DECISÃO DA COMISSÃO de 14 de Abril de 1993 que estabelece os métodos a utilizar para a pesquisa de resíduos de substâncias com efeito hormonal e de substâncias com efeito tireostático

(93/256/CEE)A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,

Tendo em conta a Directiva 85/358/CEE do Conselho, de 16 de Julho de 1985, que completa a Directiva 81/602/CEE respeitante à proibição de determinadas substâncias com efeito hormonal e de substâncias com efeito tireostático (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 88/146/CEE (2) e, nomeadamente, o no 2 do seu artigo 5o,

Considerando que, nos termos do no 1 do artigo 8o da Directiva 64/433/CEE do Conselho, de 26 de Junho de 1964, relativa a problemas sanitários em matéria de comércio intracomunitário de carne fresca (3), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 92/5/CEE (4), e do no 4, segundo parágrafo, do artigo 11o da Directiva 85/397/CEE do Conselho, de 5 de Agosto de 1985, relativa aos problemas sanitários e de polícia sanitária no comércio intracomunitário de leite tratado termicamente (5), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 89/662/CEE (6), os exames dos resíduos devem ser efectuados segundo métodos cientificamente reconhecidos e comprovados na prática, nomeadamente os definidos em directivas comunitárias ou outras normas internacionais;

Considerando que a determinação de métodos de análise das amostras inclui a definição dos processos de análise a utilizar, das regras a seguir para a amostragem e dos critérios relativos à realização das análises;

Considerando que os processos de análise a utilizar devem ser suficientemente sensíveis para detectar a presença de resíduos de substâncias com efeito hormonal e de substâncias com efeito tireostático;

Considerando que a amostragem constitui uma parte essencial do método de análise; que é, portanto, conveniente adoptar regras relativas à colheita das amostras;

Considerando que, para efeitos da presente decisão, é conveniente ter em conta os critérios previstos no ponto 1 do anexo da Directiva 85/591/CEE do Conselho, de 20 de Dezembro de 1985, relativa à introdução de modos de colheita de amostras e de métodos de análise comunitários para o controlo dos géneros destinados à alimentação humana (7);

Considerando que, tendo em conta os progressos no domínio científico e técnico, e por motivos de clareza, é necessário revogar a Decisão 87/410/CEE da Comissão (8);

Considerando que as medidas estabelecidas na presente decisão estão em conformidade com o parecer do Comité veterinário permanente,

ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO:

Artigo 1o

Os processos de análise de rotina autorizados para a pesquisa de resíduos de substâncias com efeito hormonal e de substâncias com efeito tireostático são os seguintes:

- dosagem imunológica,

- cromatografia em camada fina,

- cromatografia em fase líquida,

- cromatografia em fase gasosa,

- espectrometria de massa,

- espectrometria,

e quaisquer outros métodos que satisfaçam critérios idênticos aos estabelecidos em anexo.

Artigo 2o

A colheita de amostras deve efectuar-se de acordo com as seguintes regras:

1. A amostra deve ser representativa e de uma dimensão suficiente para permitir uma análise adequada, possibilitando a sua repetição e a realização de ensaios de confirmação.

2. As amostras devem ser marcadas de modo a permitir a sua identificação em todas as fases do exame.

3. Os métodos de amostragem, acondicionamento, conservação, transporte e armazenagem da amostra devem manter a integridade da mesma e não prejudicar os resultados do exame. Deve ser impedido o acesso à amostra por parte de pessoas não autorizadas.

Artigo 3o

Os critérios aplicáveis aos métodos de rotina para a análise de resíduos de substâncias com efeitos hormonais e de substâncias com efeito tireostático são fixados no anexo.

Artigo 4o

A presente decisão será reexaminada antes de 1 de Janeiro de 1996 de modo a ter em conta a evolução dos conhecimentos científicos e técnicos.

Artigo 5o

É revogada a Decisão 87/410/CEE.

Artigo 6o

Os Estados-membros são os destinatários da presente decisão.

Feito em Bruxelas, em 14 de Abril de 1993.

Pela Comissão

René STEICHEN

Membro da Comissão

(1) JO no L 191 de 23. 7. 1985, p. 46.

(2) JO no L 70 de 16. 3. 1988, p. 16.

(3) JO no 121 de 29. 7. 1964, p. 2012/64.

(4) JO no L 57 de 2. 3. 1992, p. 1.

(5) JO no L 226 de 24. 8. 1985, p. 13.

(6) JO no L 395 de 30. 12. 1989, p. 13.

(7) JO no L 372 de 31. 12. 1985, p. 50.

(8) JO no L 223 de 11. 8. 1987, p. 18.

