w sprawie wykonania dyrektywy Rady 2006/88/WE w zakresie środków mających na celu zwalczanie podwyższonej śmiertelności ostryg z gatunku Crassostrea gigas w związku z wykryciem herpeswirusa 1 μvar u ostryg (OsHV-1 μvar)

uwzględniając dyrektywę Rady 2006/88/WE z dnia 24 października 2006 r. w sprawie wymogów w zakresie zdrowia zwierząt akwakultury i produktów akwakultury oraz zapobiegania niektórym chorobom zwierząt wodnych i zwalczania tych chorób (1), w szczególności jej art. 41 ust. 3 i art. 61 ust. 3,

Dla celów niniejszego rozporządzenia OsHV-1 μvar oznacza genotyp wirusa herpeswirus-1 ostryg (OsHV-1), który zdefiniowano na podstawie danych dotyczących częściowej sekwencji wykazującej systematyczną delecję 12 par zasad w ORF 4 genomu w porównaniu z OsHV-1 (GenBank numer dostępu AY509253).

Pobieranie próbek, badanie i ustanawianie obszarów zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby

1. W przypadku wykrycia podwyższonej śmiertelności ostryg z gatunku Crassostrea gigas („ostryg Crassostrea gigas”) właściwy organ:

2. Gdy wyniki badań, o których mowa w ust. 1 lit. b), wykazują obecność wirusa OsHV-1 μvar, właściwy organ ustanawia obszar zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby. Dany obszar określa się na podstawie każdej indywidualnej analizy z uwzględnieniem czynników wpływających na ryzyko rozprzestrzenienia choroby określone w części C załącznika I.

3. Państwa członkowskie niezwłocznie informują Komisję i inne państwa członkowskie o pierwszym obszarze zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby ustanowionym na ich terytorium w 2010 r.

Wymogi w zakresie wprowadzania do obrotu dotyczące ostryg Crassostrea gigas pochodzących z obszaru zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby, o którym mowa w art. 2

1. Ostryg Crassostrea gigas pochodzących z obszarów zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby ustanowionych zgodnie z art. 2 ust. 2 nie przemieszcza się poza ten obszar.

2. W drodze odstępstwa od ust. 1 przesyłki ostryg Crassostrea gigas można przemieszczać poza obszar zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby, jeżeli:

3. Przesyłkom, o których mowa w ust. 2 lit. a) i lit. b), przeznaczonym do obszarów hodowli lub obszarów przejściowych towarzyszy świadectwo zdrowia zwierząt wypełnione zgodnie z wzorem określonym w załączniku II do niniejszego rozporządzenia i z uwagami wyjaśniającymi zawartymi w załączniku V do rozporządzenia (WE) nr 1251/2008.

Właściwy organ może znieść środki zwalczania choroby odnoszące się do obszarów zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby ustanowionych zgodnie z art. 2 ust. 2 i ograniczenia w zakresie wprowadzania do obrotu przewidziane w art. 3 po przeprowadzeniu dwóch kolejnych inspekcji w odstępie 15 dni, które wykazują, że podwyższona śmiertelność ustała.

Wymogi w zakresie wprowadzania do obrotu dotyczące ostryg Crassostrea gigas pochodzących z enklawy wcześniej objętej środkami zwalczania z powodu podwyższonej śmiertelności ostryg Crassostrea gigas związanej z wirusem OsHV-1 μvar

1. Ostrygi Crassostrea gigas, które są wprowadzane do obrotu, a pochodzą z enklawy objętej środkami zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby w 2009 lub 2010 r. z powodu podwyższonej śmiertelności ostryg Crassostrea gigas związanej z wirusem OsHV-1 μvar:

2. Program wczesnego wykrywania wirusa OsHV-1 μvar, o którym mowa w ust. 1 lit. a) ppkt (i), spełnia następujące wymogi:

3. Ustęp 1 stosuje się jeden tydzień od dnia posiedzenia Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt, na którym zgłoszono program, o którym mowa w ust. 1 lit. a) ppkt (i).

