1991R2568 — RO — 09.08.2012 — 024.001

Acest document reprezintă un instrument de documentare, iar instituţiile nu îşi asumă responsabilitatea pentru conţinutul său.

Astfel cum a fost modificat prin:

▼B

REGULAMENTUL (CEE) NR. 2568/91 AL COMISIEI

din 11 iulie 1991

privind caracteristicile uleiurilor de măsline și ale uleiurilor din resturi de măsline, precum și metodele de analiză a acestora

▼M20

Articolul 1

(1)  Sunt considerate uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 1 literele (a) și (b) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiurile ale căror caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctele 1 și 2 la prezentul regulament.

(2)  Este considerat ulei de măsline lampant, în sensul punctului 1 litera (c) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 3 la prezentul regulament.

(3)  Este considerat ulei de măsline rafinat, în sensul punctului 2 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate în anexa I punctul 4 la prezentul regulament.

(4)  Este considerat ulei de măsline compus din ulei rafinat și din uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 3 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 5 la prezentul regulament.

(5)  Este considerat ulei din reziduuri de măsline brut, în sensul punctului 4 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 6 la prezentul regulament.

(6)  Este considerat ulei din reziduuri de măsline rafinat, în sensul punctului 5 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 7 la prezentul regulament.

(7)  Este considerat ulei din reziduuri de măsline, în sensul punctului 6 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 8 la prezentul regulament.

▼B

Articolul 2

(1)  Caracteristicile uleiurilor prevăzute la anexa I se efectuează în conformitate cu metodele de analiză următoare:

▼M19

▼B

▼M21

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M11

▼M13

▼M19

▼M23

▼M19

2.  Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3.  When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

▼M17

Pentru verificarea prevăzută la alineatul (3), analizele menționate la anexele II, III, IX, X și XII, precum și, după caz, contraanalizele prevăzute de legislațiile naționale, se efectuează înainte de data minimă de valabilitate. În cazul în care prelevarea probei se face cu mai mult de patru luni înaintea datei minime de valabilitate, aceste analize se efectuează cel târziu în a patra lună de la prelevarea probei. Pentru celelalte analize prevăzute de regulamentul menționat anterior nu se prevede nici o limită de timp.

 ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5.  For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Articolul 2a

Verificarea de către autoritățile naționale sau de către reprezentanții acestora a conformității unei probe de uleiuri de măsline sau de uleiuri din reziduuri de măsline cu categoria declarată se poate face:

▼M19 —————

▼M5

Articolul ►M19  3 ◄

În cazul în care se constată că nu există o corespondență a caracteristicilor organoleptice ale unui ulei cu descrierea acestuia, statul membru în cauză aplică, fără a aduce atingere altor penalități, penalități administrative financiare, care se vor stabili în funcție de gravitatea neregulii detectate.

La evaluarea neregulii se acordă atenție în special schimbărilor naturale ale caracteristicilor unui ulei păstrat în condiții normale.

La începutul fiecărui semestru, statele membre informează Comisia cu privire la numărul și tipul neregulilor detectate și la penalitățile aplicate în semestrul anterior.

▼M5

Articolul 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

(2)  Atunci când statele membre au dificultăți în înființarea comisiilor de degustători pe teritoriul lor, acestea pot solicita o comisie de degustători autorizată în alt stat membru.

(3)  Fiecare stat membru elaborează o listă cu comisiile de degustători înființate de organizații profesionale sau inter-filiale în conformitate cu condițiile prevăzute la alineatul (1) și asigură respectarea acestor condiții.

▼M19 —————

▼B

Articolul 6

(1)  Conținutul de ulei din resturile și alte reziduuri rezultate din extragerea uleiului cu codurile NC 2306 90 11 și 2306 90 19 se determină în conformitate cu metoda prezentată în anexa XV.

(2)  Conținutul de ulei la care se face referire în alineatul (1) se exprimă ca procent din greutatea de ulei raportată la greutatea materiei uscate.

▼M20

Articolul 7

Se aplică dispozițiile comunitare privind prezența contaminanților.

În ceea ce privește concentrația de solvenți halogenați, limitele pentru toate categoriile de ulei de măsline sunt următoarele:

▼B

Articolul 8

(1)  Statele membre comunică Comisiei măsurile luate pentru punerea în aplicare a prezentului regulament.

(2)  Statele membre transmit Comisiei, la începutul fiecărui semestru, un raport cu datele analitice obținute pe baza testelor efectuate în cursul semestrului precedent.

Comitetul de gestionare pentru uleiuri și grăsimi analizează aceste date în conformitate cu procedura stabilită la articolul 39 din Regulamentul nr. 136/66/CEE.

Articolul 9

Regulamentul (CEE) nr. 1058/77 se abrogă.

Articolul 10

(1)  Prezentul regulament intră în vigoare în a treia zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.

Cu toate acestea, metoda prezentată în anexa XII se aplică de la ►M1  1 noiembrie 1992 ◄ , cu excepția operațiunilor privind sistemul de intervenție.

▼M5

Metoda respectivă nu se aplică pentru uleiul de măsline virgin pregătit în vederea comercializării până la 1 noiembrie 1992.

▼B

(2)  Prezentul regulament nu se aplică uleiurilor de măsline și uleiurilor din resturi de măsline ambalate înainte de intrarea în vigoare a prezentului regulament și comercializate până la 31 octombrie 1992.

Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se aplică direct în toate statele membre.

ANEXE

Cuprins

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

▼M23

▼M23

ANEXA I

CARACTERISTICILE ULEIURILOR DE MĂSLINE

▼M20

ANEXA Ia

Prelevarea de probe de ulei de măsline sau de ulei din reziduuri de măsline livrate în ambalaje imediate de maximum 100 litri

Prezenta metodă de prelevare se aplică pentru livrările de ulei de măsline sau din reziduuri de măsline de maximum 125 000 litri, în ambalaje imediate de maximum 100 litri.

În cazul în care livrarea este mai mare de 125 000 litri, aceasta este împărțită în loturi de cantități mai mici sau egale cu 125 000. În cazul în care livrarea este mai mică de 125 000 litri, aceasta constituie un lot. Metoda se aplică atunci fiecărui lot.

În funcție de mărimea lotului, se stabilește numărul minim de probe primare, conform tabelului de la punctul 1.

Importanța probei primare se stabilește în funcție de capacitatea ambalajelor imediate, conform tabelului de la punctul 2.1.

Termenii „livrare”, „probă primară” și „probă de laborator” se interpretează în sensul definițiilor menționate în norma EN ISO 5555.

Prin „lot” se înțelege un ansamblu de unități de vânzare produse, fabricate și ambalate astfel încât uleiul conținut în fiecare din aceste unități de vânzare este considerat omogen din punct de vedere al tuturor caracteristicilor analitice.

1.   NUMĂRUL DE PROBE PRIMARE

Numărul minim de probe primare se stabilește în funcție de mărimea lotului conform tabelului următor:

Ambalajele imediate ale aceleiași probe trebuie să fie adiacente în lot.

În caz de neclaritate, statul membru mărește numărul de probe primare de prelevat.

2.   CONȚINUTUL UNEI PROBE PRIMARE

2.1.   Fiecare probă primară este alcătuită din:

2.2.   Probele primare va trebui păstrate în ambalajele imediate până în momentul analizelor. Apoi, după caz, uleiul din probele primare se împarte în trei probe de laborator în vederea efectuării:

2.3.   Ambalajele care constituie o probă primară se împart în conformitate cu procedurile prevăzute de legislațiile naționale.

3.   ANALIZE ȘI REZULTATE

▼M20

ANEXA Ib

ARBORELE DECIZIONAL PENTRU VERIFICAREA CONFORMITĂȚII UNEI PROBE DE ULEI DE MĂSLINE CU CATEGORIA DECLARATĂ

Analiza conformității uleiului de măsline sau din reziduuri de măsline cu categoria declarată se poate efectua:

Analizele referitoare la contaminanți, necesare pentru verificarea conformității cu normele Comunității Europene, se efectuează separat.

Arborele decizional se aplică tuturor categoriilor de uleiuri de măsline și din reziduuri de măsline. Acesta este alcătuit din tabele numerotate de la 1 la 11, care trebuie abordate în funcție de categoria declarată a uleiului respectiv, în conformitate cu ordinea prevăzută de tabelul general.

Pentru lectura tabelelor, de la cel general la tabelul 11:

Tabel general

Tabelul 1

Tabelul 2

Tabelul 3

Tabelul 4

Tabelul 5

Tabelul 6

Tabelul 7

Tabelul 8

Tabelul 9

Tabelul 10

Tabelul 11

Apendicele 1

Tabel de corespondență între anexele la prezentul regulament și analizele menționate în arborele decizional

Apendicele 2

Tabelul 1

Tabelul 2

Tabelul 3

Tabelul 4

Tabelul 7

Tabelul 8

Tabelul 11

▼B

ANEXA II

▼M21

DETERMINAREA ACIZILOR GRAȘI LIBERI, METODA LA RECE

▼B

1.   OBIECT

Determinarea acizilor grași liberi din uleiurile de măsline. Conținutul de acizi grași liberi se exprimă prin aciditatea calculată în mod convențional.

