1991R2568 — PT — 16.10.2015 — 028.001

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▼B

REGULAMENTO (CEE) N.o 2568/91 DA COMISSÃO

de 11 de Julho de 1991

relativo às características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona, bem como aos métodos de análise relacionados

▼M20

Artigo 1.o

1.  São considerados azeites virgens, na acepção do ponto 1, alíneas a), b) e c), do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, os azeites que apresentem as características indicadas nos pontos 1 e 2 do anexo I do presente regulamento.

2.  É considerado azeite lampante, na acepção do ponto 1, alínea c) do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 3 do anexo I do presente regulamento.

3.  É considerado azeite refinado, na acepção do ponto 2 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 4 do anexo I do presente regulamento.

4.  É considerado azeite constituído por azeite refinado e azeites virgens, na acepção do ponto 3 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 5 do anexo I do presente regulamento.

5.  É considerado óleo de bagaço de azeitona bruto, na acepção do ponto 4 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 6 do anexo I do presente regulamento.

6.  É considerado óleo de bagaço de azeitona refinado, na acepção do ponto 5 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 7 do anexo I do presente regulamento.

7.  É considerado óleo de bagaço de azeitona, na acepção do ponto 6 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 8 do anexo I do presente regulamento.

▼M26

Artigo 2.o

1.  A determinação das características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona previstas no anexo I é efetuada de acordo com os seguintes métodos de análise:

▼M28

▼M26

▼M28

▼M26

▼M28 —————

▼M26

2.  A verificação, pelas autoridades nacionais ou por representantes destas, das características organolépticas de azeites virgens deve ser efetuada por júris de provadores aprovados pelos Estados-Membros.

As características organolépticas de um azeite referido no primeiro parágrafo serão consideradas conformes com a categoria de azeite declarada se um júri aprovado pelo Estado-Membro em causa confirmar a classificação atribuída.

Se o júri não confirmar a categoria declarada no respeitante às características organolépticas, as autoridades nacionais ou os representantes destas farão realizar sem demora, a pedido do interessado, duas contra-análises por outros júris aprovados, das quais pelo menos uma a efetuar por um júri aprovado pelo Estado-Membro produtor. As características em questão serão consideradas conformes com as declaradas se as duas contra-análises confirmarem a classificação declarada. Caso contrário, as despesas das contra-análises devem ser imputadas ao interessado.

3.  A colheita de amostras para fins de verificação, pelas autoridades nacionais ou por representantes destas, das características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona previstas no n.o 1 deve ser efetuada de acordo com as normas internacionais EN ISO 661, relativa à preparação das amostras para ensaio, e EN ISO 5555, relativa à amostragem. Todavia, por derrogação ao ponto 6.8 da norma EN ISO 5555, no caso dos lotes dos referidos azeites e óleos de bagaço de azeitona em embalagens imediatas, a colheita de amostras deve ser efetuada de acordo com o anexo IA do presente regulamento. No caso dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona a granel cuja amostragem não possa ser realizada de acordo com a norma EN ISO 5555, a amostragem deve ser realizada segundo as instruções da autoridade competente do Estado-Membro.

Sem prejuízo da norma EN ISO 5555 e do capítulo 6 da norma EN ISO 661, as amostras devem ser colocadas, o mais rapidamente possível, ao abrigo da luz e de temperaturas elevadas e ser enviadas para análise, ao laboratório, o mais tardar no quinto dia útil após a sua colheita. Caso contrário, as amostras devem ser conservadas de modo a que não se degradem nem deteriorem antes de chegarem ao laboratório, durante o seu transporte ou armazenagem.

4.  Para efeitos da verificação prevista no n.o 3, as análises referidas nos anexos II, III, IX, XII e XX, bem como, se for caso disso, as contra-análises exigidas pela legislação nacional, devem, no caso dos produtos embalados, ser efetuadas antes do final do prazo de durabilidade mínima. No caso das amostras de azeites e de óleos de bagaço de azeitona a granel, as referidas análises devem ser efetuadas, o mais tardar, no sexto mês após aquele em que as amostras foram colhidas.

Não se estabelece nenhum prazo para as outras análises previstas no presente regulamento.

Salvo no caso de a colheita da amostra ter ocorrido menos de dois meses antes do final do prazo de durabilidade mínima, se os resultados das análises não corresponderem às características da categoria de azeite ou de óleo de bagaço de azeitona declarada, o interessado deve ser notificado, o mais tardar, um mês antes do final do período previsto no primeiro parágrafo.

5.  Para a determinação das características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona pelos métodos previstos no n.o 1, primeiro parágrafo, os resultados analíticos devem ser diretamente comparados com os limites estabelecidos no presente regulamento.

▼M25

Artigo 2.o-A

1.  Para efeitos do disposto no presente artigo, entende-se por «azeite comercializado» a quantidade de azeites e de óleos de bagaço de azeitona de um determinado Estado-Membro que nele é consumida ou dele é exportada.

2.  Os Estados-Membros devem zelar por que as verificações de conformidade sejam efetuadas seletivamente, com base em análises de risco, e com a frequência adequada, a fim de garantir que o azeite comercializado corresponde à categoria declarada.

3.  Podem constituir critério de avaliação do risco:

4.  Os Estados-Membros devem estabelecer previamente:

O número mínimo de verificações de conformidade a efetuar por milhar de toneladas de azeite comercializado no Estado-Membro é de uma por ano.

5.  Para verificarem a conformidade, os Estados-Membros devem:

▼M19 —————

▼M25

Artigo 3.o

Caso se verifique que um azeite ou um óleo de bagaço de azeitona não corresponde à descrição da categoria alegada, o Estado-Membro em causa deve aplicar, sem prejuízo de outras sanções eventuais, sanções efetivas, proporcionadas e dissuasoras, a estabelecer em função da gravidade da irregularidade detetada.

Se as verificações revelarem irregularidades significativas, os Estados-Membros devem aumentar a frequência das verificações efetuadas em relação ao estádio de comercialização, à categoria de azeite ou de óleo de bagaço de azeitona, à origem dos mesmos ou a outros critérios.

▼M5

Artigo 4.o

▼M19

1.  Para a apreciação e controlo das características organolépticas pelas autoridades nacionais ou representantes destas, os Estados-Membros podem aprovar júris de provadores.

As condições de aprovação serão estabelecidas pelos Estados-Membros, nomeadamente de modo a:

Cada Estado-Membro comunicará à Comissão a lista dos júris aprovados e as medidas tomadas em conformidade com o presente número.

▼M5

2.  Caso um Estado-membro encontre dificuldades na criação de um júri de provadores no seu território, pode recorrer a um júri de provadores aprovado noutro Estado-membro.

3.  Cada Estado-membro estabelecerá a lista dos júris de provadores criados por organizações profissionais ou interprofissionais, em conformidade com as condições estabelecidas no n.o 1 e velará pelo respeito dessas condições.

▼M19 —————

▼B

Artigo 6.o

1.  O teor de ►C1  óleo de bagaço ◄ e outros resíduos da extracção do azeite (códigos NC 2306 90 11 e 2306 90 19 ) é determinado em conformidade com o método constante do anexo XV.

2.  O teor de óleo referido no n.o 1 é expresso em percentagem do seu peso em relação ao extracto seco.

▼M20

Artigo 7.o

São aplicáveis as disposições comunitárias respeitantes à presença de contaminantes.

Relativamente ao teor de solventes halogenados, os limites para todas as categorias de azeite são os seguintes:

▼M25

Artigo 7.o-A

As pessoas singulares ou coletivas e os agrupamentos que, para qualquer finalidade profissional ou comercial, detenham azeite ou óleo de bagaço de azeitona nalgum estádio compreendido entre a extração no lagar e o engarrafamento, inclusive, devem dispor de registos das entradas e saídas relativos a cada categoria de azeite ou de óleo de bagaço de azeitona.

Compete aos Estados-Membros assegurar que a obrigação estabelecida no primeiro parágrafo é devidamente cumprida.

▼M25

Artigo 8.o

1.  Compete a cada Estado-Membro comunicar à Comissão as medidas que tomar para dar execução ao presente regulamento e informar a Comissão das alterações eventuais dessas medidas.

2.  Compete igualmente aos Estados-Membros transmitir anualmente à Comissão, até 31 de maio, um relatório sobre a execução do presente regulamento no ano anterior. Devem constar desse relatório, pelo menos, os resultados das verificações de conformidade efetuadas aos azeites e aos óleos de bagaço de azeitona, apresentadas de acordo com o modelo do anexo XXI.

3.  As comunicações referidas no presente regulamento devem ser efetuadas em conformidade com o Regulamento (CE) n.o 792/2009 da Comissão ( 5 ).

▼B

Artigo 9.o

É revogado o Regulamento (CEE) n.o 1058/77.

Artigo 10.o

1.  O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias. No entanto, o método constante do anexo XII é aplicável a partir de ►M1  1 de Novembro de 1992 ◄ , salvo no que concerne às operações ligadas à intervenção.

▼M5

Este método não se aplica aos azeites virgens acondicionados antes de 1 de Novembro de 1992.

▼B

2.  O presente regulamento não é aplicável aos azeites e óleos de bagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor do presente regulamento e comercializados até 31 de Outubro de 1992.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.

ANEXOS

Sumário

▼M27

ANEXO I

CARACTERÍSTICAS DOS AZEITES E ÓLEOS DE BAGAÇO DE AZEITONA

Notas:

Apêndice

ESQUEMA DE DECISÃO

Esquema de decisão relativo ao campesterol para azeites virgens e azeites virgens extra:

Os outros parâmetros devem respeitar os limites estabelecidos no presente regulamento.

Esquema de decisão relativo ao delta-7-estigmastenol para:

Os outros parâmetros devem respeitar os limites estabelecidos no presente regulamento.

▼M26

ANEXO I-A

AMOSTRAGEM DE AZEITES E ÓLEOS DE BAGAÇO DE AZEITONA ENTREGUES EM EMBALAGENS IMEDIATAS

O presente método de amostragem é aplicável a lotes de azeite ou óleo de bagaço de azeitona acondicionados em embalagens imediatas. O método de amostragem depende do volume da embalagem imediata (até 5 litros ou superior a 5 litros).

