 μmol/ml pentru fiecare, în acid clorhidric.

Se pot obține din surse comerciale.

Se dizolvă 0,2115 g de acid cisteic (punctul 3.16.2) și 0,2265 g de metionin sulfonă (punctul 3.16.3) în soluție tampon de citrat (punctul 3.24) într-un balon gradat de 1 litru și se completează până la semn cu soluție tampon de citrat. Se păstrează la o temperatură sub 5 °C, nu mai mult de 12 luni. Această soluție nu se utilizează dacă soluția etalon stoc (punctul 3.27.1) conține acid cisteic și metionin sulfonă.

Se dizolvă 0,6560 g de norleucină (punctul 3.13) în soluție tampon de citrat (punctul 3.24) într-un balon gradat și se completează cu soluție tampon de citrat până la 250 ml. Se păstrează la o temperatură sub 5 °C, nu mai mult de 6 luni.

Se transferă cantitativ într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu soluție tampon de citrat (punctul 3.24) și se amestecă.

Se păstrează la o temperatură sub 5 °C, nu mai mult de 3 luni.

A se vedea și observațiile de la punctul 9.1.

Se păstrează la o temperatură sub 5 °C, nu mai mult de 3 luni.

4.    Aparatură

Coloana este umplută cu rășini de polistiren sulfonat capabile să separe aminoacizii unul de altul, precum și de materiale care conțin ninhidrină. Fluxul din liniile cu soluție tampon și ninhidrină este asigurat de pompe care au o stabilitate a fluxului de ± 0,5 % în perioada care include atât funcționarea în vederea calibrării standardului, cât și analiza eșantionului.

În cazul unor analizori de aminoacizi se pot utiliza proceduri de hidrolizare în care hidrolizatul are o concentrație de sodiu de c = 0,8 mol/l și conține întreaga cantitate de acid formic rezidual din etapa de oxidare. Alți analizori nu oferă o separare satisfăcătoare a anumitor aminoacizi dacă hidrolizatul conține exces de acid formic și/sau concentrații mari de ioni de sodiu. În acest caz, volumul de acid se reduce prin evaporare la aproximativ 5 ml după hidroliză și înainte de ajustarea pH-ului. Evaporarea se face sub vid, la o temperatură maximă de 40 °C.

5.    Procedura

5.1.    Pregătirea eșantionului

Eșantionul se macină astfel încât poate trece printr-o sită cu ochiuri de 0,5 mm. Înainte de măcinare, eșantioanele cu un conținut ridicat de umiditate trebuie fie uscate la aer la o temperatură de maximum 50 °C, fie liofilizate. Eșantioanele cu un conținut ridicat de substanțe grase se extrag cu eter de petrol (punctul 3.12) înainte de măcinare.

5.2.    Determinarea aminoacizilor liberi

Se cântărește cu o abatere de 0,2 mg o cantitate adecvată (1-5 g) din eșantionul preparat (punctul 5.1), într-un flacon tip Erlenmeyer și se adaugă 100,0 ml de extract de mixtură (punctul 3.21). Se agită mixtura timp de 60 de minute cu ajutorul agitatorului mecanic sau magnetic (punctul 4.8). Se lasă să se decanteze sedimentul și se pipetează 10,0 ml din soluția supernatantă într-un pahar de laborator de 100 ml.

Se adaugă 5,0 ml de soluție de acid sulfosalicilic (punctul 3.22) în cursul agitării și se continuă agitarea cu ajutorul agitatorului magnetic timp de 5 minute. Se filtrează sau se centrifughează supernatantul pentru a se îndepărta orice precipitat. Se introduc 10,0 ml din soluția rezultată într-un pahar de laborator de 100 ml și se ajustează pH-ul la valoarea de 2,20 cu ajutorul soluției de hidroxid de sodiu (punctul 3.18), se transferă într-un balon gradat de volum adecvat utilizându-se soluție tampon de citrat (punctul 3.24) și se completează până la semn cu soluția tampon (punctul 3.24).

Dacă se utilizează etalon intern, se adaugă 1,00 ml de etalon intern (punctul 3.27.3) pentru fiecare 100 ml de soluție finală și se completează până la semn cu soluție tampon (punctul 3.24).

Se trece la etapa de cromatografie conform punctului 5.4.

Dacă extractele nu se examinează în aceeași zi, trebuie păstrate la o temperatură sub 5 °C.

5.3.    Determinarea aminoacizilor totali

5.3.1.    Oxidare

Se cântăresc cu o abatere de 0,2 mg între 0,1 și 1 g de eșantion preparat (punctul 5.1) într-un (într-o):

Porția de eșantion cântărită are un conținut de azot de aproximativ 10 mg și un conținut de umiditate de maximum 100 mg.

Se introduce balonul/sticla într-o baie de apă cu gheață și se răcește la 0 °C, se adaugă 5 ml de mixtură de oxidare (punctul 3.23) și se amestecă cu ajutorul unei spatule de sticlă cu vârf încovoiat. Se etanșeizează balonul/sticla conținând spatula cu ajutorul unei pelicule ermetizante, se introduce baia de apă cu gheață conținând recipientul etanșeizat într-un frigider la 0 °C și se lasă timp de 16 ore. După 16 ore, se scoate din frigider, iar excesul de reactiv de oxidare se descompune prin adăugarea a 0,84 g de disulfit de sodiu (punctul 3.4).

Se trece la 5.3.2.1.

5.3.2.    Hidroliza

La eșantioanele oxidate preparate în conformitate cu punctul 5.3.1 se adaugă 25 ml de mixtură de hidroliză (punctul 3.20) având grijă să se spele orice reziduu de eșantion de pe pereții vasului și de pe spatulă.

În funcție de procedura de hidrolizare utilizată, se trece la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4.

Se cântăresc 0,1-1 g de eșantion preparat (punctul 5.1), cu o abatere de 0,2 mg, fie într-un balon cu fund rotund de 100 ml sau 250 ml (punctul 4.1), fie într-o sticlă de 100 ml dotată cu dop filetat (punctul 4.2). Porția de eșantion cântărit trebuie să aibă un conținut de azot de aproximativ 10 mg. Se adaugă cu grijă 25 ml de mixtură de hidroliză (punctul 3.20) și se amestecă cu eșantionul. Se procedează ca la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4.

Se adaugă 3 mărgele de sticlă în mixtura din balon (preparată conform mențiunilor de la punctul 5.3.2.1 sau 5.3.2.2) și se fierbe în clocot continuu sub reflux timp de 23 de ore. La încheierea hidrolizei, se spală condensatorul cu 5 ml de soluție tampon de citrat (punctul 3.24). Se deconectează balonul și se răcește într-o baie de apă cu gheață.

Se procedează ca la punctul 5.3.3.

Sticla conținând mixtura preparată conform punctului 5.3.2.1 sau 5.3.2.2 se introduce în cuptor (punctul 4.3) la 110 °C. În timpul primei ore, pentru a se preveni o creștere progresivă a presiunii (datorată expansiunii substanțelor gazoase) și pentru a se evita o explozie, se plasează dopul filetat la nivelul extremității superioare a vasului. A nu se închide vasul cu dopul respectiv. După o oră, se închide vasul cu dopul respectiv și se lasă în cuptor (punctul 4.3) timp de 23 de ore. La încheierea hidrolizei, se îndepărtează sticla din cuptor, se scoate cu grijă dopul de la nivelul sticlei, iar aceasta se introduce într-o baie de apă cu gheață. Se lasă să se răcească.

În funcție de procedura de ajustare a pH-ului (punctul 5.3.3), se transferă cantitativ conținutul sticlei într-un pahar de laborator de 250 ml sau într-un balon cu fund rotund de 250 ml, utilizând soluție tampon de citrat (punctul 3.24).

Se procedează ca la punctul 5.3.3.

5.3.3.    Ajustarea pH-ului

În funcție de toleranța la sodiu a analizorului de aminoacizi (punctul 4.9), pentru ajustarea pH-ului se procedează ca la punctul 5.3.3.1 sau 5.3.3.2.

Este recomandabil să se utilizeze o soluție etalon stoc internă (punctul 3.27.3) în cazul în care se folosesc analizori de aminoacizi necesitând o concentrație mică de sodiu (în cazul în care volumul de acid trebuie redus).

În acest caz, la hidrolizat se adaugă 2,00 ml de soluție etalon stoc internă (punctul 3.27.3) înainte de evaporare.

La hidrolizatul obținut conform punctului 5.3.2.3 sau 5.3.2.4 se adaugă 2 picături de 1-octanol (punctul 3.15).

Utilizând un evaporator rotativ (punctul 4.7) se reduce volumul la 5-10 ml în condiții de vid la 40 °C. Dacă volumul este redus accidental la mai puțin de 5 ml, hidrolizatul trebuie aruncat, iar analiza trebuie repetată.

Se ajustează pH-ul la 2,20 cu ajutorul soluției de hidroxid de sodiu (punctul 3.18) și se procedează ca la punctul 5.3.4.

Hidrolizatele obținute conform punctului 5.3.2.3 sau 5.3.2.4 se neutralizează parțial prin adăugarea cu grijă, în condiții de agitare continuă, a 17 ml de soluție de hidroxid de sodiu (punctul 3.17), asigurându-se că temperatura este menținută sub 40 °C.

Se ajustează pH-ul la valoarea de 2,20 la temperatura camerei prin utilizarea soluției de hidroxid de sodiu (punctul 3.17) și în cele din urmă a soluției de hidroxid de sodiu (punctul 3.18). Se trece la punctul 5.3.4.

5.3.4.    Soluția de eșantion pentru cromatografie

Se transferă cantitativ hidrolizatul cu pH ajustat (punctul 5.3.3.1 sau 5.3.3.2) cu soluție tampon de citrat (punctul 3.24) într-un balon gradat de 200 ml și se completează până la semn cu soluție tampon (punctul 3.24).

Dacă nu s-a utilizat deja un etalon intern, se adaugă 2,00 ml de etalon intern (punctul 3.27.3) și se completează până la semn cu soluție tampon de citrat (punctul 3.24). Se amestecă minuțios.

Se trece la etapa cromatografică (punctul 5.4).

Dacă soluțiile de eșantion nu se examinează în aceeași zi, ele se păstrează la o temperatură sub 5 °C.

5.4.    Cromatografia

Înainte de cromatografie se aduce extractul (punctul 5.2) sau hidrolizatul (punctul 5.3.4) la temperatura camerei. Se agită mixtura și se filtrează o cantitate potrivită printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,22 μm (punctul 4.5). Soluția limpede rezultată se supune cromatografiei prin schimb ionic, utilizând un analizor de aminoacizi (punctul 4.9).

Injectarea poate fi efectuată manual sau automat. Este important ca aceeași cantitate de soluție ± 0,5 % să fie adăugată în coloană pentru analizarea etaloanelor și a eșantioanelor cu excepția situațiilor în care se utilizează un etalon intern și ca raporturile sodiu:aminoacizi în soluțiile de etalon și în cele de eșantion să fie cât mai similare posibil.

În general, frecvența manevrelor de calibrare depinde de stabilitatea reactivului ninhidrină și a sistemului analitic. Etalonul sau eșantionul se diluează cu soluție tampon de citrat (punctul 3.24) pentru a genera o arie a vârfului pentru etalon de 30-200 % din aria vârfului pentru eșantionul de aminoacid.

Cromatografia aminoacizilor va varia ușor în funcție de tipul analizorului și de rășina utilizate. Sistemul ales trebuie să fie capabil să separe aminoacizii unul de altul, precum și de materiale care conțin ninhidrină. În cursul operațiilor, sistemul cromatografic generează un răspuns linear la modificările cantităților de aminoacizi adăugați la coloană.

În cursul etapei cromatografice se aplică rapoartele înălțimii corespunzătoare punctului minim:vârfului menționate mai jos, în cazul în care se analizează o soluție echimolară (de aminoacizi analizați). Această soluție echimolară trebuie să conțină cel puțin 30 % din cantitatea maximă de aminoacizi care poate fi măsurată cu precizie cu ajutorul sistemului analizor de aminoacizi (punctul 4.9).

Pentru separarea treoninei-serinei, în cazul suprapunerii a doi aminoacizi, raportul punct minim/vârf corespunzător aminoacidului situat mai jos pe cromatogramă nu trebuie să depășească 2:10. [dacă se determină doar cist(e)ina, metionina, treonina și lizina, separarea insuficientă a vârfurilor învecinate va influența în mod negativ determinarea]. Pentru toți ceilalți aminoacizi, separarea trebuie să fie mai bună de 1:10.

Sistemul trebuie să asigure că lizina se separă de „artefactele de lizină” și de ornitină.

6.    Calculul rezultatelor

Aria vârfului pentru eșantion și etalon se măsoară pentru fiecare aminoacid în parte, iar cantitatea (X) se calculează în g de aminoacid per kg de eșantion.

Dacă se utilizează un etalon intern se multiplică cu:

A

=

aria vârfului, hidrolizat sau extract

B

=

aria vârfului, soluția etalon de calibrare

C

=

aria vârfului, etalon intern în hidrolizat sau extract

D

=

aria vârfului, etalon intern, soluția etalon de calibrare

M

=

greutatea molară a aminoacidului determinat

c

=

concentrația de standard în μmol/ml

m

=

greutatea eșantionului (g) (corectată pentru a obține greutatea originală dacă produsul este uscat sau degresat)

V

=

total hidrolizat în ml (punctul 5.3.4) sau volumul de diluție total calculat pentru extract, în ml (6.1)

Cistina și cisteina se determină amândouă ca acid cisteic în hidrolizate de eșantion oxidat, dar se calculează ca cistină (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) folosind M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionina se determină ca metionin sulfonă în hidrolizate de eșantion oxidat, dar se calculează ca metionină folosind M pentru metionină: 149,21 g/mol.

Metionina liberă adăugată se determină după extracție ca metionină, pentru calculare folosindu-se aceeași M.

V

=

volumul extractului final

7.    Evaluarea metodei

Metoda a fost testată prin comparații la nivel internațional în 1990 utilizând patru furaje diferite (furaje combinate pentru porcine, furaje combinate pentru pui de carne, concentrate proteice, preamestecuri).

Rezultatele studiului de comparare interlaboratoare din 1990, după eliminarea valorilor extreme, exprimate ca medie și deviație standard sunt prezentate în tabelele de la acest punct:

7.1.    Repetabilitate

Repetabilitatea exprimată ca „deviație standard intralaborator” a comparației interlaboratoare din tabelul de mai sus este redată în tabelele de mai jos:

7.2.    Reproductibilitate

Rezultatele pentru deviația standard interlaboratoare pentru comparația interlaboratoare menționată mai sus sunt prezentate în tabelul de mai jos:

8.    Utilizarea materialelor de referință

Aplicarea corectă a metodei se verifică prin repetarea măsurătorilor pentru materialele de referință certificate, atunci când acestea sunt disponibile. Se recomandă calibrarea cu soluție de calibrare pentru aminoacid certificată.

9.    Observații

Intervalul răspunsului liniar al aparatului trebuie verificat pentru toți aminoacizii.

Soluția etalon se diluează cu soluție tampon de citrat pentru a genera arii de vârf situate la mijlocul intervalului.

10.    Criterii de performanță

Compilarea rezultatelor (cu excepția tirozinei) care provin din cele două studii colaborative (din 1990 raportate la punctul 7 de mai sus și din 2005 raportate în EN/ISO 13903) oferă următoarele criterii de repetabilitate și reproductibilitate. Este posibil ca valorile obținute din aceste două studii interlaboratoare să nu fie aplicabile altor intervale de concentrație și matrice decât cele date.

10.1.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate pe același eșantion în același laborator și de către același laborant nu trebuie să depășească:

10.2.    Reproductibilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate pe același eșantion în laboratoare diferite și/sau efectuate de laboranți diferiți nu trebuie să depășească:

F.   DETERMINAREA TRIPTOFANULUI

Metodele de analiză utilizate pentru determinarea triptofanului sunt:

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea în furaje a triptofanului total și liber. Ea nu face distincție între formele D și L.

2.    Principiu

Pentru determinarea triptofanului total, eșantionul se hidrolizează în mediu bazic cu o soluție de hidroxid de bariu saturată și se încălzește la 110 °C timp de 20 de ore. După hidroliză, se adaugă etalon intern.

Pentru determinarea triptofanului liber, eșantionul se extrage în mediu ușor acid în prezența etalonului intern.

Triptofanul și etalonul intern din hidrolizat sau din extract se determină prin HPLC prin detectarea fluorescenței.

3.    Reactivi

Se dizolvă 40,0 g de NaOH (punctul 3.5) în apă și se completează până la 1 litru cu apă (punctul 3.1).

Se iau 492 ml HCl (punctul 3.7) și se completează până la 1 litru cu apă.

Se iau 82 ml HCl (punctul 3.7) și se completează până la 1 litru cu apă.

Se iau 8,2 ml HCl (punctul 3.7) și se completează până la 1 litru cu apă.

Se iau 34 ml de acid ortofosforic (punctul 3.6) și se completează până la 1 litru cu apă (punctul 3.1).

Într-un balon gradat de 500 ml se dizolvă 0,2553 g de triptofan (punctul 3.2) în acid clorhidric (punctul 3.13) și se completează până la semn cu acid clorhidric (punctul 3.13). Se păstrează la – 18 °C timp de maximum 4 săptămâni.

Într-un balon gradat de 500 ml se dizolvă 0,2728 g de α-metil-triptofan (punctul 3.3) în acid clorhidric (punctul 3.13) și se completează până la semn cu acid clorhidric (punctul 3.13). Se păstrează la – 18 °C timp de maximum 4 săptămâni.

Se iau 2,00 ml din soluția concentrată de triptofan (punctul 3.15) și 2,00 ml din soluția concentrată de etalon intern (α-metil-triptofan) (punctul 3.16). Se diluează cu apă (punctul 3.1) și metanol (punctul 3.8) până se ajunge la un volum aproximativ egal și la aproximativ aceeași concentrație de metanol (10-30 %) ca și hidrolizatul final.

Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

În timpul preparării se protejează de lumina solară directă.

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Prepararea eșantioanelor

Eșantionul se macină astfel încât poate trece printr-o sită cu ochiuri de 0,5 mm. Înainte de măcinare, eșantioanele cu un conținut ridicat de umiditate trebuie fie uscate la aer la o temperatură de maximum 50 °C, fie liofilizate. Înainte de măcinare, eșantioanele cu un conținut ridicat de substanțe grase se extrag cu eter de petrol (punctul 3.9).

5.2.    Determinarea triptofanului liber (extract)

Se cântărește cu o abatere de 1 mg o cantitate adecvată (1-5 g) din eșantionul preparat (punctul 5.1), într-un flacon tip Erlenmeyer. Se adaugă 100,0 ml de acid clorhidric (punctul 3.13) și 5,00 ml din soluția etalon intern concentrată (punctul 3.16). Se agită sau se amestecă timp de 60 de minute cu ajutorul unui agitator mecanic sau al unui amestecător magnetic (punctul 4.7). Se lasă să se decanteze sedimentul și se pipetează 10,0 ml din soluția supernatantă într-un pahar de laborator. Se adaugă 5 ml de acid ortofosforic (punctul 3.14). Se ajustează pH-ul la valoarea 3 utilizând hidroxid de sodiu (punctul 3.10). Se adaugă suficient metanol (punctul 3.8) pentru a obține o concentrație de metanol în volumul final de 10-30 %. Se transferă într-un balon gradat de volum corespunzător și se diluează cu apă până la un volum necesar pentru cromatografie (aproximativ același volum ca și soluția etalon de calibrare (punctul 3.17).

Se filtrează câțiva ml de soluție printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,45 μm (punctul 4.5) înainte de a se injecta în coloana HPLC. Se trece la etapa de cromatografie conform punctului 5.4.

Soluția etalon și extractele se protejează de lumina solară directă. Dacă analizarea extractelor nu este posibilă în aceeași zi, ele pot fi depozitate la 5 °C, cel mult 3 zile.

5.3.    Determinarea triptofanului total (hidrolizat)

Se cântăresc cu o abatere de 0,2 mg între 0,1 și 1 g din eșantionul preparat (punctul 5.1) într-un vas de polipropilenă (punctul 4.4). Porția de eșantion cântărit trebuie să aibă un conținut de azot de aproximativ 10 mg. Se adaugă 8,4 g de hidroxid de bariu octahidrat (punctul 3.4) și 10 ml de apă. Se amestecă într-un mixer Vortex (punctul 4.8) sau într-un amestecător magnetic (punctul 4.7). Magnetul învelit în teflon se lasă în amestec. Se spală pereții vasului cu 4 ml de apă. Se pune dopul filetat și se închide vasul neermetic. Se transferă într-o autoclavă (punctul 4.6) cu apă clocotită și se expun la vapori de apă timp de 30-60 de minute. Se închide autoclava și se autoclavează la 110 (± 2) °C timp de 20 de ore.

Înainte de a deschide autoclava se reduce temperatura la o valoare imediat sub 100 °C. Pentru a evita cristalizarea Ba(OH)2.8 H2O, se adaugă la amestecul cald 30 ml apă la temperatura camerei. Se agită sau se amestecă ușor. Se adaugă 2,00 ml din soluția etalon intern concentrată (α-metil-triptofan) (punctul 3.16). Se răcesc vasele într-o baie de apă/gheață timp de 15 minute.

Apoi, se adaugă 5 ml de acid ortofosforic (punctul 3.14). Se menține vasul în baia de răcire și se neutralizează cu HCl (punctul 3.11) amestecând continuu, apoi se ajustează pH-ul la valoarea 3,0 utilizând HCl (punctul 3.12). Se adaugă suficient metanol pentru a obține o concentrație de metanol în volumul final de 10-30 %. Se transferă într-un balon gradat de volum corespunzător și se diluează cu apă până la volumul definit necesar pentru cromatografie (de exemplu 100 ml). Adăugarea de metanol nu provoacă precipitare.

Se filtrează câțiva ml de soluție printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,45 μm (punctul 4.5) înainte de a se injecta în coloana HPLC. Se trece la etapa de cromatografie conform punctului 5.4.

Soluția etalon și hidrolizatele se protejează de lumina solară directă. Dacă analizarea hidrolizatelor nu este posibilă în aceeași zi, ele pot fi depozitate la 5 °C, cel mult 3 zile.

5.4.    Determinarea prin HPLC

Următoarele condiții pentru eluția izocratică sunt oferite în scop orientativ; se pot aplica alte condiții cu condiția ca acestea să determine rezultate echivalente (a se vedea, de asemenea, observațiile de la punctele 9.1 și 9.2):

6.    Calculul rezultatelor

Se calculează cantitatea de triptofan (X), în g per 100 g de eșantion.

A

=

aria vârfului etalonului intern, soluția etalon de calibrare (punctul 3.17)

B

=

suprafața vârfului pentru triptofan, extract (punctul 5.2) sau hidrolizat (punctul 5.3)

V1

=

volumul în ml (2 ml) al soluției concentrate de triptofan (punctul 3.15) adăugată la soluția de calibrare (punctul 3.17)

c

=

concentrația în μmol/ml (= 2,50) a soluției concentrate de triptofan (punctul 3.15) adăugată la soluția de calibrare (punctul 3.17)

V2

=

volumul în ml al soluției etalon intern concentrate (punctul 3.16) adăugată la extract (punctul 5.2) (= 5,00 ml) sau la hidrolizat (punctul 5.3) (= 2,00 ml)

C

=

aria vârfului etalonului intern, extract (punctul 5.2) sau hidrolizat (punctul 5.3)

D

=

aria vârfului pentru triptofan, soluția etalon de calibrare (punctul 3.17)

V3

=

volumul în ml (= 2,00 ml) al soluției de etalon intern concentrate (punctul 3.16) adăugată la soluția etalon de calibrare (punctul 3.17)

m

=

greutatea eșantionului în g (corectată pentru a obține greutatea originală dacă produsul este uscat și/sau degresat)

M

=

masa molară a triptofanului (= 204,23 g/mol).

7.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe același eșantion nu trebuie să depășească 10 % din rezultatul cel mai mare.