1.1.   Principiu

Se dizolvă o mostră într-un amestec de solvenți, apoi se titrează acizii grași liberi prezenți cu ajutorul unei soluții etanolice de hidroxid de potasiu.

1.2.   Reactivi

Toți reactivii trebuie să aibă o calitate analitică recunoscută, iar apa utilizată trebuie să fie distilată sau cu un grad de puritate echivalent.

1.3.   Aparatură

Materiale obișnuite de laborator, în special:

1.4.   Mod de lucru

1.5.   Exprimarea acidității în procente de acid oleic

Aciditatea, exprimată în procente de masă este egală cu:

în care:

Se consideră drept rezultat media aritmetică a ►M6  două calcule ◄ .

ANEXA III

DETERMINAREA INDICELUI DE PEROXID

1.   OBIECT

Prezenta normă descrie o metodă de determinare a indicelui de peroxid în uleiuri și materii grase.

2.   DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta normă se aplică uleiurilor și materiilor grase animale și vegetale.

3.   DEFINIȚIE

Indicele de peroxid reprezintă cantitatea de substanțe din mostră (exprimată în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram) care oxidează iodura de potasiu în condițiile de lucru descrise.

4.   PRINCIPIU

Mostra sub formă de soluție într-un amestec de acid acetic și cloroform se tratează cu o soluție de iodură de potasiu. Iodul eliberat se titrează cu o soluție de tiosulfat de sodiu.

5.   APARATURĂ

Echipamentele utilizate trebuie să fie lipsite de orice urmă de substanțe oxidante sau dezoxidante.

Nota bene: nu se gresează suprafețele din sticlă rodată.

6.   REACTIVI

7.   MOSTRA

Mostra trebuie să fie prelevată și păstrată la adăpost de lumină, conservată la rece și închisă în recipiente de sticlă umplute în întregime și închise ermetic cu dopuri de plută sau de sticlă rodată.

8.   MOD DE LUCRU

Testul trebuie să fie realizat la o lumină difuză (lumina zilei) sau artificială. Într-o lingură de sticlă (5.1) sau, la nevoie, într-un balon (5.2), se cântărește, cu o aproximare de 0,001 grame, una dintre masele de mostră menționate în tabelul următor, în funcție de indicele de peroxid prevăzut.

Se scoate dopul unui balon (5.2) și se introduce lingura de sticlă cu mostra. Se adaugă 10 ml de cloroform (6.1). Se dizolvă rapid mostra prin agitare. Se adaugă 15 ml de acid acetic (6.2), apoi 1 ml de soluție de iodură de potasiu (6.3). Se pune rapid dopul la loc, se agită timp de un minut și se lasă în repaus exact 5 minute, la adăpost de lumină și la o temperatură de la 15–25 °C.

Se adaugă aproximativ 75 ml de apă distilată. Se titrează iodul eliberat cu soluție de tiosulfat de sodiu (6.4) (soluție de 0,002 N, în cazul în care indicii prevăzuți sunt mai mici de 12, și de 0,001 N, în cazul în care sunt mai mari de 12) prin agitare puternică și prin folosirea soluției de amidon (6,5) ca indicator.

Se efectuează două analize pe aceeași mostră.

Simultan, se efectuează un test etalon. În cazul în care rezultatul acestuia din urmă este mai mare de 0,05 ml de soluție de tiosulfat de sodiu (6,4) 0,001 N, se înlocuiesc reactivii impuri.

9.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

Indicele de peroxid (IP), exprimat în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram, este dat de formula:

în care:

Se ia drept rezultat media aritmetică a celor două determinări.

▼M21

ANEXA IV

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CEARĂ CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1.   OBIECT

Metoda descrie un procedeu de determinare a conținutului de ceară din uleiurile de măsline. Tipurile de ceară sunt definite în funcție de numărul de atomi de carbon. Metoda poate fi folosită în special pentru a deosebi uleiul de măsline obținut prin presare de cel obținut prin extracție (ulei din resturi de măsline).

2.   PRINCIPIU

Materia grasă, la care s-a adăugat un standard intern adecvat, este fracționată prin cromatografie pe o coloană de silicagel hidratat; fracțiunea eluată prima în condițiile de testare (a cărei polaritate este mai mică decât cea a trigliceridelor) este recuperată, apoi analizată direct prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3.   APARATURĂ

4.   REACTIVI

5.   MOD DE LUCRU

5.1.   Pregătirea coloanei cromatografice

Se prepară o suspensie de 15 g de silicagel (4.1) în n-hexan (4.2) și se introduce pe coloană (3.2). Se lasă să se clarifice spontan și se definitivează clarificarea cu ajutorul unui agitator electric (3.5) pentru omogenizarea stratului de cromatografie. Se percolează 30 ml de n-hexan pentru a înlătura orice impurități. Se cântăresc cu exactitate cu ajutorul balanței (3.8) 500 mg din mostră în paharul Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se adaugă cantitatea adecvată de standard intern (4.5), în funcție de conținutul de ceară estimat.

Se adaugă, de exemplu, 0,1 mg de lauril arahidat în cazul uleiului de măsline și între 0,25 și 0,5 mg pentru uleiul din resturi de măsline. Se transferă mostra astfel preparată în coloana cromatografică cu ajutorul a două doze de câte 2 ml de n-hexan (4.2).

Se lasă să scadă nivelul solventului până la 1 mm deasupra marginii superioare a absorbantului, apoi se percolează o cantitate suplimentară de 70 ml de n-hexan, pentru a elimina n-alcanii prezenți în mod natural. Se începe eluarea cromatografică prin colectarea a 180 ml de amestec de n-hexan/eter etilic, în raport de 99:1, la un debit de aproximativ 15 picături la fiecare 10 secunde. Eluarea mostrei se efectuează la o temperatură ambiantă de 22 ± 4 °C.

Note:

Fracțiunea astfel obținută este uscată într-un evaporator rotativ (3.6) până la eliminarea aproape totală a solventului. Ultimii 2 ml de solvent se elimină cu ajutorul unui ușor curent de azot; se adaugă apoi 2-4 ml de n-heptan.

5.2.   Analiza prin cromatografie în fază gazoasă

5.2.1.   Operațiuni preliminare

Se instalează coloana în cromatograful în fază gazoasă (3.3), conectând extremitatea de intrare la sistemul coloanei și extremitatea de ieșire la detector. Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în faza gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului și a sistemului de înregistrare etc.).

În cazul în care coloana este folosită pentru prima dată, se recomandă ca aceasta să fie condiționată. Se trece un ușor flux de gaz prin coloană, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă. Se încălzește treptat până când se ajunge, după aproximativ 4 ore, la o temperatură de 350 °C. Se menține această temperatură timp de cel puțin două ore, apoi se reglează complexul la condițiile de funcționare [se reglează debitul de gaz, se aprinde flacăra, se conectează la aparatul de înregistrare electronic (3.3.4), se reglează temperatura camerei pentru coloană, detectorul etc.] și se înregistrează semnalul la o sensibilitate cel puțin de două ori mai mare decât cea prevăzută pentru efectuarea analizei. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf, de orice natură, și nu trebuie să prezinte abateri.

O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei; o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei.

5.2.2.   Alegerea condițiilor de funcționare

Condițiile de funcționare care trebuie respectate sunt, în general, următoarele:

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, astfel încât să se obțină o separare a tuturor tipurilor de ceară, o rezoluție convenabilă a valorilor de vârf (a se vedea figura) și un timp de retenție al standardului intern C32, care trebuie să fie de 18 ± 3 minute. Valoarea de vârf cea mai reprezentativă a cerii trebuie să se situeze la cel puțin 60 % din scara totală.

Parametrii de integrare ai valorilor de vârf trebuie să fie astfel impuși încât să se obțină o evaluare corectă a ariilor valorilor de vârf care sunt luate în considerare.

Notă: Având în vedere temperatura finală ridicată, se admite o variație pozitivă, care nu trebuie să depășească 10 % din scara totală.

5.3.   Efectuarea analizei

Se prelevează 1 μl de soluție cu microseringa de 10 μl; se trage înapoi pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul în complexul de injecție și după 1-2 secunde se injectează rapid; după aproximativ 5 secunde, acul se scoate lent.

Se procedează la înregistrare până la eluarea completă a cerii.

Linia de bază trebuie să corespundă întotdeauna condițiilor impuse.

5.4.   Identificarea valorilor de vârf

Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu amestecurile de ceară cu timpi de retenție cunoscuți, analizate în aceleași condiții.

Figura prezintă cromatograma cerii pentru un ulei de măsline virgin.

5.5.   Evaluare cantitativă

Cu ajutorul integratorului, se procedează la calculul ariilor valorilor de vârf corespunzătoare standardului intern și esterilor alifatici de la C40 la C46.

