1.1.

„Poziom reagowania” jest to poziom danej substancji, określony w załączniku do zalecenia 2013/711/UE, którego przekroczenie prowadzi do wszczęcia postępowania zmierzającego do zidentyfikowania źródeł podwyższonych poziomów tej substancji.

1.2.

„Metody przesiewowe” są to metody wykorzystywane do wyboru próbek, w których poziomy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB przekraczają najwyższe dopuszczalne poziomy lub poziomy reagowania. Pozwalają one na względnie tanie i szybkie oznaczanie dużej liczby próbek, zwiększając w ten sposób szansę wykrycia nowych przypadków, w których wysokie narażenie może stanowić ryzyko dla zdrowia konsumentów. Metody przesiewowe muszą opierać się na metodach bioanalitycznych lub metodach GC-MS. Wyniki przekraczające wartość odcięcia, które pochodzą z próbek zbadanych w celu kontroli zgodności z najwyższym dopuszczalnym poziomem, należy zweryfikować, wykonując ponownie pełną analizę oryginalnej próbki laboratoryjnej z wykorzystaniem metody potwierdzającej.

1.3.

„Metody potwierdzające” są to metody, które dostarczają pełnych lub uzupełniających informacji, pozwalające na jednoznaczną identyfikację i ilościowe oznaczenie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB na najwyższym dopuszczalnym poziomie lub w razie potrzeby na poziomie reagowania. W metodach tych wykorzystuje się chromatografię gazową z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (GC-HRMS) lub chromatografię gazową z tandemową spektrometrią mas (GC-MS/MS).

1.4.

„Metody bioanalityczne” są to metody oparte na zasadach biologicznych, np. metody biologiczne wykorzystujące hodowle komórkowe, metody biologiczne bazujące na badaniu receptorów lub testy immunologiczne. Nie dają one wyników na poziomie kongenerów, a jedynie wskazanie (1) poziomu TEQ wyrażonego w równoważnikach bioanalitycznych (BEQ), aby uwzględnić fakt, że nie wszystkie związki obecne w ekstrakcie próbki, które wywołują odpowiedź w badaniu, spełniają wszystkie wymogi zasady TEQ.

1.5.

„Odzysk testu biologicznego” jest to poziom BEQ obliczony z krzywej wzorcowej TCDD lub PCB 126, skorygowany o wynik dla próbki ślepej, a następnie podzielony przez poziom TEQ oznaczony metodą potwierdzającą. Jego celem jest korekta takich czynników, jak strata PCDD/PCDF i związków dioksynopodobnych podczas ekstrakcji i oczyszczania, związki współekstrahowane zwiększające lub zmniejszające odpowiedź (efekt agonistyczny lub antagonistyczny), jakość dopasowania krzywej lub różnice między wartościami TEF a REP. Odzysk testu biologicznego jest obliczany na podstawie wyników badania odpowiednich próbek referencyjnych zawierających reprezentatywny profil kongenerów na poziomie zbliżonym do wartości najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania.

1.6.

„Powtórna analiza” oznacza odrębną analizę analitów będących przedmiotem zainteresowania z wykorzystaniem drugiej podwielokrotności tej samej próbki zhomogenizowanej.

1.7.

„Przyjęta swoista granica oznaczalności (2) danego kongeneru w próbce” jest to najniższa zawartość analitu, którą można zmierzyć z istotną pewnością statystyczną przy spełnieniu kryteriów identyfikacji opisanych w normach uznanych międzynarodowo, na przykład w normie EN 16215:2012 (Pasze – Oznaczanie dioksyn i dioksynopodobnych PCB metodą GC-HRMS oraz wskaźnikowych PCB metodą GC-HRMS) lub w najnowszych wersjach metod EPA 1613 i 1668.

Granicę oznaczalności danego kongeneru można określić jako:

1.8.

„Metoda granicy oznaczalności” (ang. upper-bound) jest to założenie polegające na przyjęciu wartości równej granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów.

1.9.

„Metoda zerowa” (ang. lower-bound) jest to założenie polegające na przyjęciu wartości równej zero dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów.

1.10.

„Metoda połowy granicy oznaczalności” (ang. medium-bound) jest to założenie polegające na przyjęciu wartości równej połowie granicy oznaczalności dla wszystkich nieoznaczonych ilościowo kongenerów.

1.11.

„Partia” jest to możliwa do zidentyfikowania ilość żywności dostarczonej w tym samym czasie, w przypadku której urzędowo stwierdzono, że posiada wspólne cechy, takie jak pochodzenie, odmiana, rodzaj opakowania, pakujący, nadawca lub oznakowanie. W przypadku ryb i produktów rybołówstwa porównywalna musi być również wielkość ryb. Jeżeli wielkość lub masa ryb w przesyłce nie są porównywalne, przesyłka nadal może być traktowana jako partia, należy jednak zastosować specjalne procedury pobierania próbek.

1.12.

„Podpartia” jest to część wydzielona z większej partii w celu zastosowania metody pobierania próbek do tej wyznaczonej części. Każda podpartia musi być fizycznie wydzielona i możliwa do zidentyfikowania.

1.13.

„Próbka pierwotna” jest to ilość materiału pobrana z jednego miejsca w partii lub w podpartii.

