1.1.

Próg podejmowania działań oznacza poziom danej substancji, określony w załączniku do zalecenia 2011/516/UE, który prowadzi do rozpoczęcia dochodzenia w celu zidentyfikowania źródła tej substancji w przypadkach, w których wykrywane są podwyższone poziomy tej substancji.

1.2.

Metody bioanalityczne oznaczają metody oparte na zasadach biologicznych, np. oznaczenia wykorzystujące hodowle komórkowe, oznaczenie wykorzystujące receptor lub oznaczenie immunologiczne. Nie dają one wyników na poziomie kongenerów, a jedynie wskazanie (2) poziomu TEQ wyrażonego w równoważnikach bioanalitycznych (BEQ), aby uwzględnić fakt, że nie wszystkie związki obecne w ekstrakcie próbki, które wywołują odpowiedź w badaniu, spełniają wszystkie wymogi zasady TEQ.

1.3.

Odzysk uzyskany w oznaczeniu biologicznym oznacza poziom BEQ obliczony z TCDD lub krzywej kalibracyjnej PCB 126, skorygowany o próbę ślepą, a następnie podzielony przez poziom TEQ określony metodą GC/HRMS. Jego celem jest korekta takich czynników, jak strata PCDD/PCDF i związków dioksynopodobnych podczas ekstrakcji i oczyszczania, związki współekstrahowane zwiększające lub zmniejszające odpowiedź (efekt agonistyczny lub antagonistyczny), jakość dopasowania krzywej lub różnice między wartościami TEF a REP. Odzysk uzyskany w oznaczeniu biologicznym jest obliczany z odpowiednich próbek referencyjnych z reprezentatywnymi profilami kongenerów na poziomie zainteresowania.

1.4.

Metody półilościowe oznaczają metody, które dają przybliżone wskazanie stężenia przypuszczalnie występującego analitu, podczas gdy wynik liczbowy nie spełnia wymogów dla metod ilościowych.

1.5.

Akceptowalna swoista granica oznaczalności pojedynczego kongeneru oznacza stężenie analitu w ekstrakcie próbki, które wywołuje odpowiedź instrumentu na impuls dla dwóch różnych jonów, monitorowaną przy współczynniku S/N (sygnał/szum) wynoszącym 3:1 dla sygnału mniej wrażliwego i przy spełnieniu kryteriów identyfikacji opisanych na przykład w normie prEN 16215 (Pasze – Oznaczanie dioksyn i dioksynopodobnych PCB metodą GC-HRMS oraz wskaźnikowych PCB metodą GC-HRMS) lub w metodzie EPA 1613, rev. B.

1.6.

Koncepcja górnej granicy wymaga podania zawartości równej granicy oznaczalności dla każdego kongeneru niemożliwego do oznaczenia.

1.7.

Koncepcja dolnej granicy wymaga podania ślepej zawartości dla każdego kongeneru niemożliwego do oznaczenia.

1.8.

Koncepcja średniej granicy wymaga podania zawartości równej połowie granicy oznaczalności dla każdego kongeneru niemożliwego do oznaczenia.

1.9.

Partia oznacza możliwą do zidentyfikowania ilość żywności dostarczonej w jednym czasie, określoną przez urzędnika jako posiadającą wspólne cechy, takie jak pochodzenie, odmiana, rodzaj opakowania, pakujący, nadawca lub znakowanie. W przypadku ryb i produktów rybołówstwa porównywalna musi być również wielkość ryb. Jeżeli wielkość lub masa ryb w przesyłce nie są porównywalne, przesyłka nadal może być traktowana jako partia, należy jednak zastosować specjalne procedury pobierania próbek.

1.10.

Podpartia oznacza część wyznaczoną z większej partii w celu zastosowania metody pobierania próbek do tej wyznaczonej części. Każda podpartia musi być fizycznie oddzielona i możliwa do zidentyfikowania.

1.11.

Próbka pierwotna oznacza ilość materiału pobraną z jednego miejsca w partii lub w podpartii.

1.12.

Próbka zbiorcza oznacza całość utworzoną przez połączenie wszystkich próbek pierwotnych pobranych z partii lub podpartii.

1.13.

Próbka laboratoryjna oznacza reprezentatywną część/ilość próbki zbiorczej przeznaczoną dla laboratorium.

BEQ

Równoważnik bioanalityczny

GC

Chromatografia gazowa

HRMS

Spektrometria masowa o wysokiej rozdzielczości

LRMS

Spektrometria masowa o niskiej rozdzielczości

PCB

Polichlorowane bifenyle

PCDD

Polichlorowane dibenzo-p-dioksyny

PCDF

Polichlorowane dibenzofurany

QC

Kontrola jakości

REP

Względny potencjał działania

TEF

Współczynnik równoważny toksyczności

TEQ

Równoważnik toksyczności

TCDD

Tetrachlorodibenzodioksyna

U

Rozszerzona niepewność pomiaru

—

Jeżeli partia, z której należy pobrać próbki, zawiera małe ryby (poszczególne ryby ważą mniej niż ok. 1 kg), jako próbkę pierwotną w celu utworzenia próbki zbiorczej pobiera się całą rybę. Jeżeli otrzymana masa próbki zbiorczej jest większa niż 3 kg, próbki pierwotne mogą składać się z części środkowej ryb tworzących próbkę zbiorczą, ważącej przynajmniej 100 gramów każda. Cała część, do której stosuje się najwyższy dopuszczalny poziom, jest stosowana do homogenizacji próbki.

