BIJLAGE
De bijlagen bij Uitvoeringsverordening (EU) 2016/1240 worden als volgt gewijzigd:
|
1) |
Bijlage IV wordt als volgt gewijzigd:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
2) |
In bijlage V wordt het volgende deel I bis ingevoegd: „DEEL I BIS Methoden voor de analyse van mageremelkpoeder bestemd voor openbare interventie
Aanhangsel I MAGEREMELKPOEDER: KWANTITATIEVE BEPALING VAN FOSFATIDYLSERINE EN FOSFATIDYLETHANOLAMINE Methode: reversed phase HPLC 1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED De methode beschrijft een procedure voor de kwantitatieve bepaling van fosfatidylserine (PS) en fosfatidylethanolamine (PE) in mageremelkpoeder (MMP) en is geschikt voor de detectie van vaste stoffen uit karnemelk in MMP. 2. DEFINITIE Gehalte aan PS + PE: de massafractie van de met de hier beschreven methode bepaalde stof. Het resultaat wordt uitgedrukt in milligram fosfatidylethanolamine dipalmitoyl (PEDP) per 100 g poeder. 3. PRINCIPE VAN DE METHODE De aminofosfolipiden worden met methanol uit opgelost melkpoeder geëxtraheerd. PS en PE worden met behulp van reversed phase HPLC en fluorescentiedetectie als o-ftaaldialdehyde-derivaten bepaald. Het gehalte aan PS en PE in het testmonster wordt aan de hand van een standaardmonster met een bekend gehalte aan PEDP gekwantificeerd. 4. REAGENTIA Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van ten minste gelijkwaardige zuiverheid te zijn, tenzij anders wordt vermeld. 4.1. Standaardmateriaal: PEDP met een zuiverheid van ten minste 99 % NB: Het standaardmateriaal moet bij – 18 °C worden bewaard. 4.2. Reagentia voor de bereiding van het standaardmonster en het testmonster 4.2.1. Methanol, HPLC-kwaliteit 4.2.2. Chloroform, HPLC-kwaliteit 4.2.3. Tryptamine-monohydrochloride 4.3. Reagentia voor de o-ftaaldialdehyde-derivatisering 4.3.1. Natriumhydroxide, 12 M oplossing in water 4.3.2. Boorzuur, 0,4 M oplossing in water, waarvan de pH met natriumhydroxide (4.3.1) op 10,0 is gebracht 4.3.3. 2-mercapto-ethanol 4.3.4. o-Ftaaldialdehyde (OPA) 4.4. Loopvloeistoffen voor HPLC 4.4.1. De loopvloeistoffen moeten met reagentia van HPLC-kwaliteit worden bereid. 4.4.2. Water van HPLC-kwaliteit 4.4.3. Methanol met een fluorimetrisch bepaalde zuiverheid 4.4.4. Tetrahydrofuraan 4.4.5. Natriumdiwaterstoffosfaat 4.4.6. Natriumacetaat 4.4.7. Azijnzuur 5. APPARATUUR 5.1. Analytische balans, tot op 1 mg nauwkeurig en tot op 0,1 mg afleesbaar 5.2. Bekerglazen, 25 en 100 ml 5.3. Pipetten waarmee 1 en 10 ml kan worden toegevoegd 5.4. Magneetroerder 5.5. Meetpipetten waarmee 0,2, 0,5 en 5 ml kan worden toegevoegd 5.6. Maatkolven, 10, 50 en 100 ml 5.7. Injectiespuiten, 20 en 100 μl 5.8. Ultrasoonbad 5.9. Centrifuge, geschikt voor 27 000 × g 5.10. Glazen flesjes, ongeveer 5 ml 5.11. Maatcilinder, 25 ml 5.12. pH-meter, tot op 0,1 pH-eenheid nauwkeurig 5.13. HPLC-apparatuur 5.13.1. Gradiëntpompsysteem, geschikt voor een debiet van 1,0 ml/minuut bij 200 bar 5.13.2. Autosampler, geschikt voor derivatisering 5.13.3. Kolomverwarming, geschikt om de kolom op 30 °C ± 1 °C te houden 5.13.4. Fluorescentiedetector, geschikt voor een excitatiegolflengte van 330 nm en een emissiegolflengte van 440 nm 5.13.5. Integrator of software voor gegevensverwerking, geschikt voor piekoppervlakmeting 5.13.6. Kolom: LiChrospher® – 100 (250 × 4,6 mm) of een vergelijkbare kolom, gepakt met octadecylsilaan (C 18) met een deeltjesgrootte van 5 μm 6. MONSTERNEMING De monsters moeten overeenkomstig ISO-norm 707 worden genomen. 7. PROCEDURE 7.1. Bereiding van de interne standaardoplossing 7.1.1. Weeg 30,0 ± 0,1 mg tryptamine-monohydrochloride (4.2.3) af in een maatkolf van 100 ml (5.6) en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep. 7.1.2. Pipetteer 1 ml (5.3) van deze oplossing in een maatkolf van 10 ml (5.6) en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep voor een tryptamineconcentratie van 0,15 mM. 7.2. Bereiding van de testoplossing 7.2.1. Weeg 1,000 ± 0,001 g MMP-monster af in een bekerglas van 25 ml (5.2). Voeg met een pipet (5.3) 10 ml gedestilleerd water van 40 °C ± 1 °C toe en roer gedurende 30 minuten met een magneetroerder (5.4) om eventuele klontjes op te lossen. 7.2.2. Pipetteer 0,2 ml (5.5) melkpoederoplossing in een maatkolf van 10 ml (5.6), voeg met een injectiespuit (5.7) 100 μl 0,15 mM tryptamineoplossing (7.1) toe en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep. Meng zorgvuldig door omkeren en ultrasoonbehandeling (5.8) gedurende 15 minuten. 7.2.3. Centrifugeer (5.9) gedurende 10 minuten bij 27 000 g × g en vang het supernatans in een glazen flesje (5.10) op. NB: De testoplossing moet bij 4 °C worden bewaard totdat de HPLC-analyse wordt uitgevoerd. 7.3. Bereiding van de externe standaardoplossing 7.3.1. Weeg 55,4 mg PEDP (4.1) af in een maatkolf van 50 ml (5.6) en voeg met een maatcilinder (5.11) ongeveer 25 ml chloroform (4.2.2) toe. Verwarm de kolf (met een stop erop) tot 50 °C ± 1 °C en meng zorgvuldig tot het PEDP oplost. Koel de kolf af tot 20 °C, vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep en meng door omkeren. 7.3.2. Pipetteer 1 ml (5.3) van deze oplossing in een maatkolf van 100 ml (5.6) en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep. Pipetteer 1 ml (5.3) van deze oplossing in een maatkolf van 10 ml (5.6), voeg 100 μl (5.7) 0,15 mM tryptamineoplossing (7.1) toe en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep. Meng door omkeren. NB: De standaardoplossing moet bij 4 °C worden bewaard totdat de HPLC-analyse wordt uitgevoerd. 7.4. Bereiding van het derivatiseringsreagens Weeg 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4) af in een maatkolf van 10 ml (5.6), voeg 0,5 ml (5.5) methanol (4.2.1) toe en meng zorgvuldig om het OPA op te lossen. Vul met boorzuuroplossing (4.3.2) aan tot de maatstreep en voeg met een injectiespuit (5.7) 20 μl 2-mercapto-ethanol (4.3.3) toe. NB: Het derivatiseringsreagens moet bij 4 °C in een bruine fles worden bewaard en is gedurende één week stabiel. 7.5. Bepaling met HPLC 7.5.1. Loopvloeistoffen (4.4) Vloeistof A: oplossing van 0,3 mM natriumdiwaterstoffosfaat en 3 mM natriumacetaat (met azijnzuur op pH 6,5 ± 0,1 gebracht): methanol:tetrahydrofuraan = 558:440:2 (v/v/v). Vloeistof B: methanol 7.5.2. Aanbevolen loopvloeistofgradiënt:
