„B.53.   ONDERZOEK NAAR ONTWIKKELINGSNEUROTOXICITEIT

INLEIDING

1.   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 426 (2007) van de OESO. In juni 1995 boog een werkgroep inzake reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit van de OESO in Kopenhagen zich over de noodzaak om de bestaande OESO-testrichtlijnen voor reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit bij te werken en over de ontwikkeling van nieuwe richtsnoeren voor nog niet behandelde eindpunten (1). De werkgroep deed de aanbeveling een testrichtlijn voor ontwikkelingsneurotoxiciteit te schrijven uitgaande van een Amerikaanse EPA-richtlijn, die inmiddels is herzien (2). In juni 1996 werd in Kopenhagen een tweede raadplegingsbijeenkomst gehouden om het Secretariaat een leidraad te bieden voor de opzet van een nieuwe testrichtlijn voor ontwikkelingsneurotoxiciteit, met inbegrip van de hoofdelementen, bv. details over de keuze van de diersoort, toedieningsperiode, testperiode, te beoordelen eindpunten en criteria voor de evaluatie van de resultaten. In 1998 werd een Amerikaanse richtlijn over risicobeoordeling van neurotoxiciteit gepubliceerd (3). In oktober 2000 vonden back-to-back een OESO-raadplegingsbijeenkomst met deskundigen en een workshop van het Risk Science Institute van het ILSI plaats en in 2005 vond in Tokio een raadplegingsbijeenkomst met deskundigen plaats. Deze bijeenkomsten vonden plaats om de wetenschappelijke en technische problemen in verband met de huidige testrichtlijn te bespreken en de aanbevelingen van de bijeenkomsten (4)(5)(6)(7) werden bij de ontwikkeling van deze testmethode in aanmerking genomen. Aanvullende informatie over de uitvoering, interpretatie en de voor deze testmethode gebruikte terminologie is te vinden in de OESO-leidraden nr. 43: „Reproductive Toxicity Testing and Assessment” (8) en nr. 20: „Neurotoxicity Testing” (9).

INLEIDENDE OVERWEGINGEN

2.   Van een aantal stoffen is bekend dat ze ontwikkelingsneurotoxische effecten bij de mens en andere soorten veroorzaken (10)(11)(12)(13). Voor het beoordelen en evalueren van de toxische kenmerken van een stof kan het nodig zijn om de potentiële ontwikkelingsneurotoxiciteit te bepalen. Onderzoeken naar ontwikkelingsneurotoxiciteit zijn bedoeld om gegevens, waaronder dosis-responskarakteriseringen, te verkrijgen over de potentiële functionele en morfologische effecten op het ontwikkelende zenuwstelsel van de nakomelingen die kunnen ontstaan door blootstelling in utero en in het begin van hun leven.

3.   Een onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit kan als een apart onderzoek worden uitgevoerd, worden opgenomen in een onderzoek naar reproductietoxiciteit en/of neurotoxiciteit bij volwassenen (bv. testmethoden B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)) of worden toegevoegd aan een onderzoek naar prenatale-ontwikkelingstoxiciteit (bv. testmethode B.31 (17)). Wanneer het onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit wordt opgenomen in of toegevoegd aan een ander onderzoek, is het absoluut noodzakelijk dat de integriteit van beide onderzoekstypen behouden blijft. Alle testen moeten voldoen aan de toepasselijke wetgeving of richtlijnen van de overheid of de instelling voor het gebruik van proefdieren in onderzoek (bv. 18).

4.   Het testlaboratorium moet vóór uitvoering van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof bestuderen. Deze informatie betreft de identiteit en structuur van de stof; de fysisch-chemische eigenschappen ervan; de resultaten van eventuele andere in-vitro- of in-vivotoxiciteitstesten met de stof; toxicologische gegevens over qua structuur verwante stoffen, en het/de verwachte vorm(en) van gebruik van de stof. Deze informatie is noodzakelijk om alle betrokkenen ervan te verzekeren dat de test relevant is voor de bescherming van de gezondheid van de mens en helpt bij het kiezen van een geschikte aanvangsdosis.

PRINCIPE VAN DE TEST

5.   De teststof wordt aan dieren toegediend tijdens de dracht en de zoogperiode. Om de effecten bij drachtige en zogende vrouwtjes te beoordelen, worden moederdieren getest. Dit kan ook vergelijkende informatie geven (moederdieren versus nakomelingen). Voor beoordeling van de neurotoxiciteit worden willekeurig nakomelingen uit nesten gekozen. De beoordeling bestaat uit observaties om macroscopische neurologische en gedragsafwijkingen te detecteren, waaronder de beoordeling van de lichamelijke ontwikkeling, ontogenie van het gedrag, motorische activiteit, motorische en sensorische functie, en het leervermogen en geheugen; alsmede de beoordeling van het hersengewicht en de neuropathologie tijdens de postnatale ontwikkeling en volwassenheid.

6.   Als de testmethode wordt uitgevoerd als een apart onderzoek, kunnen aanvullende beschikbare dieren in elke groep worden gebruikt voor specifieke neurogedrags-, neuropathologische, neurochemische of elektrofysiologische procedures die ter ondersteuning kunnen dienen van de gegevens die zijn verkregen van de door deze testmethode aanbevolen onderzoeken (16)(19)(20)(21). De aanvullende procedures kunnen vooral nuttig zijn als empirische waarnemingen, verwachte effecten of het werkingsmechanisme duiden op een bepaald type neurotoxiciteit. Deze aanvullende procedures kunnen zowel bij de moederdieren als bij de jongen worden gebruikt. Daarnaast kunnen ook ex-vivo- of in-vivoprocedures worden gebruikt, mits deze procedures niet de integriteit van de in-vivoprocedures doen veranderen.

VOORBEREIDINGEN VOOR DE TEST

Keuze van de diersoort

7.   De testsoort die de voorkeur verdient is de rat; andere soorten kunnen in voorkomende gevallen worden gebruikt. Merk echter op dat de in deze testmethode vermelde dracht- en postnatale dagen specifiek zijn voor vaak gebruikte rattenstammen en dat er vergelijkbare dagen moeten worden gekozen als een andere soort of ongebruikelijke stam wordt gebruikt. Het gebruik van een andere soort moet worden gemotiveerd aan de hand van toxicologische, farmacokinetische en/of andere gegevens. In de motivering moet de beschikbaarheid van soortspecifieke postnatale neurogedrags- en neuropathologische beoordelingen aan de orde komen. Als een eerdere test aanleiding gaf tot bezorgdheid, moet de in die test gebruikte soort/stam worden overwogen. Omdat verschillende rattenstammen verschillende prestatiekenmerken vertonen, moeten er aanwijzingen zijn dat de vruchtbaarheid en het responsvermogen van de gekozen stam toereikend zijn. De betrouwbaarheid en gevoeligheid van andere soorten voor de detectie van ontwikkelingsneurotoxiciteit moeten worden gedocumenteerd.

Huisvestings- en voedingsomstandigheden

8.   De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Het is ook mogelijk de lichtcyclus vóór het paren en gedurende de duur van het onderzoek om te draaien, zodat de beoordelingen van functie- en gedragseindpunten tijdens de donkere periode (onder rood licht) kunnen worden uitgevoerd, d.w.z. als de dieren normaliter actief zijn (22). Veranderingen van de licht-donkercyclus dienen vergezeld te gaan van een passende acclimatiseringstijd om de dieren aan de nieuwe cyclus te laten wennen. Als voeding mag het gewone proefdiervoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Het soort voeding en het soort water moeten worden gerapporteerd en beide moeten worden geanalyseerd op onzuiverheden.

9.   De dieren kunnen elk apart of in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden ondergebracht. Het paren moet plaatsvinden in kooien die voor dat doel geschikt zijn. Na gebleken copulatie of niet later dan dag 15 van de dracht, moeten gedekte dieren afzonderlijk in kooien worden ondergebracht, die zijn bestemd voor werpen of moederschap. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Als het moment van werpen nadert, moeten de gedekte vrouwtjes worden voorzien van geschikt en gedefinieerd nestmateriaal. Het is algemeen bekend dat onjuiste behandeling of stress tijdens de dracht kan leiden tot ongunstige uitkomsten, zoals prenatale sterfte en afwijkende foetale en postnatale ontwikkeling. Om verlies van de foetus als gevolg van factoren die geen verband houden met de behandeling, te voorkomen, moeten de dieren tijdens de dracht voorzichtig worden behandeld en moet stress als gevolg van externe factoren, zoals overmatig geluid van buitenaf, worden vermeden.

Voorbereiding van de dieren

10.   Er moeten gezonde dieren worden gebruikt die aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd, tenzij het onderzoek is opgenomen in een ander onderzoek (zie punt 3). De kenmerken van de proefdieren qua soort, stam, herkomst, geslacht, gewicht en leeftijd worden vastgelegd. Aan elk dier moet een uniek identificatienummer worden toegekend, waarmee het gemarkeerd wordt. De dieren van alle testgroepen moeten zoveel mogelijk van gelijk gewicht en gelijke leeftijd zijn, en moeten tot de normale variëteiten van de onderzochte soort en stam behoren. Bij elk dosisniveau moeten jongvolwassen vrouwtjes worden gebruikt die nog geen jongen hebben gehad. Dekking door mannetjes met dezelfde ouders moet worden vermeden en daar moet op worden toegezien. Drachtdag (gestation day, GD) 0 is de dag waarop een vaginale prop en/of sperma worden waargenomen. Als bij een leverancier dieren zijn aangeschaft die op een bekend tijdstip zijn gedekt, moet een passende acclimatiseringstijd (bv. 2-3 dagen) in acht worden genomen. Gedekte vrouwtjes moeten op neutrale wijze worden toegewezen aan de controle- en behandelgroepen en zo gelijk mogelijk worden verdeeld over de groepen (er wordt bijvoorbeeld een gestratificeerde gerandomiseerde procedure aanbevolen voor een gelijke verdeling over alle groepen, zoals wat betreft lichaamsgewicht). Vrouwtjes die door hetzelfde mannetje zijn geïnsemineerd, moeten gelijkelijk over de groepen worden verdeeld.

PROCEDURE

Aantal en geslacht van de dieren

11.   Elke test- en controlegroep moet een voldoende aantal drachtige vrouwtjes bevatten die worden blootgesteld aan de teststof om ervoor te zorgen dat het aantal nakomelingen dat wordt geproduceerd toereikend is voor beoordeling van de neurotoxiciteit. Bij elk dosisniveau wordt aanbevolen in totaal 20 nesten te gebruiken. Doseringsopzetten waarbij gebruik wordt gemaakt van duplo's en opeenvolgende groepen zijn toegestaan als het totaal aantal nesten per groep wordt bereikt en passende statistische modellen worden gebruikt om rekening te houden met duplo's.

12.   Op of vóór postnatale dag (PND) 4 (dag van werpen is PND 0), moet de grootte van elk nest worden aangepast door eliminatie van extra jongen door willekeurige selectie tot alle nesten een gelijke nestgrootte hebben (23). De nestgrootte mag niet groter zijn dan de gemiddelde nestgrootte voor de gebruikte knaagdierstam (8-12). Het nest moet zoveel mogelijk bestaan uit gelijke aantallen mannelijke en vrouwelijke jongen. Er dient geen selectieve eliminatie van jongen, bv. op grond van lichaamsgewicht, plaats te vinden. Na standaardisatie van de nesten (ruimen) en voorafgaand aan verder testen van functie-eindpunten, krijgen individuele jongen waarmee testen vóór of na spening uitgevoerd gaan worden, een unieke identificatie met behulp van een geschikte humane methode voor identificatie van jongen (bv. 24).

Toewijzen van dieren aan functie- en gedragstesten, bepaling hersengewicht en neuropathologische beoordelingen

13.   Met deze testmethode kunnen dieren die in utero en via het zogen zijn blootgesteld, op verscheidene manieren worden toegekend aan functie- en gedragstesten, bepaling van geslachtsrijping en hersengewicht en neuropathologische beoordeling (25). Andere testen van de neurogedragsfunctie (bv. sociaal gedrag), neurochemie of neuropathologie kunnen per geval worden toegevoegd, mits de integriteit van de oorspronkelijke vereiste testen niet in het gedrang komt.

14.   De jongen worden gekozen uit elke dosisgroep en toegewezen aan eindpuntsbeoordelingen op of na PND 4. De selectie van de jongen moet zodanig gebeuren, dat in alle testen beide geslachten uit elk nest in elke dosisgroep zo veel mogelijk gelijk vertegenwoordigd zijn. Voor het testen van de motorische activiteit moet op alle leeftijden vóór spening hetzelfde paar van mannelijke en vrouwelijke jongen worden getest (zie punt 35). Voor alle andere testen kunnen hetzelfde paar of verschillende paren van mannelijke en vrouwelijke dieren worden toegewezen aan verschillende gedragstesten. Er moeten mogelijk verschillende jongen worden toegewezen aan testen van de cognitieve functie met gespeende dieren versus die met volwassen dieren om verstoring door de effecten van leeftijd en eerdere training in deze bepalingen te voorkomen (26)(27). Op het moment van spenen (PND 21) kunnen jongen die niet zijn geselecteerd voor onderzoek, op humane wijze worden afgevoerd. Eventuele veranderingen in toewijzing van jongen moeten worden gerapporteerd. De statistische meeteenheid moet het nest (of het moederdier) zijn en niet het jong.

15.   De toewijzing van jongen aan de onderzoeken vóór en na spening, cognitieve testen, pathologische onderzoeken enz. kan op verschillende wijzen plaatsvinden (zie figuur 1 voor algemene opzet en aanhangsel 1 voor voorbeelden van toewijzingen). In elke dosisgroep voor onderzoeken vóór en na spening worden de volgende minimumaantallen van dieren aanbevolen:

Klinische observaties en lichaamsgewicht	Alle dieren
Gedetailleerde klinische observaties	20/geslacht (1/geslacht/nest)
Hersengewicht (na fixatie) PND 11-22	10/geslacht (1/nest)
Hersengewicht (niet gefixeerd) ~ PND 70	10/geslacht (1/nest)
Neuropathologie (immersie- of perfusiefixatie) PND 11-22	10/geslacht (1/nest)
Neuropathologie (perfusiefixatie) PND ~70	10/geslacht (1/nest)
Geslachtsrijping	20/geslacht (1/geslacht/nest)
Andere ontwikkelingsmijlpalen (facultatief)	Alle dieren
Ontogenie van het gedrag	20/geslacht (1/geslacht/nest)
Motorische activiteit	20/geslacht (1/geslacht/nest)
Motorische en sensorische functie	20/geslacht (1/geslacht/nest)
Leervermogen en geheugen	10/geslacht (1) (1/nest)

Dosering

16.   Er worden ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige controlegroep gebruikt. De dosisniveaus moeten zodanig zijn verdeeld, dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. Tenzij de fysisch-chemische aard of biologische eigenschappen van de stof dit beperken, moet het hoogste dosisniveau zodanig worden gekozen dat enige maternale toxiciteit optreedt (bv. klinische symptomen, verminderde gewichtstoename (niet meer dan 10 %) en/of aanwijzingen voor dosisbeperkende toxiciteit in een doelorgaan). De hoge dosis kan worden beperkt tot 1 000 mg/kg/dag lichaamsgewicht, met enkele uitzonderingen. Zo kan de verwachte blootstelling voor mensen erop wijzen dat een hoger dosisniveau moet worden gebruikt. Een andere mogelijkheid is verkennende onderzoeken of voorlopige bereikbepalingsonderzoeken uit te voeren om de hoogste te gebruiken dosering te bepalen waarbij een minimale mate van maternale toxiciteit optreedt. Als gebleken is dat de teststof toxisch is voor de ontwikkeling, hetzij in een standaard-ontwikkelingstoxiciteitsonderzoek, hetzij in een verkennend onderzoek, moet het hoogste dosisniveau de maximale dosis zijn die geen overmatige toxiciteit bij nakomelingen, of in utero dan wel neonatale sterfte of misvormingen induceert die voldoende is/zijn om een beletsel te vormen voor een betekenisvolle beoordeling van neurotoxiciteit. Het laagste dosisniveau moet erop gericht zijn geen aanwijzingen voor maternale of ontwikkelingstoxiciteit, waaronder neurotoxiciteit, te produceren. Er moet een dalende reeks dosisniveaus worden gekozen teneinde een eventuele doseringsgerelateerde respons en het laagste dosisniveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (no-observed-adverse-effect level, NOAEL) aan te tonen, of doses nabij de detectiegrens waarmee een benchmarkdosis kan worden bepaald. Intervallen van een factor twee tot vier zijn vaak optimaal voor het vaststellen van de dalende dosisniveaus en het is vaak beter een vierde dosisgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor tien) tussen de doseringen te gebruiken.

17.   De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van alle bestaande toxiciteitsgegevens en aanvullende informatie over het metabolisme en de toxicokinetiek van de teststof of verwante stoffen. Aan de hand van deze informatie kan ook worden aangetoond of het doseringsschema adequaat is. Op grond van blootstellings- en farmacokinetische gegevens moet directe toediening aan jongen worden overwogen (28)(29). De voor- en nadelen moeten zorgvuldig worden overwogen alvorens onderzoeken met directe toediening uit te voeren (30).

18.   De gelijktijdige controlegroep wordt met placebo of, als bij de toediening van de teststof een medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Alle dieren krijgen normaliter dezelfde hoeveelheid teststof of medium toegediend, op basis van lichaamsgewicht. Bij gebruik van een medium of een ander additief om toediening te vergemakkelijken, moet met de volgende factoren rekening worden gehouden: effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken daarvan kunnen veranderen, en effecten op de voedsel- of waterconsumptie of de voedingsstatus van de dieren. Het medium mag geen effecten teweegbrengen die de interpretatie van het onderzoek kunnen verstoren, noch mag het neurogedragstoxisch zijn of gevolgen hebben voor de voortplanting of ontwikkeling. Voor nieuwe media moet naast een mediumcontrolegroep een placebocontrolegroep worden opgenomen. De dieren in de controlegroep(en) moeten op identieke wijze worden behandeld als de testgroepdieren.

Toediening van de doses

19.   De teststof of het medium moet worden toegediend via de weg die het meest relevant is voor mogelijke menselijke blootstelling en gebaseerd zijn op de beschikbare informatie betreffende metabolisme en distributie bij de proefdieren. De toedieningsweg zal doorgaans oraal (bv. via maagsonde, voeding, drinkwater) zijn, maar andere wegen (bv. dermaal, inhalatie) kunnen ook worden gebruikt, naargelang van de kenmerken en verwachte of bekende blootstellingsroutes bij de mens (verdere richtsnoeren staan in leidraad nr. 43 (8)). De keuze voor een bepaalde toedieningsweg moet worden gemotiveerd. De teststof moet elke dag op ongeveer hetzelfde tijdstip worden toegediend.

20.   De aan elk dier toegediende dosis moet normaliter gebaseerd zijn op het meest recente individuele lichaamsgewicht van het dier. Voorzichtigheid is echter geboden bij het aanpassen van de doses tijdens het laatste derde deel van de dracht. Als bij de behandelde moederdieren sprake is van overmatige toxiciteit, moeten die dieren op humane wijze worden gedood.

21.   De teststof of het medium moet minimaal dagelijks worden toegediend aan gedekte vrouwtjes vanaf het moment van nidatie (GD 6) tot en met de zoogperiode (PND 21), zodat de jongen tijdens de pre- en postnatale neurologische ontwikkeling aan de teststof worden blootgesteld. De leeftijd waarop de toediening start, en de duur en frequentie van de toediening kunnen worden aangepast als er aanwijzingen zijn die een testopzet die relevanter is voor blootstellingen bij de mens, ondersteunen. De toedieningsduur moet voor andere soorten zodanig worden aangepast, dat de blootstelling plaatsvindt tijdens alle vroege perioden van de hersenontwikkeling (d.w.z. gelijkwaardig aan prenatale en vroeg-postnatale hersengroei bij de mens). De toediening kan beginnen vanaf de start van de dracht (GD 0), hoewel er rekening moet worden gehouden met mogelijk verlies van dieren vóór nidatie als gevolg van de teststof. Toediening vanaf GD 6 voorkomt dit risico, maar in dat geval worden de ontwikkelingsfasen tussen GD 0 en 6 niet behandeld. Als een laboratorium gebruikmaakt van aangeschafte dieren die op een bepaald tijdstip zijn gedekt, is het niet mogelijk om op GD 0 te starten met toedienen. GD 6 is dan een goede startdag. Het testlaboratorium moet het doseringsschema opstellen aan de hand van relevante informatie over de effecten van de teststof, eerdere ervaring en logistieke overwegingen. Dit kan verlenging van toediening na spening inhouden. Er mag niet worden toegediend op de dag waarop wordt geworpen bij de dieren die nog niet helemaal klaar zijn met werpen. In het algemeen wordt aangenomen dat blootstelling van de jongen plaatsvindt via de moedermelk. In gevallen waarin er onvoldoende aanwijzingen zijn voor voortdurende blootstelling van de nakomelingen, moet evenwel directe toediening aan jongen worden overwogen. Aanwijzingen voor voortdurende blootstelling kunnen bv. worden verkregen uit de farmacokinetiek, toxiciteit bij de nakomelingen of veranderingen in biomarkers (28).

OBSERVATIES

Observaties bij moederdieren

22.   Alle moederdieren moeten ten minste eenmaal daags zorgvuldig geobserveerd worden met betrekking tot de gezondheidstoestand, waaronder ziekelijkheid en sterfte.

23.   Tijdens de behandelings- en observatieperioden moeten periodiek gedetailleerdere klinische observaties worden verricht (ten minste twee maal tijdens de drachttoedieningsperiode en twee maal tijdens de zoogtoedieningsperiode) met ten minste tien moederdieren per dosisniveau. De dieren moeten buiten hun kooi worden geobserveerd door getrainde technici die niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan, met behulp van gestandaardiseerde procedures om te zorgen voor minimale stress bij de dieren en waarnemersvertekening, en maximale interobserver-betrouwbaarheid. Indien mogelijk is het raadzaam de observaties in een bepaald onderzoek door dezelfde technicus te laten verrichten.

24.   De aanwezigheid van waargenomen verschijnselen moet worden geregistreerd. Indien mogelijk moet de ernst van de waargenomen verschijnselen eveneens geregistreerd worden. Klinische observaties moeten onder meer (maar niet alleen) bestaan uit: veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van uitscheiding, en onwillekeurige reacties (zoals traanvorming, rechtop staan van het haar, pupilgrootte, een ongewoon ademhalingspatroon en/of mondademhaling en eventuele ongewone symptomen van urineren of defecatie).

25.   Alle ongewone responsen met betrekking tot lichaamspositie, activiteit (bv. meer of minder intensieve verkenning van het standaardgebied) en coördinatie van bewegingen moeten ook worden genoteerd. Veranderingen in gang (bv. waggelen, ataxie), houding (bv. gebogen rug) en reactiviteit op vastpakken, neerzetten of andere prikkels uit de omgeving, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, convulsies, trillingen, stereotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, ongewone kopbewegingen, herhaaldelijk ronddraaien), bizar gedrag (bv. bijten of overmatig likken, zelfverminking, achteruitlopen, geluiden maken) of agressie moeten worden opgetekend.

26.   Symptomen van toxiciteit moeten worden opgetekend, met de dag waarop deze ontstonden, tijdstip, mate van ernst en duur.

27.   De dieren moeten op het moment van toediening worden gewogen, en wel ten minste elke week gedurende het onderzoek, op of vlak na de dag van werpen en op PND 21 (spenen). Voor met een maagsonde uitgevoerde onderzoeken moeten de moederdieren ten minste tweemaal per week worden gewogen. Na elke bepaling van het lichaamsgewicht moeten de doses zo nodig worden aangepast. De voedselconsumptie moet tijdens de dracht en zoogperiode minimaal wekelijks worden bepaald. Indien de blootstelling via de watertoevoer verloopt, moet ten minste wekelijks de waterconsumptie worden bepaald.

Observaties bij nakomelingen

28.   Alle nakomelingen moeten ten minste dagelijks zorgvuldig geobserveerd worden op symptomen van toxiciteit en ziekelijkheid en sterfte.

29.   Tijdens de behandelings- en observatieperioden moeten gedetailleerdere klinische observaties van de nakomelingen worden verricht. De nakomelingen (ten minste één jong/geslacht/nest) moeten worden geobserveerd door getrainde technici die niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan met behulp van gestandaardiseerde procedures om te zorgen voor minimale vertekening en maximale interobserver-betrouwbaarheid. Indien mogelijk is het raadzaam de observaties door dezelfde technicus te laten verrichten. Minimaal moeten de in punten 24 en 25 beschreven eindpunten worden gecontroleerd, al naargelang van toepassing voor de ontwikkelingsfase die geobserveerd wordt.

30.   Alle symptomen van toxiciteit bij de nakomelingen moeten worden opgetekend, met de dag waarop deze ontstonden, tijdstip, mate van ernst en duur.

Lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen

31.   Veranderingen in ontwikkelingsmijlpalen vóór spening (zoals ontvouwen van de oorschelp, openen van de ogen, doorkomen van snijtanden) hangen nauw samen met het lichaamsgewicht (30)(31). Lichaamsgewicht is mogelijk de beste indicator van lichamelijke ontwikkeling. De bepaling van ontwikkelingsmijlpalen wordt daarom alleen aanbevolen als er al aanwijzingen zijn dat deze eindpunten aanvullende informatie zullen verschaffen. De tijdstippen voor de beoordeling van deze parameters staan vermeld in tabel 1. Afhankelijk van de verwachte effecten en de resultaten van de eerste metingen kan het raadzaam zijn extra tijdstippen toe te voegen of de metingen in andere ontwikkelingsfasen te verrichten.

32.   Het is raadzaam om bij de beoordeling van de lichamelijke ontwikkeling de postcoïtale leeftijd in plaats van de postnatale leeftijd te gebruiken (33). Als jongen worden getest op de dag van spening, wordt geadviseerd dit onderzoek te doen vóór de feitelijke spening om de stress van het spenen, die een verstorend effect zou kunnen geven, te vermijden. Bovendien mogen met de jongen geen testen na spening worden gedaan gedurende de twee dagen na het spenen.

Tabel 1

Tijdstippen van de beoordeling van lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen, en functie/gedragseindpunten  (2)

Levensperiode Eindpunten	Vóór spenen (3)	Adolescentie (3)	Jongvolwassen dieren (3)
Lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen
Lichaamsgewicht en klinische observaties	wekelijks (4)	ten minste om de twee weken	ten minste om de twee weken
Hersengewicht	PND 22 (5)		aan einde onderzoek
Neuropathologie	PND 22 (5)		aan einde onderzoek
Geslachtsrijping	—	wanneer van toepassing	—
Andere ontwikkelingsmijlpalen (6)	wanneer van toepassing	—	—
Functie/gedragseindpunten
Ontogenie van het gedrag	Ten minste twee metingen
Motorische activiteit (waaronder gewenning)	1-3 keer (7)	—	eenmaal
Motorische en sensorische functie	—	eenmaal	eenmaal
Leervermogen en geheugen	—	eenmaal	eenmaal

33.   Levende jongen moeten worden geteld en gesekst, bv. door visuele inspectie of meting van de anogenitale afstand (34)(35) en elk jong in een nest moet afzonderlijk worden gewogen bij de geboorte of kort daarna, ten minste wekelijks tijdens de zoogperiode en ten minste eenmaal per twee weken daarna. Bij de beoordeling van de geslachtsrijping moeten, wanneer opening van de vagina (36) of loslaten van de voorhuid (37) optreedt, de leeftijd en het lichaamsgewicht van het dier worden bepaald voor ten minste één mannetje en één vrouwtje per nest.

Ontogenie van het gedrag

34.   De ontogenie van bepaald gedrag moet worden gemeten bij ten minste één jong/geslacht/nest tijdens de passende levensperiode, waarbij op alle testdagen voor al het gedrag dat wordt beoordeeld, dezelfde jongen worden gebruikt. De meetdagen moeten gelijkelijk over die periode worden verdeeld om te bepalen of de verandering in ontogenie van dat gedrag normaal of behandelingsgerelateerd is (38). Voorbeelden van gedrag waarvan de ontogenie kan worden beoordeeld zijn: oprichtreflex, negatieve geotaxis en motorische activiteit (38)(39)(40).

Motorische activiteit

35.   De motorische activiteit moet worden gecontroleerd (41)(42)(43)(44)(45) tijdens de levensperiode vóór spening en de volwassen levensperiode. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. De testsessie moet lang genoeg zijn om gewenning binnen een sessie voor niet-behandelde controles aan te tonen. Het wordt sterk aanbevolen ter beoordeling van de ontogenie van het gedrag de motorische activiteit te bepalen. Indien gebruikt als test voor ontogenie van het gedrag, moet het testen voor alle testsessies vóór spening met dezelfde dieren plaatsvinden. Er moet vaak genoeg worden getest om de ontogenie van gewenning binnen een sessie te kunnen beoordelen (44). Hiervoor kunnen drie of meer tijdsperioden tot en met de dag van spening nodig zijn (bv. PND 13, 17, 21). Het testen van dezelfde dieren of nestgenoten moet ook plaatsvinden op volwassen leeftijd, tegen het einde van het onderzoek (bv. PND 60-70). Zo nodig kan op extra dagen getest worden. De motorische activiteit moet worden gecontroleerd met een geautomatiseerd activiteitsregistratieapparaat dat zowel toenamen als afnamen in activiteit moet kunnen detecteren (d.w.z. de door het apparaat gemeten activiteit op baseline moet niet zo laag zijn dat afnamen niet kunnen worden gedetecteerd en ook niet zo hoog dat toenamen van de activiteit niet kunnen worden gedetecteerd). Elk apparaat moet volgens standaardprocedures worden getest om de betrouwbaarheid van de werking van alle apparaten op alle dagen zo veel mogelijk te waarborgen. De behandelgroepen moeten zo evenwichtig mogelijk over de apparaten worden verdeeld. Elk dier moet apart worden getest. De behandelgroepen moeten evenwichtig worden verspreid over de testtijden om verstoring door circadiaanse activiteitritmen te vermijden. Er moet zoveel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de testomstandigheden minimaal zijn en niet systematisch samenhangen met de behandeling. Variabelen die van invloed kunnen zijn op veel maten van gedrag, waaronder motorische activiteit, zijn geluidsniveau, grootte en vorm van de testkooi, temperatuur, relatieve vochtigheid, lichtomstandigheden, geuren, gebruik van verblijfskooi of nieuwe testkooi en afleiding uit de omgeving.

Motorische en sensorische functie

36.   De motorische en sensorische functie moet ten minste eenmaal in de adolescentieperiode en ten minste eenmaal in de jongvolwassenperiode (bv. PND 60-70) uitvoerig worden onderzocht. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. Er moet voldoende worden getest om te zorgen voor een toereikende kwantitatieve sampling van de sensorische modaliteiten (bv. somatosensorisch, vestibulair) en motorische functies (bv. kracht, coördinatie). Enkele voorbeelden van testen voor de motorische en sensorische functie zijn voetzoolreflex (46), oprichtreflex (47)(48), gewenning aan auditieve schrikreactie (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) en opgewekte potentialen (55).

Leervermogen- en geheugentesten

37.   Na het spenen (bv. 25 ± twee dagen) en bij jongvolwassen dieren (PND 60 en ouder) moet een test van het associatieve leervermogen en geheugen worden uitgevoerd. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. Voor deze twee ontwikkelingsfasen kunnen dezelfde test of aparte test(en) worden gebruikt. Enige flexibiliteit in de keuze van de test(en) voor leervermogen en geheugen bij gespeende en volwassen ratten is toegestaan. De test(en) moet(en) echter zodanig zijn opgezet dat wordt voldaan aan twee criteria. Ten eerste moet het leervermogen worden beoordeeld als een verandering over verschillende herhaalde leervermogenonderzoeken of -sessies, of, bij testen met één onderzoek, door te kijken naar een toestand die controleert op niet-associatieve effecten van de trainingservaring. Ten tweede moet(en) de test(en) naast het oorspronkelijke leervermogen (acquisitie) een maat voor het geheugen (kortetermijn- of langetermijngeheugen) omvatten, maar deze maat voor het geheugen kan niet gerapporteerd worden indien een met dezelfde test verkregen maat voor acquisitie ontbreekt. Als uit de test(en) voor het leervermogen en geheugen een effect van de teststof naar voren komt, kunnen aanvullende testen worden overwogen om alternatieve interpretaties op grond van veranderingen in sensorische, motivatie- en/of motorische capaciteiten uit te sluiten. Naast de twee bovenstaande criteria wordt geadviseerd de test voor het leervermogen en geheugen te kiezen op grond van de aangetoonde gevoeligheid ervan voor de klasse van stoffen waartoe de teststof behoort, als dergelijke informatie in de literatuur beschikbaar is. Als dergelijke informatie ontbreekt, kunnen de volgende testen worden gedaan om te voldoen aan de bovenstaande criteria: passieve vermijding (43)(56)(57), „delayed-matching-to-position” voor de volwassen rat (58) en voor de infantiele rat (59), olfactorische conditionering (43)(60), waterlabyrint van Morris (Morris water maze) (61)(62)(63), labyrint van Biel of Cincinnati (64)(65), stervormig labyrint (radial arm maze) (66), T-labyrint (43) en acquisitie en retentie van gedrag volgens een bepaald schema (schedule-controlled behaviour) (26)(67)(68). Aanvullende testen worden in de literatuur beschreven voor gespeende (26)(27) en volwassen ratten (19)(20).

Postmortaal onderzoek

38.   De moederdieren kunnen worden geëuthanaseerd nadat de nakomelingen zijn gespeend.

39.   Neuropathologische beoordeling van de nakomelingen wordt uitgevoerd met weefsels van dieren die om humane redenen zijn gedood op PND 22 of eerder, tussen PND 11 en PND 22, en aan het einde van het onderzoek. Van nakomelingen die op PND 22 of eerder worden gedood, moet het hersenweefsel worden beoordeeld; van dieren die aan het einde worden gedood, moet weefsel van het centrale zenuwstelsel (CZS) en het perifere zenuwstelsel (PZS) worden beoordeeld. Dieren die worden gedood op PND 22 of eerder, kunnen worden gefixeerd door immersie of perfusie. Dieren die aan het einde van het onderzoek worden gedood, moeten door perfusie worden gefixeerd. Bij alle aspecten van de preparatie van de weefselmonsters, d.w.z. vanaf de persfusie van de dieren tot en met de dissectie van de weefselmonsters, weefselbewerking en kleuren van de glaasjes, moet evenwichtig te werk worden gegaan, zodat elke partij representatieve monsters van elke dosisgroep bevat. Nadere richtsnoeren over neuropathologie zijn te vinden in OESO-leidraad nr. 20 (9), zie ook (103).

Bewerking van weefselmonsters

40.   Alle macroscopische afwijkingen die bij de obductie worden opgemerkt, moeten worden genoteerd. De weefselmonsters moeten afkomstig zijn van alle belangrijke gebieden van het zenuwstelsel. De weefselmonsters moeten worden bewaard in een geschikt fixatiemiddel en bewerkt volgens gestandaardiseerde gepubliceerde histologische protocollen (69)(70)(71)(103). Inbedding in paraffine is acceptabel voor weefsels van het CZS en PZS, maar wanneer een hogere mate van resolutie vereist is (bv. voor perifere zenuwen bij vermoeden van een perifere neuropathie en/of voor morfometrische analyse van perifere zenuwen), kan het aangewezen zijn om bij postfixatie osmium te gebruiken samen met inbedden in epoxy. Voor morfometrische analyse verzameld hersenweefsel moet bij alle dosisniveaus op hetzelfde moment in geschikte media worden ingebed om artefacten als gevolg van krimp die kan optreden bij langdurig bewaren in fixatiemiddel, te voorkomen (6).

Neuropathologisch onderzoek

41.   Het kwalitatieve onderzoek heeft tot doel:

i)	identificeren van gebieden binnen het zenuwstelsel waarbij sprake is van aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen;

ii)	identificeren van typen neuropathologische veranderingen die het gevolg zijn van blootstelling aan de teststof, en

iii)	bepalen van de mate van ernst van de neuropathologische veranderingen.

Representatieve histologische coupes van de weefselmonsters moeten door een goed opgeleide patholoog microscopisch worden onderzocht op aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen. Aan alle neuropathologische veranderingen moet een subjectieve graad van ernst worden toegekend. Een hematoxyline- en eosinekleuring kan voldoende zijn voor de beoordeling van hersencoupes van dieren die op PND 22 of eerder`om humane redenen zijn gedood. Voor coupes van CZS- en PZS-weefsels van dieren die zijn gedood aan het einde van het onderzoek wordt echter een myelinekleuring (bv. luxol fast blue/cresylviolet) en een zilverkleuring (bv. Bielschowsky- of Bodiankleuring) aanbevolen. Afhankelijk van het professionele oordeel van de patholoog en de soort veranderingen dat wordt waargenomen, kunnen andere kleuringen worden beschouwd als geschikt voor de identificatie en karakterisering van bepaalde typen veranderingen (bv. glia fibrillair zuur eiwit (glial fibrillary acidic protein, GFAP) of lectinehistochemie om veranderingen in het glia en microglia te beoordelen (72), fluoro-jade om necrose te detecteren (73)(74), of voor neurodegeneratie specifieke zilverkleuringen (75)).

42.   Aangezien deze gegevens kunnen worden gebruikt bij de detectie van een behandelingsgerelateerd effect en waardevol zijn bij de interpretatie van behandelingsgerelateerde verschillen in hersengewicht of morfologie, moet morfometrische (kwantitatieve) beoordeling plaatsvinden (76)(77). Voor de morfometrische beoordeling moeten zenuwweefselmonsters worden genomen en geprepareerd. Morfometrische beoordelingen kunnen bijvoorbeeld bestaan uit lineaire of oppervlaktemetingen van specifieke hersengebieden (78). Bij lineaire of oppervlaktemetingen moeten homologe coupes worden gebruikt die zorgvuldig zijn geselecteerd op grond van betrouwbare microscopische mijlpalen (6). Stereologie kan worden gebruikt om behandelingsgerelateerde effecten op parameters, zoals volume of aantal cellen voor specifieke neuroanatomische gebieden, te identificeren (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43.   De hersenen moeten worden onderzocht op aanwijzingen voor behandelingsgerelateerde neuropathologische veranderingen en voor grondig onderzoek moeten geschikte monsters worden genomen van alle belangrijke hersengebieden (bv. bulbus olfactorius, hersenschors, hippocampus, basale ganglia, thalamus, hypothalamus, middenhersenen (tectum, tegmentum en hersensteel), pons, verlengde merg, kleine hersenen). Het is van belang dat voor alle dieren de coupes in hetzelfde vlak worden genomen. Bij volwassen dieren die op humane wijze worden gedood aan het einde van het onderzoek, moeten representatieve coupes van het ruggenmerg en het PZS worden verzameld. De te onderzoeken gebieden zijn onder meer het oog met de oogzenuw en het netvlies, het ruggenmerg bij de cervicale en lumbale zwellingen, de dorsale en ventrale wortelvezels, de proximale ischiaszenuw, de proximale scheenbeenzenuw (bij de knie) en de vertakkingen van de scheenbeenzenuw naar de kuitspier. De coupes van het ruggenmerg en de perifere zenuwen moeten uit zowel dwars- als lengtecoupes bestaan.

44.   Neuropathologische beoordeling moet een onderzoek omvatten naar aanwijzingen voor ontwikkelingsschade aan het zenuwstelsel (6)(85)(86)(87)(88)(89), naast de cellulaire veranderingen (bv. neuronale vacuolisatie, degeneratie, necrose) en weefselveranderingen (bv. gliose, infiltratie van leukocyten, vorming van cysten). In dit opzicht is het van belang onderscheid te maken tussen behandelingsgerelateerde effecten en normale ontwikkelingen waarvan bekend is dat deze plaatsvinden tijdens de ontwikkelingsfase van het dier op het moment van doden (90). Belangrijke veranderingen die een indicatie zijn van een aanval op de ontwikkeling zijn bijvoorbeeld (maar zijn niet daartoe beperkt):

—	veranderingen in de macroscopische omvang of vorm van de bulbus olfactorius, de grote hersenen of de kleine hersenen,

—

veranderingen in de relatieve omvang van verscheidene hersengebieden, waaronder afnamen of toenamen van de omvang van deze gebieden als gevolg van het verlies of persistentie van normaal tijdelijke populaties van cellen of axonale projecties (bv. uitwendige kiemlaag van de kleine hersenen, hersenbalk),

—

veranderingen in proliferatie, migratie en differentiatie, zoals blijkt uit gebieden met overmatige apoptose of necrose, clusters of verspreide populaties van ectopische, gedesoriënteerde of misvormde neuronen of veranderingen in de relatieve omvang van verscheidene lagen van de corticale structuren,

—	veranderingen in myelinisatiepatronen, zoals een algemene afname van de omvang of gewijzigde kleuring van gemyeliniseerde structuren,

—	aanwijzingen voor hydrocefalus, met name vergroting van de ventrikels, stenose van het aquaduct van Sylvius en het dunner worden van de hersenhelften.

Analyse van de dosis-responsverhouding van neuropathologische veranderingen

45.   De volgende stapsgewijze procedure wordt aanbevolen voor de kwalitatieve en kwantitatieve neuropathologische analyses. Eerst worden coupes van de hogedosisgroep vergeleken met die van de controlegroep. Als er geen aanwijzingen worden gevonden voor neuropathologische veranderingen bij dieren van de hogedosisgroep, is verdere analyse niet nodig. Als er wel aanwijzingen worden gevonden voor neuropathologische veranderingen in de hogedosisgroep, worden dieren van de middelhoge- en lagedosisgroepen onderzocht. Als onderzoek met de hogedosisgroep wordt stopgezet vanwege sterfgevallen of andere storende toxiciteit, moeten de hoge- en middelhogedosisgroepen geanalyseerd worden op neuropathologische veranderingen. Als er aanwijzingen zijn voor neurotoxiciteit in de lagedosisgroepen, moet in die groepen neuropathologische analyse worden verricht. Als er onderzoeksgerelateerde neuropathologische veranderingen worden gevonden in het kwalitatieve of kwantitatieve onderzoek, moet op grond van een beoordeling van alle dieren uit alle dosigroepen de dosisafhankelijkheid van de incidentie, frequentie en graad van ernst van de letsels of van de morfometrische veranderingen worden bepaald. Alle gebieden van de hersenen met aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen moeten in deze beoordeling worden meegenomen. Voor elk type letsel moeten de kenmerken worden beschreven die zijn gebruikt om elke graad van ernst te definiëren, waarbij wordt aangegeven op basis waarvan elke mate van ernst zich onderscheidt. De frequentie van elk type letsel en de graad van ernst ervan moeten worden geregistreerd en een statistische analyse moet worden uitgevoerd ter beoordeling van de dosis-responsverhoudingen. Het wordt aanbevolen gecodeerde glaasjes te gebruiken (91).

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Gegevens

46.   Gegevens moeten afzonderlijk worden gerapporteerd en in tabelvorm worden samengevat, met voor elke testgroep de typen veranderingen en het aantal moederdieren, nakomelingen per geslacht en nesten waarbij ieder type verandering voorkomt. Bij directe postnatale blootstelling van de nakomelingen moet de weg, duur en periode van blootstelling gerapporteerd worden.

Beoordeling en interpretatie van resultaten

47.   Een onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit geeft informatie over de effecten van herhaalde blootstelling aan een stof tijdens de in-utero- en vroeg-postnatale ontwikkeling. Aangezien de nadruk wordt gelegd op zowel het eindpunt algemene toxiciteit als het eindpunt ontwikkelingsneurotoxiciteit, kan met de resultaten van het onderzoek onderscheid worden gemaakt tussen neuro-ontwikkelingseffecten die zich voordoen bij afwezigheid van algemene maternale toxiciteit, en neuro-ontwikkelingseffecten die alleen tot uitdrukking komen bij niveaus die ook toxisch zijn voor het moederdier. Vanwege de complexe onderlinge verbanden tussen onderzoeksopzet, statistische analyse en biologische significantie van de gegevens is voor een adequate interpretatie van ontwikkelingsneurotoxiciteitsgegevens het oordeel van een deskundige nodig (107)(109). Bij de interpretatie van de testresultaten moet gebruik worden gemaakt van een op bewijskracht gebaseerde aanpak (20)(92)(93)(94). Patronen van gedrags- of morfologische bevindingen, indien aanwezig, en aanwijzingen voor dosisrespons moeten worden besproken. Bij deze karakterisering moeten gegevens van alle onderzoeken die relevant zijn voor de beoordeling van ontwikkelingsneurotoxiciteit, worden meegenomen, waaronder epidemiologische onderzoeken of casereports met mensen en onderzoeken met proefdieren (bv. toxicokinetische gegevens, structuur-activiteitinformatie, gegevens uit andere toxiciteitsonderzoeken). Daartoe behoort ook het verband tussen de doses van de teststof en de aan- of afwezigheid, incidentie en de mate van eventuele neurotoxische effecten voor elk geslacht (20)(95).