1.14.

„Próbka zbiorcza” jest to suma wszystkich próbek pierwotnych pobranych z partii lub podpartii.

1.15.

„Próbka laboratoryjna” jest to reprezentatywna część/ilość próbki zbiorczej przeznaczona dla laboratorium.

BEQ

Równoważnik bioanalityczny

GC

Chromatografia gazowa

HRMS

Wysokorozdzielcza spektrometria mas

LRMS

Niskorozdzielcza spektrometria mas

MS/MS

Tandemowa spektrometria mas

PCB

Polichlorowane bifenyle

Niedioksynopochodne PCB

PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 oraz PCB 180

PCDD

Polichlorowane dibenzo-p-dioksyny

PCDF

Polichlorowane dibenzofurany

QC

Kontrola jakości

REP

Względny potencjał działania

TEF

Współczynnik równoważny toksyczności

TEQ

Równoważnik toksyczności

TCDD

2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioksyna

U

Niepewność rozszerzona pomiaru

—

Jeżeli partia, z której należy pobrać próbki, zawiera małe ryby (poszczególne ryby ważą mniej niż ok. 1 kg), jako próbkę pierwotną w celu utworzenia próbki zbiorczej pobiera się całą rybę. Jeżeli otrzymana masa próbki zbiorczej jest większa niż 3 kg, próbki pierwotne mogą składać się z części środkowej ryb tworzących próbkę zbiorczą, przy czym każda część środkowa waży przynajmniej 100 gramów. Cała część, do której stosuje się najwyższy dopuszczalny poziom, jest stosowana do homogenizacji próbki.

Środkowa część ryby to część, w której znajduje się środek ciężkości. W większości przypadków środek ciężkości ulokowany jest przy płetwie grzbietowej (w przypadku ryb posiadających płetwę grzbietową) lub w połowie odległości między skrzelami a odbytem.

—

Jeżeli partia, z której należy pobrać próbki, zawiera większe ryby (poszczególne ryby ważące więcej niż ok. 1 kg), próbka pierwotna składa się ze środkowej części ryby. Każda próbka pierwotna musi ważyć co najmniej 100 gramów.

W przypadku ryb średniej wielkości (ok. 1–6 kg) jako próbkę pierwotną pobiera się płat ryby od kręgosłupa do brzucha ze środkowej części ryby.

W przypadku bardzo dużych ryb (np. powyżej ok. 6 kg) próbka pierwotna pobierana jest z prawej strony (patrząc od przodu) mięśnia grzbietowo-bocznego w środkowej części ryby. Jeżeli pobranie próbki z takiego miejsca w środkowej części ryby spowodowałoby znaczną szkodę ekonomiczną, za wystarczające można uznać pobranie trzech próbek pierwotnych o masie co najmniej 350 gramów każda, niezależnie od wielkości partii, lub alternatywnie pobranie równie dużych części mięśnia w pobliżu ogona oraz mięśnia w pobliżu głowy jednej ryby w celu utworzenia próbki pierwotnej reprezentatywnej dla poziomu dioksyn w całej rybie.

—

Zastosowanie mają przepisy pkt III.3 odnoszące się do składu próbki.

—

Jeżeli przeważa jakaś klasa lub kategoria wielkości lub masy (ok. 80 % partii lub więcej), próbka pobierana jest z ryb, których wielkość lub masa są przeważające. Próbka ta uważana jest za reprezentatywną dla całej partii.

—

Jeżeli nie przeważa żadna klasa lub kategoria wielkości lub masy, należy zapewnić, aby ryby wybrane do próbki były reprezentatywne dla całej partii. Szczegółowe wytyczne postępowania w takich przypadkach znajdują się w „Wytycznych pobierania próbek z całych ryb o różnej wielkości lub masie” (2).

—

przeprowadzonej metodą przesiewową przy wskaźniku liczby wyników fałszywie ujemnych poniżej 5 % wskazuje, że poziom nie przekracza odpowiedniego najwyższego dopuszczalnego poziomu PCDD/F ani sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, określonych w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006,

—

przeprowadzonej metodą potwierdzającą nie przekracza odpowiedniego najwyższego dopuszczalnego poziomu PCDD/F ani sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, określonych w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru (5).

—

Należy podjąć niezbędne środki dla uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego na każdym etapie pobierania i analizy próbek.

—

Próbki należy przechowywać i transportować w pojemnikach szklanych, aluminiowych, polipropylenowych lub polietylenowych nadających się do tego celu i niemających wpływu na poziomy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach. Pojemnik na próbki należy oczyścić z pyłków papieru.

—

Próbki należy przechowywać i przewozić w taki sposób, by zachowana była integralność próbki środka spożywczego.

—

W razie potrzeby każdą próbkę laboratoryjną należy drobno zemleć i dokładnie wymieszać w sposób gwarantujący pełną homogenizację (np. w sposób umożliwiający przesianie przez sito o oczku 1 mm); jeżeli zawartość wilgoci jest zbyt wysoka, próbki muszą zostać osuszone przed mieleniem.

—

Duże znaczenie ma kontrola odczynników, aparatury i szkła laboratoryjnego pod kątem ewentualnego wpływu na wyniki oparte na TEQ lub BEQ.

