BIJLAGE
ENZYMATISCHE METHODE VOOR DE BEPALING VAN HET ZETMEELGEHALTE IN BEREIDINGEN VAN DE SOORT GEBRUIKT VOOR HET VOEDEREN VAN DIEREN MET BEHULP VAN HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE OF HPLC (HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY)
1. Toepassingsgebied
Beschreven wordt de enzymatische bepaling van het zetmeelgehalte van diervoeders. Het zetmeelgehalte wordt afgeleid uit de kwantitatieve bepaling van glucose na de enzymatische ontleding van het aanwezige zetmeel tot glucose. Alle gemeten glucose wordt geacht afkomstig te zijn van het in het monster aanwezige zetmeel.
2. Definities
Met deze methode wordt het gehalte aan zetmeel en de hoogmoleculaire afbraakproducten daarvan, die onoplosbaar zijn in 40 % ethanol, bepaald. Het zetmeelgehalte wordt uitgedrukt in % (m/m).
3. Principe
De monsters worden door malen gehomogeniseerd. Het monster wordt gewassen met 40 % ethanol om oplosbare suikers en oplosbare ontledingsproducten van zetmeel te verwijderen.
Het thermostabiele enzym alfa-amylase wordt aan de suspensie toegevoegd. Dit enzym breekt het zetmeel bij 100 °C af tot kortere ketens, ongeacht of het zetmeel al dan niet volledig in oplossing is.
Grote brokken zetmeel worden heel langzaam afgebroken. Daarom moeten de monsters volledig worden opgelost of aanwezig zijn in de vorm van een suspensie met heel kleine vaste deeltjes.
Vervolgens wordt het tweede enzym (amyloglucosidase) toegevoegd, dat de kortere glucoseketens bij 60 °C tot glucose hydrolyseert.
Na klaring van de vloeistof, waarbij de aanwezige eiwitten, vetten en residuen na filtratie worden verwijderd, wordt een heldere oplossing verkregen die voor HPLC kan worden gebruikt.
De scheiding van de aanwezige suikers geschiedt met behulp van HPLC.
4. Reagentia en andere materialen
Gebruik reagentia van p.a.-kwaliteit en gedemineraliseerd water.
4.1. Ethanol, 40 % (v/v) in water
4.2. Glucose, minimaal 99 %
4.3. Oplossing van amyloglucosidase (1,4-alfa-D-glucan-glucohydrolase) uit Aspergillus niger (enzymactiviteit > 5 000 U/ml). Bewaren bij ongeveer 4 °C
Ook kan amyloglucosidasepoeder worden gebruikt
4.4. Thermostabiele alfa-amylase (1,4-alfa-D-glucan-glucanohydrolase). Bewaren bij ongeveer 4 °C
4.5. Zinkacetaatdihydraat, p.a.
4.6. Kaliumhexacyanoferraat(II) (K4[Fe(CN)]6 3H2O), extra zuiver
4.7. Natriumacetaat, watervrij, p.a.
4.8. IJsazijn, 100 % (v/v)
4.9. Natriumacetaat-buffer (0,2 mol/l)
Weeg 16,4 g natriumacetaat (4.7) af in een bekerglas. Los dit op in water en breng kwantitatief over in een maatkolf van 1 000 ml. Vul aan tot de maatstreep met water en breng de pH met azijnzuur op 4,7 (met behulp van een pH-meter (5.11)). Deze oplossing kan maximaal 6 maanden worden gebruikt, indien bewaard bij 4 °C.
4.10. Amyloglucosidase-oplossing (enzymactiviteit > 250 U/ml)
Bereid een oplossing van 5 ml amyloglucosidase-oplossing (4.3) of 660 mg amyloglucosidasepoeder in een volume van in totaal 100 ml met behulp van natriumacetaatbuffer (4.9). Onmiddellijk voor gebruik bereiden.
4.11. Referentieoplossing
Bereid oplossingen van glucose in water, zoals gangbaar bij gebruik voor HPLC-analyse.
4.12. Reagens voor klaring (Carrez I)
Los 219,5 g zinkacetaat (4.5) in een bekerglas op in water. Breng kwantitatief over in een maatkolf van 1 000 ml en voeg 30 ml azijnzuur toe (4.8). Meng grondig en vul aan met water. Deze oplossing kan maximaal 6 maanden worden gebruikt, indien bewaard bij kamertemperatuur.
Ook andere klaringsreagentia die gelijkwaardig zijn aan de Carrez-oplossing, kunnen worden gebruikt.
