ANEXO
Os anexos do Regulamento de Execução (UE) 2016/1240 são alterados do seguinte modo:
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1) |
O anexo IV é alterado do seguinte modo:
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Ao anexo V é aditada a seguinte parte I-A: «PARTE I-A Métodos de análise de leite em pó desnatado para intervenção pública
Apêndice I LEITE EM PÓ DESNATADO: DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DA FOSFATIDILSERINA E DA FOSFATIDILETANOLAMINA Método: HPLC com inversão de fases 1. OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO O presente método descreve um procedimento para a determinação quantitativa de fosfatidilserina (PS) e de fosfatidiletanolamina (PE) no leite em pó desnatado, podendo ser utilizado para a deteção de sólidos de leitelho nesse leite em pó. 2. DEFINIÇÃO Teor de PS+PE: fração mássica da substância, determinada pelo procedimento a seguir descrito. O resultado é expresso em miligramas de dipalmitato de fosfatidiletanolamina (PEDP) por 100 g de pó. 3. PRINCÍPIO DO MÉTODO Extração, em metanol, dos aminofosfolípidos do leite em pó reconstituído. Determinação da PS e da PE, na forma de derivados o-ftaldialdeídicos (OPA) por HPLC com inversão de fases e deteção por fluorescência. Quantificação do teor de PS e PE na amostra de ensaio em relação a uma amostra-padrão com uma quantidade conhecida de PEDP. 4. REAGENTES Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. Salvo indicação em contrário, a água deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. 4.1. Substância-padrão: PEDP com grau de pureza mínimo de 99 % Nota: A substância-padrão deve ser armazenada a – 18 °C. 4.2. Reagentes para a preparação da amostra-padrão e da amostra de ensaio 4.2.1. Metanol para HPLC 4.2.2. Clorofórmio para HPLC 4.2.3. Monocloridrato de triptamina 4.3. Reagentes para a preparação de derivados o-ftaldialdeídicos 4.3.1. Solução aquosa 12 M de hidróxido de sódio 4.3.2. Solução aquosa 0,4 M de ácido bórico, com o pH ajustado a 10,0 com hidróxido de sódio (4.3.1) 4.3.3. 2-Mercaptoetanol 4.3.4. o-Ftaldialdeído (OPA) 4.4. Eluentes para a HPLC 4.4.1. Preparar os eluentes com reagentes para HPLC. 4.4.2. Água para HPLC 4.4.3. Metanol de pureza fluorimétrica comprovada 4.4.4. Tetra-hidrofurano 4.4.5. Di-hidrogenofosfato de sódio 4.4.6. Acetato de sódio 4.4.7. Ácido acético 5. EQUIPAMENTO 5.1. Balança analítica capaz de pesar com a aproximação de 1 mg, com leitura das décimas de miligrama 5.2. Copos de 25 e de 100 ml 5.3. Pipetas de 1 ml e de 10 ml 5.4. Agitador magnético 5.5. Pipetas graduadas de 0,2 ml, 0,5 ml e 5 ml 5.6. Balões aferidos de 10 ml, 50 ml e 100 ml 5.7. Seringas de 20 μl e 100 μl 5.8. Banho de ultrassons 5.9. Centrifugadora capaz de atingir 27 000 g 5.10. Frascos de vidro de cerca de 5 ml 5.11. Proveta graduada de 25 ml 5.12. Medidor de pH, com a aproximação de 0,1 unidades de pH 5.13. Equipamento de HPLC 5.13.1. Sistema de bombagem de gradiente, regulável para 1,0 ml/min a 200 bar 5.13.2. Injetor automático, com possibilidade de derivação 5.13.3. Câmara aquecida, capaz de manter a coluna a 30 °C ± 1 °C 5.13.4. Detetor de fluorescência, regulável para um comprimento de onda de excitação de 330 nm e um comprimento de onda de emissão de 440 nm 5.13.5. Integrador ou programa informático de tratamento de dados para a determinação da área dos picos 5.13.6. Coluna LiChrospher® — 100 (250 mm × 4,6 mm) ou coluna equivalente, com enchimento de octadecilsilano (C 18) em partículas de 5 μm 6. AMOSTRAGEM A colheita de amostras deve ser efetuada de acordo com a Norma ISO 707. 7. PROCEDIMENTO 7.1. Preparação da solução do padrão interno 7.1.1. Pesar 30,0 ± 0,1 mg de monocloridrato de triptamina (4.2.3) num balão aferido de 100 ml (5.6) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). 7.1.2. Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 10 ml (5.6) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1), de modo a obter a concentração de 0,15 mM de triptamina. 7.2. Preparação da solução da amostra para análise 7.2.1. Pesar 1,000 ± 0,001 g da amostra de leite em pó desnatado num frasco de 25 ml (5.2). Utilizando uma pipeta (5.3), adicionar 10 ml de água destilada a 40 °C ± 1 °C e agitar com um agitador magnético (5.4) durante 30 minutos, para dissolver eventuais grumos. 7.2.2. Pipetar 0,2 ml (5.5) do leite reconstituído para um balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 100 μl da solução 0,15 mM de triptamina (7.1) com uma seringa (5.7) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). Misturar cuidadosamente, invertendo o balão, e tratar a amostra com ultrassons (5.8) durante 15 minutos. 7.2.3. Centrifugar (5.9) a 27 000 g durante 10 minutos e recolher o sobrenadante num frasco de vidro (5.10). Nota: A solução da amostra para análise deve ser guardada a 4 °C até à análise por HPLC. 7.3. Preparação da solução do padrão externo 7.3.1. Pesar 55,4 mg de PEDP (4.1) num balão aferido de 50 ml (5.6) e adicionar cerca de 25 ml de clorofórmio (4.2.2) utilizando uma proveta graduada (5.11). Aquecer o balão rolhado até à temperatura de 50 °C ± 1 °C e misturar cuidadosamente até o PEDP se dissolver. Arrefecer o balão até 20 °C, completar o volume até à marca com metanol (4.2.1) e misturar por inversão. 7.3.2. Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 100 ml (5.6) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). Pipetar 1 ml (5.3) desta solução para um balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 100 μl (5.7) da solução 0,15 mM de triptamina (7.1) e completar o volume até à marca com metanol (4.2.1). Misturar por inversão Nota: A solução da amostra de referência deve ser guardada a 4 °C até à análise por HPLC. 7.4. Preparação do reagente para a obtenção de derivados Pesar 25,0 ± 0,1 mg de OPA (4.3.4) num balão aferido de 10 ml (5.6), adicionar 0,5 ml (5.5) de metanol (4.2.1) e misturar cuidadosamente para dissolver o OPA. Completar o volume com solução de ácido bórico (4.3.2) e adicionar 20 μl de 2-mercaptoetanol (4.3.3) com uma seringa (5.7). Nota: Este reagente deve ser guardado a 4 °C num frasco de vidro castanho, mantendo-se estável durante uma semana. 7.5. Determinação por HPLC 7.5.1. Eluentes (4.4) Eluente A: Solução 0,3 mM de di-hidrogenofosfato de sódio e 3 mM de acetato de sódio (pH ajustado a 6,5 ± 0,1 com ácido acético):metanol:tetra-hidrofurano = 558:440:2 (v/v/v) Eluente B: metanol 7.5.2. Gradiente de eluição sugerido:
