ANEXO
O anexo do Regulamento (CE) n.o 2870/2000 é alterado do seguinte modo:
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O índice é alterado do seguinte modo:
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Ao Capítulo III é aditada a seguinte parte: «III.3. DETERMINAÇÃO DA ACIDEZ VOLÁTIL DE BEBIDAS ESPIRITUOSAS 1. Âmbito O método foi validado num estudo interlaboratorial relativo a rum, brandy, bagaço e aguardentes de frutos, a níveis que variam entre 30 mg/l e 641 mg/l. 2. Referências normativas ISO 3696: 1987 Água para fins analíticos — Especificações e métodos de ensaio. 3. Definições 3.1. A acidez volátil é calculada deduzindo a acidez fixa da acidez total. 3.2. A acidez total é a acidez titulável. 3.3. A acidez fixa é a acidez do resíduo após evaporação da bebida espirituosa até à secura. 4. Princípio A acidez total e a acidez fixa são determinadas por titulação ou por potenciometria. 5. Material e reagentes Salvo indicação em contrário, utilizar na análise apenas reagentes pro analise reconhecidos e água de grau não inferior a 3 (escala da norma ISO 3696:1987). 5.1. Solução 0.01 M de hidróxido de sódio (NaOH) 5.2. Indicador misto.
6. Aparelhagem e equipamento Aparelhagem indireta de laboratório, material de vidro de grau A e os seguintes elementos:
7. Colheita de amostras e amostras As amostras devem ser armazenadas à temperatura ambiente até às análises. 8. Procedimento 8.1. Acidez total 8.1.1. Preparação da amostra A bebida espirituosa é irradiada com ultrassons (dispersão ultrassónica) ou agitada durante dois minutos sob vácuo para eliminar o dióxido de carbono, se necessário. 8.1.2. Titulação Pipetar 25 ml da bebida espirituosa num balão Erlenmeyer de 500 ml. Adicionar cerca de 200 ml de água destilada, fervida e arrefecida (preparada diariamente), e 2 a 6 gotas de indicador misto (5.2). Titular com a solução 0.01 M de hidróxido de sódio (5.1) até a cor amarelo-esverdeada se alterar para violeta, no caso das bebidas espirituosas incolores, e de amarelo-acastanhada para vermelho-acastanhada, no caso de bebidas de cor castanha. A titulação pode ser igualmente efetuada por potenciometria, a pH 7,5. Seja n1 ml o volume da solução 0.01 M de hidróxido de sódio adicionada. 8.1.3. Cálculos O teor de acidez total (AT), expresso em miliequivalentes por litro de álcool, é igual a 0,4 × n1. O teor de acidez total (AT′), expresso em mg de ácido acético por litro de álcool, é igual a 24 × n1. 8.2. Acidez fixa 8.2.1. Preparação da amostra Evaporar até à secura 25 ml da bebida espirituosa:
8.2.2. Titulação Dissolver o resíduo remanescente após evaporação com água destilada, fervida e arrefecida (preparada diariamente), perfazer um volume de cerca de 100 ml e adicionar 2 a 6 gotas de indicador misto (5.2). Titular com a solução 0.01 M de hidróxido de sódio (ponto 5.1). A titulação pode ser igualmente efetuada por potenciometria, a pH 7,5. Seja n2 ml o volume da solução 0.01 M de hidróxido de sódio adicionada. 8.2.3. Cálculos A acidez total (AT), expressa em miliequivalentes por litro de álcool, é igual a 0,4 × n2. A acidez fixa (AF), expressa em mg de ácido acético por litro de bebida espirituosa, é igual a 24 × n2. 9. Cálculo da acidez volátil 9.1. Expressa em miliequivalentes por L: Sejam:
Acidez volátil, AV, em miliequivalentes por L é igual a: AT – AF 9.2. Expressa em mg de ácido acético por L: Sejam:
Acidez volátil, AV, expressa em mg de ácido acético por L é igual a: AT′ – AF′ 9.3. Expresso em g de ácido acético por hectolitro de álcool puro a 100 % vol. é igual a: em que A é o título alcoométrico volúmico da bebida espirituosa. 10. Características do desempenho do método (precisão) 10.1. Resultados estatísticos do teste interlaboratorial Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método efetuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada [1] [2].