ANEXO

1. DEFINIÇÕES E CRITÉRIOS GERAIS

1.1. Definições

1.1.1. Métodos de análise de rotina

Trata-se de métodos de análise utilizados pelos Estados-membros na execução de planos nacionais para o controlo de resíduos de animais destinados à alimentação e seus produtos, em conformidade com a Directiva 86/469/CEE do Conselho (1). Os métodos de rotina devem ter sido comprovados por laboratórios oficiais e devem satisfazer os critérios estabelecidos no presente anexo. Os métodos em causa podem ser utilizados em ensaios de detecção e/ou confirmação:

- os métodos utilizados em ensaios de pré-selecção (métodos de pré-selecção) são métodos utilizados para detectar a presença de uma substância ou classe de substâncias a analisar, na quantidade requerida. Estes métodos devem possuir capacidade para a análise de um número elevado de amostras potencialmente positivas, evitando a obtenção de resultados falsos negativos,

- os métodos utilizados em ensaios de confirmação (ensaios de confirmação) são métodos que fornecem indicações completas ou complementares para a identificação inequívoca de uma substância a analisar, na quantidade requerida. Estes métodos devem evitar a obtenção de resultados falsos positivos e apresentar uma probabilidade suficientemente reduzida de obtenção de resultados falsos negativos.

1.1.2. Substância a analisar

Trata-se de um componente de uma amostra para ensaio que deve ser detectado, identificado e/ou quantificado. O termo « substância a analisar » inclui, quando tal for o caso, derivados formados a partir da substância a analisar durante o processo de análise.

O resultado da determinação quantitativa de uma substância a analisar deverá ser apresentado em termos de:

- quantidade, expressa em massa (por exemplo mg, ng)

ou

- teor, expresso em fracção relativa à massa (por exemplo, mg kg 1, ng kg 1), concentração relativa à massa (por exemplo mg l 1) ou concentração (por exemplo, mol l 1).

1.1.3. Amostras

1.1.3.1. Amostra laboratorial

Trata-se de uma amostra destinada a inspecção ou teste, tal como foi preparada para envio ao laboratório.

1.1.3.2. Amostra para ensaio

Trata-se de uma amostra preparada a partir da amostra laboratorial e da qual se deverão retirar as tomas de ensaio.

1.1.3.3. Toma de ensaio

Trata-se de uma quantidade de material retirado da amostra para ensaio (ou da amostra laboratorial, no caso de se tratar da mesma) e com base na qual o teste ou observação é efectivamente realizado.

1.1.4. Substância padrão

Trata-se de uma substância bem definida, de teor conhecido de substância a analisar, com o máximo grau de pureza disponível, destinada a ser utilizada como referência no processo analítico.

1.1.5. Material de referência

Trata-se de um material do qual uma ou várias propriedades foram confirmadas por recurso a um método comprovado, de modo a poder ser utilizado na calibração de um aparelho ou na verificação de um método de medida.

1.1.6. Ensaios em branco

1.1.6.1. Determinação da amostra em branco

Trata-se da aplicação do método analítico completo a uma toma de ensaio retirada de uma amostra isenta da substância a analisar.

1.1.6.2. Determinação do reagente em branco

Trata-se da aplicação do método analítico completo, omitindo a toma de ensaio ou utilizando, em vez desta, uma quantidade equivalente de um solvente adequado.

1.1.7. Especificidade

A especificidade é a capacidade de um método de distinguir a substância a analisar de outras substâncias. Esta característica é, essencialmente, uma função do princípio de medida utilizado, podendo variar de acordo com o tipo de composto ou matriz.

Os pormenores relativos à especificidade devem referir-se a, pelo menos, quaisquer substâncias susceptíveis de dar origem a um sinal quando for utilizado o princípio de medida descrito, nomeadamente homólogas, análogas e metabolitos do resíduo em causa. Com base nas informações relativas à especificidade, deverá ser possível determinar quantitativamente até que ponto o método permite fazer a distinção entre a substância a analisar e outras substâncias, nas condições experimentais.

1.1.8. Exactidão

Na presente decisão, este termo é entendido como a exactidão da média. A definição a utilizar é estabelecida pela norma ISO 3534-1977, no ponto 2.83 (exactidão da média: grau de concordância entre o valor real e o valor médio, obtido através da aplicação do método experimental num elevado número de vezes).

As principais limitações relativas à exactidão são:

a) Os erros acidentais;

b) Os erros sistemáticos.

Para um número muito elevado de ensaios, a exactidão da média aproxima-se do erro sistemático. Para a análise documental de um método, o número de ensaios deve ser especificado.