Nota: Para conseguir a resolução da figura 1, pode ser necessário alterar ligeiramente o gradiente de eluição. Temperatura da coluna: 30 °C. 7.5.3. Volume a injetar: 50 μl do reagente para a obtenção de derivados e 50 μl da solução da amostra 7.5.4. Estabilização da coluna Diariamente, ao pôr o sistema em funcionamento, lavar a coluna com 100 % de eluente B durante 15 minutos; ajustar depois para uma proporção A:B = 40:60 e estabilizar a 1 ml/min durante 15 minutos. Fazer uma passagem em branco injetando metanol (4.2.1). Nota: Antes de uma paragem prolongada, lavar a coluna com uma mistura 80:20 (v/v) de metanol:clorofórmio durante 30 minutos. 7.5.5. Determinação do teor de PS + PE na amostra para análise 7.5.6. Efetuar a sequência de análises cromatográficas mantendo um intervalo de tempo constante entre passagens, de modo a obter tempos de retenção constantes. Injetar a solução do padrão externo (7.3) entre cada 5-10 soluções da amostra a analisar, a fim de calcular o fator de resposta Nota: A coluna deve ser limpa, efetuando uma lavagem com 100 % de eluente B (7.5.1) durante pelo menos 30 minutos, depois de cada 20-25 passagens. 7.6. Modo de integração 7.6.1. Pico do PEDP A eluição do PEDP produz um único pico. Determinar a área do pico por integração entre o mínimo que precede o pico e o mínimo que se lhe segue. 7.6.2. Pico da triptamina A eluição da triptamina produz um único pico (figura 1). Determinar a área do pico por integração entre o mínimo que precede o pico e o mínimo que se lhe segue. 7.6.3. Grupos de picos da PS e da PE Nas condições descritas (figura 1), a eluição da PS produz dois picos principais, parcialmente sobrepostos, precedidos de um pico secundário. A eluição da PE produz 3 picos principais, parcialmente sobrepostos. Determinar a área total de cada grupo de picos, estabelecendo a linha de base conforme se indica na figura 1. 8. CÁLCULO E APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS Os teores de PS e PE da amostra para análise são calculados do seguinte modo: C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2)) em que:
9. PRECISÃO DO MÉTODO Nota: Os valores de repetibilidade foram calculados em conformidade com a norma internacional IDF (*). 9.1. Repetibilidade O desvio-padrão relativo da repetibilidade, que exprime a variabilidade de resultados analíticos independentes obtidos pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento, nas mesmas condições, na análise da mesma amostra, num curto intervalo de tempo, não deve exceder 2 %. Se duas determinações forem obtidas nestas condições, a diferença relativa entre os dois resultados não deve exceder 6 % da média aritmética dos resultados. 9.2. Reprodutibilidade Se forem efetuadas duas determinações por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamento diferente, em condições diferentes, na análise da mesma amostra, a diferença relativa entre os dois resultados não deve exceder 11 % da média aritmética dos resultados. 10. REFERÊNCIAS 10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., «Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids». Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988). Figura 1 Gráfico HPLC de derivados OPA da fosfatidilserina (PS) e da fosfatidiletanolamina (PE) presentes num extrato metanólico de leite em pó desnatado reconstituído. É indicado o modo de integração dos picos da PS, da PE e da triptamina (padrão interno) 
Minutes Fluorescência (unidades arbitrárias Apêndice II DETEÇÃO DE SORO DE COAGULAÇÃO NO LEITE EM PÓ DESNATADO DESTINADO À ARMAZENAGEM PÚBLICA ATRAVÉS DA DETERMINAÇÃO DOS CASEINOMACROPÉPTIDOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC) 1. OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO O presente método permite detetar a presença de soro de coagulação no leite em pó desnatado destinado à armazenagem pública através da determinação dos caseinomacropéptidos. 2. REFERÊNCIA Norma internacional ISO 707 - Milk and Milk Products - Guidance on sampling. 3. DEFINIÇÃO O teor de sólidos de soro de coagulação é definido em percentagem mássica, determinada em função do teor de caseinomacropéptidos obtido pelo procedimento descrito. 4. PRINCÍPIO
5. REAGENTES Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. 5.1. Solução de ácido tricloroacético Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (CCl3COOH) em água e completar o volume até 1 000 ml. A solução deve apresentar-se límpida e incolor. 5.2. Eluente, pH 6,0 Dissolver 1,74 g de hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4), 12,37 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) e 21,41 g de sulfato de sódio (Na2SO4) em cerca de 700 ml de água. Se necessário, ajustar o pH a 6,0, utilizando uma solução de ácido fosfórico ou de hidróxido de potássio. Completar o volume com água até 1 000 ml e homogeneizar. Nota: A composição do eluente pode ser adaptada de modo a corresponder à certificação dos padrões ou às recomendações do fabricante do enchimento da coluna. Antes de o utilizar, filtrar o eluente através de um filtro de membrana com poros de 0,45 μm. 5.3. Solução de lavagem das colunas Misturar um volume de acetonitrilo (CH3CN) com nove volumes de água. Antes de a utilizar, filtrar a mistura através de um filtro de membrana com poros de 0,45 μm. Nota: Pode ser utilizada qualquer outra solução de lavagem com efeito bactericida que não altere o poder de resolução das colunas. 5.4. Amostras-padrão 5.4.1. Leite em pó desnatado que satisfaça as exigências do presente regulamento (i.e. [0]) 5.4.2. Leite em pó desnatado idêntico, mas adulterado com 5 % (m/m) de soro de coagulação em pó de composição padrão (i.e. [5]) 6. EQUIPAMENTO 6.1. Balança analítica 6.2. Em opção, centrifugadora capaz de centrifugar a 2 200 g, dotada de tubos de centrifugação rolhados ou capsulados de cerca de 50 ml 6.3. Agitador mecânico 6.4. Agitador magnético 6.5. Funis de vidro, com cerca de 7 cm de diâmetro 6.6. Papel de filtro para filtração média, com cerca de 12,5 cm de diâmetro 6.7. Dispositivo de filtração de vidro, com filtro de membrana de 0,45 μm de diâmetro de poro 6.8. Pipetas graduadas de 10 ml (ISO 648, classe A, ou ISO/R 835) ou sistema que permita debitar 10,0 ml em dois minutos 6.9. Sistema que permita debitar 20,0 ml de água a cerca de 50 °C 6.10. Banho-maria termostático regulado para 25 °C ± 0,5 °C 6.11. Equipamento de HPLC, composto pelo seguinte:
7. AMOSTRAGEM 7.1. A colheita das amostras deve ser efetuada de acordo com a norma internacional ISO 707. Todavia, os Estados-Membros podem utilizar outro método de amostragem, desde que respeite os princípios da referida norma. 7.2. Conservar as amostras em condições que evitem qualquer deterioração ou alteração de composição. 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparação da amostra para análise Colocar o leite em pó num recipiente de capacidade aproximadamente dupla do volume do pó, equipado com uma tampa hermética. Fechar de imediato o recipiente. Misturar bem o leite em pó, invertendo várias vezes o recipiente. 8.2. Toma para análise Pesar 2,000 ± 0,001 g da amostra para análise num tubo de centrifugação (6.2) ou num balão rolhado adequado (50 ml). 8.3. Eliminação da matéria gorda e das proteínas 8.3.1. Adicionar 20,0 ml de água quente (50 °C) à toma para análise. Dissolver o pó, agitando durante cinco minutos com um agitador mecânico (6.3). Colocar o tubo em banho-maria (6.10) e deixar estabilizar a 25 °C. 8.3.2. Adicionar, ao longo de dois minutos, 10,0 ml da solução de ácido tricloroacético (5.1), a cerca de 25 °C, agitando sempre vigorosamente com o agitador magnético (6.4). Colocar o tubo no banho-maria (6.10) e deixar em repouso durante 60 minutos. 8.3.3. Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g ou filtrar através de papel de filtro (6.6), rejeitando os primeiros 5 ml de filtrado. 8.4. Determinação cromatográfica 8.4.1. Injetar 15 a 30 μl de sobrenadante ou filtrado (8.3.3), rigorosamente medidos, no aparelho de HPLC (6.11), com um caudal de 1,0 ml de eluente (5.2) por minuto. Nota 1. Pode utilizar-se um caudal diferente, em função do diâmetro interno das colunas utilizadas ou das instruções do fabricante das colunas. Nota 2. A cada interrupção, lavar as colunas com água. Nunca deixar eluente (5.2) nas colunas. Antes de qualquer interrupção superior a 24 horas, lavar as colunas com água e, em seguida, com a solução (5.3) durante, pelo menos, 3 horas, com um caudal de 0,2 ml por minuto. 8.4.2. Os resultados da análise cromatográfica da amostra em análise [E] são obtidos sob a forma de um cromatograma, no qual cada pico é identificado pelo tempo de retenção respetivo, RT, do seguinte modo:
A escolha da(s) coluna(s) pode influenciar consideravelmente o tempo de retenção dos diferentes picos. O integrador (6.11.6) calcula automaticamente a área, A, de cada pico:
É essencial examinar o aspeto de cada cromatograma antes de qualquer interpretação quantitativa, para detetar eventuais anomalias devidas a funcionamento deficiente do equipamento ou das colunas ou decorrentes da origem ou natureza da amostra analisada. Em caso de dúvida, repetir a análise. 8.5. Calibração 8.5.1. Aplicar às amostras-padrão (5.4) exatamente o procedimento descrito nos pontos 8.2 a 8.4.2. Utilizar soluções preparadas de fresco, já que os CMP se degradam em meio tricloroacético a 8 %. O seu teor diminui aproximadamente 0,2 % por hora, a 30 °C. 8.5.2. Antes da determinação cromatográfica às amostras, condicionar as colunas através de injeções sucessivas de solução (8.5.1) da amostra-padrão (5.4.2) até a área e o tempo de retenção do pico correspondente aos CMP se tornarem constantes. 8.5.3. Determinar os fatores de resposta, R, injetando um volume de filtrados (8.5.1) idêntico ao utilizado para as amostras. 9. APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS 9.1. Modo de cálculo e fórmulas 9.1.1. Cálculo dos fatores de resposta, R:
em que:
em que:
9.1.2. Cálculo da área relativa dos picos da amostra [E]
em que:
9.1.3. Cálculo do tempo de retenção relativo do pico III da amostra [E]: RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5]) em que:
9.1.4. Foi experimentalmente demonstrado que existe uma relação linear entre o tempo de retenção relativo do pico III, RRTIII [E], e a percentagem de soro em pó adicionado, até 10 %.
O grau de incerteza admitido nos valores RRTIII é de ± 0,002. Normalmente, o valor de RRTIII [0] difere pouco de 1,034. Consoante o estado das colunas, pode aproximar-se de 1,000, mas deve ser sempre superior a esse valor. 9.2. Cálculo da percentagem de soro de coagulação em pó da amostra: W = SIII[E] – [1,3 + (SIII[0] – 0,9)] em que:
9.3. Precisão do método 9.3.1. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas simultaneamente ou com um curto intervalo de tempo, pelo mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento, a matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 0,2 % (m/m). 9.3.2. Reprodutibilidade A diferença entre dois resultados independentes, obtidos em dois laboratórios diferentes com matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 0,4 % (m/m). 9.4. Interpretação 9.4.1. Concluir pela ausência de soro se a área relativa do pico III, SIII [E], expressa em gramas de soro de coagulação por 100 g de produto, for ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9), em que:
9.4.2. Se a área relativa do pico III, SIII [E], for > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) e a área relativa do pico II, SII [E], for ≤ 160, determinar o teor de soro de coagulação segundo as indicações do ponto 9.2. 9.4.3. Se a área relativa do pico III, SIII [E], for > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) e a área relativa do pico II, SII [E], for ≤ 160, determinar o teor de proteínas totais (P%); examinar depois os gráficos 1 e 2. 9.4.3.1. Os dados obtidos após análise de amostras de leites em pó desnatados não-adulterados, com teores de proteínas totais elevados, representam-se nos gráficos 1 e 2. A reta a cheio representa a regressão linear, cujos coeficientes foram calculados pelo método dos mínimos quadrados. A reta a tracejado fixa o limite superior da área relativa do pico III, com uma probabilidade de 90 % de não ser ultrapassado. As equações das retas a tracejado dos gráficos 1 e 2 são as seguintes:
em que:
Estas equações são equivalentes ao valor 1,3 referido no ponto 9.2. A diferença (T1 e T2) entre a área relativa SIII [E] observada e a área relativa SIII é dada pelas seguintes expressões: T1 = SIII[E] – [(0,376 P % – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]; T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)].
O teor de soro de coagulação presente é calculado por meio da seguinte equação: W = T2 + 0,91 em que: 0,91 representa a diferença entre as retas a cheio e a tracejado, medida no eixo vertical. 
