«ANEXOS

RESUMO

Anexo I	Características dos azeites e óleos de bagaço de azeitona
Anexo I-A	Amostragem de azeites e óleos de bagaço de azeitona entregues em embalagens imediatas
Anexo I-B	Fluxogramas para verificação da conformidade de amostras de azeite ou de óleo de bagaço de azeitona com a categoria declarada
Anexo II	Determinação dos ácidos gordos livres, método a frio
Anexo III	Determinação do índice de peróxidos
Anexo IV	Determinação do teor de ceras por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar
Anexo VII	Determinação da percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo
Anexo IX	Análise por espetrofotometria no ultravioleta
Anexo X	Determinação dos ésteres metílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa
Anexo XI	Determinação do teor de solventes halogenados voláteis no azeite
Anexo XII	Método do Conselho Oleícola Internacional para a avaliação organolética de azeites virgens
Anexo XV	Teor de óleo do bagaço de azeitona
Anexo XVI	Determinação do índice de iodo
Anexo XVII	Método para a determinação de estigmastadienos em óleos vegetais
Anexo XVIII	Determinação da diferença entre o teor real e o teor teórico de triacilgliceróis com NCE42
Anexo XIX	Determinação da composição esterólica, do teor de esteróis e do teor de compostos alcoólicos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar
Anexo XX	Método de determinação do teor de ceras, de ésteres metílicos de ácidos gordos e de ésteres etílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar
Anexo XXI	Resultados das verificações de conformidade efetuadas aos azeites e aos óleos de bagaço de azeitona referidas no artigo 8.o, n.o 2

«ANEXO I

CARACTERÍSTICAS DOS AZEITES E ÓLEOS DE BAGAÇO DE AZEITONA

Características de qualidade

Ésteres etílicos de ácidos gordos (mg/kg)		≤ 35	—	—	—	—	—	—	—
Exame organolético	Mediana do frutado (Mf)	Mf > 0,0	Mf > 0,0	—	—	—	—	—	—
	Mediana dos defeitos (Md) (*)	Md = 0,0	Md ≤ 3,5	Md > 3,5 (1)
Delta-K		≤ 0,01	≤ 0,01	—	≤ 0,16	≤ 0,15	—	≤ 0,20	≤ 0,18
K268 ou K270		≤ 0,22	≤ 0,25	—	≤ 1,25	≤ 1,15	—	≤ 2,00	≤ 1,70
K232		≤ 2,50	≤ 2,60	—	—	—	—	—	—
Índice de peróxidos (mEq O2/kg)		≤ 20,0	≤ 20,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0
Acidez (%) (*)		≤ 0,80	≤ 2,0	> 2,0	≤ 0,30	≤ 1,00	—	≤ 0,30	≤ 1,00
Categoria		1. Azeite virgem extra	2. Azeite virgem	3. Azeite lampante	4. Azeite refinado	5. Azeite (constituído por azeites refinados e azeites virgens)	6. Óleo de bagaço de azeitona bruto	7. Óleo de bagaço de azeitona refinado	8. Óleo de bagaço de azeitona

Características de pureza

Monopalmitato de 2-glicerilo (%)

≤ 0,9 se ácido palmítico total ≤ 14,00 %

≤ 1,0 se ácido palmítico total > 14,00 %

≤ 0,9 se ácido palmítico total ≤ 14,00 %

≤ 1,0 se ácido palmítico total > 14,00 %

≤ 0,9 se ácido palmítico total ≤ 14,00 %

≤ 1,1 se ácido palmítico total > 14,00 %

≤ 0,9 se ácido palmítico total ≤ 14,00 %

≤ 1,1 se ácido palmítico total > 14,00 %

≤ 0,9 se ácido palmítico total ≤ 14,00 %

≤ 1,0 se ácido palmítico total > 14,00 %

≤ 1,4

≤ 1,4

≤ 1,2

Diferença entre o NCE42 determinado por HPLC e o NCE42 obtido por cálculo teórico

≤|0,20|

≤|0,20|

≤|0,30|

≤|0,30|

≤|0,30|

≤|0,60|

≤|0,50|

≤|0,50|

Estigmastadienos (mg/kg) (3)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,50

—

—

—

—

—

Total de isómeros dos ácidos trans-linoleico + trans-linolénico (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,10

≤ 0,35

≤ 0,35

Total dos isómeros trans-oleicos (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,40

Composição de ácidos gordos (2)

Lignocérico (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

Beénico (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,30

Eicosenóico (%)

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

Araquídico (%)

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

Linolénico (%)

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

Mirístico (%)