8.    Rezultatele unui studiu colaborativ

S-a efectuat un studiu colaborativ la nivelul UE (a 4-a comparație interlaboratoare) în care au fost analizate trei eșantioane de către 12 laboratoare pentru a certifica metoda de hidroliză. Fiecare eșantion a fost supus la cinci analize. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos:

S-a efectuat un alt studiu colaborativ la nivelul UE (a 3-a comparație interlaboratoare) în care au fost analizate două eșantioane de către 13 laboratoare pentru a certifica metoda de extracție a triptofanului liber. Fiecare eșantion a fost supus la cinci analize. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos:

S-a efectuat un alt studiu de comparație interlaboratoare la nivelul UE în care au fost analizate patru eșantioane de către 7 laboratoare cu scopul de a certifica metoda de hidroliză pentru triptofan. Rezultatele sunt prezentate mai jos. Fiecare eșantion a fost supus la cinci analize.

9.    Observații

Eluție izocratică urmată de curățarea coloanei prin gradient:

În cursul operațiilor, sistemul cromatografic oferă un răspuns linear. Acest răspuns linear se măsoară în condiții de concentrație constantă (normalul) a etalonului intern și de concentrații variabile a triptofanului. Este important că înălțimea vârfurilor pentru triptofan și pentru etalonul intern să se situeze în gama lineară a sistemului HPLC/fluorescență. Dacă vârfurile pentru triptofan și/sau pentru etalonul intern sunt prea joase sau prea înalte, analiza se repetă cu un eșantion de o altă dimensiune și/sau un volum final modificat.

9.3.    Hidroxid de bariu

Cu timpul, hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat. Aceasta generează o soluție lipsită de limpezime pentru determinarea HPLC, ceea ce poate duce la rezultate slabe pentru triptofan.

G.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE ULEIURI ȘI GRĂSIMI BRUTE

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Prezenta metodă este destinată determinării în furaje a conținutului de uleiuri și grăsimi brute.

Utilizarea celor două proceduri descrise mai jos depinde de natura și compoziția furajului și de motivul efectuării analizei.

Pentru determinarea uleiurilor și grăsimilor brute din semințele oleaginoase și din fructele oleaginoase, precum și din hrana pentru animale în care conținutul de uleiuri/grăsimi este mai mare de 15 %, extracția trebuie efectuată prin procedura A și reextracția prin procedura B (punctul 5.3).

1.1.   Procedura A – Uleiuri și grăsimi brute care pot fi extrase direct

Această metodă este aplicabilă materiilor prime furajere de origine vegetală, cu excepția celor incluse în sfera de aplicare a procedeului B.

1.2.   Procedura B – Uleiuri și grăsimi brute totale

Această metodă este aplicabilă materiilor prime furajere de origine animală și tuturor furajelor combinate. Ea trebuie folosită pentru toate materiile din care uleiurile și grăsimile nu pot fi extrase complet fără hidroliză prealabilă (de exemplu, gluten, drojdie, proteine din cartofi și produse supuse unor procese cum ar fi extrudarea, transformarea în fulgi și încălzirea).

1.3.    Interpretarea rezultatelor

În toate cazurile în care se obține un rezultat superior folosind procedura B comparativ cu cel obținut prin folosirea procedurii A, rezultatul obținut prin procedura B se acceptă ca valoarea reală.

2.    Principiu

2.1.    Procedura A

Eșantionul se extrage cu eter de petrol. Solventul se îndepărtează prin distilare, iar reziduul se usucă și se cântărește.

2.2.    Procedura B

Eșantionul se tratează la cald cu acid clorhidric. Amestecul se răcește și se filtrează. Reziduul se spală și se usucă, apoi se supune determinării în conformitate cu procedura A.

3.    Reactivi

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.   Procedura A (a se vedea punctul 8.1)

Se cântăresc 5 g de eșantion cu o abatere de 1 mg, se transferă într-un cartuș de extracție (punctul 4.2) și se acoperă cu un tampon de vată lipsit de grăsimi.

Cartușul se introduce într-un extractor (punctul 4.1) și se extrage timp de șase ore cu eter de petrol (punctul 3.1). Se colectează extractul de eter de petrol într-un vas uscat și cântărit, care conține fragmente de piatră ponce ( 17 ).

Solventul se îndepărtează prin distilare. Se usucă reziduul, păstrând vasul timp de o oră și jumătate în cuptorul de uscare (punctul 4.3). Se lasă să se răcească într-un desicator și se cântărește. Se usucă din nou timp de 30 de minute pentru a asigura că greutatea uleiurilor și grăsimilor rămâne constantă (pierderea de greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 1 mg).

5.2.    Procedura B

Se cântăresc 2,5 g de eșantion cu o abatere de 1 mg (a se vedea punctul 8.2), se introduc într-un pahar de laborator de 400 ml sau într-un flacon tip Erlenmeyer de 300 ml și se adaugă 100 ml de acid clorhidric (punctul 3.3) și fragmente de piatră ponce. Se acoperă paharul de laborator cu o sticlă de ceas sau se conectează un condensator cu reflux la flaconul tip Erlenmeyer. Se aduce amestecul la fierbere ușoară deasupra unei flăcări mici sau pe o plită și se păstrează în această stare timp de o oră. Trebuie să se împiedice lipirea produsului de părțile laterale ale recipientului.

Se răcește și se adaugă o cantitate de adjuvant de filtrare (punctul 3.4) suficientă pentru a evita orice pierdere de ulei și grăsime în timpul filtrării. Se filtrează printr-un filtru de hârtie dublă, umezită și lipsită de grăsimi. Se spală reziduul în apă rece până se obține un filtrat neutru. Se verifică filtratul ca să nu conțină deloc uleiuri și grăsimi. Prezența acestora indică faptul că eșantionul trebuie extras cu eter de petrol, folosind procedura A, înainte de hidroliză.

Se așază filtrul de hârtie dublă care conține reziduul pe o sticlă de ceas și se usucă timp de o oră și jumătate în cuptorul cu aer (punctul 4.3) la 100 ± 3 °C.

Se așază filtrul de hârtie dublă care conține reziduul uscat într-un cartuș de extracție (punctul 4.2) și se acoperă cu un tampon de vată lipsit de grăsimi. Cartușul se introduce într-un extractor (punctul 4.1) și se procedează astfel cum se indică la paragrafele doi și trei de la punctul 5.1.

5.3.    Procedura A și reextragerea prin procedura B.

Pentru determinarea uleiurilor și grăsimilor brute din semințele oleaginoase și din fructele oleaginoase, precum și din hrana pentru animale în care conținutul de uleiuri/grăsimi este mai mare de 15 %, extracția trebuie efectuată prin procedura A și reextracția prin procedura B.

Aceasta înseamnă că, după extracția cu eter de petrol (procedura A), reziduul sau o porțiune din reziduu se reextrage cu acid clorhidric (procedura B). Conținutul de uleiuri și de grăsimi brute este suma rezultatelor procedurilor A și B.

6.    Exprimarea rezultatului

Greutatea reziduului se exprimă ca procent din eșantion.

7.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion de către același laborant nu depășește:

8.    Observații

Se cântăresc 20 g de eșantion cu o abatere de 1 mg și se amestecă cu o cantitate de 10 g sau mai mare de sulfat de sodiu anhidru (punctul 3.2). Se extrage cu eter de petrol (punctul 3.1) astfel cum se indică la punctul 5.1. Se completează extractul obținut până la 500 ml cu eter de petrol (punctul 3.1) și se amestecă. Se iau 50 ml de soluție și se introduc într-un vas mic, uscat și cântărit, care conține fragmente de piatră ponce. Se elimină solventul prin distilare, se usucă și se procedează astfel cum se indică la ultimul paragraf al punctului 5.1.

Se elimină solventul din reziduul de extracție rămas în cartuș, se macină reziduul până la o finețe de 1 mm, se reintroduce în cartușul de extracție (nu se adaugă sulfat de sodiu) și se procedează astfel cum se indică la punctul 5.1, paragrafele doi și trei.

Conținutul de uleiuri și grăsimi se calculează ca procent din eșantion folosind următoarea formulă:

unde:

m1

=

greutatea în grame a reziduului după prima extracție (parte alicotă din extract);

m2

=

greutatea în grame a reziduului după a doua extracție.

H.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE FIBRE BRUTE

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a substanțelor organice lipsite de grăsimi care sunt insolubile în mediu acid și alcalin și care sunt descrise în mod convențional ca fibre brute.

Metoda nu se aplică în cazul lignocelulozei și al carbonului vegetal (particule prea fine).

2.    Principiu

Eșantionul, degresat la nevoie, se tratează succesiv cu soluții de acid sulfuric și hidroxid de potasiu, de concentrații specifice, în stare de fierbere. Reziduul se separă prin filtrare printr-un filtru de sticlă sinterizată spălat, uscat, cântărit și calcinat la o temperatură cuprinsă între 475 și 500 °C. Pierderea de greutate rezultată prin calcinare corespunde fibrelor brute din eșantionul testat.

3.    Reactivi

4.    Aparatură

5.    Procedura

Se cântărește 1 g de eșantion preparat cu o abatere de 1 mg și se introduce în creuzet (punctul 4.2), (a se vedea observațiile 9.1, 9.2 și 9.3) și se adaugă 1 g de adjuvant de filtrare (punctul 3.3).

Se asamblează unitatea de încălzire (punctul 4.1) și creuzetul filtrant (punctul 4.2), apoi se atașează cilindrul (punctul 4.3) la creuzet. Se toarnă 150 ml de acid sulfuric aflat în stare de fierbere (punctul 3.1) în ansamblul cilindru-creuzet și, dacă este necesar, se adaugă câteva picături de agent antispumant (punctul 3.2).

Se aduce lichidul la fierbere în decurs de 5 ± 2 minute și se fierbe viguros exact 30 de minute.

Se deschide dopul țevii de evacuare (punctul 4.1) și, în condiții de vid, se filtrează acidul sulfuric prin creuzetul filtrant, apoi se spală reziduul cu trei porții consecutive de 30 ml de apă aflată în stare de fierbere, asigurându-se că reziduul se filtrează uscat după fiecare spălare.

Se închide dopul orificiului de evacuare și se toarnă 150 ml de soluție de hidroxid de potasiu aflată în stare de fierbere (punctul 3.7) în ansamblul cilindru-creuzet, apoi se adaugă câteva picături de agent antispumant (punctul 3.2). Se aduce lichidul la punctul de fierbere în decurs de 5 ± 2 minute și se fierbe viguros exact 30 de minute. Se filtrează și se repetă procedura de spălare utilizată în etapa cu acid sulfuric.

După spălarea și uscarea finală, se deconectează creuzetul împreună cu conținutul său și se reconectează la unitatea de extracție la rece (punctul 4.6). Se creează vidul, iar reziduul se spală în creuzet cu trei porții consecutive de acetonă de 25 ml (punctul 3.4), asigurându-se că reziduul se filtrează în starea uscată după fiecare spălare.

Creuzetul se usucă în cuptor la 130 °C până se ajunge la o greutate constantă. După fiecare uscare, se răcește în desicator și se cântărește rapid. Se introduce creuzetul într-un cuptor cu muflă și se calcinează până se atinge o greutate constantă (pierderea de greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 2 mg) la o temperatură cuprinsă între 475 °C și 500 °C timp de cel puțin 30 de minute.

După fiecare încălzire, înainte de cântărire se răcește mai întâi în cuptor, iar apoi în desicator.

Se efectuează un test martor fără eșantion. Pierderea de greutate rezultată din calcinare nu trebui să depășească 4 mg.

6.    Calculul rezultatelor

Conținutul de fibre brute exprimat ca procent din eșantion este dat de formula:

unde:

m

=

greutatea eșantionului în g;

m0

=

pierderea de greutate după calcinare în cursul determinării, în g;

m1

=

pierderea de greutate după calcinare în cursul testului martor, în g.

7.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească:

8.    Reproductibilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate pe același eșantion în laboratoare diferite nu trebuie să depășească:

9.    Observații

I.   DETERMINAREA ZAHARURILOR

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea cantității de zaharuri reductoare și a zaharurilor totale după inversie, exprimate ca glucoză sau, acolo unde este cazul, ca zaharoză, prin conversie cu factorul 0,95. Ea este aplicabilă furajelor combinate. Pentru alte tipuri de furaje există metode specifice. Dacă este necesar, lactoza se determină separat, ținându-se cont de aceasta la calcularea rezultatelor.

Această metodă se utilizează pentru determinarea conținutului de zahăr utilizat la calcularea valorii energetice a furajului.

În cazul în care conținutul de zahăr trebuie determinat în alte scopuri, se pot utiliza alte metode de analiză.

2.    Principiu

Zaharurile se extrag în etanol diluat; soluția se limpezește cu soluții Carrez I și II. După eliminarea etanolului, cantitățile pre- și post-inversie se determină prin metoda Luff-Schoorl.

3.    Reactivi

Amestecând cu grijă, se toarnă soluția de acid citric (punctul 3.8.2) în soluția de carbonat de sodiu (punctul 3.8.3). Se adaugă soluția de sulfat de cupru (punctul 3.8.1) și se completează până la 1 litru cu apă. Se lasă la decantare peste noapte și se filtrează.

Se verifică concentrația reactivului obținut astfel (Cu 0,05 mol/litru; Na2 CO3 1 mol/litru), a se vedea (punctul 5.4) ultimul paragraf. pH-ul soluției este aproximativ 9,4.

4.    Aparatură

Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.

5.    Procedura

5.1.    Extracția eșantionului

Se cântăresc 2,5 g de eșantion cu o abatere de 1 mg și se introduc într-un balon gradat de 250 ml. Se adaugă 200 ml etanol (punctul 3.1) și se amestecă timp de o oră în agitator. Se adaugă 5 ml de soluție Carrez I (punctul 3.2) și se amestecă timp de aproximativ 30 de secunde. Se adaugă aproximativ 5 ml de soluție Carrez II (punctul 3.3) și se amestecă din nou timp de un minut. Se completează până la volum cu etanolul (punctul 3.1), se omogenizează și se filtrează. Se îndepărtează 200 ml de filtrat și se evaporă până la aproximativ jumătate din volum în scopul eliminării majorității etanolului. Reziduul rămas după evaporare se transferă cantitativ într-un balon gradat de 200 ml cu ajutorul apei calde, se răcește, se completează până la volum cu apă, se omogenizează și, dacă este necesar, se filtrează. Această soluție se va utiliza pentru determinarea cantității zaharurilor reductoare și, după inversie, a zaharurilor totale.

5.2.    Determinarea zaharurilor reductoare

Cu ajutorul unei pipete se îndepărtează maximum 25 ml din soluția care conține mai puțin de 60 mg de zaharuri reductoare exprimate ca glucoză. Dacă este necesar, se completează până la 25 ml cu apă distilată și se determină conținutul în zaharuri reductoare prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul se exprimă sub formă de conținut procentual de glucoză în eșantion.

5.3.    Determinarea zaharurilor totale după inversie

Cu ajutorul unei pipete se recoltează 50 ml de soluție și se transferă într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă câteva picături de soluție de metiloranj (punctul 3.4), apoi, amestecând continuu, se adaugă cu grijă acid clorhidric (punctul 3.5) până când lichidul virează într-un roșu bine definit. Se adaugă 15 ml de acid clorhidric (punctul 3.6), se scufundă balonul într-o baie de apă clocotindă și se menține acolo timp de 30 de minute. Se răcește rapid la aproximativ 20 °C și se adaugă 15 ml de soluție de hidroxid de sodiu (punctul 3.7). Se completează cu apă până la 100 ml și se omogenizează. Se îndepărtează maximum 25 ml din soluția care conține mai puțin de 60 mg de zaharuri reductoare exprimate ca glucoză. Dacă este necesar, se completează până la 25 ml cu apă distilată și se determină conținutul în zaharuri reductoare prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul se exprimă în procente de glucoză sau, dacă este cazul, de zaharoză, prin multiplicare cu factorul 0,95.

5.4.    Titrare prin metoda Luff-Schoorl

Cu ajutorul unei pipete se recoltează 25 ml de reactiv Luff-Schoorl (punctul 3.8) și se transferă într-un flacon Erlenmeyer de 300 ml; se adaugă exact 25 ml din soluția de zaharuri limpezită. Se adaugă 2 granule de piatră ponce (punctul 3.13), se încălzește, amestecând manual, deasupra unei flăcări libere cu înălțime medie, aducându-se lichidul la fierbere în aproximativ 2 minute. Flaconul Erlenmeyer se așază imediat pe o plasă de sârmă acoperită cu azbest având un orificiu cu diametru de aproximativ 6 cm sub care există o flacără aprinsă. Flacăra se reglează astfel încât să se încălzească doar baza flaconului Erlenmeyer. La flaconul Erlenmeyer se montează un condensator cu reflux. Se fierbe exact 10 minute. Se răcește imediat în apă rece și, după aproximativ 5 minute, se titrează după cum urmează:

Se adaugă 10 ml de soluție de iodură de potasiu (punctul 3.12) și, imediat după aceea (cu grijă, din cauza riscului formării unei spume abundente), se adaugă 25 ml de acid sulfuric (punctul 3.11). Se titrează în continuare cu soluție de tiosulfat de sodiu (punctul 3.9) până la apariția unei coloraturi galben șters, adăugând ca indicator soluția de amidon (punctul 3.10) și încheind titrarea.

Se efectuează aceeași titrare pe un amestec de 25 ml de reactiv Luff-Schoorl (punctul 3.8) cu 25 ml de apă, măsurat cu precizie, după ce s-au adăugat 10 ml de soluție de iodură de potasiu (punctul 3.12) și 25 ml de acid sulfuric (punctul 3.11), fără a se fierbe.

6.    Calculul rezultatelor

Utilizând tabelul, se stabilește cantitatea de glucoză în mg care corespunde diferenței dintre valorile celor două titrări, exprimate în ml de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru. Rezultatul se exprimă ca procent din eșantion.

7.    Proceduri speciale

Se omogenizează și se filtrează. Se elimină etanolul astfel cum se descrie la punctul 5.1. În absența amidonului dextrinizat, se completează până la volum cu apă distilată.

8.    Observații

În ambele cazuri, cantitatea de zaharuri prezentă se determină prin metoda Luff-Schoorl și se calculează în mg de glucoză. Una dintre valori se scade din cealaltă, iar diferența se exprimă ca procent din eșantion.

Exemplu

Cele două volume considerate corespund, pentru fiecare determinare, unui eșantion de 250 mg.

În primul caz, se consumă 17 ml de soluție de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru, ceea ce corespunde la 44,2 mg de glucoză; în al doilea, 11 ml, ceea ce corespunde la 27,6 mg de glucoză.

Diferența este 16,6 mg de glucoză.

Prin urmare, conținutul de zaharuri reductoare (cu excepția lactozei), calculat ca glucoză, este:

J.   DETERMINAREA LACTOZEI

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conținutului de lactoză în furajele care au un conținut de lactoză mai mare de 0,5 %.

2.    Principiu

Zaharurile se dizolvă în apă. Soluția este supusă fermentației de către drojdia Saccharomyces cerevisiae care nu descompune lactoza. După limpezire și filtrare, conținutul de lactoză al filtratului se determină prin metoda Luff-Schoorl.

3.    Reactivi

Amestecând cu grijă, se toarnă soluția de acid citric (punctul 3.4.2) în soluția de carbonat de sodiu (punctul 3.4.3). Se adaugă soluția de sulfat de cupru (punctul 3.4.1) și se completează până la 1 litru cu apă. Se lasă la decantare peste noapte și se filtrează. Se verifică concentrația reactivului obținut astfel (Cu 0,05 mol/litru; Na2 CO3 1 mol/litru). pH-ul soluției este aproximativ 9,4.

4.    Aparatură

Baie de apă cu termostat reglat la 38-40 °C.

5.    Procedura

Se cântărește 1 g de eșantion cu o abatere de 1 mg și se introduce într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă 25-30 ml de apă. Balonul se introduce într-o baie de apă aflată la temperatura de fierbere, timp de 30 de minute, apoi se răcește la aproximativ 35 °C. Se adaugă 5 ml de suspensie de drojdie (punctul 3.1) și se omogenizează. Balonul se lasă să stea timp de două ore într-o baie de apă la temperatura de 38-40 °C. Se răcește la aproximativ 20 °C.

Se adaugă 2,5 ml de soluție Carrez I (punctul 3.2) și se amestecă timp de 30 de secunde, apoi se adaugă 2,5 ml de soluție Carrez II (punctul 3.3) și se amestecă din nou timp de 30 de secunde. Se completează cu apă până la 100 ml, se amestecă și se filtrează. Cu ajutorul unei pipete, se îndepărtează o cantitate de filtrat care nu depășește 25 ml și care conține, de preferință, 40-80 mg de lactoză, apoi se transferă într-un flacon Erlenmeyer de 300 ml. Dacă este necesar, se completează cu apă până la 25 ml.

Se efectuează un test martor în același mod cu 5 ml de suspensie de drojdie (punctul 3.1). Se determină conținutul de lactoză prin metoda Luff-Schoorl, după cum urmează: se adaugă exact 25 ml de reactiv Luff-Schoorl (punctul 3.4) și două granule de piatră ponce (punctul 3.5). Se amestecă manual concomitent cu încălzirea deasupra unei flăcări libere de înălțime medie, iar lichidul se aduce la fierbere în aproximativ 2 minute. Flaconul Erlenmeyer se așază imediat pe o plasă de sârmă acoperită cu azbest având un orificiu cu diametru de aproximativ 6 cm sub care există o flacără aprinsă. Flacăra se reglează astfel încât să se încălzească doar baza flaconului Erlenmeyer. La flaconul Erlenmeyer se montează un condensator cu reflux. Se fierbe exact 10 minute. Se răcește imediat în apă rece și, după aproximativ 5 minute, se titrează după cum urmează:

Se adaugă 10 ml de soluție de iodură de potasiu (punctul 3.6) și, imediat după aceea (cu grijă, din cauza riscului formării unei spume abundente), se adaugă 25 ml acid sulfuric (punctul 3.7). Se titrează în continuare cu soluție de tiosulfat de sodiu (punctul 3.8) până la apariția unei coloraturi galben șters, adăugând ca indicator soluția de amidon (punctul 3.9) și încheind titrarea.

Se efectuează aceeași titrare pe un amestec de 25 ml de reactiv Luff-Schoorl (punctul 3.4) cu 25 ml de apă, măsurat cu precizie, după ce s-au adăugat 10 ml de soluție de iodură de potasiu (punctul 3.6) și 25 ml de acid sulfuric (punctul 3.7), fără a se fierbe.

6.    Calculul rezultatelor

Utilizând tabelul atașat, se stabilește cantitatea de lactoză în mg care corespunde diferenței dintre rezultatele celor două titrări, exprimate în ml de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.

Rezultatul pentru lactoza anhidră se exprimă ca procent din eșantion.

7.    Observație

K.   DETERMINAREA AMIDONULUI

METODA POLARIMETRICĂ

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a conținutului de amidon și a produselor de degradare a amidonului cu masă moleculară mare cu scopul de a se verifica conformitatea cu valoarea energetică declarată (prevederile din anexa VII) și cu Regulamentul (CE) nr. 767/2009.

Această metodă se utilizează pentru determinarea conținutului de amidon utilizat la calcularea valorii energetice a furajului.

În cazul în care conținutul de amidon trebuie determinat în alte scopuri, se pot utiliza alte metode de analiză.

2.    Principiu

Metoda cuprinde două determinări. În prima, eșantionul este tratat cu acid clorhidric diluat. După limpezire și filtrare, se măsoară rotația optică a soluției prin polarimetrie.

În cea de-a doua, eșantionul este extras cu etanol 40 %. După acidificarea filtratului cu acid clorhidric, limpezire și filtrare, se măsoară rotația optică la fel ca în prima determinare.

Diferența dintre cele două măsurători, multiplicată cu un factor cunoscut, oferă conținutul de amidon al eșantionului.