1. Państwa członkowskie udostępniają Komisji i pozostałym państwom członkowskim:

2. Informacje przewidziane w ust. 1 są aktualizowane i udostępniane za pośrednictwem informacyjnych stron internetowych stworzonych zgodnie z art. 10 decyzji 2009/177/WE.

Najpóźniej do dnia 1 października 2010 r. państwa członkowskie przedstawiają Komisji sprawozdanie w sprawie programów zgłoszonych zgodnie z art. 5 ust. 2.

Sprawozdanie jest zgodne z wzorem określonym w załączniku VI do decyzji 2009/177/WE.

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie trzeciego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Niniejsze rozporządzenie stosuje się od dnia 15 marca 2010 r. do dnia 31 grudnia 2010 r.

ZAŁĄCZNIK I

CZĘŚĆ A

Pobieranie próbek

1. Pobieranie próbek do celów art. 2

Próbki, o których mowa w art. 2, powinny obejmować co najmniej 12 osobników ostryg Crassostrea gigas. Przy wyborze ostryg do próbki uwzględnia się osobniki słabe, o rozszczelnionych muszlach lub wkrótce po śmierci (które nie uległy rozkładowi), pochodzące z enklawy, w której stwierdzono śmiertelność.

2. Pobieranie próbek do celów art. 3 ust. 2 lit. b), art. 5 ust. 1 lit. b) i art. 5 ust. 2

Pobieranie próbek do celów art. 3 ust. 2 lit. b) obejmuje:

(i)	w przypadku larw – pięć próbek z każdej przesyłki zawierających co najmniej 50 mg całych osobników zebranych w ciągu 4–8 dni od zapłodnienia, w tym muszle;

(ii)	w przypadku jaj mniejszych niż 6 mm – 30 próbek z każdej przesyłki zawierających 300 mg całych osobników, w tym muszle;

(iii)

w przypadku ostryg większych niż 6 mm – 150 osobników z każdej przesyłki.

Przy wyborze tych osobników wszystkie części przesyłki muszą być proporcjonalnie reprezentowane w próbce. Jeżeli obecne są osobniki słabe, o rozszczelnionych muszlach lub wkrótce po śmierci (które nie uległy rozkładowi), wybiera się je w pierwszej kolejności.

Pobieranie próbek do celów art. 5 ust. 2 obejmuje co najmniej 150 osobników Crassostrea gigas z każdego punktu pobierania próbek. Próbki pobiera się we wszystkich gospodarstwach lub obszarach hodowli mięczaków w państwie członkowskim lub enklawie objętej programem.

Pobieranie próbek do celów art. 5 ust. 1 lit. b) obejmuje co najmniej 150 osobników ostryg Crassostrea gigas z każdej enklawy.

Przy wyborze tych osobników uwzględnia się następujące kryteria:

—	jeżeli obecne są osobniki słabe, o rozszczelnionych muszlach lub wkrótce po śmierci (które nie uległy rozkładowi), wybiera się je w pierwszej kolejności; jeżeli takie osobniki nie są obecne, wśród wybranych osobników znajdują się zdrowe mięczaki w wieku poniżej 12 miesięcy,

—	przy pobieraniu próbek w gospodarstwach, w których do produkcji wykorzystuje się więcej niż jedno źródło wodne, pobranie próbek obejmuje osobniki reprezentujące wszystkie źródła w taki sposób, aby wszystkie części gospodarstwa były proporcjonalnie reprezentowane w próbce,

—

przy pobieraniu próbek na obszarach hodowli mięczaków pobranie próbek obejmuje osobniki z wystarczającej liczby punktów pobierania próbek – z co najmniej trzech punktów pobierania próbek – w ten sposób, aby wszystkie części obszaru hodowli mięczaków były proporcjonalnie reprezentowane w próbce, w tym naturalne siedliska występujące na obszarze hodowli mięczaków. Najważniejsze czynniki, które należy uwzględnić podczas wybierania punktów pobierania próbek, są następujące: wcześniejsze wykrycie wirusa OsHV-1 μvar na danym obszarze, gęstość obsady, przepływ wody, batymetria i praktyki zarządzania.