A medida da exactidão é a diferença entre o valor médio determinado para o material de referência e o seu valor real, expressa em percentagem do valor real. No caso de não se encontrar disponível qualquer material de referência, os parâmetros mais importantes podem ser estimados através da análise de uma amostra adicionada de padrão.

Nos casos em que não se encontrem disponíveis métodos definidos nem materiais de referência comprovados, o teor de substância a analisar pode ser estabelecido através dos resultados obtidos por recurso a um método com elevado grau de especificidade, exactidão e precisão relativamente à substância a analisar.

1.1.9. Precisão

Trata-se do grau de concordância entre os resultados obtidos através da aplicação repetida do método experimental nas condições descritas [ISO 3534-1977 (2), ponto 2.84], abrangendo a repetibilidade e a reprodutibilidade.

Repetibilidade:

Grau de concordância entre resultados sucessivos obtidos com o mesmo método, com material de ensaio idêntico, nas mesmas condições, no mesmo laboratório, pelo mesmo operador e utilizando o mesmo equipamento, com curtos intervalos de tempo.

Reprodutibilidade:

Grau de concordância entre resultados analíticos independentes, obtidos em condições reprodutíveis, isto é, aplicando o mesmo método a uma amostra de ensaio idêntica, em laboratórios diferentes, com operadores diferentes e utilizando equipamentos diferentes. De acordo com o anexo da Directiva 85/591/CEE do Conselho (3), os valores de precisão relativos aos métodos de análise a seleccionar para adopção no âmbito da mesma directiva devem ser obtidos através de uma intercalibração realizada, de preferência, em conformidade com a norma ISO 5725-1986 (4). Para tal fim, os termos repetibilidade e reprodutibilidade são definidos na norma ISO 5725-1986. Na intercalibração atrás referida, deve recorrer-se a amostras com um teor conhecido da substância a analisar, próximo do limite máximo residual.

Até ao estabelecimento da reprodutibilidade de um método através de um processo de colaboração interlaboratorial, os dados disponíveis relativos à repetibilidade são suficientes para a pré-selecção documental de métodos susceptíveis de serem adoptados.

A medida de repetibilidade e reprodutibilidade a utilizar é o coeficiente de variação definido no ponto 2.35 da norma ISO 3534-1977 (coeficiente de variação: razão entre o desvio padrão e o valor absoluto da média aritmética).

1.1.10. Limite de detecção

Teor mínimo determinado a partir do qual é possível deduzir a presença da substância a analisar com uma certeza estatística razoável (correspondente a pelo menos 95 % no caso das substâncias não autorizadas - ver 1.2.6.1). O limite de detecção pode ser determinado recorrendo a diferentes métodos:

a) Um dos métodos consiste em efectuar determinações em branco com, pelo menos, 20 amostras em branco representativas. O limite de detecção é igual à média do teor medido das amostras em branco representativas (n >20) aumentada de três vezes o desvio padrão da média.

Nota 1: a toma de ensaio geralmente utilizada na análise deve ser especificada.

Nota 2: no caso de se considerar que as características de um método podem ser influenciadas por factores tais como a espécie, o sexo, a idade, a alimentação e outros factores ambientais, é necessário um conjunto de pelo menos 20 amostras em branco para cada população homogénea à qual o método for aplicado;

b) Em alternativa, no caso de determinações espectrofotométricas em que os ensaios em branco representativos fornecerem apenas um ruído, o limite de detecção é calculado como o teor aparente que corresponde ao triplo do ruído dos diversos picos.

1.1.11. Limite de determinação

Trata-se do teor mínimo de substância a analisar para o qual o método foi comprovado com uma exactidão e precisão especificadas.

1.1.12. Sensibilidade

Trata-se de uma medida da capacidade de um método para distinguir diferenças no teor da substância a analisar. Na presente decisão, a sensibilidade é calculada como o declive da curva de calibração correspondente ao nível em causa.

1.1.13. Praticabilidade

Trata-se de uma característica de um método analítico que depende do objectivo do mesmo e é determinada por recurso a requisitos tais como o manuseamento das amostras e os custos envolvidos.

1.1.14. Aplicabilidade

Trata-se de uma lista de matrizes e/ou substâncias a analisar às quais o método é aplicável tal como foi apresentado ou com pequenas alterações indicadas.

