„ANEXA IV

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CEARĂ PRIN CROMATOGRAFIA ÎN FAZĂ GAZOASĂ-LICHIDĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1.   DOMENIU DE APLICARE

Această metodă descrie o procedură de determinare a conținutului de ceară al anumitor grăsimi și uleiuri în condiții de testare.

Poate fi folosit în special pentru a deosebi uleiul de măsline obținut prin presare de cel obținut prin extracție (ulei din resturi de măsline).

2.   PRINCIPIU

Adăugarea unui standard intern adecvat pentru grăsimi și uleiuri, apoi fracționarea prin cromatografie pe o coloană cu silicagel hidratat. Recuperarea fracției eluate prima în condițiile de testare (a cărei polaritate este mai mică decât cea a trigliceridelor), apoi analiza directă prin cromatografie în fază gazoasă-lichidă cu coloană capilară.

3.   APARATURĂ DE LABORATOR

3.1.   Fiolă Erlenmeyer de 25 ml.

3.2.   Coloană de sticlă pentru cromatografie, 15 mm diametru interior și 30-40 cm lungime.

Cromatograf corespunzător pentru fază gazoasă-lichidă cu coloană capilară, dotat cu un sistem de introducere directă în coloană, incluzând următoarele:

3.3.1.   Cuptor controlat prin termostat pentru coloane, capabil să mențină temperatura dorită cu precizie de 1 °C.

3.3.2.   Injector rece pentru introducere directă în coloană.

3.3.3.   Detector de flacără cu ionizare și convertor-amplificator.

3.3.4.   Aparat înregistrator-integrator capabil să funcționeze cu convertor-amplificatorul (3.3.3), cu rata de răspuns sub 1 secundă, la o viteză variabilă a hârtiei.

3.3.5.   Coloană capilară de sticlă sau silice topită, de 10-15 m lungime, cu diametru interior de 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu lichid SE-52, SE-54 sau un lichid echivalent într-un strat de grosime uniformă de 0,10-0,30 μm.

3.4.   Microseringă cu capacitate de injecție pe coloană de 10 μl, echipată cu ace călite.

4.   REACTANȚI

4.1.   Silicagel, 70/230 mesh, articolul 7754 Merck.

Se pune gelul în cuptor la 500 °C timp de patru ore. Se lasă să se răcească, apoi se adaugă 2 % apă. Se agită bine pentru a omogeniza cantitatea. Se păstrează la întuneric timp de cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

4.2.   n-hexan, pentru cromatografie.

4.3.   Eter etilic, pentru cromatografie.

4.4.   n-heptan, pentru cromatografie.

4.5.   Soluție standard de lauril arahidat, la 0,1 % (m/v) în hexan (standard intern).

4.6.   Gaz transportor: hidrogen pur pentru cromatografia în fază gazoasă-lichidă.

4.7.   Gaze auxiliare:

—	hidrogen pur pentru cromatografia în fază gazoasă-lichidă;

—	aer pur pentru cromatografia în fază gazoasă-lichidă.

5.   PROCEDURĂ

5.1.   Separarea fracțiunii de ceară.

5.1.1.   Pregătirea coloanei pentru cromatografie.

Se suspendă 15 g de silicagel hidratat la 2 % în n-hexan anhidru și se introduce în coloană.

Se lasă să se clarifice spontan. Se definitivează clarificarea cu ajutorul unui agitator electric pentru a face banda de cromatografie mai omogenă. Se percolează 30 ml de n-hexan pentru a înlătura orice impurități.

5.1.2.   Cromatografia cu coloană

Se cântăresc exact 500 mg de probă într-o fiolă de 25 ml și se adaugă o cantitate potrivită de soluție standard intern, în funcție de conținutul de ceară estimat, respectiv se adaugă 0,1 mg de lauril arahidat în cazul uleiului de măsline și 0,25-0,5 mg în cazul uleiului din resturi de măsline.

Se transferă mostra preparată în coloana cromatografică, pregătită în conformitate cu punctul 5.1, cu ajutorul dozelor de 2 ml de n-hexan.

Se lasă solventul să curgă până la 1 mm deasupra nivelului superior al absorbantului. Apoi se începe eluarea cromatografică; se colectează 140 ml de amestec n-hexan/amestec eter etilic, la 99:1, la un debit de aproximativ 15 picături la fiecare 10 secunde (2,1 ml/minut).

Se usucă fracțiunea rezultată într-un evaporator rotativ până când aproape tot solventul este eliminat. Se înlătură ultimii 2 sau 3 ml de solvent cu ajutorul unui curent slab de azot, apoi se adaugă 10 ml de n-heptan.