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

Categoria

1. Azeite virgem extra

2. Azeite virgem

3. Azeite lampante

4. Azeite refinado

5. Azeite (constituído por azeites refinados e azeites virgens)

6. Óleo de bagaço de azeitona bruto

7. Óleo de bagaço de azeitona refinado

8. Óleo de bagaço de azeitona

Ceras (mg/kg) (**)		C42 + C44 + C46 ≤ 150	C42 + C44 + C46 ≤ 150	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (6)	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (7)	C40 + C42 + C44 + C46 > 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350
Eritrodiol e uvaol (%) (**)		≤ 4,5	≤ 4,5	≤ 4,5 (6)	≤ 4,5	≤ 4,5	> 4,5 (7)	> 4,5	> 4,5
Esteróis totais (mg/kg)		≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 2 500	≥ 1 800	≥ 1 600
Composição esterólica	Delta-7-estigmastenol (4) (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
	β-sitosterol aparente (5) (%)	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0
	Estigmasterol (%)	<Campesterol	<Campesterol	—	<Campesterol	<Campesterol	—	<Campesterol	<Campesterol
	Campesterol (4) (%)	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0
	Brassicasterol (%)	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,2	≤ 0,2	≤ 0,2
	Colesterol (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
Categoria		1. Azeite virgem extra	2. Azeite virgem	3. Azeite lampante	4. Azeite refinado	5. Azeite (constituído por azeites refinados e azeites virgens)	6. Óleo de bagaço de azeitona bruto	7. Óleo de bagaço de azeitona refinado	8. Óleo de bagaço de azeitona

Notas:

a)	Os resultados das análises devem ser expressos com um número de algarismos significativos idêntico ao previsto para cada característica. Se o algarismo seguinte for superior a 4, o último algarismo significativo deve ser aumentado de uma unidade.

b)	Basta que uma das características esteja fora dos limites fixados para que o azeite ou óleo seja classificado noutra categoria ou declarado não-conforme, para os efeitos do presente regulamento.

c)	No caso do azeite lampante, as características de qualidade assinaladas com um asterisco (*) podem diferir simultaneamente dos limites estabelecidos para a categoria correspondente.

d)

No caso dos óleos de bagaço de azeitona brutos, os valores declarados para as duas características assinaladas com dois asteriscos (**) podem diferir simultaneamente dos limites correspondentes. No caso dos óleos de bagaço de azeitona e dos óleos de bagaço de azeitona refinados, apenas um dos valores declarados pode diferir do limite correspondente.

Apêndice

Esquemas de decisão

Esquema de decisão relativo ao campesterol para azeites virgens e azeites virgens extra:

Os outros parâmetros devem respeitar os limites estabelecidos no presente regulamento.

Esquema de decisão relativo ao delta-7-estigmastenol para:

—	Azeites virgens e azeites virgens extra

Os outros parâmetros devem respeitar os limites estabelecidos no presente regulamento.

—	Óleos de bagaço de azeitona (brutos e refinados)

Os outros parâmetros devem respeitar os limites estabelecidos no presente regulamento.

«ANEXO I-B

FLUXOGRAMAS PARA VERIFICAÇÃO DA CONFORMIDADE DE AMOSTRAS DE AZEITE OU DE ÓLEO DE BAGAÇO DE AZEITONA COM A CATEGORIA DECLARADA

Quadro geral

Quadro 1 – Azeite virgem extra – Critérios de qualidade

Quadro 2 – Azeite virgem – Critérios de qualidade

Quadro 3 – Azeite virgem extra e azeite virgem – Critérios de pureza

Quadro 4 – Azeite lampante – Critérios de pureza

Quadro 5 – Azeite refinado – Critérios de qualidade

Quadro 6 – Azeite (constituído por azeites refinados e azeites virgens) – Critérios de qualidade

Quadro 7 – Azeite refinado e azeite constituído por azeites refinados e azeites virgens – Critérios de pureza

Quadro 8 – Óleo de bagaço de azeitona bruto – Critérios de pureza.

Quadro 9 – Óleo de bagaço de azeitona refinado – Critérios de qualidade.

Quadro 10 – Óleo de bagaço de azeitona – Critérios de qualidade.

Quadro 11 – Óleo de bagaço de azeitona refinado e óleo de bagaço de azeitona – Critérios de pureza

«ANEXO XIX

DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO ESTERÓLICA, DO TEOR DE ESTERÓIS E DO TEOR DE COMPOSTOS ALCOÓLICOS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR

1.   OBJETIVO

Este método descreve um processo de determinação do teor, individual e total, de compostos alcoólicos de azeites, de óleos de bagaço de azeitona e de misturas de azeites e óleos de bagaço de azeitona.

Os compostos alcoólicos dos azeites e óleos de bagaço de azeitona compreendem álcoois alifáticos, esteróis e diálcoois triterpénicos.

2.   PRINCÍPIO DO MÉTODO

Saponificação do azeite ou óleo, adicionado de α-colestanol e 1-eicosanol como padrões internos, com hidróxido de potássio em solução etanólica; em seguida, extração com éter etílico do insaponificável.

Separação, do insaponificável, das diversas frações de compostos alcoólicos, por cromatografia de camada fina numa placa de sílica-gel alcalinizada (método de referência) ou por HPLC numa coluna de sílica-gel. Conversão da fração recuperada do sílica-gel em éteres trimetilsilílicos. Análise dos éteres por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

PARTE I

PREPARAÇÃO DO EXTRATO INSAPONIFICÁVEL

1.   OBJETIVO

Descreve-se a preparação e extração do insaponificável de azeites ou óleos de bagaço de azeitona.

2.   PRINCÍPIO DO MÉTODO

Saponificação de uma toma de ensaio, levando-a à ebulição sob refluxo com uma solução etanólica de hidróxido de potássio. Extração com éter dietílico do insaponificável.