Se calculează conținutul de ceară al fiecărui ester, în mg/kg de materie grasă, după formula:

unde:

6.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se indică suma conținuturilor diferitelor tipuri de ceară de la C40 la C46 în mg/kg de substanță grasă (ppm).

Notă: Componentele care trebuie cuantificate se referă la valorile de vârf cu număr par de atomi de carbon, cuprinse între esterii C40 și C46, după modelul cromatogramei cerii uleiului de măsline, prezentate în figura următoare. Pentru a identifica esterul C46, în cazul în care apare de două ori, se recomandă analizarea fracțiunii de ceară a unui ulei din resturi de măsline, a cărei valoare de vârf C46, prezentă în cantitate majoritară, este ușor de identificat.

Rezultatele se exprimă cu o zecimală.

Figură

Cromatograma tipurilor de ceară ale unui ulei de măsline ( 5 )

Legendă:

Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat la condiții de funcționare normale, se injectează 1-3 μl de metan (sau propan). Se măsoară timpul în care gazul trece prin coloană, din momentul în care a fost injectat până când apare vârful (tM).

Viteza liniară în cm/sec se obține prin formula L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri, iar tM este timpul măsurat în secunde.

▼B

ANEXA V

DETERMINAREA COMPOZIȚIEI ȘI A CONȚINUTULUI DE STEROLI CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1.   OBIECT

Metoda descrie procedeul de determinare a conținutului de steroli, simpli și totali, al materiilor grase.

2.   PRINCIPIUL METODEI

Materia grasă, la care s-a adăugat α-colestanol ca etalon intern, este saponificată cu hidroxid de potasiu soluție în etanol, apoi se extrage nesaponificabilul cu eter etilic.

Fracțiunea sterolică se separă de extractul nesaponificabil prin cromatografie pe placă de silicagel bazic; sterolii recuperați din silicagel sunt transformați în trimetilsilileteri și analizați prin cromatografie în fază gazoasă în coloană capilară.

3.   APARATURĂ

4.   REACTIVI

5.   MOD DE LUCRU

6.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

APENDICE

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat în condiții de operare normale, se injectează 1–3 μl de metan (sau propan) și se cronometrează timpul folosit de gaz pentru a parcurge coloana, între momentul de injecție și cel de ieșire din valoarea de vârf (tM).

Viteza liniară în cm pe secundă este dată de L/tM, unde L este lungimea coloanei în cm și tM timpul cronometrat în secunde.

Figura 1

Cromatografie în fază gazoasă a fracțiunii sterolice a unui ulei de măsline brut

Figura 2

Cromatografie în fază gazoasă a fracțiunii sterolice a unui ulei de măsline rafinat

ANEXA VI

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE ERITRODIOL ȘI DE UVAOL

INTRODUCERE

Eritrodiolul (termen generic care desemnează în mod convențional ansamblul de dioli eritrodiol și uvaol) este un element constitutiv al nesaponificabilului care se găsește în anumite tipuri de materii grase. Dozarea sa poate să servească la verificarea prezenței uleiului de măsline de extracție, concentrația sa fiind net mai ridicată decât în celelalte uleiuri (uleiuri de măsline obținute prin presare, uleiuri de sâmburi de struguri).

1.   OBIECT

Metoda descrie procedeul de determinare a conținutului de eritrodiol din materiile grase.

2.   PRINCIPIUL METODEI

Substanța grasă este saponificată cu soluție de hidroxid de potasiu în etanol. Se extrage apoi nesaponificabilul cu eter etilic, purificat prin trecerea pe o coloană de alumină și fracționat prin cromatografie în strat subțire pe plăcile de silicagel. În acest mod, benzile de fracțiuni sterolică și eritrodiolică sunt izolate.

Sterolii și eritrodiolul recuperați pe placă sunt transformați în trimetilsilileteri și analizați prin cromatografie în fază gazoasă.

Rezultatul se exprimă în procente de eritrodiol în raport cu ansamblul eritrodioli + steroli.

3.   APARATURĂ

4.   REACTIVI

5.   MODUL DE LUCRU

5.1.   Prepararea nesaponificabilului

Se procedează conform indicațiilor de la punctul 5.1.2 din anexa V.

5.2.   Separarea eritrodiolului și sterolilor

5.3.   Prepararea trimetilsilileterilor

Se procedează conform indicațiilor de la punctul 5.3 din metoda descrisă în anexa V.

5.4.   Analiza prin cromatografie în fază gazoasă

Se procedează conform indicațiilor de la punctul 5.4 de la aceeași metodă. Analiza prin cromatografie în fază gazoasă trebuie să fie realizată în condiții care să permită respectarea cerințelor de analiză a sterolilor și de separare a TMSE, a eritrodiolului și a uvaolului.

După injectarea mostrei, se lasă hârtia să se deruleze până la eluarea completă a sterolilor prezenți, a eritrodiolului și a uvaolului. Se identifică apoi valorile de vârf (timpii de reținere relativi ai eritrodiolului și uvaolului, în raport cu β-sitosterolul, sunt de aproximativ 1,4, respectiv 1,55). Se calculează apoi ariile conform indicațiilor pentru steroli.

6.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

în care:

Rezultatul se exprimă cu o zecimală.

▼M21

ANEXA VII

DETERMINAREA PROCENTULUI DE MONOPALMITAT DE 2-GLICERIL

1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă descrie procedura analitică de determinare a procentului de acid palmitic în poziția 2 a trigliceridelor cu ajutorul evaluării monopalmitatului de 2-gliceril.

Prezenta metodă se aplică uleiurilor vegetale lichide la temperatură ambiantă (20 °C).

2.   PRINCIPIU

După preparare, mostra de ulei este supusă acțiunii lipazei pancreatice: o hidroliză parțială și specifică în pozițiile 1 și 3 ale moleculei de trigliceridă determină apariția monogliceridelor în poziția 2. Procentul de monopalmitat de 2-gliceril în fracțiunea de monogliceridă este determinat, după sililare, prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3.   APARATURĂ ȘI MATERIALE

4.   REACTIVI

5.   PROCEDURĂ

5.1.   Prepararea mostrei

5.2.   Hidroliză cu lipază pancreatică

5.3.   Prepararea derivaților silanizați și a cromatografiei în fază gazoasă

5.4.   Cromatografia în fază gazoasă

Condițiile de funcționare sunt următoarele:

5.4.1.   Identificarea valorilor de vârf

Monogliceridele individuale sunt identificate în funcție de timpii de retenție obținuți și în raport cu cei obținuți prin amestecurile standard de mopogliceride analizate în aceleași condiții.

5.4.2.   Evaluare cantitativă

Aria fiecărei valori de vârf se calculează cu ajutorul unui integrator electronic.

6.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

Procentul de monopalmitat de gliceril se calculează pe baza raportului dintre aria valorii de vârf corespunzătoare și suma ariilor valorilor de vârf ale tuturor monogliceridelor (a se vedea figura 2), după formula:

unde:

Rezultatul trebuie exprimat cu o zecimală.

7.   RAPORTUL ANALIZEI

Raportul analizei va trebui să precizeze:

Figura 1

Cromatogramă a produșilor de silanizare, obținuți prin acțiunea lipazei asupra unui ulei de măsline rafinat cu adaos de 20 % ulei esterificat (100 %)

[Legendă: „acides gras libres” = acizi grași liberi; „Huile d'olive raffinée + 20 % huile estérifiée” = ulei de măsline rafinat + 20 % ulei esterificat; „1-2 monopalmitoléine” = 1-2 monopalmitolein; „1-2 mono C18 insat” = unsaturated 1-2 mono C18]

Figura 2

Cromatogramă a unui:

A.

ulei de măsline neesterificat, după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta. După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %. Legendă: 1 = Acizi grași liberi 2 = Monogliceride 3 = Digliceride 4 = Trigliceride * = 2-monopalmitină ** = Trigliceridă C54

Cromatogramă a unui:

B.

ulei esterificat după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta. După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %. Legendă: 1 = Acizi grași liberi 2 = Monogliceride 3 = Digliceride 4 = Trigliceride * = 2-monopalmitină ** = Trigliceridă C54

8.   NOTE

Lipaze cu un nivel de activitate satisfăcător sunt disponibile în comerț. Acestea pot fi, de asemenea, preparate în laborator după cum urmează:

Se răcesc 5 kg de pancreas proaspăt de porc la 0 °C. Se elimină grăsimea solidă și țesutul conjunctiv din jur, apoi se triturează într-un malaxor până la obținerea unei paste fluide. Se agită această pastă într-un agitator cu 2,5 litri de acetonă anhidră timp de 4-6 ore, apoi se centrifughează. Se efectuează alte trei extracții de reziduu cu același volum de acetonă anhidră, apoi două extracții cu un amestec 1/1 (V/V) de acetonă și de eter dietilic și două extracții cu eter dietilic.

Se usucă reziduul sub vid timp de 48 ore pentru a obține o pudră stabilă, care se păstrează timp îndelungat în frigider și ferită de umiditate.

Se prepară o emulsie de ulei de măsline astfel:

Se agită timp de 10 minute într-un agitator adecvat un amestec compus din 165 ml de soluție de gumă arabică de 100 g/l, din 15 g de gheață pisată și 20 ml dintr-un ulei neutralizat în prealabil.