—

Należy wykonać analizę ślepej próby, obejmującą przeprowadzenie pełnej procedury analitycznej, ale bez próbki.

—

W przypadku metod bioanalitycznych ważne jest, aby upewnić się, że szkło laboratoryjne i rozpuszczalniki stosowane podczas analizy są wolne od związków interferujących z wykrywaniem związków docelowych w zakresie roboczym. Szkło należy przemyć rozpuszczalnikami lub ogrzać do temperatur, w których z powierzchni usuwane są pozostałości PCDD/F, związków dioksynopodobnych i związków interferujących.

—

Ilość próbki stosowanej do ekstrakcji musi być wystarczająca do spełnienia wymagań dotyczących wystarczająco niskiego zakresu roboczego, obejmującego stężenia na najwyższym dopuszczalnym poziomie lub poziomie reagowania.

—

Konkretne procedury przygotowania próbki stosowane do badanych produktów muszą być zgodne z międzynarodowymi wytycznymi.

—

W przypadku ryb należy usunąć skórę, ponieważ najwyższy dopuszczalny poziom dotyczy mięsa bez skóry. Konieczne jest jednak dokładne i całkowite zdrapanie całego pozostałego mięsa i tkanki tłuszczowej z wewnętrznej strony skóry i dodanie ich do analizowanej próbki.

—

Zgodnie z przepisami rozporządzenia (WE) nr 882/2004 laboratoria muszą być akredytowane przez uznany organ działający zgodnie z przewodnikiem ISO 58, aby zagwarantować, że stosują system zapewniania jakości analitycznej. Laboratoria muszą posiadać akredytację zgodną z normą EN ISO/IEC 17025. W stosownych przypadkach korzysta się z zasad opisanych w dokumencie „Technical Guidelines for the estimation of measurement uncertainty and limits of quantification for PCDD/F and PCB analysis” (1).

—

Biegłość laboratoriów musi być udowodniona stałym uczestnictwem w międzylaboratoryjnych badaniach oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odpowiednich matrycach żywności i zakresach stężeń.

—

Laboratoria stosujące przesiewowe metody analizy do rutynowej kontroli próbek nawiązują ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metody potwierdzające, zarówno w celach kontroli jakości, jak i potwierdzania wyników analitycznych podejrzanych próbek.

—

W przypadku PCDD/F wykrywalne ilości muszą znajdować się na górnym poziomie femtogramów (10– 15 g) z uwagi na ekstremalną toksyczność niektórych z tych związków. W przypadku większości kongenerów PCB granica oznaczalności rzędu nanogramów (10– 9 g) jest już wystarczająca. Jednakże w przypadku oznaczania bardziej toksycznych kongenerów dioksynopodobnych PCB (w szczególności kongenerów podstawionych w pozycji non-orto) dolna granica zakresu roboczego musi osiągnąć niskie poziomy rzędu pikogramów (10– 12 g).

—

Konieczne jest rozróżnienie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB od wielu innych współekstrahowanych i ewentualnie interferujących związków występujących w stężeniach do kilku razy wyższych od stężeń analitów będących przedmiotem zainteresowania. W przypadku metod GC-MS (chromatografia gazowa/spektometria masowa) konieczne jest rozróżnienie między różnymi kongenerami, np. między kongenerami toksycznymi (np. siedemnaście PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 oraz dwanaście dioksynopodobnych PCB) a pozostałymi kongenerami.

—

Metody bioanalityczne muszą być w stanie wykrywać docelowe związki jako sumę PCDD/F lub dioksynopodobnych PCB. Oczyszczanie próbki ma na celu usunięcie związków dających wyniki fałszywie ujemne lub związków, które mogą zmniejszać odpowiedź, powodując wyniki fałszywie ujemne.

—

W przypadku metod GC-MS oznaczenie musi dostarczyć wiarygodnych szacunków rzeczywistego stężenia w próbce. Wysoka dokładność (dokładność pomiaru: stopień zgodności między wynikiem pomiaru a rzeczywistą lub domniemaną wartością mierzoną) jest konieczna, aby uniknąć odrzucenia wyniku analizy próbki z powodu słabej wiarygodności oznaczonego poziomu TEQ. Dokładność jest wyrażona jako poprawność (różnica między średnią wartością mierzoną w odniesieniu do analitu w certyfikowanym materiale a jego certyfikowaną wartością, wyrażona jako odsetek tej wartości) i precyzja (RSDR – względne odchylenie standardowe obliczone na podstawie wyników osiągniętych w warunkach odtwarzalności).

—

W przypadku metod bioanalitycznych należy oznaczyć odzysk testu biologicznego.

—

Laboratoria muszą wykazać zdolność metody w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu, np. 0,5-, 1- i 2-krotność najwyższego dopuszczalnego poziomu przy akceptowalnej wartości współczynnika zmienności obliczonego dla wielokrotnych powtórzeń analizy podczas procedury walidacji lub rutynowej analizy.