3.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

3.1.	Balão de 250 ml de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo com juntas esmeriladas;

3.2.	Ampola de decantação de 500 ml;

3.3.	Balões de 250 ml;

3.4.	Microsseringas de 100 μl e 500 μl;

3.5.	Cadinho cilíndrico de fundo filtrante com porosidade G3 (poros de 15 μm a 40 μm), de aproximadamente 2 cm de diâmetro e 5 cm de profundidade, adequado para filtração sob vácuo, com junta esmerilada macho;

3.6.	Balão de erlenmeyer de 50 ml com junta esmerilada fêmea, adaptável ao cadinho de fundo filtrante (3.5);

3.7.	Tubo de centrifugação de fundo cónico, de 10 ml, com tampa de vidro hermética;

3.8.	Exsicador de dicloreto de cálcio.

4.   REAGENTES

4.1.	Hidróxido de potássio a 85 % (ou de título superior).

4.2.

Solução etanólica aproximadamente 2 M de hidróxido de potássio. Dissolver, com arrefecimento, 130 g de hidróxido de potássio (4.1) em 200 ml de água destilada e completar o volume até um litro com etanol (4.7). Esta solução conserva-se em garrafas de vidro escuro bem fechadas, durante, no máximo, dois dias.

4.3.	Éter etílico para análises.

4.4.	Sulfato de sódio anidro para análises.

4.5.	Acetona para cromatografia.

4.6.	Éter etílico para cromatografia.

4.7.	Etanol para análises.

4.8.	Acetato de etilo para análises.

4.9.	Padrão interno α-colestanol de pureza superior a 99 % (a verificar por análise cromatográfica em fase gasosa).

4.10.

Solução de padrão interno a 0,2 % (m/v) de α-colestanol em acetato de etilo (4.8).

4.11.

Solução a 10 g/l de fenolftaleína em etanol (4.7).

4.12.

Solução a 0,1 % (m/v) de 1-eicosanol em acetato de etilo (padrão interno).

5.   TÉCNICA

Introduzir num balão de 250 ml (3.1), por meio de uma microsseringa de 500 μl (3.4), um volume da solução padrão interno de α-colestanol (4.10) e um volume da solução padrão interno de 1-eicosanol (4.12) cujas quantidades de colestanol e de eicosanol correspondam a cerca de 10 % do teor de álcoois e do teor de esteróis da amostra. Por exemplo, para 5 g de amostra de azeite, adicionar 500 μl de solução de α-colestanol (4.10) e 250 μl de solução de 1-eicosanol (4.12). Caso se trate de óleo de bagaço de azeitona, adicionar 1500 μl de solução de α-colestanol (4.10) e 1500 μl de solução de 1-eicosanol (4.12). Evaporar em banho-maria com uma corrente ligeira de azoto até à secura, arrefecer o balão e, em seguida, pesar exatamente 5 ± 0,01 g da amostra filtrada e seca para o mesmo balão.

Nota 1:

No caso das matérias gordas vegetais e animais que contenham quantidades consideráveis de colesterol, pode observar-se um pico com tempo de retenção igual ao do pico do colestanol. Nesse caso, é necessário analisar a fração esterólica em duplicado, com e sem padrão interno.

Juntar 50 ml de solução etanólica 2 M de hidróxido de potássio (4.2) e um pouco de pedra-pomes, montar o condensador de refluxo e aquecer até ligeira ebulição, até que se produza a saponificação (a solução fica límpida). Continuar a aquecer durante 20 minutos, juntar 50 ml de água destilada pela parte de cima do condensador, retirar este e arrefecer o balão a cerca de 30 °C.

Transferir quantitativamente o conteúdo do balão para uma ampola de decantação de 500 ml (3.2), utilizando diversas vezes água destilada (50 ml). Juntar cerca de 80 ml de éter etílico (4.6) e agitar energicamente durante cerca de 60 segundos. Libertar a pressão de vez em quando, invertendo a ampola e retirando a tampa. Deixar em repouso até à separação completa das duas fases (nota 2). Em seguida, separar a fase saponificada, tão completamente quanto possível, para outra ampola de decantação. Proceder a duas outras extrações análogas da fase hidroalcoólica, utilizando de cada vez 60-70 ml de éter etílico (4.6).

Nota 2:

As eventuais emulsões podem ser eliminadas juntando pequenas quantidades de etanol (4.7).

Reunir os três extratos etéreos numa ampola de decantação que já contenha 50 ml de água. Prosseguir a lavagem com água (50 ml), até a água deixar de produzir uma coloração rosada por adição de uma gota de solução de fenolftaleína (4.11). Uma vez eliminada a água de lavagem, filtrar através de sulfato de sódio anidro (4.4) para um balão de 250 ml previamente tarado. Lavar a ampola de decantação e o filtro com pequenas quantidades de éter etílico (4.6).

Evaporar o solvente por destilação sob vácuo, a 30 °C, num evaporador rotativo. Adicionar 5 ml de acetona (4.5) e eliminar completamente o solvente volátil com uma ligeira corrente de azoto. Secar o resíduo numa estufa a 103 °C ± 2 °C, durante 15 minutos. Arrefecer num exsicador e pesar com a aproximação de 0,1 mg.