NB: De loopvloeistofgradiënt moet wellicht enigszins worden gewijzigd om de resolutie van figuur 1 te krijgen. Kolomtemperatuur: 30 °C. 7.5.3. Injectievolume: 50 μl derivatiseringsreagens en 50 μl testoplossing 7.5.4. Equilibreren van de kolom Spoel de kolom elke dag eerst gedurende 15 minuten met 100 % vloeistof B; breng vervolgens de verhouding A:B op 40:60 en equilibreer gedurende 15 minuten bij 1 ml/min. Voer een blancobepaling uit door methanol (4.2.1) te injecteren. NB: Spoel de kolom, als deze lange tijd niet wordt gebruikt, gedurende 30 minuten met methanol:chloroform = 80:20 (v/v). 7.5.5. Bepaal het gehalte aan PS + PE van het testmonster. 7.5.6. Voer de reeks chromatografische analyses uit, waarbij de tijd van run tot run constant wordt gehouden om constante retentietijden te krijgen. Injecteer om de 5-10 testoplossingen de externe standaardoplossing (7.3) om de responsfactor te berekenen. NB: Om de 20-25 runs moet de kolom worden gereinigd door gedurende ten minste 30 minuten met 100 % vloeistof B (7.5.1) te spoelen. 7.6. Wijze van integratie 7.6.1. PEDP-piek PEDP wordt als één piek geëlueerd. Bepaal het piekoppervlak door dal-tot-dalintegratie. 7.6.2. Tryptamine-piek Tryptamine wordt als één piek geëlueerd (figuur 1). Bepaal het piekoppervlak door dal-tot-dalintegratie. 7.6.3. PS- en PE-piekgroepen Onder de beschreven omstandigheden (figuur 1) wordt PS geëlueerd als twee hoofdpieken die elkaar gedeeltelijk overlappen, voorafgegaan door een kleinere piek. PE wordt geëlueerd als drie hoofdpieken die elkaar gedeeltelijk overlappen. Bepaal het totale oppervlak van elke piekgroep, waarbij de basislijn overeenkomstig figuur 1 wordt bepaald. 8. BEREKENING EN WEERGAVE VAN DE RESULTATEN Het gehalte aan PS en PE in het testmonster wordt als volgt berekend: C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2)) Hierbij is:
9. NAUWKEURIGHEID VAN DE METHODE NB: De waarden voor de herhaalbaarheid zijn berekend volgens de internationale IDF-norm (*). 9.1. Herhaalbaarheid De relatieve standaarddeviatie van de herhaalbaarheid, die een maat is voor de variabiliteit van onafhankelijke analyseresultaten die binnen korte tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur onder dezelfde omstandigheden met hetzelfde testmonster worden verkregen, mag niet groter zijn dan 2 %. Als twee bepalingen onder deze omstandigheden worden uitgevoerd, mag het relatieve verschil tussen de twee resultaten niet groter zijn dan 6 % van het rekenkundig gemiddelde van de resultaten. 9.2. Reproduceerbaarheid Als twee resultaten door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur onder verschillende omstandigheden bij de analyse van hetzelfde testmonster worden verkregen, mag het relatieve verschil tussen de twee resultaten niet groter zijn dan 11 % van het rekenkundig gemiddelde van de resultaten. 10. REFERENTIES 10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M.: „Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids”, Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988). Figuur 1 HPLC-patroon van OPA-derivaten van fosfatidylserine (PS) en fosfatidylethanolamine (PE) in methanolextract van opgelost mageremelkpoeder. De integratiewijze voor de pieken van PS, PE en tryptamine (interne standaard) wordt gerapporteerd 
Minuten Fluorescentie (willekeurige eenheden) Aanhangsel II DETECTIE VAN LEBWEI IN VOOR OPENBARE OPSLAG BESTEMD MAGEREMELKPOEDER DOOR DE BEPALING VAN CASEÏNEMACROPEPTIDEN MET BEHULP VAN HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE (HPLC) 1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED Met deze methode kan lebwei in voor openbare opslag bestemd mageremelkpoeder worden gedetecteerd door middel van bepaling van de caseïnemacropeptiden. 2. REFERENTIE Internationale norm ISO 707: Melk en melkproducten — Leidraad voor monsterneming. 3. DEFINITIE Het gehalte aan vaste lebweibestanddelen wordt gedefinieerd als het massapercentage, zoals bepaald door het gehalte aan caseïnemacropeptiden volgens onderstaande methode. 4. PRINCIPE
5. REAGENTIA Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van ten minste gelijkwaardige zuiverheid te zijn. 5.1. Trichloorazijnzuuroplossing Los 240 g trichloorazijnzuur (CCl3COOH) op in water en vul aan tot 1 000 ml. De oplossing moet helder en kleurloos zijn. 5.2. Loopvloeistof, pH 6,0 Los 1,74 g dikaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4), 12,37 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) en 21,41 g natriumsulfaat (Na2SO4) op in ongeveer 700 ml water. Zo nodig wordt de pH met verdund fosforzuur of een kaliumhydroxideoplossing op 6,0 gebracht. Vul met water aan tot 1 000 ml en meng. NB: De samenstelling van de loopvloeistof kan worden aangepast om aan het certificaat van de standaards of de aanbevelingen van de fabrikant van het pakkingsmateriaal van de kolom te voldoen. Filtreer de loopvloeistof vóór gebruik over een membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm. 5.3. Spoelvloeistof Meng één deel acetonitril (CH3CN) met negen delen water. Filtreer het mengsel vóór gebruik over een membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm. NB: Elke andere spoelvloeistof met een bactericide werking die geen nadelige effecten op het scheidend vermogen van de kolom heeft, kan worden gebruikt. 5.4. Standaardmonsters 5.4.1. Mageremelkpoeder dat aan de eisen van deze verordening voldoet (standaard [0]). 5.4.2. Hetzelfde mageremelkpoeder dat is vermengd met 5 % m/m lebweipoeder met een standaardsamenstelling (standaard [5]). 6. APPARATUUR 6.1. Analytische balans 6.2. Eventueel een centrifuge met een centrifugaalkracht tot minimaal 2 200 g, voorzien van centrifugebuizen met stop of dop met een inhoud van ongeveer 50 ml 6.3. Mechanisch schudapparaat 6.4. Magneetroerder 6.5. Glazen trechters, diameter ongeveer 7 cm 6.6. Filtreerpapier, normaal, diameter ongeveer 12,5 cm 6.7. Glazen filtreerapparaat met membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm 6.8. Meetpipetten, geschikt voor 10 ml (ISO 648, klasse A, of ISO/R 835) of een doseersysteem dat in twee minuten 10,0 ml kan toevoegen 6.9. Doseersysteem dat 20,0 ml water bij ongeveer 50 °C kan toevoegen 6.10. Waterbad met thermostaat, ingesteld op 25 ± 0,5 °C 6.11. HPLC-apparaat bestaande uit:
7. MONSTERNEMING 7.1. De monsters moeten worden genomen volgens de procedure van internationale norm ISO 707. De lidstaten mogen echter een andere monsternemingsmethode gebruiken, mits deze de beginselen van bovengenoemde norm in acht neemt. 7.2. Bewaar het monster onder zodanige omstandigheden dat bederf of wijziging van de samenstelling uitgesloten is. 8. PROCEDURE 8.1. Bereiding van het testmonster Breng het melkpoeder over in een houder waarvan de inhoud ongeveer twee keer zo groot is als het volume van het poeder, voorzien van een luchtdicht deksel. Sluit de houder onmiddellijk. Meng het melkpoeder grondig door de houder herhaaldelijk om te keren. 8.2. Testhoeveelheid Weeg in een centrifugebuis (6.2) of een geschikte kolf met stop (50 ml) 2,000 ± 0,001 g testmonster af. 8.3. Verwijdering van vetten en eiwitten 8.3.1. Voeg aan de testhoeveelheid 20,0 ml warm water (50 °C) toe. Los het poeder op door gedurende 5 minuten op het schudapparaat (6.3) te schudden. Zet de buis in het waterbad (6.10) en equilibreer op 25 °C. 8.3.2. Voeg in twee minuten onder krachtig roeren met de magneetroerder (6.4) 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing (5.1) van ongeveer 25 °C toe. Zet de buis gedurende 60 minuten in een waterbad (6.10). 8.3.3. Centrifugeer (6.2) gedurende 10 minuten bij 2 200 g of filtreer over filtreerpapier (6.6), waarbij de eerste 5 ml filtraat niet wordt opgevangen. 8.4. Chromatografische bepaling 8.4.1. Injecteer een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid van 15-30 μl supernatans of filtraat (8.3.3) in het HPLC-apparaat (6.11) bij een debiet van 1,0 ml loopvloeistof (5.2) per minuut. NB 1: Afhankelijk van de inwendige diameter van de gebruikte kolommen of de aanwijzingen van de fabrikant van de kolom kan een ander debiet worden gebruikt. NB 2: Spoel de kolommen gedurende elke onderbreking met water. Laat nooit loopvloeistof (5.2) in de kolommen staan. Spoel de kolommen vóór elke onderbreking van meer dan 24 uur met water en vervolgens gedurende ten minste drie uur met oplossing (5.3) bij een debiet van 0,2 ml per minuut. 8.4.2. De resultaten van de chromatografische analyse van het testmonster [E] worden verkregen in de vorm van een chromatogram, waarin elke piek als volgt wordt geïdentificeerd door zijn retentietijd RT:
De keuze van de kolom(men) kan een significante invloed hebben op de retentietijd van de verschillende pieken. De integrator (6.11.6) berekent automatisch het oppervlak A van elke piek:
Om eventuele onregelmatigheden ten gevolge van slecht werkende apparatuur of kolommen of de herkomst en aard van het geanalyseerde monster te kunnen signaleren, moet vóór de kwantitatieve interpretatie het algemene beeld van elk chromatogram worden bekeken. Bij twijfel wordt de analyse herhaald. 8.5. Kalibratie 8.5.1. Volg voor de standaardmonsters (5.4) exact de onder 8.2 tot en met 8.4.2 beschreven procedure. Gebruik vers bereide oplossingen omdat CMP in 8 % trichloorazijnzuur ontleedt. Het verlies wordt bij 30 °C geraamd op 0,2 % per uur. 8.5.2. Conditioneer de kolommen vóór de chromatografische bepaling van de monsters door herhaaldelijk het standaardmonster (5.4.2) in oplossing (8.5.1) te injecteren totdat het oppervlak en de retentietijd van de CMP-piek constant zijn. 8.5.3. Bepaal de responsfactoren R door hetzelfde volume filtraat (8.5.1) te injecteren als voor de monsters is gebruikt. 9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN 9.1. Berekeningswijze en formules 9.1.1. Berekening van de responsfactoren R:
Hierbij is:
Hierbij is:
9.1.2. Berekening van het relatieve oppervlak van de pieken van monster [E]
Hierbij zijn:
9.1.3. Berekening van de relatieve retentietijd van piek III van monster [E]: RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5]) Hierbij is:
9.1.4. Experimenteel is aangetoond dat er tot 10 % een lineair verband is tussen de relatieve retentietijd van piek III (RRTIII[E]) en het toegevoegde percentage weipoeder:
De toegestane onzekerheid voor de waarden van RRTIII is ± 0,002. Doorgaans verschilt de waarde RRTIII [0] weinig van 1,034. Afhankelijk van de toestand van de kolommen mag deze waarde 1,000 benaderen, maar moet zij wel altijd groter dan 1,000 blijven. 9.2. Bereken het percentage lebweipoeder in het monster: W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)] Hierbij is:
9.3. Nauwkeurigheid van de methode 9.3.1. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die tegelijkertijd of kort na elkaar door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 0,2 % m/m. 9.3.2. Reproduceerbaarheid Het verschil tussen twee aparte en onafhankelijke resultaten die in twee verschillende laboratoria op identiek testmateriaal zijn verkregen, mag niet groter zijn dan 0,4 % m/m. 9.4. Interpretatie 9.4.1. Wei wordt geacht afwezig te zijn als het relatieve oppervlak van piek III (SIII[E]), uitgedrukt in gram lebwei per 100 g product, ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9) is, waarbij:
9.4.2. Bepaal, als het relatieve oppervlak van piek III (SIII[E]) > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) is en het relatieve oppervlak van piek II (SII[E]) ≤ 160 is, het lebweigehalte volgens 9.2. 9.4.3. Bepaal, als het relatieve oppervlak van piek III (SIII[E]) > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) is en het relatieve oppervak van piek II (SII[E]) ≤ 160 is, het totale eiwitgehalte (P %); zie vervolgens de figuren 1 en 2. 9.4.3.1. De resultaten van de analyse van monsters onvermengd mageremelkpoeder met een hoog totaal eiwitgehalte zijn verzameld in de figuren 1 en 2. De doorgetrokken lijn is het resultaat van de lineaire regressie, waarvan de coëfficiënten worden berekend volgens de kleinste kwadratenmethode. De onderbroken lijn is de bovengrens van het relatieve oppervlak van piek III die met een waarschijnlijkheid van 90 % niet zal worden overschreden. De vergelijkingen voor de onderbroken lijnen van de figuren 1 en 2 zijn:
Hierbij is:
Deze vergelijkingen komen overeen met het bij 9.2 vermelde getal 1,3. De afwijking (T1 en T2) tussen het gevonden relatieve oppervlak SIII[E] en het relatieve oppervlak SIII is: T1 = SIII[E] – [(0,376 P % – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)]
Het lebweigehalte wordt berekend met de volgende vergelijking: W = T2 + 0,91 Hierbij is:
Piek II Mageremelkpoeder totaal gehalte aan eiwit (%) Piek III Piek III Mageremelkpoeder Aanhangsel III BEPALING VAN VASTE LEBWEIBESTANDDELEN IN MAGEREMELKPOEDER 1. DOEL: DETECTIE VAN DE TOEVOEGING VAN VASTE LEBWEIBESTANDDELEN AAN MAGEREMELKPOEDER 2. REFERENTIES: INTERNATIONALE NORM ISO 707 3. DEFINITIE Het gehalte aan vaste lebweibestanddelen wordt gedefinieerd als het massapercentage, zoals bepaald door het gehalte aan caseïnemacropeptiden volgens onderstaande methode. 4. PRINCIPE De monsters worden met behulp van reversed phase hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) onderzocht op de aanwezigheid van caseïnemacropeptide A. Het resultaat wordt beoordeeld aan de hand van standaardmonsters die bestaan uit mageremelkpoeder waaraan al dan niet een bekend percentage weipoeder is toegevoegd. Een resultaat dat hoger is dan 1 % m/m geeft aan dat vaste lebweibestanddelen aanwezig zijn. 5. REAGENTIA Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van ten minste gelijkwaardige zuiverheid te zijn. Acetonitril moet van spectroscopie- of HPLC-kwaliteit zijn. 5.1. Trichloorazijnzuuroplossing Los 240 g trichloorazijnzuur (CCl3COOH) op in water en vul aan tot 1 000 ml. De oplossing moet helder en kleurloos zijn. 5.2. Loopvloeistoffen A en B Loopvloeistof A: breng 150 ml acetonitril (CH3CN), 20 ml isopropanol (CH3CHOHCH3) en 1,00 ml trifluorazijnzuur (TFA, CF3COOH) in een maatkolf van 1 000 ml. Vul met water aan tot 1 000 ml. Loopvloeistof B: breng 550 ml acetonitril, 20 ml isopropanol en 1,00 ml TFA in een maatkolf van 1 000 ml. Vul met water aan tot 1 000 ml. Filtreer de loopvloeistof vóór gebruik over een membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm. 5.3. Conservering van de kolommen Na de analyses wordt de kolom gespoeld met loopvloeistof B (volgens een gradiënt) en vervolgens met acetonitril (volgens een gradiënt gedurende 30 minuten). De kolom wordt in acetonitril bewaard. 5.4. Standaardmonsters 5.4.1. Mageremelkpoeder dat aan de eisen voor openbare opslag voldoet (standaard [0]) 5.4.2. Hetzelfde mageremelkpoeder dat is vermengd met 5 % m/m lebweipoeder met een standaardsamenstelling (standaard [5]) 5.4.3. Hetzelfde mageremelkpoeder dat is vermengd met 50 % m/m lebweipoeder met een standaardsamenstelling (standaard [50]) 6. APPARATUUR 6.1. Analytische balans 6.2. Eventueel een centrifuge met een centrifugaalkracht tot minimaal 2 200 g, voorzien van centrifugebuizen met stop of dop met een inhoud van ongeveer 50 ml 6.3. Mechanisch schudapparaat 6.4. Magneetroerder 6.5. Glazen trechters, diameter ongeveer 7 cm 6.6. Filtreerpapier, normaal, diameter ongeveer 12,5 cm 6.7. Glazen filtreerapparaat met membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm 6.8. Meetpipetten, geschikt voor 10 ml (ISO 648, klasse A, of ISO/R 835) of een doseersysteem dat in 2 minuten 10,0 ml kan toevoegen 6.9. Doseersysteem dat 20,0 ml water bij ongeveer 50 °C kan toevoegen 6.10. Waterbad met thermostaat, ingesteld op 25 ± 0,5 °C 6.11. HPLC-apparaat bestaande uit:
7. MONSTERNEMING 7.1. De monsters moeten worden genomen volgens de procedure van internationale norm ISO 707. De lidstaten mogen echter een andere monsternemingsmethode gebruiken, mits deze de beginselen van bovengenoemde norm in acht neemt. 7.2. Bewaar het monster onder zodanige omstandigheden dat bederf of wijziging van de samenstelling uitgesloten is. 8. PROCEDURE 8.1. Bereiding van het testmonster Breng het melkpoeder over in een houder waarvan de inhoud ongeveer twee keer zo groot is als het volume van het poeder, voorzien van een luchtdicht deksel. Sluit de houder onmiddellijk. Meng het melkpoeder grondig door de houder herhaaldelijk om te keren. 8.2. Testhoeveelheid Weeg in een centrifugebuis (6.2) of een geschikte kolf met stop (50 ml) 2,00 ± 0,001 g testmonster af. NB: Weeg bij mengsels een zodanige hoeveelheid testmonster af dat de ontvette testhoeveelheid overeenkomt met 2,00 g. 8.3. Verwijdering van vetten en eiwitten 8.3.1. Voeg aan de testhoeveelheid 20,0 ml warm water (50 °C) toe. Los het poeder op door gedurende 5 minuten op het schudapparaat (6.3) te schudden. Zet de buis in het waterbad (6.10) en equilibreer op 25 °C. 8.3.2. Voeg in 2 minuten onder krachtig roeren met de magneetroerder (6.4) met constante snelheid 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing (5.1) van ongeveer 25 °C toe. Zet de buis gedurende 60 minuten in een waterbad (6.10). 8.3.3. Centrifugeer (6.2) gedurende 10 minuten bij 2 200 g of filtreer over filtreerpapier (6.6), waarbij de eerste 5 ml filtraat niet wordt opgevangen. 8.4. Chromatografische bepaling 8.4.1. De reversed phase HPLC-methode sluit de mogelijkheid van vals-positieve resultaten door de aanwezigheid van zurekarnemelkpoeder uit. 8.4.2. Voordat de reversed phase HPLC-analyse wordt uitgevoerd, moeten de gradiëntomstandigheden worden geoptimaliseerd. Voor gradiëntsystemen met een dood volume (d.w.z. het volume vanaf het punt waar de twee loopvloeistoffen samenkomen tot en met het volume in de injectorlus) van ongeveer 6 ml is een retentietijd van 26 ± 2 minuten voor CMPA optimaal. Voor gradiëntsystemen met een kleiner dood volume (bv. 2 ml) moet 22 minuten als optimale retentietijd worden gehanteerd. Neem oplossingen van de standaardmonsters (5.4) met en zonder 50 % lebwei. Injecteer 100 μl supernatans of filtraat (8.3.3) in het HPLC-apparaat bij de in tabel 1 vermelde verkennende gradiëntomstandigheden. Tabel 1 Verkennende gradiëntomstandigheden om de chromatografische analyse te optimaliseren
Door de twee chromatogrammen te vergelijken kan de plaats van de CMPA-piek worden bepaald. Met onderstaande vergelijking kan de beginsamenstelling van de loopvloeistof voor de normale gradiënt (8.4.3) worden berekend: % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*1,11 Hierbij is:
8.4.3. Neem oplossingen van de testmonsters Injecteer een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid van 100 μl supernatans of filtraat (8.3.3) in het HPLC-apparaat bij een debiet van 1,0 ml loopvloeistof (5.2) per minuut. De samenstelling van de loopvloeistof bij het begin van de analyse wordt volgens 8.4.2 bepaald. Normaliter is deze ongeveer A:B = 76:24 (5.2). Onmiddellijk na het injecteren wordt een lineaire gradiënt gestart die leidt tot een 5 % hoger percentage B na 27 minuten. Vervolgens wordt een nieuwe lineaire gradiënt gestart die het percentage B in de loopvloeistof in 5 minuten op 90 % brengt. Deze samenstelling wordt gedurende 5 minuten gehandhaafd, waarna de samenstelling via een lineaire gradiënt in 5 minuten wordt gewijzigd tot de aanvankelijke samenstelling. Afhankelijk van het interne volume van het pompsysteem kan 15 minuten na het bereiken van de aanvankelijke samenstelling opnieuw worden geïnjecteerd. NB 1: De retentietijd van CMPA moet 26 ± 2 minuten zijn. Dit kan worden bereikt door de aanvankelijke en eindsamenstelling van de eerste gradiënt te variëren. Het verschil in % B tussen de aanvankelijke en eindsamenstelling van de eerste gradiënt moet echter 5 % blijven. NB 2: De loopvloeistoffen moeten afdoende worden ontgast en moeten ook ontgast blijven. Dit is essentieel voor een goede werking van het gradiëntpompsysteem. De standaarddeviatie voor de retentietijd van de CMPA-piek moet kleiner zijn dan 0,1 minuut (n = 10). NB 3: Om de vijf monsters moet referentiemonster [5] worden geïnjecteerd en worden gebruikt om een nieuwe responsfactor R (9.1.1) te berekenen. 8.4.4. De resultaten van de chromatografische analyse van het testmonster [E] worden verkregen in de vorm van een chromatogram waarop de CMPA-piek aan de hand van zijn retentietijd van ongeveer 26 minuten kan wordt geïdentificeerd. De integrator (6.11.6) berekent automatisch de piekhoogte H van de CMPA-piek. Op ieder chromatogram moet de plaats van de basislijn worden gecontroleerd. Als de basislijn zich niet op de juiste plaats bevindt, moet de analyse of de integratie worden herhaald. NB: Als de CMPA-piek afdoende van de andere pieken gescheiden is, moet de dal-tot-dalbasislijn worden gebruikt; in andere gevallen worden loodlijnen getrokken naar een gemeenschappelijke basislijn die in de buurt van de CMPA-piek moet beginnen (dus niet bij t = 0!). Gebruik voor de standaard en de monsters dezelfde integratievorm en controleer bij een gemeenschappelijke basislijn of deze voor de monsters en de standaard consistent is. Om eventuele onregelmatigheden ten gevolge van slecht werkende apparatuur of kolommen of in verband met de herkomst en aard van het geanalyseerde monster te kunnen signaleren, moet vóór de kwantitatieve interpretatie het algemene beeld van elk chromatogram worden bekeken. Bij twijfel wordt de analyse herhaald. 8.5. Kalibratie 8.5.1. Volg voor de standaardmonsters (5.4.1 tot 5.4.2) exact de onder 8.2 tot en met 8.4.4 beschreven procedure. Gebruik vers bereide oplossingen omdat CMP in 8 % trichloorazijnzuur bij kamertemperatuur ontleedt. Bij 4 °C blijft de oplossing 24 uur stabiel. Bij een lange reeks analyses is het gebruik van een gekoelde monsterhouder in de automatische injector wenselijk. NB: 8.4.2 kan worden overgeslagen als de aanvankelijke % B uit eerdere analyses bekend is. Het chromatogram van referentiemonster [5] moet analoog zijn aan figuur 1. In deze figuur wordt de CMPA-piek voorafgegaan door twee kleine pieken. Het is essentieel dat eenzelfde scheiding wordt verkregen. 8.5.2. Injecteer vóór de chromatografische bepaling van de monsters 100 μl standaardmonster [0] zonder lebwei (5.4.1). Het chromatogram mag geen piek vertonen op de retentietijd van de CMPA-piek. 8.5.3. Bepaal de responsfactoren R door hetzelfde volume filtraat (8.5.1) te injecteren als voor de monsters is gebruikt. 9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN 9.1. Berekeningswijze en formules 9.1.1. Berekening van de responsfactor R: CMPA-piek: R = W/H Hierbij is:
9.2. Berekening van het percentage lebweipoeder in het monster W(E) = R × H(E) Hierbij is:
Als W(E) groter is dan 1 % en het verschil tussen de retentietijd en die van standaardmonster [5] kleiner is dan 0,2 minuut, zijn er vaste lebweibestanddelen aanwezig. 9.3. Nauwkeurigheid van de methode 9.3.1. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die tegelijkertijd of kort na elkaar door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 0,2 % m/m. 9.3.2. Reproduceerbaarheid Niet bepaald. 9.3.3. Lineariteit Van 0 tot 16 % lebwei moet er een lineaire relatie worden verkregen met een correlatiecoëfficiënt > 0,99. 9.4. Interpretatie In de grenswaarde van 1 % is ook de onzekerheid vanwege de reproduceerbaarheid opgenomen. Figuur 1 Ni-4,6-standaard 
Absorptie (220 nm) tijd (minuten) CMP A
|
|
3) |
De volgende bijlagen worden toegevoegd: „BIJLAGE VI Methoden voor de analyse van boter voor particuliere opslag
„BIJLAGE VII Methoden voor de analyse van mageremelkpoeder voor particuliere opslag
„BIJLAGE VIII Methoden voor de analyse van kaas voor particuliere opslag
„Aanhangsel METHODE VOOR DE DETECTIE VAN KOEMELK EN KOEMELKCASEÏNAAT IN KAAS VAN SCHAPEN-, GEITEN- OF BUFFELMELK OF VAN MENGSELS VAN SCHAPEN-, GEITEN- EN BUFFELMELK 1. DOEL Detectie van koemelk en koemelkcaseïnaat in kaas van schapen-, geiten- of buffelmelk of mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk door middel van iso-elektrische focussering van γ-caseïnen na plasminolyse. 2. TOEPASSINGSGEBIED De methode is bruikbaar voor een gevoelige specifieke detectie van niet-warmtebehandelde en warmtebehandelde koemelk en koemelkcaseïnaat in verse en gerijpte kaas die is gemaakt van schapen-, geiten- of buffelmelk of mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk. Zij is niet geschikt voor de detectie van melk- en kaasvervalsing door gebruik van warmtebehandelde concentraten van eiwit uit wei van runderen. 3. PRINCIPE VAN DE METHODE 3.1. De caseïnen worden uit kaas en de referentiestandaards geïsoleerd. 3.2. De geïsoleerde caseïnen worden opgelost en met plasmine (EC.3.4.21.7) geïncubeerd. 3.3. De met plasmine behandelde caseïnen worden in aanwezigheid van ureum iso-elektrisch gefocusseerd en de eiwitten worden gekleurd. 3.4. De gekleurde patronen van γ3-caseïne en γ2-caseïne (deze tonen koemelk aan) worden beoordeeld door het patroon van het monster te vergelijken met het patroon van de referentiestandaards met 0 % en 1 % koemelk in dezelfde gel. 4. REAGENTIA Tenzij anders aangegeven, moeten chemicaliën van analysekwaliteit worden gebruikt. Water moet tweemaal gedestilleerd of van gelijkwaardige zuiverheid zijn. NB: De onderstaande bijzonderheden zijn van toepassing op in eigen laboratorium vervaardigde ureumhoudende polyacrylamidegels van 265 × 125 × 0,25 mm. Bij gebruik van gels van een ander type of met andere afmetingen moeten de scheidingsomstandigheden wellicht worden aangepast. Iso-elektrische focussering 4.1. Reagentia voor de bereiding van de ureumhoudende polyacrylamidegels 4.1.1. Stamoplossing voor de gels Los:
op in water en vul aan tot 100 ml. Bewaar de oplossing in een bruine glazen fles in de koelkast. NB: In plaats van de vermelde hoeveelheden neurotoxische acrylamiden mag ook een in de handel verkrijgbare kant-en-klare acrylamide/BIS-oplossing worden gebruikt. Indien deze oplossing 30 % (m/v) acrylamide en 0,8 % (m/v) BIS bevat, wordt in plaats van de vermelde hoeveelheden een volume van 16,2 ml gebruikt. De stamoplossing is maximaal tien dagen houdbaar; indien de geleidbaarheid meer dan 5 μS bedraagt, wordt gedeïoniseerd door eerst 30 minuten met 2 g Amberlite MB-3 te roeren en vervolgens door een 0,45 μm membraan te filtreren. 4.1.2. Geloplossing Bereid een geloplossing door additieven en amfolyten (*) met de stamoplossing (4.1.1) te mengen:
Meng de geloplossing en ontgas 2 tot 3 minuten in een ultrasoonbad of in vacuüm. NB: Bereid de geloplossing vlak voor het gieten van de gel (6.2). 4.1.3. Katalysatoroplossingen 4.1.3.1. N, N, N′, N′-tetramethylethyleendiamine (Temed) 4.1.3.2. 40 % (m/v) ammoniumpersulfaat (PER): Los 800 mg PER op in water en vul aan tot 2 ml. NB: Gebruik altijd een vers bereide PER-oplossing. 4.2. Contactvloeistof Petroleum of vloeibare paraffine 4.3. Anodeoplossing Los 5,77 g fosforzuur (85 % m/m) op in 100 ml water. 4.4. Kathodeoplossing Los 2,00 g natriumhydroxide op in 100 ml water. Monstervoorbereiding 4.5. Reagentia voor eiwitisolatie 4.5.1. Verdund azijnzuur (25,0 ml ijsazijn, met water verdund tot 100 ml) 4.5.2. Dichloormethaan 4.5.3. Aceton 4.6. Eiwitoplossende buffer Los:
op in water en vul aan tot 50 ml. NB: In de koelkast bewaren; deze oplossing is één week houdbaar. 4.7. Reagentia voor plasminesplitsing van caseïnen 4.7.1. Ammoniumcarbonaatbuffer Titreer een oplossing van 0,2 mol/l ammoniumwaterstofcarbonaat (1,58 g/100 ml water) die 0,05 mol/l ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, 1,46 g/100 ml) bevat, met een oplossing van 0,2 mol/l ammoniumcarbonaat (1,92 g/100 ml water) die 0,05 mol/l EDTA bevat, tot pH 8. 4.7.2. Runderplasmine (EC. 3.4.21.7), activiteit ten minste 5 U/ml 4.7.3. ε-Aminocapronzuuroplossing voor enzymremming Los 2,624 g ε-aminocapronzuur (6-amino-n-hexaanzuur) op in 100 ml 40 % (v/v) ethanol. 4.8. Standaards 4.8.1. Gecertificeerde referentiestandaards van een mengsel van gestremde magere schapen- en geitenmelk met 0 % en 1 % koemelk zijn verkrijgbaar bij het Instituut voor referentiematerialen en -metingen van de Commissie, 2440 Geel, België. 4.8.2. Bereiding van tijdelijke laboratoriumstandaards van gestremde buffelmelk met 0 % en 1 % koemelk Magere melk wordt bereid door losse rauwe buffelmelk of koemelk bij 37 °C gedurende 20 minuten bij 2 500 g te centrifugeren. Nadat de buis met inhoud snel tot 6-8 °C is afgekoeld, wordt de bovendrijvende vetlaag volledig verwijderd. Voeg voor de bereiding van de standaard van 1 % in een bekerglas van 1 liter 5,00 ml magere koemelk aan 495 ml magere buffelmelk toe en breng de pH door toevoeging van verdund melkzuur (10 % m/v) op 6,4. Stel de temperatuur in op 35 °C, voeg 100 μl kalfsstremsel (1:10 000, circa 3 000 U/ml) toe, roer gedurende één minuut, dek het bekerglas met aluminiumfolie af en laat het gedurende één uur bij 35 °C staan, zodat de wrongel zich kan vormen. Nadat de wrongel is gevormd, wordt de gestremde melk in zijn geheel gevriesdroogd zonder deze eerst te homogeniseren of de wei af te tappen. Na het vriesdrogen wordt het product tot een homogeen poeder fijngemalen. Volg voor de bereiding van de 0 %-standaard dezelfde werkwijze met zuivere magere buffelmelk. De standaards moeten bij – 20 °C worden opgeslagen. NB: Het verdient aanbeveling de zuiverheid van de buffelmelk vóór de bereiding van de standaards door iso-elektrische focussering van de met plasmine behandelde caseïnen te controleren. Reagentia voor eiwitkleuring 4.9. Fixeeroplossing Los 150 g trichloorazijnzuur op in water en vul aan tot 1 000 ml. 4.10. Ontkleuroplossing Verdun 500 ml methanol en 200 ml ijsazijn met gedestilleerd water tot 2 000 ml. NB: De ontkleuroplossing moet dagelijks vers worden bereid; dit kan gebeuren door gelijke volumes stamoplossingen met 50 % (v/v) methanol en 20 % (v/v) ijsazijn met elkaar te mengen. 4.11. Kleuroplossing 4.11.1. Kleuroplossing (stamoplossing 1) Los 3,0 g Coomassie briljantblauw G 250 (C.I. 42655) met behulp van een magneetroerder (ongeveer 45 minuten) op in 1 000 ml 90 % (v/v) methanol en filtreer over twee middelsnelle vouwfilters. 4.11.2. Kleuroplossing (stamoplossing 2) Los 5,0 g kopersulfaat-pentahydraat op in 1 000 ml 20 % (v/v) azijnzuur. 4.11.3. Kleuroplossing (werkoplossing) Meng vlak vóór de kleuring 125 ml van beide stamoplossingen (4.11.1 en 4.11.2). NB: De kleuroplossing moet op de dag van gebruik worden bereid. 5. APPARATUUR 5.1. Glasplaten (265 × 125 × 4 mm); rubberen rol (breedte 15 cm); waterpas tafel 5.2. Gel-dragerfolie (265 × 125 mm) 5.3. Afdekfolie (280 × 125 mm). Plak op beide lange zijden een strook plakband (280 × 6 × 0,25 mm) als afstandshouder (zie figuur 1) 5.4. Elektrofocusseringskamer met koelplaat (bv. 265 × 125 mm) met geschikte spanningsbron (≥ 2,5 kV) of automatisch elektroforeseapparaat 5.5. Rondpompcryostaat, ingesteld op 12 ± 0,5 °C 5.6. Centrifuge, geschikt voor 3 000 g 5.7. Elektrodestroken (≥ 265 mm lang) 5.8. Plastic druppelflessen voor anodeoplossing en kathodeoplossing 5.9. Monsterdragers (10 × 5 mm, viscose of filtreerpapier met geringe eiwitadsorptie) 5.10. Roestvast stalen of glazen kleurings- en ontkleuringsschalen (bv. instrumentbakjes van 280 × 150 mm) 5.12. Instelbare staafhomogenisator (schachtdiameter 10 mm), 8 000 tot 20 000 rpm 5.13. Magneetroerder 5.14. Ultrasoonbad 5.15. Folie-lasapparaat 5.16. Micropipetten, 25 μl 5.17. Vacuümverdamper of vriesdroger 5.18. Thermostatisch geregeld waterbad, instelbaar op 35 en 40 ± 1 °C, met schudder 5.19. Densitometer met aflezing bij λ = 634 nm 6. PROCEDURE 6.1. Monstervoorbereiding 6.1.1. Isolatie van caseïnen Weeg een hoeveelheid kaas die overeenkomt met 5 g droge massa of de referentiestandaard af in een centrifugebuis van 100 ml, voeg 60 ml gedestilleerd water toe en homogeniseer met een staafhomogenisator (8 000-10 000 rpm). Breng de pH met verdund azijnzuur (4.5.1) op 4,6 en centrifugeer (5 minuten, 3 000 g). Decanteer het vet en de wei, homogeniseer het residu bij 20 000 rpm in 40 ml gedestilleerd water dat met verdund azijnzuur (4.5.1) op pH 4,5 is gebracht, voeg 20 ml dichloormethaan (4.5.2) toe, homogeniseer opnieuw en centrifugeer (5 minuten, 3 000 g). Verwijder de caseïnelaag die tussen de waterfase en de organische fase drijft (zie figuur 2) met een spatel en decanteer beide fasen. Homogeniseer de caseïne opnieuw in 40 ml gedestilleerd water (zie boven) en 20 ml dichloormethaan (4.5.2) en centrifugeer. Herhaal deze procedure tot beide extractiefasen kleurloos zijn (twee- tot driemaal). Homogeniseer het eiwitresidu met 50 ml aceton (4.5.3) en filtreer over een middelsnel vouwfilter. Was het residu op het filter tweemaal met telkens 25 ml aceton, laat het aan de lucht of onder een stikstofstroom drogen en verpulver het in een mortier tot een fijn poeder. NB: Droge caseïne-isolaten moeten bij – 20 °C worden bewaard. 