—

W ramach wewnątrzlaboratoryjnej kontroli jakości należy regularnie przeprowadzać ślepe próby i badania z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analizy próbek kontrolnych (zwłaszcza certyfikowanych materiałów referencyjnych, jeżeli materiały takie są dostępne). Wykresy kontroli jakości dla ślepych prób, badań z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analiz próbek kontrolnych należy rejestrować i kontrolować, aby upewnić się, że zdolność analityczna jest zgodna z wymaganiami.

—

W przypadku bioanalitycznej metody przesiewowej ustanowienie granicy oznaczalności (LOQ) nie jest niezbędnym wymaganiem, ale należy dowieść, że metoda pozwala na rozróżnienie między ślepą próbą a wartością odcięcia. Podając poziom BEQ, należy ustalić poziom zgłaszania, aby uwzględnić próbki wykazujące odpowiedź poniżej tego poziomu. Należy wykazać, że poziom zgłaszania jest różny od ślepych próbek proceduralnych co najmniej o współczynnik 3 przy odpowiedzi poniżej zakresu roboczego. W związku z powyższym należy go obliczyć z próbek zawierających związki docelowe w granicach wymaganego poziomu minimalnego, a nie ze stosunku S/N lub ze ślepej próby.

—

Granica oznaczalności (LOQ) dla metody potwierdzającej wynosi ok. jednej piątej najwyższego dopuszczalnego poziomu.

—

Dla uzyskania wiarygodnych wyników metodą potwierdzającą lub przesiewową należy spełnić poniższe kryteria w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu dla wartości TEQ w odniesieniu do wartości BEQ, niezależnie do tego, czy są oznaczane jako całkowita wartość TEQ lub BEQ (jako suma PCDD/F i dioksynopodobnych PCB), czy odrębnie dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

—

W metodach przesiewowych można stosować zarówno metody GC-MS, jak i metody bioanalityczne. W przypadku metod GC-MS zastosowanie mają wymagania ustanowione w pkt 6. W przypadku metod bioanalitycznych opierających się na oznaczeniach komórkowych zastosowanie mają szczegółowe wymagania ustanowione w pkt 7.

—

Laboratoria stosujące metody przesiewowe do rutynowej kontroli próbek nawiązują ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metodę potwierdzającą.

—

Podczas rutynowej analizy wymagana jest weryfikacja zdolności metody przesiewowej w drodze kontroli jakości analizy i walidacji metody podczas analizy. Należy prowadzić ciągły program kontroli wyników ujemnych.

—

Należy sprawdzać, czy nie zachodzi ewentualne tłumienie odpowiedzi komórek i cytotoksyczność.

20 % ekstraktów próbek należy analizować rutynowo metodą przesiewową bez TCDD oraz z TCDD dodanym zgodnie z najwyższym dopuszczalnym poziomem lub poziomem reagowania, aby sprawdzić, czy odpowiedź jest ewentualnie tłumiona przez substancje interferujące obecne w ekstrakcie próbki. Zmierzone stężenie próbki wzbogaconej jest porównywane do sumy stężenia ekstraktu próbki niewzbogaconej i stężenia wzbogacenia. Jeżeli zmierzone stężenie jest o ponad 25 % niższe niż obliczone (zsumowane) stężenie, wskazuje to na ewentualne tłumienie sygnału, a odpowiednia próbka musi zostać przekazana do analizy potwierdzającej. Wyniki należy monitorować na wykresach kontroli jakości.

—

Kontrola jakości próbek ujemnych

Należy potwierdzić ok. 2–10 % próbek ujemnych, zależnie od matrycy próbki i doświadczenia laboratorium.

—

Oznaczenie wskaźnika liczby wyników fałszywie ujemnych z danych kontroli jakości

Należy oznaczyć wskaźnik liczby wyników fałszywie ujemnych z badań przesiewowych próbek poniżej i powyżej najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania. Rzeczywisty wskaźnik liczby wyników fałszywie ujemnych nie może przekraczać 5 %.

Po uzyskaniu z kontroli jakości próbek ujemnych co najmniej 20 potwierdzonych wyników na matrycę/grupę matryc należy na podstawie tej bazy danych wyciągnąć wnioski dotyczące wskaźnika liczby wyników fałszywie ujemnych. Do tych 20 wyników w celu oceny wskaźnika liczby wyników fałszywie ujemnych można także włączyć wyniki uzyskane na próbkach analizowanych w badaniach biegłości lub podczas incydentów wystąpienia zanieczyszczenia, obejmujące zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego stężenia. Próbki muszą obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

Chociaż badania przesiewowe mają na celu wykrywanie próbek przekraczających poziom reagowania, kryterium określania wskaźnika liczby wyników fałszywie ujemnych jest najwyższy dopuszczalny poziom, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru metody potwierdzającej.

—

Potencjalnie dodatnie wyniki z badania przesiewowego weryfikuje się zawsze pełną ponowną analizą pierwotnej próbki przy zastosowaniu metody potwierdzającej. Próbki te mogą być też zastosowane do oceny wskaźnika wyników fałszywie dodatnich. W przypadku metod przesiewowych wskaźnik wyników fałszywie dodatnich to odsetek wyników, które potwierdzono w drodze analizy potwierdzającej jako ujemne, a w przypadku których we wcześniejszych badaniach przesiewowych stwierdzono podejrzenie, że są dodatnie. Ocena korzyści metody przesiewowej musi jednak być oparta na porównaniu próbek fałszywie dodatnich z całkowitą liczbą sprawdzonych próbek. Wskaźnik ten musi być na tyle niski, aby stosowanie narzędzia przesiewowego było korzystne.