1.1.15. Interpretação dos resultados

1.1.15.1. Resultado positivo

A presença da substância a analisar na amostra é provada, de acordo com o método analítico, quando os critérios gerais e os critérios especificados para o método de detecção individual forem satisfeitos:

a) Para substâncias com tolerância nula, o resultado da análise é positivo se a identidade da substância a analisar na amostra for provada de um modo inequívoco;

b) Para substâncias com um limite residual máximo estabelecido, o resultado da análise é positivo se o teor determinado experimentalmente de substância a analisar na amostra (após a aplicação eventual de uma correcção relativa à recuperação) for superior ao limite residual máximo estabelecido, tendo em conta a probabilidade aceitável de obtenção de resultados falsos positivos ou resultados falsos negativos.

1.1.15.2. Resultado negativo

O resultado da análise é considerado negativo, de acordo com o processo analítico, quando os critérios gerais e os critérios especificados para o método individual de detecção forem satisfeitos no caso da análise dos materiais de referência adequados e do ensaio em branco e:

a) No caso de substâncias com tolerância nula, se a identidade da substância a analisar não for provada de um modo inequívoco;

b) No caso de substâncias com um limite residual máximo estabelecido, se o teor determinado de substância a analisar na amostra se situar abaixo do nível especificado no ponto 1.1.15.1 b). Nota: um resultado negativo não prova, no caso da alínea a), que a amostra se encontra isenta da substância a analisar e, no caso da alínea b), que o teor real da substância a analisar é inferior ao limite residual máximo.

1.1.16. Co-cromatografia

Trata-se de um processo de acordo com o qual a solução para ensaio purificada é dividida em duas partes, antes da execução da cromatografia:

a) Uma das partes é submetida a cromatografia sem qualquer tratamento prévio;

b) A substância padrão a identificar é adicionada à parte restante, procedendo-se à cromatografia da mistura resultante da solução para ensaio e da substância padrão. A quantidade de substância padrão adicionada deve ser semelhante ao teor previsto de substância a analisar na solução.

1.1.17. Imunograma

Na presente decisão, um imunograma é definido como uma representação gráfica da resposta imunoquímica em função do tempo de retenção ou do volume de eluição, obtidos numa separação cromatográfica acompanhada de detecção imunoquímica (em geral autónoma) dos componentes de um extracto de amostra.

1.2. Requisitos gerais

1.2.1. Critérios

Em conformidade com o anexo da Directiva 85/591/CEE, os critérios que se estabelecem de seguida referem-se ao exame de métodos de análise.

1.2.2. Métodos de pré-selecção

No caso dos métodos de pré-selecção, não é possível estabelecer critérios constantes. O aspecto mais importante do processo reside no facto de a incidência de resultados falsos negativos nos níveis de concentração em causa dever ser mínima.

1.2.2.1. A especificidade deve ser definida.

1.2.2.2. Exactidão e precisão:

A quantificação pode não ser necessária. Consoante a utilização de uma substância for proibida ou autorizada, o método de pré-selecção pode ser qualitativo ou quantitativo. A ocorrência de resultados falsos positivos é aceitável, mas os resultados falsos negativos, no nível de concentrações em questão, devem ser mínimos.

1.2.2.3. Limite de detecção:

O limite de detecção deve ser adequado para o objectivo em causa. No caso de substâncias com um limite residual máximo estabelecido, o limite de detecção deve ser suficientemente baixo para permitir a detecção de resíduos ao nível deste limite. No caso de substâncias cuja utilização em animais destinados à alimentação não for permitida, o limite de detecção deve ser tão baixo quanto possível.

1.2.2.4. Praticabilidade:

Os métodos devem possuir capacidade para a análise de um número elevado de amostras e o seu custo deve ser reduzido.

1.2.3. Métodos de confirmação

1.2.3.1. Especificidade:

Na medida do possível, os métodos de confirmação devem fornecer informações inequívocas relativamente à estrutura química da substância a analisar. No caso de vários compostos originarem uma resposta idêntica, o método não permite a distinção dos mesmos compostos.

Os métodos que utilizam apenas a análise cromatográfica, sem recurso a um sistema de detecção baseado na espectrometria molecular, não são adequados para utilização enquanto métodos de confirmação.

Se uma determinada técnica não possuir especificidade suficiente, a especificidade desejada pode ser obtida através de processos analíticos constituídos por combinações adequadas de processos de purificação, separação cromatográfica e detecção espectrofotométrica ou imunoquímica, isto é, GC-MS, LC-MS, IAC/GC-MS, GC-IR, LC-IR, LC/IMG.

