Accept Refuse

EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32003D0466

Decizia Comisiei din 13 iunie 2003 de stabilire a criteriilor de zonare și a măsurilor de monitorizare oficială care trebuie să fie adoptate ca urmare a suspectării sau confirmării prezenței anemiei infecțioase a somonului (AIS) [notificată cu numărul C(2003) 1831]Text cu relevanță pentru SEE.

OJ L 156, 25.6.2003, p. 61–73 (ES, DA, DE, EL, EN, FR, IT, NL, PT, FI, SV)
Special edition in Czech: Chapter 03 Volume 039 P. 139 - 151
Special edition in Estonian: Chapter 03 Volume 039 P. 139 - 151
Special edition in Latvian: Chapter 03 Volume 039 P. 139 - 151
Special edition in Lithuanian: Chapter 03 Volume 039 P. 139 - 151
Special edition in Hungarian Chapter 03 Volume 039 P. 139 - 151
Special edition in Maltese: Chapter 03 Volume 039 P. 139 - 151
Special edition in Polish: Chapter 03 Volume 039 P. 139 - 151
Special edition in Slovak: Chapter 03 Volume 039 P. 139 - 151
Special edition in Slovene: Chapter 03 Volume 039 P. 139 - 151
Special edition in Bulgarian: Chapter 03 Volume 047 P. 247 - 259
Special edition in Romanian: Chapter 03 Volume 047 P. 247 - 259
Special edition in Croatian: Chapter 03 Volume 014 P. 128 - 140

No longer in force, Date of end of validity: 13/09/2015; abrogat prin 32015D1554

ELI: http://data.europa.eu/eli/dec/2003/466/oj

03/Volumul 47

RO

Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene

247


32003D0466


L 156/61

JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE


DECIZIA COMISIEI

din 13 iunie 2003

de stabilire a criteriilor de zonare și a măsurilor de monitorizare oficială care trebuie să fie adoptate ca urmare a suspectării sau confirmării prezenței anemiei infecțioase a somonului (AIS)

[notificată cu numărul C(2003) 1831]

(Text cu relevanță pentru SEE)

(2003/466/CE)

COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,

având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,

având în vedere Directiva 91/67/CEE a Consiliului din 28 ianuarie 1991 privind condițiile de sănătate animală care reglementează introducerea pe piață a animalelor și a produselor de acvacultură (1), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Regulamentul (CE) nr. 806/2003 (2), în special articolul 15,

având în vedere Directiva 93/53/CEE a Consiliului din 24 iunie 1993 de introducere a unor măsuri comunitare minime pentru controlul anumitor boli ale peștilor (3), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Decizia 2001/288/CE a Comisiei (4), în special articolul 5 alineatul (2) și articolul 6,

întrucât:

(1)

Directiva 93/53/CEE stipulează că prelevarea de probe și analiza de laborator destinate depistării prezenței bolilor din listele I și II (care sunt incluse în anexa A la Directiva 91/67/CEE) se efectuează după metodele stabilite în conformitate cu articolul 15 din Directiva 91/67/CEE.

(2)

Planurile de prelevare a probelor și metodele de diagnosticare privind depistarea sau confirmarea bolilor peștilor incluse în lista II, și anume septicemia hemoragică virală (SHV) și necroza hematopoietică infecțioasă (NHI), sunt stabilite prin Decizia 2001/183/CE a Comisiei (5).

(3)

În conformitate cu articolul 5 alineatul (2) și articolul 6 din Directiva 93/53/CEE, toate exploatațiile situate în același bazin de captație sau în aceeași zonă de coastă cu o exploatație suspectată de a fi infectată cu virusul anemiei infecțioase a somonului (AIS) sau a cărei infectare este confirmată sunt supuse unei monitorizări oficiale. Este necesară stabilirea criteriilor de zonare și a măsurilor de monitorizare oficială care trebuie să fie aplicate.

(4)

Pentru a defini planurile de prelevare a probelor și metodele de diagnosticare pentru depistarea și confirmarea AIS și a pentru a stabili criteriile de zonare și măsurile de monitorizare oficială care trebuie adoptate ca urmare a suspectării sau confirmării AIS, au fost consultați experți în domeniul stării de sănătate a peștilor, precum și experți de laborator. De asemenea, trebuie să se țină seama de indicațiile privind diagnosticarea AIS enunțate în ediția curentă a Manualului privind diagnosticarea bolilor animalelor acvatice al Oficiului Internațional de Epizootii (OIE).

(5)

Este necesar a se prevedea o perioadă suficient de lungă pentru punerea în aplicare a acestor noi cerințe.

(6)

Măsurile prevăzute de prezenta decizie sunt în conformitate cu avizul Comitetului permanent pentru lanțul alimentar și sănătatea animală,

ADOPTĂ PREZENTA DECIZIE:

Articolul 1

Planurile de prelevare a probelor și metodele de diagnosticare privind depistarea și confirmarea anemiei infecțioase a somonului (AIS), precum și criteriile de zonare și măsurile de monitorizare oficială care trebuie adoptate ca urmare a suspectării sau confirmării AIS sunt stabilite în anexa la prezenta decizie.

Articolul 2

Prezenta decizie se aplică de la 23 octombrie 2003.

Articolul 3

Prezenta decizie se adresează statelor membre.

Adoptată la Bruxelles, 13 iunie 2003.

Pentru Comisie

David BYRNE

Membru al Comisiei


(1)  JO L 46, 19.2.1991, p. 1.

(2)  JO L 122, 16.5.2003, p. 1.

(3)  JO L 175, 19.7.1993, p. 23.

(4)  JO L 99, 10.4.2001, p. 11.

(5)  JO L 67, 9.3.2001, p. 65.


ANEXĂ

Planuri de prelevare a probelor și metode de diagnosticare pemtru depistarea și confirmarea anemiei infecțioase a somonului (AIS), precum și criterii de zonare și măsuri de monitorizare oficială care trebuie adoptate ca urmare a suspectării sau confirmării AIS

INTRODUCERE ȘI DEFINIȚII

Prezenta anexă:

(a)

prevede orientările și cerințele minime privind planurile de prelevare de probe și metodele de diagnosticare pentru depistarea și confirmarea prezenței AIS;

(b)

încorporează dispozițiile și definițiile incluse în Directivele 91/67/CEE și 93/53/CEE;

(c)

precizează dispozițiile corespunzătoare care trebuie adoptate pentru diagnosticarea, controlul și monitorizarea AIS, în caz de suspectare sau de confirmare a bolii;

(d)

se adresează atât autorităților de control al AIS, cât și personalului de laborator care efectuează testele privind această boală. Se pune accentul pe procedurile de prelevare a probelor, pe principiile și pe aplicarea testelor de laborator și pe evaluarea rezultatelor acestora, precum și pe tehnicile de laborator amănunțite. Cu toate acestea, dacă este necesar, laboratoarele pot să modifice textele descrise în prezenta anexă sau să efectueze teste diferite, cu condiția să poată dovedi că acestea din urmă au o sensibilitate și o specificitate egală sau superioară. De asemenea, sunt stabilite criteriile de zonare și măsurile de monitorizare oficială, ca urmare a suspectării sau confirmării AIS.