PARTE 2

SEPARAÇÃO DAS FRAÇÕES ALCOÓLICAS

1.   OBJETIVO

Fracionamento do extrato insaponificável, preparado conforme se explicou na parte 1, nos diversos compostos alcoólicos: álcoois alifáticos, esteróis e diálcoois triterpénicos (eritrodiol e uvaol).

2.   PRINCÍPIO DO MÉTODO

Fracionamento do extrato insaponificável por cromatografia de camada fina em meio alcalino (método de referência), revelação das placas e raspagem e extração das bandas correspondentes. Como método alternativo de separação, pode utilizar-se HPLC em coluna de sílica-gel com detetor de UV, recolhendo-se as diversas frações. Os álcoois alifáticos e os álcoois triterpénicos, por um lado, e os esteróis e os diálcoois triterpénicos, por outro, são isolados conjuntamente.

3.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

3.1.	Equipamento completo para análise por cromatografia em camada fina, com placas de vidro de 20 cm × 20 cm;

3.2.	Lâmpada de ultravioleta de comprimento de onda de 366 nm ou 254 nm;

3.3.	Microsseringas de 100 μl e 500 μl;

3.4.	Cadinho cilíndrico de fundo filtrante com porosidade G3 (poros de 15 μm a 40 μm), de aproximadamente 2 cm de diâmetro e 5 cm de profundidade, adequado para filtração sob vácuo, com junta esmerilada macho;

3.5.	Balão de erlenmeyer de 50 ml com junta esmerilada fêmea, adaptável ao cadinho de fundo filtrante (3.4);

3.6.	Tubo de centrifugação de fundo cónico, de 10 ml, com tampa de vidro hermética;

3.7.	Exsicador de dicloreto de cálcio;

3.8.	Equipamento de HPLC, constituído por: 3.8.1. Bomba binária; 3.8.2. Injetor manual ou automático, equipado com circuito de injeção de 200 μl; 3.8.3. Desgasificador em linha; 3.8.4. Detetor UV-VIS ou IV;

3.9.	Coluna para HPLC (25 cm × 4 mm de diâmetro interno), com enchimento de sílica gel 60 (granulometria de 5 μm);

3.10.

Filtro para seringa, de 0,45 μm;

3.11.

Balão de erlenmeyer de 25 ml.

4.   REAGENTES

4.1.	Hidróxido de potássio a 85 % (ou de título superior).

4.2.

Solução etanólica aproximadamente 2 M de hidróxido de potássio. Dissolver, com arrefecimento, 130 g de hidróxido de potássio (4.1) em 200 ml de água destilada e completar o volume até um litro com etanol (4.9). Esta solução conserva-se em garrafas de vidro escuro bem fechadas, durante, no máximo, dois dias.

4.3.	Éter etílico para análises.

4.4.	Solução etanólica aproximadamente 0,2 M de hidróxido de potássio. Dissolver 13 g de hidróxido de potássio (4.1) em 20 ml de água destilada e completar o volume até um litro com etanol (4.9).

4.5.	Placas de vidro (20 cm x 20 cm) revestidas de uma camada de sílica-gel, sem indicador de fluorescência, com 0,25 mm de espessura (disponíveis no comércio prontas a utilizar).

4.6.	Acetona para cromatografia.

4.7.	n-Hexano para cromatografia.

4.8.	Éter etílico para cromatografia.

4.9.	Etanol para análises.

4.10.

Acetato de etilo para análises.

4.11.

Solução de referência para a cromatografia em camada fina: solução a 5 % de colesterol, fitoesteróis, álcoois e eritrodiol em acetato de etilo (4.10).

4.12.

Solução etanólica a 0,2 % de 2,7-diclorofluoresceína. Adicionar algumas gotas da solução alcoólica 2 M de hidróxido de potássio (4.2) para tornar a solução ligeiramente básica.

4.13.

Mistura 65:35 (v/v) de n-hexano (4.7) e éter etílico (4.8).

4.14.

Fase móvel para a HPLC: mistura 1:1 (v/v) de n-hexano (4.7) e éter etílico (4.8).

5.   MÉTODO DE REFERÊNCIA: SEPARAÇÃO DOS COMPOSTOS ALCOÓLICOS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA EM PLACAS ALCALINIZADAS

Preparação das placas alcalinizadas para cromatografia em camada fina: imergir as placas com sílica-gel (4.5) cerca de 4 cm, durante 10 segundos, na solução etanólica 0,2 M de hidróxido de potássio (4.4); deixar secar durante duas horas numa câmara de exaustão e colocar numa estufa, a 100 °C, durante uma hora.

Retirar as placas da estufa e conservar num exsicador com cloreto de cálcio (3.7) até à utilização (devem utilizar-se no prazo de 15 dias).

Introduzir a mistura de hexano e éter etílico (4.13) na câmara de revelação das placas (nota 3), até uma altura de aproximadamente 1 cm. Fechar a câmara com uma tampa adequada e deixar em repouso durante, pelo menos, meia hora, num local fresco, de modo que se estabeleça o equilíbrio líquido/vapor. Podem colocar-se nas superfícies internas da câmara folhas de papel de filtro que mergulhem no eluente. Esta precaução permite reduzir o tempo de revelação em cerca de um terço e obter uma eluição mais uniforme e regular dos componentes.