Entende-se por «lote» um conjunto de unidades de venda produzidas, fabricadas e acondicionadas em circunstâncias tais que o azeite ou óleo nelas contido seja considerado homogéneo relativamente a todas as características analíticas. A individualização dos lotes deve respeitar o disposto na Diretiva 2011/91/UE do Parlamento Europeu e do Conselho ( 6 ).

Entende-se por «incremento» a quantidade de azeite ou óleo de uma embalagem imediata, proveniente de um ponto aleatório do lote.

1.   COMPOSIÇÃO DAS AMOSTRAS DE PARTIDA

1.1.    Embalagens imediatas de volume não superior a 5 litros

Entende-se por «amostra de partida» de embalagens imediatas de volume não superior a 5 litros o número de incrementos provenientes do lote de acordo com o quadro 1.

O Estado-Membro pode aumentar, em função das suas necessidades (por exemplo, realização da avaliação organoléptica por um laboratório diferente do que realiza as análises químicas, contra-análises, etc.), o número de embalagens estabelecido no quadro 1 para a amostra de partida.

1.2.    Embalagens imediatas de volume superior a 5 litros

Entende-se por «amostra de partida» de embalagens imediatas de volume superior a 5 litros uma parte representativa do total de incrementos, obtida por um processo de redução de acordo com o quadro 2. A amostra de partida é obrigatoriamente constituída por vários exemplos.

Entende-se por «exemplo» da amostra de partida cada embalagem que a compõe.

A fim de reduzir o volume das embalagens imediatas que compõem a amostra, homogeneízam-se os incrementos para preparar a amostra de partida. Vertem-se os diversos incrementos para o mesmo recipiente e homogeneíza-se mexendo o azeite ou óleo, tomando a precaução de evitar ao máximo a incorporação de ar.

Verte-se a amostra de partida assim preparada numa série de embalagens de capacidade não inferior a 1,0 litro, passando cada uma delas a constituir um exemplo da amostra de partida.

O Estado-Membro pode aumentar, em função das suas necessidades (por exemplo, realização da avaliação organoléptica por um laboratório diferente do que realiza as análises químicas, contra-análises, etc.), o número de amostras de partida.

Deve proceder-se ao enchimento de cada embalagem de modo a reduzir ao mínimo a camada de ar superior, após o que se fecha convenientemente a embalagem e se procede à sua selagem, para evitar que possa haver interferências no produto que contém.

Rotulam-se os exemplos assim constituídos para que possam ser corretamente identificados.

2.   ANÁLISES E RESULTADOS

3.   VERIFICAÇÃO DA CATEGORIA DO LOTE

ANEXO I-B

ESQUEMA DE DECISÃO PARA VERIFICAÇÃO DA CONFORMIDADE DE UMA AMOSTRA DE AZEITE COM A CATEGORIA DECLARADA

Quadro 1

Quadro 2

Quadro 3

Apêndice 1

▼B

ANEXO II

▼M21

DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GORDOS LIVRES, MÉTODO A FRIO

▼B

1.   OBJECTIVO

Determinação dos ácidos gordos livres em azeites. O teor de ácidos gordos livres é expresso em termos de acidez, calculada convencionalmente, ou em índice de acidez.

1.1.   Princípio

Dissolução da amostra numa mistura de solventes, seguida de titulação dos ácidos gordos livres presentes com uma solução etanólica de hidróxido de potássio.

1.2.   Reagentes

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida e a água a utilizar deve ser destilada ou de pureza equivalente.

1.3.   Aparelhos e utensílios

Material corrente de laboratório, designadamente:

1.4.   Processo

1.5.   Expressão da acidez em percentagem de ácido oleico

A acidez, expressa em percentagem em massa, é igual a:

em que:

V = é o volume consumido, expresso em mililitros de solução titulada de hidróxido de potássio.

c = é a concentração exacta, em moles por litro, da solução titulada de hidróxido de potássio utilizada.

M = é a massa molar, em gramas por mole, do ácido adoptado para a expressão dos resultados (= 282).

m = é a massa, em gramas, da toma do ensaio.

Toma-se como resultado a média aritmética de duas determinações.

ANEXO III

DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE PERÓXIDOS

1.   OBJECTIVO

A presente norma descreve um método para a determinação do índice de peróxidos em óleos e gorduras.

2.   DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

A presente norma é aplicada a óleos e gorduras de origem animal e vegetal.

3.   DEFINIÇÃO

O índice de peróxidos é a quantidade de substâncias presentes na amostra, expressa em miliequivalentes de oxigénio activo por kg, capazes de oxidar o iodeto de potássio nos condições operacionais descritas.

4.   PRINCÍPIO

Tratamento da toma da amostra em estudo, dissolvida em ácido acético e clorofórmio, com uma solução de iodeto de potássio. Titulação do iodo libertado com uma solução padrão de tiossulfato de sódio.

5.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

Todo o equipamento usado deve estar isento de substâncias oxidantes ou redutoras.

Nota:

Não se lubrificam os contactos esmerilados.

6.   REAGENTES

7.   AMOSTRA

A amostra deverá ser colhida e conservada na ausência de luz, devendo ainda ser mantida a baixa temperatura e contida em recipientes de vidro completamente cheios, hermeticamente fechados com rolhas de vidro esmerilado ou cortiça.

8.   TÉCNICA

O ensaio deverá ser efectuado em presença de luz solar difusa ou luz artificial. Pesa-se numa cápsula de vidro (ponto 5.1) ou, na falta desta, num frasco (ponto 5.2), com uma aproximação de 0,001 g, uma massa de toma de acordo com o quadro seguinte, em conformidade com o índice de peróxidos presumido:

Abre-se o frasco (ponto 5.2) e introduz-se a cápsula de vidro contendo a toma em estudo. Adicionam-se 10 ml de clorofórmio (ponto 6.1) e dissolve-se a toma rapidamente, sob agitação. Adicionam-se 15 ml de ácido acético glacial (ponto 6.2) e, de seguida, 1 ml de solução de iodeto de potássio (ponto 6.3). Tapa-se rapidamente, agita-se durante 1 minuto, e deixa-se durante exactamente 5 minutos na ausência de luz a uma temperatura de 15 a 20 °C.

Adicionam-se cerca de 75 ml de água destilada. Titula-se o iodo libertado com a solução de tiossulfato de sódio (ponto 6.4) (solução 0,002 N para valores presumidos inferiores a 12 e solução 0,01 N para valores presumidos superiores a 12), agitando vigorosamente e usando solução de amido (ponto 6.5) como indicador.

Fazem-se duas determinações com a mesma amostra.

Efectua-se simultaneamente um ensaio em branco. Se o resultado do ensaio em branco exceder 0,05 ml de solução de tiossulfato de sódio 0,01 N (ponto 6.4), substituem-se os reagentes impuros.

9.   EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

O índice de peróxidos (I.P.), expresso em miliequivalentes de oxigénio activo por kg, é dado pela fórmula:

onde:

V = é o número de mililitros de solução de tiossulfato de sódio (ponto 6.4) gasta no ensaio, com a correcção relativa ao ensaio em branco.

N = é a normalidade exacta da solução de tiossulfato de sódio utilizada.

m = é a massa, expressa em gramas, da toma de amostra em estudo.

Toma-se como resultado a média aritmética das duas determinações efectuadas.

▼M21

ANEXO IV

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CERAS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR

1.   OBJECTO

O presente método descreve um processo para a determinação do teor de ceras dos azeites. As ceras são separadas em função do número de átomos de carbono. O método pode ser utilizado, em particular, para distinguir o azeite obtido por pressão do azeite obtido por extracção (óleo de bagaço de azeitona).

2.   PRINCÍPIO

Após a adição de um padrão interno adequado, a gordura ou o óleo em causa é fraccionado por cromatografia numa coluna de silicagel hidratada. Recolher a fracção eluída em primeiro lugar nas condições de ensaio (fracção cuja polaridade é inferior à polaridade dos triglicéridos), procedendo-se à análise directa por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

3.   MATERIAL

4.   REAGENTES

5.   PROCEDIMENTO

5.1.   Preparação da coluna cromatográfica.

Suspender 15 g de silicagel (4.1) em n-hexano (4.2) e introduzir na coluna (3.2). Deixar assentar e completar a operação por recurso a um agitador eléctrico (3.5), de modo a tornar mais homogénea a camada cromatográfica. Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas. Utilizando a balança (3.8), pesar rigorosamente 500 mg de amostra num Erlenmeyer de 25 ml (3.1) e adicionar uma quantidade adequada de padrão interno (4.5), em função do teor de ceras previsto. A título de exemplo, juntar 0,1 mg de araquidato de laurilo no caso de azeite e 0,25 a 0,50 mg no caso de óleo de bagaço de azeitona. Transferir a amostra para a coluna cromatográfica com o auxílio de duas porções de 2 ml de n-hexano (4.2).

Deixar fluir o solvente até 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar 70 ml de n-hexano suplementares para remover os n-alcanos naturalmente presentes. Iniciar a eluição cromatográfica, recolhendo 180 ml da mistura n-hexano/éter etílico na proporção de 99:1, de acordo com um fluxo de cerca de 15 gotas por cada 10 segundos. A eluição da amostra deve ser efectuada a uma temperatura ambiente de 22 °C + 4.

Notas:

Evaporar a fracção resultante num evaporador rotativo (3.6), até à eliminação de quase todo o solvente. Remover os últimos 2 ml do mesmo com o auxílio de uma corrente de azoto de fluxo reduzido e adicionar 2-4 ml de n-heptano.

5.2.   Análise por cromatografia em fase gasosa

5.2.1.   Operações preliminares

Instalar a coluna no cromatógrafo de fase gasosa (3.3), ligando uma das extremidades ao sistema de injecção directa na coluna e a outra extremidade ao detector. Efectuar o controlo geral do sistema cromatográfico (operacionalidade dos circuitos de gases, eficiência do detector e do registador, etc.).

