ANEXO

Regime de testes necessário para verificar a realização do objectivo da União de redução dos serótipos de salmonelas relevantes em bandos adultos de reprodução de Gallus gallus

1.   BASE DE AMOSTRAGEM

A base de amostragem para detectar a presença de Salmonella Enteritidis, Salmonella infantis, Salmonella hadar, Salmonella typhimurium e Salmonella virchow («os serótipos de salmonelas relevantes») abrange todos os bandos adultos de reprodução de galos e galinhas (Gallus gallus) com, pelo menos, 250 aves («bandos de reprodução»). É sem prejuízo das disposições do Regulamento (CE) n.o 2160/2003 e da Directiva 2003/99/CE, no que diz respeito aos requisitos de monitorização de outras populações animais ou de outros serótipos.

2.   MONITORIZAÇÃO DOS BANDOS DE REPRODUÇÃO

2.1.   Localização, frequência e estatuto da amostragem

Os bandos de reprodução são amostrados por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar e como elemento dos controlos oficiais.

2.1.1.   Amostragem por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar

A amostragem efectua-se de duas em duas semanas, no local designado pela autoridade competente, segundo duas opções possíveis:

a)	No centro de incubação; ou

b)	Na exploração.

A autoridade competente pode decidir aplicar uma das opções referidas nas alíneas a) ou b) ao regime de testes na sua integralidade para todos os bandos de reprodução de frangos de carne e outra dessas opções para todos os bandos de reprodução de galinhas poedeiras. Contudo, a amostragem de bandos de reprodução que põem ovos para incubação destinados ao comércio no interior da União deve ter lugar na exploração.

Deve ser implantado um procedimento para garantir que a detecção da presença dos serótipos de salmonelas relevantes durante a amostragem por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar é notificada imediatamente à autoridade competente pelo laboratório que efectua as análises. A notificação atempada da detecção da presença de qualquer serótipo de salmonelas relevante é da responsabilidade do operador da empresa do sector alimentar e do laboratório que efectua as análises.

Em derrogação ao disposto no primeiro parágrafo do presente ponto, se o objectivo da União tiver sido alcançado durante pelo menos dois anos civis consecutivos em todo o território do Estado-Membro, a amostragem na exploração pode passar a efectuar-se de três em três semanas, a critério da autoridade competente. Todavia, em caso de detecção da presença de um serótipo de salmonelas relevante num bando de reprodução na exploração e/ou em qualquer outro caso considerado apropriado pela autoridade competente, esta pode decidir manter ou reduzir novamente o intervalo entre amostragens para duas semanas.

2.1.2.   Amostragem como elemento dos controlos oficiais

A amostragem como elemento dos controlos oficiais consiste em:

2.1.2.1.   Se a amostragem por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar se efectuar no centro de incubação:

a)	Amostragem de rotina com uma periodicidade de 16 semanas no centro de incubação;

b)

Amostragem de rotina na exploração, por duas vezes no decurso do ciclo de produção, a primeira vez no prazo de quatro semanas a seguir à passagem para a fase ou unidade de postura, a segunda mais para o final da fase de postura, pelo menos no período de oito semanas que antecede o final do ciclo de produção;

c)	Amostragem de confirmação na exploração, caso se tenha detectado a presença dos serótipos de salmonelas relevantes nas amostras colhidas no centro de incubação.

2.1.2.2.   Se a amostragem por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar se realizar na exploração, a amostragem de rotina efectuar-se-á por três vezes no decurso do ciclo de produção:

a)	No prazo de quatro semanas a seguir à passagem para a fase de postura ou unidade de postura;

b)	No final da fase de postura, pelo menos no período de oito semanas que antecede o final do ciclo de produção;

c)	A qualquer momento do ciclo de produção suficientemente distante da amostragem referida nas alíneas a) e b).

2.1.2.3.   Em derrogação aos pontos 2.1.2.1 e 2.1.2.2 e se o objectivo da União for alcançado durante pelo menos dois anos civis consecutivos em todo o território do Estado-Membro, a autoridade competente pode substituir as amostragens de rotina por uma amostragem:

a)	Na exploração, uma vez e em qualquer altura durante o ciclo de produção, e uma vez por ano no centro de incubação; ou

b)	Na exploração, em duas ocasiões e em qualquer altura desde que suficientemente distantes uma da outra durante o ciclo de produção.