În sensul prezentei anexe, se înțelege prin:

 

„Bazin de captație” semnifică întregul bazin hidrografic, de la izvoarele cursului de apă până la estuar sau o parte dintr-un bazin de hidrografic, de la izvorul cursului de apă până la un baraj natural sau artificial, care împiedică migrarea peștilor dincolo de barajul respectiv;

 

„Zonă de coastă”: o parte din apele de coastă sau maritime sau un estuar corespunzând unei delimitări geografice precise, care constă dintr-un sistem hidrodinamic omogen sau dintr-o serie de astfel de sisteme.

 

În partea I se stabilesc principiile generale și criteriile de diagnosticare și confirmare a AIS, precum și criteriile de zonare și măsurile de monitorizare oficială care trebuie adoptate ca urmare a suspectării sau confirmării AIS.

 

În partea II se indică inspecțiile și prelevările care trebuie efectuate în scopul depistării prezenței AIS.

 

În partea III se stabilesc metodele examenului virusologic.

 

În partea IV se descrie procedura de examinare a probelor cu RT-PCR pentru depistarea AIS.

 

În partea V se descrie protocolul care trebuie urmat pentru examinarea peliculelor de țesut de rinichi cu IFAT (testul de imunofluorescență indirectă), în scopul depistării AIS.

 

În partea VI se descrie metodologia examenului histologic.

 

În partea VII este se prezintă lista acronimelor și abrevierilor utilizate.

I.   Criteriile de diagnosticare a AIS în scopul stabilirii zonelor și adoptării anumitor măsuri de control și de monitorizare oficială

I.1.   Principii generale de diagnosticare a AIS

Partea 1.2 din prezenta anexă indică motivele temeinice de suspectare a infectării peștilor cu virusul AIS. Statele membre se asigură ca, în cazul în care peștii dintr-o exploatație sunt suspectați de a fi infectați cu virusul AIS, să aibă loc o anchetă oficială cât mai repede posibil pentru confirmarea sau excluderea prezenței bolii, anchetă care să se bazeze pe inspecții și examene clinice, pe colectarea și selectarea probelor și pe metodele de laborator prevăzute la părțile III-VI din prezenta anexă. Prezența AIS este confirmată oficial atunci când este îndeplinit unul din cele trei serii de criterii enunțate în partea I.3 din prezenta anexă.

I.2.   Suspectarea infectării cu AIS

I.2.1.   Este suspectată prezența AIS dacă este îndeplinit cel puțin unul din următoarele criterii:

(a)

stabilirea unor constatări post mortem compatibile cu AIS, cu sau fără semne clinice ale bolii. Constatările post mortem și semnele clinice ale bolii sunt în conformitate cu cele enunțate în ediția curentă a Manualului privind diagnosticarea bolilor animalelor acvatice al Oficiului Internațional de Epizootii (OIE);

(b)

izolarea și identificarea virusului AIS într-o cultură celulară a unei probe unice prelevate de la oricare pește provenit din exploatație, în conformitate cu partea III;

(c)

dovada rezonabilă a prezenței virusului AIS, în două teste de laborator independente, precum testul RT-PCR (partea IV) și testul IFAT (partea V);

(d)

transferul peștilor vii într-o exploatație în care există motive temeinice de suspectare a prezenței AIS în momentul transferului;

(e)

în cazul în care o anchetă descoperă alte legături epidemiologice importante cu exploatații unde se suspectează sau se confirmă prezența AIS.

I.2.2.   Suspectarea AIS poate fi exclusă atunci când anchete continue, care presupun cel puțin o inspecție clinică lunară într-un interval de șase luni, nu furnizează nici o altă dovadă semnificativă a prezenței AIS.

I.3.   Confirmarea AIS

Se consideră ca prezența AIS este confirmată în cazul în care sunt îndeplinite criteriile descrise la litera (a), (b) sau (c):

(a)

observarea semnelor clinice și constatările post mortem compatibile cu AIS în conformitate cu ediția curentă a Manualului privind diagnosticarea bolilor animalelor acvatice al OIE, inclusiv la peștii morți, debili sau cu un comportament anormal, observarea semnelor de anemie, alte constatări post mortem și modificări patologice; detectarea virusului AIS prin una sau mai multe dintre următoarele metode:

(i)

izolarea și identificarea virusului AIS într-o cultură celulară de cel puțin o probă prelevată de la pești proveniți din exploatație, în conformitate cu prevederile de la partea III;

(ii)

depistarea virusului AIS prin testul RT-PCR în conformitate cu metodele descrise în partea IV;

(iii)

depistarea virusului AIS în țesuturi sau preparate din țesuturi, cu ajutorul unor anticorpi specifici contra virusului AIS (de exemplu, testul IFAT pe pelicule de țesut de rinichi, în conformitate cu descrierea din partea V);

(b)

izolarea și identificarea virusului AIS în două probe prelevate, în momente diferite, de la unul sau mai mulți pești din exploatația controlată, în conformitate cu metoda descrisă la partea III;

(c)

izolarea și identificarea virusului AIS în cel puțin o probă prelevată de la peștii din exploatație în conformitate cu metoda descrisă în partea III, urmate de confirmarea dovezii prezenței virusului respectiv în preparatele tisulare prelevate de la peștii din exploatație prin testul RT-PCR (partea IV) sau testul IFAT (partea V).

I.4.   Criteriile de stabilire și de desființare a zonelor de control și de monitorizare oficială ca urmare a suspectării și confirmării AIS

I.4.1.   În scopul stabilirii unui program oficial de monitorizare bazat pe factorul de risc, statele membre stabilesc, în apropierea unei exploatații unde contaminarea cu AIS este suspectată sau confirmată oficial, zone corespunzătoare de control și de monitorizare.

I.4.2.   Zonele care trebuie stabilite se definesc pe baza unei analize de la caz la caz a riscurilor de răspândire ulterioară a bolii. În conformitate cu situația epizootiologică, bazinul de captație sau zona de coastă respectivă:

se definește ca zonă de control sau

poate să fie împărțit(ă), în cazul în care este vorba de un bazin de captație sau de o regiune de coastă întinsă, într-o zonă de control și o zonă de monitorizare, cu condiția să nu se compromită prevenirea răspândirii AIS.

De asemenea, se pot stabili, dacă este necesar, zone de monitorizare suplimentare în afara bazinului de captație sau a zonei de coastă.