3.    Reactivi

Concentrația se verifică prin titrare folosind o soluție de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru în prezența roșului de metil 0,1 % (greutate/volum) în etanol 94 % (v/v). Pentru neutralizarea a 10 ml sunt necesari 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/litru.

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Pregătirea eșantionului

Eșantionul se zdrobește până când devine suficient de fin pentru a trece complet printr-o sită cu orificii rotunde de 0,5 mm.

5.2.   Determinarea rotației optice totale (P sau S) (a se vedea observația de la punctul 7.1)

Se cântăresc 2,5 g din eșantionul zdrobit cu abatere de 1 mg și se introduc într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă 25 ml de acid clorhidric (punctul 3.2), se agită pentru a obține o distribuție uniformă a eșantionului de testat și se adaugă încă 25 ml de acid clorhidric (punctul 3.2). Se scufundă balonul într-o baie de apă care fierbe, agitându-se cu putere și în mod constant în primele trei minute pentru a preveni formarea de aglomerări. Cantitatea de apă din baia de apă trebuie să fie suficientă pentru ca baia să rămână la punctul de fierbere atunci când balonul este introdus în ea. Balonul nu trebuie să fie scos din baie în timp ce este agitat. După exact 15 minute, se scoate din baie, se adaugă 30 ml de apă rece și se răcește imediat la 20 °C.

Se adaugă 5 ml de soluție Carrez I (punctul 3.3) și se agită timp de aproximativ 30 de secunde. Apoi se adaugă 5 ml de soluție Carrez II (punctul 3.4) și se agită din nou timp de aproximativ 30 de secunde. Se completează cu apă până la volum, se amestecă și se filtrează. Dacă filtratul nu este perfect limpede (ceea ce se întâmplă rar), se repetă determinarea folosind o cantitate mai mare din soluțiile Carrez I și II, de exemplu 10 ml.

Se măsoară rotația optică a soluției într-un tub de 200 mm cu polarimetrul sau cu zaharimetrul.

5.3.    Determinarea rotației optice (P’ sau S’) a substanțelor solubile în etanol 40 %

Se cântăresc 5 g din eșantion cu abatere de 1 mg, se introduc într-un balon gradat de 100 ml și se adaugă aproximativ 80 ml de etanol (punctul 3.5) (a se vedea observația de la punctul 7.2). Se lasă balonul să stea timp de 1 oră la temperatura camerei; în acest timp, se agită cu putere de șase ori astfel încât eșantionul de testat să se amestece complet cu etanolul. Se completează până la volum cu etanol (punctul 3.5), se amestecă și se filtrează.

Se pipetează 50 ml de filtrat (corespunde la 2,5 g de eșantion) într-un flacon Erlenmeyer de 250 ml, se adaugă 2,1 ml de acid clorhidric (punctul 3.1) și se agită puternic. La flaconul Erlenmeyer se montează un condensator cu reflux, iar vasul se scufundă într-o baie de apă în fierbere. După exact 15 minute, se scoate flaconul Erlenmeyer din baie, se transferă conținutul într-un balon gradat de 100 ml, clătind cu puțină apă rece și se răcește la 20 °C.

Se limpezește folosind soluțiile Carrez I (punctul 3.3) și II (punctul 3.4), se completează până la volum cu apă, se amestecă, se filtrează și se măsoară rotația optică astfel cum se indică la punctul 5.2 paragrafele doi și trei.

6.    Calculul rezultatelor

Conținutul de amidon (%) se calculează după cum urmează:

6.1.    Măsurare cu polarimetrul

P

=

rotația optică totală în grade unghiulare

P’

=

rotația optică în grade unghiulare a substanțelor solubile în etanol 40 % (V/V)

=

rotația optică specifică a amidonului pur. Valorile numerice acceptate în mod convențional pentru acest factor sunt următoarele:

+ 185,9°

:

amidon din orez

+ 185,7°

:

amidon din cartofi

+ 184,6°

:

amidon din porumb

+ 182,7°

:

amidon din grâu

+ 181,5°

:

amidon din orz

+ 181,3°

:

amidon din ovăz

+ 184,0

:

alte tipuri de amidon și amestecuri de amidon în furaje combinate

6.2.    Măsurare cu zaharimetrul

S

=

rotația optică totală în grade zaharimetrice

S’

=

rotația optică în grade zaharimetrice a substanțelor solubile în etanol 40 % (v/v)

N

=

greutatea (g) a zaharozei în 100 ml de apă determinând o rotație optică de 100 grade zaharimetrice măsurată cu un tub de 200 mm 16,29 g pentru zaharimetrele franceze 26,00 g pentru zaharimetrele germane 20,00 g pentru zaharimetrele mixte.

=

rotația optică specifică a amidonului pur (a se vedea punctul 6.1)

6.3.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească 0,4 în valoare absolută pentru un conținut de amidon mai mic de 40 % și 1 % în valoare relativă în cazul conținutului de amidon egal sau mai mare de 40 %.

7.    Observații

L.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CENUȘĂ BRUTĂ

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a conținutului de cenușă brută.

2.    Principiu

Eșantionul se calcinează la 550 °C; reziduul se cântărește.

3.    Reactivi

Nitrat de amoniu, soluție 20 % (greutate/volum).

4.    Aparatură

5.    Procedura

Se cântăresc aproximativ 5 g de eșantion cu o abatere de 1 mg (2,5 g pentru produsele cu tendință de umflare) și se introduc într-un creuzet pentru calcinare, care în prealabil a fost încălzit la 550 °C, răcit și tarat. Se așază creuzetul pe plită și se încălzește progresiv până la carbonizarea materialului. Se calcinează în conformitate cu mențiunile de la punctul 5.1 sau 5.2.

6.    Calculul rezultatelor

Se calculează greutatea reziduului prin deducerea tarei.

Rezultatul se exprimă ca procent din eșantion.

7.    Observații

M.   DETERMINAREA CENUȘII INSOLUBILE ÎN ACID CLORHIDRIC

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a conținutului de substanțe minerale insolubile în acid clorhidric. Se pot utiliza două metode, în funcție de natura eșantionului.

2.    Principiu

3.    Reactivi

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Metoda A:

Eșantionul se calcinează prin metoda descrisă la determinarea cenușii brute. Se poate utiliza și cenușă obținută din analiza respectivă.

Se introduce cenușa într-un pahar de laborator de 250-400 ml, utilizând 75 ml de acid clorhidric (punctul 3.1). Se aduce lent la fierbere și se fierbe încet timp de 15 minute. Soluția caldă se filtrează printr-un filtru de hârtie lipsit de cenușă, iar reziduul se spală cu apă caldă până când reacția acidă nu mai este vizibilă. Filtrul care conține reziduul se usucă și se calcinează într-un creuzet tarat, la o temperatură de minimum 550 °C și maximum 700 °C. Se lasă să se răcească într-un desicator și se cântărește.

5.2.    Metoda B

Se cântăresc 5 g de eșantion cu o abatere de 1 mg și se introduc într-un pahar de laborator de 250-400 ml. Se adaugă succesiv 25 ml apă și 25 ml acid clorhidric (punctul 3.1), se amestecă și se așteaptă ca efervescența să înceteze. Se adaugă încă 50 ml de acid clorhidric (punctul 3.1). Se așteaptă ca degajarea de gaz să înceteze, apoi se introduce paharul de laborator într-o baie de apă la temperatura de fierbere și se menține acolo timp de 30 de minute sau, dacă este necesar, mai mult, pentru ca amidonul eventual prezent să se hidrolizeze complet. Se filtrează până este încă cald, printr-un filtru lipsit de cenușă, iar filtrul se spală în 50 ml de apă caldă (a se vedea observația 7). Se introduce filtrul care conține reziduul într-un creuzet pentru calcinare, se usucă și se calcinează la o temperatură de minimum 550 °C și maximum 700 °C. Se introduce cenușa într-un pahar de laborator de 250-400 ml, utilizând 75 ml de acid clorhidric (punctul 3.1); se continuă astfel cum se descrie la punctul 5.1, al doilea paragraf.

6.    Calculul rezultatelor

Se calculează greutatea reziduului prin deducerea tarei. Rezultatul se exprimă ca procent din eșantion.

7.    Observație

Dacă filtrarea se dovedește dificilă, se reia analiza, înlocuind cei 50 ml de acid clorhidric (punctul 3.1) cu 50 ml de acid tricloracetic, soluție 20 % (greutate/volum) (punctul 3.2) și spălând filtrul într-o soluție caldă de acid tricloracetic 1 % (punctul 3.3).

N.   DETERMINAREA FOSFORULUI TOTAL

Fosforul total se determină prin:

METODA FOTOMETRICĂ

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a conținutului de fosfor total. Ea este indicată în special pentru analiza produselor sărace în fosfor. În anumite cazuri (produs bogat în fosfor), se poate utiliza o metodă gravimetrică.

2.    Principiu

Eșantionul se mineralizează, fie prin combustie uscată (în cazul furajelor organice), fie prin dizolvare în mediu acid (în cazul furajelor combinate conținând minerale și al celor lichide), iar apoi se introduce în soluție acidă. Soluția se tratează cu reactivul molibdovanadat. Densitatea optică a soluției galbene astfel formate se măsoară cu un spectrofotometru la 430 nm.

3.    Reactivi

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Prepararea soluției

În funcție de natura eșantionului, soluția se prepară astfel cum se indică la punctul 5.1.1 sau 5.1.2.

5.1.1.    Procedura uzuală

Se cântărește 1 g de eșantion, sau mai mult, cu o abatere de 1 mg. Se introduce eșantionul de testat într-un flacon Kjeldahl, se adaugă 20 ml de acid sulfuric (punctul 3.5), se agită pentru a impregna complet substanța cu acid și pentru a preveni ca substanța să adere pe pereții flaconului, se încălzește și se menține la punctul de fierbere timp de 10 minute. Se lasă să se răcească ușor, se adaugă 2 ml de acid azotic (punctul 3.4), se încălzește ușor, se lasă să se răcească ușor, se mai adaugă puțin acid azotic (punctul 3.4) și se readuce la punctul de fierbere. Se repetă această procedură până se obține o soluție incoloră. Se răcește, se adaugă puțină apă, se decantează lichidul într-un balon gradat de 500 ml clătind flaconul Kjeldahl cu apă fierbinte. Se lasă să se răcească, se completează până la volum cu apă, se omogenizează și se filtrează.

5.1.2.    Eșantioane care conțin substanțe organice și sunt lipsite de fosfați diacizi de calciu și magneziu

Se cântăresc aproximativ 2,5 g de eșantion cu abatere de 1 mg într-un creuzet de calcinare. Se amestecă eșantionul de testat cu 1 g de carbonat de calciu (punctul 3.1) până când se obține un amestec complet omogen. Se calcinează în cuptor la 550 °C până se obține o cenușă albă sau gri (o cantitate mică de cărbune se ignoră). Se transferă cenușa într-un pahar de laborator de 250 ml. Se adaugă 20 ml de apă și acid clorhidric (punctul 3.2) până când efervescența încetează. Se adaugă încă 10 ml de acid clorhidric (punctul 3.2). Se așază paharul de laborator pe o baie de nisip și se evaporă până la uscare, pentru a face silicea insolubilă. Se redizolvă reziduul în 10 ml de acid azotic (punctul 3.3) și se fierbe pe baia de nisip sau pe o plită timp de 5 minute, fără a se evapora până la uscare. Se decantează lichidul într-un balon gradat de 500 ml, clătind paharul de mai multe ori cu apă fierbinte. Se lasă să se răcească, se completează până la volum cu apă, se omogenizează și se filtrează.

5.2.    Apariția colorației și măsurarea densității optice

Se diluează o parte alicotă de filtrat obținut ca la punctul 5.1.1 sau 5.1.2 pentru a obține o concentrație de fosfor de maximum 40 μg/ml. Se introduc 10 ml din această soluție într-o eprubetă (punctul 4.6) și se adaugă 10 ml de reactiv molibdovanadat (punctul 3.6). Se omogenizează și se lasă să stea timp de cel puțin 10 minute la 20 °C. Densitatea optică se măsoară cu un spectrofotometru la 430 nm, prin comparație cu o soluție obținută prin adăugarea de 10 ml de reactiv molibdovanadat (punctul 3.6) la 10 ml de apă.

5.3.    Curba de calibrare

Din soluția etalon (punctul 3.7) se prepară soluții care conțin 5, 10, 20, 30 și 40 μg de fosfor per ml, respectiv. Se iau 10 ml din fiecare din aceste soluții și se adaugă la 10 ml de reactiv molibdovanadat (punctul 3.6). Se omogenizează și se lasă să stea timp de cel puțin 10 minute la 20 °C. Densitatea optică se măsoară astfel cum se indică la punctul 5.2. Se trasează curba de calibrare prin înscrierea grafică a densităților optice în raport cu cantitățile corespunzătoare de fosfor. Pentru concentrații cuprinse între 0 și 40 μg/ml, curba va fi liniară.

6.    Calculul rezultatelor

Cantitatea de fosfor din eșantionul de testat se determină prin utilizarea curbei de calibrare.

Rezultatul se exprimă ca procent din eșantion.

Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele obținute în două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu depășesc:

O.   DETERMINAREA CLORULUI DIN CLORURI

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea cantității de clor din clorurile solubile în apă, exprimate convențional ca clorură de sodiu. Este aplicabilă tuturor furajelor.

2.    Principiu

Clorurile se dizolvă în apă. Dacă produsul conține materii organice, se limpezește. Soluția se acidifică ușor cu acid azotic, iar clorurile precipită sub formă de clorură de argint cu ajutorul unei soluții de nitrat de argint. Excesul de nitrat de argint se titrează cu o soluție de tiocianat de amoniu, prin metoda Volhard.

3.    Reactivi

4.    Aparatură

Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.

5.    Procedura

5.1.    Prepararea soluției

În funcție de natura eșantionului, se prepară o soluție conform indicațiilor de la punctul 5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3.

În același timp, se efectuează un test martor fără eșantionul de analizat.

5.1.1.    Eșantioane fără materii organice

Se cântăresc maximum 10 g de eșantion cu o abatere de 1 mg, care conțin maximum 3 g de clor sub formă de cloruri. Se introduc, împreună cu 400 ml de apă, într-un balon gradat de 500 ml la aproximativ 20 °C. Se amestecă timp de 30 de minute în agitator, se aduce la volum, se omogenizează și se filtrează.

5.1.2.    Eșantioane care conțin materii organice, exceptând produsele menționate la punctul 5.1.3

Se cântăresc aproximativ 5 g de eșantion cu o abatere de 1 mg și se introduc, împreună cu 1 g de cărbune activ, într-un balon gradat de 500 ml. Se adaugă 400 ml apă la aproximativ 20 °C și 5 ml de soluție Carrez I (punctul 3.7), se amestecă timp de 30 de secunde, apoi se adaugă 5 ml de soluție Carrez II (punctul 3.8). Se amestecă timp de 30 de minute în agitator, se aduce la volum, se omogenizează și se filtrează.

5.1.3.    Furaje preparate termic, turte și făină de in, produse bogate în făină de in și alte produse bogate în mucilagii sau în substanțe coloidale (de exemplu amidon dextrinat)

Se prepară soluția astfel cum se descrie la punctul 5.1.2, dar nu se filtrează. Se decantează (dacă este necesar, se centrifughează), se îndepărtează 100 ml lichid supernatant și se transferă într-un flacon de măsurare de 200 ml. Se amestecă cu acetonă (punctul 3.6) și se aduce la volum cu acest solvent, se omogenizează și se filtrează.

5.2.    Titrarea

Cu ajutorul unei pipete, se transferă într-un flacon Erlenmeyer o cantitate cuprinsă între de 25 și 100 ml de filtrat (în funcție de conținutul anticipat de clor), obținut astfel cum se descrie la punctul 5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3. Porția alicotă nu trebuie să conțină mai mult de 150 mg de clor (Cl). Dacă este necesar, se diluează cu maximum 50 ml de apă, se adaugă 5 ml acid azotic (punctul 3.4), 2 ml de soluție saturată de sulfat feric de amoniu (punctul 3.3) și două picături de soluție de tiocianat de amoniu (punctul 3.1) transferată cu ajutorul unei biurete umplute până la gradația zero. Cu ajutorul unei biurete, se transferă soluția de nitrat de argint (punctul 3.2) astfel încât să se obțină un exces de 5 ml. Se adaugă 5 ml de eter dietilic (punctul 3.5) și se agită puternic pentru a coagula precipitatul. Excesul de nitrat de argint se titrează cu soluția de tiocianat de amoniu (punctul 3.1) până când colorația maro-roșcat a persistat timp de un minut.

6.    Calculul rezultatelor

Cantitatea de clor (X), exprimată ca % de clorură de sodiu, se calculează cu ajutorul următoarei formule:

unde:

V1

=

ml de soluție de nitrat de argint 0,1 mol/l adăugată;

V2

=

ml de soluție de tiocianat de amoniu 0,1 mol/l utilizată la titrare;

m

=

g din greutatea eșantionului în partea alicotă.

Dacă testul martor indică un consum de soluție de nitrat de argint 0,1 mol/l, se deduce această valoare din volum (V1 – V2).

7.    Observații

▼M10

P.   DETERMINAREA CARBONAȚILOR

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Metoda permite dozarea carbonaților, în mod convențional exprimați în carbonat de calciu, din furaje cu excepția furajelor în care este prezent carbonatul de fier.

2.    Principiu

Carbonații se descompun în acid clorhidric; dioxidul de carbon eliberat se colectează într-un tub gradat, iar volumul său se compară cu cel eliberat în aceleași condiții de o cantitate cunoscută de carbonat de calciu.

3.    Reactivi

4.    Aparatură

Aparatul Scheibler-Dietrich (a se vedea schema din apendice) sau aparatură echivalentă (calcimetru).

5.    Procedură

În funcție de conținutul de carbonați al eșantionului, se cântărește o porție de eșantion conform indicațiilor de mai jos:

Se adaugă acid clorhidric (punctul 3.1 de mai sus) la porția de eșantion pentru a descompune carbonații prezenți. Volumul de dioxid de carbon se măsoară cu ajutorul aparatului Scheibler-Dietrich sau al unei aparaturi echivalente (calcimetru) și se compară cu volumul de dioxid de carbon produs de 0,5 g de carbonat de calciu pur (punctul 3.2 de mai sus).

Toate determinările se efectuează în aceleași condiții pentru a se evita corectarea diferențelor de temperatură și presiune. Determinarea trebuie efectuată, de preferință, într-o încăpere cu temperatură controlată.

Procedura de utilizare a aparatului Scheibler-Dietrich este descrisă în detaliu în apendice.

6.    Calculul rezultatelor

Conținutul de carbonați, exprimați drept carbonat de calciu pur, se calculează prin utilizarea următoarei formule:

unde:

X

=

% (g/g) de carbonați în eșantioane, exprimați drept carbonat de calciu;

V

=

ml de CO2 eliberat de porția de eșantion;

V1

=

ml de CO2 eliberat de 0,5 g de CaCO3;

m

=

greutatea, în grame, a porției de eșantion.

7.    Observații

▼M9

---

ANEXA IV

METODE DE ANALIZĂ PENTRU CONTROLAREA NIVELULUI AUTORIZAT DE ADITIVI DIN FURAJE

A.   DETERMINAREA VITAMINEI A

Vitamina A se determină prin:

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea nivelului de vitamină A (retinol) din furaje. Vitamina A include alcoolul all-trans-retinil și izomerii săi cis, care se determină prin această metodă. Conținutul de vitamină A se exprimă în unități internaționale (UI) per kg O UI corespunde activității a 0,300 μg de alcool all-trans-vitamină A sau a 0,344 μg all-trans-vitamină A acetat sau 0,550 μg all-trans-vitamină A palmitat.

Limita de cuantificare este 2 000 UI de vitamină A/kg.

2.    Principiu

Eșantionul se hidrolizează cu o soluție de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina A se extrage cu eter de petrol. Solventul se îndepărtează prin evaporare, iar reziduul se dizolvă în metanol și, dacă este necesar, se diluează până la concentrația necesară. Conținutul de vitamină A se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversată (RP-HPLC) cu ajutorul unui detector de UV sau de fluorescență. Parametrii cromatografiei se aleg astfel încât să nu existe separație între alcoolul all-trans-vitamina A și izomerii săi cis.

3.    Reactivi

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Pregătirea eșantionului

Se macină eșantionul pentru a trece printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, evitându-se producerea de căldură. Măcinarea trebuie efectuată imediat înainte de cântărire și saponificare, în caz contrar riscându-se pierderi de vitamina A. Nu se macină eșantionul (eșantioanele) în cazul în care distribuția granulometrică este adecvată (de exemplu, preamestecuri și aditivi furajeri).

5.2.    Saponificarea

În funcție de conținutul de vitamină A, se cântăresc 2-25 g de eșantion cu o abatere de 1 mg într-un balon cu fund plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml (punctul 4.2.1). În cazul concentrațiilor scăzute, greutatea eșantionului poate fi mărită pentru a avea suficiente particule în porțiunea de testare. Se adaugă, agitând circular, 130 ml de etanol (punctul 3.1), aproximativ 100 mg de BHT (punctul 3.13), 2 ml de soluție de ascorbat de sodiu (punctul 3.5) și 2 ml de soluție de sulfură de sodiu (punctul 3.6). Se montează un condensator (punctul 4.3) la balon și acesta se scufundă într-o baie de apă cu agitator magnetic (punctul 4.7). Se încălzește până la fierbere și se lasă să reflueze timp de 5 minute. Apoi se adaugă 25 ml de soluție de hidroxid de potasiu (punctul 3.4) prin condensator (punctul 4.3) și se lasă să reflueze timp de încă 25 min, amestecând sub un flux ușor de azot. Apoi se clătește condensatorul cu circa 20 ml de apă și se răcește conținutul vasului la temperatura camerei.

5.3.    Extracție

Se transferă cantitativ prin decantare soluția saponificată, prin clătire cu un volum total de 250 ml de apă într-o pâlnie de separare de 1 000 ml (punctul 4.2.3) sau în aparatul de extracție (punctul 4.8). Se clătește succesiv vasul de saponificare cu 25 ml de etanol (punctul 3.1) și 100 ml de eter de petrol (punctul 3.2) și se transferă lichidul de clătire în pâlnia de separare sau în aparatul de extracție. Proporția de apă și etanol în soluțiile combinate trebuie să fie de cca 2:1. Se agită energic timp de 2 minute și se lasă să se sedimenteze timp de 2 minute.

5.3.1.    Extracția folosind o pâlnie de separare (punctul 4.2.3)

Când straturile s-au separat (a se vedea observația de la punctul 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de separare (punctul 4.2.3). Se repetă această extracție de două ori cu 100 ml eter de petrol (punctul 3.2) și de două ori cu 50 ml eter de petrol (punctul 3.2).

Se spală de două ori extractele combinate în pâlnia de separare amestecând ușor (pentru a se evita formarea de emulsii) cu cantități de 100 ml de apă și din nou, prin agitare repetată cu alte cantități de apă de 100 ml până când apa rămâne incoloră după adăugarea unei soluții de fenolftaleină (punctul 3.7) (patru spălări sunt în general suficiente). Se filtrează extractul spălat cu un filtru cutat uscat pentru separarea fazelor (punctul 4.4) pentru a se elimina apa în suspensie și se transferă într-un balon gradat de 500 ml (punctul 4.2.2). Se clătesc pâlnia de separare și filtrul cu 50 ml eter de petrol (punctul 3.2), se completează până la semn cu eter de petrol (punctul 3.2) și se amestecă bine.

5.3.2.    Extracția folosind un aparat de extracție (punctul 4.8)

Când straturile s-au separat (a se vedea observația de la punctul 7.3), se înlocuiește dopul cilindrului de sticlă (punctul 4.8.1) prin inserție de sticlă șlefuită (punctul 4.8.2) și se amplasează extremitatea inferioară în formă de „U” a tubului reglabil astfel încât să se afle exact deasupra nivelului interfeței. Aplicând o presiune de la generatorul de azot prin brațul lateral, se transferă stratul superior de eter de petrol într-o pâlnie de separare de 1 000 ml (punctul 4.2.3). Se adaugă 100 ml de eter de petrol (punctul 3.2) în cilindrul de sticlă, se pune dopul și se agită energic. Se lasă straturile să se separe și se transferă stratul superior în pâlnia de separare, la fel ca înainte. Se repetă procedura de extracție cu încă 100 ml eter de petrol (punctul 3.2), apoi de două ori cu cantități de 50 ml eter de petrol (punctul 3.2) și se adaugă straturile de eter de petrol în pâlnia de separare.