Środkowa część ryby to część, w której znajduje się środek ciężkości. W większości przypadków środek ciężkości ulokowany jest przy płetwie grzbietowej (w przypadku ryb posiadających płetwę grzbietową) lub w połowie odległości między skrzelami a odbytem.

—

Jeżeli partia, z której należy pobrać próbki, zawiera większe ryby (poszczególne ryby ważące więcej niż ok. 1 kg), próbka pierwotna składa się ze środkowej części ryby. Każda próbka pierwotna powinna ważyć co najmniej 100 gramów.

W przypadku ryb średniej wielkości (ok. 1–6 kg) jako próbkę pierwotną pobiera się płat ryby od kręgosłupa do brzucha ze środkowej części ryby.

W przypadku bardzo dużych ryb (np. powyżej ok. 6 kg) próbka pierwotna pobierana jest z prawej strony (patrząc od przodu) mięśnia grzbietowo-bocznego w środkowej części ryby. Jeżeli pobranie próbki z takiego miejsca w środkowej części ryby spowodowałoby znaczne szkody ekonomiczne, wystarczające może być pobranie trzech próbek pierwotnych o masie co najmniej 350 gramów każda, niezależnie od wielkości partii, lub alternatywnie pobranie równych części mięśnia w pobliżu ogona oraz mięśnia w pobliżu głowy jednej ryby w celu utworzenia próbki pierwotnej reprezentatywnej dla poziomu dioksyn w całej rybie.

—

Zastosowanie mają przepisy pkt III.3 odnoszące się do składu próbki.

—

Jeżeli przeważa jakaś klasa lub kategoria wielkości lub masy (ok. 80 % partii lub więcej), próbka pobierana jest z ryb, których wielkość lub masa są przeważające. Próbka ta uważana jest za reprezentatywną dla całej partii.

—

Jeżeli nie przeważa żadna klasa lub kategoria wielkości lub masy, należy dopilnować, aby ryby wybrane do próbki były reprezentatywne dla całej partii. Szczegółowe wytyczne postępowania w takich przypadkach znajdują się w „Wytycznych pobierania próbek z całych ryb o różnej wielkości lub masie” (2).

—

obliczając niepewność rozszerzoną z użyciem współczynnika rozszerzenia 2, która określa przedział ufności na poziomie około 95 %. Partia lub podpartia jest niezgodna, jeśli mierzona wartość po odjęciu U jest wyższa niż dopuszczalny poziom,

—

ustalając decyzyjną wartość graniczną (CCα) zgodnie z przepisami decyzji 2002/657/WE (pkt 3.1.2.5 załącznika I do tej decyzji – przypadki substancji, dla których ustalono dopuszczalny poziom). Partia lub podpartia jest niezgodna, jeżeli wartość mierzona jest równa lub wyższa niż CCα.

—

przeprowadzonej metodą przesiewową przy wskaźniku ilości wyników fałszywie ujemnych poniżej 5 % wskazuje, że poziom nie przekracza odpowiedniego najwyższego dopuszczalnego poziomu PCDD/F ani sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, określonych w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006,

—

przeprowadzonej metodą potwierdzającą nie przekracza odpowiedniego najwyższego dopuszczalnego poziomu PCDD/F ani sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, określonych w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006, przy uwzględnieniu niepewność pomiaru.

—

obliczając niepewność rozszerzoną z użyciem współczynnika rozszerzenia 2, która określa przedział ufności na poziomie około 95 %. Partia lub podpartia jest niezgodna, jeśli mierzona wartość po odjęciu U jest wyższa niż dopuszczalny poziom. W przypadku odrębnego oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB należy zastosować sumę szacowanej niepewności rozszerzonej odrębnych wyników analitycznych dla dioksyn i dioksynopodobnych PCB, w odniesieniu do szacowanej niepewności rozszerzonej sumy dioksyn i dioksynopodobnych PCB,

—

ustalając decyzyjną wartość graniczną (CCα) zgodnie z przepisami decyzji 2002/657/WE (pkt 3.1.2.5 załącznika I do tej decyzji – przypadki substancji, dla których ustalono dopuszczalny poziom). Partia lub podpartia jest niezgodna, jeżeli wartość mierzona jest równa lub wyższa niż CCα.

a)

wybór próbek o poziomach PCDD/F i dioksynopodobnych PCB przekraczających najwyższe dopuszczalne poziomy lub progi podejmowania działań. Podejście to może wymagać zastosowania metody przesiewowej pozwalającej na oszczędną i skuteczną przepustowość próbek i zwiększającej w ten sposób szansę wykrycia nowych incydentów o wysokim stopniu narażenia i ryzyku dla zdrowia konsumentów. Metody przesiewowe mogą obejmować metody bioanalityczne i metody GC/MS. Ich stosowanie powinno mieć na celu unikanie wyników fałszywie ujemnych. Stężenie PCDD/F oraz sum PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach, które zawierają znaczące ich poziomy, należy oznaczyć lub potwierdzić przy zastosowaniu metody potwierdzającej;

b)