4.13. Reagens voor klaring (Carrez II)
Los 106,0 g kaliumhexacyanoferraat(II) (4.6) in een bekerglas op in water. Breng kwantitatief over in een maatkolf van 1 000 ml. Meng grondig en vul aan met water. Deze oplossing kan maximaal 6 maanden worden gebruikt, indien bewaard bij kamertemperatuur.
Ook andere klaringsreagentia die gelijkwaardig zijn aan de Carrez-oplossing, kunnen worden gebruikt.
4.14. Mobiele fase
Bereid een mobiele fase die gangbaar is voor gebruik bij HPLC-analyse van suikers. Wanneer een aminopropyl-silicagelkolom wordt gebruikt, is een mengsel van water van HPLC-kwaliteit en acetonitril bijvoorbeeld een gangbare mobiele fase.
5. Apparatuur
5.1. Standaard-laboratoriumglaswerk
5.2. Centrifuge, 1 000 g of meer (berekend in het midden van de buis)
5.3. Glazen centrifugebuizen, 100 ml
5.4. Magneetroerder
5.5. Magneetstaafjes
5.6. Vouwfilters, bv. 185 mm
5.7. Spuitfilters, 0,45 μm, geschikt voor waterige oplossingen
5.8. Monsterflesjes, geschikt voor de HPLC-autosampler
5.9. Maatkolven, 100 ml
5.10. Plastic spuiten, 5 en 10 ml
5.11. pH-meter
5.12. Waterbad met thermostaat, instelbaar op 60 °C en 100 °C
5.13. Verwarmingsplaten met magneetroerders
5.14. HPLC-apparatuur:
5.14.1. Pomp, geschikt voor een pulsvrije vloeistofstroom
5.14.2. Autosampler
5.14.3. Kolom en voorkolom, geschikt voor de analyse van suikers
5.14.4. Kolomoven, temperatuurbereik tussen kamertemperatuur en 40 °C
5.14.5. Detector, geschikt voor de analyse van suikers, bv. refractie-index-detector
5.14.6. Integratiesysteem
6. Procedure
6.1. Algemeen
De monsters worden in enkelvoud geanalyseerd.
6.2. Voorbereiding van het monster voor bepaalde soorten producten
Het product wordt door malen gehomogeniseerd.
6.3. Monsterhoeveelheid
Raam op basis van de lijst van ingrediënten het zetmeelgehalte. De hoeveelheid monster (tot op 0,1 mg nauwkeurig afgewogen) kan als volgt worden geraamd:
6.4. Blancobepaling
Het blancogehalte wordt bepaald door een volledige analyse (zoals beschreven onder 6.5) zonder toevoeging van een monster uit te voeren. Het resultaat van de blancobepaling wordt bij de berekening van het zetmeelgehalte (7.1) gebruikt.
6.5. Analyse
6.5.1. Monstervoorbereiding
Meng het monster door schudden of roeren. Weeg de gekozen monsterhoeveelheid (6.3) af in een centrifugebuis (5.3) en voeg 50 ml 40 % ethanol (4.1) toe. Roer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met een magneetroerder. Laat het magneetstaafje in de buis en centrifugeer gedurende 5 minuten. Verwijder de vloeistoffase door deze voorzichtig op te zuigen (bijvoorbeeld met een pasteurpipet). Herhaal deze extractieprocedure met twee keer 25 ml ethanol (4.1). Breng het residu met ongeveer 70 ml water over in een maatkolf van 100 ml (5.9).
Voeg na oplossen of suspenderen 100 μl thermostabiel alfa-amylase (4.4) toe en verwarm gedurende 1 uur bij 100 °C in een waterbad (5.12). Koel in een waterbad af tot 60 °C en voeg 5 ml amyloglucosidase-oplossing (4.10) toe. Zet de kolf gedurende 30 minuten in een waterbad van 60 °C. Koel af tot kamertemperatuur, klaar de oplossing door 1 ml Carrez I (4.12) toe te voegen, schud en voeg vervolgens 1 ml Carrez II (4.13) toe. Carrez I en Carrez II kunnen vóór of na het afkoelen worden toegevoegd. Vul aan tot de maatstreep met water, homogeniseer en filtreer de oplossing over een vouwfilter (5.6). Vang het extract van het monster op.
6.5.2. Verwerking van de monsterextracten
Filtreer de extracten over een spuitfilter (5.7) met een spuit (5.10) die vooraf met het extract is gespoeld. Vang het filtraat in flesjes (5.8) op.
Noot: Het spuitfilter kan verschillende keren worden gebruikt. Het dient dan wel vooraf met het volgende extract te worden gespoeld om verontreiniging met het voorgaande extract te voorkomen.