Se spală extractele combinate de eter de petrol conform procedurii descrise la punctul 5.3.1 și se procedează conform punctului menționat.

5.4.    Prepararea soluției de eșantion pentru HPLC

Se pipetează o parte alicotă din soluția de eter de petrol (de la punctul 5.3.1 sau 5.3.2) într-un balon piriform de 250 ml (punctul 4.2.4). Se evaporă solventul aproape în totalitate pe evaporatorul rotativ (punctul 4.1), cu presiune redusă, la o temperatură a băii de apă de maximum 40 °C. Se restabilește presiunea atmosferică prin admisia azotului (punctul 3.10) și se îndepărtează flaconul din evaporatorul rotativ. Se elimină restul de solvent cu un jet de azot (punctul 3.10), iar reziduul se dizolvă imediat într-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (punctul 3.3) (concentrația de vitamină A trebuie să fie cuprinsă în intervalul 5-30 UI/ml).

5.5.    Determinarea prin HPLC

Vitamina A se separă pe o coloană cu fază inversată C18 (punctul 4.5.1), iar concentrația se măsoară cu un detector de UV (punctul 325 nm) sau un detector de fluorescență (excitație: 325 nm, emisie: 475 nm) (punctul 4.5.2).

Se injectează o porție alicotă (de exemplu 20 μl) din soluția metanolică obținută la punctul 5.4 și se eluează cu faza mobilă (punctul 3.9). Se calculează înălțimea medie a vârfului (aria) mai multor injectări ale aceleiași soluții de eșantion și înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor mai multor injectări ale soluțiilor de calibrare (punctul 5.6.2).

Condiții HPLC

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica și alte condiții, dacă acestea duc la rezultate echivalente.

5.6.    Calibrarea

5.6.1.    Prepararea soluțiilor etalon de lucru

Se pipetează 20 ml de soluție stoc de vitamină A acetat (punctul 3.11.1) sau 20 ml de soluție stoc de vitamină A palmitat (punctul 3.12.1) într-un balon cu fund plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml (punctul 4.2.1) și se hidrolizează astfel cum se descrie la punctul 5.2, dar fără a se adăuga BHT. În continuare se extrage cu eter de petrol (punctul 3.2) conform punctului 5.3 și se completează până la 500 ml cu eter de petrol (punctul 3.2). Se lasă să se evaporeze 100 ml din acest extract aproape în totalitate în evaporatorul rotativ (a se vedea punctul 5.4), se îndepărtează solventul rămas într-un curent de azot (punctul 3.10) și se dizolvă din nou reziduul în 10,0 ml de metanol (punctul 3.3). Concentrația nominală a acestei soluții este de 560 UI vitamină A per ml. Conținutul exact se determină în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.6.3.3. Soluția etalon de lucru trebuie să fie preparată imediat înainte de utilizare.

Se pipetează 2,0 ml din această soluție etalon de lucru într-un balon gradat de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (punctul 3.3) și se amestecă. Concentrația nominală a acestei soluții etalon de lucru diluate este de 56 UI de vitamină A per ml.

5.6.2.    Prepararea soluțiilor de calibrare și a curbei de calibrare

Se transferă 1,0, 2,0, 5,0 și 10,0 ml din soluția etalon de lucru diluată într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (punctul 3.3) și se amestecă. Concentrațiile nominale ale acestor soluții sunt de 2,8, 5,6, 14,0 și respectiv 28,0 UI de vitamină A per ml.

Se injectează de mai multe ori câte 20 μl din fiecare soluție de calibrare și se determină înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor. Utilizând înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor, se trasează o curbă de calibrare ținând cont de rezultatele obținute cu soluția de control UV (punctul 5.6.3.3).

5.6.3.    Standardizarea UV a soluțiilor etalon

5.6.3.1.   Soluția stoc de vitamină A acetat

Se pipetează 2,0 ml din soluția stoc de vitamină A acetat (punctul 3.11.1) într-un balon gradat de 50 ml (punctul 4.2.2) și se completează până la semn cu 2-propanol (punctul 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 56 UI vitamină A per ml. Se pipetează 3,0 ml din această soluție diluată de vitamină A acetat într-un balon gradat de 25 ml și se completează până la semn cu 2-propanol (punctul 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 6,72 UI vitamină A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluții comparativ cu cel al soluției de 2-propanol (punctul 3.8), în spectrofotometru (punctul 4.6), în intervalul 300-400 nm. Maximumul de extincție trebuie să fie între 325 și 327 nm.

Calculul conținutului de vitamină A:

5.6.3.2.   Soluția stoc de vitamină A palmitat

Se pipetează 2,0 ml de soluție stoc de vitamină A palmitat (punctul 3.12.1) într-un balon gradat de 50 ml (punctul 4.2.2) și se completează până la gradație cu propanol-2 (punctul 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 56 UI vitamină A per ml. Se pipetează 3,0 ml din această soluție diluată de vitamină A palmitat într-un balon gradat de 25 ml și se completează până la semn cu 2-propanol (punctul 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 6,72 UI vitamină A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluții comparativ cu cel al soluției de 2-propanol (punctul 3.8), în spectrofotometru (punctul 4.6), în intervalul 300-400 nm. Maximumul de extincție trebuie să fie între 325 și 327 nm.

Calculul conținutului de vitamină A:

5.6.3.3.   Soluția etalon de lucru de vitamină A

Se pipetează 3,0 ml din soluția etalon de lucru nediluată de vitamină A, preparată conform punctului 5.6.1, într-un balon gradat de 50 ml (punctul 4.2.2) și se completează până la semn cu 2-propanol (punctul 3.8). Se pipetează 5,0 ml din această soluție într-un balon gradat de 25 ml și se completează până la semn cu 2-propanol (punctul 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 6,72 UI vitamină A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluții comparativ cu cel al soluției de 2-propanol (punctul 3.8), în spectrofotometru (punctul 4.6), în intervalul 300-400 nm. Maximumul de extincție trebuie să fie între 325 și 327 nm.

Calculul conținutului de vitamină A:

6.    Calculul rezultatelor

Din înălțimea (aria) medie a vârfurilor de vitamină A ale soluției de eșantion se determină concentrația soluției de eșantion în UI/ml prin referire la curba de calibrare (punctul 5.6.2).

Conținutul w de vitamină A al eșantionului, în UI/kg, este dat de următoarea formulă:

unde:

c

=

concentrația de vitamină A a soluției de eșantion (punctul 5.4), în UI/ml;

V1

=

volumul soluției de eșantion (punctul 5.4), în ml;

V2

=

volumul de alicotă prelevat la punctul 5.4, în ml;

m

=

greutatea porțiunii de testat, în g.

7.    Observații

Pentru a verifica dacă metoda de analizare aplicată generează rezultate fiabile pentru această matrice specifică (înlocuitor de lapte), se aplică un test de recuperare pe o porție suplimentară de testat. Dacă rata de recuperare este mai mică de 80 %, rezultatul analitic trebuie corectat în funcție de recuperare.

8.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe același eșantion nu trebuie să depășească 15 % din rezultatul superior.

9.    Rezultatele unui studiu colaborativ ( 20 )

Figura 1

Aparat de extracție (punctul 4.8)

B.   DETERMINAREA VITAMINEI E

Vitamina E se determină prin:

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea nivelului de vitamină E din furaje. Conținutul de vitamină E se exprimă ca mg DL-α-tocoferol acetat per kg 1 mg DL-α-tocoferol acetat corespunde la 0,91 mg DL-α-tocoferol (vitamină E).

Limita de cuantificare este 2 mg de vitamină E/kg Această limită de cuantificare se obține doar cu detectorul de fluorescență. Cu un detector de UV, limita de cuantificare este 10 mg/kg

2.    Principiu

Eșantionul se hidrolizează cu o soluție etanolică de hidroxid de potasiu, iar vitamina E se extrage cu eter de petrol. Solventul se îndepărtează prin evaporare, iar reziduul se dizolvă în metanol și, dacă este necesar, se diluează până la concentrația necesară. Conținutul de vitamina E se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversată (RP-HPLC), utilizând un detector de fluorescență sau de UV.

3.    Reactivi

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Pregătirea eșantionului

Se macină eșantionul pentru a trece printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, evitându-se producerea de căldură. Măcinarea trebuie efectuată imediat înainte de cântărire și saponificare, în caz contrar riscându-se pierderi de vitamina E.

5.2.    Saponificarea

În funcție de greutatea conținutului de vitamina E, se cântăresc, cu o abatere de 0,01 g, 2-25 g de eșantion într-un balon cu fund plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer, de 500 ml (punctul 4.2.1). Se adaugă, agitând circular, 130 ml de etanol (punctul 3.1), aproximativ 100 mg de BHT (punctul 3.12), 2 ml de soluție de ascorbat de sodiu (punctul 3.5) și 2 ml de soluție de sulfură de sodiu (punctul 3.6). Se montează un condensator (punctul 4.3) la vas și se introduce vasul într-o baie de apă cu agitator magnetic (punctul 4.7). Se încălzește până la fierbere și se lasă să reflueze timp de 5 minute. Apoi se adaugă 25 ml de soluție de hidroxid de potasiu (punctul 3.4) prin condensator (punctul 4.3) și se lasă să reflueze timp de încă 25 min, amestecând sub un flux ușor de azot. Apoi se clătește condensatorul cu circa 20 ml de apă și se răcește conținutul vasului la temperatura camerei.

5.3.    Extracție

Se transferă cantitativ prin decantare soluția saponificată, prin clătire cu un volum total de 250 ml de apă într-o pâlnie de separare de 1 000 ml (punctul 4.2.3) sau în aparatul de extracție (punctul 4.8). Se clătește succesiv vasul de saponificare cu 25 ml de etanol (punctul 3.1) și 100 ml de eter de petrol (punctul 3.2) și se transferă lichidul de clătire în pâlnia de separare sau în aparatul de extracție. Proporția de apă și etanol în soluțiile combinate trebuie să fie de cca 2:1. Se agită energic timp de 2 minute și se lasă să se sedimenteze timp de 2 minute.

5.3.1.    Extracția folosind o pâlnie de separare (punctul 4.2.3)

Când straturile s-au separat (a se vedea observația de la punctul 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de separare (punctul 4.2.3). Se repetă această extracție de două ori cu 100 ml eter de petrol (punctul 3.2) și de două ori cu 50 ml eter de petrol (punctul 3.2).

Se spală de două ori extractele combinate în pâlnia de separare amestecând ușor (pentru a se evita formarea de emulsii) cu cantități de 100 ml de apă și din nou, prin agitare repetată cu alte cantități de apă de 100 ml până când apa rămâne incoloră după adăugarea unei soluții de fenolftaleină (punctul 3.7) (patru spălări sunt în general suficiente). Se filtrează extractul spălat cu un filtru cutat uscat pentru separarea fazelor (punctul 4.4) pentru a se elimina apa în suspensie și se transferă într-un balon gradat de 500 ml (punctul 4.2.2). Se clătesc pâlnia de separare și filtrul cu 50 ml eter de petrol (punctul 3.2), se completează până la semn cu eter de petrol (punctul 3.2) și se amestecă bine.

5.3.2.   Extracția folosind un aparat de extracție (punctul 4.8)

Când straturile s-au separat (a se vedea observația de la punctul 7.3), se înlocuiește dopul cilindrului de sticlă (punctul 4.8.1) prin inserție de sticlă șlefuită (punctul 4.8.2) și se amplasează extremitatea inferioară în formă de „U” a tubului reglabil astfel încât să se afle exact deasupra nivelului interfeței. Aplicând o presiune de la generatorul de azot prin brațul lateral, se transferă stratul superior de eter de petrol într-o pâlnie de separare de 1 000 ml (punctul 4.2.3). Se adaugă 100 ml de eter de petrol (punctul 3.2) în cilindrul de sticlă, se pune dopul și se agită energic. Se lasă straturile să se separe și se transferă stratul superior în pâlnia de separare, la fel ca înainte. Se repetă procedura de extracție cu încă 100 ml eter de petrol (punctul 3.2), apoi de două ori cu cantități de 50 ml eter de petrol (punctul 3.2) și se adaugă straturile de eter de petrol în pâlnia de separare.

Se spală extractele combinate de eter de petrol conform procedurii descrise la punctul 5.3.1 și se procedează conform punctului menționat.

5.4.    Prepararea soluției de eșantion pentru HPLC

Se pipetează o parte alicotă din soluția de eter de petrol (de la punctul 5.3.1 sau 5.3.2) într-un balon piriform de 250 ml (punctul 4.2.4). Se evaporă solventul aproape în totalitate pe evaporatorul rotativ (punctul 4.1), cu presiune redusă, la o temperatură a băii de apă de maximum 40 °C. Se restabilește presiunea atmosferică prin admisia azotului (punctul 3.9) și se îndepărtează flaconul din evaporatorul rotativ. Se elimină restul de solvent cu un curent de azot (punctul 3.9) și se dizolvă imediat reziduul într-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (punctul 3.3) (concentrația de DL-α-tocoferol trebuie să fie în intervalul 5-30 μg/ml).

5.5.    Determinarea prin HPLC

Vitamina E se separă pe o coloană cu fază inversată C18 (punctul 4.5.1), iar concentrația se măsoară cu un detector de fluorescență (excitație: 295 nm, emisie: 330 nm) sau un detector UV (292 nm) (punctul 4.5.2).

Se injectează o porție alicotă (de exemplu, 20 μl) din soluția metanolică obținută la punctul 5.4 și se eluează cu faza mobilă (punctul 3.8). Se calculează înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor pentru mai multe injectări ale aceleiași soluții eșantion și înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor pentru mai multe injectări ale soluțiilor de calibrare (punctul 5.6.2).

Condiții HPLC

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica și alte condiții, dacă acestea duc la rezultate echivalente.

5.6.    Calibrare (DL-α-tocoferol acetat sau DL-α-tocoferol)

5.6.1.    Etalon de DL-α-tocoferol acetat

5.6.1.1.   Prepararea soluției etalon de lucru

Se picură din pipetă 25 ml din soluția stoc de Dl--tocoferolα-tocoferol acetat (punctul 3.10.1) într-un balon cu fundul plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer, de 500 ml (punctul 4.2.1) și se hidrolizează conform procedurii descrise la punctul 5.2. Se realizează apoi extracția cu eter de petrol (punctul 3.2) conform punctului 5.3 și se completează până la 500 ml cu eter de petrol. Se lasă să se evaporeze 25 ml din acest extract aproape în totalitate în evaporatorul rotativ (a se vedea punctul 5.4), se îndepărtează solventul rămas într-un curent de azot (punctul 3.9) și se dizolvă din nou reziduul în 25,0 ml de metanol (punctul 3.3). Concentrația nominală a acestei soluții este de 45,5 μg DL-α-tocoferol per ml, echivalent cu 50 μg DL-α-tocoferol acetat per ml. Soluția etalon de lucru trebuie să fie preparată imediat înainte de utilizare.

5.6.1.2.   Prepararea soluțiilor de calibrare și a curbei de calibrare

Se transferă 1,0, 2,0, 4,0 și 10,0 ml din soluția etalon de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (punctul 3.3) și se amestecă. Concentrațiile nominale ale acestor soluții sunt 2,5, 5,0, 10,0 și 25,0 μg/ml DL-α-tocoferol acetat, echivalent cu 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml și 22,8 μg/ml DL-α-tocoferol.

Se injectează de mai multe ori câte 20 μl din fiecare soluție de calibrare și se determină înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor. În funcție de înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor, se trasează o curbă de calibrare.

5.6.1.3.   Standardizarea UV a soluției stoc de DL-α-tocoferol acetat (punctul 3.10.1)

Se diluează 5,0 ml din soluția stoc de DL-α-tocoferol acetat (punctul 3.10.1) în 25,0 ml de etanol și se măsoară spectrul UV al acestei soluții față de etanol (punctul 3.1) în spectrofotometru (punctul 4.6), între 250 nm și 320 nm.

Absorbția maximă este de 284 nm:

La această diluție trebuie să se obțină o valoare de extincție între 0,84 și 0,88.

5.6.2.    Etalonul de DL-α-tocoferol

5.6.2.1.   Prepararea soluției etalon de lucru

Se pun cu pipeta 2 ml din soluția stoc de DL-α-tocoferol (punctul 3.11.1) într-un balon gradat de 50 ml, se dizolvă în metanol (punctul 3.3) și se completează până la semn cu metanol. Concentrația nominală a acestei soluții este de 40 μg DL-α-tocoferol per ml, echivalent cu 44,0 μg DL-α-tocoferol acetat per ml. Soluția etalon de lucru trebuie să fie preparată imediat înainte de utilizare.

5.6.2.2.   Prepararea soluțiilor de calibrare și a curbei de calibrare

Se transferă 1,0, 2,0, 4,0 și 10,0 ml din soluția etalon de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (punctul 3.3) și se amestecă. Concentrațiile nominale ale acestor soluții sunt 2,0, 4,0, 8,0 și 20,0 μg/ml DL-α-tocoferol, echivalent cu 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml și 22,0 μg/ml DL-α-tocoferol acetat.

Se injectează de mai multe ori câte 20 μl din fiecare soluție de calibrare și se determină înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor. În funcție de înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor, se trasează o curbă de calibrare.

5.6.2.3.   Standardizarea UV a soluției stoc de DL-α-tocoferol (punctul 3.11.1)

Se diluează 2,0 ml din soluția stoc de DL-α-tocoferol (punctul 3.11.1) în 25,0 ml de etanol și se măsoară spectrul UV al acestei soluții față de etanol (punctul 3.1) în spectrofotometru (punctul 4.6) între 250 nm și 320 nm. Absorbția maximă este de 292 nm:

La această diluție trebuie să se obțină o valoare de extincție de 0,6.

6.    Calculul rezultatelor

Pornindu-se de la înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor de vitamina E ale soluției de eșantion, se determină concentrația soluției de eșantion în μg/ml (calculată ca DL-α-tocoferol acetat) prin referire la curba de calibrare (punctul 5.6.1.2 sau 5.6.2.2).

Conținutul w de vitamina E al eșantionului, exprimat în mg/kg, este dat de următoarea formulă:

unde:

c

=

concentrația de vitamina E (ca DL-α-tocoferol acetat) al soluției de eșantion (punctul 5.4) în μg/ml

V1

=

volumul soluției de eșantion (punctul 5.4), în ml

V2

=

volumul de alicotă prelevat la punctul 5.4, în ml

m

=

greutatea porțiunii de testat, în g

7.    Observații

8.    Repetabilitate.

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe același eșantion nu trebuie să depășească 15 % din rezultatul superior.

9.    Rezultatele unui studiu colaborativ ( 22 )

Figura 2

Aparat de extracție (punctul 4.8)

C.   DETERMINAREA OLIGOELEMENTELOR FIER, CUPRU, MANGAN ȘI ZINC

Conținutul de fier, cupru, mangan și zinc se determină prin:

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea oligoelementelor fier, cupru, mangan și zinc din furaje ( 23 ). Limitele de cuantificare sunt:

2.    Principiu

Eșantionul este pus în soluție de acid clorhidric după distrugerea materiei organice, dacă aceasta este prezentă. Se determină elementele fier, cupru, mangan și zinc, după o diluare corespunzătoare, cu ajutorul spectrometriei de absorbție atomică.

3.    Reactivi

Comentarii introductive

Pentru prepararea reactivilor și a soluțiilor analitice se folosește apă fără cationii care urmează să fie determinați, obținută fie prin distilarea dublă a apei într-un distilator din sticlă borosilicat sau din cuarț, fie prin dublu tratament cu rășină schimbătoare de ioni.

Reactivii trebuie să fie cel puțin de calitate analitică. Absența elementului care urmează să fie determinat trebuie verificată într-un experiment martor. Dacă este necesar, reactivii trebuie să fie purificați în continuare.

În locul soluțiilor etalon descrise mai jos pot fi folosite soluții etalon din comerț, cu condiția ca ele să fie garantate și să fi fost verificate înainte de utilizare.

4.    Aparatură

5.    Procedura ( 24 )

5.1.    Eșantioane care conțin materie organică

5.1.1.    Arderea și prepararea soluției pentru analiză ( 25 )

Se umezește cenușa cu apă și se transferă substanța obținută într-un pahar de laborator de 250 ml. Se spală creuzetul cu o cantitate totală de circa 5 ml de acid clorhidric (punctul 3.1) și se adaugă acesta din urmă încet și cu atenție în paharul de laborator (poate apărea o reacție puternică din cauza formării de CO2). Se adaugă acid clorhidric (punctul 3.1), picătură cu picătură, agitându-se, până când efervescența încetează. Se evaporă până la uscare, agitându-se din când în când cu o baghetă de sticlă.

Se adaugă apoi 15 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (punctul 3.2) la reziduu, apoi circa 120 ml de apă. Se amestecă cu bagheta de sticlă, care se lasă în paharul de laborator, și se acoperă paharul cu o sticlă de ceas. Se aduce încet la fierbere și se menține la punctul de fierbere până când cenușa se dizolvă complet. Se filtrează cu hârtie de filtru lipsită de cenușă și se colectează filtratul într-un balon gradat de 250 ml. Se spală paharul de laborator și se filtrează cu 5 ml de acid clorhidric 6 mol/litru fierbinte (punctul 3.2) și de două ori cu apă fiartă. Se umple balonul gradat cu apă până la semn (concentrația de HCl: circa 0,5 mol/litru).

Note:

5.1.2.    Determinarea spectrofotometrică

5.1.2.1.   Pregătirea soluțiilor de calibrare

Pentru fiecare dintre elementele care urmează să fie determinate se prepară din soluțiile etalon de lucru de la punctele 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 și 3.10.1 o gamă de soluții de calibrare, fiecare soluție de calibrare având o concentrație de HCl de aproximativ 0,5 mol/litru și (în cazul fierului, manganului și zincului) o concentrație de clorură de lantan echivalentă cu 0,1 % La (g/v).

Concentrațiile de oligoelemente selectate trebuie să se situeze în intervalul sensibilității spectrofotometrului utilizat. Tabelele prezentate în continuare indică, de exemplu, compozițiile unor seturi tipice de soluții de calibrare; totuși, în funcție de tipul și sensibilitatea spectrofotometrului folosit, poate fi necesar să se selecteze alte concentrații.

5.1.2.2.   Prepararea soluției pentru analiză

Pentru determinarea cuprului, soluția preparată la punctul 5.1.1 poate fi, în mod normal, folosită direct. Dacă este necesar să se obțină o concentrație situată în intervalul soluțiilor de calibrare, o parte alicotă poate fi pipetată într-un balon gradat de 100 ml și completată până la semn cu acid clorhidric 0,5 mol/litru (punctul 3.3).

Pentru determinarea fierului, manganului și zincului, se pipetează o parte alicotă din soluția preparată la punctul 5.1.1 într-un balon gradat de 100 ml, se adaugă 10 ml de soluție de clorură de lantan (punctul 3.11) și se completează până la semn cu acid clorhidric 0,5 mol/litru (punctul 3.3) (a se vedea și punctul 8, „Observații”).

5.1.2.3.   Experiment martor

Experimentul martor trebuie să includă toate etapele prevăzute în procedură, cu excepția faptului că materialul de eșantion este omis. Soluția de calibrare „0” nu trebuie să fie folosită ca martor.

5.1.2.4.   Măsurarea absorbției atomice

Se măsoară absorbția atomică a soluțiilor de calibrare și a soluției care urmează să fie analizată folosind o flacără aer-acetilenă oxidantă, la următoarele lungimi de undă:

5.2.    Furaje minerale

Dacă eșantionul nu conține materie organică, calcinarea prealabilă nu este necesară. Se procedează conform descrierii de la punctul 5.1.1.1, începând de la al doilea paragraf. Evaporarea cu acid fluorhidric poate fi omisă.