oznaczanie poziomów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach żywności przy wielu niskich poziomach tła. Jest to ważne dla śledzenia tendencji w czasie, oceny narażenia populacji i stworzenia bazy danych na potrzeby ewentualnej ponownej oceny progów podejmowania działań i najwyższych dopuszczalnych poziomów. Cel ten jest osiągany przy zastosowaniu metody potwierdzającej pozwalającej w sposób jednoznaczny identyfikować i oznaczać ilościowo PCDD/F i dioksynopodobne PCB na poziomie zainteresowania. Metody te można stosować do potwierdzania wyników uzyskanych metodami przesiewowymi oraz do oznaczania niskich poziomów tła w monitorowaniu żywności. Są one ważne także dla ustanowienia profili kongenerów w celu zidentyfikowania źródła ewentualnego zanieczyszczenia. Obecnie metody te wykorzystują chromatografię gazową wysokiej rozdzielczości lub spektrometrię masową wysokiej rozdzielczości (HRGC/HRMS).

—

metody bioanalityczne, które mogą wykrywać interesujące anality, obejmować krzywą kalibracji, dawać odpowiedź tak/nie dla wskazania ewentualnego przekroczenia poziomu zainteresowania oraz pozwalać na uzyskiwanie wyników w postaci równoważników bioanalitycznych (BEQ), będących wskazaniem wartości TEQ w próbce,

—

badania fizykochemiczne (np. GC-MS/MS lub GC/LRMS), gdzie wyznaczone parametry precyzji metody nie spełniają kryteriów dla badania ilościowego.

—

Należy podjąć niezbędne środki dla uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego na każdym etapie pobierania i analizy próbek.

—

Próbki należy przechowywać i transportować w pojemnikach szklanych, aluminiowych, polipropylenowych lub polietylenowych nadających się do tego celu i nie mających wpływu na poziomy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach. Pojemnik na próbki należy oczyścić z pyłków papieru.

—

Przechowywanie i przewożenie próbek należy przeprowadzać w sposób zachowujący integralność próbki środka spożywczego.

—

W razie potrzeby każdą próbkę laboratoryjną należy drobno zemleć i dokładnie wymieszać w sposób gwarantujący pełną homogenizację (np. w sposób umożliwiający przesianie przez sito o oczku 1 mm); jeżeli zawartość wilgoci jest zbyt wysoka, próbki muszą zostać osuszone przed mieleniem.

—

Duże znaczenie ma kontrola odczynników, aparatury i szkła laboratoryjnego pod kątem ewentualnego wpływu na wyniki oparte na TEQ lub BEQ.

—

Należy wykonać analizę ślepej próby, obejmującą przeprowadzenie pełnej procedury analitycznej, ale bez próbki.

—

W przypadku metod bioanalitycznych ważne jest, aby upewnić się, że szkło laboratoryjne i rozpuszczalniki stosowane podczas analizy są wolne od związków interferujących w wykrywaniu związków docelowych w zakresie roboczym. Szkło należy przemyć rozpuszczalnikami lub ogrzać do temperatur, w których z powierzchni usuwane są pozostałości PCDD/F, związków dioksynopodobnych i związków interferujących.

—

Ilość próbki stosowanej do ekstrakcji musi być wystarczająca do spełnienia wymogów dotyczących wystarczająco niskiego zakresu roboczego, obejmującego stężenia na poziomie zainteresowania.

—

Konkretne procedury przygotowania próbki stosowane do badanych produktów powinny być zgodne z międzynarodowymi wytycznymi.

—

W przypadku ryb należy usunąć skórę, ponieważ najwyższy dopuszczalny poziom dotyczy mięsa bez skóry. Konieczne jest jednak dokładne i całkowite zdrapanie całego pozostałego mięsa i tkanki tłuszczowej z wewnętrznej strony skóry i dodanie ich do analizowanej próbki.

—

Zgodnie z przepisami rozporządzenia (WE) nr 882/2004 laboratoria powinny być akredytowane przez uznany organ działający zgodnie z przewodnikiem ISO 58, aby zagwarantować, że w przeprowadzaniu analiz stosują system zapewniania jakości. Laboratoria muszą posiadać akredytację zgodną z normą EN ISO/IEC 17025.

—

Profesjonalizm laboratoriów należy udowadniać stałym uczestnictwem w międzylaboratoryjnych badaniach oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odpowiednich matrycach żywności i zakresach stężeń.

—

Laboratoria stosujące przesiewowe metody analizy do rutynowej kontroli próbek powinny nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metody potwierdzające, zarówno w celach kontroli jakości, jak i potwierdzania wyników analitycznych podejrzanych próbek.

—

W przypadku PCDD/F wykrywalne ilości muszą znajdować się na poziomie femtogramów (10–15 g) z uwagi na ekstremalną toksyczność niektórych spośród tych związków. W przypadku większości kongenerów PCB granica oznaczalności rzędu nanogramów (10–9 g) jest już wystarczająca. Jednakże w przypadku oznaczania bardziej toksycznych kongenerów dioksynopodobnych PCB (w szczególności kongenerów non-orto), dolna granica zakresu roboczego musi znajdować się na poziomie pikogramów (10–12 g).