Într-un pahar de laborator de 50 ml se toarnă succesiv câte 10 ml din această emulsie, apoi 0,3 ml de soluție de colat de sodiu de 0,2 g/ml și 20 ml de apă distilată.

Se plasează paharul de laborator într-un termostat menținut la 37 °C; se introduc electrozii unui pH-metru și un agitator cu spirală.

Cu ajutorul unei biurete, se adaugă soluția de hidroxid de sodiu 0,1 N picătură cu picătură, până când pH-ul atinge valoarea de 8,3.

Se adaugă o cantitate suficientă de suspensie apoasă de lipază (0,1 g/ml de lipază). Din momentul în care pH-metrul indică un pH de 8,3, se declanșează cronometrul și se începe adăugarea soluției de hidroxid de sodiu picătură cu picătură cu viteza necesară pentru a menține constant pH-ul de 8,3. Se notează la fiecare minut volumul de soluție consumat.

Se raportează observațiile pe o diagramă ce indică pe abscisă timpii și pe ordonată mililitrii de soluție alcalină de 0,1 N consumați pentru menținerea pH-ului constant. Rezultatul obținut trebuie să fie un grafic liniar.

Activitatea lipazei, exprimată în unități lipazice pe mg, este calculată cu ajutorul formulei următoare:

unde:

Unitatea lipazică se definește ca fiind cantitatea de enzimă care produce 10 microechivalenți de acid pe minut.

▼M20 —————

▼B

ANEXA IX

ANALIZĂ SPECTROFOTOMETRICĂ

INTRODUCERE

Examinarea spectrofotometrică în ultraviolet poate furniza indicații privind calitatea unei materii grase, starea de conservare a acesteia și modificările datorate proceselor tehnologice.

Absorbțiile cu lungimi de undă prevăzute în metodă sunt datorate prezenței sistemelor de diene și triene conjugate. Valorile acestor absorbții sunt exprimate ca extincția specifică E1 % 1 cm (extincția unei soluții de substanță grasă de 1 % în solventul prescris, pentru o grosime de 1 % cm) notată în mod condițional cu K (denumit, de asemenea, coeficient de extincție).

1.   OBIECT

Metoda descrie procedeul executării examinării spectrofotometrice în ultraviolet a materiilor grase.

2.   PRINCIPIUL METODEI

Substanța grasă studiată se dizolvă în solventul necesar, apoi se determină extincția soluției la lungimea de undă prescrisă, în raport cu solventul pur. Se calculează extincțiile specifice pornind de la citirile spectrofotometrice.

3.   APARATURĂ

▼M6

▼B

4.   REACTIVI

5.   MOD DE LUCRU

6.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

APENDICE I

Prepararea aluminei și controlul activității acesteia

A.1.1.   Prepararea aluminei

Într-un recipient care se închide ermetic se pune alumina uscată în prealabil în cuptor la 380-400 °C timp de 3 ore, se adaugă apă distilată până la 5 ml pentru 100 g de alumină, se închide rapid recipientul, se agita de mai multe ori, apoi se lasă timp de cel puțin 12 ore înainte de folosire.

A.1.2   Controlul activității aluminei

Se prepară o coloană cromatografică cu 30 g de alumină. Se acționează conform descrierii de la alineatul (5).4. Se trece un amestec constituit din:

prin coloană.

În cazul în care, după trecerea prin coloană, amestecul prezintă o extincție specifică la 268 nm mai mare de 0,11, alumina este acceptabilă, în caz contrar se majorează coeficienții de hidratare.

APENDICE II

Etalonarea spectrofotometrului

ANEXA X A

ANALIZĂ PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ A ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI

1.   DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă furnizează directive generale pentru determinarea prin cromatografie în fază gazoasă a compoziției calitative și cantitative a unui amestec de esteri metilici ai acizilor grași obținut conform metodei vizate la anexa X B.

Metoda nu se aplică acizilor grași polimerizați.

2.   REACTIVI

2.1.   Gaz vector

Gaz inert (azot, heliu, argon, hidrogen etc.) uscat cu grijă și conținând mai puțin de 10 mg pe kilogram de oxigen.

Nota 1: Hidrogenul care se utilizează ca gaz vector numai cu coloanele capilare permite dublarea vitezei de analiză, dar prezintă pericole. Cu toate acestea, există dispozitive de securitate.

2.2.   Gaze auxiliare

2.3.   Produse de etalonare

Amestec de esteri metilici de acizi grași puri sau esteri metilici ai unei substanțe grase, cu compoziție cunoscută, dacă este posibil apropiată de cea a substanței grase de analizat.

Se iau toate prevederile pentru a se evita oxidarea acizilor grași polinesaturați.

3.   APARATURA

Indicațiile se referă la aparatele obișnuite de cromatografie în fază gazoasă care utilizează coloane pline și/sau capilare și un detector cu ionizare cu flacără. Orice aparatură cu aceeași eficacitate și aceeași rezoluție ca cea definită la punctul 5.1.2 este adecvată.

3.1.   Aparat de cromatografie în fază gazoasă

Aparatul de cromatografie în fază gazoasă trebuie să cuprindă elementele următoare.

3.1.1.   Dispozitiv de injecție

Se utilizează un dispozitiv de injecție:

Nota 2: În absența substanței grase care conține acizi grași cu mai puțin de 16 atomi de carbon, se poate folosi un injector cu ac mobil.

3.1.2.   Cuptor

Cuptorul trebuie să fie în măsură să aducă coloana la o temperatură de minimum 260 °C și să mențină temperatura aleasă în limita a 1 °C, cu o coloană plină, și în limita a 0,1 °C, cu o coloană capilară. Această ultimă caracteristică este importantă îndeosebi atunci când se utilizează un tub de siliciu topit.

Utilizarea unui aparat echipat cu un programator de temperatură este recomandată în toate cazurile, în special în prezența acizilor grași cu mai puțin de 16 atomi de carbon.

3.1.3.   Coloană plină

3.1.4.   Coloana capilară

3.2.   Seringa

Seringa trebuie să aibă o capacitate de maximum 10 ml și să fie gradată la 0,1 ml.

3.3.   Aparatul de înregistrare

Când curba înregistrată este utilizată pentru a calcula compoziția amestecului analizat, aparatul de înregistrare trebuie să fie un aparat electronic de mare precizie, compatibil cu aparatura utilizată, și cu următoarele caracteristici:

3.4.   Integrator sau calculator (facultativ)

Folosirea unui integrator electronic sau a unui calculator permite un calcul rapid și precis. Acesta trebuie să furnizeze un răspuns liniar, să prezinte o sensibilitate suficientă, iar corecția deviației liniei de bază trebuie să fie satisfăcătoare.

4.   MODUL DE LUCRU

Detaliile privind modul de lucru de la punctele 4.1–4.3. se referă la folosirea unui detector cu ionizarea cu flacără.

Ca variantă, se poate utiliza un aparat de cromatografie în fază gazoasă cu un detector cu conductibilitate termică (catarometru). Condițiile de operare trebuie modificate conform descrierii de la punctul 6.

4.1.   Condițiile de testare

4.2.   Mostră pentru testare

Cu ajutorul seringii (4.2), se prelevează 0,1–2 μl din soluția de esteri metilici obținută conform metodei descrise în anexa X „B” și se injectează în coloană.

În cazul esterilor fără solvenți, se prepară o soluție cu aproximativ 100 mg pe mililitru în heptanul pentru cromatografie în fază gazoasă și se injectează 0,1–1 μl din această soluție.

Pentru cercetarea constituenților prezenți în starea de urme, această mostră pentru test va putea fi mărită (până la zece ori).

4.3.   Analiza

În cazurile obișnuite, se operează în condițiile descrise la 5.1.1.

Totuși, este posibil să se opereze cu o temperatură de coloană mai scăzută, în cazul în care este necesară dozarea acizilor grași al căror număr de atomi de carbon este mai mic de 12, sau mai mare, în cazul în care este necesară dozarea acizilor grași al căror număr de atomi de carbon este mai mare de 20. Eventual, este posibilă operarea cu o temperatură programată în cele două cazuri. De exemplu, dacă mostra conține esteri metilici de acizi grași cu mai puțin de 12 atomi de carbon, se injectează mostra la 100 °C (sau la 50-60 °C dacă acidul butiric este prezent) și se programează imediat la un debit de la 4–8 °C pe minut până la temperatura optimă. În anumite cazuri, cele două procedee pot fi combinate.

După perioada de programare a temperaturii, se continuă eluarea la temperatură izotermă până la eluarea tuturor constituanților. În cazul în care aparatul nu poate funcționa la temperatura programată, se operează la cele două temperaturi stabilite între 100 și 195 °C.

Dacă este necesar, se recomandă o analiză a celor două faze fixe de polarități diferite pentru a se verifica absența valorilor de vârf mascate, de exemplu în cazul prezenței simultane a C18:3 și C20:0 sau a C18:3 și C18:2 conjugate.