—

Metody bioanalityczne przynajmniej w warunkach walidacji muszą dostarczyć wiarygodnego wskazania poziomu TEQ, obliczonego i wyrażonego jako BEQ.

—

Także w przypadku metod bioanalitycznych przeprowadzonych w warunkach powtarzalności wewnątrzlaboratoryjny RSDr byłby zwykle niższy niż odtwarzalność RSDR.

—

Do celów potwierdzenia, że zostały przekroczone najwyższe dopuszczalne poziomy lub, w razie potrzeby, poziomy reagowania, różnica między poziomami uzyskanymi metodą granicy oznaczalności i metodą zerową nie może przekraczać 20 %.

—

Aby dokonać walidacji procedury analitycznej, dodanie wzorców wewnętrznych PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla 13C oraz wzorców wewnętrznych dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla 13C musi nastąpić na samym początku analizy, np. przed ekstrakcją. Należy dodać co najmniej jeden kongener dla każdej grupy homologicznej, od tetra- do oktachlorowanego PCDD/F oraz co najmniej jeden kongener dla każdej grupy homologicznej dioksynopodobnych PCB (alternatywnie, co najmniej jeden kongener dla każdej funkcji monitorowania wybranego jonu w spektrometrii mas, służącej do monitorowania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod potwierdzających należy zastosować wszystkie 17 wzorców wewnętrznych PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla 13C oraz wszystkie 12 wzorców wewnętrznych dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla 13C.

—

Dla tych kongenerów, dla których nie zastosowano analogów znakowanych izotopem węgla 13C, należy również oznaczyć względne współczynniki odpowiedzi przez zastosowanie odpowiednich roztworów kalibracyjnych.

—

W przypadku środków spożywczych pochodzenia roślinnego i środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego zawierających mniej niż 10 % tłuszczu dodawanie wzorców wewnętrznych przed ekstrakcją jest obowiązkowe. W przypadku środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego zawierających więcej niż 10 % tłuszczu wzorce wewnętrzne mogą zostać dodane przed albo po ekstrakcji tłuszczu. Zależnie od etapu, na którym wprowadza się wzorce wewnętrzne, a także zależnie od tego, czy wyniki podaje się w odniesieniu do produktu, czy do tłuszczu, należy dokonać właściwej walidacji skuteczności ekstrakcji.

—

Przed analizą GC-MS należy dodać 1 lub 2 wzorce odzysku (zastępcze).

—

Konieczna jest kontrola odzysku. W przypadku metod potwierdzających odzysk poszczególnych wzorców wewnętrznych musi mieścić się w zakresie od 60 do 120 %. Dopuszczalne są niższe lub wyższe wartości odzysku dla poszczególnych kongenerów, w szczególności dla niektórych hepta- i oktachlorowanych dibenzo-p-dioksyn i dibenzofuranów, jeżeli ich udział w wartości TEQ nie przekracza 10 % całkowitej wartości TEQ (na podstawie sumy PCDD/F oraz dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod przesiewowych GC-MS odzysk musi mieścić się w zakresie od 30 do 140 %.

—

Rozdzielenie PCDD/F od interferujących związków chlorowanych, takich jak niedioksynopodobne PCB czy polichlorowane difenyloetery, należy przeprowadzić przez zastosowanie odpowiednich technik chromatograficznych (najlepiej stosując jako wypełnienie kolumny florisil, tlenek glinu lub węgiel).

—

Rozdzielanie izomerów metodą chromatografii gazowej musi być wystarczające (< 25 % nakładania się pików pomiędzy 1,2,3,4,7,8-HxCDF i 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Zakres krzywej wzorcowej musi obejmować odpowiednie zakresy najwyższych dopuszczalnych poziomów lub poziomów reagowania.

—

Dla GC-HRMS:

—

Dla GC-MS/MS:

—

Podczas obliczania stężenia z krzywej wzorcowej TCDD wartości na górnej granicy krzywej wykazywać będą wysoką zmienność (wysoki współczynnik zmienności, CV). Zakres roboczy to obszar, w którym CV jest mniejszy niż 15 %. Dolna granica zakresu roboczego (poziom zgłaszania) musi następnie zostać ustalona znacznie (co najmniej o współczynnik 3) powyżej ślepej próbki proceduralnej. Górna granica zakresu roboczego jest zwykle reprezentowana przez wartość EC70 (70 % najwyższego skutecznego stężenia), ale jest niższa, jeżeli CV jest wyższy niż 15 % w tym zakresie. Zakres roboczy musi być ustalony podczas walidacji. Wartości odcięcia (zob. pkt 7.3) muszą mieścić się w zakresie roboczym.

—

Roztwory wzorcowe i ekstrakty próbek należy zbadać trzykrotnie lub co najmniej dwukrotnie. Przy stosowaniu dwukrotnego badania roztwór wzorcowy lub ekstrakt kontrolny badany w czterech do sześciu dołkach rozmieszczonych na płytce musi wywołać odpowiedź lub dać stężenie (możliwe tylko w zakresie roboczym) w oparciu o CV < 15 %.