48.   Bij de beoordeling van de gegevens moet zowel de biologische als de statistische significantie worden besproken. Statistische analyse moet worden gezien als een instrument dat een leidraad geeft voor de interpretatie van gegevens, zonder dat het bepalend daarvoor is. De conclusie dat er geen sprake is van een behandelingsgerelateerd effect, mag niet louter gebaseerd zijn op het ontbreken van statistische significantie. Evenzo geldt dat de conclusie dat er wel sprake is van een behandelingsgerelateerd effect, niet louter op statistische significantie gebaseerd mag zijn. Om mogelijke vals-negatieve bevindingen en de moeilijkheden die inherent zijn aan „aantonen van een negatieve” te voorkomen, moeten beschikbare positieve en historische controlegegevens worden besproken, met name als er geen behandelingsgerelateerde effecten zijn (102)(106). De kans op vals-positieven moet worden besproken in het licht van de totale statistische beoordeling van de gegevens (96). De beoordeling moet het eventuele verband tussen waargenomen neuropathologische en gedragsveranderingen omvatten.

49.   Alle resultaten worden geanalyseerd worden met behulp van voor de testopzet toepasselijke statistische modellen. De keuze voor een parametrische of een niet-parametrische analyse moet worden gemotiveerd aan de hand van factoren zoals de aard van de gegevens (al dan niet getransformeerd) en de verspreiding ervan, alsook de relatieve robuustheid van de gekozen statistische analyse. Het doel en de opzet van het onderzoek moeten als leidraad dienen voor de keuze van statistische analyses om type I (vals-positieve) en type II (vals-negatieve) fouten tot het minimum te beperken (96)(97)(104)(105). Bij ontwikkelingsonderzoeken met multipara's in het geval dat meerdere jongen per nest worden getest, moet het nest in het statistische model worden opgenomen om opgeschroefde type I-foutenpercentages te voorkomen (98)(99)(100)(101). De statistische meeteenheid moet het nest zijn en niet het jong. De experimenten moeten zodanig zijn opgezet, dat nestgenoten niet als onafhankelijke observaties worden behandeld. Eindpunten die herhaaldelijk worden gemeten bij hetzelfde proefdier, moeten geanalyseerd worden met statistische modellen die rekening houden met deze niet-onafhankelijke werkwijze.

Testverslag

50.   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Teststof:

—	fysische aard en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken,

—	identificatiegegevens, waaronder de herkomst,

—	zuiverheid van het preparaat en bekende en/of verwachte onzuiverheden.

Medium (indien van toepassing):

—	motivering van de keuze van het medium, indien geen water of fysiologische zoutoplossing wordt gebruikt.

Proefdieren:

—	gebruikte soort en stam, en een motivering voor het gebruik van een andere soort dan ratten,

—	leverancier van de proefdieren,

—	aantal, leeftijd bij aanvang en geslacht van de dieren,

—	herkomst, huisvesting, voeding, water enz.,

—	gewicht van elk dier bij aanvang van de test.

Testomstandigheden:

—	motivering van de keuze van de dosisniveaus,

—	motivering van de toedieningsweg en tijdsduur,

—	specificaties van de toegediende doses, waaronder details van het medium, de hoeveelheid en de fysische vorm van de toegediende stof,

—	gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereiding van het voer en de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat,

—	gebruikte methode voor de unieke identificatie van moederdieren en nakomelingen,

—	gedetailleerde beschrijving van de gerandomiseerde procedures(s) voor het toewijzen van de moederdieren aan behandelgroepen, het ruimen van jongen en het toewijzen van jongen aan testgroepen,

—	gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof,

—	omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater of van de inhalatieteststof (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing,

—	milieuomstandigheden,

—	gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en water (bv. kraanwater, gedestilleerd water),

—	data van aanvang en einde onderzoek.

Observaties en testprocedures:

—	een gedetailleerde beschrijving van de gebruikte procedures voor de standaardisatie van observaties en procedures en operationele definities voor het scoren van observaties,

—	een lijst van alle gebruikte testprocedures en een motivering van het gebruik ervan,

—	gedetailleerde gegevens over de gebruikte gedrags/functie-, pathologische, neurochemische of elektrofysiologische procedures, waaronder informatie en details over geautomatiseerde apparatuur,

—	procedures om apparatuur te ijken en om de gelijkwaardigheid van apparatuur te waarborgen en om evenwichtige behandelgroepen te krijgen bij het testen,

—	een korte motivering waarin beslissingen genomen op basis van professioneel oordeel uiteengezet worden.

Resultaten (afzonderlijke en beknopte, waaronder gemiddelde en variantie indien van toepassing):

—	het aantal dieren bij aanvang van het onderzoek en het aantal aan het einde van het onderzoek,

—	het aantal dieren en nesten dat voor elke testmethode werd gebruikt,

—	het identificatienummer van elk dier en het nest waaruit het afkomstig was,

—	nestgrootte en gemiddeld geboortegewicht naar geslacht,

—	gegevens over lichaamsgewicht en verandering in lichaamsgewicht, waaronder eindlichaamsgewicht voor moederdieren en nakomelingen,

—	gegevens over voer- en waterconsumptie, indien van toepassing (bv. als de teststof via water wordt toegediend),

—	gegevens over toxische responsen naar geslacht en dosisniveau, met inbegrip van toxiciteitsverschijnselen of sterftecijfers, waaronder het tijdstip en de oorzaak van overlijden, indien van toepassing,

—	aard, ernst, duur, dag van ontstaan, tijdstip en verdere verloop van de gedetailleerde klinische observaties,

—	score van elke ontwikkelingsmijlpaal (gewicht, geslachtsrijping en ontogenie van het gedrag) bij elke observatietijd,

—	een gedetailleerde beschrijving van alle gedrags-, functie-, neuropathologische, neurochemische, elektrofysiologische bevindingen naar geslacht, waaronder zowel toenamen als afnamen ten opzichte van de controles,

—	obductiebevindingen,

—	hersengewichten,

—	diagnoses gesteld op basis van neurologische verschijnselen en letsels, waaronder natuurlijk voorkomende ziekten of aandoeningen,

—	beelden van voorbeeldige bevindingen,

—	lageresolutiebeelden ter beoordeling van de homologie van coupes die zijn gebruikt voor morfometrie,

—	absorptie- en metabolismegegevens, waaronder complementaire gegevens van een afzonderlijk toxicokinetisch onderzoek, indien beschikbaar,

—	statistische behandeling van resultaten, waaronder statistische modellen die zijn gebruikt voor analyse van de gegevens, en de resultaten, ongeacht de significantie ervan,

—	lijst van onderzoeksmedewerkers, inclusief beroepsopleiding.

Bespreking van de resultaten:

—	informatie over dosisresponsen, naar geslacht en groep,

—	verband van eventuele andere toxische effecten met een conclusie over het neurotoxische potentieel van de teststof, naar geslacht en groep,

—	invloed van eventuele toxicokinetische informatie op de conclusies,

—	overeenkomsten van effecten met bekende neurotoxische stoffen,

—	gegevens die de betrouwbaarheid en gevoeligheid van de testmethode ondersteunen (d.w.z. positieve en historische controlegegevens),

—	eventuele verbanden tussen neuropathologische en functie-effecten,

—	NOAEL- of benchmarkdosis voor moederdieren en nakomelingen, naar geslacht en groep.

Conclusies

—	een discussie over de algehele interpretatie van de gegevens op grond van de resultaten, waaronder een conclusie over het feit of de teststof ontwikkelingsneurotoxiciteit veroorzaakte en de NOAEL.

LITERATUUR

1.

OESO (1995). Draft Report of the OECD Ad HocWorking Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Kopenhagen, Denemarken, 13-14 juni 1995.

2.

US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit. US EPA 712-C-98-239. Te vinden op: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

3.

US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Te vinden op: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

4.

Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

5.

Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

6.

Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

7.

OESO (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23-25 October 2000.

8.

OESO (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OESO, Parijs, juli 2008. Te vinden op: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

9.

OESO (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OESO, Parijs, september 2003. Te vinden op: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

10.

Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

11.

Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

12.

Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

13.

Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

14.

Hoofdstuk B.34 van deze bijlage, Reproductietoxiciteitsonderzoek over één generatie.

15.

Hoofdstuk B.35 van deze bijlage, Reproductietoxiciteitsonderzoek over twee generaties.

16.

Hoofdstuk B.43 van deze bijlage, Neurotoxiciteitsonderzoek bij knaagdieren.

17.

Hoofdstuk B.31 van deze bijlage, Onderzoek naar prenatale ontwikkelingstoxiciteit.

18.

Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).

19.

WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Te vinden op: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

20.

WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Genève. Te vinden op: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

21.

Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

22.

De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

23.

Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

24.

Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

25.

Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

26.

Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

27.

Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

28.

Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

29.

Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

30.

Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

31.

ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

32.

Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

33.

Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

34.

Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

35.

Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, bbp, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

36.

Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

37.

Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

38.

Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

39.

Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

40.

Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67-100.

41.

Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

42.

Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, pp. 37-82.

43.

Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

44.

Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

45.

Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

46.

Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

47.

Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669.

48.

Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

49.

Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287-351

50.

Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

51.

Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.

52.

Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

53.

Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25-30.

54.

Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437-445.

55.

Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 125-145.

56.

Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

57.

Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

58.

Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

59.

Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

60.

Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

61.

Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

62.

Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

63.

D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

64.

Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

65.

Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

66.

Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

67.

Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

68.

Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338-341.

69.

Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

70.

Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, pp. 84-107.

71.

Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

72.

Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

73.

Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

74.

Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

75.

De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

76.

De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

77.

De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

78.

Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129-135.

79.

Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

80.

Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

81.

Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

82.

Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

83.

West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

84.

Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813-831.

85.

Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

86.

Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

87.

Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.

88.

Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

89.

Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056-1060.

90.

Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

91.

House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

92.

Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

93.

US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

94.

US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

95.

Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

96.

Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

97.

Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

98.

Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

99.

Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

100.

Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

101.

Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

102.

Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

103.

Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A „best practices” approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

104.

Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

105.

Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

106.

Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

107.

Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

108.

Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

109.

Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

Figuur 1

Algemeen testschema voor functie/gedragstesten, neuropathologische beoordeling en hersengewichten. Dit diagram is gebaseerd op de beschrijving in punten 13-15 (PND = postnatale dag). Voorbeelden van toewijzing van dieren staan in aanhangsel 1.

B.54.   UTEROTROFE BIOASSAY BIJ KNAAGDIEREN: EEN KORTLOPENDE SCREENINGSTEST OP OESTROGENE EIGENSCHAPPEN

INLEIDING

1.   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 440 (2007) van de OESO. In 1998 is de OESO een actie gestart om bestaande richtlijnen te herzien en nieuwe richtlijnen te ontwikkelen voor het screenen op en testen van potentiële hormoonontregelaars (1), en heeft zij daaraan een hoge prioriteit toegekend. Een onderdeel van deze actie was het ontwikkelen van een testrichtlijn voor de uterotrofe bioassay bij knaagdieren. De uterotrofe bioassay bij knaagdieren werd vervolgens onderworpen aan een uitgebreid valideringsprogramma dat onder meer bestond uit het opstellen van een gedetailleerd achtergronddocument (2)(3) en het uitvoeren van uitgebreide intra- en interlaboratoriumonderzoeken om de relevantie en reproduceerbaarheid aan te tonen van de bioassay met een krachtig referentie-oestrogeen, zwakke oestrogeenreceptoragonisten, een sterke oestrogeenreceptorantagonist en een negatieve referentiestof (4)(5)(6)(7)(8)(9). Deze testmethode B.54 is het resultaat van de ervaring die is opgedaan tijdens het valideringstestprogramma en de daaruit verkregen resultaten met oestrogeenagonisten.

2.   De uterotrofe bioassay bij knaagdieren is een kortlopende screeningstest die in de jaren 30 werd ontwikkeld (27)(28) en in 1962 voor het eerst werd gestandaardiseerd voor screening door een comité van deskundigen (32)(35). De test berust op de toename van het gewicht van de baarmoeder of de uterotrofe respons (zie 29 voor een overzichtsartikel). Beoordeeld wordt in welke mate een stof in staat is biologische activiteiten teweeg te brengen die overeenkomen met die van agonisten of antagonisten of natuurlijke oestrogenen (bv. 17b-estradiol); de test wordt echter veel minder vaak gebruikt voor de detectie van antagonisten dan voor de detectie van agonisten. De baarmoeder reageert op twee manieren op oestrogenen. In eerste instantie neemt het gewicht toe als gevolg van waterimbibitie. Deze respons wordt gevolgd door een gewichtstoename als gevolg van weefselgroei (30). De responsen van de baarmoeder bij ratten en muizen zijn kwalitatief vergelijkbaar.

3.   Deze bioassay fungeert als een in-vivoscreeningstest en de toepassing ervan moet worden gezien in samenhang met het „Conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen” (aanhangsel 2). In dit conceptueel kader is de uterotrofe bioassay ondergebracht in niveau 3 als een in-vivotest waarmee gegevens kunnen worden verkregen over een enkel hormoonmechanisme, d.w.z. oestrogene werking.

4.   De bedoeling is dat de uterotrofe bioassay wordt opgenomen in een reeks in-vitro- en in-vivotesten voor de identificatie van stoffen die mogelijk interactie vertonen met het hormoonsysteem, op basis waarvan uiteindelijk beoordelingen van het risico voor de gezondheid van de mens of het milieu tot stand komen. Het valideringsprogramma van de OESO maakte gebruik van zowel sterke als zwakke oestrogeenagonisten bij de beoordeling van de prestatie van de test voor de identificatie van oestrogene stoffen (4)(5)(6)(7)(8). De gevoeligheid van de testprocedure voor oestrogeenagonisten werd daarbij goed aangetoond, evenals een goede intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid.

5.   Wat betreft negatieve stoffen werd slechts één „negatieve” referentiestof, waarvan al gerapporteerd was dat deze negatief was volgens een uterotrofe test alsook in-vitroreceptorbindings- en receptortesten, opgenomen in het valideringsprogramma. Daarnaast zijn echter aanvullende testgegevens beoordeeld die geen verband hielden met het OESO-valideringsprogramma, en hierdoor werd de specificiteit van de uterotrofe bioassay voor de screening van oesterogeenagonisten verder ondersteund (16).

INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

6.   Oestrogeenagonisten en -antagonisten werken als liganden voor de oestrogeenreceptoren a en b en kunnen de transcriptiewerking van de receptoren respectievelijk activeren of remmen. Dit zou kunnen leiden tot schadelijke gevaren voor de gezondheid, waaronder effecten op de voortplanting en de ontwikkeling. Er bestaat daarom behoefte aan een snelle methode om een stof te beoordelen en te evalueren als een mogelijke oestrogeenagonist of -antagonist. De affiniteit van een ligand voor een oestrogeenreceptor of transcriptieactivering van reportergenen in vitro is wel informatief, maar is slechts een van de verschillende determinanten van mogelijk gevaar. Mogelijke andere determinanten zijn onder meer metabole activering en deactivering nadat de stof het lichaam is binnengetreden, distributie naar doelweefsels en klaring uit het lichaam, en zijn ten minste deels afhankelijk van de toedieningsweg en de betreffende stof. Hierdoor bestaat de behoefte de mogelijke activiteit van een stof in vivo te screenen onder relevante omstandigheden, tenzij de kenmerken van de stof wat betreft absorptie, distributie, metabolisme en eliminatie (ADME) al voldoende informatie opleveren. Baarmoederweefsels reageren met snelle en krachtige groei op stimulering door oestrogenen, met name bij proefknaagdieren, waarbij de oestruscyclus ongeveer vier dagen duurt. Knaagdiersoorten, in het bijzonder de rat, worden bovendien veel gebruikt in toxiciteitsonderzoeken naar karakterisering van gevaren. De baarmoeder van knaagdieren is daarom een geschikt doelorgaan voor de in-vivoscreening van oestrogeenagonisten en -antagonisten.

7.   Deze testmethode is gebaseerd op de in het OESO-valideringsonderzoek toegepaste protocollen die betrouwbaar en herhaalbaar zijn gebleken in intra- en interlaboratoriumonderzoeken (5)(7). Op dit moment zijn er twee methoden beschikbaar, namelijk de methode met volwassen vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan (ovx-volwassen-methode), en de methode met onvolgroeide vrouwtjes die geen ovariëctomie hebben ondergaan (onvolgroeid-methode). In het OESO-valderingstestprogramma is aangetoond dat beide methoden wat betreft gevoeligheid en reproduceerbaarheid vergelijkbaar zijn. Vanwege de intacte hypothalamus-hypofyse-gonadeas (HPG-as), is het onvolgroeide dier weliswaar enigszins minder specifiek, maar heeft het een grotere onderzoeksreikwijdte dan het dier dat ovariëctomie heeft ondergaan, omdat het kan reageren op stoffen die interactie vertonen met de HPG-as en niet alleen met de oestrogeenreceptor. De HGP-as van de rat is functioneel vanaf een leeftijd van ongeveer 15 dagen. Eerder kan de puberteit niet met behandelingen als GnRH worden versneld. Als de vrouwtjes richting de puberteit gaan, heeft het vrouwtje vóór de vaginale opening verscheidene stille cycli die niet leiden tot vaginale opening of ovulatie, maar waarbij er wel enige hormonale schommelingen zijn. Als een stof de HPG-as direct of indirect stimuleert, leidt dit tot vroegtijdige puberteit, vroege eisprong en versnelde vaginale opening. Dit treedt niet alleen op bij stoffen die inwerken op de HPG-as, maar ook bepaald voer met een hogere metaboliseerbare energiewaarde dan ander voer stimuleert de groei en versnelt de vaginale opening zonder een oestrogene werking te hebben. Dergelijke stoffen induceren geen uterotrofe respons bij volwassen ovx-dieren, omdat hun HPG-as niet werkt.

8.   Met het oog op dierenwelzijn moet de voorkeur worden gegeven aan de methode met onvolgroeide ratten, zodat dat operatieve voorbehandeling van de dieren wordt voorkomen en ook wordt voorkomen dat de dieren met aanwijzingen dat deze in de oestrus komen, mogelijk niet worden gebruikt (zie punt 30).

9.   De uterotrofe respons is niet geheel van oestrogene oorsprong, d.w.z. andere stoffen dan agonisten of antagonisten van oestrogenen kunnen ook een respons geven. Zo kunnen relatief hoge doses progesteron, testosteron of verscheidene synthetische progestinen allemaal leiden tot een stimulerende respons (30). Elke respons kan histologisch geanalyseerd worden op keratinisatie en verhoorning van de vagina (30). Ongeacht de mogelijke bron van de respons moet bij een positieve uitkomst van een uterotrofe bioassay normaliter actie worden ondernomen om meer duidelijkheid te verschaffen. Aanvullende aanwijzingen voor oestrogene werking kunnen komen uit in-vitrotesten, zoals de ER-bindingtesten en transcriptieactiveringstesten of uit andere in-vivotesten zoals de test op de puberale ontwikkeling bij vrouwtjes (female pubertal assay).

10.   Aangezien de uterotrofe bioassay fungeert als een in-vivoscreeningstest, diende de gekozen valideringsaanpak zowel de overwegingen met het oog op dierenwelzijn als een gefaseerde teststrategie. Daartoe lag de focus meer op grondige validering van de reproduceerbaarheid en gevoeligheid voor oestrogene werking — de belangrijkste bron van zorg voor veel stoffen — dan op het anti-oestrogene deel van de test. Omdat het aantal stoffen met een duidelijk anti-oestrogeen profiel (niet vertroebeld door enige oestrogene activiteit) zeer beperkt is, werd slechts één anti-oestrogeen met sterke activiteit onderzocht. Deze testmethode heeft dus betrekking op het oestrogene protocol; het protocol waarin de antagonistmodus van de test wordt beschreven, is in een leidraad opgenomen (37). De reproduceerbaarheid en gevoeligheid van de test voor stoffen met zuiver anti-oestrogene activiteit wordt later duidelijker gedefinieerd, nadat de testprocedure enige tijd routinematig in gebruik is geweest en meer stoffen met dit type werking zijn geïdentificeerd.

11.   Erkend wordt dat alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, aan de plaatselijke normen voor de verzorging van dieren moeten voldoen. De beschrijvingen van verzorging en behandeling hieronder zijn minimale uitvoeringsnormen, die ondergeschikt zijn aan lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (38). De OESO heeft nadere richtsnoeren voor de humane behandeling van dieren opgesteld (25).

12.   Net als met alle testen waarbij levende dieren worden gebruikt, is het van essentieel belang om vóór de start van de test zeker te stellen dat de gegevens echt noodzakelijk zijn. Twee situaties waarbij de gegevens noodzakelijk kunnen zijn, zijn bijvoorbeeld:

—	hoge potentiële blootstelling (niveau 1 van het conceptueel kader, aanhangsel 2) of aanwijzingen voor oestrogene werking (niveau 2), om te onderzoeken of dergelijke effecten kunnen plaatsvinden in vivo,

—	effecten die wijzen op oestrogene werking bij in-vivotesten van niveau 4 of 5, om aan te tonen dat de effecten verband hielden met een oestrogeen mechanisme dat niet kan worden opgehelderd met een in-vitrotest.

13.   De bij deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.

PRINCIPE VAN DE TEST

14.   De gevoeligheid van de uterotrofe bioassay berust op een testsysteem met proefdieren waarbij de hypothalamus-hypofyse-gonadeas niet functioneel is, wat lage endogene concentraties van circulerend oestrogeen geeft. Dit zorgt voor een laag basisgewicht van de baarmoedergewicht op baseline en een maximaal bereik van de respons op toegediende oestrogenen. Twee oestrogeengevoelige toestanden van het vrouwelijke knaagdier voldoen aan deze eis:

i)	onvolgroeide vrouwtjes na spening en vóór de puberteit, en

ii)	jongvolwassen vrouwtjes na ovariëctomie waarbij er voldoende tijd is voor regressie van baarmoederweefsels.

15.   De teststof wordt dagelijks toegediend via een orale maagsonde of subcutane injectie. De stof wordt in geleidelijk stijgende doses toegediend aan minimaal twee behandelgroepen (zie punt 33 voor richtsnoeren) van proefdieren met één dosisniveau per groep en een toedieningsperiode van drie opeenvolgende dagen voor de onvolgroeid-methode en een minimale toedieningsperiode van drie opeenvolgende dagen voor de ovx-volwassen-methode. Ongeveer 24 uur na de laatste dosis wordt obductie verricht op de dieren. Voor oestrogeenagonisten wordt beoordeeld of het gemiddelde baarmoedergewicht van de groepen met behandelde dieren statistisch significant is toegenomen ten opzichte van dat van de mediumgroep. Een statistisch significante toename van het gemiddelde baarmoedergewicht van een testgroep wijst op een positieve respons in deze bioassay.

BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Keuze van de diersoort

16.   Voor de methode kunnen vaak gebruikte proefknaagdierstammen worden gebruikt. Tijdens de validering werden bijvoorbeeld de rattenstammen Sprague-Dawley en Wistar gebruikt. Stammen met baarmoeders waarvan bekend is of vermoed wordt dat het responsvermogen lager is, mogen niet worden gebruikt. Het laboratorium moet de gevoeligheid van de gebruikte stam aantonen, zoals beschreven in punten 26 en 27.

17.   De rat en muis zijn al sinds de jaren 30 routinematig gebruikt voor de uterotrofe bioassay. De OESO-valideringsonderzoeken werden alleen met ratten verricht op grond van de aanname dat beide soorten naar verwachting gelijkwaardig zijn en dat één soort daarom voldoende moet zijn voor de wereldwijde validering, om zodoende te besparen op middelen en dieren. In de meeste onderzoeken naar reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit is de rat de aangewezen soort. In aanmerking genomen dat er voor muizen een enorme historische databank bestaat werd er, om de reikwijdte van de testmethode van de uterotrofe bioassay bij knaagdieren uit te breiden met het gebruik van muizen als testsoorten, een beperkt follow-upvalideringsonderzoek met muizen uitgevoerd (16). Er is gekozen voor een overbruggingsaanpak met een beperkt aantal teststoffen, deelnemende laboratoria en zonder codering van monsters, in overeenstemming met de oorspronkelijke intentie om te besparen op middelen en dieren. Uit dit overbruggingsvalideringsonderzoek blijkt voor de uterotrofe bioassay bij jongvolwassen muizen die ovariëctomie hebben ondergaan, dat de bij ratten en muizen verkregen gegevens kwalitatief en kwantitatief goed met elkaar overeenkomen. Dit maakt het mogelijk, in het geval de uterotrofe bioassay inleidend is voor een langdurig onderzoek, in beide onderzoeken dieren van dezelfde stam en afkomst te gebruiken. Omdat de overbruggingsaanpak werd beperkt tot ovx-muizen en in het verslag geen robuuste dataset staat die het onvolgroeid-model valideert, valt het onvolgroeid-model voor muizen niet onder de reikwijdte van de huidige testmethode.

18.   In bepaalde gevallen kunnen dus muizen in plaats van ratten worden gebruikt. De keuze voor deze soort moet worden gemotiveerd op basis van toxicologische, farmacokinetische en/of andere criteria. Het kan noodzakelijk zijn om voor muizen van het protocol af te wijken. Zo is de voedselconsumptie van muizen op basis van lichaamsgewicht hoger dan die van ratten en moet daarom het gehalte aan fyto-oestrogenen in het voer voor muizen lager zijn dan voor ratten (9)(20)(22).

Huisvestings- en voedingsomstandigheden

19.   Alle procedures moeten verlopen conform de plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. Deze beschrijvingen van de verzorging en behandeling zijn minimumnormen, die ondergeschikt zijn aan lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (38). De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 °C te zijn (met een spreiding van ± 3 °C). De relatieve vochtigheid moet minimaal 30 % zijn en bij voorkeur niet hoger dan maximaal 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte). Er moet worden gestreefd naar een relatieve vochtigheid van 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht, met een dagelijkse lichtcyclus van 12 uur licht en 12 uur donker.

20.   Proefdiervoer en drinkwater moeten ad libitum worden verstrekt. Jongvolwassen dieren kunnen elk apart of in groepjes van maximaal drie dieren worden ondergebracht. Vanwege de jonge leeftijd van de onvolgroeide dieren, wordt sociale groepshuisvesting aanbevolen.

21.   Het is bekend dat hoge gehaltes aan fyto-oestrogenen in proefdiervoer het baarmoedergewicht bij knaagdieren in zodanige mate verhogen, dat dit de uterotrofe bioassay verstoort (13)(14)(15). Hoge gehaltes aan fyto-oestrogenen en hoge metaboliseerbare energiewaarden in proefdiervoer kan bij gebruik van onvolgroeide dieren ook leiden tot vroegtijdige pubertijd. De fyto-oestrogenen komen hoofdzakelijk uit soja- en luzerneproducten die in het proefdiervoer zijn verwerkt, en het is gebleken dat de concentratie fyto-oestrogenen in standaardproefdiervoer van partij tot partij varieert (23). Het lichaamsgewicht is een belangrijke variabele, omdat de hoeveelheid voedsel die ingenomen wordt, gerelateerd is aan het lichaamsgewicht. De feitelijke dosis fyto-oestrogenen die dieren via hetzelfde voer binnenkrijgen, kan daarom per soort en per leeftijd variëren (9). Voor onvolgroeide vrouwelijke ratten kan de voedselconsumptie op basis van lichaamsgewicht ongeveer een factor twee groter zijn dan die voor jongvolwassen vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan. Voor jongvolwassen muizen kan de voedselconsumptie op basis van lichaamsgewicht ongeveer een factor vier groter zijn dan die voor jongvolwassen vrouwelijke ratten die ovariëctomie hebben ondergaan.

22.   Uit resultaten van uterotrofe testen (9)(17)(18)(19) blijkt echter dat beperkte hoeveelheden fyto-oestrogenen in voer aanvaardbaar zijn en de gevoeligheid van de bioassay niet verminderen. Als richtsnoer mogen de gehaltes aan fyto-oestrogenen in voer niet hoger zijn dan 350 μg genisteïne-equivalenten/gram proefdiervoer voor onvolgroeide vrouwelijke Sprague Dawley- en Wistar-ratten (6)(9). Dergelijk voer moet eveneens aangewezen zijn bij het testen van jongvolwassen ratten die ovariëctomie hebben ondergaan, omdat de voedselconsumptie op basis van lichaamsgewicht bij jongvolwassen dieren lager is dan bij onvolgroeide dieren. Als volwassen muizen die ovariëctomie hebben ondergaan, of ratten die gevoeliger zijn voor fyto-oestrogenen, gebruikt gaan worden, moet worden overwogen de gehaltes aan fyto-oestrogenen in voer op evenredige wijze te verlagen (20). Bovendien kunnen de verschillen in de beschikbare metabole energie die verschillend voer levert, leiden tot verschuiving van het moment waarop de pubertijd begint (21)(22).

23.   Voorafgaand aan het onderzoek moet zorgvuldig een voer zonder een verhoogd gehalte aan fyto-oestrogenen (zie (6)(9) voor richtsnoeren) of een verhoogde metaboliseerbare energiewaarde worden uitgekozen, omdat anders verstoring van de resultaten zou kunnen optreden (15)(17)(19)(22)(36). Erop toezien dat het door het laboratorium gebruikte testsysteem naar behoren presteert, zoals beschreven in punten 26 en 27, vormt een belangrijke controle op beide factoren. Als voorzorgsmaatregel in overeenstemming met goede laboratoriumpraktijken (GLP) moet van elke partij voer die tijdens het onderzoek wordt toegediend, een representatief monster worden genomen voor mogelijke analyse van het gehalte aan fyto-oestrogenen (bv. in het geval van een hoog controle-baarmoedergewicht ten opzichte van historische controles of een inadequate respons op het referentie-oesterogeen, 17-alfa-ethinylestradiol). Aliquots moeten als onderdeel van het onderzoek geanalyseerd worden of ingevroren worden bij – 20 °C of op zodanige wijze bewaard worden dat afbraak van het monster vóór analyse wordt voorkomen.

24.   Bepaald strooisel kan natuurlijk voorkomende oestrogene of anti-oestrogene stoffen bevatten (het is bv. bekend dat maïsspil de cyclus van ratten beïnvloedt en een anti-oestrogene werking lijkt te hebben). Het gehalte aan fyto-oestrogenen in het gekozen strooisel moet minimaal zijn.

Voorbereiding van de dieren

25.   Proefdieren zonder aanwijzingen voor ziekte of lichamelijke afwijkingen worden willekeurig toegewezen aan de controle- en behandelgroepen. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Aan de dieren moet een unieke code worden toegekend. Bij voorkeur moeten onvolgroeide dieren tijdens de acclimatisering tot de spening worden ondergebracht met moederdieren of pleegmoederdieren. De acclimatiseringsperiode vóór aanvang van het onderzoek moet ongeveer vijf dagen duren voor jongvolwassen dieren en voor de onvolgroeide dieren die zijn geleverd met moederdieren of pleegmoederdieren. Als de onvolgroeide dieren gespeende dieren zonder moederdieren zijn, kan het noodzakelijk worden de acclimatiseringsperiode te verkorten omdat de toediening direct na de spening moet beginnen (zie punt 29).

PROCEDURE

Verificatie van de geschiktheid van laboratoria

26.   De geschiktheid van laboratoria kan op twee verschillende mogelijkheden geverifieerd worden:

—

periodieke verificatie op basis van een inleidend positieve-controleonderzoek op baseline (zie punt 27). Ten minste elke zes maanden en elke keer dat er sprake is van een verandering die van invloed kan zijn op de prestatie van de test (bv. een nieuwe formulering van het voer, andere medewerkers die de excisies verrichten, andere stam of leverancier van de dieren), moet het responsvermogen van het testsysteem (diermodel) geverifieerd worden met een gepaste dosis (gebaseerd op het in punt 27 beschreven inleidende positieve-controleonderzoek op baseline) van een referentie-oestrogeen: 17a-ethinylestradiol (CAS-nr. 57-63-6) (EE);

—	toepassing van gelijktijdige controles door opname van een groep die een gepaste dosis van het referentie-oestrogeen krijgt toegediend in elke test.

Als het systeem niet reageert zoals verwacht, moeten de testomstandigheden worden onderzocht en dienovereenkomstig worden gewijzigd. De aanbevolen dosis van het te gebruiken referentie-oestrogeen in beide aanpakken is ongeveer de ED 70 tot 80.

27.   Positieve-controleonderzoek op baseline — Voordat een laboratorium voor het eerst een onderzoek volgens deze testmethode uitvoert, moet eerst de geschiktheid van het laboratorium worden aangetoond door het responsvermogen van het diermodel te testen door de dosisrespons van het referentie-oestrogeen 17a-ethinylestradiol (CAS-nr. 57-63-6) (EE) te bepalen met minimaal vier doses. De respons op het baarmoedergewicht wordt vergeleken met vastgestelde historische gegevens (zie referentie (5)). Als dit positieve-controleonderzoek op baseline niet de verwachte resultaten oplevert, moeten de testomstandigheden worden onderzocht en gewijzigd.

Aantal en toestand van de dieren

28.   De behandel- en controlegroepen moeten elk ten minste 6 dieren bevatten voor beide protocollen (methode met onvolgroeide dieren en methode met ovx-volwassen dieren).

Leeftijd van onvolgroeide dieren

29.   Voor de uterotrofe bioassay met onvolgroeide dieren moet de geboortedatum vermeld worden. De toediening moet vroeg genoeg beginnen opdat aan het einde van de toediening van de stof de met de pubertijd samenhangende fysiologische stijging van endogene oestrogenen nog niet heeft plaatsgevonden. Anderzijds zijn er aanwijzingen dat zeer jonge dieren mogelijk minder gevoelig zijn. Voor het bepalen van de optimale leeftijd moet elk laboratorium rekening houden met de eigen achtergrondgegevens over rijping.

Als richtsnoer kan worden aangehouden dat de toediening bij ratten direct na vroegtijdig spening op postnatale dag 18 kan beginnen (waarbij de geboortedag postnatale dag 0 is). De toediening bij ratten moet bij voorkeur afgerond zijn op postnatale dag 21, maar in elk geval vóór postnatale dag 25, omdat na deze leeftijd de hypothalamus-hypofyse-gonadeas functioneel wordt en de endogene oestrogeenspiegels kunnen gaan stijgen met een daarmee gepaard gaande toename in gemiddeld baarmoedergewicht op baseline en een toename in de groep-standaarddeviaties (2)(3)(10)(11)(12).

Procedure voor ovariëctomie

30.   Voor de vrouwelijke rat en muis die ovariëctomie hebben ondergaan (behandel- en controlegroepen) moet de ovariëctomie plaatsvinden op een leeftijd tussen 6 en acht weken. Voor ratten moet tussen de ovariëctomie en de eerste toedieningsdag een tussenpoos van minimaal 14 dagen worden aangehouden, zodat de baarmoeder kan terugkeren tot een minimale stabiele uitgangssituatie. Voor muizen moet tussen de ovariëctomie en de eerste toedieningsdag een tussenpoos van ten minste zeven dagen worden aangehouden. Omdat kleine stukjes eierstokweefsel voldoende zijn om significante circulerende oestrogeenspiegels te produceren (3), moeten de dieren vóór gebruik worden getest door observatie van epitheelcellen in een vaginaal uitstrijkje op ten minste vijf opeenvolgende dagen (bv. op dag 10-14 na ovariëctomie voor ratten). Als er aanwijzingen zijn dat de dieren in de oestrus komen, mogen deze dieren niet worden gebruikt. Verder moeten bij de obductie de eierstokstompjes worden onderzocht op aanwijzingen voor aanwezig eierstokweefsel. Zo ja, dan mogen de gegevens van dit dier niet worden meegenomen in de berekeningen (3).

31.   De ovariëctomie-ingreep begint met het dier in ventrale ligging te positioneren, nadat het dier op correcte wijze onder narcose is gebracht. De incisie die de dorso-laterale buikwand opent moet ongeveer 1 cm in lengte zijn op het middelpunt tussen de inferiore ribgrens en de darmbeenkam (crista iliaca), en enkele millimeters lateraal aan de laterale marge van de lumbale spier. De eierstok moet uit de buikholte worden genomen en op een aseptisch vlak worden geplaatst. De eierstok moet worden losgemaakt bij de verbinding van de eileider met het baarmoederlichaam. Nadat is vastgesteld dat er geen grote bloedingen zijn, moet de buikwand worden gesloten met een hechting en de huid worden gesloten met nietjes of geschikt hechtdraad. De punten van afbinding staan schematisch weergegeven in figuur 1. Er moet passende postoperatieve analgesie worden gegeven volgens de aanbevelingen van een dierenarts met ervaring in de verzorging van knaagdieren.

Lichaamsgewicht

32.   Bij de ovx-volwassen-methode is er geen verband tussen het lichaamsgewicht en het baarmoedergewicht, omdat het baarmoedergewicht wordt beïnvloed door hormonen zoals oestrogenen en niet door de groeifactoren die de lichaamsgrootte reguleren. Bij het onvolgroeid-model hangt het lichaamsgewicht daarentegen wel samen met het baarmoedergewicht tot volwassenheid is bereikt (34). Aan het begin van het onderzoek mag bij het onvolgroeid-model het gewicht van de gebruikte dieren daarom slechts minimaal en niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Dit betekent dat de nestgrootte door de fokker gestandaardiseerd moet worden om ervoor te zorgen dat nakomelingen van verschillende moederdieren ongeveer hetzelfde worden gevoerd. Dieren moeten worden toegewezen aan (controle- en behandel-) groepen via gerandomiseerde gewichtsverdeling, zodat het gemiddelde lichaamsgewicht van elke groep niet statistisch afwijkt van alle andere groepen. Er moet zoveel mogelijk getracht worden toewijzing van nestgenoten aan dezelfde behandelgroep te voorkomen zonder daarvoor het aantal nesten voor het onderzoek te moeten verhogen.

Dosering

33.   Om vast te stellen of een teststof oestrogene werking kan hebben in vivo, zijn twee dosisgroepen en een controlegroep normaal voldoende, en deze opzet verdient daarom de voorkeur met het oog op dierenwelzijn. Voor het opstellen van een dosis-responscurve of de extrapolatie naar lagere doses zijn ten minste 3 dosisgroepen nodig. Als meer informatie nodig is naast vaststelling van de oestrogene activiteit (zoals een schatting van de werkzaamheid), moet een ander doseringsschema worden overwogen. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld worden als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een medium gebruik wordt gemaakt, dient de controlegroep dezelfde hoeveelheid medium te krijgen als voor de behandelgroepen is gebruikt (of het hoogste volume dat in de testgroepen is gebruikt als er verschillen in zijn).

34.   Het doel van de uterotrofe bioassay is het bepalen van doses waarbij overleving van de dieren gewaarborgd is en er geen sprake is van significante toxiciteit of leed voor de dieren na drie opeenvolgende dagen van toediening van de stof tot een maximumdosis van 1 000 mg/kg/dag. Alle dosisniveaus moeten worden voorgesteld en gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof of verwante stoffen. Bij het bepalen van het hoogste dosisniveau moet eerst rekening worden gehouden met informatie over de LD50 en/of acute toxiciteit om sterfte, ernstig lijden of ongerief bij de dieren te voorkomen (24)(25)(26). De hoogste dosis moet de maximaal verdraagbare dosis (maximum tolerated dose, MTD) zijn; een onderzoek uitgevoerd bij een dosisniveau dat een positieve uterotrofe respons induceerde, is ook aanvaardbaar. Als screening zijn grote intervallen (bv. eenheden van een halve log, overeenkomend met een verhoging van de dosis met een factor 3,2, tot zelfs eenheden van één log) tussen doseringen doorgaans aanvaardbaar. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek worden uitgevoerd om de orde van grootte van de te gebruiken doses te helpen bepalen.

35.   Een andere mogelijkheid is om, als de oestrogene werkzaamheid van een agonist in vitro (of in silico) bepaald kan worden, deze gegevens in aanmerking te nemen bij het kiezen van de dosis. Een schatting van de hoeveelheid van de teststof die uterotrofe responsen zou produceren die equivalent zijn aan die van de referentieagonist (ethinylestradiol), wordt bijvoorbeeld gemaakt uit de relatieve in-vitrowerkzaamheid ervan ten opzichte van ethinylestradiol. De hoogste testdosis krijgt men dan door deze equivalente dosis te vermenigvuldigen met de juiste factor, bv. 10 of 100.

Overwegingen voor bereikbepaling

36.   Zo nodig kan met enkele dieren een inleidend bereikbepalingsonderzoek worden uitgevoerd. Daarbij kan de OESO-leidraad nr. 19 (25) worden geraadpleegd voor definities van klinische verschijnselen die wijzen op toxiciteit of leed bij de dieren. Als het mogelijk is binnen dit bereikbepalingsonderzoek na drie dagen toediening, kunnen de baarmoeders ongeveer 24 uur na de laatste dosis worden uitgesneden en gewogen. Deze gegevens kunnen vervolgens worden gebruikt bij het opzetten van het hoofdonderzoek (keuze van aanvaardbare maximum- en lagere doses en een aanbeveling voor het aantal dosisgroepen).

Toediening van de doses

37.   De teststof wordt toegediend via een orale maagsonde of subcutane injectie. Bij het kiezen van de toedieningsweg moet rekening worden gehouden met zowel overwegingen met het oog op dierenwelzijn als toxicologische aspecten, zoals de relevantie voor de weg van blootstelling van de mens aan de stof (bv. orale maagsonde t.o.v. inname volgens het model, subcutane injectie t.o.v. inhalatie of dermale adsorptie volgens het model), de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof en met name bestaande toxicologische informatie en gegevens over metabolisme en kinetiek (bv. noodzaak om first-passmetabolisme te voorkomen, betere efficiëntie via een bepaalde weg).

38.   Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterige oplossing/suspensie te overwegen. Omdat de meeste oestrogeenliganden of de metabole voorlopers ervan vaak hydrofoob zijn, wordt echter doorgaans een oplossing/suspensie in olie gebruikt (bv. maïs-, pinda-, sesam- of olijfolie). Deze oliën verschillen echter in caloriewaarde en vetgehalte, zodat het medium van invloed kan zijn op de totale inname van metaboliseerbare energie (ME), waardoor gemeten eindpunten zoals het baarmoedergewicht mogelijk veranderen, met name bij de onvolgroeid-methode (33). Voorafgaand aan het onderzoek moet daarom elk te gebruiken medium worden getest tegen controles zonder media. De teststoffen kunnen worden opgelost in een minimale hoeveelheid 95 % ethanol of andere geschikte oplosmiddelen en verdund in het testmedium tot de eind-werkconcentraties. De toxische kenmerken van het oplosmiddel moeten bekend zijn en moeten worden getest in een aparte controlegroep met alleen oplosmiddel. Als de teststof als stabiel wordt beschouwd, kan het oplossen van de teststof worden bevorderd door voorzichtig verwarmen en krachtig mechanisch roeren. De stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald. Als de teststof stabiel is voor de duur van het onderzoek, kan van de teststof één startaliquot worden bereid, waaruit de gespecificeerde doseringsverdunningen dagelijks worden bereid.