4.4.   Pregătirea cromatogramei de referință și a curbelor de referință

Se analizează amestecul etalon (a se vedea punctul 2.3), în condiții de operare identice cu cele ale testului, și se determină timpii de retenție sau distanțele de retenție pentru acizii grași constitutivi. Se trasează pe hârtie semilogaritmică, pentru fiecare rată de nesaturare, curbele care dau logaritmul timpului de retenție sau al distanței de retenție în funcție de numărul atomilor de carbon; în condiții izoterme și pentru esteri cu lanț drept și o rată de nesaturare fixă, aceste curbe trebuie să fie drepte. Aceste drepte trebuie să fie practic paralele.

Se evită condițiile de operare care favorizează existența „valorilor de vârf mascate”, adică doi constituenți nu pot fi separați în urma unei rezoluții insuficiente.

5.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

5.1.   Analiza cantitativă

Pentru test, se identifică valorile de vârf ale metil esterului prin raportarea la curbele preparate la punctul 4.4 prin interpolare.

5.2.   Analiza cantitativă

5.2.1.   Determinarea compoziției

Se utilizează metoda de standardizare internă (în afara excepțiilor), adică se admite că totalitatea constituenților prezenți în mostră este reprezentată pe cromatogramă, prin urmare că suma ariilor valorilor de vârf reprezintă 100 % din constituenți (eluare totală).

În cazul în care aparatura include un integrator, se utilizează cifrele furnizate de acesta. În caz contrar, se determină aria fiecărei valori de vârf prin multiplicarea înălțimii vârfului cu lățimea acestuia la jumătate din înălțime, ținând seama de diversele atenuări utilizate eventual în cursul înregistrării.

5.2.2.   Mod de calcul

▼M2

6.   CAZ SPECIAL – DETERMINAREA IZOMERILOR TRANS

Este posibil să se determine conținutul izomerilor trans în acizii grași cu un număr de atomi de carbon cuprins între 10 și 24 separând esterii metilici prin cromatografia în fază gazoasă cu coloane capilare care au o polaritate specifică.

▼M21

▼M2

6.4.

Identificarea diverșilor esteri metilici se efectuează pe baza timpilor de retenție care sunt comparați cu timpii de retenție pentru mixturile de referință (în conformitate cu punctul 2.3). Esterii acizilor grași de tip trans sunt supuși procesului de eluare înaintea izomerilor cis corespunzători. Figura 2 conține un exemplu de cromatogramă. Figura 2 Cromatogramă în fază gazoasă a izomerilor trans ai acidului gras prin utilizarea coloanei capilare. 18:2 CC solvente 18:1 C 16:0 18:0 18:1 W7 C 18:3 CCT 18:3 CTC 18:3 TCC 18:3 TCT 18:2 TT 18:2 CT 18:2 TC 18:1 T 18:3 CCC 16: 1 C

▼B

►M2  7. ◄    CAZUL SPECIAL AL UTILIZĂRII UNUI DETECTOR CU CONDUCTIBILITATE TERMICĂ (CATAROMETRU)

Pentru determinarea compoziției calitative și cantitative a unui amestec de esteri metilici de acizi grași se poate utiliza un aparat de cromatografie în fază gazoasă cu un detector cu conductibilitate termică (catarometru). În acest caz, condițiile specificate la punctele 3 și 4 trebuie să fie modificate conform indicațiilor din tabelul 3.

Pentru analiza cantitativă, se utilizează factorii de corecție definiți la 5.2.2.2.

►M2  8. ◄    PROCESUL-VERBAL DE TESTARE

Procesul-verbal de testare trebuie să indice metodele utilizate pentru prepararea esterilor metilici și pentru analiza prin cromatografie în fază gazoasă, precum și rezultatele obținute. În plus, trebuie să se menționeze toate detaliile de operare necuprinse în prezenta normă internațională sau facultative, precum și incidentele eventuale care au putut influența rezultatele.

Procesul-verbal de testare trebuie să ofere toate informațiile necesare identificării complete a mostrei.

▼M19

ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A : Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B : Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for triglyceride analysis by HPLC, if necessary.

METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS

1.   Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

1.1.   Purpose

This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-esterified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.

1.2.   Principle

Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potassium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place (title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).

1.3.   Reagents

Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.

Heptane, chromatographic quality.

Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.

1.4.   Apparatus

Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.

Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml

1.5.   Procedure

In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than 12 hours is not recommended.

2.   Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium

2.1.   Purpose

This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of more than 3,3 %.

2.2.   Principle

Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).

2.3.   Reagents

2.4.   Apparatus

2.5.   Procedure

Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.

Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.

Caution: Methylation by method B must be done under a hood.

2.6.   Alternatives to methylation Method B

2.6.1.   Method C

2.6.1.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydrochloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.

2.6.1.2.   Apparatus

2.6.1.3.   Reagents

Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).

Hexane, chromatographic quality.

Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulphuric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted funnel with the rim just touching the surface of the liquid. Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.

2.6.1.4.   Procedure

2.6.2.   Method D

2.6.2.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.

2.6.2.2.   Apparatus

2.6.2.3.   Reagents

2.6.2.4.   Procedure

Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.

Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath (Note 2).

Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.

Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.

To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit the temperature of the water bath to 90 °C.

3.   Precision parameters

The statistical evaluation of the precision of methods A and B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.

RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

1.   Procedure

The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyanopropylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).

Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.

2.   Calculations

2.2.

For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak corresponding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calculation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17). The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out according to the formula: Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromatographic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.

▼B

ANEXA XI

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE SOLVENȚI HALOGENAȚI VOLATILI ÎN ULEIUL DE MĂSLINE

1.   PRINCIPIU

Analiză prin cromatografie în fază gazoasă cu tehnica spațiului de cap (tehnica head space).

2.   APARATURĂ

3.   REACTIVI

Standard: solvenți halogenați volatili cu un grad de puritate adecvat utilizării cromatografiei în fază gazoasă.

4.   PROCEDURA DE ANALIZĂ

▼M22

ANEXA XII

METODA CONSILIULUI OLEICOL INTERNAȚIONAL PENTRU EVALUAREA ORGANOLEPTICĂ A ULEIURILOR DE MĂSLINE VIRGINE

1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă se bazează pe Decizia nr. DEC-21/95-V/2007 din 16 noiembrie 2007 cu privire la metoda revizuită pentru evaluarea organoleptică a uleiului de măsline virgin adoptată de Consiliul Oleicol Internațional. Aceasta vizează stabilirea procedurii pentru evaluarea caracteristicilor organoleptice ale uleiurilor de măsline virgine în înțelesul punctului 1 din anexa XVI la Regulamentul (CE) nr. 1234/2007 și determinarea metodei de clasare a uleiurilor pe baza acestor caracteristici. Metoda conține și indicații pentru etichetarea opțională.

Metoda prezentată nu se aplică decât uleiurilor de măsline virgine și clasificării sau etichetării acestora în funcție de intensitatea defectelor percepute, a gustului fructat și a altor atribute pozitive, determinată de un grup de degustători selecționați, formați și testați, constituiți într-o comisie.

2.   GENERALITĂȚI

Pentru vocabularul general de bază, sala de degustare, paharul de degustare a uleiurilor și orice altă problemă legată de prezenta metodă, se recomandă respectarea dispozițiilor Consiliului Oleicol Internațional, în special Decizia nr. DEC-21/95-V/2007 din 16 noiembrie 2007 privind metoda revizuită pentru evaluarea organoleptică a uleiului de măsline virgin.

3.   VOCABULAR SPECIFIC

3.1.   Atribute pozitive

ansamblul senzațiilor olfactive caracteristice ale uleiului, în funcție de soiul măslinelor, provenind de la fructe sănătoase și proaspete, verzi sau coapte, senzații percepute direct și/sau retronazal.

Atributul fructat este calificat drept verde atunci când senzațiile olfactive le amintesc pe cele ale fructelor verzi, caracteristice uleiului provenind de la fructe verzi.

Atributul fructat este calificat drept copt atunci când senzațiile olfactive le amintesc pe cele ale fructelor coapte, caracteristice uleiului provenind de la fructe verzi și coapte.

Amar : gust elementar caracteristic al uleiului obținut din măsline verzi sau în stadiul de coacere, perceput de papilele caliciforme care formează V-ul lingual.

Picant : senzație tactilă de pișcătură, caracteristică uleiurilor produse la începutul sezonului, în principal pe bază de măsline încă verzi, senzație care poate fi percepută în toată cavitatea bucală, în special în gât.

3.2.   Atribute negative

Stătut/de drojdie : aromă caracteristică uleiului extras din măsline strânse sau depozitate în condiții de natură să determine un stadiu avansat de fermentare anaerobă sau uleiului rămas în contact cu depunerile rezultate în urma decantării, care au suferit, de asemenea, un proces de fermentare anaerobă în containere și cuve.

Mucegăit-umed : aromă caracteristică uleiului obținut din măsline atacate de mucegaiuri și drojdii, ca urmare a unei depozitări a fructelor timp de mai multe zile în condiții de umiditate.