Todavia, em caso de detecção da presença de um serótipo de salmonelas relevante num bando de reprodução na exploração e/ou em qualquer outro caso considerado apropriado pela autoridade competente, esta pode decidir manter ou reduzir novamente o intervalo entre as amostragens estabelecidas nos pontos 2.1.2.1 ou 2.1.2.2.

Uma amostragem realizada pela autoridade competente pode substituir a amostragem realizada por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar.

2.2.   Protocolo de amostragem

2.2.1.   Amostragem no centro de incubação

Em cada amostragem, deve ser colhida pelo menos uma amostra de cada bando de reprodução.

A amostragem deve ser prevista para um dia de incubação em que estejam disponíveis amostras de todos os bandos de reprodução. Se tal não for possível, tem de se garantir que as amostras são colhidas de cada bando, pelo menos com a frequência estabelecida no ponto 2.1.

Todas as matérias de todas as incubadoras de onde são retirados os pintos nascidos no dia da amostragem devem contribuir para o conjunto de amostras de forma proporcional.

Se houver mais de 50 000 ovos de um banho de reprodução nas incubadoras, deve ser colhida uma segunda amostra desse bando.

A amostra deve consistir, no mínimo:

a)

Numa amostra composta de revestimentos dos tabuleiros de incubação, visivelmente sujos, colhida aleatoriamente de cinco tabuleiros ou locais distintos, para atingir uma superfície total de amostragem de, pelo menos, 1 m2; se os ovos para incubação de um bando de reprodução ocuparem mais do que uma incubadora, colher-se-á uma amostra composta de todas as incubadoras, num máximo de cinco; ou

b)

Numa amostra colhida imediatamente após a remoção das aves, utilizando um ou vários tecidos para esfregaço humedecidos que tenham, pelo menos, 900 cm2 de área total, passados em toda a superfície do fundo de no mínimo cinco cestos de incubação, ou na penugem de cinco locais diferentes, incluindo o soalho, em todas a incubadoras com ovos incubados provenientes do bando, num máximo de cinco incubadoras, assegurando que se colhe, pelo menos, uma amostra por bando de que provêm os ovos; ou

c)	10 g de cascas de ovo quebradas tiradas de um total de 25 cestos de incubação diferentes, ou seja, 250 g de amostra inicial, num máximo de cinco incubadoras com ovos incubados provenientes do bando, esmagadas, misturadas e subdivididas para formar uma subamostra de 25 g para submeter a ensaio.

O procedimento indicado nas alíneas a), b) e c) será seguido na realização de amostragens por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar, bem como enquanto elemento dos controlos oficiais. Contudo, não é obrigatório incluir uma incubadora com ovos de bandos diferentes se pelo menos 80 % dos ovos estiverem noutras incubadoras submetidas a amostragem.

2.2.2.   Amostragem na exploração

2.2.2.1.   Amostragem de rotina por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar

A amostragem consiste principalmente na recolha de amostras de excrementos e tem por objectivo detectar uma prevalência de 1 % no bando, com um limite de confiança de 95 %. Para esse efeito, as amostras incluem um dos seguintes elementos:

a)

Amostras combinadas de excrementos, compostas de amostras separadas de excrementos frescos, pesando cada uma pelo menos 1 g, colhidas aleatoriamente em diversos pontos da capoeira em que se encontra o bando de reprodução ou, caso este tenha livre acesso a mais de uma capoeira de uma determinada exploração, colhidas em cada grupo de capoeiras da exploração em que se encontra o bando de reprodução. Os excrementos podem ser agrupados para análise até um mínimo de dois grupos. O número de diferentes locais de colheita de excrementos para constituir uma amostra combinada deve ser o que adiante se indica: Número de aves mantidas no bando de reprodução Número de amostras de excrementos a colher do bando de reprodução 250-349 200 350-449 220 450-799 250 800-999 260 1 000 ou mais 300

b)