5.2.   Analiza cromatografică în fază gazoasă-lichidă.

5.2.1.   Procedura preliminară, condiționarea coloanei.

5.2.1.1.   Se fixează coloana pe cromatograful în fază gazoasă-lichidă conectând orificiul de admisie la sistemul coloanei și orificiul de evacuare la detector.

Se verifică aparatura pentru cromatografia în fază gazoasă-lichidă (funcționarea buclelor cu gaz, eficiența detectorului și a aparatului înregistrator etc.).

5.2.1.2.   În cazul în care coloana este folosită pentru prima dată, se recomandă ca aceasta să fie condiționată. Se trece un debit slab de gaz prin coloană, apoi se deschid aparatele de cromatografie în fază gazoasă-lichidă. Se încălzește treptat până la o temperatură cu cel puțin 20 °C mai ridicată decât temperatura de funcționare (notă). Se menține această temperatură timp de cel puțin două ore, apoi se reglează aparatele la condițiile de funcționare (se reglează debitul de gaz, se aprinde flacăra, se conectează la aparatul înregistrator electronic, se reglează temperatura cuptorului pentru coloană, detectorul etc.). Se înregistrează semnalul la o sensibilitate cel puțin de două ori mai mare decât cea necesară pentru efectuarea analizei. Linia de bază ar trebui să fie rectilinie, fără nici un fel de vârfuri sau devieri.

O deviație rectilinie negativă indică faptul că legăturile coloanei nu sunt corecte; o deviație pozitivă indică o condiționare defectuoasă a coloanei.

Notă: Temperatura de condiționare se menține în permanență la cel puțin 20 °C sub valoarea maximă a temperaturii specificate pentru eluentul folosit.

5.2.2.   Alegerea condițiilor de funcționare.

5.2.2.1.   Condițiile de funcționare sunt în general următoarele:

—	temperatura coloanei: la început 80 °C, crește cu 30 °C/minut până la 120 °C, apoi este programată să crească cu 5 °C/minut până la 340 °C;

—	temperatura detectorului: 350 °C;

—	viteza liniară a gazului transportor: hidrogen, 20 până la 35 cm/sec;

—	sensibilitatea instrumentelor: de 4 până la 16 ori mai mare decât atenuarea minimă;

—	sensibilitatea aparatului înregistrator: 1-2 mV, de la baza scalei;

—	viteza hârtiei: 30 cm/oră;

—	cantitatea injectată: 0,5-1 μl soluție.

Aceste condiții pot fi modificate pentru a corespunde caracteristicilor coloanei și ale aparaturii pentru cromatografia în fază gazoasă-lichidă (pentru a obține cromatograme îndeplinind următoarele condiții: timpul de retenție al standardului intern C32 trebuie să fie de 25 ± 2 minute, iar cel mai reprezentativ vârf al cerurilor trebuie să se situeze între 60 și 100 % de la baza scalei).

5.2.2.2.   Se determină parametrii de integrare a vârfurilor în așa fel încât să se obțină o evaluare corectă a suprafeței vârfurilor luate în considerare.

5.2.3.   Realizarea analizei

5.2.3.1.   Se ia 1μl soluție cu ajutorul unei microseringi de 10 μl; se trage înapoi pistonul până când acul s-a golit. Se introduce acul în sistemul de injecție și se injectează repede, după una sau două secunde. După aproximativ 5 secunde, acul se scoate ușor.

5.2.3.2.   Se înregistrează până când cerurile sunt complet eluate.

Linia de bază trebuie să îndeplinească întotdeauna condițiile cerute (5.2.1.2).

5.2.4.   Identificarea vârfurilor

Se identifică vârfurile cu ajutorul timpilor de retenție, comparându-le cu amestecuri de ceară cu timpi de retenție cunoscuți, analizate în aceleași condiții.

Figura 1 prezintă cromatograma cerii pentru un ulei de măsline virgin.

5.2.5.   Analiza cantitativă

5.2.5.1.   Se determină suprafețele vârfurilor corespunzătoare standardului intern și esterilor alifatici de la C40 la C46 cu ajutorul unui integrator.

5.2.5.2.   Se determină conținutul de ceară pentru fiecare ester, în mg/kg de grăsime, după formula:

unde

Ax	=	suprafața vârfului fiecărui ester;
As	=	suprafața vârfului de lauril arahidat;
ms	=	masa de lauril arahidat adăugat, în miligrame;
m	=	masa probei prevalate pentru determinare, în grame.