Tipos de amostra:
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É inserido o Capítulo VIII, como se segue: «VIII. AÇÚCARES TOTAIS 1. Âmbito O método de HPLC-IR é aplicável no que se refere à determinação dos açúcares totais (expressos em açúcar invertido) das bebidas espirituosas, com exceção dos licores que contêm ovos e produtos lácteos. O método foi validado num estudo interlaboratorial relativo a pastis, anis destilado, licor de cereja, crème de (seguido do nome do fruto ou da matéria-prima utilizados) e crème de cassis, a níveis que variam entre 10,86 g/l e 509,7 g/l. No entanto, a linearidade da resposta do instrumento foi demonstrada em relação ao intervalo de concentração entre 2,5 g/l e 20,0 g/l. Este método não se destina a determinar baixos níveis de açúcares. 2. Referências normativas ISO 3696:1987 Água para fins analíticos — Especificações e métodos de ensaio. 3. Princípio Análises de cromatografia líquida de alta resolução de soluções de açúcar, a fim de determinar a sua concentração de glicose, frutose, sacarose, maltose e lactose. Este método utiliza uma fase estacionária alquilamina e deteção refratométrica diferencial, sendo utilizado apenas como exemplo. A utilização de resinas de permuta aniónica como fase estacionária seria igualmente possível. 4. Material e reagentes 4.1. Glicose (CAS 50-99-7), pelo menos 99 % pura. 4.2. Frutose (CAS 57-48-7), pelo menos 99 % pura. 4.3. Sacarose (CAS 57-50-1), pelo menos 99 % pura. 4.4. Lactose (CAS 5965-66-2), pelo menos 99 % pura. 4.5. Maltose mono-hidratada (CAS 6363-53-7), pelo menos 99 % pura. 4.6. Acetonitrilo puro (CAS 75-05-8) para análise por HPLC. 4.7. Água destilada ou desmineralizada, de preferência microfiltrada. 4.8. Solventes (exemplo) O solvente de eluição é composto por:
Passar o hélio a baixo ritmo durante 5 a 10 minutos antes de o utilizar para eliminar o gás. Se a água utilizada não tiver sido microfiltrada, o solvente deve ser filtrado com um filtro para solventes orgânicos, com um poro de dimensão inferior ou igual a 0,45 μm. 4.9. Etanol absoluto (CAS 64-17-5). 4.10. Solução de etanol (5 %, v/v). 4.11. Preparação da solução-mãe padrão (20 g/l) Introduzir 2 g de cada um dos açúcares a analisar (4.1. a 4.5.) e transferi-los sem perdas para um balão volumétrico de 100 ml. (NB: 2,11 g de maltose mono-hidratada é equivalente a 2 g de maltose). Adaptar para 100 ml com uma solução com 5 % vol. de álcool (4.10.), agitar e armazenar a cerca de + 4 °C. Preparar uma nova solução-mãe, uma vez por semana. 4.12. Preparação das soluções-padrão de trabalho (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 20,0 g/l) Diluir a solução-mãe, 20 g/l, (4.11) de forma adequada, com uma solução com 5 % vol. de álcool (4.10) para obter cinco padrões de trabalho de 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 20,0 g/l. Filtrar com um filtro de poro inferior ou igual a 0,45 μm (5.3.). 5. Aparelhagem e equipamento 5.1. Sistema de HPLC capaz de alcançar uma resolução de base do conjunto dos açúcares. 5.1.1. Cromatografia líquida de alta resolução com uma válvula de injeção de seis vias equipada com um circuito de 10 μL ou qualquer outro dispositivo, quer automático, quer manual, para uma injeção fiável de microvolumes. 5.1.2. Sistema de bombagem que permita obter e manter um caudal constante ou programado com grande precisão 5.1.3. Refratómetro diferencial. 5.1.4. Integrador ou registador informatizado, cujo desempenho seja compatível com o restante sistema. 5.1.5. Pré-coluna: Recomenda-se a anexação de uma pré-coluna adequada à coluna analítica. 5.1.6. Coluna (exemplo):