6.1.2. Splitsing van β-caseïnen met plasmine om de γ-caseïnen te intensiveren Dispergeer 25 mg geïsoleerde caseïne (6.1.1) in 0,5 ml ammoniumcarbonaat-buffer (4.7.1) en homogeniseer 20 minuten, bijvoorbeeld in een ultrasoonbad. Verwarm tot 40 °C, voeg 10 μl plasmine (4.7.2) toe, meng en incubeer één uur bij 40 °C onder voortdurend schudden. Voeg vervolgens 20 μl ε-aminocapronzuuroplossing (4.7.3) toe om het enzym te remmen en daarna 200 mg vast ureum en 2 mg dithiotreïtol. NB: Teneinde meer symmetrie in de gefocusseerde caseïnebanden te verkrijgen verdient het aanbeveling de oplossing na de toevoeging van het ε-aminocapronzuur te vriesdrogen en de residuen vervolgens in 0,5 ml eiwitoplossende buffer (4.6) op te lossen. 6.2. Bereiding van de ureumhoudende polyacrylamidegels Rol de gel-dragerfolie (5.2) met behulp van enkele druppels water op een glasplaat (5.1) en verwijder eventueel overtollig water met een papieren handdoek of een tissue. Rol de afdekfolie (5.3) met plakband (0,25 mm) op dezelfde manier op een tweede glasplaat. Leg de plaat horizontaal op een waterpas tafel. Voeg aan de ontgaste geloplossing (4.1.2) 10 μl Temed (4.1.3.1) toe, voeg na roeren 10 μl PER-oplossing (4.1.3.2) toe, meng grondig en giet het mengsel onmiddellijk gelijkmatig uit op het midden van de afdekfolie. Zet de plaat met dragerfolie (met de folie naar beneden) aan één kant op de plaat met afdekfolie en laat de plaat langzaam zakken, zodat zich tussen de platen met folie een gellaag vormt die zich gelijkmatig en zonder luchtbellen verspreidt (zie figuur 3). Laat de plaat met dragerfolie aan een dunne spatel voorzichtig helemaal naar beneden zakken en leg bij wijze van gewicht nog drie glasplaten op de plaat. Verwijder, wanneer de polymerisatie is voltooid (na ongeveer 60 minuten), de op de dragerfolie gepolymeriseerde gel samen met de afdekfolie door de glasplaten te kiepen. Reinig de achterkant van de dragerfolie zorgvuldig om gelresten en ureum te verwijderen. Las de gel-sandwich tot een foliebuis en bewaar deze in de koelkast (maximaal zes weken). NB: De afdekfolie met plakband kan opnieuw worden gebruikt. De polyacrylamidegel kan in kleinere stukken worden gesneden, hetgeen aanbeveling verdient wanneer er weinig monsters zijn of wanneer een automatisch elektroforeseapparaat wordt gebruikt (twee gels, afmetingen 4,5 × 5 cm). 6.3. Iso-elektrische focussering Stel de koelthermostaat in op 12 °C. Veeg de achterkant van de gel-dragerfolie af met petroleum en breng midden op het koelblok enkele druppels petroleum (4.2). Leg de gel-sandwich met de dragerfolie naar beneden op het koelblok en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Veeg eventuele overmaat petroleum weg en verwijder de afdekfolie. Bevochtig de elektrodestroken met de elektrodeoplossingen (4.3 en 4.4), knip ze af op de lengte van de gel en leg ze op hun plaats (afstand tussen de elektroden 9,5 cm). Omstandigheden voor de iso-elektrische focussering: 6.3.1. Gelformaat: 265 × 125 × 0,25 mm
NB: Als de dikte of de breedte van de gels wordt veranderd, moeten de waarden voor de stroomsterkte en het vermogen dienovereenkomstig worden aangepast (bv. een verdubbeling van stroomsterkte en vermogen als een gel van 265 × 125 × 0,5 mm wordt gebruikt). 6.3.2. Voorbeeld van een voltageprogramma voor een automatisch elektroforeseapparaat (twee gels van 5,0 × 4,5 cm), elektroden zonder stroken rechtstreeks op de gel aangebracht
Breng de monsterdrager in stap 2 bij 0 Vh aan. Verwijder de monsterdrager in stap 2 bij 30 Vh. 6.4. Eiwitkleuring 6.4.1. Eiwitfixatie Verwijder de elektrodestroken direct na het uitschakelen van de stroom en leg de gel onmiddellijk in een (ont)kleuringsschaal met 200 ml fixeeroplossing (4.9); laat 15 minuten staan onder voortdurend schudden. 6.4.2. Wassen en kleuren van de gelplaat Giet de fixeeroplossing volledig af en was de gelplaat tweemaal telkens 30 seconden met 100 ml ontkleuroplossing (4.10). Giet de ontkleuroplossing af en vul de schaal met 250 ml kleuroplossing (4.11.3); laat de kleur onder zachtjes schudden gedurende 45 minuten ontwikkelen. 6.4.3. Ontkleuren van de gelplaat Giet de kleuroplossing af, was de gelplaat tweemaal met telkens 100 ml ontkleuroplossing (4.10) en schud daarna gedurende 15 minuten met 200 ml ontkleuroplossing. Herhaal deze ontkleurstap ten minste twee of drie keer, totdat de achtergrond schoon en ongekleurd is. Spoel de gelplaat vervolgens met gedestilleerd water (2 × 2 minuten) en droog aan de lucht (2 tot 3 uur) of met een föhn (10 tot 15 minuten). NB 1: Het fixeren, wassen, kleuren en ontkleuren gebeurt bij 20 °C. Gebruik geen hoge temperaturen. NB 2: Indien de voorkeur wordt gegeven aan de gevoeligere zilverkleuring (bv. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, codenr. 17-1150-01), moeten de met plasmine behandelde caseïnemonsters tot 5 mg/ml worden verdund. 7. BEOORDELING De beoordeling vindt plaats door vergelijking van de eiwitpatronen van het onbekende monster met die van referentiestandaards op dezelfde gel. De detectie van koemelk in kaas van schapen-, geiten- en buffelmelk of mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk gebeurt via de γ3- en γ2-caseïnen, waarvan het iso-elektrisch punt tussen pH 6,5 en pH 7,5 ligt (zie de figuren 4a, 4b en 5). De detectielimiet ligt lager dan 0,5 %. 7.1. Visuele beoordeling Voor een visuele beoordeling van de hoeveelheid koemelk verdient het aanbeveling de concentraties van monsters en standaards zodanig aan te passen dat de intensiteit voor de γ2- en γ3-caseïnen van schapen, geiten en/of buffels vergelijkbaar is (zie „γ2 E,G,B” en „γ3 E,G,B” in de figuren 4a, 4b en 5). Daarna kan de hoeveelheid koemelk (minder dan, gelijk aan of meer dan 1 %) in het onbekende monster rechtstreeks worden bepaald door de intensiteit voor de γ3- en γ2-caseïnen van runderen (zie „γ3 C” en „γ2 C” in de figuren 4a, 4b en 5) te vergelijken met die van de 0 %- en 1 %-referentiestandaards (schapen, geiten) of tijdelijke laboratoriumstandaards (buffel). 