—

Konieczne jest rozróżnienie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB od wielu innych współekstrahowanych i ewentualnie interferujących związków występujących w stężeniach do kilku razy wyższych od stężeń interesujących analitów. W przypadku metod GC/MS (chromatografia gazowa/spektometria masowa) konieczne jest rozróżnienie między różnymi kongenerami, takimi jako kongenery toksyczne (np. siedemnaście PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 oraz dwanaście dioksynopodobnych PCB) i pozostałe kongenery.

—

Metody bioanalityczne powinny być w stanie wykrywać docelowe związki jako sumę PCDD/F oraz dioksynopodobnych PCB. Oczyszczanie próbki ma na celu usunięcie związków dających wyniki fałszywie ujemne lub związków, które mogą zmniejszać odpowiedź, powodując wyniki fałszywie ujemne.

—

W przypadku metod GC/MS oznaczenie musi dostarczyć wiarygodnych szacunków rzeczywistego stężenia w próbce. Wysoka dokładność (dokładność pomiaru: stopień zgodności między wynikiem pomiaru a rzeczywistą lub domniemaną wartością mierzoną) jest konieczna, aby uniknąć odrzucenia wyniku analizy próbki z powodu słabej wiarygodności oznaczonego poziomu TEQ. Dokładność jest wyrażona jako prawdziwość (różnica między średnią wartością mierzoną w odniesieniu do analitu w certyfikowanym materiale a jego certyfikowaną wartością, wyrażona w procentach) i precyzja (RSDR – względne odchylenie standardowe obliczone na podstawie wyników osiągniętych w warunkach odtwarzalności).

—

W przypadku metod bioanalitycznych należy oznaczyć odzysk uzyskany w oznaczeniu biologicznym.

—

Laboratoria muszą wykazać zdolność metody w zakresie poziomu zainteresowania, np. 0,5-, 1- i 2-krotność poziomu zainteresowania wraz z akceptowalną wartością współczynnika zmienności obliczonego dla wielokrotnych powtórzeń analizy podczas procedury walidacji lub rutynowej analizy.

—

W ramach wewnątrzlaboratoryjnej kontroli jakości należy regularnie przeprowadzać ślepe próby i badania z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analizy próbek kontrolnych (zwłaszcza certyfikowanych materiałów referencyjnych, jeżeli materiały takie są dostępne). Wykresy kontroli jakości dla ślepych prób, badań z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analiz próbek kontrolnych należy rejestrować i kontrolować, aby upewnić się, że zdolność jest zgodna z wymaganiami.

—

W przypadku bioanalitycznej metody przesiewowej ustanowienie granicy oznaczalności (LOQ) nie jest niezbędnym wymogiem, ale należy dowieść, że metoda pozwala na rozróżnienie między ślepą próbą a wartością odcięcia. Podając poziom BEQ, należy ustalić poziom zgłaszania, aby uwzględnić próbki wykazujące odpowiedź poniżej tego poziomu. Należy wykazać, że poziom zgłaszania jest różny od procedury ślepej próby co najmniej o współczynnik 3 przy odpowiedzi poniżej zakresu roboczego. W związku z powyższym należy go obliczyć z próbek zawierających związki docelowe w granicach wymaganego poziomu minimalnego, a nie ze współczynnika S/N lub ze ślepej próby.

—

Granica oznaczalności (LOQ) dla metody potwierdzającej powinna wynosić ok. jednej piątej poziomu zainteresowania.

—

Dla uzyskania wiarygodnych wyników metodą potwierdzającą lub przesiewową należy spełnić poniższe kryteria dla wartości TEQ w odniesieniu do wartości BEQ, niezależnie do tego, czy są oznaczane jako całkowita wartość TEQ (jako suma PCDD/F i dioksynopodobnych PCB), czy oddzielnie dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

—

W metodach przesiewowych można stosować zarówno metody GC/MS, jak i metody bioanalityczne. W przypadku metod GC/MS zastosowanie mają wymagania ustanowione w pkt 7 niniejszego załącznika. W przypadku metod bioanalitycznych opierających się na oznaczeniach komórkowych zastosowanie mają szczegółowe wymogi ustanowione w pkt 8 niniejszego załącznika.

—

Laboratoria stosujące metody przesiewowe do rutynowej kontroli próbek powinny nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metodę potwierdzającą.

—

Weryfikacja zdolności metody przesiewowej jest wymagana podczas rutynowej analizy w drodze kontroli jakości analizy i walidacji metody podczas analizy. Należy prowadzić ciągły program kontroli wyników ujemnych.

—

Należy sprawdzać, czy nie zachodzi ewentualne tłumienie odpowiedzi komórek i cytotoksyczność

20 % ekstraktów próbek należy analizować rutynowo metodą przesiewową z dodanym 2,3,7,8-TCDD i bez, zgodnym z poziomem zainteresowania, aby sprawdzić, czy odpowiedź jest ewentualnie tłumiona przez substancje interferujące obecne w ekstrakcie próbki. Zmierzone stężenie próbki wzbogaconej jest porównywane do sumy stężenia ekstraktu próbki niewzbogaconej i stężenia wzbogacenia. Jeżeli zmierzone stężenie jest o ponad 25 % niższe niż obliczone (zsumowane) stężenie, wskazuje to na ewentualne tłumienie sygnału, a odpowiednia próbka musi zostać przekazana do analizy metodą potwierdzającej GC/HRMS. Wyniki należy monitorować na wykresach kontroli jakości.