Amostras de esfregaços em botas e/ou amostras de pó:   As botas para esfregaço devem ser suficientemente absorventes de modo a absorver a humidade. Para este efeito, também são aceitáveis as «meias» tubulares de gaze.   Humedece-se a superfície das botas para esfregaço com diluente adequado (como cloreto de sódio a 0,8 %, peptona a 0,1 % em água desionizada estéril, água estéril, ou qualquer outro diluente aprovado pela autoridade competente).   As amostras são colhidas enquanto se anda através da instalação, utilizando um caminho que produza amostras representativas de todas as partes da capoeira ou do respectivo sector. Isto deve incluir as zonas de cama e com chão de ripas, desde que seja seguro caminhar sobre essas ripas. A amostragem deve incluir todos os diferentes compartimentos dentro de uma mesma capoeira. Concluída a amostragem em determinado sector, devem retirar-se cuidadosamente as botas para esfregaço de modo a não remover o material aderente. As amostras devem consistir em: i) cinco pares de botas para esfregaço, representando cada um cerca de 20 % da superfície da capoeira; as amostras de esfregaços podem ser agrupadas para análise num mínimo de dois grupos, ou ii) pelo menos um par de botas para esfregaço, representando a totalidade da superfície da capoeira, e uma amostra de pó adicional colhida em diversos locais em toda a capoeira em superfícies onde a presença de pó seja visível; para colher a amostra de pó, devem ser utilizados um ou vários tecidos para esfregaço humedecidos que tenham, pelo menos, 900 cm2 de área total.

c)

No que se refere aos bandos criados em gaiolas, as amostras podem ser excrementos naturalmente misturados provenientes dos tapetes de evacuação do esterco, das raspadeiras ou das fossas, dependendo do tipo de gaiola utilizada. Recolhem-se duas amostras de, pelo menos, 150 g, que serão analisadas individualmente: i) tapetes de evacuação do esterco por baixo de cada piso de gaiolas que são regularmente accionados e descarregados para um sistema de parafuso sem fim ou um tapete rolante; ii) sistema de fossa, em que existem deflectores por baixo das gaiolas que raspam para uma fossa por baixo da instalação; iii) sistema de fossa no caso de gaiolas montadas em escada, estando desalinhadas, e os excrementos caem directamente para a fossa. Numa instalação há normalmente vários blocos de gaiolas. Na amostra global combinada devem encontrar-se representados os excrementos misturados de cada bloco. Para cada bando de reprodução, devem colher-se duas amostras combinadas tal como descrito nos parágrafos terceiro a sexto seguintes. Nos sistemas em que existem tapetes ou raspadeiras, estes devem ser colocados em funcionamento no dia da amostragem antes da sua realização. Nos sistemas em que existem deflectores por baixo das gaiolas e raspadeiras, recolhem-se os excrementos misturados que se depositaram na raspadeira após o seu funcionamento. Nos sistemas de gaiolas montadas em escada, em que não existe qualquer sistema de tapete ou raspadeira, será necessário recolher os excrementos misturados por toda a fossa. Sistema de tapetes de evacuação do esterco: colhem-se os excrementos misturados nas extremidades de descarga dos tapetes.

2.2.2.2.   Amostragem como elemento dos controlos oficiais

a)	A amostragem de rotina será efectuada tal como descrita no ponto 2.2.2.1.

b)

A amostragem de confirmação, caso se tenham detectado os serótipos de salmonelas relevantes nas amostras colhidas no centro de incubação, efectua-se tal como descrito no ponto 2.2.2.1. Podem ser colhidas amostras adicionais para eventuais testes de detecção de agentes antimicrobianos ou de efeito inibidor do crescimento bacteriano do seguinte modo: seleccionar-se-ão aves aleatoriamente em cada uma das capoeiras da exploração, normalmente até cinco aves por capoeira, salvo se a autoridade competente considerar necessárias amostras de um número mais elevado de aves. Se a fonte de infecção não for confirmada, deverão realizar-se testes de detecção de agentes antimicrobianos ou novos testes bacteriológicos para detecção dos serótipos de salmonelas relevantes no bando de reprodução ou na sua progenitura antes que possam ser levantadas as restrições ao comércio. Se forem detectados agentes antimicrobianos ou de efeito inibidor do crescimento bacteriano, a infecção por salmonelas é considerada como confirmada.

c)	Suspeita de resultados falsos Em casos excepcionais, quando a autoridade competente tenha razões para pôr em causa os resultados (por exemplo, resultados falsos positivos ou falsos negativos) pode decidir repetir os testes em conformidade com a alínea b).