39.   De toedieningstijdstippen hangen af van het gebruikte model (zie punt 29 voor het onvolgroeid-model en punt 30 voor het ovx-volwassen-model). Onvolgroeide vrouwelijke ratten krijgen de teststof dagelijks toegediend, op drie opeenvolgende dagen. Een driedaagse behandeling wordt eveneens aanbevolen voor vrouwelijke ratten die ovariëctomie hebben ondergaan, maar langere blootstellingen zijn aanvaardbaar en kunnen de detectie van zwak actieve stoffen verbeteren. Met vrouwelijke muizen die ovariëctomie hebben ondergaan, moet voor sterke oestrogeenagonisten een toedieningsduur van drie dagen voldoende zijn zonder dat verlenging tot zeven dagen significant voordeel oplevert. Dit verband werd echter niet aangetoond voor zwakke oestrogenen in het valideringsonderzoek (16), zodat de dosering moet worden verlengd tot 7 opeenvolgende dagen bij ovx-volwassen muizen. De dosis moet elke dag op hetzelfde tijdstip worden toegediend. Zo nodig moeten de doses worden aangepast om het dosisniveau per lichaamsgewicht van het dier constant te houden (bv. mg teststof per kg lichaamsgewicht per dag). Variatie van het testvolume op basis van lichaamsgewicht moet tot het minimum beperkt worden door de concentratie van de doseeroplossing zodanig aan te passen, dat per lichaamsgewicht een constant volume wordt gegeven bij alle dosisniveaus en voor elke toedieningsweg.

40.   Indien de teststof via een maagsonde wordt toegediend, moet dit in één enkele dosis dagelijks gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Het maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. De plaatselijke richtlijnen voor dierverzorging moeten in acht worden genomen, maar het volume mag niet groter zijn dan 5 ml/kg lichaamsgewicht, tenzij het om een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 10 ml/kg lichaamsgewicht worden gebruikt.

41.   Wordt de teststof toegediend via subcutane injectie, dan moet dit dagelijks gebeuren in een enkele dosis. Doses moeten met een steriele naald (bv. 23 of 25 gauge) en een tuberculinespuit worden toegediend in de dorso-scapulaire of lumbale regio. Eventueel kan de injectieplaats worden geschoren. Eventueel verlies, weglekken op de injectieplaats of onvolledige toediening moet worden opgetekend. Het totale volume dat per rat per dag wordt geïnjecteerd mag niet groter zijn dan 5 ml/kg lichaamsgewicht, verdeeld over 2 injectieplaatsen, tenzij het om een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 10 ml/kg lichaamsgewicht worden gebruikt.

Observaties

Algemene en klinische observaties

42.   Algemene klinische observaties moeten ten minste eenmaal per dag worden verricht en vaker wanneer verschijnselen van toxiciteit worden waargenomen. De observaties moeten bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip plaatsvinden en met inachtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. Alle dieren moeten worden geobserveerd op ziekteverschijnselen, sterfte en algemene klinische verschijnselen zoals veranderingen in gedrag, huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, recht opstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon.

Lichaamsgewicht en consumptie van voer

43.   Alle dieren moeten dagelijks worden gewogen op 0,1 g nauwkeurig, te beginnen vlak voor de behandeling start, d.w.z. wanneer de dieren over de groepen worden verdeeld. Eventueel kan de hoeveelheid voer die tijdens de behandelperiode geconsumeerd wordt, per kooi gemeten worden door de voerbak te wegen. De voerconsumptiegegevens moeten worden genoteerd in gram per rat per dag.

Excisie van de baarmoeder en gewichtsbepaling

44.   Vierentwintig uur na de laatste behandeling worden de ratten op humane wijze gedood. In het ideale geval wordt de volgorde van obductie gerandomiseerd over de groepen ter voorkoming van rechtstreeks verloop in de volgorde waarin de dosisgroepen afgegaan worden, wat de gegevens subtiel kan beïnvloeden. Doel van de bioassay is het meten van het gewicht van de natte en de drooggedepte baarmoeder. Onder het natte gewicht wordt het gewicht van de baarmoeder en het luminale vocht erin verstaan. Het drooggedepte („blotted”) gewicht wordt gemeten nadat de luminale inhoud van de baarmoeder is uitgedrukt en verwijderd.

45.   Vóór de excisie wordt bij onvolgroeide dieren onderzocht of de vagina geopend is. De excisie begint met het openen van de buikwand vanaf de symphysis pubica. Daarna worden de baarmoederhoorn en eierstokken, indien aanwezig, losgemaakt van de dorsale buikwand. De blaas en urineleiders worden weggenomen van de ventrale en laterale zijde van de baarmoeder en de vagina. De vezelige hechting tussen de endeldarm en de vagina wordt losgemaakt tot de overgang van de vaginaopening naar de huid van het perineum kan worden geïdentificeerd. De baarmoeder en vagina worden losgemaakt van het lichaam door insnijding van de vaginawand net boven de overgang tussen de huid van het perineum, zie figuur 2. De baarmoeder moet losgemaakt worden van het lichaam door voorzichtig doorsnijden van het baarmoedermesenterium bij het bevestigingspunt ervan over de volle lengte van de dorsolaterale zijde van elke baarmoederhoorn. Na uitname uit het lichaam moet de baarmoeder snel genoeg worden verwerkt om uitdroging van de weefsels te voorkomen. Gewichtsverlies als gevolg van uitdroging wordt belangrijker bij kleinere weefsels zoals de baarmoeder (23). Indien eierstokken aanwezig zijn, worden deze verwijderd bij de eileider, waarbij moet worden voorkomen dat het luminale vocht uit de baarmoederhoorn lekt. Na ovariëctomie van het dier moeten de stompjes worden onderzocht op eventueel aanwezig eierstokweefsel. Overmatig vet en bindweefsel moeten worden weggesneden. De vagina wordt net onder de baarmoederhals verwijderd uit de baarmoeder, zodat de baarmoederhals bevestigd blijft aan het baarmoederlichaam, zie figuur 2.

46.   Elke baarmoeder moet worden overgebracht in een gewogen houder met een unieke code (bv. een petrischaaltje of een kunststof weegschaaltje), waarbij er voortdurend op wordt gelet dat vóór het wegen geen uitdroging plaatsvindt (plaats bv. filterpapier dat enigszins is bevochtigd met zoutoplossing in de houder). De baarmoeder met luminaal vocht wordt gewogen op 0,1 mg nauwkeurig (nat baarmoedergewicht).

47.   Elke baarmoeder wordt daarna apart verwerkt om het luminale vocht te verwijderen. Beide baarmoederhoornen worden doorboord of in de lengterichting ingesneden. De baarmoeder wordt op een licht bevochtigd filtreerpapier geplaatst (bv. Whatman nr. 3) en voorzichtig uitgedrukt met een twee stuk licht bevochtigd filtreerpapier om het luminale vocht volledig te verwijderen. De baarmoeder zonder luminale inhoud wordt gewogen op 0,1 mg nauwkeurig (gewicht van drooggedepte baarmoeder).

48.   Het baarmoedergewicht aan het einde kan worden gebruikt om te controleren of de onvolgroeide intacte rat niet ouder was dan de passende leeftijd. De historische gegevens van de door het laboratorium gebruikte rattenstam zijn in dit opzicht echter doorslaggevend (zie punt 56 voor de interpretatie van de resultaten).

Facultatieve onderzoeken

49.   Na het wegen kan de baarmoeder gefixeerd worden in 10 % neutraal gebufferd formaline voor histopathologisch onderzoek na haematoxyline-eosine-kleuring (H&E-kleuring). De vagina kan dienovereenkomstig onderzocht worden (zie punt 9). Daarnaast kan ter kwantitatieve vergelijking morfometrische meting van het endometriumepitheel worden verricht.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Gegevens

50.   De onderzoeksgegevens moeten bestaan uit:

—	het aantal dieren bij aanvang van de test,

—	het aantal en de identiteit van de dieren die dood zijn aangetroffen tijdens de test of om humane redenen zijn gedood, samen met de datum en het tijdstip van sterfte of humane doding,

—	het aantal en de identiteit van de dieren met verschijnselen van toxiciteit en een beschrijving van de waargenomen verschijnselen van toxiciteit, waaronder het tijdstip van ontstaan en de ernst van eventuele toxische effecten, en

—	het aantal en de identiteit van de dieren met letsel en een beschrijving van het type letsel.

51.   Per dier moeten gegevens geregistreerd worden over het lichaamsgewicht en het gewicht van de natte en de drooggedepte baarmoeder. Er moet gebruikgemaakt worden van eenzijdige statistische analyses voor agonisten om te bepalen of de toediening van een teststof resulteerde in een statistisch significante (p < 0,05) toename van het baarmoedergewicht. Om te testen op behandelingsgerelateerde veranderingen in gewicht van de natte en de drooggedepte baarmoeder moeten passende statistische analyses worden gedaan. De gegevens kunnen bijvoorbeeld worden beoordeeld door middel van een analyse van covariantie (Ancova) met lichaamsgewicht bij de obductie als de covariabele. Voorafgaand aan de gegevensanalyse kan een variantie-stabiliserende logaritmische transformatie worden uitgevoerd met de baarmoedergegevens. De Dunnett- en Hsu-test zijn geschikt om van elke dosisgroep paarsgewijze vergelijkingen te maken met mediumcontroles en de betrouwbaarheidsintervallen te berekenen. Gestudentiseerde residuplots kunnen worden gebruikt om mogelijke uitschieters te detecteren en homogeniteit van variantie te beoordelen. Deze procedures werden toegepast bij het OESO-valideringsprogramma, waarbij gebruik werd gemaakt van het PROC GLM in het statistische analysesysteem (SAS Institute, Cary, NC), versie 8 (6)(7).

52.   Een eindverslag moet bestaan uit:

Testinstelling:

—	de verantwoordelijke medewerkers en hun verantwoordelijkheden met betrekking tot het onderzoek,

—	gegevens van de positieve-controletest op baseline en gegevens van periodieke positieve controles (zie punten 26 en 27).

Teststof:

—	karakterisering van teststoffen,

—	fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschappen,

—	methode en frequentie van de bereiding van verdunningen,

—	alle gegenereerde gegevens over stabiliteit,

—	alle analyses van doseeroplossingen.

Medium:

—	karakterisering van testmedium (aard, leverancier en partij),

—	motivering van de keuze van het medium (wanneer dat geen water is).

Proefdieren:

—	soort en stam en motivering van de keuze ervan,

—	leverancier en specifieke instelling van de leverancier,

—	leeftijd bij levering met geboortedatum,

—	bij onvolgroeide dieren: of het dier geleverd is met moederdier of pleegmoederdier en datum van spening,

—	gedetailleerde gegevens over wijze van acclimatisering van het dier,

—	aantal dieren per kooi,

—	gegevens en methode van identificatie van individuele dieren en groepen.

Testomstandigheden:

—	gedetailleerde gegevens over randomiseringsproces (d.w.z. de gebruikte methode),

—	motivering van de keuze van de dosis,

—	gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereikte concentraties ervan, stabiliteit en homogeniteit,

—	gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof en motivering van de keuze van de blootstellingsweg,

—	voer (naam, type, leverancier, samenstelling en, indien bekend, gehaltes aan fyto-oestrogenen),

—	herkomst water (bv. kraanwater of gefiltreerd water) en toevoer (via een slang uit een grote tank, in flessen enz.),

—	strooisel (naam, type, leverancier, samenstelling),

—	registratie van kooiomstandigheden, lichtcyclus, kamertemperatuur en vochtigheid; reiniging van de ruimte,

—	gedetailleerde beschrijving van obductie en procedures voor gewichtsbepaling van de baarmoeder,

—	beschrijving van statistische procedures.

Resultaten

Voor elk dier:

—	alle dagelijks gemeten individuele lichaamsgewichten (vanaf toewijzing aan groepen tot aan obductie) (op 0,1 g nauwkeurig),

—	leeftijd van elk dier (in dagen, met geboortedag als dag 0) vanaf toediening van teststof,

—	datum en tijdstip van elke toediening van een dosis,

—	berekend volume en toegediende dosering en observaties van eventuele dosisverliezen tijdens of na toediening,

—	dagelijkse registratie van de status van het dier, waaronder relevante symptomen en observaties,

—	vermoedelijke doodsoorzaak (indien tijdens het onderzoek stervend of dood aangetroffen),

—	datum en tijdstip van om humane redenen doden met tijdsduur tot laatste toediening,

—	gewicht van natte baarmoeder (op 0,1 mg nauwkeurig) en eventuele observaties van verlies van luminaal vocht tijdens excisie en voorbereiding voor de gewichtsbepaling,

—	gewicht drooggedepte baarmoeder (op 0,1 mg nauwkeurig).

Voor elke groep dieren:

—	gemiddelde dagelijks gemeten lichaamsgewichten (op 0,1 g nauwkeurig) en standaarddeviaties (vanaf toewijzing aan groepen tot aan obductie),

—	gemiddelde gewichten van natte en van drooggedepte baarmoeder (op 0,1 mg nauwkeurig) en standaarddeviaties,

—	dagelijkse voerconsumptie (berekend als per dier geconsumeerd gram voer), indien gemeten,

—	de resultaten van statistische analyses waarbij het gewicht van natte en van drooggedepte baarmoeders van behandelde groepen wordt vergeleken met die van de mediumcontrolegroepen, die verder op dezelfde wijze zijn behandeld,

—	de resultaten van statistische analyse waarbij het totale lichaamsgewicht en de toename in lichaamsgewicht van behandelde groepen wordt vergeleken met die van de mediumcontrolegroepen, die verder op dezelfde wijze zijn behandeld.

53.   Samenvatting van belangrijke richtsnoeren van de testmethode

	Rat	Muis
Dieren
Stam	Vaak gebruikte proefknaagdierstam
Aantal dieren	Minimaal 6 dieren per dosisgroep
Aantal groepen	Minimaal 2 testgroepen (zie punt 33 voor richtsnoeren) en een negatieve-controlegroep Zie punten 26 en 27 voor richtsnoeren over positieve-controlegroepen
Huisvestings- en voedingsomstandigheden
Temp. in verblijfsruimte	22 °C ± 3 °C
Relatieve vochtigheid	50-60 % en niet lager dan 30 % of hoger dan 70 %
Dagelijkse lichtcyclus	12 uur licht, 12 uur donker
Voer en drinkwater	Ad libitum
Huisvesting	individueel of in groepen van maximaal drie dieren (voor onvolgroeide dieren wordt sociale groepshuisvesting aanbevolen)
Voer en strooisel	In voer en strooisel wordt een laag gehalte aan fyto-oestrogenen aanbevolen
Protocol
Methode	Onvolgroeid-methode (d.w.z. geen ovariëctomie, verdient de voorkeur) Ovx-volwassen-methode (met vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan)	Ovx-volwassen-methode (met vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan)
Toedieningsleeftijd voor onvolgroeide dieren	Op z'n vroegst op PND 18 Toediening moet worden afgerond vóór PND 25	Niet relevant in het kader van de huidige testmethode
Leeftijd van ovariëctomie	Tussen 6 en acht weken oud
Toedieningsleeftijd voor dieren die ovariëctomie hebben ondergaan	Tussen de ovariëctomie en de eerste toedieningsdag moet een tussenpoos van minimaal 14 dagen worden aangehouden.	Tussen de ovariëctomie en de eerste toedieningsdag moet een tussenpoos van minimaal zeven dagen worden aangehouden.
Lichaamsgewicht	Het lichaamsgewicht mag slechts minimaal en niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.
Toediening
Toedieningsweg	Orale maagsonde of subcutane injectie
Toedieningsfrequentie	Dagelijks een enkele dosis
Volume voor sonde en injectie	≤ 5 ml/kg lichaamsgewicht (of maximaal 10 ml/kg lichaamsgewicht in geval van waterige oplossingen) (in 2 injectieplaatsen voor de subcutane weg)
Toedieningsduur	3 opeenvolgende dagen voor onvolgroeid-model Minimaal 3 opeenvolgende dagen voor het ovx-model	7 opeenvolgende dagen voor het ovx-model
Tijdstip van obductie	Ongeveer 24 uur na de laatste dosis
Resultaten
Positieve respons	Statistisch significante toename van het gemiddelde baarmoedergewicht (nat en/of drooggedept)
Referentieoestrogeen	17α-ethinylestradiol

RICHTSNOEREN VOOR DE INTERPRETATIE EN ACCEPTATIE VAN DE RESULTATEN

54.   In het algemeen moet een test op oestrogene werking worden beschouwd als positief als er ten minste bij het hoge dosisniveau een statistisch significante (p < 0,05) toename van het baarmoedergewicht is ten opzichte van de oplosmiddelcontrolegroep. Een positief resultaat wordt verder ondersteund door bewijs van een vanuit biologisch oogpunt aannemelijk verband tussen de dosis en de grootte van de respons, daarbij rekening houdend met het feit dat overlappende oestrogene en anti-oestrogene activiteiten van de teststof van invloed kunnen zijn op de vorm van de dosis-responscurve.

55.   Om de gegevens op betekenisvolle wijze te kunnen interpreteren moet erop worden toegezien de maximaal aanvaardbare dosis niet te overschrijden. Afname van lichaamsgewicht, klinische verschijnselen en andere bevindingen moeten met het oog daarop grondig worden beoordeeld.

56.   Een belangrijke overweging voor de acceptatie van de gegevens van de uterotrofe bioassay zijn de baarmoedergewichten van de mediumcontrolegroep. Hoge controlewaarden kunnen het responsvermogen van de bioassay en het vermogen om zeer zwakke oestrogeenagonisten te detecteren negatief beïnvloeden. Overzichtsartikelen en de gegevens die zijn verkregen tijdens de validering van de uterotrofe bioassay, wijzen erop dat gevallen van hoge controlegemiddelden niet spontaan optreden, in het bijzonder bij onvolgroeide dieren (2)(3)(6)(9). Omdat het baarmoedergewicht van onvolgroeide ratten afhankelijk is van veel variabelen, zoals stam of lichaamsgewicht, kan er geen beslissende bovengrens voor het baarmoedergewicht worden gegeven. Als richtsnoer moeten resultaten als verdacht worden beschouwd als gewichten van drooggedepte baarmoeders bij onvolgroeide controleratten tussen 40 en 45 mg liggen, en baarmoedergewichten van meer dan 45 mg kunnen een reden zijn de test opnieuw te doen. Dit moet echter per geval worden bekeken (3)(6)(8). Als volwassen ratten worden getest waarbij onvolledige ovariëctomie heeft plaatsgevonden, blijft er eierstokweefsel achter dat endogeen oestrogeen kan produceren en de regressie van het baarmoedergewicht kan vertragen.

57.   Gewichten van drooggedepte baarmoeders in een mediumcontrolegroep die minder dan 0,09 % van het lichaamsgewicht uitmaken voor onvolgroeide vrouwelijke ratten en minder dan 0,04 % voor jongvolwassen vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan, lijken aanvaardbare resultaten te geven (zie tabel 31 (2)). Als de procentuele baarmoedergewichten in de controlegroep hoger zijn dan de bovengenoemde percentages, moeten verscheidene factoren nader onderzocht worden, waaronder de leeftijd van de dieren, correcte uitvoering van de ovariëctomie, fyto-oestrogenen in voer enz., en moet een negatief testresultaat (geen aanwijzingen voor oestrogene activiteit) met voorzichtigheid worden gebruikt.

58.   Historische gegevens voor mediumcontrolegroepen moeten in het laboratorium worden behouden. Historische gegevens voor responsen op positieve referentieoestrogenen, zoals 17a-ethinylestradiol, moeten eveneens in het laboratorium worden behouden. Laboratoria kunnen ook de respons op bekende zwakke oestrogeenagonisten testen. Al deze gegevens kunnen worden vergeleken met beschikbare gegevens (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) om te controleren of de door het laboratorium toegepaste methoden voldoende gevoelig zijn.

59.   De gewichten van drooggedepte baarmoeders vertoonden minder variabiliteit in de loop van het OESO-valideringsonderzoek dan de gewichten van de natte baarmoeders (6)(7). Een significante respons in een van beide testen wijst er echter op dat de teststof positief is voor oestrogene activiteit.

60.   Hoewel de uterotrofe respons niet geheel van oestrogene oorsprong is, moet een positief resultaat van de uterotrofe bioassay doorgaans geïnterpreteerd worden als een aanwijzing voor mogelijke oestrogene activiteit in vivo en moet op basis hiervan actie worden ondernomen om meer duidelijkheid te verschaffen (zie punt 9 en het „Conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen”, aanhangsel 2).

Figuur 1

Schematisch diagram van de operatieve verwijdering van de eierstokken

De ingreep begint met het openen van de dorso-laterale buikwand op het middelpunt tussen de inferiore ribgrens en de darmbeenkam (crista iliaca), en enkele millimeters lateraal aan de laterale marge van de lumbale spier. De eierstokken bevinden zich in de buikholte. Op een aseptisch vlak worden de eierstokken vervolgens fysiek verwijderd uit de buikholte: er wordt een ligatuur geplaatst tussen de eierstok en de baarmoeder om bloedingen onder controle te houden en de eierstok wordt losgemaakt door middel van een incisie boven de ligatuur bij de verbinding van de eileider met elke baarmoederhoorn. Nadat is vastgesteld dat er geen grote bloedingen meer zijn, moet de buikwand worden gesloten met een hechting en de huid worden gesloten met bv. nietjes of hechtdraad. Men moet de dieren laten herstellen en het baarmoedergewicht gedurende minimaal 14 dagen vóór gebruik de tijd geven voor regressie.

Figuur 2

De verwijdering en voorbereiding van de baarmoederweefsels voor de gewichtsbepaling

De ingreep begint met het openen van de buikwand bij de symphysis pubica. Daarna worden elke eierstok, indien aanwezig, en de baarmoederhoorn losgemaakt van de dorsale buikwand. De blaas en urineleiders worden weggenomen van de ventrale en laterale zijde van de baarmoeder en de vagina. De vezelige hechting tussen de endeldarm en de vagina wordt losgemaakt tot de overgang van de vaginaopening naar de huid van het perineum kan worden geïdentificeerd. De baarmoeder en vagina worden losgemaakt van het lichaam door insnijding van de vaginawand net boven de overgang tussen de huid van het perineum, zie figuur. De baarmoeder moet losgemaakt worden van het lichaam door voorzichtig doorsnijden van het baarmoedermesenterium bij het bevestigingspunt ervan over de volle lengte van de dorsolaterale zijde van elke baarmoederhoorn. Na uitname uit het lichaam wordt het overmatige vet en bindweefsel weggesneden. Indien eierstokken aanwezig zijn, worden deze verwijderd bij de eileider, waarbij moet worden voorkomen dat het luminale vocht uit de baarmoederhoorn lekt. Na ovariëctomie van het dier moeten de stompjes worden onderzocht op eventueel aanwezig eierstokweefsel. De vagina wordt net onder de baarmoederhals verwijderd uit de baarmoeder, zodat de baarmoederhals bevestigd blijft aan het baarmoederlichaam, zie figuur. De baarmoeder kan dan worden gewogen.

OPMERKINGEN BIJ HET KADER

Opmerking 1:

het is mogelijk om op alle niveaus in- en uit te stappen. Dit hangt af van de soort informatie waaraan behoefte bestaat voor gevaar- en risicobeoordelingsdoeleinden.

Opmerking 2:

in niveau 5 moet de ecotoxicologie eindpunten omvatten die duiden op mechanismen van schadelijke effecten en potentiële schade voor de populatie.

Opmerking 3:

als een multimodaal model enkele van de testen met een enkel eindpunt omvat, vervangt dat model het gebruik van deze testen met een enkel eindpunt.

Opmerking 4:

de beoordeling van elke stof moet per geval plaatsvinden, rekening houdend met alle beschikbare informatie en de functie van de niveaus van het kader.

Opmerking 5:

het kader moet op dit moment niet worden beschouwd als alomvattend. Op niveaus 3, 4 en 5 voorziet het kader in testen die al beschikbaar zijn of waarvan de validering nog loopt. De laatstgenoemde testen zijn daarom als voorlopig opgenomen. Na de ontwikkeling en validering ervan worden deze testen formeel toegevoegd aan het kader.

Opmerking 6:

niveau 5 moet niet worden beschouwd als een niveau dat alleen beslissende testen omvat. De in dat niveau opgenomen testen worden beschouwd als bij te dragen aan de algemene gevaar- en risicobeoordeling.

LITERATUUR

1.

OESO (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

2.

OESO (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.

3.

Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520.

4.

OESO (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006)33.

5.

Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. (2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ Health Perspect. 109:785-94.

6.

OESO (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.

7.

Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549

8.

Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558.

9.

Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567.

10.

Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Proliferative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I125]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587.

11.

Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b-estradiol. Endocrinology 117:2229-2237.

12.

Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleischmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active UV screens. SÖFW-J. 127:10-15.

13.

Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a commercial animal ration. Science 118:650-651.

14.

Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxicol. 13:425-427.

15.

Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Perspec. 106:369-373.

16.

OESO (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 67.

17.

Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157.

18.

Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525.

19.

Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613-620.

20.

Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477-485.

21.

Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. (2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343-347.

22.

Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381-393.

23.

Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596-601.

24.

OESO (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.

25.

OESO (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

26.

OESO (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.

27.

Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320-333.

28.

Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 19: 33-41.

29.

Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288-305.

30.

Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284-291.

31.

OESO (1982). Organization for Economic Co-operation and Development — Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Parijs.

32.

Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, Academic Press.

33.

Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401-416.

34.

Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances on behavioral and morphological reproductive development: endocrine versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159-184.

35.

Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807-1808.

36.

Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414.

37.

OESO (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Procedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.

38.

Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).

B.55.   HERSHBERGER-BIOASSAY BIJ RATTEN: EEN KORTLOPENDE SCREENINGSTEST OP (ANTI)ANDROGENE EIGENSCHAPPEN

INLEIDING

1.   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 441 (2009) van de OESO. In 1998 is de OESO een actie gestart om bestaande richtlijnen te herzien en nieuwe richtlijnen te ontwikkelen voor het screenen op en testen van potentiële hormoonontregelaars (1), en heeft zij daaraan een hoge prioriteit toegekend. Een onderdeel van deze actie was het ontwikkelen van een testrichtlijn voor de Hershberger-bioassay bij ratten. Na enkele decennia gebruik in de farmaceutische industrie werd deze assay voor het eerst in 1962 gestandaardiseerd door een officiële commissie van deskundigen als screening op androgene stoffen (2). Van 2001-2007 heeft de Hershberger-bioassay bij de rat een uitgebreid valideringsprogramma ondergaan waaronder de samenstelling van een Background Review Document (23), samenstelling van een gedetailleerd document over methoden (3), ontwikkeling van een gids voor sectie (21) en de uitvoering van uitgebreide studies binnen en tussen laboratoria om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de bioassay aan te tonen. Deze valideringsstudies werden verricht met een krachtig referentieandrogeen (testosteronpropionaat (TP)), twee krachtige synthetische androgenen (trenbolonacetaat en methyltestosteron), een krachtig antiandrogeen farmaceuticum (flutamide), een krachtige remmer van de synthese (finasteride) van het natuurlijke androgeen (dihydrotestosteron-DHT), verschillende zwak antiandrogene pesticiden (linuron, vinclozoline, procymidon, p,p' DDE), een krachtige 5α-reductaseremmer (finasteride) en twee bekende negatieve stoffen (dinitrofenol en nonylfenol) (4) (5) (6) (7) (8). Deze testmethode is het resultaat van de langdurige ervaring met de bioassay en de ervaring die is opgedaan tijdens het valideringstestprogramma en de daarbij verkregen resultaten.

2.   De Hershberger-bioassay is een kortlopende in-vivoscreeningstest op weefsel van de mannelijke secundaire geslachtsorganen. De bepaling is oorspronkelijk ontwikkeld in de jaren 1930; na aanpassing in de jaren 1940 konden ook op androgenen reagerende spieren uit de mannelijke geslachtsorganen worden gebruikt. (2) (9-15). In de jaren 1960 werden meer dan 700 mogelijke androgenen beoordeeld aan de hand van de gestandaardiseerde versie van het protocol (2) (14), en gebruik van de bepaling voor zowel androgenen als antiandrogenen werd in de jaren 1960 als standaard beschouwd (2) (15). De huidige bioassay is gebaseerd op de veranderingen in gewicht van vijf androgeenafhankelijke weefsels bij de gecastreerde peripuberale mannetjesrat. Aan de hand van de bepaling wordt het vermogen van de stof beoordeeld om biologische activiteiten teweeg te brengen die overeenkomen met androgeenagonisten, -antagonisten of 5α-reductaseremmers. De vijf androgeen-afhankelijke doelweefsels bij deze testmethode zijn ventrale prostaat (VP), zaadblaasje (seminal vesicle — SV) (plus vloeistoffen en coagulans uitscheidende klieren), m.levator ani-bulbocavernosus (LABC), paarsgewijze Cowperse klieren (COW) en de glans penis (GP). Bij de gecastreerde peripuberale mannetjesrat reageren al deze vijf weefsels op androgenen met een toename in absoluut gewicht. Als deze zelfde weefsels gestimuleerd worden om zwaarder te worden door toediening van een krachtig referentieandrogeen, reageren deze vijf weefsels alle op antiandrogenen met een afname in absoluut gewicht. Het primaire model voor de Hershberger-bioassay is het chirurgisch gecastreerde peripuberale mannetjesdier, dat in fasen 1, 2 en 3 van het Hershberger-valideringsprogramma gevalideerd is.

3.   De Hershberger-bioassay dient als een mechanistische in-vivoscreeningstest voor androgeenagonisten, androgeenantagonisten en 5α-reductaseremmers en de toepassing ervan moet worden gezien in de context van het „Conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen”, aanhangsel 2). In dit conceptuele kader bevindt de Hershberger-bioassay zich op niveau 3 als een in-vivobepalingdie gegevens oplevert over één endocrien mechanisme, te weten (anti)androgeniteit. De bedoeling is dat de assay wordt opgenomen in een reeks in-vitro- en in-vivotesten voor de identificatie van stoffen die mogelijk interactie vertonen met het hormoonsysteem, op basis waarvan uiteindelijk beoordelingen van het gevaar en het risico voor de gezondheid van de mens of het milieu tot stand komen.

4.   Vanwege zorgen om dierwelzijn bij de castratieprocedure werd gestreefd naar een alternatief model voor de Hershberger-bioassay met het intact (ongecastreerd) gestimuleerd, pas gespeend mannetjesdier om de castratiestap te kunnen vermijden. De testmethode met het gestimuleerd pas gespeend mannetjesdier werd gevalideerd (24); maar in de valideringsstudies leek de versie met het gespeende dier van de Hershberger-bioassay niet in staat te zijn om effecten van zwakke antiandrogenen op het gewicht van androgeenafhankelijke organen bij de onderzochte doses consistent te detecteren. Daarom is deze niet in deze testmethode opgenomen. Omdat de toepassing ervan echter niet alleen het dierwelzijn ten goede kan komen maar ook informatie kan opleveren over andere werkingsmechanismen, is deze beschikbaar in OESO-leidraad nr. 115 (25).

INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

5.   Androgeenagonisten en -antagonisten fungeren als liganden voor de androgeenreceptor en kunnen de door de receptor gestuurde gentranscriptie activeren resp. remmen. Daarnaast remmen sommige stoffen in bepaalde androgene doelweefsels de omzetting van testosteron in het krachtigere natuurlijke androgeen dihydrotestosteron (5α-reductaseremmers). Deze stoffen kunnen gevaar voor de gezondheid opleveren, waaronder effecten op de voortplanting en de ontwikkeling. Er bestaat daarom behoefte aan een snelle methode om een stof te beoordelen en te evalueren als een mogelijke androgeenagonist of -antagonist of 5α-reductaseremmer. Hoewel de affiniteit van een ligand voor een androgeenreceptor, gemeten door receptorbinding of transcriptionele activatie van reportergenen in vitro wel informatief is, is het niet de enige determinant van mogelijk gevaar. Andere determinanten zijn metabole activatie en deactivatie als het in het lichaam komt, chemische verdeling naar doelweefsels, en klaring uit het lichaam. Daarom moet de mogelijke activiteit van een stof in vivo onder relevante omstandigheden en blootstelling worden gescreend. Beoordeling in vivo is minder essentieel als de kenmerken van de stof voor wat betreft absorptie, distributie, metabolisme en eliminatie (ADME) bekend zijn. Androgeenafhankelijke weefsels reageren op stimulering door androgenen met een snelle en krachtige groei, vooral bij gecastreerde peripuberale mannetjesratten. Knaagdiersoorten, in het bijzonder de rat, worden bovendien veel gebruikt in toxiciteitsonderzoeken naar karakterisering van gevaren. Daarom zijn de bepaling met de gecastreerde peripuberale rat en de vijf doelweefsels van deze bepaling geschikt voor de screening in vivoop androgeenagonisten en -antagonisten en 5α-reductaseremmers.

6.   Deze testmethode is gebaseerd op de protocols die in de OESO-valideringsstudie zijn gebruikt waarvan is aangetoond dat zij in studies binnen en tussen laboratoria betrouwbaar en reproduceerbaaar zijn (4)(5)(6)(7)(8). In deze testmethode worden procedures voor zowel androgenen als antiandrogenen gepresenteerd.

7.   Hoewel er tussen de verschillende laboratoria enige variatie was in de gebruikte dosis TP om antiandrogenen in het Hershberger Bioassay-valideringsprogramma van de OESO te detecteren (0,2 versus 0,4 mg/kg/d, subcutane injectie), was er weinig verschil tussen deze twee protocolvarianten in het vermogen om zwakke of sterke antiandrogene activiteit te detecteren. Het is evenwel duidelijk dat de dosis TP niet zo hoog mag zijn dat de effecten van zwakke androgeenreceptor (AR)-antagonisten worden geblokkeerd of zo laag dat de androgene weefsels een geringe groeirespons vertonen, zelfs zonder gelijktijdige toediening van antiandrogenen.

8.   De groeirespons van de individuele androgeenafhankelijke weefsels is niet geheel van androgene oorsprong; stoffen anders dan androgeenagonisten kunnen ook het gewicht van bepaalde weefsels veranderen. Maar de groeirespons van verschillende weefsels tegelijkertijd vormt bewijs voor een meer androgeenspecifiek mechanisme. Zo kunnen hoge doses van krachtige oestrogenen het gewicht van de zaadblaasjes verhogen, zonder dat de andere androgeenafhankelijke weefsels in de bepaling op soortgelijke wijze reageren. Antiandrogene stoffen kunnen als androgeenreceptorantagonist of 5α-reductaseremmer fungeren. 5α-reductaseremmers hebben een variabel effect omdat de omzetting in het krachtigere dihydrotestosteron per weefsel verschilt. Antiandrogenen die 5α reductase remmen, zoals finasteride, hebben een meer uitgesproken effect in de ventrale prostaat dan andere weefsels in vergelijking met een krachtige AR-antagonist, zoals flutamide. Dit verschil in weefselrespons kan worden gebruikt om te differentiëren tussen door AR en 5α — reductase gemedieerde werkingsmechanismen. Daarnaast is de androgeenreceptor evolutionair gerelateerd aan de receptor van andere steroïdhormonen; sommige andere hormonen kunnen zich bij toediening in hoge, suprafysiologische doseringen binden aan TP en de groeibevorderende effecten ervan antagoneren (13). Bovendien is het plausibel dat een verhoogd steroïdmetabolisme en een daaropvolgende verlaging van het serumtestosteron de groei van androgeenafhankelijke weefsels kan verminderen. Daarom moet een positief resultaat van de Hershberger-bioassay normaliter worden beoordeeld op basis van gewicht van bewijs, zoals uit bepalingen in vitro, zoals de AR- en estrogeenreceptor (ER)-bindingsassays en corresponderende transcriptionele activatieassays, of uit andere bepalingen in vivo die soortgelijke androgene doelweefsels onderzoeken, zoals de male pubertal assay, 15-day intact adult male assay, of 28-day of 90-day repeat dose studies.

9.   De ervaring leert dat xenobiotische androgenen zeldzamer zijn dan xenobiotische antiandrogenen. De verwachting is dan dat de Hershberger-bioassay het meest wordt gebruikt voor de screening op antiandrogenen. Niettemin kan de procedure om op androgenen te testen eventueel worden aanbevolen voor steroïde of steroïd-achtige stoffen of voor stoffen waarvoor een indicatie van een mogelijk androgeen effect verkregen is uit methoden in niveau 1 of 2 van het conceptuele kader (aanhangsel 2). Zo ook kunnen bij bepalingen in niveau 5 bijwerkingen in samenhang met (anti)androgene profielen worden waargenomen, waardoor het nodig is om te beoordelen of een stof via een endrocrien werkingsmechanisme werkt.

10.   Erkend wordt dat alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, aan de plaatselijke normen voor de verzorging van dieren moeten voldoen; de hieronder beschreven zorg en behandeling zijn minimale normen en zijn ondergeschikt aan lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (26). De OESO heeft nadere richtsnoeren voor de humane behandeling van dieren opgesteld (17).

11.   Zoals geldt voor elke bioassay bij proefdieren, moet de noodzaak van de uitvoering van dit onderzoek zorgvuldig worden overwogen. In basis kunnen er twee redenen voor een dergelijk besluit zijn:

—	hoge potentiële blootstelling (niveau 1 van het conceptueel kader) of aanwijzingen voor (anti)androgeniteit in bepalingen in vitro (niveau 2) die onderzoek rechtvaardigen of dergelijke effecten ook in vivo kunnen optreden,

—	effecten die passen bij (anti)androgeniteit bij niveau 4- of 5-tests in vivo die onderzoek naar het specifieke werkingsmechanisme rechtvaardigen, bijvoorbeeld om vast te stellen of de effecten het gevolg waren van een (anti)androgeen mechanisme.

12.   De in deze testmethode gebruikte definities staan in aanhangsel 1.

PRINCIPE VAN DE TEST

13.   De Hershberger-bioassay verkrijgt haar gevoeligheid door mannetjesdieren te gebruiken met minimale androgeenproductie. Dit wordt bereikt door gebruik van gecastreerde mannetjesdieren mits voldoende tijd na castratie wordt gelaten zodat de doelweefsels kunnen afnemen naar een minimaal en uniform baselinegewicht. Als dan bij screening op mogelijke androgene activiteit er lage endogene concentraties circulerende androgenen zijn, wordt de hypothalamus-hypofyse-gonadeas weerhouden om te compenseren via een terugkoppelingsmechanisme, is het vermogen van de weefsels om te reageren maximaal, en is de variabiliteit in weefselgewicht bij aanvang minimaal. Bij screening op mogelijke antiandrogene activiteit kan een consistente toename in weefselgewicht worden bereikt als de weefsels worden gestimuleerd door een referentieandrogeen. Daarom vereist de Hershberger-bioassay slechts 6 dieren per dosisgroep terwijl andere bepalingen met intacte puberale of volwassen mannetjesdieren vaak 15 mannetjesdieren per dosisgroep gebruiken.

14.   Castratie van peripuberale mannetjesratten moet op passende wijze plaatsvinden met goedgekeurde anesthetica en aseptische techniek. Gedurende de eerste paar dagen na chirurgie moeten pijnstillers worden toegediend om postchirurgische pijn te elimineren. Castratie verhoogt de precisie waarmee de bepaling zwakke androgenen en antiandrogenen detecteert door compensatoire endocriene terugkoppelingsmechanismen te elimineren die in het intacte dier aanwezig zijn en die de effecten van toegediende androgenen en antiandrogenen kunnen afzwakken, en door de grote interindividuele variabiliteit in het serumtestosteron te elimineren. Daardoor wordt het aantal benodigde dieren voor screening op deze endocriene activiteiten door castratie verminderd.

15.   Bij screening op mogelijke androgene activiteit wordt de teststof dagelijks via een maagsonde of subcutane (sc) injectie toegediend gedurende een periode van tien opeenvolgende dagen. Teststoffen worden toegediend aan minimaal twee behandelingsgroepen met proefdieren met één doseringsniveau per groep. Ongeveer 24 uur na de laatste dosis wordt obductie verricht op de dieren. Een statistisch significante verhoging in twee of meer doelorgaangewichten in de teststofgroep in vergelijking met de mediumcontrolegroep wijst erop dat de teststof positief is voor mogelijk androgene activiteit (zie paragraaf 60). Androgenen zoals trenbolon waarbij 5α-reductie niet kan plaatsvinden, hebben een meer uitgesproken effect op de LABC en GP dan TP, maar alle weefsels moeten meer groei vertonen.

16.   Bij de screening op mogelijke antiandrogene activiteit wordt de teststof dagelijks toegediend via maagsonde of subcutane injectie gedurende een periode van tien opeenvolgende dagen samen met dagelijkse doses TP (0,2 of 0,4 mg/kg/d) per sc injectie. In het valideringsprogramma is vastgesteld dat hetzij 0,2 hetzij 0,4 mg/kg/d TP gebruikt kan worden, omdat beide effectief waren voor het detecteren van antiandrogenen; daarom moet voor de bepaling slechts één dosis worden geselecteerd. Trapsgewijs stijgende doses van de teststof worden toegediend aan minimaal drie behandelingsgroepen met proefdieren met één dosisniveau per groep. Ongeveer 24 uur na de laatste dosis wordt obductie verricht op de dieren. Een statistisch significante afname in twee of meer doelorgaangewichten in de groepen met de teststof en TP in vergelijking met de controlegroep met TP alleen wijst erop dat de teststof positief is voor mogelijke antiandrogene activiteit (zie paragraaf 61).

BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Selectie van diersoort en stam

17.   Sinds de jaren 1930 wordt de rat standaard gebruikt in de Hershberger-bioassay. Hoewel het biologisch plausibel is dat zowel de rat als de muis soortgelijke responsen zouden vertonen, is op basis van 70 jaar ervaring met het rattenmodel de rat de geprefereerde diersoort voor de Hershberger-bioassay. Daarnaast, omdat gegevens uit de Hershberger-bioassay aan de basis kunnen staan van een langdurig multigenerationeel onderzoek, is het op deze manier mogelijk om dieren uit dezelfde diersoort, stam en bron te gebruiken in beide studies.

18.   In dit protocol kunnen laboratoria de in de bepaling te gebruiken rattenstam selecteren, welke over het algemeen de stam moet zijn die meestal door het deelnemende laboratorium wordt gebruikt. Veel in het laboratorium gebruikte rattenstammen kunnen worden gebruikt; maar stammen die aanmerkelijk later dan na 42 dagen volwassen worden mogen niet worden gebruikt omdat bij castratie van deze mannetjesdieren op een leeftijd van 42 dagen mogelijk niet het gewicht van de glans penis gemeten kan worden, wat alleen kan worden gedaan nadat de voorhuid van de penisschacht teruggetrokken is. Daarom mogen stammen die zijn verkregen uit de Fisher 344-rat, niet worden gebruikt, behalve in uitzonderlijke gevallen. De Fisher 344-rat heeft een ander tijdsverloop van de seksuele ontwikkeling dan andere vaker gebruikte stammen zoals Sprague Dawley- of Wistar-stammen (16). Als een dergelijke stam gebruikt gaat worden, moet het laboratorium deze op iets hogere leeftijd castreren en de gevoeligheid van de te gebruiken stam kunnen aantonen. Het laboratorium moet een heldere motivering voor de keuze van de rattenstam kunnen geven. Waar de screeningstest vooraf kan gaan aan een onderzoek met herhaalde orale doses, een voortplantings- en ontwikkelingsonderzoek, of een langdurig onderzoek, moeten in alle onderzoeken bij voorkeur dieren uit dezelfde stam en bron worden gebruikt.

Huisvestings- en voedingsomstandigheden

19.   Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met alle plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. Deze beschrijvingen van de verzorging en behandeling zijn minimumnormen, die ondergeschikt zijn aan striktere lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (26). De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 °C te zijn (met een spreiding van ± 3 °C). De relatieve luchtvochtigheid moet minimaal 30 % zijn en bij voorkeur niet hoger zijn dan 70 %, behalve bij reiniging van de ruimte. Er moet worden gestreefd naar een relatieve vochtigheid van 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht, met een dagelijkse lichtcyclus van 12 uur licht en 12 uur donker.

20.   De dieren samen onderbrengen is te verkiezen boven isolatie gezien de jonge leeftijd van de dieren en het feit dat de ratten sociale dieren zijn. Met twee of drie dieren per kooi wordt overbevolking en daarmee samenhangende stress voorkomen die de hormonale controle van de ontwikkeling van de weefsels van de secundaire geslachtsorganen kan verstoren. De kooien worden grondig gereinigd om eventuele verontreinigingen te verwijderen en zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Met kooien van adequate omvang (~2 000 vierkante centimeter) wordt overbevolking voorkomen.

21.   Elk dier moet door middel van een humane methode individueel geïdentificeerd worden (bv. oormerk of identificatieplaatje). De identificatiemethode moet worden vastgelegd.