Pico II Leite em pó desnatado Teor de proteínas totais (%) Pico III Pico III Leite em pó desnatado Apêndice III DETEÇÃO DE SÓLIDOS DE SORO DE COAGULAÇÃO EM LEITE EM PÓ DESNATADO 1. OBJECTO: DETEÇÃO DA ADIÇÃO DE SÓLIDOS DE SORO DE COAGULAÇÃO A LEITE EM PÓ DESNATADO. 2. REFERÊNCIAS: NORMA INTERNACIONAL ISO 707. 3. DEFINIÇÃO O teor de sólidos de soro de coagulação é definido em percentagem mássica, determinada em função do teor de caseinomacropéptidos obtido pelo procedimento descrito. 4. PRINCÍPIO As amostras são analisadas para deteção de caseinomacropéptidos A por um método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com inversão de fases. A avaliação dos resultados obtidos é feita por comparação com amostras-padrão de leite em pó desnatado com e sem uma percentagem conhecida de soro de coagulação em pó. Qualquer resultado superior a 1 % (m/m) revela a presença de sólidos de soro de coagulação. 5. REAGENTES Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. O acetonitrilo deve ser de qualidade para espectroscopia ou para HPLC. 5.1. Solução de ácido tricloroacético Dissolver 240 g de ácido tricloroacético (CCl3COOH) em água e completar o volume até 1 000 ml. A solução deve apresentar-se límpida e incolor. 5.2. Eluentes A e B Eluente A: misturar 150 ml de acetonitrilo (CH3CN), 20 ml de isopropanol (CH3CHOHCH3) e 1,00 ml de ácido trifluoroacético (TFA, CF3COOH) num balão aferido de 1 000 ml. Completar o volume com água. Eluente B: misturar 550 ml de acetonitrilo, 20 ml de isopropanol e 1,00 ml de TFA num balão aferido de 1 000 ml. Completar o volume com água. Antes de o utilizar, filtrar o eluente através de um filtro de membrana com poros de 0,45 μm. 5.3. Conservação da coluna Após as análises, lavar a coluna com o líquido B (aumentando o caudal gradualmente) e, a seguir, com acetonitrilo (aumentando o caudal gradualmente durante 30 minutos). A coluna é conservada em acetonitrilo. 5.4. Amostras-padrão 5.4.1. Leite em pó desnatado que satisfaça as exigências aplicáveis à armazenagem pública (i.e. [0]). 5.4.2. Leite em pó desnatado idêntico, mas adulterado com 5 % (m/m) de soro de coagulação em pó de composição padrão (i.e. [5]). 5.4.3. Leite em pó desnatado idêntico, mas adulterado com 50 % (m/m) de soro de coagulação em pó de composição padrão (i.e. [50]). 6. EQUIPAMENTO 6.1. Balança analítica 6.2. Em opção, centrifugadora capaz de centrifugar a 2 200 g, dotada de tubos de centrifugação rolhados ou capsulados de cerca de 50 ml 6.3. Agitador mecânico 6.4. Agitador magnético 6.5. Funis de vidro, com cerca de 7 cm de diâmetro 6.6. Papel de filtro para filtração média, com cerca de 12,5 cm de diâmetro 6.7. Dispositivo de filtração de vidro com filtro de membrana de 0,45 μm de diâmetro de poro 6.8. Pipetas graduadas de 10 ml (ISO 648, classe A, ou ISO/R 835) ou sistema que permita debitar 10,0 ml em dois minutos 6.9. Sistema que permita debitar 20,0 ml de água a cerca de 50 °C 6.10. Banho-maria termostático regulado para 25 °C ± 0,5 °C 6.11. Equipamento de HPLC, composto por:
7. AMOSTRAGEM 7.1. A colheita das amostras deve ser efetuada de acordo com a norma internacional ISO 707. Todavia, os Estados-Membros podem utilizar outro método de amostragem, desde que respeite os princípios da referida norma. 7.2. Conservar as amostras em condições que evitem qualquer deterioração ou alteração de composição. 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparação da amostra para análise Colocar o leite em pó num recipiente de capacidade aproximadamente dupla do volume do pó, equipado com uma tampa hermética. Fechar de imediato o recipiente. Misturar bem o leite em pó, invertendo várias vezes o recipiente. 8.2. Toma para análise Pesar 2,00 ± 0,001 g da amostra para análise num tubo de centrifugação (6.2) ou num balão rolhado adequado (50 ml). Nota: No caso das misturas, pesar uma quantidade da amostra para análise que corresponda a 2,00 g de amostra sem matérias gordas. 8.3. Eliminação da matéria gorda e das proteínas 8.3.1. Adicionar 20,0 ml de água quente (50 °C) à toma para análise. Dissolver o pó, agitando durante cinco minutos com um agitador mecânico (6.3). Colocar o tubo em banho-maria (6.10) e deixar estabilizar a 25 °C. 8.3.2. Adicionar, ao longo de 2 minutos, de forma constante, 10,0 ml da solução de ácido tricloroacético, a cerca de 25 °C (5.1), agitando sempre vigorosamente com o agitador magnético (6.4). Colocar o tubo no banho-maria (6.10) e deixar em repouso durante 60 minutos 8.3.3. Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g ou filtrar através de papel de filtro (6.6), rejeitando os primeiros 5 ml de filtrado. 8.4. Determinação cromatográfica 8.4.1. O método HPLC com inversão de fases exclui a possibilidade de resultados falsamente positivos devido à presença de leitelho ácido em pó. 8.4.2. Antes de se proceder à análise HPLC com inversão de fases, devem ser otimizadas as condições de gradiente. No caso dos sistemas de gradiente com um volume morto de cerca de 6 ml (volume a partir do ponto em que os solventes se juntam até ao volume da ansa do injetor, inclusive), o tempo de retenção ótimo para os CMPA é de 26 ± 2 minutos. Os sistemas de gradiente com menos volume morto (por exemplo: 2 ml) devem utilizar 22 minutos como tempo de retenção ótimo. Tomar as soluções de amostras-padrão (5.4) sem e com 50 % de soro de coagulação. Injetar 100 μl do sobrenadante ou filtrado (8.3.3) no aparelho de HPLC, que deve funcionar nas condições de gradiente de aferição indicadas no quadro 1. Quadro 1 Condições de gradiente de aferição para otimização da cromatografia
A comparação dos dois cromatogramas deve revelar a localização do pico dos CMPΑ. Utilizando a fórmula a seguir indicada, pode calcular-se a composição inicial do solvente a utilizar para o gradiente normal (ver 8.4.3): % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) × 30 / 27 %; B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) × 1,11. em que:
8.4.3. Toma das soluções das amostras para análise Injetar 100 μl de sobrenadante ou filtrado (8.3.3), medidos rigorosamente, no aparelho de HPLC, com um caudal de 1,0 ml de eluente (5.2) por minuto. A composição do eluente no início da análise é obtida aplicando o ponto 8.4.2. Normalmente, será próxima de A:B = 76:24 (5.2). Imediatamente após a injeção, dá-se início a um gradiente linear, de modo a atingir uma percentagem de B 5 % mais elevada após 27 minutos. Em seguida, dá-se início a um novo gradiente linear, para levar a composição do eluente a 90 % de B em cinco minutos. Esta composição é mantida durante cinco minutos, voltando depois a mudar em cinco minutos, através de um gradiente linear, para a composição inicial. A injeção seguinte, que depende do volume interno do sistema de bombagem, pode ser feita 15 minutos após a obtenção das condições iniciais. Nota 1. O tempo de retenção dos CMPA deve ser de 26 ± 2 minutos. Esse tempo de retenção pode ser conseguido adaptando as condições iniciais e finais do primeiro gradiente. Todavia, a diferença entre a% de B nas condições iniciais e finais do primeiro gradiente deve manter-se em 5 % de B. Nota 2. Os eluentes devem ser suficientemente desgaseificados e permanecer nesse estado. Tal é essencial para o funcionamento adequado do sistema de bombagem em gradiente. O desvio-padrão do tempo de retenção do pico dos CMPA deve ser inferior a 0,1 minutos (n =10). Nota 3. Após cada cinco amostras, deve voltar a ser injetada a amostra de referência (5), que será utilizada para calcular um novo fator de resposta, R (9.1.1). 8.4.4. Os resultados da análise cromatográfica da amostra em análise (E) são obtidos sob a forma de um cromatograma, no qual o pico dos CMPA é identificado pelo seu tempo de retenção de cerca de 26 minutos. O integrador (6.11.6) calcula automaticamente a altura, H, do pico dos CMPA. Em todos os cromatogramas, deve ser verificada a localização da linha de base. Deve repetir-se a análise ou a integração se a linha de base estiver incorretamente localizada. Nota: Se o pico dos CMPA estiver suficientemente separado dos outros picos, deve aplicar-se uma integração entre mínimos consecutivos na linha de base; caso contrário, utilizar a projeção perpendicular sobre uma linha de base comum, que deverá ter início perto do pico dos CMPA (e, portanto, não em t = 0 min!). Utilizar o mesmo tipo de integração para as amostras e para o padrão e, caso se recorra a uma linha de base comum, verificar a sua aplicabilidade às amostras e ao padrão. É essencial examinar o aspeto de cada cromatograma antes de qualquer interpretação quantitativa, para detetar eventuais anomalias devidas a funcionamento deficiente do equipamento ou da coluna ou decorrentes da origem ou natureza da amostra analisada. Em caso de dúvida, repetir a análise. 8.5. Calibração 8.5.1. Aplicar às amostras-padrão (5.4.1 e 5.4.2) exatamente o procedimento descrito nos pontos 8.2 a 8.4.4. Utilizar soluções preparadas de fresco, já que os CMP se degradam, à temperatura ambiente, em meio de ácido tricloroacético a 8 %. A 4 °C, a solução mantém-se estável durante 24 horas. No caso de séries longas de análises, é desejável a utilização de um recipiente arrefecido para amostras no injetor automático. Nota: O ponto 8.4.2. pode ser suprimido se a% de B nas condições iniciais for conhecida de análises anteriores. O cromatograma da amostra de referência [5] deve ser idêntico à figura. 1. Nesta figura, o pico dos CMPA é precedido por dois pequenos picos. É essencial obter uma separação semelhante. 8.5.2. Antes da determinação cromatográfica às amostras, injetar 100 μl da amostra-padrão sem soro de coagulação [0] (5.4.1). O cromatograma não deve apresentar nenhum pico com o mesmo tempo de retenção que o pico dos CMPA. 8.5.3. Determinar os fatores de resposta, R, injetando um volume de filtrados (8.5.1) idêntico ao utilizado para as amostras 9. APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS 9.1. Modo de cálculo e fórmulas 9.1.1. Cálculo do fator de resposta R: Pico dos CMPA: R = W/H em que:
9.2. Cálculo da percentagem dE soro de coagulação em pó da amostra W(E) = R × H(E) em que:
Se W(E) for superior a 1 % e a diferença entre o tempo de retenção e o da amostra-padrão [5] for inferior a 0,2 minutos, conclui-se pela presença de sólidos de soro de coagulação. 9.3. Precisão do método 9.3.1. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações efetuadas simultaneamente ou com um curto intervalo de tempo, pelo mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento, a matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 0,2 % (m/m). 9.3.2. Reprodutibilidade Não determinada. 9.3.3. Linearidade Entre 0 % e 16 % de soro de coagulação, deve ser obtida uma relação linear com um coeficiente de correlação superior a 0,99. 9.4. Interpretação O limite de 1 % a inclui incerteza associada à reprodutibilidade. Figura 1 Padrão Ni-4.6 
Absorvância (220 nm) Tempo (minutos) CMP A
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São aditados os seguintes anexos: «ANEXO VI Métodos de análise de manteiga em armazenamento privado
«ANEXO VII Métodos de análise de leite em pó desnatado em armazenamento privado
«ANEXO VIII Métodos de análise de queijo em armazenamento privado
«Apêndice MÉTODO PARA A DETEÇÃO DE LEITE DE VACA E DE CASEINATOS PROVENIENTES DE LEITE DE VACA EM QUEIJOS DE LEITE DE OVELHA, LEITE DE CABRA OU LEITE DE BÚFALA OU DE MISTURAS DE LEITES DE OVELHA, CABRA E BÚFALA 1. OBJETO Deteção de leite de vaca e de caseinatos provenientes de leite de vaca em queijos produzidos com leite de ovelha, leite de cabra e leite de búfala ou com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala, por focagem isoelétrica das γ-caseínas após plasminólise. 2. ÂMBITO DE APLICAÇÃO Este método é adequado para uma deteção sensível e específica de leite de vaca cru ou tratado termicamente e de caseinatos provenientes desses leites de vaca em queijos frescos ou curados produzidos com leite de ovelha, leite de cabra ou leite de búfala ou com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala. Não é adequado para a deteção de leite e queijo adulterados com concentrados proteicos de soro de leite de vaca tratados termicamente. 3. PRINCÍPIO DO MÉTODO 3.1. Isolamento das caseínas do queijo e dos padrões de referência. 3.2. Dissolução das caseínas isoladas e clivagem pela plasmina (EC 3.4.21.7). 3.3. Focagem isoelétrica das caseínas tratadas com plasmina, na presença de ureia, e coloração das proteínas. 3.4. Avaliação das bandas coradas de γ3-caseína e de γ2-caseína (indício da presença de leite de vaca) por comparação entre as bandas correspondentes à amostra e as bandas dos padrões de referência com 0 % e 1 % de leite de vaca obtidas no mesmo gel. 4. REAGENTES Salvo indicação em contrário, devem ser utilizados reagentes de grau analítico. A água deve ser bidestilada ou de pureza equivalente. Nota: As especificações a seguir descritas aplicam-se a géis de poliacrilamida com ureia, de dimensões 265 mm × 125 mm × 0,25 mm, preparados em laboratório. Caso sejam utilizadas outras dimensões e tipos de gel, poderá ser necessário ajustar as condições de separação. Focagem isoelétrica 4.1. Reagentes para a produção de géis de poliacrilamida com ureia 4.1.1. Solução de reserva de gel Dissolver:
em água e completar o volume até 100 ml. Guardar no frigorífico, em recipiente de vidro de cor âmbar. Nota: Em vez das quantidades indicadas das acrilamidas neurotóxicas, pode ser preferível utilizar uma solução disponível no comércio de acrilamida e BIS, previamente misturadas. Caso essa solução contenha 30 % (m/v) de acrilamida e 0,8 % (m/v) de BIS, deve ser utilizado na formulação um volume de 16,2 ml, em vez das quantidades indicadas. A solução de reserva pode ser guardada durante um período máximo de 10 dias. Se a sua condutividade for superior a 5 μS, proceder a uma desionização, por agitação com 2 g de Amberlite MB-3 durante 30 minutos, seguida de filtração através de uma membrana de 0,45 μm. 4.1.2. Solução de gel Preparar uma solução de gel misturando os aditivos e os anfólitos (*) com a solução de reserva de gel (ver o ponto 4.1.1):