6.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se indică diferitele conținuturi de ceară și suma lor, în mg/kg de grăsime.

„ANEXA XIV

NOTELE SUPLIMENTARE 2, 3 ȘI 4 LA CAPITOLUL 15 DIN NOMENCLATURA COMBINATĂ

A.   Nr. 1509 și 1510 se referă numai la uleiurile derivate din tratarea măslinelor, ale căror caracteristici analitice ale compoziției acide și sterolice sunt următoarele:

Tabelul I: Compoziția acizilor grași ca procentaj din totalul acizilor grași		Tabelul II: Compoziția sterolică sub formă de procentaj din totalul sterolilor
Acid miristic	M 0,1	Colesterol	M 0,5
Acid linolenic	M 0,9	Brassicasterol	M 0,2
Acid arahidic	M 0,7	Campesterol	M 4,0
Acid eicosanoic	M 0,5	Stigmasterol (4)	< Campesterol
Acid behenic	M 0,3	Beta-sitosterol (5)	m 93,0
Acid lignoceric	M 0,5	Delta-7-stigmasterol	M 0,5
m= minimum M= maximum

Nr. 1509 și 1510 nu includ uleiul de măsline alterat chimic (în special ulei de măsline re-esterificat) sau la amestecuri de ulei de măsline cu alte uleiuri. Prezența uleiului reesterificat sau a altor uleiuri este stabilită folosind metodele din anexele V, VIII, X A și X B din Regulamentul (CEE) nr. 2568/91.

Subpoziția 1509 10 10 include numai uleiurile de măsline definite în secțiunile I și II de mai jos, obținute numai prin mijloace mecanice sau alte mijloace fizice în condiții, în special condiții termice, care nu duc la alterarea uleiului și care nu au fost supuse unui alt tratament decât spălarea, decantarea, centrifugarea sau filtrarea. Uleiurile derivate din măsline cu ajutorul solvenților se încadrează la poziția 1510.

I.   În sensul subpoziției 1509 10 10, «uleiul de măsline virgin lampant», indiferent de aciditate, reprezintă uleiul de măsline cu:

(a)	un conținut de alcooli alifatici care nu depășește 400mg/kg;

(b)	un conținut de eritiodiolși uvaol care nu depășește 4,5 %;

(c)	un conținut de acizi grași saturați la poziția 2 a trigliceridelor care nu depășește 1,3 % și/sau

(d)	suma izomerilor transoleici mai mică de 0,10 % și suma izomerilor translinoleici + translinolenici mai mică de 0,10 %;

(e)

una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: (i) un număr periodic ce depășește 20 meq O2/kg; (ii) un conținut de solvenți volatili halogenați ce depășește 0,1mg/kg pentru orice solvent; (iii) un coeficient de extincție K270 (100) mai mare de 0,250 și, după tratarea uleiului cu alumină activată, nu mai mare de 0,11. De fapt, unele uleiuri cu conținut de acizi grași liberi, exprimat ca acid oleic, de peste 3,3 g la 100 g pot avea, după trecerea prin alumină activată, în conformitate cu metoda prezentată în anexa IX la Regulamentul (CEE) nr. 2568/91, un coeficient de extincție K270 mai mare de 0,10. În cazul acesta, după neutralizarea și decolorarea în laborator, în conformitate cu metoda prezentată în anexa XIII la regulamentul menționat anterior, aceste uleiuri trebuie să aibă următoarele caracteristici: — un coeficient de extincție K270 nu mai mare de 1,20; — o variație a coeficientului de extincție (Delta K), în regiunea de 270 nm, mai mare de 0,01, dar nu mai mare de 0,16, adică: ; Km = coeficientul de extincție la o lungime de undă a vârfului curbei de absorbție în regiunea de 270 nm, Km-4 și Km + 4 = coeficienții de extincție la o lungime de undă cu 4 nm mai joasă, respectiv mai înaltă decât lungimea de undă K270; (iv) caracteristicile organoleptice, inclusiv defectele detectabile, care depășesc limitele de acceptabilitate și un rezultat al testului comisiei sub 3,5 în conformitate cu anexa XII la Regulamentul (CEE) nr. 2568/91.