No caso de a coluna ser utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder ao seu acondicionamento. Fazer passar um fluxo ligeiro de gás através da coluna, ligando em seguida o sistema. Aquecer gradualmente até obter, ao fim de cerca de 4 horas, uma temperatura de 350 °C. Manter esta temperatura durante pelo menos duas horas, regulando seguidamente o aparelho para as condições de trabalho [regular o fluxo de gás, acender a chama, ligar o registador electrónico (3.3.4), regular a temperatura do forno para a coluna, regular o detector, etc.]. Registar o sinal obtido, com uma sensibilidade pelo menos duas vezes superior à sensibilidade prevista para a execução da análise. A linha de base deve apresentar-se linear e isenta de picos de qualquer tipo, não devendo apresentar desvios.

A ocorrência de um desvio linear negativo indica que as ligações da coluna não foram efectuadas de um modo correcto; a ocorrência de um desvio positivo indica que a coluna não foi acondicionada de um modo adequado.

5.2.2.   Escolha das condições de trabalho

As condições de trabalho são, em geral, as seguintes:

Estas condições podem ser ajustadas em função das características da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obter uma separação de todas as ceras, uma resolução satisfatória dos picos (ver figura) e um tempo de retenção do padrão interno C32 de 18 ± 3 minutos. O pico mais representativo correspondente às ceras deverá situar-se em pelo menos 60 % do início da escala.

Os parâmetros de integração dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das áreas dos picos pertinentes.

Nota:Atendendo à temperatura final elevada, é admissível um desvio positivo, que não pode exceder 10 % da base da escala.

5.3.   Execução da análise

Efectuar uma toma de 1 μl de solução com a microsseringa de 10 μl; manejar o êmbolo de modo a que a agulha não contenha nenhuma porção de amostra. Introduzir a agulha no sistema de injecção e injectar rapidamente após um a dois segundos. Retirar cuidadosamente a agulha após cerca de cinco segundos.

Efectuar o registo até à eluição completa das ceras.

A linha de base deve satisfazer sempre as condições requeridas.

5.4.   Identificação dos picos

A identificação dos picos é efectuada com base nos tempos de retenção que são comparados com os tempos de retenção conhecidos de misturas de ceras analisadas em condições idênticas.

A figura representa um cromatograma relativo às ceras de um azeite virgem.

5.5.   Avaliação quantitativa

Por recurso ao integrador, determinar as áreas dos picos correspondentes ao padrão interno e aos ésteres alifáticos C40 a C46.

Determinar o teor de cada um dos ésteres, expresso em mg/kg de gordura, através da fórmula:

Em que:

6.   EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das várias ceras de C40 a C46, expressos em mg/kg de gordura (ppm).

Nota:Os componentes a quantificar referem-se aos picos que correspondem a um número par de átomos de carbono (ésteres C40 a C46), de acordo com o exemplo de cromatograma das ceras de azeite indicado na figura seguinte. Se o éster C46 surgir em duplicado, para identificá-lo convém analisar a fracção das ceras de um óleo de bagaço de azeitona em que o pico C46 seja fácil de identificar por ser maioritário.

Os resultados arredondam-se às décimas.

Figura

Cromatograma das ceras de azeite ( 7 )

Legenda:

APÊNDICE

Determinação da velocidade linear do gás

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatógrafo de fase gasosa, regulado para as condições normais de trabalho, e medir o tempo requerido pelo gás para percorrer a coluna, desde o momento da injecção até ao registo do respectivo pico (tM).

A velocidade linear, expressa em centímetros por segundo, é dada por L/tM, sendo L o comprimento da coluna, expresso em centímetros, e tM o tempo de retenção, expresso em segundos.

▼M26

ANEXO V

DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E DO TEOR DE ESTERÓIS E DE DIÁLCOOIS TRITERPÉNICOS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR

1.   OBJETIVO

O método descreve um processo de determinação do teor de esteróis e de diálcoois triterpénicos, individuais e totais, de azeites e óleos de bagaço de azeitona.

2.   PRINCÍPIO DO MÉTODO

Saponificação do azeite ou óleo, adicionado de α-colestanol como padrão interno, com hidróxido de potássio em solução etanólica; em seguida, extração com éter etílico do insaponificável.

Separação da fração esterólica e de diálcoois triterpénicos, do extrato insaponificável, por cromatografia em camada fina realizada em placas de sílica-gel alcalinizadas. Conversão da fração recuperada do sílica-gel em éteres trimetilsilílicos. Análise dos éteres por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

3.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

4.   REAGENTES

5.   TÉCNICA

6.   EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

▼M28

▼M26

Apêndice

Determinação da velocidade linear do gás

Injetam-se 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatógrafo de fase gasosa, regulado para as condições de funcionamento normais, e cronometra-se o tempo gasto pelo gás para percorrer a coluna, entre o momento da injeção e o da saída do pico (tM).

A velocidade linear, em cm/s, é dada por L/tM, sendo L o comprimento da coluna, em centímetros, e tM o tempo cronometrado, em segundos.

Figura 1

Cromatograma de cromatografia em fase gasosa da fração esterólica e de diálcoois triterpénicos de um azeite lampante (com padrão interno)

Figura 2

Cromatograma de cromatografia em fase gasosa da fração esterólica e de diálcoois triterpénicos de um azeite refinado (com padrão interno)

Figura 3

Placa de cromatografia em camada fina de um óleo de bagaço de azeitona, com indicação da zona a raspar para determinação dos esteróis e dos diálcoois triterpénicos

▼M26 —————

▼B

O resultado é arredondado às décimas.

▼M21

ANEXO VII

DETERMINAÇÃO DA PERCENTAGEM DE MONOPALMITATO DE 2-GLICERILO

1.   OBJECTIVO E CAMPO DE APLICAÇÃO

O presente método descreve o procedimento analítico para a determinação da percentagem de ácido palmítico em posição 2 dos triglicéridos através da avaliação do monopalmitato de 2-glicerilo.

Este método é aplicável aos óleos vegetais líquidos à temperatura ambiente (20 °C).

2.   PRINCÍPIO

Após preparação, a amostra de azeite é sujeita à acção da lipase pancreática: uma hidrólise parcial e específica nas posições 1 e 3 da molécula de triglicérido determina a formação de monoglicéridos na posição 2. A percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo na fracção monoglicerídica é determinada, após sililação, por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

3.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

4.   REAGENTES

5.   PROCEDIMENTO

5.1.   Preparação da amostra

5.2.   Hidrólise com lipase pancreática

5.3.   Preparação dos derivados silanizados e da cromatografia em fase gasosa

5.4.   Cromatografia em fase gasosa

As condições de funcionamento são as seguintes:

5.4.1.   Identificação dos picos

Os monoglicéridos individuais são identificados em função dos respectivos tempos de retenção obtidos, comparando com os correspondentes a misturas-padrão de monoglicéridos analisadas mas mesmas condições.

5.4.2.   Avaliação quantitativa

A área referente a cada pico é calculada utilizando um integrador electrónico.

6.   EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Calcular a percentagem de monopalmitato de glicerilo com base na relação entre a área do respectivo pico e a soma das áreas dos picos de todos os monoglicéridos (ver figura 2), de acordo com a seguinte fórmula:

Glycéril monopalmitate (%):

Em que:

Os resultados arredondam-se às décimas.

7.   RELATÓRIO DA ANÁLISE

O relatório da análise deve especificar:

Figura 1

Cromatograma dos produtos da reacção de silanização obtidos pela acção da lipase num azeite refinado adicionado de 20 % de azeite esterificado (100 %).

[Key: «acides gras libres» = ácidos gordos livres; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = azeite refinado + 20 % azeite esterificado; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitoleína; «1-2 mono C18 insat.» = 1-2 mono C18 insaturado]

Figura 2

Cromatograma de:

A)

Azeite não esterificado, após tratamento com lipase; após silanização; nestas condições (coluna capilar de 8 a 12 m), a fracção de ceras é eluída ao mesmo tempo que a fracção de diglicéridos, ou pouco depois. Após lipase, o teor de triglicéridos não deve exceder 15 %. Legenda: 1 = Ácidos gordos livres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-Monopalmitina ** = Triglicérido C54

Cromatograma de:

B)

azeite esterificado após tratamento com lipase; após silanização; nestas condições (coluna capilar de 8 a 12 m), a fracção de ceras é eluída ao mesmo tempo que a fracção de diglicéridos ou pouco depois. Após lipase, o teor de triglicéridos não deve exceder 15 %. Legenda: 1 = Ácidos gordos livres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-Monopalmitina ** = Triglicérido C54

8.   NOTAS

PREPARAÇÃO DA LIPASE

Existem no comércio lipases com uma actividade satisfatória. Também é possível prepará-las no laboratório da forma seguinte:

Arrefecer 5 kg de pâncreas fresco de porco a 0 °C. Remover a matéria gorda sólida periférica, bem como o tecido conjuntivo, e triturar num almofariz de modo a obter um fluido pastoso. Agitar esta pasta durante 4 a 6 horas, em 2,5 l de acetona anidra, e centrifugar. Extrair o resíduo mais três vezes com o mesmo volume de acetona anidra e, seguidamente, extrair duas vezes com uma mistura de acetona e éter etílico na proporção de 1:1 (V/V). Por fim, extrair duas vezes com éter etílico.

Secar o resíduo sob vácuo durante 48 horas, de modo a obter um pó estável, que se conserva no frigorífico por um período prolongado, ao abrigo da humidade.

CONTROLO DA ACTIVIDADE DA LIPASE

Prepara-se uma emulsão de azeite do seguinte modo:

Agitar durante 10 minutos, num agitador, uma mistura de 165 ml de solução de goma arábica a 100g/l, 15 g de gelo triturado e 20 ml de azeite neutralizado.

Num copo de 50 ml, colocar sucessivamente 10 ml da emulsão, 0,3 ml de solução de colato de sódio a 0,2g/ml e 20 ml de água destilada.

Colocar o copo num termóstato regulado a 37 °C; introduzir os eléctrodos do medidor de pH e o agitador de hélice.