De vin oțetit/Acid-acru : aromă caracteristică a anumitor uleiuri care amintește de vin sau de oțet. Această aromă se datorează în principal unui proces de fermentare aerobă a măslinelor sau a resturilor de pastă de măsline de pe rogojini care nu au fost probabil spălate corespunzător, ceea ce a condus la formarea acidului acetic, a acetatului de etil și a etanolului.

Metalic : aromă care amintește de metale. Aceasta este caracteristică uleiului care a rămas în contact îndelungat cu suprafețe metalice, pe durata procesului de măcinare, de malaxare, de presare sau de stocare.

Rânced : aromă a uleiurilor care au fost supuse unui proces intens de oxidare.

Copt sau ars : aromă caracteristică a uleiurilor, care provine din încălzirea excesivă și/sau prelungită în cursul obținerii acestora și, în special, în timpul malaxării termice a pastei, dacă aceasta se realizează în condiții termice necorespunzătoare.

De fân-lemnos : aromă caracteristică anumitor uleiuri care provin de la măsline uscate.

Grosier : senzație bucotactilă densă și păstoasă produsă de anumite uleiuri vechi.

De lubrifianți : aromă a uleiului care amintește de motorină, de grăsime sau de uleiul mineral.

De ape de vegetație : aromă dobândită de ulei în urma unui contact prelungit cu apele de vegetație care au suferit procese de fermentare.

De saramură : aroma uleiului obținut din măsline conservate în saramură.

Rogoz : aromă caracteristică uleiului obținut din măsline presate între rogojini împletite din rogoz nou. Aceasta poate fi diferită în funcție de materialul folosit la fabricarea rogojinilor, și anume rogoz verde sau rogoz uscat.

De pământ : aroma uleiului obținut din măsline culese cu pământ sau măsline cu noroi, care nu au fost spălate.

Mâncat de viermi : aroma uleiului provenit din măsline care au fost supuse unui atac puternic al larvelor muștei măslinului (Bactrocera Oleae).

De castravete : aroma uleiului care se produce în urma unei condiționări ermetice prelungite în mod excesiv, în special în recipiente de tinichea, și care este atribuită formării de 2-6 nonadienal.

De lemn umed : aromă caracteristică uleiurilor extrase din măsline care au făcut obiectul unui proces de înghețare înaintea culesului.

3.3.   Terminologie opțională în scopul etichetării

La cerere, șeful comisiei poate atesta faptul că uleiurile evaluate respectă definițiile și intervalele corespunzătoare expresiilor și adjectivelor următoare în funcție de intensitatea și de percepția atributelor:

4.   COMISIA

Comisia este compusă dintr-un șef de comisie și din opt până la doisprezece degustători.

Șeful comisiei trebuie să fi primit o formare solidă și trebuie să fie expert în materie de diferite tipuri de ulei. Acesta este responsabil de comisie, de organizarea și funcționarea acesteia, de pregătirea, codificarea și prezentarea mostrelor către degustători, precum și de colectarea și procesarea datelor.

Șeful comisiei selecționează degustătorii, le supraveghează formarea și le controlează performanțele pentru a se asigura că aceștia păstrează un nivel de aptitudini adecvat.

Degustătorii pentru controlul organoleptic al uleiului de măsline trebuie să fie aleși și formați în funcție de capacitatea lor de a face distincția între mostre similare, conform ghidului Consiliului Oleicol Internațional pentru selectarea, formarea și controlul degustătorilor calificați de uleiuri de măsline virgine.

Comisiile trebuie să se angajeze să participe la evaluări organoleptice prevăzute pe plan național, comunitar sau internațional pentru controlul periodic și pentru armonizarea criteriilor de percepție. Printre altele, în cazul comisiilor autorizate în conformitate cu dispozițiile articolului 4 alineatul (1) din prezentul regulament, acestea trebuie să furnizeze anual statului membru în cauză toate informațiile cu privire la compoziția lor și la numărul de evaluări realizate în calitate de comisie autorizată.

5.   PROCEDURĂ PENTRU EVALUAREA ORGANOLEPTICĂ ȘI CLASIFICARE

5.1.   Utilizarea foii de profil de către degustător

Foaia de profil care trebuie utilizată de către degustător se găsește în apendicele A.

Fiecare degustător care face parte din comisie trebuie să miroasă, apoi să deguste uleiul supus examinării. Trebuie apoi să reprezinte intensitatea la care percepe fiecare dintre atributele negative și pozitive ( 6 ), pe scara de 10 cm de pe foaia de profil pe care o are la dispoziție. În cazul percepției caracterului verde sau copt al atributului fructat, degustătorul bifează căsuța corespunzătoare de pe foaia de profil.

În cazul în care sunt percepute atribute negative neindicate pe foaia de profil, acestea trebuie să fie indicate la rubrica „altele”, folosindu-se termenul sau termenii care să le descrie cu cea mai mare precizie dintre cei definiți mai sus.

5.2.   Utilizarea datelor de către șeful comisiei

Șeful comisiei trebuie să strângă foile de profil completate de fiecare dintre degustători; trebuie să controleze intensitățile desemnate pentru diferitele atribute; în eventualitatea constatării unei anomalii, va solicita degustătorului să-și revizuiască foaia de profil și, dacă este cazul, să repete proba.

Șeful comisiei poate aduna datele de la fiecare degustător într-un software, în conformitate cu metoda de calcul statistic al medianei care se găsește în apendicele B. Inserarea datelor pentru o mostră se realizează cu ajutorul unei matrice compuse din 9 coloane care corespund celor 9 atribute senzoriale și dintr-un număr de rânduri care corespunde numărului de degustători din comisie.

Atunci când un atribut negativ perceput de cel puțin 50 % din comisie se înscrie la rubrica „altele”, se va calcula mediana acestui defect, iar uleiul se va clasifica în consecință.

Șeful comisiei nu poate atesta faptul că uleiul evaluat îndeplinește condițiile menționate la punctul 3.3.a. în ceea ce privește termenii verde și copt decât atunci când cel puțin 50 % din comisie a semnalat perceperea caracterului verde sau copt al atributului fructat.

În cazul analizelor efectuate în cadrul controalelor de conformitate, se realizează o probă. În cazul contraanalizelor, șeful comisiei trebuie să procedeze la efectuarea analizei în dublu. În cazul analizelor dirimante, evaluarea trebuie efectuată în triplu. În aceste cazuri, mediana atributelor se va calcula pe baza valorii medii a medianelor. Toate repetările acestor analize trebuie să fie realizate în reprize diferite.

5.3.   Clasificarea uleiurilor

Uleiul este clasificat în categoriile de mai jos, în funcție de mediana defectelor și de mediana atributului fructat. Mediana defectelor se definește ca mediana defectului perceput cu cea mai mare intensitate. Mediana defectelor și mediana atributului fructat se exprimă cu o singură zecimală, iar valoarea coeficientului de variație robust care le definește va trebui să fie mai mică sau egală cu 20 %.

Clasificarea uleiului se efectuează prin compararea valorilor medianei defectelor și medianei atributului fructat cu intervalele de referință prezentate în cele ce urmează. Întrucât limitele acestor intervale s-au stabilit ținându-se cont de eroarea metodei, acestea sunt considerate drept absolute. Programele software permit o clasificare vizualizată pe un tabel de date statistice sau prin metoda grafică:

5.4.   Caz special

Atunci când mediana unui alt atribut pozitiv decât atributul fructat este mai mare de 5,0, șeful comisiei va semnala acest fapt pe certificatul de analiză al uleiului.

Apendice A

Foaie de profil a uleiului de măsline virgin

Apendice B

METODA DE CALCUL A MEDIANEI ȘI A INTERVALELOR DE ÎNCREDERE

Mediana

Mediana se definește ca numărul real Xm caracterizat de faptul că probabilitatea (P) ca valorile distribuției (X) să fie inferioare acestui număr (Xm) este mai mică sau egală cu 0,5 și că, simultan, probabilitatea (P) ca valorile distribuției (X) să fie inferioare sau egale cu Xm este mai mare sau egală cu 0,5. O altă definiție consideră mediana ca fiind a 50-a percentilă a unei distribuții de numere ordonate în ordine crescătoare. Mai simplu, mediana reprezintă valoarea centrală a unei serii ordonate de numere impare sau media a două valori centrale ale unei serii ordonate de numere pare.

Abatere standard robustă

Pentru obținerea unei estimări fiabile a variabilității care se produce în jurul medianei, trebuie să se recurgă la estimarea abaterii standard robuste după metoda Stuart și Kendall. Formula următoare indică abaterea standard asimptotică, adică estimarea robustă a variabilității datelor luate în considerare, în care N este numărul de observații și IQR este intervalul interquartil, care înglobează exact 50 % din cazurile oricărei distribuții de probabilitate.

Calculul intervalului interquartil se efectuează calculând magnitudinea abaterii dintre a 75-a și a 25-a percentilă.