—

Poziomy w próbkach można oszacować przez porównanie czułości badania z krzywą wzorcową TCDD (lub PCB 126 albo mieszaniny wzorcowej PCDD/F/dioksynopodobnych PCB) w celu obliczenia poziomu BEQ w ekstrakcie, a następnie w próbce.

—

Krzywe wzorcowe muszą zawierać 8–12 stężeń (co najmniej w dwukrotnym badaniu) z wystarczającą liczbą stężeń w dolnych zakresach krzywej (zakres roboczy). Szczególną uwagę należy zwrócić na jakość dopasowania krzywej w zakresie roboczym. Wartość R2 jako taka ma niewielką lub żadną wartość do celów szacowania dopasowania w regresji nieliniowej. Lepsze dopasowanie jest osiągane poprzez minimalizowanie różnicy między obliczanym a obserwowanym poziomem w zakresie roboczym krzywej (np. przez minimalizowanie sumy kwadratów reszt).

—

Oszacowany poziom w ekstrakcie próbki jest następnie korygowany o poziom BEQ obliczony dla ślepej próbki matrycowej lub próby odczynnikowej (aby uwzględnić zanieczyszczenia z zastosowanych rozpuszczalników i chemikaliów) oraz odzysk (obliczany z poziomu BEQ odpowiednich próbek referencyjnych zawierających reprezentatywny profil kongenerów na poziomie zbliżonym do wartości najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania). Dla przeprowadzenia korekty odzysku odzysk musi zawsze mieścić się w wymaganym zakresie (zob. pkt 7.1.4). Próbki referencyjne stosowane do korekty odzysku muszą być zgodne z wymaganiami podanymi w pkt 7.2.

—

Próbki referencyjne reprezentują matrycę próbki, profile kongenerów i zakresy stężeń dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB na poziomie zbliżonym do wartości najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania.

—

Ślepą próbę proceduralną (lub najlepiej ślepą próbę matrycową) oraz próbkę referencyjną na najwyższym dopuszczalnym poziomie lub poziomie reagowania należy włączyć do każdej serii badań. Próbki te muszą zostać ekstrahowane i zbadane w tym samym czasie w identycznych warunkach. Próbka referencyjna musi dawać wyraźnie podwyższoną odpowiedź w porównaniu ze ślepą próbką, gwarantując przydatność badania. Próbki te można zastosować do korekty ślepej próby i korekty odzysku.

—

Próbki referencyjne wybrane do przeprowadzenia korekty odzysku muszą być reprezentatywne dla próbek badanych, co oznacza, że profile kongenerów nie mogą prowadzić do niedoszacowania poziomów.

—

Można włączyć dodatkowe próbki referencyjne zawierające np. 0,5- i 2-krotność najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania, aby wykazać właściwą zdolność badania — w zakresie zainteresowania — do celów kontroli najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania. Próbki te można zastosować łącznie do obliczania poziomów BEQ w próbkach badanych (zob. pkt 7.1.2.2).

BEQDL

wartość BEQ odpowiadająca decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej będącej najwyższym dopuszczalnym poziomem przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru

sy,x

odchylenie standardowe reszt

t α,f = m-2

czynnik Studenta (α = 5 %, f = stopnie swobody, jednostronne)

m

całkowita liczba punktów kalibracji (indeks j)

n

liczba powtórzeń na każdym poziomie

xi

stężenie próbki (w TEQ) w punkcie kalibracji I określone metodą potwierdzającą

średnia stężeń (w TEQ) wszystkich próbek kalibracji

i

=

indeks punktu kalibracji i

SDR

odchylenie standardowe wyników testu biologicznego przy BEQDL, mierzone w warunkach odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej

1.

z dolnego pasma 95 % przedziału predykcji przy poziomie decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej;

2.

z wielokrotnych analiz próbek (n ≥ 6) zanieczyszczonych na poziomie decyzyjnej wartości granicznej metody potwierdzającej, jako dolna granica dystrybucji danych (reprezentowana na wykresie przez krzywą dzwonową) przy odpowiadającej średniej wartości BEQ.

—

Ponieważ w metodach bioanalitycznych niemożliwe jest stosowanie wzorców wewnętrznych, należy przeprowadzić badania powtarzalności pozwalające na uzyskanie informacji o odchyleniu standardowym w obrębie jednej serii badań i między tymi seriami. Powtarzalność musi być na poziomie poniżej 20 %, a odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna — poniżej 25 %. Wyniki te muszą opierać się na obliczonych poziomach w BEQ po korekcie próby ślepej i odzysku.

—

Jako część procesu walidacji należy wykazać, że badania pozwalają na odróżnienie między próbą ślepą a poziomem wartości odcięcia, umożliwiając identyfikację próbek powyżej odpowiadającej wartości odcięcia (zob. pkt 7.1.2).

—

Należy zdefiniować docelowe związki, możliwe interferencje oraz najwyższy dopuszczalny poziom sygnału próby ślepej.