Com o auxílio de uma pipeta, adicionar gota a gota uma solução de hidróxido de sódio 0,1 N até ser atingido o valor de pH 8,3.

Juntar um volume de suspensão de pó de lipase em água (0,1 g/ml de lipase). No instante em que o medidor de pH indicar um valor de 8,3, accionar o cronómetro e adicionar a solução de hidróxido de sódio, gota a gota, ao ritmo necessário para manter um pH de 8,3. Anotar o volume de solução consumido por minuto.

Anotar as observações num sistema de eixos coordenados, em que as abcissas correspondem ao tempo e as ordenadas aos mililitros de solução alcalina 0,1 N consumidos para manter o pH constante. Deve obter-se um gráfico linear.

A actividade da lipase, medida em unidades de lipase por mg, é dada pela fórmula seguinte:

em que:

A unidade de lipase é definida como a quantidade de enzimas que permite libertar 10 miliequivalentes de ácido por minuto.

▼M20 —————

▼M28

ANEXO IX

ANÁLISE POR ESPETROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA

INTRODUÇÃO

A análise espetrofotométrica no ultravioleta pode fornecer indicações sobre a qualidade de uma matéria gorda, o estado de conservação desta e as modificações devidas aos processos tecnológicos a que foi sujeita. As absorvências nos comprimentos de onda especificados no método são devidas à presença de sistemas diénicos e triénicos conjugados, resultantes de processos de oxidação e/ou de práticas de refinação. Os valores destas absorvências são expressos em termos de extinção específica

– extinção de uma solução a 1 % (m/v) da matéria gorda no solvente prescrito, numa célula de 10 mm –, convencionalmente designada por K e também por «coeficiente de extinção».

1.   OBJETIVO

Este anexo descreve o processo de realização de análises espectrofotométricas no ultravioleta ao azeite.

2.   PRINCÍPIO DO MÉTODO

Dissolve-se uma amostra no solvente estabelecido e mede-se a absorvência da solução em relação ao solvente puro, nos comprimentos de onda prescritos.

Calculam-se as extinções específicas a 232 nm e 268 nm em iso-octano ou a 232 nm e 270 nm em ciclo-hexano, à concentração de 1 % (m/v), numa célula de 10 mm.

3.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

4.   REAGENTES

Salvo indicação em contrário, utilizam-se unicamente nas análises reagentes de qualidade analítica reconhecida e água destilada ou desmineralizada ou de pureza equivalente.

Solventes: iso-octano (2,2,4-trimetilpentano), para as medições a 232 nm e 268 nm, ou ciclo-hexano, para as medições a 232 nm e 270 nm, de absorvência inferior a 0,12 a 232 nm e inferior a 0,05 a 270 nm, comparativamente a água destilada, medida numa célula de 10 mm.

5.   TÉCNICA

6.   EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

ANEXO X

DETERMINAÇÃO DOS ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA

1.   OBJETIVO

Este anexo fornece orientações sobre a determinação por cromatografia em fase gasosa de ácidos gordos livres e ligados em matérias gordas vegetais, após conversão dos ácidos em ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME)

Convertem-se os ácidos gordos ligados dos triacilgliceróis e, dependendo do método de esterificação, os ácidos gordos livres em ésteres metílicos de ácidos gordos, que são determinados por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar.

O método descrito neste anexo permite determinar ésteres metílicos de ácidos gordos de C12 a C24, incluindo ésteres metílicos de ácidos gordos saturados, monoinsaturados cis e trans e poli-insaturados cis e trans.

2.   PRINCÍPIO

Determinam-se quantitativamente os ésteres metílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa. Preparam-se os ésteres de acordo com a parte A, após o que se injetam e vaporizam no injetor. Separam-se os ésteres em colunas analíticas de polaridade e comprimento específicos. Para detetar os ésteres, utiliza-se um detetor de ionização de chama. As condições analíticas são descritas na parte B.

O gás vetor (fase móvel) utilizado na cromatografia em fase gasosa de ésteres metílicos de ácidos gordos com detetor de ionização de chama é hidrogénio ou hélio. O hidrogénio acelera a separação e permite obter picos mais nítidos. A fase estacionária é uma camada microscópica constituída por um filme líquido fino numa superfície sólida inerte de sílica fundida.

À medida que percorrem a coluna capilar, os compostos volatilizados em análise interagem com a fase estacionária que reveste a superfície interior da coluna. Devido à interação diferente com os diversos compostos, estes eluem em tempos diferentes, constituindo cada um deles o tempo de retenção do composto em causa para a série de parâmetros analíticos considerada. Identifica-se cada composto por comparação do tempo de retenção correspondente.

PARTE A

PREPARAÇÃO DOS ÉSTERES METÍLICOS DOS ÁCIDOS GORDOS DO AZEITE E DO ÓLEO DE BAGAÇO DE AZEITONA

1.   OBJETIVO

Esta parte descreve a preparação dos ésteres metílicos de ácidos gordos. Compreende métodos para a preparação dos ésteres metílicos de ácidos gordos de azeites e de óleo de bagaço de azeitona.

2.   DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

Preparam-se os ésteres metílicos de ácidos gordos de azeites e de óleo de bagaço de azeitona por transesterificação à temperatura ambiente com solução metanólica de hidróxido de potássio. A necessidade de purificar a amostra antes da transesterificação depende do teor de ácidos gordos livres da amostra e do parâmetro analítico a determinar. A decisão pode ser tomada com base no quadro seguinte:

3.   MÉTODO

3.1.    Transesterificação à temperatura ambiente com solução metanólica de hidróxido de potássio

3.1.1.    Princípio

Formação dos ésteres metílicos por transesterificação com uma solução metanólica de hidróxido de potássio, como fase intermédia antes da saponificação.

3.1.2.    Reagentes

3.1.3.    Utensílios

3.1.4.    Purificação das amostras de azeite ou de óleo

Se necessário, purificam-se as amostras passando o azeite ou óleo por um cartucho de sílica-gel para extração em fase sólida. Coloca-se um cartucho de sílica-gel (3.1.2.8) num aparelho de eluição sob vazio e lava-se com 6 ml de hexano (3.1.2.2). A lavagem não é efetuada sob vazio. Introduz-se a seguir na coluna uma solução de aproximadamente 0,12 g do azeite ou óleo em 0,5 ml de hexano (3.1.2.2). Empurra-se e elui-se esta solução com 10 ml de hexano/éter dietílico na proporção 87:13 (v/v) (3.1.2.6). Combinam-se os eluatos, homogeneiza-se e divide-se o volume total em dois volumes semelhantes. Evapora-se um dos volumes até à secura, num evaporador rotativo, sob pressão reduzida, à temperatura ambiente. Dissolve-se o resíduo em 1 ml de heptano. A solução obtida está pronta para a análise dos ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa. Evapora-se o segundo volume e dissolve-se o resíduo em 1 ml de acetona, para a análise dos triacilgliceróis por HPLC, se necessário.

3.1.5.    Procedimento

Num tubo de ensaio com tampa de rosca de 5 ml (3.1.3.1), pesa-se aproximadamente 0,1 g da amostra de azeite ou óleo. Juntam-se 2 ml de heptano (3.1.2.2) e agita-se. Juntam-se 0,2 ml da solução metanólica de hidróxido de potássio (3.1.2.7), tapa-se com a tampa com junta de PTFE, fecha-se bem e agita-se energicamente durante 30 segundos. Deixa-se repousar até a parte superior da solução ficar límpida. Decanta-se a camada superior, que contém os ésteres metílicos. A solução de heptano está pronta para ser injetada no cromatógrafo de fase gasosa. É aconselhável manter esta solução no frigorífico até à análise cromatográfica. Não é recomendável guardar a solução durante mais de 12 horas.

PARTE B

ANÁLISE DOS ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA

1.   OBJETIVO

Esta parte fornece orientações gerais para a aplicação de um método cromatográfico em fase gasosa em coluna capilar na determinação da composição qualitativa e quantitativa de uma mistura de ésteres metílicos de ácidos gordos obtida pelo método descrito na parte A.

Não é aplicável a ácidos gordos polimerizados.

2.   REAGENTES

2.1.    Gás vetor

Gás inerte (hélio ou hidrogénio) bem seco e com teor de oxigénio inferior a 10 mg/kg.

2.2.    Gases auxiliares

2.3.    Padrão de referência

Mistura de ésteres metílicos de ácidos gordos puros ou os ésteres metílicos de uma matéria gorda de composição conhecida, de preferência semelhante à da matéria gorda a analisar. Os isómeros cis e trans dos ésteres metílicos dos ácidos octadecenóico, octadecadienóico e octadecatrienóico são úteis na identificação dos isómeros trans de ácidos insaturados.

É necessário tomar precauções para evitar a oxidação dos ácidos gordos poli-insaturados.

3.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

As instruções fornecidas referem-se ao equipamento vulgarmente utilizado em cromatografia em fase gasosa com coluna capilar e detetor de ionização de chama.

3.1.    Cromatógrafo de fase gasosa

Elementos do cromatógrafo de fase gasosa:

3.1.1.    Sistema de injeção

Sistema de injeção especialmente concebido para colunas capilares. Pode ser com divisão de fluxo (tipo «split») ou sem divisão de fluxo e com injeção direta na coluna (tipo «on-column»).

3.1.2.    Forno

Forno capaz de aquecer a coluna capilar a, pelo menos, 260 °C e de manter a temperatura desejada com uma aproximação de 0,1 °C. Este último requisito é especialmente importante quando se utiliza um tubo de sílica fundida.

Recomenda-se em todos os casos o uso de aquecimento com programação de temperatura, particularmente para ácidos gordos com menos de 16 átomos de carbono.

3.1.3.    Coluna capilar

3.1.4.    Detetor de ionização de chama e conversor-amplificador.

3.2.    Seringa

A capacidade máxima da seringa é de 10 μl, graduados em intervalos de 0,1 μl.

3.3.    Sistema de aquisição de dados

Sistema de aquisição de dados ligado em linha com os detetores, dispondo de um programa adequado para a normalização e integração dos picos.