22.   Proefdiervoer en drinkwater moeten ad libitum worden verstrekt. Laboratoria die de Hershberger-bioassay uitvoeren moeten het laboratoriumvoer gebruiken dat zij normaliter in hun onderzoek van stoffen gebruiken. In de valideringsstudies van de bioassay werden geen effecten of variabiliteit waargenomen die aan het voer waren toe te schrijven. Het gebruikte voer wordt vastgelegd en een monster van het laboratoriumvoer moet worden bewaard voor eventuele analyse in de toekomst.

Prestatiecriteria voor androgeenafhankelijk orgaangewicht

23.   Tijdens de valideringsstudie waren er geen aanwijzingen dat de afname van het lichaamsgewicht van invloed was op toename of afname van de groei van het gewicht van doelweefsels (d.w.z. die in dit onderzoek gewogen moeten worden)).

24.   Bij de verschillende rattenstammen die met succes in het valideringsprogramma zijn gebruikt, is het androgeenafhankelijke orgaangewicht bij de zwaardere rattenstammen hoger dan bij de lichtere stammen. Daarom wordt in de prestatiecriteria van de Hershberger-bioassay geen absoluut verwacht orgaangewicht genoemd voor positieve en negatieve controles.

25.   Omdat het Variatiecoëfficiënt (CV) van een weefsel een omgekeerde evenredigheid vertoont met statistisch onderscheidingsvermogen, zijn de prestatiecriteria voor de Hershberger-bioassay gebaseerd op maximale CV-waarden voor elk weefsel (tabel 1). De CV's zijn verkregen uit de OESO-valideringsstudies. In het geval van negatieve resultaten moeten laboratoria de CV's voor de controlegroep en de met de hoge doses behandelde groep onderzoeken om vast te stellen of de maximale CV-prestatiecriteria overschreden zijn.

26.   Het onderzoek wordt herhaald als: 1) drie of meer van de tien mogelijke individuele CV's in de controlegroep en de met de hoge doses behandelde groep de maxima te boven gaan die voor agonisten- en antagonistenstudies zijn vastgesteld in tabel 1, en 2) minstens twee doelweefsels marginaal insignificant zijn, dat wil zeggen p-waarden tussen 0,05 en 0,10.

Tabel 1

Maximaal toegestane CV's vastgesteld voor doelweefsels van secundaire geslachtsorganen voor het castraatmodel in de OESO-valideringsstudies  (12) .

Weefsel	Antiandrogene effecten	Androgene effecten
Zaadblaasjes	40 %	40 %
Ventrale prostaat	40 %	45 %
LABC	20 %	30 %
Cowperse klieren	35 %	55 %
Glans penis	17 %	22 %

PROCEDURE

Naleving van de wet en laboratoriumverificatie

27.   In tegenstelling tot de Uterotrofe bepaling (hoofdstuk B.54 van deze bijlage), hoeft de competentie van een laboratorium voor de Hershberger-assay niet voor aanvang van het onderzoek te worden aangetoond, omdat positieve (testosteronpropionaat en flutamide) en negatieve controles tegelijkertijd plaatsvinden als integraal onderdeel van de bepaling.

Aantal en toestand van de dieren

28.   Elke behandelings- en controlegroep moet minimaal 6 dieren omvatten. Dit geldt voor zowel de androgene als de antiandrogene protocols.

Castratie

29.   Na ontvangst van de dieren moet er een eerste acclimatisatieperiode van enkele dagen worden ingeruimd om er zeker van te zijn dat de dieren gezond zijn en gedijen. Omdat bij dieren die voor een leeftijd van 42 dagen of postnatale dag (pnd) 42 de voorhuid mogelijk niet is teruggetrokken, moeten dieren worden gecastreerd op pnd 42 of later, niet daarvoor. De dieren worden onder anesthesie gecastreerd door een incisie in het scrotum aan te brengen en beide testes en epididymides te verwijderen waarbij bloedvaten en zaadbuisjes worden afgebonden. Na bevestiging dat er geen bloeding optreedt, kan het scrotum met hechtingen of autoclips worden gesloten. Dieren moeten de eerste dagen na chirurgie met pijnstillers worden behandeld om postchirurgische pijn te verlichten. Als gecastreerde dieren van een dierleverancier worden betrokken, moeten de leeftijd van de dieren en het stadium van de seksuele rijping door de leverancier worden gegarandeerd.

Acclimatisatie na castratie

30.   Acclimatisatie van de dieren aan de laboratoriumomstandigheden moet worden voortgezet zodat het doelweefselgewicht minimaal zeven dagen na castratie kan afnemen. De dieren moeten dagelijks worden geobserveerd, en alle dieren met aanwijzingen van ziekte of lichamelijke afwijkingen moeten worden verwijderd. Behandeling en instelling van de toediening (in onderzoek) kan dus beginnen vanaf een leeftijd van pnd 49 dagen, maar niet later dan pnd 60. De leeftijd bij obductie mag niet hoger zijn dan pnd 70. Met deze flexibiliteit kan een laboratorium het werk aan het experiment efficiënt plannen.

Lichaamsgewicht en groeprandomisatie

31.   Verschillen in individueel lichaamsgewicht zijn een bron van variabiliteit in weefselgewicht zowel binnen als tussen groepen dieren. Toenemende variabiliteit in weefselgewicht leidt tot een hogere variatiecoëfficiënt (CV) en vermindert het statistisch onderscheidingsvermogen van de bepaling (soms de gevoeligheid van de bepaling genoemd). Daarom moeten variaties in lichaamsgewicht zowel experimenteel als statistisch gereguleerd worden.

32.   Experimentele regulering houdt in het bereiken van geringe variaties in lichaamsgewicht binnen en tussen de onderzoeksgroepen. In de eerste plaats moeten ongebruikelijk kleine of grote dieren worden vermeden en niet in de onderzoekscohort worden opgenomen. Bij aanvang van het onderzoek moet de gewichtvariatie van de gebruikte dieren niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht zijn (bv. 175 g ± 35 g voor gecastreerde peripuberale ratten). Ten tweede moeten dieren worden toegewezen aan (controle- en behandel-) groepen via gerandomiseerde gewichtsverdeling, zodat het gemiddelde lichaamsgewicht van elke groep niet statistisch afwijkt van alle andere groepen. De toegepaste blokrandomisatieprocedure moet worden vastgelegd.

33.   Omdat toxiciteit het lichaamsgewicht van de behandelde groep ten opzichte van de controlegroep kan verminderen, moet het lichaamsgewicht op de eerste dag van de toediening van de teststof worden gebruikt als statistische covariabele, niet het lichaamsgewicht bij obductie.

Dosering

34.   Om vast te stellen of de teststof in vivo een androgene werking kan hebben, zijn twee dosisgroepen van de teststof plus positieve en medium (negatieve) controles (zie paragraaf 43) normaliter voldoende, en daarom geniet deze opzet de voorkeur uit het oogpunt van dierwelzijn. Als het doel is om een dosisresponscurve te verkrijgen of naar lagere doses te extrapoleren, zijn minstens 3 dosisgroepen nodig. Als informatie naast identificatie van androgene activiteit (zoals een schatting van de potentie) nodig is, moet een ander dosisregime worden overwogen. Om te testen op antiandrogenen wordt de teststof samen toegediend met een referentieandrogeenagonist. Er moeten minimaal 3 testgroepen met verschillende doses van de teststof en een positieve en negatieve controle worden gebruikt (zie paragraaf 44). Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een medium gebruik wordt gemaakt, dient dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend te worden.

35.   De dosisniveaus moeten worden voorgesteld en gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof en verwante stoffen. Bij het hoogste dosisniveau moet in de eerste plaats rekening worden gehouden met de LD50 en/of informatie over acute toxiciteit om overlijden, ernstig lijden of stress voor de dieren te voorkomen (17) (18) (19) (20) en, in de tweede plaats, met de beschikbare informatie over de doses die in de subchronische en chronische studies gebruikt zijn. In het algemeen zou de hoogste dosis geen verlaging van het uiteindelijke lichaamsgewicht van de dieren van meer dan 10 % van het controlegewicht moeten veroorzaken. De hoogste dosis moet zijn hetzij 1) de hoogste dosis die overleving van het dier waarborgt en die geen aanzienlijke toxiciteit of stress aan de dieren geeft na 10 opeenvolgende dagen van toediening tot een maximale dosis van 1 000 mg/kg/dag (zie paragraaf 36) of 2) een dosis die (anti)androgene effecten opwekt, afhankelijk van welke lager is. Bij screening zijn grote intervallen, bijvoorbeeld een half log eenheden (overeenkomend met een dosisprogressie van 3,2) of zelfs één log eenheden, tussen toedieningen aanvaardbaar. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek worden uitgevoerd (zie paragraaf 37) om de te gebruiken doses te helpen bepalen.

Maximale dosis

36.   Als een test bij de maximale dosis van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag en een lagere dosis met de voor dit onderzoek voorgeschreven procedures geen statistisch significante verandering in het gewicht van de geslachtsorganen geeft, dan kunnen overige dosisniveaus onnodig worden geacht. De maximale dosis is van toepassing, behalve wanneer op grond van gegevens over blootstelling bij de mens een hoger dosisniveau nodig wordt geacht.

Overwegingen voor bereikbepaling

37.   Waar nodig kan een preliminair bereikbepalingsonderzoek plaatsvinden met enkele dieren om de geschikte dosisgroepen te selecteren [aan de hand van methoden voor testen op acute toxiciteit (hoofdstukken B.1 bis, B.1 tris van deze bijlage (27), OESO TG 425 (19))]. De doelstelling in het geval van de Hershberger-bioassay is om doses te selecteren waarbij de dieren overleven en die geen aanmerkelijke toxiciteit of stress aan de dieren veroorzaken na tien opeenvolgende dagen van toediening van de stof tot een maximale dosis van 1 000 mg/kg/d zoals opgemerkt in paragrafen 35 en 36. Hierbij kan een OESO-leidraad (17) worden gebruikt waarin de klinische tekenen worden gedefinieerd die wijzen op toxiciteit of stress voor de dieren. Waar mogelijk kunnen binnen dit bereikbepalingsonderzoek na tien dagen toediening de doelweefsels worden uitgesneden en gewogen, ongeveer 24 uur na toediening van de laatste dosis. Deze gegevens kunnen dan worden gebruikt om te helpen bij het selecteren van de dosis in het hoofdonderzoek.

Referentiestoffen en medium

38.   De referentieandrogeenagonist moet zijn testosteronpropionaat (TP), CAS nr 57-82-5. De referentie-TP-dosering kan zijn hetzij 0,2 mg/kg-lg/d of 0,.4 mg/kg-lg/d. De referentieandrogeenantagonist moet zijn flutamide (FT), CAS nr 1311-84-7. De referentie-FT-dosering moet zijn 3 mg/kg-lg/d, en FT moet gelijktijdig worden toegediend met de referentie-TP-dosering.

39.   Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig(e) oplosmiddel/suspensie te overwegen. Maar omdat veel androgeenliganden of hun metabole precursors over het algemeen hydrofoob zijn, is de meest gangbare benadering om een oplossing/suspensie in olie te gebruiken (bv. maïs-, pinda-, sesam- of olijfolie). Teststoffen kunnen worden opgelost in een minimale hoeveelheid 95 % ethanol of andere geschikte oplosmiddelen en verdund tot de uiteindelijke werkconcentraties in het testmedium. De toxische eigenschappen van het oplosmiddel moeten bekend zijn, en moeten in een aparte controlegroep met alleen oplosmiddel worden getest. Als de teststof stabiel wordt geacht, kan voorzichtige verwarming en krachtig schudden worden gebruikt om te helpen bij het oplossen van de teststof. De stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald. Als de teststof gedurende het onderzoek stabiel is, kan één beginaliquot van de teststof worden bereid, en kunnen de gespecificeerde oplossingen dagelijks worden bereid, waarbij vervuiling en morsen van de monsters wordt vermeden.

Toediening van de doses

40.   TP moet worden toegediend door subcutane injectie en FT via maagsonde.

41.   De teststof wordt toegediend via maagsonde of subcutane injectie. Bij het kiezen van de toedieningsroute moet rekening worden gehouden met dierwelzijn en de fysische/chemische eigenschappen van de teststof. Daarnaast moet rekening worden gehouden met toxicologische aspecten zoals de relevantie van de humane route van blootstelling aan de stof (bv. maagsonde voor modelingestie, subcutane injectie voor modelinhalatie of dermale absorptie) en bestaande toxicologische informatie en gegevens over metablisme en kinetiek (bv. noodzaak om first-passmetabolisme te voorkomen, betere effectiviteit via een bepaalde route) voordat uitvoerige en langdurige tests worden gestart als positieve resultaten met injectie worden verkregen.

42.   De dieren moeten gedurende tien opeenvolgende dagen met intervallen van ongeveer 24 uur op dezelfde manier en op hetzelfde tijdstip een dosis ontvangen. Het dosisniveau moet dagelijks worden aangepast op basis van gelijktijdig verrichte meting van het lichaamsgewicht. Het volume van de dosis en de tijd waarop deze is toegediend moet op elke blootstellingsdag worden vastgelegd. Er moet voor worden gezorgd dat de maximale dosis die in paragraaf 35 is beschreven niet wordt overschreven om zo een zinvolle interpretatie van de gegevens mogelijk te maken. Vermindering van lichaamsgewicht, klinische tekenen, en andere bevindingen moeten in dit opzicht grondig worden beoordeeld. Bij voeding via een orale maagsonde moet een geschikte buis of intubatiecanule worden gebruikt. Het maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. De lokale richtlijnen voor dierverzorging moeten worden gevolgd, maar het volume mag niet hoger zijn dan 5 ml/kg lichaamsgewicht, behalve in het geval van oplossingen in water waarbij 10 ml/kg lichaamsgewicht aangehouden kan worden. Voor subcutane injecties moeten de doses worden toegediend in het dorsoscapulaire en of lumbale gebied via een steriele naald (bv. 23- of 25-gauge) en een tuberculinespuit. Het scheren van de injectieplaats is facultatief. Elk(e) verlies of lekkage op de injectieplaats of onvolledige toediening moet worden vastgelegd. Het totale per rat geïnjecteerde volume per dag mag niet hoger zijn dan 0,5 ml/kg lichaamsgewicht.

Specifieke procedures voor androgeenagonisten

43.   Voor de androgeenagonisttest is het medium de negatieve controle, de met TP behandelde groep is de positieve controle. Biologische activiteit die past bij androgeenagonisten wordt getest door toediening van een teststof aan behandelingsgroepen in geselecteerde doses gedurende 10 opeenvolgende dagen. Het gewicht van de vijf weefsels van secundaire geslachtsorganen uit de teststofgroepen wordt vergeleken met de mediumgroep op statistisch significante gewichtstoenames.

Specifieke procedures voor androgeenantagonisten en 5α-reductaseremmers

44.   Voor de androgeenantagonisten- en 5α-reductaseremmerstest is de met TP behandelde groep de negatieve controle, en de groep met gelijktijdige toediening van referentiedoses TP en FT de positieve controle. Er wordt getest op biologische activiteit die past bij androgeenantagonisten en 5α-reductaseremmers door toediening van een referentiedosis TP en toediening van de teststof gedurende 10 opeenvolgende dagen. Het gewicht van de vijf weefsels uit secundaire geslachtsorganen uit de groepen met TP en teststof worden vergeleken met de referentiegroep met alleen TP op statistisch significante gewichtsafnames.

WAARNEMINGEN

Klinische waarnemingen

45.   Minstens eenmaal per dag, en vaker als er tekenen van toxiciteit worden waargenomen, moeten algemene klinische waarnemingen worden gedaan. De waarnemingen worden bij voorkeur elke dag op het/dezelfde tijdstip(pen) verricht waarbij rekening wordt gehouden met de periode met verwachte piekeffecten na toediening. Alle dieren moeten worden geobserveerd op mortaliteit, morbiditeit, en algemene klinische tekenen zoals veranderingen in gedrag, huid, vacht, ogen, slijmvliezen, uitscheidingen en afscheidingen en autonome activiteiten (zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, pupilgrootte, ongebruikelijk ademhalingspatroon).

46.   Elk dood aangetroffen dier moet worden verwijderd en afgevoerd zonder verdere gegevensanalyse. Alle mortaliteit van dieren vóór obductie moet in het onderzoeksverslag worden opgenomen samen met een eventuele kennelijke reden voor de mortaliteit.. Stervende dieren moeten op humane wijze worden gedood. Alle stervende en gedode dieren moeten worden opgenomen in het onderzoeksverslag met de kennelijke redenen voor de morbiditeit.

Lichaamsgewicht en consumptie van voer

47.   Alle dieren moeten dagelijks worden gewogen op 0,1 g nauwkeurig, te beginnen vlak voor de behandeling start, d.w.z. wanneer de dieren over de groepen worden verdeeld. Eventueel kan de hoeveelheid voer die tijdens de behandelperiode geconsumeerd wordt, per kooi gemeten worden door de voerbak te wegen. De voerconsumptiegegevens moeten worden genoteerd in gram per rat per dag.

Sectie en meting van weefsel- en orgaangewicht

48.   Ongeveer 24 uur na de laatste toediening van de teststof moeten de ratten worden gedood met aftappen van bloed volgens normale procedures van het uitvoerende laboratorium, en obductie worden verricht. De wijze van humaan doden moet in het laboratoriumrapport worden vermeld.

49.   Idealiter moet de volgorde van obductie worden gerandomiseerd tussen de groepen om opeenvolgende stijgende of dalende doses te vermijden, wat de gegevens zou kunnen beïnvloeden. Alle bevindingen bij obductie, met name pathologische veranderingen/zichtbare laesies moeten worden opgemerkt en gerapporteerd.

50.   De vijf androgeenafhankelijke weefsels (VP, SV, LABC, COW, GP) moeten worden gewogen. Deze weefsels moeten worden uitgesneden, waarbij aanliggend weefsel en vet zorgvuldig worden weggesneden, en hun verse (niet gefixeerde) gewicht wordt vastgesteld. Elk weefsel moet met grote zorg worden behandeld om verlies van vocht en uitdroging te voorkomen, wat aanmerkelijke fouten en variabiliteit kan veroorzaken doordat het vastgelegde gewicht lager is. Verschillende weefsels kunnen heel klein of moeilijk te ontleden zijn, en dit zal tot variabiliteit leiden. Daarom is het belangrijk dat de personen die de sectie op de weefsels van de secundaire geslachtsorganen verrichten bekend zijn met de standaard sectieprocedures voor deze weefsels. Een standard operating procedure (SOP)-gids voor sectie is beschikbaar bij de OESO (21). Met zorgvuldige training volgens de SOP-gids wordt mogelijke variabiliteit in het onderzoek tot een minimum beperkt. Idealiter is steeds dezelfde prosector verantwoordelijk voor de sectie van een bepaald weefsel om interindividuele verschillen in de verwerking van weefsels te elimineren. Als dat niet mogelijk is, moet de obductie zo worden ingericht dat elke prosector sectie verricht op een bepaald weefsel uit alle behandelingsgroepen in plaats van dat één persoon sectie verricht op alle weefsels uit een controlegroep, terwijl iemand anders verantwoordelijk is voor de behandelde groepen. Alle secundaire geslachtsweefsels moeten zonder droogdeppen worden gewogen, afgerond op 0,1 mg, en het gewicht wordt voor elk dier vastgelegd.

51.   Sommige weefsels kunnen heel klein zijn waardoor sectie moeilijk te verrichten is, en dit zal tot variabiliteit leiden. In het verleden is gebleken dat variatiecoëfficiënten (CV's) kunnen verschillen als gevolg van verschillen in vaardigheid van het laboratorium. In enkele gevallen zijn bij een bepaald laboratorium grote verschillen in het absolute gewicht van de weefsels zoals de VP en COWS waargenomen.

52.   Meting van gewicht van lever, nieren paarsgewijs, en bijnieren paarsgewijs, is facultatief. Ook hier moeten weefsels worden ontdaan van aanliggend bindweefsel en vet. Het gewogen levergewicht moet worden vastgelegd, afgerond op 0,1 g, en de nieren en bijnieren moeten paarsgewijs worden gewogen en afgerond op 0,1 mg. De lever, nieren en bijnieren worden niet alleen door androgenen beïnvloed; ze leveren ook bruikbare indices op van systemische toxiciteit.

53.   Meting van luteïniserend hormoon (LH), follikelstimulerend hormoon (FSH) en testosteron (T) in het serum is facultatief. Serum T-concentraties zijn nuttig voor het vaststellen of de teststof metabolisme van testosteron door de lever induceert waardoor de serumconcentraties dalen. Zonder de T-gegevens zou zo'n effect kunnen lijken plaats te vinden via een antiandrogeen mechanisme. De LH-concentraties geven informatie over het vermogen van een antiandrogeen om niet alleen het orgaangewicht te verminderen, maar ook de hypothalamus-hypofysefunctie te beïnvloeden, wat in langetermijnstudies testistumoren kan induceren. FSH is een belangrijk hormoon voor de spermatogenese. Serum-T4 en -T3 zijn ook optionele metingen die nuttige aanvullende informatie kunnen geven over het vermogen om de homeostase van het thyroïdhormoon te verstoren. Als hormoonmetingen gedaan worden, moeten de ratten vóór obductie onder narcose worden gebracht en wordt bloed met een hartpunctie afgenomen; de wijze van verdoving moet zorgvuldig worden gekozen zodat deze de hormoonmeting niet beïnvloedt. De methode van serumbereiding, de herkomst van de radio-immunoassay of andere sets voor meting, de analystische procedures, en de resultaten moeten worden vastgelegd. LH-concentraties worden vermeld als ng per ml serum, en T moet ook worden vermeld als ng per ml serum.

54.   Sectie op de weefsels wordt als volgt beschreven met een gedetailleerde sectiegids met foto's, gepubliceerd als aanvullend materiaal in het kader van het valideringsprogramma (21). Een sectievideo is ook beschikbaar op de webpagina van de Korea Food and Drug Administration (22).

—	Stel met de buikzijde van het dier omhoog vast of de voorhuid van de penis is losgekomen van de glans penis. Zo ja, trek de voorhuid dan terug en verwijder de glans penis, weeg deze (afronden op 0,1 mg), en noteer het gewicht.

—

Open de buikhuid en -wand, waardoor de ingewanden worden blootgelegd. Als de optionele organen gewogen worden, verwijder de lever dan en weeg deze, rond af op 0,1 g, verwijder de maag en darmen, verwijder en weeg paarsgewijs de nieren en bijnieren, rond af op 0,1 mg. Met deze sectie wordt de blaas blootgelegd en kan worden begonnen met de sectie van de gewenste secundaire geslachtsweefsels.

—

Voor sectie van de VP wordt de blaas van de ventrale spierlaag losgemaakt door het bindweefsel langs de middellijn door te snijden. Schuif de blaas in anterieure richting opzij naar de zaadblaasjes (SV), waardoor de linker- en rechterlobben van de ventrale prostaat (bedekt door een vetlaag) zichtbaar worden. Verwijder voorzichtig het vet van de rechter- en linkerlobben van de VP. Trek voorzichtig de rechter VP-lob van de urethra af en snijd de lob van de urethra los. Terwijl de rechter VP-lob nog wordt vastgehouden, wordt voorzichtig de linker VP-lob van de urethra afgetrokken en losgesneden; weeg en rond af op 0,1 mg en noteer het gewicht.

—

Voor sectie van de SVCG wordt de blaas in caudale richting verschoven, waardoor de vas deferens en rechter- en linkerlobben van de zaadblaasjes plus coagulans uitscheidende klieren (SVCG) zichtbaar worden. Voorkom lekkage van vocht door een hemostaatklem aan de basis van de SVCGs te plaatsen, waar de vas deferens samenkomt met de urethra. Snijd voorzichtig de SVCGs los, met de hemostaat op zijn plaats, verwijder vet en adnexa, leg in een getarreerde weger, verwijder de hemostaat, weeg en rond af op 0,1 mg, en noteer het gewicht.

—

Voor sectie van de m. levator ani plus bulbocavernosus (LABC) worden de spieren en de basis van de penis blootgelegd. De LA-spieren liggen rond de colon, terwijl de anterieure LA- en BC-spieren aan de bulbus penis gehecht zijn. De huid en adnexa van het perianale gebied vanaf de basis van de penis tot het anterieure uiteinde van de anus worden verwijderd. De BC-spieren worden een voor een van de bulbus penis en weefsels losgemaakt. De colon wordt doorgesneden en de volledige LABC kan worden uitgesneden en verwijderd. De LABC moet worden ontdaan van vet en adnexa, gewogen met afronding op 0,1 mg, en het gewicht moet worden genoteerd.

—

Na verwijdering van de LABC zijn de ronde Cowperse of bulbo-urethrale klieren (COW) zichtbaar aan de basis van, en enigszins dorsaal van, de bulbus penis. Zorgvuldige sectie is geboden om te voorkomen dat het dunne kapsel wordt doorgeprikt om zo vochtlekkage te vermijden. Weeg de COW paarsgewijs, rond af op 0,1 mg, en noteer het gewicht.

—	Daarnaast moet eventueel verlies van vocht uit een klier tijdens obductie en sectie worden genoteerd.

55.   Als de beoordeling van elke stof de obductie van meer dieren vereist dan voor één dag redelijk is, kan het begin van het onderzoek over twee opeenvolgende dagen worden verspreid, waardoor obductie en verwante werkzaamheden ook over twee dagen worden verspreid. Als de werkzaamheden zo worden gespreid, moet per dag de helft van de dieren per behandelingsgroep worden verwerkt.

56.   Na obductie moeten de karkassen op passende wijze worden afgevoerd.

RAPPORTAGE

Gegevens

57.   Gegevens moeten individueel worden gemeld (te weten lichaamsgewicht, gewicht secundaire geslachtsweefsels, optionele metingen en andere responsen en waarnemingen) en voor elke groep dieren (gemiddelden en standaarddeviaties van alle verrichte metingen). De gegevens moeten in tabelvorm worden samengevat. De gegevens moeten het aantal dieren laten zien aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of met tekenen van toxiciteit, een omschrijving van de waargenomen tekenen van toxiciteit, waaronder tijd van begin, duur en ernst.

58.   Een eindrapport moet het volgende bevatten:

Testinstelling:

—	naam instelling, locatie,

—	onderzoeksleider en andere medewerkers en hun verantwoordelijkheden met betrekking tot het onderzoek,

—	begin- en einddatum van het onderzoek, te weten de eerste dag van toediening van de teststof resp. laatste dag van obductie.

Teststof:

—	herkomst, partij/chargenummer, identiteit, zuiverheid, volledig adres van leverancier en kenmerken van de teststof,

—	fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschappen,

—	opslagomstandigheden en methode en frequentie van bereiding van verdunning,

—	alle gegenereerde gegevens over stabiliteit,

—	alle analyses van doseeroplossingen/suspensies.

Medium:

—	kenmerken van het medium (identiteit, leverancier en partijnummer),

—	motivering van de keuze van het medium (wanneer dat geen water is).

Procedures voor proefdieren en dierhouderij:

—	gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze,

—	herkomst of leverancier van dieren, inclusief volledig adres,

—	aantal en leeftijd van geleverde dieren,

—	huisvesting (temperatuur, verlichting enz.),

—	voer (naam, type, leverancier, partijnummer, inhoud en indien bekend, concentraties fyto-oestrogenen),

—	strooisel (naam, type, leverancier, samenstelling),

—	omstandigheden in de kooi en aantal dieren per kooi.

Testomstandigheden:

—	leeftijd bij castratie en duur van acclimatisatie na castratie,

—	individueel gewicht van de dieren bij aanvang van het onderzoek (afgerond op 0,1 g),

—	randomisatieproces en een vastlegging van de toewijzing aan medium, referentie, teststofgroepen, en kooien,

—	gemiddelde en standaarddeviatie van lichaamsgewicht voor elke groep voor elke weegdag in het onderzoek,

—	motivering van de keuze van de dosis,

—	Toedieningsroute van teststof en motivering van keuze van de blootstellingsweg,

—	indien een bepaling voor antiandrogeniteit, de TP-behandeling (dosis en volume),

—	behandeling met teststof (dosis en volume),

—	tijdstip van toediening,

—	obductieprocedures, inclusief wijze van aftappen van bloed en eventuele narcose,

—	Indien serumanalyses worden verricht, moeten details van de methode worden gegeven. Bijvoorbeeld, als RIA wordt gebruikt, moet de RIA-procedure, herkomst van RIA-sets, vervaldata van sets, procedure voor scintillatietelling, en standaardisatie worden vermeld.

Resultaten:

—	Dagelijkse observaties voor elk dier tijdens toediening, waaronder:

—	lichaamsgewicht (afgerond op 0,1 g),

—	klinische tekenen (indien aanwezig),

—	eventuele meting van of opmerking over voerconsumptie.

—	Observaties bij obductie voor elk dier, waaronder:

—	datum obductie,

—	behandelingsgroep van het dier,

—

dier-ID,

—	prosector,

—	tijdstip dat necropsie en sectie wordt verricht,

—	leeftijd dier,

—	uiteindelijk lichaamsgewicht bij obductie, met opmerking van eventuele statistisch significante toename of afname,

—	volgorde van aftappen van bloed en sectie bij obductie,

—	gewicht van de vijf androgeenafhankelijke doelweefsels:

—	ventrale prostaat (afgerond op 0,1 mg),

—	zaadblaasjes plus coagulans uitscheidende klieren, inclusief vocht (paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),

—	m levator ani plus bulbocavernosuscomplex (afgerond op 0,1 mg),

—	Cowperse klieren (vers gewicht — paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),

—	glans penis (vers gewicht afgerond op 0,1 mg),

—	gewicht van optionele weefsels, indien verricht:

—	lever (afgerond op 0,1 g),

—	nieren (paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),

—	bijnieren (paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),

—	algemene opmerkingen.

—	Analyses van serumhormonen, indien verricht: — serum-LH (facultatief — ng per ml serum), en — serum-T (facultatief — ng per ml serum), en

—	algemene opmerkingen.

Samenvatting van gegevens

Gegevens moeten worden samengevat in tabelvorm met steekproefgrootte voor elke groep, gemiddelde van de waarde, en de standaardfout of standaarddeviatie. Tabellen moeten lichaamsgewicht bij obductie, veranderingen in lichaamsgewicht vanaf begin van toediening tot obductie, gewicht secundaire geslachtsdoelweefsels, en eventuele optionele orgaangewichten bevatten.

Bespreking van de resultaten.

Analyse van resultaten

59.   Het lichaams- en orgaangewicht bij obductie moeten statistisch worden geanalyseerd op kenmerken zoals homogeniteit van variantie met passende datatransformaties waar nodig. Behandelingsgroepen moeten worden vergeleken met een controlegroep aan de hand van technieken als ANOVA gevolgd door paarsgewijze vergelijkingen (bv. eenzijdige Dunnett-test) en het criterium voor statistisch verschil, bijvoorbeeld p ≤ 0,05. Groepen die statistische significantie bereiken moeten worden geïdentificeerd. Maar „relatief orgaangewicht” moet worden vermeden vanwege de ongeldige statistische aannamen die aan deze gegevensbewerking ten grondslag liggen.

60.   Voor androgeenagonisme moet de controle de testgroep met alleen medium zijn. De kenmerken van het werkingsmechanisme van de teststof kunnen tot verschillende relatieve responsen in weefsels leiden, bijvoorbeeld trenbolon, waarbij 5α-reductie niet mogelijk is, heeft een meer uitgesproken effect op het LABC en GP dan TP. Een statistisch significante verhoging (p≤ 0,05) in het gewicht van twee of meer van de vijf androgeenafhankelijke doelweefsels (VP, LABC, GP, CG en SVCG) moet worden beschouwd als een positief androgeenagonistresultaat, en alle doelweefsels moeten enige mate van groeitoename vertonen. Een gecombineerde beoordeling van de respons van de weefsels van alle secundaire geslachtsorganen (ASO) kan worden bereikt met passende multivariabele gegevensanalyse. Dit kan de analyse verbeteren, vooral in gevallen waar slechts één weefsel een statistisch significante respons vertoont.

61.   Voor androgeenantagonisme moet de controle de testgroep met het referentieandrogeen (alleen testosteronpropionaat) zijn. De kenmerken van het werkingsmechanisme van een teststof kunnen tot een verschillende relatieve respons in weefsels leiden; zo hebben 5α-reductaseremmers als finasteride een meer uitgesproken effect op de ventrale prostaat dan andere weefsels in vergelijking met krachtige AR-antagonisten, zoals flutamide. Een statistisch significante verlaging (p≤ 0,05) in het weefselgewicht van twee of meer van de vijf androgeenafhankelijke doelweefsels (VP, LABC, GP, CG en SVCG) wordt beschouwd als een positief androgeenantagonistresultaat, en alle doelweefsels moeten enige mate van groeiafname vertonen. Een gecombineerde beoordeling van alle ASO-weefselresponsen kan worden bereikt met passende multivariabele gegevensanalyse. Dit kan de analyse verbeteren, vooral in gevallen waar slechts één weefsel een statistisch significante respons vertoont.

62.   De gegevens moeten worden samengevat in tabelvorm met gemiddelde, standaardfout (standaarddeviatie zou ook acceptabel zijn) en steekproefgrootte voor elke groep. Ook individuele datatabellen moet worden toegevoegd. De individuele waarden, gemiddelden, SE (SD) en CV-waarden voor de controlegegevens moeten worden geverifieerd om vast te stellen of ze aan aanvaardbare criteria voldoen voor consistentie met verwachte historische waarden. Aan de hand van CV's die de CV-waarden in tabel 1 (zie paragraaf 25 en 26) voor elk orgaangewicht te boven gaan, moeten worden vastgesteld of er fouten zijn in het vastleggen of invoeren van gegevens, dan wel of het laboratorium een accurate sectie van androgeenafhankelijke weefsels nog niet beheerst en aanvullende training/oefening gerechtvaardigd is. Over het algemeen zijn CV's (de standaarddeviatie gedeeld door het gemiddelde orgaangewicht) van lab tot lab en van onderzoek tot onderzoek reproduceerbaar. De gepresenteerde gegevens moeten ten minste bevatten: ventrale prostaat, zaadblaasje, m levator ani plus bulbocavernosus, Cowperse klieren, glans penis, lever, en lichaamsgewicht en verandering in lichaamsgewicht vanaf begin van toediening tot obductie. Gegevens kunnen ook worden gepresenteerd na aanpassing voor covariantie voor lichaamsgewicht, maar dit moet niet in de plaats komen van het presenteren van de onaangepaste gegevens. Daarnaast, als het loskomen van de voorhuid (preputial separation — PPS) niet in een van de groepen optreedt, moet de incidentie van PPS worden vastgelegd en statistisch vergeleken met de controlegroep aan de hand van de Fisher Exact test.

63.   Bij controle op juistheid van de ingegeven computergegevens door vergelijking met de oorspronkelijke gegevensformulieren, moeten waarden voor orgaangewicht die niet biologisch plausibel zijn of met meer dan drie standaarddeviaties van het gemiddelde van die behandelingsgroep afwijken, zorgvuldig worden onderzocht en mogelijk worden genegeerd, omdat het waarschijnlijk fouten in de vastlegging zijn.

64.   Vergelijking van onderzoeksresultaten met OESO-waarden (in tabel 1) is vaak een belangrijke stap in het interpreteren van de validiteit van de onderzoeksresultaten. In het laboratorium moeten historische gegevens voor mediumcontrolegroepen worden bijgehouden. Historische gegevens voor responsen op positieve referentiestoffen, zoals TP en FT, moeten eveneens in het laboratorium worden bijgehouden. Laboratoria kunnen ook periodiek de respons op bekende zwakke androgeenagonisten en -antagonisten testen en deze gegevens bijhouden. Deze gegevens kunnen worden vergeleken met beschikbare OESO-gegevens om ervoor te zorgen dat de methoden in het laboratorium voldoende statistisch(e) precisie en onderscheidingvermogen opleveren.

OPMERKINGEN BIJ HET KADER

Opmerking 1:

het is mogelijk om op alle niveaus in- en uit te stappen. Dit hangt af van de soort informatie waaraan behoefte bestaat voor gevaar- en risicobeoordelingsdoeleinden.

Opmerking 2:

in niveau 5 moet de ecotoxicologie eindpunten omvatten die duiden op mechanismen van schadelijke effecten en potentiële schade voor de populatie.

Opmerking 3:

als een multimodaal model enkele van de testen met een enkel eindpunt omvat, vervangt dat model het gebruik van deze testen met een enkel eindpunt.

Opmerking 4:

de beoordeling van elke stof moet per geval plaatsvinden, rekening houdend met alle beschikbare informatie en de functie van de niveaus van het kader.

Opmerking 5:

het kader moet op dit moment niet worden beschouwd als alomvattend. Op niveaus 3, 4 en 5 voorziet het kader in testen die al beschikbaar zijn of waarvan de validering nog loopt. De laatstgenoemde testen zijn daarom als voorlopig opgenomen. Na de ontwikkeling en validering ervan worden deze testen formeel toegevoegd aan het kader.

Opmerking 6:

niveau 5 moet niet worden beschouwd als een niveau dat alleen beslissende testen omvat. Tests die in dat niveau zijn opgenomen worden geacht aan de algehele beoordeling van gevaar en risico bij te dragen.

LITERATUUR

1.

OESO (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10-11 maart 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

2.

Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. Academic Press, NY.

3.

Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antiandrogenic activity in castrate-immature male rats. In: Current Protocols in Toxicology 16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc.

4.

OESO (2006). Final OECD report of the initial work towards the validation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testosterone propionate and antiandrogenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 62. ENV/JM/MONO(2006)30.

5.

OESO (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Laboratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 86. ENV/JM/MONO(2008)3.

6.

OESO (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 73. ENV/JM/MONO(2007)20.

7.

Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269.

8.

Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E (2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8.

9.

Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. Biochem J26:413-422.

10.

Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306-1314.

11.

Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38-44.

12.

Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119.

13.

Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19-nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180.

14.

Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.

15.

Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220.

16.

Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: Humana Press, p 38.

17.

OESO (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

18.

OESO (1982). Organization for Economic Co-operation and Development — Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Parijs.

19.

OESO (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.

20.

OESO (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.

21.

Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.

22.

Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hershberger assay procedure, including a dissection video. http://rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html.

23.

OESO (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.

24.

OESO (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.

25.

OESO (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. Series on Testing and Assessment, Number 115.

26

Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).

27.

De volgende hoofdstukken van deze bijlage:   B.1 bis, Acute orale toxiciteit — Procedure met vaste doses   B.1 tris, Acute orale toxiciteit — Methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse.

B.56.   UITGEBREID ONDERZOEK NAAR REPRODUCTIETOXICITEIT OVER ÉÉN GENERATIE

INLEIDING

1.   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 443 (2012) van de OESO. De methode is gebaseerd op het voorstel van het Agricultural Chemical Safety Assessment (ACSA) Technical Committee van het International Life Science Institute (ILSI)-Health and Environmental Sciences Institute (HESI) voor een uitgebreid reproductieonderzoek over één generatie met betrekking tot levensfase F1, zoals gepubliceerd in Cooper et al., 2006 (1). Er zijn verscheidene verbeteringen en verduidelijkingen aangebracht in de opzet van het onderzoek om de flexibiliteit te vergroten en te benadrukken dat het van belang is uit te gaan van bestaande kennis bij het gebruik van observaties bij levende dieren om de testen richting te geven en af te stemmen. Deze testmethode voorziet in een gedetailleerde beschrijving van de operationele uitvoering van een uitgebreid onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie. Hierin worden drie cohorten van F1-dieren beschreven:

cohort 1: beoordeelt reproductie/ontwikkelingseindpunten; deze cohort kan worden uitgebreid met een F2-generatie,

cohort 2: beoordeelt de potentiële invloed van blootstelling aan stoffen op het ontwikkelende zenuwstelsel,

cohort 3: beoordeelt de potentiële invloed van blootstelling aan stoffen op het immuunsysteem.

2.   Beslissingen over het al dan niet beoordelen van de tweede generatie en het achterwege laten van de ontwikkelingsneurotoxiciteitscohort en/of ontwikkelingsimmunotoxiciteitscohort, moeten gebaseerd zijn op bestaande kennis over de te beoordelen stof alsook op de behoeften van verscheidene regelgevende instanties. De testmethode heeft tot doel nadere gegevens te verstrekken over de wijze waarop het onderzoek kan worden uitgevoerd en elke cohort moet worden beoordeeld.

3.   De procedure voor de beslissing over het intern triggeren van de productie van een tweede generatie wordt beschreven in OESO-leidraad nr. 117 (39) voor de regelgevende instanties die interne triggers toepassen.

INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN DOELSTELLINGEN

4.   Het hoofddoel van het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie is het beoordelen van specifieke levensfasen die niet in andere typen toxiciteitsonderzoeken aan de orde komen en het testen op effecten die kunnen optreden als gevolg van pre- en postnatale blootstelling aan een stof. Voor reproductie-eindpunten is het de bedoeling dat, als een eerste stap en indien beschikbaar, informatie van onderzoeken met herhaalde toediening (zoals screeningsonderzoeken naar reproductietoxiciteit, bv. OESO TG 422 (32)) of kortlopende screeningstesten op hormoonontregelaars (bv. uterotrofe test — testmethode B.54 (36), en de Hershberger-test — testmethode B.55 (37)) wordt gebruikt om effecten op de geslachtsorganen bij mannetjes en vrouwtjes te detecteren. Dit kan onder meer spermatogenese (testiculaire histopathologie) voor mannetjes en oestruscycli, aantal follikels/eicelrijping en integriteit van de eierstokken (histopathologie) voor vrouwtjes omvatten. Het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie dient dan als een test voor reproductie-eindpunten waarvoor de interactie van mannetjes met vrouwtjes, vrouwtjes met een foetus en vrouwtjes met nakomelingen en de F1-generatie tot na de geslachtsrijping nodig is (zie OESO-leidraad nr. 151 voor ondersteuning van deze testmethode (40)).

5.   De testmethode is bedoeld om de pre- en postnatale effecten van stoffen op de ontwikkeling te beoordelen alsook de systemische toxiciteit bij drachtige en zogende vrouwtjes en jonge en volwassen nakomelingen grondig te beoordelen. Door gedetailleerd onderzoek van belangrijke ontwikkelingseindpunten, zoals levensvatbaarheid van nakomelingen, neonatale gezondheid, ontwikkelingsstatus bij de geboorte en de lichamelijke en functionele ontwikkeling tot volwassenheid kunnen naar verwachting specifieke doelorganen bij de nakomelingen worden vastgesteld. Daarnaast wordt door middel van het onderzoek informatie verkregen en/of bevestigd over de effecten van een teststof op de integriteit en werking van de voortplantingssystemen van volwassen mannetjes en vrouwtjes. Met name, maar niet aansluitend, komen daarbij de volgende parameters aan de orde: gonadale functie, de oestruscyclus, epididymalespermarijping, paringsgedrag, conceptie, dracht, werpen en zogen. Verder worden met de informatie verkregen uit de beoordelingen van de ontwikkelingsneurotoxiciteit en ontwikkelingsimmunotoxiciteit mogelijke effecten op deze systemen gekarakteriseerd. Met de uit deze testen verkregen gegevens kunnen bepalingen worden gedaan van het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (no-observed-adverse-effect level, NOAEL), het laagste niveau waarbij een schadelijk effect werd vastgesteld (lowest-observed-adverse-effect level, LOAEL) en/of benchmarkdoses voor de verscheidene eindpunten en/of deze gegevens kunnen worden gebruikt om effecten te karakteriseren die naar voren zijn gekomen uit eerdere onderzoeken met herhaalde toediening en/of dienen als een richtsnoer voor latere testen.

6.   In figuur 1 wordt het protocol schematisch weergegeven. De teststof wordt continu toegediend in geleidelijk stijgende doses aan diverse groepen van geslachtsrijpe mannetjes en vrouwtjes. Deze parentale (P) generatie krijgt de stof toegediend gedurende een gedefinieerde periode vóór paring (gekozen op grond van de beschikbare informatie voor de teststof, maar minimaal twee weken) en een twee weken durende paringsperiode. P-mannetjes worden ten minste verder behandeld tot spening van de F1 en moeten minimaal tien weken worden behandeld. Ze kunnen langer worden behandeld als effecten op de voortplanting helder gekregen moeten worden. De behandeling van de P-vrouwtjes wordt voortgezet tijdens de dracht en zoogperiode tot het einde na de spening van hun nesten (d.w.z. 8-tien weken behandeling). De F1-nakomelingen worden verder behandeld met de teststof vanaf de spening tot volwassenheid. Bij beoordeling van een tweede generatie (zie OESO-leidraad nr. 117 (39)) blijven de F1-nakomelingen behandeling krijgen tot spening van de F2 of tot het einde van het onderzoek.