6.6. Chromatografie
HPLC wordt zoals gebruikelijk voor de analyse van suikers uitgevoerd. Omdat de monsters met ethanol/water worden geëxtraheerd, is glucose de belangrijkste suiker die wordt bepaald. Als uit de HPLC-analyse blijkt dat er sporen van maltose aanwezig zijn, kan dit erop wijzen dat het zetmeel niet volledig is omgezet.
7. Berekening en uitdrukking van de resultaten
7.1. Berekening van de HPLC-resultaten
Uit de resultaten van de HPLC-analyse wordt het glucosegehalte (%, m/m) berekend.
De enzymatische amyloglucosidase-oplossing (4.3) wordt met glucose gestabiliseerd. Daarnaast wordt de thermostabiele alfa-amylase (4.4) met sacharose gestabiliseerd, dat door de invertase-activiteit van amyloglucosidase gedeeltelijk in glucose kan worden omgezet. Daarom moet de gemeten glucose-concentratie (%, m/v) worden gecorrigeerd voor de glucose-concentratie (%, m/v) in de blanco-oplossing. Vervolgens wordt het voor de blancobepaling gecorrigeerde glucosegehalte (%, m/m) berekend op basis van de gecorrigeerde glucoseconcentratie, het gewicht van het monster en de kalibratie met de referentieoplossingen (4.11).
7.2. Berekening van het zetmeelgehalte
Het zetmeelgehalte (%, m/m) wordt berekend op basis van het glucosegehalte (%, m/m) na correctie voor de blancobepaling.
Zetmeelgehalte = 0,9 * glucose gecorrigeerd.
8. Precisie
8.1. Ringonderzoek
Nadere gegevens over een ringonderzoek naar de precisie van de methode zijn te vinden in 8.4.
8.2. Herhaalbaarheid
Het absolute verschil tussen twee onafhankelijke afzonderlijke testresultaten, met dezelfde methode en identiek testmateriaal in hetzelfde laboratorium door dezelfde laboratoriummedewerker met dezelfde apparatuur met een korte tussenpoos verkregen, zal in niet meer dan 5 % van de gevallen groter zijn dan de herhaalbaarheidsgrens van 1,1 % (m/m). De herhaalbaarheidsgrens is afgeleid van de gecombineerde resultaten van een ringonderzoek (zie 8.4).
8.3. Reproduceerbaarheid
Het absolute verschil tussen twee afzonderlijke testresultaten, met dezelfde methode en identiek testmateriaal in verschillende laboratoria door verschillende laboratoriummedewerkers met verschillende apparatuur verkregen, zal in niet meer dan 5 % van de gevallen groter zijn dan de reproduceerbaarheidsgrens van 3,7 % (m/m). De reproduceerbaarheidsgrens is afgeleid van de gecombineerde resultaten van een ringonderzoek (zie 8.4).
8.4. Resultaten van het ringonderzoek
In 2005 en 2006 vond een ringonderzoek plaats waaraan de Europese douanelaboratoria deelnamen. Dit onderzoek werd uitgevoerd overeenkomstig ISO 5725 en het IUPAC-protocol (W. Horwitz, Pure and Applied Chemistry, vol. 67, 1995, blz. 331-343). De precisiegegevens zijn in onderstaande tabel weergegeven.
Statistische resultaten van het ringonderzoek
|
|
Monster |
|||||||||||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
||||||||||||||||
|
Aantal overgebleven laboratoria na eliminatie van uitschieters |
25 |
26 |
26 |
25 |
24 |
|||||||||||||||
|
Aantal geaccepteerde resultaten |
50 |
52 |
52 |
50 |
48 |
|||||||||||||||
|
Gemiddeld zetmeelgehalte (%, m/m) |
31,2 |
14,4 |
25,1 |
12,9 |
27,8 |
|||||||||||||||
|
Standaardafwijking herhaalbaarheid sr (%, m/m) |
0,4 |
0,3 |
0,6 |
0,2 |
0,3 |
|||||||||||||||
|
Herhaalbaarheidgrens r (%, m/m) |
1,1 |
0,8 |
1,7 |
0,7 |
0,9 |
|||||||||||||||
|
Standaardafwijking reproduceerbaarheid sR (%, m/m) |
1,7 |
0,8 |
1,7 |
0,9 |
1,3 |
|||||||||||||||
|
Reproduceerbaarheidsgrens r (%, m/m) |
4,8 |
2,2 |
4,7 |
2,5 |
3,7 |
|||||||||||||||
|
Monsters
|
||||||||||||||||||||