IQR = a 75-a percentilă – a 25-a percentilă

Percentila este valoarea Xpc caracterizată de faptul că probabilitatea (P) ca valorile distribuției să fie inferioare numărului Xpc este mai mică sau egală cu o sutime determinată și că, simultan, probabilitatea (P) ca valorile distribuției să fie inferioare sau egale cu Xpc este mai mare sau egală cu respectiva sutime. Sutimea indică fracțiunea de distribuție reținută. În cazul medianei, aceasta este egală cu 50/100.

În practică, percentila este valoarea de distribuție care corespunde unei arii determinate trasate dintr-o curbă de distribuție sau de densitate. De exemplu, a 25-a percentilă reprezintă valoarea de distribuție care corespunde unei arii egale cu 0,25 sau 25/100.

Coeficient de variație robust în %

CVr% reprezintă un număr pur, și anume fără dimensiune, care indică procentajul de variabilitate al seriei de numere analizate. Din acest motiv, coeficientul este foarte util pentru verificarea fiabilității membrilor comisiei.

Intervale de încredere la 95 % pe mediană

Intervalele de încredere la 95 % (valoarea erorii de tip I egale cu 0,05 sau 5 %) reprezintă intervalul în care valoarea medianei ar putea varia în ipoteza în care ar fi posibilă repetarea experienței de un număr infinit de ori. În practică, acest interval indică intervalul de variabilitate al probei în condițiile de operare reținute, dacă se pleacă de la ipoteza că proba ar putea fi repetată de mai multe ori. Intervalul ajută la evaluarea fiabilității probei, ca și în cazul CVr%.

ICsup = Me + (c.S*)

ICinf = Me - (c.S*),

unde c este egal cu 1,96, în cazul intervalului de încredere de 0,95.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

ANEXA XV

1.   CONȚINUTUL DE ULEI AL RESTURILOR DE MĂSLINE

1.1.   Material

1.2.   Reactiv

n-hexan tehnic al cărui reziduu în urma evaporării complete trebuie să fie mai mic de 0,002 g pentru 100 de ml.

2.   MOD DE LUCRU

2.1.   Prepararea mostrei

Se sfărâmă mostra pentru laborator, dacă este necesar, în concasorul mecanic bine curățat în prealabil cu scopul de a-l mărunți în particule ce pot trece prin sită.

Se folosește aproximativ a douăzecea parte din mostră pentru a finaliza curățarea concasorului, se aruncă mostra măcinată, se macină restul, se colectează, se amestecă cu grijă și se analizează imediat.

2.2.   Mostra

Se cântăresc, cu o precizie de 0,01 grame, după încheierea concasării, aproximativ 10 g de mostră pentru test.

2.3.   Prepararea cartușului de extracție

Se plasează mostra în cartuș și se astupă cu tamponul de vată hidrofilă. În cazul în care se folosește hârtie de filtru, se ambalează mostra măcinată în această hârtie.

2.4.   Uscarea prealabilă

În cazul în care resturile sunt foarte umede (conținutul de apă și de materii volatile este mai mare de 10 %), se efectuează o uscare prealabilă prin introducerea, pentru o perioadă de timp suficientă, a cartușului umplut (sau a hârtiei de filtru) în etuva încălzită la maximum 80 °C, pentru a reduce conținutul de apă și de materii volatile la mai puțin de 10 %.

2.5.   Prepararea balonului

Se cântărește, cu o precizie de 1 miligram, balonul ce conține 1 sau 2 granule de piatră ponce, uscat în prealabil în etuvă la 103 °C ± 2 °C, apoi se răcește timp de cel puțin o oră într-un exsicator.

2.6.   Prima extracție

Se pune în aparatul de extracție cartușul (sau hârtia de filtru) ce conține mostra. Se toarnă în balon cantitatea necesară de hexan. Se adaptează balonul la aparatul de extracție și se plasează totul pe baia cu încălzire electrică. Încălzirea se efectuează în așa fel încât debitul refluxului să fie de cel puțin trei picături pe secundă (fierbere moderată, fără clocote). După 4 ore de extracție, se lasă să se răcească. Se scoate cartușul aparatului de extracție și se plasează într-un curent de aer astfel încât să se elimine cea mai mare parte a solventului impregnat.

2.7.   A doua extracție

Se golește cartușul în microconcasor și se concasează cât mai fin posibil. Se plasează din nou, cantitativ, amestecul în cartuș, și acesta se pune în aparatul de extracție.

Se începe din nou extracția timp de încă două ore folosindu-se același balon ce conține prima extracție.

Soluția obținută în balonul de extracție trebuie să fie limpede. În caz contrar, aceasta se filtrează printr-o hârtie de filtru, spălându-se de mai multe ori primul balon și hârtia de filtru cu hexan. Se colectează filtratul și solventul de spălare într-un al doilea balon, uscat în prealabil și tarat cu o precizie de 1 miligram.

2.8.   Eliminarea solventului și cântărirea extractului

Se înlătură, prin distilare pe baia cu încălzire electrică, cea mai mare parte a solventului. Se elimină ultimele urme de solvent prin încălzirea balonului în etuvă la 103 °C ± 2 °C timp de 20 de minute. Se facilitează această eliminare fie prin insuflarea de aer, din când în când, sau, de preferință, a unui gaz inert, fie operând sub presiune redusă.

Se lasă să se răcească balonul într-un exsicator timp de cel puțin o oră, și se cântărește cu o precizie de 1 mg.

Se încălzește din nou 10 minute în aceleași condiții, se răcește în exsicator și se cântărește.

Diferența dintre rezultatele celor două cântăriri trebuie să fie mai mică sau egală cu 10 mg. În caz contrar, se încălzește din nou timp de câte 10 minute, perioade urmate de răciri și de cântăriri, până când diferența de masă este cel mult egală cu 10 mg. Se reține ultima cântărire a balonului.

Se efectuează două determinări pe aceeași mostră pentru testare.

3.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

3.1.   Mod de calcul și formula

3.2.   Repetabilitatea

Diferența dintre rezultatele celor două determinări, efectuate simultan sau rapid una după alta de către același analist, nu trebuie să fie mai mare de 0,2 g de extract cu hexan pentru 100 g de mostră.

În caz contrar, se repetă analiza pe alte două mostre pentru test. În cazul în care și de această dată diferența depășește 0,2 grame, se ia ca rezultat media aritmetică a celor patru determinări efectuate.

ANEXA XVI

DETERMINAREA INDICELUI DE IOD

1.   OBIECT

Prezenta normă internațională descrie o metodă destinată determinării indicele de iod în substanțele grase de origine animală și vegetală.

2.   DEFINIȚIE

În sensul prezentei norme internaționale, se aplică următoarele definiții.

3.   PRINCIPIU

Punerea în soluție a mostrei într-un solvent și adăugarea reactivului Wijs. După un interval de timp determinat, adăugarea unei soluții de iodură de potasiu și de apă; titrarea iodului eliberat cu ajutorul unei soluții de tiosulfat de sodiu.

4.   REACTIVI

Toți reactivii sunt de calitate analitică recunoscută.

5.   APARATURĂ

Materialul de laborator obișnuit, în special:

6.   PREPARAREA MOSTREI DE ANALIZAT

Mostra omogenizată este uscată pe sulfat de sodiu și filtrată.

7.   MOD DE LUCRU

8.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

Indicele de iod este egal cu:

în care:

c = valoarea numerică a concentrației exacte, în moli pe litru, a soluției etalon de tiosulfat de sodiu volumetric (4.3) utilizate;

V1 = valoarea numerică a volumului, în ml, a soluției etalon de tiosulfat de sodiu volumetric (4.3) utilizate pentru mostra etalon;

V2 = valoarea numerică a volumului, în ml, a soluției etalon de tiosulfat de sodiu volumetric (4.3) utilizate pentru determinare;

m = valoarea numerică a masei, în grame, a mostrei (7.1).

Se ia ca rezultat media aritmetică a celor două determinări, cu condiția să fie îndeplinit criteriul repetabilității.

▼M11

ANEXA XVII

METODĂ DE DETERMINARE A CONȚINUTULUI DE STIGMASTADIENE DIN ULEIURILE VEGETALE

1.   OBIECT

Determinarea conținutului de stigmastadiene din uleiurile vegetale conținând concentrații scăzute din aceste hidrocarburi, în special în uleiul virgin de măsline și în uleiul brut din resturi de măsline.

2.   DOMENIU DE APLICARE

Metoda se utilizează pentru toate uleiurile vegetale, dar măsurătorile sunt fiabile doar în cazul în care conținutul de hidrocarburi este cuprins între 0,01 și 4,0 mg/kg. Această metodă este adecvată în special pentru detectarea prezenței uleiurilor vegetale rafinate (de măsline, resturi de măsline, floarea soarelui, palmier etc.) în ulei virgin de măsline, deoarece uleiurile rafinate conțin stigmastadiene, iar uleiurile virgine nu conțin.

3.   PRINCIPIU

Izolarea substanței nesaponificabile. Separarea fracțiunii de hidrocarburi steroidale prin cromatografie în coloană pe silicagel și analiza prin cromatografie în fază gazoasă în coloană capilară.