6.    Calculul rezultatelor

Folosind o curbă de calibrare, se calculează concentrația de oligoelemente în soluția care urmează să fie analizată și se exprimă rezultatul în mg de oligoelemente per kg de eșantion (ppm).

7.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion de către același laborant nu depășește:

8.    Observație

Prezența de cantități mari de fosfați ar putea interfera cu determinarea fierului, manganului și zincului. Astfel de interferențe trebuie să fie corectate adăugând soluție de clorură de lantan (punctul 3.11). Dacă, însă, în eșantion, raportul de greutate Ca + Mg/P este > 2, adăugarea soluției de clorură de lantan (punctul 3.11) la soluția de analizat și la soluțiile de calibrare poate fi omisă.

D.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE HALOFUGINONĂ

DL-trans-7-brom-6-clor-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-(3H)-onă hidrobromid

Conținutul de halofuginonă se determină prin:

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea conținutului de halofuginonă din furaje. Limita de cuantificare este de 1 mg/kg

2.    Principiu

După tratarea cu apă fierbinte, halofuginona se extrage ca bază liberă în acetat de etil și ulterior se separă ca clorhidrat, într-o soluție apoasă de acid. Extractul se purifică prin cromatografie prin schimb ionic. Conținutul de halofuginonă se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversată (RP-HPLC), prin utilizarea unui detector de raze UV.

3.    Reactivi

Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de halofuginonă (punctul 3.6) într-un balon gradat de 500 ml, apoi se dizolvă în soluție tampon de acetat de amoniu (punctul 3.18), se completează până la semn cu soluție tampon și se amestecă. Această soluție este stabilă timp de trei săptămâni, la 5 °C, dacă este depozitată la întuneric.

Se transferă 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 și 6,0 ml de soluție etalon stoc (punctul 3.6.1) într-o serie de baloane gradate de 100 ml. Se completează până la semn cu fază mobilă (punctul 3.21) și se amestecă. Soluțiile au concentrații de 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 și 6,0 μg/ml de halofuginonă. Soluțiile se prepară imediat înainte de a fi utilizate.

Se dizolvă 50 g de carbonat de sodiu (punctul 3.11) în apă, se diluează până la 1 litru și se adaugă clorură de sodiu (punctul 3.12) până la saturarea soluției.

Se diluează 10 ml de HCl (punctul 3.7) în apă până la 1 litru.

Se dizolvă 19,3 g de acetat de amoniu (punctul 3.3) și 30 ml de acid acetic (punctul 3.5) în apă (punctul 3.14) și se diluează până la 1 litru.

Se spală cu apă o cantitate corespunzătoare de Amberlit (punctul 3.2), până la îndepărtarea tuturor ionilor de clor, după cum indică testul cu nitrat de argint (punctul 3.20) efectuat pe faza apoasă eliminată. Apoi se spală rășina cu 50 ml de metanol (punctul 3.8), se elimină metanolul și se depozitează rășina în metanol proaspăt.

Se dizolvă 0,17 g de nitrat de argint (punctul 3.9) în 10 ml de apă.

Se amestecă 500 ml de acetonitril (punctul 3.1) cu 300 ml soluție tampon de acetat de amoniu (punctul 3.18) și 1 200 ml de apă (punctul 3.14). Se aduce pH-ul la valoarea 4,3 folosind acid acetic (punctul 3.5). Se trece printr-un filtru de 0,22 μm (punctul 4.8) și se degazează soluția (de exemplu, prin ultrasonare timp de 10 minute). Această soluție este stabilă timp de o lună dacă este depozitată într-un recipient închis, la întuneric.

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Generalități

5.2.    Extracție

Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 g, 10 g de eșantion preparat, într-un tub de centrifugă de 200 ml, se adaugă 0,5 g de ascorbat de sodiu (punctul 3.10), 0,5 g de EDTA (punctul 3.13) și 20 ml de apă, apoi se amestecă. Se plasează tubul într-o baie de apă timp de 5 minute (80 °C). După răcire la temperatura camerei se adaugă 20 ml soluție de carbonat de sodiu (punctul 3.15) și se amestecă. Se adaugă imediat 100 ml de acetat de etil (punctul 3.4) și se agită energic cu mâna timp de 15 secunde. Apoi tubul se așază într-o baie cu ultrasunete (punctul 4.1) timp de 3 minute și se slăbește dopul. Se centrifughează timp de 2 minute și se decantează faza de acetat de etil printr-un filtru de fibră de sticlă (punctul 4.6), într-o pâlnie de separare de 500 ml. Se repetă extracția eșantionului cu o a doua cantitate de 100 ml acetat de etil. Se spală extractele combinate timp de un minut cu 50 ml de soluție de carbonat de sodiu saturată cu clorură de sodiu (punctul 3.16) și se îndepărtează stratul apos.

Se extrage stratul organic timp de 1 minut cu 50 ml de acid clorhidric (punctul 3.17). Se trece stratul inferior de acid printr-o pâlnie de separare de 250 ml. Se extrage din nou stratul organic timp de 1,5 minute, cu o altă cantitate de 50 ml acid clorhidric, apoi se combină cu primul extract. Se spală extractele de acid combinate prin agitare circulară timp de aproximativ 10 secunde cu 10 ml de acetat de etil (punctul 3.4).

Se transferă cantitativ stratul apos într-un balon cu fund rotund de 250 ml și se îndepărtează faza organică. Se evaporă din soluția acidă tot acetatul de etil rămas utilizând un evaporator rotativ cu generare de film (punctul 4.2). Temperatura băii de apă nu trebuie să depășească 40 °C. Sub vid la o presiune de aproximativ 25 mbar întreaga cantitate de acetat de etil rezidual se îndepărtează în 5 minute la 38 °C.

5.3.    Curățare

5.3.1.    Pregătirea coloanei de Amberlit

Pentru fiecare extract de eșantion se pregătește câte o coloană XAD-2. Se transferă 10 g de Amberlit preparat (punctul 3.19) într-o coloană de sticlă (punctul 4.5) cu metanol (punctul 3.8). Se adaugă un dop mic de vată de sticlă deasupra patului de rășină. Se scurge metanolul din coloană și se spală rășina cu 100 ml de apă, oprind fluxul pe măsură ce lichidul ajunge la partea superioară a patului de rășină. Se lasă coloana să se echilibreze timp de 10 minute înainte de utilizare. Niciodată nu se lasă coloana să se usuce.

5.3.2.    Curățarea eșantionului

Se transferă cantitativ extractul (punctul 5.2) în partea superioară a coloanei de Amberlit preparată (punctul 5.3.1) și se eluează, îndepărtând apoi eluatul. Rata de eluare nu trebuie să depășească 20 ml/min. Se clătește balonul cu fund rotund cu 20 ml de acid clorhidric (punctul 3.17), apoi acesta se folosește pentru spălarea coloanei de rășină. Se suflă orice urmă de soluție acidă rămasă cu ajutorul unui curent de aer. Se îndepărtează lichidele de spălare. Se adaugă 100 ml de metanol (punctul 3.8) în coloană și se eluează 5-10 ml; se colectează eluatul într-un balon cu fundul rotund de 250 ml. Se lasă metanolul rămas timp de 10 minute să se echilibreze cu rășina și se continuă eluarea la o rată care să nu depășească 20 ml/min, colectând eluatul în același balon cu fundul rotund. Se evaporă metanolul pe evaporatorul rotativ cu generare de film (punctul 4.2); temperatura băii de apă trebuie să nu depășească 40 °C. Se transferă cantitativ reziduul într-un balon gradat de 10 ml, utilizând faza mobilă (punctul 3.21). Se completează până la semn cu ajutorul fazei mobile și se amestecă. Se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană (punctul 4.7). Această soluție se păstrează pentru determinarea prin HPLC (punctul 5.4).

5.4.    Determinarea prin HPLC

5.4.1.    Parametri

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica și alte condiții, dacă acestea duc la rezultate echivalente.

Stabilitatea sistemului cromatografic se verifică prin injectarea de mai multe ori a soluției de calibrare (punctul 3.6.2) conținând 3,0 μg/ml, până la obținerea de înălțimi (sau de arii) ale vârfurilor și de timpi de retenție constanți.

5.4.2.    Curba de calibrare

Se injectează fiecare soluție de calibrare (punctul 3.6.2) de mai multe ori și se determină înălțimile (ariile) vârfurilor pentru fiecare concentrație. Se trasează o curbă de calibrare utilizând înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor soluțiilor de calibrare ca ordonate și concentrațiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.

5.4.3.    Soluția de eșantion

Se injectează extractul de eșantion (punctul 5.3.2) de mai multe ori, utilizând același volum ca cel utilizat pentru soluțiile de calibrare și se determină înălțimea (aria) medie a vârfurilor pentru vârfurile de halofuginonă.

6.    Calculul rezultatelor

Concentrația soluției de eșantion în μg/ml se determină plecând de la înălțimea (aria) medie a vârfurilor de halofuginonă a soluției de eșantion prin referire la curba de calibrare (punctul 5.4.2).

Conținutul de halofuginonă w (mg/kg) al eșantionului este dat de formula următoare:

unde:

c

:

concentrația de halofuginonă din soluția de eșantion, în μg/ml,

m

:

greutatea porțiunii de testat, în grame.

7.    Validarea rezultatelor

7.1.    Identitate

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode care permite compararea spectrelor extractului de eșantion și ale soluției de calibrare (punctul 3.6.2), care conține 6,0 μg/ml.

7.1.1.    Co-cromatografie

Un extract de eșantion este îmbogățit prin adăugarea unei cantități corespunzătoare de soluție de calibrare (punctul 3.6.2). Cantitatea de halofuginonă adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea estimată de halofuginonă găsită în extractul de eșantion.

După luarea în considerare atât a cantității adăugate, cât și a diluției extractului, crește numai înălțimea vârfului de halofuginonă. Lărgimea vârfului, la jumătate din înălțimea sa maximă, trebuie să se încadreze într-o variație de ± 10 % din lărgimea originală.

7.1.2.    Detecție cu grup de diode

Rezultatele se evaluează în funcție de următoarele criterii:

Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezența analitului nu a fost confirmată.

7.2.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească 0,5 mg/kg pentru un conținut de halofugiononă de până la 3 mg/kg

7.3.    Recuperare

Pentru eșantionul martor îmbogățit se realizează o recuperare de minimum 80 %.

8.    Rezultatele unui studiu colaborativ

A fost organizat un studiu colaborativ ( 26 ) în cadrul căruia trei eșantioane au fost analizate de opt laboratoare.

E.   DETERMINAREA ROBENIDINEI

Clorhidrat de 1,3-bis[(4-clorbenziliden)amino]guanidină

Conținutul de robenidină se determină prin

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea conținutului de robenidină din furaje. Limita de cuantificare este de 5 mg/kg

2.    Principiu

Eșantionul se extrage cu metanol acidifiat. Extractul se usucă și o parte alicotă se curăță într-o coloană de oxid de aluminiu. Robenidina se eluează din coloană cu metanol, se concentrează și se completează până la un volum adecvat cu fază mobilă. Conținutul de robenidină se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversată (RP-HPLC), utilizând un detector de radiații UV.

3.    Reactivi

Se transferă 4,0 ml de acid clorhidric (ρ20 = 1,18 g/ml) într-un balon gradat de 500 ml, se completează până la semn cu metanol (punctul 3.1) și se amestecă. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Tip 3A, 8-12 noduri ale sitei (noduri de 1,6-2,5 mm, aluminosilicat cristalin, diametrul porilor 0,3 mm).

Se transferă 100 g de oxid de aluminiu într-un recipient adecvat și se adaugă 2,0 ml de apă. Se închide și se agită timp de aproximativ 20 de minute. Se păstrează într-un recipient bine închis.

Se dizolvă 3,40 g de fosfat diacid de potasiu în apă (de calitate HPLC), într-un balon gradat de 1 000 ml, se completează până la semn și se amestecă.

Se dizolvă 3,55 g de fosfat acid disodic anhidru (sau 4,45 g de dihidrat sau 8,95 g de dodecahidrat) în apă (de calitate HPLC), într-un balon gradat de 1 litru, se completează până la semn și se amestecă.

Se amestecă următorii reactivi:

Se trece printr-un filtru de 0,22 μm (punctul 4.6) și se degazează soluția (de exemplu, prin ultrasonare timp de 10 minute).

Robenidină pură: Clorhidrat de 1,3-bis[(4-clorbenziliden)amino]guanidină.

Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 30 mg de substanță etalon de robenidină (punctul 3.9). Se dizolvă în metanol acidifiat (punctul 3.2) într-un balon gradat de 100 ml, se completează până la semn cu același solvent și se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu și se păstrează la întuneric.

Se transferă 10,0 ml din soluția etalon stoc (punctul 3.9.1) într-un balon gradat de 250 ml, se completează până la semn cu faza mobilă (punctul 3.8) și se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu și se păstrează la întuneric.

Se transferă 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 și 25,0 ml de soluție etalon intermediară (punctul 3.9.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se completează până la semn cu fază mobilă (punctul 3.8) și se amestecă. Aceste soluții corespund concentrațiilor de 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 și 6,0 μg/ml de robenidină. Soluțiile se prepară imediat înainte de a fi utilizate.

4.    Aparatură

Construită din sticlă brună, prevăzută cu robinet de închidere și un rezervor cu capacitatea de aproximativ 150 ml, diametru interior 10-15 mm, lungime 250 mm.

5.    Procedura

5.1.    Generalități

5.2.    Extracție

Se cântăresc cu o abatere de 0,01 g, aproximativ 15 g de eșantion preparat. Se transferă într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml și se adaugă 100,0 ml metanol acidifiat (punctul 3.2), se închide și se agită timp de o oră în agitator (punctul 4.2). Se filtrează soluția prin hârtie de filtru din fibră de sticlă (punctul 4.5) și se colectează întregul filtrat într-un flacon tip Erlenmeyer de 150 ml. Se adaugă 7,5 g de sită moleculară (punctul 3.4), se închide și se agită timp de 5 minute. Se filtrează imediat prin hârtie de filtru din fibră de sticlă. Se conservă această soluție pentru etapa de purificare (punctul 5.3).

5.3.    Purificare

5.3.1.    Pregătirea coloanei de oxid de aluminiu

Se introduce un tampon mic de vată de sticlă în capătul inferior al coloanei de sticlă (punctul 4.1) și se împinge utilizând o baghetă de sticlă. Se cântăresc 11,0 g din oxidul de aluminiu preparat (punctul 3.5) și se transferă în coloană. Pe parcursul acestei etape este important ca expunerea la aer să fie redusă la minimum. Se lovește ușor coloana încărcată în partea inferioară pentru a permite stabilizarea oxidului de aluminiu.

5.3.2.    Purificarea eșantionului

Se transferă în coloană cu pipeta 5,0 ml de extract de eșantionul preparat în (punctul 5.2). Vârful pipetei se menține aproape de peretele coloanei și se permite ca soluția să fie absorbită de oxidul de aluminiu. Se eluează robenidina din coloană folosind 100 ml metanol (punctul 3.1), cu un debit de 2-3 ml/minut și se colectează eluatul într-un balon cu fundul rotund de 250 ml. Se evaporă soluția de metanol până la uscare sub presiune redusă la 40 °C, prin intermediul unui evaporator rotativ cu generare de film (punctul 4.3). Se redizolvă reziduul în 3-4 ml de fază mobilă (punctul 3.8) și se transferă cantitativ într-un balon gradat de 10 ml. Se clătește balonul de mai multe ori cu cantități de 1-2 ml de fază mobilă și se transferă lichidul de clătire în balonul gradat. Se completează până la semn cu același solvent și se amestecă. Se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 μm (punctul 4.7). Această soluție se păstrează pentru determinarea prin HPLC (punctul 5.4).

5.4.    Determinarea prin HPLC

5.4.1.    Parametri

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica și alte condiții, dacă acestea duc la rezultate echivalente:

Stabilitatea sistemului cromatografic se verifică prin injectarea de mai multe ori a soluției de calibrare (punctul 3.9.3) conținând 3,6 μg/ml, până la obținerea de înălțimi ale vârfurilor și de timpi de retenție constanți.

5.4.2.    Curba de calibrare

Se injectează fiecare soluție de calibrare (punctul 3.9.3) de mai multe ori și se determină înălțimile (ariile) vârfurilor pentru fiecare concentrație. Se trasează o curbă de calibrare utilizând înălțimile sau ariile medii ale vârfurilor soluțiilor de calibrare ca ordonate și concentrațiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.

5.4.3.    Soluția de eșantion

Se injectează de mai multe ori extractul de eșantion (punctul 5.3.2) folosind același volum ca și în cazul soluțiilor de calibrare și se determină înălțimea (aria) medie a vârfurilor pentru vârfurile de robenidină.

6.    Calculul rezultatelor

Din înălțimea (aria) medie a vârfurilor robenidinei din soluția de eșantion se determină concentrația în μg/ml a soluției de eșantion prin referire la curba de calibrare (punctul 5.4.2).

Conținutul de robenidină w (mg/kg) din eșantion este dat de formula următoare:

unde:

c

=

concentrația de robenidină din soluția de eșantion, în μg/ml,

m

=

greutatea porțiunii de testat, în grame.

7.    Validarea rezultatelor

7.1.    Identitate

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode care permite compararea spectrelor extractului de eșantion și ale soluției de calibrare (punctul 3.9.3), care conține 6 μg/ml.

7.1.1.    Co-cromatografie

Un extract de eșantion se îmbogățește prin adăugarea unei cantități adecvate de soluție de calibrare (punctul 3.9.3). Cantitatea de robenidină adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea estimată de robenidină constatată în extractul de eșantion.

Numai înălțimea vârfului de robenidină crește după luarea în considerare a cantității adăugate și a diluției extractului. Lărgimea vârfului la jumătatea înălțimii sale maxime trebuie să se încadreze într-o variație de aproximativ 10 % din lărgimea inițială.

7.1.2.    Detecție cu grup de diode

Rezultatele se evaluează în funcție de următoarele criterii:

Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezența analitului nu a fost confirmată.

7.2.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească 10 % din valoarea superioară, pentru un conținut de robenidină mai mare de 15 mg/kg

7.3.    Recuperare

Pentru un eșantion martor îmbogățit, recuperarea este de cel puțin 85 %.

8.    Rezultatele unui studiu colaborativ

A fost organizat un studiu prin colaborare la nivelul UE, în cursul căruia au fost analizate de către 12 laboratoare patru eșantioane, sub formă de făină sau de pelete, de hrană pentru păsări de curte și pentru iepuri. Fiecare eșantion a făcut obiectul unei duble analize. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos:

F.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE DICLAZURIL

(+)-4-clorfenil [2,6-diclor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2il)fenil]-acetonitril.

Conținutul de diclazuril se determină prin:

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea conținutului de diclazuril din furaje combinate și preamestecuri ( 27 ). Limita de detecție este de 0,1 mg/kg, iar limita de cuantificare este de 0,5 mg/kg Limite de cuantificare mai mici sunt realizabile, dar acest lucru trebuie validat de către utilizator.

2.    Principiu

După adăugarea unui standard intern, eșantionul este extras cu metanol acidifiat. Pentru furaje, o parte alicotă a extractului este purificată pe un cartuș C18 pentru extracție în fază solidă. Diclazurilul este eluat din cartuș cu un amestec de metanol acidifiat și apă. După evaporare, reziduul se dizolvă într-un amestec DMF/apă. Pentru preamestecuri, extractul se evaporă și reziduul se dizolvă într-un amestec DMF/apă. Conținutul de diclazuril se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu gradient ternar și cu fază inversată, prin utilizarea unui detector UV.

3.    Reactivi

Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 25 mg de substanță etalon de diclazuril (punctul 3.8) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF (punctul 3.6), se completează până la semn cu DMF (punctul 3.6) și se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună și se depozitează în frigider. La o temperatură mai mică sau egală cu 4 °C soluția este stabilă timp de 1 lună ( 28 ).

Se transferă 5,00 ml din soluția etalon stoc (punctul 3.8.1) într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu DMF (punctul 3.6) și se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună și se depozitează în frigider. La o temperatură mai mică sau egală cu 4 °C soluția este stabilă timp de 1 lună.

Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 25 mg de substanță etalon internă (punctul 3.9) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF (punctul 3.6), se completează până la semn cu DMF (punctul 3.6) și se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună și se depozitează în frigider. La o temperatură mai mică sau egală cu 4 °C soluția este stabilă timp de 1 lună.

Se transferă 5,00 ml din soluția etalon stoc internă de etalon intern (punctul 3.9.1) într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu DMF (punctul 3.6) și se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună și se depozitează în frigider. La o temperatură mai mică sau egală cu 4 °C soluția este stabilă timp de 1 lună.

Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, p/10 mg de substanță etalon intern într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în DMF (punctul 3.6) într-o baie cu ultrasunete (punctul 4.7), se completează până la semn cu DMF și se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună și se depozitează în frigider. La o temperatură mai mică sau egală cu 4 °C soluția este stabilă timp de 1 lună.

Se pipetează 1,00 ml din soluția etalon de diclazuril (punctul 3.8.2) și 2,00 ml din soluția etalon intern (punctul 3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 17 ml de DMF (punctul 3.6), se completează până la semn cu apă (punctul 3.1) și se amestecă. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Se pipetează 2,00 ml din soluția etalon de diclazuril (punctul 3.8.2) și 2,00 ml din soluția etalon intern (punctul 3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 16 ml de DMF (punctul 3.6), se completează până la semn cu apă (punctul 3.1) și se amestecă. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Se pipetează 3,00 ml din soluția etalon de diclazuril (punctul 3.8.2) și 2,00 ml din soluția etalon intern (punctul 3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 15 ml de DMF (punctul 3.6), se completează până la semn cu apă (punctul 3.1) și se amestecă. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Se pipetează 4,00 ml din soluția etalon de diclazuril (punctul 3.8.2) și 2,00 ml din soluția etalon intern (punctul 3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 14 ml de DMF (punctul 3.6), se completează până la semn cu apă (punctul 3.1) și se amestecă. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Se pipetează 5,00 ml din soluția etalon de diclazuril (punctul 3.8.2) și 2,00 ml din soluția etalon intern (punctul 3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 13 ml de DMF (punctul 3.6), se completează până la semn cu apă (punctul 3.1) și se amestecă. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Se pipetează 5,0 ml de acid clorhidric (punctul 3.7) în 1 000 ml de metanol (punctul 3.5) și se amestecă.

Se dizolvă 5 g de acetat de amoniu (punctul 3.2) și 3,4 g de TBHS (punctul 3.3) în 1 000 ml de apă (punctul 3.1) și se amestecă.

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Generalități

5.1.1.    Furaj martor

Se analizează un furaj martor pentru a verifica absența diclazurilului și a substanțelor interferente. Furajul martor este similar, ca tip, cu eșantionul, iar prin analiză nu se detectează nici diclazuril, nici substanțe interferente.

5.1.2.    Test de recuperare

Se efectuează un test de recuperare prin analiza furajului martor îmbogățit prin adăugarea unei cantități de diclazuril, similară cu cea prezentă în eșantion. Pentru a obține o concentrație de 1 mg/kg, se adaugă 0,1 ml din soluția etalon stoc (punctul 3.8.1) la 50 g din furajul martor, se amestecă bine și se lasă timp de 10 minute, amestecând din nou de mai multe ori înainte de a continua (punctul 5.2).

Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor similar, ca tip, cu eșantionul (a se vedea punctul 5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat conform metodei de adiție standard. În acest caz, eșantionul de analizat se îmbogățește adăugând o cantitate de diclazuril similară celei deja prezente în eșantion. Acest eșantion este analizat împreună cu eșantionul neîmbogățit, iar recuperarea poate fi calculată prin diferență.