1.2.3.2. Exactidão

No caso da análise repetida de um material de referência, os limites indicativos para o desvio do teor médio determinado experimentalmente (após a aplicação de uma correcção eventual relativa à recuperação) do valor real são os seguintes:

No caso da análise repetida de um material de referência em condições reprodutíveis, os valores característicos do coeficiente de variação (CV) interlaboratorial calculado de acordo com a equação de Horwitz [CV(%) = 2(5) 0,5 logC)], em que C representa o teor, expresso em potência de 10, são os seguintes:

geral, compreendido entre metade e dois terços dos valores atrás apresentados. 1.2.3.4. Limite de detecção:

Adequado para o objectivo em causa (ver 1.2.6.1).

1.2.3.5. Limite de determinação:

Adequado para o objectivo em causa (ver 1.2.6.2).

1.2.3.6. Sensibilidade:

Adequada para o objectivo em causa.

1.2.3.7. Praticabilidade:

A rapidez e o custo revestem-se de uma importância inferior, relativamente aos métodos de pré-selecção.

No caso dos métodos de confirmação, a maioria dos aspectos referentes à praticabilidade possuem uma importância menor, relativamente aos outros critérios definidos na presente directiva. A disponibilidade dos reagentes e do equipamento requeridos é, em geral, suficiente.

1.2.4. Curvas de calibração

Se o método depende de uma curva de calibração, devem fornecer-se as informações seguintes:

- fórmula matemática que descreve a curva de calibração,

- limites aceitáveis entre os quais os parâmetros da curva de calibração podem variar de um dia para outro,

- zona de trabalho da curva de calibração.

Sempre que possível, devem ser usados padrões internos e materiais de referência adequados para o controlo da qualidade das curvas de calibração dos métodos de confirmação, devendo fornecer-se indicações relativas à variância das variáveis que é válida, pelo menos, na zona de trabalho da curva de calibração.

1.2.5. Susceptibilidade às interferências

1.2.5.1. Relativamente a todas as condições experimentais que possam, na prática, estar sujeitas a variações (por exemplo, estabilidade dos reagentes, composição da amostra, pH, temperatura), devem ser indicadas quaisquer alterações susceptíveis de afectar os resultados analíticos. A descrição do método deve incluir os meios para ultrapassar quaisquer interferências previsíveis. Se necessário, devem descrever-se princípios alternativos de detecção, adequados para a confirmação.

1.2.5.2. No caso de ser utilizada a co-cromatografia, deve obter-se apenas um pico, cujo incremento na altura (ou área) deverá ser equivalente à quantidade de substância a analisar adicionada. No caso de GC e LC, a largura do pico a metade da altura máxima deverá ser compreendida entre 90 % e 110 % da largura original, e os tempos de retenção deverão ser idênticos, com um desvio de 5 %. Para métodos baseados em TLC, a mancha presumivelmente devida à substância a analisar deve apenas sofrer uma intensificação; não deve observar-se o aparecimento de uma nova mancha e o aspecto visual da mesma não deve sofrer alterações.

1.2.5.3. A investigação das interferências susceptíveis de resultar de componentes da matriz é de importância primordial.

1.2.6. Relação entre os níveis residuais permitidos e os limites analíticos

1.2.6.1. No caso de substâncias cuja utilização em animais destinados à alimentação não for autorizada, o limite de detecção do método analítico deve ser suficientemente baixo para que os níveis residuais cuja presença, em virtude da sua utilização ilegal, seja previsível sejam detectados com uma probabilidade mínima de 95 %.

1.2.6.2. No caso de substâncias com um limite residual máximo estabelecido, o limite de determinação do método acrescido do triplo do desvio padrão que o método apresenta para uma amostra com o limite residual máximo não deve exceder o limite residual máximo estabelecido.

1.2.6.3. No caso de substâncias com um limite residual máximo estabelecido, o método deve ser comprovado para aquele limite e para valores correspondentes a metade e ao dobro do mesmo.

2. CRITÉRIOS PARA A IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE RESÍDUOS

2.1. Requisitos gerais

Os laboratórios que efectuam análises para a confirmação final da presença de resíduos de substâncias orgânicas de baixo peso molecular devem assegurar-se de que os critérios para a interpretação dos resultados são satisfeitos, de acordo com os requisitos apresentados na presente secção. Os critérios destinam-se à identificação da substância a analisar e têm como objectivo evitar a ocorrência de resultados falsos positivos. Para uma conclusão positiva, os resultados analíticos devem satisfazer os critérios estabelecidos para o método analítico em causa.

2.2. Considerações gerais relativas ao método analítico

2.2.1. Preparação da amostra

A amostra deve ser obtida, manuseada e tratada de modo a que a probabilidade de detecção da substância a analisar seja máxima, no caso de esta se encontrar presente.

2.2.2. Susceptibilidade às interferências

Devem fornecer-se informações de acordo com o especificado no ponto 1.2.5 (Susceptibilidade às interferências).