—

Kontrola jakości próbek ujemnych

Około 2–10 % próbek ujemnych, zależnie od matrycy próbki i doświadczenia laboratorium, należy potwierdzić metodą GC/HRMS.

—

Oznaczenie wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych z danych kontroli jakości

Należy oznaczyć wskaźnik ilości wyników fałszywie ujemnych z badań przesiewowych próbek poniżej i powyżej najwyższego dopuszczalnego poziomu lub progu podejmowania działań. Wskaźnik rzeczywistej ilości wyników fałszywie ujemnych nie powinien przekraczać 5 %.

Po uzyskaniu co najmniej 20 potwierdzonych wyników na matrycę/grupę matryc z kontroli jakości próbek ujemnych należy z tej bazy danych wyciągnąć wnioski dotyczące wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych. Do tych 20 wyników w celu oceny wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych można także włączyć wyniki uzyskane na próbkach analizowanych w badaniach biegłości lub podczas incydentów wystąpienia zanieczyszczenia, obejmujące zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego stężenia. Próbki powinny obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

Chociaż badania przesiewowe powinny mieć na celu wykrywanie próbek przekraczających próg podejmowania działań, kryterium określania wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych jest najwyższy dopuszczalny poziom, przy uwzględnieniu niepewności pomiaru metody potwierdzającej.

—

Ewentualne dodatnie wyniki z badania przesiewowego powinny zawsze zostać zweryfikowane potwierdzającą metodą analizy (GC/HRMS). Próbki te mogą być też zastosowane do oceny odsetka wyników fałszywie dodatnich. W przypadku metod przesiewowych częstość wyników fałszywie dodatnich to odsetek wyników potwierdzonych jako ujemne metodą potwierdzającą GC/HRMS, które we wcześniejszych badaniach przesiewowych były podejrzewane jako dodatnie. Jednak ocena korzyści metody przesiewowej powinna być oparta na porównaniu próbek fałszywie dodatnich z całkowitą liczbą sprawdzonych próbek. Częstość ta musi być na tyle niska, aby stosowanie narzędzia przesiewowego było korzystne.

—

Metody bioanalityczne przynajmniej w warunkach walidacji powinny dostarczyć wiarygodnego wskazania poziomu TEQ, obliczonego i wyrażonego jako BEQ.

—

Także w przypadku metod bioanalitycznych przeprowadzonych w warunkach powtarzalności, wewnątrzlaboratoryjny RSDr byłby zwykle niższy niż odtwarzalność RSDR.

—

Różnica między poziomem górnej i dolnej granicy nie powinna przekraczać 20 % dla środków spożywczych zanieczyszczonych na poziomie ok. 1 pg WHO-TEQ/g tłuszczu (na podstawie sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB). W przypadku środków spożywczych o niskiej zawartości tłuszczu stosuje się te same wymagania odnośnie do zanieczyszczeń na poziomie 1 pg WHO-TEQ/g produktu. W przypadku niższych poziomów zanieczyszczeń, np. 0,5 pg WHO-TEQ/g produktu, różnica między górną i dolną granicą może wynosić 25–40 %.

—

Rozpoczynając analizę, np. przed ekstrakcją, należy dodać wzorce wewnętrzne PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla 13C, oraz wzorce wewnętrzne dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla 13C w celu walidacji procedury analitycznej. Należy dodać co najmniej 1 kongener dla każdej grupy homologicznej, od tetra- do oktachlorowanego PCDD/F oraz co najmniej 1 kongener dla każdej grupy homologicznej dioksynopodobnych PCB (alternatywnie, co najmniej 1 kongener na każdy wyselekcjonowany jon widma masowego, rejestrujący funkcję służącą do monitorowania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod potwierdzających należy zastosować wszystkie siedemnaście wzorców wewnętrznych PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla 13C oraz wszystkie dwanaście wzorców wewnętrznych dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla 13C.

—

Dla tych kongenerów, dla których nie zastosowano analogów znakowanych izotopem węgla 13C, należy również oznaczyć względne współczynniki odpowiedzi przez zastosowanie odpowiednich roztworów kalibracyjnych.

—

W przypadku środków spożywczych pochodzenia roślinnego i środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego zawierających mniej niż 10 % tłuszczu dodawanie wzorców wewnętrznych przed ekstrakcją jest obowiązkowe. W przypadku środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego zawierających więcej niż 10 % tłuszczu wzorce wewnętrzne mogą zostać dodane przed albo po ekstrakcji tłuszczu. Zależnie od etapu, na którym wprowadza się wzorce wewnętrzne, a także zależnie od tego, czy wyniki podaje się w odniesieniu do produktu, czy do tłuszczu, należy dokonać właściwej walidacji skuteczności ekstrakcji.

—

Przed analizą GC/MS należy dodać 1 lub 2 wzorce odzysku.

—

Konieczna jest kontrola odzysku. W przypadku metody potwierdzającej, odzysk poszczególnych wzorców wewnętrznych musi mieścić się w zakresie od 60 do 120 %. Dopuszczalne są niższe lub wyższe wartości odzysku dla poszczególnych kongenerów, w szczególności dla niektórych hepta- i oktachlorowanych dibenzo-p-dioksyn i dibenzofuranów, jeżeli ich udział w wartości TEQ nie przekracza 10 % całkowitej wartości TEQ (na podstawie PCDD/F oraz dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod przesiewowych GC/MS odzysk powinien miesić się w zakresie od 30 do 140 %.