5.2.    Extracție

5.2.1.    Pui de carne

Se cântăresc, cu o abatere de 0,01 g, aproximativ 50 g de eșantion. Se transferă într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml, se adaugă 1,00 ml din soluția etalon intern (punctul 3.9.2), 200 ml din solventul de extracție (punctul 3.12) și se astupă flaconul. Se agită amestecul în agitator (punctul 4.1) pe parcursul nopții. Se lasă să se sedimenteze timp de 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 20 ml din supernatant într-un recipient de sticlă adecvat și se diluează în 20 ml apă (punctul 3.1). Se transferă această soluție într-un cartuș de extracție (punctul 3.11) și se trece prin acesta prin aplicare de vid (punctul 4.6). Se spală cartușul cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracție (punctul 3.12) și apă (punctul 3.1), 65 + 35 (V + V). Se elimină fracțiunile colectate și se eluează compușii cu ajutorul a 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracție (punctul 3.12) și apă, 80 + 20 (V + V). Se evaporă această fracțiune până la uscare prin intermediul evaporatorului rotativ (punctul 4.3) la 60 °C. Se dizolvă reziduul în 1,0 ml DMF (punctul 3.6), se adaugă 1,5 ml de apă (punctul 3.1) și se amestecă. Se filtrează printr-un filtru cu membrană (punctul 4.4) montat pe o seringă de unică folosință (punctul 4.5). Se continuă cu determinarea prin HPLC (punctul 5.3).

5.2.2.    Preamestecuri

Se cântăresc, cu o abatere de 0,001 g, aproximativ 1 g de eșantion. Se transferă într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml, se adaugă 1,00 ml din soluția etalon intern (punctul 3.9.3), 200 ml din solventul de extracție (punctul 3.12) și se astupă flaconul. Se agită amestecul în agitator (punctul 4.1) pe parcursul nopții. Se lasă să se sedimenteze timp de 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 10 000 /p ml (p = conținutul nominal în diclazuril al preamestecului în mg/kg) din supernatant într-un balon cu fund rotund de dimensiuni adecvate. Se evaporă acest amestec până la uscare, la presiune scăzută și la 60 °C, cu ajutorul unui evaporator rotativ (punctul 4.3). Se dizolvă din nou reziduul în 10,0 ml de DMF (punctul 3.6), se adaugă 15,0 ml de apă (punctul 3.1) și se amestecă. Se continuă cu determinarea prin HPLC (punctul 5.3).

5.3.    Determinarea prin HPLC

5.3.1.    Parametri

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica și alte condiții, dacă acestea duc la rezultate echivalente sau mai bune.

Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic injectându-se de mai multe ori soluția de calibrare (punctul 3.10.2) care conține 2 μg/ml de diclazuril sau etalon intern, până când se obțin valori de vârf și timpi de retenție constanți.

5.3.2.    Analiza cromatografică a soluțiilor de calibrare

Se injectează de două ori 20 μl din fiecare soluție de calibrare (punctele 3.10.1, 3.10.3, 3.10.4, 3.10.5 și 3.10.2), se identifică și se integrează vârfurile diclazurilului și etalonului intern și se trasează curba de calibrare pe baza raportului dintre înălțimea medie a vârfului sau aria diclazurilului și înălțimea medie a vârfului sau aria etalonului intern în raport cu concentrația de diclazuril în soluțiile de calibrare (μg/ml).

5.3.3.    Analiza cromatografică a soluțiilor eșantion

Se injectează 20 μl din soluția de eșantion (punctul 5.2.1 sau 5.2.2) de două ori și se determină înălțimea medie sau aria vârfurilor de diclazuril și a vârfurilor etalonului intern.

6.    Calculul rezultatelor

6.1.    Pui de carne

Conținutul de diclazuril w (în mg/kg) al eșantionului este dat de următoarea formulă:

sau

unde:

6.2.    Preamestecuri

Conținutul de diclazuril w (în mg/kg) al eșantionului este dat de următoarea formulă:

 

 p sau

 

 p

unde:

7.    Validarea rezultatelor

7.1.    Identitate

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode care permite compararea spectrelor extractului de eșantion (punctul 5.2.1 sau 5.2.2) și ale soluției de calibrare (punctul 3.10.2).

7.1.1.    Co-cromatografie

Un extract de eșantion (punctul 5.2.1 sau 5.2.2) este îmbogățit prin adăugarea unei cantități adecvate din soluția de calibrare (punctul 3.10.2). Cantitatea de diclazuril adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea de diclazuril constatată în extractul de eșantion.

Numai înălțimea vârfului de diclazuril și a vârfului etalonului intern crește după luarea în considerare atât a cantității adăugate, cât și a diluției extractului. Lărgimea vârfului, la jumătatea înălțimii sale, trebuie să se încadreze în ± 10 % din lărgimea inițială a vârfului de diclazuril sau a vârfului etalonului intern al extractului de eșantion neîmbogățit.

7.1.2.    Detecție cu grup de diode

Rezultatele se evaluează în funcție de următoarele criterii:

Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezența analitului nu a fost confirmată.

7.2.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două măsurători independente efectuate pe două subeșantioane nu trebuie să depășească:

7.3.    Recuperare

Pentru un eșantion (martor) îmbogățit, recuperarea este de cel puțin 80 %.

8.    Rezultatele unui studiu colaborativ

Au fost organizate două studii colaborative. În primul, efectuat de un alt grup de laboratoare în 1994, eșantioanele analizate au fost două preamestecuri (O 100, A 100) și trei eșantioane de furaje complementare pentru păsări de curte (L1, Z1, K1). Un eșantion de preamestec a fost amestecat cu o matrice organică (O 100), iar celălalt cu o matrice anorganică (A 100). Conținutul teoretic este de 100 mg de diclazuril pe kg Laboratoarele au primit instrucțiuni să analizeze fiecare eșantion o singură dată sau în duplicat. (Informații detaliate privind primul studiu colaborativ figurează în Journal of AOAC International, vol. 77, nr. 6, 1994, p. 1359-1361).

În al doilea studiu colaborativ au fost analizate trei furaje combinate pentru păsări de curte, care conțin diclazuril în concentrații de 0,9 mg/kg (MAT 1), 1,5 mg/kg (MAT 2) și furajul martor (MAT 3). (Informații detaliate privind al doilea studiu figurează în JRC Technical report (2016) și în Journal of AOAC International, vol. 102, nr. 2, 2019, p. 646-652). Rezultatele celor două studii colaborative sunt prezentate în tabelul următor.

9.    Observații generale

Trebuie să se demonstreze în prealabil că reacția diclazurilului este liniară pentru toată gama de concentrații măsurate.

Cel puțin pentru analiza diclazurilului din furajele combinate cu un conținut ridicat de grăsime (în acest scop, care depășește 12 % grăsime), metoda analitică poate fi înlocuită cu alte metode bazate pe HPLC, de exemplu o cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu spectrometrie de masă (HPLC-MS), cu condiția ca metoda alternativă să aibă caracteristici de performanță echivalente (rata de recuperare, precizia la condițiile de repetabilitate și reproductibilitate).

G.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE LASALOCID SODIC

Sare sodică a unui acid monocarboxilic polieter, produsă de Streptomyces lasaliensis.

Conținutul de lasalocid sodic se determină prin

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea conținutului în lasalocid sodic din furaje. Limita de detecție este de 5 mg/kg, iar limita de cuantificare este de 10 mg/kg

2.    Principiu

Lasalocidul sodic este extras din eșantion cu metanol acidifiat și dozat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversată (RP-HPLC) cu ajutorul unui detector spectrofluorimetric (fluorescență).

3.    Reactivi

Se diluează 23,5 ml acid ortofosforic (punctul 3.2) în 100 ml de apă.

Se dizolvă 1,36 g de KH2PO4 (punctul 3.1) în 500 ml de apă (punctul 3.11), se adaugă 3,5 ml de acid ortofosforic (punctul 3.2) și 10,0 ml de 6-metil-2-heptilamină (punctul 3.4). Se ajustează pH-ul la 4,0 cu ajutorul soluției de acid ortofosforic (punctul 3.3) și se diluează cu apă completându-se până la 1 000 ml (punctul 3.11).

Se transferă 5,0 ml de acid clorhidric (punctul 3.6) într-un balon gradat de 1 000 ml, se completează până la semn cu metanol (punctul 3.5) și se amestecă. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Se amestecă 5 ml de soluție tampon de fosfat (punctul 3.7) cu 95 ml de metanol (punctul 3.5).

Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de lasalocid sodic (punctul 3.10) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în metanol acidifiat (punctul 3.8), se completează până la semn cu același solvent și se amestecă. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Se pipetează 10,0 ml din soluția etalon stoc (punctul 3.10.1) într-un balon gradat de 100 ml, se completează până la semn cu metanol acidifiat (punctul 3.8) și se amestecă. Soluția se prepară imediat înainte de utilizare.

Se transferă 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 și 10,0 ml de soluție etalon intermediară (punctul 3.10.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se completează până la semn cu metanol acidifiat (punctul 3.8) și se amestecă. Aceste soluții corespund concentrațiilor de 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 și 10,0 μg de lasalocid sodic pe ml. Soluțiile se prepară imediat înainte de utilizare.

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Generalități

5.1.1.    Furaj martor

Pentru a efectua testul de recuperare (punctul 5.1.2), se analizează un furaj martor pentru a verifica absența lasalocidului sodic și a substanțelor interferente. Furajul martor este similar, ca tip, cu eșantionul; nu se detectează nici lasalocid sodic, nici substanțe interferente.

5.1.2.    Test de recuperare

Se efectuează un test de recuperare prin analiza furajului martor îmbogățit prin adăugarea unei cantități de lasalocid sodic, similară cu cea prezentă în eșantion. Pentru a obține o concentrație de 100 mg/kg, se transferă 10,0 ml de soluție etalon stoc (punctul 3.10.1) într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml și se evaporă soluția până la aproximativ 0,5 ml. Se adaugă 50 g de furaj martor, se amestecă bine și se lasă timp de 10 minute, amestecând din nou de mai multe ori înainte de a trece la etapa de extracție (punctul 5.2).

Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor similar, ca tip, cu eșantionul (a se vedea punctul 5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat conform metodei de adiție standard. În acest caz, eșantionul de analizat este îmbogățit cu o cantitate de lasalocid sodic asemănătoare celei deja prezente în eșantion. Acesta este analizat împreună cu eșantionul neîmbogățit, iar recuperarea se poate calcula prin diferență.

5.2.    Extracție

5.2.1.    Pentru porcine

Se cântăresc cu o abatere de 0,01 g, de la 5 la 10 g de eșantion într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml cu dop. Se picură cu pipeta 100,0 ml de metanol acidifiat (punctul 3.8). Se închide ușor și se agită circular pentru a se dispersa. Flaconul se plasează într-o baie cu ultrasunete (punctul 4.1) la aproximativ 40 °C timp de 20 de minute, se scoate și se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se lasă în repaus timp de aproximativ 1 oră, până la decantarea materiilor în suspensie, apoi se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 μm (punctul 4.2) într-un recipient adecvat. Se continuă cu determinarea prin HPLC (punctul 5.3).

5.2.2.    Preamestecuri

Se cântăresc, cu o abatere de 0,001 g, 2 g de preamestec nemăcinat într-un balon gradat de 250 ml. Se adaugă 100,0 ml de metanol acidifiat (punctul 3.8) și se agită circular pentru a se dispersa. Se pune balonul și conținutul acestuia într-o baie cu ultrasunete (punctul 4.1) la aproximativ 40 °C timp de 20 de minute, apoi se scoate și se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se completează până la semn cu metanol acidifiat (punctul 3.8) și se amestecă bine. Se lasă în repaus timp de aproximativ 1 oră, până la decantarea materiilor în suspensie, apoi se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 μm (punctul 4.2). Se diluează un volum adecvat de filtrat limpede cu metanol acidifiat (punctul 3.8), pentru a produce o soluție de testat finală care să conțină aproximativ 4 μg/ml de lasalocid sodic. Se continuă cu determinarea prin HPLC (punctul 5.3).

5.3.    Determinarea prin HPLC

5.3.1.    Parametri

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica și alte condiții, dacă acestea duc la rezultate echivalente:

Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, injectând de mai multe ori soluția de calibrare (punctul 3.10.3) conținând 4,0 μg/ml, până la obținerea de înălțimi (arii) ale vârfurilor și de timpi de retenție constanți.

5.3.2.    Curba de calibrare

Se injectează fiecare soluție de calibrare (punctul 3.10.3) de mai multe ori și se determină înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor pentru fiecare concentrație. Se trasează o curbă de calibrare utilizând valorile (ariile) medii ale vârfurilor ca ordonate și concentrațiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.

5.3.3.    Soluția de eșantion

Se injectează extractul de eșantion (punctul 5.2.1 sau 5.2.2) de mai multe ori utilizând același volum cu cel reținut pentru soluția de calibrare și se determină înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor de lasalocid sodic.

6.    Calculul rezultatelor

Plecând de la înălțimea (aria) medie a vârfurilor soluției de eșantion (punctul 5.3.3), se determină concentrația de lasalocid sodic (μg/ml) prin referire la curba de calibrare.

6.1.    pentru porcine

Conținutul de lasalocid sodic w (în mg/kg) al eșantionului este dat de următoarea formulă:

unde:

c

=

concentrația de lasalocid sodic a soluției de eșantion (punctul 5.2.1) în μg/ml

V1

=

volumul extractului de eșantion conform 5.2.1 în ml (adică 100)

m

=

greutatea porțiunii de testat, în g

6.2.    Preamestecuri

Conținutul de lasalocid sodic w (în mg/kg) al eșantionului este dat de următoarea formulă:

unde:

c

=

concentrația de lasalocid sodic a soluției de eșantion (punctul 5.2.2) în μg/ml

V2

=

volumul extractului de eșantion conform 5.2.2 în ml (adică 250)

f

=

factorul de diluție conform 5.2.2

m

=

greutatea porțiunii de testat, în g

7.    Validarea rezultatelor

7.1.    Identitate

Metodele bazate pe spectrofluorimetrie sunt mai puțin supuse interferențelor decât cele care utilizează un detector UV. Identitatea analitului poate fi confirmată de către co-cromatografie.

7.1.1.    Co-cromatografie

Un extract de eșantion (punctul 5.2.1 sau 5.2.2) este îmbogățit prin adăugarea unei cantități corespunzătoare de soluție de calibrare (punctul 3.10.3). Cantitatea de lasalocid sodic adăugată trebuie să fie asemănătoare cantității de lasalocid sodic constatată în extractul de eșantion. Numai înălțimea vârfului corespunzător lasalocidului sodic se mărește după ce s-a luat în calcul cantitatea de lasalocid sodic adăugată și diluția extractului. Lărgimea vârfului, la jumătatea înălțimii, trebuie să se încadreze între ± 10 % din lărgimea inițială a vârfului produs de extractul de eșantion neîmbogățit.

7.2.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească:

7.3.    Recuperare

Pentru un eșantion de furaj (martor) îmbogățit, recuperarea este de cel puțin 80 %. Pentru eșantioanele de preamestecuri îmbogățite, recuperarea este de cel puțin 90 %.

8.    Rezultatele unui studiu colaborativ

S-a realizat un studiu colaborativ ()  în cursul căruia au fost analizate 2 preamestecuri (eșantioanele 1 și 2) și 5 furaje (eșantioanele 3-7) de către 12 laboratoare. Fiecare eșantion a făcut obiectul unei duble analize. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos:

H.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CLORHIDRAT DE AMPROLIU

clorură de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidinil)metil]-2-metilpiridiniu monoclorhidrat

1.    Obiectiv și domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea conținutului de amproliu din furaje. Limita de detecție este de 1 mg/kg, limita de cuantificare este de 5 mg/kg

2.    Principiu

Eșantionul este extras cu un amestec de metanol și apă. După diluarea cu fază mobilă și filtrarea prin membrană, conținutul de amproliu se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu schimb de cationi, utilizând un detector UV.

3.    Reactivi

Se dizolvă 13,80 g de fosfat diacid de sodiu în apă (punctul 3.3) într-un balon gradat de 1 000 ml, se completează până la semn cu apă (punctul 3.3) și se amestecă.

Se dizolvă 224,74 g de perclorat de sodiu monohidrat în apă (punctul 3.3) într-un balon gradat de 1 000 ml, se completează până la semn cu apă (punctul 3.3) și se amestecă.

Amestec de acetonitril (punctul 3.2), soluție de fosfat diacid de sodiu (punctul 3.4) și soluție de perclorat de sodiu (punctul 3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Înainte de utilizare, se filtrează printr-un filtru cu membrană de 0,22 μm (punctul 4.3) și se degazează soluția [de exemplu, într-o baie cu ultrasunete (punctul 4.4) timp de cel puțin 15 minute].

Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de amproliu (punctul 3.7) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în 80 ml de metanol (punctul 3.1) și se plasează balonul timp de 10 minute într-o baie cu ultrasunete (punctul 4.4). După tratamentul cu ultrasunete, se aduce soluția la temperatura camerei, se completează până la semn cu apă și se amestecă. La o temperatură de ≤ 4 °C, soluția este stabilă timp de 1 lună.

Se pipetează 5,0 ml din soluția etalon stoc (punctul 3.7.1) într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu solvent de extracție (punctul 3.8) și se amestecă. La o temperatură de ≤ 4 °C, soluția este stabilă timp de 1 lună.

Se transferă 0,5, 1,0 și 2,0 ml din soluția etalon intermediară (punctul 3.7.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se completează până la semn cu faza mobilă (punctul 3.6) și se amestecă. Aceste soluții corespund la 0,5, 1,0 și respectiv 2,0 μg de amproliu per ml. Soluțiile se prepară imediat înainte de utilizare.

Amestec de metanol (punctul 3.1) și apă 2 + 1 (v + v)

4.    Aparatură

5.    Procedura

5.1.    Generalități

5.1.1.    Furaj martor

Pentru efectuarea testului de recuperare (punctul 5.1.2), se analizează un furaj martor pentru a verifica absența amproliului și a substanțelor interferente. Furajul martor este similar, ca tip, cu eșantionul; nu trebuie să se detecteze amproliu sau substanțe interferente.

5.1.2.    Testul de recuperare

Se efectuează un test de recuperare prin analiza furajului martor îmbogățit prin adăugarea unei cantități de amproliu similară celei prezente în eșantion. Pentru a obține o concentrație de 100 mg/kg, se transferă 10,0 ml de soluție etalon stoc (punctul 3.7.1) într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml și se evaporă soluția până la aproximativ 0,5 ml. Se adaugă 50 g de furaj martor, se amestecă bine și se lasă timp de 10 min, amestecând din nou de mai multe ori înainte de a trece la etapa de extracție (punctul 5.2).

Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor similar, ca tip, cu eșantionul (a se vedea punctul 5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat conform metodei de adiție standard. În acest caz, eșantionul de analizat este îmbogățit cu o cantitate de amproliu similară cu cea deja prezentă în eșantion. Acest eșantion este analizat împreună cu eșantionul neîmbogățit și recuperarea poate fi calculată prin scădere.

5.2.    Extracție

5.2.1.    Preamestecuri (conținut de amproliu < 1 %) și furaje

Se cântăresc, cu o abatere de 0,01 g, între 5 și 40 g de eșantion, în funcție de conținutul de amproliu, într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml și se adaugă 200 ml de solvent de extracție (punctul 3.8). Se plasează flaconul în baia cu ultrasunete (punctul 4.4) și se lasă timp de 15 minute. Se scoate flaconul din baia cu ultrasunete și se agită timp de 1 oră cu agitatorul mecanic sau magnetic (punctul 4.5). Se diluează o parte alicotă din extract cu faza mobilă (punctul 3.6), pentru a se obține un conținut de amproliu între 0,5 și 2 μg/ml și se amestecă (a se vedea observația de la 9.3). Se filtrează 5-10 ml din această soluție diluată cu un filtru cu membrană (punctul 4.2). Se continuă cu determinarea prin HPLC (punctul 5.3).

5.2.2.    Preamestecuri (conținut de amproliu ≥ 1 %)

Se cântăresc, cu o abatere de 0,001 g, 1-4 g de preamestec, în funcție de conținutul de amproliu, într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml și se adaugă 200 ml solvent de extracție (punctul 3.8). Se plasează flaconul în baia cu ultrasunete (punctul 4.4) și se lasă timp de 15 minute. Se scoate flaconul din baia cu ultrasunete și se agită timp de 1 oră cu agitatorul mecanic sau magnetic (punctul 4.5). Se diluează o parte alicotă din extract cu faza mobilă (punctul 3.6), pentru a se obține un conținut de amproliu între 0,5 și 2 μg/ml și se amestecă. Se filtrează 5-10 ml din această soluție diluată cu un filtru cu membrană (punctul 4.2). Se continuă cu determinarea prin HPLC (punctul 5.3).

5.3.    Determinarea prin HPLC

5.3.1.    Parametri:

Următoarele condiții sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica și alte condiții, dacă acestea duc la rezultate echivalente.

Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, injectându-se de mai multe ori soluția de calibrare (punctul 3.7.3) care conține 1,0 μg/ml, până când se obțin valori de vârf și timpi de retenție constanți.

5.3.2.    Curba de calibrare

Se injectează fiecare soluție de calibrare (punctul 3.7.3) de mai multe ori și se determină înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor pentru fiecare concentrație. Se trasează o curbă de calibrare utilizând înălțimile (ariile) medii ale vârfurilor soluțiilor de calibrare ca ordonate și concentrațiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.

5.3.3.    Soluția de eșantion

Se injectează extractul de eșantion (punctul 5.2) de mai multe ori folosind același volum ca cel utilizat pentru soluțiile de calibrare și se determină înălțimea (aria) medie a vârfurilor de amproliu.

6.    Calculul rezultatelor

Din înălțimea (aria) medie a vârfurilor de amproliu din soluția de eșantion se determină concentrația în μg/ml a soluției de eșantion prin referire la curba de calibrare (punctul 5.3.2).

Conținutul w de amproliu al eșantionului, exprimat în mg/kg, este dat de următoarea formulă:

unde:

V

=

volumul solventului de extracție (punctul 3.8), în ml, conform 5.2 (adică 200 ml)

c

=

concentrația de amproliu din extractul de eșantion (punctul 5.2), în μg/ml

f

=

factorul de diluție conform 5.2

m

=

greutatea porțiunii de testat, în g

7.    Validarea rezultatelor

7.1.    Identitate

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode care permite compararea spectrelor extractului de eșantion (punctul 5.2) și ale soluției de calibrare (punctul 3.7.3), care conține 2,0 μg/ml.

7.1.1.    Co-cromatografie

Un extract de eșantion (punctul 5.2) se îmbogățește prin adăugarea unei cantități adecvate de soluție de calibrare (punctul 3.7.3). Cantitatea de amproliu adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea de amproliu constatată în extractul de eșantion.

Numai înălțimea vârfului de amproliu se mărește după luarea în considerare atât a cantității adăugate, cât și a diluției extractului. Lărgimea vârfului, la jumătatea înălțimii sale, trebuie să se încadreze într-o variație de ± 10 % din lărgimea inițială a vârfului de amproliu din extractul de eșantion neîmbogățit.

7.1.2.    Detecție cu grup de diode

Rezultatele se evaluează în funcție de următoarele criterii:

Dacă unul dintre aceste criterii nu este îndeplinit, prezența analitului nu este confirmată.

7.2.    Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe același eșantion nu trebuie să depășească:

7.3.    Recuperare

Pentru un eșantion (martor) îmbogățit, recuperarea este de cel puțin 90 %.