4.   APARATURĂ

5.   REACTIVI

Toți reactivii trebuie să fie puri, în lipsa unor indicații contrare. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă cu o puritate cel puțin echivalentă.

6.   MOD DE LUCRU

6.1.   Prepararea substanței nesaponificabile

6.2.   Separarea fracțiunii de hidrocarbură steroidală

6.3.   Cromatografie în fază gazoasă

Figura 1

Cromatograme (cromatografii în fază gazoasă) obținute prin analiza eșantioanelor de ulei de măsline pe o coloană capilară cu silice topită (diametru intern de 0,25 mm și lungime de 25 m), acoperită cu fenilmetilsilicon 5 %, cu o grosime a peliculei de 0,25 μm.

Figura 2

Cromatogramă în fază gazoasă obținută dintr-un eșantion de ulei de măsline rafinat analizat pe o coloană DB-5 pe care figurează izomerul de 3,5-stigmastadienă.

STIG-3,5

I.S.

izomer

0

10

20

min

▼M13

ANNEX XVIII

DETERMINATION OF TRIACYLGLYCEROLS WITH ECN 42 (DIFFERENCE BETWEEN HPLC DATA AND THEORETICAL CONTENT)

1.   Scope

Determination of the composition of triacylglycerols (TAGs) in olive oils, in terms of their equivalent carbon number by differences between the analytical results obtained by high performance liquid chromatography (HPLC) and the theoretical content, calculated starting from the fatty acid composition.

2.   Field application

The standard is applicable to olive oils. The method is applicable to the detection of the presence of small amounts of seed oils (rich in linoleic acid) in every class of olive oils.

3.   Principle

The content of triacylglycerols with ECN42 determined by HPLC analysis and the theoretical content of triacylglycerols with ECN42 (calculated on the basis of GLC determination of fatty acid composition) correspond within a certain limit for pure oils. A difference larger than the values stated in the Regulation for each type of oil points out that the oil contains seed oils.

4.   Method

The method for calculation of theoretical content of triacylglycerols with ECN42 and of the difference between the HPLC data and this one essentially is made by the coordination of analytical data obtained by means of other methods: it is possible to distinguish three phases: determination of fatty acid composition by capillary gas chromatography, calculation of theoretical composition of triacylglycerols with ECN42, HPLC determination of ECN42 triacylglycerols

4.1.   Apparatus

4.2.   Reagents

The reagents should be of analytical purity. Elution solvents should be de-gassed, and may be recycled several times without effect on the separations.

4.3.   Sample preparation

As a number of interfering substances can rise false positive results, the sample must always be purified according to IUPAC method 2.507, used for determination of polar substances in oxidised oils.

4.3.1.   Chromatographic column preparation

Fill the column (4.1.3) with about 30 ml of elution solvent (4.2.3), then introduce inside the column some glass wool (4.2.5) pushing it to the bottom of the column by means of the glass rod (4.1.5).

In a 100 ml beaker, suspend 25 g of silicagel (4.2.4) in 80 ml of elution mixture (4.2.3), then transfer it inside the column, by means of a glass funnel (4.1.6).

To ensure the complete transfer of silicagel inside the column, wash the beaker with the elution mixture and transfer the washing portions inside the column, too.

Open the cock and let solvent elute from the column until its level is about 1 cm over the silicagel.

4.3.2.   Column chromatography

Weigh with the accuracy of 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g of oil, previously filtered, homogenized and anhydrified, if necessary, in a 50 ml volumetric flask (4.1.7). Solve it in about 20 ml of elution solvent (4.2.3), if necessary, slightly heat it to make the dissolution easily. Cool at room temperature and adjust the volume with elution solvent.

By means of a volumetric pipette, introduce 20 ml of solution inside the column prepared according to 4.3.1, open the cock and let solvent elute to the silicagel layer level.

Then elute with 150 ml of elution solvent (4.2.3), adjusting the solvent rate at about 2 ml/min (150 ml will take about 60 to 70 minutes to pass through the column).

The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1) previously tared in an oven and exactly weighted. Eliminate solvent at reduce pressure (Rotavapor) and weigh the residue that will be used to prepare the solution for HPLC analysis and for methyl ester preparation.

The sample recovery from the column must be 90 % at least for extra virgin, virgin, ordinary refined and olive oil categories, and a minimum of 80 % for lampante and residue olive oils.

4.4.   HPLC analysis

4.4.1.   Preparation of the samples for chromatographic analysis

A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 0,5 ± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to 10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).

4.4.2.   Procedure

Set up the chromatographic system. Pump elution solvent (4.2.8) at a rate of 1,5 ml/min to purge the entire system. Wait until a stable base line is obtained. Inject 10 μl of the sample prepared as in 4.3.

4.4.3.   Calculation and expression of results

Use the area normalization method, i.e. assume that the sum of the areas of the peaks corresponding to TAGs from ECN42 up to ECN52 is equal to 100 %. Calculate the relative percentage of each triglyceride using the formula:

% triglyceride = area of peak × 100/ sum of peak areas.

The results are to be given to within at least two decimal places.

Note 1:

The elution order can be determined by calculating the equivalent carbon numbers, often defined by the relation ECN = CN-2n, where CN is the carbon number and n is the number of double bounds, it can be calculated more precisely by taking into account the origin of the double bond. If no, nl and nln are the numbers of double bonds attributed to oleic, linoleic and linolenic acids respectively, the equivalent carbon number can be calculated by means of the relation of the formula:

ECN = CN - dono - dlnl - dlnnln,

where the coefficient do, dl and dln can be calculated by means of the reference triglycerides. Under the conditions specified in this method, the relation obtained will be close in:

ECN = CN - (2,60 no) - (2,35 nl) - (2,17 nln)

Note 2:

Note 3:

With several reference triglycerides, it is also possible to calculate the resolution with respect to triolein:

α = RT' / RT triolein

by use of the reduced retention time RT' = RT - RT solvent.

The graph of log α against f (number of double bonds) enables the retention values to be determined for all the triglycerides of fatty acids contained in the reference triglycerides — see figure 2.

Note 4:

The efficiency of the column should permit clear separation of the peak of trilinoein from the peaks of the triglycerides with an adjacent RT. The elution is carried out up to ECN52 peak.

Note 5:

A correct measure of the areas of all peaks of interest for the present determination is ensured if the second peak corresponding to ECN50 is 50 % of full scale of the recorder.

4.5.   Calculation of triacylglycerols composition

4.5.1.   Determination of fatty acid composition

Fatty acid composition is carried out by means of the EEC gas chromatographic method reported in Annex X A of Regulation (EEC) No 2568/91, by means of a capillary column. The methyl esters preparation is carried out according to Annex X B (sodium methylate alcohol solution).

4.5.2.   Fatty acids for calculation

Glycerides are grouped by their equivalent carbon number (ECN), taking into account the following equivalencies between ECN and fatty acids. Only fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were taken in consideration, because only these are important for olive oil.

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

moles P = area % PMW Pmoles S = area % SMW Smoles Po = area % PoMW Po	(1)
moles O = area % OMW Omoles L = area % LMW Lmoles Ln = area % LnMW Ln

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

moles % P 1,2,3 = moles P * 100moles P + S + Po + O + L + Ln	(2)
moles % S 1,2,3 = moles S * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
moles % Po 1,2,3 = moles Po * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
moles % O 1,2,3 = moles O * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
moles % L 1,2,3 = moles L * 100moles P + S + Po + O + L + Ln
moles % Ln 1,2,3 = moles Ln * 100moles P + S + Po + O + L + Ln

The result gives the percentage of each fatty acid in moles % in the overall (1,2,3-) position of the TAGs.

Then the sum of the saturated fatty acids P and S (SFA) and the unsaturated fatty acids Po, O, L and Ln (UFA) are calculated:

moles % SFA = moles % P + moles % S	(3)
moles UFA = 100 - moles % SFA

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of TAGs

The fatty acids are distributed to three pools as follows: two identical for 1- and 3- positions and one for 2- position, with different coefficients for the saturated (P and S) and unsaturated acids (Po, O, L and Ln).

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = moles % P (1,2,3) * 0,06 (4) moles % S(2) = moles % S (1,2,3) * 0,06

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 2- position [Po(2), O(2), L(2) and Ln(2)]: moles % Po2 = moles % Po1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 (5) moles % O2 = moles % O1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - mol % S2 moles % L2 = moles % L1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 moles % Ln2 = moles % Ln1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)]: moles % P1,3 = moles % P1,2,3 - moles % P22 + moles % P1,2,3 (6) moles % S1,3 = moles % S1,2,3 - moles % S22 + moles % S1,2,3 moles % Po1,3 = moles % Po1,2,3 - moles % Po22 + moles % Po1,2,3 moles % O1,3 = moles % O1,2,3 - moles % O22 + moles % O1,2,3 moles % L1,3 = moles % L1,2,3 - moles % L22 + moles % L1,2,3 moles % Ln1,3 = moles % Ln1,2,3 - moles % Ln22 + moles % Ln1,2,3

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols