Accept Refuse

EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32019R1390

Regulamentul (UE) 2019/1390 al Comisiei din 31 iulie 2019 de modificare, în scopul adaptării la progresul tehnic, a anexei la Regulamentul (CE) nr. 440/2008 de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH) (Text cu relevanță pentru SEE)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 247/1


REGULAMENTUL (UE) 2019/1390 AL COMISIEI

din 31 iulie 2019

de modificare, în scopul adaptării la progresul tehnic, a anexei la Regulamentul (CE) nr. 440/2008 de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH)

(Text cu relevanță pentru SEE)

COMISIA EUROPEANĂ,

având în vedere Tratatul privind funcționarea Uniunii Europene,

având în vedere Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH), de înființare a Agenției Europene pentru Produse Chimice, de modificare a Directivei 1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 793/93 al Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 al Comisiei, precum și a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a Directivelor 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale Comisiei (1), în special articolul 13 alineatul (2),

întrucât:

(1)

Regulamentul (CE) nr. 440/2008 al Comisiei (2) conține metodele de testare pentru determinarea proprietăților fizico-chimice, a toxicității și a ecotoxicității substanțelor chimice, care trebuie aplicate în sensul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006.

(2)

Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică (OCDE), dezvoltă orientări referitoare la testare armonizate și convenite la nivel internațional pentru testarea substanțelor chimice în scopuri de reglementare. OCDE publică periodic orientări noi și revizuite referitoare la testare, ținând seama de progresul științific în acest domeniu.

(3)

Pentru a ține seama de progresul tehnic și, ori de câte ori este posibil, în vederea reducerii numărului de animale utilizate în scopuri experimentale în conformitate cu articolul 13 alineatul (2) din Regulamentul (CE) nr. 1907/2006, în urma adoptării orientărilor relevante ale OCDE referitoare la testare, ar trebui stabilite două noi metode de testare pentru evaluarea ecotoxicității și nouă noi metode de testare pentru determinarea toxicității pentru sănătatea umană, iar șapte metode de testare ar trebui să fie actualizate. Unsprezece dintre aceste metode de testare se referă la teste in vitro pentru iritația/coroziunea cutanată și oculară, sensibilizarea pielii, genotoxicitate și efecte endocrine. Părțile interesate au fost consultate cu privire la propunerea de modificare.

(4)

Prin urmare, Regulamentul (CE) nr. 440/2008 ar trebui modificat în consecință.

(5)

Măsurile prevăzute în prezentul regulament sunt conforme cu avizul comitetului instituit în temeiul articolului 133 din Regulamentul (CE) nr. 1907/2006,

ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:

Articolul 1

Anexa la Regulamentul (CE) nr. 440/2008 se modifică în conformitate cu anexa la prezentul regulament.

Articolul 2

Prezentul regulament intră în vigoare în a douăzecea zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene.

Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se aplică direct în toate statele membre.

Adoptat la Bruxelles, 31 iulie 2019.

Pentru Comisie,

Președintele

Jean-Claude JUNCKER


(1)  JO L 396, 30.12.2006, p. 1.

(2)  Regulamentul (CE) nr. 440/2008 al Comisiei din 30 mai 2008 de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH) (JO L 142, 31.5.2008, p. 1).


ANEXĂ

Anexa la Regulamentul (CE) nr. 440/2008 se modifică după cum urmează:

(1)

În partea B, capitolul B.4 se înlocuiește cu următorul text:

„B.4   IRITAȚIE/COROZIUNE CUTANATĂ ACUTĂ

INTRODUCERE

1.

Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 404 (2015). Orientările OCDE privind testarea substanțelor chimice sunt revizuite periodic pentru a se asigura că acestea reflectă cele mai bune cunoștințe științifice disponibile. La revizuirea orientării 404 a OCDE privind testarea, s-a acordat o atenție deosebită posibilelor îmbunătățiri în ceea ce privește problemele de bunăstare animală și evaluării tuturor informațiilor existente privind substanța chimică de testat pentru a se evita testarea inutilă pe animale de laborator. Versiunea actualizată a Orientării nr. 404 a OCDE privind testarea (adoptată inițial în 1981, revizuită în 1992, 2002 și 2015) include o trimitere la documentul de orientare privind strategiile integrate pentru testare și evaluare (Integrated Approaches to Testing and Assessment - IATA) pentru iritație/coroziune cutanată (1), propunând o abordare modulară pentru testarea iritației și a coroziunii cutanate. IATA descrie mai multe module care grupează surse de informații și instrumente de analiză și (i) oferă îndrumări cu privire la modul de integrare și utilizare a datelor existente provenite din teste și care nu provin din teste pentru evaluarea potențialului de iritație cutanată și de coroziune cutanată al substanțelor chimice și (ii) propune o abordare atunci când sunt necesare teste suplimentare (1). În plus, dacă este necesar, se recomandă în respectiva orientare să se opteze pentru aplicarea succesivă, și nu simultană, a celor trei plasturi la animalul de experiență în cadrul testului inițial in vivo.

2.

Definiții pentru iritația și coroziunea cutanată sunt prezentate în apendicele la prezenta metodă de testare.

CONSIDERAȚII INIȚIALE

3.

În interesul acurateței științifice și al bunăstării animale, testele in vivo nu ar trebui să fie efectuate până când nu au fost evaluate toate datele disponibile relevante pentru o posibilă corosivitate/iritație cutanată a substanței chimice de testat în cadrul unei analize a valorii probante a datelor (WoE), astfel cum este prezentată în Documentul de orientare privind abordările integrate de testare și evaluare în ceea ce privește coroziunea și iritația cutanată, și anume, în cele trei părți ale prezentei orientări și în modulele aferente (1). Pe scurt, în partea 1, sunt abordate datele existente pe parcursul a șapte module care acoperă date umane, date in vivo, date in vitro, date privind proprietățile fizico-chimice (de exemplu, pH-ul, în special o aciditate sau alcalinitate puternică) și metode care nu implică testarea. În partea 2, este efectuată analiza bazată pe forța probantă a datelor (FPD). Dacă această analiză FPD este încă neconcludentă, partea 3 ar trebui să fie desfășurată cu efectuarea de teste suplimentare, începând cu metodele in vitro, iar testarea in vivo este utilizată ca soluție de ultimă instanță. Această analiză ar trebui așadar să reducă necesitatea efectuării unor teste in vivo de coroziune/iritație cutanată asupra substanțelor chimice de testat pentru care există deja dovezi suficiente din alte studii privind aceste două puncte finale.

PRINCIPIUL TESTULUI IN VIVO

4.

Substanța chimică de testat se aplică într-o singură doză pe pielea unui animal de experiență; zonele netratate ale pielii animalului de experiență se utilizează ca martor. La intervale specificate se examinează și se punctează gradul de iritare/coroziune, care este descris în detaliu pentru a permite o evaluare completă a efectelor. Durata studiului trebuie să fie suficientă pentru evaluarea reversibilității sau ireversibilității efectelor observate.

5.

Animalele care manifestă semne persistente de suferință și/sau dureri profunde în orice etapă a testului sunt eutanasiate, iar substanța chimică de testat se evaluează în consecință. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde fac obiectul unui document de orientare separat (2).

PREGĂTIREA PENTRU TESTUL IN VIVO

Selecția speciilor de animale

6.

Se preferă utilizarea de exemplare adulte tinere și sănătoase de iepure albinos ca animale de laborator. Utilizarea altor specii ar trebui să fie justificată.

Pregătirea animalelor

7.

Cu aproximativ 24 de ore înainte de test, se rade blana din regiunea dorsală de pe corpul animalelor. Se evită cu atenție jupuirea pielii și se utilizează exclusiv animalele cu pielea sănătoasă, intactă.

8.

La unele sușe de iepuri, blana este mai deasă în unele zone, în anumite perioade ale anului. Astfel de zone în care crește o blană mai deasă nu ar trebui să fie utilizate ca zone de testare.

Condiții de adăpostire și hrănire

9.

Animalele ar trebui să fie adăpostite individual. Temperatura incintei în care se află animalele de experiență ar trebui să fie de 20 °C (± 3 °C) pentru iepuri. Cu toate că umiditatea relativă ar trebui să fie de cel puțin 30 % și, de preferință, să nu depășească 70 % decât în timpul operațiunilor de curățare a sălii, obiectivul de umiditate este de 50-60 %. Spațiul ar trebui să fie iluminat artificial, cu o alternanță de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantități nelimitate de apă potabilă

PROCEDURA DE TESTARE

Aplicarea substanței chimice de testat

10.

Substanța chimică de testat ar trebui să fie aplicată uniform pe o suprafață mică (aproximativ 6 cm2) de piele și este menținută în contact cu pielea cu ajutorul unui bandaj de tifon și al unui plasture neiritant. În cazurile în care nu este posibilă aplicarea directă (de exemplu, lichide sau anumite paste), substanța chimică de testat ar trebui să fie aplicată mai întâi pe un bandaj de tifon, care este apoi aplicat pe piele. Se asigură un contact ușor între bandaj și piele cu ajutorul unui pansament semi-ocluziv pentru întreaga durată a perioadei de expunere. Dacă substanța chimică de testat este aplicată pe bandaj, aceasta se fixează pe piele astfel încât să existe un contact adecvat și o distribuție uniformă a substanței chimice de testat pe piele. Ar trebui să se împiedice accesul animalului la bandaj și ingerarea sau inhalarea substanței chimice de testat.

11.

Substanțele chimice de testat lichide sunt utilizate, în general, în stare nediluată. La testarea substanțelor solide (care pot fi pulverizate, dacă se consideră necesar), substanța chimică de testat ar trebui să fie umezită cu cea mai redusă cantitate de apă (sau, dacă este necesar, cu un alt vehicul adecvat) suficient pentru a asigura un contact bun cu pielea. Atunci când se utilizează alte vehicule decât apa, o posibilă influență a vehiculului asupra iritației pielii provocate de substanța chimică de testat ar trebui să fie minimă, dacă există.

12.

La sfârșitul perioadei de expunere, care este în mod normal de patru ore, substanța chimică de testat reziduală ar trebui să fie eliminată, atunci când este posibil, folosind apă sau un solvent adecvat fără a modifica răspunsul existent sau integritatea epidermei.

Nivelul dozei

13.

Pe zona de testare se aplică o doză de 0,5 ml de lichid sau de 0,5 g de substanță solidă sau pastă.

Testul inițial (test in vivo de iritație/coroziune cutanată utilizând un animal)

14.

Atunci când o substanță chimică de testat este considerată a fi corozivă, iritantă sau neclasificată pe baza unor analize ale forței probante a datelor sau a unor teste in vitro anterioare, în mod normal nu este necesară efectuarea de teste in vivo suplimentare. Însă, în cazurile în care se justifică obținerea unor date suplimentare, testul in vivo este efectuat inițial utilizând un animal și aplicând abordarea de mai jos. Se aplică animalului, secvențial, maximum trei plasturi pentru testare. Primul plasture se îndepărtează după trei minute. Dacă nu se observă o reacție cutanată gravă, se aplică un al doilea plasture într-o altă zonă, care este îndepărtat după o oră. Dacă în această etapă, observațiile arată că poate fi permisă prelungirea expunerii la patru ore, fără a cauza suferințe, se aplică un al treilea plasture, care se îndepărtează după patru ore și se punctează reacția.

15.

Dacă se observă un efect coroziv după oricare dintre cele trei expuneri secvențiale, testul se încheie imediat. Dacă nu se observă un efect coroziv după îndepărtarea ultimului plasture, animalul se observă timp de 14 zile, cu excepția cazului în care coroziunea se manifestă mai devreme.

16.

În cazurile în care se estimează că substanța chimică de testat nu este corozivă, dar ar putea fi iritantă, se aplică un singur plasture unui animal, timp de patru ore.

Test de confirmare (test de iritație cutanată in vivo pe animale suplimentare)

17.

Dacă la testul inițial nu se observă efecte corozive, reacția de iritație sau negativă se confirmă prin testarea a maximum alte două animale, fiecare cu câte un plasture, cu o perioadă de expunere de patru ore. Dacă se observă un efect iritant la testul inițial, testul de confirmare poate fi efectuat secvențial sau prin expunerea simultană a celor două animale suplimentare. În cazul excepțional în care nu se efectuează testul inițial, două sau trei animale pot fi tratate cu câte un singur plasture, care se îndepărtează după patru ore. Dacă se utilizează două animale și ambele manifestă aceeași reacție, nu mai sunt necesare teste suplimentare. În caz contrar, se testează și al treilea animal. Este posibil să fie necesară evaluarea reacțiilor echivoce utilizând alte animale.

Perioada de observație

18.

Durata perioadei de observare ar trebui să fie suficientă pentru evaluarea completă a reversibilității efectelor observate. Cu toate acestea, experimentul ar trebui să fie încheiat dacă animalul prezintă semne persistente de durere sau suferință profundă. Pentru a determina reversibilitatea efectelor, animalele ar trebui să fie observate timp de până la 14 zile de la îndepărtarea plasturilor. Dacă reversibilitatea intervine înainte de 14 zile, experimentul ar trebui încheiat în acel moment.

Observații clinice și punctarea reacțiilor cutanate

19.

Ar trebui să se examineze semnele de eritem și edem la toate animalele și să se puncteze reacțiile la 60 de minute, iar apoi la 24, 48 și 72 de ore de la îndepărtarea plasturilor. Pentru testul inițial pe un singur animal, zona de testare se examinează, de asemenea, imediat după îndepărtarea plasturelui. Reacțiile cutanate se punctează și se înregistrează conform punctajelor din tabelul de mai jos. Dacă la 72 de ore se observă leziuni cutanate care nu pot fi identificate ca iritații sau coroziuni, este posibil să fie necesară observarea timp de 14 zile, pentru a determina reversibilitatea efectelor. În plus față de examinarea iritației, se descriu și se înregistrează toate efectele toxice locale, precum uscarea pielii, și orice efecte sistemice adverse (de exemplu, efecte manifestate prin semne clinice de toxicitate sau efecte asupra greutății corporale). Pentru clarificarea reacțiilor echivoce se efectuează un examen histopatologic.

20.

Punctarea reacțiilor cutanate este neapărat subiectivă. Pentru a promova armonizarea punctării reacțiilor cutanate și pentru a veni în sprijinul laboratoarelor de testare și a persoanelor implicate în efectuarea și interpretarea observațiilor, personalul care efectuează observațiile trebuie să fie instruit corespunzător cu privire la sistemul de punctaj utilizat (a se vedea tabelul de mai jos). Ar putea fi util un ghid ilustrat pentru punctarea iritațiilor dermice și a altor leziuni (3).

DATE ȘI RAPORTARE

21.

Rezultatele studiului ar trebui să fie sintetizate în formă tabelară în raportul final al testului și să includă toate punctele menționate la punctul 24.

Evaluarea rezultatelor

22.

Punctajele privind iritația cutanată ar trebui să fie evaluate în legătură cu natura și severitatea leziunilor, precum și cu reversibilitatea sau ireversibilitatea lor. Punctajele individuale nu reprezintă un standard absolut pentru proprietățile iritante ale unui material de testat, întrucât se evaluează și alte efecte ale materialului. În schimb, punctajele individuale ar trebui să fie considerate drept valori de referință, care trebuie să fie evaluate în legătură cu toate celelalte observații ale studiului.

23.

Reversibilitatea leziunilor cutanate ar trebui să fie luată în considerare la evaluarea reacțiilor iritante. Atunci când reacții precum alopecia (zonă limitată), hiperkeratoza, hiperplazia și exfolierea persistă la sfârșitul perioadei de observare de 14 zile, substanța chimică de testat ar trebui să fie considerată drept iritantă.

Raportul testului

24.

Raportul testului trebuie să includă următoarele informații:

 

Justificarea pentru testarea in vivo:

analiza valorii probante a datelor prealabile testului, inclusiv a rezultatelor strategiei de testare secvențiale;

descrierea datelor relevante disponibile din testele anterioare;

date obținute în fiecare etapă a strategiei de testare;

descrierea testelor in vitro efectuate, inclusiv detalii privind procedurile, rezultatele obținute cu substanțele de testat/de referință;

analiza valorii probante a datelor pentru efectuarea studiului in vivo.

 

Substanța chimică de testat:

Substanță mono-constituent: identificarea chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS, numărul CAS sau codul său InChI, formula structurală, puritatea, identitatea chimică a impurităților după cum este necesar și fezabil din punct de vedere practic etc.;

Substanță multicomponentă, amestec și substanțe cu o compoziție necunoscută sau variabilă, produse de reacție complexă sau materiale biologice (UVCB): în măsura în care este posibil, caracterizată prin identitatea chimică (a se vedea mai sus), apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante ale componentelor;

aspectul fizic, solubilitatea în apă și alte proprietăți fizico-chimice relevante;

sursa, numărul lotului, dacă există;

tratamentul substanțelor chimice de testat/martor înainte de efectuarea testului, după caz (de exemplu, încălzire, măcinare);

stabilitatea substanței chimice de testat, data limită de utilizare sau data pentru reanalizare, dacă se cunoaște;

condiții de depozitare.

 

Vehicul:

identificare, concentrație (dacă este cazul), volumul utilizat;

justificarea alegerii vehiculului.

 

Animal(e) de testare:

specie/șușă utilizată, justificarea utilizării altui (altor) animal(e) decât iepurele albinos;

numărul de animale din fiecare sex;

greutatea fiecărui animal la începutul și la sfârșitul testului;

vârsta la începutul studiului;

sursa animalului (animalelor), condiții de adăpostire, regimul alimentar etc.

 

Condiții de testare:

tehnica de pregătire a zonei de aplicare a plasturelui;

detalii despre materialele folosite pentru plasture și despre tehnica aplicării plasturelui;

detalii privind prepararea, aplicarea și îndepărtarea substanței chimice de testat.

 

Rezultate:

tabel cu punctajele acordate pentru reacția de iritație/coroziune, pentru fiecare animal, în fiecare moment măsurat;

descrierea tuturor leziunilor observate;

descrierea narativă a naturii și gradului de iritație/coroziune observat și concluziile examenului histopatologic;

descrierea altor efecte locale adverse (de exemplu, uscarea pielii) și a altor efecte sistemice apărute în plus față de iritația sau coroziunea cutanată.

 

Discutarea rezultatelor

 

Concluzii

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

(1)

OCDE (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr. 203), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris.

(2)

OCDE (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, astfel cum a fost aprobat în cadrul celei de a 28-a reuniuni comune a Comitetului privind substanțele chimice (Chemicals Committee) și a Grupului de lucru privind substanțele chimice (Working Party on Chemicals), noiembrie 1998.

(3)

OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr. 19), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris.

Tabel

Punctarea Reacțiilor Cutanate

Fără eritem…

0

Eritem foarte redus (greu perceptibil)…

1

Eritem bine definit…

2

Eritem moderat spre sever…

3

Eritem grav (roșu violaceu) cu formare de escare care împiedică punctarea eritemului…

4

Maximum posibil: 4

Fără edem…

0

Edem foarte redus (greu perceptibil)…

1

Edem redus (contururile zonei sunt bine definite prin proeminență clară)…

2

Edem moderat (proeminență de aproximativ 1 mm)…

3

Edem sever (proeminență mai mare de 1 mm și extindere dincolo de zona de expunere)…

4

Maximum posibil: 4

Pentru clarificarea reacțiilor echivoce se poate proceda la un examen histopatologic.

Apendice

DEFINIȚII

Substanță chimică înseamnă o substanță sau un amestec.

Iritație cutanată înseamnă producerea de leziuni reversibile ale pielii în urma aplicării unei substanțe chimice de testat timp de până la 4 ore.

Coroziune cutanată înseamnă producerea unor leziuni cutanate ireversibile; și anume, necroză vizibilă prin epidermă și în dermă, ca urmare a aplicării unei substanțe chimice de testat timp de până la patru ore. Reacțiile corozive sunt tipic exemplificate de ulcere, sângerare, cruste de sânge și, spre sfârșitul perioadei de observație de 14 zile, prin decolorare datorată depigmentării pielii, zone complete de alopecie, precum și cicatrici. Pentru evaluarea leziunilor incerte ar trebui să se aibă în vedere efectuarea unui examen histopatologic.

Substanță chimică de testat înseamnă orice substanță sau amestec de substanțe testat(ă) utilizând această metodă de testare

(2)

În partea B, capitolul B.17 se înlocuiește cu următorul text:

„B.17   TESTE IN VITRO DE MUTAȚIE GENICĂ PE CELULE DE MAMIFERE FOLOSIND GENELE HPRT ȘI XPRT

INTRODUCERE

1.

Această metodă de testare (MT) este echivalentă cu Orientarea OCDE nr. 476 privind testarea (2016). Metodele de testare sunt revizuite periodic în contextul progreselor științifice, al necesităților fluctuante de reglementare și al bunăstării animalelor. Actuala versiune revizuită a MT B.17 reflectă aproape treizeci de ani de experiență în ceea ce privește acest test și, de asemenea, constituie rezultatul dezvoltării unei noi metode separate dedicate testelor in vitro de mutație genică pe celule de mamifere folosind gena timidin-kinază. MT B.17 face parte dintr-o serie de metode de testare privind toxicologia genetică. OCDE a elaborat un document care oferă informații succinte privind testarea pentru toxicologia genetică și o prezentare a modificărilor efectuate recent asupra orientărilor OCDE privind testarea pentru toxicologia genetică (1).

2.

Scopul testului in vitro de mutație genică pe celule de mamifere este detectarea mutațiilor genice induse de substanțe chimice. Liniile celulare utilizate în aceste teste măsoară mutațiile directe la genele reporter, în special la gena endogenă hipoxantin-guanină fosforibozil transferază (Hprt la celulele de rozătoare, HPRT la celulele umane; denumite colectiv gena Hprt și testul HPRT în cadrul prezentei metode de testare), precum și la transgena de xantin-guanină fosforibozil transferază (gpt) (denumit testul XPRT). Testele de mutație HPRT și XPRT permit detectarea diferitelor spectre de fenomene genetice. În plus față de mutațiile detectate prin testul HPRT (de exemplu, substituții ale perechilor de bază, decalări ale cadrului de citire, mici deleții și inserții), localizarea autozomică a transgenei gpt ar putea permite detectarea mutațiilor produse ca urmare a unor deleții semnificative și, eventual, a recombinării mitotice care nu este detectată prin testul HPRT, deoarece gena Hprt se află pe cromozomul X (2) (3) (4) (5) (6) (7). În prezent, XPRT este mai puțin utilizat decât testul HPRT în scopuri de reglementare.

3.

Definițiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.

CONSIDERAȚII PRELIMINARE ȘI LIMITĂRI

4.

Testele realizate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică. Sistemul exogen de activare metabolică nu reproduce integral condițiile in vivo.

5.

Ar trebui să se acorde atenție evitării condițiilor care ar conduce la rezultate pozitive artificiale (și anume, o posibilă interacțiune cu sistemul de testare), care nu sunt cauzate de interacțiunea directă dintre substanțele chimice de testat și materialul genetic al celulei; astfel de condiții includ modificări ale pH-ului sau ale osmolalității (8) (9) (10), interacțiunea cu componentele de mediu (11) (12) sau niveluri excesive ale citotoxicității (13). Citotoxicitatea care depășește nivelurile recomandate de citotoxicitate de vârf, astfel cum sunt definite la punctul 19, este considerată excesivă pentru testul HPRT.

6.

Înainte de utilizarea metodei de testare pe un amestec pentru a genera date pentru un obiectiv de reglementare prevăzut, se ia în considerare dacă și, în caz afirmativ, din ce cauză aceasta poate oferi rezultate adecvate pentru respectivul scop. Astfel de considerații nu sunt necesare atunci când există o cerință de reglementare pentru testarea amestecului.

PRINCIPIUL TESTULUI

7.

Celulele mutante deficiente în activitatea enzimei Hprt în cadrul testului HPRT sau în activitatea enzimei xprt în cadrul testului XPRT sunt rezistente la efectele citostatice ale substanței 6-tioguanină purină analogă (TG). Celulele care conțin enzima Hprt (în cadrul testului HPRT) sau gpt (în cadrul testului XPRT) sunt sensibile la TG, ceea ce produce inhibarea metabolismului celular și oprirea diviziunii celulare. Astfel, celulele mutante pot prolifera în prezența TG, în timp ce celulele normale, care conțin enzima Hprt (în cadrul testului HPRT) sau gpt (în cadrul testului XPRT), nu pot prolifera.

8.

Celulele în suspensie sau culturile monostrat sunt expuse la substanța chimică de testat atât în prezența, cât și în absența unei surse exogene de activare metabolică (a se vedea punctul 14), pentru o perioadă adecvată de timp (3-6 ore) și apoi subcultivate pentru determinarea citotoxicității și pentru a permite expresia fenotipică înaintea selecției mutantului (14) (15) (16) (17). Citotoxicitatea este determinată prin supraviețuire relativă (RS), și anume, eficacitatea clonării măsurată imediat după tratament și ajustată pentru orice pierdere de celule în timpul tratamentului comparativ cu martorul negativ (punctul 18 și apendicele 2). Culturile tratate sunt menținute în mediul de cultură un timp suficient, caracteristic pentru fiecare tip de celulă, pentru a permite o expresie fenotipică aproape optimă a mutațiilor induse (de regulă, minim 7-9 zile). În urma manifestării fenotipice, frecvența mutanților se determină prin însămânțarea unui număr cunoscut de celule într-un mediu ce conține agentul selectiv pentru a detecta coloniile mutante și într-un mediu fără agent selectiv pentru a determina eficacitatea clonării (viabilitatea). După un timp corespunzător de incubare, se numără coloniile. Frecvența mutanților se calculează pe baza numărului de colonii de mutanți, corectat prin eficacitatea clonării la momentul selecției mutantului.

DESCRIEREA METODEI

Pregătiri

Celule

9.

Tipurile de celule utilizate pentru testele HPRT și XPRT ar trebui să aibă o sensibilitate demonstrată la mutageni chimici, o eficacitate de clonare mare, un cariotip stabil și o frecvență stabilă a celulelor mutante spontane. Cele mai frecvent utilizate celule pentru testul HPRT includ liniile CHO, CHL și V79 de celule de hamster chinezesc, celule de limfom de șoarece L5178Y și celule limfoblastoide umane TK6 (18) (19). Celulele AS52 derivate din CHO, care conțin transgena gpt (dar nu și gena Hprt) sunt utilizate pentru testul XPRT (20) (21); testul HPRT nu poate fi efectuat pe celule AS52, deoarece gena hprt a fost eliminată. Utilizarea altor linii celulare ar trebui să fie justificată și validată.

10.

Liniile celulare ar trebui să fie controlate în mod regulat pentru verificarea stabilității numărului modal de cromozomi și a absenței contaminării cu micoplasmă (22) (23), iar, în cazul în care se constată contaminarea sau în cazul în care numărul modal de cromozomi s-a modificat, celulele nu se mai utilizează. Ar trebui să se stabilească durata normală a ciclului celular utilizată în laboratorul de testare, iar aceasta ar trebui să fie conformă cu caracteristicile celulare publicate. Frecvența celulei mutante spontane în stocul de celule mamă ar trebui să fie, de asemenea, verificată, iar stocul nu ar trebui utilizat în cazul în care frecvența mutanților nu este acceptabilă.

11.

Înainte de utilizare în cadrul acestui test, este posibil să fie necesară curățarea culturilor de celule mutante preexistente, de exemplu, prin cultivare în mediul HAT pentru testul HPRT și în MPA pentru testul XPRT (5) (24) (a se vedea apendicele 1). Celulele curățate pot fi păstrate în mediu criogenic și apoi decongelate pentru a fi utilizate ca stocuri de lucru. Stocul de lucru proaspăt decongelat poate fi utilizat pentru testare după încheierea perioadelor normale de dublare. Atunci când este efectuat testul XPRT, cultura de rutină a celulelor AS52 ar trebui să utilizeze condiții care asigură menținerea transgenei gpt (20).

Condiții pentru medii și cultură

12.

Ar trebui să fie asigurate condiții adecvate pentru mediul de cultură și incubare (vase de cultură, umiditate atmosferică de 5 % CO2 și temperatura de incubare de 37 °C) pentru menținerea culturilor. Culturile de celule ar trebui să fie menținute întotdeauna în condiții care să asigure creșterea acestora în faza de dezvoltare logaritmică. Este deosebit de important să se aleagă condiții de medii și de cultură astfel încât să se asigure creșterea optimă a celulelor în perioada de manifestare și eficacitatea optimă a clonării atât pentru celulele mutante, cât și pentru cele nemutante.

Pregătirea culturilor

13.

Liniile celulare se propagă din culturi stoc, se însămânțează în mediul de cultură la o anumită densitate astfel încât celulele în suspensie ori în culturile monostrat să continue să crească exponențial în perioadele de tratament și manifestare (de exemplu, ar trebui să se evite confluența celulelor care cresc în monostrat).

Activare metabolică

14.

Recurgerea la un sistem endogen de activare metabolică este necesară în cazul utilizării de celule dotate cu o capacitate endogenă metabolică inadecvată. Sistemul utilizat cel mai frecvent și care este recomandat implicit, cu excepția cazului în care se justifică altfel, constă într-o fracție postmitocondrială îmbogățită cu un cofactor (S9) preparată din ficat provenit de la rozătoare (în general, șobolani) tratat cu agenți de inducție enzimatică, de exemplu Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) sau un amestec de fenobarbital și β-naftoflavonă (29) (30) (31) (32). Utilizarea celui din urmă amestec nu este contrară prevederilor Convenției de la Stockholm privind poluanții organici persistenți (33) și s-a dovedit a fi la fel de eficientă ca și Aroclor 1254 pentru inducția de oxidaze cu funcție mixtă (29) (31). Fracția S9 este utilizată în general cu o concentrație cuprinsă între 1-2 % (v/v), dar poate fi majorată la 10 % (v/v) în mediul de testare final. Alegerea tipului și concentrației sistemului exogen de activare metabolică sau inductorului metabolic utilizat poate fi influențată de clasa de substanțe chimice testate (34) (35) (36).

Prepararea substanței chimice de testat

15.

Substanțele chimice de testat în stare solidă ar trebui să fie preparate în solvenți adecvați și diluate, dacă este cazul, înainte de tratamentul aplicat celulelor (a se vedea punctul 16). Substanțele chimice de testat în stare lichidă pot fi adăugate direct în sistemul de testare și/sau diluate anterior tratamentului sistemului de testare. Gazele sau substanțele chimice de testat volatile necesită o modificare adecvată a protocoalelor standard, de exemplu utilizarea de vase de cultură închise ermetic (37) (38). Preparatele cu substanța chimică de testat ar trebui să fie realizate anterior tratamentului, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în ceea ce privește acceptabilitatea condițiilor de stocare.

CONDIȚII DE TESTARE

Solvenți

16.

Solventul ar trebui ales pentru a optimiza solubilitatea substanțelor chimice de testat fără a afecta negativ desfășurarea testului, de exemplu, modificarea creșterii celulare, afectarea integrității substanței chimice de testat, reacția cu vasele de cultură, afectarea sistemului de activare metabolică. Se recomandă ca, în măsura în care este posibil, să se ia în considerare în primă instanță utilizarea unui solvent apos (sau a unui mediu de cultură). Solvenții bine stabiliți sunt, de exemplu, apa și dimetilsulfoxidul. În general, solvenții organici nu ar trebui să depășească 1 % (v/v) și solvenții apoși (soluție salină sau apă) nu ar trebui să depășească 10 % (v/v) în mediul final de tratament. În cazul în care solvenții utilizați nu sunt bine stabiliți (de exemplu, etanol sau acetonă), utilizarea acestora ar trebui să fie justificată prin date care să indice compatibilitatea acestora cu substanța chimică de testat și cu sistemul de testare, precum și absența genotoxicității la concentrația utilizată. În lipsa unor astfel de date justificative, este important să se includă martori netratați (a se vedea apendicele 1) pentru a demonstra că solventul ales nu induce efecte vătămătoare sau mutagene.

Măsurarea citotoxicității și alegerea concentrațiilor de expunere

17.

În momentul determinării celei mai mari concentrații a substanței chimice de testat, ar trebui să se evite concentrațiile susceptibile de a produce răspunsuri pozitive date de artefacte, cum ar fi cele care produc citotoxicitate excesivă (a se vedea punctul 20), precipitate în mediul de cultură (a se vedea punctul 21) sau modificări importante de pH sau osmolalitate (a se vedea punctul 5). În cazul în care substanța chimică de testat provoacă o modificare importantă a pH-ului mediului la momentul adăugării acesteia, pH-ul ar putea fi ajustat prin tamponarea mediului final de tratament astfel încât să se evite rezultate pozitive date de artefacte și să se mențină condiții de cultură corespunzătoare.

18.

Selecția concentrației este efectuată în funcție de citotoxicitate și pe baza altor considerente (a se vedea punctele 20-22). Chiar dacă evaluarea citotoxicității în cadrul unui test inițial poate fi utilă pentru o mai bună definire a concentrațiilor care urmează să fie utilizate în experimentul principal, efectuarea unui test inițial nu este obligatorie. Chiar dacă se realizează o evaluare inițială a citotoxicității, măsurarea citotoxicității pentru fiecare cultură este totuși necesară în cadrul experimentului principal. Citotoxicitatea ar trebui să fie evaluată cu ajutorul RS, și anume, eficacitatea clonării (EC) celulelor placate imediat după tratament, ajustată prin orice pierdere de celule în timpul tratamentului, pe baza numărului de celule, în comparație cu ajustarea eficacității clonării la martorii negativi (cărora li se atribuie o rată de supraviețuire de 100 %) (a se vedea apendicele 2 pentru formulă).

19.

Ar trebui să se evalueze cel puțin patru concentrații de testat (fără a include martorii cu solvent și cei pozitivi) care îndeplinesc criteriile de acceptabilitate (citotoxicitate adecvată, număr de celule etc.). Chiar dacă se recomandă utilizarea culturilor duplicat, se poate utiliza fie cultura duplicat, fie cultura tratată ca fiind unică în cadrul fiecărei concentrații testate. Rezultatele obținute în ceea ce privește culturile duplicate independente la o concentrație dată ar trebui să fie consemnate separat, însă pot fi grupate pentru analiza datelor (17). În cazul substanțelor chimice de testat cu citotoxicitate ușoară sau fără citotoxicitate, sunt adecvate, de regulă, intervale de concentrație de aproximativ 2 până la 3 ori mai mari. În prezența citotoxicității, concentrațiile de testat selectate ar trebui să acopere un interval de la concentrația care produce citotoxicitate până la concentrații la care există citotoxicitate moderată și ușoară sau la care nu există citotoxicitate. Multe substanțe chimice de testat prezintă curbe concentrație-răspuns cu pante abrupte, iar pentru a acoperi întregul interval de valori de citotoxicitate sau pentru a studia în detaliu relația concentrație-răspuns, ar putea fi necesară utilizarea concentrațiilor cu spațiu de separare redus și mai mult de patru concentrații, în special în situațiile în care este necesară repetarea experimentului (a se vedea punctul 43). Utilizarea a peste patru concentrații poate fi deosebit de importantă atunci când se utilizează culturi unice.

20.

În cazul în care concentrația maximă se bazează pe citotoxicitate, cea mai mare concentrație ar trebui să vizeze obținerea unei valori cuprinse între 20 și 10 % RS. Ar trebui să se acorde atenție atunci când se interpretează rezultate pozitive identificate doar la valori de până la 10 % RS (punctul 43).

21.

În cazul substanțelor chimice de testat cu solubilitate redusă care nu sunt citotoxice la concentrații mai mici decât concentrația minimă de insolubilitate, cea mai mare concentrație analizată produce o turbiditate sau un precipitat vizibil cu ochiul liber sau cu ajutorul unui microscop inversat la sfârșitul tratamentului cu substanța chimică de testat. Chiar dacă apare citototoxicitatea la un nivel peste concentrația minimă de insolubilitate, se recomandă testarea la o singură concentrație care produce turbiditate sau cu un precipitat vizibil deoarece pot rezulta efecte date de artefacte din precipitat. La concentrația care produce un precipitat, ar trebui să se acorde atenție pentru a se asigura faptul că precipitatul nu interferează cu desfășurarea testului. Ar putea fi utilă determinarea solubilității în mediul de cultură înainte de experiment.

22.

În cazul în care se constată inexistența precipitatului sau o citotoxicitate limitată, concentrația maximă de testare ar trebui să corespundă cu 10 mM, 2 mg/ml sau 2 μl/ml, fiind reținută cea mai mică valoare (39) (40). În cazul în care substanța chimică de testat nu are o compoziție definită, de exemplu, o substanță cu o compoziție necunoscută sau variabilă, produse cu reacție complexă sau materiale biologice [și anume, substanțele chimice cu o compoziție necunoscută sau variabilă (UVCB)] (41), extracte din mediu etc., este posibil să fie necesară o concentrație de vârf mai mare (de exemplu, 5 mg/ml), în absența citotoxicității suficiente, pentru a crește concentrația fiecăreia dintre componente. Cu toate acestea, ar trebui remarcat faptul că aceste cerințe pot fi diferite de cele pentru produsele farmaceutice umane (42).

Martori

23.

Pentru fiecare condiție experimentală ar trebui să se includă martori negativi testați concomitent (a se vedea punctul 16) constituiți doar dintr-un solvent în mediul de tratare și tratați în aceleași condiții precum culturile de tratare.

24.

Martorii pozitivi testați în paralel sunt necesari pentru a demonstra abilitatea laboratorului de a identifica substanțe mutagene în condițiile prevăzute în protocolul de testare utilizat și eficacitatea sistemului exogen de activare metabolică, după caz. Tabelul 1 de mai jos prezintă exemple de martori pozitivi. Pot fi utilizate substanțe martor pozitive alternative, dacă acest lucru este justificat. Întrucât testele in vitro pe celule de mamifere pentru toxicitate genetică sunt suficient de standardizate, pot fi efectuate teste folosind tratamente cu și fără activare metabolică exogenă, cu utilizarea unui singur martor pozitiv care necesită activare metabolică. În acest caz, acest răspuns al unicului martor pozitiv va demonstra atât activitatea sistemului de activare metabolică, cât și capacitatea de răspuns a sistemului de testare. Fiecare martor pozitiv ar trebui să fie utilizat la una sau mai multe concentrații prevăzute a genera creșteri reproductibile și detectabile față de cele de fond pentru a demonstra sensibilitatea sistemului de testare, iar răspunsul nu ar trebui să fie compromis de citotoxicitate care depășește limitele specificate în prezenta metodă de testare (a se vedea punctul 20).

Tabelul 1

Substanțe de referință recomandate pentru evaluarea competenței de laborator și pentru selectarea de martori pozitivi

Condiția activării metabolice

Locus

Substanța și nr. CAS

Absența activării metabolice exogene

Hprt

Metan-sulfonat de etil [CAS nr. 62-50-0] Etil nitrozouree [CAS nr. 759-73-9] 4-nitrochinolină 1-oxid [CAS nr. 56-57-5]

 

xprt

Streptonigrină [CAS nr. 3930-19-6] Mitomicină C [CAS nr. 50-07-7]

Prezența activării metabolice exogene

Hprt

3-metilcolantren [CAS nr. 56-49-5] 7,12-dimetilbenzantracen [CAS nr. 57-97-6] Benzopiren [CAS nr. 50-32-8]

 

xprt

Benzopiren [CAS nr. 50-32-8]

PROCEDURA

Tratamentul cu substanța chimică de testat

25.

Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanța chimică de testat atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică. Timpul de expunere ar trebui să fie corespunzător (de obicei, un timp de 3 până la 6 ore este suficient).

26.

Numărul minim de celule utilizate pentru fiecare cultură de testare (martor și tratată) în fiecare etapă a testului ar trebui să depindă de frecvența celulelor mutante spontane. Orientarea generală este să se trateze și să se treacă suficiente celule pentru a menține 10 celule mutante spontane în fiecare cultură în toate etapele testului (17). Frecvența celulelor mutante spontane se situează, în general, între 5 și 20 × 10-6. Pentru o frecvență spontană a celulelor mutante de 5 × 10-6 și pentru a menține un număr suficient de celule mutante spontane (10 sau mai multe) chiar și pentru culturile tratate la concentrații care provoacă 90 % citotoxicitate în timpul tratamentului (10 % RS), ar fi necesar să se trateze cel puțin 20 × 106 celule. În plus, în perioada de manifestare, trebuie cultivate un număr suficient de celule (dar niciodată sub 2 milioane) care să fie placate pentru selecția celulelor mutante (17).

Timpul de expresie fenotipică și măsurarea frecvenței celulelor mutante

27.

După perioada de tratament, celulele sunt cultivate pentru a permite manifestarea fenotipului mutant. În general, minim 7-9 zile sunt suficiente pentru a permite manifestarea fenotipică aproape optimă a celulelor mutante nou induse Hprt și xprt (43) (44). În această perioadă, celulele sunt subcultivate în mod regulat pentru a le menține într-o creștere exponențială. După manifestarea fenotipică, celulele sunt replacate în mediu cu și fără agent selectiv (6-tioguanină) pentru determinarea numărului de celule mutante și, respectiv, a eficacității clonării la momentul selecției. Această placare se poate realiza prin utilizarea de plăcuțe pentru culturi monostrat sau de plăci cu micro-godeuri pentru celule în suspensie. Pentru selectarea celulelor mutante, celulele ar trebui să fie placate la o densitate pentru a asigura recuperarea optimă a respectivelor celule mutante (și anume, pentru a se evita cooperarea metabolică) (17). Plăcile sunt incubate pentru o perioadă adecvată de timp pentru creșterea optimă a coloniilor (de exemplu, 7-12 zile) și coloniile sunt numărate. Frecvența celulelor mutante se calculează pe baza numărului de colonii de mutanți, corectat prin eficacitatea clonării la momentul selecției celulelor mutante (a se vedea apendicele 2 pentru formule).

Competența de laborator

28.

Pentru a stabili o experiență suficientă în materie de testare înainte de utilizarea acestuia pentru efectuarea testelor de rutină, laboratorul ar trebui să fi efectuat o serie de experiențe cu substanțe pozitive de referință care acționează prin diferite mecanisme (cel puțin una cu și una fără activare metabolică, alese dintre substanțele enumerate în tabelul 1) și diferiți martori negativi (utilizând diferiți solvenți/diferite vehicule). Aceste răspunsuri ale martorilor pozitivi și negativi ar trebui să fie în concordanță cu referințele bibliografice. Acest lucru nu se aplică laboratoarelor care au experiență, și anume, celor care au o bază de date anterioară disponibilă, astfel cum este definit la punctele 30-33.

29.

În absența și în prezența activării metabolice ar trebui să se examineze o selecție de substanțe martor pozitive (a se vedea tabelul 1 de la punctul 25), pentru a demonstra capacitatea de a detecta substanțele chimice mutagene, pentru a determina eficacitatea sistemului de activare metabolică și pentru a demonstra caracterul adecvat al condițiilor de creștere a celulelor în timpul tratamentului, al manifestării fenotipice și al selecției celulelor mutante, precum și al procedurilor de punctare. Ar trebui să se aleagă o plajă de valori ale concentrațiilor substanțelor chimice selectate astfel încât să se obțină creșteri reproductibile și legate de concentrație peste nivelul de fond pentru a demonstra sensibilitatea și gama dinamică a sistemului de testare.

Date anterioare privind martorii testați

30.

Laboratorul ar trebui să stabilească:

o plajă de valori și o distribuție a martorilor pozitivi testați anterior,

o plajă de valori și o distribuție a martorilor negativi (netratați, solvenți) testați anterior.

31.

La obținerea primelor date pentru o distribuție a martorilor negativi testați anterior, martorii negativi testați în paralel ar trebui să fie în concordanță cu datele publicate referitoare la martori (22). Pe măsură ce se adaugă tot mai multe date experimentale la distribuția martorilor, martorii negativi testați în paralel ar trebui să fie, în mod ideal, în limitele de control de 95 % ale respectivei distribuții (17) (45) (46).

32.

Baza de date privind martori negativi testați anterior a laboratorului ar trebui să fie construită inițial cu cel puțin 10 experimente, dar ar fi de preferat să conțină cel puțin 20 de experimente efectuate în conformitate cu condiții experimentale comparabile. Laboratoarele ar trebui să utilizeze metode de control al calității precum grafice de control [de exemplu, diagrame C sau X (47)] pentru a identifica gradul de variabilitate al datelor privind martorii negativi și pozitivi ale acestora și pentru a dovedi faptul că metodologia se află „sub control” în cadrul respectivului laborator (46). Referințele bibliografice prezintă recomandări suplimentare privind modalitatea în care se pot construi și utiliza datele istorice (și anume, criteriile de includere și excludere a datelor în datele istorice și criteriile de acceptabilitate pentru un anumit experiment) (45).

33.

Datele privind martorii negativi ar trebui să constea în frecvențe ale celulelor mutante dintr-o cultură unică sau, de preferință, din culturi duplicate, astfel cum este descris la punctul 23. Martorii negativi testați în paralel trebuie să fie, în mod ideal, în limitele de control de 95 % ale distribuției bazelor de date privind martorii negativi testați anterior ale laboratorului (17) (45) (46). În cazul în care datele privind martorii negativi testați în paralel se situează în afara limitei de 95 % a martorilor, acestea pot fi acceptabile pentru a fi incluse în distribuția martorilor testați anterior, în măsura în care datele respective nu reprezintă valori aberante extreme și există dovezi că sistemul de testare se află „sub control” (a se vedea mai sus) și nu există nicio dovadă a unor erori tehnice sau umane.

34.

Orice modificare a protocolului experimental ar trebui să fie luată în considerare în ceea ce privește consecvența acesteia cu bazele de date privind martorii testați anterior existente ale laboratorului. Orice inconsecvență majoră ar trebui să conducă la stabilirea unei noi baze de date privind martorii testați anterior.

DATE ȘI RAPORTARE

Prezentarea rezultatelor

35.

Prezentarea rezultatelor ar trebui să includă toate datele necesare pentru calcularea citotoxicității (exprimată ca RS). Datele, atât pentru culturile tratate, cât și pentru cele martor, ar trebui să includă numărul de celule la sfârșitul tratamentului, numărul de celule placate imediat după tratament și numărul de colonii (sau numărul de godeuri fără colonii, în cazul metodei cu micro-godeuri). Valoarea RS pentru fiecare cultură ar trebui exprimată ca procent raportat la martorul tratat cu solvent testat în paralel (a se vedea apendicele 1 pentru definiții).

36.

Prezentarea rezultatelor ar trebui să includă, de asemenea, toate datele necesare pentru calcularea frecvenței celulelor mutante. Datele pentru culturile tratate și cele martor ar trebui să includă: (1) numărul de celule placate cu și fără agent selectiv (în momentul în care celulele sunt placate pentru selecția celulelor mutante) și (2) numărul coloniilor numărate (sau numărul de godeuri fără colonii, în cazul metodei cu micro-godeuri) din plăcile cu și fără agent selectiv. Frecvența celulelor mutante se calculează pe baza numărului de colonii de mutanți (pe plăci cu agent selectiv), corectat prin eficacitatea clonării (pe plăcile fără agent selectiv). Frecvența celulelor mutante ar trebui să fie exprimată ca fiind numărul de celule mutante pe milion de celule viabile (a se vedea apendicele 1 pentru definiții).

37.

Ar trebui să fie prezentate date pentru fiecare cultură în parte. În plus, toate datele ar trebui să fie sintetizate sub formă de tabel.

Criterii de acceptabilitate

38.

Acceptarea unui test se bazează pe următoarele criterii:

Martorul negativ testat în paralel este considerat acceptabil pentru a fi adăugat în baza de date privind martorii negativi testați anterior a laboratorului, astfel cum este descris la punctul 33.

Martorii pozitivi testați în paralel (a se vedea punctul 24) ar trebui să inducă răspunsuri compatibile cu cele provenite din baza de date privind martorii pozitivi testați anterior și să producă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel.

Două condiții experimentale (și anume, cu și fără activare metabolică) au fost testate, cu excepția cazului în care una a condus la rezultate pozitive (a se vedea punctul 25).

Se pot analiza un număr adecvat de celule și concentrații (punctele 25, 26 și 19).

Criteriile de selecție ale concentrației maxime sunt conforme cu cele descrise la punctele 20, 21 și 22.

Evaluarea și interpretarea rezultatelor

39.

Cu condiția ca toate criteriile de acceptabilitate să fie îndeplinite, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar pozitivă în cazul în care, în oricare dintre condițiile experimentale examinate:

cel puțin una dintre concentrațiile de testare prezintă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel,

atunci când este evaluată prin intermediul unui test de stabilire a tendinței corespunzător, creșterea depinde de concentrație,

Oricare dintre aceste rezultate se situează în afara distribuției de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limita de control de 95 % pe baza distribuției Poisson; a se vedea punctul 33).

La îndeplinirea tuturor acestor criterii, se consideră că substanța chimică de testat poate produce mutații ale genelor la celulele de mamifere în cultură în cadrul acestui sistem de testare. Referințele bibliografice prezintă recomandări pentru cele mai adecvate metode statistice (46) (48).

40.

Cu condiția ca toate criteriile de acceptabilitate să fie îndeplinite, o substanță chimică de testat este considerată în mod clar negativă dacă, în toate condițiile experimentale examinate:

niciuna dintre concentrațiile de testare nu prezintă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel,

atunci când este evaluată prin intermediul unui test de stabilire a tendinței, nu se înregistrează nicio creștere legată de concentrație,

toate rezultatele se situează în interiorul distribuției de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limita de control de 95 % pe baza distribuției Poisson; a se vedea punctul 33).

Atunci substanța chimică de testat este considerată a fi incapabilă de a provoca mutații ale genelor la celulele de mamifere în cultură în cadrul acestui sistem de testare.

41.

Nu există nicio cerință referitoare la verificarea unui răspuns clar pozitiv sau negativ.

42.

În cazul în care răspunsul nu este nici în mod clar negativ, nici în mod clar pozitiv, astfel cum este descris mai sus sau pentru a ajuta la stabilirea relevanței biologice a unui rezultat, datele ar trebui să fie evaluate de către experți și/sau prin intermediul unor investigații suplimentare. Ar putea fi util să se desfășoare un experiment repetat, eventual folosind condiții experimentale modificate [de exemplu, stabilirea unei distanțe între concentrații, alte condiții de activare metabolică (și anume, concentrația S9 sau originea S9)].

43.

În cazuri rare, chiar și după efectuarea de investigații suplimentare, setul de date va exclude posibilitatea stabilirii unei concluzii pentru rezultate pozitive sau negative. Prin urmare, răspunsul substanței chimice de testat ar trebui să fie concluzionat ca fiind echivoc (interpretat cu aceeași probabilitate de a fi pozitiv sau negativ).

Raportul testului

44.

Raportul testului ar trebui să includă următoarele informații:

 

Substanța chimică de testat:

sursa, numărul lotului, data limită de utilizare, dacă sunt disponibile;

stabilitatea substanței chimice de testat, dacă se cunoaște;

solubilitatea și stabilitatea substanței chimice de testat în solvent, dacă se cunosc;

măsurarea pH-ului, a osmolalității și a precipitatului în mediul de cultură în care s-a adăugat substanța chimică de testat, după caz.

 

Substanță mono-constituent:

aspectul fizic, solubilitatea în apă și alte proprietăți fizico-chimice relevante;

identificarea chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS, numărul CAS sau codul său InChI, formula structurală, puritatea, identitatea chimică a impurităților după cum este necesar și fezabil din punct de vedere practic etc.

 

Substanță multicomponentă, UVCB și amestecuri:

în măsura în care este posibil, caracterizată prin identitatea chimică (a se vedea mai sus), apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante ale componentelor.

 

Solvent:

justificarea alegerii solventului;

procentul de solvent în mediul final de cultură.

 

Celule:

 

Pentru culturile principale din laborator:

tipul, sursa liniilor celulare;

numărul de treceri, dacă există, precum și istoricul în laborator;

caracteristicile cariotipului și/sau numărul modal de cromozomi;

metode de întreținere a culturilor de celule;

absența micoplasmei;

perioade de dublare a celulelor.

 

Condiții de testare:

justificarea selectării concentrațiilor și a numărului de culturi, inclusiv, de exemplu, datele de citotoxicitate și limitele de solubilitate;

compoziția mediilor de cultură, concentrația de CO2, nivelul de umiditate;

concentrația substanței chimice de testat, exprimată în concentrație finală în mediu de cultură (de exemplu, μg sau mg/ml sau mM din mediul de cultură);

concentrația (și/sau volumul) de solvent și substanță chimică de testat adăugate în mediul de cultură;

temperatura de incubare;

timpul de incubare;

durata tratamentului;

densitatea celulară în timpul tratamentului;

tipul și compoziția sistemului de activare metabolică (sursa fracției S9, metoda de preparare a amestecului S9, concentrația și volumul amestecului S9 și fracția S9 în mediul final de cultură, controalele de calitate ale fracției S9); substanțe martor pozitive și negative, concentrații finale pentru fiecare condiție de tratament;

timpul de manifestare (inclusiv numărul de celule însămânțate, subculturile și programele de alimentare, dacă este cazul);

identitatea agentului selectiv și a concentrației acestuia;

criteriile pentru acceptarea testelor;

metodele utilizate pentru numărarea celulelor viabile și mutante;

metodele utilizate pentru măsurarea citotoxicității;

orice alte informații suplimentare cu privire la citotoxicitate și metoda utilizată;

durata perioadelor de incubare după placare;

criteriile conform cărora un studiu poate fi considerat ca fiind pozitiv, negativ sau echivoc;

metode utilizate pentru a determina pH-ul, osmolalitatea și precipitarea.

 

Rezultate:

numărul de celule tratate și numărul de celule subcultivate pentru fiecare cultură;

măsurători ale citotoxicității și alte observații, dacă este cazul;

semne de precipitare și ora determinării;

numărul de celule placată în mediu selectiv și neselectiv;

numărul de colonii în mediul neselectiv și numărul de colonii rezistente în mediu selectiv și frecvențele celulelor mutante aferente;

relația concentrație-răspuns, dacă este posibil;

date (concentrație și solvenți) privind martorii negativi (solvent) și pozitivi testați în paralel;

datele anterioare privind martorii negativi (cu solvent) și cei pozitivi, cu intervale, valori medii și abateri standard, precum și intervale de încredere (de exemplu, 95 %) și numărul de date;

analize statistice (pentru culturi individuale și duplicate grupate, dacă este cazul) și valori p, dacă există.

 

Discutarea rezultatelor.

 

Concluzii

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

(1)

OCDE (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, nr. 234, OCDE, Paris.

(2)

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. și Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3)

Chu E.H.Y. și Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.

(4)

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. și Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

(5)

Aaron C.S. și Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121-128.

(6)

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. și Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235-239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. și Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. Mutation Res., 196, 17-36.

(8)

Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. și Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

(9)

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. și Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10)

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

(11)

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. și Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.

(12)

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. și Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.

(13)

Kirkland D., Aardema M., Henderson L. și Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14)

Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O’Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. și Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15)

Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16)

Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. și Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17)

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. și Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 66-101.

(18)

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P. și Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

(19)

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

(20)

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R. și Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

(21)

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M. și Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in preparation).

(23)

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. și Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.

(24)

Rosen M.P., San R.H.C. și Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. și de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26)

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. și Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27)

Ames B.N., McCann J. și Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28)

Maron D.M. și Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. și Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. și Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. și Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(31)

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. și Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(32)

Johnson T.E., Umbenhauer D.R. și Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(33)

UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, Programul Organizației Națiunilor Unite pentru Mediu (UNEP). Publicație disponibilă la adresa: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan E.-L. și Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)

O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36)

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37)

Krahn D.F., Barsky F.C. și McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.

(38)

Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. și Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.

(39)

OCDE (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Orientările nr. 473, 476 și 487 privind testarea). Disponibil, la cerere, la Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică.

(40)

Brookmire L., Chen J.J. și Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Publicație disponibilă la adresa: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill J.P. și Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L. și Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

(45)

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J. și Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.

(46)

OCDE (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental Health and Safety, Series on Testing and Assessment, (nr. 199), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris.

(47)

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O.și Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(48)

Fleiss J. L., Levin B. și Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, a treia ediție, New York: John Wiley & Sons.

Apendicele 1

DEFINIȚII

Mutageni care provoacă substituția perechilor de bază: Substanțe chimice care cauzează substituția perechilor de bază în ADN.

Substanță chimică: O substanță sau un amestec.

Eficacitatea clonării: Procentul de celule placate la o densitate scăzută, care pot crește într-o colonie care poate fi numărată.

Concentrații: se referă la concentrații finale ale substanței chimice de testat în mediul de cultură.

Citotoxicitate: Pentru testele incluse în prezenta metodă de testare, citotoxicitatea este identificată ca fiind o reducere a supraviețuirii relative a celulelor tratate în comparație cu martorul negativ (a se vedea punctul specific).

Mutație directă: o mutație a genelor de la forma parentală la forma mutantă care generează o modificare sau o pierdere a activității enzimatice sau a funcției proteinei codificate.

Mutageni de decalare a cadrului de citire: substanțe chimice care provoacă adăugarea sau ștergerea uneia sau a mai multor perechi de bază din molecula de ADN.

Genotoxic: termen general cuprinzând toate tipurile de leziuni ale ADN-ului sau ale cromozomilor, inclusiv ruperi ale ADN-ului, aducții, rearanjări, mutații, aberații cromozomiale și aneuploidie. Nu toate tipurile de efecte genotoxice au drept rezultat mutații sau leziuni cromozomiale stabile.

Mediul HAT: Mediu care conține hipoxantină, aminopterină și timidină, utilizate pentru curățarea celulelor mutante Hprt.

Recombinare mitotică: În timpul mitozei, recombinarea între cromatide omoloage, ceea ce ar putea conduce la inducerea unor rupturi duble ale șirului ADN sau la pierderea heterozigozității.

Mediul MPA: Mediu care conține xantină, adenină, timidină, aminopterină și acid micofenolic utilizat pentru curățarea genelor mutante Xprt.

Mutagen: produce o modificare ereditară a uneia sau mai multor secvențe de perechi de bază de ADN la gene sau a structurii cromozomilor (aberații cromozomiale).

Frecvența mutanților (FM): numărul de colonii de celule mutante observate împărțit la numărul de celule placate într-un mediu selectiv, corectat pentru eficacitatea (sau viabilitatea) clonării la momentul selecției.

Timpul de expresie fenotipică: Timpul după tratament, în care modificarea genetică se fixează în interiorul genomului și orice produse genetice preexistente sunt epuizate până la modificarea trăsăturii fenotipice.

Supraviețuire relativă (RS): RS este utilizat ca indicator al citotoxicității legate de tratament. RS constituie eficacitatea clonării (EC) celulelor placate imediat după tratament, ajustată prin orice pierdere de celule în timpul tratamentului, în comparație cu eficacitatea clonării la martorii negativi (se atribuie o rată de supraviețuire de 100 %).

Fracția S9 a ficatului: supernatant din ficat omogenizat după centrifugare la 9 000 g, și anume extract din ficat crud.

Amestec S9: amestecul dintre fracția S9 a ficatului și cofactorii necesari pentru activitatea metalică a enzimelor.

Martor tratat cu solvent: Termen general pentru a defini culturile martor care primesc doar solventul, care este utilizat pentru a dizolva substanța chimică de testat.

Substanța chimică de testat: orice substanță sau amestec testat utilizând prezenta metodă de testare.

Martor netratat: culturi care nu beneficiază de niciun tratament (și anume, nici substanță chimică de testat, nici solvent), dar care sunt prelucrate în mod simultan și în același mod precum culturile care primesc substanța chimică de testat.

UVCB: substanțe chimice cu o compoziție necunoscută sau variabilă, produși de reacție complexă și materiale biologice

Apendicele 2

FORMULE PENTRU EVALUAREA CITOTOXICITĂȚII ȘI A FRECVENȚEI GENELOR MUTANTE

Citotoxicitatea este evaluată prin supraviețuirea relativă, și anume, eficacitatea clonării (EC) celulelor placate imediat după tratament, ajustată prin orice pierdere de celule în timpul tratamentului, în comparație cu eficacitatea ajustată a clonării la martorii negativi (se atribuie o rată de supraviețuire de 100 %) (a se vedea formula RS de mai jos).

EC ajustată pentru o cultură tratată printr-o substanță chimică de testat se calculează ca:

Formula

RS ajustată pentru o cultură tratată cu o substanță chimică de testat se calculează după cum urmează:

Formula

Frecvența genelor mutante reprezintă eficacitatea clonării coloniilor de gene mutante în mediu selectiv împărțită la eficacitatea clonării în mediu neselectiv, măsurată pentru aceeași cultură la momentul selecției.

Formula

În cazul în care se utilizează plăci pentru eficacitatea clonării:

EC = Număr de colonii/Număr de celule placate.

Atunci când se utilizează plăci cu micro-godeuri pentru eficacitatea clonării:

Numărul de colonii per godeu pe plăcile cu micro-godeuri respectă o distribuție Poisson.

Eficacitatea clonării = -LnP (0)/Numărul celulelor placate per godeu

Unde -LnP(0) este numărul probabil de godeuri goale dintre godeurile însămânțate și este descris prin următoarea formulă

LnP(0) = -Ln (număr de godeuri goale/numărul de godeuri placate)

(3)

În partea B, capitolul B.22 se înlocuiește cu următorul text:

„B.22   TESTUL DE LETALITATE DOMINANTĂ LA ROZĂTOARE

INTRODUCERE

1.

Această metodă de testare (MT) este echivalentă cu Orientarea OCDE nr. 478 privind testarea (TG) (2016). Metodele de testare sunt revizuite periodic în contextul progreselor științifice, al necesităților fluctuante de reglementare și al considerațiilor privind bunăstarea animalelor. Această versiune modificată a metodei de testare reflectă mai mult de 30 de ani de experiență în ceea ce privește acest test, precum și potențialul de a integra sau de a combina acest test cu alte teste de toxicitate, precum studiile privind dezvoltarea toxicității și toxicitatea pentru reproducere sau studiile de genotoxicitate; însă, din cauza limitărilor sale și a utilizării unui număr mare de animale, acest test nu este prevăzut a fi utilizat ca metodă primară, ci ca o metodă de testare suplimentară care poate fi utilizată doar în cazul în care nu există nicio alternativă la cerințele de reglementare. Combinarea testelor de toxicitate are potențialul de a cruța un număr mare de animale pentru a nu fi utilizate în testele de toxicitate. OCDE a elaborat un document care oferă informații succinte privind testarea pentru toxicologia genetică și o prezentare a modificărilor efectuate recent asupra orientărilor OCDE privind testarea pentru toxicologia genetică (1).

2.

Scopul testului de letalitate dominantă (LD) este de a verifica dacă substanțele chimice produc mutații ca urmare a aberațiilor cromozomiale din celulele germinale. În plus, testul de letalitate dominantă este relevant pentru evaluarea genotoxicității deoarece, în pofida faptului că aceștia pot să difere de la o specie la alta, factorii metabolismului in vivo, farmacocinetica și procesele de regenerare a ADN-ului sunt active și contribuie la răspunsuri. Inducerea unei mutații LD după expunerea la o substanță chimică de testat indică faptul că substanța chimică a afectat țesutul germinal al animalului de testare.

3.

Mutațiile LD provoacă moartea embrionului sau a fetusului. Inducerea mutației LD după expunerea la o substanță chimică de testat indică faptul că substanța chimică a afectat celulele germinale ale animalului de testare.

4.

Un test LD este util pentru confirmarea rezultatelor pozitive ale testelor pe baza punctelor finale somatice in vivo și constituie un punct final relevant pentru estimarea pericolelor pentru om și a riscului de boli genetice care se transmit pe linia germenilor. Însă, acest test necesită un număr mare de animale și utilizarea intensivă a forței de muncă; prin urmare, acesta este foarte costisitor și de lungă durată. Deoarece frecvența spontană a mutațiilor letale dominante este destul de mare, sensibilitatea testului pentru detectarea creșterilor mici ale frecvenței mutațiilor este, în general, limitată.

5.

Definițiile termenilor cheie sunt prezentate în apendicele 1.

CONSIDERAȚII INIȚIALE

6.

Testul este desfășurat cel mai frecvent pe șoareci (2) (3) (4), însă pot fi adecvate și alte specii, cum ar fi șobolanii (5) (6) (7) (8), în unele cazuri, în cazul în care acest lucru este justificat din punct de vedere științific. În general, LD-urile constituie rezultatul unor aberații cromozomiale brute (anomalii structurale și numerice) (9) (10) (11), dar mutațiile genetice nu pot fi excluse. O mutație LD este o mutație care se produce într-o celulă germinală în sine sau este fixată după fertilizare în embrionul timpuriu, care nu cauzează disfuncția gametelui, însă este letală pentru oul fertilizat sau embrionul aflat în dezvoltare.

7.

Fiecare mascul este împerecheat în mod succesiv cu femele virgine la intervale de timp adecvate. Numărul de împerecheri în urma tratamentului depinde de scopul final al studiului LD (punctul 23) și ar trebui să se asigure evaluarea tuturor fazelor de maturare a celulelor germinale masculine pentru LD-uri (12).

8.

În cazul în care există dovezi că substanța chimică testată sau metabolitul (metaboliții) acesteia nu va (vor) ajunge la testicul, utilizarea acestui test nu este adecvată.

PRINCIPIUL TESTULUI

9.

În general, masculii sunt expuși la o substanță chimică de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare și sunt împerechiați cu femele virgine netratate. Diferitele tipuri de celule germinale pot fi testate prin utilizarea intervalelor de împerechere succesive. După împerechere, femelele sunt eutanasiate după o perioadă corespunzătoare de timp, iar uterele acestora sunt examinate pentru determinarea numărului de implanturi și de embrioni vii și morți. Mortalitatea dominantă a unei substanțe chimice de testat este determinată prin compararea implanturilor vii pentru o femelă din grupul tratat cu implanturile vii pentru o femelă din grupul martor tratat cu vehicul/solvent. Creșterea numărului de ovule implantate moarte per femelă în lotul tratat comparativ cu cele per femelă din grupul martor reflectă pierderea după implantare indusă de substanța chimică de testat. Pierderea după implantare se calculează prin determinarea raportului dintre implanturile moarte și cele totale la grupul tratat comparativ cu raportul dintre implanturile moarte și cele totale la grupul martor. Pierderea înainte de implantare poate fi estimată prin compararea numărului de corpora lutea minus implanturile totale sau numărul total de implanturi per femelă în grupul tratat și cel martor.

VERIFICAREA COMPETENȚEI LABORATORULUI

10.

Competența în cadrul acestui test ar trebui să fie stabilită prin demonstrarea capacității de a reproduce frecvențele letale dominante din datele publicate [de exemplu, (13) (14) (15) (16) (17) (18)] cu substanțe martor pozitive (inclusiv răspunsuri slabe), cum ar fi cele enumerate în tabelul 1, precum și cu martori tratați cu vehicule, și prin obținerea de frecvențe ale martorilor negativi care constituie un interval de date consecvente acceptabile (a se vedea referințele de mai sus) sau cu distribuția anterioară a martorilor în cadrul laboratorului respectiv, dacă există.

DESCRIEREA METODEI

Pregătiri

Selecția speciilor de animale

11.

Ar trebui să se utilizeze sușe de laborator utilizate în mod curent de la animale mature din punct de vedere sexul și sănătoase. De regulă, se utilizează șoareci, însă șobolanii ar putea fi, de asemenea, adecvați. Orice altă specie adecvată de mamifere poate fi utilizată, în cazul în care se furnizează justificarea științifică în raport.

Condiții de adăpostire și de hrănire a animalelor

12.

În cazul rozătoarelor, temperatura sălii în care se află animalele trebuie să fie de 22 °C (±3 °C). Cu toate că umiditatea relativă este, în mod ideal, de 50-60 %, aceasta trebuie să fie de cel puțin 40 % și să nu depășească, de preferință, 70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul. Spațiul ar trebui să fie iluminat artificial, cu o alternanță de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu asigurarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Alegerea regimului alimentar poate fi influențată de necesitatea de a asigura o proporție adecvată de substanță chimică de testat în cazul alegerii acestei căi de administrare. Înainte de tratament sau de împerechere, rozătoarele ar trebui să fie adăpostite în grupuri mici (maximum cinci) de același sex, în cazul în care nu se preconizează sau se observă vreun comportament agresiv, de preferat în cuști solide, cu o îmbogățire adecvată a mediului. Animalele pot fi adăpostite individual, dacă acest lucru se justifică din punct de vedere științific.

Pregătirea animalelor

13.

Masculii și femelele sănătoase și mature din punct de vedere sexual se distribuie în mod aleatoriu în grupuri martor și grupuri de tratament. Animalele se identifică în mod individual prin utilizarea unei metode umane, minim invazive (de exemplu, prin aplicarea de inele, crotaliere, microcipare sau identificare biometrică, dar nu prin secționarea degetului sau a urechii) și se aclimatizează la condițiile de laborator timp de minimum cinci zile. Cuștile ar trebui să fie dispuse astfel încât să se reducă la minim eventualele efecte datorate amplasării cuștii. Se evită contaminarea încrucișată între martorul pozitiv și substanța chimică de testat. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte o variație minimă și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.

Prepararea dozelor

14.

Substanțele chimice de testat în stare solidă ar trebui dizolvate sau suspendate în solvenți sau vehicule corespunzătoare sau amestecate în hrană sau în apa potabilă înainte de a fi administrate animalelor. Substanțele chimice de testat în stare lichidă se pot administra direct sau se pot dilua înainte de administrare. În cazul expunerilor la inhalare, substanțele chimice de testat pot fi administrate sub formă de gaz, vapori sau aerosol solid/lichid, în funcție de proprietățile lor fizico-chimice. Ar trebui să se utilizeze preparate proaspete de substanță chimică de testat, cu excepția cazului în care datele de stabilitate demonstrează caracterul acceptabil al depozitării și definesc condițiile de depozitare corespunzătoare.

Condiții de testare

Solvent/vehicul

15.

Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la volumele de dozare utilizate și nu ar trebui să existe suspiciunea unei reacții chimice cu substanța chimică de testat. În cazul în care se utilizează alți solvenți/vehicule decât cei recunoscuți, includerea acestora ar trebui să fie justificată cu date de referință care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare mai întâi utilizarea unui solvent/vehicul apos. Printre exemplele de solvenți/vehicule compatibili utilizați în mod obișnuit se numără apa, soluția fiziologică salină, soluția de metilceluloză, soluția de carboximetilceluloză sare de sodiu, uleiul de măsline și uleiul de porumb.

Martori pozitivi

16.

Ar trebui să se utilizeze întotdeauna, concomitent, animale ca martori pozitivi, cu excepția cazului în care laboratorul a demonstrat competență în efectuarea testului și a utilizat în mod curent testul în ultimii ani (de exemplu, în ultimii 5 ani). Însă nu este necesar să se trateze animalele care sunt martori pozitivi pe aceeași cale ca și animalele care primesc substanța chimică de testat sau să se eșantioneze toate intervalele de împerechere. Ar trebui să se cunoască faptul că substanțele martor pozitive produc LD-uri în condițiile utilizate pentru test. Cu excepția tratamentului, animalele din grupurile martor ar trebui tratate în mod identic cu cele din grupurile tratate.

17.

Dozele substanțelor martor pozitive ar trebui să fie selectate astfel încât să producă efecte reduse sau moderate care evaluează în mod critic performanța și sensibilitatea testului, dar care produc în mod consecvent efecte de letalitate dominantă pozitive. Tabelul 1 include exemple de substanțe martor pozitive și dozele adecvate.

Tabelul 1

Exemple de substanțe martor pozitive

Substanță [nr. CAS]

(nr. de referință)

Interval de dozare eficace (mg/kg)

(specii de rozătoare)

Timp de administrare (zile)

Trietilenmelamină [51-18-3] (15)

0,25 (șoareci)

1

Ciclofosfamidă [50-18-0] (19)

50-150 (șoareci)

5

Ciclofosfamidă [50-18-0] (5)

25-100 (șobolani)

1

Metansulfonat de etil [62-50-0] (13)

100-300 (șoareci)

5

Acrilamidă monomerică [79-06-1] (17)

50 (șoareci)

5

Clorambucil [305-03-3] (14)

25 (șoareci)

1

Martori negativi

18.

Animalele martori negativi, tratați doar cu solvent sau vehicul, dar altfel tratați în același mod precum grupurile de tratament, ar trebui să fie incluse în fiecare moment de eșantionare (20). În absența unor date anterioare sau publicate referitoare la martori care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezintă LD-uri sau alte efecte vătămătoare, animalele martor netratate ar trebui să fie, de asemenea, incluse pentru fiecare moment de eșantionare, pentru a stabili acceptabilitatea martorului tratat cu vehicul.

PROCEDURA

Număr de animale

19.

Masculii sunt împerecheați în mod secvențial la intervale adecvate prestabilite (de exemplu, intervale săptămânale, punctele 21 și 23), de preferat, cu o femelă virgină. Numărul de masculi per grup ar trebui să fie prestabilit pentru a fi suficient (în combinație cu numărul de femele împerecheate în fiecare interval de împerechere) pentru a furniza puterea statistică necesară pentru a detecta cel puțin o dublare a frecvenței LD (punctul 44).

20.

Numărul de femele dintr-un interval de împerechere ar trebui să fie prestabilit, de asemenea, prin calcule ale puterii statistice pentru a permite identificarea a cel puțin unei dublări a frecvenței LD (și anume, un număr suficient de femele gestante care să furnizeze cel puțin 400 de implanturi totale) (20) (21) (22) (23) și pentru a preconiza cel puțin un implant mort pe unitate de analiză (de exemplu, grup de împerechere per doză) (24).

Perioada de administrare și intervale de împerechere

21.

Numărul de intervale de împerechere după tratament este reglementat de programul de tratament și ar trebui să asigure evaluarea tuturor fazelor de maturare a celulelor germinale masculine pentru inducția DL (12) (25). Pentru un singur tratament cu maxim cinci doze administrate zilnic, ar trebui să existe 8 (șoarece) sau 10 (șobolan) împerecheri la intervale săptămânale după ultimul tratament. În cazul administrării mai multor doze, numărul de intervale de împerechere poate fi redus proporțional cu creșterea duratei perioadei de administrare, însă cu menținerea obiectivului de evaluare a tuturor fazelor spermatogenezei (de exemplu, după o expunere de 28 de zile, numai 4 împerecheri săptămânale sunt suficiente pentru a evalua toate fazele spermatogenezei la șoarece). Toate programele de tratament și de împerechere ar trebui să fie justificate din punct de vedere științific.

22.

Femelele ar trebui să rămână cu masculii cel puțin pe durata unui ciclu estral (de exemplu, o săptămână acoperă un ciclu estral atât la șoareci, cât și la șobolani). Femelele care nu s-au împerecheat într-un interval de o săptămână pot fi folosite pentru un interval de împerechere ulterior. În mod alternativ, până la împerechere, astfel cum este stabilit prin prezența spermei în vagin sau prin prezența unui dop vaginal.

23.

Regimul de expunere și de împerechere utilizat depinde de obiectivul final al studiului LD. Dacă obiectivul este de a determina dacă o anumită substanță chimică induce mutații LD per se, atunci metoda acceptată ar fi să se expună o întreagă rundă de spermatogeneză (de exemplu, 7 săptămâni la șoarece, 5-7 tratamente pe săptămână) și să se realizeze împerecherea o dată, la sfârșit. Însă, dacă obiectivul este de a identifica tipul de celule germinale sensibile pentru inducerea LD, se preferă o expunere de o zi sau de 5 zile, urmată de împerecherea săptămânală.

Niveluri de dozare

24.

În cazul în care este realizat un studiu preliminar de stabilire a dozelor deoarece nu există date adecvate disponibile pentru a contribui la selectarea dozei, acesta ar trebui să fie realizat în același laborator, utilizând aceeași specie, sușă, sex și regim de tratament precum cele care urmează să fie utilizate în studiul principal (26). Obiectivul studiului este de a identifica doza maximă tolerată (DMT), definită drept doza cea mai mare care va fi tolerată fără dovezi de toxicitate care să limiteze studiul, în funcție de durata perioadei de studiu [de exemplu, comportament sau reacții anormale, reducerea ușoară a greutății corporale sau citotoxicitatea sistemului hematopoietic), dar nu decesul sau semne de durere, suferință sau stres care să necesite eutanasiere (27)].

25.

De asemenea, DMT nu trebuie să afecteze negativ reușita împerecherii (21).

26.

Substanțele chimice de testat cu activitate biologică specifică la doze netoxice mici (cum ar fi hormonii și mitogenii) și substanțele chimice care prezintă saturarea proprietăților toxicocinetice pot face excepție de la criteriile de stabilire a dozelor și ar trebui să fie evaluate de la caz la caz.

27.

Pentru a obține informații privind relația doză-răspuns, un studiu complet ar trebui să includă un grup martor negativ și minim trei niveluri de dozare separate, în general, de un factor de 2, dar nu mai mult de 4. În cazul în care substanța chimică de testat nu produce toxicitate în cadrul unui studiu de stabilire a plajei sau pe baza datelor existente, doza maximă pentru o singură administrare ar trebui să fie de 2 000 mg/kg corp. Cu toate acestea, în cazul în care substanța chimică de testat provoacă toxicitate, DMT ar trebui să fie cea mai mare doză administrată, iar dozele utilizate ar trebui, de preferat, să acopere un interval de toxicitate de la doza maximă până la o doză care provoacă toxicitate minimă sau nu provoacă toxicitate. Pentru substanțele chimice netoxice, doza-limită pentru o perioadă de administrare de cel puțin 14 de zile este de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, iar pentru perioade de administrare de mai puțin de 14 zile, doza-limită este de 2 000 mg/kg greutate corporală/zi.

Administrarea dozelor

28.

La conceperea unui test se ia în considerare calea anticipată de expunere umană. Prin urmare, se pot alege căile de expunere precum alimentația, apa potabilă, expunerea subcutanată, intravenoasă, locală, orală (prin gavaj) sau implantarea, dacă se justifică. În orice caz, calea ar trebui să fie aleasă astfel încât să se asigure expunerea adecvată a țesutului (țesuturilor) țintă. Injecția intraperitoneală nu se recomandă, în mod normal, deoarece nu este o cale prevăzută pentru expunerea umană și ar trebui să fie utilizată doar cu justificări științifice specifice. În cazul în care substanța chimică de testat este administrată în amestec cu hrana sau apa potabilă, în special în cazul administrării unice, se acordă atenție deosebită intervalului dintre consumul de hrană și apă și împerechere, care trebuie să fie suficient pentru a permite identificarea efectelor (punctul 31). Volumul maxim de lichid care se poate administra prin gavaj sau prin injecție într-o singură priză depinde de dimensiunea animalului de testare. De regulă, volumul nu ar trebui să depășească 1 ml/100 g greutate corporală, exceptând cazul soluțiilor apoase, când se pot utiliza maxim 2 ml/100 g. Se justifică utilizarea unor volume mai mari decât această valoare (dacă legislația privind bunăstarea animalelor permite acest lucru). Variabilitatea volumului de testat ar trebui să fie redusă la minimum prin ajustarea concentrației, pentru a asigura un volum constant în raport cu greutatea corporală la toate nivelurile de dozare.

Observații

29.

Se recomandă emiterea de observații clinice generale asupra animalelor de experiență și înregistrarea semnelor clinice cel puțin o dată pe zi, de preferat la aceeași (aceleași) oră (ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrarea dozei. În perioada de administrare a dozei, ar trebui să fie observate toate animalele, cel puțin de două ori pe zi, pentru a se determina morbiditatea și mortalitatea. Toate animalele ar trebui să fie cântărite la începutul studiului și cel puțin o dată pe săptămână în timpul studiilor asupra dozelor repetate, precum și la momentul eutanasierii. Consumul de hrană ar trebui să fie măsurat cel puțin săptămânal. În cazul în care substanța chimică de testat este administrată prin apa de băut, ar trebui să se măsoare consumul de apă la fiecare schimbare de apă și cel puțin o dată pe săptămână. Animalele care prezintă indicatori neletali de toxicitate excesivă ar trebui să fie eutanasiate înainte de finalizarea perioadei de testare (27).

Colectarea și prelucrarea țesuturilor

30.

Femelele sunt eutanasiate în a doua jumătate a perioadei de sarcină, în ziua de gestație (ZG) 13 la șoareci și în ZG 14-15 la șobolani. Se examinează uterele pentru identificarea efectelor de letalitate dominantă în vederea determinării numărului de implanturi, de embrioni vii și morți și de corpi galbeni.

31.

Coarnele uterine și ovarele sunt expuse pentru numărarea corpurilor galbene, iar fetușii sunt îndepărtați, numărați și cântăriți. Ar trebui să se examineze cu atenție uterele pentru identificarea de resorbții mascate de fetușii vii și să se asigure enumerarea tuturor resorbțiilor. Mortalitatea fetală este înregistrată. Se înregistrează, de asemenea, numărul de femele impregnate cu succes și numărul total de implantații, pierderile anterioare implantării și mortalitatea post-implantare (inclusiv resorbțiile timpurii sau târzii). În plus, fetușii vizibili pot fi conservați în fixator Bouin timp de cel puțin două săptămâni, iar apoi examinați pentru identificarea de malformații externe majore (28) pentru a furniza informații suplimentare cu privire la efectele de reproducere și de dezvoltare ale agentului de testat.

DATE ȘI RAPORTARE

Prelucrarea rezultatelor

32.

Datele ar trebui să fie prezentate în format tabelar pentru indicarea numărului de masculi împerecheați, de femele gestante și de femele negestante. Rezultatele fiecărei împerecheri, inclusiv identitatea fiecărui mascul și a fiecărei femele, ar trebui să fie consemnate individual. Pentru fiecare femelă ar trebui să se specifice intervalul de împerechere, nivelul dozei pentru masculii tratați și numărul implanturilor vii și al implanturilor moarte.

33.

Pierderile din faza de post-implantare se calculează prin determinarea raportului dintre implanturile moarte și cele totale la grupul tratat comparativ cu raportul dintre implanturile moarte și cele totale la grupul martor tratat cu vehicul/solvent.

34.

Pierderile din faza de pre-implantare sunt calculate ca o diferență între numărul de corpuri galbene și numărul de implanturi sau ca o reducere a numărului mediu de implanturi per femelă în comparație cu împerecherile martor. În cazul în care se estimează pierderile din faza de pre-implantare, acestea ar trebui să fie consemnate.

35.

Factorul de letalitate dominantă este estimat ca fiind: (decese post-implantare/implantări totale per femelă) × 100.

36.

Ar trebui să se raporteze datele cu privire la toxicitate și semne clinice în conformitate cu punctul 29.

Criterii de acceptabilitate

37.

Următoarele criterii determină acceptabilitatea unui test.

Martorul negativ testat în paralel este în concordanță cu normele publicate referitoare la datele privind martorii negativi testați anterior și datele anterioare ale laboratorului privind martorii, dacă sunt disponibile (a se vedea punctele 10 și 18).

Martorii pozitivi testați în paralel induc răspunsuri consecvente cu normele publicate pentru datele privind martorii pozitivi testați anterior sau cu baza de date a laboratorului privind martorii pozitivi testați anterior, dacă sunt disponibile, și produc o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ (a se vedea punctele 17 și 18).

A fost analizat un număr adecvat de implanturi și doze totale (punctul 20).

Criteriile pentru selecția dozei de vârf sunt în concordanță cu cele descrise la punctele 24 și 27.

Evaluarea și interpretarea rezultatelor

38.

Pentru a furniza date suficiente pentru analiza doză-răspuns, ar trebui să se analizeze cel puțin trei grupuri de doze tratate.

39.

Cu condiția îndeplinirii tuturor criteriilor de acceptabilitate, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar pozitivă în cazul în care:

cel puțin una dintre dozele de testare prezintă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel;

creșterea este legată de doză în cel puțin o stare experimentală (de exemplu, un interval săptămânal de împerechere) atunci când evaluarea are loc în cadrul unui test corespunzător; și,

oricare dintre aceste rezultate se situează în afara intervalului acceptabil de date privind martorul negativ, sau a distribuției de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limita de control de 95 % pe baza distribuției Poisson), dacă există.

Apoi substanța chimică de testat este considerată capabilă să inducă mutații de letalitate dominantă la celulele germinale ale animalelor de testare. În punctul 44 sunt prezentate recomandări privind cele mai adecvate metode statistice (44); alte abordări statistice recomandate pot fi găsite, de asemenea, în referințele bibliografice (20) (21) (22) (24) (29). Testele statistice utilizate ar trebui să considere animalul ca fiind unitatea experimentală.

40.

Cu condiția îndeplinirii tuturor criteriilor de acceptabilitate, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar negativă în cazul în care:

niciuna dintre dozele de testare nu prezintă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel;

nu există o creștere legată de doză în nicio condiție experimentală; și

toate rezultatele se situează în intervalul acceptabil de date privind martorul negativ sau de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limita de control de 95 % pe baza distribuției Poisson), dacă există.

Apoi substanța chimică de testat este considerată incapabilă să inducă mutații de letalitate dominantă la celulele germinale ale animalelor de testare.

41.

În cazul unui răspuns clar pozitiv sau clar negativ, nu există nicio cerință referitoare la verificare.

42.

În cazul în care răspunsul nu este în mod clar negativ sau pozitiv și pentru a contribui la stabilirea relevanței biologice a unui rezultat (de exemplu, o creștere ușoară sau la limită), datele ar trebui evaluate în cadrul unei expertize și/sau al unor investigații suplimentare, folosind datele experimentale existente, cum ar fi analiza problemei dacă rezultatul pozitiv se situează în afara intervalului acceptabil al datelor privind martorii negativi sau al datelor istorice privind martorii negativi din laborator (30).

43.

În cazuri rare, chiar și după efectuarea de investigații suplimentare, setul de date va exclude posibilitatea stabilirii unei concluzii pentru rezultate pozitive sau negative și, prin urmare, se va concluziona că acesta este echivoc.

44.

Testele statistice utilizate ar trebui să considere masculul ca fiind unitatea experimentală. Deși este posibil ca datele privind numărarea (de exemplu, numărul implanturilor pe femelă) să fie distribuite conform distribuției Poisson și/sau proporțiile (de exemplu, proporția implanturilor moarte) să fie distribuite binomial, aceste date sunt deseori dispersate excesiv (31). În consecință, analiza statistică ar trebui să recurgă mai întâi la un test pentru identificarea dispersiei deficitare-excesive utilizând teste de varianță, cum ar fi testul de varianță binomială al lui Cochran (32) sau testul C(α) al lui Tarone pentru dispersie binominală excesivă (31) (33). În cazul în care nu se detectează nicio abatere de la dispersia binomială, pot fi testate tendințele proporțiilor la diferite niveluri de doze prin testul Cochran-Armitage al tendințelor (34) și se pot testa comparațiile pe perechi cu grupul martor prin testul Fisher al exactității (35). De asemenea, în cazul în care nu se detectează nicio abatere de la dispersia Poisson, tendințele numărătorilor pot fi testate folosind regresia Poisson (36), iar comparațiile pe perechi cu grupul martor pot fi testate în contextul modelului Poisson, utilizând contraste pe perechi (36). În cazul în care se detectează o dispersie deficitară sau excesivă semnificativă, se recomandă metodele care nu sunt bazate pe parametri (23) (31). Printre acestea se numără testele bazate pe clasificare, cum ar fi testul Jonckheere-Terpstra pentru tendință (37) și testele Mann-Whitney (38) pentru comparații pe perechi cu grupul martor tratat cu vehicul/solvent, cât și testele de permutație, re-eșantionare sau de tip bootstrap pentru comparații ale tendințelor și pe perechi cu grupul martor (31) (39).

45.

Un test LD pozitiv oferă dovezi privind genotoxicitatea substanței chimice de testat la celulele germinale ale masculilor tratați din specia de testat.

46.

Analizarea problemei dacă valorile observate se situează în interiorul sau în afara intervalului martor istoric poate oferi îndrumări la evaluarea semnificației biologice a răspunsului (40).

Raport testului

47.

Raportul testului ar trebui să includă următoarele informații:

Sinteză.

 

Substanța chimică de testat:

sursa, numărul lotului, data limită de utilizare, dacă sunt disponibile;

stabilitatea substanței chimice de testat, dacă se cunoaște;

solubilitatea și stabilitatea substanței chimice de testat în solvent, dacă se cunosc;

măsurarea pH-ului, a osmolalității și a precipitatului în mediul de cultură în care s-a adăugat substanța chimică de testat, după caz.

 

Substanță mono-constituent:

aspectul fizic, solubilitatea în apă și alte proprietăți fizico-chimice relevante;

identificarea chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS, numărul CAS sau codul său InChI, formula structurală, puritatea, identitatea chimică a impurităților după cum este necesar și fezabil din punct de vedere practic etc.

 

Substanță multicomponentă, UVCB și amestecuri:

în măsura în care este posibil, caracterizată prin identitatea chimică (a se vedea mai sus), apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante ale componentelor.

 

Prepararea substanței chimice de testat:

justificarea alegerii vehiculului;

solubilitatea și stabilitatea substanței chimice de testat în solvent/vehicul, dacă se cunosc;

prepararea formulărilor hranei, a apei potabile sau a inhalărilor;

determinări analitice cu privire la formulări (de exemplu, stabilitatea, omogenitatea, concentrațiile nominale), atunci când sunt realizate.

 

Animale de testare:

specia/sușa utilizată și o justificare a alegerii acestora;

numărul, vârsta și sexul animalelor;

sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.;

metoda de identificare unică a animalelor;

pentru studii pe termen scurt: greutatea corporală a fiecărui mascul la începutul și la sfârșitul testului; pentru studii cu o durată mai mare de o săptămână: greutatea corporală individuală pe parcursul studiului și consumul de hrană. Ar trebui să fie inclus intervalul de greutate, valoarea medie și deviația standard pentru fiecare grup.

 

Condiții de testare:

date cu privire la martori pozitivi și negativi (solvent/vehicul);

datele din studiul de stabilire a intervalului dozelor;

justificarea selecției nivelului dozei administrate;

detalii privind prepararea substanței chimice de testat;

detalii privind administrarea substanței chimice de testat;

justificarea căii de administrare;

metodele de măsurare a toxicității pentru animale, inclusiv, după caz, analize histopatologice sau hematologice și frecvența cu care s-au efectuat observațiile și cu care s-a măsurat greutatea corporală a animalelor;

metode prin care se verifică dacă substanța chimică de testat a ajuns în țesutul țintă sau în circulația generală, în cazul în care se obțin rezultate negative;

doza efectivă (mg/kg greutate corporală/zi) calculată din concentrația substanței chimice de testat (ppm) în hrană/ apă potabilă și consum, dacă este cazul;

detalii cu privire la calitatea hranei și a apei;

detalii privind îmbogățirea mediului din captivitate;

descrierea amănunțită a schemelor de tratament și de eșantionare și justificările alegerilor;

metoda de analgezie;

metoda de eutanasiere;

proceduri pentru izolarea și păstrarea țesuturilor;

sursa și numărul lotului pentru toate trusele și reactivii (după caz);

metodele de enumerare a LD-urilor;

programul de împerechere;

metodele folosite pentru confirmarea împerecherii;

momentul eutanasierii;

criteriile de punctare a efectelor LD, inclusiv a corpurilor galbene, a implantărilor, a resorbțiilor și a pierderilor dinaintea implantării, a implanturilor vii și moarte.

 

Rezultate:

starea animalelor înainte și pe toată durata perioadei de testare, inclusiv semne de toxicitate;

greutatea corporală masculină în timpul tratamentului și al perioadelor de împerechere;

numărul de femele împerecheate;

relația doză-răspuns, dacă este posibil;

date concomitente și istorice privind martorii negativi cu intervale, valori medii și deviații standard;

date concomitente privind martorii pozitivi;

date sub formă de tabel pentru fiecare femelă gravidă, inclusiv: număr de corpuri galbene; număr de embrioni implantați; numărul de resorbții și pierderi înainte de implantare; număr de implanturi vii; număr de implanturi moarte; greutăți ale fetusului;

datele de mai sus sintetizate pentru fiecare perioadă de împerechere și doză, cu frecvențele de letalitate dominantă;

analize statistice și metode aplicate.

 

Discutarea rezultatelor.

 

Concluzie.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

(1)

OCDE (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, nr. 234, OCDE, Paris.

(2)

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, în Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M. și Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Elaborat de către grupul de lucru „Dominant” lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185

(4)

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159-167.

(5)

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. și Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.

(6)

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. și Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. și Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.

(8)

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. și Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.

(9)

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P. și Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

(10)

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. și Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.

(11)

Marchetti F. și Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.

(12)

Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13)

Favor J. și Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21-27.

(14)

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. și Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15)

Hastings S.E., Huffman K.W. și Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.

(16)

James D.A. și Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.

(17)

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. și Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

(18)

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. și Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

(19)

Holstrom L.M., Palmer A.K. și Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. și Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 129-156.

(20)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. și Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. și Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

(22)

Generoso W.M. și Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.

(23)

Haseman J.K. și Soares E.R. (1976). The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24)

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.

(25)

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S. și Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. și Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.

(27)

OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr. 19), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris.

(28)

Barrow M.V., Taylor W.J și Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

(29)

Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. și Thybaud V. (2011). „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87-90.

(31)

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. și Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.

(32)

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33)

Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34)

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. În Encyclopedia of Statistical Sciences, volumul 9, Kotz S. și Johnson N. L. (Eds.), pp. 334-336. John Wiley and Sons, New York.

(35)

Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36)

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. și Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, a patra ediție, capitolele 14 și 17. McGraw-Hill, Boston

(37)

Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.

(38)

Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)

Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

Apendicele 1

DEFINIȚII

Substanță chimică: o substanță sau un amestec

Corp(uri) galben(e): structura hormonală secretoare formată pe ovar, în locul în care un folicul a eliberat oul. Numărul de corpuri galbene din ovare corespunde numărului de ouă care au fost produse.

Mutație cu letalitate dominantă: o mutație care apare într-o celulă germinală sau este fixată după fertilizare și care provoacă moartea embrionului sau a fătului.

Rată de fertilitate: numărul de femele gestante împerecheate pe numărul de femele împerecheate.

Interval de împerechere: intervalul de timp dintre sfârșitul expunerii și împerecherea masculilor tratați. Prin controlarea acestui interval se pot evalua efectele chimice asupra diferitelor tipuri de celule germinale. La împerecherea șoarecilor în săptămânile 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 și 8, după sfârșitul expunerii, măsoară efectele produse la nivelul spermei, al spermatidelor condensate, al spermatidelor rotunde, al spermatocitelor pachitene, al spermatocitelor timpurii, al spermatocitelor diferențiate, cu diferențierea între spermatogonie și spermatogonia celulele stem.