Nota 3:

A fim de obter condições de eluição perfeitamente reprodutíveis, a mistura de revelação deve ser mudada em cada ensaio. Também pode utilizar-se um solvente constituído por uma mistura 50:50 (v/v) de n-hexano e éter etílico.

Preparar uma solução aproximadamente a 5 % do extrato insaponificável, preparado como se explicou na parte 1, em acetato de etilo (4.10) e, com a microsseringa de 100 μl (3.3), depositar na placa cromatográfica (4.5), a aproximadamente 2 cm do bordo inferior, 0,3 ml da solução supracitada, numa linha contínua, fina e uniforme. No alinhamento da linha de partida, depositar 2 μl a 3 μl da solução de referência (4.11), a fim de identificar a banda de esteróis, diálcoois triterpénicos e álcoois após a revelação.

Colocar a placa na câmara de revelação (3.1). A temperatura ambiente deve ser mantida entre 15 °C e 20 °C (nota 4). Tapar imediatamente a câmara e deixar eluir até que a frente de solvente chegue a cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Retirar a placa da câmara de revelação e evaporar o solvente numa corrente de ar quente, ou deixando a placa sob um exaustor durante alguns momentos.

Nota 4:

Temperaturas mais elevadas podem dificultar a separação.

Nebulizar a placa, ligeira e uniformemente, com a solução de 2,7-diclorofluoresceína (4.12) e deixar a secar. Quando a placa é observada à luz ultravioleta (3.2), as bandas dos esteróis, diálcoois triterpénicos e álcoois podem ser identificadas pelo alinhamento com as manchas obtidas para a solução de referência (4.11). Delimitar as bandas com um lápis preto ao longo das margens de fluorescência (ver a placa de cromatografia em camada fina na figura 1).

Raspar, com uma espátula metálica, o sílica-gel da zona delimitada. Introduzir a matéria retirada, finamente triturada, no cadinho de fundo filtrante (3.4). Juntar 10 ml de acetato de etilo (4.10) quente, misturar cuidadosamente com a espátula metálica e filtrar (se necessário sob vácuo). Recolher o filtrado no balão de erlenmeyer (3.5) ligado ao cadinho de fundo filtrante.

Lavar o resíduo no cadinho três vezes com éter etílico (4.3) (cerca de 10 ml de cada vez) e recolher o filtrado no balão de erlenmeyer adaptado ao cadinho de fundo filtrante. Evaporar o filtrado até se obter um volume de 4-5 ml. Transferir a solução residual para um tubo de centrifugação de 10 ml (3.6), previamente tarado, e evaporar até à secura, aquecendo suavemente, numa ligeira corrente de azoto. Deitar algumas gotas de acetona (4.6) e evaporar novamente até à secura. O resíduo contido no tubo é constituído pela fração esterólica e de diálcoois triterpénicos ou pela fração de álcoois e álcoois triterpénicos.

6.   SEPARAÇÃO DOS COMPOSTOS ALCOÓLICOS POR HPLC

Dissolver em 3 ml da fase móvel (4.14) o extrato insaponificável obtido como se explicou na parte 1, filtrar a solução com um filtro para seringas (3.10) e guardar.

Injetar no equipamento de HPLC (3.8) 200 μl da solução filtrada do insaponificável.

Efetuar a separação por HPLC ao caudal de 0,8 ml/min, descartando o eluído dos primeiros cinco minutos e recolhendo em seguida o eluído em balões de erlenmeyer de 25 ml (3.11), entre os 5 e os 10 minutos de eluição os álcoois alifáticos e álcoois triterpénicos e entre os 11 e os 25 minutos de eluição os esteróis, o eritrodiol e o uvaol (nota 5).

Pode monitorizar-se a separação com um detetor de UV, ao comprimento de onda de 210 nm, ou com um detetor de índice de refração (ver a figura 6).

Evaporar as frações até à secura e prepará-las em seguida para a análise cromatográfica.

Nota 5:

Dado que o éter etílico pode aumentar a pressão, é necessário regular cuidadosamente a pressão da bomba do equipamento HPLC, adaptando o fluxo de modo a manter a pressão sob controlo.

PARTE 3

ANÁLISE DAS FRAÇÕES ALCOÓLICAS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA

1.   OBJETIVO

Esta parte fornece orientações gerais para a aplicação de um método cromatográfico em fase gasosa com coluna capilar na determinação da composição qualitativa e quantitativa dos compostos alcoólicos isolados pelo método descrito na parte 2.

2.   PRINCÍPIO DO MÉTODO

Conversão das frações obtidas a partir do extrato insaponificável por cromatografia em camada fina ou HPLC em éteres trimetilsilílicos e análise destes por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar, com injetor de divisão de fluxo e detetor de ionização por chama.

3.   APARELHOS E UTENSÍLIOS

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

3.1.	Tubo de centrifugação de fundo cónico, de 10 ml, com tampa de vidro hermética;

3.2.