5.1.7. Condições cromatográficas (exemplo)
A fim de assegurar que o detetor se encontra perfeitamente estável, este deve ser ligado algumas horas antes da utilização. A célula de referência deve ser preenchida com o solvente de eluição. 5.2. Balança analítica com exatidão de 0,1 mg. 5.3. Instalação de filtragem para pequenos volumes utilizando uma micromembrana de 0,45 μm. 6. Armazenamento da amostra Após receção, as amostras devem ser armazenadas à temperatura ambiente até ao momento das análises. 7. Procedimento 7.1. PARTE A: Preparação das amostras 7.1.1. Agitar a amostra. 7.1.2. Filtrar a amostra através de um filtro com um poro de dimensão inferior ou igual a 0,45 μm (5.3). 7.2. PARTE B: HPLC 7.2.1. Determinação Injetar 10 μL das soluções-padrão (4.12) e das amostras (7.1.2). Efetuar a análise nas devidas condições cromatográficas, nomeadamente as descritas supra. 7.2.2. Caso um pico de uma amostra apresente uma área (ou altura) maior do que a do pico correspondente da solução-padrão mais concentrada, a amostra deve ser diluída com água destilada e novamente analisada. 8. Cálculos Comparar os dois cromatogramas obtidos para a solução-padrão e para a bebida espirituosa. Identificar os picos pelos seus tempos de retenção. Medir a sua área (ou altura) para calcular as concentrações pelo método do padrão externo. Ter em conta as diluições a que a amostra foi sujeita. O resultado final é a soma de sacarose, lactose, maltose, glicose e frutose, expressa em açúcar invertido em g/l. O teor de açúcar invertido é calculado como a soma dos mono e dissacáridos redutores presentes e da quantidade estequiométrica de glicose e frutose, calculada a partir da sacarose presente.
9. Características do desempenho do método (precisão) 9.1. Resultados estatísticos do teste interlaboratorial Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método efetuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada [1] [2].
Quadro 1 Frutose, Glicose, Maltose
Quadro 2 Sacarose
Quadro 3 Açúcares totais (Nota: estes dados foram calculados para os açúcares totais, e não para o açúcar invertido, tal como definido na Secção 8 supra.)
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É aditado o Capítulo X, como se segue: «X. DETERMINAÇÃO DOS SEGUINTES COMPOSTOS DE MADEIRA NAS BEBIDAS ESPIRITUOSAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO (HPLC): FURFURAL, 5-HIDROXIMETILFURFURAL, 5-METILFURFURAL, VANILINA, SIRINGALDEÍDO, CONIFERALDEÍDO, SINAPALDEÍDO, ÁCIDO GÁLICO, ÁCIDO ELÁGICO, ÁCIDO VANÍLICO, ÁCIDO SIRÍNGICO E ESCOPOLETINA 1. Âmbito O método diz respeito à determinação de furfural, 5-hidroximetilfurfural, 5-metilfurfural, vanilina, siringaldeído, coniferaldeído, sinapaldeído, ácido gálico, ácido elágico, ácido vanílico, ácido siríngico e escopoletina, por cromatografia líquida de alta resolução. 2. Referências normativas Método de análise reconhecido pela Assembleia-Geral da Organização Internacional da Vinha e do Vinho (OIV) e publicado pela OIV sob a referência OIV-MA-BS-16: R2009. 3. Princípio Determinação por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), com deteção por espetrofotometria ultravioleta a vários comprimentos de onda e por espetrofluorimetria. 