Misturar a solução de gel e desgaseificar durante 2 a 3 minutos num banho de ultrassons ou sob vácuo. Nota: Preparar a solução de gel imediatamente antes da sua utilização (ver 6.2). 4.1.3. Soluções catalisadoras 4.1.3.1. N,N,N′,N′-tetrametiletilenodiamina (TEMED). 4.1.3.2. Solução de persulfato de amónio (PER) a 40 % (m/v): Dissolver 800 mg de PER em água e completar o volume até 2 ml. Nota: Utilizar sempre solução de PER preparada de fresco. 4.2. Fluido de contacto Querosene ou parafina líquida. 4.3. Solução anódica Dissolver 5,77 g de ácido fosfórico (85 % m/m) em água e diluir até 100 ml. 4.4. Solução catódica Dissolver 2,00 g de hidróxido de sódio em água e diluir até 100 ml com água. Preparação da amostra 4.5. Reagentes para isolamento das proteínas 4.5.1. Ácido acético diluído (25,0 ml de ácido acético glacial, diluído com água até 100 ml). 4.5.2. Diclorometano. 4.5.3. Acetona. 4.6. Solução-tampão para dissolução das proteínas Dissolver
em água e completar o volume até 50 ml. Nota: Guardar no frigorífico durante um período máximo de uma semana. 4.7. Reagentes para clivagem das caseínas pela plasmina 4.7.1. Solução-tampão de carbonato de amónio Titular, até pH 8, uma solução 0,2 mol/1 de hidrogenocarbonato de amónio (1,58 g/100 ml de água) contendo 0,05 mol/l de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 1,46 g/100 ml) com uma solução 0,2 mol/l de carbonato de amónio (1,92 g/100 ml de água) contendo 0,05 mol/l de EDTA. 4.7.2. Plasmina de bovino (EC 3.4.21.7), com atividade de, pelo menos, 5 U/ml. 4.7.3. Solução de ácido ε-aminocapróico para inibição enzimática Dissolver 2,624 g de ácido ε-aminocapróico (ácido 6-amino-n-hexanóico) em 100 ml de etanol a 40 % (v/v). 4.8. Padrões 4.8.1. Estão disponíveis no Instituto de Materiais e Medidas de Referência da Comissão, B-2440 Geel, Bélgica, padrões de referência certificados de uma mistura de leites desnatados coalhados de ovelha e de cabra com 0 % e 1 % de leite de vaca. 4.8.2. Preparação de padrões laboratoriais provisórios de leite de búfala coalhado com 0 % e 1 % de leite de vaca Os leites desnatados são preparados por centrifugação de leite cru a granel, de búfala ou de vaca, a 37 °C e 2 500 g durante 20 minutos. Após arrefecimento rápido do tubo e do seu conteúdo para 6-8 °C, remover completamente a camada superior de matéria gorda. Para a preparação do padrão a 1 %, adicionar 5,00 ml de leite de vaca desnatado a 495 ml de leite de búfala desnatado, num copo de 1 l, e ajustar o pH a 6,4 com ácido láctico diluído (10 % m/v). Ajustar a temperatura a 35 °C e adicionar 100 μl de coalho de vitelo (atividade do coalho 1:10 000, c. 3 000 U/ml), agitar durante um minuto e deixar o copo coberto com uma folha de alumínio, a 35 °C, durante uma hora, a fim de permitir a coagulação. Depois da coagulação, liofiliza-se todo o leite coalhado sem homogeneização ou escorrimento prévios do soro. Em seguida, mói-se finamente o leite liofilizado, a fim de produzir um pó homogéneo. Para a preparação do padrão a 0 %, proceder do mesmo modo, com leite desnatado de búfala puro. Os padrões devem ser conservados a – 20 °C. Nota: Antes da preparação dos padrões, é aconselhável verificar a pureza do leite de búfala, por focagem isoelétrica das caseínas tratadas com plasmina. Reagentes para coloração das proteínas 4.9. Fixador Dissolver 150 g de ácido tricloroacético em água e completar o volume até 1 000 ml. 4.10. Solução de descoloração Misturar 500 ml de metanol e 200 ml de ácido acético glacial e completar o volume até 2 000 ml com água destilada. Nota: Preparar solução de descoloração fresca todos os dias. Esta pode ser facilmente preparada misturando volumes iguais de soluções de reserva de metanol a 50 % (v/v) e de ácido acético glacial a 20 % (v/v). 4.11. Soluções de coloração 4.11.1. Solução de coloração de reserva 1 Dissolver 3,0 g de Coomassie Brilliant Blue g 250 (Color Index 42655) em 1 000 ml de metanol a 90 % (v/v), utilizando um agitador magnético (aproximadamente 45 minutos) e filtrar através de dois filtros de pregas de velocidade média. 4.11.2. Solução de coloração de reserva 2 Dissolver 5,0 g de sulfato de cobre penta-hidratado em 1 000 ml de ácido acético a 20 % (v/v). 4.11.3. Solução de coloração de trabalho Misturar 125 ml de cada solução de reserva (4.11.1 e 4.11.2) imediatamente antes da coloração. Nota: A solução de coloração deve ser preparada no dia da utilização. 5. EQUIPAMENTO 5.1. Placas de vidro (265 mm × 125 mm × 4 mm); rolo de borracha (largura 15 cm); mesa de nivelamento. 5.2. Folha de suporte do gel (265 mm × 125 mm). 5.3. Folha de cobertura (280 mm × 125 mm). Colar uma faixa de fita adesiva (280 mm × 6 mm × 0,25 mm) em cada uma das margens mais longas (ver a figura1). 5.4. Câmara de eletrofocagem com placa de arrefecimento (por exemplo, 265 mm × 125 mm) e alimentação elétrica adequada (≥ 2,5 kV) ou aparelho automático de eletroforese. 5.5. Crióstato de circulação, termostatizado a 12 °C ± 0,5 °C. 5.6. Centrifugadora regulável a 3 000 g. 5.7. Elétrodos de fita (≥ 265 mm de comprimento). 5.8. Frascos conta-gotas de plástico para as soluções anódica e catódica. 5.9. Aplicadores de amostra (10 mm × 5 mm, viscose ou papel de filtro com baixa adsorção de proteínas). 5.10. Tinas de aço inoxidável ou de vidro para coloração e descoloração (por exemplo, tabuleiros de instrumentos com 280 mm × 150 mm). 5.12. Homogeneizador de varinha, regulável (varinha com 10 mm de diâmetro); gama de velocidades de 8 000 rpm a 20 000 rpm. 5.13. Agitador magnético. 5.14. Banho de ultrassons. 5.15. Soldador de folhas. 5.16. Micropipetas de 25 μl. 5.17. Concentrador de vácuo ou liofilizador. 5.18. Banho-maria termostático, regulável a 35 °C e 40 °C ± 1 °C, com agitador. 