7.2. Densitometrische beoordeling Gebruik zo mogelijk densitometrie (5.19) om de verhouding te bepalen tussen het piekoppervlak voor de γ2- en γ3-caseïnen van runderen en het piekoppervlak voor de γ2- en γ3-caseïnen van schapen, geiten en/of buffels (zie figuur 5). Vergelijk deze waarde met de piekoppervlakverhouding voor de γ2- en γ3-caseïnen bij de op dezelfde gel geanalyseerde 1 %-referentiestandaard (schapen of geiten) of tijdelijke laboratoriumstandaard (buffel). NB: De methode werkt bevredigend wanneer er in de 1 %-referentiestandaard een duidelijk positief signaal is voor zowel γ2- als γ3-caseïnen van runderen, maar niet in de 0 %-referentiestandaard. Is dat niet het geval, dan moet de procedure worden geoptimaliseerd, waarbij de methode exact tot in de details moet worden gevolgd. Een monster wordt als positief beoordeeld als de intensiteit van zowel de γ2- als de γ3-caseïnen van runderen of de bijbehorende piekoppervlakverhoudingen gelijk zijn aan of groter zijn dan bij de 1 %-referentiestandaard. 8. REFERENTIES Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins, Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990). Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffallo cheese using immunoblotting; Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier, Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) blz. 389-393, Bode-Verlag, München (1989). Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films, Electrophoresis 1, 43-56 (1980). Figuur 1 Schematische tekening van de afdekfolie 
Polyesterfilm Afstandsband Figuur 2 Caseïnelaag die na centrifugeren tussen de water- en de organische fase drijft 
H2O-fase Caseïne CH2Cl2-fase Figuur 3 Omklapmethode voor het gieten van ultradunne polyacrylamidegels
a = afstandsband (0,25 mm); b = afdekfolie (5.3); c, e = glasplaten (5.1); d = geloplossing (4.1.2); f = gel-dragerfolie (5.2) Figuur 4a Iso-elektrische focussering van met plasmine behandelde caseïnen uit kaas van schapen- en geitenmelk met verschillende hoeveelheden koemelk
% CM = percentage koemelk; C = koe; E = schaap; G = geit. Bovenste helft van de IEF-gel. Figuur 4b Iso-elektrische focussering van met plasmine behandelde caseïnen uit kaas van mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk met verschillende hoeveelheden koemelk
% CM = percentage koemelk; 1+ = monster met 1 % koemelk waaraan in het midden zuivere rundercaseïne is toegevoegd; C = koe, E = schaap, G = geit, B = buffel. Totale scheidingsafstand van de IEF-gel. Figuur 5 Superpositie van densitogrammen van standaards (STD) en van monsters kaas van een mengsel van schapen- en geitenmelk na iso-elektrische focussering
a, b = standaards met 0 en 1 % koemelk; c-g = kaasmonsters met 0, 1, 2, 3 en 7 % koemelk. C = koe; E = schaap; G = geit. De bovenste helft van de IEF-gel is gemeten bij λ = 634 nm. „BIJLAGE IX Beoordeling van de analyses 1. Kwaliteitsborging De analyses moeten worden uitgevoerd door laboratoria die zijn aangewezen overeenkomstig artikel 12 van Verordening (EG) nr. 882/2004 van het Europees Parlement of de Raad (**) of die zijn aangewezen door de bevoegde autoriteiten van de lidstaat. 2. Monsterneming en betwisting van de analyseresultaten
„Aanhangsel Beoordeling of een partij aan de wettelijke grenswaarde voldoet 1. Principe Wanneer in de wetgeving met betrekking tot openbare interventie en particuliere opslag gedetailleerde monsternemingsprocedures zijn vastgelegd, worden die procedures gevolgd. In alle andere gevallen wordt een monster gebruikt dat bestaat uit ten minste drie componenten die aselect worden genomen uit de partij die moet worden gecontroleerd. Er kan een samengesteld monster worden bereid. Het verkregen resultaat wordt met de wettelijke grenswaarden vergeleken door berekening van een 95 %-betrouwbaarheidsinterval als 2 × standaarddeviatie, waarbij als standaarddeviatie wordt gebruikt: 1) als de methode via internationale samenwerking is gevalideerd, de waarden voor σr and σR; 2) bij een interne validering, de berekende interne reproduceerbaarheid. Dit betrouwbaarheidsinterval wordt vervolgens gelijkgesteld aan de meetonzekerheid van het resultaat. 2. De methode is via internationale samenwerking gevalideerd In dit geval zijn de standaarddeviatie van de herhaalbaarheid σr en de standaarddeviatie van de reproduceerbaarheid σR bepaald en kan het laboratorium aantonen of de prestatiekenmerken van de gevalideerde methode worden gehaald. Bereken het rekenkundig gemiddelde Bereken de totale onzekerheid (k = 2) van
Als het eindresultaat x van de meting wordt berekend met een vergelijking van de vorm x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 of x = y 1/y 2, moeten de gebruikelijke procedures voor de combinatie van standaarddeviaties worden gevolgd. De partij wordt geacht niet aan de bovenste wettelijke grenswaarde UL te voldoen als:
in alle andere gevallen wordt de partij geacht wel aan UL te voldoen. De partij wordt geacht niet aan de onderste wettelijke grenswaarde LL te voldoen als:
in alle andere gevallen wordt de partij geacht wel aan LL te voldoen. 3. Interne validering met berekening van de standaarddeviatie van de interne reproduceerbaarheid Wanneer methoden worden gebruikt die niet in deze verordening worden vermeld en er geen maat voor de precisie is bepaald, moet een interne validering worden uitgevoerd. In de vergelijkingen voor de berekening van de totale onzekerheid U moeten de standaarddeviatie van de interne herhaalbaarheid sir en de standaarddeviatie van de interne reproduceerbaarheid si R worden gebruikt in plaats van respectievelijk σr en σ R . De regels om te beslissen of aan de wettelijke grenswaarde is voldaan, zijn dezelfde als in punt 1. Als de partij echter wordt geacht niet aan de wettelijke grenswaarde te voldoen, moeten de metingen worden herhaald met de in deze verordening vermelde methode en moet het resultaat worden beoordeeld overeenkomstig punt 1.
”. |
(1) De toe te passen methode moet door het betaalorgaan erkend zijn.
(2) Analysen van verbrande deeltjes mogen systematisch worden verricht. Dergelijke analysen moeten evenwel steeds worden verricht wanneer geen sensorische controles worden verricht.
(3) De toe te passen methode moet door het betaalorgaan erkend zijn (één methode of beide methoden).
(4) De toe te passen methode moet door het betaalorgaan erkend zijn.
(5) Sensorische controles moeten worden verricht wanneer zulks noodzakelijk wordt geacht na een door het betaalorgaan goedgekeurde risicogebaseerde analyse.
(6) De toe te passen methode moet door het betaalorgaan erkend zijn.
(7) Opbrengen van het monster: pipetteer na de prefocussering (stap 1) 18 μl van de monster- en standaardoplossingen op de monsterdragers (10 × 5 mm); leg deze met een onderlinge afstand van 1 mm en in de lengterichting op 5 mm van de anode op de gel en druk ze zachtjes aan. Voer de focussering onder bovenstaande omstandigheden uit en verwijder de monsterdragers voorzichtig na de 60 minuten monsterfocussering.