4.   TÉCNICA

As operações descritas nos pontos 4.1 a 4.3 associam-se à utilização de um detetor de ionização de chama.

4.1.    Condições operatórias

4.1.1.    Escolha das condições operatórias ótimas de colunas capilares

As propriedades de eficiência e permeabilidade das colunas capilares tornam a separação dos componentes e a duração das análises fortemente dependentes do caudal do gás vetor na coluna. É, portanto, necessário otimizar as condições operatórias regulando este parâmetro (ou, mais simplesmente, a perda de carga na coluna) consoante se pretenda melhorar a separação ou acelerar a análise.

As condições a seguir indicadas revelaram-se adequadas para separar ésteres metílicos de ácidos gordos (C4 a C26). Apresentam-se exemplos de cromatogramas no apêndice B.

4.1.2.    Determinação da resolução (ver o apêndice A)

Calcula-se a resolução, R, de dois picos vizinhos, I e II, do seguinte modo:

R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) ou R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (Farmacopeia dos Estados Unidos da América)

ou

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) (Farmacopeia Europeia, Farmacopeia Britânica, Farmacopeia Japonesa, Farmacopeia Alemã),

em que:

Se ω(I) ≈ ω(II), calcula-se R do seguinte modo:

R = (dr ( II ) – d r(I))/ω = (dr ( II ) – d r(I))/4σ

em que:

σ é o desvio-padrão (ver a figura 1 do apêndice A).

Se a distância entre os dois picos, d r = d r(II) - d r(I), for igual a 4σ, o fator de resolução R é igual a 1.

Se os dois picos não estiverem completamente separados, as tangentes ao ponto de inflexão de cada pico intersetam-se no ponto C. A separação completa dos picos exige que a distância entre eles seja igual a:

d r(II) - d r(I) = 6 σ e, consequentemente, R = 1,5 (ver a figura 3 do apêndice A).

5.   EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

5.1.    Análise qualitativa

Identificam-se os picos correspondentes aos ésteres metílicos da amostra a partir do cromatograma ilustrado na figura 1 do apêndice B, se necessário por interpolação, ou por comparação com os picos de misturas de referência de ésteres metílicos (como é referido no ponto 2.3).

5.2.    Análise quantitativa

5.2.1.    Determinação da composição

Calcula-se a fração mássica, w i , de ésteres metílicos de cada ácido gordo, expressa em percentagem mássica de ésteres metílicos, do seguinte modo:

5.2.2.    Método de cálculo

5.2.2.1.   Caso geral

Determinando a percentagem correspondente ao quociente entre a área do pico em causa e a soma das áreas de todos os picos, calcula-se do seguinte modo o teor de um componente i expresso em percentagem mássica de ésteres metílicos:

wi = (Ai/ΣA) × 100

em que:

Os resultados são arredondados às centésimas.

5.2.2.2.   Fatores de correção

Em certos casos, por exemplo na presença de ácidos gordos com menos de oito átomos de carbono ou de ácidos com grupos secundários, é necessário corrigir as áreas aplicando fatores de correção específicos (Fci), determinados para cada instrumento. Para isso, utilizam-se materiais de referência adequados, com uma composição certificada de ácidos gordos na gama de composições em causa.

Para a mistura de referência, a percentagem mássica de ésteres metílicos do ácido gordo i é calculada do seguinte modo:

wi = (mi /Σm) × 100

em que:

A partir do cromatograma da mistura de referência, calcula-se a percentagem (área/área) correspondente aos ésteres metílicos do ácido gordo i do seguinte modo:

wi = (Ai/ΣA) × 100

em que:

O fator de correção, Fc, é calculado do seguinte modo:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

No caso da amostra, a percentagem mássica de ésteres metílicos do ácido gordo i é calculada do seguinte modo:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Os resultados são arredondados às centésimas.

5.2.2.3.   Padrão interno

Em algumas análises (por exemplo quando nem todos os ácidos gordos são quantificados, o que acontece quando estão presentes ácidos com 4 e 6 átomos de carbono e ácidos com 16 e 18 átomos de carbono, ou quando é necessário determinar a quantidade absoluta de um ácido gordo numa amostra) é preciso utilizar um padrão interno. Para isso, recorre-se frequentemente aos ácidos gordos com 5, 15 ou 17 átomos de carbono. Se necessário, determina-se o fator de correção relativo ao padrão interno.

A percentagem mássica do componente i, expresso em ésteres metílicos, é calculada do seguinte modo:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

em que:

Os resultados são arredondados às centésimas.

6.   RELATÓRIO DO ENSAIO

O relatório deve especificar os métodos utilizados na preparação dos ésteres metílicos e na análise cromatográfica em fase gasosa. Deve mencionar igualmente todas as condições operatórias não especificadas neste método normalizado ou consideradas opcionais, assim como todas as ocorrências que possam ter influenciado os resultados.

O relatório do ensaio tem de conter todas as indicações necessárias para a completa identificação da amostra.

7.   PRECISÃO

7.1.    Resultados do estudo interlaboratorial

O anexo C da norma IOC/T.20/Doc. n.o 33 dá pormenores sobre um estudo interlaboratorial relativo à precisão do método. Os valores decorrentes desse estudo podem não ser aplicáveis a gamas de concentração e matrizes diferentes das indicadas.

7.2.    Repetibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados independentes, obtidos pelo mesmo método, com o mesmo material em estudo, no mesmo laboratório e pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento num curto intervalo de tempo, não deve exceder em mais de 5 % dos casos o valor r indicado no anexo C, quadros 1 a 14, da norma IOC/T.20/Doc. n.o 33.

7.3.    Reprodutibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados, obtidos pelo mesmo método, com o mesmo material em estudo, em laboratórios diferentes e por operadores diferentes, utilizando equipamento diferente, não deve exceder em mais de 5 % dos casos o valor R indicado no anexo C, quadros 1 a 14, da norma IOC/T.20/Doc. n.o 33.

Apêndice A

Figura 1

ω0,5 é a largura a meia altura do triângulo ABC; b é a largura a meia altura do triângulo NPM.

Apêndice B

Figura 1

Perfil cromatográfico em fase gasosa de um óleo de bagaço de azeitona, após aplicação do método de metilação a frio.

Salvo indicação em contrário, os picos cromatográficos correspondem aos ésteres metílicos e etílicos.

▼B

ANEXO XI

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE SOLVENTES HALOGENADOS VOLÁTEIS NO AZEITE

1.   FUNDAMENTO

Análise por cromatografia em fase gasosa segundo a técnica do espaço de cabeça.

2.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.   REAGENTES

4.   TÉCNICA

▼M26

ANEXO XII

MÉTODO DO CONSELHO OLEÍCOLA INTERNACIONAL PARA A AVALIAÇÃO ORGANOLÉPTICA DE AZEITES VIRGENS

▼M28

1.   OBJETIVO E DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

O método internacional descrito neste anexo visa estabelecer o procedimento de avaliação das características organoléticas dos azeites virgens, na aceção do anexo VII, parte VIII, ponto 1, do Regulamento (UE) n.o 1308/2013 do Parlamento Europeu e do Conselho ( 8 ), bem como o método de classificação desses azeites com base em tais características. Inclui igualmente indicações relativas a determinados aspetos facultativos de rotulagem.

O método descrito só é aplicável aos azeites virgens e à classificação ou rotulagem dos mesmos em função da intensidade dos defeitos detetados e do frutado, determinada por um júri constituído por um grupo de provadores selecionados, treinados e supervisionados.

Remete-se para a última versão disponível das normas do COI referidas neste anexo.

▼M26

2.   VOCABULÁRIO BÁSICO GERAL DOS EXAMES ORGANOLÉPTICOS

Ver a norma IOC/T.20/Doc. No 4 «Sensory Analysis: General Basic Vocabulary».

3.   VOCABULÁRIO ESPECÍFICO

3.1.    Atributos negativos

▼M28

3.1.1.    Outros atributos negativos

3.2.    Atributos positivos

3.3.    Terminologia facultativa para efeitos de rotulagem

Se lhe for solicitado, o presidente do júri pode certificar que os azeites avaliados satisfazem as definições e intervalos correspondentes aos adjetivos seguintes, em função da intensidade e perceção dos atributos:

Atributos positivos (frutado, amargo e picante), em função da intensidade de perceção:

▼M26

4.   COPO PARA PROVA DE AZEITES

Ver a norma IOC/T.20/Doc. No 5, «Glass for Oil Tasting».

5.   SALA DE PROVA

Ver a norma IOC/T.20/Doc. No 6, «Guide for the Installation of a Test Room».

6.   ACESSÓRIOS

Acessórios necessários em cada cabina de prova para que os provadores possam exercer a sua função corretamente (devem estar ao alcance do provador):

7.   PRESIDENTE DO JÚRI E PROVADORES

7.1.    Presidente do júri

O presidente do júri deve ter recebido uma formação adequada e ser conhecedor e um perito experiente nos tipos de azeite que se lhe deparem na função. É o elemento central do júri, sendo responsável pela organização e pelo funcionamento deste.

O trabalho do presidente do júri exige formação de base nos instrumentos dos exames organolépticos, sentidos apurados para estes exames e a capacidade de os preparar, organizar e realizar meticulosamente, assim como habilidade e paciência para planear e realizar os exames segundo bases científicas.

O presidente do júri é o único responsável pela seleção, formação e supervisão dos provadores, para que estes mantenham um nível de aptidão adequado. É, portanto, responsável pela avaliação dos provadores, que deve ser sempre objetiva e para a qual deve estabelecer procedimentos próprios baseados na experimentação, bem como critérios fundamentados de aceitação e rejeição. Ver a norma IOC/T.20/Doc. No 14, «Guide for the selection, training and monitoring of skilled virgin olive oil tasters».

O presidente do júri é responsável pelo desempenho do júri e, portanto, pela avaliação por este efetuada, da qual deve apresentar provas fiáveis e objetivas. Compete-lhe estar sempre em condições de demonstrar que o método e os provadores estão sob controlo. É recomendável proceder a uma calibração periódica do júri (IOC/T.20/Doc. No 14, § 5).