7.   Met alle dieren worden klinische observaties en pathologische onderzoeken gericht op verschijnselen van toxiciteit verricht, met speciale nadruk op de integriteit en werking van de mannelijke en vrouwelijke voortplantingssystemen en de gezondheid, groei, ontwikkeling en functionering van de nakomelingen. Bij de spening worden geselecteerde nakomelingen toegewezen aan specifieke subgroepen (cohorten 1-3, zie punten 33 en 34 en figuur 1) voor nader onderzoek, waaronder geslachtsrijping, integriteit en functie van de voortplantingsorganen, neurologische en gedragseindpunten en immuunfuncties.

8.   Bij het uitvoeren van het onderzoek moeten de richtsnoeren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in de OESO-leidraad nr. 19 over het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische verschijnselen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (34).

9.   Als er voldoende onderzoeken beschikbaar zijn om vast te stellen wat de impact is van deze nieuwe onderzoeksopzet, wordt de testmethode beoordeeld en indien nodig herzien in het licht van opgedane ervaring.

Figuur 1

Schema van het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie

BESCHRIJVING VAN DE METHODE/VOORBEREIDINGEN VOOR DE TEST

Dieren

Keuze van diersoort en stam

10.   De keuze van de soort voor de reproductietoxiciteitstest moet zorgvuldig overwogen worden in het licht van alle beschikbare informatie. Vanwege de omvang van de achtergrondgegevens en de vergelijkbaarheid met algemene toxiciteitstesten, is de rat echter normaliter de voorkeurssoort en hebben de bij deze testmethode gegeven criteria en aanbevelingen betrekking op deze soort. Wordt een andere soort gebruikt, dan moet dit gemotiveerd worden en zijn passende aanpassingen van het protocol noodzakelijk. Stammen met een lage vruchtbaarheid of een algemeen bekende hoge incidentie van spontane afwijkingen in de ontwikkeling mogen niet worden gebruikt.

Leeftijd, lichaamsgewicht en inclusiecriteria

11.   Er worden gezonde P-dieren gebruikt waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd. Zowel de mannetjes als de vrouwtjes worden onderzocht en de vrouwtjes moeten nullipara's zijn en niet drachtig zijn. De P-dieren moeten geslachtsrijp, bij aanvang van de toediening van gelijk gewicht (binnen hetzelfde geslacht) en bij het paren van gelijke leeftijd zijn (ongeveer 90 dagen), en het moeten representatieve exemplaren zijn van de soort en stam die worden onderzocht. De dieren moeten na levering ten minste vijf dagen acclimatiseren. De dieren worden willekeurig toegewezen aan de controle- en behandelgroepen. Dit moet zodanig gebeuren, dat dit vergelijkbare waarden voor het gemiddelde lichaamsgewicht van de groepen geeft (d.w.z. ± 20 % van het gemiddelde).

Huisvestings- en voedingsomstandigheden

12.   De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. De relatieve vochtigheid moet tussen 30 en 70 % liggen, idealiter tussen 50 en 60 %. De cyclus van het kunstlicht moet worden ingesteld op 12 uur licht en 12 uur donker. Het gewone proefdiervoer mag worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Er dient goed gelet te worden op het gehalte aan fyto-oestrogenen in het voer, aangezien een hoog gehalte van invloed kan zijn op bepaalde reproductie-eindpunten. Gestandaardiseerd voer zonder voorgeschreven samenstelling met een verlaagd gehalte aan oestrogene stoffen wordt aanbevolen (2) (30). De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt toegediend. Het gehalte, de homogeniteit en de stabiliteit van de teststof in het voer moet gecontroleerd worden. Het voer en drinkwater moeten regelmatig op onzuiverheden worden onderzocht. Van elke partij voer die tijdens het onderzoek wordt gebruikt moeten monsters onder de juiste omstandigheden worden bewaard (bv. ingevroren bij – 20 °C) tot het rapport afgerond is voor het geval de resultaten nadere analyse van de bestanddelen van het voer noodzakelijk maken.

13.   De dieren moeten in kleine groepen van hetzelfde geslacht en dezelfde behandelgroep worden ondergebracht. Ze kunnen elk apart worden gehuisvest om mogelijk letsel te voorkomen (bv. mannetjes na de paringsperiode). Het paren moet plaatsvinden in geschikte kooien. Na gebleken copulatie worden vrouwtjes die geacht worden drachtig te zijn elk apart gehuisvest in kooien die zijn bestemd voor werpen of moederschap, waar ze worden voorzien van geschikt en gedefinieerd nestmateriaal. Nesten worden tot de spening met hun moeders gehuisvest. F1-dieren moeten vanaf de spening tot het einde in kleine groepen van hetzelfde geslacht en dezelfde behandelgroep worden gehuisvest. Dieren kunnen elk apart worden gehuisvest als daarvoor een wetenschappelijke motivering wordt gegeven. Het gehalte aan fyto-oestrogenen in het gekozen strooisel moet minimaal zijn.

Aantal dieren en identificatie

14.   Normaal moet elke test- en controlegroep een voldoende aantal paringskoppels bevatten om ten minste 20 drachtige vrouwtjes per dosisgroep op te leveren. Het doel is voldoende drachten tot stand te brengen om een betekenisvolle evaluatie van de mogelijke invloed van de stof op de vruchtbaarheid, dracht en het moederlijke gedrag van de P-generatie en de groei en ontwikkeling van de F1-nakomelingen, vanaf de conceptie tot de volwassenheid, mogelijk te maken. Wordt het gewenste aantal drachtige dieren niet gehaald, dan maakt dit het onderzoek niet noodzakelijkerwijs ongeldig en moet dit per geval worden geëvalueerd, rekening houdend met een mogelijk oorzakelijk verband met de teststof.

15.   Aan elk P-dier wordt een uniek identificatienummer toegekend alvorens de toediening start. Als historische laboratoriumgegevens erop wijzen dat een aanzienlijk deel van de vrouwtjes mogelijk geen regelmatige oestruscyclus (van 4 of vijf dagen) vertoont, wordt aanbevolen de oestruscycli te beoordelen vóór aanvang van de behandeling. Een andere mogelijkheid is de groepsgrootte te vergroten, zodat ten minste 20 vrouwtjes in elke groep bij aanvang van de behandeling regelmatige oestruscycli (van 4 of vijf dagen) hebben. Alle F1-nakomelingen krijgen een unieke identificatie bij het eerste onderzoek als pasgeborene op postnatale dag (PND) 0 of 1. Van alle F1-dieren, en F2-dieren indien van toepassing, moeten de gegevens over het nest van herkomst het hele onderzoek worden bewaard.

Teststof

Beschikbare informatie over de teststof

16.   Het is van belang om op basis van beoordeling van bestaande informatie beslissingen te nemen over de toedieningsweg, de keuze van het medium, de keuze van de diersoort, de keuze van doseringen en mogelijke aanpassingen van het doseringsschema. Alle relevante beschikbare informatie over de teststof, d.w.z. fysisch-chemische, toxicokinetische (waaronder soortspecifiek metabolisme) en toxicodynamische eigenschappen, structuur-activiteitrelaties (SAR's), metabole processen in vitro, resultaten van eerdere toxiciteitsonderzoeken en relevante informatie over structuuranaloga, moet daarom in aanmerking worden genomen bij het plannen van het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie. Verkennende informatie over absorptie, distributie, metabolisme en eliminatie (ADME) en bioaccumulatie kan worden verkregen uit de chemische structuur, fysisch-chemische gegevens, mate van plasma-eiwitbinding of toxicokinetiekonderzoeken (TK-onderzoeken), terwijl resultaten van toxiciteitsonderzoeken aanvullende informatie geven, bv. over NOAEL, metabolisme of inductie van metabolisme.

Overweging van toxicokinetische gegevens

17.   Hoewel TK-gegevens van eerder uitgevoerde doseringsbereikonderzoeken of andere onderzoeken niet vereist zijn, zijn ze buitengewoon nuttig bij het opzetten van het onderzoek, de keuze van dosisniveaus en interpretatie van resultaten. Bijzonder nuttig zijn gegevens die: 1) de blootstelling van ontwikkelende foetussen en jongen aan de teststof beoordelen (of relevante metabolieten), 2) een schatting geven van interne dosimetrie, en 3) potentiële dosisafhankelijke verzadiging van kinetische processen evalueren. Aanvullende TK-gegevens, zoals metabolietprofielen, concentratie-tijdcurves enz., moeten ook in aanmerking worden genomen, indien beschikbaar. Aanvullende TK-gegevens kunnen ook worden verzameld tijdens het hoofdonderzoek, mits dit niet de verzameling en interpretatie van de eindpunten voor het hoofdonderzoek verstoort.

Als algemeen richtsnoer is de volgende TK-dataset nuttig bij het plannen van het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie:

—	late dracht (bv. drachtdag 20) — bloed van moederdier en foetus,

—	halverwege zoogperiode (PND 10) — bloed van moederdier en jong en/of melk,

—	vlak na spening (bv. PND 28) — bloedmonsters van gespeende dieren.

Bij het bepalen van de specifieke analyten (bv. moederstof en/of metabolieten) en/of het monsternameschema moet flexibel te werk worden gegaan. Zo is het aantal te nemen monsters en de tijdstippen ervan op een gegeven monsternamedag afhankelijk van de blootstellingsweg en eerder opgedane kennis van TK-eigenschappen bij niet-drachtige dieren. Voor onderzoeken met toediening via het voer is monstername op één vast tijdstip op elk van deze dagen voldoende, terwijl bij toediening via een maagsonde aanvullende monsternamepunten nodig kunnen zijn om een betere schatting te krijgen van de spreiding van de inwendige doses. Het is echter niet noodzakelijk om op een van de monsternamedagen het volledig verloop van de concentratie in de tijd vast te leggen. Indien noodzakelijk kan bloed per geslacht binnen nesten worden samengevoegd voor foetale en neonatale analyses.

Toedieningsweg

18.   Bij het kiezen van de weg moet(en) de weg(en) worden betrokken die het relevantste is/zijn voor menselijke blootstelling. Hoewel het protocol bedoeld is voor toediening van de teststof via het voer, kan dit worden aangepast voor toediening via andere wegen (drinkwater, maagsonde, inhalatie, dermaal), afhankelijk van de kenmerken van de stof en de vereiste informatie.

Keuze van het medium

19.   Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspendeerd. Aanbevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken en als dit niet kan een oplossing/suspensie in olie (bv. maïsolie) te overwegen. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. Het gebruik van media met potentiële intrinsieke toxiciteit moet worden vermeden (bv. aceton, DMSO). De stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald. Bij gebruik van een medium of een ander additief om toediening te vergemakkelijken, moet met de volgende factoren rekening worden gehouden: effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken daarvan kunnen veranderen, en effecten op de voedsel- of waterconsumptie of de voedingsstatus van de dieren.

Keuze van de dosis

20.   Normaliter moet het onderzoek ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige controle omvatten. Bij het kiezen van de juiste dosisniveaus moet de onderzoeker rekening houden met alle beschikbare informatie, waaronder de toedieningsinformatie van eerdere onderzoeken, TK-gegevens van drachtige en niet-drachtige dieren, de mate van uitscheiding in de moedermelk en schattingen van de menselijke blootstelling. Als er TK-gegevens beschikbaar zijn die wijzen op dosisafhankelijke verzadiging van TK-processen, moet erop worden gelet hoge dosisniveaus die duidelijk verzadiging vertonen te vermijden, mits uiteraard menselijke blootstellingen naar verwachting ruim onder dat verzadigingspunt liggen. In dat geval moet het hoogste dosisniveau op of net boven het buigpunt voor overgang naar niet-lineair TK-gedrag liggen.

21.   Bij afwezigheid van relevante TK-gegevens moeten de dosisniveaus gebaseerd zijn op toxische effecten, tenzij de fysisch-chemische aard van de teststof dit beperkt. Als de dosisniveaus gebaseerd zijn op toxiciteit, moet de hoogste dosis zodanig worden gekozen, dat enige systemische toxiciteit geïnduceerd wordt, maar geen sterfte of ernstig lijden van de dieren.

22.   Er moet een dalende reeks dosisniveaus worden gekozen om een eventueel dosisgerelateerd effect aan te kunnen tonen en NOAEL's of doses nabij de detectiegrens te kunnen bepalen waarmee een benchmarkdosis kan worden afgeleid voor het/de gevoeligste eindpunt(en). Om grote dosisintervallen tussen NOAEL's en LOAEL's te voorkomen, zijn intervallen van een factor twee tot vier vaak optimaal. Het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan een zeer groot interval (bv. meer dan een factor tien) tussen de doseringen te gebruiken.

23.   Afgezien van de behandeling met de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Deze groep wordt niet behandeld of krijgt placebo of krijgt, als bij de toediening van de teststof een medium wordt gebruikt, medium toegediend. Indien van een medium gebruik wordt gemaakt, dient dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend te worden.

Grenstest

24.   Als er bij een dosis van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag in onderzoeken met herhaalde toediening geen aanwijzingen zijn voor toxiciteit of als geen toxiciteit wordt verwacht op grond van gegevens van qua structuur en/of metabolisme verwante stoffen, die wijzen op vergelijkbare metabole eigenschappen in vivo/in vitro, is een onderzoek met verscheidene dosisniveaus wellicht niet noodzakelijk. In dat geval moet het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie worden uitgevoerd met een controlegroep en een enkele dosis van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag. Worden er bij deze grensdosis echter aanwijzingen gevonden voor reproductie- of ontwikkelingstoxiciteit, dan zijn verdere onderzoeken bij lagere dosisniveaus noodzakelijk om een NOAEL vast te kunnen stellen. Deze overwegingen omtrent de grenstest zijn alleen van toepassing wanneer de menselijke blootstelling niet duidt op de noodzaak van een hoger dosisniveau.

PROCEDURES

Blootstelling van nakomelingen

25.   Blootstelling via het voer is de toedieningsmethode die de voorkeur verdient. Bij onderzoeken met maagsondes moet worden opgemerkt dat de jongen normaliter de teststof alleen indirect binnenkrijgen, via de melk, totdat voor hen de directe toediening start vanaf de spening. In onderzoeken met toediening via voer of drinkwater krijgen de jongen daarnaast de teststof direct binnen wanneer ze zelf gaan eten tijdens de laatste week van de zoogperiode. Het moet worden overwogen de onderzoeksopzet aan te passen wanneer de mate van uitscheiding van de teststof in melk laag is en wanneer er onvoldoende aanwijzingen zijn voor continue blootstelling van de nakomelingen. In dat geval moet directe toediening van jongen tijdens de zoogperiode worden overwogen op grond van beschikbare TK-informatie, toxiciteit bij nakomelingen of veranderingen in biomarkers (3) (4). De voor- en nadelen moeten zorgvuldig overwogen worden alvorens onderzoeken uit te voeren met directe toediening aan jongen die worden gezoogd (5).

Doseringsschema en toediening van doses

26.   Uit eerdere toxiciteitsonderzoeken met herhaalde toediening met een toereikende duur kan bepaalde informatie over oestruscycli, histopathologie van het mannelijke en vrouwelijke voortplantingssysteem en testiculaire/epididymale sperma-analyse beschikbaar zijn. De duur van de behandeling vóór paring in het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie is er daarom op gericht effecten op functionele veranderingen te detecteren die kunnen interfereren met paringsgedrag en bevruchting. De behandeling vóór paring moet lang genoeg zijn om steady-state blootstellingsomstandigheden te bereiken bij P-mannetjes en -vrouwtjes. In de meeste gevallen wordt voor beide geslachten een twee weken durende behandeling vóór paring toereikend geacht. Voor vrouwtjes beslaat dit 3-4 volledige oestruscycli, wat voldoende moet zijn voor de detectie van eventuele schadelijke effecten op de cyclus. Voor mannetjes is dit gelijkwaardig aan de tijd die nodig is voor epididymale doorvoer van rijpende spermatozoa en kunnen hierin post-testiculaire effecten op sperma gedetecteerd worden (tijdens de eindfasen van spermiatie en epididymale spermarijping) bij de paring. Aan het einde van het onderzoek, wanneer testiculaire en epididymale histopathologie en analyse van spermaparameters staan ingepland, zijn de P- en F1-mannetjes blootgesteld geweest gedurende ten minste één volledig spermatogeneseproces ((6) (7) (8) (9) en OESO-leidraad nr. 151 (40)).

27.   Blootstellingsscenario's vóór paring voor mannetjes kunnen worden aangepast indien in eerdere onderzoeken testiculaire toxiciteit (verstoorde spermatogenese) of effecten op de integriteit en functie van sperma duidelijk zijn vastgesteld. Evenzo kunnen voor vrouwtjes bekende effecten van de teststof op de oestruscyclus en dus op de seksuele ontvankelijkheid verschillende blootstellingsscenario's vóór paring rechtvaardigen. In speciale gevallen kan het aanvaardbaar zijn de behandeling van de P-vrouwtjes pas te starten na een spermapositief uitstrijkje (zie OESO-leidraad nr. 151 (40)).

28.   Na vaststelling van de doseringsperiode vóór paring moeten de dieren continu, zeven dagen per week tot aan de obductie, met de teststof worden behandeld. De toedieningsmethode moet voor alle dieren hetzelfde zijn. De toediening moet doorgaan tijdens de twee weken durende paringsperiode en voor P-vrouwtjes gedurende de dracht en zoogperiode tot de dag van het einde na spening. Mannetjes moeten op dezelfde manier worden behandeld tot het einde op het moment dat de F1-dieren worden gespeend. Voor de obductie moet prioriteit moet worden gegeven aan vrouwtjes waarop op (ongeveer) dezelfde zoogdag obductie moet worden verricht. De obductie van mannetjes kan over een groter aantal dagen worden verspreid, afhankelijk van de laboratoriumfaciliteiten. Tenzij er al mee gestart is tijdens de zoogperiode, moet de directe toediening van de geselecteerde F1-mannetjes en -vrouwtjes beginnen bij de spening en doorgaan tot de ingeplande obductie, afhankelijk van de cohorttoewijzing.

29.   Wanneer stoffen via de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren met de normale voedings- of waterbalans. Wanneer de teststof via het voer wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van het dier worden gebruikt; de gekozen mogelijkheid moet gespecificeerd worden.

30.   Wanneer de teststof via een maagsonde wordt toegediend, mag de in één keer toegediende hoeveelheid vloeistof normaliter niet meer zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht (maximaal 0,4 ml/100 g lichaamsgewicht voor olie, bv. maïsolie). Behalve bij irriterende of bijtende stoffen, die normaliter bij hogere concentraties hevigere effecten hebben, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat er bij alle dosisniveaus hetzelfde volume wordt toegediend. De behandeling moet elke dag op hetzelfde tijdstip worden gegeven. De dosis voor elk dier moet gewoonlijk gebaseerd zijn op de meest recente individuele lichaamsgewichtsbepaling en ten minste wekelijks worden aangepast bij volwassen mannetjes en volwassen niet-drachtige vrouwtjes en elke twee dagen bij drachtige vrouwtjes en F1-dieren tijdens de toedieningsperiode vóór spening en de twee weken na spening. Als TK-gegevens wijzen op een lage overdracht van de teststof via de placenta, moet de dosis via de maagsonde tijdens de laatste week van de dracht mogelijk worden aangepast om te voorkomen dat het moederdier een te grote toxische dosis krijgt. De behandeling van vrouwtjes mag op de dag van werpen niet plaatsvinden via een maagsonde of een andere weg waarbij het dier moet worden behandeld; het verdient de voorkeur toediening van de teststof die dag over te slaan om het geboorteproces niet te verstoren.

Paring

31.   Elk P-vrouwtje moet worden geplaatst met één willekeurig geselecteerd niet-verwant mannetje uit dezelfde dosisgroep (1:1-koppels) tot observatie van aanwijzingen voor copulatie of nadat twee weken zijn verstreken. Bij een ontoereikend aantal mannetjes, bijvoorbeeld als gevolg van sterfte van mannetjes vóór de koppeling, kan/kunnen (een) mannetje(s) die al gepaard heeft/hebben worden gekoppeld (1:1) met een tweede vrouwtje, zodat alle vrouwtjes gekoppeld worden. Dag 0 van de dracht wordt gedefinieerd als de dag waarop aanwijzingen voor paring worden bevestigd (observatie van een vaginale plug en/of sperma). De dieren moeten zo snel mogelijk worden gescheiden na observatie van aanwijzingen voor copulatie. Als na twee weken geen paring heeft plaatsgevonden, worden de dieren gescheiden zonder nog mogelijkheid te geven voor paring. Gegevens over paringskoppels moeten duidelijk geregistreerd worden.

Nestgrootte

32.   Op dag 4 na de geboorte kan de grootte van de nesten worden aangepast door eliminatie van extra jongen door willekeurige selectie, zodat elk nest uiteindelijk zoveel mogelijk bestaat uit vijf mannetjes en vijf vrouwtjes. Selectieve eliminatie van jongen, bijvoorbeeld op grond van lichaamsgewicht, is niet gepast. Als het door het aantal mannelijke of vrouwelijke jongen niet mogelijk is om op vijf per geslacht per nest uit te komen, is gedeeltelijke aanpassing (bv. zes mannetjes en vier vrouwtjes) aanvaardbaar.

Selectie van jongen voor onderzoek na spening (zie figuur 1)

33.   Bij de spening (omstreeks PND 21) worden jongen van alle beschikbare nesten tot 20 per dosis- en controlegroep geselecteerd voor verdere onderzoeken en aangehouden tot de geslachtsrijping (tenzij eerder testen noodzakelijk is). De jongen worden willekeurig geselecteerd, behalve dat duidelijk ondermaatse dieren (dieren met een lichaamsgewicht dat meer dan twee standaarddeviaties onder het gemiddelde gewicht van de jongen van het desbetreffende nest ligt) niet mogen worden opgenomen omdat dit geen representatieve exemplaren van de behandelgroep kunnen zijn.

Op PND 21 worden de geselecteerde F1-jongen als volgt willekeurig toegewezen aan een van drie dierencohorten:

cohort 1 (1A en 1B)= testen op reproductie/ontwikkelingstoxiciteit,

cohort 2 (2A en 2B)= testen op ontwikkelingsneurotoxiciteit,

cohort 3= testen op ontwikkelingsimmunotoxiciteit.

Cohort 1A: één mannetje en één vrouwtje/nest/groep (20/geslacht/groep): voorkeursselectie voor primaire beoordeling van effecten op voortplantingssystemen en van algemene toxiciteit.

Cohort 1B: één mannetje en één vrouwtje/nest/groep (20/geslacht/groep): voorkeursselectie voor follow-upbeoordeling van het voortplantingsvermogen door F1-dieren te paren als deze beoordeeld zijn (zie OESO-leidraad nr. 117 (39)) en om aanvullende histopathologische gegevens te verkrijgen in geval van stoffen die worden verdacht van toxiciteit voor de voortplanting of het hormoonsysteem, of wanneer de resultaten van cohort 1A onduidelijk zijn.

Cohort 2A: in totaal 20 jongen per groep (10 mannetjes en 10 vrouwtjes per groep; één mannetje of één vrouwtje per nest), toegewezen voor neurogedragstesten gevolgd door neurohistopathologische beoordeling als volwassenen.

Cohort 2B: in totaal 20 jongen per groep (10 mannetjes en 10 vrouwtjes per groep; één mannetje of één vrouwtje per nest), toegewezen voor neurohistopathologische beoordeling bij de spening (PND 21 of PND 22). Bij een ontoereikend aantal dieren verdient het de voorkeur dieren toe te wijzen aan cohort 2A.

Cohort 3: in totaal 20 jongen per groep (10 mannetjes en 10 vrouwtjes per groep; één per nest, waar mogelijk). Mogelijk zijn extra jongen uit de controlegroep nodig om te fungeren als positieve-controledieren in de T-cel-afhankelijke antilichaamresponstest (TDAR) op PND 56 ± 3.

34.   Als het aantal jongen in een nest ontoereikend is om alle cohorten te kunnen vullen, heeft cohort 1 voorrang omdat deze cohort kan worden uitgebreid door productie van een F2-generatie. In geval van een specifiek probleem, bv. als een stof wordt verdacht van neurotoxiciteit, immunotoxiciteit of reproductietoxiciteit, kunnen aanvullende jongen worden toegewezen aan een van de cohorten. Deze jongen kunnen worden gebruikt voor onderzoeken op verschillende tijdspunten of voor de beoordeling van aanvullende eindpunten. Jongen die niet aan cohorten zijn toegewezen, worden onderworpen aan klinisch biochemisch onderzoek (punt 55) en macroscopische obductie (punt 68).

Tweede paring van de P-dieren

35.   Voor de P-dieren wordt een tweede paring gewoonlijk niet aanbevolen omdat dit ten koste gaat van belangrijke informatie over het aantal innestelingsplaatsen (en dus ten koste van gegevens over postinnestelings- en perinatale verliezen, indicatoren van een mogelijk teratogeen potentieel) voor het eerste nest. Als het nodig is een effect bij blootgestelde vrouwtjes te verifiëren of te verhelderen, kan het onderzoek beter uitgebreid worden met een paring van de F1-generatie. Een tweede paring van de P-mannetjes met onbehandelde vrouwtjes is echter altijd een mogelijkheid om onduidelijke bevindingen te verhelderen of voor verdere karakterisering van bij de eerste paring waargenomen effecten op de vruchtbaarheid.

OBSERVATIES BIJ LEVENDE DIEREN

Klinische observaties

36.   Voor de P- en de geselecteerde F1-dieren wordt eenmaal daags een algemene klinische observatie verricht. In geval van toediening via een maagsonde moeten de klinische observaties vóór en na toediening plaatsvinden (vanwege mogelijke verschijnselen van toxiciteit samenhangend met piek-plasmaconcentratie). Relevante gedragsveranderingen, verschijnselen van moeilijke of langdurige worp en alle verschijnselen van toxiciteit worden geregistreerd. Tweemaal daags, tijdens het weekend eenmaal daags, worden alle dieren geobserveerd op ernstige toxiciteit, ziekelijkheid en sterfte.

37.   Daarnaast worden alle P- en F1-dieren wekelijks uitgebreider onderzocht (na spening). Het is handig dit te doen op het moment dat het dier wordt gewogen, om stress van vastpakken tot een minimum te beperken. De observaties moeten zorgvuldig worden verricht en geregistreerd met scoringssystemen die zijn gedefinieerd door het testlaboratorium. Er moet zoveel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de testomstandigheden minimaal zijn. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraaien) of bizar gedrag (bv. zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend.

Lichaamsgewicht en consumptie van voedsel en water

38.   Op de eerste toedieningsdag en ten minste wekelijks daarna worden de P-dieren gewogen. Daarnaast worden P-vrouwtjes gewogen tijdens de zoogperiode op dezelfde dagen dat de jongen in hun nesten worden gewogen (zie punt 44). Alle F1-dieren worden elk apart gewogen bij de spening (PND 21) en ten minste wekelijks daarna. Het lichaamsgewicht wordt ook geregistreerd op de dag dat ze in de pubertijd komen (volledige loslating van de voorhuid of opening van de vagina). Alle dieren worden gewogen op het moment dat ze worden gedood.

39.   Tijdens het onderzoek wordt de voedsel- en waterconsumptie (bij toediening van de teststof via het drinkwater) ten minste wekelijks geregistreerd op dezelfde dagen als de lichaamsgewichten (behalve tijdens cohabitatie). De voedselconsumptie van elke kooi met F1-dieren wordt wekelijks geregistreerd vanaf de selectie tot een bepaalde cohort.

Oestruscycli

40.   Uit eerdere toxiciteitsonderzoeken met herhaalde toediening kan al voorlopige informatie over teststof-gerelateerde effecten op de oestruscyclus beschikbaar zijn, die kan worden gebruikt bij het opzetten van een teststof-specifiek protocol voor het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie. De beoordeling van de oestruscyclus (door vaginale cytologie) start gewoonlijk bij het begin van de behandelperiode en duurt tot paring bevestigd is of tot het einde van de twee weken durende paringsperiode. Als vrouwtjes zijn gescreend op normale oestruscycli vóór de behandeling, is het nuttig uitstrijkjes te blijven maken als de behandeling start, maar als er bezorgdheid bestaat over niet-specifieke effecten bij de start van de behandeling (zoals een initiële duidelijk verminderde voedselconsumptie), kunnen de dieren gedurende maximaal twee weken vóór de start van de twee weken durende uitstrijkjesperiode voorafgaand aan de koppeling op behandeling worden gezet. Als de behandelperiode voor vrouwtjes op deze wijze wordt verlengd (d.w.z. tot een behandeling vóór paring van vier weken), moet worden overwogen jongere dieren aan te schaffen en de behandelperiode voor mannetjes vóór de koppeling te verlengen. Wanneer monsters van vaginale/cervicale cellen worden genomen, moet erop worden gelet verstoring van het slijmvlies en latere inductie van schijndracht te voorkomen (10) (11).

41.   Vaginale uitstrijkjes moeten dagelijks onderzocht worden voor alle F1-vrouwtjes in cohort 1A na het optreden van vaginale opening tot het eerste uitstrijkje met verhoornde cellen is geregistreerd, zodat het tijdsinterval hiertussen kan worden bepaald. De oestruscycli voor alle F1-vrouwtjes in cohort 1A moeten eveneens gecontroleerd worden gedurende een periode van twee weken, vanaf ongeveer PND 75. Mocht paring van de F1-generatie noodzakelijk zijn, dan moet daarnaast de vaginale cytologie in cohort 1B worden gevolgd vanaf het moment van koppelen tot aanwijzingen voor paring zijn gedetecteerd.

Paring en dracht

42.   Naast de standaardeindpunten (bv. lichaamsgewicht, voedselconsumptie, klinische observaties zoals controles op sterfte en ziekelijkheid) worden de data van koppeling, de datum van inseminatie en de datum van werpen geregistreerd en het interval vóór coïtus (koppeling tot inseminatie) en de drachtduur (inseminatie tot bevalling) berekend. De P-vrouwtjes moeten op het verwachte moment van werpen zorgvuldig onderzocht worden op verschijnselen van dystokie. Eventuele afwijkingen in nestgedrag of zoogactiviteit moeten geregistreerd worden.

43.   De dag van werpen is zoogdag 0 (lactation day 0, LD 0) voor het moederdier en postnatale dag 0 (PND 0) voor de nakomelingen. Een andere mogelijkheid is alle vergelijkingen te baseren op de tijd na coïtus om verstoring van postnatale ontwikkelingsgegevens door verschillen in drachtduur te elimineren; de tijd ten opzichte van de worp moet echter ook geregistreerd worden. Dit is met name van belang als de teststof van invloed is op de drachtduur.

Parameters met betrekking tot de nakomelingen

44.   Elk nest moet zo snel mogelijk na de worp (PND 0 of 1) onderzocht worden om het aantal en geslacht van de jongen, doodgeborenen, levendgeborenen en de aanwezigheid van macroscopische afwijkingen (uitwendig zichtbare afwijkingen, zoals een gespleten gehemelte, onderhuidse bloedingen; afwijkende kleur of textuur van de huid, aanwezigheid van navelstreng; afwezigheid van melk in de maag; aanwezigheid van gedroogde afscheidingen) vast te stellen. Daarnaast moet het eerste klinische onderzoek van de neonaten een kwalitatieve beoordeling omvatten van de lichaamstemperatuur, activiteitstoestand en reactie op vastpakken. Jongen die dood zijn aangetroffen op PND 0 of op een later tijdstip moeten onderzocht worden op mogelijke afwijkingen en doodsoorzaak. Levende jongen worden geteld en elk apart gewogen op PND 0 of PND 1 en regelmatig daarna, bv. ten minste op PND 4, 7, 14 en 21. Klinische onderzoeken, zoals van toepassing voor de leeftijd van de dieren, moeten worden herhaald als de nakomelingen worden gewogen of vaker als bij de geboorte gevalspecifieke bevindingen zijn geconstateerd. Verschijnselen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): uitwendige afwijkingen, veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding en onwillekeurige reacties. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag of bizar gedrag moeten worden opgetekend.

45.   De anogenitale afstand (AGD) van elk jong moet ten minste één keer worden gemeten vanaf PND 0 tot en met PND 4. Het lichaamsgewicht van elk jong moet worden bepaald op de dag dat de AGD wordt gemeten en de AGD moet genormaliseerd worden tot een maat voor jonggrootte, bij voorkeur de derdemachtswortel van het lichaamsgewicht (12). De aanwezigheid van tepels/tepelhof bij mannelijke jongen moet gecontroleerd worden op PND 12 of 13.

46.   Alle geselecteerde F1-dieren worden dagelijks beoordeeld op loslaten van de voorhuid van de eikel of vaginale opening voor respectievelijk mannetjes/vrouwtjes, te beginnen vóór de verwachte dag om deze eindpunten te verkrijgen en aan de hand daarvan eventuele vroege geslachtsrijping te detecteren. Alle afwijkingen van de geslachtsorganen, zoals aanhoudende vaginale thread, hypospadie of gespleten penis, moeten worden genoteerd. De geslachtsrijpheid van F1-dieren wordt vergeleken met de lichamelijke ontwikkeling door bepaling van de leeftijd en het lichaamsgewicht bij het loslaten van de voorhuid van de eikel of de vaginale opening voor respectievelijk mannetjes/vrouwtjes (13).

Beoordeling van potentiële ontwikkelingsneurotoxiciteit (cohorten 2A en 2B)

47.   Voor neurotoxiciteitsbeoordelingen worden van elke behandelgroep 10 mannelijke en 10 vrouwelijke dieren in cohort 2A en 10 mannelijke en 10 vrouwelijke dieren in cohort 2B (voor elke cohort: 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest; alle nesten zijn met ten minste 1 jong vertegenwoordigd; willekeurig geselecteerd) gebruikt. Dieren in cohort 2A moeten worden onderworpen aan testen van de auditieve schrikreactie, „functional observational battery”, motorische activiteit (zie punten 48-50) en neuropathologische beoordelingen (zie punten 74-75). Er moet zoveel mogelijk worden gezorgd dat variaties in alle testomstandigheden minimaal zijn en niet systematisch samenhangen met de behandeling. Variabelen die van invloed kunnen zijn op gedrag zijn geluidsniveau (bv. intermitterend geluid), temperatuur, vochtigheid, verlichting, geuren, tijdstip van de dag en afleiding uit de omgeving. De resultaten van neurotoxiciteitstesten moeten geïnterpreteerd worden in samenhang met passende historische controle-normaalwaarden. Dieren in cohort 2B moeten worden gebruikt voor neuropathologische beoordeling op PND 21 of PND 22 (zie punten 74-75).

48.   Met dieren in cohort 2A wordt een test van de auditieve schrikreactie gedaan op PND 24 (± één dag). De testdag moet evenwichtig worden verdeeld over de behandel- en controlegroepen. Elke sessie bestaat uit 50 onderzoeken. Bij de test van de auditieve schrikreactie moet de gemiddelde responsamplitude van elk blok van 10 onderzoeken (5 blokken van 10 onderzoeken) worden bepaald, met testomstandigheden die geoptimaliseerd zijn om te komen tot gewenning binnen een sessie. Deze procedures moeten worden uitgevoerd conform testmethode B.53 (35).

49.   Op een passend tijdstip tussen PND 63 en PND 75 worden de dieren in cohort 2A onderworpen aan een „functional observational battery” en een geautomatiseerde test van de motorische activiteit. Deze procedures moeten worden uitgevoerd conform testmethoden B.43 (33) en B.53 (35). De „functional observational battery” omvat een uitvoerige beschrijving van het uiterlijk, het gedrag en de functionele integriteit van het proefdier. Dit wordt beoordeeld door observaties in de verblijfskooi, na verplaatsing naar een standaardarena voor observatie (open veld) waarbij het dier zich vrij beweegt en door manipulatieve testen. De testen moeten worden gedaan in volgorde van minst naar meest interactieve test. In aanhangsel 1 staat een lijst met parameters. Alle dieren moeten zorgvuldig geobserveerd worden door getrainde observeerders die niet weten welke behandeling een gegeven dier krijgt met behulp van gestandaardiseerde procedures om te zorgen voor minimale observer-variabiliteit. Waar mogelijk is het raadzaam een dier in een gegeven test door steeds dezelfde observeerder te laten beoordelen. Als dit niet mogelijk is, wordt bewijs van interobserver-betrouwbaarheid vereist. Voor elke parameter in de reeks gedragstesten moeten expliciet operationeel gedefinieerde schalen en scoringscriteria worden gebruikt. Indien mogelijk moeten objectieve kwantitatieve parameters worden ontwikkeld voor observationele eindpunten, die subjectief zijn gerangschikt. Voor de motorische activiteit wordt elk dier apart getest. De testsessie moet lang genoeg duren om gewenning binnen een sessie voor controles aan te kunnen tonen. De motorische activiteit moet worden gecontroleerd met een geautomatiseerd activiteitsregistratieapparaat dat zowel toenames als afnames in activiteit moet kunnen detecteren (d.w.z. de door het apparaat gemeten activiteit op baseline moet niet zo laag zijn dat afnames niet kunnen worden gedetecteerd en ook niet zo hoog dat toenames in activiteit niet kunnen worden gedetecteerd). Elk apparaat moet volgens standaardprocedures worden getest om een betrouwbare werking van alle apparaten op alle dagen te waarborgen, voor zover mogelijk. De behandelgroepen moeten zoveel mogelijk evenwichtig worden verdeeld over de apparaten. De behandelgroepen moeten evenwichtig worden verspreid over de testtijden om verstoring te vermijden door circadiaanse activiteitritmes.

50.   Als uit bestaande informatie blijkt dat andere functietesten noodzakelijk zijn (bv. sensorisch, sociaal, cognitief), moet de integratie ervan plaatsvinden zonder dat dit ten koste gaat van de integriteit van de andere beoordelingen in het onderzoek. Als deze testen worden verricht bij dezelfde dieren als voor het testen van de standaard auditieve schrikreactie, „functional observational battery” en motorische activiteit, moeten verschillende testen worden ingepland om het risico dat dit ten koste gaat van de integriteit van deze testen tot een minimum te beperken. Aanvullende procedures kunnen vooral nuttig zijn als empirische waarnemingen, verwachte effecten of mechanistische effecten/het werkingsmechanisme duiden op een bepaalde neurotoxiciteit.

Beoordeling van potentiële ontwikkelingsimmunotoxiciteit (cohort 3)

51.   Op PND 56 (± drie dagen) moeten van elke behandelgroep 10 mannelijke en 10 vrouwelijke dieren in cohort 3 (1 mannetje of 1 vrouwtje per nest; alle nesten zijn met ten minste 1 jong vertegenwoordigd; willekeurig geselecteerd) worden gebruikt in een test van de T-cel-afhankelijke antilichaamrespons, d.w.z. de primaire respons van IgM-antilichaam op een T-celafhankelijk antigeen, zoals Sheep Red Blood Cells (SRBC) of Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), conform de huidige procedures voor immunotoxiciteittesten (14) (15). De respons kan worden beoordeeld door telling van specifieke plaquevormende cellen (PFC) in de milt of door bepaling van de titer van SRBC- of KLH-specifiek IgM-antilichaam in het serum door middel van ELISA op de piek van de respons. De piek van de respons treedt doorgaans vier (PFC-respons) of vijf (ELISA) dagen op na intraveneuze immunisatie. Als de primaire antilichaamrespons wordt getest door telling van plaquevormende cellen is beoordeling van subgroepen van dieren op afzonderlijke dagen toegestaan, mits: het tijdstip van immunisatie en doding van de subgroepen zo valt, dat PFC's worden geteld op de piek van de respons; de subgroepen een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke nakomelingen uit alle dosisgroepen bevatten, met inbegrip van controles, en de subgroepen worden beoordeeld op ongeveer dezelfde postnatale leeftijd.Blootstelling aan de teststof duurt voort tot de dag vóór verzameling van milten voor de PFC-respons of serum voor de ELISA-test.

Follow-upbeoordeling van potentiële reproductietoxiciteit (cohort 1B)

52.   Indien nodig kunnen dieren in cohort 1B worden doorbehandeld na PND 90 om er een F2-generatie mee te fokken. Mannetjes en vrouwtjes van dezelfde dosisgroep moeten samen worden ondergebracht (waarbij samenplaatsing van siblings wordt voorkomen) gedurende maximaal twee weken, en wel vanaf of na PND 90, maar niet tot na PND 120. De procedures moeten op vergelijkbare wijze verlopen als voor de P-dieren. Op grond van bewijskracht kan het echter volstaan de nesten te beëindigen op PND 4 in plaats van ze te volgen tot de spening of daarna.

OBSERVATIES AAN EINDE ONDERZOEK

Biochemisch onderzoek/hematologie

53.   Bij de P-dieren moeten systemische effecten worden gecontroleerd. Aan het einde worden van 10 willekeurig geselecteerde nuchtere P-mannetjes en -vrouwtjes per dosisgroep bloedmonsters genomen van een gedefinieerde plaats, die onder de juiste omstandigheden worden bewaard en worden onderworpen aan gedeeltelijke of volledige hematologische en klinisch-biochemische bepalingen, T4- en TSH-test of andere onderzoeken die aangewezen zijn op basis van het bekende effectprofiel van de teststof (zie OESO-leidraad nr. 151 (40)). De volgende hematologische parameters moeten worden onderzocht: hematocriet, hemoglobinegehalte, aantal rode bloedcellen, totaal aantal en gedifferentieerde aantallen witte bloedcellen, aantal bloedplaatjes en bloedstollingstijd/vermogen. Onderzoeken van plasma of serum moeten bestaan uit: glucose, totaal cholesterol, ureum, creatinine, totaal eiwit, albumine en ten minste twee enzymen die indicatief zijn voor hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotranferase, aspartaataminotransferase, alkalisch fosfatase, gammaglutamyltranspeptidase en sorbitoldehydrogenase). Bepaling van andere enzymen en galzuren kan onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven. Daarnaast kan bloed van andere dieren worden afgenomen en bewaard voor mogelijke analyse op een later moment om onduidelijke effecten te helpen verhelderen of om gegevens over inwendige blootstelling te verkrijgen. Als er geen tweede paring van P-dieren gepland staat, worden de bloedmonsters genomen vlak vóór of als onderdeel van de procedure bij het ingeplande doden van dieren. In het geval dat de dieren behouden blijven, moeten enkele dagen vóór men de dieren voor de tweede keer laat paren bloedmonsters worden verzameld. Tenzij uit bestaande gegevens van onderzoeken met herhaalde toediening blijkt dat de parameter niet wordt beïnvloed door de teststof, moet vóór het einde urineonderzoek worden gedaan met beoordeling van de volgende parameters: uiterlijk, volume, osmolaliteit of soortelijk gewicht, pH, eiwit, glucose, bloed en bloedcellen, celdébris. Urine kan ook worden verzameld om de uitscheiding van de teststof en/of metaboliet(en) te controleren.

54.   Systemische effecten moeten ook gecontroleerd worden bij de F1-dieren. Aan het einde worden van 10 willekeurig geselecteerde nuchtere mannetjes en vrouwtjes in cohort 1A per dosisgroep bloedmonsters genomen van een gedefinieerde plaats, die onder de juiste omstandigheden worden bewaard en worden onderworpen aan standaard klinisch-biochemische bepalingen, waaronder de beoordeling van serumspiegels van schildklierhormonen (T4 en TSH), hematologie (totaal aantal en gedifferentieerde aantallen witte bloedcellen plus aantal rode bloedcellen) en urineonderzoek.

55.   Op de overtollige jongen op PND 4 wordt macroscopische obductie verricht en bepaling van schildklierhormoon- (T4) concentraties in serum dient overwogen te worden. Indien nodig kan neonataal (PND 4) bloed per nest worden samengevoegd voor biochemische/schildklierhormoonanalyses. Er wordt ook bloed afgenomen voor T4-en TSH-analyse van gespeende dieren tot de macroscopische obductie op PND 22 (F1-jongen die niet geselecteerd zijn voor cohorten).