2.2.3. Critérios gerais relativos ao processo

2.2.3.1. A especificidade (1.1.7), bem como os limites de detecção (1.1.10) e de determinação (1.1.11) do método, relativamente à substância a analisar na amostra em estudo, devem ser conhecidos.

Nota: as informações em causa podem ser obtidas a partir de dados experimentais e/ou considerações teóricas.

2.2.3.2. No caso de um resultado positivo, o comportamento físico e químico da substância a analisar, no decurso da análise, não deve diferir do comportamento da substância padrão numa amostra adequada.

2.2.3.3. O resultado positivo ou negativo da análise deve referir-se apenas aos limites de especificidade, detecção e determinação do processo para a substância a analisar e a amostra em estudo.

2.2.3.4. O material de referência ou material adicionado de padrão que contenha quantidades conhecidas da substância a analisar deve, de preferência, ser analisado juntamente com cada série de amostras para ensaio, no decurso do processo. Em alternativa, poderá adicionar-se um padrão interno às amostras para ensaio.

2.2.4. Critérios relativos aos processos físicos e/ou químicos autónomos de pré-concentração, purificação e separação

2.2.4.1. A substância a analisar deve encontrar-se na fracção característica da substância padrão correspondente na amostra adequada, em condições experimentais idênticas.

2.2.4.2. Os parâmetros de retenção referentes aos padrões, amostras para controlo e tomas de ensaio devem ser apresentados juntamente com o resultado final positivo ou negativo.

2.2.5. Critérios para as determinações quantitativas

2.2.5.1. A recuperação deve ser medida e especificada para todas as determinações quantitativas.

2.2.5.2. A variabilidade intralaboratorial da recuperação deve ser tão baixa quanto possível.

2.2.5.3. Deve referir-se claramente se os resultados finais foram ou não objecto de uma correcção relativa à recuperação. Em caso afirmativo, o método de correcção utilizado deve ser descrito.

2.3. Critérios relativos a métodos de análise que podem ser utilizados para confirmação unicamente em combinação com outros métodos

2.3.1. Requisitos de qualidade relativos à determinação de uma substância a analisar por IA

2.3.1.1. A zona útil da curva de calibração deve ser especificada, devendo, em geral, abranger uma gama de concentrações de, pelo menos, dez unidades decimais.

2.3.1.2. São necessários, pelo menos, seis pontos de calibração, distribuídos de um modo adequado ao longo da curva de calibração.

2.3.1.3. Os parâmetros adequados de controlo de qualidade devem estar em conformidade com os dos ensaios anteriores, isto é, NSB e parâmetros relativos à curva de calibração.

2.3.1.4. Devem incluir-se em cada ensaio amostras para controlo. As suas concentrações devem situar-se aos níveis zero, inferior, médio e superior da zona útil. Os resultados obtidos devem estar em conformidade com os resultados dos ensaios anteriores.

Todos os dados relativos às amostras para controlo e à toma de ensaio devem ser apresentados juntamente com o resultado final positivo ou negativo.

2.3.2. Critérios para a determinação de uma substância a analisar por GC ou LC, mediante o uso de um sistema de detecção não específico

2.3.2.1. A substância a analisar deve ser eluída no tempo de retenção característico da substância padrão correspondente, nas mesmas condições experimentais.

2.3.2.2. O valor máximo do pico mais próximo no cromatograma deve encontrar-se separado do pico correspondente à substância a analisar por, pelo menos, uma largura total a 10 % da altura máxima.

2.3.2.3. Para a obtenção de informações complementares poderá recorrer-se à co-cromatografia e à cromatografia utilizando pelo menos duas colunas de polaridade diferente.

2.3.3. Critérios para a determinação de uma substância a analisar por TLC

2.3.3.1. O(s) valor(es) de Rf relativo(s) à substância a analisar deve(m) corresponder ao(s) valor(es) característico(s) da substância padrão. Esta condição é satisfeita quando o(s) valor(es) de Rf relativo(s) à substância a analisar se encontrar(em) no limite de ± 3 % do(s) valor(es) de Rf referente(s) à substância padrão, nas mesmas condições experimentais.

2.3.3.2. O aspecto visual da substância a analisar não deve ser distinto do aspecto visual da substância padrão.

2.3.3.3. O centro da mancha mais próxima da mancha referente à substância a analisar deve encontrar-se separada deste última por, pelo menos, metade da soma dos diâmetros das manchas.