O presidente do júri é o principal responsável pela manutenção de registos do funcionamento do júri, que devem ser sempre rastreáveis. Os registos devem respeitar as exigências de segurança e qualidade estabelecidas nas normas internacionais de exames organolépticos e salvaguardar o anonimato das amostra em todas as circunstâncias.

O presidente do júri é responsável pela inventariação dos utensílios e equipamentos necessários para satisfazer as especificações do presente método, bem como pela adequada limpeza e manutenção dos mesmos, cabendo-lhe conservar prova escrita disso e da observância das condições estabelecidas para a realização das provas.

Compete ao presidente do júri a receção das amostras e a armazenagem das mesmas no laboratório, antes e depois de examinadas. Cabe-lhe garantir que as amostras se mantêm anónimas e são adequadamente armazenadas, devendo estabelecer por escrito os procedimentos necessários para salvaguardar a rastreabilidade e a garantia do processo.

É igualmente responsável pela preparação e codificação das amostras e pela apresentação destas aos provadores segundo um plano de provas adequado, consentâneo com o protocolo preestabelecido, bem como pela recolha e tratamento estatístico dos dados obtidos pelos provadores.

Compete igualmente ao presidente do júri definir e redigir qualquer outro procedimento necessário para complementar o presente método e para assegurar o correto funcionamento do júri.

Compete-lhe ainda procurar maneiras de comparar os resultados do seu júri com os resultados obtidos por outros júris que analisam azeites virgens, para se certificar de que o primeiro está a funcionar corretamente.

O presidente do júri tem o dever de motivar os provadores, incentivando o interesse, a curiosidade e o espírito de competição entre eles. Para isso, recomenda-se vivamente que assegure um intercâmbio fluido de informação com os provadores, mantendo-os informados acerca das tarefas que a estes compete desempenhar, assim como dos resultados obtidos. Deve ainda garantir que a sua opinião não é conhecida e evitar que determinados provadores, que assumam um papel de liderança, condicionem os restantes sobrepondo-lhes os seus critérios.

O presidente do júri deve convocar os provadores com antecedência suficiente e responder a todas as perguntas relativas à realização dos exames, mas deve abster-se de fazer transparecer qualquer opinião sua sobre as amostras.

▼M28

7.1.1.    Presidente suplente do júri

O presidente do júri pode, por motivo justificado, ser substituído por um presidente suplente em tarefas relacionadas com a realização dos exames organoléticos, o qual deve ter todas as aptidões exigidas ao presidente do júri.

▼M28

7.2.    Provadores

As pessoas que assumam a função de provadores em exames organoléticos de azeites devem fazê-lo voluntariamente. É, portanto, recomendável que os interessados apresentem uma candidatura escrita. Os candidatos devem ser selecionados, formados e supervisionados pelo presidente do júri em função das aptidões que revelem para distinguir amostras semelhantes. Importa ter presente que o rigor dos provadores melhora com formação.

Os provadores devem comportar-se como efetivos observadores sensoriais, pondo de parte os seus gostos pessoais e dando conta unicamente das sensações que sintam. Para isso, devem trabalhar em silêncio, relaxados e sem pressas, concentrando-se ao máximo, em termos sensoriais, na amostra que estão a provar.

Para cada exame, são necessários 8 a 12 provadores. É prudente manter uma reserva de provadores, para acautelar eventuais ausências.

▼M26

8.   CONDIÇÕES DE REALIZAÇÃO DOS EXAMES

8.1.    Apresentação da amostra

As amostras de azeite a examinar devem ser apresentadas em copos de prova normalizados conformes com a norma IOC/T.20/Doc. No 5, «Glass for oil tasting».

Cada copo deve conter 14 ml a 16 ml de azeite – ou 12,8 g a 14,6 g, se as amostras forem pesadas – e ser tapado com um vidro de relógio.

Cada copo deve ser marcado com um código constituído por algarismos ou por uma combinação alfanumérica, em qualquer dos casos aleatória, recorrendo a um sistema de marcação inodoro.

8.2.    Temperatura de realização dos exames e temperatura das amostras

As amostras de azeite a provar devem permanecer nos copos durante todo o exame à temperatura de 28 °C ± 2 °C. Foi escolhida esta temperatura porque se torna mais fácil apreciar diferenças organolépticas do que à temperatura ambiente e porque, a temperaturas mais baixas, os compostos odoríferos peculiares dos azeites se volatilizam pouco, ao passo que a temperaturas mais elevadas se formam os compostos voláteis peculiares dos óleos aquecidos. Relativamente ao método a seguir para aquecer as amostras no copo, ver a norma IOC/T.20/Doc. No 5, «Glass for Oil Tasting».

A temperatura da sala de provas deve estar compreendida entre 20 °C e 25 °C (ver a norma IOC/T.20/Doc. No 6).

8.3.    Períodos para a realização das provas

O período da manhã é o melhor para provar azeites. Está demonstrado que, ao longo do dia, há períodos ótimos de perceção de sabores e odores. Antes das refeições, aumenta a sensibilidade olfativa e gustativa, que diminui a seguir.

Todavia, este critério não deve ser levado ao extremo de a fome distrair os provadores, ao ponto de diminuir a capacidade discriminatória destes. Recomenda-se, portanto, que as sessões de prova decorram entre as 10h00 e as 12h00.

8.4.    Regras gerais de conduta dos provadores

Segue-se uma série de recomendações relativamente à conduta dos provadores no exercício da sua atividade.

Uma vez convocados pelo presidente do júri para participar num exame organoléptico, os provadores devem poder comparecer à hora marcada e respeitar as seguintes condições:

9.   AVALIAÇÃO ORGANOLÉPTICA E CLASSIFICAÇÃO DE AZEITES VIRGENS

9.1.    Técnica de prova

9.2.    Utilização da folha de perfil pelos provadores

A folha de perfil a utilizar pelos provadores constitui a figura 1 do presente anexo.

Cada provador do júri deve cheirar e depois provar ( 9 ) o azeite em causa. Em seguida, cada provador deve inscrever a intensidade com que sente cada atributo negativo ou positivo na escala de 10 cm que figura na folha de perfil que lhe foi fornecida.

Se um provador detetar algum atributo negativo não previsto na secção 4, deve indicar esse atributo na rubrica «outros», utilizando o termo ou termos que mais rigorosamente o descreva(m).

▼M28

9.3.    Utilização dos dados pelo presidente do júri

O presidente do júri deve recolher as folhas de perfil preenchidas por cada provador e verificar as intensidades imputadas aos diferentes atributos. Se detetar alguma anomalia, deve solicitar ao provador que reveja a folha de perfil e, se necessário, que repita o exame.

O presidente do júri deve introduzir os dados de cada provador num programa informático como o previsto na norma IOC/T.20/Doc. n.o 15, tendo em vista o cálculo estatístico dos resultados do exame, baseados no cálculo das medianas. Ver o ponto 9.4 e o apêndice do presente anexo. A introdução dos dados respeitantes a cada amostra deve ser efetuada por recurso a uma matriz de nove colunas — correspondentes aos nove atributos sensoriais — e n linhas — correspondentes aos n provadores do júri.

Se, pelo menos, 50 % dos provadores detetarem um defeito e o inscreverem na rubrica «outros», o presidente do júri deve calcular a mediana desse defeito e determinar a classificação correspondente.

O valor do coeficiente de variação robusto que define a classificação (defeito com a maior intensidade e atributo frutado) deve ser igual ou inferior a 20 %.

Caso contrário, o presidente do júri deve repetir a avaliação da amostra em causa noutra sessão de prova.

Se isto ocorrer com frequência, é recomendável que o presidente do júri faculte aos provadores formação adequada (IOC/T.20/Doc. n.o 14, § 5) e que utilize o índice de repetibilidade e o índice de desvio para aferir do desempenho do júri (IOC/T.20/Doc. n.o 14, § 6).

9.4.    Classificação do azeite

O azeite é classificado nas categorias seguintes, em função da mediana dos defeitos e da mediana do atributo «frutado». Entende-se por «mediana dos defeitos» a mediana do defeito a que tenha sido atribuída a intensidade mais elevada. A mediana dos defeitos e a mediana do atributo «frutado» são expressas com uma casa decimal.

Classifica-se um azeite por comparação do valor da mediana dos defeitos e da mediana do atributo «frutado» com os intervalos de referência a seguir indicados. Dado que os limites dos intervalos foram estabelecidos tendo em conta o erro do método, são considerados absolutos. Os programas informáticos permitem visualizar a classificação num quadro de dados estatísticos ou num gráfico.

No caso de análises efetuadas no âmbito de verificações de conformidade, é realizado um exame. No caso de contra-análises, compete ao presidente do júri providenciar a realização das mesmas em duplicado, em duas sessões, calculando-se a mediana dos atributos com base nos dados constantes das folhas de perfil de ambos os exames.

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Apêndice

Método de cálculo da mediana e dos intervalos de confiança

Mediana

Define-se «mediana» como o número real Xm caracterizado pelo facto de a probabilidade (p) de os valores da distribuição (X) serem inferiores a esse número (Xm) ser igual ou inferior a 0,5 e, simultaneamente, de a probabilidade (p) de os valores da distribuição (X) serem iguais ou inferiores a Xm ser igual ou superior a 0,5. Uma definição mais prática é ser a mediana o percentil 50 de uma distribuição de números ordenados por ordem crescente. Por outras palavras, a mediana representa o valor central de uma série ordenada de números ímpares ou a média dos dois valores centrais de uma série ordenada de números pares.

Desvio-padrão robusto

Para se obter uma estimativa fiável da variabilidade em redor da mediana, torna-se necessário estimar o desvio-padrão robusto de Stuart e Kendall (4). A fórmula do desvio-padrão robusto assimptótico, isto é, a estimativa robusta da variabilidade dos dados considerados, em que N é o número de observações e IQR é o intervalo interquartílico, que abrange exatamente 50 % dos casos de uma distribuição de probabilidade, é a seguinte:

Para calcular o intervalo interquartílico, determina-se a grandeza da diferença entre o percentil 75 e o percentil 25.