I.4.3.   Principalii factori care trebuie luați în considerare pentru stabilirea zonelor menționate anterior sunt cei care au incidență asupra riscurilor de transmitere a bolii la peștii de crescătorie și la cei din sălbaticie, și anume: numărul, proporția și repartizarea cazurilor de mortalitate a peștilor în cadrul exploatației în care contaminarea cu virusul AIS este suspectată sau confirmată oficial, cauza deceselor în exploatația respectivă, distanța față de exploatațiile învecinate și densitatea acestora din urmă, exploatațiile cu care intră în contact, speciile prezente în exploatații, gestionarea aplicată în exploatațiile infectate și învecinate, condițiile hidrodinamice și alți factori de importanță epidemiologică identificați în cadrul anchetei epizootice efectuate în conformitate cu prevederile articolului 5 alineatul (2) și ale articolului 8 din Directiva 93/53/CEE.

I.4.4.   În scopul stabilirii zonelor se aplică următoarele criterii minime:

 

I.4.4.1.   Statul membru stabilește o „zonă de control”, în imediata apropiere a unei exploatații în care este confirmată contaminarea cu virusul AIS, după cum urmează:

în zonele de coastă: zona înscrisă într-un cerc cu raza cel puțin egală cu o deplasare a mareei sau de cel puțin 5 km, având ca centru exploatația în care este confirmată contaminarea cu virusul AIS, sau o zonă echivalentă stabilită pe baza unor date hidrodinamice sau epidemiologice corespunzătoare sau

în interiorul uscatului: întreaga suprafață a bazinului de captație din exploatația în care este confirmată contaminarea cu virusul AIS; în bazinele de captație întinse, statul membru poate limita extinderea zonei la părți ale bazinului de captație, cu condiția să nu fie compromisă prevenirea răspândirii AIS.

 

I.4.4.2.   În cazul suspectării prezenței AIS, se stabilește o „zonă de control temporar”, în temeiul unor criterii identice cu cele stabilite pentru „zona de control”.

 

I.4.4.3.   Atunci când este necesar, statul membru stabilește o „zonă de monitorizare”, în afara zonei de control, în sectoarele în care o monitorizare mai puțin severă este considerată suficientă; aceasta corespunde:

în zonele de coastă: suprafeței care se suprapune, în jurul zonei de control, peste zonele de deplasare a mareei, sau suprafeței din jurul zonei de control înscrise într-un cerc cu o rază de 10 km din centrul zonei de control, sau unei suprafețe echivalente stabilite pe baza datelor hidrodinamice sau epidemiologice corespunzătoare sau

în interiorul uscatului: dacă este necesar, unei zone întinse situate în exteriorul zonei de control stabilite.

I.5.   Vidul sanitar și desființarea zonelor stabilite

I.5.1.   Autoritatea competentă a statului membru se asigură ca toate exploatațiile situate în zona de control să fie supuse unei perioade corespunzătoare de vid sanitar, după ce sunt depopulate de pești, și dezinfectate, după caz. Perioada de vid sanitar a exploatațiilor în care este confirmată contaminarea cu virusul AIS este de cel puțin șase luni. În cazul celorlalte exploatații situate în zone de control, această perioadă este stabilită de autoritatea competentă pe baza unei evaluări a riscurilor de la caz la caz. În cazul în care se depopulează toate exploatațiile situate în zona de control, se stabilește un vid sanitar sincronizat de cel puțin șase săptămâni.

De asemenea, autoritatea competentă poate decide instituirea vidului sanitar și în exploatațiile situate în zonele de monitorizare stabilite.

I.5.2.   Zonele de control stabilite pot fi desființate și repopulate numai după ce toate exploatațiile din acestea au fost depopulate de pești și dezinfectate, după caz, și după ce au fost supuse unui vid sanitar în conformitate cu partea I.5.1. La repopulare, zonele de control sunt transformate în zone de monitorizare, în conformitate cu partea I.4.4.3.

I.5.3.   Zonele de control temporar stabilite pot fi desființate numai după ce s-a exclus suspiciunea de contaminare cu virusul AIS, în conformitate cu partea I.2.2. În cazul confirmării AIS în conformitate cu partea I.3, zona de control temporar este transformată în zonă de control.

I.5.4.   Zonele de monitorizare stabilite pot fi desființate numai după doi ani de la desființarea zonei de control.

I.6.   Monitorizarea oficială în cazul suspectării sau confirmării AIS

I.6.1.   În temeiul articolului 5 alineatul (2) și al articolului 6 din Directiva 93/53/CEE și în scopul stabilirii răspândirii și evoluției bolii, în urma suspectării sau confirmării AIS într-o exploatație, autoritatea competentă sau serviciile sanitare calificate în domeniul stării de sănătate a peștilor, prin consultare cu autoritatea competentă și sub controlul acesteia, trebuie să pună în aplicare un program oficial de monitorizare bazat pe factorul de risc în toate exploatațiile situate în zonele stabilite.

I.6.2.   În scopul aplicării acestui program oficial de monitorizare, autoritatea competentă trebuie să identifice, dacă este necesar, printr-o inspecție la fața locului, toate exploatațiile situate în zonele stabilite și să efectueze recensământul oficial al speciilor, al categoriilor și al cantităților de pești crescuți în exploatații, inclusiv al ratei mortalității.

I.6.3.   Ca urmare a recensământului oficial inițial, exploatațiile situate în zonele de control temporar stabilite, unde este crescut somonul de Atlantic (Salmo salar) – sau oricare altă specie cunoscută a fi susceptibilă la AIS sau la oricare alt vector potențial al acestei boli, în conformitate cu ultima ediție a Codului Zoosanitar Internațional privind animalele acvatice al OIE, sunt obligate să notifice autorității competente cazurile de mortalitate o dată la paisprezece zile. Creșterea mortalității se notifică pentru fiecare zi și pentru fiecare cușcă în parte. Autoritatea competentă efectuează o anchetă după fiecare creștere sensibilă a mortalității în cadrul unei exploatații.

În cazul în care se confirmă suspiciunea de contaminare, toate exploatațiile din zona de control stabilită notifică săptămânal autorității competente cazurile de mortalitate, pentru fiecare cușcă și fiecare zi în parte.

Exploatațiile situate în zonele de monitorizare notifică autorității competente cazurile de mortalitate o dată la paisprezece zile.

De asemenea, în zonele stabilite se efectuează inspecții la intervale periodice, în tot cursul anului, în conformitate cu frecvența prevăzută la tabelul 1. Cu toate acestea, atunci când condițiile climatice fac imposibile inspecțiile respective pe o anumită perioadă a anului, statele membre pot stabili alte periodicități ale inspecțiilor, în cadrul unui plan de urgență.

Tabelul I

Program de monitorizare oficial

Localizarea exploatațiilor

Numărul minim de inspecții pe an

Numărul minim de inspecții pe an ca urmare a desființării zonei de control

Zonă de control

12

 

Zonă de monitorizare

6

6

Zonă de control temporar

6

 

Programul de monitorizare se aplică până la desființarea zonelor.

I.6.4.   Inspecțiile precum și selecția, prelevarea, pregătirea și trimiterea probelor se desfășoară în conformitate cu prevederile de la părțile II.1-II.4. Examinarea probelor se face în conformitate cu prevederile părților III-VI.