II.   În sensul subpoziției 1509 10 90, «ulei virgin» reprezintă uleiul de măsline cu următoarele caracteristici:

(a)	un conținut acid, exprimat ca acid oleic, ce nu depășește 3,3 g la 100 g;

(b)	un număr peroxidic ce nu depășește 20 meq O2 activ/kg;

(c)	un conținut de alcooli alifatici ce nu depășește 300 mg/kg;

(d)	un conținut de solvenți volatili halogenați ce nu depășește 0,2 mg/kg per total și 0,1 mg/kg pentru fiecare solvent;

(e)	un coeficient de extincție K270 de maximum 0,250 și, după tratarea uleiului cu alumină activată, de maximum 0,10;

(f)	o variație a coeficientului de extincție (Delta K), în regiunea de 270 nm, de maximum 0,01;

(g)	caracteristicile organoleptice, inclusiv defectele detectabile aflate în limitele acceptabile și un rezultat al testului comisiei de peste 3,5 în conformitate cu anexa XII la Regulamentul (CEE) nr. 2568/91;

(h)	un conținut de eritrodiol și uvaol care nu depășește 4,5 %;

(i)	un conținut de acizi grași saturați la poziția 2 a trigliceridelor care nu depășește 1,3 %;

(j)	o sumă a izomerilor transoleici mai mică de 0,03 % și o sumă a izomerilor translinoleici + translinolenici mai mică de 0,03 %.

C.   Subpoziția 1509 90 00 include uleiul de măsline obținut prin tratarea uleiului de măsline inclus la subpozițiile 1509 10 10 sau 1509 10 90, amestecat sau nu cu ulei de măsline virgin, având următoarele caracteristici:

(a)	un conținut de acid, exprimat ca acid oleic, ce nu depășește 3,3 g la 100 g;

(b)	un conținut de alcooli alifatici care nu depășește 350 mg/kg;

(c)	un coeficient de extincție K270 (100) mai mare de 0,250 și nu mai mare de 1,20 și, după tratarea probei cu alumină activată, mai mare de 0,10;

(d)	o variație a coeficientului de extincție (Delta K), în regiunea de 270 nm, mai mare de 0,01 și nu mai mare de 0,16;

(e)	un conținut de eritrodiol și uvaol care nu depășește 4,5 %;

(f)	un conținut de acizi grași saturați la poziția 2 a trigliceridelor care nu depășește 1,5 %;

(g)	o sumă a izomerilor transoleici mai mică de 0,20 % și o sumă a izomerilor translinoleici + translinolenici mai mică de 0,30 %.

D.   În sensul subpoziției 1510 00 10, «uleiuri brute» reprezintă uleiurile, în special uleiurile din resturi de măsline, având următoarele caracteristici:

(a)	un conținut acid, exprimat ca acid oleic, mai mare de 2 g la 100 g;

(b)	un conținut de eritrodiol și uvaol ce depășește 12 %;

(c)	un conținut de acizi grași saturați la poziția 2 a trigliceridelor care nu depășește 1,8 %;

(d)	o sumă a izomerilor transoleici mai mică de 0,20 % și o sumă a izomerilor translinoleici + translinolenici mai mică de 0,10 %.

E.   Subpoziția 1510 00 90 include uleiurile obținute prin tratarea uleiurilor incluse la subpoziția 1510 00 10, indiferent dacă acestea se află în amestec cu un ulei de măsline virgin, și uleiuri care nu au caracteristicile uleiurilor menționate în notele suplimentare 2B, 2C și 2D. Uleiurile incluse în această subpoziție trebuie să aibă un conținut de acizi grași saturați la poziția 2 a trigliceridelor care să nu depășească 2 %, o sumă a izomerilor transoleici mai mică de 0,4 % și o sumă a izomerilor translinoleici + translinolenici mai mică de 0,35 %.

3.   Subpozițiile 1522 00 31 și 1522 00 39 nu includ:

(a)	reziduurile rezultate din tratarea substanțelor grase care conțin ulei cu un index de iod, determinat în conformitate cu metoda prezentată în anexa XVI la Regulamentul (CEE) nr. 2568/91, mai mic de 70 sau mai mare de 100;

(b)

reziduurile rezultate din tratarea substanțelor grase care conțin ulei cu un index de iod mai mic de 70 sau mai mare de 100, pentru care suprafața totală de vârf reprezentând volumul de retenție a Beta-sitosterolului (6), determinat în conformitate cu anexa V la Regulamentul (CEE) nr. 2568/91, este mai mică de 93 % din totalul suprafețelor totale de vârf pentru sterol.

4.   Metodele analitice de determinare a caracteristicilor produselor menționate anterior sunt cele incluse în anexele la Regulamentul (CEE) nr. 2568/91.