8.    Rezultatele unui studiu colaborativ

S-a realizat un studiu colaborativ în cursul căruia au fost analizate trei tipuri de hrană pentru păsări de curte (eșantioanele 1-3), un furaj mineral (eșantionul 4) și un preamestec (eșantionul 5). Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos:

9.    Observații

I.   DETERMINAREA NARAZINULUI

Conținutul de nazarin se determină prin

J.   DETERMINAREA NICARBAZINULUI

Conținutul de nicarbazin se determină prin:

K.   DETERMINAREA DECOCHINATULUI

Conținutul de decochinat se determină prin:

L.   DETERMINAREA MONENSINULUI

Conținutul de monensin se determină prin

M.   DETERMINAREA SALINOMICINULUI

Conținutul de salinomicin se determină prin

N.   DETERMINAREA SEMDURAMICINULUI

Conținutul de semduramicin se determină prin:

O.   STANDARDE EN

Pentru aplicarea articolului 34 alineatul (2) litera (a) din Regulamentul (UE) 2017/625, sunt relevante următoarele standarde EN:

---

ANEXA V

METODE DE ANALIZĂ PENTRU CONTROLUL SUBSTANȚELOR NEDORITE DIN FURAJE

A.   DETERMINAREA NIVELURILOR DE DIOXINE (PCDD/PCDF) ȘI DE PCB-URI

CAPITOLUL I

METODE DE EȘANTIONARE ȘI DE INTERPRETARE A REZULTATELOR ANALITICE

1.    Domeniu de aplicare și definiții

Eșantioanele destinate controlului oficial al nivelurilor de p-dibenzodioxine policlorurate (PCDD-uri), dibenzofurani policlorurați (PCDF-uri), bifenili policlorurați de tipul dioxinelor (PCB-uri) ( 29 ) și PCB-uri care nu sunt de tipul dioxinelor din furaje sunt prelevate în conformitate cu dispozițiile din anexa I. Se aplică cerințele cantitative privind controlul substanțelor sau produselor repartizate uniform în furaje, așa cum sunt prevăzute la punctul 5.1 din anexa I. Eșantioanele agregat astfel obținute se consideră reprezentative pentru loturile sau subloturile din care sunt prelevate. Pe baza nivelurilor determinate în eșantioanele de laborator se stabilește dacă se respectă nivelurile maxime prevăzute de Directiva 2002/32/CE.

În sensul prezentei părți, se aplică definițiile menționate în anexa I la Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2021/808 al Comisiei ( 30 ).

În plus față de aceste definiții, în sensul prezentei părți se aplică următoarele definiții:

2.    Conformitatea lotului sau a sublotului cu nivelul maxim

2.1.    În ceea ce privește PCB-urile care nu sunt de tipul dioxinelor

Lotul sau sublotul respectă nivelul maxim în cazul în care rezultatul analitic al sumei PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 și PCB 180 (PCB-uri care nu sunt de tipul dioxinelor) nu depășește nivelul maxim prescris de Directiva 2002/32/CE, ținând cont de incertitudinea de măsurare extinsă ( 31 ). Lotul sau sublotul nu respectă nivelul maxim prescris de Directiva 2002/32/CE în cazul în care media celor două rezultate analitice ale estimării superioare ( 32 ) obținută printr-o analiză duplicat ( 33 ), luându-se în considerare incertitudinea de măsurare extinsă, depășește dincolo de orice îndoială rezonabilă nivelul maxim, adică, pentru a evalua conformitatea, se folosește concentrația analizată după ce s-a dedus incertitudinea de măsurare extinsă.

Incertitudinea de măsurare extinsă se calculează utilizându-se un coeficient de acoperire cu valoarea 2, care conferă un nivel de încredere de aproximativ 95 %. Un lot sau un sublot nu este conform dacă media valorilor măsurate minus incertitudinea extinsă a mediei este mai mare decât nivelul maxim.

Normele menționate la paragrafele de mai sus din cadrul acestui punct se aplică pentru rezultatul analitic obținut pe proba pentru controlul oficial. În cazul analizei efectuate pentru o a doua expertiză sau pentru referință, se aplică reglementările naționale.

2.2.    Referitor la PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor

Lotul sau sublotul respectă nivelul maxim în cazul în care rezultatul unei singure analize

Pentru testele de screening, se stabilește o valoare-limită pentru deciziile privind conformitatea eșantioanelor cu nivelurile maxime respective stabilite fie pentru PCDD-uri/PCDF-uri, fie pentru suma de PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor.

Lotul sau sublotul este considerat neconform cu nivelul maxim conform Directivei 2002/32/CE dacă media celor două rezultate analitice ale estimării superioare ( 34 ) obținute în urma unei analize duplicat ( 35 ) depășește dincolo de orice îndoială rezonabilă nivelul maxim, ținând seama de incertitudinea de măsurare extinsă, adică pentru a evalua conformitatea, este utilizată concentrația analizată după ce s-a dedus incertitudinea de măsurare extinsă.

Incertitudinea de măsurare extinsă se calculează utilizându-se un coeficient de acoperire cu valoarea 2, care conferă un nivel de încredere de aproximativ 95 %. Un lot sau un sublot nu este conform dacă media valorilor măsurate minus incertitudinea extinsă a mediei este mai mare decât nivelul maxim.

Se utilizează suma incertitudinilor extinse estimate a rezultatelor analitice separate ale PCDD-urilor/PCDF-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor pentru suma PCDD-urilor/PCDF-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor.

Normele menționate la paragrafele de mai sus din cadrul acestui punct se aplică pentru rezultatul analitic obținut pe proba pentru controlul oficial. În cazul analizei efectuate în scop de apărare sau pentru referință, se aplică reglementările naționale.

3.    Rezultate care depășesc pragurile de acțiune stabilite în anexa II la Directiva 2002/32/CE

Pragurile de acțiune servesc ca instrument pentru selectarea eșantioanelor în cazurile în care este necesar să se identifice o sursă de contaminare și să se ia măsuri pentru reducerea sau eliminarea acesteia. Metodele de screening stabilesc valori-limită corespunzătoare pentru selectarea acelor eșantioane. În cazul în care sunt necesare eforturi importante pentru a identifica o sursă și pentru a reduce sau elimina contaminarea, s-ar putea să fie adecvat să se confirme depășirea pragurilor de acțiune printr-o analiză duplicat folosind o metodă de confirmare și luându-se în considerare incertitudinea de măsurare extinsă ( 36 ).

CAPITOLUL II

PREGĂTIREA EȘANTIOANELOR ȘI CERINȚE PRIVIND METODELE DE ANALIZĂ UTILIZATE PENTRU CONTROLUL OFICIAL AL NIVELURILOR DE DIOXINE (PCDD/PCDF) ȘI DE PCB-URI DE TIPUL DIOXINELOR DIN FURAJE

1.    Domeniu de aplicare

Cerințele stabilite în prezentul capitol se aplică atunci când furajele sunt analizate pentru controlul oficial al nivelurilor de PCDD/PCDF substituite la pozițiile 2,3,7,8 și PCB-uri de tipul dioxinelor, precum și în ceea ce privește pregătirea eșantioanelor și cerințele analitice pentru alte scopuri de reglementare, care includ controalele oficiale efectuate de operatorii din sectorul hranei pentru animale pentru a asigura conformitatea cu Regulamentul (CE) nr. 183/2005 al Parlamentului European și al Consiliului ( 37 ).

Monitorizarea prezenței PCDD-urilor/PCDF-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor în furaje poate fi efectuată cu două tipuri diferite de metode analitice:

(a)    Metode de screening

Obiectivul metodelor de screening este selectarea acelor eșantioane cu niveluri de PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor care depășesc nivelurile maxime sau pragurile de acțiune. Metodele de screening trebuie să garanteze o capacitate sporită de analiză a eșantioanelor, eficientă din punctul de vedere al costurilor, sporind astfel șansa de a descoperi noi incidente cu un nivel mare de expunere și riscuri de sănătate importante pentru consumatori. Aplicarea lor trebuie să urmărească evitarea rezultatelor fals conforme. Ele pot să cuprindă metode bioanalitice și metode GC-MS.

Metodele de screening compară rezultatul analitic cu o valoare-limită, determinând o decizie de tip da/nu în legătură cu eventuala depășire a nivelului maxim sau a pragului de acțiune. Concentrația PCDD-urilor/PCDF-urilor și suma de PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor din eșantioanele suspectate a fi neconforme cu nivelul maxim trebuie determinate sau confirmate printr-o metodă de confirmare.

În plus, metodele de screening pot oferi o indicație a nivelului de PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor prezente în probă. În cazul aplicării metodelor bioanalitice de screening, rezultatul se exprimă ca echivalente bioanalitice (BEQ), iar în cazul aplicării metodelor GC-MS fizico-chimice se exprimă ca echivalente toxice (TEQ). Rezultatele exprimate numeric ale metodelor de screening sunt utile pentru a dovedi conformitatea sau suspiciunea de neconformitate sau depășirea pragurilor de acțiune și oferă o indicație a intervalului în care se situează nivelurile în vederea monitorizării prin metode de confirmare. Acestea nu sunt adecvate pentru scopuri precum evaluarea nivelurilor de fond, aprecierea prelevării, urmărirea tendințelor pe care le urmează nivelurile în timp sau reevaluarea pragurilor de acțiune și a nivelurilor maxime.

(b)    Metode de confirmare

Metodele de confirmare permit identificarea și cuantificarea fără echivoc a PCDD-urilor/PCDF-urilor și PCB-urilor de tipul dioxinelor prezente într-o probă și oferă informații depline la nivel de congeneri individuali. Prin urmare, aceste metode permit controlarea nivelurilor maxime și a pragurilor de acțiune, inclusiv confirmarea rezultatelor obținute prin metodele de screening. În plus, rezultatele pot fi folosite și pentru alte scopuri, precum determinarea nivelurilor de fond scăzute în monitorizarea furajelor, urmărirea tendințelor în timp, evaluarea expunerii și crearea unei baze de date pentru eventuala reevaluare a pragurilor de acțiune și a nivelurilor maxime. Acestea sunt, de asemenea, importante pentru stabilirea modelelor pentru congeneri în scopul de a identifica sursa unei posibile contaminări. Astfel de metode utilizează GC-HRMS. Pentru a confirma respectarea sau nerespectarea nivelului maxim, se poate utiliza, de asemenea, GC-MS/MS.

2.    Context

Pentru calcularea concentrațiilor echivalentelor toxice (TEQ), concentrațiile fiecărei substanțe dintr-o probă dată se înmulțesc cu factorul de echivalență toxică (TEF) corespunzător (a se vedea nota de subsol 1 de la capitolul I) și apoi se adună pentru a obține concentrația totală de compuși de tipul dioxinelor exprimată ca TEQ-uri.

În sensul prezentei părți A, limita specifică acceptată de cuantificare a unui congener individual înseamnă conținutul minim al unui analit care poate fi măsurat cu certitudine statistică rezonabilă și îndeplinește criteriile de identificare, astfel cum sunt descrise în standarde recunoscute la nivel internațional, de exemplu, EN 16215:2012 (Hrană pentru animale – Determinarea conținutului de dioxină, a PCB-urilor de tip dioxină și a indicatorilor PCB prin GC-HRMS) și/sau în metodele EPA 1613 și 1668 revizuite.

Limita de cuantificare a unui congener individual poate fi identificată drept:

Metodele bioanalitice de screening nu vor da rezultate la nivel de congener, ci doar o indicație ( 38 ) a nivelului TEQ, exprimată în echivalente bioanalitice (BEQ) pentru a ține cont de faptul că nu toți compușii prezenți într-un extract de probă care produce un răspuns în cadrul testului pot să îndeplinească toate cerințele principiului TEQ.

Metodele de screening și de confirmare pot fi aplicate pentru controlul unei anumite matrice numai dacă metodele sunt suficient de sensibile pentru a detecta în mod fiabil niveluri la pragul de acțiune sau nivelul maxim.

3.    Cerințe de asigurare a calității

4.    Cerințe pentru laboratoare

5.    Cerințe de bază privind procedura analitică pentru dioxine (PCDD/F-uri) și PCB-uri de tipul dioxinelor

5.1.    Intervalul de lucru la niveluri mici și limitele de cuantificare

Pentru PCDD-uri/PCDF-uri, cantitățile detectabile sunt de ordinul femtogramelor (10-15g), extremitatea superioară a intervalului, din cauza toxicității extreme a unora dintre acești compuși. Pentru majoritatea congenerilor PCB, limita de cuantificare de ordinul nanogramelor (10-9 g) este deja suficientă. Pentru măsurarea congenerilor PCB-urilor de tipul dioxinelor mai toxici (în special a congenerilor substituiți non-orto), extremitatea inferioară a intervalului de lucru ajunge la niveluri mici de ordinul picogramelor (10-12g). Pentru toți ceilalți congeneri PCB, o limită de cuantificare de ordinul nanogramelor (10-9 g) este suficientă.

5.2.    Selectivitate (specificitate) mare

5.3.    Acuratețe ridicată (autenticitate și precizie, recuperare aparentă a biotestului)

5.4.    Validarea în intervalul nivelului maxim și măsuri generale de control al calității

5.5.    Limita de cuantificare

5.6.    Criterii analitice

Pentru rezultate fiabile în urma metodelor de confirmare sau de screening, trebuie să fie respectate următoarele criterii în intervalul nivelului maxim pentru valoarea TEQ sau, respectiv, BEQ, indiferent dacă este determinată ca TEQ total sau BEQ total (ca sumă de PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor) sau separat pentru PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor:

5.7.    Cerințe specifice pentru metodele de screening

20 % din extractele de probe sunt măsurate în screeningul de rutină cu și fără 2,3,7,8-TCDD care se adaugă în funcție de nivelul maxim sau de pragul de acțiune, pentru a verifica dacă răspunsul este, eventual, suprimat de către substanțele interferente prezente în extractul de probă. Concentrația măsurată a probei îmbogățite se compară cu suma concentrației extractului neîmbogățit, plus concentrația cu îmbogățire. Dacă această concentrație măsurată este cu peste 25 % mai mică decât concentrația (suma) calculată, aceasta indică posibilitatea eliminării semnalului, iar proba respectivă este supusă analizei de confirmare prin GC-HRMS. Rezultatele sunt monitorizate prin grafice de control al calității.

Aproximativ 2-10 % din probele conforme, în funcție de matricea probei și de experiența laboratorului, sunt confirmate prin GC-HRMS.

Se determină rata rezultatelor fals conforme care rezultă din screeningul probelor sub și peste nivelul maxim sau pragul de acțiune. Ratele rezultatelor fals conforme reale trebuie să fie sub 5 %. Atunci când, în urma controlului de calitate al probelor conforme, sunt disponibile cel puțin 20 de rezultate confirmate per matrice/grup de matrice, concluziile privind rata rezultatelor fals conforme trebuie să fie desprinse din această bază de date. Rezultatele probelor analizate prin intermediul testărilor interlaboratoare sau în timpul incidentelor de contaminare, care acoperă un interval de concentrații de până la, de exemplu, 2 × nivelul maxim (NM), pot fi, de asemenea, incluse în cele cel puțin 20 de rezultate pentru evaluarea ratei rezultatelor fals conforme. Probele acoperă cele mai frecvente modele pentru congeneri, reprezentând diverse surse.

Deși testele de screening au, preferabil, ca scop detectarea probelor care depășesc pragul de acțiune, criteriul de determinare a ratelor rezultatelor fals conforme este nivelul maxim, ținând seama de incertitudinea de măsurare extinsă a metodei de confirmare.

Și pentru metodele bioanalitice efectuate în condiții de repetabilitate, valoarea RSDr intralaborator ar fi, în general, mai mică decât în condiții de reproductibilitate (RSDR)

6.    Cerințe specifice privind metodele GC-MS care trebuie respectate în scop de screening sau de confirmare

6.1.    Diferențe acceptabile între estimarea superioară și estimarea inferioară a rezultatelor OMS-TEQ

Diferența dintre nivelul estimării superioare și cel al estimării inferioare nu depășește 20 % pentru confirmarea depășirii nivelului maxim sau în cazul în care sunt necesare praguri de acțiune.

6.2.    Controlul recuperărilor

6.3.    Eliminarea substanțelor interferente

6.4.    Calibrarea cu curba standard

Intervalul curbei de calibrare trebuie să acopere intervalul relevant de niveluri maxime sau praguri de acțiune.

6.5.    Criterii specifice pentru metodele de confirmare

7.    Cerințe specifice pentru metodele bioanalitice

Metodele bioanalitice sunt metode bazate pe utilizarea de principii biologice precum testele pe bază de celule sau de receptori sau imunodozări. Prezentul punct stabilește cerințe pentru metodele bioanalitice în general.

O metodă de screening, în principiu, clasifică o probă ca fiind conformă sau suspectată a fi neconformă. În acest scop, nivelul BEQ calculat este comparat cu valoarea-limită (a se vedea punctul 7.3). Probele sub valoarea-limită sunt declarate conforme, probele egale sau peste valoarea-limită sunt suspectate a fi neconforme, necesitând o analiză printr-o metodă de confirmare. În practică, un nivel BEQ echivalent cu două treimi din nivelul maxim poate servi drept valoare-limită, cu condiția să se asigure o rată a rezultatelor fals conforme de sub 5 % și o rată acceptabilă pentru rezultate fals neconforme. Cu niveluri maxime diferite pentru PCDD-uri/PCDF-uri și pentru suma de PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, verificarea conformității probelor fără fracționare necesită valori-limită corespunzătoare ale biotestelor pentru PCDD-uri/PCDF-uri. Pentru verificarea probelor care depășesc pragurile de acțiune, un procentaj corespunzător al pragului de acțiune respectiv este considerat adecvat ca valoare-limită.

Dacă un nivel indicativ este exprimat în BEQ, rezultatele probelor trebuie să fie în intervalul de lucru și să depășească limita de raportare (a se vedea punctele 7.1.1 și 7.1.6).

7.1.    Evaluarea răspunsului la test

7.1.1.    Condiții generale

7.1.2.    Calibrarea

7.1.2.1.   Calibrarea cu curba standard

7.1.2.2.   Calibrarea cu eșantioane de referință

Alternativ, poate fi utilizată o curbă de calibrare realizată pe baza a cel puțin patru eșantioane de referință (a se vedea punctul 7.2.4): poate fi utilizată un eșantion martor de matrice, plus trei eșantioane de referință de 0,5x, 1x și 2x nivelul maxim sau pragul de acțiune, eliminând necesitatea de a corecta în funcție de martor și de recuperare. În acest caz, răspunsul la test echivalent cu două treimi din nivelul maxim (a se vedea punctul 7.3) poate fi calculat direct din aceste probe și utilizat ca valoare-limită. Pentru verificarea probelor care depășesc pragurile de acțiune, un procentaj corespunzător al acestor praguri de acțiune este considerat adecvat ca valoare-limită.

7.1.3.    Determinarea separată a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor

Extractele pot fi divizate în fracțiuni care conțin PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, permițând o indicare separată a nivelurilor TEQ pentru PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor (în BEQ). Se utilizează, de preferință, o curbă de calibrare standard a PCB 126 pentru evaluarea rezultatelor fracțiunii care conține PCB-uri de tipul dioxinelor.

7.1.4.    Recuperări aparente ale biotestului

„Recuperarea aparentă a biotestului” se calculează pornind de la probe de referință adecvate cu modele reprezentative pentru congeneri în jurul nivelului maxim sau al pragului de acțiune și exprimate ca procentaj al nivelului BEQ în comparație cu nivelul TEQ. În funcție de tipul de test și de TEF ( 40 ) utilizați, diferențele între factorii TEF și REP pentru PCB-urile de tipul dioxinelor pot cauza recuperări aparente reduse pentru PCB-urile de tipul dioxinelor în comparație cu PCDD-uri/PCDF-uri. Prin urmare, în cazul în care se efectuează o determinare separată a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor, recuperările aparente ale testului biologic sunt: pentru PCB-uri de tipul dioxinelor, între 20 % și 60 %, pentru PCDD-uri/PCDF-uri, între 50 % și 130 % (intervalele se aplică pentru curba de calibrare a TCDD). Deoarece contribuția PCB-urilor de tipul dioxinelor la suma de PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor poate varia între diferite matrice și probe, recuperările aparente ale biotestului pentru suma de PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor reflectă aceste intervale și se situează între 30 % și 130 %. Orice implicare a valorilor TEF revizuite în mod substanțial pentru legislația Uniunii pentru PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor necesită revizuirea acestor intervale.

7.1.5.    Controlul recuperărilor pentru curățare

Pierderea de compuși în timpul curățării se verifică în timpul validării. Un eșantion martor îmbogățit cu un amestec de congeneri diferiți face obiectul curățării (n = 3 cel puțin), iar recuperarea și variabilitatea sunt verificate printr-o metodă de confirmare. Recuperarea se situează între 60 % și 120 %, mai ales pentru congeneri care contribuie cu mai mult de 10 % la nivelul TEQ în diverse amestecuri.

7.1.6.    Limita de raportare

Atunci când se raportează nivelurile BEQ, se determină o limită de raportare pornind de la probele de matrice relevante care implică modele tipice pentru congeneri, dar nu pornind de la curba de calibrare a standardelor, din cauza preciziei reduse în intervalul inferior al curbei. Se iau în considerare efectele extracției și ale curățării. Limita de raportare se fixează cel puțin cu un factor de trei peste martorii procedurii.

7.2.    Utilizarea eșantioanelor de referință

7.3.    Determinarea valorilor-limită

Se stabilește relația dintre rezultatele bioanalitice în BEQ și rezultatele în urma metodei de confirmare în TEQ [de exemplu, prin experimente de calibrare în raport cu matricea, care implică probe de referință îmbogățite la 0, 0,5x, 1x și 2x față de nivelul maxim (NM), cu șase repetări la fiecare nivel (n = 24)]. Factorii de corecție (martor și recuperare) pot fi estimați pornind de la această relație, însă se verifică în conformitate cu punctul 7.2.2.

Valorile-limită se stabilesc pentru deciziile privind conformitatea probelor cu nivelurile maxime sau pentru controlul pragurilor de acțiune, în cazul în care acest lucru este relevant, cu nivelurile maxime sau pragul de acțiune respective stabilite fie numai pentru PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, fie pentru suma de PCDD-uri/PCDF-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor. Acestea sunt reprezentate prin extremitatea inferioară a distribuției rezultatelor bioanalitice (corectate în funcție de martor și recuperare) care corespund limitei de decizie a metodei de confirmare bazată pe un nivel de încredere de 95 %, ceea ce înseamnă o rată a rezultatelor fals conforme < 5 %, și pe o valoare a RSDR < 25 %. Limita de decizie a metodei de confirmare este nivelul maxim, ținând seama de incertitudinea de măsurare extinsă.

Valoarea-limită (în BEQ) poate fi calculată în conformitate cu una dintre abordările descrise la punctele 7.3.1, 7.3.2 și 7.3.3 (a se vedea figura 1).

unde:

BEQDL

BEQ corespunzând limitei de decizie a metodei de confirmare este nivelul maxim, ținând seama de incertitudinea de măsurare extinsă

sy,x	deviația standard reziduală

t α,f = m-2

factorul student (α = 5 %, f = grade de libertate, asimetric)

m	m numărul total de puncte de calibrare (indice j)

n	n numărul de repetări la fiecare nivel

xi	concentrația probei (în TEQ) a punctului de calibrare i determinat printr-o metodă de confirmare

medie a concentrațiilor (în TEQ) ale tuturor probelor de calibrare

parametrul sumei pătratelor, i = indice pentru punctul de calibrare i

unde:

SDR	deviația standard a rezultatelor biotestului la BEQDL, măsurată în condiții de reproductibilitate intralaborator

Calcul al valorilor-limită, bazat pe un nivel de încredere de 95 %, implicând o rată a rezultatelor fals conforme < 5 %, și pe o valoare a RSDR < 25 %:

Figura 1

Valorile-limită bazate pe BEQ, calculate pornind de la valoarea RSDR obținută în cursul validării utilizând un număr limitat de probe cu modele pentru matrice/congeneri diferite pot fi mai mari decât nivelurile maxime sau pragurile de acțiune bazate pe TEQ datorită unei precizii mai mari decât cea realizabilă în analizele de rutină atunci când trebuie controlat un spectru necunoscut de posibile modele pentru congeneri. În astfel de cazuri, valorile-limită se calculează pornind de la RSDR = 25 % sau se preferă două treimi din nivelul maxim sau pragul de acțiune.