—

Rozdzielenie PCDD/F od interferujących związków chlorowanych, takich jak niedioksynopodobne PCB czy polichlorowane difenyloetery, należy przeprowadzić przez zastosowanie odpowiednich technik chromatograficznych (najlepiej stosując jako wypełnienie kolumny florisil, tlenek glinu lub węgiel).

—

Rozdzielanie izomerów metodą chromatografii gazowej musi być wystarczające (< 25% nakładania się pików pomiędzy 1,2,3,4,7,8-HxCDF i 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Zakres krzywej kalibracji powinien obejmować odpowiednie zakresy poziomów zainteresowania.

—

Podczas obliczania stężenia z krzywej kalibracji TCDD wartości na dolnej i górnej granicy krzywej wykazywać będą wysoką zmienność (wysoki współczynnik zmienności, CV). Zakres roboczy to obszar, w którym CV jest mniejszy niż 15 %. Dolna granica zakresu roboczego (poziom zgłaszania) musi następnie zostać ustalona znacznie (co najmniej o współczynnik 3) powyżej procedury próby ślepej. Górna granica zakresu roboczego jest zwykle reprezentowana przez wartość EC70 (70 % najwyższego skutecznego stężenia), ale jest niższa, jeżeli CV jest wyższy niż 15 % w tym zakresie. Zakres roboczy powinien być ustalony podczas walidacji. Wartości odcięcia (pkt 8.3) muszą mieścić się w zakresie roboczym.

—

Roztwory standardowe i ekstrakty próbek należy zbadać co najmniej w duplikacie. Przy stosowaniu duplikatów roztwór standardowy lub ekstrakt kontrolny badany w 4–6 dołkach rozmieszczonych na płytce powinien wywołać odpowiedź lub dać stężenie (możliwe tylko w zakresie roboczym) w oparciu o CV < 15 %.

—

Poziomy w próbkach można oszacować przez porównanie czułości badania z krzywą kalibracyjną TCDD (lub PCB 126 albo mieszaniny wzorcowej PCDD/F/dioksynopodobnych PCB) w celu obliczenia poziomu BEQ w ekstrakcie, a następnie w próbce.

—

Krzywe kalibracji powinny zawierać 8–12 stężeń (co najmniej w duplikacie) z wystarczającą ilością stężeń w dolnych zakresach krzywej (zakres roboczy). Szczególną uwagę należy zwrócić na jakość dopasowania krzywej w roboczym zakresie. Wartość R2 jako taka ma niewielką lub żadną wartość w szacowaniu dopasowania w regresji nieliniowej. Lepsze dopasowanie jest osiągane poprzez minimalizowanie różnicy między obliczanym a obserwowanym poziomem w zakresie roboczym krzywej (np. przez minimalizowanie sumy kwadratów reszt).

—

Szacowany poziom w ekstrakcie próbki jest następnie korygowany o poziom BEQ obliczany dla ślepej próby matrycy/rozpuszczalnika (aby uwzględnić zanieczyszczenia z zastosowanych rozpuszczalników i chemikaliów) oraz pozorny odzysk (obliczany z poziomu BEQ odpowiednich próbek referencyjnych z reprezentatywnymi profilami kongenerów w granicach poziomu zainteresowania). Dla przeprowadzenia korekty odzysku pozorny odzysk musi zawsze mieścić się w wymaganym zakresie (zob. pkt 8.1.4.). Próbki referencyjne stosowane do korekty odzysku muszą być zgodne z wymogami podanymi w pkt 8.2.

—

Strata związków podczas oczyszczania powinna zostać sprawdzona podczas walidacji. Ślepą próbę wzbogaconą mieszaniną różnych kongenerów należy przekazać do oczyszczania (co najmniej n = 3), a odzysk i zmienność sprawdzić metodą GC/HRMS. Odzysk powinien wynosić od 60 do 120 % szczególnie dla kongenerów mających ponad 10 % udział w poziomie TEQ w różnych mieszaninach.

—

Przy zgłaszaniu poziomów BEQ należy określić poziom zgłaszania na odpowiednich próbkach matrycy, obejmujących typowe profile kongenerów, ale nie z krzywej kalibracji wzorców ze względu na niską precyzję w dolnym zakresie krzywej. Należy uwzględnić wpływy z ekstrakcji i oczyszczania. Poziom zgłaszania należy ustalić znacznie (co najmniej o współczynnik 3) powyżej procedury próby ślepej.

—

Próbki referencyjne reprezentują matrycę próbki, profile kongenerów i zakresy stężeń dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w granicach poziomu zainteresowania (najwyższy dopuszczalny poziom lub próg podejmowania działań).

—

Ślepą próbę procedury lub najlepiej ślepą próbę matrycową oraz próbkę referencyjną na poziomie zainteresowania należy włączyć do każdej serii badanej. Próbki te muszą zostać ekstrahowane i zbadane w tym samym czasie w identycznych warunkach. Próbka referencyjna musi dawać wyraźnie podwyższoną odpowiedź w porównaniu ze ślepą próbą, gwarantując przydatność badania. Próbki te można zastosować do korekty ślepej próby i korekty odzysku.