2.3.3.4. Para a obtenção de informações complementares deve recorrer-se à co-cromatografia e/ou TLC bidimensional.

2.4. Critérios relativos a métodos de análise que podem ser utilizados para confirmação

2.4.1. Critérios para a determinação de uma substância a analisar por LC/IA ou LC/IMG

2.4.1.1. Para LC/IMG, o pico correspondente à substância a analisar no IMG deve ser constituído a partir de, pelo menos, cinco fracções de LC.

2.4.1.2. Os critérios definidos nos pontos 2.2.4.1 e 2.2.4.2 devem ser satisfeitos.

2.4.1.3. Reagentes

A origem e as características do anticorpo e de quaisquer outros reagentes devem ser especificadas.

2.4.1.4. Curva de calibração

Na medida em que o método depende de curvas de calibração, devem fornecer-se as informações referidas no ponto 1.2.4 (curvas de calibração).

Os requisitos de qualidade especificados para métodos baseados em IA (2.3.1.1 a 2.3.1.4) devem ser satisfeitos.

2.4.1.5. Para fins de confirmação, no caso de o método não ser utilizado em combinação com outros métodos, devem efectuar-se duas separações distintas por LC ou dois imunogramas por recurso a anticorpos com diferente especificidade.

2.4.2. Critérios para a determinação de uma substância a analisar por LC/SP

2.4.2.1. Devem ser preenchidos os critérios dos pontos 2.3.2.1 e 2.3.2.2.

2.4.2.2. Os máximos de absorção no espectro da substância a analisar devem ocorrer aos mesmos comprimentos de onda que os máximos de absorção da substância padrão, com uma margem determinada pela resolução do sistema de detecção. No caso de um sistema de detecção baseado em díodos, a margem em causa é, em geral, de ± 2 nm.

2.4.2.3. Acima de 220 nm, o aspecto visual do espectro da substância a analisar não deve diferir do espectro da substância padrão, nas zonas dos dois espectros com uma absorvância relativa & ge;10 %. Este critério é satisfeito quando os mesmos máximos se encontram presentes e quando em nenhum dos pontos observados a diferença entre os máximos de ambos os espectros não excede 10 % da absorvância da sustância padrão.

2.4.2.4. Para efeitos de confirmação, se o método não for usado em combinação com outros métodos, é necessária a realização de co-cromatografia no passo de LC. No que se refere aos requisitos a satisfazer pela co-cromatografia, veja-se o ponto 1.2.5.2.

2.4.3. Critérios para a determinação de uma substância a analisar por TLC-SP

2.4.3.1. O método deve satisfazer os critérios especificados para TLC (2.3.3.1 a 2.3.3.3).

2.4.3.2 Os máximos de absorção no espectro da substância a analisar devem situar-se aos mesmos comprimentos de onda que os máximos relativos à substância padrão, com uma margem determinada pela resolução do sistema de detecção.

2.4.3.3. O aspecto visual do espectro da substância a analisar não deve diferir do aspecto visual do espectro da substância padrão.

2.4.3.4. Para efeitos de confirmação, se o método não for utilizado em combinação com outros métodos, é necessária a realização de co-cromatografia no passo de TLC. No que se refere aos requisitos a satisfazer pela co-cromatografia, veja-se o ponto 1.2.5.2.

2.4.4. Critérios para a determinação de uma substância a analisar por GC-MS

2.4.4.1. Critérios relativos à GC

2.4.4.1.1. Os critérios definidos em 2.3.2.1 e 2.3.2.2 devem ser satisfeitos.

2.4.4.1.2. No caso de se encontrar disponível um material adequado para tal efeito, deve usar-se um padrão interno. Este padrão deve ser, de preferência, uma forma da substância a analisar marcada com um isótopo estável ou, no caso de esta não se encontrar disponível, um padrão afim com um tempo de retenção próximo do tempo de retenção da substância a analisar.

2.4.4.1.3. A razão entre o tempo de retenção da substância a analisar em GC e o tempo de retenção do padrão interno, isto é, o tempo de retenção relativo da substância a analisar, deve ser idêntico ao da substância padrão na matriz adequada, com uma margem de ± 0,5 %.

2.4.4.1.4. Para utilização enquanto método de confirmação, no caso de não se recorrer a um padrão interno, a identificação da substância a analisar pode ser apoiada utilizando a co-cromatografia.

2.4.4.2. Critérios relativos a LRMS

2.4.4.2.1. Para uso como método de pré-selecção, deve ser determinada pelo menos a intensidade do ião de controlo mais abundante.