Pierdere pre-implantare: diferența dintre numărul de implanturi și numărul de corpuri galbene. Acesta poate fi estimat, de asemenea, prin compararea implanturilor totale per femelă în grupul tratat și cel martor.

Pierdere post-implantare: raportul dintre implanturile moarte din grupul tratat comparativ cu raportul dintre implanturile moarte și cele totale la grupul martor.

Substanța chimică de testat: orice substanță sau amestec testat utilizând prezenta metodă de testare.

UVCB: substanță cu compoziție necunoscută sau variabilă, produse de reacție complexă sau materiale biologice

Apendicele 2

DURATA SPERMATOGENEZEI LA MAMIFERE

Image 1

Fig. 1: Compararea duratei (în zile) a dezvoltării celulelor germinale masculine la șoareci, șobolani și la om. Repararea ADN-ului nu are loc în perioadele marcate prin nuanțare.

Mai sus este prezentată o schemă a spermatogenezei la șoarece, șobolan și om (preluată de la Adler, 1996). Printre spermatogoniile nediferențiate se numără: A-unice; A-perechi; și spermatogonii A-aliniate (Hess și de Franca, 2008). Spermatogonia A-unică este considerată a fi adevăratele celule stem; prin urmare, pentru evaluarea efectelor asupra celulelor stem, ar trebui să treacă cel puțin 49 zile (la șoarece) de la ultima injecție a substanței chimice de testat și împerechere.

Referințe

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. În: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

(4)

În partea B, capitolul B.23 se înlocuiește cu următorul text:

„B.23   TEST DE ABERAȚIE CROMOZOMIALĂ PE SPERMATOGONII DE MAMIFERE

INTRODUCERE

1.

Această metodă de testare (MT) este echivalentă cu Orientarea OCDE nr. 483 privind testarea (TG) (2016). Metodele de testare sunt revizuite periodic în contextul progreselor științifice, al necesităților fluctuante de reglementare și al considerațiilor privind bunăstarea animalelor. Această versiune modificată a metodei de testare mulți ani de experiență în ceea ce privește acest test, precum și potențialul de a integra sau de a combina acest test cu alte studii de toxicitate sau de genotoxicitate; Combinarea studiilor de toxicitate are potențialul de a reduce numărul de animale utilizate în testele de toxicitate. Această metodă de testare face parte dintr-o serie de metode de testare cu privire la toxicologia genetică. OCDE a elaborat un document care oferă informații succinte privind testarea pentru toxicologia genetică și o prezentare a modificărilor efectuate recent asupra orientărilor OCDE privind testarea pentru toxicologia genetică (1).

2.

Scopul testului in vivo de aberație cromozomială pe spermatogonii de mamifere constă în identificarea acelor substanțe chimice care produc aberații cromozomiale ale structurii în celulele spermatogoniale ale mamiferelor (2) (3) (4). În plus, acest test este relevant pentru evaluarea genotoxicității deoarece, în pofida faptului că aceștia pot să difere de la o specie la alta, factorii metabolismului in vivo, farmacocinetica și procesele de regenerare a ADN-ului sunt active și contribuie la răspunsuri. Această metodă de testare nu este concepută pentru a măsura anomaliile numerice; testul nu este utilizat în mod obișnuit în acest scop.

3.

Acest test măsoară aberațiile cromozomiale structurale (tipul cromozom și cromatidă) la împărțirea celulelor germinale spermatogoniale și, prin urmare, se preconizează că va prezice inducția mutațiilor ereditare la aceste celule germinale.

4.

Definițiile principalilor termeni sunt prevăzute în apendice.

CONSIDERAȚII INIȚIALE

5.

De regulă, se utilizează rozătoare în cadrul acestui test, însă, în unele cazuri, ar putea fi adecvată și utilizarea altor specii, dacă acest lucru este justificat din punct de vedere științific. Preparatele citogenetice standard din testiculele rozătoarelor produc metafaze mitotice (spermatogonii) și meiotice (spermatocite). Metafazele mitotice și meiotice sunt identificate pe baza morfologiei cromozomilor (4). Prezentul test citogenetic in vivo permite detectarea aberațiilor cromozomiale din mitozele spermatogoniale. Alte celule-țintă nu fac obiectul prezentei metode de testare.

6.

Pentru detectarea aberațiilor de tip cromatidă din celulele spermatogoniale, ar trebui să se examineze prima diviziune celulară mitotică după tratament, înainte ca aceste aberații să fie transformate în aberații de tip cromozomial în cadrul diviziunilor celulare ulterioare. Informații suplimentare pot fi obținute din spermatocitele tratate prin analiza cromozomilor meiotici pentru aberații cromozomiale structurale în metafaza I și II a diachinezei.

7.

În testicul există un număr de generații de spermatogonii (5), iar aceste tipuri diferite de celule germinale pot avea un spectru de sensibilitate la tratamentul chimic. Astfel, aberațiile detectate reprezintă un răspuns agregat al populațiilor de celule spermatogoniale tratate. Majoritatea celulelor mitotice din preparatele pentru testicul sunt spermatogonii B, care au un ciclu celular de aproximativ 26 h (3).

8.

În cazul în care există dovezi că substanța chimică testată sau metabolitul (metaboliții) acesteia nu va (vor) ajunge la testicul, utilizarea acestui test nu este adecvată.

PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

9.

În general, animalele sunt expuse la substanța chimică de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare și sunt eutanasiate la momentul corespunzător după tratament. Înainte de eutanasiere, animalele sunt tratate cu un agent de inhibare a metafazei (de exemplu, colchicină sau Colcemid®). Apoi, din celulele germinale, se realizează preparate cromozomiale care se colorează, iar celulele în metafază sunt analizate la microscop pentru detectarea aberațiilor cromozomiale.

VERIFICAREA COMPETENȚEI LABORATORULUI

10.

Competența în cadrul acestui test ar trebui să fie stabilită prin demonstrarea capacității de a reproduce rezultatele preconizate pentru frecvențele aberațiilor cromozomiale structurale la spermatogonii cu substanțe martor pozitive (inclusiv răspunsuri slabe), cum ar fi cele enumerate în tabelul 1, și obținerea de frecvențe ale martorului negativ care sunt consecvente cu o gamă acceptabilă de date despre martori din literatura publicată [de exemplu: (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)] sau distribuția istorică a martorilor din laborator, dacă există.

DESCRIEREA METODEI

Pregătiri

Selecția speciilor de animale

11.

Ar trebui să se utilizeze sușe de laborator utilizate în mod curent, alegându-se animale adulte, tinere, sănătoase. De regulă, se utilizează șoareci masculi; însă, se pot utiliza masculi și din alte specii de mamifere adecvate, în cazul în care acest lucru este justificat din punct de vedere științific și pentru a permite efectuarea acestui test în comun cu o altă metodă de testare. Justificarea științifică pentru utilizarea altor specii decât rozătoare ar trebui prezentată în raport.

Condiții de adăpostire și de hrănire a animalelor

12.

În cazul rozătoarelor, temperatura sălii în care se află animalele trebuie să fie de 22 °C (±3 °C). Cu toate că umiditatea relativă este, în mod ideal, de 50-60 %, aceasta trebuie să fie de cel puțin 40 % și să nu depășească, de preferință,70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul. Spațiul ar trebui să fie iluminat artificial, cu o alternanță de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu asigurarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Alegerea regimului alimentar poate fi influențată de necesitatea de a asigura o proporție adecvată de substanță chimică de testat în cazul alegerii acestei căi de administrare. Rozătoarele ar trebui să fie adăpostite în grupuri mici (maximum cinci), în cazul în care nu se preconizează vreun comportament agresiv, de preferat în cuști solide la sol, cu o îmbogățire adecvată a mediului. Animalele pot fi adăpostite individual, dacă acest lucru se justifică din punct de vedere științific.

Pregătirea animalelor

13.

Masculii adulți, tineri și sănătoși (cu vârsta de 8-12 săptămâni la începutul tratamentului) sunt utilizați, de regulă, și repartizați aleatoriu în grupurile de control și de tratament. Animalele se identifică în mod individual prin utilizarea unei metode umane, minim invazive (de exemplu, prin aplicarea de inele, crotaliere, microcipare sau identificare biometrică, dar nu prin secționarea urechii sau a degetului) și se aclimatizează la condițiile de laborator timp de minimum cinci zile. Cuștile ar trebui să fie dispuse astfel încât să se reducă la minim eventualele efecte datorate amplasării cuștii. Ar trebui să se evite contaminarea încrucișată între martorul pozitiv și substanța chimică de testat. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte o variație minimă și să nu depășească ± 20 %.

Prepararea dozelor

14.

Substanțele chimice de testat în stare solidă ar trebui dizolvate sau suspendate în solvenți sau vehicule corespunzătoare sau amestecate în hrană sau în apa potabilă înainte de a fi administrate animalelor. Substanțele chimice de testat în stare lichidă se pot administra direct sau se pot dilua înainte de administrare. În cazul expunerilor la inhalare, substanțele chimice de testat pot fi administrate sub formă de gaz, vapori sau aerosol solid/lichid, în funcție de proprietățile lor fizico-chimice. Ar trebui să se utilizeze preparate proaspete de substanță chimică de testat, cu excepția cazului în care datele de stabilitate demonstrează caracterul acceptabil al depozitării și definesc condițiile de depozitare corespunzătoare.

Condiții de testare - Solvent/vehicul

15.

Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozajele utilizate și nu ar trebui să reacționeze chimic cu substanțele chimice de testat. În cazul în care se utilizează alți solvenți/vehicule decât cei recunoscuți, includerea acestora ar trebui să fie justificată cu date de referință care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, în măsura în care este posibil, să se ia în considerare în primă instanță utilizarea unui solvent/vehicul apos. Printre exemplele de solvenți/vehicule compatibili utilizați în mod obișnuit se numără apa, soluția fiziologică salină, soluția de metilceluloză, soluția de carboximetilceluloză sare de sodiu, uleiul de măsline și uleiul de porumb. În absența unor date anterioare sau publicate cu privire la martori care să ateste faptul că nicio aberație cromozomială de structură și alte efecte vătămătoare nu sunt induse de un anumit solvent/vehicul atipic, se efectuează un studiu inițial pentru a stabili acceptabilitatea martorului tratat cu solvent/vehicul.

Martori pozitivi

16.

Ar trebui să se utilizeze întotdeauna, concomitent, animale ca martori pozitivi, cu excepția cazului în care laboratorul a demonstrat competență în efectuarea testului și a utilizat în mod curent testul în ultimii ani (de exemplu, în ultimii 5 ani). În cazul în care nu este inclus un grup de martori pozitivi testați în paralel, în fiecare experiment ar trebui să fie incluși martori examinați (lame fixate și necolorate). Acestea pot fi obținute prin includerea în sistemul de punctare a probelor de referință adecvate ale studiului care au fost obținute și păstrate dintr-un experiment separat pe martor pozitiv realizat periodic (de exemplu, la 6-18 luni) în laboratorul în care este efectuat testul; de exemplu, în timpul testării competențelor și, ulterior, în mod regulat, după caz.

17.

Substanțele chimice martor pozitive ar trebui să producă în mod fiabil o creștere detectabilă a frecvențelor celulelor cu aberații cromozomiale structurale peste nivelurile spontane. Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât să se obțină efecte clare, dar fără a releva imediat examinatorului identitatea probelor codate. Tabelul 1 include exemple de substanțe chimice martor pozitive.

Tabelul 1

Exemple de substanțe martor pozitive

Substanțe [nr. CAS] (nr. de referință)

Ciclofosfamidă (monohidrat) [nr. CAS 50-18-0 (nr. CAS 6055-19-2)] (9)

Ciclohexilamină [nr. CAS 108-91-8] (7)

Mitomicină C [CAS nr. 50-07-7] (6)

Acrilamidă monomerică [79-06-1] (10)

Trietilenmelamină [nr. CAS 51-18-3]

Martori negativi

18.

Animalele martori negativi, tratați doar cu solvent sau vehicul, dar altfel tratați în același mod precum grupurile de tratament, ar trebui să fie incluse în fiecare eșantionare. În absența unor date anterioare sau publicate referitoare la martori care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezintă aberații cromozomiale sau alte efecte vătămătoare, animalele martor netratate ar trebui să fie, de asemenea, incluse pentru fiecare moment de eșantionare, pentru a stabili acceptabilitatea martorului tratat cu vehicul.

PROCEDURA

Număr de animale

19.

Dimensiunile grupului la începutul studiului ar trebui să fie stabilite cu scopul de a oferi minim 5 masculi pentru fiecare grup. Acest număr de animale pe grup este considerat a fi suficient pentru a asigura o putere statistică adecvată (adică, în general, poate detecta cel puțin o dublare a frecvenței aberațiilor cromozomiale atunci când nivelul martorului negativ este de 1,0 % sau mai mare, cu o probabilitate de 80 % la un nivel de semnificație de 0,05) (3) (11). Ca o orientare pentru cerințe maxime tipice animalelor, un studiu efectuat la două eșantionări cu trei grupuri de dozaj și un grup martor negativ testat în paralel, la care se adaugă un grup martor pozitiv (fiecare grup alcătuit din cinci animale pe grup) ar necesita 45 de animale.

Schema de tratament

20.

Substanțele chimice de testat sunt administrate, de obicei, o singură dată (și anume, un singur tratament); ar putea fi utilizate alte regimuri de dozaj, cu condiția ca acestea să fie justificate din punct de vedere științific.

21.

La grupa cu dozajul maxim, se utilizează două eșantionări după tratament. Întrucât timpul necesar pentru absorbția și metabolizarea substanței (substanțelor) chimice de testat, precum și acțiunea acesteia (acestora) asupra cineticii ciclului celular poate avea efecte asupra timpului optim pentru detectarea aberației cromozomiale, se utilizează o eșantionare târzie la aproximativ 24 și 48 de ore după tratament. Pentru doze diferite de cea mai mare doză, se stabilește un interval de eșantionare timpurie de 24 de ore (cel mult egal cu durata ciclului celular la spermatogonii B și, astfel, optimizând probabilitatea de a puncta primele metafazate de după tratament) după tratament, cu excepția cazului în care se cunoaște faptul un alt interval de eșantionare ca fiind mai adecvat și justificat.

22.

Se pot utiliza și alte eșantionări. De exemplu, în cazul substanțelor chimice care exercită efecte independente S, pot fi adecvate intervale de eșantionare timpurii (și anume, mai mici de 24 de ore).

23.

Se poate aplica un regim de tratament cu repetarea dozei, cum ar fi concomitent cu un test asupra unui alt punct final care utilizează o perioadă de administrare de 28 de zile (de exemplu, TM B.58); însă, ar fi necesare grupuri de animale suplimentare pentru încadrarea unor intervale de eșantionare diferite. În consecință, caracterul adecvat al unui astfel de program trebuie justificat științific de la caz la caz.

24.

Înainte de eutanasiere, se procedează la injectarea intraperitoneală a animalelor cu o doză corespunzătoare de substanță chimică de inhibare a metafazei (de exemplu Colcemid® sau colchicină). Eșantionarea animalelor este efectuată apoi la un interval corespunzător. În cazul șoarecilor și al șobolanilor, acest interval este de aproximativ 3-5 ore.

Doze

25.

În cazul în care se efectuează un studiu preliminar de stabilire a dozelor din cauza faptului că nu există date deja disponibile pentru a contribui la selectarea dozei, acesta este realizat în același laborator, utilizând aceeași specie, sușă și regim de tratament care urmează să fie utilizate în studiul principal, în conformitate cu recomandările pentru realizarea de studii de stabilire a dozelor (12). Studiul ar trebui să aibă ca obiectiv identificarea dozei maxime tolerate (DMT), definită ca doza care induce efecte toxice ușoare în raport cu durata perioadei de studiu (de exemplu, un comportament sau reacții anormale sau scăderea ușoară a greutății corporale sau citotoxicitate în sistemul hematopoietic), dar nu decesul sau semne de durere, suferință sau stres care necesită eutanasierea animalelor (13).

26.

Doza maximă poate fi definită ca fiind doza care produce anumite semne de toxicitate la celulele spermatogoniale (de exemplu, o diminuare a proporției de mitoze spermatogoniale în raport cu prima și a doua metafază meiotică). Reducerea respectivă nu ar trebui să fie mai mare de 50 %.

27.

Substanțele chimice de testat cu activitate biologică specifică la doze netoxice mici (cum ar fi hormonii și mitogenii) și substanțele chimice care prezintă saturarea proprietăților toxicocinetice pot face excepție de la criteriile de stabilire a dozelor și ar trebui să fie evaluate de la caz la caz.

28.

Pentru a obține informații privind relația doză-răspuns, un studiu complet ar trebui să includă un grup martor negativ (punctul 18) și minim trei niveluri de dozare separate, în general, de un factor de 2, dar nu mai mare de 4. În cazul în care substanța chimică de testat nu produce toxicitate într-un studiu de stabilire a dozelor sau pe baza datelor existente, doza maximă pentru o singură administrare este de 2 000 mg/kg corp. Cu toate acestea, în cazul în care substanța chimică de testat provoacă toxicitate, DMT ar trebui să fie cea mai mare doză administrată, iar dozele utilizate ar trebui, de preferat, să acopere un interval de toxicitate de la doza maximă până la o doză care provoacă toxicitate minimă sau la care nu provoacă toxicitate. În cazul în care se observă toxicitate în țesutul țintă (și anume, în testicule) la toate dozele testate, se recomandă realizarea unui studiu suplimentar la doze netoxice. Studiile care au drept scop caracterizarea pe deplin a informațiilor cantitative doză-răspuns pot necesita grupuri suplimentare de dozare. Pentru anumite tipuri de substanțe chimice de testat (de exemplu, produsele farmaceutice umane) reglementate prin cerințe specifice, aceste limite pot varia. În cazul în care substanța chimică de testat produce toxicitate, ar trebui să fie selectată doza-limită plus două doze mai mici (astfel cum este descris mai sus). Doza-limită pentru o perioadă de administrare de cel puțin 14 de zile este de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, iar pentru perioade de administrare mai mici de 14 zile, doza-limită este de 2 000 mg/kg greutate corporală/zi.

Administrarea dozelor

29.

La conceperea unui test se ia în considerare calea anticipată de expunere umană. Prin urmare, căile de expunere precum alimentația, apa potabilă, expunerea locală, subcutanată, intravenoasă, calea orală (prin gavaj), inhalarea sau implantarea pot fi alese ca fiind justificate. În orice caz, calea ar trebui să fie aleasă astfel încât să se asigure expunerea adecvată a țesutului-țintă. Injectarea intraperitoneală nu se recomandă, în mod normal, decât dacă aceasta este justificată din punct de vedere științific, întrucât aceasta nu este, de regulă, o cale relevantă de expunere umană din punct de vedere fiziologic. În cazul în care substanța chimică de testat este administrată în amestec cu hrana sau apa potabilă, în special în cazul administrării unice, se acordă atenție deosebită intervalului dintre consumul de hrană și apă și eșantionare, care trebuie să fie suficient pentru a permite identificarea efectelor (a se vedea punctul 33). Volumul maxim de lichid care se poate administra prin gavaj sau prin injecție într-o singură priză depinde de dimensiunea animalului de testare. De regulă, volumul nu ar trebui să depășească 1 ml/100 g greutate corporală, exceptând cazul soluțiilor apoase, când se pot utiliza maxim 2 ml/100 g greutate corporală. Se justifică utilizarea unor volume mai mari decât această valoare (dacă legislația privind bunăstarea animalelor permite acest lucru). Variabilitatea volumului de testat ar trebui să fie redusă la minimum prin ajustarea concentrației, pentru a asigura un volum constant în raport cu greutatea corporală la toate nivelurile de dozare.

Observații

30.

Se recomandă emiterea de observații clinice generale asupra animalelor de experiență și înregistrarea semnelor clinice cel puțin o dată pe zi, de preferat la aceeași (aceleași) oră (ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrarea dozei. Toate animalele ar trebui să fie examinate cel puțin de două ori pe zi pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea. Toate animalele ar trebui să fie cântărite la începutul studiului, cel puțin o dată pe săptămână în timpul studiilor cu doză repetată și la eutanasiere. În cadrul studiilor cu o durată de cel puțin o săptămână, ar trebui să se măsoare consumul de hrană cel puțin săptămânal. În cazul în care substanța chimică de testat este administrată prin apa de băut, ar trebui să se măsoare consumul de apă la fiecare schimbare de apă și cel puțin o dată pe săptămână. Animalele care prezintă indicatori neletali de toxicitate excesivă ar trebui să fie eutanasiate înainte de finalizarea perioadei de testare (13).

Prepararea cromozomilor

31.

Imediat după eutanasiere, se obțin suspensii de celule germinale din unul sau ambele testicule, care sunt expuse la o soluție hipotonică și se fixează conform protocoalelor instituite [de exemplu, (2) (14) (15)]. Celulele sunt apoi răspândite pe lamele și colorate (16) (17). Toate lamelele ar trebui să fie codificate, astfel încât identitatea lor să nu fie disponibilă factorului de punctare.

Analiză

32.

Pentru fiecare animal ar trebui să fie punctate cel puțin 200 de metafaze bine stabilite (3) (11). În cazul în care frecvența martorilor negativi anteriori este < 1 %, ar trebui punctate peste 200 de celule/animal pentru a crește puterea statistică (3). Ar trebui utilizate metode de colorare care să permită identificarea centromerului.

33.

Aberațiile de tip cromatidian și cromozomial ar trebui să fie înregistrate separat și clasificate în funcție de subtipuri (rupturi, schimburi). Lacunele ar trebui înregistrate, dar nu luate în considerare atunci când se stabilește dacă o substanță chimică induce creșterea semnificativă a incidenței celulelor cu aberații cromozomiale. Procedurile utilizate în laborator ar trebui să asigure efectuarea analizei aberațiilor cromozomiale de către factori de punctare bine instruiți. Recunoscând faptul că metodele de preparare a lamelor conduc adesea la scindarea unei fracții de celule în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele examinate ar trebui, prin urmare, să conțină un număr de centromeri nu mai mic de 2n±2, unde n este numărul haploid de cromozomi pentru specia respectivă.

34.

Deși scopul testului este de a detecta aberațiile cromozomiale structurale, este important să se înregistreze frecvențele celulelor poliploide și ale celulelor cu cromozomi endoreduplicați atunci când se observă astfel de evenimente (a se vedea punctul 44).

DATE ȘI RAPORTARE

Interpretarea rezultatelor

35.

Datele pentru fiecare animal ar trebui să fie prezentate sub formă de tabel. Pentru fiecare animal, ar trebui să se evalueze numărul de celule cu (o) aberație (aberații) cromozomială (cromozomiale) structurală (structurale) și numărul de aberații cromozomiale per celulă. Ar trebui să se întocmească separat o listă cu aberațiile de tip cromatidian și cromozomial clasificate în funcție de subtipuri (rupturi, schimburi), specificând numărul și frecvența acestora pentru culturile experimentale și cele martor. Lacunele sunt înregistrate separat. Se raportează frecvența lacunelor, dar, în general, aceasta nu se include în analiza frecvenței totale a aberațiilor cromozomiale structurale. Dacă se observă, se raportează procentul poliploidiei și al celulelor cu cromozomi endoreduplicați.

36.

Ar trebui să se raporteze datele cu privire la toxicitate și semne clinice în conformitate cu punctul 30.

Criterii de acceptabilitate

37.

Următoarele criterii determină acceptabilitatea unui test.

Martorul negativ testat în paralel este în concordanță cu normele publicate referitoare la datele privind martorii negativi testați anterior, care sunt preconizate, în general, a fi > 0 % și ≤ 1,5 % celule cu aberații cromozomiale, și datele anterioare ale laboratorului privind martorii, dacă sunt disponibile (a se vedea punctele 10 și 18).