7.4.    Caracteristici de performanță

8.    Raportarea rezultatelor

8.1.    Metode de confirmare

8.2.    Metode bioanalitice de screening

8.3.    Metode fizico-chimice de screening

CAPITOLUL III

PREGĂTIREA PROBELOR ȘI CERINȚE PRIVIND METODELE DE ANALIZĂ UTILIZATE PENTRU CONTROLUL OFICIAL AL NIVELURILOR DE PCB-URI CARE NU SUNT DE TIPUL DIOXINELOR DIN FURAJE

1.    Domeniu de aplicare

Cerințele stabilite în prezentul capitol se aplică atunci când furajele sunt analizate pentru controlul oficial al nivelurilor de bifenili policlorurați care nu sunt de tipul dioxinelor (PCB-uri care nu sunt de tipul dioxinelor), precum și în ceea ce privește pregătirea probelor și cerințele analitice pentru alte scopuri de reglementare, care includ controalele oficiale efectuate de operatorii din sectorul hranei pentru animale pentru a asigura conformitatea cu Regulamentul (CE) nr. 183/2005.

2.    Metode de detectare aplicabile

Gaz-cromatografie/detectare prin captură de electroni (GC-CDE), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS sau metode echivalente.

3.    Identificarea și confirmarea analiților de interes

Monitorizarea cel puțin a următorului număr de ioni moleculari sau de ioni caracteristici din clusterul molecular:

Toleranțele maxime admisibile pentru raportul valorilor izotopilor pentru fragmentele de masă selecționate:

Deviația relativă a abundenței izotopice relative pentru fragmentele de masă selecționate și valoarea teoretică a abundenței izotopice sau standardul de calibrare pentru ionul țintă (ionul monitorizat cu cea mai ridicată abundență izotopică) și ionul (ionii) calificativ(i): ± 15 %.

Rezultatele care depășesc nivelul maxim sunt confirmate cu două coloane de GC cu faze staționare de polaritate diferită.

4.    Demonstrarea randamentului metodei

Randamentul metodei se validează în intervalul nivelului maxim (0,5 la 2 x nivelul maxim), cu un coeficient de variație acceptabil pentru analiza repetată (a se vedea cerințele pentru precizia intermediară de la punctul 9).

5.    Limita de cuantificare

Suma limitelor de cuantificare (LOQ) ( 42 ) ale PCB-urilor care nu sunt de tipul dioxinelor nu trebuie să fie mai mare de o treime din nivelul maxim ( 43 ).

6.    Controlul calității

Controale ale martorului, analiză a probelor îmbogățite, probe pentru controlul calității, participarea la studii interlaboratoare pe matrice relevante, la intervale regulate.

7.    Controlul recuperărilor

adăugare la produse (înaintea procesului de extracție și de curățare).

8.    Cerințe pentru laboratoare

În conformitate cu dispozițiile Regulamentului (UE) 2017/625, laboratoarele sunt acreditate de un organism recunoscut care funcționează în conformitate cu Ghidul ISO/IEC 58, pentru a se asigura aplicarea de către acestea a procedurilor de asigurare a calității analizelor. Laboratoarele sunt acreditate conform standardului EN ISO/IEC 17025. În plus, trebuie respectate principiile descrise în Orientările tehnice pentru estimarea incertitudinii de măsurare și a limitelor de cuantificare pentru analiza PCB-urilor ( 44 ).

9.    Caracteristici de performanță: criterii pentru suma celor șase PCB-uri care nu sunt de tipul dioxinelor la nivelul maxim

10.    Raportarea rezultatelor

B.   STANDARDE EN

Pentru aplicarea articolului 34 alineatul (2) litera (a) din Regulamentul (UE) 2017/625, sunt relevante următoarele standarde EN:

▼M2

---

ANEXA VI

METODE DE ANALIZĂ PENTRU DETERMINAREA CONSTITUENȚILOR DE ORIGINE ANIMALĂ PENTRU CONTROLUL OFICIAL AL FURAJELOR

▼M8

1.   SCOP ȘI DOMENIU DE APLICARE

Determinarea constituenților de origine animală în hrana pentru animale se efectuează prin microscopie optică sau reacție în lanț a polimerazei (PCR), în conformitate cu dispozițiile stabilite în prezenta anexă.

Aceste două metode fac posibilă depistarea prezenței constituenților de origine animală în preamestecuri, în materiile prime pentru hrana animalelor și în hrana combinată pentru animale. Totuși, ele nu fac posibilă calcularea cantității acestor constituenți în preamestecuri, în materiile prime pentru hrana animalelor și în hrana combinată pentru animale. Ambele metode au o limită de detecție sub 0,1 % (G/G).

Metoda PCR face posibilă identificarea grupului taxonomic al constituenților de origine animală prezenți în preamestecuri, în materiile prime pentru hrana animalelor și în hrana combinată pentru animale.

Aceste metode se aplică pentru controlul aplicării interdicțiilor prevăzute la articolul 7 alineatul (1) din Regulamentul (CE) nr. 999/2001 al Parlamentului European și al Consiliului ( 45 ), în anexa IV la regulamentul respectiv și la articolul 11 alineatul (1) din Regulamentul (CE) nr. 1069/2009 al Parlamentului European și al Consiliului ( 46 ).

În funcție de tipul de hrană pentru animale testată, aceste metode pot fi utilizate, în cadrul unui singur protocol operațional, fie singure, fie combinate, în conformitate cu procedurile standard de operare (PSO) stabilite de laboratorul de referință al UE pentru depistarea proteinelor animale în hrana pentru animale (EURL-AP) și publicate pe site-ul său de internet ( 47 ).

▼M2

2.   METODE

▼M8

2.1.    Microscopie optică

2.1.1.    Principiu

Constituenții de origine animală care pot fi prezenți în preamestecuri, în materiile prime pentru hrana animalelor și în hrana combinată pentru animale, trimise spre analizare, sunt identificați pe baza caracteristicilor tipice și identificabile microscopic, cum ar fi fibrele musculare și alte particule de carne, cartilajul, oasele, coarnele, părul, părul, părul de porc, fragmentele cuticulare ale nevertebratelor, structurile traheale ale insectelor, produsele de sânge, globule din lapte, cristalele de lactoză, penele, cojile de ouă, oasele și solzii de pește.

Examinările microscopice se efectuează după prepararea eșantioanelor prin sedimentare.

Eșantioanele se supun unei etape de sedimentare, după cum urmează:

2.1.2.    Reactivi și echipamente

2.1.2.1.   Reactivi

2.1.2.1.1.   Agent de concentrare

2.1.2.1.2.   Agent de colorare

2.1.2.1.3.   Medii de montare

2.1.2.1.4.   Mediu de montare cu proprietăți de colorare

2.1.2.1.5.   Agenți de limpezire

2.1.2.1.6.   Agent de decolorare

2.1.2.2.   „Echipamente

2.1.3.    Eșantionarea și prepararea eșantioanelor

2.1.3.1.   Eșantionare

Se utilizează un eșantion reprezentativ, prelevat în conformitate cu anexa I.

2.1.3.1.1.   Uscarea eșantioanelor

Eșantioanele cu un conținut de umiditate > 14 % se usucă înainte de manipulare în conformitate cu anexa III.

2.1.3.1.2.   Cernerea în prealabil a eșantioanelor

Pentru a colecta informații privind posibila contaminare ambientală a hranei destinate animalelor, se recomandă să se cearnă în prealabil la dimensiunea de 1 mm hrana sub formă de pelete și grăunțe și apoi să se prepare, să se analizeze și să se raporteze separat cele două fracțiuni rezultate, care trebuie să fie considerate ca eșantioane distincte.

2.1.3.2.   Măsuri de precauție

Pentru a se evita contaminarea încrucișată în laborator, toate echipamentele reutilizabile se curăță cu grijă înainte de utilizare. Piesele pâlniei de separare se demontează înainte de curățare. Piesele pâlniei de separare și sticlăria se prespală manual și apoi se spală într-o mașină de spălat. Sitele se curăță utilizând o perie cu peri sintetici aspri. Se recomandă curățarea finală a sitelor cu acetonă și aer comprimat după cernerea materiilor grase, precum făina de pește.

2.1.3.3.   Prepararea eșantioanelor constând în grăsimi sau uleiuri

Pentru prepararea eșantioanelor constând în grăsimi se aplică următorul protocol:

Același protocol, cu excepția primei și a celei de a patra liniuțe, se aplică pentru prepararea eșantioanelor de ulei.

2.1.3.4.   Prepararea altor eșantioane decât de grăsimi sau uleiuri

Toate etapele se realizează într-o pâlnie de separare conică din sticlă de 250 ml, astfel cum se descrie la punctul 2.1.2.2, a patra liniuță.

2.1.4.    Examinare microscopică

2.1.4.1.   Prepararea lamelor

Lamele de microscopie se prepară din sediment și, în funcție de alegerea operatorului, fie din materia flotantă, fie din materia primă. Dacă este cazul, numai pentru depistarea constituenților proveniți de la nevertebrate terestre, se prepară lame și din materia flotantă finală obținută conform descrierii de la punctul 2.1.3.4.4. Se prepară cele două fracțiuni rezultate (cea fină și cea grosieră). Porțiunile de testat din fracțiuni întinse pe lame trebuie să fie reprezentative pentru întreaga fracțiune.

Se pregătește un număr suficient de lame pentru a se asigura că se poate efectua un protocol complet de examinare, astfel cum se prevede la punctul 2.1.4.2.

Lamele de microscopie se montează cu mediul de montare adecvat în conformitate cu PSO stabilite de EURL-AP și publicate pe site-ul său de internet. Lamele se acoperă cu lamele de acoperire.

2.1.4.2.   Diagrama de observare pentru depistarea particulelor de origine animală în preamestecuri, în materiile prime pentru hrana animalelor și în hrana combinată pentru animale.

Lamele de microscopie preparate se observă în conformitate cu diagramele de observare stabilite în diagramele 1 și 2.

Observațiile de microscopie se realizează utilizând microscopul compus pe sediment și, în funcție de alegerea operatorului, fie pe materia flotantă, fie pe materia primă. În plus, pentru depistarea constituenților proveniți de la nevertebrate terestre, se efectuează observații și asupra materiei flotante finale obținute conform descrierii de la punctul 2.1.3.4.4, în conformitate cu diagrama 3. Microscopul stereoscopic poate fi utilizat în plus față de microscopul compus pentru fracțiunile grosiere. Fiecare lamă se examinează în întregime la diferite amplificări. Explicații precise cu privire la modul de utilizare a diagramelor sunt detaliate printr-o PSO stabilită de EURL-AP și publicată pe site-ul său de internet.

Numărul minim de lame care trebuie observate în fiecare etapă a diagramelor de observare trebuie să fie strict respectat, cu excepția cazului în care întregul material al fracțiunii nu permite să se ajungă la numărul prevăzut de lame, de exemplu atunci când nu se obține deloc sediment. Nu se utilizează mai mult de 6 lame pentru fiecare determinare pentru înregistrarea numărului de particule.

În cazul în care se prepară lame suplimentare cu ajutorul unui mediu de montare mai specific, cu proprietăți de colorare, astfel cum se descrie la punctul 2.1.2.1.4, pe materia flotantă sau pe materia primă pentru a caracteriza suplimentar structurile (de exemplu, pene, păr, mușchi sau particule de sânge), care au fost depistate pe lamele preparate cu alte medii de montare, astfel cum se descrie la punctul 2.1.2.1.3, numărul de particule se numără pe baza unui număr de lame per determinare care nu depășește 6, inclusiv lamele suplimentare cu un mediu de montare mai specific. Lamele suplimentare preparate din materia flotantă finală obținută, astfel cum se descrie la punctul 2.1.3.4.4, pentru depistarea constituenților proveniți de la nevertebrate terestre nu se iau în considerare pentru identificarea altor naturi (vertebrate terestre și pești).

Pentru a facilita identificarea naturii și originii particulelor, operatorul poate utiliza instrumente de sprijin cum ar fi sisteme de asistare în luarea deciziilor, biblioteci de imagini și eșantioane de referință.

Diagrama 1

Diagramă de observare după sedimentarea doar cu TCE pentru depistarea particulelor de origine animală, alta decât nevertebratele terestre, în preamestecuri, în materiile prime pentru hrana animalelor și în hrana combinată pentru animale, pentru prima determinare

Diagrama 2

Diagramă de observare după sedimentarea doar cu TCE pentru depistarea particulelor de origine animală, alta decât nevertebratele terestre, în preamestecuri, în materiile prime pentru hrana animalelor și în hrana combinată pentru animale, pentru a doua determinare

Diagrama 3

Diagramă de observare după sedimentarea dublă cu PE/TCE pentru depistarea constituenților proveniți de la nevertebrate terestre, în preamestecuri, în materiile prime pentru hrana animalelor și în hrana combinată pentru animale

2.1.4.3.   Numărul de determinări

Determinările se efectuează pe subeșantioane diferite de 50 g fiecare.

Dacă, în urma primei determinări efectuate în conformitate cu diagrama de observare din diagrama 1 sau, după caz, din diagrama 3, nu se depistează deloc particule de origine animală, nu este necesară o determinare suplimentară, iar rezultatul analizei se raportează utilizând formularea de la punctul 2.1.5.1.

Dacă, în urma unei prime determinări efectuate în conformitate cu diagrama de observare din diagrama 1, se depistează una sau mai multe particule de origine animală de o anumită natură (și anume, vertebrate terestre sau pești), iar natura particulelor găsite confirmă conținutul declarat al eșantionului, nu este necesară o a doua determinare. Dacă numărul particulelor de origine animală de o anumită natură depistate pe parcursul acestei prime determinări este mai mare de 5, rezultatul analizei se raportează în funcție de natura animală utilizând formularea de la punctul 2.1.5.3. Altminteri, rezultatul analizei se raportează în funcție de natura animală utilizând formularea de la punctul 2.1.5.2.

Dacă, în urma primei determinări efectuate în conformitate cu diagrama de observare din diagrama 3 se depistează mai mult de 5 particule provenite de la nevertebrate terestre, nu este necesară o a doua determinare, iar rezultatul analizei se raportează utilizând formularea de la punctul 2.1.5.3 pentru această natură.

În toate celelalte cazuri, inclusiv atunci când nu a fost furnizată laboratorului nicio declarație cu privire la conținut, se efectuează o a doua determinare pornind de la un nou subeșantion. Dacă, în urma celei de-a doua determinări efectuate în conformitate cu diagrama de observare din diagrama 2 sau, după caz, din diagrama 3, suma particulelor de origine animală de o anumită natură depistate pe parcursul celor două determinări este mai mare de 10, rezultatul analizei se raportează în funcție de natura animală utilizând formularea de la punctul 2.1.5.3. Altminteri, rezultatul analizei se raportează în funcție de natura animală utilizând formularea de la punctul 2.1.5.2.

2.1.5.    Exprimarea rezultatelor

Atunci când raportează rezultatele, laboratorul indică tipul de material care a fost analizat (sediment, materie flotantă, materie flotantă finală sau materie primă). Raportarea indică în mod clar numărul de determinări care au fost efectuate și dacă cernerea fracțiunilor înainte de prepararea lamelor, în conformitate cu punctul 2.1.3.4.3, prima liniuță, al treilea paragraf sau cu punctul 2.1.3.4.4, a treia liniuță, nu a fost efectuată.

Raportul laboratorului conține cel puțin informații privind prezența constituenților derivați din vertebrate terestre și din pești.

Diferitele situații se raportează în modul următor:

În cazul în care s-a efectuat o singură determinare:

Atunci când au fost efectuate două determinări:

În plus:

În cazul în care s-a efectuat o singură determinare:

Atunci când au fost efectuate două determinări:

În plus:

▼M2

2.2.    PCR

2.2.1.    Principiu

Fragmentele de acid dezoxiribonucleic (ADN) de origine animală care pot fi prezente în materiile prime furajere și furajele combinate sunt detectate printr-o tehnică de amplificare genetică prin PCR, care vizează secvențe de ADN specifice speciei.

Metoda PCR necesită, în primul rând, o etapă de extragere a ADN-ului. Etapa de amplificare se aplică ulterior extractului de ADN astfel obținut, în vederea detectării speciilor de animale vizate de test.

2.2.2.    Reactivi și echipamente

2.2.2.1.   Reactivi

2.2.2.1.1.   Reactivi pentru etapa de extragere a ADN-ului

Se utilizează numai reactivii aprobați de laboratorul de referință al UE pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale și publicați pe site-ul internet al acestuia.

2.2.2.1.2.   Reactivi pentru etapa de amplificare genetică

2.2.2.1.2.1.   Primeri și sonde

Se utilizează numai primerii și sondele cu secvențe de oligonucleotide validate de către laboratorul de referință al UE pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale ( 48 ).

2.2.2.1.2.2.   Amestecul principal

Se utilizează doar soluțiile de amestec principal care nu conțin reactivi susceptibili să conducă la rezultate false datorită prezenței de ADN animal ( 49 ).

2.2.2.1.2.3.   Reactivi de decontaminare

2.2.2.1.2.3.1.   Soluție de acid clorhidric (0,1N)

2.2.2.1.2.3.2.   Înălbitor (soluție de hipoclorit de sodiu la 0,15 % din clor activ)

2.2.2.1.2.3.3.   Reactivi necorozivi pentru decontaminarea dispozitivelor costisitoare, precum balanțele analitice (de exemplu, DNA EraseTM al MP Biomedicals)

2.2.2.2.   Echipamente

2.2.2.2.1.   Balanță analitică cu o precizie de 0,001 g

2.2.2.2.2.   Echipament de măcinare

2.2.2.2.3.   Thermocycler care permite PCR în timp real

2.2.2.2.4.   Microcentrifugă pentru tuburi de microcentrifugare

2.2.2.2.5.   Set de micropipete care permit introducerea cu pipeta de la 1 μl până la 1 000 μl

2.2.2.2.6.

Material de plastic standard de biologie moleculară: tuburi de microcentrifugare, vârfuri de plastic filtrate pentru micropipete, plăci adecvate pentru thermocycler.

2.2.2.2.7.

Congelatoare pentru depozitarea eșantioanelor și reactivilor

2.2.3.    Eșantionarea și pregătirea eșantioanelor

2.2.3.1.   Eșantionare

Se utilizează un eșantion reprezentativ, prelevat în conformitate cu dispozițiile prevăzute în anexa I.

2.2.3.2.   Pregătirea eșantioanelor

Pregătirea eșantioanelor de laborator înainte de extragerea ADN-ului respectă cerințele prevăzute în anexa II. Cel puțin 50 g din eșantion constituie subeșantioane pentru a fi analizate și ulterior măcinate.

Pregătirea eșantioanelor se efectuează într-o încăpere diferită de cele dedicate extragerii ADN-ului și reacțiilor de amplificare genetică descrise în ISO 24276.

Se pregătesc două porțiuni de testat de cel puțin 100 mg fiecare.

2.2.4.    Extragerea ADN-ului

Extragerea ADN-ului se efectuează pe fiecare porțiune de testat pregătită utilizând PSO stabilite de laboratorul de referință al UE pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale și publicate pe site-ul internet al acestuia.

Se pregătesc două controale de extragere pentru fiecare serie de extrageri descrise în ISO 24276:

2.2.5.    Amplificarea genetică

Amplificarea genetică se efectuează utilizând metodele validate pentru fiecare specie care necesită identificare. Aceste metode sunt prevăzute în PSO stabilite de laboratorul de referință al UE pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale și publicate pe site-ul internet al acestuia. Fiecare extract de ADN se analizează în cel puțin două diluții diferite în scopul de a evalua inhibarea.

Se pregătesc două controale de amplificare pentru fiecare specie țintă, astfel cum se descrie în ISO 24276.

2.2.6.    Interpretarea și exprimarea rezultatelor

Atunci când raportează rezultatele, laboratorul indică cel puțin greutatea porțiunilor de testat utilizate, tehnica de extragere utilizată, numărul de determinări efectuate și limita de detecție a metodei.

Rezultatele nu sunt interpretate și raportate în cazul în care controlul de extragere al ADN-ului pozitiv și controalele țintă ale ADN-ului pozitiv nu oferă rezultate pozitive pentru obiectivul care face obiectul testului, în timp ce controlul reactivului de amplificare este negativ.

În cazul în care rezultatele celor două porțiuni de testat nu sunt consecvente, se repetă cel puțin etapa de amplificare genetică. În cazul în care laboratorul suspectează că extractele de ADN pot fi cauza inconsecvenței, se efectuează o nouă extracție de ADN și o altă amplificare genetică înainte de interpretarea rezultatelor.

Exprimarea finală a rezultatelor se bazează pe integrarea și interpretarea rezultatelor celor două porțiuni de testat în conformitate cu PSO stabilite de laboratorul de referință al UE pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale și publicate pe site-ul internet al acestuia.

2.2.6.1.   Rezultat negativ

Un rezultat negativ este raportat după cum urmează:

Niciun ADN de la X nu a fost detectat în eșantionul prezentat (X fiind specia de animale sau grupul de specii de animale care sunt vizate de test).

2.2.6.2.   Rezultat pozitiv

Un rezultat pozitiv este raportat după cum urmează:

A fost detectat ADN de la X în eșantionul prezentat (X fiind specia de animale sau grupul de specii de animale care sunt vizate de test).

▼M9

---

ANEXA VII

METODA DE CALCUL A VALORII ENERGETICE A FURAJELOR PENTRU PĂSĂRI DE CURTE

1.   METODA DE CALCUL ȘI EXPRIMAREA VALORII ENERGETICE

Valoarea energetică a hranei combinate pentru păsările de curte se calculează aplicându-se formula de mai jos, pe baza procentajului anumitor compuși analitici ai furajelor pentru păsări de curte. Această valoare se exprimă în megajouli (MJ) de energie metabolizabilă (EM), corectată pentru azot, per kilogram de furaje combinate:

MJ/kg de EM = 0,1551 × % proteină brută + 0,3431 × % grăsime brută + 0,1669 × % amidon + 0,1301 × % zaharuri totale (exprimate în zaharoză).

2.   TOLERANȚE APLICABILE VALORILOR DECLARATE

În cazul în care la inspecția oficială se constată o diferență (valoare energetică mai mare sau mai mică a furajului) între rezultatul inspecției și valoarea energetică menționată, se admite o toleranță de 0,4 MJ/kg EM.

3.   EXPRIMAREA REZULTATULUI

Rezultatul obținut prin aplicarea formulei menționate se exprimă cu o zecimală.

4.   METODE DE EȘANTIONARE ȘI DE ANALIZĂ

Prelevarea eșantionului din furajele combinate și determinarea conținutului de compuși analitici indicați în metoda de calcul trebuie să se efectueze în conformitate cu metodele Uniunii de eșantionare și de analiză pentru controlul oficial al hranei pentru animale.

Se aplică următoarele metode:

METODA DE CALCUL A VALORII ENERGETICE A MATERIILOR PRIME DESTINATE HRANEI ANIMALELOR ȘI A HRANEI COMBINATE PENTRU PISICI ȘI CÂINI

Valoarea energetică a materiilor prime destinate hranei animalelor și a hranei combinate pentru pisici și câini se calculează în conformitate cu EN 16967 Hrană pentru animale: Metode de eșantionare și de analiză – ecuații predictive pentru energia metabolizabilă în materiile prime destinate hranei animalelor și în hrana combinată pentru animale (hrană pentru animale de companie) pentru pisici și câini, inclusiv în alimentele dietetice.

▼M9 —————

▼B

---

ANEXA IX

TABELE DE CORESPONDENȚĂ MENȚIONATE LA ARTICOLUL 6

1.   Directiva 71/250/CEE

2.   Directiva 71/393/CEE

3.   Directiva 72/199/CEE

4.   Directiva 73/46/CEE

5.   Directiva 76/371/CEE

6.   Directiva 76/372/CEE

7.   Directiva 78/633/CEE

8.   Directiva 81/715/CEE

9.   Directiva 84/425/CEE

10.   Directiva 86/174/CEE

11.   Directiva 93/70/CEE

12.   Directiva 93/117/CE

13.   Directiva 98/64/CE

14.   Directiva 1999/27/CE

15.   Directiva 1999/76/CE

16.   Directiva 2000/45/CE

17.   Directiva 2002/70/CE

18.   Directiva 2003/126/CE