—

Próbki referencyjne wybrane do przeprowadzenia korekty odzysku powinny być reprezentatywne dla próbek badanych, co oznacza, że profile kongenerów nie powinny prowadzić do niedoszacowania poziomów.

—

Można włączyć dodatkowe próbki referencyjne zawierające np. 0,5- i 2-krotność poziomu zainteresowania, aby wykazać właściwą zdolność badania w zakresie zainteresowania do celów kontroli poziomu zainteresowania. Razem próbki te można zastosować do obliczania poziomów BEQ w próbkach badanych (8.1.2.2).

BEQDL

wartość BEQ odpowiadająca poziomowi decyzji GC/HRMS, będącemu najwyższym dopuszczalnym poziomem przy uwzględnieniu niepewności pomiaru

sy,x

odchylenie standardowe reszt

t α,f=m-2

czynnik Studenta (α = 5 %, f = stopnie swobody, jednostronne)

m

całkowita liczba punktów kalibracji (indeks j)

n

liczba powtórzeń na każdym poziomie

xi

stężenie próbki GC/HRMS (w TEQ) w punkcie kalibracji i

średnia stężeń (w TEQ) wszystkich próbek kalibracji

SDR

odchylenie standardowe wyników badania biologicznego przy BEQDL, mierzone w warunkach odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej

—

Ponieważ w metodach bioanalitycznych niemożliwe jest stosowanie wzorców wewnętrznych, należy przeprowadzić badania powtarzalności pozwalające na uzyskanie informacji o odchyleniu standardowym w obrębie jednej serii badanej i między tymi seriami. Powtarzalność powinna być na poziomie poniżej 20 %, odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna – poniżej 25 %. Wyniki te powinny opierać się na obliczonych poziomach w BEQ po korekcie próby ślepej i odzysku.

—

Jako część procesu walidacji należy wykazać, że badania pozwalają na odróżnienie między próbą ślepą a poziomem wartości odcięcia, umożliwiając identyfikację próbek powyżej odpowiadającej wartości odcięcia (zob. 8.1.2).

—

Należy zdefiniować docelowe związki, możliwe interferencje oraz najwyższy dopuszczalny poziom sygnału próby ślepej.

—

Procent odchylenia standardowego w odpowiedzi lub stężeniu obliczonym z odpowiedzi (możliwy tylko w zakresie roboczym) potrójnego oznaczenia ekstraktu próbki nie powinien przekraczać 15 %.

—

Do oceny zdolności metody bioanalitycznej w stałym okresie należy zastosować nieskorygowane wyniki próbek referencyjnych wyrażone w BEQ (próba ślepa i poziom zainteresowania).

—

Wykresy kontroli jakości dla próby ślepej procedury i każdego typu próbki referencyjnej należy zarejestrować i sprawdzić, aby upewnić się, że zdolność analityczna jest zgodna z wymogami, w szczególności dla próby ślepej procedury w odniesieniu do wymaganej minimalnej różnicy między dolną granicą zakresu roboczego oraz dla próbek referencyjnych w odniesieniu do odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej. Próby ślepe procedury muszą być dobrze kontrolowane, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych podczas odejmowania.

—

Należy zgromadzić wyniki z analiz GC/HRMS podejrzanych próbek oraz 2-10 % próbek ujemnych (co najmniej 20 próbek na matrycę) i zastosować je do oceny zdolności metody przesiewowej oraz związku między BEQ i TEQ. Ta baza danych może zostać zastosowana do ponownej oceny wartości odcięcia stosowanej do rutynowych próbek dla zwalidowanych matryc.

—

Zdolność metody można także wykazać przez uczestnictwo w badaniach biegłości. Wyniki z próbek analizowanych w badaniach biegłości, obejmujących zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego poziomu, mogą zostać włączone do oceny wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych, jeżeli laboratorium może wykazać zdolność metody. Próbki powinny obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

—

Podczas incydentów można ponownie ocenić wartości odcięcia, odzwierciedlające konkretne profile matryc i kongenerów pojedynczego incydentu.

—

Jeśli zastosowana procedura analityczna to umożliwia, wyniki analiz powinny zawierać poziomy poszczególnych kongenerów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB i być przedstawiane jako ich górne, dolne i średnie granice, aby zawrzeć w sprawozdaniu maksymalną ilość informacji umożliwiających dokonanie interpretacji wyników zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

—

Sprawozdanie powinno także zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F, dioksynopodobnych PCB i tłuszczów. W sprawozdaniu należy oznaczyć i podać zawartość tłuszczu w próbce dla próbek żywności o najwyższym dopuszczalnym poziomie lub progu podejmowania działań ustalonych w odniesieniu do tłuszczu i oczekiwanym stężeniu tłuszczu w zakresie 0-2 % (zgodnie z obowiązującym prawodawstwem); w przypadku pozostałych próbek oznaczenie zawartości tłuszczu jest opcjonalne.

—

Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem wymienionym w pkt 7.2 lub przekraczają najwyższy dopuszczalny poziom, a w pozostałych przypadkach na żądanie.

—

Ponieważ przy ustalaniu zgodności próbki uwzględnia się niepewność pomiaru, należy podać również ten parametr. W związku z powyższym wyniki badań należy podawać jako x +/- U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U rozszerzoną niepewność pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia w wysokości 2, który daje wynik w przedziale ufności ok. 95 %. W przypadku odrębnego oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB należy zastosować sumę szacowanej niepewności rozszerzonej dla odrębnych wyników analitycznych dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odniesieniu do sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

—

Jeżeli niepewność pomiaru jest uwzględniana przez zastosowanie CCα (zob. załącznik II pkt IV.2), należy podać również ten parametr.