Cromatógrafo de fase gasosa adequado para colunas capilares, dotado de um sistema de injeção com divisão de fluxo (“split”), constituído por: 3.2.1. Forno termostatizado para a coluna, que permita manter a temperatura desejada com a aproximação de ± 1 °C; 3.2.2. Unidade de injeção de temperatura regulável, com elemento vaporizador de vidro persilanizado e sistema de divisão de fluxo; 3.2.3. Detetor de ionização por chama; 3.2.4. Sistema de aquisição de dados adequado para o detetor de ionização por chama (3.10.3.), com possibilidade de integração manual;

3.3.	Coluna capilar de sílica fundida, com 20-30 m de comprimento e 0,25-0,32 mm de diâmetro interno, revestida interiormente com uma camada de difenil (5 %) – dimetil (95 %) polissiloxano (fase estacionária SE-52, SE-54 ou equivalente), de espessura uniforme compreendida entre 0,10 μm e 0,30 μm;

3.4.	Microsseringa de 10 μl para cromatografia em fase gasosa, com agulha cementada, adequada para o sistema de injeção com divisão de fluxo.

4.   REAGENTES

4.1.	Piridina anidra para cromatografia.

4.2.	Hexametildissilazano para análises.

4.3.	Trimetilclorossilano para análises.

4.4.	Soluções-amostra dos éteres trimetilsilílicos dos esteróis: a preparar no momento da utilização a partir dos esteróis e do eritrodiol provenientes dos azeites ou óleos que os contenham.

4.5.	Solução-padrão de éteres trimetilsilílicos dos álcoois alifáticos C20 a C28: a preparar, a partir de misturas de álcoois puros, no momento da utilização.

4.6.	Gás vetor: hidrogénio ou hélio, para cromatografia em fase gasosa.

4.7.	Gases auxiliares: hidrogénio, hélio, azoto e ar, para cromatografia em fase gasosa.

4.8.	Reagente de sililação, constituído por uma mistura 9:3.1 (v/v/v) de piridina, hexametildissilazano e trimetilclorossilano.

4.9.	n-Hexano para cromatografia.

5.   PREPARAÇÃO DOS ÉTERES TRIMETILSILÍLICOS

No tubo de centrifugação (3.1) que contém a fração alcoólica, juntar o reagente de sililação (4.8) (nota 6), na proporção de 50 μl por miligrama de compostos alcoólicos, evitando qualquer absorção de humidade (nota 7).

Nota 6:

Existem no comércio soluções prontas a utilizar. Estão igualmente disponíveis outros reagentes de sililação, como o bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida + 1 % de trimetilclorossilano, a diluir num volume igual de piridina anidra. Pode substituir-se a piridina por igual quantidade de acetonitrilo.

Nota 7:

A ligeira opalescência eventualmente formada é normal e não provoca interferências. A formação de um floculado branco ou o aparecimento de uma coloração rosa indicam a presença de humidade ou deterioração do reagente. Nessa eventualidade, a análise tem de ser repetida (apenas se for utilizado hexametildissilazano/trimetilclorossilano).

Tapar o tubo de centrifugação (3.1) e agitar cuidadosamente (sem virar) até à solubilização completa dos compostos. Deixar repousar durante, pelo menos, 15 minutos à temperatura ambiente e depois centrifugar durante alguns minutos. A solução límpida está pronta a ser analisada por cromatografia em fase gasosa.

6.   ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA

6.1.   Operações preliminares, condicionamento da coluna capilar

Instalar a coluna (3.3) no cromatógrafo de fase gasosa, ligando a extremidade de entrada à câmara de injeção com divisão de fluxo e a extremidade de saída ao detetor.

Efetuar as verificações gerais da unidade de cromatografia em fase gasosa (hermeticidade do circuito dos gases, eficácia do detetor, eficácia do sistema de divisão de fluxo e do sistema de registo etc.).

Se a coluna for utilizada pela primeira vez, é aconselhável condicioná-la. Para isso, faz-se passar um ligeiro fluxo gasoso pela coluna, liga-se a unidade de cromatografia em fase gasosa e aquece-se gradualmente, até atingir uma temperatura pelo menos 20 °C acima da temperatura de trabalho (nota 8). Mantém-se essa temperatura durante, pelo menos, duas horas. Em seguida, leva-se toda a unidade às condições de trabalho (regulação do fluxo gasoso e da divisão de fluxo, inflamação da chama, ligação ao sistema de computação, regulação da temperatura da coluna, do detetor e do injetor etc.) e regista-se o sinal com sensibilidade pelo menos duas vezes superior à pretendida para a análise. O traçado da linha de base obtida deve ser linear, sem qualquer pico ou desvio. Um desvio retilíneo negativo indica hermeticidade imperfeita das ligações da coluna; se for positivo, indica condicionamento inadequado da mesma.

Nota 8:

A temperatura de condicionamento deve ser sempre inferior, em pelo menos 20 °C, à temperatura máxima especificada para a fase estacionária utilizada.

6.2.   Condições de trabalho

Otimizar o programa de temperatura e o fluxo do gás vetor de modo a obter cromatogramas semelhantes aos ilustrados nas figuras 3 a 6.