Spermaparameters

56.   Bij alle mannetjes van de P-generatie moeten de spermaparameters worden bepaald, tenzij uit bestaande gegevens blijkt dat de spermaparameters niet worden beïnvloed in een 90 dagen durend onderzoek. Het onderzoek van de spermaparameters moet worden verricht bij alle mannetjes in cohort 1A.

57.   Aan het einde worden voor alle P- en F1-mannetjes (cohort 1A) de teelbal- en bijbalgewichten geregistreerd. Ten minste één teelbal en één bijbal worden gereserveerd voor histopathologisch onderzoek. De resterende bijbal wordt gebruikt voor de telling van spermareserves in de cauda epididymis (16) (17). Daarnaast wordt sperma verzameld uit de cauda epididymis (of zaadleider) via methoden waarbij schade voor beoordeling van de motiliteit en morfologie (18) van het sperma tot een minimum beperkt wordt.

58.   De spermamotiliteit kan onmiddellijk na het doden beoordeeld worden of geregistreerd worden voor latere analyse. Het percentage progressief beweeglijk sperma kan subjectief worden bepaald, of objectief door middel van geautomatiseerde bewegingsanalyse (19) (20) (21) (22) (23) (24). Voor de beoordeling van de morfologie van het sperma moet een monster van sperma uit de bijbal (of zaadleider) onderzocht worden als gefixeerde of natte preparaten (25) en moeten ten minste 200 spermatozoa per monster worden ingedeeld als normaal (zowel de kop als het middendeel/staart ziet er normaal uit) of abnormaal. Voorbeelden van morfologische sperma-afwijkingen zijn fusie, geïsoleerde koppen en misvormde koppen en/of staarten (26). Misvormde of grote spermakoppen kunnen wijzen op afwijkingen in de spermiatie.

59.   Na invriezen van spermamonsters, fixatie van preparaten en registratie van beelden voor spermamotiliteitanalyse op het moment van obductie (27), kan latere analyse worden beperkt tot controle- en hogedosismannetjes. Indien echter behandelingsgerelateerde effecten worden waargenomen, moeten de lagedosisgroepen eveneens worden beoordeeld.

Macroscopische obductie

60.   Bij beëindiging van het onderzoek of na voortijdige sterfte wordt op alle P- en F1-dieren obductie verricht en worden ze macroscopisch onderzocht op structuurafwijkingen of pathologische veranderingen. Bijzondere aandacht moet worden geschonken aan de organen van het voortplantingssysteem. Jongen die om humane redenen in stervende toestand zijn gedood en dode jongen moeten geregistreerd en, wanneer er geen sprake is van maceratie, onderzocht op mogelijke afwijkingen en/of doodsoorzaak en geconserveerd worden.

61.   Voor volwassen P- en F1-vrouwtjes wordt een vaginaal uitstrijkje onderzocht op de dag van obductie om de fase van de oestruscyclus te bepalen en dit in verband te kunnen brengen met de histopathologie in de voortplantingsorganen. De baarmoeders van alle P-vrouwtjes (en F1-vrouwtjes, indien van toepassing) worden onderzocht op de aanwezigheid van innestelingsplaatsen en het aantal ervan, en wel zodanig dat dit geen belemmering vormt voor histopathologische beoordeling.

Gewicht van organen en conservering van weefsels — volwassen P- en F1-dieren

62.   Aan het einde van het onderzoek worden van alle P-dieren en alle volwassen F1-dieren uit relevante cohorten (zoals hieronder vermeld) lichaamsgewichten en natte gewichten van de onderstaande organen bepaald. Dit dient zo snel mogelijk na excisie te gebeuren om uitdroging te voorkomen. Deze organen worden vervolgens onder passende omstandigheden geconserveerd. Tenzij anders vermeld kunnen dubbele organen afzonderlijk of samen worden gewogen, al naargelang van de gebruikelijke praktijk van het uitvoerende laboratorium.

—	baarmoeder (met eileiders en baarmoederhals), eierstokken,

—	teelballen, bijballen (totaal en cauda epididymis voor de monsters voor spermatellingen),

—

prostaat (dorsolaterale en ventrale delen gecombineerd). Het prostaatcomplex moet voorzichtig worden ontdaan van aanhechtend weefsel om te voorkomen dat de met vloeistof gevulde zaadblaasjes lek raken. In het geval van een behandelingsgerelateerd effect op het totale prostaatgewicht, moeten de dorsolaterale en ventrale segmenten na fixatie voorzichtig worden uitgesneden en apart worden gewogen,

—	zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klieren en het vocht erin (als één geheel),

—	hersenen, lever, nieren, hart, milt, thymus, hypofyse, schildklier (na fixatie), bijnieren en bekende doelorganen of -weefsels.

63.   Naast de bovenstaande organen moeten monsters van perifere zenuwen, spieren, ruggenmerg, ogen plus oogzenuw, maag-darmkanaal, blaas, long, luchtpijp (met schildklier en bijschildklier eraan bevestigd), beenmerg, zaadleiders (mannetjes), borstklier (mannetjes en vrouwtjes) en de vagina geconserveerd worden onder passende omstandigheden.

64.   Van dieren in cohort 1A worden alle organen gewogen en geconserveerd voor histopathologie.

65.   Voor onderzoek van pre- en postnataal geïnduceerde immunotoxische effecten wordt met 10 mannelijke en 10 vrouwelijke dieren in cohort 1A van elke behandelgroep (1 mannetje of 1 vrouwtje per nest; alle nesten zijn met ten minste 1 jong vertegenwoordigd; willekeurig geselecteerd) aan het einde het volgende verricht:

—	wegen van de lymfeklieren die verband houden met de blootstellingsweg en zich op afstand daarvan bevinden (naast de reeds uitgevoerde gewichtsbepaling van de bijnieren, de thymus en de milt bij alle dieren in cohort 1A),

—	analyse van subpopulaties van miltlymfocyten (CD4+ en CD8+ T-lymfocyten, B-lymfocyten en naturalkillercellen), waarbij één helft van de milt wordt gebruikt en de andere helft van de milt wordt geconserveerd voor histopathologische beoordeling.

Uit analyse van subpopulaties van miltlymfocyten bij niet-geïmmuniseerde (cohort 1A) dieren is te bepalen of de blootstelling gerelateerd is aan een verschuiving in de immunologische steady state distributie van „helper”-lymfocyten (CD4+) of cytotoxische (CD8+), van de thymus afkomstige lymfocyten of naturalkiller- (NK) cellen (snelle responsen op neoplastische cellen en pathogenen).

66.   Van dieren in cohort 1B worden de volgende organen gewogen en de corresponderende weefsels ervan verwerkt tot blokken:

—	vagina (niet gewogen),

—	baarmoeder met baarmoederhals,

—	eierstokken,

—	teelballen (ten minste één),

—	epididymides,

—	zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klieren,

—

prostaat,

—

hypofyse,

—	vastgestelde doelorganen.

Histopathologie in cohort 1B wordt verricht indien de resultaten van cohort 1A twijfelachtig zijn of in geval van stoffen die worden verdacht van toxiciteit voor de voortplanting of het hormoonsysteem.

67.   Cohorten 2A en 2B: testen op ontwikkelingsneurotoxiciteit (PND 21 of PND 22 en volwassen nakomelingen). Dieren in cohort 2A worden afgemaakt na gedragstesten, met registratie van hersengewicht en volledige neurohistopathologie ten behoeve van neurotoxiciteitsbeoordeling. Dieren in cohort 2B worden afgemaakt op PND 21 of PND 22, met registratie van hersengewicht en microscopisch onderzoek van de hersenen ten behoeve van neurotoxiciteitsbeoordeling. Perfusiefixatie is vereist voor dieren in cohort 2A en eventueel voor dieren in cohort 2B, zie testmethode B.53 (35).

Gewicht van organen en conservering van weefsels — gespeende F1-dieren

68.   De jongen die niet geselecteerd zijn voor cohorten, met inbegrip van ondermaatse dieren, worden afgemaakt na spening, op PND 22, tenzij uit de resultaten blijkt dat verder onderzoek bij levende dieren noodzakelijk is. Op de afgemaakte jongen wordt macroscopische obductie verricht, waaronder een beoordeling van de voortplantingsorganen, zoals beschreven in punten 62 en 63. Van maximaal 10 jongen per geslacht per groep uit zoveel mogelijk nesten moeten de hersenen, milt en thymus worden gewogen en onder de juiste omstandigheden worden bewaard. Daarnaast kan van deze mannelijke en vrouwelijke jongen borstweefsel geconserveerd worden voor nadere microscopische analyse (13) (zie OESO-leidraad nr. 151 (40)). Macroscopische afwijkingen en doelweefsels moeten worden bewaard voor mogelijk histologisch onderzoek.

Histopathologie — P-dieren

69.   Voor alle hogedosis- en controle-P-dieren wordt volledige histopathologie van de in punten 62 en 63 vermelde organen verricht. Organen die behandelingsgerelateerde veranderingen vertonen, moeten ook worden onderzocht bij alle dieren in de lagedosisgroepen om een NOAEL te helpen bepalen. Daarnaast moeten voortplantingsorganen van alle dieren bij wie vermoeden bestaat van verminderde vruchtbaarheid, bv. dieren die niet paarden of drachtig werden of geen nakomelingen verwekten of gezonde nakomelingen voortbrachten of waarvan de oestruscyclus of het aantal, de motiliteit of de morfologie van de spermatozoa negatief was beïnvloed, en alle macroscopische letsels worden onderworpen aan histopathologische evaluatie.

Histopathologie — F1-dieren

Dieren in cohort 1

70.   Voor alle hogedosis- en volwassen controledieren in cohort 1A wordt een volledig histopathologisch onderzoek van de in punten 62 en 63 vermelde organen verricht. Alle nesten moeten met ten minste 1 jong per geslacht vertegenwoordigd zijn. Organen en weefsels die behandelingsgerelateerde veranderingen vertonen en alle macroscopische letsels moeten ook worden onderzocht bij alle dieren in de lagedosisgroepen om een NOAEL te helpen bepalen. Voor de beoordeling van pre- en postnataal geïnduceerde effecten op de lymfeorganen moet ook de histopathologie van de verzamelde lymfeklieren en het verzamelde beenmerg worden beoordeeld van 10 mannelijke en 10 vrouwelijke dieren in cohort 1A, naast de reeds verrichte histopathologische beoordeling van de thymus, milt en bijnieren bij alle dieren in cohort 1A.

71.   Voortplantings- en hormonale weefsels van alle dieren in cohort 1B, verwerkt tot blokken zoals beschreven in punt 66, moeten histopathologisch worden onderzocht in geval van stoffen die worden verdacht van toxiciteit voor de voortplanting of het hormoonsysteem. Cohort 1B moet ook histologisch onderzocht worden bij twijfelachtige resultaten van cohort 1A.

72.   Eierstokken van volwassen vrouwtjes moeten primordiale en groeiende follikels alsook corpora lutea bevatten. Een histopathologisch onderzoek moet daarom gericht zijn op het vaststellen van een kwantitatieve beoordeling van primordiale en kleine groeiende follikels alsook corpora lutea bij F1-vrouwtjes; het aantal dieren, de keuze van de eierstokcoupe en de grootte van het coupemonster moeten statistisch passend zijn voor de gebruikte beoordelingsprocedure. De telling van follikels kan eerst worden uitgevoerd bij de controle- en hogedosisdieren en in het geval van een schadelijk effect bij de laatstgenoemde, moeten lagedosisdieren worden onderzocht. Het onderzoek moet bestaan uit telling van het aantal primordiale follikels en kan worden gecombineerd met de telling van kleine groeiende follikels ter vergelijking van behandelde en controle-eierstokken (zie OESO-leidraad nr. 151 (40)). Beoordeling van de corpora lutea moet parallel aan het testen van de oestruscyclus worden uitgevoerd, zodat de cyclusfase in de beoordeling kan worden meegenomen. Er wordt onderzocht of de eileiders, baarmoeder en vagina op de juiste, orgaantypische wijze zijn ontwikkeld.

73.   Met de F1-mannetjes wordt gedetailleerd histopathologisch onderzoek van de teelballen verricht om behandelingsgerelateerde effecten op de teelbaldifferentiatie en -ontwikkeling en op de spermatogenese vast te stellen (38). Indien mogelijk moeten coupes van de rete testis onderzocht worden. Er wordt onderzocht of de caput, corpus en cauda van de bijbal en de zaadleiders op de juiste, orgaantypische wijze zijn ontwikkeld. Ook worden de parameters ervan onderzocht die voor de P-mannetjes vereist zijn.

Dieren in cohort 2

74.   Voor alle hogedosis- en controledieren in cohort 2A wordt per geslacht neurohistopathologisch onderzoek verricht na afronding van de gedragstesten (na PND 75, maar niet later dan PND 90). Per geslacht worden van alle hogedosis- en controledieren in cohort 2B de hersenen histopathologisch onderzocht op PND 21 of PND 22. Organen of weefsels die behandelingsgerelateerde veranderingen vertonen, moeten ook worden onderzocht voor de dieren in de lagedosisgroepen om een NOAEL te helpen bepalen. Voor dieren in cohort 2A en 2B wordt een aantal coupes van de hersenen onderzocht voor onderzoek van bulbus olfactorius, hersenschors, hippocampus, basale ganglia, thalamus, hypothalamus, middenhersenen (tectum, tegmentum en hersensteel), hersenstam en kleine hersenen. Alleen voor cohort 2A worden de ogen (netvlies en oogzenuw) en monsters van de perifere zenuwen, spieren en het ruggenmerg onderzocht. Alle neurohistologische procedures moeten worden uitgevoerd conform testmethode B.53 (35).

75.   Er moeten morfometrische (kwantitatieve) evaluaties worden verricht van representatieve gebieden van de hersenen (homologe coupes die zorgvuldig zijn geselecteerd op grond van betrouwbare microscopische mijlpalen) en dit kan bestaan uit lengte- en/of oppervlaktebepalingen van specifieke hersengebieden. Bij elke mijlpaal (niveau) moeten ten minste drie opeenvolgende coupes worden genomen, zodat de meest homologe en representatieve coupe voor het te beoordelen specifieke hersengebied geselecteerd kan worden. De neuropatholoog moet nauwkeurig nagaan of bepaalde voor de bepaling vervaardigde coupes homoloog zijn met andere coupes in de monsterset en daarmee geschikt zijn voor opname omdat vooral lengtebepalingen over een relatief korte afstand kunnen veranderen (28). Niet-homologe coupes mogen niet worden gebruikt. Beoogd wordt alle dieren die voor dit doel gereserveerd zijn te bemonsteren (10/geslacht/dosisniveau), maar kleinere aantallen kunnen toch toereikend zijn. Het wordt voor de doeleinden van deze testmethode echter doorgaans niet voldoende geacht monsters te nemen van minder dan zes dieren/geslacht/dosisniveau. Stereologie kan worden gebruikt om behandelingsgerelateerde effecten op parameters, zoals volume of celaantallen voor specifieke neuroanatomische gebieden, te identificeren. Bij alle aspecten van de preparatie van weefselmonsters, d.w.z. vanaf de weefselfixatie tot en met de dissectie van weefselmonsters, weefselbewerking en kleuren van de glaasjes, moet evenwichtig te werk worden gegaan, zodat elke partij representatieve monsters van elke dosisgroep bevat. Wanneer morfometrische of stereologische analyses moeten worden toegepast, moet hersenweefsel bij alle dosisniveaus op hetzelfde moment in geschikte media worden ingebed om artefacten als gevolg van krimp die kan optreden bij langdurig bewaren in fixatiemiddel te voorkomen.

RAPPORTAGE

Gegevens

76.   Gegevens worden afzonderlijk gerapporteerd en in tabelvorm samengevat. Indien van toepassing moet voor elke testgroep en elke generatie het volgende gerapporteerd worden: aantal dieren bij aanvang van de test, aantal dieren dat dood is aangetroffen tijdens de test of is gedood om humane redenen, tijdstip van sterfte of humane doding, aantal vruchtbare dieren, aantal drachtige vrouwtjes, aantal vrouwtjes dat een nest heeft geworpen en aantal dieren met verschijnselen van toxiciteit. Er moet ook een beschrijving worden gegeven van de toxiciteit, waaronder tijdstip van aanvang, duur en ernst.

77.   Numerieke resultaten moeten met behulp van een geschikte en erkende statistische methode worden geëvalueerd. De statistische methoden moeten worden gekozen als onderdeel van de onderzoeksopzet en op passende wijze niet-normale gegevens (bv. gegevens over aantallen), gecensureerde gegevens (bv. beperkte observatietijd), niet-onafhankelijkheid (bv. nesteffecten en herhaalde parameters) en ongelijke varianties behandelen. Gegeneraliseerde lineaire gemengde modellen en de dosis-responsmodellen omvatten een brede klasse van analytische instrumenten die geschikt kunnen zijn voor de gegevens die met deze testmethode worden gegenereerd. Het verslag moet voldoende informatie over de analysemethode en het gebruikte computerprogramma bevatten, zodat een onafhankelijke evaluator/statisticus de analyse (opnieuw) kan evalueren.

Evaluatie van de resultaten

78.   De bevindingen moeten geëvalueerd worden aan de hand van de waargenomen effecten, met inbegrip van obductie en microscopische bevindingen. De evaluatie omvat het verband, of het ontbreken daarvan, tussen de dosis en de aanwezigheid, incidentie en ernst van afwijkingen, waaronder macroscopische letsels. Ook moeten doelorganen, vruchtbaarheid, klinische afwijkingen, gegevens over voortplanting en nestproductie, veranderingen in lichaamsgewicht, sterfte en eventuele andere toxische effecten en effecten op de ontwikkeling worden beoordeeld. Bijzondere aandacht moet worden geschonken aan geslachtsspecifieke veranderingen. Bij beoordeling van de testresultaten moet rekening worden gehouden met de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof en, indien beschikbaar, TK-gegevens, zoals overdracht via de placenta en uitscheiding in de melk.

Testverslag

79.   In het testverslag moet de volgende informatie die in het onderhavige onderzoek is verkregen van P-, F1- en F2-dieren aan de orde komen (voor zover relevant):

Teststof:

—	alle relevante beschikbare informatie over de stof, toxicokinetische en toxicodynamische eigenschappen van de teststof,

—	identificatiegegevens,

—	zuiverheid.

Medium (indien van toepassing):

—	motivering voor de keuze van het medium, indien geen water wordt gebruikt.

Proefdieren:

—	gebruikte soort/stam,

—	aantal, leeftijd en geslacht van de dieren,

—	herkomst, huisvesting, voer, nestmateriaal enz.,

—	gewicht van elk dier aan het begin van de test,

—	gegevens over vaginale uitstrijkjes voor P-vrouwtjes vóór aanvang van de behandeling (indien daar op dat moment gegevens over zijn verzameld),

—	gegevens over koppeling van de P-generatie, met vermelding van de mannelijke en vrouwelijke partner van een paring en succes van de paring,

—	gegevens over nest van herkomst voor volwassen dieren van de F1-generatie.

Testomstandigheden:

—	motivering van de keuze van de dosisniveaus,

—	bijzonderheden over de formulering van de teststof, respectievelijk de samenstelling van het voer, verkregen concentraties,

—	stabiliteit en homogeniteit van het preparaat in het medium of de drager (bv. voer, drinkwater), in het bloed en/of de melk onder de gebruiksomstandigheden en opslag tussen de gebruiksmomenten,

—	gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof,

—	omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) naar de verkregen dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing,

—	gedetailleerde gegevens over het voedsel en de waterkwaliteit (waaronder samenstelling voer, indien beschikbaar),

—	gedetailleerde beschrijving van de randomisatieprocedures voor de selectie van te ruimen jongen en de toewijzing van jongen aan testgroepen,

—	omgevingsomstandigheden,

—	lijst van onderzoeksmedewerkers, inclusief beroepsopleiding.

Resultaten (beknopte en afzonderlijke gegevens naar geslacht en dosis):

—	voedselconsumptie, waterconsumptie indien beschikbaar, voedselefficiëntie (lichaamsgewichttoename per gram geconsumeerd voedsel, behalve gedurende de cohabitatie- en zoogperiode) en consumptie van teststof (voor toediening via het voer/drinkwater) voor P- en F1-dieren,

—	absorptiegegevens (indien beschikbaar),

—	lichaamsgewichtgegevens voor P-dieren,

—	lichaamsgewichtgegevens voor de geselecteerde F1-dieren na spening,

—	tijdstip van sterfte tijdens het onderzoek en of de dieren overleefden tot het einde van het onderzoek,

—	aard, ernst en duur van (al dan niet reversibele) klinische observaties,

—	gegevens over hematologie, urineonderzoek en klinische chemie, waaronder TSH en T4,

—	fenotypische analyse van miltcellen (T-, B-, NK-cellen),

—	cellulariteit van het beenmerg,

—	gegevens over toxische responsen,

—	aantal P- en F1-vrouwtjes met een normale of abnormale oestruscyclus en cyclusduur van deze vrouwtjes,

—	tijd tot paring (interval vóór coïtus, het aantal dagen tussen koppeling en paring),

—

toxische of andere effecten op de voortplanting, waaronder aantallen en percentages van dieren die hebben gepaard, geworpen en gezoogd en drachtig zijn geraakt, van mannetjes die bij een vrouwtje dracht hebben bewerkstelligd, van vrouwtjes met verschijnselen van dystokie/langdurige of moeilijke worp,

—	duur van de dracht en, indien beschikbaar, van de worp,

—	aantal innestelingen, nestgrootte en percentage mannelijke jongen,

—	aantal en percentage gestorven dieren na innesteling, levendgeborenen en doodgeborenen,

—	gewichtsgegevens van de nesten en jongen (mannetjes, vrouwtjes en gecombineerd), het aantal ondermaatse dieren, indien bepaald,

—	aantal jongen met macroscopisch zichtbare afwijkingen,

—	toxische of andere effecten op nakomelingen, postnatale groei, levensvatbaarheid enz.,

—	gegevens over lichamelijke mijlpalen bij jongen en andere gegevens over de postnatale ontwikkeling,

—	gegevens over de geslachtsrijping van F1-dieren,

—	gegevens over functionele observaties bij jongen en volwassenen, in voorkomende gevallen,

—	lichaamsgewicht bij doding en gegevens over het absolute en relatieve orgaangewicht voor de P-dieren en volwassen F1-dieren,

—	obductiebevindingen,

—	gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen,

—	totaal aantal spermatozoa in de cauda epididymis, percentage progressief beweeglijke spermatozoa, percentage morfologisch normale spermatozoa en percentage spermatozoa met elke vastgestelde afwijking voor P- en F1-mannetjes,

—	aantallen en rijpingsstadia van follikels in de eierstokken van P- en F1-vrouwtjes, indien van toepassing,

—	telling van corpora lutea in de eierstokken van F1-vrouwtjes,

—	statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing.

Parameters van cohort 2:

—	gedetailleerde beschrijving van de gebruikte procedures voor de standaardisatie van observaties en procedures en operationele definities voor het scoren van observaties,

—	lijst van alle gebruikte testprocedures en een motivering van het gebruik ervan,

—	gedetailleerde gegevens over de gebruikte gedrags/functie-, neuropathologische en morfometrische procedures, waaronder informatie en details over geautomatiseerde apparatuur,

—	procedures om apparatuur te ijken en om de gelijkwaardigheid van apparatuur te waarborgen en om evenwichtige behandelgroepen te krijgen bij het testen,

—	korte motivering waarin beslissingen genomen op basis van professioneel oordeel uiteengezet worden,

—	gedetailleerde beschrijving van alle gedrags/functie-, neuropathologische en morfometrische bevindingen naar geslacht en dosisgroep, met inbegrip van zowel toenames als afnames ten opzichte van controles,

—	hersengewicht,

—	diagnoses gesteld op basis van neurologische verschijnselen en letsels, waaronder natuurlijk voorkomende ziekten of aandoeningen,

—	beelden van voorbeeldige bevindingen,

—	lageresolutiebeelden ter beoordeling van de homologie van coupes die zijn gebruikt voor morfometrie,

—	statistische behandeling van resultaten, met inbegrip van statistische modellen die zijn gebruikt voor analyse van de gegevens, en de resultaten, ongeacht de significantie ervan,

—	verband van eventuele andere toxische effecten met een conclusie over het neurotoxische potentieel van de teststof, naar geslacht en dosisgroep,

—	invloed van eventuele toxicokinetische informatie op de conclusies,

—	gegevens die de betrouwbaarheid en gevoeligheid van de testmethode ondersteunen (d.w.z. positieve en historische controlegegevens),

—	eventuele verbanden tussen neuropathologische en functie-effecten,

—	NOAEL- of benchmarkdosis voor moederdieren en nakomelingen, naar geslacht en dosisgroep,

—	discussie over de algehele interpretatie van de gegevens op grond van de resultaten, waaronder een conclusie over de vraag of de teststof al dan niet ontwikkelingsneurotoxiciteit veroorzaakte en de NOAEL.

Parameters van cohort 3:

—	IgM-antilichaamtiters in serum (sensibilisatie voor SRBC of KLH) of IgM PFC-eenheden in de milt (sensibilisatie voor SRBC),

—	de prestatie van de TDAR-methode moet in het kader van optimalisatie worden bevestigd door de test voor het eerst door een laboratorium te laten opzetten en deze periodiek (bv. jaarlijks) door alle laboratoria te laten opzetten,

—	discussie over de algehele interpretatie van de gegevens op grond van de resultaten, waaronder een conclusie over het feit of de teststof ontwikkelingsimmunotoxiciteit veroorzaakte en de NOAEL.

Bespreking van de resultaten:

Conclusies, onder meer over NOAEL-waarden voor effecten op parentale generatie en nakomelingen

Alle informatie die niet tijdens het onderzoek is verkregen, maar wel nuttig is voor de interpretatie van de resultaten (bv. overeenkomsten van effecten met bekende neurotoxische stoffen), moet ook worden verstrekt.

Interpretatie van de resultaten

80.   Een uitgebreid onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie geeft informatie over de effecten van herhaalde blootstelling aan een stof tijdens alle fasen van de voortplantingscyclus, zo nodig. Het onderzoek geeft met name informatie over het voortplantingssysteem en over de ontwikkeling, groei, overleving en functie-eindpunten van nakomelingen tot PND 90.

81.   Bij de interpretatie van de resultaten van het onderzoek moet alle beschikbare informatie over de stof, waaronder fysisch-chemische, toxicokinetische en toxicodynamische eigenschappen, beschikbare relevante informatie over structuuranaloga en resultaten van eerder uitgevoerde toxiciteitsonderzoeken met de teststof (bv. acute toxiciteit, toxiciteit na herhaalde blootstelling, mechanistische onderzoeken en onderzoeken waarin wordt beoordeeld of er tussen soorten aanzienlijke kwalitatieve en kwantitatieve verschillen bestaan in metabole eigenschappen in vivo of in vitro), in aanmerking worden genomen. Resultaten van macroscopische obductie en orgaangewichten moeten indien mogelijk worden beoordeeld in samenhang met observaties die zijn verricht in andere onderzoeken met herhaalde toediening. Afnames in groei van nakomelingen zouden in verband kunnen staan met een invloed van de teststof op de melksamenstelling (29).

Cohort 2 (ontwikkelingsneurotoxiciteit)

82.   Neurogedrags- en neuropathologische resultaten moeten in samenhang met alle bevindingen worden geïnterpreteerd, onder gebruikmaking van een op bewijskracht gebaseerde aanpak met oordeel van deskundigen. Patronen van gedrags- of morfologische bevindingen, indien aanwezig, en aanwijzingen voor dosisrespons moeten worden besproken. De beoordeling van ontwikkelingsneurotoxiciteit, waaronder epidemiologische onderzoeken of casereports met mensen en onderzoeken met proefdieren (bv. toxicokinetische gegevens, structuur-activiteitinformatie, gegevens uit andere toxiciteitsonderzoeken), moet bij deze karakterisering worden meegenomen. Bij de beoordeling van de gegevens moet zowel de biologische als de statistische significantie worden besproken. De beoordeling moet het eventuele verband tussen waargenomen neuropathologische en gedragsveranderingen omvatten. Zie voor richtsnoeren over de interpretatie van resultaten op het gebied van ontwikkelingsneurotoxiciteit testmethode B.53 (35) en Tyl et al., 2008 (31).

Cohort 3 (ontwikkelingsimmunotoxiciteit)

83.   Onderdrukking of verbetering van de immuunfunctie die is vastgesteld met behulp van TDAR (T-cel-afhankelijke antilichaamrespons) moet worden beoordeeld in samenhang met alle verrichtte observaties. De significantie van de uitkomst van TDAR kan worden ondersteund door andere effecten op immunologisch gerelateerde indicatoren (bv. cellulariteit van het beenmerg, gewicht en histopathologie van lymfeweefsels, distributie van lymfocyten-subgroepen). Door TDAR vastgestelde effecten kunnen minder betekenisvol zijn in het geval van andere toxiciteiten die bij lagere blootstellingsconcentraties zijn waargenomen.

84.   OESO-leidraad nr. 43 dient te worden geraadpleegd voor hulp bij de interpretatie van resultaten op het gebied van toxiciteit en neurotoxiciteit.

LITERATUUR

1.

Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), „A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment”, Critical Reviews in Toxicology, 36, 69-98.

2.

Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), „Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets”, Lab. Anim. Sci., 49, 530- 536.

3.

Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.

4.

Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), „Direct Dosing of Preweaning Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group”, International Journal of Toxicology, 24, 87-94.

5.

Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), „Stimulating Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment”, Toxicological Sciences, 49, 1-4.

6.

Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), „Detection of Effects on Male Reproduction — a Literature Survey”, Journal of the American College of Toxicologists, 14, 293-327.

7.

Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), „Some Aspects Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility”, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 37, 356-369.

8.

Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. Mayahara and Y. Ohno (2000). „Collaborative work to evaluate toxicity on male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies”, Journal of Toxicological Sciences, 25, 1-21.

9.

Creasy, D.M. (2003), „Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxicologic Pathology”, Birth Defects Research, Part B, 68, 408-415.

10.

Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper (2007), „The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies”, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.

11.

Sadleir, R.M.F.S. (1979), „Cycles and Seasons”, in C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.

12.

Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds (1999), „Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.

13.

Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), „Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat”, Biological Reproduction, 17, 298-303.

14.

Ladics, G.S. (2007), „Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxicity Testing”, Methods, 41, 9-19.

15.

Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. Herzyk (2004), „Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemocyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation”, Toxicology, 197, 23-35.

16.

Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), „A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat”, Fundamental and Applied Toxicology, 12, 92-108.

17.

Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), „Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats”, Journal of Reproduction and Fertility, 54, 103-107.

18.

Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), „The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat”. Reproductive Toxicology, 5, 39-44.

19.

Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), „Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report”, Reproductive Toxicology, 10, 237- 244.

20.

Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), „Methods for Assessing Rat Sperm Motility”, Reproductive Toxicology, 6, 267-273.

21.

Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), „Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration”, Journal of Andrology, 13, 409-421.

22.

Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), „Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations”, Reproductive Toxicology, 5, 449-458.

23.

Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), „Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer”, Methods in Toxicology, Part A, Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.

24.

Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), „The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations”, Journal of Andrology, 10, 401-415.

25.

Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), „Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants”, Reproductive Toxicology, 6, 491-505.

26.

OESO (2008), Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment, Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/JM/MONO(2008)16, OESO, Parijs.

27.

Working, P.K., M. Hurtt (1987), „Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility”, Journal of Andrology, 8, 330-337.

28.

Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), „A „Best Practices” Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing — for Today”, Toxicological Pathology, 34, 296-313.

29.

Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de Duffard, and R. Duffard (2006), „Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components”, Food Chemicals Toxicology, 44, 8-16.

30.

Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Caviness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), „Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats”, Environmental health perspectives, 115(12), 1717-1726.

31.

Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. Sobotka (2008), „Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints”, Neurotoxicology and Teratology, 30: 349-381.

32.

OESO (1996), Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test, OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 422, OESO, Parijs.

33.

Hoofdstuk B.43 van deze bijlage, Neurotoxiciteitsonderzoek bij knaagdieren

34.

OESO (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OESO, Parijs.

35.

Hoofdstuk B.53 van deze bijlage, Onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit

36.

Hoofdstuk B.54 van deze bijlage, Uterotrofe bioassay bij knaagdieren: Een kortlopende screeningstest op oestrogene eigenschappen

37.

Hoofdstuk B.55 van deze bijlage, Hershberger-bioassay bij ratten: een kortlopende screeningstest op (anti)androgene eigenschappen

38.

OESO (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 106, OESO, Parijs.

39.

OESO (2011), Guidance Document on the Current Implementation of Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OESO, Parijs.

40.

OESO (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, No. 151, OESO, Parijs.

B.57.   H295R-STEROÏDOGENESETEST

INLEIDING

1.   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 456 (2011) van de OESO. In 1998 is de OESO met hoge prioriteit een actie gestart om bestaande testrichtlijnen te herzien en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars (1). Het Conceptueel kader van de OESO van 2000 voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen omvat vijf niveaus, waarbij elk niveau correspondeert met een ander niveau van biologische complexiteit (1). De in deze testmethode beschreven H295R-steroïdogenesebepaling in vitro(H295R) maakt gebruik van een humane adrenocarcinoomcellijn (NCI-H295R-cellen) en is een „in-vitro-bepaling die mechanistische gegevens oplevert” op niveau 2, te gebruiken voor screening en prioritering. De ontwikkeling en standaardisatie van de test als screening voor chemische effecten op de steroïdogenese, met name de productie van 17β-oestradiol (E2) en testosteron (T), is in een meerstappenproces verricht. De H295R-test is geoptimaliseerd en gevalideerd (2) (3) (4) (5).

2.   Het doel van de H295R-steroïdogenesetest is stoffen te detecteren die van invloed zijn op de productie van E2 en T. De H295R-test is bedoeld om xenobiotica te identificeren die aangrijpen op de endogene componenten die de intracellulaire biochemische pathway vormen, te beginnen met de opeenvolging van reacties van cholesterol tot de productie van E2 en/of T. De H295R-test is niet bedoeld om stoffen te identificeren die de steroïdogenese beïnvloeden via effecten op de hypothalamus-hypofyse-gonaden (HPG)-as. Het doel van de test is een JA/NEEN-antwoord te geven ten aanzien van het vermogen van een stof om de productie van T en E2 te induceren of remmen; maar in sommige gevallen kunnen kwantitatieve resultaten worden verkregen (zie punten 53 en 54). De resultaten van de test worden uitgedrukt in relatieve veranderingen in hormoonproductie ten opzichte van de oplosmiddelcontroles (solvent controls — SC's). Het doel van de test is niet om specifieke mechanistische informatie op te leveren over de interactie van de teststof met het endocriene systeem. Onderzoek is verricht met de cellijn om effecten te identificeren op specifieke enzymen en tussenproducten zoals progesteron (2).

3.   De in deze testmethode gebruikte definities en afkortingen staan in het aanhangsel. Een gedetailleerd protocol met instructies voor de bereiding van oplossingen, het kweken van cellen en diverse aspecten van de test is beschikbaar als Aanhangsel I-III van het OESO-document „Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production” (4).

INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

4.   Bij de biosynthese van geslachtssteroïdhormonen zijn vijf verschillende enzymen betrokken die zes verschillende reacties katalyseren. Enzymatische omzetting van cholesterol in pregnenolon door het cytochroom-P450 (CYP)-enzym dat de zijketen van cholesterol splitst (CYP11A) is de eerste stap in een serie van biochemische reacties die leiden tot de synthese van steroïde eindproducten. Afhankelijk van de volgorde van de volgende twee reacties splitst de steroïdogene pathway zich in twee routes, de Δ5-hydroxysteroïd-pathway en Δ4-ketosteroïd-pathway, die bij de productie van androsteendion weer samenkomen (figuur 1).

5.   Androsteendion wordt in testosteron (T) omgezet door 17β-hydroxysteroïddehydrogenase (17β-HSD). Testosteron is zowel een tussenproduct als een eindhormoon. Bij mannen kan T in dihydrotestosteron (DHT) worden omgezet door 5α-reductase, dat wordt aangetroffen in de celmembranen, kernomhulling, en het endoplasmatisch reticulum van doelweefsels met een androgene werking zoals de prostaat en de zaadblaasjes. DHT is een aanzienlijk krachtiger androgeen dan T en wordt ook als een eindproducthormoon beschouwd. De H295R-test meet geen DHT (zie punt 10).

6.   Het enzym in de steroïdogene pathway dat androgene stoffen omzet in oestrogene stoffen is aromatase (CYP19). CYP19 zet T in 17β-oestradiol (E2) en androsteendion in oestron om. E2 en T worden beschouwd als eindproducthormonen van de steroïdogene pathway.

7.   De specificiteit van de lyaseactiviteit van CYP17 verschilt voor de tussenproductsubstraten tussen soorten. Bij de mens heeft het enzym een voorkeur voor substraten van de Δ5-hydroxysteroïd-pathway (pregnenolon), terwijl bij de rat substraten in de Δ4-ketosteroïd-pathway (progesteron) de voorkeur hebben (19). Dergelijke verschillen in de CYP17-lyaseactiviteit kunnen bepaalde soortafhankelijke verschillen verklaren in de reactie op stoffen die de steroïdogenese in vivo veranderen (6). De H295-cellen blijken de vorming van bijnierenzymen en patronen van de steroïdproductie (20) bij de mens het dichtst te benaderen, maar het is bekend dat ze enzymen vormen voor zowel de Δ5-hydroxysteroïd- als de Δ4-ketosteroïd-pathways voor de androgeensynthese (7) (11) (13) (15).

Figuur 1

Steroïdogene pathway in H295R-cellen

NB:

Enzymen staan cursief, hormonen vet en pijlen geven de syntheserichting aan. Grijze achtergrond betekent corticosteroïde pathways/producten. Geslachtssteroïdhormonen/producten staan omcirkeld. CYP = cytochroom-P450; HSD = hydroxysteroïddehydrogenase; DHEA = dehydro-epiandrosteron.

8.   De humane H295R-adrenocarcinoomcellijn is een bruikbaar in-vitro-model voor onderzoek naar de effecten op de steroïdhormoonsynthese (2) (7) (8) (9) (10). De H295R-cellijn vormt genen die coderen voor alle sleutelenzymen voor de hierboven beschreven steroïdogenese (11) (15) (figuur 1). Dit is een unieke eigenschap omdat in-vivo-expressie van deze genen weefsel- en ontwikkelingsstadiumspecifiek is met meestal niet één weefsel of één ontwikkelingsstadium met expressie van alle bij de steroïdogenese betrokken genen (2). H295R-cellen hebben fysiologische eigenschappen van zonaal ongedifferentieerde humane foetale adrenale cellen (11). De cellen vertegenwoordigen een uniek in-vitro-systeem omdat ze het vermogen hebben om alle steroïdhormonen te produceren die in de volwassen bijnierschors en gonaden worden aangetroffen, waardoor kan worden getest op effecten op zowel corticosteroïdsynthese als de productie van geslachtssteroïdhormonen zoals androgenen en oestrogenen, hoewel de test alleen gevalideerd is om T en E2 te detecteren. Door het testsysteem vastgelegde veranderingen in de vorm van verandering van de productie van T en E2 kunnen het resultaat zijn van tal van verschillende interacties tussen teststoffen en steroïdogene functies die door de H295R-cellen worden verricht. Dat zijn onder meer modulatie van de expressie, synthese of functie van enzymen die betrokken zijn bij de productie, transformatie of eliminatie van steroïdhormonen (12) (13) (14). Remming van de hormoonproductie kan worden veroorzaakt door directe competitieve binding aan een enzym in de pathway, impact op cofactoren zoals NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) en cAMP (cyclic Adenosine Monophosphate), en/of verhoging van het steroïdmetabolisme of onderdrukking van de genexpressie van bepaalde enzymen in de steroïdogenese-pathway. Hoewel remming een functie kan zijn van zowel directe als indirecte bij de hormoonproductie betrokken processen, is inductie meestal van indirecte aard, zoals door beïnvloeding van cofactoren zoals NADPH en cAMP (zoals in het geval van forskoline), vermindering van het steroïdmetabolisme (13), en of upregulatie van de steroïdogene genexpressie.

9.   De H295R-test heeft verschillende voordelen:

—	de test maakt detectie mogelijk van zowel verhoging als verlaging van de productie van zowel T als E2,

—

hij maakt een directe beoordeling mogelijk van de potentiële impact van de stof op de levensvatbaarheid/cytotoxiciteit van cellen. Dit is een belangrijke eigenschap omdat daarmee onderscheid kan worden gemaakt tussen effecten die worden veroorzaakt door cytotoxiciteit en die welke worden veroorzaakt door directe interactie van stoffen met steroïdogene pathways, wat niet mogelijk is in weefselexplantatiesystemen die bestaan uit meerdere celtypes met wisselende sensitiviteit en functionaliteit,

—	er hoeven geen dieren te worden gebruikt,

—	de H295R-cellijn is op de markt verkrijgbaar.

10.   De belangrijkste beperkingen van de test zijn de volgende:

—	de metabole capaciteit is onbekend maar waarschijnlijk vrij beperkt; daarom worden stoffen die metabool geactiveerd moeten worden waarschijnlijk bij deze test gemist,

—

omdat de H295R uit bijnierweefsel verkregen is, bezit zij de enzymen die in staat zijn om de gluco- en mineraalcorticoïden en ook de geslachtshormonen te produceren; daarom kunnen effecten op de productie van gluco- en mineraalcorticoïden de in de test waargenomen concentraties van T en E2 beïnvloeden,

—	DHT wordt niet gemeten; daarom wordt niet verwacht dat stoffen gedetecteerd kunnen worden die 5α-reductase remmen; in dat geval kan de Hershberger-test (16) worden gebruikt,

—	de H295R-test detecteert geen stoffen die de steroïdogenese verstoren door beïnvloeding van de hypothalamus-hypofyse-gonaden (HPG)-as omdat dit alleen bij intacte dieren kan worden onderzocht.

PRINCIPE VAN DE TEST

11.   Het doel van de test is om stoffen te detecteren die de productie van T en E2 beïnvloeden. T is ook een tussenproduct in de pathway om E2 te produceren. De test kan stoffen detecteren die normaliter de enzymen van de steroïdogenese-pathway remmen of induceren.

12.   De test wordt meestal verricht onder standaard celkweekomstandigheden in 24-wells kweekplaten. Ook andere plaatgroottes kunnen voor de test worden gebruikt; maar het zaaien en de experimentele omstandigheden moeten worden aangepast om aan de prestatiecriteria te kunnen blijven voldoen.

13.   Na een acclimatisatieperiode van 24 uur in multiwellplaten worden de cellen 48 uur blootgesteld aan zeven concentraties van de teststof, minstens in drievoud. Oplosmiddel en een bekende remmer en inductor van de hormoonproductie worden gebruikt bij een vaste concentratie als negatieve en positieve controles. Aan het eind van de blootstellingsperiode wordt het medium uit elke well verwijderd. Direct na verwijdering van het medium wordt de levensvatbaarheid van cellen in elke well geanalyseerd. Concentraties van hormonen in het medium kunnen worden gemeten met diverse methoden waaronder op de markt verkrijgbare hormoonmetingkits en/of instrumentele technieken zoals vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). Gegevens worden uitgedrukt als x-voudige verandering ten opzichte van oplosmiddelcontrole en de laagste concentratie die nog effect geeft (Lowest-Observed-Effect-Concentration — LOEC). Als de test negatief is, wordt de hoogste geteste concentratie gemeld als de No-Observed-Effect-Concentration (NOEC). Conclusies over het vermogen van een stof om de steroïdogenese te beïnvloeden moeten worden gebaseerd op minstens twee onafhankelijke reeksen van metingen. De eerste reeks kan als bereiksbepaling dienen met daaropvolgende aanpassing van de concentraties voor reeksen 2 en 3, waar van toepassing, als problemen met oplosbaarheid of cytotoxiciteit worden ondervonden of de activiteit van de stof aan het einde van het bereik van de geteste concentraties lijkt te zijn.