O percentil é o valor Xpc caracterizado pelo facto de a probabilidade (p) de os valores da distribuição serem inferiores a Xpc ser igual ou inferior a um determinado centésimo e, simultaneamente, de a probabilidade (p) de os valores da distribuição serem iguais ou inferiores a Xpc ser igual ou superior a esse centésimo. O centésimo indica o quantil considerado da distribuição. No caso da mediana, o quantil é de 50/100.

Para efeitos práticos, o percentil é o valor de distribuição correspondente a uma área determinada, delimitada pela curva de distribuição ou de densidade. A título de exemplo, o percentil 25 representa o valor de distribuição correspondente a uma área igual a 0,25 ou 25/100.

Neste método, determinam-se os percentis com base nos valores reais que figuram na matriz de dados (método de cálculo informatizado de percentis).

Coeficiente de variação percentual robusto

O CVr% é um número adimensional que indica a percentagem de variabilidade da série de números analisada. É, por isso, muito útil para verificar a fiabilidade dos membros de um júri.

Intervalos de confiança a 95 % da mediana

Os intervalos de confiança a 95 % (valor do erro de primeira espécie igual a 0,05 ou 5 %) representam o intervalo no qual o valor da mediana poderia variar, na hipótese de a experiência poder ser repetida um número infinito de vezes. Na prática, este intervalo indica o intervalo de variabilidade do ensaio nas condições de trabalho consideradas, na hipótese de aquele poder ser repetido muitas vezes. Tal como o CVr%, este intervalo ajuda a avaliar a fiabilidade do ensaio.

em que, no caso do intervalo de confiança a 95 %, c é igual a 1,96.

A norma IOC/T 20/Doc. No 15 apresenta um exemplo da folha de cálculo no seu anexo I.

Referências

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

ANEXO XV

1.   TEOR DE ÓLEO DO BAGAÇO DE AZEITONA

1.1.   Aparelhos e utensílios

1.2.   Reagentes

n-Hexano técnico cujo resíduo, na evaporação completa, deve ser inferior a 0,002 g por 100 ml.

2.   TÉCNICA

2.1.   Preparação da amostra para análise

Tritura-se a amostra para laboratório, se necessário, num triturador mecânico previamente bem limpo a fim de a reduzir a partículas que possam atravessar completamente o peneiro.

Utiliza-se cerca de um vigésimo da amostra para perfazer a limpeza do triturador, deita-se essa parte fora, tritura-se o restante que se recolhe, mistura-se com cuidado e analisa-se sem demora.

2.2.   Toma

Pesa-se com uma precisão de 0,01 g, logo após o final da trituração, uma toma para análise com aproximadamente 10 g.

2.3.   Preparação do cartucho de extracção

Coloca-se a toma no cartucho e tapa-se este com o tampão de algodão hidrófilo. No caso de se ter utilizado um filtro de papel, embala-se a moedura nesse papel.

2.4.   Pré-secagem

Se o bagaço estiver muito húmido (teor de água e de matérias voláteis superior a 10 %) efectua-se uma pré-secagem colocando durante um espaço de tempo conveniente o cartucho cheio (ou filtro de papel) na estufa aquecida a 80 °C, no máximo, para reduzir o teor de água e de matérias voláteis a menos de 10 %.

2.5.   Preparação do balão

Pesa-se, com uma precisão de 1 mg, o balão contendo 1 a 2 grãos de pedra-pomes, previamente seco na estufa a 103 °C ± 2 °C e depois arrefecido durante pelo menos uma hora num exsicador.

2.6.   Primeira extracção

Coloca-se no aparelho de Soxhlet o cartucho (ou filtro de papel) que contém a toma. Verte-se para o balão a quantidade necessária de hexano. Adapta-se o balão ao aparelho de Soxhlet, coloca-se o conjunto sobre um banho com aquecimento eléctrico. Regula-se o aquecimento em condições tais que o refluxo seja pelo menos de três gotas por segundo (ebulição moderada, não tumultuosa).

Após quatro horas de extracção, deixa-se arrefecer. Tira-se o cartucho do aparelho de Soxhlet e coloca-se numa corrente de ar a fim de eliminar a maior parte do solvente que o impregna.

2.7.   Segunda extracção

Despeja-se o cartucho no microtriturador e tritura-se o mais possível. Volta-se a colocar quantitativamente a mistura no cartucho e este no aparelho de Soxhlet.

Recomeça-se a extracção ainda durante duas horas utilizando o mesmo balão que contém a primeira extracção.

A solução obtida no balão de extracção deve ser límpida. Se o não for, filtra-se por filtro de papel lavando várias vezes o primeiro balão e o filtro com hexano. Recolhe-se o filtrado e o solvente de lavagem num segundo balão previamente seco e pesado com uma precisão de 1 mg.

2.8.   Eliminação do solvente e pesagem do extracto

Expulsa-se, por destilação sobre banho de aquecimento eléctrico, a maior parte do solvente. Eliminam-se os últimos vestígios de solvente aquecendo o balão na estufa a 103 °C ± 2 °C durante 20 minutos. Facilita-se esta eliminação quer insuflando ar de vez em quando ou de preferência um gás inerte quer submetendo-o a pressão reduzida.

Deixa-se arrefecer o balão num exsicador durante pelo menos uma hora e pesa-se com uma precisão de 1 mg.

Volta-se a aquecer durante 10 minutos nas mesmas condições, arrefece-se no exsicador e pesa-se.

A diferença entre os resultados destas duas pesagens deve ser inferior ou igual a 10 mg. Se não, volta-se a aquecer durante períodos de dez minutos, seguidos de arrefecimento e de pesagem, até que a diferença de massa seja no máximo igual a 10 mg. Tenha-se em consideração a última pesagem do balão.

Efectuam-se duas determinações na mesma amostra para análise.

3.   EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

3.1.   Cálculos

Toma-se como resultado a média aritmética de duas determinações se as condições de repetibilidade estiverem prenchidas.

O resultado exprime-se arredondado às décimas.

3.2.   Repetibilidade

A diferença entre os resultados das duas determinações, efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma após a outra pelo mesmo analista, não deve ser superior a 0,2 g de extracto com hexano para 100 g de amostra.

No caso contrário, repete-se a análise com outras duas tomas. Se ainda desta vez a diferança ultrapassar 0,2 g, toma-se como resultado a média aritmética das quatro determinações efectuadas.

ANEXO XVI

DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE IODO

1.   OBJECTIVO

Determinação do índice de iodo de óleos e gorduras animais e vegetais, a seguir denominados gorduras.

2.   DEFINIÇÃO

No final da presente norma internacional, aplicar-se-á a seguinte definição:

3.   RESUMO DO PROCESSO

Dissolução de uma toma de amostra num solvente seguida da adição de reagente de Wijs. Após um intervalo de tempo determinado, adição de solução de iodeto de potássio e água, titulação do iodo libertado com uma solução de tiossulfato de sódio.

4.   REAGENTES

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida.

5.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

Material de uso corrente em laboratório, nomeadamente o seguinte:

6.   PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE

A amostra homogeneizada é seca com sulfato de sódio e filtrada.

7.   TÉCNICA

8.   EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

O índice de iodo é dado pela expressão:

onde:

c = representa a concentração exacta, expressa em moles por litro, de solução titulada de tiossulfato de sódio (ponto 4.3) utilizada.

V1 = representa o volume, expresso em mililitros, da solução titulada de tiossulfato de sódio (ponto 4.3) gasto no ensaio em branco.

V2 = representa o volume, expresso em mililitros, da solução titulada de tiossulfato de sódio (ponto 4.3) gasto na determinação.

m = representa a massa, expressa em gramas, da toma (ponto 7.1).

Considera-se como resultado a média aritmética das duas determinações, desde que as exigências de repetibilidade (ponto 11.2) sejam satisfeitas.

▼M11

ANEXO XVII

MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DE ESTIGMASTADIENOS EM ÓLEOS VEGETAIS

1.   OBJECTIVO

Determinação de estigmastadienos em óleos vegetais que contenham concentrações reduzidas destes hidrocarbonetos, nomeadamente azeites virgens e óleos de bagaço de azeitona.

2.   ÂMBITO

O método é aplicável a todos os óleos vegetais, embora as determinações apenas sejam fiáveis nos casos em que o teor de hidrocarbonetos em causa esteja compreendido entre de 0,01 e 4,0 mg/kg. O método é particularmente adequado para detectar a presença de óleos vegetais refinados (azeite, óleo de bagaço de azeitona, óleo de girassol, óleo de palma, etc.) em azeites virgens, uma vez que, contrariamente a estes últimos, os azeites refinados contêm estigmastadienos.

3.   PRINCÍPIO

Isolamento da matéria insaponificável, seguido de separação da fracção que contém hidrocarbonetos esteróides por cromatografia em coluna de silicagel e análise por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

4.   EQUIPAMENTO

5.   REAGENTES

Salvo indicação em contrário, todos os reagentes devem ser de qualidade analítica. Deve utilizar-se água destilada ou de grau de pureza equivalente.

6.   PROCEDIMENTO

6.1.   Preparação da matéria insaponificável:

6.2.   Separação da fracção que contém hidrocarbonetos esteróides:

6.3.   Cromatrografia em fase gasosa:

Figura 1

Cromatogramas obtidos na análise de amostras de azeite com uma coluna capilar de sílica fundida (0,25 mm de diâmetro interno e 25 m de comprimento), revestida com uma película de fenilmetilsilicone a 5 % de 0,25 mm de espessura.

Figura 2

Cromatogramas obtidos na análise de uma amostra de azeite refinado com uma coluna DB-5, em que se observa o pico correspondente ao isómero do estigmasta-3,5-dieno.

▼M25

ANEXO XVIII

DETERMINAÇÃO DA DIFERENÇA ENTRE O TEOR REAL E O TEOR TEÓRICO DE TRIACILGLICERÓIS COM NCE42

1.   OBJETIVO

Determinação da diferença absoluta entre os valores experimentais de triacilgliceróis com número de átomos de carbono equivalente 42, determinados no azeite ou óleo por cromatografia de alta eficiência em fase líquida (NCE42HPLC), e o valor teórico de triacilgliceróis com número de átomos de carbono equivalente 42 (NCE42teórico), calculado a partir da composição de ácidos gordos.