5.19. Densitómetro, com leitura a λ = 634 nm. 6. PROCEDIMENTO 6.1. Preparação da amostra 6.1.1. Isolamento das caseínas Pesar a quantidade correspondente a 5 g de matéria seca de queijo ou dos padrões de referência para um tubo de centrifugação de 100 ml, adicionar 60 ml de água destilada e homogeneizar com um homogeneizador de varinha (8 000 rpm a 10 000 rpm). Ajustar o pH a 4,6 com ácido acético diluído (4.5.1) e centrifugar (cinco minutos a 3 000 g). Decantar a matéria gorda e o soro, homogeneizar o resíduo a 20 000 rpm em 40 ml de água destilada, ajustada a pH 4,5 com ácido acético diluído (4.5.1), adicionar 20 ml de diclorometano (4.5.2), homogeneizar novamente e centrifugar (cinco minutos a 3 000 g). Retirar com uma espátula a camada de caseína que se encontra entre as fases aquosa e orgânica (ver a figura 2) e decantar ambas as fases. Homogeneizar de novo a caseína em 40 ml de água destilada (ver acima) e 20 ml de diclorometano (4.5.2) e centrifugar. Repetir este processo até que ambas as fases extraídas se apresentem incolores (duas a três vezes). Homogeneizar o resíduo proteico com 50 ml de acetona (5.3) e filtrar através de papel de filtro com pregas de velocidade média. Lavar o resíduo retido no filtro com duas porções sucessivas de 25 ml de acetona e secar ao ar ou numa corrente de azoto. Em seguida, pulverizar finamente num almofariz. Nota: Os isolados de caseína secos devem ser conservados a – 20 °C. 6.1.2. Clivagem pela plasmina das β-caseínas, para intensificação das γ-caseínas Suspender 25 mg de caseínas isoladas (6.1.1) em 0,5 ml de tampão de carbonato de amónio (4.7.1) e homogeneizar durante 20 minutos, por exemplo com ultrassons. Aquecer a 40 °C e adicionar 10 μl de plasmina (4.7.2), misturar e incubar durante 1 hora a 40 °C, com agitação contínua. A fim de inibir as enzimas, adicionar 20 μl de solução de ácido ε-aminocapróico (4.7.3) e, seguidamente, 200 mg de ureia sólida e 2 mg de ditiotreitol. Nota: Para obter mais simetria nas bandas de caseína focadas, é aconselhável liofilizar a solução depois de adicionar o ácido ε-aminocaproico e dissolver em seguida os resíduos em 0,5 ml de solução-tampão para dissolução das proteínas (4.6). 6.2. Preparação dos géis de poliacrilamida com ureia Com a ajuda de algumas gotas de água, estender com o rolo a folha de suporte de gel (5.2) numa placa de vidro (5.1) e retirar toda a água remanescente com um toalhete ou um lenço de papel. Estender, da mesma forma, a folha de cobertura (5.3) com separadores (0,25 mm) noutra placa de vidro. Colocar a placa horizontalmente numa mesa de nivelamento. Adicionar 10 μl da solução TEMED (4.1.3.1) à solução de gel preparada e desgaseificada (4.1.2), agitar e adicionar 10 μl de solução PER (4.1.3.2), misturar bem e deitar imediatamente, de maneira uniforme, no centro da folha de cobertura. Colocar uma extremidade da placa de suporte do gel (folha virada para baixo) sobre a placa de cobertura e rebatê-la lentamente, de modo a que se forme um filme de gel entre as folhas, distribuído regularmente e sem bolhas de ar (figura 3). Com cuidado, rebater completamente a placa de suporte do gel, utilizando uma espátula fina, e colocar por cima mais três placas de vidro, que servirão de pesos. Depois de terminada a polimerização (cerca de 60 minutos), retirar o gel polimerizado para a placa de suporte do gel juntamente com a folha de cobertura, inclinando as placas de vidro. Limpar cuidadosamente o reverso da placa de suporte do gel, para remover os resíduos de gel e de ureia. Enrolar a «sanduíche de gel» de modo a formar um tubo revestido de filme, soldar e guardar no frigorífico (no máximo seis semanas). Nota: A folha de cobertura com os separadores pode ser reutilizada. O gel de poliacrilamida pode ser cortado em dimensões mais pequenas, cuja utilização é recomendada quando se disponha de poucas amostras ou se se utilizar um aparelho automático de eletroforese (dois géis, dimensão 4,5 cm × 5 cm). 6.3. Focagem isoelétrica Ligar o termóstato de arrefecimento a 12 °C. Limpar o reverso da folha de suporte do gel com querosene e, em seguida, deitar algumas gotas de querosene (4.2) no centro do bloco de arrefecimento. Aplicar a sanduíche de gel, desenrolando-a com o lado de suporte para baixo, tendo o cuidado de evitar bolhas de ar. Limpar qualquer excesso de querosene e retirar a folha de cobertura. Impregnar os elétrodos de fita com as soluções anódica e catódica (4.3, 4.4), cortá-los ao comprimento do gel e colocá-los nas posições previstas (a distância entre os elétrodos deve ser de 9,5 cm). Condições da focagem isoelétrica: 6.3.1. Formato do gel: 265 mm × 125 mm × 0,25 mm
Nota: Se a espessura ou largura dos géis forem alteradas, os valores da corrente elétrica e da potência terão de ser devidamente adaptados (duplicar os valores da corrente elétrica e da potência se for utilizado um gel de 265 mm × 125 mm × 0,5 mm). 6.3.2. Exemplo de um programa de tensão para um aparelho automático de eletroforese (dois géis de 5,0 cm × 4,5 cm), com elétrodos sem fitas aplicados diretamente no gel
Colocar o aplicador de amostras na etapa 2 a 0 Vh. Retirar o aplicador de amostras na etapa 2 a 30 Vh. 6.4. Coloração das proteínas 6.4.1. Fixação das proteínas Retirar os elétrodos de fitas imediatamente após desligar a corrente e colocar logo o gel numa tina de coloração/descoloração cheia com 200 ml de fixador (4.9); deixar imerso durante 15 minutos, agitando continuamente. 6.4.2. Lavagem e coloração da placa de gel Escorrer todo o fixador e lavar a placa de gel duas vezes, durante 30 segundos de cada vez, com 100 ml da solução de descoloração (4.10). Escorrer a solução de descoloração e encher a tina com 250 ml de solução de coloração (4.11.3); deixar corar durante 45 minutos, agitando suavemente. 6.4.3. Descoloração da placa de gel Escorrer a solução de coloração, lavar a placa de gel duas vezes, com 100 ml de solução de descoloração (4.10) de cada vez, e, em seguida, agitar durante 15 minutos com 200 ml de solução de descoloração, repetindo a etapa da descoloração pelo menos duas ou três vezes, até que o fundo esteja claro e incolor. Lavar a placa de gel com água destilada (2 × 2 minutos) e secar ao ar (duas a três horas) ou com um secador de cabelo (10 a 15 minutos). Nota 1: Proceder à fixação, lavagem, coloração e descoloração a 20 °C. Não o fazer a temperaturas elevadas. Nota 2: No caso de se preferir uma coloração pela prata, de maior sensibilidade (por exemplo Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, código n.o 17-1150-01), as amostras de caseína tratadas com plasmina terão de ser diluídas a 5 mg/ml. 7. AVALIAÇÃO A avaliação é efetuada por comparação das bandas proteicas da amostra desconhecida com as bandas dos padrões de referência no mesmo gel. A deteção de leite de vaca em queijos produzidos com leite de ovelha, leite de cabra ou leite de búfala ou com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala é efetuada através da γ3-caseína e da γ2-caseína, cujos pontos isoelétricos se situam entre pH 6,5 e pH 7,5 (figuras 4a, 4b e 5). O limite de deteção é inferior a 0,5 %. 7.1. Avaliação visual Para a avaliação visual da quantidade de leite de vaca, é aconselhável ajustar as concentrações das amostras e dos padrões de modo a obter o mesmo nível de intensidade da γ2-caseína e da γ3-caseína de ovelha (E), cabra (G) e/ou búfala (B) (ver «γ2 E,G,B» e «γ3 E,G,B» nas figuras 4a, 4b e 5). Em seguida, a quantidade de leite de vaca (inferior, igual ou superior a 1 %) na amostra desconhecida poderá ser diretamente avaliada por comparação da intensidade da γ3-caseína e da γ2-caseína (ver «γ3 C» e «γ2 C» nas figuras 4a, 4b e 5) com as intensidades correspondentes dos padrões de referência (ovelha, cabra) ou padrões laboratoriais provisórios (búfala) a 0 % e 1 %. 