Pobieranie próbek, o którym mowa w art. 5 ust. 2, przeprowadza się w okresie roku, w którym wiadomo, że częstość występowania wirusa OsHV-1 μvar w państwie członkowskim lub enklawie jest największa. Jeżeli takie dane są niedostępne, pobieranie próbek przeprowadza się niezwłocznie po okresie, w którym temperatura wody przekracza 16 °C lub w porze roku, w której temperatura zazwyczaj osiąga maksymalną roczną wartość.

Pobieranie próbek, o którym mowa w art. 5 ust. 1 lit. b) najlepiej jest przeprowadzić w okresie roku opisanym w lit. c). Jeżeli próbki pobiera się poza tym okresem roku, ostrygi, od których pobiera się próbki, zanim zostaną zbadane, muszą być utrzymywane w warunkach równoważnych z warunkami opisanymi w lit. c) przez okres odpowiedni do wykrycia wirusa OsHV-1 μvar.

CZĘŚĆ B

Metody diagnostyczne wykrywania wirusa OsHV-1 μvar

1. Zakres

Niniejsza procedura wyjaśnia standardową metodę diagnostyczną, którą należy stosować do wykrywania i identyfikacji wirusa OsHV-1 μvar za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (zwanej dalej „PCR”). Umożliwia ona rozróżnienie między wirusem OsHV-1 a wirusem OsHV-1 μvar.

W stosownych przypadkach – w celu zoptymalizowania warunków reakcji i dostosowania wyposażenia i warunków w laboratoriach – laboratoria mogą wprowadzić modyfikacje do metod opisanych w niniejszym załączniku, pod warunkiem że możliwe jest wykazanie jednakowej czułości i swoistości.

2. Definicja

Wirus OsHV-1 μvar jest zdefiniowany w art. 1 niniejszego rozporządzenia.

3. Wyposażenie i warunki otoczenia

Badanie diagnostyczne stosowane do wykrywania i identyfikacji wirusa OsHV-1 μvar za pomocą metody PCR wymaga następującego wyposażenia i warunków otoczenia zwyczajowo stosowanych w analizie PCR:

—	zamkniętego dygestorium wyposażonego w urządzenie wytwarzające promieniowanie UV w celu wyeliminowania możliwości skażenia podczas przygotowywania mieszaniny reakcyjnej PCR,

—	dwóch pełnych zestawów pipet (2 μl, 20 μl, 200 μl i 1 000 μl), pierwszego w celu ekstrakcji DNA, drugiego w celu przygotowania mieszaniny reakcyjnej PCR,

—	trzech różnych pipet: jednej pipety (2 μl) w celu dozowania próbek w mieszaninie reakcyjnej PCR, jednej pipety (20 μl) w celu analizy EB próbek i kolejnej pipety (20 μl) w celu umieszczenia produktów reakcji PCR w żelu agarozowym,

—	końcówek filtrujących do pipet (2 μl, 20 μl, 200 μl i 1 000 μl) w celu ekstrakcji DNA, przygotowywania mieszaniny reakcyjnej PCR i dozowania próbek,

—	końcówek do pipet (20 μl) w celu zebrania próbek do analizy EB i do umieszczenia produktów amplifikacji w żelu agarozowym,

—	termocyklera w celu przeprowadzenia amplifikacji,

—	urządzenia do elektroforezy poziomej w celu przeprowadzenia elektroforezy produktów PCR,

—	tabeli UV w celu obserwacji produktów PCR po elektroforezie żelu agarozowego,

—	systemu uzyskiwania obrazów żelu.