—

Odchylenie standardowe procentowe w odpowiedzi lub stężeniu obliczonym z odpowiedzi (możliwe tylko w zakresie roboczym) potrójnego oznaczenia ekstraktu próbki nie może przekraczać 15 %.

—

Do oceny zdolności metody bioanalitycznej w stałym okresie należy zastosować nieskorygowane wyniki próbek referencyjnych wyrażone w BEQ (próbka ślepa i najwyższy dopuszczalny poziom lub poziom reagowania).

—

Wykresy kontroli jakości dla ślepej próbki proceduralnej i każdego typu próbki referencyjnej należy zarejestrować i sprawdzić, aby upewnić się, że zdolność analityczna jest zgodna z wymaganiami, w szczególności dla ślepych próbek proceduralnych w odniesieniu do wymaganej minimalnej różnicy między dolną granicą zakresu roboczego oraz dla próbek referencyjnych w odniesieniu do odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej. Ślepe próbki proceduralne muszą być dobrze kontrolowane, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych podczas odejmowania.

—

Należy zgromadzić wyniki z analizy metodami potwierdzającymi podejrzanych próbek oraz 2–10 % próbek ujemnych (co najmniej 20 próbek na matrycę) i zastosować je do oceny zdolności metody przesiewowej oraz związku między BEQ i TEQ. Tę bazę danych można zastosować do ponownej oceny wartości odcięcia stosowanej do rutynowych próbek dla zwalidowanych matryc.

—

Zdolność metody można także wykazać przez uczestnictwo w badaniach biegłości. Wyniki z próbek analizowanych w badaniach biegłości, obejmujących zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego poziomu, mogą zostać włączone do oceny wskaźnika liczby wyników fałszywie ujemnych, jeżeli laboratorium jest w stanie wykazać zdolność metody. Próbki muszą obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

—

Podczas incydentów można ponownie ocenić wartości odcięcia odzwierciedlające konkretne profile matryc i kongenerów danego incydentu.

—

Wyniki analiz muszą zawierać poziomy poszczególnych kongenerów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, przy czym podaje się wartości TEQ zgodnie z metodą zerową, metodą granicy oznaczalności i metodą połowy granicy oznaczalności, aby zawrzeć w sprawozdaniu na temat wyników maksymalną ilość informacji i umożliwić tym samym dokonanie interpretacji wyników zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

—

Sprawozdanie musi także zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F, dioksynopodobnych PCB i tłuszczów. W sprawozdaniu należy oznaczyć i podać zawartość tłuszczu w próbce dla matryc żywności o najwyższym dopuszczalnym poziomie ustalonym w odniesieniu do tłuszczu i oczekiwanym stężeniu tłuszczu w zakresie 0–2 % (zgodnie z obowiązującym prawodawstwem). W przypadku pozostałych próbek oznaczenie zawartości tłuszczu jest opcjonalne.

—

Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem, o którym mowa w pkt 6.2, w przypadku gdy przekroczono najwyższy dopuszczalny poziom (w tym przypadku wartości odzysku dla jednej z dwóch analiz powtórnych), a w pozostałych przypadkach na żądanie.

—

Ponieważ przy ustalaniu zgodności próbki uwzględnia się niepewność rozszerzoną pomiaru, należy podać również ten parametr. W związku z powyższym wyniki badań należy podawać jako x +/– U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U niepewność rozszerzoną pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, co daje przedział ufności na poziomie około 95 %. W przypadku odrębnego oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB należy zastosować sumę szacowanej niepewności rozszerzonej dla odrębnych wyników analitycznych dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odniesieniu do sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

—

Wyniki należy wyrażać w tych samych jednostkach i przy użyciu takiej samej liczby cyfr znaczących co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006.

—

Wynik badań przesiewowych wyrażany jest jako ujemny lub podejrzewany o bycie dodatnim („podejrzany”).

—

Ponadto można podać orientacyjny wynik dla PCDD/F lub dla dioksynopodobnych PCB wyrażony w BEQ (nie TEQ) (zob. pkt 1). Próbki dające odpowiedź poniżej poziomu zgłaszania należy oznaczyć jako poniżej poziomu zgłaszania. Próbki dające odpowiedź powyżej zakresu roboczego oznacza się jako przekraczające zakres roboczy, a poziom odpowiadający górnej granicy zakresu roboczego podaje się w BEQ.

—

W sprawozdaniu, dla każdego typu matrycy próbki, należy podać najwyższy dopuszczalny poziom lub poziom reagowania, na którym opiera się ocena.

—

W sprawozdaniu należy podać zastosowany rodzaj badania, podstawowe zasady badania i rodzaj kalibracji.

—

Sprawozdanie musi także zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F, dioksynopodobnych PCB i tłuszczów. W sprawozdaniu należy oznaczyć i podać zawartość tłuszczu w próbce dla matryc żywności o najwyższym dopuszczalnym poziomie ustalonym w odniesieniu do tłuszczu i oczekiwanym stężeniu tłuszczu w zakresie 0–2 % (zgodnie z obowiązującym prawodawstwem). W przypadku pozostałych próbek oznaczenie zawartości tłuszczu jest opcjonalne.