7.2. Avaliação densitométrica Se possível, determinar por densitometria (5.19) a razão entre as áreas dos picos da γ2-caseína e da γ3-caseína bovinas e as áreas dos picos da γ2-caseína e da γ3-caseína de ovelha, de cabra e/ou de búfala (ver figura 5). Comparar o valor obtido com a razão das áreas dos picos da γ2-caseína e da γ3-caseína dos padrões de referência (ovelha, cabra) ou padrões laboratoriais provisórios (búfala) a 1 % analisados no mesmo gel. Nota: O método estará a funcionar satisfatoriamente caso exista um sinal positivo claro da γ2-caseína e da γ3-caseína bovinas no padrão de referência a 1 %, mas não no padrão de referência a 0 %. Caso contrário, otimizar os procedimentos, seguindo rigorosamente a descrição do método. Considera-se uma amostra positiva se tanto a γ2-caseína como a γ3-caseína bovinas, ou as razões correspondentes de áreas de picos, forem iguais ou superiores aos níveis do padrão de referência a 1 %. 8. REFERÊNCIAS Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990). Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995). Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp. 389-393, Bode-Verlag, München (1989). Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980). Figura 1 Representação esquemática da folha de cobertura 
Folha de poliéster Fita separadora Figura 2 Camada de caseína a flutuar entre as fases aquosa e orgânica, após centrifugação 
Fase aquosa Caseína Fase CH2Cl2 Figura 3 Técnica de rebatimento para distribuição de géis ultrafinos de poliacrilamida
a = fita separadora (0,25 mm); b = folha de cobertura (5.3); c, e = placas de vidro (5.1); d = solução de gel (4.1.2); f = folha de suporte de gel (5.2). Figura 4a Focagem isoelétrica de caseínas provenientes de queijo produzido com leites de ovelha e de cabra com diferentes quantidades de leite de vaca, após tratamento com plasmina
% CM = percentagem de leite de vaca; C = vaca; E = ovelha; G = cabra. Apresenta-se a metade superior do gel da focagem isoelétrica. Figura 4b Focagem isoelétrica de caseínas provenientes de queijos produzidos com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala, com diferentes quantidades de leite de vaca, após tratamento com plasmina
% CM = percentagem de leite de vaca; 1 + = amostra com 1 % de leite de vaca e com adição de caseína bovina pura a meio do percurso; C = vaca; E = ovelha; G = cabra; B = búfala. Apresenta-se a distância de separação total do gel da focagem isoelétrica. Figura 5 Sobreposição de densitogramas de padrões (STD) e de amostras de queijos produzidos com misturas de leites de ovelha e de cabra, após focagem isoelétrica
a, b = padrões com 0 % e 1 % de leite de vaca; c-g = amostras de queijo com 0 %, 1 %, 2 %, 3 % e 7 % de leite de vaca; C = vaca; E = ovelha; G = cabra. Varreu-se a metade superior do gel da focagem isoelétrica a λ = 634 nm. «ANEXO IX Avaliação das análises 1. Garantia da qualidade As análises devem ser realizadas por laboratórios designados em conformidade com o artigo 12.o do Regulamento (CE) n.o 882/2004 (**), ou designados pelas autoridades competentes do Estado-Membro. 2. Amostragem e contestação dos resultados das análises
«Apêndice Avaliação da conformidade de uma remessa com os limites legais 1. Princípio Sempre que a legislação atinente à intervenção pública e ao armazenamento privado estabeleça procedimentos de amostragem pormenorizados, aplicar-se-ão esses procedimentos. Nos restantes casos, utiliza-se uma amostra com, pelo menos, três unidades de amostragem, retiradas de forma aleatória da remessa submetida a controlo. Pode ser preparada uma amostra composta. O resultado obtido deve ser comparado com os limites legais através do cálculo de um intervalo de confiança a 95 %, equivalente ao dobro do desvio-padrão, em que o desvio-padrão em causa dependerá: 1) de o método ter sido validado através de cooperação internacional, tendo sido estabelecidos valores para σr e σR, ou 2) caso o método de validação tenha sido desenvolvido internamente, da reprodutibilidade interna calculada. Esse intervalo de confiança corresponde então à incerteza do resultado decorrente do processo de medição. 2. Método validado através de cooperação internacional Neste caso, terão sido estabelecidos o desvio-padrão da repetibilidade, σr, e o desvio-padrão da reprodutibilidade, σR, e o laboratório poderá demonstrar a conformidade com as características de desempenho do método validado. Calcular a média aritmética, Calcular a incerteza expandida, (k = 2), de
Se o resultado final da medição, x, for calculado utilizando uma fórmula com a forma x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 ou x = y 1/y 2, devem seguir-se os procedimentos habituais para a combinação dos desvios-padrão nesses casos. A remessa será considerada não-conforme com o limite legal máximo, UL, quando:
caso contrário, será considerada em conformidade com o UL. A remessa será considerada não-conforme com o limite legal mínimo, LL, quando:
caso contrário, será considerada em conformidade com o LL. 3. Validação interna e cálculo do desvio-padrão da reprodutibilidade interna Se forem utilizados métodos diferentes dos especificados no presente regulamento cujo grau de precisão não tenha sido medido, deve proceder-se a uma validação interna. O desvio-padrão da repetibilidade interna, sir, e o desvio-padrão da reprodutibilidade interna, si R , serão então utilizados em vez de σr e σ R , respetivamente, nas fórmulas de cálculo da incerteza expandida, U. As regras a seguir para determinar a conformidade com o limite legal são as estabelecidas no ponto 1. Contudo, se uma remessa for considerada não-conforme com o limite legal, as medições terão de ser repetidas, utilizando o método especificado no presente regulamento, avaliando-se em seguida o resultado em conformidade com o ponto 1.
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(1) O método a aplicar deve ser aprovado pelo organismo pagador.
(2) A análise de partículas queimadas pode ou não ser realizada de forma sistemática. No entanto, devem realizar-se essas análises sempre que não se efetuem exames organoléticos.
(3) O método a aplicar deve ser aprovado pelo organismo pagador (um método ou ambos).
(4) O método a aplicar deve ser aprovado pelo organismo pagador.
(5) Devem ser efetuados exames organoléticos se tal for considerado necessário após uma análise de riscos aprovada pelo organismo pagador.
(6) O método a aplicar deve ser aprovado pelo organismo pagador.
(7) Aplicação da amostra: Depois da pré-focagem (etapa 1), pipetar 18 μl da amostra e das soluções-padrão para os aplicadores de amostra (10 mm × 5 mm), colocá-los sobre o gel com intervalos de 1 mm entre cada aplicador e a uma distância de 5 mm do ânodo, no sentido longitudinal, e pressionar ligeiramente. Proceder à focagem nas condições acima descritas e remover cuidadosamente os aplicadores de amostra passados os 60 minutos de focagem da amostra.