Podczas wszystkich opisanych poniżej poszczególnych etapów laborant musi być ubrany w fartuch laboratoryjny i nosić rękawice. Fartuch laboratoryjny i rękawice należy zmieniać najlepiej po każdym głównym etapie: ekstrakcji DNA, przygotowaniu mieszaniny reakcyjnej PCR, dozowaniu próbek, amplifikacji i umieszczaniu w żelu.

Zaleca się przeprowadzanie tych etapów w różnych pomieszczeniach. Przede wszystkim amplifikacja i umieszczanie w żelu/elektroforeza powinny odbywać się w innym pomieszczeniu niż ekstrakcja DNA, przygotowanie mieszaniny reakcyjnej PCR i dozowanie DNA.

4. Procedura

4.1. Przygotowanie próbek

Ostrygi żywe lub wkrótce po śmierci (które nie uległy rozkładowi), które można uprzednio zamrozić, przygotowuje się w celu ekstrakcji DNA.

Sposób przygotowania próbek zależy od ich rozmiaru:

a)	w przypadku larw – próbki zawierające 50 mg całych osobników (w tym muszle) i uzupełnione 200 μl wody destylowanej rozgniata się i odwirowuje z prędkością 1 000 g na 1 min;

b)	w przypadku jaj mniejszych lub równych 6 mm – próbki zawierające 300 mg całych osobników (w tym muszle) i uzupełnione 1 200 μl wody destylowanej rozgniata się i odwirowuje z prędkością 1 000 g na 1 min;

c)	w przypadku jaj o wielkości 6–15 mm – wszystkie tkanki miękkie każdego osobnika rozgniata się indywidualnie;

d)	w przypadku osobników większych niż 15 mm oddziela się skrzela i płaszcz.

Ekstrakcję DNA przeprowadza się przy użyciu QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) i zgodnie z instrukcjami protokołu badania tkanki.

Dalsze przygotowanie próbki przeprowadza się w następującej kolejności:

1.	Umieścić 100 μl supernatantu w przypadku próbek, o których mowa w lit. a) i b), lub 10–50 mg tkanki w przypadku próbek, o których mowa w lit. c) i d), w rurce wirówki o pojemności 1,5 ml i dodać 180 μl buforu ATL.

2.	Dodać 20 μl roztworu Proteinase K, mieszać, wirując i inkubować w temperaturze 56 °C do momentu całkowitego rozpadu tkanki (przez noc). Podczas inkubacji, aby rozproszyć próbkę, wirować od czasu do czasu. Odwirować krótko rurkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby usunąć krople z przykrywki.

3.	Do próbki dodać 200 μl buforu AL, mieszać, wirując pulsacyjnie, przez 15 s i inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 min. Odwirować krótko rurkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby usunąć krople z przykrywki.

4.	Do próbki dodać 200 μl etanolu (96–100 %) i mieszać, wirując pulsacyjnie, przez 15 s. Odwirować krótko rurkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby usunąć krople z przykrywki.

Wprowadzić ostrożnie mieszaninę opisaną w kroku 4 do kolumny QIAamp Spin (w probówce o pojemności 2 ml), unikając zwilżenia krawędzi. Założyć przykrywkę i odwirowywać przez 1 minutę z prędkością 10 000 obr./min. Umieścić kolumnę QIAamp Spin w czystej probówce o pojemności 2 ml (znajdującej się w zestawie) i odstawić rurkę zawierającą filtrat.

6.	Ostrożnie otworzyć kolumnę QIAamp Spin i dodać 500 μl buforu AW1, nie mocząc krawędzi. Założyć przykrywkę i odwirowywać przez 1 minutę z prędkością 10 000 obr./min. Umieścić kolumnę QIAamp w czystej probówce o pojemności 2 ml (znajdującej się w zestawie) i odstawić probówkę zawierającą filtrat.