Martorii pozitivi testați în paralel induc răspunsuri consecvente cu normele publicate pentru datele privind martorii pozitivi testați anterior sau cu baza de date a laboratorului privind martorii pozitivi testați anterior, dacă sunt disponibile, și produc o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ (a se vedea punctele 17 și 18).

Analizarea unui număr adecvat de celule și doze (a se vedea punctele 28 și 32).

Criteriile pentru selecția dozei de vârf sunt în concordanță cu cele descrise la punctele 25 și 26.

38.

Dacă se observă atât mitoză, cât și meioză, ar trebui să se stabilească rata mitozelor spermatogoniale în prima și a doua metafază meiotică, ca măsură a citotoxicității pentru toate animalele tratate și cele martor negative dintr-un eșantion total de 100 de celule divizoare pe animal. Dacă se constată doar mitoză, ar trebui să se determine indexul mitotic în cel puțin 1 000 de celule pentru fiecare animal.

Evaluarea și interpretarea rezultatelor

39.

Pentru a furniza date suficiente pentru analiza doză-răspuns, ar trebui să se analizeze cel puțin trei grupuri de doze tratate.

40.

Cu condiția îndeplinirii tuturor criteriilor de acceptabilitate, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar pozitivă în cazul în care:

cel puțin una dintre dozele de testare prezintă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel;

creșterea este legată de doză cel puțin în cadrul unui interval de eșantionare; și,

oricare dintre aceste rezultate se situează în afara intervalului acceptabil de date privind martorul negativ, sau a distribuției de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limita de control de 95 % pe baza distribuției Poisson), dacă există.

Apoi substanța chimică de testat este considerată capabilă să inducă aberații cromozomiale la celulele spermatogoniale ale animalelor de testare. Referințele bibliografice prezintă, de asemenea, recomandări pentru cele mai adecvate metode statistice (11) (18). Testele statistice utilizate ar trebui să considere animalul ca fiind unitatea experimentală.

41.

Cu condiția îndeplinirii tuturor criteriilor de acceptabilitate, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar negativă în cazul în care:

niciuna dintre dozele de testare nu prezintă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel;

nu există o creștere legată de doză în nicio condiție experimentală; și,

toate rezultatele se situează în intervalul acceptabil de date privind martorul negativ sau de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limita de control de 95 % pe baza distribuției Poisson), dacă există.

Apoi substanța chimică de testat este considerată incapabilă să inducă aberații cromozomiale la celulele spermatogoniale ale animalelor de testare. Referințele bibliografice prezintă, de asemenea, recomandări pentru cele mai adecvate metode statistice (11) (18). Un rezultat negativ nu exclude posibilitatea ca substanța chimică să inducă aberații cromozomiale în faze de dezvoltare ulterioare nestudiate, sau mutații genetice.

42.

În cazul unui răspuns clar pozitiv sau clar negativ, nu există nicio cerință referitoare la verificare.

43.

În cazul în care răspunsul nu este în mod clar negativ sau pozitiv și pentru a contribui la stabilirea relevanței biologice a unui rezultat (de exemplu, o creștere ușoară sau la limită), datele ar trebui evaluate în cadrul unei expertize și/sau al unor investigații suplimentare, folosind datele experimentale existente, cum ar fi analiza problemei dacă rezultatul pozitiv se situează în afara intervalului acceptabil al datelor privind martorii negativi sau al datelor istorice privind martorii negativi din laborator (19).

44.

În cazuri rare, chiar și după efectuarea de investigații suplimentare, setul de date va exclude posibilitatea stabilirii unei concluzii pentru rezultate pozitive sau negative și, prin urmare, se va concluziona că acesta este echivoc.

45.

O creștere a numărului de celule poliploide poate să indice faptul că substanța chimică de testat are potențialul de a inhiba procesele mitotice și să producă aberații cromozomiale numerice (20). O creștere a numărului de celule cu cromozomi endoreduplicați poate să indice faptul că substanța chimică de testat are potențialul de a inhiba evoluția ciclului celular (21) (22), care reprezintă un mecanism de inducere a modificărilor cromozomiale numerice diferit de inhibarea procesele mitotice (a se vedea punctul 2). Prin urmare, incidența celulelor poliploide și a celulelor cu cromozomi endoreduplicați ar trebui să se înregistreze separat.

Raportul testului

46.

Raportul testului ar trebui să includă următoarele informații:

 

Sinteză.

 

Substanța chimică de testat:

sursa, numărul lotului, data limită de utilizare, dacă sunt disponibile;

stabilitatea substanței chimice de testat, dacă se cunoaște;

solubilitatea și stabilitatea substanței chimice de testat în solvent, dacă se cunosc;

măsurarea pH-ului, a osmolalității și a precipitatului în mediul de cultură în care s-a adăugat substanța chimică de testat, după caz.

 

Substanță monocomponentă:

aspectul fizic, solubilitatea în apă și alte proprietăți fizico-chimice relevante;

identificarea chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS, numărul CAS sau codul său InChI, formula structurală, puritatea, identitatea chimică a impurităților după cum este necesar și fezabil din punct de vedere practic etc.

 

Substanță multicomponentă, UVCB și amestecuri:

în măsura în care este posibil, caracterizată prin identitatea chimică (a se vedea mai sus), apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante ale componentelor.

 

Prepararea substanței chimice de testat:

justificarea alegerii vehiculului;

solubilitatea și stabilitatea substanței chimice de testat în solvent/vehicul;

prepararea formulărilor hranei, a apei potabile sau a inhalărilor;

determinări analitice cu privire la formulări (de exemplu, stabilitate, omogenitate, concentrații nominale), atunci când sunt realizate.

 

Animale de testare:

specia/sușă utilizată și justificarea utilizării;

numărul și vârsta animalelor;

sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.;

metoda de identificare unică a animalelor

pentru studii pe termen scurt: greutatea fiecărui animal la începutul și la sfârșitul testului; pentru studii cu o durată mai mare de o săptămână: greutatea corporală individuală pe parcursul studiului și consumul de hrană. Ar trebui să fie inclus intervalul de greutate, valoarea medie și deviația standard pentru fiecare grup.

 

Condiții de testare:

date cu privire la martori pozitivi și negativi (solvent/vehicul);

datele din studiul de stabilire a dozelor, dacă s-a realizat;

justificarea selecției nivelului dozei administrate;

justificarea căii de administrare;

detalii privind prepararea substanței chimice de testat;

detalii privind administrarea substanței chimice de testat;

justificarea momentelor de sacrificare;

metodele de măsurare a toxicității pentru animale, inclusiv, după caz, analize histopatologice sau hematologice și frecvența cu care s-au efectuat observațiile și cu care s-a măsurat greutatea corporală a animalelor;

metode prin care se verifică dacă substanța chimică de testat a ajuns în țesutul țintă sau în circulația generală, în cazul în care se obțin rezultate negative;

doza efectivă (mg/kg greutate corporală/zi) calculată din concentrația substanței chimice de testat (ppm) în hrană/ apă potabilă și consum, dacă este cazul;

detalii cu privire la calitatea hranei și a apei;

descrierea amănunțită a schemelor de tratament și de eșantionare și justificările alegerilor;

metoda de eutanasiere;

metoda de analgezie (atunci când se utilizează);

proceduri pentru izolarea țesuturilor;

identitatea substanței chimice de inhibare a metafazei, concentrația acesteia și durata tratamentului;

metodele de preparare a lamelor;

criteriile pentru examinarea aberațiilor;

numărul de celule analizate per animal;

criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.

 

Rezultate:

starea animalelor înainte și pe toată durata perioadei de testare, inclusiv semne de toxicitate;

greutățile corporale și ale organelor la sacrificare (dacă sunt utilizate tratamente multiple, greutățile corporale luate în timpul regimului de tratament);

semnele de toxicitate;

indexul mitotic;

proporția de celule spermatogoniale în mitoză în prima și a doua metafază meiotică sau alte dovezi ale expunerii la țesutul țintă;

tipul și numărul aberațiilor, consemnate separat pentru fiecare animal;

numărul total de aberații pentru fiecare grup împreună cu valoarea medie și deviațiile standard;

numărul de celule cu aberații pentru fiecare grup împreună cu valoarea medie și deviațiile standard;

relația doză-răspuns, dacă este posibil;

analizele statistice și metodele aplicate;

datele privind martorii negativi studiați în paralel;

datele istorice privind martorii negativi cu intervale, valori medii, abateri standard și un interval de încredere de 95 % (dacă există) sau datele istorice privind martorii negativi publicate, care sunt utilizate pentru acceptabilitatea rezultatelor testului;

date concomitente privind martorii pozitivi;

variațiile ploidiei, dacă există, inclusiv frecvența celulelor poliploide și/sau enderoduplicate.

 

Discutarea rezultatelor

 

Concluzii

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

(1)

OCDE (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, nr. 234, OCDE, Paris

(2)

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. În: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt și J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

(3)

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. și Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

(4)

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)

Hess, R.A. și de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. În: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379. Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. În: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. și Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.

(7)

Cattanach, B.M. și Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

(8)

Cattanach, B.M. și Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313-324.

(11)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. și Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. și Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

(13)

OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (nr. 19), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris.

(14)

Yamamoto, K. și Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

(15)

Hsu, T.C., Elder, F. și Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

(16)

Evans, E.P., Breckon, G. și Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. și Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, în: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Partea I revizuită. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. și Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays În: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Raport, Partea III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. și Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.

(20)

Warr T.J., Parry E.M. și Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

(21)

Huang, Y., Change, C. și Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Apendice

DEFINIȚII

Aneuploidie: orice deviere de la numărul diploid (sau haploid) normal de cromozomi, cu unul sau mai mulți cromozomi, dar nu cu un set (seturi) întreg (întregi) de cromozomi (poliploidie).

Centromer: regiune (regiuni) dintr-un cromozom care, în timpul diviziunii celulare, este (sunt) legată(e) de fibrele fusului, ceea ce permite deplasarea ordonată a cromozomilor fiice către polii celulelor fiice.

Substanță chimică: o substanță sau un amestec

Diversitatea cromozomilor: diversitatea formelor cromozomiale (de exemplu, metacentrică, acrocentrică etc.) și dimensiuni.

Aberație de tip cromatidic: o leziune structurală a cromozomului care se traduce prin ruptura cromatidelor singure sau prin ruptura și alipirea între cromatide.

Aberație de tip cromozomial: o leziune structurală a cromozomului care se traduce prin ruptura sau ruptura și reuniunea ambelor cromatide în același loc.

Clastogen: orice substanță chimică care cauzează aberații cromozomiale structurale la populații de celule sau organisme.

Deficiență: leziune acromatică mai mică decât lățimea unei cromatide și cu o eroare minimă de aliniere a cromatidelor.

Genotoxic: termen general cuprinzând toate tipurile de leziuni ale ADN-ului sau ale cromozomilor, inclusiv rupturi, deleții, aducții, modificări și legături nucleotidice, rearanjări, mutații, aberații cromozomiale și aneuploidie. Nu toate tipurile de efecte genotoxice au drept rezultat mutații sau leziuni cromozomiale stabile.

Indice mitotic (MI): raportul dintre numărul de celule în metafază și numărul total de celule observate într-o populație celulară; indică gradul de proliferare a populației respective.

Mitoză: divizarea nucleului celular, împărțită în general în profază, prometafază, metafază, anafază și telofază.

Mutagen: produce o modificare ereditară a uneia sau mai multor secvențe de perechi de bază de ADN la gene sau a structurii cromozomilor (aberații cromozomiale).

Anomalie numerică: modificare a numărului de cromozomi față de numărul normal caracteristic pentru animalele utilizate.

Poliploidie: multiplicare a numărului de cromozomi haploizi (n), alta decât diploidia (și anume 3n, 4n ș.a.m.d.).

Aberație structurală: modificare a structurii cromozomilor, detectabilă la examinarea microscopică a celulelor în stadiul de metafază al diviziunii acestora, care se prezintă sub formă de deleții și fragmente, modificări intracromozomiale și intercromozomiale.

Substanța chimică de testat: orice substanță sau amestec testat utilizând prezenta metodă de testare.

UVCB: substanțe chimice cu o compoziție necunoscută sau variabilă, produși de reacție complexă și materiale biologice

(5)

În partea B, capitolul B.40 se înlocuiește cu următorul text:

„B.40   COROZIUNE CUTANATĂ IN VITRO: METODA DE TESTARE PRIVIND REZISTENȚA ELECTRICĂ TRANSCUTANATĂ (RET)

INTRODUCERE

1.

Această metodă de testare (MT) este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 430 (2015). Corodarea pielii înseamnă producerea de leziuni ireversibile ale pielii, care se manifestă ca o necroză vizibilă ce pătrunde în epidermă, ajungând în dermă, în urma aplicării unei substanțe chimice de testat [astfel cum este definită de Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice (GHS) al Organizației Națiunilor Unite (ONU) (1) și în Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 privind clasificarea, etichetarea și ambalarea substanțelor și a amestecurilor (CLP) (1)]. Această metodă de testare B.40 actualizată asigură o procedură in vitro care permite identificarea substanțelor și amestecurilor necorozive și corozive în conformitate cu GHS al ONU (1) și cu Regulamentul CLP.

2.

Evaluarea corozivității cutanate a implicat, de regulă, utilizarea animalelor de laborator (MT B.4, echivalentă cu Orientarea nr. 404 a OCDE adoptată inițial în 1981 și revizuită în 1992, 2002 și 2015) (2). În plus față de MT B.40, au fost validate și adoptate alte metode de testare in vitro pentru testarea potențialului de coroziune cutanată ale substanțelor chimice ca MT B.40bis (echivalentă cu Orientarea TG nr. 431 a OCDE) (3) și MT B.65 (echivalentă cu Orientarea TG nr. 435 a OCDE) (4), care pot, de asemenea, să identifice subcategorii de produse chimice corozive atunci când este necesar. Au fost adoptate mai multe metode de testare in vitro validate ca MT B.46 (echivalentă cu Orientarea TG nr. 439) a OCDE (5), pentru testarea iritației cutanate. Un document de orientare privind metodele integrate de testare și evaluare al OCDE (Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment - IATA) pentru coroziunea și iritația cutanată descrie mai multe module care grupează diverse surse de informații și instrumente de analiză și oferă îndrumări cu privire la (i) modul de integrare și utilizare a datelor existente privind testarea și alte date decât cele privind testarea pentru evaluarea potențialului de iritație cutanate și de coroziune cutanată al substanțelor chimice și (ii) propune o abordare atunci când sunt necesare teste suplimentare (6).

3.

Prezenta metodă de testare abordează coroziunea cutanată având drept punct final sănătatea umană. Aceasta se bazează pe metoda de testare a rezistenței electrice transcutanate (RET) pe piele de șobolan, care utilizează discuri de piele pentru identificarea substanțelor corozive prin capacitatea lor de a produce o pierdere a integrității normale a stratului cornos și a funcției de barieră. Orientarea OCDE aferentă privind testarea a fost adoptată inițial în 2004 și actualizată în 2015 pentru a face trimitere la documentul de orientare IATA.

4.

Pentru a evalua testele de coroziune cutanată in vitro în scopuri de reglementare, au fost realizate studii de pre-validare (7), urmate de un studiu de validare formală a metodei de testare a RET pe piele de șobolan pentru evaluarea coroziunii cutanate (8) (9) (10) (11). Rezultatul acestor studii a condus la recomandarea că metoda de testare a RET (desemnată drept metoda de referință validată – MRV) ar putea fi utilizată în scopuri de reglementare pentru evaluarea corozivității cutanate in vivo (12) (13) (14).

5.

Înainte să se poată utiliza în scopuri de reglementare o metodă de testare RET in vitro similară sau modificată propusă pentru coroziunea cutanată, alta decât MRV, ar trebui să se stabilească fiabilitatea, relevanța (precizia) și limitările acesteia pentru scopul propus al acesteia pentru a asigura similaritatea acesteia cu MRV în conformitate cu cerințele standardelor de performanță (PS) (15). Sistemul de acceptare reciprocă a datelor al OCDE va fi garantat numai după revizuirea și includerea în orientarea OCDE aferentă privind testarea a oricăror metode de testare noi sau actualizate propuse în urma standardelor de performanță.

DEFINIȚII

6.

Definițiile utilizate sunt prezentate în apendice.

CONSIDERAȚII INIȚIALE

7.

Un studiu de validare (10) și alte studii publicate (16) (17) au raportat că metoda de testare a RET pe piele de șobolan este în măsură să facă diferența între substanțele cunoscute ca fiind corozive și cele necorozive pentru piele, cu o sensibilitate totală de 94 % (51/54) și specificitate de 71 % (48/68), pentru o bază de date cu 122 de substanțe.

8.

Această metodă de testare abordează coroziunea cutanată in vitro. Aceasta permite identificarea substanțelor chimice necorozive și corozive, în conformitate cu GHS al ONU/Regulamentul CLP. O limitare a acestei metode de testare, astfel cum s-a demonstrat prin studiile de validare (8) (9) (10) (11), este aceea că aceasta nu permite subclasificarea substanțelor și amestecurilor corosive, în conformitate cu GHS al ONU/Regulamentul CLP. Cadrul de reglementare aplicabil va determina modul în care va fi utilizată această metodă de testare. Deși această metodă de testare nu oferă informații adecvate privind iritația cutanată, ar trebui remarcat faptul că MT B.46 abordează în mod specific efectul iritației cutanate in vitroasupra sănătății (5). Pentru o evaluare completă a efectelor cutanate locale după o singură expunere a dermei, ar trebui să se consulte documentul de orientare al OCDE privind IATA (6).

9.

În cadrul procesului de validare a acestei metode de testare a fost testată o gamă largă de substanțe chimice reprezentând în principal substanțe, iar baza de date empirice a studiului de validare a ajuns să cuprindă 60 de substanțe chimice în total dintr-o gamă largă de clase de substanțe chimice (8) (9). Pe baza datelor generale disponibile, metoda de testare este aplicabilă pentru o gamă largă de clase de substanțe chimice și stări fizice, inclusiv lichide, semisolide, solide și ceruri. Însă, întrucât pentru anumite stări fizice nu sunt disponibile elemente de testare cu date de referință adecvate, ar trebui remarcat faptul că, în timpul validării, au fost evaluate un număr comparativ redus de ceruri și substanțe solide corozive. Lichidele pot fi apoase sau neapoase; solidele pot fi solubile sau insolubile în apă. În cazul în care poate fi demonstrată existența unor dovezi privind lipsa de aplicabilitate a metodei de testare la o anumită categorie de substanțe, metoda de testare nu ar trebui să fie utilizată pentru respectiva categorie de substanțe. În plus, se presupune că această metodă de testare este aplicabilă pentru amestecuri ca o extindere a aplicabilității sale la substanțe. Însă, datorită faptului că amestecurile acoperă un spectru larg de categorii și compoziții și că, în prezent, sunt disponibile doar informații limitate privind testarea amestecurilor, în cazurile în care poate fi demonstrată existența unor dovezi privind neaplicabilitatea metodei de testare la o categorie specifică de amestecuri (de exemplu, în urma unei strategii propuse de Eskes et al., 2012) (18), metoda de testare nu ar trebui să fie utilizată pentru respectiva categorie specifică de amestecuri. Înainte de utilizarea metodei de testare pe un amestec pentru a genera date pentru un obiectiv de reglementare prevăzut, se ia în considerare dacă și, în caz afirmativ, din ce cauză aceasta poate oferi rezultate adecvate pentru respectivul scop. Astfel de considerații nu sunt necesare atunci când există o cerință normativă pentru testarea amestecului. Gazele și aerosolii nu au fost încă evaluați în cadrul studiilor de validare (8) (9). Deși se poate concepe faptul că gazele și aerosolii pot fi testați cu ajutorul metodei de testare RET, actuala metodă de testare nu permite testarea gazelor și a aerosolilor.

PRINCIPIUL TESTULUI

10.

Substanța chimică de testat este aplicată timp de maxim 24 de ore pe suprafețele epidermice ale discurilor de piele într-un sistem de testare cu două compartimente, în care discurile de piele funcționează ca separație între compartimente. Discurile de piele sunt prelevate de la șobolani cu vârste cuprinse între 28 și 30 de zile, care au fost eutanasiați. Substanțele chimice corozive sunt identificate după capacitatea lor de a produce o pierdere a integrității normale a stratului cornos și a funcției de barieră, care este măsurată ca o micșorare a RET sub nivelul de prag (16) (a se vedea punctul 32). Pentru testarea RET a pielii de șobolan a fost aleasă o valoare-limită de 5 kΩ, pe baza numeroaselor date referitoare la o gamă largă de substanțe, în care marea majoritate a valorilor au fost în mod clar cu mult peste (deseori > 10 kΩ) sau cu mult sub (deseori < 3 kΩ) această valoare (16). În general, substanțele chimice de testat care sunt necorozive pentru animale, dar sunt iritante sau neiritante, nu reduc RET sub această valoare-limită. Mai mult decât atât, utilizarea altor preparate de piele sau a altor echipamente poate modifica valoarea-limită, necesitând o validare ulterioară.

11.

În procedura de testare este introdusă o etapă de fixare a unui colorant pentru testarea în vederea confirmării rezultatelor pozitive ale RET care prezintă valori apropiate de 5 kΩ. Această etapă de fixare a unui colorant determină dacă creșterea permeabilității ionice are loc datorită distrugerii fizice a stratului cornos. Metoda RET, în care s-a utilizat piele de șobolan, s-a demonstrat a fi anticipativă pentru coroziunea in vivo la iepure, evaluată prin MT B.4 (2).

DEMONSTRAREA PERFORMANȚEI

12.

Înainte de utilizarea sistematică a metodei de testare a RET pe piele de șobolan, care respectă această metodă de testare, laboratoarele ar trebui să demonstreze performanțele tehnice prin clasificarea corectă a celor douăsprezece substanțe de verificare recomandate în tabelul 1. În situațiile în care o substanță inclusă pe listă nu este disponibilă sau în cazul în care acest lucru se poate justifica, se poate utiliza o altă substanță pentru care sunt disponibile date de referință in vivo și in vitro adecvate [de exemplu, din lista de substanțe chimice de referință (16)], cu condiția să se aplice aceleași criterii de selecție, astfel cum sunt descrise în tabelul 1.

Tabelul 1

Lista substanțelor de verificare  (2)

Substanță

NR CAS

Clasa chimică (3)

GHS al ONU/CLP Cat. bazată pe rezultate in vivo  (4)

MRV Cat. bazată pe rezultate in vitro

Stare fizică

pH (5)

Substanțe corozive in vivo

N,N’-Dimetil dipropilentriamină

10563-29-8

bază organică

1A

6 × C

L

8,3

1,2-Diaminopropan

78-90-0

bază organică

1A

6 × C

L

8,3

Acid sulfuric (10 %)

7664-93-9

acid anorganic

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × NC

L

1,2

Hidroxid de potasiu (10 % soluție apoasă)

1310-58-3

bază anorganică

(1A/)1B/1C

6 × C

L

13,2

Acid octanoic (caprilic)

124-07-2

acid organic

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,6

2-terț-Butilfenol

88-18-6

fenol

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,9

Substanțe necorozive in vivo

Acid izostearic

2724-58-5

acid organic

NC

6 × NC

L

3,6

4-Amino-1,2,4-triazol

584-13-4

bază organică

NC

6 × NC

S

5,5

Bromură de fenetil

103-63-9

electrofil

NC

6 × NC

L

3,6

4-(metiltio) -benzaldehidă

3446-89-7

electrofil

NC

6 × NC

L

6,8

1,9-Decadienă

1647-16-1

substanță organică neutră

NC

6 × NC

L

3,9

Tetracloretilenă

127-18-4

substanță organică neutră

NC

6 × NC

L

4,5

Abrevieri: aq = apos; Nr. CAS = Număr de înregistrare al Chemical Abstracts Service; MRV = Metodă de referință validată; C = coroziv; NC = necoroziv.