II.   Inspecții și prelevarea de probe

II.1.   Inspecția, selecția și prelevarea probelor în cadrul unei exploatații în care se suspectează prezența AIS

II.1.1.   Cu ocazia inspecțiilor periodice efectuate în cadrul programului oficial de monitorizare descris în partea I.6, precum și în exploatațiile suspectate de a fi infectate cu AIS, toate echipamentele exploatațiilor (cuști, cuve și bazine) sunt supuse unei inspecții destinate să depisteze prezența peștilor morți, debili sau cu un comportament anormal. În măsura posibilului, peștii morți recent (nedescompuși), debili sau cu un comportament anormal sunt supuși unui examen destinat depistării semnelor clinice ale AIS sau efectuării de constatări post mortem ale bolii, după cum se indică în ediția curentă a Manualului privind diagnosticarea bolilor animalelor acvatice al OIE.

II.1.2.   În cazul în care se observă semne clinice recente compatibile cu AIS sau în cazul în care un inspector sau un medic veterinar are motive să suspecteze o posibilă infectare a peștilor, se efectuează o prelevare de la cel puțin zece pești. Atunci când este posibil, eșantionul constă din pești morți recent, debili sau cu un comportament anormal. Dacă nu există suficienți pești care să prezinte semne clinice, eșantionul se completează cu pești sănătoși, prelevați din cuștile, cuvele sau bazinele în care se constată ratele cele mai mari de mortalitate sau cel mai mare număr de pești care prezintă semne clinice ale bolii.

II.1.3.   În cazul în care se observă pești morți recent, debili sau cu un comportament anormal, dar ale căror semne clinice și constatări post mortem nu sunt compatibile cu AIS, nu este obligatorie prelevarea de probe, însă pot fi prelevate probe, la cererea inspectorului sau a medicului veterinar, care pot fi necesare pentru emiterea unui diagnostic diferențial.

II.1.4.   În cazul în care sunt suspectați peștii dinsălbăticie de o infecție cu AIS, statele membre se asigură că se efectuează o prelevare și examinare a unor probe corespunzătoare, potrivit metodelor clinice și de laborator necesare, în conformitate cu prevederile părților II și III-VI, în scopul excluderii sau confirmării prezenței AIS și al evaluării gradului de pericol pentru peștii de crescătorie.

II.2.   Pregătirea probelor de la pești

II.2.1.   Probele destinate unei examinări histologice sunt prelevate numai de la peștii sacrificați recent, care prezintă semne clinice sau au făcut obiectul unor constatări post mortem compatibile cu prezența bolii. Se prelevă orice leziune externă sau internă; în toate cazurile, de la fiecare pește se prelevă probe de ficat, de rinichi median, de inimă și de splină, cu ajutorul unui scalpel, care apoi sunt transferate într-o soluție salină tamponată cu 8-10 % (vol/vol) formol. Raportul dintre agentul de fixare și țesut trebuie să fie de cel puțin 20:1, pentru a garanta o conservare satisfăcătoare a țesuturilor.

II.2.2.   Țesuturile utilizate pentru examinarea virusologică se prelevă de la toți peștii din eșantion. Pentru confirmare, se prelevă probe duble. De la pești se prelevă fragmente de ficat, de rinichi anterior, de inimă și de splină, cu ajutorul unui instrument steril, care sunt transferate în tuburi de plastic umplute cu 9 ml de soluție de transport, adică într-un mediu de cultură celulară cu antibiotice. Este necesară o combinație de 12,5 μg pe ml–1 de fungizon, 200 UI de polimixină B pe ml–1și 200 μg de canamicină pe ml–1, dar se pot utiliza și alte combinații cu eficacitate confirmată. Într-un tub umplut cu o soluție de transport se pot colecta țesuturi prelevate de la cel mult cinci pești: acestea constituie o probă globală. Greutatea țesutului unei probe este de 1,0 ± 0,5 grame (g).

II.2.3.   Peliculele de țesut de rinichi destinate testului IFAT se prelevă de la un pește sacrificat recent, în termen de două ore de la deces. Se prelevă un fragment de rinichi median cu ajutorul unor instrumente sterile. Țesutul este tamponat pe o hârtie absorbantă pentru îndepărtarea excesului de sânge, după care este presat de mai multe ori pe o lamă de sticlă acoperită cu poli-L-lizină. Peliculele rezultate în urma a mai multor presări sunt așezate una lângă cealaltă, fără a se suprapune, astfel încât să formeze un strat unic și continuu de celule. Sângele și lichidul tisular nu sunt indicate pentru efectuarea acestui test. Trebuie să se evite „scurgerea” probei de rinichi pe hârtia absorbantă deoarece aceasta poate duce la coagularea sângelui și depunerea unor cantități mari de proteine serice pe lamă. Peliculele de țesut sunt lăsate să se usuce în aer și apoi sunt conservate la rece, cu excepția cazului în care trebuie să fie fixate imediat. Peliculele sunt fixate în termen de 72 de ore de la prelevare. De asemenea, pot fi congelate după uscarea în aer și apoi depozitate timp de o lună, la o temperatură maximă de –20 °C înainte de fixare.

II.2.4.   Peștii care prezintă semne de anemie pot fi asomați; de la aceștia se prelevă imediat probe de sânge heparinat, în vederea unei examen hematologic, precum măsurarea hematocritului.

II.2.5.   Se prelevă țesut de la toți peștii din eșantion în vederea examenului RT-PCR. Se prelevă un fragment de rinichi anterior sau median de la pești cu ajutorul unui instrument steril și acesta este transferat într-un microtub umplut cu 1 ml de soluție de conservare a ARN, cu o eficacitate confirmată. Într-un tub cu soluție de conservare se pot colecta țesuturi de la cel mult cinci pești; acesta constituie o probă globală. Greutatea țesutului unei probe este de circa 0,5 g. În cazul în care peștii sunt prea mici pentru a li se preleva probe cu greutatea dorită, se pot preleva fragmente din rinichi, inimă, splină, ficat sau cecurile pilorice, în această ordine, pentru a se obține o greutate de 0,5 g.

II.3.   Expedierea probelor de la pești

II.3.1.   Probele de sânge și tuburile cu țesuturi de pește destinate examenului virusologic sau analizei RT-PCR sunt amplasate în recipiente izolate (de exemplu, cutii de polistiren cu pereți groși), cu o cantitate suficientă de gheață sau de blocuri refrigerente pentru a asigura refrigerarea probelor pe durata transportului spre laborator. Trebuie să se evite congelarea și recipientul de transport trebuie să conțină încă gheață în momentul recepției sau unul ori mai multe din blocurile refrigerente trebuie să fie încă parțial sau total înghețate. În mod excepțional, probele destinate analizei RT-PCR și cele destinate examenului virusologic pot fi congelate rapid și transportate spre laborator la o temperatură de –20 °C sau mai scăzută.