—

Wyniki są wyrażane w tych samych jednostkach i z (co najmniej) tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006.

—

Wynik badań przesiewowych wyrażany jest jako zgodny lub podejrzewany o niezgodność („podejrzany”).

—

Ponadto można podać wynik dla PCDD/F lub dla dioksynopodobnych PCB wyrażony w równoważnikach bioanalitycznych (BEQ) (nie TEQ) (zob. załącznik III pkt 2).

—

Jeżeli podawana jest niepewność pomiaru obliczonego poziomu BEQ, np. jako odchylenie standardowe, musi być oparta co najmniej na trzykrotnej analizie (obejmującej ekstrakcję, oczyszczanie i oznaczenie czułości badania) próbki.

—

Próbki dające odpowiedź poniżej poziomu zgłaszania należy oznaczyć jako poniżej poziomu zgłaszania.

—

W sprawozdaniu, dla każdego typu matrycy próbki, należy podać poziom zainteresowania (najwyższy dopuszczalny poziom, próg podejmowania działań), na którym opiera się ocena.

—

W sprawozdaniu należy podać zastosowany rodzaj badania, podstawowe zasady badania i rodzaj kalibracji.

—

Sprawozdanie powinno także zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F, dioksynopodobnych PCB i tłuszczów. W sprawozdaniu należy oznaczyć i podać zawartość tłuszczu w próbce dla próbek żywności o najwyższym dopuszczalnym poziomie lub progu podejmowania działań ustalonych w odniesieniu do tłuszczu i oczekiwanym stężeniu tłuszczu w zakresie 0–2 % (zgodnie z obowiązującym prawodawstwem); w przypadku pozostałych próbek oznaczenie zawartości tłuszczu jest opcjonalne.

—

Względny czas retencji w stosunku do wzorców wewnętrznych lub referencyjnych (akceptowane odchylenia +/- 0,25 %).

—

ROZDZIELENIE metodą chromatografii gazowej wszystkich sześciu wskaźnikowych PCB (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 oraz PCB 180) od substancji interferujących, przede wszystkich wymywających PCB, w szczególności jeżeli poziomy próbek mieszczą się w zakresie granic ustanowionych w przepisach i jeżeli należy potwierdzić niezgodność.

Uwaga: Kongenery, które są często wymywane, to np. PCB 28/31, PCB 52/69 oraz PCB 138/163/164. W przypadku GC/MS należy rozważyć także ewentualne interferencje z fragmentów wyżej chlorowanych kongenerów.

—

W przypadku technik GC/MS:

—

W przypadku GC/ECD:

Potwierdzenie wyników przekraczających tolerancję przy pomocy dwóch kolumn GC z fazami stacjonarnymi o różnej polarności.

—

Stosowanie właściwych wzorców wewnętrznych o właściwościach fizycznych i chemicznych porównywalnych z właściwościami interesujących analitów.

—

Dodanie wzorców wewnętrznych:

—

Wymagania dla metod z wykorzystaniem wszystkich sześciu wskaźnikowych kongenerów PCB znakowanych izotopowo:

—

Wymagania dla metod z wykorzystaniem nie wszystkich sześciu wzorców wewnętrznych znakowanych izotopowo lub innych wzorców wewnętrznych:

—

Poziomy odzysku kongenerów nieznakowanych należy sprawdzić przez próbki wzbogacone lub kontrolę jakości próbek o stężeniach w zakresie poziomu zainteresowania. Akceptowalne poziomy odzysku dla tych kongenerów wynoszą między 70 a 120 %.

—

Jeśli zastosowana procedura analityczna to umożliwia, wyniki analiz powinny zawierać poziomy poszczególnych kongenerów PCB i być przedstawiane jako ich górne, dolne i średnie granice, aby zawrzeć w sprawozdaniu maksymalną ilość informacji umożliwiających dokonanie interpretacji wyników zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

—

Sprawozdanie powinno także zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCB i tłuszczów. W sprawozdaniu należy oznaczyć i podać zawartość tłuszczu w próbce dla próbek żywności o najwyższym dopuszczalnym poziomie ustalonych w odniesieniu do tłuszczu i oczekiwanym stężeniu tłuszczu w zakresie 0-2 % (zgodnie z obowiązującym prawodawstwem); w przypadku pozostałych próbek oznaczenie zawartości tłuszczu jest opcjonalne.

—

Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem wymienionym w pkt 6 lub przekraczają najwyższy dopuszczalny poziom, a w pozostałych przypadkach na żądanie.

—

Ponieważ przy ustalaniu zgodności próbki uwzględnia się niepewność pomiaru, należy podać również ten parametr. W związku z powyższym wyniki badań należy podawać jako x +/- U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U rozszerzoną niepewność pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia w wysokości 2, który daje wynik w przedziale ufności ok. 95 %.

—

Jeżeli niepewność pomiaru jest uwzględniana przez zastosowanie CCα (zob. załącznik II pkt IV.1), należy podać również ten parametr.

—

Wyniki są wyrażane w tych samych jednostkach i z (co najmniej) tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006.