7.	Ostrożnie otworzyć kolumnę QIAamp Spin i dodać 500 μl buforu AW2, nie mocząc krawędzi. Założyć przykrywkę i odwirowywać przez 3 minuty z pełną prędkością (14 000 obr./min).

8.	(Nieobowiązkowo) Umieścić kolumnę QIAamp Spin w nowej probówce o pojemności 2 ml (nieznajdującej się w zestawie) i odstawić probówkę zawierającą filtrat. Odwirowywać przez 1 minutę z pełną prędkością (14 000 obr./min).

Umieścić kolumnę QIAamp Spin w czystej rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (nieznajdującej się w zestawie) i odstawić probówkę zawierającą filtrat. Ostrożnie otworzyć kolumnę QIAamp Spin i dodać 100 μl wody destylowanej. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odwirowywać przez 1 minutę z prędkością 10 000 obr./min.

10.	Kontrolować jakość i skuteczność ekstrakcji (na przykład, mierząc OD (260 nm) za pomocą spektrofotometru lub po elektroforezie w żelu agarozowym).

11.	Przygotować rozcieńczone próbki w celu uzyskania końcowej koncentracji DNA wynoszącej 50–100 ng/μl.

12.	Do czasu przeprowadzenia analiz PCR roztwory DNA przechowuje się w temperaturze 4 °C.

Do ekstrakcji DNA można wykorzystywać inne zestawy znajdujące się w sprzedaży, pod warunkiem udowodnienia, że dają podobne wyniki.

4.2. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)

4.2.1. Odczynniki

—	bufor 10 X (dostarczany z polimerazą Taq DNA)

—	MgCl2 (dostarczany z polimerazą DNA) (25 mM)

—	polimeraza Taq DNA (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl

—	przed użyciem dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM) należy rozcieńczyć 10-krotnie (do 2 mM)

—	dH2O (destylowane H2O bez DNA i RNA)

4.2.2. Startery

Należy stosować następujące startery (1):

CF (10 μM)

CR (10 μM)

4.2.3. Mieszanina PCR

Mieszanina PCR dla każdej rurki:

	Objętość na rurkę	Końcowa koncentracja
Bufor (10 X)	5 μl	1X
MgCl2 (25 mM)	5 μl	2,5 mM
dNTP (2 mM)	5 μl	0,2 mM
CF (10 μM)	1 μl	0,2 μM
CR (10 μM)	1 μl	0,2 μM
Polimeraza Taq (5 U/μl)	0,5 μl	2,5 U
dH2O	31,5 μl

—	w każdej rurce PCR umieszcza się 49 μl mieszaniny PCR

—	do każdej rurki dodaje się 1 μl ekstrahowanego DNA (50–100 ng/μl)

4.2.4. Kontrole

Stosuje się dwa rodzaje kontroli:

—	kontrole negatywne składają się z dH2O (1 μl na 49 μl mieszaniny PCR). Mają one na celu wykrycie ewentualnego zanieczyszczenia odczynników lub środowiska pracy; jedną kontrolę negatywną należy przeprowadzić na co dziesiątej próbce lub po każdej partii próbek,

—

kontrole pozytywne oparte na DNA plazmidowym zawierającym obszar CF-CR docelowego genomu OsHV-1, które mają na celu skontrolowanie skuteczności reakcji PCR. Przy każdej analizie PCR należy przeprowadzić jedną kontrolę pozytywną. Kontrole pozytywne dostępne są we wspólnotowym laboratorium referencyjnym.

4.2.5. Amplifikacja

Cykle amplifikacji przeprowadza się w termocyklerze.