II.3.2.   Lamele pentru testul IFAT sunt expediate în suporturi pentru lame cu o cantitate suficientă de sicativ, astfel încât peliculele de țesut de rinichi să rămână uscate și răcite în conformitate cu indicațiile anterioare.

II.3.3.   În cazul în care țesuturile de pești sunt transportate într-un agent de fixare, în vederea examenului histologic, expedierea se face în tuburi etanșe, amplasate în recipiente rezistente la șoc, cum ar fi cutii de polistiren cu pereți groși.

II.3.4.   Cu excepția cazului în care eșantioanele au fost congelate, examenul virusologic trebuie să înceapă cât mai repede posibil, în orice caz cel târziu în șaptezeci și două de ore de la colectarea eșantioanelor. Eșantionul destinat analizei de confirmare, se depozitează imediat după sosirea în laborator la o temperatură de –20 °C sau mai scăzută.

II.3.5.   Se pot transporta pești întregi către laborator în cazul în care sunt îndeplinite condițiile de temperatură pe durata transportului prevăzute la partea II.3.1. Peștii întregi sunt înfășurați în hârtie absorbantă și expediați într-un sac de plastic, răcirea făcându-se în conformitate cu indicațiile anterioare.

II.3.6.   Se pot expedia și pești vii dar numai sub supravegherea serviciului oficial.

II.3.7.   Pentru analiza RT-PCR a țesuturilor conservate ulterior în RNAlater, extragerea ARN se realizează într-un termen care variază în funcție de temperatură. Termenele care trebuie respectate sunt indicate în cele ce urmează:

37 °C

o zi,

25 °C

o săptămână,

4 °C

o lună,

–20 °C

fără termen.

II.3.8.   Toate operațiunile de ambalare și de etichetare se realizează în conformitate cu reglementările interne și internaționale în vigoare din domeniul transportului, după caz.

II.4.   Colectarea materialului de diagnosticare suplimentar

De comun acord cu laboratorul de diagnosticare, se pot colecta și pregăti alte țesuturi de pești, în vederea unui examen suplimentar.

III.   EXAMENUL VIRUSOLOGIC

III.1.   Pregătirea probelor

III.1.1.   Atunci când apar dificultăți practice care nu permit inocularea celulelor în termen de 72 de ore de la colectarea probelor de țesut, se admite congelarea probelor respective la –80 °C timp de cel mult douăzeci și opt de zile. Cu toate acestea, țesuturile nu pot fi congelate și dezghețate decât o singură dată înaintea examinării.

III.1.2.   Fiecare probă (amestec de țesuturi într-o soluție de transport) este complet omogeneizată cu un tocător stomacher, mixer sau ansamblu mojar-pistil și centrifugată de la 2 000 până la 4 000 × g timp de 15 minute la 0-6 °C, apoi supernatantul este filtrat (0,45 μm) și incubat cu un volum egal dintr-un amestec diluat corespunzător de antiseruri contra serotipurilor indigene ale virusului NPI. Titrul antiserului trebuie să fie de cel puțin 1:2000, în cadrul unui test de neutralizare pe lamă de 50 %. Amestecul este incubat timp de o oră la 15 °C. Acesta constituie inoculul.

Tratarea tuturor inoculurilor cu un ser antivirus IPN (virus care, în anumite regiuni din Europa, este prezent la 50 % din eșantioanele de pești) are scopul de a preveni apariția, în culturile celulare inoculate, a unui efect citopatic (ECP) care rezultă din virusul NPI. Această tratare permite reducerea duratei examenelor virusologice, precum și a numărului de cazuri în care apariția ECP ar trebui să fie considerată drept un indice potențial al virusului AIS.

În cazul în care probele provin de la unități de producție considerate indemne de NPI, nu este necesară tratarea inoculurilor cu ser antivirus NPI.

III.2.   Inocularea culturilor celulare

III.2.1.   Se cultivă celule SHK-1 (cu cu un număr de treceri de până la 80) sau celule TO, într-un mediu L-15, care conține 5 % ser fetal bovin, 2 % (v/v) mM de L-glutamină și 0,08 % (v/v) de 2-mercaptoetanol la 50 mM pe lame de cultură cu douăsprezece sau douăzeci și patru de godeuri. Se pot utiliza și alte linii celulare cu o eficacitate și sensibilitate confirmate pentru izolarea virusului AIS, ținând seama de variabilitatea sușei și de capacitatea diverselor sușe de a se reproduce în linii celulare diferite. Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antiser în culturi celulare tinere în fază de creștere activă, în scopul obținerii unei diluții finale a materialului tisular într-un mediu de cultură de 1:1 000. La fiecare suspensie de organe, se adaugă 40 μl de inocul la un godeu care conține 2 ml de mediu de cultură. Pentru a reduce la minimum riscul contaminării încrucișate, se recomandă utilizarea unor lame separate, cu douăsprezece sau douăzeci și patru de godeuri, în cazul probelor care provin din situri de acvacultură diferite.

III.2.2.   Se păstrează o lamă neinoculată care va servi ca martor negativ. Se inoculează o altă lamă cu un izolat de referință al virusului AIS, care va servi ca martor pozitiv, și se procedează în felul următor: se inoculează 100 μl dintr-un preparat mamă de virus AIS (titru minim: 107 TCID50 pe ml) în primul godeu și se amestecă bine. Se transferă un volum din această materie din primul în al doilea godeu pentru a se obține o diluție de 1:10 și se amestecă bine. Se repetă operațiunea pe întreaga lamă pentru a se obține șase diluții de 1:10. Preparatul mamă de virus AIS poate fi depozitat la –80 °C timp de cel puțin doi ani; cu toate acestea, o dată dezghețat, el trebuie să fie utilizat în termen de trei zile. Trebuie reținut că trebuie prevenită contaminarea încrucișată a lamelor de testare cu materialul martorului pozitiv. Pentru a se evita acest risc, martorii pozitivi și lamele de testare sunt constituite și tratate separat.

III.2.3.   Se incubează probele la 14 ± 2 °C timp de cel mult cincisprezece zile.

III.3.   Microscopie

Se examinează culturile celulare de două ori la microscop pentru depistarea unui ECP, mai întâi între a cincea și a șaptea zi, apoi între a douăsprezecea și a paisprezecea zi de la inoculare. În cazul în care un amestec prezintă un ECP, se procedează imediat la identificarea virusului (III.6). În cazul în care nu se observă nici un ECP până în a paisprezecea zi, se efectuează un test de hemadsorbție (III.4).

III.4.   Hemadsorbție

Reproducerea virusului AIS în culturile celulare nu are întotdeauna drept rezultat apariția unui ECP. În consecință, fiecare godeu este supus unui test de hemadsorbție precum cel descris anterior sau unui test IF (a se vedea partea III.6.1).