PROCEDURA

13.

Sunt disponibile proceduri standard de operare (PSO) pentru metoda de testare a coroziunii pielii prin RET pe piele de șobolan (19). Metodele de testare a RET pe piele de șobolan care fac obiectul prezentei metode de testare ar trebui să respecte următoarele condiții:

Animale

14.

Ar trebui să se utilizeze șobolani, deoarece sensibilitatea pielii lor la substanțe, în prezenta metodă de testare, a fost demonstrată anterior (12) și este singura sursă de piele care a fost validată în mod oficial (8) (9). Vârsta (la care pielea este prelevată) și specia șobolanului sunt extrem de importante pentru a obține certitudinea că foliculii piloși sunt în stare latentă, înainte să înceapă creșterea părului adult.

15.

Părul dorsal și de pe coaste al șobolanilor tineri de aproximativ 22 de zile, femele sau masculi (specia Wistar – comparabilă sau derivată), este îndepărtat cu grijă cu un clește mic. Apoi animalele sunt spălate prin ștergere atentă, iar zona fără păr este cufundată într-o soluție cu antibiotic (care conține de exemplu streptomicină, penicilină, cloramfenicol și amfotericin cu concentrații eficiente pentru inhibarea creșterii bacteriilor). Animalele sunt spălate încă o dată cu antibiotic în a treia sau a patra zi după prima spălare și sunt folosite în termen de trei zile după a doua spălare, atunci când stratul cornos s-a refăcut după îndepărtarea părului.

Pregătirea discurilor de piele

16.

Animalele sunt eutanasiate fără durere la vârsta de 28-30 de zile; această vârstă este critică. Se îndepărtează pielea dorso-laterală a fiecărui animal și se desprinde grăsimea subcutanată în exces prin jupuirea cu grijă a acesteia de pe piele. Se prelevează discuri de piele cu un diametru de aproximativ 20 mm fiecare. Pielea poate fi păstrată înainte ca discurile să fie folosite, în cazurile în care se demonstrează că datele privind martorul negativ și pozitiv sunt echivalente cu cele obținute cu pielea proaspătă.

17.

Fiecare disc de piele este așezat peste un capăt al unui tub PTFE (politetrafluoretilenă), asigurându-se că suprafața epidermei se află în contact cu tubul. Peste capătul tubului se așază prin apăsare un inel de cauciuc pentru a fixa pielea, iar excesul de țesut este tăiat. Apoi inelul de cauciuc este etanșat cu grijă la capătul tubului PTFE cu vaselină. Tubul este susținut de o clemă elastică în interiorul unei camere recipient care conține soluție de MgSO4 (154 mM) (figura 1). Discul de piele ar trebui scufundat în întregime în soluția de MgSO4. Dintr-o singură piele de șobolan se pot obține 10-15 discuri de piele. Dimensiunile tubului și ale inelului sunt prezentate în figura 2.

18.

Înainte de începerea testării, se măsoară RET pe două discuri de piele ca o procedură de control al calității pentru fiecare piele de animal. Ambele discuri ar trebui să aibă valorile rezistenței mai mari de 10 kΩ pentru ca restul discurilor să poată fi folosite pentru test. Dacă valoarea rezistenței este mai mică de 10 kΩ, discurile rămase din pielea respectivă ar trebui eliminate.

Aplicarea substanței chimice de testat și a substanțelor martor

19.

Pentru fiecare test (experiment) ar trebui utilizați martori pozitivi și negativi concomitent pentru a asigura performanța adecvată a modelului experimental. În cadrul fiecărui test (experiment) ar trebui să se utilizeze discuri de piele de la un singur animal. Substanțele chimice de testat martor pozitive și negative sugerate sunt acidul clorhidric 10 M și, respectiv, apă distilată.

20.

Substanțele chimice de testat lichide (150 μ) sunt aplicate uniform pe suprafața epidermei din interiorul tubului. Atunci când se testează materiale solide, pe disc se aplică o cantitate suficientă din substanța solidă, astfel încât întreaga suprafață a epidermei să fie acoperită. Peste substanța solidă se adaugă apă deionizată (150 μ), iar tubul este agitat ușor. Pentru a se obține un contact maxim cu pielea, substanțele solide ar trebui încălzite la 30 °C pentru ca substanțele chimice de testat să se topească sau să se înmoaie sau ar trebui să fie măcinate pentru a se obține granule sau pulbere.

21.

Pentru fiecare test și substanță chimică martor se utilizează trei discuri de piele pentru fiecare test (experiment). Substanțele chimice de testat sunt aplicate pentru 24 de ore la 20-23 ° C. Substanța chimică de testat este îndepărtată prin spălare sub jet de apă de la robinet până la temperatura camerei, până când nu se mai pot îndepărta alte materiale.

Măsurători ale RET

22.

Impedanța pielii se măsoară ca RET prin utilizarea unei punți Wheatstone de joasă tensiune și curent alternativ (18). Specificațiile generale ale punții sunt: tensiunea de lucru 1-3 V, curent alternativ sinusoidal sau dreptunghiular de 50-1000 Hz și un interval de măsurare de cel puțin 0,1-30 kΩ. Puntea de date folosită în studiul de validare a măsurat inductanța, capacitatea electrică și rezistența până la valori de 2 000 H, 2 000 μF și 2 MΩ la frecvențe de 100 Hz sau 1 kHz, utilizând valori în serie sau în paralel. Măsurătorile testului de corozivitate RET constau în înregistrarea rezistenței la o frecvență de 100 Hz utilizând valori în serie. Înainte de măsurarea rezistenței electrice, se micșorează tensiunea suprafeței pielii prin adăugarea unui volum suficient de etanol 70 % pentru a acoperi epiderma. După câteva secunde etanolul este îndepărtat din tub și apoi țesutul este hidratat prin adăugarea de 3 ml soluție MgSO4 (154 mM). Electrozii punții sunt așezați pe ambele părți ale discului de piele pentru a măsura rezistența în kΩ/disc de piele (figura 1). Dimensiunile electrozilor și lungimea electrodului expus sub clemele-crocodil sunt prezentate în figura 2. În timpul măsurării rezistenței, clema atașată electrodului interior este așezată pe partea superioară a tubului PTFE pentru a se asigura că lungimea electrodului scufundat în soluția de MgSO4 rămâne constantă. Electrodul exterior este introdus în interiorul compartimentului receptor astfel încât să se sprijine pe fundul compartimentului. Distanța dintre clema elastică și fundul tubului PTFE este menținută constantă (figura 2) deoarece această distanță influențează valoarea rezistenței obținute. Prin urmare, distanța dintre electrodul interior și discul de piele trebuie să fie constantă și minimă (1-2 mm).

23.

Dacă valoarea rezistenței măsurate este mai mare de 20 kΩ, acest lucru se poate datora resturilor de substanță chimică de testat care acoperă suprafața epidermică a discului de piele. Se poate încerca o îndepărtare suplimentară a acestui strat depus, de exemplu prin acoperirea tubului PTFE cu degetul mare protejat cu o mănușă și agitarea acestuia timp de aproximativ 10 secunde; soluția de MgSO4 este înlăturată și se repetă măsurarea rezistenței cu MgSO4 proaspăt.

24.

Proprietățile și dimensiunile aparatului de testare și ale procedurii experimentale utilizate pot influența valorile RET obținute. Pe baza datelor obținute utilizând aparatul specific și procedura descrisă în această metodă, s-a stabilit un prag de corozivitate de 5 kΩ. Dacă se modifică condițiile de testare sau dacă se folosește un alt aparat, valorile de control și de prag pot fi diferite. Prin urmare, este necesar să se etaloneze metodologia și valorile de prag ale rezistenței prin testarea unei serii de substanțe de performanță alese dintre substanțele utilizate pentru studiul de validare (8) (9) sau dintre clase de substanțe chimice similare cu substanțele studiate. În tabelul 1 se identifică un set de substanțe de verificare adecvate.

Metode de fixare a unui colorant

25.

Expunerea anumitor materiale necorozive poate duce la micșorarea rezistenței sub limita de 5 kΩ, permițându-se trecerea ionilor prin stratul cornos, ceea ce reduce rezistența electrică (9). De exemplu, substanțele organice neutre și substanțele care au proprietăți tensioactive (inclusiv detergenți, emulgatori și alți surfactanți) pot îndepărta lipidele pielii, făcând bariera cutanată mai permeabilă pentru ioni. Astfel, dacă, în absența unei deteriorări perceptibil vizibile a discurilor de piele, valorile RET generate de aceste substanțe chimice sunt de aproximativ 5 kΩ sau mai mici, ar trebui efectuată o evaluare a penetrării colorantului pentru țesuturile tratate și cele martor pentru a se determina dacă valorile RET obținute au constituit rezultatul unei permeabilități cutanate crescute sau al coroziunii cutanate (7) (9). În acest din urmă caz, în care stratul cornos este perturbat, colorantul sulforhodamină B, atunci când este aplicat pe suprafața pielii, pătrunde rapid și colorează țesutul de dedesubt. Acest colorant specific este stabil pentru o gamă largă de substanțe și nu este afectat de procedura de extracție descrisă mai jos.

Aplicarea și îndepărtarea colorantului sulforhodamină B

26.

După efectuarea măsurătorilor RET, sulfatul de magneziu este îndepărtat din tub, iar pielea este examinată cu atenție pentru a se depista deteriorări evidente. În cazul în care nu există nicio vătămare evidentă gravă (de exemplu, perforare), se aplică o diluție de 150 μl de soluție de 10 % (g/v) în apa distilată a colorantului sulforhodamină B (acid roșu 52; C.I. 45100; număr CAS 3520-42-1) pe suprafața epidermei fiecărui disc de piele timp de 2 ore. Ulterior, aceste discuri de piele sunt spălate cu apă de la robinet la temperatura camerei, timp de aproximativ 10 secunde, pentru a îndepărta colorantul în exces/nefixat. Se scoate cu grijă fiecare disc de piele de pe tubul de PTFE și se introduce într-un flacon (de ex. un flacon scintilator din sticlă, de 20 ml) care conține apă deionizată (8 ml). Flacoanele sunt agitate ușor timp de cinci minute pentru a se îndepărta orice cantitate de colorant nefixat. Se repetă procedura de spălare, după care discurile de piele sunt scoase și așezate în flacoane care conțin 5 ml de dodecilsulfat de sodiu (SDS) 30 % (greutate/volum) în apă distilată și incubate la 60 °C în timpul nopții.

27.

După incubare, fiecare disc de piele este scos și eliminat, iar soluția rămasă este centrifugată timp de 8 minute la 21 °C (forța centrifugală relativă ~ 175 × g). Un eșantion de supernatant de 1 ml este diluat într-o proporție de 1 la 5 (v/v) [și anume 1 ml + 4 ml] cu SDS 30 % (g/v) în apă distilată. Densitatea optică (DO) a soluției este măsurată la 565 nm.

Calcularea conținutului de colorant

28.

Conținutul de colorant sulforhodamină B din fiecare disc se calculează din valorile DO (9) (coeficientul de extincție molară a colorantului sulforhodamină B la 565 nm = 8,7 × l04; greutatea moleculară = 580). Conținutul de colorant este determinat pentru fiecare disc de piele folosind o curbă caracteristică de etalonare, iar ulterior se calculează conținutul mediu de colorant pentru testele repetate.

Criterii de acceptabilitate

29.

Valorile medii ale RET sunt acceptate cu condiția ca valorile controalelor pozitive și negative efectuate în paralel să se încadreze în intervalele acceptabile pentru metoda în laboratorul de testare. Pentru metodologia și aparatele descrise mai sus, intervalele acceptabile ale rezistenței sunt prezentate în următorul tabel:

Substanță

martor

Interval de rezistență (kΩ)

Pozitivă

Acid clorhidric 10 M

0,5 - 1,0

Negativă

Apă distilată

10 - 25

30.

Valorile medii de fixare ale colorantului sunt acceptate cu condiția ca valorile controalelor efectuate în paralel să se încadreze în intervalele acceptabile pentru metodă. Pentru metodologia și aparatele descrise mai sus, intervalele propuse pentru conținutul acceptabil de colorant pentru substanțele martor sunt prezentate în următorul tabel:

Substanță

martor

Intervalul conținutului de colorant (μg/disc)

Pozitivă

Acid clorhidric 10 M

40 - 100

Negativă

Apă distilată

15 - 35

Interpretarea rezultatelor

31.

Valoarea-limită a RET care face distincția între substanțele chimice de testat corozive și cele necorozive a fost stabilită în timpul optimizării metodei de testare, testată într-o fază de pre-validare și confirmată în cadrul unui studiu de validare formală.

32.

Modelul predictiv pentru metoda de testare a coroziunii pielii prin RET pe piele de șobolan (9) (19), asociat cu sistemul de clasificare GHS al ONU/Regulamentul CLP, este prezentat mai jos:

Substanța chimică de testat este considerată necorozivă pentru piele:

i)

dacă valoarea medie a RET obținută pentru substanța chimică de testat este mai mare de 5 kΩ sau

ii)

valoarea medie a RET obținută pentru substanța chimică de testat este mai mică decât sau egală cu (≤) 5 kΩ și

discurile de piele nu prezintă deteriorări evidente (de exemplu, perforare); și

conținutul mediu de colorant pe disc este sub (<) conținutul mediu de colorant pe disc din martorul pozitiv HCl 10 M obținut în paralel (a se vedea punctul 30 pentru valori ale martorului pozitiv).

Substanța chimică de testat este considerată corozivă pentru piele:

i)

Dacă valoarea medie a RET obținută pentru substanța chimică de testat este mai mică decât sau egală cu (≤) 5 kΩ, iar discurile de piele sunt în mod evident deteriorate (de exemplu, perforate) sau

ii)

valoarea medie a RET obținută pentru substanța chimică de testat este mai mică decât sau egală cu (≤) 5 kΩ și

discurile de piele nu prezintă deteriorări evidente (de exemplu, perforare), însă

conținutul mediu de colorant pe disc este peste sau egal cu (≥) conținutul mediu de colorant pe disc din martorul pozitiv HCl 10 M obținut în paralel (a se vedea punctul 30 pentru valori ale martorului pozitiv).

33.

Un singur test (experiment) compus din cel puțin trei discuri de piele duplicate ar trebui să fie suficient pentru o substanță chimică de testat atunci când clasificarea este fără echivoc. Însă, în cazul rezultatelor ambigue, precum măsurători neconcordante ale duplicatelor și/sau un procent mediu al RET egal cu 5 ± 5 kΩ, ar trebui avut în vedere un al doilea test (experiment) independent, precum și un al treilea în cazul unor rezultate discordante între primele două teste (experimente).

DATE ȘI RAPORTARE

Date

34.

Valorile rezistenței (kΩ) și valorile conținutului de colorant (μg/disc), după caz, pentru substanța chimică de testat, precum și pentru martorii pozitivi și negativi, ar trebui să fie consemnate în format tabelar, incluzând date pentru fiecare disc duplicat în cadrul fiecărui test (experiment) și valorile medii ± SD. Ar trebui să fie consemnate toate experimentele repetate. Deteriorările observate pe discurile de piele ar trebui să fie consemnate pentru fiecare substanță chimică de testat.

Raportul testului

35.

Raportul testului ar trebui să includă următoarele informații:

 

Substanțe chimice de testat și substanțe martor

Substanță mono-constituent: identificarea chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS, numărul CAS sau codul său InChI, formula structurală, puritatea, identitatea chimică a impurităților după cum este necesar și fezabil din punct de vedere practic etc.;

Substanța multicomponentă, UVCB și amestec: în măsura în care este posibil, caracterizată prin identitatea chimică (a se vedea mai sus), apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante ale componentelor;

aspectul fizic, solubilitatea în apă și alte proprietăți fizico-chimice relevante;

sursa, numărul lotului, dacă există;

tratamentul substanțelor chimice de testat/martor înainte de efectuarea testului, după caz (de exemplu, încălzire, măcinare);

stabilitatea substanței chimice de testat, data limită de utilizare sau data pentru reanalizare, dacă se cunoaște;

condiții de depozitare.

 

Animale de testare:

sușa și sexul utilizat;

vârsta animalelor atunci când sunt folosite ca animale donatoare;

sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.;

detalii privind pregătirea pielii.

 

Condiții de testare:

curbe de etalonare pentru aparatele de testare;

curbe de etalonare pentru încercarea de legare a colorantului, filtrul de tip band pass pentru măsurarea valorilor densității optice și intervalul de liniaritate a DO a dispozitivului de măsurare (de exemplu, spectrofotometru), dacă este cazul;

detalii ale procedurii de testare utilizate pentru măsurările RET;

detalii ale procedurii de testare utilizate pentru evaluarea legării colorantului, după caz;

dozele de testare utilizate, durata perioadei (perioadelor) de expunere și temperatura (temperaturile) expunerii;

detalii privind procedura de spălare utilizată după perioada de expunere;

numărul de discuri de piele duplicate utilizate pentru fiecare substanță chimică de testat și martori (martor pozitiv și negativ);

descrierea oricăror modificări ale procedurii de testare;

trimiteri la datele istorice ale modelului. Aceasta trebuie să includă, printre altele:

i)

Acceptabilitatea valorilor RET ale substanțelor martor pozitive și negative (în kΩ) în raport cu intervalele de valori ale substanțelor martor pozitive și negative

ii)

Acceptabilitatea valorilor privind conținutul de colorant al substanțelor martor pozitive și negative (în μg/disc) în raport cu intervalele de valori privind conținutul de colorant al substanțelor martor pozitive și negative

iii)

Acceptabilitatea rezultatelor testelor în raport cu variabilitatea istorică dintre discurile de piele duplicate

Descrierea criteriilor de decizie/a modelului predictiv aplicat.

 

Rezultate:

Prezentarea tabelară a datelor obținute în cadrul testelor RET și de legare a colorantului (dacă este cazul), în cazul fiecărei substanțe chimice de testat și fiecărui martor, pentru fiecare test (experiment) și pentru fiecare disc de piele duplicat (animale individuale și eșantioane de piele individuale), medii, SD și CV;

descrierea tuturor efectelor observate;

clasificarea derivată, raportată la modelul predictiv/criteriile de decizie utilizate.

 

Discutarea rezultatelor

 

Concluzii

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

(1)

Organizația Națiunilor Unite (ONU) (2013). Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice (GHS), a doua ediție revizuită, ONU New York și Geneva, 2013. Publicație disponibilă la adresa: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Capitolul B.4 din prezenta anexă, Iritație/coroziune cutanată acută.

(3)

Capitolul B.40bis din prezenta anexă, Model de piele in vitro.

(4)

Capitolul B.65 din prezenta anexă, Metoda de testare in vitro prin barieră cu membrană.

(5)

Capitolul B.46 din prezenta anexă, Iritația cutanată in vitro: Metoda de testare pe epidermă umană reconstruită.

(6)

OCDE (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr. 203), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P. și Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P. și Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G. și Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H. și Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. Publicația NIH nr. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), emisă de către Comitetul Consultativ Științific ECVAM (ESAC10), 3 aprilie 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. Publicația NIH nr. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OCDE (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr. 218. Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A. și Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.

(17)

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J. și Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. și Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (decembrie 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OCDE (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr. 34), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris.

Figura 1

Aparatura Pentru Testarea Ret Pe Pielea De Șobolan

Image 2

Figura 2

Dimensiunile Tubului De Politetrafluoretilenă (Ptfe) Și A Tuburilor Receptoare Și A Electrozilor Utilizați

Image 3

Factori importanți ai aparatului prezentat mai sus:

diametrul interior al tubului PTFE,

lungimea electrozilor în raport cu tubul PFTE și tubul receptor, astfel încât discul de piele să nu fie atins de electrozi, iar lungimea standard a electrodului să fie în contact cu soluția de MgSO4,

cantitatea de soluție de MgSO4 din tubul receptor ar trebui să fie suficientă pentru ca adâncimea lichidului, în raport cu nivelul din tubul PTFE, să fie astfel cum se arată în figura 1,

discul de piele ar trebui fixat de tubul PFTE suficient de bine, astfel încât rezistența electrică să fie o măsură reală a proprietăților pielii.

Apendice

DEFINIȚII

Acuratețe : Gradul de apropiere dintre rezultatele metodei de testare și valorile de referință acceptate. Aceasta constituie una dintre caracteristicile de performanță ale metodei de testare și unul dintre aspectele relevanței acesteia. Termenul este adesea utilizat în paralel cu termenul sinonim «concordanță», pentru a desemna proporția de rezultate corecte ale unei metode de testare (20).

C : Coroziv.

Substanță chimică : O substanță sau un amestec.

Concordanță : Un indicator al performanței metodei de testare pentru metodele de testare care oferă un rezultat categoric și este unul dintre aspectele relevante ale acesteia. Termenul este uneori utilizat în paralel cu termenul „acuratețe” și este definit ca proporție a tuturor substanțelor chimice testate și clasificate corect ca fiind pozitive sau negative. Concordanța depinde foarte mult de prevalența pozitivelor în tipurile de substanțe chimice de testat supuse examinării (20).

GHS [Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice (ONU)] : Un sistem care propune clasificarea substanțelor chimice (substanțe și amestecuri) în funcție de tipuri și niveluri standardizate de pericole fizice, pericole pentru sănătate și pericole pentru mediu și care elaborează elemente de comunicare corespunzătoare, precum pictograme, cuvinte de avertizare, declarații cu privire la pericole, declarații de securitate și fișe tehnice de securitate pentru a transmite informații privind efectele adverse ale acestora în scopul protejării populației (inclusiv angajatorii, lucrătorii, transportatorii, consumatorii și cei care se ocupă de serviciile de urgență) și a mediului (1).

IATA : Strategie integrată pentru testare și evaluare.

Amestec : Un amestec sau o soluție compus/ă din două sau mai multe substanțe.

Substanță monocomponentă : O substanță definită prin compoziția sa cantitativă, în care un singur component principal este prezent în proporție de cel puțin 80 % (g/g).

Substanță multicomponentă : O substanță definită prin compoziția sa cantitativă, în care mai mult de un singur component principal este prezent într-o concentrație ≥ 10 % (g/g) și < de 80 % (g/g). O substanță multicomponentă este rezultatul unui proces de fabricație. Diferența dintre un amestec și o substanță multicomponentă este faptul că un amestec este obținut prin combinarea a două sau mai multe substanțe chimice fără o reacție chimică. O substanță multicomponentă este rezultatul unei reacții chimice.

NC : Necoroziv.

DO : Densitate optică.

MP : Martor pozitiv, un duplicat conținând toate componentele unui sistem de testare și care a fost tratat cu o substanță cunoscută pentru faptul că provoacă un răspuns pozitiv. Pentru a asigura posibilitatea evaluării variabilității în timp a reacției martorului pozitiv, amplitudinea reacției severe nu ar trebui să fie excesiv de mare.

Standarde de performanță (SP) : Standarde bazate pe o metodă de referință validată, care permit evaluarea comparabilității unei metode de testare propuse similare din punct de vedere al mecanismului și din punct de vedere funcțional. Sunt incluse: (i) componentele esențiale ale metodei de testare; (ii) o listă minimală de substanțe chimice de referință selectate dintre substanțele chimice utilizate pentru a demonstra performanțele acceptabile ale metodei de referință validate; și (iii) niveluri similare de fiabilitate și acuratețe, bazate pe datele obținute pentru metoda de testare validată, pe care metoda de testare propusă ar trebui să le demonstreze în momentul evaluării acesteia utilizându-se lista minimă de substanțe chimice de referință.