—	Początkowa denaturacja: 2 min w temperaturze 94 °C

—	Amplifikacja: 35 cykli (1 min w temperaturze 94 °C, 1 min w temperaturze 50 °C i 1 min w temperaturze 72 °C)

—	Końcowa elongacja: 5 min w temperaturze 72 °C

4.3. Elektroforeza

4.3.1. Odczynniki

—

50 X TAE (możliwość zakupienia bezpośrednio gotowego do użytku):

—	bufor tris (40 mM) 242 g

—	kwas octowy lodowaty (40 mM) 57,1 ml

—	Na2EDTA.2H2O (1 mM) 18,61 g

—	dH2O na 1 litr

—	Doprowadzić pH do wartości 8

—	Żel agarozowy 2,5 % w 1X TAE Bromek etydyny (0,5 μg/ml) dodany po schłodzeniu żelu.

—

Niebieski barwnik ładujący:

—	błękit bromofenolowy 0,25 %

—	cyjanoksylen FF 0,25 %

—	sacharoza 40 %

—	Przechowywać w temperaturze 4 °C.

—	Należy stosować po 6-krotnym rozcieńczeniu (2 μl niebieskiego bufora ładującego na 10 μl produktów PCR).

—	Marker masy cząsteczkowej: SmartLadder SF (Eurogentec): gotowy do użycia marker masy cząsteczkowej zawierający 9 regularnie rozstawionych pasm od 100 do 1 000 bp.

4.3.2. Przygotowanie żelu agarozowego

1.	Zważyć 2,5 g agarozy, dodać 100 ml 1X TAE i podgrzewać aż do rozpuszczenia mieszaniny.

2.	Po schłodzeniu roztworu dodaje się bromek etydyny (5 μl na 100 ml żelu agarozowego) i umieszcza się roztwór w specjalnej formie wyposażonej w grzebienie (aby ukształtować dołki).

3.	Po polimeryzacji żelu usuwa się grzebienie, a żel umieszcza w zestawie do elektroforezy poziomej zawierającym wystarczająco 1X TAE, aby pokryć żel agarozowy.

4.	10 μl produktów PCR miesza się z 2 μl niebieskiego barwnika (6X) i umieszcza w dołkach.

5.	Jednemu dołkowi odpowiada jeden marker masy cząsteczkowej (5 μl).

6.	Stosuje się napięcie 50–150 V przez okres od 30 min do 1 godz. w zależności od objętości i gęstości żelu.

7.	Żel obserwuje się w świetle ultrafioletowym.

4.4. Interpretacja

Obecność pasma odpowiedniej szerokości (157 bp zamiast 173 bp dla OsHV-1) na 2,5 % żelu agarozowym przy ujemnych wynikach wszystkich kontroli negatywnych i dodatnich wynikach wszystkich kontroli pozytywnych wskazuje na obecność OsHV-1 μVar w próbce.

CZĘŚĆ C

Określanie obszaru zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby

Przy określaniu obszaru zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby należy uwzględnić następujące czynniki wpływające na ryzyko rozprzestrzeniania się takiej choroby zgodnie z art. 2 ust. 2:

a)	liczbę, odsetek i rozmieszczenie mięczaków w zakażonym gospodarstwie lub na zakażonym obszarze hodowli mięczaków;

b)	odległość i zagęszczenie sąsiednich gospodarstw lub sąsiednich obszarów hodowli mięczaków;

c)	odległość od zakładu przetwórczego, przyległych gospodarstw lub przyległych obszarów hodowli mięczaków;

d)	gatunki znajdujące się w gospodarstwach lub na obszarach hodowli mięczaków;

e)	praktyki hodowlane stosowane w zakażonych i sąsiednich gospodarstwach lub na zakażonych i sąsiednich obszarach hodowli mięczaków; oraz

f)	ustalone warunki hydrodynamiczne i inne czynniki o znaczeniu epizootiologicznym.

(1) Startery te lub ich opisy można otrzymać ze wspólnotowego laboratorium referencyjnego ds. chorób mięczaków (LGP-Ifremer, av de Mus de Loup, 17390 La Tremblade, Francja).