III.4.1.   Se efectuează o prelevare din mediul de cultură celulară din fiecare godeu, inclusiv din godeurile martorilor pozitivi și negativi, și fiecare probă prelevată se introduce într-un tub steril etichetat. La fiecare godeu se adaugă 500 μl de suspensie 0,2 % (v/v) de globule roșii de iepure sau de cal spălate sau de suspensie de 0,05 % (v/v) de globule roșii de păstrăv curcubeu sau de somon de Atlantic spălate și se lasă să incubeze la temperatura ambiantă timp de 45 de minute. Se îndepărtează globulele roșii și se spală fiecare godeu de două ori cu mediul L-15. Fiecare godeu este examinat la microscop.

III.4.2.   Prezența grupelor de globule roșii aderente pe suprafața celulelor SHK-1 sau TO indică infecția presupusă cu un ortomixovirus. În cazul în care testul de hemadsorbție este pozitiv, se efectuează imediat un test de identificare a virusului (III.6).

III.5.   Subcultură sau trecere

III.5.1.   Între a treisprezecea și a cincisprezecea zi se realizează o subcultură. Se adaugă 225 μl de supernatant de cultură în godeurile care conțin celule SHK-1 în fază activă de creștere pe lame cu douăsprezece godeuri, apoi se lasă să incubeze la 14 ± 2 °C timp de cel mult optsprezece zile. Celulele de cultură se examinează de două ori la microscop pentru a depista un ECP, mai întâi între a cincea și a șaptea zi, apoi între a paisprezecea și a optsprezecea zi de la inoculare. Dacă o probă de celule prezintă un ECP, se efectuează imediat identificarea virusului (III.6). Dacă între a paisprezecea și a optsprezecea zi nu se observă nici un ECP, se efectuează un test de hemadsorbție (III.4).

III.5.2.   În cazul în care în curs de șapte zile de la incubație se observă un efect citotoxic, se realizează o subcultură, se lasă celulele la incubat timp de paisprezece până la optsprezece zile, apoi se realizează o nouă subcultură, urmată de o nouă perioadă de incubare de paisprezece până la optsprezece zile. În cazul în care după șapte zile apare efectul citotoxic, se realizează o singură subcultură și celulele se lasă la incubat astfel încât să se ajungă la un număr total de douăzeci și opt până la treizeci și șase de zile de incubare de la inocularea primară.

III.5.3.   În cazul contaminării bacteriene a culturii primare, se reia testul, pe un omogenat de țesuturi depozitat la –80 °C. Înainte de inoculare, omogenatul trebuie să fie centrifugat la 4 000 × g timp de 30 de minute, la o temperatură de 0-6 °C și se filtrează supernatantul la 0,22 μm. În cazul în care are loc contaminarea bacteriană în cursul fazei de subcultură, supernatantul se filtrează la 0,22 μm, se inoculează unor celule proaspete și se lasă la incubat o nouă perioadă de paisprezece până la optsprezece zile.

III.6.   Teste de identificare a virusului

În cazul depistării unui ECP, indiferent de stadiu, sau în cazul unui test de hemadsorbție pozitiv, se efectuează identificarea virusului. Metodele de identificare a virusului AIS disponibile sunt imunofluorescența (IF) (a se vedea partea III.6.1) și RT-PCR (partea IV). Dacă se suspectează prezenta altor virusuri, este recomandabil să se efectueze teste suplimentare de identificare a virusului. În cazul în care aceste teste nu permit identificarea definitivă a virusului în termen de o săptămână, supernatantul se trimite la un laborator național de referință sau la un laborator de referință din Uniunea Europeană, specializat în bolile peștilor, în scopul identificării imediate a virusului.

III.6.1.   IMUNOFLUORESCENȚA

III.6.1.1.   Se cultivă celule de rinichi anterior de somon SHK-1 (cu un număr de treceri de până la 80) sau celule TO într-un mediu L-15 care conține 5 % ser fetal bovin, 2 % (v/v) de L-glutamină la 200 mM și 0,08 % (v/v) de 2-mercaptoetanol la 50 mM pe lame cu douăzeci și patru sau nouăzeci și șase de godeuri, cu o densitate care creează o confluență mai mare de 50 %. Se pot utiliza și alte linii celulare sau un mediu de cultură cu o eficacitate confirmată. Se adaugă 225 μl de supernatant de cultură presupusă a fi infectată de virus în fiecare din cele două godeuri, se amestecă și se transferă 225 μl în alte două godeuri, la o diluție de 1:5. Alte două godeuri neinoculate vor servi drept martori. Probele de la diferite exploatații se tratează pe lame separate, la fel ca și martorii. Virusul este controlat pe un izolat de referință de virus AIS.

III.6.1.2.   Lamele se incubează la 14 ± 2 °C și sunt examinate la microscop timp de cel mult șapte zile. În cazul în care se observă un ECP prematur sau în cazul în care nu se observă nici un ECP în termen de șapte zile, etapa următoare este fixarea. În acest scop, se spală godeurile cu PBS și se fixează prin incubare cu 80 % acetonă, timp de 20 de minute, la temperatura ambiantă. Lamele sunt lăsate să se usuce în aer și apoi se colorează imediat sau sunt depozitate la o temperatură de 0-6 °C timp de cel mult 24 de ore înainte de colorare.

III.6.1.3.   Godeurile duplicate se marchează cu anticorpul monoclonal antivirus AIS 3H6F8 sau cu un alt anticorp monoclonal cu o eficacitate și specificitate confirmate, se diluează în PBS și se lasă la incubat la o temperatură de 37 ± 4 °C, timp de 30 de minute. Se îndepărtează anticorpul monoclonal și se spală lamele de trei ori cu 0,05 % Tween 20 în PBS. Se adaugă un conjugat anti-cobai IgG FITC marcat, diluat în PBS în fiecare godeu, și se incubează la 37 ± 4 °C, timp de 30 de minute. Trebuie reținut că diluțiile diferitelor loturi de anticorp monoclonal și conjugat FITC se optimizează în fiecare laborator. Se îndepărtează anticorpul și se spală lamele de trei ori cu 0,05 % Tween 20 în PBS.

III.6.1.4.   Se examinează imediat godeurile la un microscop inversat, echipat pentru fluorescență cu un filtru adaptat pentru excitarea FITC. Un test este considerat pozitiv dacă se observă celule fluorescente. Pentru ca un test să fie valabil, martorii pozitivi trebuie să indice un rezultat pozitiv, iar martorii negativi un rezultat negativ.