Os seguintes parâmetros foram experimentados e revelaram-se úteis:

6.2.1.   Álcoois alifáticos

Programação da temperatura do forno	180 °C (8 min.) → 260 °C (gradiente de 5 °C/min.) → 260 °C (15 min)
Temperatura do injetor	280 °C
Temperatura do detetor	290 °C
Velocidade linear do gás vetor	hélio: 20-30 cm/s; hidrogénio: 30-50 cm/s
Divisão de fluxo (“split”):	1:50 a 1:100
Volume injetado	0,5-1 μl de solução de éteres trimetilsilílicos

6.2.2.   Esteróis e diálcoois triterpénicos

Programação da temperatura do forno	260 °C ± 5 °C, condições isotérmicas
Temperatura do injetor	280 °C a 300 °C
Temperatura do detetor	280 °C a 300 °C
Velocidade linear do gás vetor	hélio: 20-30 cm/s; hidrogénio: 30-50 cm/s
Divisão de fluxo (“split”):	1:50 a 1:100
Volume injetado	0,5-1 μl de solução de éteres trimetilsilílicos

Estas condições podem ser alteradas em função das características da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obter cromatogramas que satisfaçam as seguintes condições:

—	tempo de retenção do álcool C26: 18 minutos ± 5 minutos;

—	pico do álcool C22: 80 % ± 20 % da escala completa, no caso do azeite, e 40 % ± 20 % da escala completa, no caso do óleo de bagaço de azeitona;

—	tempo de retenção do pico do β-sitosterol: 20 minutos ± 5 minutos;

—	pico do campesterol do azeite (teor médio de 3 %): 20 % ± 5 % da escala completa;

—

separação de todos os esteróis presentes. É necessário que, além de se apresentarem separados, os picos apresentem também resolução completa, ou seja, o traçado do pico deve voltar à linha de base antes do arranque do pico seguinte. No entanto, é tolerada uma resolução incompleta, desde que o pico a TRR 1,02 (sitostanol) seja quantificável segundo a perpendicular.

6.3.   Técnica analítica

Com a microsseringa de 10 μl (3.4), tomar 1 μl de hexano, aspirar 0,5 μl de ar e, em seguida, 0,5 μl a 1 μl da solução da amostra. Puxar um pouco mais o êmbolo da seringa, para que a agulha fique vazia. Introduzir a agulha através da membrana do injetor e, transcorridos 1 s a 2 s, injetar rapidamente. Passados cerca de 5 s, retirar a agulha devagar. Também pode utilizar-se um injetor automático.

Efetuar o registo até à eluição completa dos éteres trimetilsilílicos dos compostos alcoólicos presentes. A linha de base deve continuar a corresponder às condições de trabalho respetivas (6.2.1 ou 6.2.2).

6.4.   Identificação dos picos

Identificam-se individualmente os picos com base nos tempos de retenção, por comparação com as misturas de éteres trimetilsilílicos de, respetivamente, álcoois alifáticos e álcoois triterpénicos, uma, e esteróis e diálcoois triterpénicos, a outra, cromatografadas nas mesmas condições. A figura 3 ilustra um cromatograma da fração de álcoois alifáticos e álcoois triterpénicos; a figura 2 o cromatograma correspondente à fração de esteróis e diálcoois triterpénicos.

A ordem de eluição dos álcoois alifáticos é a seguinte: C20-ol (P.I.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol e C28-ol.

A ordem de eluição dos esteróis e dos diálcoois triterpénicos é a seguinte: colesterol, brassicasterol, ergosterol, 24-metilenocolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-estigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-estigmastadienol, Δ7-estigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol e uvaol.

6.5.   Determinação quantitativa

Recorrendo ao sistema de aquisição de dados, calcula-se a área dos picos do 1-eicosanol e dos álcoois alifáticos C22, C24, C26 e C28. Considera-se o coeficiente de resposta para o 1-eicosanol igual a 1.

Recorrendo ao sistema de computação, calcula-se a área dos picos do α-colestanol, dos esteróis e dos diálcoois triterpénicos. Não se consideram os eventuais picos de compostos não incluídos na lista do quadro 1 (não se efetua o cálculo para o ergosterol). Considera-se o coeficiente de resposta para o α-colestanol igual a 1.

Calcula-se a concentração de cada composto alcoólico, em mg/kg de matéria gorda, do seguinte modo:

em que:

Ax	=	área do pico do composto alcoólico x, em unidades do sistema de computação;
As	=	área do pico do 1-eicosanol/α-colestanol, em unidades do sistema de computação;
ms	=	massa de 1-eicosanol/α-colestanol adicionada, em miligramas;
m	=	massa da toma de amostra utilizada na determinação, em gramas.

7.   EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Exprime-se a concentração de cada álcool alifático ou triterpénico em mg/kg de matéria gorda e a soma das concentrações respetivas como “teor total de álcoois alifáticos”. O teor total corresponde à soma de C22, C24, C26 e C28.

Exprime-se a concentração de cada composto alcoólico com uma casa decimal.

A concentração de esteróis totais é expressa sem casas decimais.

Calcula-se a percentagem de cada esterol a partir da relação entre a área do pico respetivo e a soma das áreas dos picos de esteróis.

em que:

Ax	=	área do pico do esterol x;
ΣA	=	soma das áreas dos picos de esteróis.

β-sitosterol aparente: Δ5,23-estigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5,24-estigmastadienol.

Cálculo da percentagem de eritrodiol e uvaol:

em que:

AEr	=	área do pico do eritrodiol, em unidades do sistema de computação;
AUv	=	área do pico do uvaol, em unidades do sistema de computação;
ΣAT	=	soma das áreas dos picos dos esteróis, do eritrodiol e do uvaol, em unidades do sistema de computação.