2.4.4.2.2. Para uso como método de confirmação, devem ser determinadas as intensidades de um número mínimo preferencial de quatro iões de controlo. Se, através do método utilizado, o composto não der origem a quatro iões de controlo, a identificação da substância a analisar deve basear-se nos resultados de, pelo menos, dois métodos independentes de GC-LRMS, por recurso a derivados e/ou técnicas de ionização diferentes, cada um dos quais deverá produzir dois ou três iões de controlo.

O ião molecular deve, de preferência, ser um dos iões de controlo seleccionados.

2.4.4.2.3. As abundâncias relativas de todos os iões de controlo detectados na substância a analisar devem corresponder às abundâncias relativas da substância padrão, de preferência com uma margem de ± 10 % (modo EI) ou ± 20 % (modo CI).

Critérios para a identificação de uma substância a analisar por IR

2.4.5.1. Definição de picos adequados

Os picos adequados correspondem a máximos de absorção no espectro de infravermelhos de uma substância padrão que satisfazem os requisitos seguintes.

2.4.5.1.1. O máximo de absorção situa-se no intervalo de comprimentos de onda 1 800 a 500 cm 1.

2.4.5.1.2. A intensidade da absorção não deve ser inferior a:

a) Uma absorvância molar específica de 40 relativamente à absorvância zero e de 20 relativamente à linha de base do pico,

ou

b) Uma absorvância relativa de 12,5 % da absorvância do pico mais intenso na região 1 800 - 500 cm 1, no caso de ambos serem medidos relativamente à absorvância zero, e de 5 % da absorvância do pico mais intenso na região 1 800 - 500 cm 1, no caso de a medição de ambos se efectuar relativamente à linha de base dos seus picos.

Nota: embora, do ponto de vista teórico, sejam preferíveis os picos adequados descritos na alínea a), os picos referidos na alínea b) são mais fáceis de determinar na prática.

2.4.5.2. Deve determinar-se o número de picos do espectro de infravermelhos da substância a analisar cujas frequências correspondem a um pico adequado no espectro da substância padrão com uma margem de ± 1 cm 1.

2.4.5.3. Critérios relativos à IR

2.4.5.3.1. Deve observar-se absorção em todas as regiões do espectro da substância a analisar que correspondem a um pico adequado no espectro de referência da substância padrão.

2.4.5.3.2. No espectro de infravermelhos da substância padrão é necessária a presença de, pelo menos, seis picos adequados. No caso de se encontrarem presentes menos de seis picos, o espectro em causa não pode ser utilizado como espectro de referência.

2.4.5.3.3. O « resultado », isto é, a percentagem de picos adequados presentes no espectro de infravermelhos da substância a analisar, deve ser de, pelo menos, 50.

2.4.5.3.4. Quando não existir uma correspondência exacta para um pico adequado, a região em causa do espectro da substância a analisar deve ser conforme à presença de um pico correspondente.

2.4.5.3.5. O processo descrito é aplicável apenas a picos de absorção no espectro da amostra com uma intensidade pelo menos de três vezes o ruído de pico a pico.

2.5. Outros métodos de análise

Além dos métodos descritos nos pontos 2.3 e 2.4 (nomeadamente LC-MS, MS-MS, GC-IR) podem ser utilizados para efeitos de detecção ou confirmação outros métodos analíticos ou combinações de métodos que satisfaçam critérios idênticos e permitam a identificação inequívoca da quantidade requerida da substância a analisar.

APÊNDICE

Lista de apreviaturas e símbolos CI = ionização química

EI = ionização por impacte electrónico

g = grama(s)

GC = cromatografia em fase gasosa

IA = dosagem imunológica

IAC = cromatografia de imunoafinidade

IMG = imunograma

IR = espectrometria de infravermelhos

kg = quilograma(s) (103 g)

l = litro(s)

LC = cromatografia em fase líquida

LRMS = espectrometria de massa de baixa resolução

mg = miligrama(s) (10 3 g)

MS = espectrometria de massa

ng = nanograma(s) (10 9 g)

NSB = ligação não específica

Rf = distância percorrida em relação à frente do solvente

SP = espectrometria, nomeadamente com um sistema de detecção de díodos

TLC = cromatografia em camada fina

mg = micrograma(s) (10 6 g)

/ = técnicas associadas autónomas

- = técnicas associadas em linha

por exemplo, LC/GC - MS = LC autónoma seguida de GC com MS associado em linha

(1) JO no L 275 de 26. 9. 1986, p. 36.

(2) Organização Internacional de Normalização: Estatística - vocabulário e símbolos

(3) JO no L 372 de 31. 12. 1985, p. 50.

(4) Organização Internacional de Normalização: Precisão de métodos de ensaio - determinação da repetibilidade e reprodutibilidade de um método-padrão de ensaio por recurso a testes interlaboratoriais.