4. Reagentes Os reagentes devem ser de qualidade analítica. A água utilizada deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente. É preferível utilizar águas microfiltradas com uma resistividade de 18,2 M Ω.cm. 4.1. Álcool a 96 % vol. 4.2. Metanol para HPLC (Solvente B). 4.3. Ácido acético diluído em 0,5 % vol. (Solvente A). 4.4. Fases móveis: (a título de exemplo, apenas). Solvente A (0,5 % de ácido acético) e Solvente B (metanol puro). Filtrar através de uma membrana (porosidade 0,45 μm). Eliminar o gás num banho de ultrassons, se necessário. 4.5. Padrões de referência com uma pureza mínima de 99 %: furfural, 5-hidroximetilfurfural, 5-metilfurfural, vanilina, siringaldeído, coniferaldeído, sinapaldeído, ácido gálico, ácido elágico, ácido vanílico, ácido siríngico e escopoletina. 4.6. Solução-padrão: as substâncias padrão são dissolvidas numa solução aquoso-alcoólica com 50 % vol. de álcool. As concentrações finais na solução de referência devem estar na ordem de: furfural: 5 mg/l; 5-hidroximetil furfural: 10 mg/l; 5-metilfurfural 2 mg/l; vanilina: 5 mg/l; siringaldeído: 10 mg/l; coniferaldeído: 5 mg/l; sinapaldeído: 5 mg/l; Ácido gálico: 10 mg/l; ácido elágico: 10 mg/l; ácido vanílico: 5 mg/l; ácido siríngico: 5 mg/l; escopoletina: 0,5 mg/l. 5. Utensílios Material corrente de laboratório 5.1. Um cromatógrafo de fase líquida de alta resolução capaz de funcionar em modo de gradiente binário e equipado com:
5.2. Seringas para HPLC. 5.3. Dispositivo para filtração por membrana de pequenos volumes. 5.4. Computador integrador ou registador de desempenho compatível com toda a aparelhagem, devendo ter, em especial, vários canais de aquisição. 6. Procedimento 6.1. Preparação da solução a injetar A solução de referência e a bebida espirituosa são filtradas, se necessário, através de uma membrana com um poro com 0,45 μm diâmetro máximo. 6.2. Condições de funcionamento da cromatografia: efetuar a análise à temperatura ambiente, seguindo as indicações fornecidas em 5.1, utilizando as fases móveis (4.4) com um fluxo de aproximadamente 0,6 ml por minuto de acordo com o seguinte gradiente (a título de exemplo, apenas) Hora: 0 minutos 50 minutos 70 minutos 90 minutos Solvente A (água-ácido): 100 % 60 % 100 % 100 % Solvente B (metanol): 0 % 40 % 0 % 0 % Importa salientar que, em certos casos, o gradiente deve ser alterado a fim de evitar coeluições. 6.3. Determinação 6.3.1. Injetar os padrões de referência separadamente, e posteriormente combinados. Adaptar as condições de funcionamento de modo a que os fatores de resolução dos picos de todos os compostos sejam iguais a, pelo menos, 1. 6.3.2. Injetar a amostra preparada em conformidade com o ponto 6.1. 6.3.3. Medir a área dos picos na solução de referência e na bebida espirituosa, calculando igualmente as concentrações. 7. Expressão dos resultados A concentração de cada componente deve ser expressa em mg/l. 8. Características de desempenho do método (precisão) Os dados a seguir discriminados foram obtidos em 2009, com base num estudo internacional sobre o desempenho do método relativamente a uma série de bebidas espirituosas, tendo aquele sido efetuado segundo uma metodologia acordada a nível internacional [1], [2]. 8.1. Furfural
8.2. 5-Hidroximetilfurfural
8.3. 5-Metilfurfural
8.4. Vanilina
8.5. Siringaldeído
8.6. Coniferaldeído
8.7. Sinapaldeído
8.8. Ácido gálico
8.9. Ácido elágico
8.10. Ácido vanílico
8.11. Ácido siríngico
8.12. Escopoletina
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(*1) duplicados com teores diferentes
(*2) duplicados com teores diferentes».