IV.   Examinarea probelor prin RT-PCR

IV.1.   În prezenta secțiune se descriu procedurile necesare amplificării prin PCR a unei părți din segmentul 8 al genomului virusului AIS, care poate fi realizată pe țesuturi de pește sau într-o cultură de virus

IV.1.1.   Extragerea ARN

(a)

Din fiecare probă se îndepărtează RNAlater. Se adaugă 1 ml de apă distilată tratată cu DEPC în fiecare tub și se centrifughează tuburile la o viteză de 13 000 rot/min, timp de 5 minute, la o temperatură de 0-6 °C;

(b)

din fiecare probă se îndepărtează supernatantul, apoi se adaugă 800 μl de TRIzol (Invitrogen) sau un alt reactiv cu eficacitate confirmată echivalentă sau superioară, în fiecare probă și într-un tub martor care conține o substanță de control corespunzătoare (400 μl apă distilată sau un omogenat de rinichi prelevat de la pești indemni de organisme patogene). În cazul în care este necesar, țesuturile se separă prin pipetări repetate. Tuburile sunt lăsate la incubat, la temperatura ambiantă, timp de 5 minute. Se adaugă 160 μm de cloroform în fiecare tub și se agită energic tuburile timp de 3 minute, după care sunt supuse unei centrifugări la o viteză de 13 000 rot/min, timp de 15 minute, la o temperatură de 0-6 °C;

(c)

se îndepărtează stratul apos superior, care este transferat într-un microtub marcat, de 1,5 ml, care conține 500 μl de izopropanol; se lasă tuburile la incubat timp de 10 minute, la temperatura ambiantă după care sunt supuse unei centrifugări la o viteză de 6 500 rot/min, timp de 15 minute, la o temperatură de 0-6 °C;

(d)

se îndepărtează supernatantul și se adaugă 1 ml de etanol la 75 % la reziduul de ARN. Tuburile sunt supuse unei centrifugări la o viteză de 6 500 rot/min, timp de 5 minute, la o temperatură de 0-6 °C;

(e)

se îndepărtează supernatantul și se lasă tuburile deschise circa 3 minute, astfel încât etanolul rezidual să se evapore. Se adaugă 15 µl de apă distilată tratată cu DEPC pentru a repune reziduul în suspensie, apoi acesta este supus unei turbionări, dacă este necesar;

(f)

se utilizează un spectrofotometru pentru a calcula concentrația ARN-ului și puritatea probelor. Se măsoară densitățile optice la 260 și 280 nm;

(g)

ARN-ul, care trebuie să fie utilizat imediat (în aceeași zi), poate totuși să fie depozitat provizoriu la o temperatură de 0-6 °C. ARN-ul care nu este utilizat imediat este depozitat la o temperatură de –80 °C.

IV.1.2.   TRANSCRIPTAZA INVERSĂ (RT)

(a)

Se diluează 2 μg de ARN în apă distilată tratată cu DEPC în microtuburi de 1,5 ml. În cazul în care concentrația unei probe în ARN este prea mică pentru a se putea utiliza 2 μg în reacția RT, se utilizează cea mai mare cantitate posibilă de ARN. Se lasă ARN-ul diluat la incubat, la o temperatură de 55-60 °C, timp de 10 minute.

(b)

Tuburile cu ARN se pun la gheață și se adaugă reactivii pentru RT, în scopul obținerii unor concentrații finale tampon de 1 ×, 1 mM de dNTP, 100 ng de hexameri aleatorii, douăzeci de unități de inhibitor al RNazei și două sute de unități de MMLV-RT la un volum total de 20 μl.

(c)

Se lasă tuburile la incubat, la o temperatură de 37 °C, timp de o oră.

(d)

Se depozitează ADNc, la o temperatură de 0-6 °C, atât timp cât este necesar și se efectuează un PCR cât mai repede posibil.

IV.1.3.   PCR

(a)

Se adaugă 5 µl de ADNc la 45 µl de amestec PCR pentru a se obține concentrații finale tampon 1 ×, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM din fiecare dNTP, 25 pmol din fiecare amorsă și o unitate de polimerază Taq. Amorsele sunt ISA + (amorsă sens) și ISA- (5′-GCC-AAG-TGT-AAG-TAG-CAC-TCC-3′) (amorsă antisens). Se efectuează controale negative în vederea extracției pentru RT și PCR.

(b)

Se introduc tuburile într-un termociclu programat la 94 °C timp de 5 minute, urmat de treizeci și cinci de cicluri la 94 °C timp de 1 minut, la 55 °C timp de 1 minut și la 72 °C timp de 1 minut, cu o incubație finală la 72 °C timp de 5 minute.

(c)

Rezultatele PCR sunt evaluate după o electroforeză, cu ajutorul unui gel de 2 % agaroză colorat cu bromură de etidiu și care cuprinde marcatori de mărime alături de probe, precum și controale negative pentru etapele RT și PCR. Un singur produs PCR de 155 pb se consideră ca o indicație a prezenței ARN-ului virusului AIS. De asemenea, se consideră că probele care conțin un produs suplimentar de 310 pb conțin ARN-ul virusului AIS. Probele care dau multe produse PCR, inclusiv cel puțin un produs de circa 155 pb, pot conține ARN-ul virusului AIS. Ele pot fi supuse unui examen suplimentar practicat cu sonde ADN sau unei secvențieri nucleotidice.

IV.1.4.   Confirmarea prin PCR a virusului AIS izolat într-o cultură tisulară

În cazul în care în cursul examenului virusologic al probelor de țesut din celulele SHK-1 se produce un efect citopatic (ECP) complet, se scot din godeu 400 µl de supernatant, care sunt turnați într-un tub steril de 1,5 ml. Din proba respectivă se extrage ARN-ul, după cum se indică la partea III.1, și se efectuează testul RT-PCR. În cazul utilizării unor culturi în care ECP nu este complet, se îndepărtează supernatantul, se recuperează celulele prin răzuirea suprafeței godeului sau a flaconului, care apoi se introduc într-un tub steril de 1,5 ml, în scopul extragerii ARN-ului și a efectuării testului RT-PCR.

IV.1.5.   Confirmarea produselor PCR prin sondă ADN

(a)

Specificitatea unui produs PCR de 155 pb poate fi evaluată prin sondaj cu un oligonucleotid, care se hibridează într-o regiune a produsului PCR, cu excepția regiunilor amorselor. Produsele PCR sunt supuse unei electroforeze, într-un gel de 1 % agaroză, în paralel cu marcatori de mărime și un control pozitiv și un control negativ pentru etapele RT și PCR.

(b)

Se supune ADN-ul unei reacții Southern-blot pe o membrană și se lasă să incubeze oligonucleotidul marcat (5′-GGGAGTTGATCAGACATGCACTGA AGGTG-3′) cu membrana, după etapele prehibridării.

(c)

Sondele nefixate și fixate nespecific se îndepărtează prin spălarea membranei și apoi se vizualizează sonda fixată.

(d)

Sonda fixată pe un fragment de 155 pb (și de 310 pb, dacă este prezentă) constituie o dovadă a specificității PCR-urilor și indică prezența în probă a ARN-ul virusului AIS.

IV.1.6.   Secvențierea nucleotidică a produselor PCR

Specificitatea produsului PCR poate fi evaluată printr-un examen al secvenței nucleotidice a produsului PCR de 155 pb.

(a)

Se purifică produsul PCR de gelul de agaroză sau de soluție.

(b)

Fragmentul este secvențializat cu aceleași amorse ca cele utilizate pentru reacția PCR sau cu amorse specifice ale vectorului, în cazul în care fragmentul a fost clonat într-un vector înainte de secvențiere.