3.   ANÁLISE DAS AMOSTRAS

3.1.   Transporte e preparação das amostras

3.1.1.   Transporte

As amostras devem ser enviadas, de preferência, por correio expresso ou por serviço de correio privado aos laboratórios mencionados nos artigos 11.o e 12.o do Regulamento (CE) n.o 2160/2003 no prazo de 24 horas após a colheita. Se não forem enviadas nesse prazo, devem manter-se refrigeradas. O transporte pode ser efectuado à temperatura ambiente desde que sejam evitados calor excessivo (superior a 25 °C) e exposição à luz solar. No laboratório, as amostras devem conservar-se refrigeradas até à sua análise, a qual deve iniciar-se no prazo de 48 horas após a sua recepção e de 96 horas após a colheita.

3.1.2.   Revestimentos dos tabuleiros de incubação

a)	Colocar a amostra num litro de água peptonada tamponada, previamente aquecida à temperatura ambiente, e agitar suavemente;

b)	Continuar a cultura da amostra através do método de detecção descrito no ponto 3.2.

3.1.3.   Amostras de esfregaços em botas e amostras de pó

a)

Os pares de botas/meias para esfregaço e as amostras de pó (tecido para esfregaço) devem ser desembrulhados cuidadosamente, de forma a evitar a retirada dos excrementos aderentes ou a perda de partículas de pó, e colocados em 225 ml de água peptonada tamponada, previamente aquecida à temperatura ambiente;

b)

As botas/meias para esfregaço e o tecido para esfregaço devem ficar completamente imersos na água peptonada tamponada para que o líquido livre à volta da amostra seja suficiente para permitir a migração das salmonelas, podendo, por conseguinte, ser acrescentada mais água peptonada tamponada, se necessário. As botas/meias e o tecido para esfregaço devem ser preparados separadamente;

c)

Nos casos em que se tenham reunido cinco pares de botas/meias para esfregaço em duas amostras, colocar cada amostra já reunida em 225 ml de água peptonada tamponada, ou mais se necessário, para imersão total da amostra e de modo a que o líquido livre à volta da amostra seja suficiente para permitir a migração das salmonelas;

d)	Agitar para saturar completamente a amostra e continuar a cultura através do método de detecção descrito no ponto 3.2.

3.1.4.   Outras amostras de excrementos

a)	As amostras de excrementos devem ser combinadas e misturadas cuidadosamente, devendo colher-se uma subamostra de 25 g para cultura;

b)	À subamostra de 25 g devem adicionar-se 225 ml de água peptonada tamponada, previamente aquecida à temperatura ambiente;

c)	Continuar a cultura da amostra através do método de detecção descrito no ponto 3.2.

Caso sejam acordadas normas ISO sobre a preparação de amostras relevantes para a detecção de salmonelas, essas normas devem ser aplicadas, devendo substituir-se às disposições referidas nos pontos 3.1.2, 3.1.3 e 3.1.4 relativas à preparação das amostras.

3.2.   Método de detecção

A detecção dos serótipos de salmonelas relevantes é realizada de acordo com a alteração 1 da norma EN/ISO 6579-2002/Amd1:2007. «Microbiologia de alimentos para consumo humano e para alimentação animal — Método horizontal para a detecção de Salmonella spp. — Alteração 1: Anexo D: Detecção de Salmonella spp. em excrementos de origem animal e em amostras ambientais da fase de produção primária».