Além do cálculo da percentagem relativa de cada esterol e diálcool triterpénico e da concentração total de esteróis, calculam-se a concentração de eritrodiol, a concentração de uvaol e a soma destas concentrações, em mg/kg de matéria gorda, por aplicação das seguintes expressões:

em que:

AEr	=	área do pico do eritrodiol, em unidades do sistema de computação;
AUv	=	área do pico do uvaol, em unidades do sistema de computação;
As	=	área do pico do α-colestanol, em unidades do sistema de computação;
ms	=	massa de α-colestanol adicionada, em miligramas;
m	=	massa da toma de amostra utilizada na determinação, em gramas.

Apêndice

1 Hidrocarbonetos 2 α-Tocoferol 3 Prenóis 4 Álcoois triterpénicos 5 Álcoois alifáticos 6 Metilesteróis 7 Esteróis 8 Diálcoois triterpénicos

Figura 1 – Placa de cromatografia em camada fina da fração insaponificável de um óleo de bagaço de azeitona eluída duas vezes com uma mistura 65:35 de hexano e éter dietílico, revelada com H2SO4 (50 %) e aquecida. As bandas a raspar são as delimitadas pelos retângulos: 1 designa as bandas dos álcoois alifáticos e 2 as dos esteróis e dos diálcoois triterpénicos.

Quadro I – Tempos de retenção relativos dos esteróis

Pico	Identificação		Tempos de retenção relativos
			Coluna SE 54	Coluna SE 52
1	Colesterol	Δ5-Colesten-3ß-ol	0,67	0,63
2	Colestanol	5α-Colestan-3ß-ol	0,68	0,64
3	Brassicasterol	[24S]-24-Metil-Δ5,22-colestadien-3β-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S]-24-Metil-Δ5,7,22-colestatrien-3β-ol	0,78	0,76
4	24-Metilenocolesterol	24-Metileno-Δ5,24-colestadien-3ß-o1	0,82	0,80
5	Campesterol	[24R]-24-Metil-Δ5-colesten-3ß-ol	0,83	0,81
6	Campestanol	[24R]-24-Metilcolestan-3ß-ol	0,85	0,82
7	Estigmasterol	[24S]-24-Etil-Δ5,22-colestadien-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ7-Campesterol	[24R]-24-Metil-Δ7-colesten-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-Estigmastadienol	[24R,S]-24-Etil-Δ5,23-colestadien-3ß-ol	0,95	0,95
10	Clerosterol	[24S]-24-Etil-Δ5,25-colestadien-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-Sitosterol	[24R]-24-etil-Δ5-colesten-3ß-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-Etilcolestan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ5-Avenasterol	[24Z]-24-Etilideno-Δ7-colesten-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ5,24-Estigmastadienol	[24R,S]-24-Etil-Δ5,24-colestadien-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ7-Estigmastenol	[24R,S]-24-Etil-Δ7-colesten-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ7-Avenasterol	[24Z]-24-Etilideno-Δ7-colesten-3ß-ol	1,16	1,16
17	Eritrodiol	5α-Olean-12-eno-3β,28-diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-Urseno-3ß,28-diol	1,52	1,52

Figura 2 – Traçado de cromatografia em fase gasosa com detetor de ionização por chama dos esteróis e dos diálcoois triterpénicos de um azeite refinado (tempo em minutos). (1) Colesterol, (2) α-colestanol (P.I.), (3) 24-metilenocolesterol, (4) campesterol, (5) campestanol, (6) estigmasterol, (7) Δ5,23-estigmastadienol, (8) clerosterol, (9) β-sitosterol, (10) sitostanol, (11) Δ5-avenasterol, (12) Δ5,24-estigmastadienol, (13) Δ7-estigmastenol, (14) Δ7-avenasterol, (15) eritrodiol, (16) uvaol.

Figura 3 – Traçado de cromatografia em fase gasosa com detetor de ionização por chama dos esteróis e dos diálcoois triterpénicos de um azeite lampante. (1) Colesterol, (2) α-colestanol, (3) brassicasterol, (4) 24-metilenocolesterol, (5) campesterol, (6) campestanol, (7) estigmasterol, (8) Δ7-campesterol, (9) Δ5,23-estigmastadienol, (10) clerosterol, (11) β-sitosterol, (12) sitostanol, (13) Δ5-avenasterol, (14) Δ5,24-estigmastadienol, (15) Δ7-estigmastenol, (16) Δ7-avenasterol, (17) eritrodiol, (18) uvaol.

Figura 4 – Traçado de cromatografia em fase gasosa com detetor de ionização por chama dos álcoois alifáticos e dos álcoois triterpénicos de um azeite. (I.S. – padrão interno) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) álcoois triterpénicos.

Figura 5 – Traçado de cromatografia em fase gasosa com detetor de ionização por chama dos álcoois alifáticos e dos álcoois triterpénicos de um azeite refinado e de um azeite de segunda centrifugação. (I.S. – padrão interno) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) álcoois triterpénicos.

Figura 6 – Traçado HPLC da fração insaponificável de um azeite separada por HPLC, utilizando um detetor UV (tempo de retenção em minutos). (1) Álcoois alifáticos e álcoois triterpénicos (2) Esteróis e diálcoois triterpénicos.