—

W przypadku próbek podejrzanych o bycie dodatnimi sprawozdanie musi zawierać uwagę o działaniach, jakie należy podjąć. Stężenie PCDD/F oraz sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach, które zawierają ich podwyższone poziomy, trzeba oznaczyć lub potwierdzić przy zastosowaniu metody potwierdzającej.

—

Dodatnie wyniki zgłasza się wyłącznie na podstawie analizy potwierdzającej.

—

Wynik badań przesiewowych wyrażany jest jako ujemny lub podejrzewany o bycie dodatnim („podejrzany”).

—

W sprawozdaniu, dla każdego typu matrycy próbki, należy podać najwyższy dopuszczalny poziom lub poziom reagowania, na którym opiera się ocena.

—

Ponadto można podać poziomy poszczególnych kongenerów PCDD/F lub dioksynopodobnych PCB oraz wartości TEQ zgodnie z metodą zerową, metodą granicy oznaczalności i metodą połowy granicy oznaczalności. Wyniki należy wyrazić w tych samych jednostkach i z (co najmniej) tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006.

—

Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem, o którym mowa w pkt 6.2, a w pozostałych przypadkach na żądanie.

—

W sprawozdaniu podaje się zastosowaną metodę GC-MS.

—

Sprawozdanie musi także zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F, dioksynopodobnych PCB i tłuszczów. W sprawozdaniu należy oznaczyć i podać zawartość tłuszczu w próbce dla matryc żywności o najwyższym dopuszczalnym poziomie ustalonym w odniesieniu do tłuszczu i oczekiwanym stężeniu tłuszczu w zakresie 0–2 % (zgodnie z obowiązującym prawodawstwem). W przypadku pozostałych próbek oznaczenie zawartości tłuszczu jest opcjonalne.

—

W przypadku próbek podejrzanych o bycie dodatnimi sprawozdanie musi zawierać uwagę o działaniach, jakie należy podjąć. Stężenie PCDD/F oraz sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach, które zawierają ich podwyższone poziomy, trzeba oznaczyć lub potwierdzić przy zastosowaniu metody potwierdzającej.

—

Decyzję o tym, że próbka jest dodatnia, podejmuje się wyłącznie po analizie potwierdzającej.

—

Względny czas retencji w stosunku do wzorców wewnętrznych lub referencyjnych (dopuszczalne odchylenia +/– 0,25 %).

—

Rozdzielenie metodą chromatografii gazowej niedioksynopodobnych PCB (od substancji interferujących, przede wszystkim wymywających PCB, w szczególności jeżeli poziomy próbek mieszczą się w zakresie granic ustanowionych w przepisach i jeżeli należy potwierdzić niezgodność (1)).

—

Dla technik GC-MS:

—

Dla GC-ECD:

Potwierdzenie wyników przekraczających najwyższy dopuszczalny poziom przy pomocy dwóch kolumn GC z fazami stacjonarnymi o różnej polarności.

—

Stosowanie właściwych wzorców wewnętrznych o właściwościach fizycznych i chemicznych porównywalnych z właściwościami analitów będących przedmiotem zainteresowania.

—

Dodanie wzorców wewnętrznych:

—

Wymagania dla metod z wykorzystaniem wszystkich sześciu kongenerów niedioksynopodobnych PCB znakowanych izotopowo:

—

Wymagania dla metod niewykorzystujących wszystkich sześciu wzorców wewnętrznych znakowanych izotopowo lub wykorzystujących inne wzorce wewnętrzne:

—

Poziomy odzysku kongenerów nieznakowanych należy sprawdzić przez próbki wzbogacone lub kontrolę jakości próbek o stężeniach w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu. Akceptowalne poziomy odzysku dla tych kongenerów wynoszą między 60 a 120 %.

—

Wyniki analiz muszą zawierać poziomy poszczególnych kongenerów niedioksynopodobnych PCB oraz sumy niedioksynopodobnych PCB, przy czym podaje się wartości zgodnie z metodą zerową, metodą granicy oznaczalności i metodą połowy granicy oznaczalności, aby zawrzeć w sprawozdaniu na temat wyników maksymalną ilość informacji i umożliwić tym samym dokonanie interpretacji wyników zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

—

Sprawozdanie musi także zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCB i tłuszczów. W sprawozdaniu należy oznaczyć i podać zawartość tłuszczu w próbce dla matryc żywności o najwyższym dopuszczalnym poziomie ustalonym w odniesieniu do tłuszczu i oczekiwanym stężeniu tłuszczu w zakresie 0–2 % (zgodnie z obowiązującym prawodawstwem). W przypadku pozostałych próbek oznaczenie zawartości tłuszczu jest opcjonalne.

—

Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem, o którym mowa w pkt 6, w przypadku gdy przekroczono najwyższy dopuszczalny poziom, a w pozostałych przypadkach na żądanie.

—

Ponieważ przy ustalaniu zgodności próbki uwzględnia się niepewność rozszerzoną pomiaru, należy podać również ten parametr. W związku z powyższym wyniki badań należy podawać jako x +/– U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U niepewność rozszerzoną pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, co daje przedział ufności na poziomie około 95 %.

—

Wyniki należy wyrażać w tych samych jednostkach i przy użyciu takiej samej liczby cyfr znaczących co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006.