No que se refere às amostras em botas para esfregaço, amostras de pó e outras amostras de excrementos referidas no ponto 3.1, é possível combinar para cultura posterior o caldo de enriquecimento de água peptonada tamponada incubado. Para o efeito, incubar ambas as amostras em água peptonada tamponada, tal como referido no ponto 3.1.3. Retirar 1 ml de caldo incubado de cada amostra e misturar cuidadosamente; em seguida, retirar 0,1 ml da mistura e inocular as placas de meio Rappaport-Vassiladis semi-sólido modificado (MSRV).

Não mexer nem agitar de qualquer outra maneira as amostras em água peptonada tamponada após a incubação, dado que isto liberta partículas inibitórias e reduz o isolamento subsequente em MSRV.

3.3.   Serotipagem

Para cada amostra que revela uma reacção positiva, deve fazer-se a tipagem de pelo menos um isolado, segundo o sistema Kaufmann-White.

3.4.   Métodos alternativos

No atinente às amostras colhidas por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar, podem ser utilizados métodos alternativos, em substituição dos métodos de preparação de amostras, dos métodos de detecção e da serotipagem previstos nos pontos 3.1, 3.2 e 3.3 do presente anexo, se validados de acordo com a versão mais recente da norma EN/ISO 16140.

3.5.   Armazenagem das estirpes

Deve assegurar-se a armazenagem, para eventual futura fagotipagem ou teste de susceptibilidade antimicrobiana, de pelo menos uma estirpe dos serótipos de salmonelas relevantes por capoeira e por ano, isolada a partir da amostragem como elemento dos controlos oficiais, usando os métodos normais de colecção de culturas, que devem assegurar a integridade das estirpes durante um período mínimo de dois anos. Se a autoridade competente assim o decidir, os isolados da amostragem por iniciativa dos operadores de empresas do sector alimentar serão igualmente armazenados para estes fins.

4.   RESULTADOS E RELATÓRIOS

Um bando de reprodução é considerado positivo para efeitos de verificação da consecução do objectivo da União,

—	se for detectada a presença dos serótipos de salmonelas relevantes (excepto estirpes de vacina) numa ou várias amostras do bando, mesmo que os serótipos de salmonelas relevantes apenas sejam detectados na amostra de pó, ou

—	se a amostragem de confirmação como elemento dos controlos oficiais em conformidade com o ponto 2.2.2.2, alínea b), não confirmar a detecção dos serótipos de salmonelas relevantes mas tenham sido detectados no bando agentes antimicrobianos ou de efeito inibidor do crescimento bacteriano.

Esta regra não se aplica nos casos excepcionais descritos no ponto 2.2.2.2, alínea c), sempre que o resultado inicial positivo às salmonelas da amostragem por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar não for confirmado pela amostragem como elemento dos controlos oficiais.

Um bando de reprodução positivo é apenas contabilizado uma vez independentemente da frequência com que os serótipos de salmonelas relevantes tiverem sido detectados neste bando durante o período de produção ou de a amostragem ter sido realizada por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar ou pela autoridade competente. No entanto, se a amostragem durante o período de produção abranger mais de dois anos civis, o resultado de cada ano é notificado separadamente.

Os relatórios devem incluir:

a)	Uma descrição pormenorizada das opções aplicadas no regime de amostragem e o tipo de amostras colhidas, conforme adequado;

b)	O número total de bandos adultos de reprodução com, pelo menos, 250 aves que foram testados no mínimo uma vez durante o ano a que se refere o relatório;

c)

Os resultados das análises, incluindo: i) o número total de bandos de reprodução positivos a quaisquer salmonelas no Estado-Membro; ii) o número de bandos de reprodução positivos a, pelo menos, um dos serótipos de salmonelas relevantes; iii) o número de bandos de reprodução positivos a cada serótipo de salmonelas ou a salmonelas não especificadas (isolados não tipáveis ou não submetidos a serotipagem);

d)	O número de casos nos quais a amostra inicial positiva às salmonelas da amostragem por iniciativa do operador da empresa do sector alimentar não foi confirmada pela amostragem como elemento dos controlos oficiais;

e)	A explicação dos resultados, sobretudo no que se refere aos casos excepcionais.

Os resultados e quaisquer informações adicionais relevantes devem ser notificados como parte do relatório sobre tendências e origens previsto no n.o 1 do artigo 9.o da Directiva 2003/99/CE.