2.   DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

O presente método é aplicável aos azeites e óleos de bagaço de azeitona. O método é aplicável à pesquisa de pequenas quantidades de óleos de sementes (ricos em ácido linoleico) em todas as categorias de azeites e óleos de bagaço de azeitona.

3.   PRINCÍPIO

Nos azeites e óleos de bagaço de azeitona genuínos, o teor de triacilgliceróis com NCE42 determinado por HPLC e o teor teórico de triacilgliceróis com NCE42 (calculado a partir da composição de ácidos gordos determinada por cromatografia gás-líquido) equivalem-se, dentro de certos limites. Diferenças superiores às adotadas para cada categoria de azeite ou óleo de bagaço de azeitona indicam que o azeite ou óleo de bagaço de azeitona em questão contém óleos de sementes.

4.   MÉTODO

O método de cálculo do teor teórico de triacilgliceróis com NCE42 e da diferença entre este e o valor obtido por HPLC assenta essencialmente na coordenação de dados analíticos obtidos por outros métodos. Podem distinguir-se três etapas: determinação da composição de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar; cálculo da composição teórica de triacilgliceróis com NCE42; determinação do teor de triacilgliceróis com NCE42 por HPLC.

4.1.    Aparelhos e utensílios

4.2.    Reagentes

Os reagentes devem ser de qualidade analítica. Os solventes de eluição devem estar isentos de gases e podem ser reutilizados várias vezes sem prejuízo para as separações.

4.3.    Preparação das amostras

Dado que há várias substâncias interferentes que podem gerar falsos positivos, as amostras devem ser sempre purificadas de acordo com o método IUPAC 2507, utilizado na determinação de compostos polares em gorduras de fritura.

4.3.1.    Preparação da coluna cromatográfica

Encher a coluna (4.1.3) com cerca de 30 ml de solvente de eluição (4.2.3). Introduzir um pouco de fibra de vidro (4.2.5), empurrando-a até ao fundo da coluna com a vareta (4.1.5).

Preparar, num copo de 100 ml, uma suspensão de 25 g de sílica-gel (4.2.4) em 80 ml da mistura de eluição (4.2.3). Transferir a suspensão para a coluna utilizando o funil de vidro (4.1.6).

Para garantir a transferência completa do sílica-gel para a coluna, lavar várias vezes o copo com a mistura de eluição e transferir o líquido de lavagem para a coluna.

Abrir a torneira da coluna e deixar escoar o solvente de eluição até que o nível deste desça até 1 cm acima do leito de sílica-gel.

4.3.2.    Cromatografia em coluna

Num balão aferido de 50 ml (4.1.7), pesar, com a aproximação de 0,001 g, 2,5 g ± 0,1 g de azeite ou óleo filtrado, homogeneizado e, se necessário, desidratado.

Diluir com cerca de 20 ml de solvente de eluição (4.2.3). Se necessário, aquecer ligeiramente para facilitar a dissolução. Arrefecer até à temperatura ambiente e completar o volume com solvente de eluição.

Com uma pipeta aferida, introduzir 20 ml desta solução na coluna preparada conforme descrito no ponto 4.3.1. Abrir a torneira e eluir o solvente até atingir o nível do enchimento de sílica-gel.

Proceder em seguida a uma eluição com 150 ml de solvente (4.2.3), regulando o caudal para aproximadamente 2 ml/minuto (de modo que os 150 ml passem pela coluna em 60 a 70 minutos).

Recolher o eluído num balão de fundo redondo de 250 ml (4.1.1), previamente tarado em estufa, e pesar com exatidão. Eliminar o solvente a pressão reduzida num evaporador rotativo (4.1.9) e pesar o resíduo, com o qual se preparará a solução destinada à análise por HPLC e à preparação dos ésteres metílicos.

No caso das categorias azeite virgem extra, azeite virgem, azeite comum, azeite refinado e azeite, a recuperação da amostra depois da passagem na coluna deve ser, pelo menos, de 90 %; no caso do azeite lampante e dos óleos de bagaço de azeitona, deve ser, no mínimo, de 80 %.

4.3.3.    Purificação por extração em fase sólida

Ativar a coluna de extração em fase sólida com enchimento de sílica passando, sob vácuo, 6 ml de hexano (4.2.3), tendo o cuidado de evitar a secagem.

Pesar 0,12 g, com a aproximação de 0,001 g, num frasquinho de 2 ml (4.1.15), e dissolver com 0,5 ml de hexano (4.2.3).

Transferir esta solução para a coluna de extração em fase sólida e eluir sob vácuo com 10 ml de mistura a 87:13 (v/v) de hexano e éter dietílico (4.2.3).

Evaporar a fração recolhida até à secura, num evaporador rotativo (4.1.9), sob pressão reduzida, à temperatura ambiente. Dissolver o resíduo em 2 ml de acetona (4.2.6), para a análise dos triacilgliceróis.

4.4.    Análise por HPLC

4.4.1.    Preparação das amostras para a análise cromatográfica

Preparar uma solução a 5 % da amostra a analisar pesando uma toma de 0,5 g ± 0,001 g da mesma num balão aferido de 10 ml e completando o volume até 10 ml com o solvente de solubilização (4.2.9).

4.4.2.    Técnica

Preparar o sistema cromatográfico para ser utilizado. Proceder à sua purga total por bombagem de solvente de eluição (4.2.8) ao caudal de 1,5 ml/minuto. Aguardar até ser obtida uma linha de base estável.

Injetar 10 μl de amostra, preparada conforme descrito no ponto 4.3.

4.4.3.    Cálculos e expressão dos resultados

Utilizar o método da normalização das áreas dos picos, isto é, considerar que a soma das áreas dos picos correspondentes aos triacilgliceróis com NCE42 a NCE52 é igual a 100 %.

A percentagem relativa de cada triacilglicerol calcula-se pela seguinte fórmula:

Os resultados devem ter, pelo menos, duas casas decimais.

Ver as notas 1 e 4.

4.5.    Cálculo da composição de triacilgliceróis (percentagem molar) a partir dos dados obtidos para a composição de ácidos gordos (percentagem correspondente a cada área)

4.5.1.    Determinação da composição de ácidos gordos

Determina-se a composição de ácidos gordos com base na norma ISO 5508, utilizando uma coluna capilar e preparando os ésteres metílicos de acordo com o COI/T.20/Doc. No 24.

4.5.2.    Ácidos gordos tidos em conta nos cálculos

Agrupam-se os acilgliceróis em função do número de átomos de carbono equivalente (NCE), com base nas equivalências entre este parâmetro e os ácidos gordos a seguir indicadas. Só são tidos em conta os ácidos gordos com 16 ou 18 átomos de carbono, os únicos com interesse no caso dos azeites e óleos de bagaço de azeitona. Normalizam-se estes ácidos gordos a 100 %.

4.5.3.    Conversão em moles da percentagem correspondente a cada área para todos os ácidos gordos (1)

4.5.4.    Normalização das moles de ácidos gordos a 100 % (2)

O resultado indica a percentagem molar de cada ácido gordo em todas as posições (1, 2 e 3) dos triacilgliceróis.

Calcula-se a seguir o somatório dos ácidos gordos saturados P e S (AGS) e dos ácidos gordos insaturados Po, O, L e Ln (AGI) (3):

4.5.5.    Cálculo da composição de ácidos gordos na posição 2 e nas posições 1 e 3 dos triacilgliceróis

Distribuem-se os ácidos gordos por três grupos do seguinte modo: um grupo para a posição 2 e dois grupos idênticos para as posições 1 e 3, com coeficientes diferentes para os ácidos saturados (P e S) e insaturados (Po, O, L e Ln).

4.5.5.1.   Ácidos gordos saturados na posição 2 [P(2) e S(2)] (4):

4.5.5.2.   Ácidos gordos insaturados na posição 2 [Po(2), O(2), L(2) e Ln(2)] (5):

4.5.5.3.   Ácidos gordos nas posições 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e Ln(1,3)] (6):

4.5.6.    Cálculos relativos aos triacilgliceróis

4.5.6.1.   Triacilgliceróis com um único ácido gordo (AAA, neste caso LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2.   Triacilgliceróis com dois ácidos gordos diferentes (AAB, neste caso PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3.   Triacilgliceróis com três ácidos gordos diferentes (ABC, neste caso OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4.   Triacilgliceróis com NCE42

Efetuam-se os cálculos relativos aos triacilgliceróis seguintes com NCE42 aplicando as equações 7, 8 e 9; apresentam-se os resultados correspondentes pela ordem de eluição esperada em HPLC (normalmente, evidenciam-se apenas três picos).

Os triacilgliceróis com NCE42 são dados pelo somatório dos nove triacilgliceróis acima indicados, incluindo os respetivos isómeros posicionais. Os resultados devem ter, pelo menos, duas casas decimais.

5.   AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS

Compara-se o teor teórico calculado com o teor determinado por HPLC. Se o valor absoluto da diferença «teor determinado por HPLC – teor teórico calculado» exceder os valores indicados na norma para a categoria de azeite ou óleo de bagaço de azeitona em questão, conclui-se que a amostra contém óleos de sementes.

Os resultados apresentam-se com duas casas decimais.

6.   EXEMPLO (OS NÚMEROS DOS PONTOS CORRESPONDEM AOS DO TEXTO DESCRITIVO DO MÉTODO)

— 4.5.1.    Cálculo da percentagem molar dos ácidos gordos a partir de dados de cromatografia gás-líquido (percentagem normalizada correspondente a cada área)

Pelo método de cromatografia gás-líquido, obtiveram-se os dados seguintes para a composição de ácidos gordos:

— 4.5.3    Conversão, em moles, da percentagem correspondente a cada área para todos os ácidos gordos (ver a fórmula 1)

— 4.5.4    Normalização das moles de ácidos gordos a 100 % (ver a fórmula 2)