Relevanță : Descrierea relației dintre metoda de testare și efectul de interes și dacă aceasta este relevantă și utilă pentru un anumit scop. Aceasta reprezintă măsura în care metoda de testare măsoară sau prezice în mod corect efectul biologic de interes. Relevanța include luarea în considerare a acurateței (conformității) unei metode de testare (20).

Fiabilitate : Măsuri în care o metodă de testare poate fi reprodusă în mod reproductibil, în același laborator sau în laboratoare diferite în timp, atunci când sunt efectuate utilizând același protocol. Aceasta se evaluează prin calcularea reproductibilității intra-laborator sau inter-laborator (20).

Sensibilitate : Proporția tuturor substanțelor chimice pozitive/active clasificate în mod corect prin metoda de testare. Acesta permite măsurarea acurateței unei metode de testare care conduce la rezultate clasificabile în categorii și constituie un aspect important în evaluarea relevanței unei metode de testare (20).

Coroziunea cutanată in vivo : Producerea unor leziuni cutanate ireversibile; și anume, necroză vizibilă prin epidermă și în dermă, ca urmare a aplicării unei substanțe chimice de testat timp de până la patru ore. Reacțiile cutanate se manifestă, în general, prin ulcere, sângerare, cruste sângerânde, și, spre sfârșitul perioadei de observație de 14 zile, o decolorare datorată albirii pielii, zone de alopecie completă și cicatrice. Pentru evaluarea leziunilor incerte ar trebui să se aibă în vedere efectuarea unui examen histopatologic.

Specificitate : Proporția tuturor substanțelor chimice negative/inactive clasificate în mod corect prin metoda de testare. Acesta permite măsurarea acurateței unei metode de testare care conduce la rezultate clasificabile în categorii și constituie un aspect important în evaluarea relevanței unei metode de testare (20).

Substanță : un element chimic și compușii săi în stare naturală sau obținuți prin orice proces de producție, inclusiv orice aditiv necesar pentru a-i păstra stabilitatea și orice impuritate care derivă din procesul utilizat, însă excluzând orice solvent care poate fi separat fără a afecta stabilitatea substanței sau fără a-i schimba compoziția.

Testare : O singură substanță chimică de testat testată concomitent pe minim trei discuri de piele duplicate.

Substanța chimică de testat : Orice substanță sau amestec testat utilizând prezenta metodă de testare.

Rezistența electrică transcutanată (RET) : O măsură a impedanței electrice a pielii, exprimată ca valoare a rezistenței în kiloohmi. Este o metodă simplă și fiabilă de evaluare a funcției de barieră a pielii prin înregistrarea trecerii ionilor prin piele folosind o punte Wheatstone.

UVCB : Substanțe cu compoziție necunoscută sau variabilă, produși de reacție complexă sau materiale biologice.

(6)

În partea B, capitolul B.40 se înlocuiește cu următorul text:

„B.40   COROZIUNE CUTANATĂ IN VITRO: METODĂ DE TESTARE PE EPIDERMĂ UMANĂ RECONSTRUITĂ (RhE)

INTRODUCERE

1.

Această metodă de testare (MT) este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr. 431 (2016). Corodarea pielii înseamnă producerea de leziuni ireversibile ale pielii, care se manifestă ca o necroză vizibilă ce pătrunde în epidermă, ajungând în dermă, în urma aplicării unei substanțe chimice de testat [astfel cum este definită de Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice (GHS) al Organizației Națiunilor Unite (ONU) (1) și în Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 privind clasificarea, etichetarea și ambalarea substanțelor și a amestecurilor (CLP) (6)]. Această metodă de testare B.40bis actualizată asigură o procedură in vitro care permite identificarea substanțelor și amestecurilor necorozive și corozive în conformitate cu GHS al ONU și cu Regulamentul CLP. Aceasta permite, de asemenea, o subclasificare parțială a substanțelor corozive.

2.

Evaluarea potențialului de coroziune cutanată al substanțelor chimice a implicat, de regulă, utilizarea de animale de laborator (MT B.4, echivalentă cu Orientarea TG nr. 404 a OCDE; adoptată inițial în 1981 și revizuită în 1992, 2002 și 2015) (2). În plus față de actuala metodă de testare B.40bis, au fost validate și adoptate alte metode de testare in vitro pentru testarea potențialului de coroziune cutanată ale substanțelor chimice ca MT B.40 (echivalentă cu Orientarea TG nr. 431 a OCDE) (3) și MT B.65 (echivalentă cu Orientarea TG nr. 435 a OCDE) (4). În plus, s-a adoptat metoda MT B.46 in vitro (echivalentă cu Orientarea TG nr. 439 a OCDE) pentru testarea potențialului de iritație cutanată. Un document de orientare privind strategiile integrate de testare și evaluare al OCDE (Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment - IATA) pentru coroziunea și iritația cutanată descrie mai multe module care grupează surse de informații și instrumente de analiză și oferă îndrumări cu privire la (i) modul de integrare și utilizare a datelor existente privind testarea și alte date decât cele privind testarea pentru evaluarea potențialului de iritație cutanate și de coroziune cutanată al substanțelor chimice și (ii) propune o abordare atunci când sunt necesare teste suplimentare (6).

3.

Prezenta metodă de testare abordează coroziunea cutanată având drept punct final sănătatea umană. Aceasta utilizează epiderma umană reconstruită (RhE) (obținută din keratinocite epidermice netransformate derivate de la om), care imită aproape perfect proprietățile histologice, morfologice, biochimice și fiziologice ale părților superioare ale pielii umane, și anume, epiderma. Orientarea OCDE corespunzătoare privind testarea a fost inițial adoptată în 2004, actualizată în 2013 pentru a include metode de testare suplimentare bazate pe modele RhE și posibilitatea de a utiliza metodele pentru a susține subclasificarea substanțelor chimice corozive și actualizată în 2015 pentru a face trimitere la documentul de orientare IATA și a introduce utilizarea unei proceduri alternative pentru măsurarea viabilității.

4.

În această metodă de testare sunt incluse patru modele RhE validate disponibile în comerț. Studii de pre-validare (7), urmate de un studiu de validare oficial pentru evaluarea coroziunii pielii (8) (9) (10), au fost realizate (11) (12) pentru două dintre aceste modele de testare disponibile în comerț, EpiSkin ™ Standard Model (SM) și EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (denumite în textul de mai jos metode de referință validate - MRV). Rezultatul acestor studii a condus la recomandarea ca cele două MRV-uri menționate mai sus să poată fi utilizate în scopuri de reglementare pentru a distinge substanțele corozive (C) de substanțele necorozive (NC) și ca EpiSkin™ să poată fi utilizată, în plus, pentru a susține subclasificarea substanțelor corozive (13) (14) (15). Alte două modele de testare RhE a coroziunii pielii in vitro, care sunt disponibile în comerț, au generat rezultate similare cu cele ale MRV EpiDerm™ conform validării bazate pe standardele de performanță (16) (17) (18). Acestea sunt SkinEthic™ RHE (7) și epiCS® (denumită anterior EST-1000) care pot fi, de asemenea, utilizate în scopuri de reglementare pentru a distinge substanțele corozive de cele necorozive (19) (20). Studiile post-validare realizate de producătorii modelului RhE în anii 2012-2014, cu un protocol îmbunătățit de corectare a interferențelor reducerii MTT nespecifice produse de substanțele chimice de testat, au îmbunătățit performanța atât a diferențierii C/NC, cât și a susținerii subclasificării substanțelor corozive (21) (22). Au fost efectuate alte analize statistice ale datelor post-validare generate cu EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE și EpiCS® pentru identificarea modelelor alternative de predicție care au îmbunătățit capacitatea predictivă pentru subclasificare (23).

5.

Înainte să se poată utiliza în scopuri de reglementare o metodă de testare RhE in vitro similară sau modificată propusă pentru coroziunea cutanată, alta decât MRV-urile, ar trebui să se stabilească fiabilitatea, relevanța (precizia) și limitările acesteia pentru scopul propus al acesteia pentru a asigura similaritatea acesteia cu MRV-urile în conformitate cu cerințele standardelor de performanță (PS) (24) prevăzute în concordanță cu principiile din documentul de orientare nr. 34 al OCDE (25). Sistemul de acceptare reciprocă a datelor va fi garantat numai după revizuirea și includerea în orientarea aferentă privind testarea a oricăror metode de testare noi sau actualizate propuse în urma standardelor de performanță. Modelele de testare incluse în respectiva orientarea privind testarea pot fi utilizate pentru a aborda cerințele țărilor pentru rezultatele testelor privind metoda de testare in vitro pentru coroziunea cutanată, în același timp beneficiind de acceptarea reciprocă a datelor.

DEFINIȚII

6.

Definițiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.

CONSIDERAȚII INIȚIALE

7.

Această metodă de testare permite identificarea substanțelor și amestecurilor necorozive și corozive în conformitate cu GHS al ONU și cu Regulamentul CLP. Această metodă de testare susține, în continuare, subclasificarea substanțelor și amestecurilor corozive în subcategoria opțională 1A, în conformitate cu GHS al ONU (1), precum și o combinație între subcategoriile 1B și 1C (21) (22) (23). O limitare a acestei metode de testare o constituie faptul că nu permite diferențierea între subcategoria de substanțe corozive pentru piele 1B și subcategoria 1C în conformitate cu GHS al ONU și Regulamentul CLP din cauza setului limitat de substanțe chimice corozive in vivo bine cunoscute din subcategoria 1C. Modelele de testare EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE și epiCS® pot stabili subcategorii (și anume, 1A față de 1B și 1C față de NC)

8.

Se testează o gamă largă de substanțe chimice reprezentând, în principal, substanțe individuale în cadrul validării care susține modelele de testare incluse în prezenta metodă de testare, atunci când acestea sunt utilizate pentru identificarea substanțelor necorozive și a celor corozive; baza de date empirice a studiului de validare a ajuns să cuprindă 60 de substanțe chimice dintr-o gamă largă de clase de substanțe chimice (8) (9) (10). Testul pentru demonstrarea sensibilității, a specificității, a preciziei și a reproductibilității în laborator a testului pentru subclasificare a fost realizat de către dezvoltatorii metodei de testare și rezultatele au fost analizate de OCDE (21) (22) (23). Pe baza datelor generale disponibile, metoda de testare este aplicabilă pentru o gamă largă de clase de substanțe chimice și stări fizice, inclusiv lichide, semisolide, solide și ceruri. Lichidele pot fi apoase sau neapoase; solidele pot fi solubile sau insolubile în apă. În măsura în care este posibil, solidele trebuie transformate în pulbere fină înainte de aplicare; nu este necesar alt tratament prealabil al eșantionului. În cazul în care poate fi demonstrată existența unor dovezi privind lipsa de aplicabilitate a modelelor de testare incluse în această metodă de testare la o anumită categorie de substanțe chimice de testat, acestea nu ar trebui să fie utilizate pentru respectiva categorie de substanțe chimice de testat. În plus, se presupune că această metodă de testare este aplicabilă pentru amestecuri ca o extindere a aplicabilității sale la substanțe. Însă, datorită faptului că amestecurile acoperă un spectru larg de categorii și compoziții și că, în prezent, sunt disponibile doar informații limitate privind testarea amestecurilor, în cazurile în care poate fi demonstrată existența unor dovezi privind neaplicabilitatea metodei de testare la o categorie specifică de amestecuri [de exemplu, în urma unei strategii propuse la punctul (26)], metoda de testare nu ar trebui să fie utilizată pentru respectiva categorie specifică de amestecuri. Înainte de utilizarea metodei de testare pe un amestec pentru a genera date pentru un obiectiv de reglementare prevăzut, se ia în considerare dacă și, în caz afirmativ, din ce cauză aceasta poate oferi rezultate adecvate pentru respectivul scop. Astfel de considerații nu sunt necesare atunci când există o cerință normativă pentru testarea amestecului. Gazele și aerosolii nu au fost încă evaluați în cadrul studiilor de validare (8) (9) (10). Deși se recunoaște faptul că gazele și aerosolii pot fi testați cu ajutorul tehnologiei bazate pe RhE, actuala metodă de testare nu permite testarea produselor de acest tip.

9.

Substanțele chimice de testat, care absorb lumina în același interval ca și formazanul MTT, și substanțele chimice de testat care pot să reducă direct colorantul MTT esențial (la formazan MTT) pot să interfereze cu măsurătorile de viabilitate tisulară și să necesite utilizarea unor martori adaptați pentru corecții. Tipul de martori adaptați care pot fi necesari vor varia în funcție de tipul de interferență produsă de substanța chimică de testat și de procedura utilizată pentru a măsura formazanul MTT (a se vedea punctele 25-31).

10.

Chiar dacă această metodă de testare nu furnizează informații adecvate privind iritația cutanată, ar trebui remarcat faptul că MT B.46 abordează în mod specific iritația cutanată in vitro ca efect asupra sănătății și se bazează pe același sistem de testare RhE, deși cu utilizarea unui alt protocol (5). Pentru o evaluare completă a efectelor cutanate locale după o singură expunere a dermei, ar trebui să se consulte Documentul de orientare al OCDE privind metodele integrate de testare și evaluare (6). Această abordare IATA include efectuarea de teste in vitro pentru coroziunea cutanată (așa cum sunt descrise în prezenta metodă de testare) și pentru iritarea cutanată, înainte de a se lua în considerare testarea pe animale vii. Este recunoscut faptul că utilizarea de piele umană face obiectul considerațiilor etice și al condițiilor stabilite la nivel național și internațional.

PRINCIPIUL TESTULUI

11.

Substanța chimică de testat se aplică local pe un model tridimensional de RhE compus din keratinocite ne-transformate derivate din epidermă umană care au fost cultivate pentru a forma un model multistratificat extrem de diferențiat de epidermă umană. Modelul este compus din straturi organizate (bazal, spinos și granular), precum și dintr-un strat cornos multistratificat care conține straturi lipidice lamelare intercelulare reprezentând principalele clase lipidice similare celor observate in vivo.

12.

Metoda de testare RhE se bazează pe ipoteza că substanțele chimice corozive pot să penetreze stratul cornos prin difuziune sau eroziune și sunt citotoxice pentru celulele din straturile inferioare. Viabilitatea celulară se măsoară prin conversia enzimatică a colorantului vital MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu, bromură de tetrazoliu, albastru de tiazolil; număr CAS 298-93-1] într-o sare de formazan de culoare albastră care este măsurată cantitativ după ce a fost extrasă din țesuturi (27). Substanțele chimice corozive sunt identificate pe baza capacității acestora de a reduce viabilitatea celulară sub pragurile stabilite (a se vedea punctele 35 și 36). Metoda de testare RhE pentru coroziunea cutanată s-a dovedit a prezice efectele de coroziune cutanată in vivo evaluate la iepuri conform MT B.4 (2).

DEMONSTRAREA PERFORMANȚEI

13.

Înainte de utilizarea sistematică a oricăruia dintre modelele de testare validate RhE care respectă prezenta metodă de testare, laboratoarele ar trebui să demonstreze performanțele tehnice proprii prin clasificarea corectă a celor douăsprezece substanțe de verificare enumerate în tabelul 1. În cazul utilizării unei metode de subclasificare, ar trebui demonstrată, de asemenea, subclasificarea corectă. În situațiile în care o substanță inclusă pe listă nu este disponibilă sau în cazul în care acest lucru se poate justifica, se poate utiliza o altă substanță pentru care sunt disponibile date de referință in vivo și in vitro adecvate [de exemplu, din lista de substanțe chimice de referință (24)], cu condiția să se aplice aceleași criterii de selecție, astfel cum sunt descrise în tabelul 1.

Tabelul 1

Lista substanțelor de verificare  (8)

martor

NR CAS

Clasa chimică (9)

Categ. conf. GHS al ONU/CLP pe baza rezultatelor in vivo  (10)

MRV Categ. bazată pe rezultate in vitro  (11)

MTT Reductor (12)

Stare fizică

Subcategoria 1A de substanțe corozive in vivo

Acid bromacetic

79-08-3

Acid organic

1A

(3) 1A

S

Trifluorură de bor, dihidrat

13319-75-0

Acid anorganic

1A

(3) 1A

L

Fenol

108-95-2

Fenol

1A

(3) 1A

S

Clorură de dicloracetil

79-36-7

Electrofil

1A

(3) 1A

L

Combinație între subcategoriile de substanțe corozive 1B și 1C in vivo

Monohidrat de acid glioxilic

563-96-2

Acid organic

1B-și-1C

(3) 1B-și-1C

S

Acid lactic

598-82-3

Acid organic

1B-și-1C

(3) 1B-și-1C

L

Etanolamină

141-43-5

Bază organică

1B

(3) 1B-și-1C

Y

Vâscoasă

Acid hidrocloric (14,4 %)

7647-01-0

Acid anorganic

1B-și-1C

(3) 1B-și-1C

L

Substanțe necorozive in vivo

Bromură de fenetil

103-63-9

Electrofil

NC

(3) NC

Y

L

4-Amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Bază organică

NC

(3) NC

S

4-(metiltio)-benzaldehidă

3446-89-7

Electrofil

NC

(3) NC

Y

L

Acid lauric

143-07-7

Acid organic

NC

(3) NC

S

Abrevieri: Nr. CAS = Număr de înregistrare al Chemical Abstracts Service; MRV = Metodă de referință validată; NC = necoroziv; Y = da; S = solid; L = lichid

14.

Ca parte a demonstrării performanței, se recomandă ca utilizatorul să verifice proprietățile de barieră ale țesuturilor după primire astfel cum sunt specificate de producătorul modelului de RhE. Această etapă este în mod special importantă în cazul în care țesuturile sunt transportate pe distanțe/perioade de timp lungi. Odată ce o metodă de testare a fost stabilită cu succes, iar performanța acesteia în utilizare a fost demonstrată, nu este necesar ca astfel de verificări să fie efectuate în mod sistematic. Cu toate acestea, atunci când se utilizează în mod sistematic o metodă de testare, se recomandă evaluarea continuă a proprietăților de barieră la intervale regulate.

PROCEDURA

15.

În continuare este prezentată o descriere generică a componentelor și a procedurilor modelelor de testare RhE pentru evaluarea coroziunii cutanate care fac obiectul prezentei metode de testare. Modelele RhE confirmate ca fiind valabile din punct de vedere științific pentru a fi utilizate în cadrul acestei metode de testare, și anume, modelele EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE and epiCS® (16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33), pot fi obținute din surse comerciale. Există proceduri standard de operare (PSO) pentru aceste patru modele RhE (34) (35) (36) (37), iar componentele principale ale acestora pentru metoda de testare sunt prezentate pe scurt în apendicele 2. Se recomandă să se consulte PSO relevantă la implementarea și utilizarea unuia dintre aceste modele în laborator. Testarea cu cele patru modele de testare RhE care fac obiectul prezentei metode de testare ar trebui să respecte următoarele condiții:

COMPONENTELE METODEI DE TESTARE RHE

Condiții generale

16.

Pentru reconstrucția epiteliului ar trebui utilizate keratinocite umane ne-transformate. Sub stratul cornos funcțional ar trebui să existe straturi multiple de celule epiteliale viabile (stratul bazal, stratul spinos, stratul granulos). Stratul cornos ar trebui să fie multistratificat și să prezinte profilul lipidic esențial pentru a constitui o barieră funcțională robustă care să reziste la penetrarea rapidă a substanțelor citotoxice de referință, de exemplu dodecilsulfatul de sodiu (SDS) sau Triton X-100. Bariera funcțională ar trebui demonstrată și poate fi evaluată fie prin stabilirea concentrației la care substanța chimică de referință reduce viabilitatea țesuturilor cu 50 % (IC50) după o perioadă fixă de expunere, fie prin stabilirea perioadei de expunere necesare pentru a reduce viabilitatea celulară cu 50 % (ET50) la aplicarea substanței chimice de referință cu o concentrație specifică fixă (a se vedea punctul 18). Etanșeitatea modelului RhE ar trebui să prevină trecerea substanței dincolo de stratul cornos către țesutul viabil, ceea ce ar conduce la o slabă modelizare a expunerii pielii. Modelul RhE nu trebuie să fie contaminat cu bacterii, virusuri, micoplasmă sau ciuperci.

Condiții funcționale

Viabilitate

17.

Testul utilizat pentru cuantificarea viabilității tisulare este testul MTT (27). Celulele viabile ale structurii țesutului RhE reduc colorantul vital MTT într-un precipitat de formazan MTT de culoare albastră, care este apoi extras din țesut utilizând izopropanol (sau un solvent similar). DO a solventului de extracție trebuie să fie suficient de mică, și anume DO < 0,1. Formazanul MTT extras poate fi cuantificat folosind fie o măsurare standard a absorbanței (DO), fie o procedură de spectrofotometrie HPLC/UPLC (38). Utilizatorii modelului RhE ar trebui să se asigure că fiecare lot de model RhE utilizat îndeplinește criteriile stabilite pentru substanța martor negativă. Producătorul/furnizorul modelului RhE ar trebui să stabilească un interval de acceptabilitate (limita superioară și inferioară) pentru valorile DO ale martorului negativ. Intervalele de acceptabilitate pentru valorile DO ale martorului negativ pentru cele patru modele de testare RhE validate incluse în prezenta metodă de testare sunt date în tabelul 2. Un utilizator al spectrofotometriei HPLC/UPLC ar trebui să utilizeze intervalele DO ale martorului negativ din tabelul 2 ca și criteriu de acceptare pentru martorul negativ. Ar trebui documentat faptul că țesuturile tratate cu substanță martor negativă sunt stabile în cultură (prezintă măsurători DO similare) în perioada de expunere.

Tabelul 2

Intervalele de acceptabilitate pentru valorile DO ale martorului negativ pentru controlul calității lotului

 

Limita inferioară de acceptabilitate

Limita superioară de acceptabilitate

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Funcția de barieră

18.

Stratul cornos și compoziția lipidică a acestuia ar trebui să fie suficiente pentru a rezista la penetrarea rapidă a anumitor substanțe chimice citotoxice de referință (de exemplu, SDS sau Triton X-100), astfel cum este estimat prin IC50 sau ET50 (tabelul 3). Funcția de barieră a fiecărui lot de model RhE utilizat ar trebui să fie demonstrată de către producătorul/furnizorul modelului RhE la momentul livrării țesuturilor la utilizatorul final (a se vedea punctul 21).

Morfologie

19.

Ar trebui să fie efectuată examinarea histologică a modelului RhE, cu demonstrarea structurii de epidermă umană multi-stratificată care conține stratul bazal, stratul spinos, stratul granulos și stratul cornos și prezintă un profil lipidic similar cu profilul lipidic al epidermei umane. Examinarea histologică a fiecărui lot de model RhE utilizat, care demonstrează o morfologie adecvată a țesuturilor, ar trebui să fie asigurată de către producătorul/furnizorul modelului RhE la momentul livrării țesuturilor la utilizatorul final (a se vedea punctul 21).

Reproductibilitate

20.

Utilizatorii metodei de testare ar trebui să demonstreze reproductibilitatea metodelor de testare în timp cu martori pozitivi și negativi. În plus, metoda de testare ar trebui să fie utilizată numai în cazul în care producătorul/furnizorul modelului RhE furnizează date care demonstrează reproductibilitatea în timp cu substanțe chimice corozive și necorozive, de exemplu, din lista substanțelor de verificare (tabelul 1). În cazul utilizării unei metode de testare pentru subclasificare, ar trebui demonstrată, de asemenea, reproductibilitatea în raport cu subclasificarea.

Controlul calității (CC)

21.

Modelul RhE ar trebui să fie utilizat doar dacă producătorul/furnizorul demonstrează că fiecare lot de modele RhE îndeplinește criteriile definite pentru introducere în procesul de fabricație, printre care cele mai importante sunt criteriile privind viabilitatea (punctul 17), funcția de barieră (punctul 18) și morfologia (punctul 19). Datele respective sunt furnizate utilizatorilor metodei de testare pentru ca aceștia să le poată includ