KWEEKPROCEDURE

Cellijn

14.   De NCI-H295R-cellen zijn op de markt verkrijgbaar bij American Type Culture Collections (ATCC) na ondertekening van een Material Transfer Agreement (MTA) (14).

Inleiding

15.   Vanwege verandering in de E2-producerende capaciteit van de cellen bij toenemende leeftijd/passages (2), moeten cellen worden gekweekt volgens een specifiek protocol voordat ze worden gebruikt; het aantal passages sinds de cellen ontdooid zijn en ook het aantal passages waarbij de cellen werden ingevroren en in vloeibaar stikstof werden opgeslagen moeten worden vastgelegd. Het eerste getal geeft het feitelijke aantal celpassages aan, het tweede getal beschrijft het aantal passages waarbij de cellen werden ingevroren en opgeslagen. Zo zouden cellen die werden ingevroren na passage 5 en ontdooid en dan driemaal gesplitst (4 passages waarbij de vers ontdooide cellen als passage 1 worden geteld) nadat ze opnieuw waren gekweekt, als passage 4.5 worden gelabeld. Een voorbeeld van de nummering staat in aanhangsel I van het validatierapport (4).

16.   Voorraadmedium wordt gebruikt als basis voor de verrijkte en vriesmedia. Verrijkt medium is een noodzakelijk bestanddeel bij celkweek. Vriesmedium wordt speciaal ontwikkeld om impactvrij invriezen van cellen voor langdurige opslag mogelijk te maken. Vóór gebruik moet Nu-serum (of een vergelijkbaar serum met dezelfde eigenschappen waarvan is aangetoond dat het gegevens oplevert die voldoen aan de vereisten van de test en kwaliteitscontrole (QC)), dat een bestanddeel is van verrijkte media, worden geanalyseerd op achtergrond T- en E2-concentraties. De bereiding van deze oplossingen wordt beschreven in aanhangsel II van het validatierapport (4).

17.   Na de start van een H295R-celkweek op basis van een originele ATCC-partij moeten cellen in vijf passages worden gekweekt (d.w.z. de cellen worden 4 keer gesplitst). Passage vijf-cellen worden dan in vloeibaar stikstof ingevroren voor opslag. Voor het invriezen van de cellen moet een metingreeks worden verricht met een monster van de voorgaande passage vier-cellen op een QC-plaat (zie punten 36 en 37) om vast te stellen of de basale productie van hormonen en de reactie op positieve controlestoffen voldoen aan de kwaliteitscontrolecriteria voor de test zoals gedefinieerd in tabel 5.

18.   H295R-cellen moeten gekweekt, in vloeibaar stikstof ingevroren en opgeslagen worden om ervoor te zorgen dat er altijd cellen van de geschikte passage/leeftijd beschikbaar zijn voor kweek en gebruik. Het maximale aantal passages na het kweken van een nieuwe (15) of ingevroren (16) partij cellen dat aanvaardbaar is voor gebruik in de H295R-test mag niet hoger zijn dan 10. Zo zouden aanvaardbare passages voor kweken van cellen uit een partij die bij passage 5 ingevroren zijn 4.5 tot 10.5 zijn. Voor cellen die uit deze ingevroren partijen worden gekweekt, moet de in punt 19 omschreven procedure worden gevolgd. Deze cellen moeten nog eens minstens vier (4) passages (passage 4.5) worden gekweekt voor ze in de test worden gebruikt.

Cellen uit de ingevroren voorraad kweken

19.   De procedure voor het kweken van cellen uit ingevroren voorraad moet worden gebruikt als een nieuwe partij cellen uit de opslag in vloeibaar stikstof wordt gehaald om te worden gebruikt bij het kweken en testen. Details over deze procedure staan in aanhangsel III van het validatierapport (4). Cellen worden uit opslag in vloeibaar stikstof gehaald, snel ontdooid, in verrijkt medium in een centrifugebuis geplaatst, bij kamertemperatuur gecentrifugeerd, opnieuw gesuspendeerd in verrijkt medium, en overgebracht in een kweekfles. Het medium moet de daaropvolgende dag worden vervangen. De H295R-cellen worden in een incubator gekweekt bij 37 °C met 5 % CO2 in luchtatmosfeer en het medium wordt 2-3 keer per week vernieuwd. Als de cellen ongeveer 85-90 % confluent zijn, moeten deze worden gesplitst. Splitsen van de cellen is nodig om ervoor te zorgen dat de cellen gezond blijven en groeien en om cellen te houden om biologische tests op te verrichten. De cellen worden drie keer met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (phosphate-buffered saline — PBS, zonder Ca2+ Mg2+.) gespoeld en van de kweekfles losgemaakt door toevoeging van een geschikt losmakingsenzym, bijvoorbeeld trypsine, in PBS (zonder Ca2+ Mg2+). Direct nadat de cellen van de kweekfles zijn losgekomen, moet de enzymactie worden gestopt door toevoeging van verrijkt medium in een verhouding van 3 × het voor de enzymbehandeling gebruikte volume. Cellen worden in een centrifugebuis geplaatst, bij kamertemperatuur gecentrifugeerd, het supernatant wordt verwijderd en de pellet met cellen wordt opnieuw gesuspendeerd in verrijkt medium. Een geschikte hoeveelheid celoplossing wordt in de nieuwe kweekfles geplaatst. De hoeveelheid celoplossing moet worden aangepast zodat de cellen binnen 5-zeven dagen confluent zijn. De aanbevolen subkweekratio is 1:3 tot 1:4. De plaat moet zorgvuldig worden gelabeld. De cellen zijn nu klaar voor gebruik in de test en overgebleven cellen moeten in vloeibaar stikstof worden ingevroren zoals beschreven in punt 20.

Invriezen van H295R-cellen (cellen klaarmaken voor opslag in vloeibaar stikstof)

20.   Om H295R-cellen klaar te maken voor invriezen moet de procedure die hierboven is omschreven voor het splitsen van cellen worden gevolgd tot de stap voor het opnieuw suspenderen van de pellet met cellen aan de onderkant van de centrifugebuis. Hier wordt de pellet met cellen opnieuw gesuspendeerd in een vriesmedium. De oplossing wordt overgebracht in een cryogene flacon, correct gelabeld, en 24 uur ingevroren bij – 80°C waarna de cryogene flacon in vloeibaar stikstof wordt overgebracht voor opslag. Details voor deze procedures staan in aanhangsel III van het validatierapport (4).

Cellen op de plaat aanbrengen en preïncuberen voor testen

21.   Het aantal 24-wells platen, klaargemaakt zoals omschreven in punt 19, dat nodig zal zijn hangt af van het aantal te testen stoffen en de confluentie van de cellen in de kweekschalen. Als vuistregel geldt dat één kweekfles (75 cm2) van 80-90 % confluente cellen voldoende cellen zal leveren voor één tot 1,5 (24-wells) platen bij een doeldichtheid van 200 000 tot 300 000 cellen per ml medium wat leidt tot ongeveer 50-60 % confluentie in de wells na 24 uur (figuur 2). Dit is meestal de optimale celdichtheid voor hormoonproductie in de test. Bij hogere dichtheden kan het productiepatroon voor T en ook E2 veranderen. Voordat de test voor het eerst wordt verricht, wordt aanbevolen om verschillende dichtheden tussen 200 000 en 300 000 cellen per ml te testen, en de dichtheid die na 24 uur leidt tot 50-60 % confluentie in de well te kiezen voor verdere experimenten.

Figuur 2

Fotomicrografie van H295R-cellen bij een zaaidichtheid van 50 % in een 24-wells kweekplaat na 24 uur, genomen aan de rand (A) en het midden (B) van een well

22.   Het medium wordt uit de kweekfles gepipetteerd, en de cellen worden 3 keer met steriel PBS (zonder Ca2+Mg2+) gespoeld. Een enzymoplossing (in PBS) wordt toegevoegd om de cellen van de kweekfles los te maken. Na voldoende tijd voor losmaking van de cellen wordt de enzymreactie gestopt door toevoeging van verrijkt medium in een verhouding van 3 × het volume dat gebruikt is voor de enzymbehandeling. Cellen worden in een centrifugebuis geplaatst, bij kamertemperatuur gecentrifugeerd, het supernatant wordt verwijderd, en de pellet met cellen wordt opnieuw gesuspendeerd in verrijkt medium. De celdichtheid wordt berekend met bv. een hemocytometer of een celteller. De celoplossing moet worden verdund tot de voor het aanbrengen op de plaat gewenste dichtheid en grondig gemengd om een homogene celdichtheid te verzekeren. De cellen moeten op de plaat worden aangebracht met 1 ml van de celoplossing/well en de platen en wells moeten worden gelabeld. De gezaaide platen worden geïncubeerd bij 37 °C bij 5 % CO2 in de luchtatmosfeer gedurende 24 uur om de cellen zich aan de wells te laten vasthechten.

VEREISTEN VOOR KWALITEITSCONTROLE

23.   Het is essentieel dat exacte hoeveelheden oplossing en monster in de wells worden gedaan omdat deze hoeveelheden de concentraties bepalen die bij de berekeningen van de resultaten van de test worden gebruikt.

24.   Voor de start van de celkweek en eventuele volgende tests moet elk laboratorium de sensitiviteit van haar hormoonmetingssysteem (punten 29-31) aantonen.

25.   Als op antilichamen gebaseerde hormoonmetingstesten gebruikt gaan worden, moeten voor de test wordt gestart de te testen stoffen worden geanalyseerd op hun vermogen om een verstoring te geven van het meetsysteem dat wordt gebruikt om T en E2 te kwantificeren, volgens punt 32.

26.   DMSO is het aanbevolen oplosmiddel voor de test. Als een ander oplosmiddel wordt gebruikt, moet het volgende worden vastgesteld:

—	de oplosbaarheid van de teststof, forskoline en prochloraz in het oplosmiddel, en

—	de cytotoxiciteit als functie van de concentratie van het oplosmiddel.

Aanbevolen wordt dat de maximaal toegestane concentratie oplosmiddel niet hoger mag zijn dan 10 × verdunning van de laagste cytotoxische concentratie van het oplosmiddel.

27.   Voordat de test voor de eerste keer wordt verricht, moet het laboratorium een kwalificeringsexperiment verrichten om aan te tonen dat het laboratorium in staat is om geschikte omstandigheden te bereiken en vast te houden voor celkweek en experimenten voor het testen van stoffen zoals beschreven in punten 33-35.

28.   Bij het starten van een test met een nieuwe partij moet een reeks metingen plaatsvinden met een controleplaat voordat een nieuwe partij cellen wordt gebruikt voor beoordeling van de prestaties van de cellen zoals omschreven in punten 36 en 37.

Prestaties van het hormoonmetingssysteem

Sensitiviteit, nauwkeurigheid, precisie van de methode en kruisreactiviteit met monstermatrix

29.   Elk laboratorium kan een hormoonmetingssysteem naar keuze gebruiken voor de analyse van de productie van T en E2 door H295R-cellen, zolang deze aan de prestatiecriteria voldoet, inclusief de kwantificeringslimiet (Limit of Quantification — LOQ). Nominaal zijn dit 100 pg/ml voor T en 10 pg/ml voor E2, die gebaseerd zijn op de in de validatieonderzoeken waargenomen basale hormoonconcentraties. Maar hogere of lagere concentraties kunnen geschikt zijn, afhankelijk van de in het verrichtende laboratorium bereikte basale hormoonconcentraties. Voor de start van de QC-plaat en testmetingen moet het laboratorium aantonen dat de te gebruiken hormoontest hormoonconcentraties in verrijkt medium met voldoende nauwkeurigheid en precisie kan meten om te voldoen aan de in tabellen 1 en 5 gespecificeerde QC-criteria door verrijkt medium te analyseren waaraan een interne hormooncontrolestof is toegevoegd. Aan verrijkt medium moeten minstens drie concentraties van elk hormoon worden toegevoegd (bv. 100, 500 en 2 500 pg/ml T; 10, 50 en 250 pg/ml E2, of de laagst mogelijke concentraties op basis van de detectielimieten van het gekozen hormoonmetingssysteem kan worden gebruikt voor de laagste concentraties toegevoegd T en E2) en geanalyseerd. De gemeten hormoonconcentraties van niet-geëxtraheerde monsters moeten binnen 30 % van de nominale concentraties liggen, en variatie tussen herhaalde metingen van hetzelfde monster mag niet hoger zijn dan 25 % (zie ook tabel 8 voor aanvullende QC-criteria). Als aan deze QC-criteria wordt voldaan, wordt ervan uitgegaan dat de gekozen hormoonmetingstest voldoende nauwkeurig en precies is en geen kruisreactie vertoont met componenten in het medium (monstermatrix) in een mate die een aanmerkelijke invloed op het resultaat van de test te verwachten zou doen verwachten. In dat geval is geen extractie van monsters vóór meting van de hormonen vereist.

30.   Als aan de QC-criteria in tabellen 1 en 8 niet wordt voldaan, kan dit komen door een aanmerkelijk matrixeffect, en moet een experiment met medium waaraan een extractie is toegevoegd worden verricht. Een voorbeeld van een extractieprocedure wordt beschreven in aanhangsel II van het validatierapport (4). Metingen van de hormoonconcentraties in de geëxtraheerde monsters moeten in drievoud worden verricht (17). Als kan worden aangetoond dat na extractie de componenten van het medium de hormoondetectie zoals gedefinieerd door de QC-criteria niet verstoren, worden alle volgende experimenten verricht met geëxtraheerde monsters. Als na extractie niet aan de QC-criteria kan worden voldaan, is het gebruikte hormoonmetingssysteem ongeschikt voor het doel van de H295R-steroïdogenesetest, en moet een andere hormoondetectiemethode worden gebruikt.

Standaardcurve

31.   De hormoonconcentraties van de oplosmiddelcontroles (SC's) moeten binnen het lineaire deel van de standaardcurve vallen. Bij voorkeur liggen de SC-waarden dicht bij het midden van het lineaire deel om ervoor te zorgen dat inductie en remming van de hormoonsynthese gemeten kunnen worden. Verdunningen van te meten medium (of extracten) moeten dienovereenkomstig worden geselecteerd. Het lineaire verband moet worden vastgesteld aan de hand van een passende statistische methode.

Stofinterferentietest

32.   Als op antilichamen gebaseerde testen zoals Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA's) en Radio-Immuno Assays (RIA's) gebruikt gaan worden om hormonen te meten, moet elke stof worden getest op mogelijke interferentie met het te gebruiken hormoonmetingssysteem voordat het feitelijke testen van stoffen begint (aanhangsel III van het validatierapport (4)), want sommige stoffen kunnen deze tests verstoren (17). Als interferentie optreedt die ≥ 20 % is van de basale hormoonproductie voor T en/of E2 zoals door hormoonanalyse vastgesteld, moet de Chemical Hormone Assay Interference Test (zoals beschreven in aanhangsel III van het validatierapport (4) afdeling 5.0) worden verricht op alle verdunningen van voorraadoplossing van de teststof om de drempelwaarde te vinden waarbij aanmerkelijke (≥ 20 %) interferentie optreedt. Als de interferentie minder is dan 30 %, mogen de resultaten voor de interferentie worden gecorrigeerd. Als de interferentie hoger is dan 30 %, zijn de gegevens ongeldig en moeten de gegevens bij deze concentraties worden genegeerd. Als aanmerkelijke interferentie van een teststof met een hormoonmetingssysteem optreedt bij meer dan één niet-cytotoxische concentratie, moet een ander hormoonmetingssysteem worden gebruikt. Om interferentie van vervuilende stoffen te vermijden, wordt aanbevolen hormonen te extraheren uit het medium met een geschikt oplosmiddel; methoden daarvoor zijn te vinden in het validatierapport (4).

Tabel 1

Prestatiecriteria voor hormoonmetingssystemen

Parameter	Criterium
Sensitiviteit meetmethode	Kwantificeringslimiet (LOQ) T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (18)
Efficiëntie hormoonextractie (alleen als extractie nodig is)	De gemiddelde teruggevonden hoeveelheden (op basis van drievoudige metingen) van de toegevoegde hoeveelheden hormoon mogen niet meer dan 30 % afwijken van de toegevoegde hoeveelheden.
Interferentie met de stof (alleen systemen op basis van antilichamen)	Er mag geen aanmerkelijke (≥ 30 % van de basale hormoonproductie van het desbetreffende hormoon) kruisreactiviteit optreden met één van de door de cellen geproduceerde hormonen (19)  (20).

Vaardigheidstest laboratorium

33.   Voordat laboratoria onbekende stoffen testen, moeten zij aantonen dat zij in staat zijn om de geschikte omstandigheden voor celkweek en tests te bereiken en in stand te houden die voor een goed verloop van de test vereist zijn, door een laboratoriumvaardigheidstest te doen. Omdat de prestatie van een test direct afhankelijk is van het laboratoriumpersoneel dat de test verricht, moeten deze procedures deels worden herhaald als er andere medewerkers in het laboratorium komen.

34.   Deze vaardigheidstest wordt verricht onder dezelfde omstandigheden die in punten 38-40 staan door cellen bloot te stellen aan 7 stijgende concentraties van sterke, matige en zwakke inductoren en remmers en aan een negatieve stof (zie tabel 2). Met name zijn de te testen stoffen de krachtige inductor forskoline (CAS-nr. 66575-29-9); de krachtige remmer prochloraz (CAS-nr. 67747-09-5); de matige inductor atrazine (CAS-nr. 1912-24-9); de matige remmer aminoglutethimide (CAS-nr. 125-84-8); de zwakke inductor (E2-productie) en zwakke remmer (T-productie) bisfenol A (CAS-nr. 80-05-7), en de negatieve stof humaan choriongonadotropine (HCG) (CAS-nr. 9002-61-3) zoals getoond in tabel 2. Metingen worden op afzonderlijke platen verricht voor alle stoffen aan de hand van de opzet in tabel 6. Bij elke dagelijkse reeks metingen moet een QC-plaat (tabel 4, punten 36-37) worden meegenomen voor de vaardigheidsstoffen.

Tabel 2

Vaardigheidsstoffen en blootstellingsconcentraties

Vaardigheidsstof	Testconcentraties [μM]
Prochloraz	0 (21), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10
Forskoline	0 (21), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10
Atrazine	0 (21), 0,01, 0,03, 0,1, 30, 1, 3, 10
Aminoglutethimide	0 (21), 0,01, 0,03, 0,1, 30, 1, 3, 10
Bisfenol A	0 (21), 0,01, 0,03, 0,1, 30, 1, 3, 10
HCG	0 (21), 0,01, 0,03, 0,1, 30, 1, 3, 10

Blootstelling van H295R aan de vaardigheidsstoffen moet tijdens de laboratoriumvaardigheidstest in platen met 24 wells worden verricht. De dosering is in μM voor alle doses van de teststof. De doses moeten worden toegediend in DMSO bij 0,1 % v/v per well. Alle testconcentraties moeten in drie wells worden getest (tabel 6). Voor metingen van elke stof worden afzonderlijke platen gebruikt. Bij elke dagelijkse reeks metingen wordt één QC-plaat meegenomen.

35.   Cellevensvatbaarheid- en hormoonanalyses moeten worden verricht zoals omschreven in punten 42-46. De drempelwaarde (concentratie bij laagst waargenomen effect, LOEC) en classificatiebeslissing moeten worden gemeld en vergeleken met de waarde in tabel 3. De gegevens worden als acceptabel beschouwd als ze voldoen aan de LOEC en beslissingsclassificatie in tabel 3.

Tabel 3

Drempelwaarden (LOEC's) en beslissingsclassificaties voor vaardigheidsstoffen

	CAS-nr.	LOEC [μM]		Beslissingsclassificatie
		T	E2	T	E2
Prochloraz	67747-09-5	≤ 0,1	≤ 1,0	+ (22)(Remming)	+ (22)(Remming)
Forskoline	66575-29-9	≤ 10	≤ 0,1	+ (Inductie)	+ (Inductie)
Atrazine	1912-24-9	≤ 100	≤ 10	+ (Inductie)	+ (Inductie)
Aminoglutethimide	125-84-8	≤ 100	≤ 100	+ (22)(Remming)	+ (22)(Remming)
Bisfenol A	80-05-7	≤ 10	≤ 10	+ (22)(Remming)	+ (Inductie)
HCG	9002-61-3	n.v.t.	n.v.t.	Negatief	Negatief

Kwaliteitscontroleplaat

36.   De kwaliteitscontrole (QC)-plaat wordt gebruikt om de prestatie van de H295R-cellen te verifiëren onder standaard kweekomstandigheden en om een historische database op te zetten voor hormoonconcentraties in oplosmiddelcontroles, positieve en negatieve controles, en ook andere QC-metingen in de tijd.

—	De prestaties van de H295R-cellen moeten worden beoordeeld met een QC-plaat voor elke nieuwe ATCC-partij of na gebruik voor de eerste keer van een eerder ingevroren voorraad cellen, tenzij de laboratoriumvaardigheidstest (punten 32-34) met die partij cellen gedaan is.

—	Een QC-plaat geeft een volledige beoordeling van de testomstandigheden (zoals cellevensvatbaarheid, oplosmiddelcontrole, negatieve en positieve controles, en ook variabiliteit binnen en tussen testen) bij het testen van stoffen en moet onderdeel zijn van elke reeks testmetingen.

37.   De QC-test wordt verricht in een 24-wells plaat en volgt dezelfde procedures voor incubatie, dosering, cellevensvatbaarheid/cytotoxiciteit, hormoonextractie en hormoonanalyse die in de punten 38 tot en met 46 voor het testen van stoffen beschreven zijn. De QC-plaat bevat blanco's, oplosmiddelcontroles, en twee concentraties van een bekende inductor (forskoline, 1, 10 μM) en remmer (prochloraz, 0,1, 1 μM) van de E2- en T-synthese. Daarnaast wordt MeOH gebruikt in bepaalde wells als positieve controle voor de levensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest. Een gedetailleerde omschrijving van de plaatlayout is te vinden in tabel 4. De criteria waaraan de QC-plaat moet voldoen staan in tabel 5. De minimale basale hormoonproductie voor T en E2 moet zowel in de oplosmiddelcontrole- als blanco wells worden bereikt.

Tabel 4

Layout van de QC-plaat voor het testen van de prestaties van niet-blootgestelde H295R-cellen en cellen die zijn blootgesteld aan bekende remmers (PRO = prochloraz) en stimulators (FOR = forskoline) van de E2- en T-productie. Na beëindiging van het blootstellingsexperiment en verwijdering van het medium wordt een oplossing van 70 % methanol toegevoegd aan alle MeOH-wells om te dienen als positieve controle voor cytotoxiciteit (zie cytotoxiciteitstest in aanhangsel III van het validatierapport (4)).

	1	2	3	4	5	6
A	Blanco (23)	Blanco (23)	Blanco (23)	Blanco (23) MeOH (24)	Blanco (23) MeOH (24)	Blanco (23) MeOH (24)
B	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl (MeOH) (24)	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)
C	FOR 1 μM	FOR 1 μM	FOR 1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM
D.	FOR 10 μM	FOR 10 μM	FOR 10 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM

Tabel 5

Prestatiecriteria voor de QC-plaat

	T	E2
Basale productie van hormoon in de oplosmiddelcontrole (SC)	≥ 5 keer de LOQ	≥ 2,5 keer de LOQ
Inductie (10 μM forskoline)	≥ 1,5 keer de SC	≥ 7,5 keer de SC
Remming (1μM prochloraz)	≥ 0,5 keer de SC	≥ 0,5 keer de SC

PROCEDURE VOOR BLOOTSTELLING AAN EEN STOF

38.   De gepreïncubeerde cellen worden uit de incubator verwijderd (punt 21) en onder een microscoop gecontroleerd om er zeker van te zijn dat ze in goede staat verkeren (aanhechting, morfologie) vóór toediening.

39.   De cellen worden in een bioveiligheidskast geplaatst en het verrijkte medium wordt verwijderd en vervangen door nieuw verrijkt medium (1 ml/well). DMSO is het oplosmiddel dat voor deze testmethode bij voorkeur wordt gebruikt. Als er redenen zijn om andere oplosmiddelen te gebruiken moet de wetenschappelijke motivering daarvoor worden beschreven. Cellen worden aan de teststof blootgesteld door 1 μl van de geschikte stamoplossing in DMSO (zie aanhangsel II van het validatierapport (4)) per 1 ml verrijkt medium (vakvolume) toe te voegen. Dit leidt tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 % DMSO in de wells. Om een goede menging te verzekeren wordt over het algemeen geprefereerd dat de desbetreffende stamoplossing van de teststof in DMSO wordt vermengd met verrijkt medium om voor elke dosis de gewenste uiteindelijke concentratie te verkrijgen, en dat het mengsel direct na verwijdering van oud medium aan elke well wordt toegevoegd. Als deze optie wordt gebruikt, moet de concentratie DMSO (0,1 %) in alle wells gelijk blijven. De wells die de hoogste twee concentraties bevatten worden met een stereomicroscoop visueel beoordeeld op de vorming van precipitaat of troebelheid als indicatie van onvolledige oplosbaarheid van de teststof. Als dergelijke omstandigheden (troebelheid, vorming van precipitaat) worden waargenomen, worden de wells met de volgende lagere concentraties ook gecontroleerd (enzovoorts); de concentraties die niet volledig zijn opgelost moeten van verdere beoordeling en analyse worden uitgesloten. De plaat wordt teruggezet in de incubator bij 37 °C onder 5 % CO2 in de luchtatmosfeer gedurende 48 uur. De layout van de teststofplaat staat in tabel 6. Stamoplossingen 1-7 tonen de plaatsing van toenemende doses van de teststof.

Tabel 6

Dosisschema voor de blootstelling van H295R-cellen aan teststof in een 24-wells plaat

	1	2	3	4	5	6
A	DMSO	DMSO	DMSO	Stamoplossing 4	Stamoplossing 4	Stamoplossing 4
B	Stamoplossing 1	Stamoplossing 1	Stamoplossing 1	Stamoplossing 5	Stamoplossing 5	Stamoplossing 5
C	Stamoplossing 2	Stamoplossing 2	Stamoplossing 2	Stamoplossing 6	Stamoplossing 6	Stamoplossing 6
D	Stamoplossing 3	Stamoplossing 3	Stamoplossing 3	Stamoplossing 7	Stamoplossing 7	Stamoplossing 7

40.   Na 48 uur worden de blootgestelde platen uit de incubator verwijderd en elke well wordt onder de microscoop gecontroleerd op celomstandigheden (aanhechting, morfologie, mate van confluentie) en tekenen van cytotoxiciteit. Het medium voor elke well wordt in twee gelijke hoeveelheden gesplitst (ongeveer 490 μl elk) en in twee afzonderlijke en goed gelabelde flacons overgebracht (dat wil zeggen een aliquot om voor elke well een reservemonster te hebben). Om te voorkomen dat cellen uitdrogen wordt medium uit één rij of kolom tegelijk verwijderd en vervangen met medium voor de cellevensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest. Als de levensvatbaarheid/cytotoxiciteit van de cellen niet direct gemeten wordt, wordt 200 μl PBS met Ca2+ en Mg2+ aan elke well toegevoegd. De media worden ingevroren bij – 80 °C tot verdere verwerking om de hormoonconcentraties te analyseren (zie punten 44-46). Hoewel bij – 80 °C en in medium bewaard T en E2 over het algemeen minstens drie maanden stabiel zijn, moet de hormoonstabiliteit tijdens de opslag in elk laboratorium worden vastgelegd.

41.   Direct na verwijdering van het medium wordt voor elke blootstellingsplaat de levensvatbaarheid/cytotoxiciteit van de cellen bepaald.

Bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen

42.   Er kan een cellevensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest naar keuze worden gebruikt om de mogelijke impact van de teststof op de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. De test moet een reële meting van het percentage levensvatbare cellen in een well kunnen geven, of aangetoond moet kunnen worden dat het direct vergelijkbaar is met (een lineaire functie van) de Live/Dead® Assay (zie aanhangsel III van het validatierapport (4)). Een andere test waarvan is aangetoond dat deze net zo goed werkt is de MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide]-test (18). De beoordeling van de cellevensvatbaarheid met de bovenstaande methoden is een relatieve meting die niet noodzakelijkerwijs een lineair verband vertoont met het absolute aantal cellen in een well. Daarom moet de analist een subjectieve parallelle visuele beoordeling van elke well verrichten, en er moeten digitale foto's van de SC's en de twee hoogste niet-cytotoxische concentraties worden genomen en bewaard zodat later de ware celdichtheid kan worden beoordeeld mocht dat nodig zijn. Als na visuele inspectie of op grond van de levensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest er een toename van het aantal cellen lijkt te zijn, moet de kennelijke toename worden geverifieerd. Als een hoger aantal cellen wordt geverifieerd, moet dit in het testrapport worden vermeld. De levensvatbaarheid van de cellen wordt uitgedrukt ten opzichte van de gemiddelde respons in de SC's, wat beschouwd wordt als 100 % levensvatbare cellen, en wordt op een voor de gebruikte cellevensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest passende wijze berekend. Voor de MTT-test kan de volgende formule worden gebruikt:

% levensvatbare cellen = (respons in well – gemiddelde respons in met MeOH behandelde [= 100 % dode] wells) ÷ (gemiddelde respons in SC-wells – gemiddelde respons in met MeOH behandelde [= 100 % dode] wells)

43.   Wells met een levensvatbaarheid lager dan 80 % ten opzichte van de gemiddelde levensvatbaarheid in de SC's (= 100 % levensvatbaar), mogen niet in de uiteindelijke data-analyse worden meegenomen. Remming van de steroïdogenese die optreedt in aanwezigheid van bijna 20 % cytotoxiciteit moet zorgvuldig worden beoordeeld om er zeker van te zijn dat cytotoxiciteit niet de oorzaak is van de remming.

Hormoonanalyse

44.   Elk laboratorium kan voor de analyse van T en E2 een hormoonmetingssysteem naar keuze gebruiken. Er kunnen reservealiquots van medium uit elke behandelingsgroep worden gebruikt voor het bereiden van oplossingen om de concentratie binnen het lineaire deel van de standaardcurve te brengen. Zoals opgemerkt in punt 29 moet elk laboratorium aantonen dat zijn hormoonmetingssysteem (bv.ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) aan de QC-criteria voldoet door verrijkt medium waaraan een interne hormooncontrole is toegevoegd te analyseren voordat QC-metingen worden verricht of stoffen worden getest. Om ervoor te zorgen dat de componenten van het testsysteem de meting van hormonen niet verstoren, kan het nodig zijn de hormonen voor meting ervan uit de media te extraheren (zie punt 30 voor de omstandigheden waaronder een extractie al of niet vereist is). Aanbevolen wordt om extractie te verrichten volgens de procedures in aanhangsel III van het validatierapport (4).

45.   Als een op de markt verkrijgbare testkit wordt gebruikt om de hormoonproductie te meten, moet de hormoonanalyse worden verricht zoals omschreven in de handleidingen van de fabrikant van de testkit. De meeste fabrikanten hebben een eigen procedure waarmee de hormoonanalyses worden verricht. Oplossingen van monsters moeten zodanig worden aangepast dat de verwachte hormoonconcentraties voor de oplosmiddelcontroles in het midden van het lineaire bereik van de standaardcurve voor de individuele test vallen (aanhangsel III van het validatierapport (4)). Waarden buiten het lineaire deel van de standaardcurve moeten worden verworpen.

46.   Uiteindelijke hormoonconcentraties worden als volgt berekend:

Voorbeeld:

Geëxtraheerd:	450 μl medium
Gereconstitueerd in:	250 μl testbuffer
Oplossing in test:	1:10 (om het monster binnen het lineaire bereik van de standaardcurve te brengen)
Hormoonconcentratie in test:	150 pg/ml (al aangepast aan concentratie per ml getest monster)
Recovery:	89 %
Uiteindelijke hormoonconcentratie =	(Hormoonconcentratie (per ml) ÷ recovery) (verdunningsfactor)
Uiteindelijke hormoonconcentratie =	(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml

Selectie van testconcentraties

47.   Er moeten minimaal twee onafhankelijke metingreeksen van de test plaatsvinden. Tenzij eerdere informatie zoals informatie over oplosbaarheidslimieten of cytotoxiciteit een basis vormt voor selectie van testconcentraties, wordt aanbevolen dat de testconcentraties voor de eerste reeks met intervallen van log10 worden verricht, waarbij 10–3 M de maximale concentratie is. Als de stof oplosbaar is, en bij geen van de geteste concentraties cytotoxisch, en de eerste reeks was negatief voor alle concentraties, dan moet dit worden bevestigd in een extra reeks onder dezelfde omstandigheden als de eerste reeks (tabel 7). Als de resultaten van de eerste reeks ambigu zijn (dat wil zeggen de x-voudige verandering is statistisch significant t.o.v. de SC bij slechts één concentratie) of positief (dat wil zeggen de x-voudige verandering bij twee of meer opeenvolgende concentraties is statistisch significant), moet de test worden herhaald zoals aangegeven in tabel 7 door de geselecteerde testconcentraties te verfijnen. De testconcentraties in metingen twee en drie (waar van toepassing) moeten worden aangepast op de basis van de resultaten van uiterste concentraties van de eerste reeks metingen waarbij een effect optrad met concentratie-intervallen van 1/2-log (bv.als de oorspronkelijke reeks van 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM bij 1 en 10 μM tot inductie leidde, moeten de bij de tweede reeks geteste concentraties 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM zijn), tenzij lagere concentraties gebruikt moeten worden om een LOEC te bereiken. In dat laatste geval moeten bij de tweede meting minstens vijf concentraties onder de laagste bij de eerste reeks geteste concentratie worden gebruikt aan de hand van een 1/2-log-schaal. Als de tweede reeks de eerste reeks niet bevestigt (d.w.z. statistische significantie treedt niet op bij de eerder positief geteste concentratie ± 1 concentratiestap), moet een derde experiment verricht worden in de oorspronkelijke testomstandigheden. Ambigue resultaten bij de eerste reeks worden als negatief beschouwd als het waargenomen effect bij geen van de twee volgende reeksen kan worden bevestigd. Ambigue resultaten worden als positieve respons (effect) beschouwd als de respons bij minstens één volgende meting kan worden bevestigd binnen een ± 1 concentratiestap (zie afdeling 55 voor de procedure voor interpretatie van gegevens).

Tabel 7

Beslissingsmatrix voor mogelijke uitkomstscenario's

Reeks 1	Reeks 2		Reeks 3		Beslissing
Scenario	Beslissing	Scenario	Beslissing	Scenario	Positief	Negatief
Negatief	Bevestig (26)	Negatief	Stop			X
Negatief	Bevestig (26)	Positief	Verfijn (27)	Negatief		X
Ambigu (28)	Verfijn (27)	Negatief	Bevestig (26)	Negatief		X
Ambigu (28)	Verfijn (27)	Negatief	Bevestig (26)	Positief	X
Ambigu (28)	Verfijn (27)	Positief			X
Positief	Verfijn (27)	Negatief	Bevestig (26)	Positief	X
Negatief	Bevestig (26)	Positief	Verfijn (27)	Positief	X
Positief	Verfijn (27)	Positief	Stop		X

Kwaliteitscontrole van de testplaat

48.   Naast de criteria voor de QC-plaat moet ook worden voldaan aan andere kwaliteitscriteria met betrekking tot een acceptabele variatie tussen duplowells, duplo-experimenten, lineariteit en sensitiviteit van hormoonmetingssystemen, variabiliteit tussen duplohormoonmetingen van hetzelfde monster, en percentage recovery van hormoontoevoegingen na extractie van medium (waar van toepassing, zie punt 30 over extractievereisten); deze staan in tabel 8. Gegevens moeten binnen het acceptabele bereik vallen dat gedefinieerd is voor elke parameter dat voor nadere beoordeling wordt overwogen. Als aan deze criteria niet wordt voldaan, moet in de spreadsheet worden aangegeven dat voor het desbetreffende monster niet aan de QC-criteria is voldaan, en dat het monster opnieuw moet worden geanalyseerd of uit de dataset moet worden verwijderd.

Tabel 8

Acceptabel(e) bereik en/of variatie (%) van testplaatparameters voor H295R-test.

(LOQ: Kwantificeringslimiet van hormoonmetingssysteem. CV: Variatiecoëfficiënt; SC: Oplosmiddelcontrole; DPM: Desintegraties per minuut.)

	Vergelijking tussen	T	E2
Basale hormoonproductie in SC's	X maal hoger dan LOQ	≥ 5 maal	≥ 2,5 maal
Blootstellingsexperimenten — Binnen plaat-CV voor SC's (duplowells)	Absolute concentraties	≤ 30 %	≤ 30 %
Blootstellingsexperimenten — Tussen plaat-CV voor SC's (duplo-experimenten)	X-voudige verandering	≤ 30 %	≤ 30 %
Hormoonmetingsysteem — sensitiviteit	Detecteerbare x-voudige afname t.o.v. SC	≥ 5 maal	≥ 2,5 maal
Hormoonmetingssysteem — Duplometing CV voor SC's (29)	Absolute concentraties	≤ 25 %	≤ 25 %
Mediumextractie — Recovery van interne 3H-standaard (waar van toepassing)	DPM	≥ 65 % Nominaal

GEGEVENSANALYSE EN RAPPORTAGE

Gegevensanalyse

49.   Om de relatieve toename/afname van de door de stof gewijzigde hormoonproductie te beoordelen, moeten de resultaten worden genormaliseerd naar de gemiddelde SC-waarde van elke testplaat, en de resultaten uitgedrukt in veranderingen ten opzichte van de SC in elke testplaat. Alle gegevens moeten worden uitgedrukt in gemiddeld ± 1 standaarddeviatie (SD).

50.   Alleen hormoongegevens uit wells waarin de cytotoxiciteit minder dan 20 % was moeten in de gegevensanalyse worden opgenomen. De relatieve veranderingen moeten als volgt worden berekend:

Relatieve verandering = (Hormoonconcentratie in elke well) ÷ (Gemiddelde hormoonconcentratie in alle wells met oplosmiddelcontrole).

51.   Als door visuele inspectie van de well of op grond van de in punt 42 beschreven levensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest er een toename in aantal cellen lijkt te zijn, moet de kennelijke toename worden geverifieerd. Als een hoger aantal cellen wordt geverifieerd, moet dit in het testrapport worden vermeld.

52.   Voordat statistische analyses worden verricht, moeten de aannames van normaliteit en homogeniteit van variantie worden beoordeeld. Normaliteit moet worden beoordeeld met standaard waarschijnlijkheidsplots of een andere geschikte statistische methode (bv. toets van Shapiro-Wilk). Als de gegevens (x-voudige veranderingen) niet normaal verdeeld zijn, moet transformatie van de gegevens worden geprobeerd om een normale verdeling zo goed mogelijk te benaderen. Als de gegevens normaal verdeeld zijn of een normale verdeling benaderen, moeten verschillen tussen de stofconcentratiegroepen en SC's worden geanalyseerd met een parametrische test (bv. toets van Dunnett) waarbij concentratie de onafhankelijke, en respons (x-voudige verandering) de afhankelijke variabele is. Als gegevens niet normaal verdeeld zijn, moet een passende niet-parametrische test worden gebruikt (bv. Kruskal Wallis, Steel's Many-one rank test). Verschillen worden als significant beschouwd bij p ≤ 0,05. Statistische beoordelingen worden verricht op basis van gemiddelde waarden voor elke well die onafhankelijke duplogegevenspunten vertegenwoordigen. Verwacht wordt dat vanwege de grote dosisintervallen bij de eerste reeks (log10-schaal), het in veel gevallen niet mogelijk zal zijn om een duidelijke concentratie-responsrelatie te beschrijven waar de twee hoogste doses zich op het lineaire deel van de sigmoïde curve zullen bevinden. Daarom wordt voor de eerste reeks of enige andere dataset waar deze omstandigheid optreedt (bv. waar geen maximale effectiviteit kan worden geschat) een vaste-variabelestatistiek type I toegepast.

53.   Als meer dan twee datapunten op het lineaire deel van de curve liggen en waar maximale effectiviteit kan worden berekend (wat wordt verwacht van enkele van de 2nd reeksen die worden verricht met semi-log-intervallen van de blootstellingsconcentratie) moet een probit-, logit- of ander passend regressiemodel worden gebruikt om effectieve concentraties te berekenen (bv.EC50 en EC20).

54.   De resultaten moeten zowel in grafiek (staafdiagram die gemiddelde +/– 1 SD weergeeft) als in tabel (LOEC/NOEC, effectrichting, en sterkte van de maximale respons die deel uitmaakt van het dosis-responsdeel van de gegevens) worden weergegeven (zie figuur 3 voor een voorbeeld). De gegevensbeoordeling wordt alleen als geldig beschouwd als deze is gebaseerd op minstens twee onafhankelijk verrichte reeksen. Een experiment of reeks wordt als onafhankelijk beschouwd als dit/deze verricht is op een andere datum met een nieuwe set oplossingen en controles. Het bij reeksen 2 en 3 (zo nodig) gebruikte concentratiebereik kan worden aangepast op basis van de resultaten van reeks 1 om het dosisresponsbereik dat de LOEC bevat beter te definiëren (zie punt 47).

Figuur 3

Voorbeeld van de presentatie en beoordeling van gegevens die met de test verkregen zijn in grafiek en tabel.

Een asterisk wijst op een statistisch significant verschil ten opzichte van oplosmiddelcontrole (p< 0,05). LOEC: Laagst waargenomen effectieve concentratie; Max verandering: Maximale sterkte van de respons die bij elke concentratie is waargenomen ten opzichte van de gemiddelde SC-respons (= 1)

Stof	LOEC	Max. verandering
Forskoline	0,01	0,15-voudig
Letrozol	0,001	29-voudig

Procedure voor gegevensinterpretatie

55.   Een teststof wordt positief geacht als de x-voudige inductie statistisch verschilt (p ≤ 0,05) van de oplosmiddelcontrole bij twee opeenvolgende concentraties in minstens twee onafhankelijke reeksen (tabel 7). Een teststof wordt negatief geacht na twee onafhankelijke negatieve reeksen, of bij drie reeksen, te weten twee negatieve reeksen en een ambigue of positieve reeks. Als de bij drie onafhankelijke experimenten verkregen gegevens niet voldoen aan de beslissingscriteria in tabel 7, zijn de resultaten van het experiment niet interpreteerbaar. Resultaten bij concentraties die de oplosbaarheidslimieten te boven gaan of bij cytotoxische concentraties mogen niet bij de interpretatie van de resultaten worden meegenomen.

Testverslag

56.   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Testfaciliteit:

—	naam faciliteit en locatie,

—	onderzoeksleider en andere medewerkers en hun verantwoordelijkheden in het onderzoek,

—	datums dat het onderzoek begon en stopte.

Teststof, reagens en controles:

—	identiteit (naam/CAS-nr. waar van toepassing), herkomst, partijnummer, zuiverheid, leverancier, en kenmerken van de teststof, reagens en controles,

—	fysische aard en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de teststof,

—	bewaarcondities en de methode en frequentie van bereiding van teststoffen, reagens en controles,

—	stabiliteit van de teststof.

Cellen:

—	herkomst en type van de cellen,

—	aantal celpassages (celpassage-identificator) van bij test gebruikte cellen,

—	omschrijving van procedures voor instandhouding van celkweken.

Vereisten voorafgaande aan de test (waar van toepassing):

—	omschrijving en resultaten van test op interferentie teststof-/hormoontest,

—	omschrijving en resultaten van meting van efficiëntie van hormoonextractie,

—	standaarden en calibratiecurves voor alle te verrichten analytische testen,

—	detectielimieten voor de geselecteerde analytische testen.

Testomstandigheden:

—	samenstelling van media,

—	concentratie van de teststof,

—	celdichtheid (geschatte of gemeten celconcentratie na 24 uur en 48 uur),

—	oplosbaarheid van de teststof (limiet van oplosbaarheid, indien bepaald),

—	incubatietijd en omstandigheden.

Testresultaten:

—	onbewerkte gegevens voor elke well voor controles en teststoffen-elke duplometing in de vorm van de oorspronkelijke gegevens die zijn geleverd door het instrument dat is gebruikt om de hormoonproductie te meten (bv. OD, fluorescentie-eenheden, DPM enz.),

—	validatie van normaliteit of verklaring van gegevenstransformatie,

—	gemiddelde respons +/– 1 SD voor elke gemeten well,

—	gegevens over cytotoxiciteit (testconcentraties die cytotoxiciteit veroorzaakte),

—	bevestiging dat aan de QC-vereisten is voldaan,

—	relatieve verandering t.o.v. oplosmiddelcontrole gecorrigeerd voor cytotoxiciteit,

—	een staafdiagram die de relatieve (x-voudige verandering) toont bij elke concentratie, SD en statistische significantie zoals omschreven in punten 49-54.