(c)

Se compară secvența nucleotidică cu cea a segmentului 8 al virusului AIS disponibil în baza de date a secvenței nucleotidice EMBR (numere de acces Y10404, AJO12285, AJ242016).

(d)

Prezența unei secvențe corespunzătoare celei a segmentului 8 al virusului AIS constituie dovada că proba conține ARN-ul virusului AIS.

V.   Examenul peliculelor de țesut de rinichi prin testul IFAT

V.1.   Examenul peliculelor de țesut de rinichi prin testul IFAT se desfășoară conform următorului protocol

V.2.   Pregătirea și marcarea peliculelor aplicate pe lame

V.2.1.   Se fixează lamele în acetonă sau într-un amestec de metanol/acetonă (1:1) timp de 3 minute și se lasă să se usuce în aer. Înainte de a se colora, fiecare lamă este examinată și se încercuiesc zonele corespunzătoare cu un creion ImmEdgeTM sau un creion echivalent și lama este lăsată să se usuce în aer. Apoi lamele se pun într-o soluție de blocare (lapte degresat de 6 % cu PBS cu un conținut de 0,2 % Tween 20) și se lasă la incubat, agitând ușor timp de 30 de minute la temperatura ambiantă. Fiecare lamă se scurge și apoi se amplasează orizontal într-o cutie pentru lame, prevăzută cu hârtie de ștergere umedă pentru menținerea unei atmosfere umede.

V.2.2.   Fiecare peliculă se acoperă cu o soluție de anticorp monoclonal 3H6F8 la virusul AIS (sau un alt anticorp cu o specificitate și o eficacitate confirmate), se închide cutia și se lasă la incubat, agitând timp de 60 de minute la temperatura ambiantă. De regulă, anticorpul este diluat între 1:10 și 1:100 în lapte degresat de 1 %, dar trebuie să se determine diluția reală pentru fiecare lot. Lamele se spală de trei ori timp de 2 minute în PBS cu un conținut de 0,1 % Tween 20. Fiecare peliculă se acoperă cu o soluție care conține conjugat de capră antișoarece marcat FITC, diluat în proporție de 1:1 000 în lapte degresat de 1 % și se lasă la incubat într-o atmosferă umedă timp de 60 de minute, la temperatura ambiantă. Lamele se spală de trei ori timp de 2 minute în PBS cu un conținut de 0,1 % Tween 20. Fiecare lamă se acoperă cu o soluție de CitifluorTM [500 µl de CitifluorTM amestecat cu 1,5 ml Tween 20 cu o concentrație de 0,1 % (v/v) în PBS] sau cu un alt mediu de montare adecvat, timp de 10 minute. Lamele se spală de trei ori în PBS cu un conținut de 0,1 % de Tween 20. Dacă este necesară o contracolorare, fiecare peliculă se acoperă cu iodură de propidiu (0,01 mg/ml) în PBS cu un conținut de 0,1 % de Tween 20 și se lasă la incubat timp de 3 minute la temperatura ambiantă. Lamele se spală de trei ori timp de 2 minute în PBS cu un conținut de 0,1 % de Tween 20. Lamele se scurg și apoi sunt montate în CitifluorTM sau într-un alt mediu de montare adecvat. Înainte de a fi examinate la microscop, lamele sunt depozitate la întuneric, la o temperatură de 4 °C.

V.3.   Examinarea cu un microscop cu fluorescență

Se examinează fiecare lamă cu un microscop adecvat pentru epi-fluorescență, utilizând un filtru corespunzător, de excitare a FITC, care determină emiterea fluorescenței verzi caracteristice. Se examinează toate câmpurile situate în zonele delimitate cu creionul ImmEdgeTM, cu obiective de × 10 și × 20; se efectuează o nouă examinare a zonelor suspecte (cele care prezintă o fluorescență verde) cu un obiectiv de × 40 și cu un contrast de fază și fluorescență care asigură buna localizare în celulă a fluorescenței. Coordonatele zonelor suspecte sunt înregistrate, în vederea unei confirmări ulterioare a naturii fluorescenței de către un al doilea examinator. După examinarea de către primul examinator, lamele care sunt pozitive sau suspecte sunt reexaminate de un al doilea examinator și rezultatele sunt confirmate.

V.4.   Controale

V.4.1.   Pentru fiecare lot de lame colorate pentru testul IFAT sunt prevăzute trei tipuri de control:

pelicule de țesut de rinichi de la un somon de Atlantic neinfectat (control negativ);

cultură celulară SHK-1 neinfectată sau o altă cultură celulară susceptibilă (control negativ);

cultură celulară SHK-1 infectată cu virusul AIS sau o altă cultură celulară susceptibilă (control pozitiv).

V.4.2.   Atunci când este posibil, se recomandă utilizarea unei pelicule de țesut de rinichi de la un somon de Atlantic infectat cu virusul AIS cu titlul de control pozitiv suplimentar.

V.4.3.   În cazul în care controalele negative indică un rezultat pozitiv, testul este considerat invalidat pentru toate lamele din lot. În cazul în care toate lamele dintr-un lot, inclusiv controalele pozitive, sunt negative, testul este considerat invalidat pentru toate lamele din lotul respectiv. În cazul în care eșuarea controalelor invalidează un lot de lame, acestea se distrug și se efectuează un nou test, cu duplicatele peliculelor de țesut de rinichi.

V.5.   Examinarea altor țesuturi

Această tehnică poate fi aplicată și altor țesuturi de pește, precum ficatul, splina și inima, cu condiția ca pe lame să se poată depune o cantitate suficientă de celule endoteliale, de leucocite și de limfocite. Procedura de marcare este identică pentru toate țesuturile, chiar dacă pentru unele dintre ele este preferabil să se renunțe la marcarea cu iodură de propidiu și să se utilizeze iluminarea în fază pentru identificarea tipurilor de celule prezente în pelicula de țesut.

VI.   HISTOLOGIE

Probele introduse în parafină sunt mai întâi tăiate la 5 μm și apoi colorate cu hematoxilină și eozină. Modificările histologice datorate AIS sunt descrise în ediția curentă a Manualului privind diagnosticarea bolilor animalelor acvatice al OIE.

VII.   Acronime și abrevieri

ADNc

Acid dezoxiribonucleic complementar

ECP

Efect citopatic

DEPC

Dietilpirocarbonat

dNTP

Dezoxinucleotid trifosfat

FITC

Izotiocianat de fluoresceină

IF

Imunofluorescență

IFAT

Test de imunofluorescență indirectă

OIE

Oficiul Internațional de Epizootii

NPI (V)

Necroză pancreatică infecțioasă (virus)

AIS (V)

Anemie infecțioasă a somonului (virus)

PBS

Soluție salină tamponată cu fosfat

ARN

Acid ribonucleic

RT-(PCR)

Transcriptază inversă (prin reacția de amplificare în lanț)

SHK-1

Celule de rinichi anterior de somon

TCID50

Doză de infectare 50 % a culturilor tisulare


Top