Gegevensinterpretatie:

—	pas de procedure voor gegevensinterpretatie toe op de resultaten en bespreek bevindingen.

Bespreking:

—	zijn er indicaties uit het onderzoek over de mogelijkheid dat de T/E2-gegevens beïnvloed kunnen zijn door indirecte effecten op de gluco- en mineraalcorticoïden?

Conclusies

LITERATUUR

1.

OESO (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals, in aanhangsel 2 van hoofdstuk B.54 van deze bijlage

2.

Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production, Toxicol. Appl. Pharmacol., 217, 114-124.

3.

Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies. Env. Sci. Pollut. Res., 14, 23-30.

4.

OESO (2010), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MONO(2010)31, Parijs. Te vinden op [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html]

5.

OESO (2010), Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for Steroidogenesis, OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/JM/MONO(2010)32, Parijs. Te vinden op: [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html]

6.

Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Te vinden op: [http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05.pdf]

7.

Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroidogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR, Toxicol. Sci., 81, 78-89.

8.

Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. (2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells, Toxicol. Appl. Pharmacol., 182, 44-54.

9.

Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. (2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to predict biochemical response to endocrineactive chemicals: Model development for metyrapone, Environ. Health Perspect., 118: 265-272.

10.

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell line, Environ. Sci. Poll. Res., 17:1137-1148.

11.

Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid biosynthesis, Cancer Res., 50, 5488-5496.

12.

He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the H295R cell line, Chemosphere, 80:578-584.

13.

Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line, Environ. Sci. Technol., 39:2777-2785.

14.

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line, Environ. Sci. Pol. Res., 17:1137-1148.

15.

Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids, J. Clin. Endocrinol. Metab., 77, 731-737.

16.

Hoofdstuk B.55 van deze bijlage: Hershberger-bioassay bij ratten: een kortlopende screeningstest op (anti)androgene eigenschappen.

17.

Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1-propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay, J. Lab. Clin. Med., 2, 222-231.

18.

Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 65, 55-63.

19.

Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.

20.

Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484-492.

B.58.   GENMUTATIETESTEN MET SOMATISCHE CELLEN EN GESLACHTSCELLEN VAN TRANSGENE KNAAGDIEREN

INLEIDING

1.   Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 488 (2013) van de OESO. Voor een grote verscheidenheid aan in-vitromutatietesten waarmee chromosomale en/of genmutaties kunnen worden gedetecteerd, zijn EU-testmethoden beschikbaar. Er bestaan testmethoden voor in-vivo-eindpunten (d.w.z. chromosoomaberraties en DNA-herstelsynthese). Hiermee worden echter geen genmutaties bepaald. Mutatietesten bij transgene knaagdieren (transgenic rodent, TGR) voorzien in de behoefte aan praktische en algemeen beschikbare in-vivotesten voor genmutaties.

2.   De TGR-mutatietesten zijn uitgebreid beoordeeld (24) (33). Er wordt gebruikgemaakt van transgene ratten en muizen die meerdere kopieën van chromosomaal geïntegreerde plasmide- of faag-shuttlevectoren bevatten. De transgenen bevatten reporter-genen voor de detectie van verscheidene typen mutaties die in vivo door chemische teststoffen zijn geïnduceerd.

3.   De mutaties die ontstaan in een knaagdier worden bepaald door isolatie van het transgen en analyse van het fenotype van het reporter-gen in een bacteriële gastheer waarin het reporter-gen ontbreekt. Door middel van TGR-genmutatietesten worden mutaties bepaald die zijn geïnduceerd in genetisch neutrale genen die zijn geïsoleerd uit vrijwel elk weefsel van het knaagdier. Met deze testen worden daarom veel van de bestaande beperkingen omzeild die samenhangen met het onderzoek van in-vivogenmutatie in endogene genen (bv. beperkte weefsels die geschikt zijn voor analyse, negatieve/positieve selectie voor mutaties).

4.   De bewijskracht wijst erop dat transgenen op vergelijkbare wijze reageren op mutagenen als op endogene genen, in het bijzonder met betrekking tot de detectie van basenpaarsubstituties, frameshift-mutaties en kleine deleties en inserties (24).

5.   De International Workshops on Genotoxicity Testing (IWGT) hebben de opname van TGR-genmutatietesten voor in-vivodetectie van genmutaties gesteund en hebben een protocol aanbevolen voor de tenuitvoerlegging ervan (15) (29). Deze testmethode is gebaseerd op de aanbevelingen. Verdere analyse ter ondersteuning van het gebruik van dit protocol is te vinden in (16).

6.   Naar verwachting is het in de toekomst wellicht mogelijk om een TGR-genmutatietest te combineren met een toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening (hoofdstuk B.7 van deze bijlage). Er zijn echter gegevens noodzakelijk om te waarborgen dat de gevoeligheid van de TGR-genmutatietesten niet wordt beïnvloed door de kortere tijdsduur van één dag tussen het einde van de toedieningsperiode en het monsternamepunt, zoals bij het toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening het geval is, vergeleken met de drie dagen als in de TGR-genmutatietesten. Bovendien zijn er gegevens noodzakelijk die erop wijzen dat de prestatie van de test bij herhaalde toediening niet negatief wordt beïnvloed door een transgene knaagdierstam te gebruiken en geen traditionele knaagdierstam. Zodra deze gegevens beschikbaar zijn, zal deze testmethode bijgewerkt worden.

7.   De definities van kernbegrippen worden uiteengezet in het aanhangsel.

INLEIDENDE OVERWEGINGEN

8.   Voor de volgende TGR-genmutatietesten zijn voldoende gegevens beschikbaar om het gebruik ervan bij deze testmethode te ondersteunen: lacZ bacteriofaag muis (Muta™Mouse); lacZ plasmide muis; gpt delta (gpt en Spi–) muis en rat; lacI muis en rat (Big Blue®), uitgevoerd onder standaardomstandigheden. Daarnaast kan de cII-positieveselectietest worden gebruikt voor beoordeling van mutaties in de Big Blue®- en Muta™Mouse-modellen. Mutagenese in de TGR-modellen wordt doorgaans beoordeeld als mutantfrequentie; indien nodig kan echter moleculaire analyse van de mutaties aanvullende informatie geven (zie paragraaf 24).

9.   Deze in-vivogenmutatietesten bij knaagdieren zijn met name in die zin relevant voor de beoordeling van het gevaar van mutagene effecten, dat de responsen van de testen afhangen van het in-vivometabolisme, de farmacokinetiek, de DNA-herstelsynthese en de translaesie-DNA-synthese, hoewel deze aspecten per soort, weefsel en type DNA-schade kunnen verschillen. Een in-vivotest voor genmutaties is nuttig voor nader onderzoek van een mutageen effect dat is gedetecteerd door een in-vitrosysteem en voor de follow-up van resultaten van testen waarbij gebruik wordt gemaakt van andere in-vivo-eindpunten (24). Naast het oorzakelijke verband ervan met de inductie van kanker, is genmutatie een relevant eindpunt voor de voorspelling van aan mutatie ten grondslag liggende niet-kankerziekten in somatische weefsels (12) (13) alsook ziekten die worden overgedragen via de kiembaan.

10.   Indien er aanwijzingen bestaan dat de chemische teststof of een relevant metaboliet geen van de te onderzoeken weefsels zal bereiken, is uitvoering van een TGR-genmutatietest niet geschikt.

PRINCIPE VAN DE TEST

11.   In de in paragraaf 8 beschreven testen is het doelgen bacterieel of bacteriofaag van oorsprong en vindt isolatie uit het genomische knaagdier-DNA plaats door opname van het transgen in een λ-bacteriofaag- of plasmide-shuttlevector. De procedure behelst de extractie van genomisch DNA uit het te onderzoeken knaagdierweefsel, in-vitrobewerking van het genomische DNA (d.w.z. verpakking van λ-vectoren of ligatie en elektroporatie van plasmiden om de shuttlevector te isoleren), en vervolgens detectie van mutaties in bacteriële gastheren onder geschikte omstandigheden. Bij de testen worden neutrale transgenen toegepast die gemakkelijk uit de meeste weefsels te isoleren zijn.

12.   Het basis-TGR-genmutatie-experiment omvat behandeling van het knaagdier met een chemische stof gedurende een bepaalde tijdsduur. Chemische stoffen kunnen worden toegediend via elke geschikte route, waaronder implantatie (bv. testen van medische hulpmiddelen). De totale periode waarin het dier de stoffen krijgt, wordt aangeduid als de toedieningsperiode. De toediening wordt gewoonlijk, vóór het doden van het dier, gevolgd door een tijdsperiode waarin de chemische stof niet wordt toegediend en waarin niet-gerepareerde DNA-laesies worden gefixeerd tot stabiele mutaties. In de literatuur worden voor deze periode verscheidene termen gebruikt, namelijk manifestatietijd, fixatietijd of expressietijd; het einde van deze periode is het monsternamepunt (15) (29). Nadat het dier is gedood, wordt genomisch DNA uit het/de te onderzoeken weefsel(s) geïsoleerd en gezuiverd.

13.   De gegevens voor één weefsel per dier van meerdere verpakkings/ligatiebewerkingsstappen worden gewoonlijk bijeengevoegd en de mutantfrequentie wordt doorgaans beoordeeld met behulp van in totaal tussen 105 en 107 plaquevormende of kolonievormende eenheden. Bij gebruik van positieveselectiemethoden wordt het totaal aantal plaquevormende eenheden bepaald met een aparte set van niet-selectieve platen.

14.   Positieveselectiemethoden zijn ontwikkeld om de detectie van mutaties in zowel het gpt-gen [gpt delta muis en rat, gpt –-fenotype (20) (22) (28)] en het lacZ-gen [Muta™Mouse of lacZ plasmide muis (3) (10) (11) (30)] mogelijk te maken; terwijl lacI-genmutaties in Big Blue®-dieren worden gedetecteerd door middel van een niet-selectieve methode waarmee mutanten worden geïdentificeerd door vorming van gekleurde (blauwe) plaques. Positieveselectiemethodologie dient tevens voor de detectie van puntmutaties die ontstaan in het cII-gen van de λ-bacteriofaag-shuttlevector [Big Blue® muis of rat en Muta™Mouse (17)] en deletiemutaties in de λ-red- en gam-genen [Spi–-selectie in gpt delta muis en rat (21) (22) (28)]. De mutantfrequentie wordt berekend door het aantal plaques/plasmiden die mutaties in het transgen bevatten te delen door het totaal aantal plaques/plasmiden die uit hetzelfde DNA-monster zijn geïsoleerd. In TGR-genmutatieonderzoeken is de mutantfrequentie de gerapporteerde parameter. Bovendien kan een mutantfrequentie worden bepaald als de fractie van cellen die onafhankelijke mutaties dragen; bij deze berekening is het noodzakelijk te corrigeren voor klonale expansie door sequencing van de geïsoleerde mutanten (24).

15.   De mutaties die worden bepaald in de lacI-, lacZ-, cII- en gpt-puntmutatietesten bestaan hoofdzakelijk uit basenpaarsubstitutiemutaties, frameshift-mutaties en kleine inserties/deleties. Het relatieve aandeel van deze mutatietypen binnen spontane mutaties is vergelijkbaar met dat wat wordt gezien in het endogene Hprt-gen. Grote deleties worden alleen gedetecteerd met de Spi–-selectie en de lacZ-plasmidetesten (24). De te onderzoeken mutaties zijn in-vivomutaties die in de muis of rat ontstaan. In-vivo- en ex-vivomutaties, die kunnen ontstaan tijdens de faag/plasmide-isolatie, replicatie of herstel, zijn relatief zeldzaam en kunnen in sommige systemen specifiek worden geïdentificeerd of uitgesloten door het systeem van bacteriële gastheer en positieve selectie.

BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Voorbereidingen

Keuze van de diersoort

16.   Er zijn momenteel diverse genmutatiedetectiemodellen met transgene muizen beschikbaar. Deze systemen zijn vaker toegepast dan modellen met transgene ratten. Als de rat duidelijk een geschikter model is dan de muis (bv. bij het onderzoeken van het mechanisme van carcinogenese voor een tumor die alleen bij ratten voorkomt, om de correlatie vast te stellen met een toxiciteitsonderzoek bij ratten of als bekend is dat het metabolisme van de rat representatiever is voor het metabolisme van de mens), dient het gebruik van modellen met transgene ratten te worden overwogen.

Huisvestings- en voedingsomstandigheden

17.   De temperatuur in de proefdierruimte moet idealiter 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid ten minste 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar handhaving van een relatieve vochtigheid van 50-60 %. Er dient kunstlicht te worden gebruikt, met een dagelijkse opeenvolging van 12 uur licht, gevolgd door 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof via het voer wordt toegediend. De dieren moeten worden gehuisvest in kleine groepen (niet meer dan vijf) van hetzelfde geslacht indien geen agressief gedrag wordt verwacht. De dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is.

Voorbereiding van de dieren

18.   Gezonde jonge geslachtsrijpe volwassen dieren (8-twaalf weken oud bij aanvang van de behandeling) worden willekeurig toegewezen aan de controlegroep en de behandelgroep. De dieren krijgen een unieke code. De dieren krijgen ten minste vijf dagen de tijd om aan de omstandigheden in het laboratorium te wennen. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Per geslacht moet bij het begin van het onderzoek het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht bedragen.

Voorbereiding van de doses

19.   Vaste chemische teststoffen moeten worden opgelost of gesuspendeerd in geschikte oplosmiddelen of media of worden vermengd met voedsel of drinkwater voordat dit aan de dieren wordt gegeven. Vloeibare chemische teststoffen kunnen direct worden gegeven of eerst worden verdund. Voor blootstelling via inhalatie kunnen teststoffen worden toegediend als gas, damp of een vaste/vloeibare aerosol, naargelang van de fysisch-chemische eigenschappen ervan. Er dienen verse preparaten van de teststof te worden toegepast, tenzij met stabiliteitsgegevens is aangetoond dat bewaren van het preparaat aanvaardbaar is.

Testomstandigheden

Oplosmiddel/medium

20.   Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisvolumes geen toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de chemische teststof moeten uitgesloten zijn. Als andere oplosmiddelen/media worden gebruikt dan de algemeen bekende, moet het gebruik ervan worden ondersteund met referentiegegevens die wijzen op de verenigbaarheid ervan. Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig oplosmiddel/medium te overwegen.

Positieve controles

21.   Gewoonlijk dienen met de dieren tegelijkertijd positieve controles te worden uitgevoerd. Voor laboratoria met aangetoonde bekwaamheid (zie paragraaf 23) die deze testen routinematig gebruiken, kan DNA van dieren waarmee eerder gelijktijdig positieve controles zijn uitgevoerd in elk onderzoek worden opgenomen om het succes van de methode te bevestigen. Dergelijk DNA van eerdere experimenten moet worden verkregen van dezelfde soort en te onderzoeken weefsels en moet op de juiste wijze worden bewaard (zie paragraaf 36). Wanneer gelijktijdig uitgevoerde positieve controles worden gebruikt, is het niet noodzakelijk dat de toedieningsroute dezelfde is als die van de teststof; het dient echter bekend te zijn dat de positieve controles mutaties induceren in een of meer weefsels die zullen worden onderzocht voor de chemische teststof. De doses van de voor positieve controle gebruikte chemische stoffen dienen zodanig te worden gekozen, dat zwakke of matige effecten worden geproduceerd waarmee de prestatie en gevoeligheid van de test kritisch worden beoordeeld. Voorbeelden van voor positieve controle gebruikte chemische stoffen en enkele van de doelweefsels ervan staan vermeld in tabel 1.

Tabel 1

Voorbeelden van voor positieve controle gebruikte chemische stoffen en enkele van de doelweefsels ervan

Voor positieve controle gebruikte chemische stof en CAS-nr.	Einecs-naam en Einecs-nr.	Kenmerken	Mutatie-doelweefsel
			Rat	Muis
N-ethyl-N-nitroso-ureum [CAS-nr. 759-73-9]	N-ethyl-N-nitroso-ureum [212-072-2]	Direct werkend mutageen	Lever, longen	Beenmerg, colon, colonepitheel, darmen, lever, longen, milt, nier, ovarium-granulosacellen, mannelijke geslachtscellen
Ethylcarbamaat (urethaan) [CAS-nr. 51-79-6]	Urethaan [200-123-1]	Mutageen, vereist metabolisatie maar produceert slechts zwakke effecten		Beenmerg, voormaag, dunne darm, lever, longen, milt
2,4-Diaminotolueen [CAS-nr. 95-80-7]	4-Methyl-m-fenyleendiamine [202-453-1]	Mutageen, vereist metabolisatie, ook positief in de Spi–-test	Lever	Lever
Benzo[a]pyreen [CAS-nr. 50-32-8]	Benzo[def]chryseen [200-028-5]	Mutageen, vereist metabolisatie	Lever, omentum	Beenmerg, borst, colon, voormaag, kliermaag, hart, lever, longen, mannelijke geslachtscellen

Negatieve controles

22.   Voor elk monsternamepunt dienen negatieve controles te worden meegenomen die zijn behandeld met alleen oplosmiddel of medium en verder op dezelfde wijze zijn behandeld als de behandelgroepen. Bij het ontbreken van historische of gepubliceerde controlegegevens waaruit blijkt dat het gekozen oplosmiddel/medium geen schadelijke of mutagene effecten induceert, dienen ook onbehandelde controles te worden meegenomen voor elk monsternamepunt om vast te stellen dat de mediumcontrole aanvaardbaar is.

Verificatie van de geschiktheid van laboratoria

23.   De bekwaamheid in deze testen dient te worden vastgesteld door te bewijzen in staat te zijn verwachte resultaten uit gepubliceerde gegevens (24) te reproduceren voor: 1) mutantfrequenties met voor positieve controle gebruikte chemische stoffen (waaronder zwakke responsen) zoals die staan vermeld in tabel 1, niet-mutagenen en mediumcontroles, en 2) transgenisolatie uit genomisch DNA (bv. verpakkingsefficiëntie).

Sequencing van mutanten

24.   Voor regelgevingstoepassingen is DNA-sequencing van mutanten niet vereist, in het bijzonder niet bij een duidelijk positief of negatief resultaat. Sequencinggegevens kunnen echter nuttig zijn als er sprake is van grote interindividuele variatie. In deze gevallen kan sequencing worden gebruikt om de mogelijkheid van jackpots of klonale voorvallen uit te sluiten door vaststelling van het aandeel van unieke mutanten in een bepaald weefsel. Sequencing van ongeveer 10 mutanten per weefsel per dier moet voldoende zijn om enkel te bepalen of klonale mutanten bijdragen aan de mutantfrequentie; sequencing van wel 25 mutanten kan noodzakelijk zijn om de mutantfrequentie wiskundig te corrigeren voor klonaliteit. Sequencing van mutanten kan ook worden overwogen wanneer kleine toenames in de mutantfrequentie (d.w.z. net hoger dan de onbehandeldecontrolewaarden) zijn vastgesteld. Verschillen in het mutantspectrum tussen de mutantkoloniën van behandelde en onbehandelde dieren kunnen wijzen op een mutageen effect (29). Tevens kunnen mutatiespectra nuttig zijn voor het ontwikkelen van mechanistische hypotheses. Wanneer sequencing deel uit dient te maken van het onderzoeksprotocol is voorzichtigheid geboden ten aanzien van de opzet van dergelijke onderzoeken, in het bijzonder met betrekking tot het aantal gesequencede mutanten per monster om voldoende onderscheidend vermogen, in overeenstemming met het gebruikte statistische model, te verkrijgen (zie paragraaf 43).

PROCEDURE

Aantal en geslacht van de dieren

25.   Het aantal dieren per groep dat voldoende is om het onderscheidend vermogen te verkrijgen dat noodzakelijk is om ten minste een verdubbeling van de mutantfrequentie te kunnen detecteren, dient vooraf te worden bepaald. De groepsgrootte van de dieren zal minimaal vijf zijn. Als het onderscheidend vermogen echter onvoldoende is, dient het aantal dieren in voorkomend geval te worden verhoogd. Doorgaans dienen mannelijke dieren te worden gebruikt. In bepaalde gevallen is testen met alleen vrouwelijke dieren gerechtvaardigd, bv. wanneer vrouwspecifieke geneesmiddelen voor menselijk gebruik worden getest of wanneer vrouwspecifiek metabolisme wordt onderzocht. Indien er significante verschillen bestaan tussen de geslachten wat betreft toxiciteit of metabolisme, zijn zowel mannelijke als vrouwelijke dieren noodzakelijk.

Toedieningsperiode

26.   Op grond van waarnemingen dat mutaties accumuleren met elke behandeling, is een behandelschema van herhaalde doses noodzakelijk met dagelijkse behandelingen gedurende een periode van 28 dagen. Dit wordt gewoonlijk als aanvaardbaar beschouwd, zowel voor voldoende accumulatie van mutaties door zwakke mutagenen als voor een blootstellingstijd die toereikend is voor de detectie van mutaties in langzaam delende organen. Voor sommige beoordelingen kunnen alternatieve behandelschema's geschikt zijn en deze alternatieve toedieningsschema's dienen in het protocol wetenschappelijk onderbouwd te worden. Behandelingen dienen niet korter te zijn dan de tijd die nodig is voor de volledige inductie van alle relevante metaboliserende enzymen, en kortere behandelingen kunnen het noodzakelijk maken meerdere monsternamepunten, die geschikt zijn voor organen met verschillende proliferatiesnelheden, te gebruiken. In ieder geval dient alle beschikbare informatie (bv. over algemene toxiciteit of metabolisme en farmacokinetiek) te worden gebruikt bij de onderbouwing van een protocol, in het bijzonder wanneer wordt afgeweken van de bovenstaande standaardaanbevelingen. Vanwege mogelijke verhoging van de gevoeligheid dienen behandeltijden langer dan acht weken duidelijk te worden toegelicht en te worden onderbouwd, aangezien lange behandeltijden een duidelijke toename in de mutantfrequentie door klonale expansie kunnen bewerkstelligen (29).

Dosisniveaus

27.   Dosisniveaus moeten worden gebaseerd op de resultaten van een doseringsbereikstudie waarin de algehele toxiciteit wordt gemeten en die verricht is via dezelfde blootstellingsroute, of op de resultaten van eerder verrichte subacute toxiciteitsonderzoeken. Niet-transgene dieren van dezelfde knaagdierstam kunnen worden gebruikt om het doseringsbereik vast te stellen. In de hoofdtest moet, om dosisresponsinformatie te krijgen, een volledig onderzoek een negatieve controlegroep omvatten (zie paragraaf 22) en minimaal drie dosisniveaus die voldoende ver uit elkaar liggen, behalve als de limietdosis gebruikt is (paragraaf 28). De hoogste dosis moet de Maximale Verdragen Dosis (Maximum Tolerated Dose — MTD) zijn. De MTD wordt gedefinieerd als de dosis die tekenen van toxiciteit geeft waarbij hogere doses, op basis van hetzelfde doseringsschema, naar verwachting tot de dood zou leiden. Chemische stoffen met specifieke biologische activiteit bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) en chemische stoffen die verzadiging van toxicokinetische eigenschappen vertonen kunnen uitzonderingen zijn op de doseringscriteria en moeten per geval worden beoordeeld. De gebruikte dosisniveaus moeten een bereik dekken van maximale tot weinig of geen toxiciteit.

Limiettest

28.   Als uit doseringsbereikstudies of bestaande gegevens bij gerelateerde knaagdierstammen blijkt dat een behandelingsregime van minstens de limietdosis (zie onder) geen waarneembare toxische effecten geeft, en als genotoxiciteit op grond van gegevens bij structuurgerelateerde chemische stoffen naar verwachting geen genotoxiciteit geeft, dan is een volledig onderzoek met drie dosisniveaus mogelijk niet nodig. Voor een toedieningsperiode van 28 dagen (d.w.z. 28 dagelijkse behandelingen) is de limietdosis 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag. Voor een toedieningsperiode van 14 dagen of minder is de limietdosis 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag (doseringsschema's die afwijken van 28 dagelijkse behandelingen moeten in het protocol wetenschappelijk worden onderbouwd; zie paragraaf 26).

Toediening van de doses

29.   De teststof wordt meestal toegediend via een maagsonde of een geschikte intubatiecanule. Over het algemeen moet bij de opzet van een test rekening worden gehouden met de verwachte blootstellingsroute bij mensen. Daarom kunnen andere blootstellingsroutes (zoals drinkwater, subcutaan, intraveneus, topicaal, inhalatie, intratracheaal, voeding of implantatie) aanvaardbaar zijn als deze onderbouwd kunnen worden. Intraperitoneale injectie wordt niet aanbevolen omdat deze bij mensen geen fysiologisch relevante blootstellingsroute is. Het maximale vloeistofvolume dat via sonde of injectie per keer kan worden toegediend hangt af van de grootte van het dier. Het volume mag niet hoger zijn dan 2 ml/100 g lichaamsgewicht. Hogere volumes dan dit moeten worden onderbouwd. Behalve bij irriterende of bijtende stoffen, die normaal gesproken bij hogere concentraties hevigere effecten hebben, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat er op alle dosisniveaus hetzelfde volume wordt toegediend.

Bemonsteringstijdstip

Somatische cellen

30.   Het bemonsteringstijdstip is een kritische variabele omdat deze wordt bepaald door de periode die nodig is om mutaties te fixeren. Deze periode is weefselspecifiek en lijkt verband te houden met de vernieuwingstijd van de celpopulatie, waarbij beenmerg en darm snelle responders zijn en de lever veel langzamer is. Een geschikt compromis voor meting van mutatiefrequenties bij zowel snel als langzaam prolifererende weefsels is 28 dagen opeenvolgende dagelijkse behandelingen (zoals beschreven in paragraaf 26) en monstername drie dagen na de laatste behandeling; maar de maximale mutatiefrequentie zal zich onder deze omstandigheden bij langzaam prolifererende weefsels mogelijk niet manifesteren. Als langzaam prolifererende weefsels van bijzonder belang zijn, dan kan een later bemonsteringstijdstip 28 dagen na de toedieningsperiode van 28 dagen geschikter zijn (16) (29). In dergelijke gevallen komt het latere bemonsteringstijdstip in de plaats van de bemonstering na drie dagen; dit zou wetenschappelijk onderbouwd moeten worden.

Geslachtscellen

31.   TGR-tests zijn goed geschikt voor onderzoek naar genmutatie-inductie bij mannelijke geslachtscellen (7) (8) (27), waarin de tijd en kinetiek van de spermatogenese goed gedefinieerd zijn (27). Omdat het aantal eicellen dat voor analyse beschikbaar is laag is, zelfs na superovulatie, en er geen DNA-synthese in de oöcyt plaatsvindt, kunnen mutaties in vrouwelijke geslachtscellen niet bepaald worden met transgene tests (31).

32.   De bemonsteringstijdstippen voor mannelijke geslachtscellen moet zo worden gekozen dat alle blootgestelde celtypen gedurende de gehele geslachtscelontwikkeling worden bemonsterd en dat het doelstadium in de monstername voldoende wordt blootgesteld. De tijd voor de progressie van ontwikkelende geslachtscellen van spermatogoniale stamcellen tot rijp sperma dat de vas deferens/cauda epididymisbereikt is ~49 dagen voor de muis (36) en ~70 dagen voor de rat (34) (35). Na blootstelling van 28 dagen gevolgd door een monsterperiode van drie dagen, vertegenwoordigt geaccumuleerd sperma dat uit de vas deferens/cauda epididymis (7)(8) is verkregen een celpopulatie die gedurende ongeveer de tweede helft van de spermatogenese is blootgesteld, die de meiotische en postmeiotische periode omvat, maar niet de spermatogoniale of stamcelperiode. Om voldoende cellen in de vas deferens/cauda epididymis te bemonsteren die tijdens de blootstellingsperiode spermatogoniale stamcellen waren, is een later bemonsteringstijdstip minimaal zeven weken (muizen) of tien weken (ratten) na afloop van de behandeling nodig.

33.   Cellen die geëxtrudeerd zijn uit de seminifereuze tubuli na behandeling van 28 + drie dagen vormen een gemengde populatie die verrijkt is voor alle stadia van ontwikkelende geslachtscellen (7) (8). Het bemonsteren van deze cellen voor het detecteren van genmutaties geeft niet een even exacte beoordeling van de stadia waarin de geslachtscelmutaties geïnduceerd worden als door het bemonsteren van spermatozoën uit de vas deferens/cauda epididymis (omdat er een verscheidenheid aan geslachtsceltypen uit de tubuli wordt bemonsterd en deze celpopulatie gecontamineerd wordt door enkele somatische cellen). Maar het bemonsteren van cellen uit de seminifereuze tubuli naast spermatozoën uit de vas deferens/cauda epididymis na een bemonsteringsregime van slechts 28 + drie dagen geeft enige dekking van cellen die zijn blootgesteld tijdens de meeste fasen van de geslachtscelontwikkeling, en kan bruikbaar zijn voor het detecteren van bepaalde geslachtscelmutagenen.

Observaties

34.   Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met inachtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De gezondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. Alle dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte. Alle dieren moeten ten minste eenmaal per week worden gewogen, en bij het doden. Ook het voedselverbruik moet ten minste wekelijks worden gemeten. Als de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet het waterverbruik bij elke verversing van water en ten minste wekelijks worden gemeten. Dieren die niet-letale indicatoren van excessieve toxiciteit vertonen moeten voor afloop van de testperiode worden gedood (23).

Weefselverzameling

35.   De rationale voor weefselverzameling moet duidelijk worden gedefinieerd. Omdat mutatie-inductie in bijna alle weefsels onderzocht kan worden, moet de selectie van de te verzamelen weefsels worden gebaseerd op de reden voor uitvoering van het onderzoek en eventuele bestaande gegevens over mutageniteit, carcinogeniteit of toxiciteit voor de onderzochte chemische stof. Belangrijke factoren ter overweging moeten zijn de toedieningsroute (op basis van de waarschijnlijke blootstelling bij mensen), de voorspelde weefseldistributie, en het mogelijke werkingsmechanisme. Als er geen achtergrondinformatie beschikbaar is, moeten verschillende somatische weefsels die van belang kunnen zijn, worden verzameld. Dit moeten snel prolifererende, langzaam prolifererende en contactplaatsweefsels zijn. Daarnaast moeten spermatozoën uit de vas deferens/cauda epididymis en zich ontwikkelende geslachtscellen uit de seminifereuze tubuli (zoals beschreven in paragrafen 32 en 33) worden verzameld en opgeslagen voor het geval er in de toekomst op mutageniteit van de geslachtscellen moet worden geanalyseerd. Het orgaangewicht moet worden gemeten, en voor grotere organen moet uit alle dieren hetzelfde gebied worden verzameld.

Opslag van weefsels en DNA

36.   Weefsels (of weefselhomogenaten) moeten worden bewaard bij of onder – 70 °C en binnen 5 jaar voor DNA-isolatie worden gebruikt. Geïsoleerd DNA, gekoeld bewaard bij 4 °C in een geschikte buffer, wordt idealiter binnen één jaar voor mutatieanalyse gebruikt.

Selectie van weefsels voor mutatieanalyse

37.   De keuze van weefsels moet worden gebaseerd op overwegingen zoals: 1) de toedieningsroute of de locatie van eerste contact (bv. glandulaire maag als toediening oraal is, long als toediening per inhalatie is, of huid als topicaal wordt aangebracht), en 2) farmacokinetische parameters die in algemene toxiciteitsonderzoeken zijn waargenomen en die iets zeggen over weefseldispositie, -retentie of -accumulatie, of doelorganen voor toxiciteit. Als onderzoeken worden verricht als vervolg op carcinogeniteitsonderzoeken moeten doelweefsels voor carcinogeniteit worden overwogen. Weefsels voor analyse moeten zo worden gekozen dat chemische stoffen die direct werkende in vitro-mutagenen zijn, snel worden gemetaboliseerd, zeer reactief zijn of slecht worden geabsorbeerd, of die waarvoor het doelweefsel door de toedieningsroute wordt bepaald, maximaal worden gedetecteerd (6).

38.   Als er geen achtergrondinformatie is, en rekening houdend met de contactplaats als gevolg van de toedieningsroute, moeten de lever en minstens één sneldelend weefsel (bv. glandulaire maag, beenmerg) op mutageniteit worden beoordeeld. In de meeste gevallen kunnen de bovenstaande vereisten worden bereikt door analyse van twee zorgvuldig geselecteerde weefsels, maar in sommige gevallen zijn er drie of nog meer nodig. Als er redenen zijn om met name bezorgd te zijn over effecten op geslachtscellen, inclusief positieve reacties in somatische cellen, moeten de geslachtscelweefsels op mutaties worden beoordeeld.

Metingsmethoden

39.   Voor de aanbevolen transgene modellen zijn standaard laboratorium- of gepubliceerde methoden beschikbaar voor de detectie van mutaties: lacZ lambda bacteriofaag en plasmide (30); lacI muis (2) (18); gpt delta muis (22); gpt delta rat (28); cII (17). Modificaties moeten onderbouwd en goed gedocumenteerd worden. Gegevens uit meerdere verpakkingen kunnen worden samengevoegd en gebruikt om een voldoende aantal plaques of kolonies te bereiken. Maar het feit dat er een hoog aantal verpakkingsreacties nodig is om het gewenste aantal plaques te bereiken, kan wijzen op slechte DNA-kwaliteit. In zulke gevallen moeten de gegevens voorzichtig worden geïnterpreteerd omdat ze mogelijk onbetrouwbaar zijn. Het optimale totale aantal plaques of kolonies per DNA-monster wordt bepaald door de statistische waarschijnlijkheid van het detecteren van voldoende aantallen mutaties bij een gegeven spontane mutatiefrequentie. Over het algemeen zijn minimaal 125 000 tot 300 000 plaques nodig als de spontane mutatiefrequentie in de orde van 3 × 10–5 (15) ligt. Voor de Big Blue® lacI-testmethode is het belangrijk om aan te tonen dat het hele bereik aan mutante kleurfenotypen gedetecteerd kan worden door de passende kleurcontroles bij elke plaat te includeren. Weefsels en de resulterende monsters (items) moeten volgens een blokopzet worden verwerkt en geanalyseerd, waarbij items uit de vehiculum/oplosmiddelcontrolegroep, de positieve controlegroep (indien gebruikt) of positieve controle-DNA (indien passend), en elke behandelingsgroep samen verwerkt worden.

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Verwerking van de resultaten

40.   Gegevens van individuele dieren moeten in tabelvorm worden gepresenteerd. Het dier is de proefeenheid. Het verslag moet het totale aantal plaquevormende eenheden (pfu) of kolonievormende eenheden (cfu) vermelden, met het aantal mutanten, en de mutatiefrequentie voor elk weefsel uit elk dier. Als er meerdere verpakkings/rescue-reacties zijn, moet het aantal reacties per DNA-monster worden vermeld. Hoewel gegevens voor elke individuele reactie bewaard moeten worden, hoeft alleen de totale pfu of cfu gemeld te worden. Gegevens over toxiciteit en klinische tekenen moeten volgens paragraaf 34 worden gemeld. Alle sequentieresultaten moeten voor elke geanalyseerde mutant worden gepresenteerd, en de resulterende mutatiefrequentieberekeningen voor elk dier en weefsel moeten worden getoond.

Statistische beoordeling en interpretatie van resultaten

41.   Er zijn verschillende criteria voor het vaststellen van een positief resultaat, zoals een dosisgerelateerde toename van de mutatiefrequentie, of een duidelijke verhoging van de mutatiefrequentie in een dosisgroep vergeleken met de oplosmiddel/vehiculumcontrolegroep. Minstens drie behandelde dosisgroepen moeten worden geanalyseerd om voldoende gegevens voor een dosisresponsanalyse te verkrijgen. Hoewel de biologische relevantie van de resultaten de primaire overweging moet zijn, kunnen passende statistische methoden worden toegepast als hulpmiddel bij beoordeling van de testresultaten (4) (14) (15) (25) (26). De gebruikte statistische tests moeten het dier als de proefeenheid beschouwen.

42.   Een teststof waarvoor de resultaten niet aan de bovenstaande criteria in enig weefsel voldoen wordt in deze bepaling als niet-mutageen beschouwd. Voor de biologische relevantie van een negatief resultaat moet de weefselblootstelling worden bevestigd.

43.   Voor DNA-sequentieanalyses zijn diverse statistische benaderingen beschikbaar om te helpen bij de interpretatie van de resultaten (1) (5) (9) (19).

44.   Bij beoordeling van de biologische significantie van de respons kan het vaststellen of de waargenomen waarden binnen of buiten het historische controlebereik vallen een aanwijzing vormen (32).

Testverslag

45.   In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Teststof:

—	identificatiegegevens en CAS-nr., indien bekend,

—	bron, partijnummer indien beschikbaar,

—	fysische aard en zuiverheid,

—	fysisch-chemische eigenschappen die voor de uitvoering van het onderzoek relevant zijn,

—	stabiliteit van de teststof, indien bekend.

Oplosmiddel/vehiculum:

—	onderbouwing van keuze vehiculum,

—	oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/vehiculum, indien bekend,

—	bereiding van toedieningsvormen voor voer, drinkwater of inhalatie,

—	analytische bepalingen op toedieningsvormen (zoals stabiliteit, homogeniteit, nominale concentraties).

Proefdieren:

—	gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze,

—	aantal, leeftijd en geslacht van de dieren,

—	de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.,

—	individueel gewicht van de dieren bij de start van de test, waaronder bereik van het lichaamsgewicht, gemiddelde en standaarddeviatie voor elke groep.

Testomstandigheden:

—	positieve en negatieve (vehiculum/oplosmiddel) controlegegevens,

—	gegevens uit het doseringsbereikonderzoek,

—	motivering voor de keuze van de dosisniveaus,

—	gedetailleerde gegevens over de bereiding van de teststof,

—	gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof,

—	motivering voor de toedieningsroute,

—	methoden voor meting van diertoxiciteit, waaronder, indien beschikbaar, histopathologische of hematologische analyses en frequentie waarmee het dier is geobserveerd en het lichaamsgewicht is gemeten,

—	methoden om te verifiëren of de teststof het doelweefsel heeft bereikt, of de algemene circulatie, als negatieve resultaten verkregen zijn,

—	feitelijke dosis (mg/kg lichaamsgewicht/dag) berekend op basis van de teststofconcentratie in voer/drinkwater (ppm) en consumptie, indien van toepassing,

—	gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater,

—	gedetailleerde omschrijving van behandeling en bemonsteringsschema's en motivering van de keuzes,

—	wijze van doden,

—	procedures voor het isoleren en preserveren van weefsels,

—	methoden voor het isoleren van genoom-DNA van de knaagdieren, waarbij het transgen uit het genoom-DNA wordt verkregen en het transgen-DNA wordt overgebracht naar een bacteriële gastheer,

—	bron en partijnummers van alle cellen, kits en reagentia (waar van toepassing),

—	methoden voor de telling van mutanten,

—	methoden voor moleculaire analyse van mutanten en gebruik bij correctie voor clonaliteit en/of berekening van de mutatiefrequenties, indien van toepassing.

Resultaten:

—	conditie van het dier voor en tijdens de testperiode, inclusief tekenen van toxiciteit,

—	lichaams- en orgaangewicht bij het doden van het dier,

—	voor elk weefsel/dier, het aantal mutanten, aantal beoordeelde plaques of kolonies, mutatiefrequentie,

—	voor elk(e) weefsel/diergroep, aantal verpakkingsreacties per DNA-monster, totaal aantal mutanten, gemiddelde mutatiefrequentie, standaarddeviatie,

—	dosisresponsrelatie, waar mogelijk,

—	voor elk weefsel/dier, het aantal onafhankelijke mutanten en gemiddelde mutatiefrequentie, indien moleculaire analyse van mutaties verricht is,

—	gelijktijdige en historische negatieve controlegegevens met bereiken, gemiddelden en standaarddeviaties,

—	gelijktijdige positieve controle (of niet-gelijktijdige DNA-positieve controle) gegevens,

—	analytische bepalingen, indien beschikbaar (bv. DNA-concentraties gebruikt in verpakking, DNA-sequentiegegevens),

—	gebruikte statistische analyses en methoden.

Bespreking van de resultaten

Conclusie

LITERATUUR

1.

Adams, W.T. and T.R. Skopek (1987), „Statistical Testfor the Comparison of Samples from Mutational Spectra”, J. Mol. Biol., 194: 391-396.

2.

Bielas, J.H. (2002), „A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement”, Mutation Res., 518: 107-112.

3.

Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg (1995), „Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo Mutations” Nature, 377(6550): 657-659

4.

Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), „Statistical Design and Analysis of Mutation Studies in Transgenic Mice”, Environ. Mol. Mutagen, 25(3): 246-255.

5.

Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), „Mutational Spectra in Transgenic Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency”, Environ. Mol. Mutagen, 28: 405-413.

6.

Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio and V. Thybaud (1999), „Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens”, Mutagenesis, 14(1): 141-151.

7.

Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper (1995), „Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7485-7489.

8.

Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), „Toward an Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells”, Mutation Res., 388(2-3): 197-212.

9.

Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), „Bayesian Analysis of Mutational Spectra”, Genetics, 156: 1411-1418.

10.

Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. Lohman, D.L. Knook and J. Vijg (1989), „Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20): 7971-7975.

11.

Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), „A Selective System for lacZ-Phage using a Galactose-sensitive E. coli Host”, Biotechniques, 14(3): 326, 330.

12.

Erikson, R.P. (2003), „Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer”, Mutation Res., 543: 125-136.

13.

Erikson, R.P. (2010), „Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer: an Update”, Mutation Res., 705: 96-106.

14.

Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), „Statistical Analysis of lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays”, Mutagenesis, 13(3): 249-255.

15.

Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), „In vivo Transgenic Mutation Assays”, Environ. Mol. Mutagen., 35: 253-259.

16.

Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), „Treatment and Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays”, Environ. Mol. Mutagen., 41: 1-6.

17.

Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya and S. Garges (1996), „Analysis of Genetic Instability during Mammary Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(17): 9073-9078.

18.

Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. Short (1990), „The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutagenicity Testing”, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212-218.

19.

Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns (2008), „Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra using Multivariate Data Analysis”, Carcinogenesis, 29(4): 772-778.

20.

Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni (1996), „A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi– and 6-thioguanine Selections”, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465-470.

21.

Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), „Spi – Selection: an Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice”, Environ. Mol. Mutagen., 34(1): 9-15.

22.

Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), „Recent Advances in the Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays”, Mutation Res., 455(1-2): 191-215.

23.

OESO (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, No19, ENV/JM/MONO(2000)7, OESO, Paris.

24.

OESO (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 103, ENV/JM/MONO(2009)7, OESO, Paris.

25.

Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), „Study Design and Sample Sizes for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay”, Environ. Mol. Mutagen., 25(3): 231-245.

26.

Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and N.J. Gorelick (1997), „Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study”, Mutation. Res., 388(2-3): 249-289.

27.

Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk (2006), „Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays”, Mutation. Res., 598: 164-193.

28.

Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawamura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), „Integration of in vivo Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers”, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78.

29.

Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), „In vivo Transgenic Mutation Assays”, Mutation Res., 540: 141-151.

30.

Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), „Bacteriophage λ and Plasmid lacZ Transgenic Mice for studying Mutations in vivo” in: G. Pfeifer (ed.), Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II, Plenum Press, New York, NY, USA, pp. 391-410.

31.

Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and G.R. Douglas (2005), „A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection of Mutations in Follicular Granulosa Cells”, Mutation Res., 578(1-2): 117-123.

32.

Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud (2011), „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.

33.

OESO (2011), Retrospective Performance Assessment of OECD Test Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 145, ENV/JM/MONO(2011)20, OESO, Parijs.

34.

Clermont, Y. (1972), „Kinetics of spermatogenesis in mammals seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal”. Physiol. Rev. 52: 198-236.

35.

Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), „The Epididymis”, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, the Netherlands, pp. 1071-1148.

36.

Russell, L.B. (2004), „Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse”, Genetica, 122: 25-36.

”